EA032985B1 - Варианты полипептидов fc-pol с улучшенным связыванием неонатального рецептора fc - Google Patents

Варианты полипептидов fc-pol с улучшенным связыванием неонатального рецептора fc Download PDF

Info

Publication number
EA032985B1
EA032985B1 EA201491235A EA201491235A EA032985B1 EA 032985 B1 EA032985 B1 EA 032985B1 EA 201491235 A EA201491235 A EA 201491235A EA 201491235 A EA201491235 A EA 201491235A EA 032985 B1 EA032985 B1 EA 032985B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
variant
amino acids
fragment
polypeptide
amino acid
Prior art date
Application number
EA201491235A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491235A1 (ru
Inventor
Жеонхоонь Сунь
Сеог Жоон Хань
Сьюзи М. Харрис
Рандал Р. Кетчем
Джи Лу
Марк Л. Майклс
Марк У. Реттер
Меи-Меи Тсаи
Original Assignee
Амген Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Амген Инк. filed Critical Амген Инк.
Publication of EA201491235A1 publication Critical patent/EA201491235A1/ru
Publication of EA032985B1 publication Critical patent/EA032985B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • G01N33/6857—Antibody fragments
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/526—CH3 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Obesity (AREA)

Abstract

В патенте описаны фрагменты Fc, которые содержат вставку в петле или рядом с указанной петлей, которые при pH 5-6 связываются с неонатальным рецептором Fc (FcRn) с более высоким сродством и/или активностью связывания, а при физиологическом pH - приблизительно с таким же или более низким сродством по сравнению с контрольным фрагментом Fc, то есть при физиологическом pH активность связывания низкая или связывание отсутствует. Также описаны варианты полипептидов Fc, которые содержат указанные фрагменты вариантов Fc. Также описаны способы получения и идентификации таких фрагментов Fc и способы получения и применения таких полипептидов Fc.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к полипептидам, содержащим варианты фрагментов Ес, которые связываются с неонатальным рецептором Ес с более высоким сродством и/или более высокой активностью связывания, чем контрольный фрагмент Ес. Также настоящее изобретение относится к способам выделения, получения и применения таких полипептидов.
Уровень техники
Терапевтические моноклональные антитела с успехом применяются в качестве средств лечения целого спектра заболеваний. Относительно большое время полужизни антител обусловлено по меньшей мере частично взаимодействием области Ес антитела с неонатальным рецептором Ес (ЕсКи). Например, см. ОйеДе с1 а1. (1996), Еиг. 1. 1ттипо1. 26: 690-96. ЕсКи связывается с областью Ес антител из класса 1дО со сродством в наномолярном диапазоне (Кб /константа диссоциации/ =100 нМ) при рН ниже либо равном 6,0, но не связывается при рН крови, т.е., приблизительно рН 7,4. Текаг апб В|бгктаи (2001), Сигг. Ορίη. 5>1гис1. Вю1. 20(2): 226-233. При интернализации антитела в клетку, например, в пиноцит, 1дО может связываться с рецептором ЕсКи в окружении эндосомы с кислой средой. 1б. Когда 1дО связывается с ЕсКи в эндосоме, он направляется назад к поверхности клетки, в противоположность входу в основной метаболический путь в эндосоме. 1б. Как правило, при физиологических значениях рН окружения на поверхности клетки 1дО может отсоединяться от ЕсКи и повторно выходить в кровоток. Данный процесс позволяет антителу вернуться в кровоток после интернализации в клетку, вместо того, чтобы подвергнуться расщеплению в клетках внутри эндосом.
В области техники существует потребность в создании терапевтических антител с увеличенным временем полужизни ίη νίνο, для обеспечения снижения вводимой дозы и частоты введения. Такие антитела обладают преимуществом, поскольку они более удобны для пациента, и, следовательно, также увеличивают вероятность соблюдения пациентом режима лечения и/или снижают стоимость лечения. С учетом современной затратозависимой обстановки в сфере здравоохранения, стоимость может быть определяющим фактором при оценке практической ценности лекарственного средства.
Сущность изобретения
Предложены варианты фрагментов Ес, которые связываются с ЕсКи с более высоким сродством и/или более высокой активностью связывания, чем у контрольного фрагмента Ес, при слегка закисленной рН, и которые связываются с ЕсКи приблизительно с тем же или более низким сродством, что и контрольный фрагмент Ес, то есть демонстрируют низкое сродство или его отсутствие, при физиологической рН. Также предложены варианты полипептидов Ес, которые содержат варианты фрагментов Ес, а также связывающую область, которая связывается с молекулой-мишенью. В настоящей заявке продемонстрировано, что варианты полипептидов Ес, содержащие варианты фрагментов Ес со свойствами связывания, упомянутыми выше, также характеризуются более длительным временем полужизни, чем контрольные полипептиды Ес. Также предложены нуклеиновые кислоты, которые кодируют указанные фрагменты Ес и полипептиды Ес, и способы получения указанных белков с применением указанных нуклеиновых кислот. Также в изобретение включены способы увеличения времени полужизни полипептидов Ес ίη νίνο и способы определения вариантов фрагментов Ес, которые связываются с ЕсКи с более высоким сродством при рН 5-6 и связываются с ЕсКи при физиологических рН со сродством, сопоставимым или более низким, чем у контрольного фрагмента ЕсКи.
В настоящей заявке описан вариант полипептида Ес, содержащий вариант фрагмента Ес из 1дС1, 1дО2, 1дО3 или 1дО4 человека, причем указанный вариант фрагмента Ес содержит вставку от 3 до 20, от 10 до 20, от 20 до 40, от 40 до 60, от 60 до 80 аминокислот в петле 5, 8 и/или 10 или рядом с указанной петлей указанного варианта фрагмента Ес, причем при рН от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0 и/или при рН приблизительно 5,0, 5,2, 5,5 5,7 или 6,0 указанный вариант полипептида Ес связывается с неонатальным рецептором Ес человека (йЕсКи) с более высоким сродством и/или более высокой активностью связывания, чем у контрольного полипептида Ес, содержащего такую же последовательность аминокислот, что и вариант полипептида Ес, за исключением того, что он не содержит вставки в петле 5, 8 или 10 или рядом с указанной петлей, и причем при физиологической рН и/или рН приблизительно 7,4, 7,5 или 7,6 указанный вариант полипептида связывается с неонатальным рецептором Ес человека (йЕсКи) со сродством или активностью связывания, приблизительно равными или более низкими, чем у контрольного полипептида Ес, т.е. активность связывания низкая или связывание отсутствует. Указанная вставка в варианте фрагмента Ес или расположенная рядом с указанным фрагментом может состоять по меньшей мере из шести аминокислот, но не более чем из 25 аминокислот, от 6 до 16 аминокислот, и/или по меньшей мере состоять из 12 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации указанная вставка не содержит остатков метионина и/или триптофана. Указанная вставка в варианте фрагмента Ес или расположенная рядом с указанным фрагментом может содержать по меньшей мере один цистеин
- 1 032985 среди первых четырех добавленных аминокислот и по меньшей мере один цистеин среди последних четырех добавленных аминокислот. Необязательно указанная вставка может не содержать остатков цистеина помимо остатков цистеина, присутствующих в первых четырех или в последних четырех добавленных аминокислотах указанной вставки. Согласно некоторым вариантам реализации указанная вставка расположена в петле 10 варианта фрагмента Ес рядом с указанной петлей, необязательно между аминокислотами 384 и 385 варианта фрагмента Ес согласно системе нумерации ЕС, показанной в табл. 1. Указанная вставка может быть расположена в пределах аминокислот 383 - 387 согласно системе нумерации ЕС. Согласно некоторым вариантам реализации указанная вставка в варианте фрагмента Ес человека может быть расположена между аминокислотами 382 и 383, 383 и 384, 385 и 386, 386 и 387, 387 и 388, 388 и 389, 389 и 390, или 390 и 391 согласно системе нумерации ЕС, показанной в табл. 1. В качестве альтернативы могут быть делетированы аминокислоты 384-386, и указанная вставка может быть расположена между аминокислотами 383 и 387 согласно системе нумерации ЕС, показанной в табл. 1. Указанная вставка в варианте фрагмента Ес может содержать последовательность аминокислот в соответствии с любой из следующих 5ЕО ГО №: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 90-356 и 359-379. Также указанная вставка в вариант фрагмента Ес может содержать последовательность аминокислот в соответствии с любой из следующих 8Ер ГО №41-67; 8Ер ГО №: 90-246; 5ЕО ГО №: 247-356; 5ЕО ГО №: 367, 369, 372, 373 и 375-379; аминокислоты 4-9 в соответствии с любой из следующих 8ЕО ГО №: 41-53, 67, 90-162,90163,165-215, 164-214, 217-247, 216-246, 359-379 и 392-399, 401-409, 411-426, 428-439, 441-447, 449-453, 456, 459, 461, 464 и 470, 475, 477-489, 491-496; аминокислоты 4-10 в соответствии с любой из следующих 8ЕО ГО №: 164, 252 и 490, а аминокислоты 4-8 в соответствии с 8ЕО ГО №: 215 или 216; аминокислоты 4-11 в соответствии с одной из 5ЕО ГО №: 248-288, 290-306, 342, 400, 410, 427, 440, 448, 454, 455, 457, 458, 460, 465-469, 471-474 и 476; аминокислоты 4-12 в соответствии с 8ЕО ГО №: 289 или 307; и аминокислоты 4-13 в соответствии с любой из 8ЕО ГО №: 308-341 и 343-356.
Также в настоящей заявке описан вариант полипептида Ес, содержащий вариант фрагмента Ес из 1дС1, 1дС2. [дС3 или 1дС4 человека, причем указанный вариант фрагмента Ес содержит вставку от 3 до 20, от 10 до 20, от 20 до 40, от 40 до 60, от 60 до 80 аминокислот в петле 10 или рядом с указанной петлей указанного варианта фрагмента Ес, причем при рН от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0 и/или при рН приблизительно 5,0, 5,2, 5,5 5,7 или 6,0 указанный вариант полипептида Ес связывается с йЕсВи с более высоким сродством и/или более высокой активностью связывания, чем у контрольного полипептида Ес, который тождественен указанному варианту полипептида Ес за исключением того, что он не содержит вставку в петле 10 или вблизи от нее, и причем при физиологической рН и/или рН приблизительно 7,4, 7,5 или 7,6 указанный вариант полипептида Ес связывается с йЕсВи со сродством или активностью связывания, приблизительно равными или более низкими, чем у контрольного полипептида Ес, т. е. активность связывания низкая или связывание отсутствует. Указанная вставка может состоять по меньшей мере из шести аминокислот, может содержать не более 25 аминокислот, от 6 до 16 аминокислот, и/или по меньшей мере состоять из 12 аминокислот, и/или может содержать по меньшей мере один цистеин среди первых четырех добавленных аминокислот и по меньшей мере один цистеин среди последних четырех добавленных аминокислот. Указанная вставка может не содержать цистеина в других положениях в пределах указанной вставки. Указанная вставка может не содержать остатков метионина и/или триптофана. Указанная вставка в вариант фрагмента Ес может быть расположена в пределах аминокислот 383 - 387 согласно системе нумерации ЕС. Указанная вставка в вариант фрагмента Ес может быть расположена между аминокислотами 382 и 383, 383 и 384, 384 и 385, 385 и 386, 386 и 387, 387 и 388, 388 и 389, 389 и 390, или 390 и 391 согласно системе нумерации ЕС, показанной в табл. 1. В качестве альтернативы могут быть делетированы аминокислоты 384-386, и указанная вставка может быть расположена между аминокислотами 383 и 387 согласно системе нумерации ЕС. Указанная вставка в вариант фрагмента Ес может содержать последовательность аминокислот в соответствии с любой из 8ЕО ГО №: 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 90-356, 359-379 и 392-496. Также указанная вставка в варианте фрагмента Ес может содержать последовательность аминокислот в соответствии с любой из следующих: 8ЕО ГО №: 41-67; 5ЕО ГО №: 90-246; 5ЕО ГО №: 247-356; 5ЕО ГО №: 367, 369, 372, 373 и 375-379; аминокислоты 4-9 в соответствии с любой из 5ЕО ГО №: 41-53, 67, 90-162, 90-163, 165-215, 164-214, 217-247, 216-246, 359379 и 392-399, 401-409, 411-426, 428-439, 441-447, 449-453, 456, 459, 461 ,464 и 470, 475, 477-489, 491496; аминокислоты 4-10 в соответствии с 8ЕО ГО №: 164, 252 и 490, аминокислоты 4-8 в соответствии с 8ЕО ГО №: 215 или 216; аминокислоты 4-11 в соответствии с одной из 8ЕО ГО №: 248-288, 290-306, 342, 400, 410, 427, 440, 448, 454, 455, 457, 458, 460, 465-469, 471-474 и 476; аминокислоты 4-12 в соответствии с 8ЕО ГО №: 289 или 307; а аминокислоты 4-13 в соответствии с одной из 8ЕО ГО №: 308-341 и 343-356. Указанный вариант полипептида Ес может быть вариантом гибридного белка Ес, содержащего полипептид, не являющийся антителом. Согласно конкретным вариантам реализации контрольным гибридным белком Ес для варианта гибридного белка Ес может быть алефацепт, рилонацепт, афлиберсепт, этанерсепт, ромиплостим или абатацепт. Согласно другим вариантам реализации указанный вариант полипептида Ес может содержать вариабельную область тяжелой цепи (Уй) и/или вариабельную область легкой
- 2 032985 цепи (У1) любого антитела, а также может содержать первую константную область тяжелой цепи (Сн1) и константную область легкой цепи (С1). Согласно некоторым вариантам реализации указанный вариант полипептида Ес может содержать (а) тяжелую цепь, содержащую область Уь, первую константную область тяжелой цепи (Сн1), шарнирную область, область Сн2 и область Сн3, и (Ь) легкую цепь, содержащую область У1 и константную область легкой цепи (С1). Указанный вариант полипептида Ес может быть моновалентным. Указанный вариант полипептида Ес может быть димером или может быть тетрамером.
Согласно дополнительным вариантам реализации в настоящей заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие указанные варианты полипептидов Ес или варианты фрагментов Ес, описанные в настоящей заявке, а также вставки в петлях указанных вариантов Ес или рядом с указанными петлями. Также описаны клетки-хозяева, содержащие такие нуклеиновые кислоты. Также предусмотрены способы получения варианта полипептида Ес или варианта фрагмента Ес, включающие (а) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный вариант полипептида Ес или фрагмента Ес, в клетку-хозяина, (Ь) культивирование клетки-хозяина, содержащей указанную нуклеиновую кислоту в условиях, при которых указанная нуклеиновая кислота экспрессируется, и (с) выделение экспрессированного варианта полипептида Ес или фрагмента Ес из культуральной среды или массы клеток, причем указанный вариант фрагмента Ес, или вариант полипептида Ес, который содержит вариант фрагмента Ес, содержит вставку от 3 до 20, от 10 до 20, от 20 до 40, от 40 до 60, от 60 до 80 аминокислот в петле 5, 8 или 10 или вблизи такой петли указанного варианта фрагмента Ес, и причем при рн в диапазоне от приблизительно 5,0 до приблизительно 6,0 и/или при рн приблизительно 5,0, 5,2, 5,5, 5,7 или 6,0 указанный вариант полипептида Ес или фрагмента Ес связывается с НЕсКп с более высоким сродством и/или более высокой активностью связывания, чем контрольный полипептид Ес или фрагмент Ес, и причем при физиологической рн и/или рн приблизительно 7,4, 7,5 или 7,6 указанный вариант полипептида Ес или фрагмента Ес связывается с ЬЕсВи со сродством или активностью связывания, приблизительно равными или более низкими, чем у контрольного полипептида Ес, т.е. активность связывания низкая или связывание отсутствует.
Также описаны способы получения любого из вариантов фрагмента Ес или полипептида Ес, описанных в настоящей заявке, включающие (а) введение нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный вариант полипептида Ес или фрагмента Ес, в клетку-хозяина, (Ь) культивирование клетки-хозяина, содержащей указанную нуклеиновую кислоту в условиях, при которых указанная нуклеиновая кислота экспрессируется, и (с) выделение экспрессированного варианта полипептида Ес или фрагмента Ес из культуральной среды или массы клеток.
Согласно дополнительным вариантам реализации в настоящей заявке описан способ увеличения времени полужизни полипептида Ес, содержащего фрагмент Ес из 1дС человека, включающий следующие этапы: выбор сайта вставки в петле 5,8 и/или 10, или рядом с указанной петлей; введение пептида в выбранный сайт, причем указанный пептид содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из 8ЕО ГО №: 41-67; 8ЕО ГО №: 90-246; 8ЕО ГО №: 247-356; 8ЕО ГО №: 367, 369, 372, 373 и 375-379; аминокислот 4-9 в соответствии с одной из следующих 8ЕО ГО №: 41-53, 67,90-162, 90163,165-215,164-214, 217-247, 216-246, 359-379 и 392-399, 401-409, 411-426, 428-439, 441-447, 449-453, 456, 459, 461, 464 и 470, 475, 477-489, 491-496; аминокислот 4-10 в соответствии с 8ЕО ГО №: 164, 252 и 490, и аминокислот 4-8 в соответствии с 8ЕО ГО №: 215 или 216; аминокислот 4-11 в соответствии с одной из 8ЕО ГО №: 248-288, 290-306, 342, 400, 410, 427, 440, 448, 454, 455, 457, 458, 460, 465-469, 471-474 и 476; аминокислот 4-12 в соответствии с 8ЕО ГО №: 289 или 307; и аминокислот 4-13 в соответствии с любой из 8ЕО ГО №: 308-341 и 343-356. Выбранный сайт может быть расположен в петле 10 или вблизи нее, и сайт вставки может быть расположен между аминокислотами 384 и 385 согласно системе нумерации ЕС. Указанный сайт вставки может быть расположен в пределах аминокислот 383 - 387 согласно системе нумерации ЕС. Указанный сайт вставки в варианте фрагмента Ес может быть расположен между аминокислотами 382 и 383, 383 и 384, 384 и 385, 385 и 386, 386 и 387, 387 и 388, 388 и 389, 389 и 390, или 390 и 391 согласно системе нумерации ЕС, показанной в табл. 1. В качестве альтернативы аминокислоты 384-386 могут быть делетированы, и может присутствовать вставка между аминокислотами 383 и 387 согласно системе нумерации ЕС.
Также в настоящей заявке предложен способ определения варианта фрагмента Ес из 1дС человека, который обеспечивает большее время полужизни варианта полипептида Ес, который содержит указанный вариант фрагмента Ес, по сравнению с контрольным полипептидом Ес, причем указанный способ, включает следующие этапы: (а) создание библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих фрагменты Ес, содержащие вставку, содержащую 4-20, 10-20, 20-40, 40-60 или 60-80 отобранных случайным образом аминокислот в петле 10 или рядом с указанной петлей; (Ь) скрининг фрагментов Ес, закодированных в указанной библиотеке, для определения вариантов фрагментов Ес, которые (ί) при рн 5,5, и/или при рн приблизительно 5-6 связывается с йЕсВи с более высоким сродством и/или более высокой активностью связывания, чем контрольный фрагмент Ес, и (п) при физиологической рн и/или рн приблизительно 7,4, 7,5 или 7,6 связывается с ЬЕсВи со сродством или активностью связывания, приблизительно равными или более низкими, чем у контрольного фрагмента Ес, т.е. активность связывания низкая или связывание отсутствует; (с) конструирование нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида Ес, содержащий идентифицированный на этапе (Ь) фрагмент Ес, причем зависимость концентрации от времени
- 3 032985 контрольного полипептида Ес, который содержит контрольный фрагмент Ес, в отлииче от варианта фрагмента Ес, как известно, снижается линейно при введении животному в условиях ίη νίνο; (6) введение нуклеиновой кислоты, полученной на этапе (с) в клетку-хозяина и культивирование указанной клеткихозяина в условиях, при которых вариант полипептида Ес, кодируемый указанной нуклеиновой кислотой, может экспрессироваться; (е) выделение варианта полипептида Ес из массы клеток или культуральной среды; (ί) введение варианта полипептида Ес животному и введение контрольного полипептида Ес другому животному; и (д) отслеживание концентрации варианта и контрольного полипептида Ес в периферической крови в течение определенного времени после введения, благодаря чему можно определить вариант фрагмента Ес, который обеспечивает большее время полужизни варианта полипептида Ес. Вставка согласно этапу (а) может быть расположена между положениями 384 и 385 согласно системе нумерации ЕС, которая проиллюстрирована в табл. 1. Сайт вставки может быть расположен между аминокислотами 383 - 387 согласно системе нумерации ЕС. Вставка в варианте фрагмента Ес может быть расположена между аминокислотами 382 и 383, 383 и 384, 384 и 385, 385 и 386, 386 и 387, 387 и 388, 388 и 389, 389 и 390, или 390 и 391 согласно системе нумерации ЕС, показанной в табл. 1. В качестве альтернативы аминокислоты 384-386 могут быть делетированы, и вставка может быть расположена между аминокислотами 383 и 387 согласно системе нумерации ЕС.
Согласно другому аспекту предложен способ лечения хронического заболевания, включающий введение пациенту, нуждающемуся в указанном лечении, варианта полипептида Ес, описанного в настоящей заявке.
Краткое описание фигур
Фиг. 1 - ленточная диаграмма прогнозируемой трехмерной структуры частей ЕсК.п человека (ЬЕсЯп) и фрагмента Ес 1дС1 человека, которые вступают в наиболее тесный контакт при связывании ЕсЯп с фрагментом Ес. На верхней панели ленточной диаграммы показана часть четвертичной структуры ЬЕсЯп. Ниже показана ленточная диаграмма части фрагмента Ес 1дС1 человека, который вступает в наиболее тесный контакт с ЕсЯп, когда ЕсЯп связывается с ним. Петли показаны в виде нитей, а альфаспирали и бета-складчатости показаны в виде лент. Шесть сайтов, в которых были сделаны вставки, обозначены с указанием названий восьми библиотек, которые были сконструированы, как описано ниже, т.е., Ь1, Ь2А, Ь2В, Ь3, Ь4, Ь5, Ь6А и Ь6В.
Фиг. 2 - форма библиотек вставок. На верхней панели показана последовательность фрагмента Ес 1дС1 человека (8ЕО ГО №: 1). Аминокислоты в петлях, в которых или рядом с которыми были сделаны вставки, показаны подчеркиванием и жирным шрифтом. Названия библиотек, т.е. Ь1, Ь2А и др., показаны над областью, в которой были сделаны вставки для данной конкретной библиотеки. Форма вставок указана выше. На крайней панели слева приведены названия библиотек, т.е. Ь1, Ь2А и др. Справа от названий библиотек показана исходная последовательность вокруг сайта вставки до вставки какой-либо аминокислоты. Буквы, показанные курсивом, обозначают аминокислоты, которые делетированы до вставки. Вертикальными пунктирными линиями показан сайт вставки в тех библиотеках, в которых были делетированы аминокислоты. На крайней панели справа показана последовательность вокруг сайта вставки уже с произведенной вставкой. Обозначения (19К.)5 или (19К.)6 показывают пять или шесть, соответственно, выбранных случайным образом аминокислот, которые могут быть любыми из 19 аминокислот, кроме цистеина. Обозначение (20К.)8 показывает восемь выбранных случайным образом аминокислот, которые могут быть любыми из двадцати аминокислот.
Фиг. 3 - кривые связывания и диссоциации при рН 6 и рН 7,4, соответственно, вариантов фрагментов Ес из библиотеки Ь5. Кривые слева отображают ответ, выявленный при помощи системы ЕойеВю Ос1е1®. как объяснено в примере 4, где части кривых слева от центральной вертикальной линии отображают относительное количество связывания разных фрагментов Ес фрагментов с ЕсЯп при рН 6, а части кривых справа от центральной вертикальной линии отображают диссоциацию Ес фрагментов от ЕсЯп при рН 7,4. В таблице справа приведена максимальная реакция связывания, выявляемая при рН 6 для фрагмента Ес каждого варианта и дикого типа (Ес\УТ).
Фиг. 4 - средние концентрации антител, содержащих варианты фрагментов Ес и контрольные фрагменты Ес, как функция времени после введения яванским макакам. По оси х отложено время в часах после инъекции, а по оси у отложена концентрация антитела в нанограммах на миллилитр (нг/мл) в периферической крови яванских макак, которым ввели антитело.
Фиг. 5 - последовательности вариантов Петли 10. Показаны последовательности аминокислот дикого типа или вариантов петли во фрагменте Ес 1дС1 человека и три соседние аминокислоты с каждой стороны. Последовательность аминокислот показана, начиная с остатков аминокислот 166-178, согласно схеме нумерации на фиг. 2, или с остатков аминокислот 381-393, согласно системе нумерации ЕС (8ЕО ГО №: 563), которая показана на данной фигуре и в табл. 1. Неизмененная последовательность - последовательность петли дикого типа обозначена как последовательность дикого типа. Последовательность области данной петли в варианте Ес 5-1 (кодируемая изолятом из библиотеки Ь5) обозначена 5-1 (8ЕО ГО №: 564). Встраиваемые последовательности аминокислот показаны жирным шрифтом и подчеркиванием. Ниже показаны последовательности области той же петли из разных вариантов 5-1, которые содержат один и тот же пептид со вставками в разных локализациях в пределах данной пели или рядом с
- 4 032985 указанной петлей, в некоторых случаях с делецией некоторых аминокислот петли.
Фиг. 6 - кривые связывания и диссоциации при рН 6 и рН 7,4, соответственно, вариантов фрагментов Ес, содержащих одинаковую вставку в разных положениях петли 10. Слева показаны кривые связывания при рН 6 (слева от центральной вертикальной линии) и кривые диссоциации при рН 7,4 (справа от центральной вертикальной линии) для разных вариантов фрагментов Ес и фрагмента Ес дикого типа (Ес\СТ). Справа в табличной форме приведен максимальный ответ связывания, выявленный для каждого варианта при рН 6.
Фиг. 7 - кривые связывания и диссоциации при рН 6 и рН 7,4, соответственно, вариантов фрагментов Ес из библиотеки Ь5, скрининг которых проводили у дрожжей. Слева показаны кривые связывания при рН 6 (слева от центральной вертикальной линии) и кривые диссоциации при рН 7,4 (справа от центральной вертикальной линии) для разных вариантов фрагментов Ес и фрагмента Ес дикого типа (Ес\СТ). Справа в табличной форме приведен максимальный ответ связывания, выявленный для каждого варианта при рН 6.
Фиг. 8 - кривые связывания и диссоциации при рН 6 и рН 7,4, соответственно, вариантов фрагментов Ес из библиотеки Ь-8 и Ь-10, скрининг которых проводили у дрожжей. Слева показаны кривые связывания при рН 6 (слева от центральной вертикальной линии) и кривые диссоциации при рН 7,4 (справа от центральной вертикальной линии) для разных вариантов фрагментов Ес и фрагмента Ес дикого типа (Ес^Т). Справа в табличной форме приведен максимальный ответ связывания, выявленный для каждого варианта при рН 6.
Фиг. 9 - средние концентрации антител, содержащих варианты фрагментов Ес и контрольный фрагмент Ес, как функция времени после введения яванским макакам. По оси х отложено время в часах после инъекции, а по оси у отложена концентрация антитела в нанограммах на миллилитр (нг/мл) в периферической крови яванских макак, которым ввели антитело.
Фиг. 10 - средние концентрации антител, содержащих варианты фрагментов Ес и контрольный фрагмент Ес, как функция времени после введения яванским макакам. По оси х отложено время в часах после инъекции, а по оси у отложена концентрация антитела в нанограммах на миллилитр (нг/мл) в периферической крови яванских макак, которым ввели антитело. Как показано, черные кружки отображают индивидуальные точки данных для яванских макак, которым вводили Υ-5-112, а сплошная линия отображает среднее для указанных данных. Аналогично, треугольники отображают индивидуальные точки данных для яванских макак, которым вводили антитело Υ, а пунктирная линия отображает среднее для указанных данных.
- 5 032985
Краткое описание последовательностей
НОМЕР В ПЕРЕЧНЕ Описание
8Е<Э Ш№:1 Последовательность аминокислот области Ес 1дО1 человека
8Е<Э ГО №:2 Последовательность нуклеотидов, кодирующая область Ес 1дО1 человека
8Е<Э ГО №:3 Последовательность аминокислот области Ес 1дС2 человека
8Е<Э ГО №:4 Последовательность нуклеотидов, кодирующая область Ес 1дО2 человека
8Е<Э ГО№:5 Последовательность аминокислот области Ес 1дОЗ человека
8Е<Э ГО№:6 Последовательность нуклеотидов, кодирующая область Ес 1дСЗ человека
8Е<Э ГО№:7 Последовательность аминокислот области Ес 1дО4 человека
8Е<Э ГО№:8 Последовательность нуклеотидов, кодирующая область Ес 1дО4 человека
8Е<Э ГО №:9 Последовательность аминокислот альфа-цепь ЕсКп человека
8Е<Э ГО№:10 Последовательность аминокислот цепи β-2-микроглобулина ЕсКп человека
8Е<Э ГО№:11 Последовательность аминокислот внеклеточной области зрелого рецептора фактора некроза опухоли р75 человека
8Е<Э ГО№:12 Последовательность аминокислот внеклеточной области зрелого (СТЬА4) человека
8Е<Э ГО№:13 Последовательность аминокислот вставки со случайной последовательностью (СХХХХХХС)
8Е<Э ГО№:14 Последовательность аминокислот вставки со случайной последовательностью (СХХХХХХХС)
8Е<Э ГО№:15 Последовательность аминокислот вставки со случайной последовательностью (СХХХХХХХХС)
8Е<Э ГО№:16 Последовательность аминокислот вставки со случайной последовательностью (6СХХХХХХСО)
8Е<Э ГО№:17 Последовательность аминокислот вставки со случайной последовательностью (6СХХХХХХХСО)
8Е<Э ГО№:18 Последовательность аминокислот вставки со случайной последовательностью (ССХХХХХХХХСС)
8Е<Э ГО№:19 Последовательность аминокислот вставки со случайной последовательностью (О6СХХХХХХСОО)
8Е<Э ГО №:20 Последовательность аминокислот вставки со случайной последовательностью (О6СХХХХХХХСОО)
8Е<Э ГО №:21 Последовательность аминокислот вставки со случайной последовательностью (О6СХХХХХХХХСОО)
- 6 032985
8Е<Э ГО №:22 Последовательность аминокислот вставки со случайной последовательностью (ОО6СХХХХХХСООО)
8Е<Э ГО №:23 Последовательность аминокислот вставки со случайной последовательностью (ОО6СХХХХХХХСООО)
8Е<Э ГО №:24 Последовательность аминокислот вставки со случайной последовательностью (ОО6СХХХХХХХХСООО)
8Е<Э ГО №:25 Последовательность нуклеотидов части, кодирующей фрагмент Ес из библиотеки Б1
8Е<Э ГО №:26 Последовательность аминокислот, кодируемая 8Е<Э ГО №:25
8Е<Э ГО №:27 Последовательность нуклеотидов части, кодирующей фрагмент Ес из библиотеки Б2А
8Е<Э ГО №:28 Последовательность аминокислот, кодируемая 8Е<Э ГО №:27
8Е<Э ГО №:29 Последовательность нуклеотидов части, кодирующей фрагмент Ес из библиотеки Б2В
8Е<Э ГО №:30 Последовательность аминокислот, кодируемая 8Е<Э ГО №:29
8Е()Ю№:31 Последовательность нуклеотидов части, кодирующей фрагмент Ес из библиотеки БЗ
8Е<Э ГО №:32 Последовательность аминокислот, кодируемая 8Е<Э ГО №:31
8Е<Э ГО №:33 Последовательность нуклеотидов части, кодирующей фрагмент Ес из библиотеки Б4
8Е<Э ГО №:34 Последовательность аминокислот, кодируемая 8Е<Э ГО №:33
8Е<Э ГО №:35 Последовательность нуклеотидов части, кодирующей фрагмент Ес из библиотеки Б 5
8Е<Э ГО №:36 Последовательность аминокислот, кодируемая 8Е<Э ГО №:35
8Е<Э ГО №:37 Последовательность нуклеотидов части, кодирующей фрагмент Ес из библиотеки Б6А
8Е<Э ГО №:38 Последовательность аминокислот, кодируемая 8Е<Э ГО №:37
8Е<Э ГО №:39 Последовательность нуклеотидов части, кодирующей фрагмент Ес из библиотеки Б6В
8Е<Э ГО №:40 Последовательность аминокислот, кодируемая 8Е<Э ГО №:39
8Εζ) ГО №:41 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс - Ес-5-51
8Е<Э ГО №:42 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес - Ес-5-69
8ЕЭ ГО №:43 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Рс - Ес-5-104
8Е<Э ГО №:44 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Рс - Ес-5-106
8ЕЭ ГО №:45 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Рс - Рс-5-112
- 7 032985
8Е<Э Ш №:46 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес - Ес-5-55
8Еф Ш №:47 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес - Ес-5-60
8Е<Э Ш №:48 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес - Ес-5-70
8Е<Э Ш №:49 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес - Ес-5-79
8Е<Э Ю№:50 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес - Ес-5-85
8Е<Э Ю№:51 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес - Ес-5-95
8Е<Э Ю№:52 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес - Ес-5-97
8Е<Э Ю№:53 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес - Ес-5-99
8Е<Э Ю№:54 Последовательность аминокислот для шести аминокислот в середине вставки в Ес-5-51
8Е<Э Ю№:55 Последовательность аминокислот для шести аминокислот в середине вставки в Ес-5-69
8Е<Э Ю№:56 Последовательность аминокислот для шести аминокислот в середине вставки в Ес-5-104
8Е<Э Ю№:57 Последовательность аминокислот для шести аминокислот в середине вставки в Ес-5-106
8Е<Э ГО №:58 Последовательность аминокислот для шести аминокислот в середине вставки в Ес-5-112
8Е<Э Ю№:59 Последовательность аминокислот для шести аминокислот в середине вставки в Ес-5-55
8Е<Э Ш№:60 Последовательность аминокислот для шести аминокислот в середине вставки в Ес-5-60
8Е<Э Ш№:61 Последовательность аминокислот для шести аминокислот в середине вставки в Ес-5-70
8Е<Э Ш№:62 Последовательность аминокислот для шести аминокислот в середине вставки в Ес-5-79
8Е<Э Ш№:63 Последовательность аминокислот для шести аминокислот в середине вставки в Гс-5-85
8Е<Э Ш№:64 Последовательность аминокислот для шести аминокислот в середине вставки в Ес-5-95
8Е<Э Ю№:65 Последовательность аминокислот для шести аминокислот в середине вставки в Ес-5-97
8Е<Э Ш№:66 Последовательность аминокислот для шести аминокислот в середине вставки в Ес-5-99
8Е<Э Ш№:67 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес - 5-1
- 8 032985
8Е<9 Ю№:68 Последовательность нуклеотидов прямого праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-1
8Е<9 Ш№:69 Последовательность нуклеотидов обратного праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-1
8Е<9 ГО№:70 Последовательность нуклеотидов прямого праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-2
8Е<9 ГО№:71 Последовательность нуклеотидов обратного праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-2
8Е<9 ГО №:72 Последовательность нуклеотидов прямого праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-3
8Е<9 ГО№:73 Последовательность нуклеотидов обратного праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-3
8Е<9 ГО№:74 Последовательность нуклеотидов прямого праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-4
8Е<9 ГО№:75 Последовательность нуклеотидов обратного праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-4
8Е<9 ГО№:76 Последовательность нуклеотидов прямого праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-5
8Е<9 ГО№:77 Последовательность нуклеотидов обратного праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-5
8Е<9 ГО№:78 Последовательность нуклеотидов прямого праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-6
8Е<9 ГО№:79 Последовательность нуклеотидов обратного праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-6
8Е<9 ГО№:80 Последовательность нуклеотидов прямого праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-7
8Е<9 ГО№:81 Последовательность нуклеотидов обратного праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-7
8Е<9 ГО№:82 Последовательность нуклеотидов прямого праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-8
8Е<9 ГО№:83 Последовательность нуклеотидов обратного праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-8
8Е<9 ГО№:84 Последовательность нуклеотидов прямого праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-9
8Е<9 ГО№:85 Последовательность нуклеотидов обратного праймера, применяемого для
- 9 032985
конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид5-1-9
8Е<9 Ю№:86 Последовательность нуклеотидов прямого праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид 5-1-10
8Е£) Ю№:87 Последовательность нуклеотидов обратного праймера, применяемого для конструирования вектора, кодирующего вариант Ес-полипептид 5-1-10
8Е<9 Ю№:88 Последовательность аминокислот вставки в библиотеку Б-8
8Е<9 Ю№:89 Последовательность аминокислот вставки в библиотеку Б-10
8Е<9 Ш №:90 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-1
8Е<9 Ш №:91 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-2
8Е<9 Ш №:92 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-3
8Е<9 Ш №:93 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-4
8Е<9 Ш №:94 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-5
8Е<9 Ш №:95 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-6
8Е<9 Ш №:96 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-7
8Е<9 Ш №:97 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-8
8Е<9 Ш №:98 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-9
8Е<9 Ш №:99 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-10
8Е<9 ГО№:100 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-11
8Е<9 Ш№:101 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-12
8Е<9 Ш№:102 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-13
8Е<9 Ш№:103 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-14
8Е<9 Ш№:104 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-15
8Е<9 Ю№:105 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-16
8Е<9 Ш№:106 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-17
8Е<9 Ш№:107 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-18
8Е<9 Ю№:108 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-19
8Е<9 Ш№:109 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-20
8Е<9 Ш№:110 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-21
8Е<9 Ш№:111 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-22
8Е<9 Ш№:112 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-23
8Е<9 Ш№:113 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-24
8Еф Ш№:114 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-25
8Е<9 Ю№:115 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-26
8Е<9 Ш№:116 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-27
8Е<9 Ш№:117 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-28
- 10 032985
8Е(/) Ю№:118 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-29
8Ε(/) Ш№:119 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-30
8Ε(/) Ш№:120 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-31
8Ε(/) Ш№:121 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-32
8Ε(/) Ш№:122 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-33
8ΕΟ Ш№:123 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-34
8Е<7 Ш№:124 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-35
8Е<7 Ю№:125 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-36
8Е<7 Ш№:126 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-37
8Е<7 Ш№:127 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-38
8Е<7 Ю№:128 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-39
8Е<7 Ш№:129 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-40
8Е<7 Ш№:130 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-41
8Е<7 Ш№:131 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-42
8Е<7 Ш№:132 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-43
8Е<7 Ш№:133 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-44
8Е<7 Ш№:134 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-45
8Е<7 Ю№:135 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-46
8Е<7 Ш№:136 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-47
8Е<7 Ш№:137 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-48
8Е<7 Ю№:138 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-49
8Е<7 Ш№:139 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-50
8Е<7 Ш№:140 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-51
8Е<7 Ш№:141 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-52
8Е<7 Ш№:142 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-53
8Е<7 Ш№:143 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-54
8Е<7 Ш№:144 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-55
8Е<4 Ю№:145 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-56
8Е<7 Ш№:146 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-57
8Е<7 Ш№:147 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-58
8Е<7 Ю№:148 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-59
8Е<7 Ш№:149 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-60
8Е<7 Ю№:150 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-61
8Е<4 Ю№:151 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-62
8Е<7 Ю№:152 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-63
- 11 032985
8Е(} Ю№:153 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-64
8Е() Ю№:154 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-65
8Е() Ю№:155 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-66
8Е() Ю№:156 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-67
8Е() Ю№:157 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-68
8Е() Ю№:158 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-69
8Е() Ю№:159 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-70
8Е() Ш№:160 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-71
8Е() Ш№:161 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-72
8Е() Ш№:162 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-73
8Е() Ш№:163 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-74
8Е() Ш№:164 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-75
8Е() Ю№:165 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-76
8Е() Ш№:166 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-77
8Е() Ш№:167 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-78
8Е() Ю№:168 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-79
8Е() Ш№:169 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-80
8Е() Ш№:170 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-81
8Е() Ш№:171 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-82
8Е() Ш№:172 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-83
8Е() Ю№:173 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-84
8Е() Ш№:174 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-85
8Е() Ю№:175 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-86
8Е() Ш№:176 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-87
8Е() Ш№:177 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-88
8Е() Ю№:178 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-89
8Е() Ш№:179 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-90
8Е() Ю№:180 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-91
8Е() Ю№:181 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-92
8Е() Ю№:182 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-93
8Е() Ю№:183 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-94
8Е() Ю№:184 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-95
8Е() Ю№:185 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-96
8Е() Ю№:186 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-97
8Е() Ю№:187 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-98
- 12 032985
8Е(} Ю№:188 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-99
8Е<Э Ю№:189 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-100
8Е<Э Ш№:190 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-101
8Е<Э Ш№:191 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-102
8Е<Э Ш№:192 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-103
8Е<Э Ш№:193 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-104
8Е<Э Ш№:194 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-105
8Е<Э Ю№:195 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-106
8Е<Э Ш№:196 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-107
8Е<Э Ш№:197 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-108
8Е<Э Ю№:198 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-109
8Е<Э Ш№:199 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-110
8Е<Э Ш №:200 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-111
8Е<Э ГО №:201 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-112
8Е<Э Ш №:202 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-113
8Е<Э Ш №:203 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-114
8Е<Э Ш №:204 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-115
8Е<Э Ш №:205 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-116
8Е<Э Ш №:206 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-117
8Е<Э Ш №:207 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-118
8Е<Э Ш №:208 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-119
8Е<Э Ш №:209 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-120
8Е<Э Ш№:210 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-121
8Е<Э Ш№:211 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-122
8Е<Э Ш№:212 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-123
8Е<Э Ш№:213 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-124
8Е<Э Ш№:214 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-125
8Е<Э Ю№:215 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-126
8Е<Э Ш№:216 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-127
8Е<Э Ш№:217 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-128
8Е<9 Ш№:218 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 5у-129
8Е<Э Ш№:219 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 5у-130
8Е<Э Ш №:220 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 5у-131
8Е<Э Ш №:221 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 5у-132
8Е<Э Ш №:222 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 5у-133
- 13 032985
8Е<4 Ш №:223 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-134
8Е<4 Ш №:224 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-135
8Е<4 Ш №:225 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-136
8Е<4 Ш №:226 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-137
8Е<4 Ш №:227 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-138
8Е<4 Ш №:228 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-139
8Е<4 Ш №:229 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-140
8Е<4 Ш №:230 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-141
8Е<4 Ш№:231 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-142
8Е<4 Ш №:232 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-143
8Е<4 Ш №:233 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-144
8Е<4 Ш №:234 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-145
8Е<4 Ш №:235 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-146
8Е<4 Ш №:236 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-147
8Е<4 Ш №:237 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-148
8Е<4 Ш №:238 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-149
8Е<4 Ш №:239 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-150
8Е<4 Ш №:240 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-151
8Е() Ю №:241 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-152
8Е<4 Ш №:242 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-153
8Е<4 Ш №:243 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-154
8Е<4 Ш №:244 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-155
8Е<4 Ш №:245 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-156
8Е<4 Ш №:246 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-157
8Е<4 Ш №:247 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 5у-158
8Е<4 Ш №:248 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-1
8Е<4 Ш №:249 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-2
8Е<4 Ш №:250 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-3
8Е<4 Ю№:251 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-4
8Е<4 Ш №:252 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-5
8Е<4 Ш №:253 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-6
8Е<4 Ш №:254 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-7
8Е<4 Ш №:255 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-8
8Е<4 Ш №:256 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-9
8Е<4 Ш №:257 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-10
- 14 032985
8Е(/) ГО №:258 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-11
8Е(/) ГО №:259 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-12
8Е(/) ГО №:260 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-13
8Е(/) ГО №:261 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-14
8Е(/) ГО №:262 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-15
8Е(/) ГО №:263 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-16
8Е(/) ГО №:264 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-17
8Е(/) ГО №:265 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-18
8Е(/) ГО №:266 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-19
8 ЕС) ГО №:267 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-20
8Е() ГО №:268 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-21
8Е() ГО №:269 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-22
8Е() ГО №:270 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-23
8Е() ГО №:271 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-24
8Е() ГО №:272 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-25
8Е() ГО №:273 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-26
8Е() ГО №:274 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-27
8Е() ГО №:275 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-28
8Е() ГО №:276 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-29
8Е() ГО №:277 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-30
8Е() ГО №:278 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-31
8Е() ГО №:279 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-32
8Е() ГО №:280 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-33
8Е() ГО №:281 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-34
8Е() ГО №:282 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-35
8Е() ГО №:283 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-36
8Е() ГО №:284 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-37
8Е() ГО №:285 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-38
8Е() ГО №:286 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-39
8Е() ГО №:287 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-40
8Е() ГО №:288 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-41
8Е() ГО №:289 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-42
8Е() ГО №:290 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-43
8Е() ГО№:291 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-44
8Е() ГО №:292 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-45
- 15 032985
8Е<Э Ш№:293 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-46
8Е<Э Ш№:294 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-47
8Е<Э Ю№:295 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-48
8Е<Э Ш№:296 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-49
8Е<Э Ш№:297 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-50
8Е<Э Ю№:298 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-51
8Е<Э Ш№:299 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-52
8Е<Э Ш№:300 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-53
8Е<Э Ш№:301 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-54
8Е<Э Ш№:302 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-55
8Е<Э Ш№:303 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-56
8Е<Э Ш№:304 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-57
8Е<Э Ю№:305 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-58
8Е<Э Ш№:306 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 8у-59
8Е<Э Ш№:307 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-1
8Е<Э Ю№:308 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-2
8Е<Э Ш№:309 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-3
8Е<Э Ш№:310 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-4
8Е<Э Ш№:311 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-5
8Е<Э Ш№:312 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-6
8Е<Э Ш№:313 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-7
8Е<Э Ш№:314 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-8
8Е<Э Ю№:315 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-9
8Е<Э Ю№:316 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-10
8Е<Э Ш№:317 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-11
8Е<Э Ю№:318 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-12
8Е<Э ГО№:319 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-13
8Е<Э Ш№:320 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-14
8Е<Э Ш№:321 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-15
8Е<Э Ш№:322 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-16
8Е<Э Ш№:323 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-17
8Е<Э Ш№:324 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-18
8Е<Э Ю№:325 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-19
8Е<Э Ш№:326 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-20
8Е<Э Ш№:327 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Ес 10у-21
- 16 032985
8Е(/) ГО №:328 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-22
8Е(/) ГО №:329 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-23
8Е(/) ГО №:330 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-24
8Е(/) ГО№:331 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-25
8Е(/) ГО №:332 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-26
8Е(/) ГО №:333 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-27
8Е(/) ГО №:334 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-28
8Е(/) ГО №:335 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-29
8Е(/) ГО №:336 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-30
8Е(/) ГО №:337 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-31
8Е(/) ГО №:338 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-32
8 Ер ГО №:339 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-33
8Е(/) ГО №:340 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-34
8Е(/) ГО №:341 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-35
8Е(/) ГО №:342 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-36
8Е(/) ГО №:343 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-37
8Е(/) ГО №:344 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-38
8Е(/) ГО №:345 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-39
8Е(/) ГО №:346 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-40
8Е(/) ГО №:347 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-41
8Е(/) ГО №:348 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-42
8Е(/) ГО №:349 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-43
8Е(/) ГО №:350 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-44
8Е(/) ГО№:351 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-45
8Е(/) ГО №:352 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-46
8Е(/) ГО №:353 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-47
8Е(/) ГО №:354 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-48
8Е(/) ГО №:355 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-49
8Е(/) ГО №:356 Последовательность аминокислот вставки в вариант фрагмента Гс 10у-50
8Е(/) ГО №:357 Последовательность нуклеотидов праймера
8Е(/) ГО №:358 Последовательность нуклеотидов праймера
8Е(/) ГО №:359 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Гс 5-57
8Е(/) ГО №:360 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Гс 5-64
- 17 032985
8Е(/) Ш №:361 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес 5-66
8Е(/) Ш №:362 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес 5-73
8Е(/) Ш №:363 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес 5-92
8Е(/) Ш №:364 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес 5-96
8Е(/) Ш №:365 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес 5-110
8Е(/) Ш №:366 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес 5-113
8Е(/) Ш №:367 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес Гс-5-69- λΥΙΓ
8Е(/) Ш №:368 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес Ес-5-69- λνΐΥ
8Е(/) Ш №:369 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес Ес-5-106- М4А
8Е(/) Ш №:370 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес Ес-5-106- М4О
8Е(/) Ш №:371 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес Ес-5-106- М4Н
8Е(} Ю №:372 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес Ес-5-106-М41
8Е(/) Ш №:373 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес Ес-5-106-М4Б
8Е(/) Ш №:374 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес Ес-5-106- Μ4Ν
8Е(/) Ш №:375 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес Ес-5-106- М4(/)
8Е(/) Ш №:376 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес Гс-5-106- М48
8Е(/) Ш №:377 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес Ес-5-106- М4Т
8Е(/) Ш №:378 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес
- 18 032985
Ес-5-106- М4У
8Е<Э Ш №:379 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант фрагмента Ес Ес-5-110
8Е<Э Ш №:380 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения антитела Х-5у-8
8Е<Э Ш №:381 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения антитела Х-5у-8
8Е<Э Ш №:382 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения антитела Х-5у-132
8Е<Э Ш №:383 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения антитела Х-5у-132
8Εζ) Ш №:384 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения антитела Х-5у-38
8Е<Э Ш №:385 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения антитела Х-5у-38
8Е<Э Ш №:386 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения антитела Х-5у-91
8Е<Э Ш №:387 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения антитела Х-5у-91
8Е<Э Ш №:388 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения антитела Х-5у-119
8Е<Э Ш №:389 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения антитела Х-5у-119
8Е<Э Ш №:390 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения антитела Х-5у-127
8Е<Э Ш №:391 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения антитела Х-5у-127
8Е<Э Ш №:392 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:393 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э ГО №:394 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:395 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
- 19 032985
8Е<Э ГО №:396 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э ГО №:397 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э ГО №:398 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Еф ГО №:399 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э ГО №:400 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э ГО №:401 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э ГО №:402 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э ГО №:403 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э ГО №:404 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э ГО №:405 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(^ ГО №:406 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э ГО №:407 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э ГО №:408 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э ГО №:409 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э ГО№:410 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э ГО№:411 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э ГО№:412 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э ГО№:413 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида
- 20 032985
Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е() Ш№:414 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е() Ю№:415 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е() Ш№:416 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е() Ш№:417 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е() Ю№:418 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е() Ш№:419 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е() Ш №:420 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е() Ш №:421 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е() Ш №:422 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е() Ш №:423 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е() Ш №:424 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е() Ш №:425 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е() ГО №:426 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е() Ш №:427 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е() Ш №:428 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е() Ш №:429 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по Е1Д8А
8Е() Ш №:430 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по Е1Л8А
- 21 032985
8Е<Э Ш№:431 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:432 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:433 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:434 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:435 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:436 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:437 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:438 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:439 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:440 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:441 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:442 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:443 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:444 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:445 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:446 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:447 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЬ18А
8Е<Э Ш №:448 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида
- 22 032985
Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:449 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:450 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО№:451 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:452 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:453 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:454 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:455 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:456 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:457 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:458 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:459 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:460 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:461 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:462 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:463 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:464 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:465 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Гс с положительным баллом по ЕЫ8А
- 23 032985
8Е<Э Ш №:466 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:467 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:468 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:469 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:470 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:471 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:472 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:473 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:474 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:475 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:476 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:477 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:478 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:479 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:480 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:481 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:482 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е<Э Ш №:483 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида
- 24 032985
Ес с положительным баллом по ЕБ18А
8Е(/) Ш №:484 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) Ш №:485 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) Ш №:486 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) Ш №:487 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) Ш №:488 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) Ш №:489 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) ГО №:490 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) Ш №:491 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) Ш №:492 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) Ш №:493 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) Ш №:494 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) Ш №:495 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) Ш №:496 Последовательность аминокислот пептидной вставки в вариант полипептида Ес с положительным баллом по ЕЫ8А
8Е(/) Ю №:497 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-69-\¥1 Е
8Е(/) Ш №:498 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-69-\¥1 Е
8Е(/) Ш №:499 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-69-\¥1 Υ
8Е(/) Ш№:500 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-69-\¥1 Υ
- 25 032985
8Е<Э ГО№:501 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-106-М4А
8Е<Э ГО№:502 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-106-М4А
8Е<Э ГО№:503 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-Ю6-М4О
8Е<Э ГО№:504 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-Ю6-М4О
8Е<Э ГО№:505 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-106-М4Н
8Е<Э ГО№:506 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-106-М4Н
8Е<Э ГО№:507 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-106-М41
8Е<Э ГО№:508 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-106-М41
8Е<Э ГО№:509 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-106-М4Е
8Е<Э ГО№:510 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-106-М4Е
8Е<Э Ю№:511 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Εε-5-106-Μ4Ν
8Е<Э ГО№:512 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Εε-5-106-Μ4Ν
8Е<Э ГО№:513 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-106-М4(5
8Е<Э ГО№:514 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-106-М4(5
8Е<Э ГО№:515 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-106-М48
8Е<Э ГО№:516 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-106-М48
8Е<Э ГО№:517 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Ес-5-106-М4Т
8Е<Э ГО№:518 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого
- 26 032985
для получения варианта Рс-5-106-М4Т
8Е(} Ю№:519 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Рс-5-106-М4У
8Е<Э Ю№:520 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для получения варианта Рс-5-106-М4У
8Е<Э Ю№:521 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотек Ь1, Б2А. Ь2В, БЗ. Б4 и Ь5
8Е<Э Ю№:522 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотеки Б1
8Е<9 Ш№:523 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотек Б2А апб Ь2В
8Е<Э Ю№:524 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотеки БЗ
8Е<Э Ю№:525 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотеки Б4
8Е<Э Ю№:526 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотеки Б5
8Е<Э Ю№:527 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотек Ь1, Б2А. Ь2В, ЬЗ, Б4 и Ь5
8Е<Э Ю№:528* Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотеки Б1
8Е<Э Ю№:529* Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотеки Б2А
8Е<Э Ю№:530* Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотеки Б2В
8Е<Э Ю№:531* Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотеки БЗ
8Е<Э Ю№:532* Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотеки Б4
8Е<Э Ю№:533* Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотеки Б5
8Е<Э Ю№:534 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотек Ь1, Б2А. Ь2В, ЬЗ, Б4 и Ь5
8Е<Э Ю№:535 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотек Ь1, Б2А. Ь2В, ЬЗ, Б4 и Ь5
- 27 032985
8ЕС ГО №:536 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотеки Б6А
8ЕС ГО№:537# Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотеки Б6В
8ЕС ГО№:538 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для конструирования библиотек Б6А и Ь6В
8ЕС ГО№:539 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для конструирования антителаХ-5-51
8ЕС ГО№:540 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для конструирования антителаХ-5-51
8ЕС ГО№:541 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для конструирования антитела Х-5-69
8ЕС ГО№:542 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для конструирования антителаХ-5-69
8ЕС ГО№:543 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для конструирования антитела Х-5-104
8ЕС ГО№:544 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для конструирования антителаХ-5-104
8ЕС ГО№:545 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для конструирования антитела Х-5-106
8ЕС ГО№:546 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для конструирования антителаХ-5-106
8ЕС ГО№:547 Последовательность нуклеотидов прямого праймера для ПЦР, применяемого для конструирования антитела Х-5-112
8ЕС ГО№:548 Последовательность нуклеотидов обратного праймера для ПЦР, применяемого для конструирования антителаХ-5-112
8ЕС ГО№:549 Последовательность аминокислот 36-41 последовательности 8 ЕС ГО №:1, которые соответствуют аминокислотам 251-256 в схеме нумерации ЕС
8ЕС ГО№:550 Последовательность аминокислот 251-256 в схеме нумерации ЕС во фрагментах Ес, кодируемых библиотекой Б1
8 ЕС ГО№:551 Последовательность аминокислот 92-99 последовательности 8 ЕС ГО №:1, которые соответствуют аминокислотам 307-314 в системе нумерации ЕС
8ЕС ГО№:552 Последовательность аминокислот 307-314 в схеме нумерации ЕС во фрагментах Ес, кодируемых библиотекой Б2А
8ЕС ГО№:553 Последовательность аминокислот 307-314 в схеме нумерации ЕС во
- 28 032985
фрагментах Гс, кодируемых библиотекой Б2В
8Е() Ю№:554 Последовательность аминокислот 213-221 последовательности 8ЕС Ю №:1, которые соответствуют 428-436 в схеме нумерации ЕС
8Е() Ю№:555 Последовательность аминокислот 428-436 в схеме нумерации ЕС во фрагментах Гс, кодируемых библиотекой БЗ
8ЕС Ю№:556 Последовательность аминокислот 68-72 последовательности 8ЕС ГО №:1, которые соответствуют аминокислотам 283-287 в схеме нумерации ЕС
8ЕС Ю№:557 Последовательность аминокислот 283-287 в схеме нумерации ЕС во фрагментах Гс, кодируемых библиотекой Б4
8ЕС Ю№:558 Последовательность аминокислот 169-174 последовательности 8ЕС ГО №:1, которые соответствуют аминокислотам 384-389 в системе нумерации ЕС
8 ЕС Ю№:559 Последовательность аминокислот 384-389 в схеме нумерации ЕС во фрагментах Гс, кодируемых библиотекой Б5
8 ЕС Ю№:560 Последовательность аминокислот 141-147 последовательности 8ЕС ГО №:1, которые соответствуют аминокислотам 356-362 в системе нумерации ЕС
8ЕС Ю№:561 Последовательность аминокислот 356-362 в схеме нумерации ЕС во фрагментах Гс, кодируемых библиотекой Б6А
8ЕС Ю№:562 Последовательность аминокислот 356-362 в схеме нумерации ЕС во фрагментах Гс, кодируемых библиотекой Б6В
8ЕС ГО №:563% Последовательность аминокислот 166 - 178 последовательности 8ЕС ГО №:1, соответствующих аминокислотам 381 - 393 в системе нумерации ЕС
8ЕС ГО №:564% Последовательность аминокислот, соответствующих аминокислотам 381 - 393 в системе нумерации ЕС варианта фрагмента Гс 5-1
8ЕС ГО№:565% Последовательность аминокислот, соответствующих аминокислотам 381 - 393 в системе нумерации ЕС варианта фрагмента Гс 5-1-1
8ЕС ГО №:566% Последовательность аминокислот, соответствующих аминокислотам 381 - 393 в системе нумерации ЕС варианта фрагмента Гс 5-1-2
8ЕС ГО №:567% Последовательность аминокислот, соответствующих аминокислотам 381 - 393 в системе нумерации ЕС варианта фрагмента Гс 5-1-3
8Е() Ю №:568% Последовательность аминокислот, соответствующих аминокислотам 381 - 393 в системе нумерации ЕС варианта фрагмента Гс 5-1-4
8Е() Ю №:569% Последовательность аминокислот, соответствующих аминокислотам 381 - 393 в системе нумерации ЕС варианта фрагмента Гс 5-1-5
8Е() Ю №:570% Последовательность аминокислот, соответствующих аминокислотам 381 - 393 в системе нумерации ЕС варианта фрагмента Гс 5-1-6
8Е() ГО ΝΟ:571% Последовательность аминокислот, соответствующих аминокислотам 381 - 393 в системе нумерации ЕС варианта фрагмента Гс 5-1-7
8ЕС ГО №:572% Последовательность аминокислот, соответствующих аминокислотам 381 - 393 в системе нумерации ЕС варианта фрагмента Гс 5-1-8
8ЕС ГО №:573% Последовательность аминокислот, соответствующих аминокислотам 381 - 393 в системе нумерации ЕС варианта фрагмента Гс 5-1-9
8ЕС ГО №:574% Последовательность аминокислот, соответствующих аминокислотам 381 - 393 в системе нумерации ЕС варианта фрагмента Гс 5-1-10
Подробное описание изобретения
Изменения в терапевтическом белке, которые увеличивают время его полужизни, могут быть полезны, поскольку такие белки можно вводить в меньших дозах и/или с меньшей частотой. В настоящем изобретении предложены варианты полипептидов Ес, содержащие фрагменты Ес, которые связываются с ЕсКп с повышенным сродством и/или активностью связывания при слегка кислой рН, например, при рН 5,0 - 6,0, и плохо связываются с ЕсКп при физиологических рН приблизительно 7,2-7,6. Как продемонстрировано в настоящей заявке, такие варианты полипептидов Ес, содержащие варианты фрагментов Ес, могут иметь большее время полужизни ΐη νΐνο по сравнению с контрольными полипептидами Ес. Пред
- 29 032985 ложены варианты полипептидов Ес, содержащие варианты фрагментов Ес, которые содержат по меньшей мере одну вставку в петлю или рядом с указанной петлей, которые связываются с ЕсЕп с повышенным сродством и/или активностью связывания при рН приблизительно 5-6 по сравнению с контрольными полипептидами Ес, которые отличается только тем, что они не содержат указанной вставки(ок). Также предложены нуклеиновые кислоты, кодирующие белки, содержащие такие варианты фрагментов Ес, и варианты полипептидов Ес, клетки-хозяева, содержащие такие нуклеиновые кислоты, и способы получения вариантов полипептидов Ес и вариантов фрагментов Ес. Также предложены способы увеличения времени полужизни полипептида Ес и способы определения вариантов фрагментов Ес, которые связываются с ЕсЕп с более высоким сродством и/или активностью связывания при рН 5-6 и с более низким или сопоставимым сродством и/или активностью связывания по сравнению с контрольными фрагментами Ес при физиологической рН.
Описываемый в настоящей заявке вариант фрагмента Ес содержит короткие вставки в избранных сайтах петель. ЕсЕп взаимодействует с фрагментом Ес. Домен иммуноглобулина, такой как СН2 или СН3, обладает бочковидной структурой, содержащей части бета-складчатости, чередующиеся с петлями. НникарШет апб Нооб (1989), Λάν. 1ттипо1. 44: 1-63; ^1Шат8 апб Вагс1ау (1988), Апп. Ееу. 1ттипо1. 6: 381-405. Сайты вставок во фрагменте Ес были выбраны в петлях, которые являются частью области, которая вступает в относительно тесный контакт с ЕсЕп, когда она связывается с указанным фрагментом Ес, или в петлях, которые соседствуют с указанными областями. На фиг. 1 показана ленточная диаграмма частей ЕсЕп (сверху) и фрагмента Ес (снизу), и указаны положения выбранных для вставки сайтов в указанном фрагменте Ес.
Как будет показано далее, многие вставки в библиотеке Ь5, обладают желаемыми свойствами повышенного связывания с ЕсЕп при рН 5-6 и низкого связывания с ЕсЕп или его отсутствия при физиологических рН. Другие библиотеки, включая библиотеки Ь1, Ь2В, Ь3 и Ь4 (см. фиг. 1 и 2), не дали на выходе вставок, которые обладали бы желаемыми свойствами, хотя был проведен скрининг примерно такого же количества вариантов. Библиотеки Ь2А, Ь6А и Ь6В дали на выходе некоторые вставки, обладающие желательными свойствами, хотя значения были значительно ниже, чем значения, полученные на основе библиотеки Ь5. Неожиданно, библиотека, которая дала наиболее многочисленные вставки с желаемыми свойствами, т.е. библиотека Ь5, основана на вставках в петлевую область участка, который вступает в наиболее тесный контакт с ЕсЕп. Фиг. 1.
Определения
Термин сродство в настоящей заявке относится к сродству связывания, определяемому по ЕС50, оцениваемому при помощи В1Асоге® Т100 (или аналогичного инструмента), как объяснено в примере 3. Более высокое сродство варианта полипептида Ес (содержащего вариант фрагмента Ес) по сравнению с контрольным полипептидом Ес (содержащим контрольный фрагмент Ес), в отношении ЕсЕп означает, что указанный вариант полипептида Ес обладает такой ЕС50, которая составляет не более 50% от ЕС50 контрольного полипептида Ес. Аналогично, более низкое сродство варианта полипептида Ес по сравнению с контрольным полипептидом Ес означает, что указанный вариант полипептида Ес обладает такой ЕС50, которая составляет более 150% от ЕС50 контрольного полипептида Ес. Сродство варианта полипептида Ес считается по существу таким же, как у контрольного полипептида Ес, если его ЕС50 попадает в диапазон 50%-150% от ЕС50 контрольного полипептида Ес.
Термин активность связывания в настоящей заявке относится к активности связывания полипептида Ес с ЕсЕп, измеряемой при помощи биосенсоров на основе стрептавидина, покрытых биотинилированным ЕсЕп человека (йЕсЕп) в системе Ос1е1 Ееб®, как описано в примере 4, где связывание происходит при рН 6, а диссоциация происходит при рН 7,4. Активность связывания варианта полипептида Ес при рН 6 считается выше, чем активность контрольного полипептида Ес, если максимальная наблюдаемая реакция по меньшей мере в 1,5, 1,75 или 2,0 раза больше максимальной наблюдаемой реакции для контрольного полипептида Ес. Очень маленькую реакцию остаточного связывания, т.е., реакцию связывания, которая остается после того, как большинство молекул белка диссоциировало от ЙЕсЕп при рН 7,4, наблюдаемую при применении контрольного полипептида Ес, содержащего фрагмент Ес дикого типа, называют низкой активностью связывания или отсутствием связывания. Также считается, что вариант полипептида Ес обладает низкой активностью связывания или связывание отсутствует при рН 7,4, если реакция остаточного связывания, выявляемая после того как некоторые или все молекулы белка диссоциировали при рН 7,4, не превышает 0,2 или 0,1 нанометров по сравнению с реакцией, выявляемой при применении контрольного полипептида Ес при помощи системы ЕойеВю, как описано в примере 4.
Термин аминокислота в настоящей заявке относится к любой из двадцати Ь-аминокислот, обычно обнаруживаемых в составе белков человека, которые включают следующие: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глутамин, глутаминовая кислота, глицин, гистидин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, триптофан, тирозин и валин.
Термин антитело в настоящей заявке относится к белку, содержащему по меньшей мере вариабельную область тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина. Например, 5сН' - молекула, содержащая две или более 5сН'. и доменные антитела, содержащие по существу единственную вариабельную область
- 30 032985 иммуноглобулина (как описано, например, в Патенте США 7 563 443) являются антителами согласно определению, данному в настоящей заявке. Во многих случаях антитело включает вариабельную область тяжелых и легких цепей плюс область 1дС человека. Таким образом, термин антитело охватывает полноразмерные антитела, содержащие две полноразмерные тяжелые цепи и две полноразмерные легкие цепи, такие как существующие в природе антитела - 1дС. 1дА, Ι§Ό, Ι§ϋ или 1дМ, обнаруживаемые у млекопитающих (Сагауаппорои1о8 апб Сарга, СН. 9 в книге Еипбатеп!а1 1ттипо1оду, 3гб еб., Раи1, еб., Кауеп Ргекк, Ыете Уотк, 1993, рр. 284-286); причем части указанной публикации, в которой описываются антитела, включены в настоящую заявку посредством ссылки. Примеры антител включают адалимумаб (ХУМИРА®, АЬЬо!! ЬаЬога1ог1е8), инфликсимаб (РЕМИКЕЙД®, Сеп!осог ОпНо Вю1есН 1пс.), устекинумаб (СТЕЛАРА®, Сеп!осог), голимумаб (СИМПОНИ®, Сеп!осог ОпНо Вю!есй), канакинумаб (ИЛАРИС®, ИоуагИк РНагтсеиОсаЕ Сотротайоп), офатумумаб (АРЗЕРРА®, С1ахо Сгоир Ь!б.), тоцилизумаб (АКТЕМРА®, СНида 8е1уаки КаЬи8Ык1 Согр., Япония), белимумаб (БЕНЛИСТА®, ЛИМФОСТАТ-В®, Нитап Сепоте Заепсек, 1пс.), бевацизумаб (АВАСТИН®, Сепеп!есН), цетуксимаб (ЭРБИТУКС®, 1тС1опе ЗуЛепъ 1пс.), эфунгумаб (МИКОГРАБ®, Ыоуаг1щ АВ Согр.), эфализумаб (РАПТИВА®, СепеШесН 1пс.), этарацизумаб (АБЕГРИН®, Меб1ттипе ЬЕС), гемтузумаб озогамицин (МИЛОТАРГ®, ^уе!й), гирентуксимаб (РЕНКАРЕКС®, \Убех АС Согр., Германия), натализумаб (ТИСАБРИ®, Е1ап РНагтсеиОсаИ 1пс.), омализумаб (КСОЛАР®, Ыоуаг1щ АС Согр., Швейцария), ореговомаб (ОВАРЕКС®, АИаКех Согр., Канада), паливизумаб (СИНАГИС®, АББОСИНАГИС®, Меб1ттипе 1пс.), панитумумаб (ВЕКТИБИКС®, Атдеп 1пс.), ранибизумаб (ЛУЦЕНТИС®, Сепеп1есН 1пс.), ритуксимаб (МАБТЕРА®, РИТУКСАН®, 1бее РНагтасеиОсаЕ Согр.), тефибазумаб (АУРЕКСИС®, 'ЧпЫЬНех Согр.), тозитумомаб (БЕКСАР®, С1ахо8тННКНпе ВеесНат Согр.), трастузумаб (ГЕРЦЕПТИН®, СепеШесН 1пс.) и денозумаб (ПРОЛИА® или ИКСГЕВА®, Атдеп 1пс.), среди многих других. Такие антитела 1дС могут быть изотипа 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4 и могут быть химерными, антителами человека или гуманизированными антителами. Кроме того, термин антитело включает димерные антитела, содержащие две тяжелые цепи и две легкие цепи, такие как существующие в природе антитела, обнаруживаемые у верблюда, других видов верблюдовых и у акул. См., например, Миу1бегтапк е! а1., 2001, 1. Вю!есНпо1. 74:277-302; Эе5ту1ег е! а1., 2001, 1. Вю1. СНет. 276:26285-90; 8!ге1!§оу е! а1. (2005), Рго!ет 8с1епсе 14: 2901-2909. Антитело может быть моноспецифичным (то есть, связывающееся только с одним типом антигена) или мультиспецифичным (то есть, связывающееся более чем с одним антигеном). Согласно некоторым вариантам реализации антитело может быть биспецифичным (т.е., связывающееся с антигенами двух разных типов). Кроме того, антитело может быть одновалентным, двухвалентным или мультивалентным, что означает, что оно может связываться с одной или более чем одной молекулой антигена одновременно. Некоторые из возможных форм таких антител включают моноспецифичные или биспецифичные полноразмерные антитела, моноспецифичные моновалентные антитела (которые описаны в Заявке на международный патент XVО 2009/089004 и заявке на патент США 2007/0105199, значимые части которых включены в настоящую заявку посредством ссылки, и в Заявке на патент США 2005/0227324, значимые части которой включены в настоящую заявку посредством ссылки), которые могут ингибировать или активировать молекулу, с которой они связываются, двухвалентные моноспецифичные или биспецифичные димеры Εν-Ес, ксЕу-Ес или диатело Ес, моноспецифичные одновалентные ксЕу-Ес/Ес'к и мультиспецифичные связывающие белки и иммуноглобулины с двойным вариабельным доменом, описанные в Публикации США 2009/0311253 (значимые части которой включены в настоящую заявку посредством ссылки), среди многих других возможных форм антител.
Термин связывающая область в настоящей заявке относится к области, включенной в полипептид Ес, контрольный полипептид Ес или вариант полипептида Ес, которые описаны в настоящей заявке, которая связывается с молекулой-мишенью, такой как, например, белок, экспрессируемый в большом количестве в раковых клетках, клетке, обусловливающей аутоиммунное или воспалительное патологическое состояние, инфицированной клетке, у возбудителя инфекции, или в клетке, опосредующей иммунную эффекторную функцию, например, в естественных киллерах. Связывающая область может содержать вариабельную область тяжелой и/или легкой цепи иммуноглобулина (УН и/или У) или полипептид - не-иммуноглобулин. Примеры связывающих областей включают, например, Еу (который содержит области УН и Уь соединенные линкером) или растворимую форму рецептора человека, который связывается с молекулой-мишенью.
Термин фрагмент Ес в настоящей заявке относится к полипептиду, который содержит часть или всю шарнирную область, а также области СН2 и СН3 антитела, а также, необязательно, области, обнаруживаемые ниже области СН3 в некоторых существующих в природе изотипах антител, таких как 1дА или 1дМ. Указанное антитело может представлять собой антитело изотипа 1дС, включая изотипы 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4, или изотипов 1дМ, 1дЕ, Ι§Ό или 1дА. Указанное антитело может происходить из организма человека или животного. Например, антитело может быть получено из организма млекопитающего, такого как мышь, крыса, хомяк, кролик, коза или овца, или из организма видов верблюдовых или акулы. Последовательности фрагментов Ес 1дС1,
1дС2, 1дС3 и 1дС4 человека раскрываются под номерами 8ЕС ΙΌ №: 1, 3, 5 и 7, соответственно.
- 31 032985
Указанные последовательности также показаны в табл. 1 ниже. Как правило, фрагменты Ес образуют димеры посредством взаимодействия между доменами Сн3 в пределах двух фрагментов Ес, которые стабилизированы дисульфидными связями, возникающими между остатками цистеина в шарнирных областях. Фрагмент Ес, в настоящей заявке обозначаемый как область Ес, специфически обозначает димерный фрагмент Ес, хотя следует понимать, что фрагменты Ес будут в большинстве случаев димеризоваться при физиологических условиях. Димеры могут диссоциировать при сильных восстановительных условиях.
В настоящей заявке термин полипептид Ес относится к белку, который содержит фрагмент Ес и связывающую область. Полипептиды Ес включают антитела, гибридные белки Ес, и антитела или гибридные белки, которые содержат дополнительный фармакологически активный фрагмент, который является компонентом непептидной органической природы (т.е., малая молекула) или пептидом, который может действовать как токсин и/или может имитировать, противодействовать или усиливать активность биологического пути, ковалентно связанный или соединенный с указанным полипептидом Ес. Полипептиды Ес, такие как фрагменты Ес, обычно образуют димеры, которые стабилизированы дисульфидными связями, возникающими между остатками цистеина в шарнирных областях двух полипептидов Ес.
Термин контрольный фрагмент Ес в настоящей заявке относится к фрагменту Ес, который тождественен варианту полипептида Ес, с которым его предполагается сравнивать, за исключением того, что у него нет вставки в петле, которая есть в варианте фрагмента Ес. Таким образом, контрольный фрагмент Ес обладает немодифицированной последовательностью, обнаруживаемой в существующем в природе фрагменте Ес, в петле, в которой у варианта фрагмента Ес находится вставка, повышающая сродство указанного варианта Ес в ЕсЯи при рн 5 или 6. Контрольный фрагмент Ес может содержать модификации по сравнению с существующим в природе фрагментом Ес, помимо указанной вставки(ок). Например, как в варианте фрагмента Ес, так и в контрольном фрагменте Ес, с которым его планируется сравнивать, могут присутствовать изменения гетеродимеризации или другие незначительные модификации, описанные ниже. Следовательно, единственным различием между контрольным фрагментом Ес и вариантом фрагмента Ес является вставка в петле или рядом с указанной петлей в указанном варианте фрагмента Ес. Под контрольной областью Ес понимают димер, содержащий два контрольных фрагмента Ес, хотя, как правило, можно ожидать, что контрольный фрагмент Ес может существовать в димерной форме.
Термин вариант фрагмента Ес в настоящей заявке относится к фрагменту Ес, который содержит вставку, состоящую из не более 80, не более 60, не более 40 или не более 20 аминокислот в петле фрагмента Ес или рядом с указанной петлей. Петли во фрагменте Ес 1дС показаны в табл. 1, а петли, в которые были введены вставки, показаны на фиг. 2. В технике известны петли в других фрагментах Ес. В технике известен целый ряд последовательностей, см., например, КаЬа! с1 а1., 8сс.|испсс5 οί РгсИеиъ οί 1ттипо1ощса1 1п1сгс51. РнЬКс неаИй 8егуюе N.1.4.. Вс111С5ба. ΜΌ, 1991, части которой относятся к последовательностям и четвертичной структуре шарнирных областей, областей Сн2 и Сн3, и которая включена в настоящую заявку посредством ссылки. У КаЬа! е1 а1., представлено выравнивание целого ряда последовательностей. Учитывая выравнивание, предложенное КаЬа! е! а1., высоко консервативную структуру доменов иммуноглобулинов, и локализацию петель, предложенных в настоящей заявке, а также обильную дополнительную информацию, имеющуюся в технике, можно заключить, что петли могут быть локализованы во фрагменте Ес любого изотипа из любого вида. Например, интернет-сайт Банка белковых структур содержит обильную информацию о четвертичной структуре многих белков. Согласно некоторым вариантам реализации вставленные аминокислоты могут заменять собой от одной до десяти аминокислот, которые в указанной петле существуют в природе. Аминокислот во вставке может быть меньше, больше или столько же, сколько аминокислот было делетировано. Согласно другим вариантам реализации все аминокислоты, исходно присутствующие в петле, остаются, и вставляемые аминокислоты просто добавляются. Согласно некоторым вариантам реализации вариант фрагмента Ес 1дС человека может содержать другие дополнительные незначительные модификации, т.е. вставку, делецию или замену не более чем шестнадцати аминокислот в локализации, отличной от той петли, в которой присутствует указанная вставка. Согласно некоторым вариантам реализации может быть не более чем 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 вставок, делеций или замен одиночных аминокислот в локализации, отличной от той петли, в которой присутствует указанная вставка. Согласно другим вариантам реализации вариант фрагмента Ес не содержит никаких дополнительных незначительных модификаций. Согласно некоторым вариантам реализации указанными дополнительными незначительными модификациями могут быть, например, изменения гетеродимеризации, описанные ниже, которые облегчают образование гетеродимерных областей Ес. Согласно некоторым вариантам реализации указанные дополнительные незначительные модификации могут включать консервативные замены аминокислот.
Консервативные замены аминокислот включают следующие: (1) валин, лейцин или изолейцин для аланина; (2) лизин, глутамин или аспарагин для аргинина; (3) глутамин, глутамат или аспартат для аспарагина; (4) глутамат, аспарагин или глутамин для аспартата; (5) серин или треонин для цистеина; (6) аспарагин, глутамат или аспартат для глутамина; (7) аспартат, глутамин или аспарагин для глутамата; (8)
- 32 032985 пролин или аланин для глицина; (9) аспарагин, глутамин, лизин или аргинин для гистидина; (10) лейцин, валин, метионин, аланин или фенилаланин дя изолейцина; (11) изолейцин, валин, метионин, аланин или фенилаланин для лейцина; (12) аргинин, аспарагин или глутамин для лизина; (13) лейцин, фенилаланин или изолейцин для метионина; (14) лейцин, валин, изолейцин, аланин или тирозин для фенилаланина; (15) аланин для пролина; (16) треонин, аланин или цистеин для серина; (17) лейцин, валин, изолейцин, аланин или тирозин для фенилаланина; (15) аланин для пролина; (16) треонин, аланин или цистеин для серина; (17) серин для треонина; (18) тирозин или фенилаланин для триптофана; (19) триптофан, фенилаланин, треонин или серин для тирозина; и (20) изолейцин, метионин, лейцин, фенилаланин или аланин для валина.
Кроме того, согласно некоторым вариантам реализации вариант фрагмента Ес может содержать дополнительный фармакологически активный компонент, который является компонентом непептидной органической природы (т.е., малая молекула) или пептидом, который может действовать как токсин и/или может имитировать, противодействовать или усиливать активность биологического пути, ковалентно связанный или соединенный с указанным полипептидом Ес. Если вариант фрагмента Ес содержит такой фармакологически активный компонент, то его контрольный фрагмент Ес также содержит такой компонент.
Согласно другим вариантам реализации указанный вариант фрагмента Ес 1дС человека не содержит изменений помимо изменений, присутствующих в петле, в которой присутствует указанная вставка. Как и фрагмент Ес, вариант фрагмента Ес может быть изотипа 1дС. включая изотипы 1дС 1, 1дО2, 1дО3 или 1дО4, или изотипа 1дМ, 1дЕ, Ι§Ό или 1дА. Он может происходить из организма человека или животных. Например, фрагмент Ес может быть получен из организма млекопитающего, такого как мышь, крыса, хомяк, кролик, коза или овца, или из организма видов верблюдовых или акулы, которые могут быть модифицированы для получения варианта фрагмента Ес. Как и в случае других фрагментов Ес, вариант фрагмента Ес в норме димерный, а термин вариант фрагмента Ес специфически обозначает димерный вариант фрагмента Ес.
В настоящей заявке вариант полипептида Ес содержит вариант фрагмента Ес и связывающую область. Необязательно вариант полипептида Ес может содержать несколько связывающих областей. Вариант полипептида Ес может быть мультимером, таким как димер, тример, тетрамер или мультимер более высокого порядка. Во многих случаях вариант фрагмента Ес как часть полипептида Ес может образовывать дисульфидные связи, что ведет к димеризации. Вариант полипептида Ес, например, включает димерные гибридные белки Ес, тетрамерные полноразмерные антитела (содержащие две тяжелых и две легких цепи), димерные зсЕу-Ес'з и т.д.. Они могут быть гетеромультимерами или гомомультимерами, такими как гетеродимеры или гомодимеры. Вариант полипептида Ес может быть антителом, гибридным белком Ес или, согласно некоторым вариантам реализации, антителом или гибридным белком Ес, содержащим дополнительный фармакологически активный компонент, не являющийся антителом. Такой фармакологически активный компонент может быть ковалентно связан или соединен с полипептидом Ес, а может быть непептидным органическим компонентом (т.е., малой молекулой) или пептидом, который может действовать как токсин и/или может имитировать, противодействовать или усиливать активность биологического пути.
В настоящей заявке термин гибридный белок Ес относится к белку, содержащему фрагмент Ес, присоединенный к другому полипептиду, не являющемуся антителом. Указанный полипептид, не являющийся антителом, содержит связывающую область, которая связывается с молекулой-мишенью и не содержит вариабельных областей тяжелой или легкой цепи антитела. Связывающая область гибридного белка Ес может содержать полипептид, не являющийся антителом, такой как растворимая часть рецептора, или один или более пептидов, которые связываются с молекулой-мишенью (например, такие как мономерный домен согласно определению в Патенте США 7 820 790, которые связываются с белкоммишенью, который можно выбрать, как обсуждается в Патенте США 7 820 790), или другие полипептиды. Части Патента США 7 820 790, в котором описаны мономерные домены и то, как их выбирают, включены в настоящую заявку посредством ссылки. Согласно специфическим вариантам реализации гибридным белком Ес может быть этанерцепт (ЭНБРЕЛ®, коммерчески доступный у Атдеп 1пс.), ромиплостим (ЭНПЛЕЙТ®, коммерчески доступный у Атдеп 1пс.), абатацепт (ОРЕНСИА®, коммерчески доступный у Βτίδΐοΐ -Муегз 8дшЬЬ), рилонацепт (АРКАЛИСТ®, коммерчески доступный у Кедепегоп) или афлиберцепт (ЭЙЛЕА™, коммерчески доступный у Кедепегоп). Другие полипептиды, которые могут быть частью связывающей области гибридного белка Ес, включают полипептиды, содержащие каркасные домены, которые были созданы случайным образом в определенных положениях и подверглись отбору по признаку связывания с определенной молекулой-мишенью. Такие каркасные домены включают, например, ассоциированный с Т-лимфоцитами белок-4 (СТЬА-4; №Ша11 е1 а1. (1999), Рго1еш8 36: 217-227), Ζ-домен белка-1 стафилококка (Νοτά е1 а1. (1995), Рго1еш Епд. 8: 601-608), зеленый флуоресцентный белок и десятый домен III типа фибронектина человека (ΕΝ3; Ко1бе е1 а/. (1998), 1. Мо1. Βίο1. 284: 1141-1151; Ката1ап е! а1. (2004), Сйет. & Βίο1. 11: 835-844). Части указанных ссылок, в которых описаны каркасные домены и их применение при генерировании связывающих доменов, включены в на
- 33 032985 стоящую заявку посредством ссылки. Гибридные белки Ес, как и другие белки, содержащие фрагменты Ес, могут образовывать мультимеры, которые могут быть димерами. Указанные мультимеры могут быть гетеродимерами или гомодимерами. И могут быть биспецифичными или моноспецифичными.
В настоящей заявке термин вариант гибридного белка Ес относится к гибридному белку Ес, который включает вариант фрагмента Ес.
В настоящей заявке термин контрольный гибридный белок Ес относится к гибридному белку Ес, который обладает последовательностью аминокислот, схожей с последовательностью варианта гибридного белка Ес, с которым его предполагается сравнивать, за исключением вставки в петлю части фрагмента Ес указанного варианта гибридного белка Ес.
В настоящей заявке термин полноразмерное антитело 1дС относится к антителу 1дС. содержащему две полные тяжелые цепи и две полные легкие цепи.
Термин изменения гетеродимеризации, как правило, обозначает изменения в двух цепях, т.е. в цепях А и В, димерной области Ес, которые облегчают образование гетеродимерных областей Ес, то есть областей Ес, в которых указанная цепь А и указанная цепь В области Ес не содержат идентичных последовательностей аминокислот. Изменения гетеродимеризации могут быть симметричными, то есть, цепь А, в которой присутствует определенное изменение, может образовывать пару с цепью В, в которой присутствует другое изменение. Указанные изменения облегчают гетеродимеризацию и не благоприятствуют гомодимеризации. Оценить, образуются ли гетеродимеры или гомодимеры, можно по величине различий, определяемых при помощи электрофореза в полиакриламидном геле в тех ситуациях, когда одна полипептидная цепь является фрагментом Ес (то есть, отсутствие последовательностей, отличных от шарнирных областей, областей Сн2 и Сн3), а другая - ксЕу-Ес. Одним примером таких парных изменений гетеродимеризации является так называемые замены выступы и впадины. См., например, Патент США 7 695 936 и Публикацию заявки на Патент США 2003/0078385, части которых, где описаны такие мутации, включены в настоящую заявку посредством ссылки. В настоящей заявке подразумевается, что область Ес, которая содержит одну пару замен выступа и впадины, содержит одну замену во фрагменте Ес (обозначаемом цепью А), а вторую пару замен в другом фрагменте Ес (обозначаемом цепью В). Например, было показано, что следующие замены выступов и впадин в цепях А и В области Ес 1дС1 усиливают образование гетеродимеров по сравнению с их образованием в немодифицированных цепях А и В: 1) Υ407Τ в одной цепи и Τ366Υ в другой цепи; 2) Υ407Α в одной цепи и Т366А в другой; 3) Е405А в одной цепи и Τ394\ν в другой; 4) Е405А в одной цепи и Τ3948 в другой; 5) Υ407Τ в одной цепи и Τ366Υ в другой; 6) Τ366Υ и Е405А в одной цепи, и Τ394ν и Υ407Τ в другой; 7) Τ366ν и Е405V в одной цепи, и Τ3948 и Υ407Α в другой; 8) Е405V и Υ407Α в одной цепи, и Τ366ν и Τ3948 в другой; и 9) Τ366ν в одном полипептиде Ес и Τ3668, Б368А и Υ407ν в другом. В настоящей заявке подразумевается, что мутации обозначаются следующим образом. После аминокислоты (в соответствии с однобуквенным кодом), обычно присутствующей в данном положении во фрагменте Ес согласно системе нумерации ЕС (см. табл. 1 ниже), идет номер положения по ЕС, а затем замещающая аминокислота, которая присутствует в данном положении. Например, Υ407Τ означает, что тирозин, обычно присутствующий в положении 407 по ЕС, заменен на треонин. В качестве альтернативы или в дополнение к таким изменениям, образование гетеродимеров может облегчаться при заменах, образующих новые дисульфидные мостики. См., например, Публикацию заявки на Патент США 2003/0078385, части которой, где описаны такие мутации, включены в настоящую заявку посредством ссылки. Такие изменения в области Ес 1дС1 включают, например, следующие замены: Υ349С в одной цепи фрагмента Ес и 8354С в другой; Υ349С в одной цепи фрагмента Ес и Е356С в другой; Υ349С в одной цепи фрагмента Ес и Е357С в другой; Б351С в одной цепи фрагмента Ес и 8354С в другой; Т394С в одной цепи фрагмента Ес и Е397С в другой; или О399С в одной цепи Фрагмента Ес и К392С в другой. Аналогично замены, приводящие к изменению заряда в одном или более остатках, на поверхности Сн3 и Сн3, могут усиливать образование гетеродимеров, как объясняется в νθ 2009/089004, части которой, где описаны такие замены, включены в настоящую заявку посредством ссылки. Такие замены в настоящей заявке называются замены пар зарядов, и область Ес, содержащая одну пару замен пар зарядов содержит одну замену в цепи А, а вторую замену в цепи В. Общие примеры пар зарядов включают следующие: 1) Κ409Ό или К409Е в одной цепи плюс Ό399Κ или Ό399Κ в другой; 2) Κ392Ό или К392Е в одной цепи плюс Ό399Κ или Ό399Κ в другой; 3) Κ439Ό или К439Е в одной цепи плюс Ό356Κ или Ό356Κ в другой; и 4) Κ370Ό или К370Е в одной цепи плюс Е357К или Е357К в другой. Кроме того, замены Κ355Ό, К355Е, Κ360Ό или К360К в обеих цепях могут стабилизировать гетеродимеры, когда их применяют с другими изменениями гетеродимеризации. Специфические замены пар зарядов можно применять либо одни, либо с другими заменами пар зарядов. Специфические примеры отдельных пар замен пар зарядов и их сочетаний включают: 1) К409Е в одной цепи плюс Ό399Κ в другой; 2) К409Е в одной цепи плюс Ό399Κ в другой; 3) Κ409Ό в одной цепи плюс Ό399Κ в другой; 4) Κ409Ό в одной цепи плюс Ό399Κ в другой; 5) К392Е в одной цепи плюс Ό399Κ в другой; 6) К392Е в одной цепи плюс Ό399Κ в другой; 7) Κ392Ό в одной цепи плюс Ό399Κ в другой; 8) Κ392Ό в одной цепи плюс Ό399Κ в другой; 9) Κ409Ό и Κ360Ό в одной цепи плюс Ό399Κ и Е356К в другой; 10) Κ409Ό и Κ370Ό в одной цепи плюс Ό399Κ и Е357К в другой; 11) Κ409Ό и Κ392Ό в одной цепи плюс Ό399Κ, Е356К, и Е357К в другой; 12) Κ409Ό и Κ392Ό в одной цепи и Ό399Κ в другой; 13) Κ409Ό и
- 34 032985
Κ392Ό в одной цепи плюс Ό399Κ и Е356К в другой; 14) Κ409Ό и Κ392Ό в одной цепи плюс Ό399Κ и Ό357Κ в другой; 15) Κ409Ό и Κ370Ό в одной цепи плюс Ό399Κ и Ό357Κ в другой; 16) Ό399Κ в одной цепи плюс Κ409Ό и Κ360Ό в другой; и 17) Κ409Ό и Κ439Ό в одной цепи плюс Ό399Κ и Е356К в другой. Любые из указанных изменений гетеродимеризации могут быть частью варианта области Ес, который описан в настоящей заявке, которая может связываться с ЕсЕп с более высоким сродством, чем контрольная область Ес.
В настоящей заявке термин петля относится к части четвертичной структуры фрагмента Ес, которая связывает бета-нити, которые образуют бета-складчатости основной укладки цепи иммуноглобулина. Петля может содержать не более двух идущих подряд остатков, которым приписывают участие в образовании бета-складчатости (как в петлях 10 и 11; см. табл. 1 ниже), а также могут содержать остатки, которым приписывают участие в образовании спирали, витка, изолированного β -мостика или сгиба. Области петель областей Ес 1дС человека, подразумеваемые в настоящей заявке, показаны в табл. 1.
Вставка в петле или в каком-либо интервале аминокислот, например, вставка в петле 10, обозначает вставку из 3-35, 3-20, 6-20, 6-15, 6-12, 3-15, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот между двумя соседними аминокислотами в петле или между аминокислотой в петле и соседней аминокислотой, которая не является частью петли. Термин вставка в петле также включает варианты, когда аминокислоты делетированы из петли, а другие аминокислоты вставлены в данную петлю. Количество аминокислот, вставленных в петлю, может быть 3-35, 3-22, 4-20, 6-18, 6-15, 6-12, 3-15, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот, а количество аминокислот, делетированных из петли, может быть меньше, такое же или больше, чем количество аминокислот, вставленных в данную петлю. Например, из петли могут быть делетированы 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот. Кроме того, термин вставка в петле включает варианты реализации, в которых в одной и той же петле существует более одной вставки, такие как вставки между двумя разными парами аминокислот, которые находятся в петле или по соседству с ней, как описано выше, или в которых одна или более соседних аминокислот в петле делетированы и заменены меньшим, таким же или большим количеством аминокислоты, чем количество делетированных. Одним из примеров такой схемы является библиотека Ь3 (как показано на фиг. 2).
Вставка в петлю или рядом с указанной петлей сходна со вставкой в петлю, определение которой дано выше, за исключением того, что она также включает варианты, в которых вставка присутствует между первой аминокислотой, которая соседствует с петлей, и второй аминокислотой, которая соседствует с указанной первой аминокислотой и находится за пределами петли.
В настоящей заявке термин физиологическая рН относится к рН приблизительно 7,2 -7,6.
ксЕу-Ес/Ес представляет собой димерный белок, состоящий по существу из ксЕу-Ес плюс фрагмент Ес, которые связаны друг с другом дисульфидными связями. Кроме того, область Ес, образованная указанным фрагментом Ес и ксЕу-Ес, может содержать изменения гетеродимеризации в доменах СН3, такие как одна, две, три или более пар изменений пар зарядов, как было описано.
В настоящей заявке термин пептид относится к короткому полипептиду. Как правило, пептид состоит из от 2 до 80, от 2 до 60, от 2 до 50, от 2 до 40, от 2 до 30, от 2 до 20 аминокислот.
В настоящей заявке термин молекула-мишень относится к молекуле, с которой связывается связывающая область полипептида Ес, описываемая в настоящей заявке. Согласно некоторым вариантам реализации молекулой-мишенью является, например, белок, который экспрессируется в больших количествах в раковой клетке или экспрессируется в клетке, опосредующей аутоиммунное или воспалительное заболевание, или в инфицированной клетке, в возбудителе инфекции или в клетке, опосредующей иммунную эффекторную функцию, например в естественных киллерах.
Под терапевтически эффективным количеством варианта полипептида Ес, который обладает более высоким сродством к ЕсЕп, чем контрольный полипептид Ес, описываемый в настоящей заявке, понимают количество, которое оказывает действие, например, снижающее или устраняющее опухолевую нагрузку у пациента с раком или снижающее или устраняющее симптомы любого патологического состояния, для лечения которого применяют указанный белок. Терапевтически эффективное количество не должно полностью устранять все симптомы патологического состояния, а может уменьшать тяжесть одного или более симптомов или отсрочивать начало более серьезных симптомов или более серьезного заболевания, которое может возникать с некоторой частотой после лечения патологического состояния. В качестве альтернативы терапевтически эффективного количества белка, содержащего модифицированный полипептид Ес, достаточно, чтобы заметно повлиять на экспрессию значимого биомаркера, когда его вводят пациенту, нуждающемуся в лечении, ίη νίνο.
Термин лечение любого заболевания, упоминаемого в настоящей заявке, включает облегчение по меньшей мере одного симптома заболевания, уменьшение тяжести указанного заболевания или отсрочку или предупреждение прогрессирования заболевания до более серьезных симптомов, которые могут в некоторых случаях сопровождать заболевание или приводить по меньшей мере в другому заболеванию. Лечение не обязательно означает, что заболевание полностью будет излечено. Подходящий терапевтический агент нужен только, чтобы уменьшить тяжесть заболевания, уменьшить тяжесть одного или более симптомов, ассоциированных с заболеванием или его лечением, или отсрочить начало более серьезных симптомов или более серьезного заболевания, которое может возникать с определенной частотой после
- 35 032985 лечения патологического состояния.
Варианты полипептидов Ге
Предложены варианты полипептидов Ес, которые при рН от 5,0 до 6,0 связываются с ЕсЯп с более высоким сродством и/или активностью связывания, чем контрольные полипептиды Ес. Такие варианты полипептидов Ес, как и контрольные полипептиды Ес, связываются с ЕсЯп с низким сродством и/или активностью связывания, если вообще связываются, при рН приблизительно от 7,2 до приблизительно 7,6. Указанные варианты полипептидов Ес могут (до модифицирования) происходить из организма человека или животных, и могут быть изотипа 1дС. включая 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4. Указанный ЕсЯп также может происходить из организма человека или животных. Указанные варианты полипептидов Ес также содержат связывающую область, которая может связываться с молекулой-мишенью, которая описана в настоящей заявке, и их можно применять для лечения патологического состояния, которое обусловлено, по меньшей мере частично, указанной молекулой-мишенью. Согласно некоторым вариантам реализации указанная молекула-мишень может напрямую опосредовать патологическое состояние, которое лечат, но связывание с молекулой-мишенью может служить для локализации полипептида Ес или молекул(ы)-мишени(ей), с которой он связывается. Например, биспецифичный полипептид Ес может связывать два разных типа клеток, например, раковую клетку и клетку иммунной системы, каждая из которых экспрессирует на своей поверхности молекулу-мишень, с которой может связываться указанный полипептид Ес. Указанные варианты полипептида Ес могут быть антителами или гибридными белками Ес, содержащими вариант фрагмента Ес. Кроме того, вариант полипептида Ес может быть антителом, которое содержит дополнительную, происходящую не из антитела, связывающую область. Необязательно вариант полипептида Ес может содержать вариант фрагмента Ес 1дС человека.
В табл. 1 ниже выровнены последовательности аминокислот полипептидов Ес 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4 человека (8ЕО ГО №: 1,3,5 и 7, соответственно). Последовательности пронумерованы согласно системе ЕС, предложенной в Е6е1тап е1 а1. (1969), Ргос. №111. Асаб. 8ск 63: 78-85, значимые части которой включены в настоящую заявку посредством ссылки. Как показано в табл. 1 единичное число может применяться для обозначения положения, которое аналогично во всех четырех изотипах 1дС человека, даже несмотря на то, что линейная схема нумерации может заставить кого-либо присвоить другое число данному положению в каждом изотипе. Например, аспарагин в положении 297 является хорошо известным и высоко консервативным сайтом гликозилирования, присутствующим во всех антителах человека типа 1дС, который называют аспарагин 297, независимо от изотипа 1дС человека, который рассматривают.
Антитела 1дС3 человека обладают значительно более длинной шарнирной областью, чем у других изотипов 1дС человека, и в табл. 1 показана часть, расположенная на С-конце.
Последовательности 1дС1, 1дС2 и 1дС4, показанные в табл. 1, включают всю шарнирную область. Как видно из табл. 1, шарнирная область антитела 1дС4 человека на три аминокислоты короче, чем шарнирная область антитела 1дС1. Шарнирная область антител 1дС2 немного короче, и присутствует пропуск величиной одна аминокислота рядом с Ν-концом области СН2 по сравнению с 1дС1. Аминокислоты 216-447, показанные в строке 1дС1, и аминокислоты 224-447 в строке 1дС4 Таблицы 1, соответствуют аминокислотам 1-232 8ЕО ΙΌ №: 1 и 6-229 8ЕО ΙΌ №: 7, соответственно. Аминокислоты 216-447 в строке 1дС3 табл. 1 соответствуют аминокислотам 48-279 8ЕО ΙΌ №: 5. Аминокислоты 237-447 в строке 1дС2 табл. 1 соответствуют аминокислотам 18-228 8ЕО ГО №: 3.
В табл. 1 аминокислоты, которые расположены в петлях, как подразумевается в настоящей заявке, показаны жирным шрифтом и подчеркнуты. Каждая петля отмечена с указанием номера, т.е., Петля 1, Петля 2, и т.д., под ними. Более конкретно, петли присутствуют в следующих локализациях: Петля 1, аминокислоты 29-43 8ЕО ΙΌ №: 1, аминокислоты 25-39 8ЕО ΙΌ №: 3, аминокислоты 76-90 8ЕО ΙΌ №: 5 и аминокислоты 26-40 8ЕО ΙΌ №: 7; Петля 2, аминокислоты 50-58 8ЕО ΙΌ №: 1, аминокислоты 46-54 8ЕО ГО №: 3, аминокислоты 97-105 8ЕО ГО №: 5 и аминокислоты 47-55 8ЕО ГО №: 7; Петля 3, аминокислоты 70-72 8ЕО ГО №: 1, аминокислоты 66-68 8ЕО ГО №: 3, аминокислоты 117-119 8ЕО ГО №: 5 и аминокислоты 67-69 8ЕО ГО №: 7; Петля 4, аминокислоты 80-84 8ЕО ГО №: 1, аминокислоты 76-80 8ЕО ГО №: 3, аминокислоты 127-131 8ЕО ГО №: 5 и аминокислоты 77-81 8ЕО ГО №: 7; Петля 5, аминокислоты 92-103 8ЕО ГО №: 1, аминокислоты 88-99 8ЕО ГО №: 3, аминокислоты 139-150 8ЕО ГО №: 5 и аминокислоты 89100 8ЕО ГО №: 7; Петля 6, аминокислоты 110-116 8ЕО ГО №: 1, аминокислоты 106-112 8ЕО ГО №: 3, аминокислоты 157-163 8ЕО ГО №: 5 и аминокислоты 107-113 8ЕО ГО №: 7; Петля 7, аминокислоты 122131 8ЕО ГО ΝΟ: 1, аминокислоты 118-127 8ЕО ГО №: 3, аминокислоты 169-178 8ЕО ГО №: 5 и аминокислоты 119-128 8ЕО ГО №: 7; Петля 8, аминокислоты 137-146 8ЕО ГО №: 1, аминокислоты 133-142 8ЕО ГО №: 3, аминокислоты 184-193 8ЕО ГО №: 5 и аминокислоты 134-143 8ЕО ГО №: 7; Петля 9, аминокислоты 158-162 8ЕО ГО №: 1, аминокислоты 154-158 8ЕО ГО №: 3, аминокислоты 205-209 8ЕО ГО №: 5 и аминокислоты 155-159 8ЕО ГО №: 7; Петля 10, аминокислоты 169-175 8ЕО ГО №: 1, аминокислоты 165-171 8ЕО ГО №: 3, аминокислоты 216-222 8ЕО ГО №: 5 и аминокислоты 166-172 8ЕО ГО №: 7; Петля 11, аминокислоты 179-188 8ЕО ГО №: 1, аминокислоты 175-184 8ЕО ГО №: 3, аминокислоты 226-235 8ЕО ГО №: 5 и аминокислоты 176-185 8ЕО ГО №: 7; Петля 12, аминокислоты 199-207 8ЕО ГО №: 1, аминокислоты 195-203 8ЕО ГО №: 3, аминокислоты 246-254 8ЕО ГО №: 5 и аминокислоты 196-204 8ЕО ГО №: 7; Петля 13, аминокислоты 214-221 8ЕО ГО №: 1, аминокислоты 210-217 8ЕО ГО №: 3, аминокислоты 261-268
- 36 032985
8ΕΡ ΙΌ №: 5 и аминокислоты 211-218 8ΕΡ ГО №: 7.
Таблица 1. Выравнивание областей Ес 1дО человека (выравнивание раскрывает 8ΕΡ ГО №: 1 и 3, остатки 48-279 8ΕΡ ГО №: 5, и 8ΕΡ ГО №: 7, соответственно, по порядку)
225 235 245 255 265 275
1дС1 ЕРКЗСРКТНТСРРСРАРЕЪЬ66Р8УГЪГРРКРКРТ1|М15ВТРЕУТСУУУРУ5НЕРРЕУКГ
1дС2 ЕРЖССУЕ---СРРСРАРРУА-6Р5УГЬЕРРКРКРТЕМ18КТРЕУТСУУУРУ8НЕРРЕУ0Е
1дСЗ ЕРКЗСРТР Р РС РКС РАРЕ Ъ ЬССР 5УЕЪ ЕРРКРКРТЬМ!5КТРЕУТ СУУУРУ5НЕ РРЕУО Е
1дС4 Ε5ΚΥ6---РРСР5СРАРЕГЬСдР8УГЪЕРРКРКРТЬМ13КТРЕУТСУУУРУ30ЕРРЕУ0Г
Р55Р 3 38 3 8 338 ЕЕЕЕЕ ННННН ТТЗ ЕЕЕЕЕЕ ТТ ЕЕ
285 295 305 Петля 1 315 325 Петля 2 335
* * * * * *
1дС1 ЫИУУРСУЕУНЫАКТКРКЕЕОУЫ8ТУКУУ8УЪТУЕНОРИЪК6КЕУКСКУ5ЫКАЪРАР1ЕКТ
1дС2 ЫТОУУР(ЗМЕУНЫАКТКРНЕЕОГ№ТЕКУУ8УЪТУУНОРИЕЫ6КЕУКСКУЗИКСЪРАР1ЕКТ
1дСЗ КИУУРетЕУНЫАКТКРКЕЕОУЫЗТЕКУУЗУЪТУЕНОРИЪКеКЕУКСКУЗЫКАЪРАРТЕКТ
I дС4 ЫИУУРСУЕУНЫАКТКРКЕЕОЕиВТУКУУЗУЪТУЪНОРИЕЫдКЕУКСКУЗККбЪРЗЗΙΕΚΤ
Ό33Ρ ЕЕЕЕТТЕЕЕ Έ* Τ'Τ'Έ* Έ* Τ'Τ' ннннннт ЕЕЕЕЕЕ ТТЗЗЗ ЕЕЕЕ
Петля 3 Петля 4 Петля 5 Петля 6
345 355 365 375 385 395
* * * * * *
1дС1 18КАКС0РКЕР0УУТЪРР8КРЕЪТКН0УЗЪТСЪУКСЕУРЗР1АУЕИЕЗЫ60РЕЫМУКТТР
1дС2 13КТКбдРКЕР0УУТЪРР5ВЕЕМТКМ0УЗЪТСЪУКСЕУР5Р1АУЕИЕЗМБ0РЕЫНУКТТР
1дСЗ 15КТКддРКЕР0УУТЪРР8ВЕЕМТКМ0УЗЪТСЪУКСЕУР5Р1АУЕИЕ3360РЕЫНУЫТТР
1дС4 13КАКе0РКЕР0УУТЪРРЗаЕЕМТКН0УЗЪТСЪУКСЕУР5Р1АУЕЩЕЗЫ50РЕЫЦУКТТР
Р55Р Е В ЕЕЕЕЕ ССССС35ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕВ53 Τ' Τ'ΈΙГПГТ1 Ρι Ρι Р* Р< Γι X 1 Ρι Ρι Р< Р< Ρι
Петля 7 Петля 8 Петля 9 Петля 10
405 415 425 435 445
* * * * *
1дС1 РУЬРЗРбЗЕЕЪУЗКЬТУРКЗВИОабИУЕЗСБУМНЕАЪНКНУТОКЯТ.ЯТ.ЯРСК 1дС2 РМЬРЗРбЗЕЕЪУБКЬТУРКЗВИООбИУЕЯСЯУМНЕаЪНКНУТОКЯТ.ЯТ.ЯРПК 1дСЗ РМЬРЗРСЗЕЕЪУ8КЪТУРКЗКИ006Н1ЕЗС£УМНЕАЬНЫКЕТ0КЗЪЗЪЗРСК 1дС4 РУЬР5Р65ЕГЪУ5КЪТУРКЗКН0ЕеНУЕ5С5УМНЕАЬНКНУТ0К8Ъ8ЬЯЪСК РЗЗР ЕЕ ТТЗ ЕЕЕЕЕЕЕЕЕЕНННННТТ ЕЕЕЕЕЕ ТТЗбЕЕ ЕЕЕЕЕ 3
Петля 11 Петля 12 Петля 13
Отметки в пятой строке каждой выровненной группы, обозначенные 'ГО88Р (что означает Словарь вторичной структуры белков) были взяты из структуры 1Н2Н (цепь Н), доступной в Банке данных о белках, и имеют следующие значения: О означает виток спирали из 3 аминокислот (310-спираль), которая имеет длину как минимум 3 остатка; Н означает виток спирали из 4 аминокислот (а-спираль), которая имеет длину как минимум 4 остатка; I означает виток спирали из 5 аминокислот (π-спираль), которая имеет длину как минимум 5 остатков; Т означает виток, соединенный водородными связями (спираль 3, 4 или 5); Е означает вытянутую нить в параллельной или антипараллельной конформации β-складчатости, минимальная длина которой 2 остатка; В означает остаток в изолированном β-мостике (образование одной пары водородных связей в (β-складчатости); 8 означает изгиб (обозначение, основанное только на отсутствии водородных связей). Остатки аминокислот, которые не находятся ни в одной из перечисленных выше конформаций, обозначены пустым местом в строке 'ГО88Р. Указанные обозначения являются стандартными в технике и доступны на интернет-сайте Банка данных о белках (РЭВ).
Шарнирная область Рс фрагментов 1дО человека простирается с аминокислоты 216 до 230 согласно нумерации, приведенной в табл. 1. Область СН2 простирается от аминокислоты 231 до 340, а область СН3 простирается от аминокислоты 341 до 447. Из выравнивания в табл. 1 видно, что последовательности фрагментов Ес 1дО человека высоко консервативны. Большинство различий в последовательностях присутствует в шарнирной области, и очень мало различий в последовательностях присутствует в областях СН2 и СН3. Таким образом, результаты, полученные с применением вариантов полипептидов Ес, содержащих варианты фрагментов Ес 1дО, содержащих вставки в область СН2 или Сн3, одного подтипа 1дО человека, по-видимому, будут применимы к другим подтипам 1дО человека.
Вставки в варианты полипептидов Ес 1дО человека, описанные в настоящей заявке, могут присутствовать в локализациях, которые, как известно, являются петлями. Указанные вставки могут присутствовать в любой петле 1-13 (как показано в табл. 1 выше) части фрагмента Ес указанного полипептида Ес
- 37 032985 или вблизи них. Согласно некоторым вариантам реализации между двумя соседними аминокислотами, по меньшей мере одна из которых включена в петлю фрагмента Рс, можно сделать вставку из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16, или 1-18, 6-16, 10-16, 12-14, 3-20, 20-30, 30-50 или 50-80 аминокислот. Согласно некоторым вариантам реализации во вставку неслучайным образом включают два цистеина, каждый в первые и последние четыре аминокислоты указанной вставки, чтобы ограничить аминокислоты между цистеинами в плотной петле, связанной дисульфидной связью. Согласно некоторым вариантам реализации первыми тремя аминокислотами вставки являются О1у-О1у-Суз, а последними тремя аминокислотами являются Суз-О1у-О1у. Между двумя цистеинами можно вводить дополнительную вставку из 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 10-30 аминокислот. Согласно некоторым другим вариантам реализации из указанной петли делетируют 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот и заменяют их вставкой из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16, или 1-18, 6-16, 10-16, 12-14, 15-30, 30-50 или 50-80 аминокислот и/или вставкой, которая сдержит два цистеина среди первых и последних четырех аминокислот вставки. Количество делетированных аминокислот может быть таким же, может быть меньше или больше, чем количество вставляемых аминокислот. Согласно другим вариантам реализации в одной петле может присутствовать более одной вставки. Варианты полипептидов Рс, которые содержат указанные вставки, могут связываться с РсКп человека с более высоким сродством при рН 5-6, чем связывается контрольный полипептид Рс. Вставляемые аминокислоты могут включать любые из всех 20 аминокислот или любые из всех аминокислот кроме цистеина. Кроме того, вариант фрагмента Рс может содержать вставку в любой петле или более чем одной петле, например, в 2, 3 или 4 петлях.
Вставки в петли 5, 8 или 10 фрагмента Рс или вблизи указанных петель могут приводить к повышению сродства связывания такого варианта фрагмента Рс с РсКп человека при рН 5-6. Согласно специфическим вариантам реализации вставку можно вводить во фрагмент Рс 1§О человека в петлю 8 или вблизи нее между аминокислотами 358 и 359, или в петлю 10 или вблизи нее между аминокислотами 384 и 385 (согласно схеме нумерации, проиллюстрированной в табл. 1). Указанная вставка может содержать 4-20, 1-18, 6-16, 10-16, 2-14, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 аминокислот. Необязательно, указанные аминокислоты могут ограничиваться всеми аминокислотами кроме цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации указанная вставка может содержать цистеин среди первых четырех и последних четырех аминокислот вставки, и вводимые в составе вставки аминокислоты могут в ином случае быть ограничены всеми аминокислотами кроме цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации указанная вставка может не содержать цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации указанная вставка может отвечать формуле, выбранной из группы, состоящей из:
СХХХХХХС (8Е() ГО №:13),
СХХХХХХХС (8ЕР ГО №:14), СХХХХХХХХС (8ЕО ГО №:15), ОСХХХХХХСО (8ЕО ГО №:16), 6СХХХХХХХСО (ЪЕС ГО №: 17), 6СХХХХХХХХСО (8ЕО ГО №: 18), О6СХХХХХХСОО (8ЕЩ ГО №:19), О6СХХХХХХХСОО (8ЕО ГО №:20) и О6СХХХХХХХХСОО (8ЕО ГО №:21), ОО6СХХХХХХСООО (ВЕЩЕ ГО №:22), ОО6СХХХХХХХСООО (8ЕО ГО №:23) и ОО6СХХХХХХХХСООО (ЪЕС ГО №:24), где X обозначает любую аминокислоту за исключением цистеина. Поскольку реальная вставка получена в результате процесса скрининга, который описан в примерах ниже, в наблюдаемых изменениях свойств фрагмента Рс преобладающую роль играют случайные аминокислоты. По этой причине предполагается, что вариант фрагмента Рс, содержащий только выбранные случайным образом части вставок, которые, как и описанные выше, содержат некоторые неслучайные аминокислоты, также могут обладать желаемыми свойствами. Примеры такой последовательности включают средние шесть аминокислот из последовательностей 8Еф ГО №: 41-53, которые показаны под номерами 8Еф ГО №: 54-66.
Согласно другому варианту реализации аминокислоты 308 и 309 (согласно нумерации ЕС, которая показана в табл. 1) в петле 5 или рядом с указанной петлей делетированы и заменены 4-20, 1-18, 6-16, 1016, 12-14, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 15-20, 20-40, 40-60 или 60-80 аминокислотами, которые могут ограничиваться всеми аминокислотами, кроме цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации указанная вставка может содержать цистеин среди первых и последних четырех аминокислот вставки, и вводимые аминокислоты могут в остальной части ограничиваться всеми аминокислотами кроме цистеина. Указанная вставка может соответствовать формуле, выбираемой из группы, состоящей из последовательностей 8Еф ГО №: 13-24.
Указанные фрагменты Рс, также как и полипептиды Рс, которые их содержат, содержащие вставки аминокислот, описанные выше и ниже, могут связываться с РсКп человека при рН 5-6 с более высоким сродством и/или активностью связывания, чем контрольный фрагмент Рс, и могут связываться с РсКп человека при физиологических рН со сродством и/или активностью связывания, сопоставимым или ниже, чем сродство или связывающая активность контрольных фрагментов Рс. Кроме того, указанные варианты фрагментов Рс могут быть изменены дополнительно, и могут проходить скрининг на изменения, которые придают еще более высокое сродство и/или активность связывания с РсКп человека при рН 5-6,
- 38 032985 более низкое сродство и/или активность связывания к ЕсРп человека при физиологических рН, или другие желаемые свойства, такие как стабильность при хранении. В Примерах, приводимых ниже, показано, что вставки конкретных последовательностей аминокислот (например, 8Е0 ΙΌ №: 41-66 и 90-246) в определенных сайтах во фрагменте Ес эффективны в отношении повышения сродства и/или активности связывания фрагмента Ес при связывании с ЕсРп человека при рН 5-6.
Варианты полипептидов Ес, содержащие варианты фрагментов Ес 1дС человека, также содержат связывающую область, которая связывается с молекулой-мишенью. Связывание таких вариантов полипептидов Ес с молекулой-мишенью может модулировать, необязательно противодействовать или способствовать, биологическую активность указанной молекулы-мишени и/или может служить для локализации указанного полипептида Ес там, где экспрессируется указанная молекула-мишень. Полипептид Ес может содержать более одной связывающей области, например, две, три или четыре связывающих области в полипептиде Ес. Поскольку полипептид Ес может мультимеризоваться, образуя в некоторых случаях димеры, тримеры или тетрамеры, мультимеризация разных полипептидов Ес может приводить к образованию мультимерных полипептидов Ес, которые связываются более чем с одной молекулоймишенью. Если в одном полипептиде Ес присутствуют множественные связывающие области, они могут связываться с одной и той же или разными молекулами-мишенями или частями молекулы-мишени. Модуляция активности молекулы-мишени может влиять на течение заболевания или патологического состояния, которое обусловлено, по меньшей мере частично, указанной молекулой-мишенью. Варианты полипептидов Ес 1дС человека могут содержать связывающую область, которая включает одну или более вариабельных областей антитела, которые связываются с одной или более молекулами-мишенями. Такие варианты полипептидов Ес 1дС человека могут, например, быть полноразмерным антителом, таким как антитела человека, гуманизированные или химерные антитела типа 1дС, зсЕс-Еу'з, одновалентными формами антител, такими как антитела, описанные в международной Заявке на патент \УО 2005/063816 и в Заявке на Патент США 2007/0105199 (значимые части которых включены а настоящую заявку посредством ссылки), которые содержат димерную область Ес, а также УН, СН1, Уь, Сь и шарнирные области. Описаны дополнительные формы, например, на фиг. 2 Заявки на патент США 2010/0286374, который включен в настоящую заявку посредством ссылки вместе с текстом, где описана Фигура 2, или где дана на нее ссылка, и в Патенте США 5 837 821, в котором описаны миниантитела, содержащие зсЕу, связанный с областью Ес. Части Патента США 5 837821, в которых описаны миниантитела, включены в настоящую заявку посредством ссылки. В качестве альтернативы связывающая область может содержать весь или часть белка, не являющегося антителом, необязательно белка человека, который связывается с указанной молекулой-мишенью. Например, связывающая область может содержать внеклеточный участок рецептора, такой, например, как внеклеточная область рецептора фактора некроза опухоли человека р75 (8ЕО ΙΌ №: 13) ассоциированного с Т-лимфоцитами белка-4 человека (СТЬА4) (8ЕО ΙΌ №: 14).
Указанная связывающая область может содержать одни или более пептидов, которые связываются с молекулой-мишенью (например, такие как мономерный домен, как описан в Патенте США 7 820 790, который связывается с белком-мишенью, который можно выбрать, как описано в Патенте США 7 820 790) или другие пептиды. Части Патента США 7 820 790, в которых описаны мономерные домены, и то, как их выбирать, включены в настоящую заявку посредством ссылки. Одним примером такого пептида является связывающий участок гибридного белка Ес ромиплостима (ЭНПЛЕЙТ®, Атдеп 1пс., Тысяча дубов, Калифорния). Инструкция по применению препарата, ЭНПЛЕЙТ®, Атдеп 1пс., 2008-2011. Другие полипептиды, которые могут быть частью связывающей области гибридного белка Ес, включают полипептиды, содержащие каркасные области, которые были случайным образом помещены в определенных положениях и подверглись отбору в зависимости от связывания с определенной молекулоймишенью. Такие каркасные домены включают например, СТЬА-4 (№Ша11 е! а1. (1999), РгсЛепъ 36: 217227), Ζ-домен белка стафилококка 1 (Νοτά е! а1. (1995), Рго1еш Епд. 8: 601-608), зеленый флуоресцентный белок и десятый домен III типа фибронектина человека (ΚΝ3; ΚοίΥ е! а1. (1998), 1. Μο1. Βίο1. 284: 11411151; Кага!апе1а1. (2004), СНет. & Βίο1. 11: 835-844). Части указанных ссылок, в которых описаны каркасные домены и их применение при генерировании связывающих доменов, включены в настоящую заявку посредством ссылки.
Молекула-мишень, с которой связывается связывающая область, может быть молекулой, для которой модуляция биологической активности молекулы может влиять на течение заболевания или патологического состояния, или может быть молекулой, локализованной в пораженной заболеванием области, например, белок, экспрессируемый на поверхности раковых клеток. При аутоиммунном или воспалительном заболевании молекулой-мишенью может быть молекула, действующая в пути, который играет определенную роль, опосредуя патологическое состояние. Молекулой-мишенью может быть молекула, которая локализована таким образом, что связывание полипептида Ес с данной молекулой-мишенью будет размещать его в пространстве должным образом, так, что это может влиять на течение заболевания. Например, если полипептид Ес содержит токсин, размещение его вблизи раковых клеток посредством связывающей области, которая связывается с белком, экспрессируемым в большом количестве на поверхности раковых клеток, может давать определенное преимущество. Молекулы-мишени включают,
- 39 032985 например, общие классы белков, такие как растворимые лиганды, лиганды, связанные с рецепторами, растворимые рецепторы, мембраносвязанные рецепторы, белки - мембранные каналы, растворимые и мембраносвязанные белки и небелковые антигены, включая внеклеточные и внутриклеточные молекулымишени. Примеры молекул-мишеней включают без ограничений следующие белки человека: фактор некроза опухоли, рецептор фактора некроза опухоли, интерлейкин-1, интерлейкин-6 (1Ь-6), рецептор 1Ь6, ί.Ό80/86. СЭ20. СЭ33. СЭ52. интерлейкин-12, интерлейкин-23, интерлейкин-17, НЕК2, неу-рецептор НЕК2, рецептор эпидермального фактора роста (ЕОЕК), фактор роста эндотелия сосудов (УЕ6Е), фактор, активирующий В-лимфоциты (ВАРЕ), лиганд КАЯК, ОК51Е2, клаудины, СЭН3, СЭ22, факторы комплемента и склеростин, среди многих других.
Частично в зависимости от клетки-хозяина, в которой вырабатывается вариант полипептида Ес, и/или применяемых способов очистки, вариант полипептида Ес может дополнительно содержать дополнительные последовательности аминокислот, такие как, например, сигнальная последовательность, облегчающая секрецию в клетках эукариот (которая удаляется у зрелых форм белка), метионин на Ν-конце для облегчения трансляции у бактерий, и/или метки последовательности (например, полигистидиновая метка или метка ЕЬАС® для облегчения очистки или идентификации белка.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие библиотеки вариантов фрагментов Ре
В настоящей заявке также описаны библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих фрагменты Ес, содержащие вставки, которые по меньшей мере частично выбраны случайным образом, которые присутствуют в петлях указанных фрагментов Ес или вблизи петель. На фиг. 2 проиллюстрирована форма каждой из восьми библиотек, которые были сделаны, как описано ниже в примерах. Последовательности указанных библиотек и последовательности аминокислот, кодируемых ими, раскрываются в последовательностях 8ЕЦ ГО №: 25-40. Такие библиотеки полезны для пэннинга с целью отбора отдельных нуклеиновых кислот, которые кодируют варианты фрагментов Ес 1дС человека, связывающиеся с повышенным сродством с ЕсКи при рН 5,0-6,0 по сравнению с контрольным фрагментом Ес. Такие варианты полипептидов Ес 1дС человека также могут связываться с ЕсКи плохо, в случае связывания, при рН 7,2 7,6, аналогично контрольному фрагменту Ес.
Согласно некоторым вариантам реализации указанные библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих фрагменты Ес, со вставками в областях, кодирующих области петель (как те, что указаны в табл. 1), могут происходить из организма человека или животного, включая нуклеиновые кислоты, кодирующие фрагменты Ес мыши, крысы, кролика или обезьяны или фрагменты Ес из организма видов верблюдовых. Согласно некоторым вариантам реализации кодируемый фрагмент Ес может быть фрагментом Ес 1дО, таким как фрагмент Ес 1д61, 1§С2, 1дС3 или 1дС4 или фрагментом Ес изотипа 1дА, 1дЕ, 1§ϋ или 1дМ. Вставки в части нуклеиновых кислот, кодирующие петли, могут быть в пределах или вблизи последовательностей нуклеотидов, кодирующих петлю 1, петлю 2, петлю 3, петлю 4, петлю 5, петлю 6, петлю 7, петлю 8, петлю 9, петлю 10, петлю 11, петлю 12 или петлю 13, которые показаны в табл. 1.
Важным фактором является размер библиотеки по сравнению с количеством разных вариантов в указанной библиотеке. В лучшем случае процедура пэннинга, которой подвергают библиотеку, будет давать высокую вероятность включения разных вариантов, которые включены в указанную библиотеку. Количество разных вариантов в библиотеке зависит от количества выбранных случайным образом положений в библиотеке и от количества разных аминокислот, которые можно применять в каждом выбранном случайным образом положении. Например, библиотека, которая содержит шесть выбираемых случайным образом положений, которые могут содержать 19 разных аминокислот, теоретически может включать 19б=4,7х107 разных вариантов. Если, например, 109 независимых фагов или бактерий, экспрессирующих указанные варианты, подвергнуть пэннингу, будет очень высокая вероятность того, что все изоляты со свойствами, по которым проводят скрининг, будут восстановлены. См., например, Сгокктаи аиб Тигиег, МаШетайск Рог 1йе Вю1одюа1 Заеисек, Сйар!ег 2, 8ес!юи 2.9, рр. 97-104, МастШаи РиЬНкйШд Со., 1ис., Νον Уогк аиб СоШег МастШаи РиЬйкйегк, Ьоибои, 1974, который включен в настоящую заявку посредством ссылки. Предполагаются библиотеки такого размера, который делает возможным скрининг достаточного количества изолятов для выявления редких изолятов с желаемыми свойствами. Таким образом, подразумеваются библиотеки, кодирующие от 105 - 1013, 10б - 1012 или 107 - 1010 разных вариантов.
Преимуществом могут обладать библиотеки с полученными случайным образом вставками в последовательностях нуклеотидов, кодирующих петли 5, 8 и 10 фрагмента Ес или вблизи таких последовательностей. Такие библиотеки могут кодировать фрагменты Ес со вставками в петлях 5, 8 или 10 или вблизи них, которые содержат 20-40, 4-20, 1-18, 6-16, 10-16, 12-14, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16 выбранных случайным образом аминокислот. Указанные выбранные случайным образом аминокислоты могут быть фланкированы остатками цистеина. Согласно некоторым вариантам реализации до или после выбранных случайным образом аминокислот могут быть вставлены дополнительные неслучайные аминокислоты. Согласно некоторым вариантам реализации перед кодируемыми выбранными случайным образом аминокислотами могут идти С1у-С1у-Сук, а после них - Сук-С1у-С1у.
- 40 032985
Нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты полипептидов Ее, фрагментов Ее и вставок
Также описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие специфические варианты фрагментов Ес, которые могут быть частью варианта полипептида Ес, и нуклеиновые кислоты, кодирующие вставки в петлях или рядом с указанными петлями вариантов фрагментов Ес. Последовательности нуклеотидов, кодирующие фрагменты Ес, известны в технике (см., например, КаЬа! е! а1., 8ес.|иепсе5 о£ РгсИепъ οί 1ттипо1ощса1 1п!еге8!, РнЬКс ИеаНН 8егу1се Ν.ΙΉ., ВеШекба, ΜΌ, 1991), а последовательности, кодирующие фрагменты Ес 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4 (8ЕО ΙΌ №: 2,4, 6 и 8, соответственно) описаны в настоящей заявке. Локализация петель во фрагментах Ес изображена в табл. 1, и в настоящей заявке описаны разные формы вставок в указанные области. Также приводятся последовательности, кодирующие вставки аминокислот, которые усиливают связывание с ЕсКп при рн 5 - 6 (см., например, 8ЕО ΙΌ №: 41-53).
В более общем смысле в настоящей заявке описаны нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант фрагмента Ес, содержащий вставку в петле или рядом с указанной петлей, причем указанный фрагмент Ес может при рн 5-6 связываться с ЕсКп человека с более высоким сродством, чем контрольный фрагмент Ес. Положения, в которых присутствуют такие вставки, включают петли 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 в указанном полипептиде Ес.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты полипептидов Ес, можно применять для получения вариантов полипептидов Ес путем введения нуклеиновых кислот в клетки-хозяева, включая клетки прокариот или эукариот, и культивирования клеток при таких условиях, чтобы экспрессировался белок(ки), кодируемый указанными нуклеиновыми кислотами. Вариант полипептида Ес можно восстанавливать из массы клеток или надосадочной жидкости культуры. Такие полипептиды можно очистить при помощи способов, хорошо известных в технике, например, аффинная хроматография с белком А или белком С, эксклюзионная хроматография, ионообменная хроматография и хроматография с гидрофобным взаимодействием, среди других доступных способов.
Способы выделения и получения вариантов фрагментов Ес и полипептидов Ес
Варианты фрагментов Ес можно выделять посредством способов скрининга, описанных подробно в разделе Примеры ниже. В общих чертах, получают библиотеку нуклеиновых кислот, кодирующих фрагменты Ес со вставками, содержащими случайно выбранные аминокислоты, в петле или рядом с указанной петлей. Затем указанную библиотеку вводят в вирус или клетку, которые культивируют при таких условиях, чтобы указанные нуклеиновые кислоты из библиотеки могли экспрессироваться, чтобы вирус (который, например, может быть бакуловирусом или нитевидным фагом) мог представить фрагменты Ес, содержащие указанные вставки. Согласно альтернативному варианту реализации библиотеку можно транслировать ίη уКго в системе рибосомного дисплея так, чтобы фрагменты Ес с желаемыми свойствами, и кодирующие их нуклеиновые кислоты, можно было отобрать из указанной смеси. В качестве альтернативы, можно применять систему дисплея С18. См., например, Обед пр е! а1. (2004), Ргос. №!1. Асаб. 8с1. 101(9): 2806-2810, значимые части которого включены в настоящую заявку посредством ссылки. Согласно способам настоящего изобретения варианты фрагментов Ес, которые могут связываться с ЕсКп человека с более высоким сродством, чем контрольный фрагмент Ес в диапазоне рн от 5 до 6, могут быть обогащены посредством пэннинга с ЕсКп, как описано в примерах ниже, и можно провести скрининг, например, путем применения твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬ18А), который можно сначала проводить для групп изолятов или для одного изолята. Если ЕЬ18А сначала проводят для группы изолятов, указанные изоляты можно амплифицировать и проводить повторный скрининг индивидуально, чтобы получить отдельные изоляты, экспрессирующие вариант фрагмента Ес с повышенным сродством к ЕсКп человека при рн 5-6 и с более низким или приблизительно таким же сродством к ЕсКп человека при физиологических рн по сравнению с контрольным фрагментом Ес.
На последующих этапах нуклеиновые кислоты, кодирующие варианты фрагментов Ес, можно выделить из фага или клеток, таких как клетки бактерий, дрожжей или млекопитающих, или амплифицировать из РНК в случае рибосомного дисплея. Указанные нуклеиновые кислоты можно секвенировать, чтобы определить точное положение и природу вставки. На основании данной информации можно сконструировать нуклеиновые кислоты, кодирующие желаемый вариант полипептида Ес или вариант фрагмента Ес, при помощи способов, хорошо известных в области техники. Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариант фрагмента Ес или полипептида Ес можно подвергнуть дополнительным модификациям, в случае необходимости.
Такие нуклеиновые кислоты можно встраивать в векторы, подходящие для клетки-хозяина, в которой полипептид Ес или фрагмент Ес будет экспрессироваться. Указанные нуклеиновые кислоты можно вводить в клетки-хозяева при помощи любого из способов, хорошо известных в технике. Подходящие для применения клетки-хозяева включают бактерии, включая ЕхсйепсЫа со11, дрожжи, включая 8ассйаготусек сегеуыае или РкЫа раз1ог15, клетки насекомых, клетки растений и клетки млекопитающих, включая клетки яичника китайского хомячка (СНО), клетки 293 и клетки почек новорожденного хомячка (ВНК), среди многих других. Указанные клетки-хозяева можно культивировать в условиях, при которых введенные нуклеиновые кислоты экспрессируются, и можно восстановить указанный полипептид Ес или фрагмент Ес из надосадочной жидкости культуры или массы клеток.
В целом, процедура, применяемая для введения указанных нуклеиновых кислот в клетки-хозяева,
- 41 032985 может зависеть от клетки-хозяина, в которую планируется вводить нуклеиновые кислоты. Способы введения нуклеиновых кислот в бактерии хорошо известны в области техники. Например, обычно применяют электропорацию или трансформацию с применением хлорида кальция. Способы введения нуклеиновых кислот в клетки дрожжей хорошо известны в технике и включают, например, способы трансформации с применением ацетата лития и полиэтиленгликоля. Способы введения гетерологичных полинуклеотидов в клетки млекопитающих хорошо известны в технике и включают без ограничений опосредуемую декстраном трансфекцию, осаждение при помощи фосфата кальция, полибрен-опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, инкапсуляцию полинуклеотида(ов) в липосомы и прямую микроинъекцию ДНК в ядра.
Векторы экспрессии, применяемые в любых клетках-хозяевах, должны содержать последовательности для сохранения плазмид для клонирования и экспрессии эндогенных последовательностей нуклеотидов. Такие последовательности, как правило, включают одну или более из следующих последовательностей нуклеотидов: промотор, одну или более последовательностей энхансеров, точку начала репликации, последовательность терминации транскрипции, полную последовательность интронов, включая донорные и акцепторные сайты сплайсинга, последовательность, кодирующую лидерную последовательность для секреции полипептида, сайт связывания с рибосомой, последовательность полиаденилирования, полилинкерную область для вставки нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, который должен экспрессироваться, и элемент селектируемого маркера.
Терапевтическое применение вариантов полипептидов Ге
Варианты полипептидов Ес, описанные в настоящей заявке, можно применять в качестве лекарственных средств у человека при целом ряде патологических состояний. То, какой вариант полипептида Ес подходит для лечения конкретного патологического состояния, можно определить по связывающей(им) области(ям) указанного полипептида Ес, а также другим возможным особенностям его структуры, таким как, например, присоединенный токсический компонент. Варианты полипептидов Ес могут обладать увеличенным временем полужизни ίη νίνο по сравнению с контрольными полипептидами Ес и, следовательно, могут требовать введения в более низких дозах и/или с меньшей частотой, чем введение контрольных полипептидов Ес. Таким образом, варианты полипептидов Ес могли бы подойти для лечения хронических патологических состояний, при которых особенно желательно более редкое введение препаратов. Однако вариант полипептида Ес можно применять в качестве средства лечения большинства или всех патологических состояний, для лечения которых можно применять контрольный полипептид Ес (который содержит такую же последовательность аминокислот, что и указанный вариант полипептида Ес, за исключением того, что он не содержит вставку в петле). Варианты полипептидов Ес, описанные в настоящей заявке, также можно применять одновременно с другими лекарственными препаратами, применяемыми при лечении патологического состояния, которое требуется лечить.
Например, гибридный белок Ес, который является вариантом полипептида Ес, содержащим вставку в петлю, можно применять в качестве средства от тех же патологических состояний, что и контрольный полипептид Ес. Однако объем дозы и/или частота введения указанного варианта полипептида Ес могут отличаться благодаря увеличенному времени полужизни. Например, можно получить вариант полипептида Ес на основе терапевтического гибридного белка Ес, такого как этанерцепт (который показан при умеренном и тяжелом ревматоидном артрите, многосуставном ювенильном идиопатическом антрите, псориатическом артрите, анкилозирующем спондилите и умеренном и тяжелом бляшечном псориазе) или ромиплостим (который показан при хронической иммунной тромбоцитопенической пурпуре), посредством введения одной или более вставок, которые усиливают связывание с ЕсКп, которые раскрываются в настоящей заявке, например, 8Е0 ГО №: 41-53, в петлю во фрагменте Ес каждой из указанных молекул. Указанную вставку можно, например, сделать в петле 5, 8 или 10 фрагмента Ес гибридного белка Ес или вблизи указанных петель. Такие варианты этанерцепта, абатацепта или ромиплостима можно применять для лечения тех же заболеваний, что и неизмененный этанерцепт, абатацепт или ромиплостим.
Аналогично, если вариантом полипептида Ес является терапевтическое антитело, например, такое как адалимумаб, устикумаб, голимумаб, натализумаб, инфликсимаб или деносумаб, такой вариант антитела, содержащий фрагмент Ес, можно применять для лечения того же заболевания, что указанные антитела в неизменной форме. Таким образом, вариант фрагмента Ес, как описаны в настоящей заявке, позволяет изменить объем дозы или частоту введения, но не патологическое состояние, для лечения которого применяют указанный полипептид Ес.
Обычно полипептиды Ес применяют для лечения широкого спектра заболеваний, включая онкологические показания, аутоиммунные и воспалительные заболевания, связанные с костями заболевания, патологические состояния, нарушения обмена веществ и неврологические заболевания, например, такие как хроническая боль, среди многих других.
Фармацевтические композиции
Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, содержащие варианты фрагментов Ес или варианты полипептидов Ес, описанные в настоящей заявке. Такие композиции могут содержать терапевтически эффективное количество варианта полипептида Ес или варианта фрагмента Ес с
- 42 032985 одним или более дополнительными компонентами, такими как физиологически приемлемая основа, вспомогательное вещество или растворитель. Такие дополнительные компоненты могут включать буферы, углеводы, многоатомные спирты, аминокислоты, хелатирующие агенты, стабилизаторы и/или консерванты, среди многих возможных компонентов.
Способы введения
Варианты полипептидов Ес или варианты фрагментов Ес, или фармацевтические композиции, содержащие указанные молекулы, можно вводить любым подходящим путем. Лекарственные препараты, которые содержат белок, как правило, можно вводить путем инъекции, поскольку пероральное введение, в отсутствии определенной лекарственной формы или условий, может приводить к гидролизу белка в кислой среде желудка. Возможными путями введения являются подкожные, внутримышечные, внутривенные, внутриартериальные инъекции, введение в область поражения или перитонеальные инъекции. Также возможно местное введение, особенно в случае заболеваний, охватывающих кожу. В качестве альтернативы варианты полипептидов Ес или варианты фрагментов Ес можно вводить посредством контактирования со слизистой оболочкой, например, путем интраназального, сублингвального, вагинального или ректального введения, или в форме ингаляции. В качестве альтернативы, определенные фармацевтические композиции, содержащие вариант полипептида Ес или вариант фрагмента Ес можно вводить перорально.
Выше настоящее изобретение описано в общем виде, и следующие примеры предложены с целью иллюстрирования, но не ограничения.
Примеры
Пример 1. Создание модели четвертичной структуры фрагмента Ес 1дС1 к ЕсЕп человека.
Чтобы облегчить разработку библиотек, описанных ниже, была создана модель гомологии четвертичной структуры ЕсЕп человека в комплексе с фрагментом Ес 1дС1 человека на основании структуры комплекса ЕсЕп крысы и фрагмента Ес 1дС1 крысы, имеющихся в Банке данных о белках (№ доступа в ΡΌΒ 1ЕЕТ). В Банке данных о белках (ΡΌΒ) Был проведен поиск последовательностей аминокислот фрагмента Ес 1дС1 человека (ЗЕО ΙΌ №: 1) и ЕсЕп человека, а также цепей а- и β-2-микроглобулина (β>2ιη). последовательности ЗЕО ΙΌ №: 9 и 10, соответственно. На основании гомологии последовательностей аминокислот и четвертичной структуры было получено несколько шаблонов. Были отобраны структуры а-цепи ЕсЕп (1ЕХи (цепь А), 1 ЕЕТ (цепь А), 1/1А (цепь А)), структуры β2т цепи ЕсЕп (1СЕ6 (цепь В), 1Н8А (цепь В), 1ΥΡΖ (цепь В), 1ННС (цепь В) и 111А (цепь В)), и структуры Ес 1ΗΖΗ (цепь Н), 1/1А (цепь С), 1О0О (цепь А), 1Т83 (цепь А) и 216Е (цепь А)). Структуры ЕсЕп а 1ЕХИ (цепь А), 1 ЕЕТ (цепь А) и 1/1А (цепь А) были наложены, и полученные в результате средние квадратичные отклонения (ЕМБЭ), то есть, среднее расстояние между аналогичными атомами в наложенных структурах белков, составили 0,30 А - 0,76 А, а среднее их значение - 0,59А. Значения ЕМБЭ между структурами доменов β2т ЕсЕп1СЕ6 (цепь В), 1Н8А (цепь В), 1ΥΡΖ (цепь В), 1ННС (цепь В) и 111А (цепь В) варьировали в диапазоне 0,30 А -0,76 А, и среднее составило 0,59А. Значения ЕМБЭ между структурами Ес ШН (цепь Н), 1/1А (цепь С), 1О0О (цепь А), 1Т83 (цепь А) и 216Е (цепь А) варьировали в диапазоне 0,30 А - 0,76 А, и среднее составило 0,59А. Данные значения ЕМЗЭ показывают, что шаблоны структур ЕсЕп и Ес из разных источников обладают весьма близкой четвертичной структурой.
На основании указанных структур-шаблонов и последовательностей аминокислот ЕсЕп человека (БЕсЕп) и фрагмента Ес 1дС 1 человека (ЫдС1 Ес) была создана модель гомологии комплекса Ес БЕсЕп:Б1дО1 с применением модуля молекулярного моделирования на базе Ыпих, состоящего из вычислительных программ Мо1еси1аг Орегайпд ЕтзгоптепГ' (МОЕ; Группа химических вычислений, Монреаль, Квебек, Канада). На фиг. 1 показана часть указанного моделируемого комплекса, где ЫдС1 Ес (внизу) и БЕсЕп (наверху) вступает в наиболее тесный контакт, а также некоторые соседние области указанных белков.
Пример 2. Конструирование библиотек вставок.
Были сконструированы восемь библиотек, кодирующих варианты областей Ес 1дО1 человека, причем каждая из библиотек содержала вставки разных типов. На фиг. 2 показана последовательность области Ес 1дО1 человека, а также положения и форма шести библиотек вставок. Положения петель, в которые вносили библиотеки вставок, описанные ниже, обозначены на фиг. 1 и 2, как Ь1, Ь2А, Ь2В, Ь3, Ь4, Ь5, Ь6А и Ь6В. Некоторые сайты вставок в Ес были среди точек наиболее тесного контакта между Ес Б1дС1 и БЕсЕп (такие как Ь1, Ь2А, Ь2В и Ь3), тогда как другие сайты (Ъ4, Ь5, Ь6А и Ь6В) были на некотором расстоянии от точек наиболее тесного контакта между Ес Б1дС1 и БЕсЕп.
Как показано на фиг. 2, в некоторых библиотеках, таких как Ь1, Ь2А, Ь2В и Ь3, аминокислоты в петле были делетированы и заменены на аминокислоты, выбранные случайным образом, в большинстве случаев количество введенных аминокислот слегка превышало количество делетированных аминокислот. Аминокислоты, выбираемые случайным образом, включали все аминокислоты кроме цистеина. В библиотеке Ь2В перед шестью выбранным случайным образом аминокислотами шла последовательность С1у-С1у-Сук, а после указанных шести аминокислот -последовательность Сук-С1у-С1у. Поскольку можно предположить, что два цистеина образуют дисульфидный мостик в случае их сближения, можно также
- 43 032985 предположить, что шесть выбранных случайным образом аминокислот между остатками цистеина могут образовывать пространственно ограниченную петлю. Например, в Б2Б перед шестью выбранным случайным образом аминокислотами шла последовательность О1у-О1у-Суз, а после указанных шести аминокислот -последовательность Суз-О1у-О1у, что создавало пространственно ограниченные петли, заключающие в себе выбранные случайным образом аминокислоты. В других библиотеках, например, Ь4 и Б5, выбранные случайным образом аминокислоты вводили без делетирования каких-либо аминокислот, присутствующих в норме.
Для конструирования библиотек Ь1, Б2А, Б2В, Б3, Б4 и Б5, кодирующих группу фрагментов Ес 1дО1 человека применяли два цикла реакций ПЦР. Матрицей, применяемой в первом и втором комплектах ПЦР в первом цикле реакций, был вектор-фагмида, в который была введена ДНК, кодирующая фрагмент Ес 1дО1 человека (8ЕЦ ГО №: 2) так, чтобы была возможна ее экспрессия как части белка оболочки фага в соответствующих штаммах бактерий (р1дО1-Ес). В первом комплекте реакций ПЦР в первом цикле реакций, применяемых для генерирования библиотек, применяли прямые и обратные праймеры, чтобы создать фрагменты ПЦР, содержащие сайт рестрикции АраЫ на верхнем конце. Следующий прямой праймер, который соответствовал последовательностям вектора выше области, кодирующей фрагмент Ес, применяли для всех из первого комплекта реакций ПТЦР в первом цикле реакций: 5'-ОТТССТ ТТС ТАТ ТСТСАС-3' (8ЕЦ ГО №: 521). Обратные праймеры, которые были в последовательностях, кодирующих Ес, были следующими:
5'-000 ООТ
ОТО СТТ ООО ТТТ ТОО ООО-З' (8ЕЦ ГО №:522; библиотека Ь1); 5'-ООТ ОАО ОАО ОСТ ОАО
САС АСО ОТА-3' (8ЕЦ ГО №:523; библиотеки Б2А и Б2В); 5'-АТО САТ САС ООА ОСА ТОА ОАА ОАС-3' (8ЕЦ ГО №:524; библиотека ЬЗ); 5'-АТТ АТО САС СТС САС ОСС ОТО САС-3' (8ЕЦ ГО №:525; библиотека 4); и 5'-АТТ ОСТ СТС ССА СТС САС ОСС ОАТ-3' (8ЕЦ ГО №:526;
Библиотека Б5).
Во втором комплекте реакций ПЦР в первом цикле реакций также в качестве матрицы применяли р1дО1-Ес, а в качестве обратного праймера применяли олигонуклеотид, который соответствовал дополнению последовательностей векторов, начиная с последовательностей, кодирующих Ес. Указанный обратный праймер имел следующую последовательность: 5'-ССС АТТ СЛО АТС СТС ТТС-3' (8ЕЦ ГО №: 527). Прямые праймеры, применяемые в указанных реакциях были следующие: Библиотека Ы,
5'-ААА ССС ААО ОАС АСС СТС (ТК1М)6 АСС ССТ ОАО ОТС
АСА ТОС-3' (8ЕЦ ГО №:528); библиотека Б2А, 5'-ОТО ОТС АСС ОТС СТС АСС (ТК1М)6 САС
САО ОАС ТОО СТО ААТ-3' (8ЕЦ ГО №:529); библиотека Б2В, 5'-ОТО ОТС АСС ОТС СТС АСС
ООТ ООТ ТОТ (ТЕ1М)6ТОТ ООТ ООТ САС САО ОАС ТОО СТО ААТ-3' (8ЕЦ ГО №:530); библиотека ЬЗ: 5'-ТСА ТСС ТСС ОТО АТО САТ (ТЕ1М)5САС (ТК1М)! САС ТАС АСО САО ААО АОС-3' (8ЕЦ ГО №:531); библиотека Б4: 5'-ООС ОТО ОАО ОТО САТ ААТ ООТ ООТ ТОТ (ТК1М)6 ТОТ ССТ ССТ ОСС ААС АСА ААС ССС ССС-3' (8ЕЦ ГО №:532); и библиотека Ь5: 5'-СТС САО ТОО ОАО АСС ААТ ООТ ООТ ТОТ (ТК1М)6 ТОТ ООТ ООТ ООО САО ССО ОАО ААС ААС-3' (8ЕЦ ГО №:533).
В указанных олигонуклеотидах ТК1М обозначает смесь тринуклеотидов, кодирующих все аминокислоты за исключением цистеина (Смесь тримеров фосфорамидитов 2, О1еп Кезеагсй, каталожный номер 13-1992-95). Указанная смесь является эквимолярной смесью следующих тринуклеотидов:
ААА, ААС, АСТ, АТС, АТО, САО, САТ, ССО, СОТ, СТО, ОАА, ОАС,
ОСТ, ООТ, ОТТ, ТАС, ТСТ, ТОО, ТТС.
Следовательно, кодоны, кодирующие все аминокислоты за исключением цистеина, в смеси ТК1М были представлены приблизительно в равных количествах. Таким образом, (ТК1М)6 означает, что в олигонуклеотид включены выбранные случайным образом нуклеотиды, кодирующие аминокислоту за исключением цистеина.
Во втором цикле реакций ПЦР (один для каждой библиотеки) матрицами служили продукты из первого и второго комплекта реакций ПЦР из первого цикла, описанного выше. Применяемые праймеры были одинаковыми для всех библиотек и были следующими: 5'-ОТТ ССТ ТТС ТАТ ТСТ САС-3' (прямой; 8Ц) ГО №:534) и 5'-ССС АТТ САО АТС СТС ТТС-3' (обратный; 8Ц) ГО №:535).
Библиотеки Б6А и Б6Б были сконструированы в ходе одного цикла ПЦР, с применением р1дО1-Ес в качестве матрицы. В реакции ПЦР, описанной ниже, сайт рестрикции Хта1 (5'-СССООО-3') в кодирующей области для фрагмента Ес был заменен на сайт рестрикции Хйо1 (5'-СТСОАО-3) из-за последовательностей указанных праймеров. Данные изменения представляли собой молчащие мутации, которые не кодировали разные аминокислоты из немодифицированного р1дО1-Ес, и они были внесены, поскольку расщепление рестриктазами Хйо1 плюс Νοΐ1 более эффективно, чем расщепление Хта1 плюс Νοΐ1. Пря
- 44 032985 мые праймеры, применяемые для указанных реакций, были следующими: библиотека Ь6А:
5'-СТО ССС ССА ТСТ СОА ОАТ
ОАО СТО ООТ ТОТ (ΤΚΙΜ)8ΤΟΤ ООТ ООТ АСС ААС САО ОТС АОС СТО АСС-3' (8Е(^ ГО №:536); и библиотека Б6В: 5'-СТО ССС ССА ТСТ СОА ОАТ ОАО СТО ООТ ТОТ (ΝΝΚ)8ΤΟΤ ООТ ООТ АСС ААС САО ОТС АСС СТО АСС-3' (8Е(^ ГО №:537).
Последовательность обратного праймера была следующая: 5'-ООС ССС ΟΤΟ ΑΤΟ ΟΤΟ ΑΤΟ ΑΤΟ3' (8ЕР ΙΌ №:538). В Б6Б применяли смесь тринуклеотидов, именуемую ΝΝΚ, которая содержала тринуклеотиды, кодирующие двадцать аминокислот в 32 вырожденных кодонах. В данной смеси тринуклеотидов Ν обозначает выбранное случайным образом положение, которое занято аденозоном, гуанидином, цитидином или тимидином, а К обозначает частично ограниченное положение, которое занято гуанидином или тимидином.
Для всех реакций ПЦР применяли базовые наборы для ПЦР (КосЬе, каталожный номер 11 578 553 001) со следующими условиями реакции: 95°С в течение 5 мин, затем 30 циклов при 95°С в течение 45 с - 55°С в течение 45 с - 72° С в течение 90 с, и в конце - 72°С 10 мин. ДНК из реакций ПЦР очищали при помощи наборов для очистки ()ΙΑΐ|ΐιιοΙ< РСК (ΡΙΑΟΕΝ, 28104). Приблизительно 200 мкг ДНК вектора-фагмиды и 10 мкг очищенного продукта ПЦР (из третьего цикла реакций ПЦР) расщепляли рестриктазами ΑραΕ1 и Νοΐΐ (для библиотек Б1-Б5) и ХЬо1 и Νοΐΐ (для библиотек Ε6Α и Б6Б). Расщепленную ДНК очищали в геле при помощи наборов для очистки ()ΙΑΐ|ΐιιοΙ< РСК (ΡΙΑΟΕΝ, 28704).
Расщепленный ДНК-вектор и библиотеки продуктов ПЦР в молярном отношении 1:2 сшивали при помощи ДНК-лигазы Т4 (\е\\· Еид1аий Б1о1аЬз). Смесь инкубировали при 16°С в течение ночи. ДНК очищали путем осаждения в этаноле. Всего 25 мкг ДНК вводили в 1000 мкл электрокомпетентных клеток Е.со11 ХБ1 Ыие (81га1адепе) в поле с напряжением 2,5 кВ с применением сопротивления 200 Ом и емкости 25 пФ для получения приблизительно 1х109 трансформантов. Точные размеры библиотек варьировали от 7х108 (для Б5) до 1,8\109 (для Б4). Клетки засевали в 1000 мл 2х среды ΥΤ (которая содержала 16 г/л триптона Бас1о, 10 г/л экстракта дрожжей Бас1о и 5 г/л \аС1 при рН 7,0-7,2), содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 2% глюкозы, и выращивали до тех пор, пока СО600 не достигала приблизительно 0,5. Затем добавляли приблизительно 3х109 бляшкообразующих единиц на миллилитр (БОЕ/мл) фагапомощника М13, и культуру инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Инфицированные клетки затем соскабливали и повторно суспендировали в 1000 мл 2х среды ΥΤ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 40 мкг/мл канамицина. Клетки выращивали при 30°С в течение ночи. Затем фаг осаждали при помощи ПЭГ (полиэтиленгликоля) 6000.
Все библиотеки, применяемые при данных трансформациях, кроме 16 А и 16В, содержали шесть рандомизированных кодонов, каждая из которых кодировала любую из девятнадцати разных аминокислот, и, следовательно, можно предположить, что они кодировали приблизительно 4.7х107 (19б) разных вариантов фрагментов Ес. Аналогично, можно предположить, что Ε6Α кодирует приблизительно 1,76х1010 (208) разных вариантов фрагментов Ес, поскольку она содержит восемь выбранных случайным образом кодонов, которые кодируют любые из 20 разных аминокислот. Для библиотек, отличных от библиотек Ε6Α и Б6Б, учитывая предполагаемое количество разных вариантов в каждой библиотеке, можно заключить, что размеры библиотек приблизительно 109 (в диапазоне от 7х108 до 1,8х109) в 7-33 раза превышали количество вариантов.
Пример 3. Скрининг библиотек петель Ес.
Два цикла пэннинга с целью отбора фага, экспрессирующего варианты фрагментов Ес, которые связываются с ЕсКп с повышенным сродством по сравнению с фрагментом Ес дикого типа при рн 6,0 (и обладают низким сродством при рн 7,4), проводили следующим образом. В первом цикле фаг повторно суспендировали в жидкости, содержащей 0,4 мл 20 мМ МЕ8 (морфолиноэтансульфоновая кислота), рн 6,0, 5% обезжиренного молока, 0,05% Фиееп 20. В каждую из четырех лунок иммунопланшета ΜΑΧ18ОКР™ (Νπη^1, Рочестер, Нью-Йорк) наносили 10 мкг ЬЕсКп и блокировали 5% обезжиренным молоком, а затем добавляли 100 мкл фага при плотности 5Х1011 БОЕ/мл. После инкубации в течение одного часа при 37°С лунки промывали 3-10 раз 20 мМ МЕ8, рн 6,0, 0,2% 'Г\\'ееп 20. Фаг десорбировали путем добавления 100 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ), рн 7,4 в каждую лунку и инкубации планшета в течение 1 ч при 37°С. Указанные фаги применяли для повторного инфицирования культуры Е.сой ХБ1Ыие в фазе экспоненциального роста, которую культивировали до тех пор, пока ОБ600 не достигала приблизительно 0,5. Затем добавляли приблизительно 3х109 БОЭ/мл фага М13, и культуру инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Затем инфицированные клетки соскабливали и повторно суспендировали в 1000 мл 2х среды ΥΤ, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 40 мкг/мл канамицина. Клетки выращивали при 30°С в течение ночи. Затем фаг осаждали при помощи ПЭГ6000.
С применением указанного фага проводили второй цикл пэннинга по существу такими же способами, которые применяли в первом цикле. Строгость пэннинга была немного повышена посредством снижения концентрации ЕсКп, наносимого в титрационные микропланшеты, и путем увеличения количества процедур промывки. Десорбированный фаг после нескольких процедур промывки применяли для по
- 45 032985 вторного инфицирования культуры Е.сой ХЬ1 -Ыие в фазе экспоненциального роста при СЭ600 приблизительно 0,5, которую затем культивировали в течение часа при 37°С и наносили в планшеты, содержащие приблизительно 100 мкг/мл ампициллина и канамицина для получения колоний.
Одиночные колонии засевали в планшеты на 96 лунок для культур тканей, содержащие 120 мкл/лунку среды ΥΤχ2, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 2% глюкозы. Клетки выращивали при 37°С на шейкере пока ΘΌ600 не достигала приблизительно 0,5. Затем в каждую лунку добавляли 3х109/мл фага-помощника М13 и инкубировали в течение 1 ч. Затем клетки соскабливали и повторно суспендировали в 180 мкл/лунку среды ΥΤχ2, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 40 мкг/мл канамицина. Затем культуру инкубировали в течение ночи при 30°С на шейкере.
Приблизительно 100 мкл биотинилированного ЕсКп человека в концентрации 2 мкг/мл добавляли в лунки планшетов МЛХ18ОКР™, в которые до этого нанесли 10 мкг/мл стрептавидина. После пятикратного опромывания ФСБ плюс 0,05% Т\гееп 200 (ФСБТ) фаг из ночных культур в буфере МЕ8 при рН 6,0 или рН 7,4 добавляли в планшеты и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Для определения связывания фага применяли анти-М13 антитело, конъюгированное с пероксидазой хрена (НКР), и планшеты подвергали анализу на микропланшетном ридере с применением длины волны в видимом диапазоне. Лунки с положительным результатом отбирали на основе более выраженного сигнала при рН 5,5 (приблизительно 150% от сигнала, генерируемого контрольным фрагментом Ес) и сигнала, который был сопоставим с сигналом от контрольного фрагмента Ес или был меньше, чем у него, при рН 7,4. Во втором цикле скрининга, в котором проводили оценку одного титрационного микропланшета на 96 лунок с изолированными колониями для каждой колонии, лунок с положительным результатом для библиотек Ь2В, Ь3 или Ь4 выявлено не было. Приблизительно 20% колоний из библиотеки Ь2Л были приняты за положительные, тогда как из библиотек Ь6Л и Ь6В за положительные были приняты приблизительно 10% колоний. Библиотека Ь5 демонстрировала явное отличие от всех других библиотек, поскольку приблизительно 90% колоний были приняты за положительные. Следовательно, библиотека Ь5 была, в широких пределах, той библиотекой, из которой было получено наибольшее число положительных результатов. Указанные данные свидетельствуют о том, что сайт, в котором была сделана вставка в библиотеке 5, особенно благоприятен для выделения вариантов, которые повышают связывание с ЕсКп при рН 5-6, но при которых сохраняется низкое сродство фрагмента Ес к ЕсКп при физиологическом рН.
Авторы отобрали колонии с положительными результатами из библиотек Ь2Л, Ь5, Ь6Л и Ь6В, которые секвенировали и описали более подробно их свойства, как описано ниже. Связывание оценивали посредством количественного твердофазного иммуноферментного анализа (ЕЬРЗЛ). Оценка, получаемая при ЕЬРЗЛ, отражает активность связывания, причем более высокая оценка означает более высокое сродство. Как правило, оценки выше, чем 3-5 указывают на связывание, превышающее фоновое. Последовательности вставок в данных колониях с положительным результатом и их оценки по ЕЬ18Л показаны в табл. 2 ниже. Для библиотеки Ь5 вставки находятся между N169 и С170 согласно нумерации, показанной на фиг. 2. Для библиотек 6А и 6В вставки находятся между Б143 и Т144 согласно нумерации, показанной на фиг. 2.
- 46 032985
Таблица 2. Последовательности и оценки по ЕЫ8А отобранных положительных результатов
Библио тека Контрол ь Оценка по ЕЫ8А при рН6 Оценка по ЕБ18А при рН7,4 Последовательность вставки (8ЕС ГО №) Идентифик ационный номер изолята
Б5 95,4 2,8 ССС νΕΝΜΕΝΟΟΟ (8ЕС ГО №:44) 5-106
Б5 95,1 15,1 СССРНМЕРи-ССС (8 ЕС ГО №:392)
Б5 92,1 28,4 ССССНС\ХЧЕССС (8ЕС ГО №:393)
Б5 91,0 4,4 ССС νΕΝΜΕΝΟΟΟ (8ЕС ГО №:394)
Б5 89,5 23,5 СССЧЕУЕУСССС (8ЕС ГО №:395)
Б5 88,6 8,9 О6СКЕРНРЕСОО (8ЕС ГО №:396)
Ь5 87,3 1,8 СССРЕЕЕТСССС (8ЕС ГО №:397)
Б5 86,5 0,4 ССС’СЬС8МНССС (8ЕС ГО №:398)
Б5 86,3 1,6 ОбСУЕИКТБСОО (8ЕС ГО №:399)
Б5 82,5 0,4 ОбСНБРЕАУСОО (8ЕС ГО №:41) 5-51
Б5 82,4 2,0 ССССНЕУМи-ССС (8ЕС ГО №:43) 5-104
Б6А 79,5 0,7 О6СКАОУООА8СОО (8ЕС ГО №:400)
Б5 79,2 0,6 О6СМУРЕ8МСОО (8ЕС ГО №:401)
Б5 76,7 0,6 ОбСХУРБСОУСОО (8ЕС ГО №:42) 5-69
Б5 75,5 о,з ОбСЕБСЕКХУСОО (8ЕС ГО №:402)
Б5 74,8 0,5 СССРАЕЖСПССС (8ЕС ГО №:403)
Б5 74,2 2,3 О6СММЕЕАССОО (8ЕС ГО №:404)
Б5 73,4 0,4 О6ССНН1МССОО (8ЕС Ю №:405)
Б5 73,1 0,4 О6СУСННМЕСОО (8ЕС ГО №:406)
Б5 72,7 0,5 ОбСМСМЯКЛУСОО (8ЕС ГО №:364) 5-96
Б5 72,3 0,6 О6СМУРЕ8МСОО (8ЕС ГО №:407)
Б5 72 0,4 ОбССКОХУУГСОО (8ЕС ГО №:408)
Б5 71,2 0,7 ОССУУОУККСОО (8ЕС ГО №:409)
Б6В 68,9 0,8 СССБКСМНСБАССС (8ЕС ГО №:410)
Б5 68,6 0,6 ОбСЯМЕАУОЗСОО (8ЕС ГО №:411)
Б5 67,4 0,4 ОбСМСРХУАЕСОО (8ЕС ГО №:412)
Б5 65,6 0,5 ОССМТСУИХУСОО (8ЕС ГО №:413)
Б5 65,2 о,з СОСУБГЛУХУЗССЮ (8ЕС ГО №:414)
Б5 64,1 0,5 О6СООКТКУСОО (8ЕС ГО №:363) 5-92
Б5 63,6 0,7 О6СУ1ТСКЕСОО (8ЕС ГО №:415)
Б5 63 0,5 ОССЕТНУТУСОО (8ЕС ГО №:416)
Ь5 62,7 0,4 СССАБУРТМССС (8ЕС ГО №:45) 5-112
Б5 62,2 о,з СССТЕСУМ'ЛА’СС (8ЕС ГО №:417)
Б5 61,2 0,4 О6С1ТЕГ8НС6С (8ЕС ГО №:418)
Б5 61 о,з ССССНВ8У\ХА’СС (8ЕС ГО №:419)
Ь5 61 0,5 СССНСТКСЕССС (8ЕС ГО №:420)
Б5 60,9 о,з ОбСЯРНКТРСОО (8ЕС ГО №:421)
Б5 60,3 о,з ОбССНБРРБСОО (8ЕС ГО №:422)
Б5 60,2 0,4 ОбСЯНЕЕТЕСОО (8ЕС ГО №:423)
Ь5 59,6 о,з ССССУРККЬССС (8ЕС ГО №:424)
- 47 032985
Ь5 59,2 0,3 СбСЮРГХУЛУСССг (8Е() ГО №:425)
Ь5 59,2 0,3 ббСМрРАУПЧСбСг (8Е() ГО №:426)
Ь6В 58,9 0,8 О6СУ(}НКМО\¥СОО (8Е<Э ГО №:427)
Ь5 58,5 0,5 ОбСЕМЕЯААУСОО (8Е(^ ГО №:428)
Ь5 58,3 о,з СССРРУ-РЕВССС (8Е(^ ГО №:429)
Ь5 57,8 о,з бОСОКШУНрСбО (8Е(^ ГО №:359) 5-57
Ь5 57,7 0,4 О6СНОРЕРЕСОО (8Е() ГО №:430)
Ь5 57,7 0,5 ОбСЯЕРКУУСОО (8Е<Э ГО №:431)
Ь5 57,7 0,5 СССОВРУАТССС (8Е(^ ГО №:432)
Ь5 57,2 0,4 О6СН8ГКНГСОО (8Е<Э ГО №:360) 5-64
Ь5 57,2 0,7 О6СЕ1РН8РСОО (8Е() ГО №:433)
Ь5 56,7 0,4 О6СМРУЕМНСОО (8Е<Э ГО №:434)
Ь5 56,1 0,7 О6С(^ОМШТУСОО (8Е() ГО №:366) 5-113
Ь5 55,6 0,7 ОССКЕЕЯРУСОО (8Е() ГО №:435)
Ь5 55,5 1,4 ббСАЕКЦУУССгС (8Е() ГО №:436)
Ь5 55,4 о,3 СОСИ УЕВЕЕССС (8Е<Э ГО №:437)
Ь5 55,2 0,2 О6СК8М18МСОО (8Е<Э ГО №:438)
Ь5 54,9 0,6 66С НН1«Э0<ЭС66 (8Е() ГО №:439)
Ь6В 54,9 0,6 ОбСЯАТЕБОУЕСОО (8Е<Э ГО №:440)
Ь5 54,7 0,6 ОССЕАТМТАУСОО (8Е<Э ГО №:441)
Ь5 54,6 0,3 СОСИ УЕВЕЕССС (8Е<Э ГО №:442)
Ь5 54,5 0,3 66СА(ДО¥ННЕУССгСг (8Е<Э ГО №:362) 5-73
Ь5 54,2 0,7 ССС8ВУЕКУССС (8Е(^ ГО №:443)
Ь5 53,2 о,з О6СНАР(^УЕССЮ (8Е<Э ГО №:444)
Ь5 53,2 0,4 ОбСРЬУНАОСОО (8Е() ГО №:445)
Ь5 53,2 0,4 СССМНИЕЕЕССС (8Е(^ ГО №:446)
Ь5 52,4 1,2 СССМЕЕТКУ-ССС (8Е<Э ГО №:447)
Ь6В 52,1 0,4 ΟΟΌΝΜΝΕλνΚδΟΌΟΟ (8Е<Э ГО №:448)
Ь5 51,6 0,4 66СЕ(}ХЕУУССгСг (8Е<Э ГО №:449)
Ь5 51,3 0,2 Οα^ΤδΜΚΝΟΟΟ (8Е<Э ГО №:450)
Ь5 51,2 0,5 О6СЕЕЕННАСОО (8Е(^ ГО №:361) 5-66
Ь5 51,1 0,4 бССЖСНМРСбб (8Е<Э ГО №:451)
Ь5 50,5 1,0 ОбСАУМАУАЕЕСОО (8Е<Э ГО №:452)
Ь5 50,3 0,4 СССνΗΝΟΚΕΟΟΟ (8ЕС ГО №:453)
Ь6В 50,1 0,4 ОбСУОКАОМКБСОО (8ЕС ГО №:454)
Ь6В 50 о,з СССУ8ААТ8ВТССС (8Е(^ ГО №:455)
Ь5 49,8 0,6 66СУР(}КЕ1ССгСг (8ЕС ГО №:456)
Ь6В 49,2 0,4 ОбС^ЗЗБКЕАСОО (8Е(^ ГО №:457)
Ь6А 48,5 0,2 СССЖУБТСАУССС (8 ЕС ГО №:458)
Ь5 48,2 1,8 СССРСНЕЕВССС (8Е() ГО №:459)
Ь6В 47,2 0,4 ССССЕУИУУССССС (8ЕО ГО №:460)
- 48 032985
Ь5 47,2 0,9 СССК'Л'8МТКССС (8Е() ГО №:461)
Ь5 47 1,4 СССГОУЧЕМКССС 18Е<9 ГО №:462)
Ь5 46,8 3,6 О6СМН8РНАСОО (8Е() ГО №:463)
Ь5 46,2 0,9 ОССММАУКУИСОО (8Е() ГО №:464)
Ь6А 45,2 о,з ОбСЕТОУАЗЕКССЮ (8Е(^ ГО №:465)
Ь6А 44 0,2 СССГОЕЕЭМ νΝ УС’СС (8Е(^ ГО №:466)
Ь6А 43,8 0,6 ОСЗСЕКНЕРЛЬГСОО (8ЕЭ ГО №:467)
Ь6В 43,6 0,2 ΟΟΌΤΈΟδΑΡΊΈΟΟΟ (8Ер ГО №:468)
Ь6В 43,2 о,з ОбСЕММКЧКЗбСОО 18Е<9 ГО №:469)
Ь5 42,4 1,6 СССЕАЗСфСССг (8Е(^ ГО №:470)
Ь6В 42,3 0,2 ОбСЕКИЕМК^ЗССЮ (8Е(^ ГО №:471)
Ь6В 42,2 0,4 ОбСРЧОТУЕОАСОО (8Е0 ГО №:472)
Ь6В 41,8 о,з О6С8Е8КНМОАСОО (8Е(^ ГО №:473)
Ь6А 41,2 0,2 бССАКОС^НТОЗСОа 18Е<9 ГО №:474)
Ь5 41,1 1,6 ОСЗСЕОЫ^ЕССЮ 18Е<9 ГО №:475)
Ь6В 41 0,2 О6СКММЕД¥К86СОО (8ЕС) ГО №:476)
Ь5 38,7 1,6 О(ЭС(^1КЕ\УССЮ (8Е() ГО №:477)
Ь5 36,1 1 ΟΟίΌΕΡΝΕΜΟΟΟ 18Е<Э ГО №:478)
Ь5 35,8 0,7 О6СМЕ8НРНСОО 18Е<9 ГО №:479)
Ь5 33,7 0,7 СССАСРУУ'АСОС (8Е0 ГО №:480)
Ь5 31,1 0,8 66СЕ(^ЕУТССгСг 18Е<9 ГО №:481)
Ь5 29,5 1,2 ОбСМОАУАУНЬСОО (8Е(^ ГО №:482)
Ь5 28,4 0,5 бССРСЩОЕМССгСг 18Е<9 ГО №:483)
ь/ Ζ, /, / 1,и όόε1 логиееνι ιν лщч-от)
Ь5 27,5 2,1 66СМРР(}\¥МССгСг 18Е<9 ГО №:485)
Ь5 26,9 1,4 бСКГОТЮАУЕССгСг (8Е() ГО №:486)
Ь5 26,3 0,7 СССС1ЕЕ8У'ССС (8Ер ГО №:487)
Ь5 26,1 0,9 О6СОРУКТЕСОО 18Е<Э ГО №:488)
Ь5 25,2 0,7 ССССДОАЗУЮбО (8Е(^ ГО №:489)
Ь5 25 0,4 ОССОК^УТОЕССЮ (8Е() ГО №:490)
Ь5 24,9 1,2 6О8(}КАРА8С6О 18Е<9 ГО №:491)
Ь5 23,9 1,5 О6СММК.Е(26ССЮ 18Е<9 ГО №:492)
Ь5 22 1,0 ΟΟίΈΕΡΝΜΕίΌΟ (8Е(} ГО №:493)
Ь5 21,7 о,з бСССРУУрНСбО 18Е<Э ГО №:494)
Ь5 21,5 1,0 О(ЭСЕМ8(ЩЕССЮ (8Е() ГО №:495)
Ь5 21,3 1,4 О6СООРУУЕСОО(8Ер ГО №:496)
Дикий 13-20 0,5-1,3
тип*
Фаг* 0,4-0,7 0,3-1,8
Среда* 0,4-0,7 0,5-0,6
*Поскольку указанные контрольные образцы подвергали многократному измерению, данные результаты приведены как диапазон значений. Дикий тип, фаг и среда обозначают, соответственно, фаг, экспрессирующий контрольный фрагмент Ес, фаг, не экспрессирующий фрагмент Ес, и отсутствие фага.
Пример 4. Исследования по оценке скорости ассоциации и диссоциации при связывании.
Чтобы более полно описать свойства некоторых из вариантов фрагментов Ес выявленных при ЕЫ8А фагов, для подгруппы идентифицированных вариантов фрагментов Ес оценивали связывание вариантов фрагментов Ес с ЕсКп при рИ 6 и 7,4. ДНК, кодирующую избранные варианты фрагментов Ес, все из библиотеки Ь5, вводили в вектор экспрессии у млекопитающих, который применяли для трансфекции клеток 293 6Е с применением деацитилированного ПЭИ (полиэтиленимина), по существу как описано у Тйотаз е! а1. (Ргос. №11. Асаб. 8ст 102(16): 5679-5684,2005), значимые части которой включены в настоящую заявку посредством ссылки. Были отобраны изоляты с высокой оценкой по ЕЫ8А в том, что касалось связывания с ЕсКп. Концентрации вариантов фрагментов Ес в кондиционированной среде (СМ) измеряли с применением разведенных 1:2 и 1:10 образцов СМ при помощи биосенсоров с белком А (Еог!еВю, 1пс., каталожный номер 18-5010) на приборе Ос!е! Кеб® (Еог!еВю 1пс., Менло-Парк, Калифорния). Концентрации рассчитывали на основании стандартной кривой, созданной с применением
- 49 032985 очищенного гибридного белка Ес.
Биотинилированный йБсКи в концентрации 100 нМ захватывался биосенсорами на основе стрептавидина (8А) (ЕойеВю 1ис., 18-5019) в автономном режиме при комнатной температуре в течение 2 ч. При применении таких биосенсоров 8А, покрытых биотинилированным йЕсКи, в системе Ос!е! Кеб® можно определять связывание и диссоциацию белка в режиме реального времени посредством дифракции света. Пробы варианта и контрольного фрагмента Ес в СМ разводили до концентрации 10 мкг/мл при рН 6 или рН 7,4. Создавали три варианта условий связывания и диссоциации: (1) связывание при рН 6 и диссоциация при рН 6; (2) связывание при рН 6 и диссоциация при рН 7,4; и (3) связывание при рН 7,4 и диссоциация при рН 7,4. Биосенсоры 8А, покрытые биотинилированным йЕсКи, погружали в буфер со специфической рН на 1 мин, а затем пропитывали пробами, содержащими варианты фрагментов Ес или контрольные фрагменты Ес при специфическом рН в течение 5 мин, чтобы могло произойти связывание с ЕсКи. Биосенсоры Ес затем пропитывали буфером со специфической рН еще в течение 5 мин, чтобы связавшиеся фрагменты Ес могли диссоциировать от ЕсКи. Определение связывания и диссоциации фрагментов Ес была возможна благодаря применению интерферометрии в биологических слоях, реализуемой при помощи системы Ос!е! Кеб®, так, чтобы связывание и диссоциация определялись в режиме реального времени.
Скорости ассоциации и диссоциации вариантов фрагментов Ес при разных рН сравнивали с данными для контрольных фрагментов Ес. Критерием, применяемым для отбора вариантов фрагментов Ес для дальнейшего описания свойств, было более высокое связывание при рН 6, более низкая скорость диссоциации при рН 6, очень слабое связывание при рН 7,4 и более высокая скорость диссоциации при рН 7,4 по сравнению с контрольным фрагментом Ес. Из 61 оцененного варианта фрагментов Ес многие демонстрировали более сильное связывание и более медленную диссоциацию при рН 6, и сопоставимую или более быструю диссоциацию при рН 7,4 после связывания при рН 6, по сравнению с контрольным фрагментом Ес. На фиг. 3 показаны кривые связывания при рН 6 (слева от центральной вертикальной линии) и диссоциации при рН 7,4 (справа от центральной вертикальной линии) для 24 оцениваемых вариантов фрагментов Ес, которые обладали наиболее благоприятными свойствами. Справа от кривых перечислены названия каждого из оцениваемых вариантов фрагментов Ес, а также указан максимальный ответ связывания (в нанометрах (нм)), наблюдаемый во время фазы связывания в эксперименте. Абсолютная величина максимальных ответов может варьировать в некоторой степени от эксперимента к эксперименту, и оно не пропорционально константам связывания, таким как кои, кб1к или Кс (кб1к/кои). На фиг. 3 минимальный ответ связывания наблюдался у фрагмента Ес дикого типа, и все показанные варианты демонстрировали более выраженные ответы при рН 6. Большинство из вариантов фрагментов Ес быстро диссоциировали при рН 7,4, как и фрагмент Ес дикого типа. Однако вариант Ес 5-1 при рН 7,4 явно диссоциировал с меньшей скоростью, чем любой другой вариант, тогда как другие оцениваемые варианты дисоциировали при рН 7,4 быстро, как и фрагмент Ес дикого типа. Вариант Ес 5-85 выделялся как вариант с наиболее выраженным ответом при рН 6, который также диссоциировал при рН 7,4. Целый ряд других вариантов, таких как 5-106, 5-104, 5-112, 5-79, 5-51 и 5-69, среди прочих, также демонстрировал выраженные ответы при рН 6 и быструю диссоциацию при рН 7,4. Таким образом, из библиотеки Ь5 были выделены многие варианты фрагментов Ес с улучшенными свойствами.
Пример 5. Получение вариантов фрагментов Ес.
ДНК, кодирующая отобранные изоляты, все из библиотеки Ь5, вводили в вектор экспрессии у млекопитающих, который применяли для трансфекции клеток 293 при помощи деацетилированного ПЭИ, по существу, как описано у Тйотак е! а1. (Ргос. Ν;·ι11. Асаб. 8сг 102(16): 5679-5684, 2005), значимые части которой включены в настоящую заявку посредством ссылки. Клетки млекопитающих были выбраны, поскольку в данной системе просто проводить экспрессию и посттрансляционный процессинг. Способы, применяемые для экспрессии и получения белка, описаны у Иигосйег е! а1. (Яис1. Ас1бк Кек. 30(2): е9, 2002), значимые части которой включены в настоящую заявку посредством ссылки. Секретированные варианты фрагментов Ес очищали от питательной среды посредством аффинной хроматографии с белком А и эксклюзионной хроматографии. Для проверки чистоты фрагментов Ес применяли высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ). Общие указания по способам очистки можно найти в Ме!йобк 1и Мо1еси1аг Вю1оду: Рго!ет РипйсаБои Рго!осо1к ν.244, Си1!1ег, еб., Нитаиа, №\ν 1егкеу, 2004. Титры белков для вариантов Ес оценивали путем окрашивания полиакриламидного геля кумасси голубым. Все изоляты экспрессировались в количестве, адекватном для оценки.
Пример 6. Термостабильность вариантов фрагментов Ес.
Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) позволяет измерить энтальпию (АН) раскручивания в связи с тепловой денатурацией. Молекулы белка (или другие макромолекулы) в растворе находятся в равновесии между нативными, скрученными популяциями и денатурированными, раскрученными популяциями. Чем выше средняя температуры температурного перехода (Тт), при которой 50% молекул белка раскручено, тем более стабильна молекула. ДСК также применяют для определения изменений теплоемкости (АСр) денатурации. Эксперименты ДСК проводили при помощи прибора для капиллярной ДСК МюгоСа! УР (ОЕ Не1а!йсаге, Р1кса!а^ау, Нью-Джерси) с целью измерения Тт разных
- 50 032985 фрагментов Рс. Концентрация очищенного контрольного фрагмента Рс (Рс-νΤ) или варианта фрагмента Рс в каждом эксперименте составляла 0,5 мг/мл в 10 мМ ацетате натрия, 9% сахарозы рН 5. Пробы нагревали с 20°С до 95°С со скоростью нагрева 60°С/ч. Средние температуры температурного перехода (Тт) отдельных доменов определяли, когда 50% отдельного домена раскручивалось. Значения Тт для вариантов фрагментов Ес и контрольного фрагмента Ес дикого типа перечислены в табл. 3 ниже.
Таблица 3. Значения Тт вариантов фрагментов Ес
Идентификационны й номец ггообы Тт домена Сн2 (°С) Тт домена СнЗ (°С)
Рс-λΥΤ 67,7 84,3
Рс-5-55 67,7 77,5
Рс-5-60 67,7 78,4
Рс-5-64 67,4 79,2
Рс-5-69 68,3 76,2
Рс-5-70 67,3 77,7
Рс-5-73 67,7 78,8
Рс-5-79 67,3 76,5
Рс-5-85 66,5 73,4
Рс-5-91 67,4 77,6
Рс-5-92 67,5 79,5
Рс-5-95 67,1 77
Рс-5-96 67,0 79,2
Рс-5-97 67,4 78,2
Рс-5-99 67,0 78,2
Рс-5-101 67,0 78,6
Рс-5-104 67,1 78,0
Рс-5-106 66,6 77,4
Рс-5-112 67,2 77,1
Рс-5-113 68,1 77,9
Рс-5-1 68,4 77,4
Рс-5-51 67,4 77,4
Рс-5-57 67,1 79,1
Рс-5-66 67,5 79
Указанные данные свидетельствуют о том, что на Тт домена СН2 не оказали значительного влияния вставки библиотеки Ь5, которые находятся в домене СН3. Хотя Тт домена СН3 немного снижалась по сравнению с контрольным фрагментом Ес (Ес^Т), значения Тт домена СН3 в вариантах фрагментов Ес оставались приблизительно на 10 °С выше, чем значения Тт домена СН2. Таким образом, более низкое пороговое значение для термостабильности всего домена Ес, то есть Тт домена СН2, оставалось неизменным.
Пример 7. Связывание вариантов фрагментов Ес с ЕсКп человека или яванской макаки.
Связывание вариантов фрагментов Ес с ЕсКп человека или яванской макаки оценивали при помощи аналитической системы В1Асоге®Т100 (СЕ НеаЙНсаге Вю-Зщепсез АВ Рпуа1е Птйей ПаЬййу Сотрапу, Упсала, Швеция) при рН 5,5 и рН 7,4. Анализ включал в себя инкубацию с разными концентрациями вариантов фрагментов Ес или контрольных фрагментов Ес с фиксированным количеством ЕсКп человека или яванской макаки при условиях связывания и последующее измерение количества свободного, несвязанного ЕсКп в указанных смесях посредством связывания на поверхности (в измерительной ячейке чипа СМ5 (В1асоге)), на которой был иммобилизован фрагмент Ес. Фрагмент Ес, иммобилизованный на чипе, был в количестве, достаточном для того, чтобы связать по существу весь свободный, несвязанный ЕсКп в смеси. Таким образом, количество несвязанного ЕсКп в смеси оценивали количественно методом поверхностного плазмонного резонанса посредством применения аналитической системы В1Асоге® Т100. На основании указанной информации рассчитывали ЕС50, то есть, концентрацию варианта фрагмента Ес или контрольного фрагмента Ес, при которой связывалось 50% ЕсКп в смеси. Первоначально, оценку на предмет связывания с ЕсКп человека проводили для группы из 23 вариантов фрагментов Ес (Ес-5-1 считался контролем), которые были идентифицированы в экспериментах, описанных выше. На основании указанных данных было отобрано четырнадцать вариантов фрагментов Ес, и в отношении них проводили дополнительную оценку связывания с ЕсКп яванских макак.
Ниже более подробно описан протокол эксперимента. Фрагменты Ес, которые планировали оценивать, нарабатывали в клетках 293 и очищали, как описано выше. Контрольный фрагмент Ес дикого типа (Ес^Т) и вариант фрагмента Ес (Ес-5-1) иммобилизовывали в измерительных ячейках чипа СМ5 (В1асоге) при помощи соединения аминов с плотностью приблизительно 6000 резонансных единиц (РЕ). Ес-5-1 применяли, потому что он в отличие от Ес^Т прочно связывается с ЕсКп при рН 7,4. Одну измерительную ячейку без иммобилизованного белка, связанного с ней, применяли в качестве контроля
- 51 032985 фонового сигнала. Было можно применять одну измерительную ячейку для идущих друг за другом проб при условии промывания между пробами раствором с рН 7,4 для отделения связавшегося ЕсЕп от фрагмента Ес, иммобилизованного в измерительной ячейке.
Для получения приемлемого сигнала для разных оцениваемых молекул и условий применяли разные условия анализа. Для анализа при рН 5,5 10 нМ ЕсЕп человека или яванской макаки смешивали с последовательными разведениями вариантов фрагментов Ес и контрольных фрагментов Ес, которые планировалось оценивать (которые варьировали в диапазоне 0,1~ 2000 нМ) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в 10 мМ растворе ацетата натрия, рН 5,5, 150 мМ №С1, 0,005% Р20, 0,1 мг/мл БСА (бычьего сывороточного альбумина). В качестве положительного контроля 10 мМ ЕсЕп человека и яванской макаки инкубировали в том же растворе, в течение того же времени и при той же температуре, которые описаны чуть выше, но без добавления фрагмента Ес. В указанных пробах предположительно весь ЕсЕХ связался. Связывание свободного, несвязанного ЕсЕп в каждой из указанных смесей с иммобилизованным Ес-^Т и Ес-5-1 оценивали путем введения смесей на поверхность измерительных ячеек и определения ЕсЕп, связавшегося с поверхностью методом поверхностного плазмонного резонанса.
Для анализа при рН 7,4 10 нМ ЕсЕп человека или яванской макаки смешивали с последовательными разведениями вариантов фрагментов Ес и контрольных фрагментов Ес, которые планировалось оценивать (которые варьировали в диапазоне 0,1~2000 нМ) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре в фосфатно-солевом буфере (ФСБ), с 0,005% полисорбата 20, 0,1 мг/мл БСА. В качестве положительного контроля 10 мМ ЕсЕп человека и яванской макаки инкубировали в том же растворе, в течение того же времени и при той же температуре, которые описаны чуть выше, но без добавления фрагмента Ес. Количество свободного, несвязанного ЕсЕп в указанных смесях определяли по связыванию с иммобилизованным фрагментом Ес-5-1, которое оценивали путем введения указанных смесей на поверхности измерительных ячеек, покрытую Ес-5-1, и определения ЕсЕп, связавшегося с поверхностью методом поверхностного плазмонного резонанса. Ес-5-1 применяли в данном анализе, потому что он связывается с ЕсЕп при рН 7,4 с более высоким сродством, чем Ес-\\Е.
Уменьшение ответа связывания ЕсЕп при повышении концентрации фрагмента Ес в смесях указывает на то, что ЕсЕп связывался с фрагментом Ес в растворе, который блокировал связывание ЕсЕп с иммобилизованным фрагментом Ес на поверхности измерительных ячеек. После построения зависимости сигнала связывания с ЕсЕп от концентрации фрагмента Ес ЕС50 рассчитывали на основании нелинейной регрессии для конкуренции за один сайт в программе ОгарБРай Рпкт 5™. Полученные результаты приведены в табл. 4.
Таблица 4. ЕС50 фрагментов Ес для связывания с ЕсЕп при рН 5,5 и 7,4
РсКп человека РсКп человека РсКп яванской РсКп яванской
рН5,5 рН7,4 макаки рН5,5 макаки рН7,4
Проба ес50 95% ДИ ес50 95% ДИ ес50 95% ДИ ес50 95% ДИ
(нМ) (нМ) (нМ) (нМ) (нМ) (нМ) (нМ) (нМ)
Рс-№Т 290 200-430 >2000 270 200-360 >2000
Рс-5-1 2,6 1,4-4,7 45 33-61 2,3 1,2-4,5 42 28-63
Рс-5-51 16 13-19 >2000 21 12-36 >2000
Проба ЕС50 95% ДИ ес50 95% ДИ ес50 95% ДИ ЕС50 95% ДИ
(нМ) (нМ) (нМ) (нМ) (нМ) (нМ) (нМ) (нМ)
Рс-5-55 49 35-69 >2000 53 46-62 >2000
Рс-5-57 180 110-310 >2000 НО* НО
Рс-5-60 67 48-94 >2000 60 43-85 >2000
Рс-5-64 210 113-375 >2000 но НО
Рс-5-66 200 170-230 >2000 но но
Рс-5-69 14 12-17 >2000 18 14-23 >2000
Рс-5-70 26 20-32 >2000 27 18-39 >2000
Рс-5-73 190 120-290 >2000 НО НО
Рс-5-79 53 45-64 >2000 63 48-81 >2000
Рс-5-85 18 15-21 >2000 25 14-43 >2000
Рс-5-91 57 40-110 >2000 НО НО
Рс-5-92 75 54-106 >2000 но но
Рс-5-95 42 31-56 >2000 50 37-67 >2000
Рс-5-96 76 58-110 >2000 НО НО
Рс-5-97 25 19-32 >2000 31 27-36 >2000
Рс-5-99 15 11-19 >2000 16 10-25 >2000
Рс-5-101 100 60-170 >2000 но НО
Рс-5-104 15 3-67 >2000 16 14-19 >2000
Рс-5-106 5,3 4,5-6,4 >2000 3,6 2,4-5,3 >2000
Рс-5-110 250 140-460 >2000 Νϋ Νϋ
Рс-5-112 46 38-56 >2000 49 34-72 >2000
Рс-5-113 20 12-33 >2000 27 21-35 >2000
НО = не определяли.
- 52 032985
Данные, приведенные в табл. 4, указывают на то, что многие из оцениваемых вариантов фрагментов Ес обладают существенно усиленным связыванием с ЕсКп человека при рН 5,5 (т.е., обладают значительно более низким ЕС50 по сравнению с Ес-^Т) и сохраняют слабое связывание при рН 7,4 (т.е., обладают высоким ЕС50, таким же как и у о£ Ес-^Т). Однако пять из них (Ес-5-57, Ес-5-64, Ес-5-66, Ес-5-73 и Ес-5-110) не демонстрируют значимо увеличенного связывания при рН 5,5. Восемь из них (Ес-5-55, Ес-560, Ес-5-79, Ес-5-91, Ес-5-92, Ес-5-96, Ес-5-101 и Ес-5-112) демонстрируют только приблизительно 2-5кратное усиление связывания при рН 5,5. Указанные данные свидетельствуют о том, что ЕС50 вариантов фрагментов Ес для связывания с ЕсКп человека и яванской макаки сопоставимы. Все оцениваемые варианты фрагментов Ес (кроме Ес-5-1, который рассматривался как контроль) при рН 7,4 сохраняют слабое связывание с ЕсКп как человека, так и яванской макаки.
Пример 8. Конструирование вариантов фрагментов Ес с дополнительными модификац иями.
Были созданы варианты фрагментов Ес с дополнительными модификациями - Ес-5-69 и Ес-5-106. Варианты Ес-5-69 создавали следующим образом. ДНК, кодирующую фрагмент Ес-5-69, вводили в вектор экспрессии у млекопитающих, который также может воспроизводиться в Е.сой, который применяли в качестве матрицы. Для варианта Ес-5-69-^1Е применяли следующие два праймера: прямой ОАО ЛОС ААТ ООТ ООТ ТОТ ТТС ССО СТО САО ОАС ТАС (8ЕЦ ГО №: 497); и обратный СТА СТС СТО САО СОО ОАА АСА АСС АСС АТТ ОСТ СТС (8ЕЦ ГО №: 498). Для Ес-5-69-^1 Υ, применяли следующие два праймера: прямой ОАО АОС ААТ ООТ ООТ ТОТ ТАС ССО СТО САО ОАС ТАС (8ЕЦ ГО №: 499); и обратный ОТА ОТС СТО САО СОО ОТА АСА АСС АСС АТТ ОСТ СТС (8ЕЦ ГО №: 500). Применяли протокол для набора для сайт-направленного мутагенеза Цшксйапде (81га1а§епе, 200518). Реакционная смесь включала 200 нМ дезоксирибонулкеозидтрифосфатов (ЙКТР), 100 нМ праймеров, 1 нг ДНКматрицы, 1 мкл ДНК-полимеразы и воду до общего объема 50 мкл. Реакцию проводили при 95°С в течение 30 с, затем проводили 16 циклов при 95°С в течение 30 с, 55°С в течение 60 с, 68°С в течение 6 мин, а затем при 68°С в течение 10 мин. Затем добавляли 1 мкл Эрп1, и реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 1 часа. Затем 2 мкл смеси применяли для трансформации 30 мкл суперкомпетентных клеток ХЫ-Ы1ие (81га1а§епе) при 42°С в течение 45 с. Затем добавляли 0,5 мл 8ОС, и клетки инкубировали при 37°С в течение 1 ч на шейкере при 300 об/мин. Трансформированные клетки распределяли на чашках с агаром Луриа-Бертани, содержащим ампициллин, и инкубировали в течение ночи при 37°С.
Отдельные колонии отбирали, и ДНК-плазмиду подготавливали и секвенировали. Последовательности ДНК показали, что варианты фрагментов Ес содержали вставки из аминокислот со следующими последовательностями, которые различались по одной аминокислоте с вставкой в Ес-5-69: Ес-5-69-^1Е, ООСЕРТСГОУСОО (8ЕЦ ГО №: 367); и Ес-5-69-^1 Υ, ООСΥР^^^ΥСОО (8ЕЦ ГО №: 368). ДНК, кодирующую указанные варианты фрагментов Ес-5, вводили в клетки 293, и очищенные фрагменты Ес получали, как описано выше для применения анализа связывания В1асоге®, который проводили, как описано выше.
Модифицированные версии Ес-5-106 создавали при помощи аналогичных способов за исключением того, что матрицей для реакций ПЦР была ДНК, кодирующая Ес-5-106, встраиваемая в вектор экспрессии у млекопитающих. Праймеры, применяемые для реакций ПЦР, обладали следующими последовательностями: Ес-5-106-М4А, прямой
ООТ ООТ ТОТ ОТТ ТТС ААС ОСО
ТТС ААС ТОТ ООТ ООТ ООО (8Е0 ГО №:501) и обратный ССС АСС АСС АСА ОТТ ОАА СОС
ОТТ ОАА ААС АСА АСС АСС (8Е0 ГО №:502); Ес-5-Ю6-М4О, прямой ООТ ООТ ТОТ ОТТ ТТС
ААС ООО ТТС ААС ТОТ ООТ ООТ ООО (8Е0 ГО №:503), и обратный ССС АСС АСС АСА ОТТ
ОАА ССС ОТТ ОАА ААС АСА АСС АСС (8Е0 ГО №:504); Ес-5-106-М4Н, прямой ООТ ООТ ТОТ
ОТТ ТТС ААС САТ ТТС ААС ТОТ ООТ ООТ ООО (8Е0 ГО №:505), и обратный ССС АСС АСС
АСА ОТТ ОАА АТО ОТТ ОАА ААС АСА АСС АСС (8Е0 ГО №:506); ЕС-5-106-М41, прямой ООТ
ООТ ТОТ ОТТ ТТС ААС АТС ТТС ААС ТОТ ООТ ООТ ООО (8 ЕС ГО №:507), и обратный ССС АСС АСС АСА ОТТ ОАА ОАТ ОТТ ОАА ААС АСА АСС АСС (8ЕС ГО №:508); Ес-5-106-М4Ь, прямой ООТ ООТ ТОТ ОТТ ТТС ААС ТТО ТТС ААС ТОТ ООТ ООТ ООО (8ЕС ГО №:509), и обратный ССС АСС АСС АСА ОТТ ОАА САА ОТТ ОАА ААС АСА АСС АСС (8ЕС ГО №:510); ΕΟ-5-106-Μ4Ν, прямой ООТ ООТ ТОТ ОТТ ТТС ААС ААС ТТС ААС ТОТ ООТ ООТ ООО (8 ЕС ГО №:511), и обратный ССС АСС АСС АСА ОТТ ОАА ОТТ ОТТ ОАА ААС АСА АСС АСС (8ЕС ГО №:512); Ес-5-106-М4С, прямой ООТ ООТ ТОТ ОТТ ТТС ААС САО ТТС ААС ТОТ ООТ ООТ ООО
- 53 032985 (8ЕС ГО №:513), и обратный ССС АСС АСС АСА ОТТ САА СТС ОТТ САА ААС АСА АСС АСС (8Е() ГО №:514); Рс-5-106-М48, прямой СОТ ОСТ ТОТ ОТТ ТТС ААС ТСС ТТС ААС ТОТ СОТ СОТ ССС (8ЕС ГО №:515), и обратный ССС АСС АСС АСА ОТТ САА СОА ОТТ САА ААС АСА АСС АСС (8Е(3 ГО №:516); Гс-5-106-М4Т, прямой СОТ СОТ ТОТ ОТТ ТТС ААС АСС ТТС ААС ТОТ ОСТ ОСТ ССС (8Ε(^ ГО №:517), и обратный ССС АСС АСС АСА ОТТ САА СОТ ОТТ САА ААС АСА АСС АСС (8Ε(^ ГО №:518); Рс-5-106-М4У, прямой СОТ СОТ ТОТ СТТ ТТС ААС СТС ТТС ААС ТОТ СОТ СОТ ССС (8Ер ГО №:519), и обратный ССС АСС АСС АСА СТТ САА САС СТТ САА ААС АСА АСС АСС (8Ер ГО №:520).
Реакции ПЦР проводили, как было описано выше, и применяли их для трансформации Е.сой. ДНКплазмиды из отдельных колоний секвенировали. Отбирали изоляты, кодирующие фрагменты Рс, содержащие вставки со следующими последовательностями:
РС-5-106-М4А, ΟαΟνΓΝΑΡΝΟΟα (8Εζ) ГО №:369); Рс-5-106-М4С, СССУРМСРМССС (8Е(Д ГО №:370); Рс-5-106-М4Н, σαΟνΡΝΗΡΝΟσσ (8Е0 Го №:371); Рс-5-106-М41, СОСУРМРЫССС (8Е(^ ГО №:372); Рс-5-106-М4Ь, СССУЕЖРМССС (8Е(^ Ю №:373); ΡΟ-5-106-Μ4Ν, ΟϋΟνΡΝΝΡΝΟΟϋ (8Е0 ГО №:374); Рс-5-106-М4О, ΟθΟνΡΝΟΡΝΟΟΟ (8Е0 ГО №:375); Рс-5-106-М48,
ΘΟΟνΓΝδΡΝΟΟΟ (8Е(} ГО №:376); Рс-5-106-М4Т, ΟΟΟνΡΝΤΡΝΟΟΟ (8Е(} ГО №:377); РС-5-106-М4У, СССУРЖТРГССС (8Е(^ ГО №:378).
Создавали указанные производные Рс-5-69 и Рс-5-106 и оценивали у них относительное сродство связывания с РсКп человека и яванской макаки при рН 5,5 и 7,4 с применением способов, описанных в примере 7.
Таблица 5. Связывание вариантов Рс-5-69 и Рс-5-106 с РсКп человека и яванских макак
РсКп человека рН5,5 РсКп человека рН7,4 РсКп яванской макаки рН5,5 РсКп яванской макаки рН7,4
Проба ЕС50 (нМ) 95% ДИ (нМ) ЕС50 (нМ) 95% ДИ (нМ) ЕС50 (нМ) 95% ДИ (нМ) ЕС50 (нМ) 95% ДИ (нМ)
Рс-УТГ 270 170-440 >2000 250 130-470 >2000
Рс-5-69 20 13-30 1100 960-1400
Рс-5-69- УТР 57 36-89 >2000
Рс-5-69- УТУ 140 75-240 >2000
Рс-5-106 5,4 3,7-8,0 1400 1100-1700 4,6 3,5-6,1 >2000
Рс-5-106-М4А 27 16-45 >2000
Рс-5-106-М4С 100 66-160 >2000
Рс-5-106-М4Н 100 48-230 >2000
РС-5-106-М41 2,6 1,8-3,6 900 760-1100 3,2 2,1-4,8 970 810-1200
РС-5-106-М4Е 2,3 1,5-3,4 650 460-920 2,8 1,6-4,7 710 460-1100
ΡΟ-5-106-Μ4Ν 100 52-180 >2000
Рс-5-106-М4О 34 17-68 >2000
Рс-5-106-М48 58 32-106 >2000
Рс-5-106-М4Т 10 4,4-21 >2000 8,3 5,3-13 >2000
Рс-5-106-М4У 6,2 3,6-11 >2000 5,0 3,4-7,3 >2000
Оба производных Рс-5-69 демонстрировали при рН 5,5 более слабое сродство связывания, чем сам Рс-5-69. Два производных Рс-5-106 (Рс-5-106-М41 и Рс-5-106-М4Ь) демонстрировали при рН 7,4 по более высокое сродство связывания как с РсКп человека, так и с РсКп яванской макаки сравнению с Рс-5106. Также четыре производных Рс-5-106, включая указанные два производных (Рс-5-106-М41, Рс-5-106М4Ь, Рс-5-106-М4Т и Ес-5-106-М4У) демонстрировали повышенную или приблизительно такую же активность связывания при рН 5,5, по сравнению с самим Рс-5-106. Указанные четыре производных анализировали с целью определения сродства связывания с РсКп яванской макаки. Все четыре производных
- 54 032985 демонстрировали ЕС50 для связывания с ЕсКп яванской макаки, которое было близко к значению ЕС50 для связывания с ЕсКп человека как при рн 5,5, так и при рн 7,4.
Пример 9. Описание свойств вариантов фрагментов Рс ίη у1уо.
Чтобы выяснить, обладают ли антитела, содержащие описанные выше варианты фрагментов Ес, улучшенными фармакокинетическими (ФК) свойствами ίη у1уо, для определения фармакокинетических параметров проводили оценку немодифицированного антитела X (которое является антителом к 1Ь-23 человека изотипа Ι§Ο2 человека) и вариантов антитела X, содержащих варианты фрагментов Ес, ίη у1уо на яванских макаках. Антитело X было выбрано в качестве подходящего антитела для оценки фармакокинетических параметров вариантов фрагмента Ес, поскольку было известно, что оно обладает линейным ФК профилем, и поскольку известно, что ГЬ-23 экспрессируется ίη у1уо в малом количестве. Таким образом, ожидалось, что связанные с мишенями эффекты на параметры ФК будут минимальны, что облегчит определение ФК действия, связанного с вариантами фрагментов Ес.
Было получено пять вариантов антител Ι§Ο2, названных Х-5-51, Х-5-69, Х-5-104, Х-5-106 и Х-5112. Указанные антитела Ι§Ο2 содержали те же вставки в тех же положениях (согласно выравниванию в табл. 1), что и варианты фрагментов Ес Ι§Ο1 Ес-5-51, Ес-5-69, Ес-5-104, Ес-5-106 и Ес-5-112, соответственно. Более конкретно, вставки были введены между аминокислотами 384 и 385 (система нумерации ЕС в табл. 1) во фрагменте Ес Ι§Ο2 человека. В качестве матрицы для пяти реакций ПЦР применяли плазмиду, содержащую ДНК, кодирующую тяжелую цепь антитела X; указанные пять реакций проводили с применением следующих праймеров: для Х-5-51, прямой
5'-САС ТОО ОАО АОС ААТ ООТ ООТ ТОТ САТ СТО ССО ТТС
ОСТ ОТТ ТОТ ООТ ООТ ООО САО ССО ОАО ААС-3' (8Е(^ ГО №:539) и обратный 5'-ОТТ СТС
СОО СТО ССС АСС АСС АСА ААС АСС ОАА СОО САО АТО АСА АСС АСС АТТ ОСТ СТС
ССА СТС-3' (8ЕЦ ГО №:540); для Х-5-69, прямой 5'-ОАО ТОО ОАО АСС ААТ ООТ ООТ ТОТ ТОО ССО СТО САО ОАС ТАС ТОТ СОТ ООТ ООО САО ССО ОАО ААС-3' (8Е(^ ГО №:541) и обратный, 5'-ОТТ СТС СОО СТС ССС АСС АСС АСА СТА СТС СТС САС СОО ССА АСА АСС АСС АТТ ОСТ СТС ССА СТС-3' (8ЕЦ ГО №:542); для Х-5-104, прямой 5'-САС ТОО САО АСС
ААТ ООТ ООТ ТОТ ООТ САТ САА ТАС АТС ТОО ТСТ ОСТ ООО САС ССО САС ААС-3' (8ЕЦ ГО №:543) и обратный 5'-СТТ СТС ССС СТС ССС АСС АСА ССА САТ СТА ТТС АТС АСС АСА АСС АСС АТТ ОСТ СТС ССА СТС-3' (8Е(^ ГО №:544); для Х-5-106, прямой 5'-САО ТСС САС
Л Г'Г' ЛАТ ТГТ Г^’-Г’-Г ’-Г’-ГГ^ ЛАГ А Т'/’’ ТТЛ' А ЛЛ' Г' Γ^'Ύ' Г'Г'Г' Г к Г Г'Г'Г' Г X Г
ΖΑνίν 2ΑΖΎ1 VIVII VIVI 1 1 VII VII 1 1 IV ΖΑΖΎν ΖΑΐνΐ 1 IV ΛΛν 1 νιι νινιι νινιι VIVIνι νχχνι νννι νιχχνι
ААС-3' (8Ε() ГО №:545), и обратный 5'-СТТ СТС ССС СТС ССС АСС АСС АСА ОТТ САА САТ
ОТТ САА ААС АСА АСС АСС АТТ ОСТ СТС ССА СТС-3' (8Е(^ ГО №:546); а для Х-5-112, прямой 5'-000 ТОО САС АСС ААТ ОСТ СОТ ТСТ ОСТ СТС ТАС ССС АСТ ААС ТСТ СОТ СОТ ССС
САО ССС САС ААС-3' (8Е(^ ГО №:547), и обратный 5'-СТТ СТС ССС СТС ССС АСС АСС АСА
ОТТ АСТ ССС ОТА САС АСС АСА АСС АСС АТТ ОСТ СТС ССА СТС-3' (8Е(^ ГО №:548).
Применяли протокол для набора для сайт-направленного мутагенеза ^и^ксйаηде (8ΐ^аΐадеηе, 200518). Реакционная смесь включала 200 нМ дезоксирибонулкеозидтрифосфатов (άΝΤΡ), 100 нМ праймеров, 1 нг ДНК-матрицы, 1 мкл ДНК-полимеразы и воду до общего объема 50 мкл. Реакцию проводили при 95°С в течение 30 с, затем проводили 16 циклов при 95°С в течение 30 с, 55°С в течение 60 с, 68°С в течение 6 мин, а затем при 68°С в течение 10 мин. Затем добавляли 1 мкл Эрп1, и реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Затем 2 мкл смеси применяли для трансформации 30 мкл суперкомпетентных клеток X^1-Ыие (8ΐ^аΐадеηе) при 42°С в течение 45 с. Затем добавляли 0,5 мл 8ОС, и клетки инкубировали при 37°С в течение 1 ч на шейкере при 300 об/мин. Трансформированные клетки распределяли на чашках с агаром Луриа-Бертани, содержащим ампициллин, и инкубировали в течение ночи при 37°С. Отдельные колонии отбирали, и ДНК-плазмиду подготавливали и секвенировали, чтобы убедиться, что выбранные изоляты содержали ожидаемую последовательность ДНК.
Антитела подготавливали по существу так же, как описано выше для фрагментов Ес, за исключением того, что клетки-хозяева млекопитающих трансфецировали ДНК, кодирующими как тяжелую цепь ΙβΟ2, содержащую часть, кодирующую либо вариант, либо контрольный фрагмент Ес, так и легкую цепь антитела X. Клетки-хозяева инкубировали при условиях, пригодных для экспрессии указанных антител, и антитела восстанавливали из питательной среды, очищали, как описано выше, и применяли для следующих экспериментов.
Яванские макаки (п=2/группу) получали однократно внутривенно немодифицированные антитела X или варианты антител X в дозе 1 мг/кг, и далее находились под наблюдением в течение 8 недель прижизненно. Пробы крови отбирали в заранее определенные моменты времени на протяжении всего эксперимента. Пробы отбирали до введения дозы, через 0,25, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 168, 240, 336,408, 504, 576, 672, 744, 840, 1008, 1176 и 1344 часов после введения дозы.
- 55 032985
Для определения концентраций введенных антител в системном кровотоке применяли сэндвичЕЫ8А с антителами на 1дО человека и сравнивали результаты со стандартной кривой, полученной для той же молекулы. В частности, антитела мыши на Гс фрагмент человека разводили в ФСБ, наносили в планшеты и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре.
Содержимое лунок сливали, и в лунки в качестве блокирующего буфера добавляли ФСБ-Тм'ееп 20 (8ирегВ1оск®, Тйегто 801^1160). После инкубации в течение одного часа при комнатной температуре лунки планшетов промывали ФСБ-Т^ееи 20 и добавляли в лунки пробы сыворотки, после чего инкубировали их в течение 1 ч при встряхивании. Лунки повторно промывали, и в планшеты добавляли антитела мыши на фрагмент Ес человека, меченные пероксидазой хрена. После инкубации в течение одного часа лунки промывали, и реакции давали развиться в течение 10 мин с применением субстрата 3,3',5,5'тетраметилбензидина (ТМВ). Получаемую в результате колориметрическую реакцию останавливали при помощи фосфорной или серной кислоты, добавляемой в планшет. Оптическую плотность (ΟΌ) определяли на 450 нм и 650 нм. И ΟΌ на 650 нм вычитали из ΟΌ на 450 нм. Перевод значений ΟΌ в концентрации для исследуемых проб проводили по регрессии на основе данных с применением логистической модели с весовыми коэффициентами, приравненными 1/Υ2 в лабораторной информационной системе Уотсона, версия 7.0.0.04.
Фармакокинетический анализ проводили при помощи пакета для ФК анализа, предлагаемого в лабораторной информационной системе Уотсона, версия 7.0.0.04. Значения воздействия (площадь под кривой (АИС)) и клиренса (мл/кг/ч) получали из указанного анализа. Данные зависимости концентрации от времени для последних 5 точек отбора проб для каждой яванской макаки применяли для расчета времени полужизни (Т1/2).
Как показано на фиг. 4, все варианты антитела X, содержащие варианты фрагментов Ес Х-5-51, Х-569, Х-5-104, Х-5-106 и Х-5-112, демонстрировали более высокие концентрации тАЬ (моноклонального антитела) у яванских макак в конкретный момент времени отбора пробы по сравнению с немодифицированным антителом X. Как показано в табл. 6, для всех оцениваемых вариантов антитела X были продемонстрированы более высокие значения воздействия и более низкие значения клиренса по сравнению с немодифицированным антителом X. Один вариант, который не демонстрировал более высокого значения времени полужизни (Х-5-106), может соответствовать ситуации, в которой у обезьян могли выработаться антитела на вводимое антитело, поскольку данные для одной из двух обезьян указывали на очень короткое время полужизни (48 часов), причем данные для другой обезьяны указывали на более длительное время полужизни (538 часов). Данный вопрос могли бы прояснить дополнительные эксперименты по измерению наличия антител на лекарственный препарат.
Таблица 6. Средние значения времени полужизни, воздействия и клиренса
Немодифиц ированное антитело X X- 5-51 Х-5-69 Х-5-104 Х-5-106 Х-5-112
Τι/г (часы) 335 910 550 477 191 520
АиС-воздейс твис 3890 6640 4960 5745 6005 7810
(мкг*ч/мл)
Клиренс (мл/кг/ч) 0,247 0,109 0,173 0,153 0,154 0,108
В целом, указанные данные свидетельствуют о том, что усиленное связывание варианта фрагмента Ес с ЕсКи при рН 5,5-6,0 (по сравнению с контрольным фрагментом Ес) и быстрая диссоциация от ЕсКи при рН 7,4 коррелирует с более продолжительным временем полужизни антитела, содержащего вариант фрагмента Ес, у яванских макак. Однако точная количественная зависимость между степенью усиления связывания при рН 5,5 или 6 варианта фрагмента Ес 1дО1 и степенью улучшения фармакокинетических параметров для полноразмерного антитела 1дО2, содержащего ту же вставку, что и указанный вариант фрагмента Ес, на основании настоящих данных не показана. Однако настоящие данные указывают на то, что Х-5-51, Х-5-69, Х-5-104 и Х-5-112 обладают увеличенным временем полужизни по сравнению с немодифицированным антителом X, и позволяют предположить, что то же справедливо и для Х-5-106. Кроме того, все оцениваемые варианты антител обладали более низкой скоростью жизни и более высоким воздействием по сравнению с контрольным антителом.
Пример 10. Конструирование вариантов фрагментов Ес со вставками в чередующихся сайтах.
Тот факт, что многие варианты из библиотеки Б5 обладали желаемыми свойствами, указывает на то, что положение указанных вставок было благоприятным. Чтобы определить, могут ли обладать лучшими свойствами сайты в той же петле или вблизи нее в качестве сайта вставки Б5, были проведены следующие эксперименты. Для проверки данной идеи один из выбранных пептидов встраивали в другую
- 56 032985 локализацию данной петли, и полученные варианты фрагментов Ес оценивали в отношении связывания с ЕсКп. В качестве пептида для вставки была избрана пептидная вставка варианта фрагмента Ес 5-1. Указанный пептид обладал следующей последовательностью аминокислот: ООСОМР1ЕЕСОС (8ЕР ГО №: 67). Как показано на фиг. 5 (на которой применена система нумерации ЕС, как показано в качестве примера в табл. 1), данный пептид встраивали в сайты в петле или рядом с указанной петлей библиотеки Ь5, которая была отлична от сайта вставки библиотеки Б5. Связывание полученных фрагментов Ес с ЕсКп оценивали при помощи биосенсоров 8А (Еог1еБю, 1пс., 18-5019) с покрытием из биотинилированного ИиЕсКп, как описано в примере 4 выше.
Более конкретно, конструкты ДНК, кодирующие указанные варианты фрагментов Ес, получали следующим образом. Применяли протокол для набора для сайт-направленного мутагенеза Ршксйапде (81га1адепе, 200518). Реакционная смесь включала 200 нМ с1\'ТР, 100 нМ праймеров, 1 нг ДНКматрицы, 1 мкл ДНК-полимеразы и воду до общего объема 50 мкл. Праймеры, применяемые в указанных реакциях для каждого варианта, показаны ниже в табл. 7. ДНК-матрицей была кДНК, кодирующая полипептид Ес 1дО1 человека дикого типа, встроенная в вектор. Реакцию проводили при 95°С в течение 30 с, затем проводили 16 циклов при 95°С в течение 30 с, 55°С в течение 60 с, 68°С в течение 6 мин, а затем при 68°С в течение 10 мин. Затем добавляли 1 мкл Брп1, и реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Затем 2 мкл смеси применяли для трансформации 30 мкл суперкомпетентных клеток Е.сой ХЫ-Ыие (81га1адепе) при 42°С в течение 45 с. Затем добавляли 0,5 мл 8ОС (супероптимального бульона - содержал 2% бактотриптона, 0,5% экстракта дрожжей, 10 нМ №С1, 2,5 мМ КС1, 10 мМ МдС12 и 20 мМ глюкозы), и клетки инкубировали при 37°С в течение 1 ч на шейкере при 300 об/мин. Трансформированные клетки распределяли на чашках с агаром Луриа-Бертани, содержащим ампициллин, и инкубировали в течение ночи при 37°С. Трансформированные клетки распределяли на чашках с агаром ЛуриаБертани, содержащим ампициллин, и инкубировали в течение ночи при 37°С.
Таблица 7. Праймеры, применяемые при ПЦР для конструирования ДНК, кодирующих варианты фрагментов Ес
Обозначение варианта фрагмента Прямой праймер Обратный праймер
5-1-1 5'- ОСТ ОТО ОАО ТОО ОАО ООТ ООТ ТОТ ООТ АТО ССО АТС ОАА ТТС ТОТ ООТ ООТ АСС ААТ ООО САО ССО-3' (8ЕЦ ГО №:68) 5'- СОО СТО ССС АТТ ОСТ АСС АСС АСА ОАА ТТС ОАТ СОО САТ АСС АСА АСС АСС СТС ССА СТС САС АОС-3' (8ЕЦ ГО №:69)
5-1-2 5'- ОТО ОАО ТОО ОАО АСС ООТ ООТ ТОТ ООТ АТО ССО АТС ОАА ТТС ТОТ ООТ ООТ ААТ ООО САО ССО ОАО-3' (8ЕЦ ГО №:70) 5'- СТС СОО СТО ССС АТТ АСС АСС АСА ОАА ТТС ОАТ СОО САТ АСС АСА АСС АСС ОСТ СТС ССА СТС САС-3' (8ЕЦ ГО №:71)
5-1-3 5’- ТОО ОАО АСС ААТ ООО ООТ ООТ ТОТ ООТ АТО ССО АТС ОАА ТТС ТОТ ООТ ООТ САО ССО ОАО ААСААС-3'(8ЕЦ ГО №:72) 51. ОТТ ОТТ СТС СОО СТО АСС АСС АСА ОАА ТТС ОАТ СОО САТ АСС АСА АСС АСС ССС АТТ ОСТ СТС ССА-3' (8ЕЦ ГО №:73)
5-1-4 5'- ОАО АСС ААТ ООО САО ООТ ООТ ТОТ ООТ АТО ССО АТС ОАА ТТС ТОТ ООТ ООТ ССО ОАО ААС ААСТАС-3'(8ЕЦ ГО №:74) 5' ОТА ОТТ ОТТ СТС СОО АСС АСС АСА ОАА ТТС ОАТ СОО САТ АСС АСА АСС АСС СТО ССС АТТ ОСТ СТС-3' (8ЕЦ ГО№:75)
5-1-5 5'- АСС ААТ ООО САО ССО ООТ ООТ ТОТ ООТ АТО ССО АТС ОАА ТТС ТОТ ООТ ООТ ОАО 5'- СТТ ОТА ОТТ ОТТ СТС АСС АСС АСА ОАА ТТС ОАТ СОО САТ АСС АСА АСС АСС СОО СТО ССС
- 57 032985
ААС ААС ТАС А АС-3' (8 ЕС ГО №:76) АТТ ОСТ-3' (8Е0 ГО №:77)
5-1-6 5'- ААТ ООО С АО ССО ОАО ООТ ООТ ТОТ ООТ АТО ССО АТС ОАА ТТС ТОТ ООТ ООТ ААС ААС ТАС ААО АСС-3' (8ЕС> ГО №:78) 5'-ООТ СТТ ОТА ОТТ ОТТ АСС АСС АСА ОАА ТТС ОАТ СОО САТ АСС АСА АСС АСС СТС СОО СТО ССС АТТ-3' (8Е0 ГО №:79)
5-1-7 5'-000 С АО ССО ОАО ААС ООТ ООТ ТОТ ООТ АТО ССО АТС ОАА ТТС ТОТ ООТ ООТ ААС ТАС ААО АССАСО-3'(8Е(^ГО№:80) 5'-СОТ ООТ СТТ ОТА ОТТ АСС АСС АСА ОАА ТТС ОАТ СОО САТ АСС АСА АСС АСС ОТТ СТС СОО СТО ССС-3'(8Е(} ГО№:81)
5-1-8 5'-САО ССО ОАО ААС ААС ООТ ООТ ТОТ ООТ АТО ССО АТС ОАА ТТС ТОТ ООТ ООТ ТАС ААО АСС АСО ССТ-3' (8Е(^ ГО №:82) 5'- АОО СОТ ООТ СТТ ОТА АСС АСС АСА ОАА ТТС ОАТ СОО САТ АСС АСА АСС АСС ОТТ ОТТ СТС СОО СТО-3' (8Е() ГО №:83)
5-1-9 5'- ОТО ОАО ТОО ОАО АСС ООТ ООТ ТОТ ООТ АТО ССО АТС ОАА ТТС ТОТ ООТ ООТ ССО ОАО ААС ААСТАС-3'(8ЕС) ГО №:84) 5'- ОТА ОТТ ОТТ СТС СОО АСС АСС АСА ОАА ТТС ОАТ СОО САТ АСС АСА АСС АСС ОСТ СТС ССА СТС САС-3' (8Е0 ГО №:85)
5-1-10 5'- ОТО ОАО ТОО ОАО АСС ООТ ООТ ООТ ТОТ ООТ АТО ССО АТС ОАА ТТС ТОТ ООТ ООТ ООТ ССО ОАО ААС ААС ТАС-3' (8Е(^ ГО№:86) 5'- ОТА ОТТ ОТТ СТС СОО АСС АСС АСС АСА ОАА ТТС ОАТ СОО САТ АСС АСА АСС АСС АСС ОСТ СТС ССА СТС САС-3' (8Е(^ ГО №:87)
Отдельные колонии отбирали, и ДНК-плазмиду подготавливали и секвенировали. ДНК, кодирующую указанные варианты фрагментов Ес, вводили в клетки 293-6Е, и фрагмнты Ес в кондиционированной среде (СМ) от указанных клеток применяли для проведения анализа связывания по протоколу Еог1еВю, как описано выше. См. Пример 4.
Результаты относительно связывания при рН 6 и диссоциации при рН 7 показаны на фиг. 6. Два из вариантов фрагментов Ес - 5-1-10 и 5-1-2 демонстрировали максимальную реакцию, превышающую реакцию варианта 5-1 при рН 6, но также более медленно диссоциировали при рН 7,4. См. фиг. 6. Все другие конструкции при рН 6,0 демонстрировали не такую максимальную реакцию, как вариант 5-1, но реакция всех из них была сопоставимой или больше, чем реакция фрагмента Ес дикого типа (на фигуре 6 обозначен ЕсVΤ). Кроме того, диссоциация указанных конструкций при рН 7,4, в отличие от 5-1, была сопоставимой с диссоциацией ЕсVΤ. Таким образом, большинство из вариантов Ес, кроме 5-1-2 и 5-1-10 (оба из которых содержали вставку между положениями 383 и 384), со вставками в петле 10 или вблизи нее, при рН 7,4 диссоциировали быстрее, чем вариант 5-1. Также варианты 5-1-1, 5-1-2, 5-1-3, 5-1-9 и 5-110 явно демонстрировали более выраженную максимальную реакцию, чем у ЕсVΤ при рН 6, вариант 5-1, тогда как варианты 5-1-6, 5-1-7 и 5-1-8 демонстрировали максимальную реакцию, сопоставимую с реакцией ЕсVΤ. Варианты 5-1-4 и 5-1-5 демонстрировали максимальную реакцию, только ненамного превышающую реакцию ЕсVΤ. Указанные данные свидетельствуют о том, что вставка пептида обладала более благоприятным действием в определенных сайтах в петле 10. В частности, вставка между положениями 382 и 383, 383 и 384, 384 и 385, 385 и 386 (по системе нумерации ЕС, которая проиллюстрирована в табл. 1 и на фиг. 5) приводила к получению вариантов фрагментов Ес, которые демонстрировали более выраженную максимальную реакцию при рН 6, чем ЕсVΐ, плюс быструю диссоциацию при рН 7,4. Напротив, варианты Ес, содержащие вставки между положениями 388 и 389, 389 и 390 или 390 и 391, обладали свойствами, сходными со свойствами ЕсVΤ. И наконец, варианты Ес, содержащие вставки между положениями 386 и 387 или 387 и 388 демонстрировали реакции, немного превышающие реакции ЕсVΤ, при рН 6 и быструю диссоциацию при рН 7,4. Кроме того, делетирование аминокислот 384-386 и вставка пептида на их место, как было сделано в вариантах 5-1-9 и 5-1-10, также приводит к улучшению свойств
- 58 032985 указанных вариантов Ес по сравнению с Ес№Т. Вставка большей длины в 5-1-10, которая содержит три вместо двух остатков глицина (как у 5-1-9) в начале и конце вставки, приводит к большей реакции, чем у любого другого варианта, включая 5-1-2, который содержит вставку (без сопутствующей делеции) между положениями 383 и 384. Указанные данные свидетельствуют о том, что вставки пептида, которые могут усиливать связывание с ЕсЕп в области вблизи положений 382 и 387, могут усиливать связывание фрагмента Ес с ЕсЕп при рН 6, но препятствовать быстрой диссоциации от ЕсЕп при рН 7,4. С другой стороны, вставка такого пептида между положениями 388 и 391 не усиливает значительно активности связывания и/или сродства фрагмента Ес с ЕсЕп при рН 6 по сравнению с Ес№Т, а также оказывает маленькое влияние или не оказывает его на диссоциацию при рН 7,4. Таким образом, указанные данные свидетельствуют, что часть петли 10, т.е., с положения 382 по 386, 387 или 388 (нумерация ЕС), содержит особенно благоприятные сайты для произведения вставок, которые могут повышать активность и/или сродство связывания с ЕсЕп при рН 6.
Пример 11. Выбор варианта фрагмента Ес при помощи дрожжевого дисплея.
Для получения другой группы вариантов полипептидов Ес проводили отбор при помощи дрожжевого дисплея. Чтобы создать библиотеки для скрининга у дрожжей, в качестве отправной точки применяли библиотеки, созданные ранее. Одной из них была библиотека Ь5, которая описана выше. См. фиг. 2 и пример 2. Две другие библиотеки содержали вставки точно в том же сайте, что библиотека Ь5, и были получены с применением тех же общих методик, которые применяли для получения библиотеки Ь5, но форма вставок отличалась тем, что библиотека Ь5 кодировала вставками с шестью выбранными случайным образом аминокислотами, тогда как библиотеки Ь-8 и Ь-10 кодировали вставки с восьмью и десятью аминокислотами, выбранными случайным образом, соответственно. Более конкретно, указанные библиотеки кодировали вставки следующей формы: библиотека Ь-8, ССС(19Е)8ССС (8Е0 ΙΌ N0: 88); и библиотека Ь-10, ССС(19Е)юССС (8Е0 ΙΌ N0: 89). Указанные вставки, как и вставки в библиотеке Ь5, находятся между Ν в положении 169 и О в положении 170 согласно схеме нумерации на фиг. 2. (19Е)8 и (19Е)10 обозначают восемь и десять, соответственно, выбранных случайным образом аминокислот, которые могут быть любой аминокислотой кроме цистеина.
Библиотеки Ь-5, Ь-8 и Ь-10 расщепляли при помощи 8асП и ΝοΐΙ, и полученные фрагменты, которые кодировали фрагменты Ес, очищали и вшивали в вектор, пригодный для экспрессии как у ЕксБепсЫа со11, так и у пекарских дрожжей. Также указанный вектор кодировал НА-метку (последовательность короткого пептида (УРУОУРОУЛ)(8Е0 ΙΌ №: 575) из гемагглютинина вируса гриппа человека) в одной рамке считывания со вставкой, который применяли для подтверждения того, что области Ес представляются на поверхности клеток дрожжей. Указанные три новые библиотеки вводили в клетки Е.соБ, в частности, в суперкомпетентные клетки Е. со11 ХЬ1-В1ие. ДНК приблизительного из 5х108 трансформантов Е.со11 применяли для трансформации приблизительно 1-2х109 клеток пекарских дрожжей с применением стандартного способа с ацетатом лития. Прожившую в течение ночи культуру пекарских дрожжей разводили до 0Ό6οο 0,2-0,3 в 100 миллилтрах среды с экстрактом дрожжей, пептоном и декстрозой (которая содержала 20 г/л бактопептона, 10 г/л экстракта дрожжей, 2% глюкозы (ΥΏΡ)) и выращивали при 30°С и при встряхивании на 300 об/мин, пока ОЭ6оо не достигала 1,0-2,0. Затем клетки промывали 30 миллилитрами воды и 30 миллилитрами 100 мМ ЫОАс. Для каждой библиотеки к клеткам добавляли смесь для трансформации, содержащую 1М ЫОАс, 50% ПЭГ, одноцепочечную ДНК-носитель, воду и 25 мкг ДНК библиотеки. Для каждой трансформации создавали тепловой шок при 42°С в течение 45 мин. Клетки осаждали центрифугированием и затем выращивали в 50 миллилитрах среды ΥΡΌ при 30°С в течение 1 ч. Клетки повторно осаждали центрифугированием и промывали 30 миллилитрами среды 8И-1еи (14,7 г/л цитрата натрия, 4,29 г/л лимонной кислоты, 2% декстрозы, 6,7 г/л основы азотного агара для дрожжей (УХВ), 1,6 г/л синтетических добавок для ослабляющей среды для дрожжей без лейцина (81дта, Υ1376)). Затем клетки повторно суспендировали в 10 мл среды 8И-1еи. Затем 10 миллилитров трансформированных клеток засевали в 300 мл среды 8И-1еи и выращивали в течение ночи при 30°С.
Индукции экспрессии вариантов фрагментов Ес в трансформантах дрожжей достигали путем засевания аликвоты ночной культуры (приблизительно 108 клеток) в среду для индукции (5,4г/л Ха2НРО4, 8,56 г/л ХаН2РО4,2% галактозы, 6,7 г/л Υ^^ и 1,6 г/л синтетических добавок для ослабляющей среды для дрожжей без лейцина (81дта, Υ1376)) и культивирования приблизительно в течение 48 ч при 20°С.
Указанные индуцированные клетки соскабливали и повторно суспендировали в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) (+0,5% БСА) при рН 7,4. Затем 0,5-1х108 индуцированных клеток инкубировали в течение одного часа с 1 мкл биотинилированного ЕсЕп (биотин- ЕсЕп). Затем клетки промывали и инкубировали с 2 мкг/мл меченного стрептавидина (страптавидин(8А)- А1еха Е1иог® 647 (Каталожный номер 832357, 'Чт'Пгодеп)) в течение 15 мин. Затем клетки промывали и инкубировали с микрогранулами с антителами на Су5/А1еха Е1иог® 647 (Каталожный номер 130-091-395, МАС8 М111епу1 Вю1ес) в течение 15 мин. Клетки промывали и отделяли при помощи колонок Ь8 (Каталожный номер 130-042-401, МАС8 М111епу| Вю1ес) и разделительного блока ОиайгоМАС8® (Каталожный номер 130-091-051, МАС8 М111епу1 Вю1ес). Аликвоты предколоночной, обрабатываемой фракций, фракции промывки и десорбции собирали для анализа ЕАС8. Обрабатываемую фракцию и фракцию промывки отбирали как истощенную попу
- 59 032985 ляцию, которая содержала клетки, экспрессирующие варианты полипептидов Ес, которые связывались с ЕсКи с очень низким сродством при рН 7,4.
Данную истощенную популяцию клеток затем выращивали в течение ночи при 30°С в среде 8О-1еи. Затем проводили индукцию клеток в течение 48 ч при 20°С в среде для индукции, как описано выше. Последующие этапы промывки и инкубации проводили в буфере МЕ8 (20 мМ МЕ8, 137 мМ ЯаС1, 0,5% БСА) при рН 5,5. Индуцированные клетки инкубировали на льду с 250 нМ биотин-ЕсКи в течение одного часа. Затем добавляли 8А-А1еха Е1иог® 647 (2 мкг/мл) и анти-НА-Е1ТС (анти-гемагглютининфлуоресцеин изотиоцианат) (1 мкг/мл) и после промывки и пропускания клеток через клеточное сито, клетки подвергали анализу ЕАС8 при рН 5,5. Створ был установлен таким образом, чтобы собирать клетки, которые проявляли надежный сигнал как в отношении Е1ТС, так и А1еха Е1иог®. Указанные клетки затем культивировали в течение ночи при 30°С в среде 8О-1еи, а затем проводили их индукцию в течение 48 ч при 20°С в среде для индукции. Затем во втором цикле индуцированные клетки инкубировали на льду с 25 нМ биотина-ЕсКи в течение одного часа, а затем повторяли мечение, промывку, окрашивание, ЕАС8, культивирование и индукцию, как описано выше. В заключении, в третьем цикле индуцированные клетки инкубировали на льду с 5 нМ биотина-ЕсКи в течение одного часа, а затем повторяли мечение, промывку, окрашивание, ЕАС8, культивирование и индукцию, как описано выше. Следовательно, конечным результатом была популяция клеток, экспрессирующих фрагменты Ес, которые при рН 5,5. могли связываться с ЕсКи с более высоким сродством, чем фрагмент Ес дикого типа.
Указанную популяцию клеток помещали в чашки Петри, и 500 колоний из библиотеки Ь5 и 400 колоний из каждой из библиотек Ь-8 - Ь-10 были отобраны для последующего анализа. Каждую из указанных отдельных колоний культивировали при 30°С в течение ночи в среде 8О-1еи, как описано выше. Последовательности вставок в каждом из указанных изолятов определяли на основании ДНК-плазмиды дрожжей. Среди указанных изолятов в каждой библиотеке Ь5, Ь-8 и Ь-10, соответственно, было выявлено всего 317, 256 и 313 уникальных последовательностей. Затем проводили индукцию клеток при 20°С в течение 48 ч в среде для индукции. Описанной выше. Последующие этапы промывки и инкубации проводили параллельно в буфере МЕ8 (20 мМ МЕ8, 137 мМ ЯаС1, 0,5% БСА) при рН 5,5 и в буфере ФСБ (+0,5% БСА) при рН 7,4. Приблизительно 5х105 клеток на пробу инкубировали с 250 нМ биотина-ЕсКи и 1 мкг/мл анти-НА-Е1ТС в течение 1 ч. Затем клетки промывали и инкубировали с 2 мкг/мл 8А-А1еха Е1иог 647 в течение 15 мин. Клетки промывали и анализировали в отношении связывания посредством ЕАС8, чтобы определить, связываются ли они сильно с ЕсКи при рН 5,5 и слабо при рН 7,4. Отдельные линии клеток с максимальным сигналом, описывающим связывание с ЕсКи при рН 5,5, и одновременно со слабым сигналом, описывающим связывание с ЕсКи при рН 7,4, а также с малым количеством или отсутствием остатков метионина или триптофана отбирали из каждой библиотеки для последующего анализа. Указанные выбранные изоляты включали 158, 59 и 50 линий клеток из библиотек Ь5, Ь-8 и Ь10, соответственно, а последовательности вставок в указанных изолятах приведены в табл. 8 ниже. (Следует отметить, что клон под названием 5у-37 не был включен в дальнейший анализ, поскольку он не был успешно повторно клонирован в соответствующий вектор).
Таблица 8. Последовательности вариантов полипептидов, которые связываются с высоким родством при рН 5,5 и . низким сродством при рН 7,4
БИБЛИОТЕКА Ь5 БИБЛИОТЕКА Ь-8 БИБЛИОТЕКА Ь-10
Клон ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНО СТЬ ВСТАВКИ (8ЕЦ П) №) Кло н ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНО СТЬ ВСТАВКИ (8ЕЦ П) №) Клон ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНО СТЬ ВСТАВКИ (8ЕЦ П) №)
5у-1 (ΧΚΉΡϋίΜΝοασ (8Е(3 ГО №:90) 8у-1 СбСКТ^ЬЫРССС (8Е<Э ГО №:248) 10у-1 ОСЗС АРЕР8 8 Α ΕΝΕΌΟ (АЕ<Э ГО №:307)
5у-2 О6СУГОРР6СОО (8Е() ГО №:91) 8у-2 СгбСЕОХАТЬУМССгСг (8Е<Э ГО №:249) 10у-2 ЗСК^ТМЬТАЕСЕАССЮ (АЕ<Э ГО №:308)
5у-3 С6СО1М1РЕССС (8ЕО ГО №:92) 8у-3 8ССАР8РУ1РРССС (8Е<Э ГО №:250) 10у-3 СОСУМОЕАРОЬЕ1ССС (АЕ<Э ГО №:309)
5у-4 О6СМТЕРА1СОО (8Е(Д ГО №:93) 8у-4 6ССЗУЕАЕ(^УЪП4ССгСг (8Е<Э ГО№:251) 10у-4 ССК^РЬРООНОТАССЮ (АЕ<Э ГО№:310)
5у-5 ОСС^У^РСОО (8Е(^ ГО №:94) 8у-5 ССК^АМАЕОЬСС (8Е(^ ГО №:252) 10у-5 Сг(ЗСРРЕЕУМ8ОЕ()ССгСг (АЕ<Э ГО№:311)
5у-6 СССРЕ8ААЕССС (8Е(^ ГО №:95) 8у-6 СССРБЕАРКЬССС (8Е<Э ГО №:253) 10у-6 8СССНСМ(ЗМО8УРСС} 6 (8Е<Э ГО№:312)
5у-7 О6СОРАРМУСОО (8Е(Д ГО №:96) 8у-7 ΟΟΟΕΡλΥΙΜΕΑΝΟσσ (8Е<Э ГО №:254) 10у-7 8ССОЕТ(}8АП¥УРССгСг (АЕ<Э ГО№:313)
5у-8 СССРУЕБЕМССС (8Е(^ ГО №:97) 8у-8 СЮСРА^НШРССЮ (8Е<Э ГО №:255) 10у-8 СбСКЕРЕСуПУТУАСС 6 (8Е<Э ГО№:314)
5у-9 СССРЕТАТКССС (8Е(Д ГО №:98) 8у-9 ОССРАУ^МОНСОО (8Е<Э ГО №:256) 10у-9 ЗСК^ЕККОЬУЧУЕУССгСг (АЕ<Э ГО№:315)
5у-10 бСЮУЬУ^РСбСг (8Е(Д ГО №:99) 8у-1 0 8ССЮРАЕ18УУССС (8Е<Э ГО №:257) 10у-1 0 8СССООМОЕРАЕАСС 6 (8Е<Э ГО№:316)
5у-11 сссушмерссс (8Е(^ ГО№:100) 8у-1 1 ОбСРУМРЬОРКСОО (8Е<Э ГО №:258) 10у-1 1 С6СУР(Л+Р8К8ОССЮ (АЕ<Э ГО№:317)
5у-12 ООСРЕТАХТСОО (8Е() Ш№:101) 8у-1 2 О6С88ОУЬМ1РСОО (8Е<Э ГО №:259) 10у-1 2 86САРОМПУРЕОУС6О (АЕ<Э ГО№:318)
- 60 032985
5у-13 ОбСРРОЮЕСОО (8ЕС ГО№:102) 8у-1 3 О6СУОЕМУ1УНСОО (8ЕС ГО №:260) 10у-1 3 ЗССАЕУ'Л'СР'ЛЪНЗССС (8ЕС ГО№:319)
5у-14 ООСЬОН^МСОО (8ЕС ГО№:103) 8у-1 4 ОбСРГМУКЬУЗСОО (8ЕСЮ№::261) 10у-1 4 О6ССЕ8ПЕТОЕРСОО (8ЕС ГО №:320)
5у-15 ООСМРУРРАСОО (8ЕС ГО№:104) 8у-1 5 СССЕЗЭТМиУЕССС (8ЕС ГО №:262) 10у-1 5 ОбСОМЬЕ^ЗОЕСГСОО (8ЕС ГО №:321)
5у-16 СССУМЕСЕУ'ССС (8ЕС ГО№:105) 8у-1 6 О6СК8ОЕПЕЕСОО (8ЕС ГО №:263) 10у-1 6 8Ο€ΉΕΙ<ΑΕΤΥΥΈΕ€’ΟΟ (8ЕС ГО №:322)
5у-17 СССЕКЕУТи'ССС (8ЕС ГО№:106) 8у-1 7 СССРиГОЕРЕРЕССС (8ЕС ГО №:264) 10у-1 7 ООСГЕЯМСУАУУКЕСО О (8ЕС ГО №:323)
5у-18 СССРКОУЕПССС (8ЕС ГО№:107) 8у-1 8 СССРХУАМЕЕУНССС (8ЕС ГО №:265) 10у-1 8 ОбСРЕ^ЕЯСГОЬРСОО (8ЕС ГО №:324)
5у-19 ООСЕУМУРРСОО (8ЕС ГО№:108) 8у-1 9 ЗССТАЗМУ'ЛЪУССС (8ЕС ГО №:266) 10у-1 9 8ССЕ8\\'СРГОММУЕССС (8ЕС ГО №:325)
5у-20 ООСУРЫТУРСОО (8ЕС ГО№:109) 8у-2 0 ООСОЬУМОРРУУОО (8ЕС ГО №:267) 10у-2 0 δΟΟΝϋΟΡΡΜΥΥΙ^ΟΟ (8ЕС ГО №:326)
5у-21 СССМЕРСЕи-ССС (8ЕС ГО№:110) 8у-2 1 ОССРУМУМЕРУСОО (8ЕС ГО №:268) 10у-2 1 ООСРЕОМАЬСРТССОО (8ЕС ГО №:327)
5у-22 СССМ1АРМУССС (8ЕС ГО№:111) 8у-2 2 ООССТЕНЬЕГСОО (8ЕС ГО №:269) 10у-2 2 зоскор^срерьусоо (8ЕС ГО №:328)
5у-23 СССММЬУРМССЮ (8ЕС ГО№:112) 8у-2 3 ЗОСАРОАНОАМСОО (8ЕС ГО №:270) 10у-2 3 О6СЕАР8МКП\ГОРСОО (8ЕС ГО №:329)
5у-24 ООСПОРРЬСОО (8ЕС ГО №:113) 8у-2 4 ООСРОРМРКМЯСОО (8ЕС ГО №:271) 10у-2 4 О6СУСРА1АМ^РРСОО (8ЕС ГО №:330)
5у-25 ОССТОМУГГСОО (8ЕС ГО№:114) 8у-2 5 8ОС8У\УРОТ18СОО (8ЕС ГО №:272) 10у-2 5 ОбСТОСОКРУЬУЕСОО (8ЕС ГО№:331)
5у-26 ΟΟΕΈΜΥΚΝ УС’СС (8ЕС ГО№:115) 8у-2 6 СССР\У8МЕ18МССС (8ЕС ГО №:273) 10у-2 6 оссрусерыуоуусоо (8ЕС ГО №:332)
5у-27 О6САРО1М\УСОО (8ЕС ГО№:116) 8у-2 7 О6СРТШЖЕ1ТСОО (8ЕС ГО №:274) 10у-2 7 ΟΟ€’8Ν8ΥΈνΤΕΥΑ€Ό О (8ЕС ГО №:333)
5у-28 ООСКНКККи'ССС (8ЕС ГО№:117) 8у-2 8 8ссригомн1уоссс (8ЕС ГО №:275) 10у-2 8 ЗОСНОЬУЕАУОУМАСО О (8ЕС ГО №:334)
5у-29 СССЕМС^'СССС (8ЕС ГО№:118) 8у-2 9 8ССЕР\¥ЕРАУЕССС (8ЕС ГО №:276) 10у-2 9 86СЕАРОЫРЕОРСОО (8ЕС ГО №:335)
5у-30 СССР8ЕРСЕССС (8ЕС ГО№:119) 8у-3 0 ОбСРРОАУЯУРНСОО (8ЕС ГО №:277) 10у-3 0 ΟΟίΆΝΡΕΕΟΜΥ'ΎΕί’Ο О (8ЕС ГО №:336)
5у-31 СССРЗУЕТи'ССС (8ЕС ГО№:120) 8у-3 1 СЮСРАУНМЕУЯЕСОО (8ЕС ГО №:278) 10у-3 1 86СОУЕУР1РЬРТСОО (8ЕС ГО №:337)
5у-32 ССС’СЕУ'Л'ЪЕССС (8ЕС ГО№:121) 8у-3 2 ООСРРАЬОМОЕСОО (8ЕС ГО №:279) 10у-3 2 ссситсСЕлижАтсс О (8ЕС ГО №:338)
5у-33 ССССиТТЕЕССС (8ЕС ГО№:122) 8у-3 3 ООСМРРРМЬЗКСОО (8Е0 ГО №:280) 10у-3 3 оосорееям^сусоо (8Е0 ГО №:339)
5у-34 СССТКЕЕОЖСС (8ЕС ГО№:123) 8у-3 4 ООСАГОЕМРАНСОО (8ЕС ГО№:281) 10у-3 4 ОбСЕРРЕЬКРУНЕОСОО (8ЕС ГО №:340)
5у-35 ООСЕМЗРРЬСОО 8ЕС ГО№:124) 8у-3 5 О6СС1СОГЕГТСОО (8ЕС Ю №:282) 10у-3 5 ООСРРСЬУАУЗРАРСОО (8ЕС ГО №:341)
5у-36 СССНЗЕУЕУССС (8ЕС ГО№:125) 8у-3 6 ОбСРМОШГОЬСОО (8ЕС ГО №:283) 10у-3 6 80€ΆΥΈΙΚ0ΐν€Ό0 (8ЕС ГО №:342)
5у-37 СССиЪНРНУССС (8ЕС ГО№:126) 8у-3 7 ОбСЕМЬЕРТУТСОО (8ЕС ГО №:284) 10у-3 7 8ОС881С8^КЬ^ЕСОО (8ЕС ГО №:343)
5у-38 СССЕТУи-ЪЕССС (8ЕС ГО№:127) 8у-3 8 ССССКМЕУАМЕССС (8ЕС ГО №:285) 10у-3 8 СОССУМСУЕШАНСС О (8ЕС ГО №:344)
5у-39 ОССКУРУРЗСОО (8 ЕС ГО№:128) 8у-3 9 О(ЭС8ГЬЕЕ1АМСОО (8ЕС ГО №:286) 10у-3 9 ЕСС’СУКУУМСЕСОСС О (8ЕС ГО №:345)
5у-40 сссси-РЕУмссс сзес ГО№:129) 8у-4 0 О6СОУЕК1М1ГСОО (8ЕС ГО №:287) 10у-4 0 сосруичррниъЕССС (8ЕС ГО №:346)
5у-41 ООСМЬРЬЕЗСОО (8ЕС ГО№:130) 8у-4 1 ООСГРМТР^ОЬСОО (8Е0 ГО №:288) 10у-4 1 ЗССЕЕУ'СОЗМЕЕЕССС (8Е0 ГО №:347)
5у-42 СОСЕНУККи-ССС (8ЕС ГО№:131) 8у-4 2 δΟΕΌνΥΕΕνδΟΝΕΌΟ (8ЕС ГО №:289) 10у-4 2 ЗССЕСОА'З'УЖЕУЕССС (8ЕС ГО №:348)
5у-43 ОССУАУЕОЕНСОО (8Е0 ГО№:132) 8у-4 3 06С0УЕ1МГН6С00 (8ЕО ГО №:290) 10у-4 3 СОСЗУОЗТи'ОЕУ'АСС Ο (8ЕО ГО №:349)
5у-44 ОССШНГБГОСОО (8ЕС ГО№:133) 8у-4 4 ООСМООЕНЬУЕСОО (8ЕС ГО№:291) 10у-4 4 8СС1<УР1Е\¥ОТ1ОССС (8ЕС ГО №:350)
5у-45 ООСНГЕУГССОО (8ЕС ГО№:134) 8у-4 5 δοορίΕπττητοσ (зес ГО №:292) 10у-4 5 зосуеусуомуурсоо (8ЕС ГО№:351)
5у-46 ООСУГЕУМССОО (8ЕС ГО№:135) 8у-4 6 СССАУиЧЕЗОАССС (8Е0 ГО №:293) 10у-4 6 ООСТОСК^РУЬУЕСОО (8Е0 ГО №:352)
5у-47 СОСМТЕЕЗи-ССС (8ЕС ГО№:136) 8у-4 7 СССРХУ8ЕН1С0ССС (8ЕС ГО №:294) 10у-4 7 ООСРРАУСЕАУНЬЗУСОО (8ЕС ГО №:353)
5у-48 ООСЕОЯМКРСОО (8ЕС ГО№:137) 8у-4 8 ЗССАЕЗМЕЕШССС (8ЕС ГО №:295) 10у-4 8 ЗОСУМОУМНЫАЕСОО (8ЕС ГО №:354)
5у-49 СОСКСНМ'Л'УССС (8ЕС ГО№:138) 8у-4 9 ЗССЕРиЪЕУМЕССС (8ЕС ГО №:296) 10у-4 9 ООСРМОЗРЗЕУУОСОО (8ЕС ГО №:355)
5у-50 СОСЕАУи-'СЕССС (8ЕС ГО№:139) 8у-5 0 δΟΟΡΓΊΊΝΓΥΊΟΟΟ (8Е0 ГО №:297) 10у-5 0 80€’Ρν0ΕΜΕΡΙ8Υ€Ό0 (8ЕС ГО №:356)
5у-51 ООСУРЗКРДУСОО (8ЕС ГО№:140) 8у-5 1 СССРЩТТ'Л'ЗТССС (8ЕС ГО №:298)
5у-52 сосммРЕитссс сзес ГО№:141) 8у-5 2 СССС1С^'УРУССС (8ЕС ГО №:299)
5у-53 ООС1ГСГЕМСОО (8ЕС ГО№:142) 8у-5 3 СССАЕС1ЕРЕМССС (8ЕС ГО №:300)
5у-54 соскисмиуссс (8ЕС ГО№:143) 8у-5 4 6ССА\УЕ1КГООСОО (8ЕС ГО№:301)
5у-55 ООСКТРЯРАУСОО (8ЕС ГО№:144) 8у-5 5 ОбСРУСЬУШАУСОО (8Е0 ГО №:302)
5у-56 СОСКАЕУРи-ССС (8ЕС ГО№:145) 8у-5 6 ООСМЕАМНУГОСОО (8Е0 ГО №:303)
- 61 032985
86СТУМУТЕО1РОС
ΟΟΟΚΜΥΟΥΌΟΟΟ (8ЕО
ΟΟΟΥΡϋΝΜΡΟΟΟ (8ΕΟ
8(30ΑΗθνΥ\νΑΡΟΟ(3
ΙτίιΟΡΝΡΡΝΓ\νΡΟίτίι
СКЮОУК1Р\¥СОО (8ΕΟ
06С81РОЕ\¥СОО (8ΕΟ
СКЮКМΥΟΑΤΟΟΟ (8ΕΟ
ОССОУЕЕАУНСОО (8ΕΟ
ОСЮКЕОН(ЖСОО (8ЕО
ОССОИМРАУОСОС
ОСЮУМЕХУРСОО (8ЕО
ΟΟΟΙΕΝΡΝΜΟΟΟ (8ЕО
ОССМНМОУРСОО (8ЕО
СКЮОУМУЬРСОО (8ЕО
ΟΟΟΕΡϋλΥΡδΟΟΟ (8ЕО иис км унотсоо (8ЕО
ССС()А'ЕУЕ8ССС (8ЕО иосЕтьАъсос! (8ео
ОССАУЕРТНАУСОО (8ΕΟ
ООСАЬАМШССКЭ (8ЕО οαοΜΥοκοΑ\νοο(3
СССРЕБААЕССС (8Е(Э
СССМРОНКУССС (8ЕО
ОССМЕПТЧРССгС (8ЕО
ОССУМЕКЬАУСОО (8ЕО
СССЕУУАУОРСОС (8ЕО
ООСРЕ8\¥ООСОО (8ЕО ϋϋί’ΙΕΥΕδΑίίίϋ (8ЕО
СССУРЕШКССС (8ЕО ϋΟΟΕδΡΟΥΕΟΟΟ (8Е(Э
СССΗ Η ΌΕΕ АСОС (8ЕО
СКЗСМРРР8\¥ССЮ (8 ЕС
ОСЗСМТУЬОЕССКг (8Е()
СССУРШМЬСбО (8ЕО
СССМУООРА'ССС
СКЮККЪУНУСОО (8ЕО
СССРН ХСРЕЕССС (8 ЕС
СССР1РРМ1ССС (8ЕО Ю
СССМ8КОЕ\¥ССС (8ЕС
СССМ Е( )МСУССС (8 ЕС
ΟϋΕΥΕΆ'ΡδΥΕΟϋ (8ЕО
СССОМЕУМОССС
ОСКЛТРРММССКг (8ЕС
СтСтСУМУХУЕУССтб
СССМАЕ УБНССС (8ЕО
- 62 032985
5у-10 1 СССМОЕЕ8У'ССС (8Е(^ ГО№:190)
5у-10 2 ОбСУГЕТ^СОСг (8Е<3 ГО№:191)
5у-10 3 ОСК^ХУАЯЗУССЮ (8Е<3 ГО№:192)
5у-10 4 СССКЕСОАУССС (8Е<3 ГО№:193)
5у-10 5 ббСУРОС^ШУССгСг (8Е(/) ГО№:194)
5у-10 6 СССЕУМ1ЕМССС (8Е<Э ГО№:195)
5у-10 7 СССЕЗРМЕУССС (8ЕО ГО№:196)
5у-10 8 ΟΟίΊΤΜΕΟΝίΌΟ (8Е<Э ГО№:197)
5у-10 9 О6СУРЕКМРСОО (8Е(2 ГО№:198)
5у-11 0 О6СОРЕ1РМСО (8Е() ГО №:199)
5у-11 1 66СЬЬрРТ6С6Сг (8Е<2 ГО №:200)
5у-11 2 ОССНРСДРОССгСг (8Е<Э ГО №:200)
5у-11 3 ббСРРОАУОКСбСг (8Е<2 ГО №:202)
5у-11 4 О6СУТРЕРРСО (8Е() ГО №:203)
5у-11 5 О6СУМУМОУСОО (8Е(/) ГО №:204)
5у-11 6 ССС’М ΕΕΑ'Ύ УС’СС (8Е<Э ГО №:205)
5у-11 7 СССРЕТУЖКСС (8Е<Э ГО №:206)
5у-11 8 ΟΟΟΕΝϋλνΚΜΟΟΟ (8Е(/) ГО №:207)
5у-11 9 О6САРЕР1УСОО (8ЕО ГО №:208)
5у-12 0 О6СРУАУРМСОО (8Е<Э ГО №:209)
5у-12 1 О6СНРО1РОСОО (8Е(^ ГО№:210)
5у-12 2 5у-12 3 5у-12 4 5у-12 5 5у-12 6 5у-12 7 5у-12 8 5у-12 9 5у-13 0 5у-13 1 5у-13 2 5у-13 3 5у-13 4 5у-13 5 5у-13 6 5у-13 7 5у-13 8 5у-13 9 5у-14 0 ООСРРЕЯМРСОО (8Е<Э ГО№:211) СгбСРРОМСгЕССгСг (8Е() ГО №:212) ССС18СЕЕУ'ССС (8Е(^ ГО №:213) 66СРРНР(}УССгСг (8Е<Э ГО №:214) ОССМРСДШССгСг (8Е<Э ГО№:215) ОСК^УРБРССЮ (8Е(^ ГО №:216) О6СНРАУЕОСОО (8Е<Э ГО№:217) ООСХУКУМОЕСОО (8Е(/) ГО№:218) О6СУТТНЕЕСОО (8Е<Э ГО №:219) ббСБУКЗУОССгСг (8Е<Э ГО №:220) ОбСУРЗАЕХУСОО (8Е(^ ГО№:221) 66СРР(}Р(2ТС6О (8Ер ГО №:222) О6САРЕММОСОО (8Е<Э ГО №:223) СССЕУУУЕЕССС (8Е(^ ГО №:224) ОбСАРОЮУСОСг (8Е<Э ГО №:225) ОбСЕЗРЕМХУСОО (8Е(^ ГО №:226) СССРЕ8УУ1ССС (8Е<Э ГО №:227) ббСМБМРрбСбСг (8Е<2> ГО №:228) ОСК^РЪШХУЕССЮ (8Е<Э ГО №:229)
5у-14 1 СССГОТУУУ'ССС (8Е(^ ГО №:230)
5у-14 2 СаСНЕЕШМЕСаа (8Ер ГО№:231)
5у-14 3 О6СЭМ1Р8ТСОО (8ЕЭ ГО №:232)
5у-14 4 ООСКМУОРОСОО (8Е0 ГО №:233)
- 63 032985
5у-14 5 ООСМАУОУРКСОО (8ЕЦ ГО №:234)
5у-14 6 О6СОЕГ6Ц8СОО (8Е(} ГО №:235)
5у-14 7 ΟΟΕΟΕΝΕΡΑΥΌΟ (8Е<2 ГО №:236)
5у-14 8 ΟΟΕΝΙΑΥΡΑΥΌΟ (ЛЕЦ ГО №:237)
5у-14 9 О6СКТ1Р1ГСОО (8ЕЦ ГО №:238)
5у-15 0 СССОМЕЕЕЕССС (8ЕЦ ГО №:239)
5у-15 1 СССЕСАЕУ'Л'ССС (8ЕЦ ГО №:240)
5у-15 2 ΟΟΟΡΓΝΓΑδΟΟΟ (8Е<2 ГО№:241)
5у-15 3 ОбСЦРОШАУСОСг (8Е(} ГО №:242)
5у-15 4 СССАУТНЕЕССС (8ЕР ГО №:243)
5у-15 5 СССООЕ'Л'ЕУССС (8ЕЦ ГО №:244)
5у-15 6 СССЕА'УОЕУССС (8ЕЦ ГО №:245)
5у-15 7 ССССМЕСАТССС (8Е(^ ГО №:246)
5у-15 8 66С\¥ЕЦНУЕС6С (8ЕЦ ГО №:247)
Выбранные отдельные клоны из каждой библиотеки объединяли, и выделяли ДНК при помощи набора 2ушоргер Уеа§1 Р1а§шМ Мш1ргер ΙΙ Κΐΐ (Ό2004, 2ушо КезеагсЕ). ПЦР проводили на объединенной ДНК с применением прямого праймера (5' ΟΟΑ ΑΑΑ 6ТС ΟΑС ΤΑΟ Α^ Α^ ΑΤΟ ΟΑ 3' (8Е^ ΙΌ Ν0:357)) и обратного праймера (5' СТТ ТСС 66С С6С ТСА ТТА ТТТ 3' (8Е^ ΙΌ Ν0:358)). Основной набор для ПЦР (КосЬе, каталожный номер 11 578 553 001) применяли при следующих условиях реакции: 95°С в течение 5 мин, затем 30 циклов при 95°С в течение 45 с, 55°С в течение 45 с, 72°С в течение 90 с, и в заключение 72°С в течение 10 мин. Продукты ПЦР и вектор экспрессии у млекопитающих расщепляли в течение ночи при 37°С с применением рестриктаз 8аП и Ν()ΙΙ (Ν'\ν Еп§1апй Бю1аЬ§). Расщепленную ДНК очищали на геле с применением наборов для очистки на геле Р^цшск (^IΑΟЕN, 28704). Расщепленный ДНК-вектор и продукты ПЦР сшивали при помощи ДНК-гигазы Т4 (Ν'\ν Епд1апс! Бю1аЬ§) и инкубировали в течение ночи при 16°С. Сшитую ДНК применяли для трансфомации ультракомпетентных клеток Е. сой X^10-βο1ά (№200315, 81га1:а§епе), и отбирали отдельные клоны. ДНКплазмиды из клона Е.со11, содержащего каждый из выбранных вариантов полипептидов, вводили в клетки млекопитающих 293-6Е. В частности, клетки 293-6Е засевали с плотностью 5х104 клеток/лунку в титрационный микропланшет на 96 лунок с покрытием из поли-Б-лизина и инкубировали их в течение ночи при 37°С. Затем 200 нг плазмиды трансфецировали в клетки с применением реагента для трансфекции Еидепе® I Ю (#Е2312, Рготеда) и инкубировали их в течение ночи при 37°С. На следющий день питательную среду заменяли на среду, не содержащую сыворотки и содержащую 0,5% триптона. Кондиционированную среду отбирали еще через 6 дней роста при 37°С. Кондиционированную среду, которая содержала варианты фрагментов Ес, затем оценивали в отношении связывания с ЕсКп с применением технологии ЕоКеБю, описанной в примере 4. Кривые связывания и диссоциации при рн 6 и 7,4, соответственно, полученные для вариантов фрагментов Ес, обладающих наиболее благоприятными профилями связывания, показаны на фиг. 7.
На фиг. 7 показаны профили связывания и диссоциации для связывания с ЕсКп при рн 6 и 7,4, соответственно, для 28 лучших вариантов фрагментов Ес из библиотеки дрожжей Б5, а также для фрагмента Ес дикого типа ^ονΤ), а на фиг. 8 показаны профили связывания с ЕсКп для 18 лучших вариантов фрагментов Ес, выбранных из библиотек дрожжей Е-8 и Е-10. Все из вариантов фрагментов Ес из библиотекеи Е5 обладали значительно более выраженной максимальной реакцией при рн 6, то есть, более высокой активностью связывания, чем ЕсVΤ. При рн 7,4 все они быстро диссоциировали, то есть, демонстрировали низкую активность связывания или вообще не связывались, аналогично ЕсVΤ. Все из вариантов фрагментов Ес Б-8 и Б-10 демонстрировали значительно большую максимальную реакцию при рн 6, то есть, более высокую активность связывания, чем ЕсVΤ. При рн 7,4 все они быстро диссоциировали, хотя большинство из них демонстрировали низкий уровень остаточного связывания, не отмечаемый у ЕсVΤ. Таким образом, все из указанных вариантов фрагментов Ес обладали благоприятными свойствами по сравнению с ЕсVΤ. Следовательно, вставки пептидов разной длины можно с успехом применять для повышения активности связывания с ЕсКп при рн 6 при сохранении быстрой диссоциации от ЕсКп при рн 7,4, хотя и с низким остаточным связыванием.
Пример 12: Описание свойств вариантов фрагментов, выбранных у дрожжей, ίη у1уо Чтобы выяснить, обладают ли антитела, содержащие варианты фрагментов Ес, идентифицированные при скрининге у дрожжей, описанном выше, улучшенными фармакокинетическими (ФК) свойствами ίη у1уо, немодифицированное антитело X (которое является антителом к ΙΕ-23 человека изотипа ΙβΟ2 человека) и варианты антитела X, содержащие варианты фрагментов Ес, оценивали ίη у1уо на яванских макаках и опреде
- 64 032985 ляли фармакокинетические параметры. Антитело X было выбрано в качестве подходящего антитела для оценки фармакокинетических параметров вариантов фрагмента Ес, поскольку было известно, что оно обладает линейным ФК профилем, и поскольку известно, что ΙΕ-23 экспрессируется т νί\Ό в малом количестве. Таким образом, ожидалось, что связанные с мишенями эффекты на параметры ФК будут минимальны, что облегчит определение ФК действия, связанного с вариантами фрагментов Ес.
Было получено шесть вариантов антител Ι§02, названных Х-5у-8, Х-5у-132, Х-5у-38, Х-5у-91, Х-5у119 и Х-5у-127. Указанные антитела Ιμ62 содержали те же вставки в тех же положениях (согласно выравниванию в табл. 1), что и варианты фрагментов Ес Ι§01 5у-8, 5у-132, 5у-38, 5у-91, 5у-119 и 5у-127, соответственно. В качестве матрицы для пяти реакций ПЦР применяли плазмиду, содержащую ДНК, кодирующую тяжелую цепь антитела Х; указанные пять реакций проводили с применением следующих праймеров:
для Х-5у-8, прямой, 5'-ОАО ТОО ОАО
АСС ААТ ООТ ООТ ТОТ ССО ОТТ СТО СТО ТТС ААС ТОТ ООТ ООТ ООО САО ССС САС
ААС-3' (8Е0 ГО №:380), и обратный, 5'- ОТТ СТС ССС СТС ССС АСС АСС АСА ОТТ ОАА САС САС ААС ССС АСА АСС АСС АТТ ССТ СТС ССА СТС -3'(8Е(} ГО №:381); для Х-5у-132,прямой, 5'-000 ТСС ОАО АСС ААТ СОТ СОТ ТОТ ОТТ ТТС ТСТ ССТ СТС ТОО ТОТ СОТ СОТ ООО САС ССС ОАО ААС-3'(8Е() ГО №:382), и обратный, 5'-ОТТ СТС СОО СТО ССС АСС АСС АСА ССА САО АСС АОА ОАА ААС АСА АСС АСС АТТ ССТ СТС ССА СТС-3' (8ЕЮ ГО №:383); для Х-5у-38, прямой, 5'- ОАО ТОО ОАО АСС ААТ ООТ ООТ ТОТ ОАА АСТ ТАС ТОО ТТО ТТС ТОТ ООТ ООТ ООО САО ССО ОАО ААС-3' (8Е<2 ГО №:384), и обратный, 5'-ОТТ СТС СОО СТО ССС АСС АСС АСА ОАА САА ССА ОТА АОТ ТТС АСА АСС АСС АТТ ОСТ СТС ССА СТС-3' (8Е(^ ГО №:385); для Х-5у-91, прямой, 5'-ОАО ТОО ОАО АСС ААТ ООТ ООТ ТОТ ССО САТ ТОО ССО ТТС ОАА ТОТ ООТ ООТ ООО САО ССО ОАО ААС-3' (8Е(^ ГО №:386), и обратный, 5'-ОТТ СТС СОО СТО ССС АСС АСС АСА ТТС ОАА СОО ССА АТО СОО АСА АСС АСС АТТ ОСТ СТС ССА СТС-3' (8Е() ГО №:387); для Х-5у-119, прямой, 5'-ОАО ТОО ОАО АСС ААТ ООТ ООТ ТОТ ОСТ ТТС ОАА ТТС АТС ТАС ТОТ ООТ ООТ ООО САО ССО ОАО ААС-3' (8Е(^ ГО №:388), и обратный, 5'- ОТТ СТС СОО СТО ССС АСС АСС АСА ОТА ОАТ ОАА ТТС ОАА АСС АСА АСС АСС АТТ ОСТ СТС ССА СТС -3' (8Е(^ ГО 5 №:389); и для Х-5у-127, прямой, 5'-ОАО ТОО ОАО АСС ААТ ООТ ООТ ТОТ САО ТАС ТТС ТТО ССО ТОТ ООТ ООТ ООО САО ССО ОАО ААС-3' (8Е0 ГО №:390), и обратный 5'-ОТТ СТС СОО СТО ССС АСС АСС АСА СОО САА ОАА ОТА СТО АСА АСС АСС АТТ ОСТ СТС ССА СТС-3' (8Е(^ ГО №:391).
Применяли протокол для набора для сайт-направленного мутагенеза ОшксБапце' (84га4адепе, 200518). Реакционная смесь включала 200 нМ άΝΓΡ, 100 нМ праймеров, 1 нг ДНК-матрицы, 1 мкл ДНКполимеразы и воду до общего объема 50 мкл. Реакцию проводили при 95°С в течение 30 с, затем проводили 16 циклов при 95°С в течение 30 с, 55°С в течение 60 с, 68°С в течение 6 мин, а затем при 68°С в течение 10 мин. Затем добавляли 1 мкл 1)рп1, и реакционную смесь инкубировали при 37°С в течение 1 ч. Затем 2 мкл смеси применяли для трансформации 30 мкл суперкомпетентных клеток ХЫ-Ыие (84га4адепе) при 42°С в течение 45 с. Затем добавляли 0,5 мл 8ОС, и клетки инкубировали при 37°С в течение 1 ч на шейкере при 300 об/мин. Трансформированные клетки распределяли на чашках с агаром ЛуриаБертани, содержащим ампициллин, и инкубировали в течение ночи при 37°С. Отдельные колонии отбирали, и ДНК-плазмиду подготавливали и секвенировали, чтобы убедиться, что выбранные изоляты содержали ожидаемую последовательность ДНК.
Антитела подготавливали по существу так же, как описано выше для фрагментов Ес, за исключением того, что клетки-хозяева млекопитающих трансфецировали ДНК, кодирующими как тяжелую цепь Ι§Ο2, содержащую часть, кодирующую либо вариант, либо контрольный фрагмент Ес, так и легкую цепь антитела Х. Клетки-хозяева инкубировали при условиях, пригодных для экспрессии указанных антител, и антитела восстанавливали из питательной среды, очищали, как описано выше, и применяли для следующих экспериментов.
Яванские макаки (п=2/группу) получали однократно внутривенно немодифицированные антитела X или варианты антител Х в дозе 1 мг/кг, и далее находились под наблюдением в течение 8 недель прижизненно. Антитела Х-5-112, которые оценивали ранее, применяли в качестве контроля, как и само антитело Х. Пробы крови отбирали в заранее определенные моменты времени на протяжении всего эксперимента. Пробы отбирали до введения дозы, через 0,25, 1, 4, 8, 12, 24, 48, 72, 168, 240, 336,408, 504, 576, 672, 744, 840, 1008, 1176 и 1344 часов после введения дозы. Антитела определяли в пробах крови, и проводили фармакокинетический анализ, по существу как описано в примере 9.
Как показано на фиг. 9, варианты антитела Х, содержащие все оцениваемые варианты фрагментов Ес, демонстрировали более высокие концентрации тАЬ у яванских макак в большинство моментов отбора пробы, включая времена свыше 400 ч, по сравнению с немодифицированным антителом Х. Кроме того, некоторые варианты были сопоставимы с Х-5-112, который был оценен ранее, включая Х-5у-8, Х-5у- 65 032985
127 и Х-5у-91.
В табл. 11 ниже приведены значения времени полужизни (Т1/2), воздействия (площадь под кривой (АИС)) и клиренса (С1) для антитела X и и их вариантов у каждой из яванских макак, участвующих в эксперименте.
Таблица 11. Индивидуальные значения времени полужизни (Т1/2);
С1 (мл/кг/ч)
Антитело ίο (часов) (идентификационный номер обезьяны)
Антитело X (№201)
Х-5-112 (№204)
Х-5у-8 (№205
Х-5у-8 (№206
Х-5у-132(№207)
АИС (мкг*ч/мл)
Антитело X (№202
Х-5-112 (№203) воздействия (ЛИС) и клиренса (С1).
Х-5у-132 (№208)
Все варианты демонстрировали увеличенное время полужизни и АИС по сравнению с данными показателями у антитела X по меньшей мере у одной из обезьян, получавших каждый из вариантов. У обезьян №207 и №213 Х-5у132 и Х-5у-119, соответственно, демонстрировали меньшее время полужизни, чем антитело X. Это можно интерпретировать так, что у данных конкретных обезьян вырабатывались антитела на лекарственный препарат, которые приводили к более быстрому клиренсу указанных антител. Значения АИС также были выше, чем АИС у антитела X для большинства из оцениваемых вариантов.
Усредненные данные для указанных фармакокинетических параметров, которые не включают показатели для обезьян №207 и №213, приведены в табл. 12 ниже. Включены значения из предыдущего исследования, приведенные в табл. 6 выше, для антитела X и Х-5-112, которые демонстрируют, что значения относительно постоянны и сохраняются в разных исследованиях.
Таблица 12. Средние значения времени полужизни (Т1/2), воздействия (АИС) и клиренса (С1)
Антитело (п) Т1/2 (часов) АИС (мкг*ч/мл) С1 (мл/кг/ч)
Антитело Х(п=2)* 335 3890 0,247
Антитело Х(п=2) 310 3550 0,272
Х-5-112 (п=2)* 529 7810 0,108
Х-5-112 (п=2) 573 6795 0,123
Х-5у-8 (п=2) 455 6044 0,149
Х-5у-132(п=1)# 531 6770 0,127
Х-5у-38 (п=2) 343 5008 0,185
Х-5у-91 (п=2) 655 4452 0,182
Х-5у-119 (п=1)# 465 7272 0,12
Х=5у-127 (п=2) 604 5386 0,154
*Эти значения из предыдущего исследования, приводимые в примере 9 и табл. 6, и здесь они включены для сравнения.
*Была включена только одна из двух оцениваемых обезьян, поскольку предполагается, что антитела на лекарственный препарат являются причиной быстрого клиренса, наблюдаемого у второй обезьяны.
Указанные данные свидетельствуют о том, что фармакокинетические параметры для антитела X и для Х-5-112 были относительно постоянными и мало изменялись от исследования к исследованию. Также они показывают, что время полужизни и воздействие увеличиваются при введении всех оцениваемых вариантов. Таким образом, полученные данные в целом свидетельствуют о том, что усиленное связывание варианта фрагмента Рс с РсКп при рН 5,5-6,0 (по сравнению с контрольным фрагментом Рс) и быстрая диссоциация от РсКп при рН 7,4 коррелирует с большим временем полужизни т νίνο у антитела, содержащего такой вариант фрагмента Рс, у яванских макак.
- 66 032985
Пример 13. Описание свойств ш νίνο антитела, содержашего вариант Ес, с нелинейным ФК профилем.
Чтобы выяснить, можно ли улучшить ФК свойства антитела, обладающего нелинейным ФК профилем, посредством вставки одного из пептидов, описанных в настоящей заявке, вставку в вариант фрагмента Ес Ес-5-112 переносили в антитело Υ - антитело человека изотипа ^С2, обладающее нелинейным ФК профилем. Указанную форму антитела Υ - вариант ^С2 человека, именуемую Υ-5-112, получали по существу, как было описано выше, за исключением применения других праймеров ПЦР, подходящих для получения необходимых изменений в антителе Υ.
Антитела получали, как описано выше в примере 9. Яванские макаки (п=2/группу) получали однократно внутривенно антитела Υ или антитела Υ-5-112 в дозе 10 мг/кг, и далее находились под наблюдением в течение 8 недель прижизненно. Пробы отбирали до введения дозы, через 0,083 (5 мин) 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192 216, 240, 264, 288, 312, 336, 384,432,480, 528, 576, 624, 672, 720, 768, 816, 864, 912, 960, 1008, 1056, 1104, 1152, 1200, 1248, 1296 и 1344 часов после введения дозы.
Концентрацию в сыворотке яванских макак определяли при помощи Сэндвич-ЕЫ8А. Антитело мыши к иммуноглобулину человека разводили в ФСБ и добавляли в лунки титрационного микропланшета на 96 лунок. После инкубации в течение ночи или до трех дней при номинальных 5°С содержимое лунок выливали и в лунки планшета помещали блокирующий буфер, содержащий блокатор ΒΕΟΤΤΟ (Τίκπιιο® 8с1епНПс). После по меньшей мере получасовой инкубации при комнатной температуре (АКТ) лунки планшета опорожняли и шесть раз промывали 1Х растором для промывания (2 мМ имидазола, 0,02% Т\уееп 20, 0,5тМЕПТА, 160 мМ №С1, который поставляется компанией КРЬ, !пс. под названием Раствор 20Х). Исследуемые образцы, стандарты для анализа и пробы для контроля качества в 100% сыворотке обезьян разводили в 50 раз в блокаторе ΒΕΟΈΓΟ перед добавлением их в лунки планшета. Содержимое лунок планшета перемешивали во время инкубации в течение 60 мин на планшетном шейкере. Затем лунки планшета промывали, и добавляли в них антитела мыши к иммуноглобулину человека, меченные пероксидазой хрена. После конечной одночасовой инкубации лунки планшета промывали и обрабатывали раствором субстрата ТМВ (3,3' ,5,5' - тетраметилбензидин). Получаемую в результате колориметрическую реакцию останавливали при помощи фосфорной или серной кислоты, добавляемой в планшет. Оптическую плотность определяли на длинах волн 450 нм и 650 нм, и значение, полученное на 650 нм, вычитали из значения, полученного на 450 нм. Перевод значений ΟΌ в концентрации для исследуемых проб проводили по регрессии на основе данных с применением логистической модели с весовыми коэффициентами, приравненными 1/Υ2 в лабораторной информационной системе Уотсона, версия 7.0.0.01.
Как показано на фиг. 10, антитело Υ обладало двухфазным ФК профилем с приблизительно линейной фазой от 0 ч до 216 ч. Далее концентрация антитела Υ спадала резко. Антитело Υ-5-112 обладало сходным профилем, за исключением того, что линейная, постепенно спадающая часть профиля длилась приблизительно от 0 до приблизительно 432 ч. Таким образом, вставка в антителе Υ-5-112 по видимому снижает наклон линейной части ФК профиля, таким образом, увеличивая общее воздействие по сравнению с антителом Υ.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> Амген Инк.
<120> ВАРИАНТЫ ПОЛИПЕПТИДОВ ЕС-РОЬ С УСИЛЕННЫМ СВЯЗЫВАНИЕМ РЕЦЕПТОРА ЕС НОВОРОЖДЕННЫХ <130> А-1688-МО-РСТ <140> Будет присвоено <141> 2012-12-17 <150> 61/729,050 <151> 2012-11-21 <150> 61/585,993 <151> 2012-01-12 <150> 61/578,780 <151> 2011-12-21 <160> 575
- 67 032985 <170> РаЬепЫп νθΓ^ίοη 3.5 <210> 1 <211> 232 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз <400> 1
О1и 1 Рго Ьуз Бег Суз 5 Азр Ьуз ТЬг Н1з ТЬг 10 Суз Рго Рго Суз Рго 15 А1а
Рго О1и Ьеи Ьеи О1у О1у Рго Бег Уа1 Рке Ьеи Рке Рго Рго Ьуз Рго
20 25 30
Ьуз Азр ТЬг Ьеи МеЬ 11е Бег Агд ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1
35 40 45
Уа1 Азр Уа1 Бег Н1з О1и Азр Рго О1и Уа1 Ьуз Рке Азп Тгр Туг Уа1
50 55 60
Азр О1у Уа1 О1и Уа1 Н1з Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд О1и О1и О1п
65 70 75 80
Туг Азп Бег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Бег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н1з О1п
85 90 95
Азр Тгр Ьеи Азп О1у Ьуз О1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Бег Азп Ьуз А1а
100 105 110
Ьеи Рго А1а Рго 11е О1и Ьуз ТЬг 11е Бег Ьуз А1а Ьуз О1у О1п Рго
115 120 125
Агд О1и Рго О1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Бег Агд Азр О1и Ьеи ТЬг
130 135 140
Ьуз Азп О1п Уа1 Бег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз О1у Рке Туг Рго Бег
145 150 155 160
Азр 11е А1а Уа1 О1и Тгр О1и Бег Азп О1у О1п Рго О1и Азп Азп Туг
165 170 175
Ьуз ТЬг ТЬг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Бег Азр О1у Бег Рке Рке Ьеи Туг
180 185 190
Бег Ьуз Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Бег Агд Тгр О1п О1п О1у Азп Уа1 Рке
195 200 205
Бег Суз Бег Уа1 МеЬ Н1з О1и А1а Ьеи Н1з Азп Н1з Туг ТЬг О1п Ьуз
210 215 220
- 68 032985
Бег Ьеи Бег Ьеи Бег Рго О1у Ьуз
225 230 <210> 2 <211> 699 <212> ДНК <213> Ното зартепз
<400> 2 дадсссаааЬ сЬЬдЬдасаа аасЬсасаса ЬдсссассдЬ дсссадсасс ЬдаасЬссЬд 60
дддддассдЬ садЬсЬЬссЬ сЬЬсссссса ааасссаадд асасссЬсаЬ даЬсЬсссдд 120
ассссЬдадд ЬсасаЬдсдЬ ддЬддЬддас дЬдадссасд аадасссЬда ддЬсаадЬЬс 180
аасЬддЬасд ЬддасддсдЬ ддаддЬдсаЬ ааЬдссаада сааадссдсд ддаддадсад 240
Ьасаасадса сдЬассдЬдЬ ддЬсадсдЬс сЬсассдЬсс Ьдсассадда сЬддсЬдааЬ 300
ддсааддадЬ асаадЬдсаа ддЬсЬссаас ааадсссЬсс садсссссаЬ сдадаааасс 360
аЬсЬссааад ссааадддса дссссдадад ссасаддЬдЬ асасссЬдсс сссаЬсссдд 420
даЬдадсЬда ссаадаасса ддЬсадссЬд ассЬдссЬдд ЬсаааддсЬЬ сЬаЬсссадс 480
дасаЬсдссд ЬддадЬддда дадсааЬддд садссддада асаасЬасаа дассасдссЬ 540
сссдЬдсЬдд асЬссдасдд сЬссЬЬсЬЬс сЬсбасадса адсЬсассдЬ ддасаададс 600
аддЬддсадс аддддаасдЬ сЬЬсЬсаЬдс ЬссдЬдаЬдс аЬдаддсЬсЬ дсасаассас 660
Ьасасдсада ададссЬсбс ссЬдЬсЬссд ддЬаааЬда 699
<210> 3 <211> 228 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз <400> 3
О1и 1 Агд Ьуз Суз Суз 5 Уа1 О1и Суз Рго Рго 10 Суз Рго А1а Рго Рго 15 Уа1
А1а О1у Рго Бег Уа1 Рке Ьеи Рке Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг Ьеи
20 25 30
МеЬ 11е Бег Агд ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Бег
35 40 45
Н1з О1и Азр Рго О1и Уа1 О1п Рке Азп Тгр Туг Уа1 Азр С1у МеЬ О1и
50 55 60
Уа1 Н1з Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд О1и О1и О1п Рке Азп Бег ТЬг
65 70 75 80
- 69 032985
Рке Агд Уа1 Уа1 Бег Уа1 85 Ьеи ТНг Уа1 Уа1 90 Н1з О1п Азр Тгр Ьеи 95 Азп
О1у Ьуз О1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Бег Азп Ьуз О1у Ьеи Рго А1а Рго
100 105 110
11е О1и Ьуз ТНг 11е Бег Ьуз ТНг Ьуз О1у О1п Рго Агд О1и Рго О1п
115 120 125
Уа1 Туг ТНг Ьеи Рго Рго Бег Агд О1и О1и Меб ТНг Ьуз Азп О1п Уа1
130 135 140
Бег Ьеи ТНг Суз Ьеи Уа1 Ьуз О1у Рке Туг Рго Бег Азр 11е А1а Уа1
145 150 155 160
О1и Тгр О1и Бег Азп О1у О1п Рго О1и Азп Азп Туг Ьуз ТНг ТНг Рго
165 170 175
Рго Меб Ьеи Азр Бег Азр О1у Бег Рке Рке Ьеи Туг Бег Ьуз Ьеи ТНг
180 185 190
Уа1 Азр Ьуз Бег Агд Тгр О1п О1п О1у Азп Уа1 Рке Бег Суз Бег Уа1
195 200 205
Меб Н1з О1и А1а Ьеи Н1з Азп Н1з Туг ТНг О1п Ьуз Бег Ьеи Бег Ьеи
210 215 220
Бег Рго О1у Ьуз
225 <210> 4 <211> 687 <212> ДНК <213> Ното зарФепз <400> 4
дадсдсаааб дббдбдбсда дбдсссассд бдсссадсас сассбдбддс аддассдбса 60
дбсббссбсб бссссссааа асссааддас асссбсабда бсбсссддас сссбдаддбс 120
асдбдсдбдд бддбддасдб дадссасдаа дассссдадд бссадббсаа сбддбасдбд 180
дасддсабдд аддбдсабаа бдссаадаса аадссасддд аддадсадбб саасадсасд 240
ббссдбдбдд бсадсдбссб сассдбсдбд сассаддасб ддсбдаасдд сааддадбас 300
аадбдсаадд бсбссаасаа аддссбссса дсссссабсд адаааассаб сбссаааасс 360
ааадддсадс сссдадаасс асаддбдбас асссбдсссс сабсссддда ддадабдасс 420
аадаассадд бсадссбдас сбдссбддбс аааддсббсб ассссадсда сабсдссдбд 480
дадбдддада дсаабдддса дссддадаас аасбасаада ссасассбсс сабдсбддас 540
- 70 032985
ЕссдасддсЕ ссЕЕсЕЕссЕ сЕасадсаад сЕсассдЕдд асаададсад дЕддсадсад 600
дддаасдЕсЕ ЕсЕсаЕдсЕс сдЕдаЕдсаЕ даддсЕсЕдс асаассасЕа сасасадаад 660
адссЕсЕссс ЕдЕсЕссддд ЕаааЕда 687
<210> 5 <211> 279 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз
<400> 5 Ьеи О1у Азр ТЪг ТЪг 10 Н1з ТЪг Суз Рго Агд 15 Суз
О1и 1 Ьеи Ьуз ТЪг Рго 5
Рго О1и Рго Ьуз Бег Суз Азр ТЪг Рго Рго Рго Суз Рго Агд Суз Рго
20 25 30
О1и Рго Ьуз Бег Суз Азр ТЪг Рго Рго Рго Суз Рго Агд Суз Рго О1и
35 40 45
Рго Ьуз Бег Суз Азр ТЪг Рго Рго Рго Суз Рго Агд Суз Рго А1а Рго
50 55 60
О1и Ьеи Ьеи О1у О1у Рго Бег Уа1 РЪе Ьеи РЪе Рго Рго Ьуз Рго Ьуз
65 70 75 80
Азр ТЪг Ьеи МеЕ 11е Бег Агд ТЪг Рго О1и Уа1 ТЪг Суз Уа1 Уа1 Уа1
85 90 95
Азр Уа1 Бег Н1з О1и Азр Рго О1и Уа1 О1п РЪе Ьуз Тгр Туг Уа1 Азр
100 105 110
О1у Уа1 О1и Уа1 Н1з Азп А1а Ьуз ТЪг Ьуз Рго Агд О1и О1и О1п Туг
115 120 125
Азп Бег ТЪг РЪе Агд Уа1 Уа1 Бег Уа1 Ьеи ТЪг Уа1 Ьеи Н1з О1п Азр
130 135 140
Тгр Ьеи Азп О1у Ьуз О1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Бег Азп Ьуз А1а Ьеи
145 150 155 160
Рго А1а Рго 11е О1и Ьуз ТЪг 11е Бег Ьуз ТЪг Ьуз О1у О1п Рго Агд
165 170 175
О1и Рго О1п Уа1 Туг ТЪг Ьеи Рго Рго Бег Агд О1и О1и МеЕ ТЪг Ьуз
180 185 190
Азп О1п Уа1 Бег Ьеи ТЪг Суз Ьеи Уа1 Ьуз О1у РЪе Туг Рго Бег Азр
- 71 032985
195 200 205
11е А1а Уа1 О1и Тгр О1и Бег Бег С1у О1п Рго О1и Азп Азп Туг Азп
210 215 220
ТЪг ТЪг Рго Рго Мек Ьеи Азр Бег Азр О1у Бег РЪе РЪе Ьеи Туг Бег
225 230 235 240
Ьуз Ьеи ТЪг Уа1 Азр Ьуз Бег Агд Тгр О1п О1п О1у Азп 11е РЪе Бег
245 250 255
Суз Бег Уа1 Мек Н1з О1и А1а Ьеи Н1з Азп Агд РЪе ТЪг О1п Ьуз Бег
260 265 270
Ьеи Бег Ьеи Бег Рго С1у Ьуз
275 <210> 6 <211> 840 <212> ДНК <213> Ното зар1епз <400> 6
дадсксаааа ссссасккдд кдасасааск сасасакдсс сасддкдссс ададсссааа 60
ксккдкдаса сасскссссс дкдсссасдд кдсссададс ссаааксккд кдасасасск 120
сссссакдсс сасддкдссс ададсссааа ксккдкдаса сасскссссс дкдсссаадд 180
кдсссадсас скдаасксск дддаддассд ксадкскксс кскксссссс аааасссаад 240
дакассскка кдаккксссд дасссскдад дксасдкдсд кддкддкдда сдкдадссас 300
даадассссд аддкссадкк саадкддкас дкддасддсд кддаддкдса каакдссаад 360
асааадссдс дддаддадса дкасаасадс асдккссдкд кддксадсдк ссксассдкс 420
скдсассадд аскддскдаа сддсааддад касаадкдса аддкскссаа сааадссскс 480
ссадссссса ксдадаааас сакскссааа ассаааддас адссссдада ассасаддкд 540
касассскдс ссссаксссд ддаддадакд ассаадаасс аддксадсск дасскдсскд 600
дксаааддск кскассссад сдасаксдсс дкддадкддд ададсадсдд дсадссддад 660
аасааскаса асассасдсс ксссакдскд даскссдасд дскссккскк сскскасадс 720
аадсксассд кддасаадад саддкддсад саддддааса кскксксакд скссдкдакд 780
сакдаддскс кдсасаассд скксасдсад аададсскск ссскдксксс дддкааакда 840
<210> 7 <211> 229 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз
- 72 032985
<400> 7 О1у 5 Рго Рго Суз Рго 5ег 10 Суз Рго А1а Рго О1и 15 Рке
О1и 1 5ег Ьуз Туг
Ьеи О1у О1у Рго 5ег Уа1 Рке Ьеи Рке Рго Рго Ьуз Рго Ьуз Азр ТЬг
20 25 30
Ьеи МеЬ 11е 5ег Агд ТЬг Рго О1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1
35 40 45
5ег О1п О1и Азр Рго О1и Уа1 О1п Рке Азп Тгр Туг Уа1 Азр О1у Уа1
50 55 60
О1и Уа1 Н1з Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд О1и О1и О1п Рке Азп 5ег
65 70 75 80
ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 5ег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н1з О1п Азр Тгр Ьеи
85 90 95
Азп О1у Ьуз О1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 5ег Азп Ьуз О1у Ьеи Рго 5ег
100 105 110
5ег 11е О1и Ьуз ТЬг 11е 5ег Ьуз А1а Ьуз О1у О1п Рго Агд О1и Рго
115 120 125
О1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго 5ег О1п О1и О1и МеЬ ТЬг Ьуз Азп О1п
130 135 140
Уа1 5ег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз О1у Рке Туг Рго 5ег Азр 11е А1а
145 150 155 160
Уа1 О1и Тгр О1и 5ег Азп О1у О1п Рго О1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг
165 170 175
Рго Рго Уа1 Ьеи Азр 5ег Азр О1у 5ег Рке Рке Ьеи Туг 5ег Агд Ьеи
180 185 190
ТЬг Уа1 Азр Ьуз 5ег Агд Тгр О1п О1и О1у Азп Уа1 Рке 5ег Суз 5ег
195 200 205
Уа1 МеЬ Н1з О1и А1а Ьеи Н1з Азп Н1з Туг ТЬг О1п Ьуз 5ег Ьеи 5ег
210 215 220
Ьеи 5ег Ьеи О1у Ьуз
225 <210> 8 <211> 690
- 73 032985
<212> ДНК <213> Ното зар+епз
<400> 8
дадЬссаааЬ аЬддЬссссс аЬдсссаЬса Ьдсссадсас сЬдадЬЬссЬ ддддддасса 60
ЬсадЬсЬЬсс ЬдЬЬсссссс аааасссаад дасасЬсЬса ЬдаЬсЬсссд дассссЬдад 120
дЬсасдЬдсд ЬддЬддЬдда сдЬдадссад даадассссд аддЬссадЬЬ саасЬддЬас 180
дЬддаЬддсд ЬддаддЬдса ЬааЬдссаад асааадссдс дддаддадса дЬЬсаасадс 240
асдЬассдЬд ЬддЬсадсдЬ ссЬсассдЬс сЬдсассадд асЬддсЬдаа сддсааддад 300
ЬасаадЬдса аддЬсЬссаа саааддссЬс ссдЬссЬсса Ьсдадаааас саЬсЬссааа 360
дссааадддс адссссдада дссасаддЬд ЬасасссЬдс ссссаЬссса ддаддада+д 420
ассаадаасс аддЬсадссЬ дассЬдссЬд дЬсаааддсЬ ЬсЬассссад сдасаЬсдсс 480
дЬддадЬддд ададсааЬдд дсадссддад аасаасЬаса адассасдсс ЬсссдЬдсЬд 540
дасЬссдасд дсЬссЬЬсЬЬ ссЬсЬасадс аддсЬаассд Ьддасаадад садд+ддсад 600
даддддаа+д ЬсЬЬсЬсаЬд сЬссдЬдаЬд саЬдаддсЬс Ьдсасаасса сЬасасасад 660
аададссЬсЬ сссЬдЬсЬсЬ дддЬаааЬда 690
<210> 9 <211> 267 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз
<400> 9 Ьеи Туг Н1з 10 Ьеи ТНг А1а Уа1 Бег 15 Бег
А1а 1 О1и Бег Н1з Ьеи 5 Бег Ьеи
Рго А1а Рго О1у ТНг Рго А1а Рке Тгр Уа1 Бег О1у Тгр Ьеи О1у Рго
20 25 30
О1п О1п Туг Ьеи Бег Туг Азп Бег Ьеи Агд О1у О1и А1а О1и Рго Суз
35 40 45
О1у А1а Тгр Уа1 Тгр О1и Азп О1п Уа1 Бег Тгр Туг Тгр О1и Ьуз О1и
50 55 60
ТНг ТНг Азр Ьеи Агд 11е Ьуз О1и Ьуз Ьеи Рке Ьеи О1и А1а Рке Ьуз
65 70 75 80
А1а Ьеи О1у О1у Ьуз О1у Рго Туг ТНг Ьеи О1п О1у Ьеи Ьеи О1у Суз
85 90 95
О1и Ьеи О1у Рго Азр Азп ТНг Бег Уа1 Рго ТНг А1а Ьуз Рке А1а Ьеи
100 105 110
- 74 032985
Азп О1у О1и О1и РЪе МеЕ Азп РЪе 120 Азр Ьеи Ьуз О1п О1у 125 ТЪг Тгр О1у
115
О1у Азр Тгр Рго О1и А1а Ьеи А1а 11е Бег О1п Агд Тгр О1п О1п О1п
130 135 140
Азр Ьуз А1а А1а Азп Ьуз О1и Ьеи ТЪг РЪе Ьеи Ьеи РЪе Бег Суз Рго
145 150 155 160
Н1з Агд Ьеи Агд О1и Н1з Ьеи О1и Агд О1у Агд О1у Азп Ьеи О1и Тгр
165 170 175
Ьуз О1и Рго Рго Бег МеЕ Агд Ьеи Ьуз А1а Агд Рго Бег Бег Рго О1у
180 185 190
РЪе Бег Уа1 Ьеи ТЪг Суз Бег А1а РЪе Бег РЪе Туг Рго Рго О1и Ьеи
195 200 205
О1п Ьеи Агд РЪе Ьеи Агд Азп О1у Ьеи А1а А1а О1у ТЪг О1у О1п О1у
210 215 220
Азр РЪе О1у Рго Азп Бег Азр О1у Бег РЪе Н1з А1а Бег Бег Бег Ьеи
225 230 235 240
ТЪг Уа1 Ьуз Бег О1у Азр О1и Н1з Н1з Туг Суз Суз 11е Уа1 О1п Н1з
245 250 255
А1а О1у Ьеи А1а О1п Рго Ьеи Агд Уа1 О1и Ьеи
260 265 <210> 10 <211> 99 <212> БЕЛОК <213> Ното зар1епз <400> 10
11е 1 О1п Агд ТЪг Рго 5 Ьуз 11е О1п Уа1 Туг 10 Бег Агд Н1з Рго А1а О1и 15
Азп О1у Ьуз Бег Азп РЪе Ьеи Азп Суз Туг Уа1 Бег О1у РЪе Н1з Рго
20 25 30
Бег Азр 11е О1и Уа1 Азр Ьеи Ьеи Ьуз Азп О1у О1и Агд 11е О1и Ьуз
35 40 45
Уа1 О1и Н1з Бег Азр Ьеи Бег РЪе Бег Ьуз Азр Тгр Бег РЪе Туг Ьеи
50 55 60
Ьеи Туг Туг ТЪг О1и РЪе ТЪг Рго ТЪг О1и Ьуз Азр О1и Туг А1а Суз
- 75 032985
Агд Уа1 Азп Н1з Уа1
ТЪг Ьеи Бег О1п Рго Ьуз
11е Уа1 Ьуз Тгр Азр
Агд Азр Мек <210> 11 <211> 235 <212> БЕЛОК <213> Ното заргепз
<400> 11 РЪе ТЪг Рго Туг 10 А1а Рго О1и Рго О1у 15 Бег
Ьеи 1 Рго А1а О1п Уа1 5 А1а
ТЪг Суз Агд Ьеи Агд О1и Туг Туг Азр О1п ТЪг А1а О1п Мек Суз Суз
20 25 30
Бег Ьуз Суз Бег Рго О1у О1п Н1з А1а Ьуз Уа1 РЪе Суз ТЪг Ьуз ТЪг
35 40 45
Бег Азр ТЪг Уа1 Суз Азр Бег Суз О1и Азр Бег ТЪг Туг ТЪг О1п Ьеи
50 55 60
Тгр Азп Тгр Уа1 Рго О1и Суз Ьеи Бег Суз О1у Бег Агд Суз Бег Бег
65 70 75 80
Азр О1п Уа1 О1и ТЪг О1п А1а Суз ТЪг Агд О1и О1п Азп Агд 11е Суз
85 90 95
ТЪг Суз Агд Рго О1у Тгр Туг Суз А1а Ьеи Бег Ьуз О1п О1и О1у Суз
100 105 110
Агд Ьеи Суз А1а Рго Ьеи Агд Ьуз Суз Агд Рго О1у РЪе О1у Уа1 А1а
115 120 125
Агд Рго О1у ТЪг О1и ТЪг Бег Азр Уа1 Уа1 Суз Ьуз Рго Суз А1а Рго
130 135 140
О1у ТЪг РЪе Бег Азп ТЪг ТЪг Бег Бег ТЪг Азр 11е Суз Агд Рго Н1з
145 150 155 160
О1п 11е Суз Азп Уа1 Уа1 А1а 11е Рго О1у Азп А1а Бег Мек Азр А1а
165 170 175
Уа1 Суз ТЪг Бег ТЪг Бег Рго ТЪг Агд Бег Мек А1а Рго О1у А1а Уа1
180 185 190
- 76 032985
Н1з Ьеи Рго 195 О1п Рго Уа1 Бег Тйг 200 Агд Бег О1п Н1з Тйг 205 О1п Рго Тйг
Рго О1и Рго Бег Тйг А1а Рго Бег Тйг Бег Рйе Ьеи Ьеи Рго Меб О1у
210 215 220
Рго Бег Рго Рго А1а О1и О1у Бег Тйг О1у Азр
225 230 235
<210> 12
<211> 124
<212> БЕЛОК
<213> Ното зар1епз
<400> 12
Меб Н1з Уа1 А1а О1п Рго А1а Уа1 Уа1 Ьеи А1а Бег Бег Агд О1у 11е
1 5 10 15
А1а Бег Рйе Уа1 Суз О1и Туг А1а Бег Рго О1у Ьуз А1а Тйг О1и Уа1
20 25 30
Агд Уа1 Тйг Уа1 Ьеи Агд О1п А1а Азр Бег О1п Уа1 Тйг О1и Уа1 Суз
35 40 45
А1а А1а Тйг Туг Меб Меб О1у Азп О1и Ьеи Тйг Рйе Ьеи Азр Азр Бег
50 55 60
11е Суз Тйг О1у Тйг Бег Бег О1у Азп О1п Уа1 Азп Ьеи Тйг 11е О1п
65 70 75 80
О1у Ьеи Агд А1а Меб Азр Тйг О1у Ьеи Туг 11е Суз Ьуз Уа1 О1и Ьеи
85 90 95
Меб Туг Рго Рго Рго Туг Туг Ьеи О1у 11е О1у Азп О1у Тйг О1п 11е
100 105 110
Туг Уа1 11е Азр Рго О1и Рго Суз Рго Азр Бег Азр
115 120
<210> 13
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание= Описание искусственной
пептид
последовательности: синтетический
- 77 032985 <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (2)..(7) <223> / замена =РИ.е или Азп или Агд или Бег или ТИг или МеВ или 11е или О1и или Азр или О1у ог
А1а или Уа1 или О1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (2)..(7) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 13
Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз
5 <210> 14 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (2)..(8) <223> /замена=РИе или Азп или Агд или Бег или ТИг или МеВ или 11е или О1и или Азр или О1у ог А1а или Уа1 или О1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (2)..(8) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 14
Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз
5 <210> 15 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
- 78 032985 <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (2)..(9) <223> / замена =РИ.е или Азп или Агд или Вег или ТИг или МеВ или 11е или О1и или Азр или О1у ог
А1а или Уа1 или О1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (2)..(9) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 15
Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз
5 10 <210> 16 <211> 10 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<220>
<221> ВАРИАНТ
<222> (3). .(8)
<223> /замена=РИе или Азп или Агд или Вег или ТИг
или МеВ или 11е или О1и или Азр или О1у ог
А1а или Уа1 или : О1п или Нтз или Рго или Ьеи
или Туг или Тгр
<220>
<221> смеш _признак
<222> (3). .(8)
<223> /примечание=остатки, вписанные в последовательно сть не имеют преиму-
щества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 16
О1у Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз О1у
5 10 <210> 17 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
- 79 032985 <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (3)..(9) <223> / замена =РЪ.е или Азп или Агд или Вег или ТЪг или МеБ или 11е или О1и или Азр или О1у ог
А1а или Уа1 или О1п или НБз или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (3)..(9) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 17
О1у Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз О1у
5 10 <210> 18 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (3)..(10) <223> /замена=РЪ.е или Азп или Агд или Вег или ТЪг или МеБ или 11е или О1и или Азр или О1у ог А1а или Уа1 или О1п или НБз или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (3)..(10) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 18
О1у Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз О1у
5 10 <210> 19 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
- 80 032985 <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (4)..(9) <223> /замена=РЪе или Азп или Агд или Бег или ТЪг или Мек или 11е или О1и или Азр или О1у ог А1а или Уа1 или О1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (4)..(9) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 19
О1у О1у Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз О1у О1у
5 10 <210> 20 <211> 13 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (4)..(10) <223> /замена=РЪе или Азп или Агд или Бег или ТЪг или Мек или 11е или О1и или Азр или О1у ог
А1а или Уа1 или О1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (4)..(10) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 20
О1у О1у Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз О1у О1у
5 10 <210> 21 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
- 81 032985 <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (4)..(11) <223> /замена=РИе или Азп или Агд или Бег или ТИг или МеВ или 11е или О1и или Азр или О1у ог А1а или Уа1 или О1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (4)..(11) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 21
О1у О1у Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз О1у О1у
5 10 <210> 22 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (5)..(10) <223> /замена=РИе или Азп или Агд или Бег или ТИг или МеВ или 11е или О1и или Азр или О1у ог
А1а или Уа1 или О1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (5)..(10) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 22
О1у О1у О1у Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз О1у О1у О1у
5 10 <210> 23 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
- 82 032985 <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (5)..(11)
<223> /замена= РИе или Азп или Агд или Вег или ТИг
или ’МеВ или 11е или О1и или Азр или О1у ог
А1а или Уа1 или : С1п или Н1з или Рго или Ьеи
или ' Туг или Тгр
<220>
<221> смеш_признак <222> (5)..(11) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 23
О1у О1у О1у Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз О1у О1у О1у
5 10 15 <210> 24 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (5)..(12)
<223> /замена= РИе или Азп или Агд или Вег или ТИг
или МеВ или 11е или О1и или Азр или О1у ог
А1а или Уа1 или : С1п или Н1з или Рго или Ьеи
или ' Туг или Тгр
<220>
<221> смеш_признак <222> (5)..(12) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 24
О1у О1у О1у Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз О1у О1у О1у
5 10 15 <210> 25 <211> 705 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 83 032985 <221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <220>
<221> изменение <222> (109)..(111) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (112)..(114) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (115)..(117) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (118)..(120) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (121)..(123) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (124)..(126) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> смеш_признак <222> (109)..(126) <223> /примечание=нуклеотиды, вписанные в последовательность, не имеет преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <220>
<221> источник <223> /примечание=см. в прилагаемом описании подробное описание замен и предпочтительных вариантов реализации <400> 25
дадоосаааб сббдбдасаа аасбсасаса ЁдсссассдЁ дсссадсасс ЁдаасЁссЁд 60
дддддассдб садбсббссб сббсссссса ааасссаадд асасссЁсаа аааааааааа 120
- 84 032985
ааааааассс сЕдаддЕсас аЕдсдЕддЕд дЕддасдЕда дссасдаада сссЕдаддЕс 180
аадЕЕсаасЕ ддЕасдЕдда сддсдЕддад дЕдсаЕааЕд ссаадасааа дссдсдддад 240
дадсадЕаса асадсасдЕа ссдЕдЕддЕс адсдЕссЕса ссдЕссЕдса ссаддасЕдд 300
сЕдааЕддса аддадЕасаа дЕдсааддЕс Ессаасааад сссЕсссадс ссссаЕсдад 360
аааассаЕсЕ ссааадссаа адддсадссс сдададссас аддЕдЕасас ссЕдссссса 420
ЕсссдддаЕд адсЕдассаа даассаддЕс адссЕдассЕ дссЕддЕсаа аддсЕЕсЕаЕ 480
сссадсдаса ЕсдссдЕдда дЕдддададс ааЕдддсадс сддадаасаа сЕасаадасс 540
асдссЕсссд ЕдсЕддасЕс сдасддсЕсс ЕЕсЕЕссЕсЕ асадсаадсЕ сассдЕддас 600
аададсаддЕ ддсадсаддд даасдЕсЕЕс ЕсаЕдсЕссд ЕдаЕдсаЕда ддсЕсЕдсас 660
аассасЕаса сдсадаадад ссЕсЕсссЕд ЕсЕссдддЕа ааЕда 705
<210> 26 <211> 234 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид ро1урерЕ1бе <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (37)..(42) <223> /замена=РЪе или Азп или Агд или Бег или ТЪг или МеЕ или 11е или О1и или Азр или О1у ог А1а или Уа1 или О1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (37)..(42) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям
<400> 26 Н1з ТЪг 10 Суз Рго Рго Суз Рго 15 А1а
О1и 1 Рго Ьуз Бег Суз 5 Азр Ьуз ТЪг
Рго О1и Ьеи Ьеи О1у О1у Рго Бег Уа1 РЪе Ьеи РЪе Рго Рго Ьуз Рго
20 25 30
Ьуз Азр ТЪг Ьеи Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз ТЪг Рго О1и Уа1 ТЪг Суз
35 40 45
Уа1 Уа1 Уа1 Азр Уа1 Бег Нтз О1и Азр Рго О1и Уа1 Ьуз РЪе Азп Тгр
- 85 032985
Туг Уа1 65 Азр С1у Уа1 С1и 70 Уа1 НБз Азп А1а Ьуз 75 ТЪг Ьуз Рго Агд С1и 80
С1и С1п Туг Азп Вег ТЪг Туг Агд Уа1 Уа1 Вег Уа1 Ьеи ТЪг Уа1 Ьеи
85 90 95
НБз С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Вег Азп
100 105 110
Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТЪг 11е Вег Ьуз А1а Ьуз С1у
115 120 125
С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЪг Ьеи Рго Рго Вег Агд Азр С1и
130 135 140
Ьеи ТЪг Ьуз Азп С1п Уа1 Вег Ьеи ТЪг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЪе Туг
145 150 155 160
Рго Вег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Вег Азп С1у С1п Рго С1и Азп
165 170 175
Азп Туг Ьуз ТЪг ТЪг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Вег Азр С1у Вег РЪе РЪе
180 185 190
Ьеи Туг Вег Ьуз Ьеи ТЪг Уа1 Азр Ьуз Вег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп
195 200 205
Уа1 РЪе Вег Суз Вег Уа1 МеБ НБз С1и А1а Ьеи НБз Азп НБз Туг ТЪг
210 215 220
С1п Ьуз Вег Ьеи Вег Ьеи Вег Рго С1у Ьуз
225 230 <210> 27 <211> 711 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид ро1упис1еоБ1Де <220>
<221> изменение <222> (277)..(279) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
- 86 032985
или ССС или ССТ или СТТ ССТ или или ТАС СТС или или ТСТ САА или или ТСС САС или или ТТС ССТ или
<220>
<221> изменение
<222> (280)..(282)
<223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
<220>
<221> изменение
<222> (283)..(285)
<223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
<220>
<221> изменение
<222> (286)..(288)
<223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
<220>
<221> изменение <222> (289)..(291) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (292)..(294) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> смеш_признак <222> (277)..(294) <223> /примечание=нуклеотиды, вписанные в последовательность, не имеет преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <220>
<221> источник <223> /примечание=см. в прилагаемом описании подробное описание замен и предпочтительных вариантов реализации <400> 27
дадсссаааб сббдбдасаа аасбсасаса бдсссассдб дсссадсасс бдаасбссбд 60
дддддассдб садбсббссб сббсссссса ааасссаадд асасссбсаб дабсбсссдд 120
ассссбдадд бсасабдсдб ддбддбддас дбдадссасд аадасссбда ддбсаадббс 180
аасбддбасд бддасддсдб ддаддбдсаб аабдссаада сааадссдсд ддаддадсад 240
басаасадса сдбассдбдб ддбсадсдбс сбсассаааа аааааааааа аааасассад 300
дасбддсбда абддсаадда дбасаадбдс ааддбсбсса асааадсссб сссадссссс 360
- 87 032985
аксдадаааа ссакскссаа адссаааддд садссссдад адссасаддк дкасассскд 420
сссссакссс дддакдадск дассаадаас саддксадсс кдасскдсск ддксаааддс 480
ккскакссса дсдасаксдс сдкддадкдд дададсаакд ддсадссдда даасааскас 540
аадассасдс сксссдкдск ддаскссдас ддскссккск ксскскасад саадсксасс 600
дкддасаада дсаддкддса дсаддддаас дкскксксак дскссдкдак дсакдаддск 660
скдсасаасс аскасасдса даададсскс кссскдкскс сдддкааакд а 711
<210> 28 <211> 236 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид ро1урерк1Де <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (93)..(98) <223> /замена=РЪе или Азп или Агд или Бег или ТЪг или Мек или 11е или О1и или Азр или О1у ог А1а или Уа1 или О1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (93)..(98) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 28
О1и 1 Рго Ьуз Бег Суз 5 Азр Ьуз ТЪг Н1з ТЪг 10 Суз Рго Рго Суз Рго 15 А1а
Рго О1и Ьеи Ьеи О1у О1у Рго Бег Уа1 РЪе Ьеи РЪе Рго Рго Ьуз Рго
20 25 30
Ьуз Азр ТЪг Ьеи Мек 11е Бег Агд ТЪг Рго О1и Уа1 ТЪг Суз Уа1 Уа1
35 40 45
Уа1 Азр Уа1 Бег Н1з О1и Азр Рго О1и Уа1 Ьуз РЪе Азп Тгр Туг Уа1
50 55 60
Азр О1у Уа1 О1и Уа1 Н1з Азп А1а Ьуз ТЪг Ьуз Рго Агд О1и О1и О1п
65 70 75 80
Туг Азп Бег ТЪг Туг Агд Уа1 Уа1 Бег Уа1 Ьеи ТЪг Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз
90 95
- 88 032985
Ьуз Ьуз Н1з С1п 100 Азр Тгр Ьеи Азп С1у 105 Ьуз С1и Туг Ьуз Суз 110 Ьуз Уа1
Бег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТИг 11е Бег Ьуз А1а
115 120 125
Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТИг Ьеи Рго Рго Бег Агд
130 135 140
Азр С1и Ьеи ТИг Ьуз Азп С1п Уа1 Бег Ьеи ТИг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у
145 150 155 160
РИе Туг Рго Бег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Бег Азп С1у С1п Рго
165 170 175
С1и Азп Азп Туг Ьуз ТИг ТИг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Бег Азр С1у Бег
180 185 190
РИе РИе Ьеи Туг Бег Ьуз Ьеи ТИг Уа1 Азр Ьуз Бег Агд Тгр С1п С1п
195 200 205
С1у Азп Уа1 РИе Бег Суз Бег Уа1 МеВ Н1з С1и А1а Ьеи Н1з Азп Н1з
210 215 220
Туг ТИг С1п Ьуз Бег Ьеи Бег Ьеи Бег Рго С1у Ьуз
225 230 235
<210> 29 <211> 729 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид ро1упис1еоВ1Де <220>
<221> изменение <222> (286)..(288) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (289)..(291) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
- 89 032985 <220>
<221> изменение <222> (292)..(294) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (295)..(297) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (298)..(300) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (301)..(303) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> смеш_признак <222> (286)..(303) <223> /примечание=нуклеотиды, вписанные в последовательность, не имеет преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <220>
<221> источник <223> /примечание=см. в прилагаемом описании подробное описание замен и предпочтительных вариантов реализации <400> 29
дадсссаааб сббдбдасаа аасбсасаса бдсссассдб дсссадсасс бдаасбссбд 60
дддддассдб садбсббссб сббсссссса ааасссаадд асасссбсаб дабсбсссдд 120
ассссбдадд бсасабдсдб ддбддбддас дбдадссасд аадасссбда ддбсаадббс 180
аасбддбасд бддасддсдб ддаддбдсаб аабдссаада сааадссдсд ддаддадсад 240
басаасадса сдбассдбдб ддбсадсдбс сбсассддбд дббдбааааа аааааааааа 300
ааабдбддбд дбсассадда сбддсбдааб ддсааддадб асаадбдсаа ддбсбссаас 360
ааадсссбсс садсссссаб сдадаааасс абсбссааад ссааадддса дссссдадад 420
ссасаддбдб асасссбдсс сссабсссдд дабдадсбда ссаадаасса ддбсадссбд 480
ассбдссбдд бсаааддсбб сбабсссадс дасабсдссд бддадбддда дадсаабддд 540
садссддада асаасбасаа дассасдссб сссдбдсбдд асбссдасдд сбссббсббс 600
сбсбасадса адсбсассдб ддасаададс аддбддсадс аддддаасдб сббсбсабдс 660
- 90 032985 бссдбдабдс абдаддсбсб дсасаассас басасдсада ададссбсбс ссбдбсбссд 720 ддбааабда
729 <210> 30 <211> 242 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид ро1урерб1Пе <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (96)..(101) <223> /замена=РЬе или Азп или Агд или Бег или ТЬг или Меб или 11е или С1и или Азр или С1у ог
А1а или Уа1 или С1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (96)..(101) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям
<400> 30 ТЬг 10 Суз Рго Рго Суз Рго 15 А1а
С1и 1 Рго Ьуз Бег Суз 5 Азр Ьуз ТЬг Н1з
Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Бег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго
20 25 30
Ьуз Азр ТЬг Ьеи Меб 11е Бег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1
35 40 45
Уа1 Азр Уа1 Бег Н1з С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1
50 55 60
Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Н1з Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п
65 70 75 80
Туг Азп Бег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Бег Уа1 Ьеи ТЬг С1у С1у Суз Ьуз
85 90 95
Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз С1у С1у Н1з С1п Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз
100 105 110
С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Бег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и
- 91 032985
115
120
125
Ьуз ТИг 130 11е Вег Ьуз А1а Ьуз 135 С1у С1п Рго Агд С1и 140 Рго С1п Уа1 Туг
ТИг Ьеи Рго Рго Вег Агд Азр С1и Ьеи ТИг Ьуз Азп С1п Уа1 Вег Ьеи
145 150 155 160
ТИг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РИе Туг Рго Вег Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр
165 170 175
С1и Вег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТИг ТИг Рго Рго Уа1
180 185 190
Ьеи Азр Вег Азр С1у Вег РИе РИе Ьеи Туг Вег Ьуз Ьеи ТИг Уа1 Азр
195 200 205
Ьуз Вег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РИе Вег Суз Вег Уа1 МеВ Н1з
210 215 220
С1и А1а Ьеи Н1з Азп Н1з Туг ТИг С1п Ьуз Вег Ьеи Вег Ьеи Вег Рго
225 230 235 240
С1у Ьуз <210> 31 <211> 705 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид ро1упис1еоВ1Эе синтетический <220>
<221> изменение <222> (646)..(648) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (649)..(651) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение
- 92 032985 <222> (652)..(654) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (655)..(657) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (658)..(660) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССТ ССС или или СТТ ССТ или или ТАС СТС или или ТСТ САА или или САС ТСС или или ССТ или ТТС
<220>
<221> смеш_ признак
<222> (646) ..(660)
<223> /примечание=нуклеотиды, вписанные в последовательность, не имеет
преимущества
по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям
<220>
<221> изменение <222> (664)..(666) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> смеш_признак <222> (664)..(666) <223> /примечание=нуклеотиды, вписанные в последовательность, не имеет преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <220>
<221> источник <223> /примечание=см. в прилагаемом описании подробное описание замен и предпочтительных вариантов реализации <400> 31
дадсссаааЕ сЕЕдЕдасаа аасЕсасаса ЕдсссассдЕ дсссадсасс ЕдаасЕссЕд 60
дддддассдЕ садЕсЕЕссЕ сЕЕсссссса ааасссаадд асасссЕсаЕ даЕсЕсссдд 120
сасассссЕд аддЕсасаЕд сдЕддЕддЕд дасдЕдадсс асдаадассс ЕдаддЕсаад 180
ЕЕсаасЕддЕ асдЕддасдд сдЕддаддЕд саЕааЕдсса адасааадсс дсдддаддад 240
садЕасааса дсасдЕассд ЕдЕддЕсадс дЕссЕсассд ЕссЕдсасса ддасЕддсЕд 300
ааЕддсаадд адЕасаадЕд сааддЕсЕсс аасааадссс Есссадсссс саЕсдадааа 360
ассаЕсЕсса аадссааадд дсадссссда дадссасадд ЕдЕасасссЕ дсссссаЕсс 420
сдддаЕдадс Едассаадаа ссаддЕсадс сЕдассЕдсс ЕддЕсааадд сЕЕсЕаЕссс 480
адсдасаЕсд ссдЕддадЕд ддададсааЕ дддсадссдд адаасаасЕа саадассасд 540
- 93 032985
ссБсссдБдс БддасБссда сддсБссББс ББссБсБаса дсаадсБсас сдБддасаад 600
адсаддБддс адсаддддаа сдБсББсБса БдсБссдБда БдсаБааааа аааааааааа 660
сасаааБаса сдсадаадад ссБсБсссБд БсБссдддБа ааБда 705
<210> 32 <211> 234 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (215)..(219) <223> /замена=РЪе или Азп или Агд или Вег или ТЪг или МеБ или 11е или С1и или Азр или С1у ог
А1а или Уа1 или С1п или НБз или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (215)..(219) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (221)..(221) <223> /замена=РЪе или Азп или Агд или Вег или ТЪг или МеБ или 11е или С1и или Азр или С1у ог
А1а или Уа1 или С1п или НБз или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (221)..(221) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям
<400> 32 НБз ТЪг 10 Суз Рго Рго Суз Рго 15 А1а
С1и 1 Рго Ьуз Вег Суз 5 Азр Ьуз ТЪг
Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Вег Уа1 РЪе Ьеи РЪе Рго Рго Ьуз Рго
20 25 30
Ьуз Азр ТЪг Ьеи МеБ 11е Вег Агд ТЪг Рго С1и Уа1 ТЪг Суз Уа1 Уа1
35 40 45
Уа1 Азр Уа1 Вег НБз С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЪе Азп Тгр Туг Уа1
- 94 032985
Азр 65 С1у Уа1 С1и Уа1 Н1з 70 Азп А1а Ьуз ТЪг Ьуз 75 Рго Агд С1и С1и С1п 80
Туг Азп Бег ТЪг Туг Агд Уа1 Уа1 Бег Уа1 Ьеи ТЪг Уа1 Ьеи Н1з С1п
85 90 95
Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Бег Азп Ьуз А1а
100 105 110
Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТЪг 11е Бег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго
115 120 125
Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЪг Ьеи Рго Рго Бег Агд Азр С1и Ьеи ТЪг
130 135 140
Ьуз Азп С1п Уа1 Бег Ьеи ТЪг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЪе Туг Рго Бег
145 150 155 160
Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Бег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг
165 170 175
Ьуз ТЪг ТЪг Рго Рго Уа1 Ьеи Азр Бег Азр С1у Бег РЪе РЪе Ьеи Туг
180 185 190
Бег Ьуз Ьеи ТЪг Уа1 Азр Ьуз Бег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЪе
195 200 205
Бег Суз Бег Уа1 Мек Н1з Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Н1з Ьуз Н1з Туг ТЪг
210 215 220
С1п Ьуз Бег Ьеи Бег Ьеи Бег Рго С1у Ьуз
225 230
<210> 33 <211> 735 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <220>
<221> изменение <222> (223)..(225) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
- 95 032985
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (226)..(228) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (229)..(231) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (232)..(234) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (235)..(237) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (238)..(240) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> смеш_признак <222> (223)..(240) <223> /примечание=нуклеотиды, вписанные в последовательность, не имеет преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <220>
<221> источник <223> /примечание=см. в прилагаемом описании подробное описание замен и предпочтительных вариантов реализации <400> 33
дадсссаааВ сВВдВдасаа аасВсасаса ВдсссассдВ дсссадсасс ВдаасВссВд 60
дддддассдв садВсВВссВ сВВсссссса ааасссаадд асасссВсаВ даВсВсссдд 120
ассссВдадд ВсасаВдсдВ ддВддВддас дВдадссасд аадасссВда ддВсаадВВс 180
аасВддВасд ВддасддсдВ ддаддВдсаВ ааВддВддВВ дВаааааааа аааааааааа 240
ВдВддВддВд ссаадасааа дссдсдддад дадсадВаса асадсасдВа ссдВдВддВс 300
адсдВссВса ссдВссВдса ссаддасВдд сВдааВддса аддадВасаа дВдсааддВс 360
Вссаасааад сссВсссадс ссссаВсдад аааассаВсВ ссааадссаа адддсадссс 420
- 96 032985
сдададссас аддЕдЕасас ссЕдссссса ЕсссдддаЕд адсЕдассаа даассаддЕс 480
адссЕдассЕ дссЕддЕсаа аддсЕЕсЕаЕ сссадсдаса ЕсдссдЕдда дЕдддададс 540
ааЕдддсадс сддадаасаа сЕасаадасс асдссЕсссд ЕдсЕддасЕс сдасддсЕсс 600
ЕЕсЕЕссЕсЕ асадсаадсЕ сассдЕддас аададсаддЕ ддсадсаддд даасдЕсЕЕс 660
ЕсаЕдсЕссд ЕдаЕдсаЕда ддсЕсЕдсас аассасЕаса сдсадаадад ссЕсЕсссЕд 720
ЕсЕссдддЕа ааЕда 735
<210> 34 <211> 244 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (75)..(80) <223> /замена=РЪе или Азп или Агд или Бег или ТЪг или МеЕ или 11е или С1и или Азр или С1у ог
А1а или Уа1 или С1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (75)..(80) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность, не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям
<400> 34 ТЪг Н1з ТЪг 10 Суз Рго Рго Суз Рго 15 А1а
С1и 1 Рго Ьуз Бег Суз 5 Азр Ьуз
Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Бег Уа1 РЪе Ьеи РЪе Рго Рго Ьуз Рго
20 25 30
Ьуз Азр ТЪг Ьеи МеЕ 11е Бег Агд ТЪг Рго С1и Уа1 ТЪг Суз Уа1 Уа1
35 40 45
Уа1 Азр Уа1 Бег Н1з С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЪе Азп Тгр Туг Уа1
50 55 60
Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Н1з Азп С1у С1у Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз
65 70 75 80
Суз С1у С1у А1а Ьуз ТЪг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п Туг Азп Бег ТЪг
- 97 032985
Туг Агд Уа1 Уа1 100 Вег Уа1 Ьеи ТИг Уа1 105 Ьеи Н1з С1п Азр Тгр 110 Ьеи Азп
С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Вег Азп Ьуз А1а Ьеи Рго А1а Рго
115 120 125
11е С1и Ьуз ТИг 11е Вег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго Агд С1и Рго С1п
130 135 140
Уа1 Туг ТИг Ьеи Рго Рго Вег Агд Азр С1и Ьеи ТИг Ьуз Азп С1п Уа1
145 150 155 160
Вег Ьеи ТИг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РИе Туг Рго Вег Азр 11е А1а Уа1
165 170 175
С1и Тгр С1и Вег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТИг ТИг Рго
180 185 190
Рго Уа1 Ьеи Азр Вег Азр С1у Вег РИе РИе Ьеи Туг Вег Ьуз Ьеи ТИг
195 200 205
Уа1 Азр Ьуз Вег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РИе Вег Суз Вег Уа1
210 215 220
МеВ Н1з С1и А1а Ьеи Н1з Азп Н1з Туг ТИг С1п Ьуз Вег Ьеи Вег Ьеи
225 230 235 240
Вег Рго С1у Ьуз <210> 35 <211> 735 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <220>
<221> изменение <222> (517)..(519) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
- 98 032985 <221> изменение <222> (520)..(522) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (523)..(525) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (526)..(528) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (529)..(531) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (532)..(534) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> смеш_признак <222> (517)..(534) <223> /примечание=нуклеотиды, вписанные в последовательность, не имеет преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <220>
<221> источник <223> /примечание=см. в прилагаемом описании подробное описание замен и предпочтительных вариантов реализации <400> 35
дадсссаааб сббдбдасаа аасбсасаса бдсссассдб дсссадсасс бдаасбссбд 60
дддддассдб садбсббссб сббсссссса ааасссаадд асасссбсаб дабсбсссдд 120
ассссбдадд бсасабдсдб ддбддбддас дбдадссасд аадасссбда ддбсаадббс 180
аасбддбасд бддасддсдб ддаддбдсаб аабдссаада сааадссдсд ддаддадсад 240
басаасадса сдбассдбдб ддбсадсдбс сбсассдбсс бдсассадда сбддсбдааб 300
ддсааддадб асаадбдсаа ддбсбссаас ааадсссбсс садсссссаб сдадаааасс 360
абсбссааад ссааадддса дссссдадад ссасаддбдб асасссбдсс сссабсссдд 420
дабдадсбда ссаадаасса ддбсадссбд ассбдссбдд бсаааддсбб сбабсссадс 480
- 99 032985
дасабсдссд бддадбддда дадсаабддб ддббдбаааа аааааааааа аааабдбддб 540
ддбдддсадс сддадаасаа сбасаадасс асдссбсссд бдсбддасбс сдасддсбсс 600
ббсббссбсб асадсаадсб сассдбддас аададсаддб ддсадсаддд даасдбсббс 660
бсабдсбссд бдабдсабда ддсбсбдсас аассасбаса сдсадаадад ссбсбсссбд 720
бсбссдддба аабда 735
<210> 36 <211> 244 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (173)..(178) <223> /замена=РЬе или Азп или Агд или Бег или ТЬг или Меб или 11е или С1и или Азр или С1у ог
А1а или Уа1 или С1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (173)..(178) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям
<400> 36 Суз 5 Азр Ьуз ТЬг Н1з ТЬг 10 Суз Рго Рго Суз Рго 15 А1а
С1и 1 Рго Ьуз Бег
Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Бег Уа1 РЬе Ьеи РЬе Рго Рго Ьуз Рго
20 25 30
Ьуз Азр ТЬг Ьеи Меб 11е Бег Агд ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг Суз Уа1 Уа1
35 40 45
Уа1 Азр Уа1 Бег Н1з С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1
50 55 60
Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Н1з Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п
65 70 75 80
Туг Азп Бег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Бег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н1з С1п
85 90 95
Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Бег Азп Ьуз А1а
- 100 032985
100 105 110
Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТИг 11е Бег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго
115 120 125
Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТИг Ьеи Рго Рго Бег Агд Азр С1и Ьеи ТИг
130 135 140
Ьуз Азп С1п Уа1 Бег Ьеи ТИг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РИе Туг Рго Бег
145 150 155 160
Азр 11е А1а Уа1 С1и Тгр С1и Бег Азп С1у С1у Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз
165 170 175
Ьуз Ьуз Суз С1у С1у С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТИг ТИг Рго
180 185 190
Рго Уа1 Ьеи Азр Бег Азр С1у Бег РИе РИе Ьеи Туг Бег Ьуз Ьеи ТИг
195 200 205
Уа1 Азр Ьуз Бег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РИе Бег Суз Бег Уа1
210 215 220
МеВ Н1з С1и А1а Ьеи Н1з Азп Н1з Туг ТИг С1п Ьуз Бег Ьеи Бег Ьеи
225 230 235 240
Бег Рго С1у Ьуз <210> 37 <211> 735 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <220>
<221> изменение <222> (439)..(441) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (442)..(444) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
- 101 032985 <220>
<221> изменение <222> (445)..(447) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (448)..(450) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (451)..(453) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (454)..(456) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> смеш_признак <222> (439)..(456) <223> /примечание=нуклеотиды, вписанные в последовательность, не имеет преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <220>
<221> источник <223> /примечание=см. в прилагаемом описании подробное описание замен и предпочтительных вариантов реализации <400> 37
дадсссаааб сббдбдасаа аасбсасаса бдсссассдб дсссадсасс бдаасбссбд 60
дддддассдб садбсббссб сббсссссса ааасссаадд асасссбсаб дабсбсссдд 120
ассссбдадд бсасабдсдб ддбддбддас дбдадссасд аадасссбда ддбсаадббс 180
аасбддбасд бддасддсдб ддаддбдсаб аабдссаада сааадссдсд ддаддадсад 240
басаасадса сдбассдбдб ддбсадсдбс сбсассдбсс бдсассадда сбддсбдааб 300
ддсааддадб асаадбдсаа ддбсбссаас ааадсссбсс садсссссаб сдадаааасс 360
абсбссааад ссааадддса дссссдадад ссасаддбдб асасссбдсс сссабсссдд 420
дабдадсбдд дбддббдбаа аааааааааа аааааабдбд дбддбассаа даассаддбс 480
адссбдассб дссбддбсаа аддсббсбаб сссадсдаса бсдссдбдда дбдддададс 540
аабдддсадс сддадаасаа сбасаадасс асдссбсссд бдсбддасбс сдасддсбсс 600
ббсббссбсб асадсаадсб сассдбддас аададсаддб ддсадсаддд даасдбсббс 660
- 102 032985
БсаБдсБссд БдаБдсаБда ддсБсБдсас аассасБаса сдсадаадад ссБсБсссБд 720
БсБссдддБа ааБда
735 <210> 38 <211> 244 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (147)..(152) <223> /замена=РЪе или Азп или Агд или Вег или ТЪг или МеБ или 11е или С1и или Азр или С1у ог
А1а или Уа1 или С1п или НБз или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (147)..(152) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям
<400> 38 ТЪг НБз ТЪг 10 Суз Рго Рго Суз Рго 15 А1а
С1и 1 Рго Ьуз Вег Суз 5 Азр Ьуз
Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго Вег Уа1 РЪе Ьеи РЪе Рго Рго Ьуз Рго
20 25 30
Ьуз Азр ТЪг Ьеи МеБ 11е Вег Агд ТЪг Рго С1и Уа1 ТЪг Суз Уа1 Уа1
35 40 45
Уа1 Азр Уа1 Вег НБз С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЪе Азп Тгр Туг Уа1
50 55 60
Азр С1у Уа1 С1и Уа1 НБз Азп А1а Ьуз ТЪг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п
65 70 75 80
Туг Азп Вег ТЪг Туг Агд Уа1 Уа1 Вег Уа1 Ьеи ТЪг Уа1 Ьеи НБз С1п
85 90 95
Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Вег Азп Ьуз А1а
100 105 110
Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТЪг 11е Вег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго
115 120 125
- 103 032985
Агд С1и 130 Рго С1п Уа1 Туг ТЪг 135 Ьеи Рго Рго Бег Агд 140 Азр С1и Ьеи С1у
С1у Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз С1у С1у ТЪг Ьуз Азп С1п Уа1
145 150 155 160
Бег Ьеи ТЪг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЪе Туг Рго Бег Азр 11е А1а Уа1
165 170 175
С1и Тгр С1и Бег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЪг ТЪг Рго
180 185 190
Рго Уа1 Ьеи Азр Бег Азр С1у Бег РЪе РЪе Ьеи Туг Бег Ьуз Ьеи ТЪг
195 200 205
Уа1 Азр Ьуз Бег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЪе Бег Суз Бег Уа1
210 215 220
Мек Нгз С1и А1а Ьеи Н1з Азп Нгз Туг ТЪг С1п Ьуз Бег Ьеи Бег Ьеи
225 230 235 240
Бег Рго С1у Ьуз <210> 39 <211> 735 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический полинуклеотид <220>
<221> тоД1ЫеД_Ьазе <222> (439)..(440) <223> а, с, к, д, неизвестный или другой <220>
<221> тоД1ЫеД_Ьазе <222> (442)..(443) <223> а, с, к, д, неизвестный или другой <220>
<221> тоД1ЫеД_Ьазе <222> (445)..(446) <223> а, с, к, д, неизвестный или другой <220>
<221> тоД1ЫеД_Ьазе <222> (448)..(449)
- 104 032985
<223> а, с, В, д, неизвестный или другой
<220>
<221> тоЭ1£ геЭ_Ьазе
<222> (451) ..(452) 1
<223> а, с, В, д, неизвестный или другой
<220>
<221> тоЭ1£ геЭ_Ьазе
<222> (454) ..(455) 1
<223> а, с, В, д, неизвестный или другой
<400> 39
дадсссаааВ сВВдВдасаа аасВсасаса ВдсссассдВ дсссадсасс ВдаасВссВд 60
дддддассдВ садВсВВссВ сВВсссссса ааасссаадд асасссВсаВ даВсВсссдд 120
ассссВдадд ВсасаВдсдВ ддВддВддас дВдадссасд аадасссВда ддВсаадВВс 180
аасВддВасд ВддасддсдВ ддаддВдсаВ ааВдссаада сааадссдсд ддаддадсад 240
Васаасадса сдВассдВдВ ддВсадсдВс сВсассдВсс Вдсассадда сВддсВдааВ 300
ддсааддадВ асаадВдсаа ддВсВссаас ааадсссВсс садсссссаВ сдадаааасс 360
аВсВссааад ссааадддса дссссдадад ссасаддВдВ асасссВдсс сссаВсссдд 420
даВдадсВдд дВддВВдВпп кппкппкппк ппкппкВдВд дВддВассаа даассаддВс 480
адссВдассВ дссВддВсаа аддсВВсВаВ сссадсдаса ВсдссдВдда дВдддададс 540
ааВдддсадс сддадаасаа сВасаадасс асдссВсссд ВдсВддасВс сдасддсВсс 600
ВВсВВссВсВ асадсаадсВ сассдВддас аададсаддВ ддсадсаддд даасдВсВВс 660
ВсаВдсВссд ВдаВдсаВда ддсВсВдсас аассасВаса сдсадаадад ссВсВсссВд 720
ВсВссдддВа ааВда 735
<210> 40 <211> 244 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический полипептид <220>
<221> МОБ_КЕВ <222> (147)..(152) <223> Любая аминокислота <400> 40
С1и Рго Ьуз Вег Суз Азр Ьуз ТИг Н1з ТИг Суз Рго Рго Суз Рго А1а
5 10 15
Рго С1и Ьеи Ьеи С1у С1у Рго
Вег Уа1 РИе Ьеи РИе Рго Рго Ьуз Рго
- 105 032985
Ьуз Азр ТЬг 35 Ьеи Меб 11е Бег Агд 40 ТЬг Рго С1и Уа1 ТЬг 45 Суз Уа1 Уа1
Уа1 Азр Уа1 Бег Н1з С1и Азр Рго С1и Уа1 Ьуз РЬе Азп Тгр Туг Уа1
50 55 60
Азр С1у Уа1 С1и Уа1 Н1з Азп А1а Ьуз ТЬг Ьуз Рго Агд С1и С1и С1п
65 70 75 80
Туг Азп Бег ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Бег Уа1 Ьеи ТЬг Уа1 Ьеи Н1з С1п
85 90 95
Азр Тгр Ьеи Азп С1у Ьуз С1и Туг Ьуз Суз Ьуз Уа1 Бег Азп Ьуз А1а
100 105 110
Ьеи Рго А1а Рго 11е С1и Ьуз ТЬг 11е Бег Ьуз А1а Ьуз С1у С1п Рго
115 120 125
Агд С1и Рго С1п Уа1 Туг ТЬг Ьеи Рго Рго Бег Агд Азр С1и Ьеи С1у
130 135 140
С1у Суз Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Суз С1у С1у ТЬг Ьуз Азп С1п Уа1
145 150 155 160
Бег Ьеи ТЬг Суз Ьеи Уа1 Ьуз С1у РЬе Туг Рго Бег Азр 11е А1а Уа1
165 170 175
С1и Тгр С1и Бег Азп С1у С1п Рго С1и Азп Азп Туг Ьуз ТЬг ТЬг Рго
180 185 190
Рго Уа1 Ьеи Азр Бег Азр С1у Бег РЬе РЬе Ьеи Туг Бег Ьуз Ьеи ТЬг
195 200 205
Уа1 Азр Ьуз Бег Агд Тгр С1п С1п С1у Азп Уа1 РЬе Бег Суз Бег Уа1
210 215 220
Меб Н1з С1и А1а Ьеи Н1з Азп Н1з Туг ТЬг С1п Ьуз Бег Ьеи Бег Ьеи
225 230 235 240
Бег Рго С1у Ьуз <210> 41 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 106 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 41
С1у С1у Суз Н1з Ьеи Рго РЪе А1а Уа1 Суз С1у С1у
5 10 <210> 42 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 42
С1у С1у Суз Тгр Рго Ьеи С1п Азр Туг Суз С1у С1у
5 10 <210> 43 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 43
С1у С1у Суз С1у Н1з С1и Туг МеЕ Тгр Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 44 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 44
С1у С1у Суз Уа1 РЪе Азп МеЕ РЪе Азп Суз С1у С1у
5 10 <210> 45 <211> 12 <212> БЕЛОК
- 107 032985 <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 45
С1у С1у Суз А1а Ьеи Туг Рго ТИг Азп Суз С1у С1у
5 10 <210> 46 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 46
С1у С1у Суз МеВ С1п Уа1 Тгр С1у Бег Суз С1у С1у
5 10 <210> 47 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 47
С1у С1у Суз С1п Ьуз С1у Тгр Уа1 РИе Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 48 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 48
С1у С1у Суз МеВ Уа1 Рго РИе Бег МеВ Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 49 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 108 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 49
С1у С1у Суз Уа1 Азп ТЪг Тгр Тгр Бег Суз С1у С1у
5 10 <210> 50 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 50
С1у С1у Суз 11е С1у Рго РЪе Тгр Тгр Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 51 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 51
С1у С1у Суз Азр Агд Рго Уа1 Тгр РЪе Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 52 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 52
С1у С1у Суз Азп МеЕ Ьеи Тгр С1у Бег Суз С1у С1у
5 10 <210> 53 <211> 12 <212> БЕЛОК
- 109 032985 <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 53
С1у С1у Суз Туг 11е ТИг С1п Ьуз Ьеи Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 54 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной пептид последовательности:
синтетический <400> 54
Н1з Ьеи Рго РИе А1а Уа1 <210> 55 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной пептид последовательности:
синтетический <400> 55
Тгр Рго Ьеи С1п Азр Туг
5 <210> 56 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной пептид последовательности:
синтетический <400> 56
С1у Н1з С1и Туг МеВ Тгр
5 <210> 57 <211> 6 <212> БЕЛОК
- 110 032985 <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 57
Уа1 РЪе Азп Мек РЪе Азп <210> 58 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной пептид последовательности:
синтетический <400> 58
А1а Ьеи Туг Рго ТЪг Азп
5 <210> 59 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной пептид последовательности:
синтетический <400> 59
Мек С1п Уа1 Тгр С1у Бег
5 <210> 60 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной пептид последовательности:
синтетический <400> 60
С1п Ьуз С1у Тгр Уа1 РЪе
5 <210> 61 <211> 6
- 111 032985 синтетический <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 61
Меб Уа1 Рго РИе Бег Меб
5 <210> 62 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной пептид последовательности:
синтетический <400> 62
Уа1 Азп ТИг Тгр Тгр Бег
5 <210> 63 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной пептид последовательности:
синтетический <400> 63
11е С1у Рго РИе Тгр Тгр
5 <210> 64 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной пептид последовательности:
синтетический <400> 64
Азр Агд Рго Уа1 Тгр РИе
5 <210> 65
- 112 032985 синтетический <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 65
Азп Меб Ьеи Тгр С1у Бег
5 <210> 66 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной пептид последовательности:
синтетический <400> 66
Туг 11е ТИг С1п Ьуз Ьеи
5 <210> 67 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 67
С1у С1у Суз С1у Меб Рго 11е С1и РИе Суз С1у С1у
5 10 <210> 68 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 68 дсбдбддадб дддадддбдд ббдбддбабд ссдабсдааб бсбдбддбдд бадсаабддд 60 садссд 66
- 113 032985 <210> 69 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 69 сддсБдссса ББдсБассас сасадааББс даБсддсаБа ссасаассас ссБсссасБс 60 сасадс <210> 70 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 70 дБддадБддд ададсддБдд ББдБддБаБд ссдаБсдааБ БсБдБддБдд БааБдддсад 60 ссддад <210> 71 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 71 сБссддсБдс ссаББассас сасадааББс даБсддсаБа ссасаассас сдсБсБссса 60 сБссас <210> 72 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 72
- 114 032985 кдддададса акдддддкдд ккдкддкакд ссдаксдаак кскдкддкдд ксадссддад 60 аасаас <210> 73 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид рг1тег <400> 73 дккдкксксс ддскдассас сасадааккс даксддсака ссасаассас ссссаккдск 60 скссса 66 <210> 74 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 74 дададсаакд ддсадддкдд ккдкддкакд ссдаксдаак кскдкддкдд кссддадаас 60 ааскас <210> 75 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 75 дкадккдккс кссддассас сасадааккс даксддсака ссасаассас сскдсссакк 60 дскскс 66 <210> 76 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический ппраймер
- 115 032985 <400> 76 адсааВдддс адссдддВдд ВВдВддВаВд ссдаВсдааВ ВсВдВддВдд Вдадаасаас 60
Васаад <210> 77 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 77 сВВдВадВВд ВВсВсассас сасадааВВс даВсддсаВа ссасаассас ссддсВдссс 60 аВВдсВ 66 <210> 78 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 78 ааВдддсадс сддадддВдд ВВдВддВаВд ссдаВсдааВ ВсВдВддВдд ВаасаасВас 60 аадасс 66 <210> 79 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 79 ддВсВВдВад ВВдВВассас сасадааВВс даВсддсаВа ссасаассас ссВссддсВд 60 сссаВВ 66 <210> 80 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
- 116 032985 <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 80 дддсадссдд адаасддбдд ббдбддбабд ссдабсдааб бсбдбддбдд баасбасаад 60 ассасд <210> 81 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 81 сдбддбсббд бадббассас сасадааббс дабсддсаба ссасаассас сдббсбссдд 60 сбдссс 66 <210> 82 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 82 садссддада асаасддбдд ббдбддбабд ссдабсдааб бсбдбддбдд ббасаадасс 60 асдссб 66 <210> 83 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 83 аддсдбддбс ббдбаассас сасадааббс дабсддсаба ссасаассас сдббдббсбс 60 сддсбд 66 <210> 84 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 117 032985 <221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 84 дВддадВддд ададсддВдд ВВдВддВаВд ссдаВсдааВ ВсВдВддВдд Вссддадаас 60 аасВас <210> 85 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 85 дВадВВдВВс Вссддассас сасадааВВс даВсддсаВа ссасаассас сдсВсВссса 60 сВссас 66 <210> 86 <211> 72 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 86 дВддадВддд ададсддВдд ВддВВдВддВ аВдссдаВсд ааВВсВдВдд ВддВддВссд 60 дадаасаасВ ас <210> 87 <211> 72 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 87 дВадВВдВВс Вссддассас сассасадаа ВВсдаВсддс аВассасаас сассассдсВ 60 сВсссасВсс ас 72 <210> 88 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 118 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (4)..(11) <223> /замена=РЬе или Азп или Агд или Бег или ТАг или Меб или 11е или С1и или Азр или С1у ог
А1а или Уа1 или С1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (4)..(11) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 88
С1у С1у Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз С1у С1у
5 10 <210> 89 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (4)..(13) <223> /замена=РЬе или Азп или Агд или Бег или ТЬг или Меб или 11е или С1и или Азр или С1у ог
А1а или Уа1 или С1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (4)..(13) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 89
С1у С1у Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз С1у С1у
5 10 15 <210> 90 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 119 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 90
С1у С1у Суз Н1з РЪе Азр 11е МеЕ Азп Суз С1у С1у
5 10 <210> 91 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 91
С1у С1у Суз Уа1 11е Азр РЪе РЪе С1у Суз С1у С1у
5 10 <210> 92 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 92
С1у С1у Суз Азр 11е МеЕ 11е РЪе С1и Суз С1у С1у
5 10 <210> 93 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический синтетический синтетический синтетический <210> 94 <211> 12 <212> БЕЛОК <400> 93
С1у С1у Суз МеЕ ТЪг С1и РЪе А1а 11е Суз С1у С1у
5 10
- 120 032985 синтетический <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 94
С1у С1у Суз 11е С1п Туг Тгр С1п РИе Суз С1у С1у
5 10 <210> 95 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 95
С1у С1у Суз Рго РИе Бег Тгр А1а РИе Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 96 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 96
С1у С1у Суз С1у
РИе А1а РИе Меб
Туг Суз С1у С1у синтетический синтетический <210> 97 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <210> 98 <211> 12 синтетический <400> 97
С1у С1у Суз Рго Уа1 Ьеи Ьеи РИе Азп Суз С1у С1у
5 10
- 121 032985 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 98
С1у С1у Суз Рго РЪе ТЪг Тгр ТЪг Ьуз Суз С1у С1у
5 10 <210> 99 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 99
С1у С1у Суз Туг Ьеи Туг Тгр С1п РЪе Суз С1у С1у
5 10 <210> 100 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический синтетический <400> 100
С1у С1у Суз Уа1 11е Азп МеБ РЪе Рго Суз С1у С1у
5 10 <210> 101 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <210> 102 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 101
С1у С1у Суз Рго РЪе ТЪг Тгр Азп ТЪг Суз С1у С1у
5 10
- 122 032985 синтетический <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 102
С1у С1у Суз Рго
РИе С1п 11е С1у
С1и Суз С1у С1у <210> 103 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 103
С1у С1у Суз Беи Азр 11е 11е Тгр МеВ Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 104 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 104
С1у С1у Суз МеВ РИе Уа1 РИе Рго А1а Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 105 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический <400> 105
С1у С1у Суз Уа1 МеВ С1и С1п Беи Тгр Суз С1у С1у
5 10
- 123 032985 синтетический <210> 106 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 106
С1у С1у Суз РИе
Буз С1и Туг ТИг
Тгр Суз С1у С1у <210> 107 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 107
С1у С1у Суз Рго Буз Азр Туг Н1з 11е Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 108 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 108
С1у С1у Суз С1и Уа1 МеВ Уа1 РИе Рго Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 109 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический <400> 109
С1у С1у Суз Уа1 РИе Азп ТИг Уа1 РИе Суз С1у С1у
5 10
- 124 032985 синтетический <210> 110 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 110
С1у С1у Суз Азп Беи Рго С1п С1и Тгр Суз С1у С1у
5 10 <210> 111 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 111
С1у С1у Суз Меб 11е
5
А1а Рго Меб Туг Суз С1у С1у <210> 112 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 112
С1у С1у Суз Меб Меб
5
Беи Туг Рго Меб Суз С1у С1у <210> 113 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический <400> 113
С1у С1у Суз 11е 11е С1у Рго РИе Беи Суз С1у С1у
5 10
- 125 032985 синтетический <210> 114 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 114
С1у С1у Суз ТЪг С1у Мек Уа1 РЪе РЪе Суз С1у С1у
5 10 <210> 115 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 115
С1у С1у Суз Беи Мек Туг Буз Азп Уа1 Суз С1у С1у
5 10 <210> 116 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 116
С1у С1у Суз А1а
РЪе С1у 11е Мек
Тгр Суз С1у С1у <210> 117 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 117
С1у С1у Суз Агд Н1з Агд Буз Буз Тгр Суз С1у С1у синтетический
- 126 032985 синтетический <210> 118 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 118
С1у С1у Суз РИе Меб С1у 11е Тгр С1п Суз С1у С1у
5 10 <210> 119 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 119
С1у С1у Суз Рго Бег Ьеи Рго С1п РИе Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 120 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 120
С1у С1у Суз Рго Бег Уа1 РИе ТИг Тгр Суз С1у С1у
5 10 <210> 121 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 121 синтетический
- 127 032985
С1у С1у Суз С1п С1и Туг Тгр С1и РЪе Суз С1у С1у
5 10 <210> 122 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 122
С1у С1у Суз С1п
Тгр Рго ТЪг С1и
РЪе Суз С1у С1у <210> 123 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 123
С1у С1у Суз 11е Ьуз РЪе РЪе Азр Тгр Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 124 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 124
С1у С1у Суз С1и МеЕ Бег РЪе РЪе Ьеи Суз С1у С1у
5 10 <210> 125 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
- 128 032985 <400> 125
С1у С1у Суз Н1з Бег С1и Уа1 С1и Туг Суз С1у С1у
5 10 <210> 126 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 126
С1у С1у Суз Тгр С1и Н1з Рго Н1з Туг Суз С1у С1у
5 10 <210> 127 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 127
С1у С1у Суз С1и ТЪг Туг Тгр Ьеи РЪе Суз С1у С1у
5 10 <210> 128 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 128
С1у С1у Суз Агд Уа1 Рго Туг Рго Бег Суз С1у С1у
5 10 <210> 129 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
- 129 032985 <400> 129
С1у С1у Суз С1у Тгр Рго РЪе Уа1 МеБ Суз С1у С1у
5 10 <210> 130 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 130
С1у С1у Суз МеБ Ьеи РЪе Ьеи С1и Вег Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 131 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 131
С1у С1у Суз РЪе НБз Уа1 Ьуз Агд Тгр Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 132 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 132
С1у С1у Суз Уа1 Тгр С1и С1п С1и НБз Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 133 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
- 130 032985 <400> 133
С1у С1у Суз 11е Ьеи Н1з РИе Ьуз Азр Суз С1у
5 10 <210> 134 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 134
С1у С1у Суз Н1з РИе С1и Уа1 РИе С1п Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 135 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 135
С1у С1у Суз Уа1 РИе С1и Уа1 МеВ С1п Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 136 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 136
С1у С1у Суз МеВ ТИг С1и РИе Бег Тгр Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 137 <220>
<221> источник <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 131 032985 <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 137
С1у С1у Суз С1и С1у Азп МеВ Агд РИе Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 138 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 138
С1у С1у Суз Ьуз С1у Н1з МеВ Тгр Туг Суз С1у С1у
5 10 <210> 139 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 139
С1у С1у Суз С1и А1а Туг Тгр С1п РИе Суз С1у С1у
5 10 <210> 140 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 140
С1у С1у Суз Уа1 РИе Вег Агд РИе Тгр Суз С1у С1у
5 10 <210> 141 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
- 132 032985 <221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 141
С1у С1у Суз Меб Меб Рго РИе Тгр Рго Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 142 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 142
С1у С1у Суз 11е РИе С1п РИе С1и Меб Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 143 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 143
С1у С1у Суз Ьуз Агд С1п Меб Тгр Туг Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 144 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 144
С1у С1у Суз Ьуз ТИг Рго Азп Рго Тгр Суз С1у С1у
5 10 <210> 145 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 133 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 145
С1у С1у Суз Ьуз А1а РАе Туг Рго Тгр Суз С1у С1у
5 10 <210> 146 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 146
С1у С1у Суз Ьуз Меб Туг С1п Туг Азр Суз С1у С1у
5 10 <210> 147 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 147
С1у С1у Суз Туг Рго Азр Азп Меб РАе Суз С1у С1у
5 10 <210> 148 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
Уа1 Ьуз 11е РАе
Тгр Суз С1у С1у <210> 149 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <400> 148
С1у С1у Суз С1п
- 134 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 149
С1у С1у Суз Бег 11е
5
Рго С1п С1и Тгр Суз С1у С1у 10 <210> 150 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 150
С1у С1у Суз Ьуз Меб Туг С1п А1а ТИг Суз С1у С1у
5 10 <210> 151 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 151
С1у С1у Суз С1п Туг С1и Агд Тгр Н1з Суз С1у С1у
5 10 <210> 152 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <210> 153 <211> 12 <212> БЕЛОК <400> 152
С1у С1у Суз Агд РИе С1п Н1з С1п Тгр Суз С1у С1у
5 10
- 135 032985 синтетический <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 153
С1у С1у Суз С1п Азп МеЕ РЪе Тгр С1п Суз С1у С1у
5 10 <210> 154 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 154
С1у С1у Суз Уа1 МеЕ С1и 11е Уа1 РЪе Суз С1у С1у
5 10 <210> 155 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 155
С1у С1у Суз 11е Ьеи Азп РЪе
5
Азп МеЕ Суз С1у С1у <210> 156 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <210> 157 <211> 12 синтетический <400> 156
С1у С1у Суз МеЕ Н1з МеЕ Азр Туг РЪе Суз С1у С1у
5 10
- 136 032985 синтетический <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 157
О1у О1у Суз О1п Уа1 Меб Уа1 Ьеи Рго Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 158 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 158
О1у О1у Суз Ьеи РИе Азр Тгр Рго Бег Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 159 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 159
О1у О1у Суз Ьуз Меб Туг Н1з О1п ТИг Суз О1у О1у
5 10 <210> 160 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <210> 161 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический <400> 160
О1у О1у Суз О1п Тгр Ьеи Туг О1и Бег Суз О1у О1у
5 10
- 137 032985 синтетический <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 161
С1у С1у Суз РИе ТИг Азп РИе Тгр Ьеи Суз С1у С1у
5 10 <210> 162 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 162
С1у С1у Суз Тгр
С1и Рго ТИг Н1з
Тгр Суз С1у С1у <210> 163 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 163
С1у С1у Суз А1а РИе А1а МеВ Ьеи С1п Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 164 <211> 13 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический <400> 164
С1у С1у Суз МеВ Туг С1п Агд С1п А1а Тгр Суз С1у С1у
5 10
- 138 032985 синтетический <210> 165 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 165
С1у С1у Суз Рго РЪе Ьеи Тгр А1а С1и Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 166 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 166
С1у С1у Суз Мек РЪе Азр Н1з Ьуз Уа1 Суз С1у С1у
5 10 <210> 167 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 167
С1у С1у Суз Мек С1и 11е РЪе Азп РЪе Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 168 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический <400> 168
С1у С1у Суз Уа1 Мек С1и Агд Ьеи Тгр Суз С1у С1у
5 10
- 139 032985 синтетический <210> 169 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 169
С1у С1у Суз С1и Туг Туг Тгр С1п РАе Суз С1у С1у
5 10 <210> 170 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 170
С1у С1у Суз Рго РАе Бег Тгр Азр С1п Суз С1у С1у
5 10 <210> 171 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 171
С1у С1у Суз 11е С1и Туг РАе Бег Тгр Суз С1у С1у
5 10 <210> 172 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический <400> 172
С1у С1у Суз Уа1 РАе С1и 11е Меб Ьуз Суз С1у С1у
5 10
- 140 032985 синтетический <210> 173 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 173
О1у О1у Суз О1и Бег Рго О1п Туг РЪе Суз О1у О1у
5 10 <210> 174 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид <400> 174
О1у О1у Суз Н1з Н1з Азр РЪе О1и Тгр Суз О1у О1у
5 10 синтетический <210> 175 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид <400> 175
О1у О1у Суз Ме: РЪе Рго РЪе Бег Тгр Суз О1у О1у
5 10 синтетический <210> 176 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 176
О1у О1у Суз Азп ТЪг Уа1 Ьеи О1п С1и Суз О1у О1у синтетический
- 141 032985 синтетический <210> 177 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 177
С1у С1у Суз Уа1 РЪе Азр 11е МеБ Беи Суз С1у С1у
5 10 <210> 178 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 178
С1у С1у Суз МеБ
Туг С1п С1п Рго
Тгр Суз С1у С1у <210> 179 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 179
С1у С1у Суз Буз Буз Беи Туг НБз Туг Суз С1у С1у
5 10 <210> 180 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <400> 180 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический
- 142 032985
С1у С1у Суз Рго Н1з Тгр Рго РИе С1и Суз С1у С1у
5 10 <210> 181 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 181
С1у С1у Суз Рго 11е РИе Рго Меб 11е Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 182 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 182
С1у С1у Суз Меб Бег Ьуз Азр Ьеи Тгр Суз С1у С1у
5 10 <210> 183 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 183
С1у С1у Суз Меб РИе С1п Меб С1у Уа1 Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 184 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
- 143 032985 <400> 184
О1у О1у Суз Туг О1и Тгр Рго Бег Туг Суз О1у О1у
5 10 <210> 185 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 185
О1у О1у Суз О1п МеЕ Ьеи Туг МеЕ Азр Суз О1у О1у
5 10 <210> 186 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 186
О1у О1у Суз ТЪг Уа1 О1п Уа1 РЪе РЪе Суз О1у О1у
5 10 синтетический <210> 187 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 187
О1у О1у Суз 11е ТЪг РЪе Рго МеЕ МеЕ Суз О1у О1у
5 10 синтетический <210> 188 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
- 144 032985 <400> 188
С1у С1у Суз Уа1 МеВ Туг Тгр С1и Туг Суз С1у С1у
5 10 <210> 189 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 189
С1у С1у Суз МеВ Тгр С1и Уа1 Ьеи Н1з Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 190 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 190
С1у С1у Суз МеВ С1п С1и Агд Бег Тгр Суз С1у С1у
5 10 <210> 191 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический синтетический <400> 191
С1у С1у Суз Уа1 РИе С1и ТИг 11е С1п Суз С1у С1у
5 10 <210> 192 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
- 145 032985 <400> 192
О1у О1у Суз О1п Тгр А1а Азп Бег Туг Суз О1у О1у
5 10 <210> 193 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 193
О1у О1у Суз Ьуз
РИе О1у О1п Тгр
Туг Суз О1у О1у <210> 194 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 194
О1у О1у Суз Уа1 РИе Азр О1п Меб Тгр Суз О1у О1у
5 10 <210> 195 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 195
О1у О1у Суз О1и Уа1 Меб
5
11е РИе Азп Суз О1у О1у <210> 196 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
- 146 032985 <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 196
С1у С1у Суз С1и Вег Рго МеВ РИе Уа1 Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 197 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 197
С1у С1у Суз 11е ТИг МеВ РИе С1п Азп Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 198 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 198
С1у С1у Суз Уа1 РИе С1и Агд МеВ РИе Суз С1у С1у
5 10 <210> 199 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 199
С1у С1у Суз С1у РИе С1и 11е РИе МеВ Суз С1у
1 5 10
<210> 200 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
- 147 032985 <221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 200
С1у С1у Суз Ьеи Ьеи С1п РАе ТАг С1у Суз С1у С1у
5 10 <210> 201 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 201
С1у С1у Суз Н1з РАе С1п 11е РАе С1п Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 202 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 202
С1у С1у Суз Рго
РАе Азр Тгр Азр
Ьуз Суз С1у С1у <210> 203 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 203
С1у С1у Суз Уа1 ТАг Рго Ьеи Рго РАе Суз С1у
1 5 10
<210> 204 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 148 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 204
О1у О1у Суз Туг МеБ Туг МеБ Азр Туг Суз О1у О1у
5 10 <210> 205 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 205
О1у О1у Суз МеБ РЪе О1и Тгр Туг Уа1 Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 206 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 206
О1у О1у Суз Рго
РЪе ТЪг Тгр Агд
11е Суз О1у О1у <210> 207 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 207
О1у О1у Суз О1и Азп Азр Тгр Ьуз МеБ Суз О1у О1у
5 10 <210> 208 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 149 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 208
О1у О1у Суз А1а РЪе О1и РЪе
5
11е Туг Суз О1у О1у <210> 209 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 209
О1у О1у Суз Рго Уа1 А1а Уа1 РЪе Мек Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 210 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 210
О1у О1у Суз Н1з РЪе Азр 11е РЪе Азр Суз О1у О1у
5 10 <210> 211 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <210> 212 <211> 12 <212> БЕЛОК <400> 211
О1у О1у Суз Рго Рго О1и Азп Мек РЪе Суз О1у О1у
5 10
- 150 032985 синтетический <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 212
С1у С1у Суз Рго
РИе С1п Меб С1у
С1и Суз С1у С1у <210> 213 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 213
С1у С1у Суз 11е Бег С1у РИе РИе Тгр Суз С1у С1у
5 10 <210> 214 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 214
С1у С1у Суз Рго РИе Н1з РИе С1п Уа1 Суз С1у С1у
5 10 <210> 215 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <210> 216 <211> 11 синтетический <400> 215
С1у С1у Суз Меб РИе С1п 11е 11е Азп Суз С1у С1у
5 10
- 151 032985 синтетический <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 216
О1у О1у Суз О1п Туг РЪе Ьеи Рго Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 217 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 217
О1у О1у Суз Н1з РЪе А1а Уа1 Ьеи Азр Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 218 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 218
О1у О1у Суз Тгр Азп Уа1 МеЕ О1у Ьеи Суз О1у О1у
5 10 <210> 219 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <210> 220 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический <400> 219
О1у О1у Суз Туг ТЪг ТЪг Н1з О1и Ьеи Суз О1у О1у
5 10
- 152 032985 синтетический <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 220
С1у С1у Суз Ьеи Туг Ьуз С1п Уа1 Азр Суз С1у С1у
5 10 <210> 221 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 221
С1у С1у Суз Уа1 РИе Бег А1а Ьеи Тгр Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 222 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 222
С1у С1у Суз Рго РИе С1п РИе С1п ТИг Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 223 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический <400> 223
С1у С1у Суз А1а РИе Ьеи МеВ МеВ Азр Суз С1у С1у
5 10
- 153 032985 синтетический <210> 224 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 224
С1у С1у Суз С1и
Уа1 Тгр Туг С1и
РИе Суз С1у С1у <210> 225 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 225
С1у С1у Суз А1а
РИе Азр 11е С1у
Уа1 Суз С1у С1у <210> 226 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 226
С1у С1у Суз Ьеи Вег Рго Ьеи МеВ Тгр Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 227 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический <400> 227
С1у С1у Суз Рго РИе Вег Тгр Уа1 11е Суз С1у С1у
5 10
- 154 032985 синтетический <210> 228 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 228
О1у О1у Суз Меб Ьеи Меб РИе О1п О1у Суз О1у О1у
5 10 <210> 229 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 229
О1у О1у Суз О1п Рго Азп Н1з Тгр Ьеи Суз О1у О1у
5 10 <210> 230 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 230
О1у О1у Суз 11е Азр ТИг Туг Уа1 Тгр Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 231 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический <400> 231
О1у О1у Суз Н1з РИе Н1з Ьеи Меб РИе Суз О1у О1у
5 10
- 155 032985 синтетический <210> 232 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 232
С1у С1у Суз С1п Меб 11е РАе Бег ТАг Суз С1у С1у
5 10 <210> 233 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 233
С1у С1у Суз Ьуз Меб Туг С1п Рго Азр Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 234 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 234
С1у С1у Суз Меб Тгр С1у Уа1 РАе Ьуз Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 235 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 235
С1у С1у Суз С1у Ьеи РАе С1у С1п Бег Суз С1у С1у синтетический
- 156 032985 синтетический <210> 236 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 236
О1у О1у Суз О1п РЪе Азп РЪе Рго Тгр Суз О1у О1у
5 10 <210> 237 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 237
О1у О1у Суз Азп 11е А1а Туг Рго Тгр Суз О1у О1у
5 10 синтетический <210> 238 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 238
О1у О1у Суз Ьуз ТЪг 11е Рго 11е РЪе Суз О1у О1у
5 10 <400> 239 <210> 239 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический
- 157 032985
О1у О1у Суз О1п МеБ О1и Ьеи РЪе Ьеи Суз О1у О1у
5 10 <210> 240 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 240
О1у О1у Суз Ьеи
О1у А1а РЪе Туг
Тгр Суз О1у О1у <210> 241 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 241
О1у О1у Суз Рго РЪе
5
Азп РЪе А1а Вег Суз О1у О1у <210> 242 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 242
О1у О1у Суз О1п РЪе Азр 11е Ьеи Тгр Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 243 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
- 158 032985 <400> 243
О1у О1у Суз Туг Туг ТЪг Н1з О1и Ьеи Суз О1у О1у
5 10 <210> 244 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 244
О1у О1у Суз О1п О1п Агд Тгр Агд Туг Суз О1у О1у
5 10 <210> 245 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид <400> 245
О1у О1у Суз Ьеи Тгр Уа1 Азр О1и Туг Суз О1у О1у
5 10 синтетический <210> 246 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 246
О1у О1у Суз О1у Мек Ьеи О1у Тгр РЪе Суз О1у О1у
5 10 <210> 247 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический синтетический
- 159 032985 <400> 247
С1у С1у Суз Тгр С1и С1п Н1з Туг Ьеи Суз С1у С1у
5 10 <210> 248 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 248
С1у С1у Суз Ьуз ТИг Тгр С1п Ьеи Ьеи 11е РИе Суз С1у С1у
5 10 <210> 249 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 249
С1у С1у Суз С1и С1п Азп Тгр ТИг Ьеи Туг МеВ Суз С1у С1у
5 10 <210> 250 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 250
Бег С1у Суз Тгр Рго Бег Рго
5
Туг 11е РИе Рго Суз С1у С1у <210> 251 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
- 160 032985 <400> 251
О1у О1у Суз Тгр О1и А1а Ьеи О1п Уа1 Азп Азп Суз О1у О1у
5 10 <210> 252 <211> 13 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 252
Суз О1у Суз О1п А1а МеЬ Уа1 Уа1 О1и Азр Ьеи Суз О1у
1 5 10
<210> 253 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 253
О1у О1у Суз Рго Ьеи О1и Тгр Рго Агд 11е Бег Суз О1у О1у 1 5 10 <210> 254 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 254
О1у О1у Суз О1и Рго Тгр 11е МеЬ О1и А1а Азп Суз О1у О1у
5 10 <210> 255 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
- 161 032985 <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 255
С1у С1у Суз Рго Тгр Азр С1п Н1з 11е Азп РИе Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 256 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 256
С1у С1у Суз Рго Тгр Туг 11е С1п Меб Азр Н1з Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 257 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 257
Бег С1у Суз С1п Рго Тгр С1и 11е Бег Туг Туг Суз С1у С1у 1 5 10 <210> 258 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 258
С1у С1у Суз Рго Уа1 Меб РИе Ьеи Азр Рго Агд Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 259 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
- 162 032985 <221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 259
С1у С1у Суз Вег Вег Азр Уа1 Ьеи МеВ 11е РИе Суз С1у С1у
5 10 <210> 260 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 260
С1у С1у Суз Уа1 Азр С1и МеВ Уа1 11е Туг Н1з Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 261 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 261
С1у С1у Суз Рго РИе МеВ Уа1 Азп Ьеи Туг Вег Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 262 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 262
С1у С1у Суз С1и Вег Азр ТИг МеВ Тгр Туг РИе Суз С1у С1у
5 10 <210> 263 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 163 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 263
О1у О1у Суз Агд Бег Азр О1и 11е 11е РЪе РЪе Суз О1у О1у
5 10 <210> 264 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 264
О1у О1у Суз Рго Тгр Азр Ьеи Ьеи Ьеи Рго Ьеи Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 265 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 265
О1у О1у Суз Рго Тгр А1а МеЕ О1и Ьеи Уа1 Н1з Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 266 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 266
Бег О1у Суз ТЪг А1а Бег МеЕ
5
Туг Тгр О1и Туг Суз О1у О1у <210> 267 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 164 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 267
С1у С1у Суз С1у Ьеи Туг Меб Азр Рго Рго Туг Туг С1у С1у
5 10 синтетический <210> 268 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 268
С1у С1у Суз Рго Уа1 Меб Уа1 Меб С1и Рго Туг Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 269 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 269
С1у С1у Суз С1п ТАг С1и РАе 11е Ьеи С1и РАе Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 270 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 270
Бег С1у Суз А1а РАе С1п А1а Н1з С1у А1а Меб Суз С1у С1у
5 10 <210> 271 <211> 14 <212> БЕЛОК
- 165 032985 синтетический <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 271
О1у О1у Суз Рго Азр РЪе МеЕ РЪе Агд МеЕ Азп Суз О1у О1у
5 10 <210> 272 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 272
Бег О1у Суз Бег Уа1 Тгр РЪе Азр ТЪг 11е Бег Суз О1у О1у
5 10 синтетический <210> 273 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 273
О1у О1у Суз Рго Тгр Бег МеЕ О1и 11е Бег Азп Суз О1у О1у
5 10 синтетический <210> 274 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 274
О1у О1у Суз Рго ТЪг Тгр Азп Тгр О1и 11е ТЪг Суз О1у О1у
5 10 <210> 275 <211> 14 синтетический
- 166 032985 синтетический <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 275
Бег О1у Суз Рго Тгр Азр Меб Н1з 11е Уа1 Азр Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 276 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 276
Бег О1у Суз РИе Рго Тгр О1и Рго А1а Туг РИе Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 277 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 277
О1у О1у Суз Рго РИе О1у Тгр Азп Уа1 РИе Н1з Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 278 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <210> 279 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический <400> 278
О1у О1у Суз Рго Тгр Н1з Меб О1и Уа1 Азп О1и Суз О1у О1у
5 10
- 167 032985 синтетический <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 279
О1у О1у Суз Рго РЪе А1а Ьеи О1у МеБ О1у О1и Суз О1у О1у
5 10 <210> 280 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 280
О1у О1у Суз МеБ РЪе Рго РЪе МеБ Ьеи Вег Азп Суз О1у О1у
5 10 синтетический <210> 281 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 281
О1у О1у Суз А1а РЪе О1п РЪе МеБ Рго А1а НБз Суз О1у О1у
5 10 синтетический <210> 282 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 282
О1у О1у Суз О1п 11е О1п О1у РЪе О1и РЪе ТЪг Суз О1у О1у
5 10 синтетический
- 168 032985 синтетический <210> 283 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 283
С1у С1у Суз Рго МеВ С1у 11е 11е Ьеи Азр Ьеи Суз С1у С1у
5 10 <210> 284 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 284
С1у С1у Суз Ьеи МеВ Ьеи С1и Рго ТИг Уа1 ТИг Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 285 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 285
С1у С1у Суз С1у Ьуз Азп С1и Уа1 А1а МеВ РИе Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 286 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический <400> 286
С1у С1у Суз Бег РИе Ьеи Ьеи С1и 11е А1а Азп Суз С1у С1у
5 10
- 169 032985 синтетический <210> 287 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 287
О1у О1у Суз Азр Уа1 О1и Ьуз
5
11е Мек 11е РЪе Суз О1у О1у <210> 288 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 288
О1у О1у Суз РЪе Рго Мек ТЪг Рго Тгр О1у Ьеи Суз О1у О1у
5 10 <210> 289 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 289
Бег О1у Суз Азр Тгр Туг Ьеи О1и Тгр Бег О1у Азп Суз О1у О1у
1 5 10 15
<210> 290 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический <400> 290
О1у О1у Суз О1у Уа1 О1и 11е Мек РЪе Н1з О1у Суз О1у О1у
5 10
- 170 032985 синтетический <210> 291 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 291
С1у С1у Суз Меб Азр С1у Беи Н1з Беи Туг РИе Суз С1у С1у
5 10 <210> 292 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 292
Бег С1у Суз Рго 11е РИе 11е РИе Азр Туг Туг Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 293 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 293
С1у С1у Суз А1а Уа1 Тгр 11е РИе Бег Азр А1а Суз С1у С1у
5 10 <400> 294
С1у С1у Суз Рго Тгр Бег Беи Н1з 11е С1п С1п Суз С1у С1у <210> 294 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический
- 171 032985 синтетический <210> 295 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 295
Вег С1у Суз А1а РИе Вег МеВ Ьеи РИе 11е Азп Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 296 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 296
Вег С1у Суз Ьеи Рго Тгр С1и Ьеи Туг МеВ РИе Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 297 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 297
Вег С1у Суз Рго РИе
5
ТИг 11е Азп РИе Туг ТИг Суз С1у С1у <210> 298 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <400> 298 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический
- 172 032985
С1у С1у Суз Рго 11е Тгр РАе ТАг Тгр Бег ТАг Суз С1у С1у
5 10 <210> 299 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 299
С1у С1у Суз С1п 11е С1п Уа1 Уа1 Азп Рго Туг Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 300 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 300
С1у С1у Суз А1а РАе С1п 11е С1и РАе Ьеи Меб Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 301 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 301
С1у С1у Суз А1а Тгр С1и 11е Агд 11е Ьеи С1у Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 302 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
- 173 032985 <400> 302
О1у О1у Суз Рго Туг О1п Ьеи Уа1 11е МеЕ Тгр Суз О1у О1у
5 10 <210> 303 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 303
О1у О1у Суз МеЕ РЪе А1а МеЕ Н1з Уа1 РЪе О1у Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 304 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 304
Бег О1у Суз ТЪг Уа1 МеЕ Туг ТЪг Ьеи О1п 11е РЪе О1у О1у
1 5 10
<210> 305 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 305
Бег О1у Суз А1а Н1з О1п Уа1 Туг Тгр А1а РЪе Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 306 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
- 174 032985 <400> 306
О1у О1у Суз Рго Азп РЪе РЪе Азп РЪе Тгр РЪе Суз О1у О1у
5 10 <210> 307 <211> 15 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 307
О1у О1у Суз А1а РЪе О1и РЪе Бег Бег А1а РЪе Азп Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 308 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 308
Бег О1у Суз О1п
ТЪг МеЕ Ьеи ТЪг
А1а О1и О1у О1и
Тгр Суз О1у О1у <210> 309 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 309
О1у О1у Суз Уа1 МеЕ Азр Ьеи Тгр Рго Азр Ьеи О1и 11е Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 310 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
- 175 032985 <400> 310
О1у О1у Суз О1п Рго Ьеи РИе Азр Азр Н1з Азр ТИг Тгр Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 311 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 311
О1у О1у Суз Рго
РИе О1и Ьеи Уа1
Меб Бег Азр О1и
О1п Суз О1у О1у <210> 312 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 312
Бег О1у Суз О1у Н1з О1у Меб О1п Меб Азр Бег Уа1 РИе Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 313 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 313
Бег О1у Суз Азр
О1и ТИг О1п Бег
А1а 11е Тгр Туг
РИе Суз О1у О1у <210> 314 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
- 176 032985 <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 314
О1у О1у Суз Агд О1и Рго О1и О1п Туг Тгр ТЪг Уа1 Тгр Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 315 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 315
Бег О1у Суз О1п О1и Ьуз Ьуз Азр Ьеи Туг Тгр О1и Туг Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 316 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 316
Бег О1у Суз О1у О1п Азр Азп Азр Ьеи Рго Тгр О1и Тгр Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 317 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 317
О1у О1у Суз Уа1 РЪе О1п Ьеи Бег РЪе Бег Агд Бег Азр Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 318 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
- 177 032985 <221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 318
Бег С1у Суз А1а РИе Азр МеВ 11е Тгр РИе С1и С1у Уа1 Суз С1у С1у
5 10 15 <210> 319 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 319
Бег С1у Суз А1а
РИе Туг Тгр С1п
Рго Тгр С1и Н1з
Бег Суз С1у С1у <210> 320 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 320
С1у С1у Суз С1п Ьеи Бег 11е 11е Ьеи ТИг С1у Ьеи Рго Суз С1у С1у
5 10 15 <210> 321 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 321
С1у С1у Суз С1у
МеВ Ьеи С1и Тгр
Бег С1у Ьеи С1п
РИе Суз С1у С1у <210> 322 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 178 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 322
Вег С1у Суз Н1з С1и Ьуз А1а Ьеи ТИг Туг Тгр С1и РИе Суз С1у С1у
5 10 15 <210> 323 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 323
С1у С1у Суз РИе
С1и Азп МеВ С1п
Уа1 Тгр Туг Азп
С1и Суз С1у С1у <210> 324 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 324
С1у С1у Суз Рго С1и Тгр С1и Азп С1п 11е Ьеи Ьеи РИе Суз С1у С1у
5 10 15 <210> 325 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 325
Вег С1у Суз С1и Вег Тгр С1п Агд Азр МеВ Азп Туг РИе Суз С1у С1у
5 10 15 <210> 326 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 179 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 326
Бег С1у Суз Азп Азр С1п РАе Рго Меб Туг Туг Ьеи РАе Суз С1у С1у
1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 327 16 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <221> <223> источник /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид <400> 327
С1у С1у Суз РАе С1и Азр Меб А1а Ьеи С1п Рго ТАг С1п Суз С1у С1у
1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 328 16 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <221> <223> источник /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид <400> 328
Бег С1у Суз Ьуз С1у Рго Тгр С1п РАе С1и РАе Ьеи Уа1 Суз С1у С1у
1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 329 16 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <221> <223> источник /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид <400> 329
С1у С1у Суз С1и А1а РАе Бег Меб Ьуз РАе Азп Азр РАе Суз С1у С1у
1 5 10 15
<210> <211> <212> 330 16 БЕЛОК
- 180 032985
<213> Искусственная последовательность
<220> <221> <223> источник /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид <400> 330
О1у О1у Суз Уа1 О1п Рго А1а 11е А1а МеБ Тгр Рго РЪе Суз О1у О1у
1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 331 16 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <221> <223> источник /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид <400> 331
О1у О1у Суз ТЪг Азр О1п О1у Агд РЪе Уа1 Ьеи Туг О1и Суз О1у О1у
1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 332 16 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <221> <223> источник /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид <400> 332
О1у О1у Суз Рго Уа1 О1п О1и РЪе Ьеи Тгр О1у Уа1 Туг Суз О1у О1у
1 5 10 15
<210> <211> <212> <213> 333 16 БЕЛОК Искусственная последовательность
<220> <221> <223> источник /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид <400> 333
О1у О1у Суз Вег Азп Вег Тгр О1и Тгр ТЪг Ьеи Туг А1а Суз О1у О1у
1 5 10 15
<210> <211> 334 16
- 181 032985 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 334
Бег С1у Суз Н1з С1у Ьеи Уа1 С1и Тгр С1у Туг Меб А1а Суз С1у С1у
5 10 15 <210> 335 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 335
Бег С1у Суз С1и А1а РИе С1у Ьеи 11е РИе С1и Азр РИе Суз С1у С1у
5 10 15 <210> 336 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 336
С1у С1у Суз А1а Азп Рго С1и РИе С1п Меб Тгр Туг РИе Суз С1у С1у
5 10 15 <210> 337 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 337
Бег С1у Суз С1у Туг С1и Уа1 Рго 11е Рго Ьеи РИе ТИг Суз С1у С1у
5 10 15 <210> 338
- 182 032985 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 338
О1у О1у Суз Тгр
РЪе О1п О1п РЪе
А1а Тгр Агд А1а
ТЪг Суз О1у О1у <210> 339 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 339
О1у О1у Суз О1у РЪе О1и Ьеи Азп Мек 11е Бег О1п Туг Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 340 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 340
О1у О1у Суз О1и Рго РЪе О1и Ьеи Агд РЪе Туг Н1з О1и О1у Суз О1у
5 10 15
О1у <210> 341 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <400> 341 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
- 183 032985
О1у О1у Суз Рго РЪе О1п Ьеи Уа1 Тгр Бег Рго А1а РЪе Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 342 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 342
Бег О1у Суз А1а Тгр О1и 11е Ьуз О1у 11е Тгр Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 343 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 343
Бег О1у Суз Бег
Бег 11е О1п Бег
Тгр Агд Ьеи Тгр
Ьеи Суз О1у О1у <210> 344 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 344
О1у О1у Суз О1у Уа1 МеЕ О1п Уа1 Ьеи Азп Агд А1а Н1з Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 345 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
- 184 032985 <400> 345
Агд О1у Суз О1п Уа1 Ьуз Туг Туг МеЕ О1у О1и О1у Азр Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 346 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 346
О1у О1у Суз Рго Уа1 Тгр 11е Рго РЪе Н1з Тгр О1и О1и Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 347 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 347
Бег О1у Суз Ьеи Ьеи Тгр О1п О1п Бег МеЕ Ьеи Ьеи РЪе Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 348 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 348
Бег О1у Суз О1и О1п О1п Тгр Бег Тгр Агд Ьеи Туг Ьеи Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 349 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
- 185 032985 <400> 349
О1у О1у Суз Бег Уа1 О1п Бег ТИг Тгр О1п Ьеи Тгр А1а Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 350 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 350
Бег О1у Суз Ьуз Туг Рго 11е РИе Тгр Азр ТИг 11е Азр Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 351 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 351
Бег О1у Суз Уа1 О1и Туг О1п Туг О1п Меб Уа1 Туг РИе Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 352 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 352
О1у О1у Суз ТИг Азр О1п Агд Тгр РИе Уа1 Ьеи Туг О1и Суз О1у О1у
5 10 15 <210> 353 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
- 186 032985 <400> 353
С1у С1у Суз Рго РИе Тгр С1п С1и Тгр Н1з Ьеи Бег Туг Суз С1у С1у
5 10 15 <210> 354 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 354
Бег С1у Суз Туг МеВ С1у Туг МеВ Н1з Ьеи 11е А1а С1и Суз С1у С1у
5 10 15 <210> 355 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 355
С1у С1у Суз РИе МеВ С1у Бег РИе Бег Ьеи Уа1 Туг С1у Суз С1у С1у
5 10 15 <210> 356 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 356
Бег С1у Суз Рго Тгр С1у РИе МеВ РИе Рго 11е Бег Туг Суз С1у С1у
5 10 15 <210> 357 <211> 26 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
- 187 032985 <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер синтетический <400> 357 ддаааадДсд асДадассас саДдда <210> 358 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной праймер последовательности:
синтетический <400> 358 сЬЬЬдсддсс дсДсаДДаДД Д <210> 359 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 359
О1у О1у Суз О1у Ьуз Н1з Тгр Н1з О1п Суз О1у О1у
5 10 <210> 360 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 360
О1у О1у Суз Н1з Бег РЪе Ьуз Н1з РЪе Суз О1у О1у
5 10 <210> 361 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
- 188 032985 <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 361
С1у С1у Суз С1и Агд РАе Н1з Н1з А1а Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 362 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 362
С1у С1у Суз А1а С1п С1п Тгр Н1з Н1з С1и Туг Суз С1у С1у
5 10 <210> 363 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 363
С1у С1у Суз Азр С1у Агд ТАг Буз Туг Суз С1у С1у
5 10 <210> 364 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 364
С1у С1у Суз Меб С1п Меб Азп Буз Тгр Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 365 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
- 189 032985 <221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 365
С1у С1у Суз Тгр С1у Вег Агд Вег С1п Суз С1у С1у
5 10 <210> 366 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 366
С1у С1у Суз С1п С1у МеВ Тгр ТИг Тгр Суз С1у С1у
5 10 <210> 367 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 367
С1у С1у Суз РИе Рго Ьеи С1п Азр Туг Суз С1у С1у
5 10 <210> 368 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический синтетический синтетический синтетический <400> 368
С1у С1у Суз Туг Рго Ьеи С1п Азр Туг Суз С1у С1у
5 10 <210> 369 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 190 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 369
С1у С1у Суз Уа1 РИе Азп А1а РИе Азп Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 370 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 370
С1у С1у Суз Уа1 РИе
5
Азп С1у РИе Азп Суз С1у С1у <210> 371 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 371
С1у С1у Суз Уа1 РИе Азп Н1з РИе Азп Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 372 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 372
С1у С1у Суз Уа1 РИе Азп 11е РИе Азп Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 373 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 191 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 373
О1у О1у Суз Уа1 РЪе Азп Ьеи РЪе Азп Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 374 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 374
О1у О1у Суз Уа1 РЪе Азп Азп РЪе Азп Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 375 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 375
О1у О1у Суз Уа1 РЪе Азп О1п РЪе Азп Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 376 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 376
О1у О1у Суз Уа1 РЪе Азп Вег РЪе Азп Суз О1у О1у
5 10 <210> 377 <211> 12 <212> БЕЛОК
- 192 032985 <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 377
О1у О1у Суз Уа1 РЪе Азп ТЪг РЪе Азп Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 378 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221>
<223>
пептид источник /примечание=Описание искусственной последовательности:
синтетический
<400> 378
О1у О1у Суз Уа1 РЪе Азп Уа1 РЪе Азп Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 379 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 379
О1у О1у Суз Тгр О1у Бег Агд Бег О1п Суз О1у О1у
5 10 <210> 380 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 380 дадкдддада дсаакддкдд ккдкссддкк скдскдккса аскдкддкдд кдддсадссд 60 дадаас <210> 381
- 193 032985 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 381 дЕЕсЕссддс Едсссассас сасадЕЕдаа садсадаасс ддасаассас саЕЕдсЕсЕс 60 ссасЕс <210> 382 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 382 дадЕдддада дсааЕддЕдд ЕЕдЕдЕЕЕЕс ЕсЕдсЕсЕдЕ ддЕдЕддЕдд Едддсадссд 60 дадаас <210> 383 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 383 дЕЕсЕссддс Едсссассас сасассасад адсададааа асасаассас саЕЕдсЕсЕс 60 ссасЕс <210> 384 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 384 дадЕдддада дсааЕддЕдд ЕЕдЕдааасЕ ЕасЕддЕЕдЕ ЕсЕдЕддЕдд Едддсадссд 60 дадаас 66
- 194 032985 <210> 385 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 385 дЕЕсЕссддс Едсссассас сасадаасаа ссадЕаадЕЕ Есасаассас саЕЕдсЕсЕс 60 ссасЕс <210> 386 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 386 дадЕдддада дсааЕддЕдд ЕЕдЕссдсаЕ ЕддссдЕЕсд ааЕдЕддЕдд Едддсадссд 60 дадаас <210> 387 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 387 дЕЕсЕссддс Едсссассас сасаЕЕсдаа сддссааЕдс ддасаассас саЕЕдсЕсЕс 60 ссасЕс <210> 388 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 388 дадЕдддада дсааЕддЕдд ЕЕдЕдсЕЕЕс дааЕЕсаЕсЕ асЕдЕддЕдд Едддсадссд 60
- 195 032985 дадаас <210> 389 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 389 дббсбссддс бдсссассас сасадбадаб дааббсдааа дсасаассас саббдсбсбс 60 ссасбс <210> 390 <211> 63 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 390 дадбдддада дсаабддбдд ббдбсадбас ббсббдссдб дбддбддбдд дсадссддад 60 аас <210> 391 <211> 63 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 391 дббсбссддс бдсссассас сасасддсаа даадбасбда саассассаб бдсбсбссса 60 сбс 63 <210> 392 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 392
- 196 032985
С1у С1у Суз Рго Н1з МеВ РИе Рго Тгр Суз С1у С1у
5 10 <210> 393 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 393
С1у С1у Суз С1у Н1з С1у Тгр 11е РИе Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 394 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 394
С1у С1у Суз Уа1 РИе Азп МеВ РИе Азп Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 395 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 395
С1у С1у Суз 11е Ьеи Азп РИе Туг С1у Суз С1у С1у
5 10 <210> 396 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
- 197 032985 <400> 396
С1у С1у Суз Агд С1и Рго Н1з Рго РИе Суз С1у С1у
5 10 <210> 397 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 397
С1у С1у Суз Рго РИе С1и РИе ТИг С1п Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 398 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 398
С1у С1у Суз С1п Ьеи С1у Бег Меб Н1з Суз С1у С1у
5 10 <210> 399 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 399
С1у С1у Суз Туг С1и Азп Ьуз ТИг Ьеи Суз С1у С1у
5 10 <210> 400 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
- 198 032985 <400> 400
С1у С1у Суз Агд А1а С1у Туг С1у Азр А1а Бег Суз С1у С1у
5 10 <210> 401 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 401
С1у С1у Суз Меб Уа1 Рго РАе Бег Меб Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 402 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 402
С1у С1у Суз С1и Ьеи С1п С1и Агд Тгр Суз С1у С1у
5 10 <210> 403 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 403
С1у С1у Суз Рго А1а Азп Тгр С1у ТАг Суз С1у С1у
5 10 <210> 404 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
- 199 032985 <400> 404
О1у О1у Суз МеД МеД О1и РЪе А1а О1п Суз О1у О1у
5 10 <210> 405 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 405
О1у О1у Суз О1п Н1з Н1з 11е МеД О1п Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 406 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 406
О1у О1у Суз Туг О1п Н1з Н1з МеД О1и Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 407 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 407
О1у О1у Суз МеД Уа1 Рго РЪе
5
Бег МеД Суз О1у О1у <210> 408 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
- 200 032985 <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 408
С1у С1у Суз С1п Ьуз С1у Тгр Уа1 РИе Суз С1у С1у
5 10 синтетический <210> 409 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 409
С1у С1у Суз Уа1 Туг Азр Уа1 Ьуз Ьуз Суз С1у С1у
5 10 <210> 410 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 410
С1у С1у Суз Ьеи Ьуз С1у МеВ Н1з С1у Вег А1а Суз С1у С1у
5 10 <210> 411 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 411
С1у С1у Суз Азп МеВ Ьеи Тгр С1у Вег Суз С1у С1у
5 10 <210> 412 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
- 201 032985 <221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 412
О1у О1у Суз МеБ О1п Рго Тгр А1а РЪе Суз О1у О1у
5 10 <210> 413 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 413
О1у О1у Суз МеБ ТЪг О1п Туг Азп Тгр Суз О1у О1у
5 10 <210> 414 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 414
О1у О1у Суз Уа1 Азп ТЪг Тгр Тгр Вег Суз О1у О1у
5 10 <210> 415 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 415
О1у О1у Суз Туг 11е ТЪг О1п Ьуз Ьеи Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 416 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 202 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 416
О1у О1у Суз О1и ТЪг Н1з Туг ТЪг Туг Суз О1у О1у
5 10 <210> 417 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 417
О1у О1у Суз ТЪг О1и О1п Уа1 МеЕ Тгр Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 418 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 418
О1у О1у Суз 11е ТЪг О1и РЪе Бег Н1з Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 419 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 419
О1у О1у Суз О1п Азп Агд Бег Туг Тгр Суз О1у О1у
5 10 <210> 420 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 203 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 420
О1у О1у Суз Н1з О1у ТЪг Ьуз О1п РЪе Суз О1у О1у
5 10 <210> 421 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 421
О1у О1у Суз Азп Рго Н1з Агд ТЪг Рго Суз О1у О1у
5 10 <210> 422 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 422
О1у О1у Суз О1п Н1з Бег Рго Рго Ьеи Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 423 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <210> 424 <211> 12 <212> БЕЛОК <400> 423
О1у О1у Суз Азп Н1з О1и О1и ТЪг РЪе Суз О1у О1у
5 10
- 204 032985 синтетический <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 424
О1у О1у Суз О1п Туг Рго Агд Ьуз Ьеи Суз О1у О1у
5 10 <210> 425 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 425
О1у О1у Суз 11е
О1у Рго РИе Тгр
Тгр Суз О1у О1у <210> 426 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 426
О1у О1у Суз Меб О1п Рго Тгр 11е Азп Суз О1у О1у
5 10 <210> 427 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <210> 428 <211> 12 синтетический <400> 427
О1у О1у Суз Уа1 О1п Н1з Ьуз Меб О1у Уа1 Уа1 Суз О1у О1у
5 10
- 205 032985 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 428
О1у О1у Суз О1и Мек О1и Азп А1а Тгр Суз О1у О1у
5 10 <210> 429 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 429
О1у О1у Суз Рго Рго Тгр Рго О1и Агд Суз О1у О1у
5 10 <210> 430 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический синтетический <400> 430
О1у О1у Суз Н1з Азр Рго О1и Рго РЪе Суз О1у О1у
5 10 <210> 431 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <210> 432 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 431
О1у О1у Суз Азп О1и Рго Ьуз Туг Уа1 Суз О1у О1у
5 10
- 206 032985 синтетический <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 432
С1у С1у Суз Азр Агд Рго Уа1 Тгр РАе Суз С1у С1у
5 10 <210> 433 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 433
С1у С1у Суз С1и 11е Рго Н1з Бег РАе Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 434 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический синтетический <400> 434
С1у С1у Суз Меб Рго Туг С1и Меб Н1з Суз С1у С1у
5 10 <210> 435 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический <400> 435
С1у С1у Суз Ьуз Агд С1и Азп Рго Туг Суз С1у С1у
5 10
- 207 032985 синтетический <210> 436 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 436
С1у С1у Суз А1а С1и Агд С1п Туг Туг Суз С1у С1у
5 10 <210> 437 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 437
С1у С1у Суз Азп Уа1 Ьеи Азр Ьеи РИе Суз С1у С1у
5 10 <210> 438 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический синтетический <400> 438
С1у С1у Суз Ьуз Бег Меб 11е Бег Меб Суз С1у С1у
5 10 <210> 439 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический <400> 439
С1у С1у Суз Н1з Н1з Ьуз С1п Азр С1п Суз С1у С1у
5 10
- 208 032985 синтетический <210> 440 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 440
С1у С1у Суз Азп А1а ТИг Ьеи Бег С1у Туг Ьеи Суз С1у С1у
5 10 <210> 441 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 441
С1у С1у Суз С1и А1а ТИг МеВ ТИг Тгр Суз С1у С1у
5 10 <210> 442 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 442
С1у С1у Суз Азп Уа1 Ьеи Азр Ьеи РИе Суз С1у С1у
5 10 синтетический синтетический <400> 443
С1у С1у Суз Бег Агд Уа1 РИе Ьуз Туг Суз С1у С1у
5 10 <210> 443 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид синтетический
- 209 032985 синтетический <210> 444 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 444
С1у С1у Суз Н1з А1а Рго С1п Тгр С1и Суз С1у С1у
5 10 <210> 445 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 445
С1у С1у Суз Рго Ьеи Уа1 Агд А1а Азр Суз С1у С1у
5 10 <210> 446 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 446
С1у С1у Суз МеВ Н1з Азп С1и С1и РИе Суз С1у С1у
5 10 синтетический синтетический <210> 447 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 447
С1у С1у Суз МеВ РИе С1и ТИг Ьуз Тгр Суз С1у С1у синтетический
- 210 032985 синтетический <210> 448 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 448
О1у О1у Суз Азп МеД Азп О1и Тгр Ьуз Бег О1у Суз О1у О1у
5 10 <210> 449 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 449
О1у О1у Суз Ьеи
О1п Азп Ьеи Туг
Уа1 Суз О1у О1у <210> 450 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 450
О1у О1у Суз О1п
ТЪг Бег МеД Ьуз
Азп Суз О1у О1у <210> 451 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 451 синтетический
- 211 032985
О1у О1у Суз Азп Ьеи О1у НБз МеБ Рго Суз О1у О1у
5 10 <210> 452 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 452
О1у О1у Суз Тгр МеБ Тгр А1а О1и О1и Суз О1у О1у
5 10 <210> 453 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 453
О1у О1у Суз Уа1 НБз Азп Азр Ьуз Ьеи Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 454 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 454
О1у О1у Суз Туг О1у Ьуз А1а О1у МеБ Агд Азр Суз О1у О1у
5 10 <210> 455 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
- 212 032985 <400> 455
О1у О1у Суз Уа1 Бег А1а А1а ТЪг Бег Агд ТЪг Суз О1у О1у
5 10 <210> 456 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 456
О1у О1у Суз Туг Рго О1п Буз О1и 11е Суз О1у О1у
5 10 <210> 457 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 457
О1у О1у Суз Азп О1п Бег Бег
5
Бег Агд О1и А1а Суз О1у О1у <210> 458 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 458
О1у О1у Суз Азп Рго Уа1 Бег ТЪг О1у А1а Туг Суз О1у О1у
5 10 <210> 459 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
- 213 032985 <400> 459
О1у О1у Суз Рго О1у Н1з О1и РЪе Агд Суз О1у О1у
5 10 <210> 460 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 460
О1у О1у Суз О1у О1и Туг Азп Туг Уа1 О1у О1у Суз О1у О1у
5 10 <210> 461 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 461
О1у О1у Суз Ьуз
Тгр Бег МеЕ ТЪг
Ьуз Суз О1у О1у <210> 462 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 462
О1у О1у Суз Азр Тгр Н1з Агд МеЕ Ьуз Суз О1у О1у
5 10 <210> 463 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
- 214 032985 <400> 463
О1у О1у Суз Меб Н1з Бег Рго Н1з А1а Суз О1у О1у
5 10 <210> 464 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 464
О1у О1у Суз Меб Меб Тгр Ьуз Уа1 Азп Суз О1у О1у
5 10 <210> 465 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 465
О1у О1у Суз РИе ТИг Азп Туг А1а Бег О1и Ьуз Суз О1у О1у
5 10 <210> 466 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 466
О1у О1у Суз Азр Агд РИе О1п Азп Уа1 Азп Уа1 Суз О1у О1у
1 5 10
<210> 467 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
- 215 032985 <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 467
О1у О1у Суз О1и Агд Н1з РЪе Рго А1а Ьеи РЪе Суз О1у О1у
5 10 синтетический <210> 468 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 468
О1у О1у Суз ТЪг Ьеи О1у Бег А1а Рго ТЪг Ьеи Суз О1у О1у
5 10 <210> 469 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 469
О1у О1у Суз О1и Мек Мек Ьуз Азп Ьуз Бег О1у Суз О1у О1у
5 10 <210> 470 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 470
О1у О1у Суз О1и А1а Бег О1у О1п 11е Суз О1у О1у
5 10 <210> 471 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
- 216 032985 <221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 471
С1у С1у Суз Ьеи Агд Азп РАе Меб Ьуз С1п Бег Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 472 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 472
С1у С1у Суз Рго Азп Азр ТАг Уа1 Агд Азр А1а Суз С1у С1у
5 10 <210> 473 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 473
С1у С1у Суз Бег РАе Бег Агд Н1з Меб С1у А1а Суз С1у С1у
5 10 <210> 474 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <210> 475 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <400> 474
С1у С1у Суз А1а Ьуз Азр С1п Н1з ТАг С1у Бег Суз С1у С1у
5 10
- 217 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 475
С1у С1у Суз Ьеи С1у Ьеи Агд С1п С1и Суз С1у С1у
5 10 <210> 476 <211> 14 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 476
С1у С1у Суз Азп МеВ Азп С1и Тгр Ьуз Бег С1у Суз С1у С1у
5 10 <210> 477 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 477
С1у С1у Суз С1п С1п 11е Ьуз С1и Тгр Суз С1у С1у
5 10 <210> 478 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 478
С1у С1у Суз Азр Ьеи Рго Азп С1и МеВ Суз С1у С1у
5 10 <210> 479 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность
- 218 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический
<400> 479
С1у С1у Суз Меб РИе Бег Н1з Рго Н1з Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 480 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 480
С1у С1у Суз А1а С1у Рго Туг Тгр А1а Суз С1у С1у
5 10 <210> 481 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 481
С1у С1у Суз С1и С1п С1п РИе
5
Уа1 ТИг Суз С1у С1у <210> 482 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <210> 483 <211> 12 <212> БЕЛОК <400> 482
С1у С1у Суз Меб С1у Тгр Тгр Н1з Ьеи Суз С1у С1у
5 10
- 219 032985 синтетический <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 483
С1у С1у Суз Рго С1п Н1з С1у С1и МеВ Суз С1у С1у
5 10 <210> 484 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид
<400> 484
С1у С1у Суз Туг А1а Вег Рго Н1з С1и Суз С1у С1у
1 5 10
<210> 485 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический синтетический <400> 485
С1у С1у Суз МеВ Рго Рго С1п Тгр МеВ Суз С1у С1у
5 10 <210> 486 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 486
С1у С1у Суз Азр ТИг 11е С1у Тгр РИе Суз С1у С1у
5 10 <210> 487 <211> 12
- 220 032985 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 487
О1у О1у Суз О1у 11е РЪе О1и Бег Тгр Суз О1у О1у
5 10 <210> 488 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 488
О1у О1у Суз О1у Рго Туг Ьуз ТЪг О1и Суз О1у О1у
5 10 <210> 489 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический синтетический <400> 489
О1у О1у Суз О1п Рго О1п А1а Бег Тгр Суз О1у О1у
5 10 <210> 490 <211> 13 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <210> 491 <400> 490
О1у О1у Суз Азр Агд О1п Уа1 ТЪг О1у РЪе Суз О1у О1у
5 10
- 221 032985 синтетический <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности:
пептид <400> 491
О1у О1у Вег О1п Агд А1а Рго А1а Вег Суз О1у О1у
5 10 <210> 492 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 492
О1у О1у Суз МеБ МеБ Агд О1и О1п О1у Суз О1у О1у
5 10 <210> 493 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид <400> 493
О1у О1у Суз Ьеи
Ьеи Рго Азп МеБ
РЪе Суз О1у О1у синтетический синтетический <210> 494 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 494
О1у О1у Суз Суз Рго Уа1 Туг О1п НБз Суз О1у О1у
5 10
- 222 032985 <210> 495 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 495
О1у О1у Суз Ьеи МеЕ Бег О1п Азр Ьеи Суз О1у О1у
5 10 <210> 496 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: пептид синтетический <400> 496
О1у О1у Суз О1у О1у Рго Туг Уа1 РЪе Суз О1у О1у
5 10 <210> 497 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер ргттег синтетический <400> 497 дададсааЕд дЕддЕЕдЕЕЕ сссдсЕдсад дасЕас <210> 498 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной праймер ргттег <400> 498 дЕадЕссЕдс адсдддааас аассассаЕЕ дсЕсЕс <210> 499 последовательности:
синтетический
- 223 032985 последовательности синтетический <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная <220>
<221> источник <223> /примечание= праймер ргттег последовательность
Описание искусственной <400> 499 дададсаабд дбддббдбба сссдсбдсад дасбас <210> 500 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной праймер последовательности:
синтетический <400> 500 дбадбссбдс адсдддбаас аассассабб дсбсбс <210> 501 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 501 ддбддббдбд ббббсаасдс дббсаасбдб ддбддбддд синтетический <210> 502 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 502 сссассасса садббдаасд сдббдаааас асаассасс синтетический <210> 503 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 224 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 503 ддЕддЕЕдЕд ЕЕЕЕсаасдд дЕЕсаасЕдЕ ддЕддЕддд <210> 504 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 504 сссассасса садЕЕдаасс сдЕЕдаааас асаассасс <210> 505 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 505 ддЕддЕЕдЕд ЕЕЕЕсаасса ЕЕЕсаасЕдЕ ддЕддЕддд синтетический синтетический синтетический <210> 506 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 506 сссассасса садЕЕдаааЕ ддЕЕдаааас асаассасс синтетический <210> 507 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер синтетический
- 225 032985 <400> 507 ддбддббдбд ббббсаасаб сббсаасбдб ддбддбддд <210> 508 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 508 сссассасса садббдаада бдббдаааас асаассасс синтетический <210> 509 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 509 ддбддббдбд ббббсаасбб дббсаасбдб ддбддбддд синтетический <210> 510 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 510 сссассасса садббдааса адббдаааас асаассасс синтетический <210> 511 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 511 ддбддббдбд ббббсаасаа сббсаасбдб ддбддбддд синтетический <210> 512 <211> 39
- 226 032985 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 512 сссассасса садккдаадк кдккдаааас асаассасс синтетический <210> 513 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 513 ддкддккдкд кккксаасса дкксааскдк ддкддкддд синтетический <210> 514 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 514 сссассасса садккдааск ддккдаааас асаассасс синтетический <210> 515 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 515 ддкддккдкд кккксааскс дкксааскдк ддкддкддд синтетический <210> 516 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер синтетический
- 227 032985 <400> 516 сссассасса садВВдаасд адВВдаааас асаассасс <210> 517 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 517 ддВддВВдВд ВВВВсаасас дВВсаасВдВ ддВддВддд синтетический <210> 518 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 518 сссассасса садВВдаасд ВдВВдаааас асаассасс синтетический <210> 519 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 519 ддВддВВдВд ВВВВсаасдВ дВВсаасВдВ ддВддВддд синтетический <210> 520 <211> 39 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 520 сссассасса садВВдааса сдВВдаааас асаассасс синтетический <210> 521 <211> 18
- 228 032985 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 521 дббссбббсб аббсбсас <210> 522 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 522 дадддбдбсс ббдддббббд дддд <210> 523 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер <400> 523 ддбдаддасд сбдассасас ддба <210> 524 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер ргДтег <400> 524 абдсабсасд дадсабдада адас синтетический синтетический синтетический синтетический <210> 525 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
- 229 032985 <223> /примечание= Описание искусственной праймер <400> 525 аббабдсасс бссасдссдб ссас <210> 526 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной праймер <400> 526 аббдсбсбсс сасбссасдд сдаб последовательности:
синтетический последовательности:
синтетический
<210> 527
<211> 18
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<221> источник
<223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический
праймер
<400> 527
сссаббсада бссбсббс 18
<210> 528 <211> 54 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: праймер синтетический <220>
<221> изменение <222> (19)..(21) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (22)..(24) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (25)..(27)
- 230 032985
<223> /замена=ААС или ССС или ССТ или СТТ или ССТ или АСТ или ТАС или СТС или АТС или АТС или ТСС или САС или САС или САТ или
или ТСТ САА или или ТТС ССТ
<220>
<221> изменение
<222> (28)..(30)
<223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
<220>
<221> изменение
<222> (31)..(33)
<223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
<220>
<221> изменение
<222> (34)..(36)
<223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
<220>
<221> смеш_признак
<222> (19)..(36)
<223> /примечание=нуклеотиды, вписанные в последовательность, не имеет
преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <220>
<221> источник <223> /примечание= см. в прилагаемом описании подробное описание замен и предпочтительных вариантов реализации <400> 528 ааасссаадд асасссЕсаа аааааааааа ааааааассс сЕдаддЕсас аЕдс <210> 529 <211> 54 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <220>
<221> изменение <222> (19)..(21) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (22)..(24) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
- 231 032985
или ССС или ССТ или СТТ ССТ или или ТАС СТС или или ТСТ САА или или ТСС САС или или ТТС ССТ или
<220> <221> изменение
<222> (25)..(27)
<223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
<220> <221> изменение
<222> (28)..(30)
<223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
<220> <221> изменение
<222> (31)..(33)
<223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
<220> <221> изменение
<222> (34)..(36)
<223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
<220> <221> <222> смеш_признак (19)..(36)
<223> /примечание=нуклеотиды, вписанные в последовательность, не имеет
преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <220>
<221> источник <223> /примечание= см. в прилагаемом описании подробное описание замен и предпочтительных вариантов реализации <400> 529 дВддВсадсд ВссВсассаа аааааааааа аааааасасс аддасВддсВ дааВ 54 <210> 530 <211> 72 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <220>
<221> изменение <222> (28)..(30) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
- 232 032985
СОТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (31)..(33)
<223> /замена=ААС или АСТ или ТАС или СТС или АТС или АТС или ТСС или САС или САС или ТТС или ССТ САТ или
или ССС или ССТ или СТТ ССТ или или ТСТ САА или
<220>
<221> изменение
<222> (34)..(36)
<223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
<220>
<221> изменение
<222> (37)..(39)
<223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
<220>
<221> изменение
<222> (40)..(42)
<223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
<220>
<221> изменение
<222> (43)..(45)
<223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
<220>
<221> смеш_признак
<222> (28)..(45)
<223> /примечание=нуклеотиды, вписанные в последовательность, не имеет
преимущества
по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям
<220>
<221> источник <223> /примечание=см. в прилагаемом описании подробное описание замен и предпочтительных вариантов реализации <400> 530 дДддДсадсд ДссДсассдд ДддДДдДааа аааааааааа аааааДдДдд ДддДсассад дасДддсДда аД <210> 531 <211> 57 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник
- 233 032985 <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <220>
<221> изменение
<222> (19). .(21 )
<223> / замена = ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
<220>
<221> изменение <222> (22)..(24) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (25)..(27) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (28)..(30) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (31)..(33) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> смеш_признак <222> (19)..(33) <223> /примечание=нуклеотиды, вписанные в последовательность, не имеет преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <220>
<221> изменение <222> (37)..(39) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССТ ССС или или СТТ ССТ или или ТАС СТС или или ТСТ САА или или САС ТСС или или ССТ или ТТС
<220>
<221> смеш_ признак
<222> (37). .(39)
<223> /примечание=нуклеотиды, вписанные в последовательность, не имеет
преимущества
по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям
<220>
<221> источник <223> /примечание=см. в прилагаемом описании подробное описание
- 234 032985 замен и предпочтительных вариантов реализации <400> 531
ЕсаЕдсЕссд ЕдаЕдсаЕаа аааааааааа ааасасааас асЕасасдса даададс 57 <210> 532 <211> 72 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <220>
<221> изменение <222> (28)..(30)
<223> / замена = ААС или АСТ или АТС или АТО или САО или САТ
или ССО или СОТ или СТО или ОАА или ОАС или ОСТ или
СОТ1 или ОТТ или ТАС или ТСТ или ТОО или ТТС
<220> <221> изменение
<222> (31). .(33 )
<223> / замена = ААС или АСТ или АТС или АТО или САО или САТ
или ССО или СОТ или СТО или ОАА или ОАС или ОСТ или
СОТ1 или ОТТ или ТАС или ТСТ или ТОО или ТТС
<220> <221> изменение
<222> (34). .(36 )
<223> / замена = ААС или АСТ или АТС или АТО или САО или САТ
или ССО или СОТ или СТО или ОАА или ОАС или ОСТ или
СОТ1 или ОТТ или ТАС или ТСТ или ТОО или ТТС
<220> <221> изменение
<222> (37). .(39 )
<223> / замена = ААС или АСТ или АТС или АТО или САО или САТ
или ССО или СОТ или СТО или ОАА или ОАС или ОСТ или
ООТ или ОТТ или ТАС или ТСТ или ТОО или ТТС
<220> <221> изменение
<222> (40). .(42 )
<223> / замена = ААС или АСТ или АТС или АТО или САО или САТ
или ССО или СОТ или СТО или ОАА или ОАС или ОСТ или
ООТ или ОТТ или ТАС или ТСТ или ТОО или ТТС
<220> <221> изменение
<222> (43). .(45 )
<223> / замена = ААС или АСТ или АТС или АТО или САО или САТ
или ССО или СОТ или СТО или ОАА или ОАС или ОСТ или
ООТ или ОТТ или ТАС или ТСТ или ТОО или ТТС
<220>
<221> смеш_признак <222> (28)..(45)
- 235 032985 <223> /примечание=нуклеотиды, вписанные в последовательность, не имеет преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <220>
<221> источник <223> /примечание=см. в прилагаемом описании подробное описание замен и предпочтительных вариантов реализации <400> 532 ддсдБддадд БдсаБааБдд БддББдБааа аааааааааа аааааБдБдд БддБдссаад 60 асааадссдс дд <210> 533 <211> 72 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <220>
<221> изменение <222> (28)..(30)
<223> / замена = ААС или АСТ или АТС или АТО или САО или САТ
или ССО или СОТ или СТО или ОАА или ОАС или ОСТ или
ООТ1 или ОТТ или ТАС или ТСТ или ТОО или ТТС
<220> <221> изменение
<222> (31). .(33 )
<223> / замена = ААС или АСТ или АТС или АТО или САО или САТ
или ССО или СОТ или СТО или ОАА или ОАС или ОСТ или
ООТ1 или ОТТ или ТАС или ТСТ или ТОО или ТТС
<220> <221> изменение
<222> (34). .(36 )
<223> / замена = ААС или АСТ или АТС или АТО или САО или САТ
или ССО или СОТ или СТО или ОАА или ОАС или ОСТ или
ООТ1 или ОТТ или ТАС или ТСТ или ТОО или ТТС
<220> <221> изменение
<222> (37). .(39 )
<223> / замена = ААС или АСТ или АТС или АТО или САО или САТ
или ССО или СОТ или СТО или ОАА или ОАС или ОСТ или
ООТ или ОТТ или ТАС или ТСТ или ТОО или ТТС
<220> <221> изменение
<222> (40). .(42 )
<223> / замена = ААС или АСТ или АТС или АТО или САО или САТ
или ССО или СОТ или СТО или ОАА или ОАС или ОСТ или
ООТ или ОТТ или ТАС или ТСТ или ТОО или ТТС
<220>
<221> изменение
- 236 032985 <222> (43)..(45) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССТ ССС или или СТТ ССТ или или ТАС СТС или или ТСТ САА или или САС ТСС или или ССТ или ТТС
<220>
<221> смеш_ признак
<222> (28). .(45)
<223> /примечание=нуклеотиды, вписанные в последовательность, не имеет
преимущества
по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям
<220>
<221> источник <223> /примечание=см. в прилагаемом описании подробное описание замен и предпочтительных вариантов реализации <400> 533 дбддадбддд ададсаабдд бддббдбааа аааааааааа ааааабдбдд бддбдддсад 60 ссддадааса ас <210> 534 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание праймер искусственной последовательности: синтетический
<400> 534 дббссбббсб аббсбсас 18
<210> 535 <211> 18 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220> <221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический
пептид рггтег
<400> 535 сссаббсада бссбсббс <210> 536 <211> 84 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной праймер последовательности:
синтетический
- 237 032985 <220>
<221> изменение <222> (31)..(33)
<223> /замена=ААС или ССТ или АСТ или АТС или ТСТ или САА или АТС или ТСС или САС или САС или ТТС или ССТ САТ или
или ССТ ССС или или СТТ или ТАС СТС или
<220>
<221> изменение
<222> (34). .(36 )
<223> / замена = ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или
ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС
<220>
<221> изменение <222> (37)..(39) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (40)..(42) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (43)..(45) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (46)..(48) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (49)..(51) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ или ССС или ССТ или СТС или САА или САС или ССТ или ССТ или СТТ или ТАС или ТСТ или ТСС или ТТС <220>
<221> изменение <222> (52)..(54) <223> /замена=ААС или АСТ или АТС или АТС или САС или САТ
или ССТ ССС или или СТТ ССТ или или ТАС СТС или или ТСТ САА или или САС ТСС или или ССТ или ТТС
<220>
<221> смеш_ признак
<222> (31). .(54)
<223> /примечание=нуклеотиды, вписанные в последовательность, не имеет
преимущества
по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям
- 238 032985 <220>
<221> источник <223> /примечание=см. в прилагаемом описании подробное описание замен и предпочтительных вариантов реализации <400> 536 сбдсссссаб сбсдадабда дсбдддббдб аааааааааа аааааааааа аааабдбддб 60 ддбассаасс аддбсадссб дасс <210> 537 <211> 84 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <220>
<221> тоТ1£1еД_Ьазе <222> (31)..(32) <223> а, с, б, д, неизвестный или другой <220>
<221> тоТ1£1еД_Ьазе <222> (34)..(35) <223> а, с, б, д, неизвестный или другой <220>
<221> тоТ1£1еД_Ьазе <222> (37)..(38) <223> а, с, б, д, неизвестный или другой <220>
<221> тоТ1£1еД_Ьазе <222> (40)..(41) <223> а, с, б, д, неизвестный или другой <220>
<221> тоТ1£1еД_Ьазе <222> (43)..(44) <223> а, с, б, д, неизвестный или другой <220>
<221> тоТ1£1еД_Ьазе <222> (46)..(47) <223> а, с, б, д, неизвестный или другой <220>
<221> тоТ1£1еД_Ьазе <222> (49)..(50) <223> а, с, б, д, неизвестный или другой <220>
<221> тоТ1£1еД_Ьазе <222> (52)..(53) <223> а, с, б, д, неизвестный или другой <400> 537
- 239 032985 сбдсссссаб сбсдадабда дсбдддббдб ппкппкппкп пкппкппкпп кппкбдбддб 60 ддбассаасс аддбсадссб дасс <210> 538 <211> 21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 538 ддссссдбда бддбдабдаб д <210> 539 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 539 дадбдддада дсаабддбдд ббдбсабсбд ссдббсдсбд бббдбддбдд бдддсадссд 60 дадаас <210> 540 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 540 дббсбссддс бдсссассас сасааасадс даасддсада бдасаассас саббдсбсбс 60 ссасбс <210> 541 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 541 дадбдддада дсаабддбдд ббдббддссд сбдсаддасб асбдбддбдд бдддсадссд 60
- 240 032985 дадаас <210> 542 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 542 дббсбссддс бдсссассас сасадбадбс сбдсадсддс саасаассас саббдсбсбс 60 ссасбс <210> 543 <211> 63 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 543 дадбдддада дсаабддбдд ббдбддбсаб даабасабдб ддбдбддбдд дсадссддад 60 аас 63 <210> 544 <211> 63 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 544 дббсбссддс бдсссассас ассасабдба ббсабдасса саассассаб бдсбсбссса 60 сбс 63 <210> 545 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 545
- 241 032985 дадЕдддада дсааЕддЕдд ЕЕдЕдЕЕЕЕс аасаЕдЕЕса асЕдЕддЕдд Едддсадссд 60 дадаас <210> 546 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 546 дЕЕсЕссддс Едсссассас сасадЕЕдаа саЕдЕЕдааа асасаассас саЕЕдсЕсЕс 60 ссасЕс <210> 547 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 547 дадЕдддада дсааЕддЕдд ЕЕдЕдсЕсЕд ЕасссдасЕа асЕдЕддЕдд Едддсадссд 60 дадаас <210> 548 <211> 66 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический праймер <400> 548 дЕЕсЕссддс Едсссассас сасадЕЕадЕ сдддЕасада дсасаассас саЕЕдсЕсЕс 60 ссасЕс
<210> <211> <212> <213> 549 6 БЕЛОК Ното заръепз
<400> 549
Ьеи МеЕ 11е Бег Агд ТЪг
5
- 242 032985 <210> 550 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (2)..(7) <223> /замена=РИе или Азп или Агд или Вег или ТИг или МеВ или 11е или С1и или Азр или С1у ог
А1а или Уа1 или С1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (2)..(7) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 550
Ьеи Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз ТИг
5 <210> 551 <211> 8 <212> БЕЛОК <213> Ното зарщепз <400> 551
ТИг Уа1 Ьеи Н1з С1п Азр Тгр Ьеи
5 <210> 552 <211> 12 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (2)..(7) <223> /замена=РИе или Азп или Агд или Вег или ТИг или МеВ или 11е или С1и или Азр или С1у ог А1а или Уа1 или С1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
- 243 032985 <221> смеш_признак <222> (2)..(7) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 552
ТЪг Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Н1з С1п Азр Тгр Ьеи
5 10 <210> 553 <211> 18 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (5)..(10) <223> /замена=РЪе или Азп или Агд или Бег или ТЪг или Мек или 11е или С1и или Азр или С1у ог
А1а или Уа1 или С1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (5)..(10) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 553
ТЪг С1у С1у Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз С1у С1у Н1з С1п Азр
5 10 15
Тгр Ьеи <210> 554 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 554
Мек Н1з С1и А1а Ьеи Н1з Азп Н1з Туг
5 <210> 555 <211> 11 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
- 244 032985 <221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (3)..(7) <223> /замена=РИе или Азп или Агд или Бег или ТИг или МеВ или 11е или С1и или Азр или С1у ог
А1а или Уа1 или С1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (3)..(7) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (9)..(9) <223> /замена=РИе или Азп или Агд или Бег или ТИг или МеВ или 11е или С1и или Азр или С1у ог
А1а или Уа1 или С1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (9)..(9) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 555
МеВ Н1з Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Н1з Ьуз Н1з Туг
5 10 <210> 556 <211> 5 <212> БЕЛОК <213> Ното заряепз <400> 556
С1и Уа1 Н1з Азп А1а
5 <210> 557 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
- 245 032985 <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (8)..(13) <223> /замена=РИе или Азп или Агд или Бег или ТИг или Меб или 11е или С1и или Азр или С1у ог А1а или Уа1 или С1п или Н1з или Рго или Ьеи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (8)..(13) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 557
С1и Уа1 Н1з Азп С1у С1у Суз Буз Буз Буз Буз Буз Буз Суз С1у С1у
1 5 10 15
А1а
<210> 558 <211> 6 <212> БЕЛОК <213> Ното зарФепз <400> 558
Азп С1у С1п Рго С1и Азп
5 <210> 559 <211> 18 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (5)..(10) <223> /замена=РИе или Азп или Агд или Бег или ТИг или Меб или 11е или С1и или Азр или С1у ог
А1а или Уа1 или С1п или Н1з или Рго или Беи или Туг или Тгр <220>
<221> смеш_признак <222> (5)..(10) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 559
Азп С1у С1у Суз Буз Буз Буз Буз Буз Буз Суз С1у С1у С1у С1п Рго
- 246 032985
5
С1и Азп <210> 560 <211> 7 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 560
Азр С1и Беи ТЪг Ьуз Азп С1п
5 <210> 561 <211> 21 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> МОБ_ЕЕБ <222> (7)..(14) <223> Любая аминокислота <400> 561
Азр С1и Беи
С1у С1у Суз
Хаа
Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Хаа Суз С1у
15
С1у ТЪг Буз
Азп С1п <210> 562 <211> 21 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <220>
<221> ВАРИАНТ <222> (7)..(14) <223> /замена=РЪе или Азп или Агд или Бег или ТЪг или МеД или 11е или С1и или Азр или С1у ог А1а или Уа1 или С1п или Н1з или Рго или Беи или Туг или Тгр
- 247 032985 <220>
<221> смеш_признак <222> (7)..(14) <223> /примечание=остатки, вписанные в последовательность не имеют преимущества по сравнению с остатками в аннотации к указанным положениям <400> 562
Азр О1и Ьеи О1у О1у Суз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Ьуз Суз О1у
5 10 15
О1у ТЪг Ьуз
Азп О1п <210> 563 <211> 13 <212> БЕЛОК <213> Ното зартепз <400> 563
Тгр О1и Бег Азп О1у О1п Рго О1и Азп Азп Туг Ьуз ТЪг
5 10 <210> 564 <211> 25 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 564
Тгр О1и Бег Азп О1у О1у Суз О1у МеЕ Рго 11е О1и РЪе Суз О1у О1у
5 10 15
О1у О1п Рго
О1и Азп Азп Туг Ьуз
ТЪг <210> 565 <211> 25 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 565
Тгр О1и О1у О1у Суз О1у МеЕ Рго 11е О1и РЪе Суз О1у О1у Бег Азп
5 10 15
О1у О1п Рго О1и Азп Азп Туг Ьуз ТЪг
- 248 032985 <210> 566 <211> 25 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 566
Тгр С1и Бег С1у С1у Суз С1у Меб Рго 11е С1и РИе Суз С1у С1у Азп
1 5 10 15
С1у С1п Рго С1и
Азп Азп Туг Ьуз
ТИг <210> 567 <211> 25 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 567
Тгр С1и Бег Азп С1у С1у С1у Суз С1у Меб Рго 11е С1и РИе Суз С1у
5 10 15
С1у С1п Рго С1и
Азп Азп Туг Ьуз
ТИг <210> 568 <211> 25 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид
<400> 568
Тгр С1и Бег Азп С1у С1п С1у С1у Суз С1у Меб Рго 11е С1и РИе Суз
1 5 10 15
С1у С1у Рго
С1и Азп Азп Туг
Ьуз
ТИг
- 249 032985 <210> 569 <211> 25 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 569
Тгр С1и Бег Азп
С1у С1п Рго С1у
С1у Суз С1у Меб
Рго 11е С1и РАе
Суз
С1у С1у С1и
Азп Азп
Туг
Буз
ТАг <210> 570 <211> 25 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 570
Тгр С1и Бег Азп
С1у С1п Рго С1и
С1у С1у Суз С1у
Меб Рго 11е С1и
РАе Суз С1у С1у Азп Азп Туг Буз
ТАг <210> 571 <211> 25 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 571
Тгр С1и Бег Азп
С1у С1п Рго С1и
Азп С1у С1у Суз
С1у Меб Рго 11е
С1и РАе Суз
С1у С1у Азп Туг Буз
ТАг <210> 572 <211> 25 <212> БЕЛОК
- 250 032985 <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 572
Тгр О1и Вег Азп
О1у О1п Рго О1и
Азп Азп О1у О1у
Суз О1у МеБ Рго
11е О1и РЪе Суз
О1у О1у Туг Ьуз ТЪг <210> 573 <211> 22 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 573
Тгр О1и Вег О1у О1у Суз О1у МеБ Рго 11е О1и РЪе Суз О1у О1у Рго
5 10 15
О1и Азп Азп Туг Ьуз ТЪг <210> 574 <211> 24 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 574
Тгр О1и Вег О1у О1у О1у Суз О1у МеБ Рго 11е О1и РЪе Суз О1у О1у
5 10 15
О1у Рго О1и Азп Азп Туг Ьуз ТЪг <210> 575 <211> 9 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
- 251 032985 <221> источник <223> /примечание=Описание искусственной последовательности: синтетический пептид <400> 575
Туг Рго Туг Азр Уа1 Рго Азр Туг А1а
5

Claims (22)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Вариант полипептида Ес, содержащий вариант фрагмента Ес 1дО1, 1§С2, 1дС3 или 1дС4 человека, причем указанный вариант фрагмента Ес содержит вставку от 3 до 20 аминокислот, причем вставка содержит по меньшей мере один цистеин среди первых четырех добавленных аминокислот и по меньшей мере один цистеин среди последних четырех добавленных аминокислот, причем вставка расположена между аминокислотами 382 и 383, аминокислотами 383 и 384, аминокислотами 384 и 385, аминокислотами 385 и 386, аминокислотами 386 и 387, аминокислотами 387 и 388 или аминокислотами 388 и 389 согласно системе нумерации ЕС, или в котором аминокислоты 384-386 делетированы и вставка расположена между аминокислотами 383 и 387 согласно системе нумерации ЕС, причем вариант полипептида Ес при рН 6,0 связывается с неонатальным рецептором Ес человека (ЬЕсЯи) с более высокой активностью связывания, чем у контрольного полипептида Ес, имеющего такую же последовательность аминокислот, что и вариант полипептида Ес, за исключением того, что он не содержит вставки, и при этом при рН 7,4 вариант полипептида Ес обладает слабой или не обладает активностью связывания с 11РсРп и реакция остаточного связывания варианта полипептида Ес, определяемая при рН 7,4, не превышает 0,1 нм по сравнению с реакцией связывания, определяемой для контрольного полипептида Ес.
  2. 2. Вариант полипептида Ес по п.1, в котором указанная вставка имеет длину от 10 до 20 аминокислот.
  3. 3. Вариант полипептида Ес по п.1, в котором вставка имеет длину 6-16 аминокислот.
  4. 4. Вариант полипептида Ес по п.1, в котором вставка имеет длину по меньшей мере 6 аминокислот.
  5. 5. Вариант полипептида Ес по любому из пп.1-4, в котором вставка в варианте фрагмента Ес человека расположена между аминокислотами 382 и 383, аминокислотами 383 и 384, аминокислотами 384 и 385, аминокислотами 385 и 386, аминокислотами 386 и 387 или аминокислотами 387 и 388 варианта фрагмента Ес согласно системе нумерации ЕС, или в котором аминокислоты 384-386 делетированы и вставка расположена между аминокислотами 383 и 387 согласно системе нумерации ЕС.
  6. 6. Вариант полипептида Ес по любому из пп.1-4, в котором вставка расположена между аминокислотами 383 и 387 согласно системе нумерации ЕС.
  7. 7. Вариант полипептида Ес по п.6, в котором вставка в варианте фрагмента Ес человека расположена между аминокислотами 384 и 385 согласно системе нумерации ЕС.
  8. 8. Вариант полипептида Ес по любому из пп.1-7, в котором первые три аминокислоты вставки представляют собой С1у-С1у-Су§, а последние три аминокислоты вставки представляют собой Су5-С1уС1у.
  9. 9. Вариант полипептида Ес по любому из пп.1-4, в котором вариант фрагмента Ес содержит вставку между аминокислотами 382 и 383, аминокислотами 383 и 384, аминокислотами 384 и 385, аминокислотами 385 и 386, аминокислотами 386 и 387, аминокислотами 387 и 388 или аминокислотами 388 и 389 согласно системе нумерации ЕС, или в котором аминокислоты 384-386 делетированы и вставка расположена между аминокислотами 383 и 387 согласно системе нумерации ЕС, в котором вставка имеет длину 10-16 аминокислот, в котором вариант полипептида Ес при рН 6,0 связывается с неонатальным рецептором Ес человека (ЬЕсКп) с более высокой активностью связывания, чем у контрольного полипептида Ес, имеющего такую же последовательность аминокислот, что и вариант полипептида Ес, за исключением того, что он не содержит вставки, и в котором при рН 7,4 вариант полипептида Ес обладает слабой или не обладает активностью связывания с №сКн и реакция остаточного связывания, определяемая при рН 7,4, не превышает 0,1 нм по сравнению с реакцией связывания, определяемой для контрольного полипептида Ес.
  10. 10. Вариант полипептида Ес по любому из пп.1-9, в котором вставка в варианте фрагмента Ес содержит последовательность аминокислот, представленную в любой из: 8ЕЦ ΙΌ №: 13-24, 41-67, 90-356, 359-367, 369, 372, 373 и 375-379; аминокислоты 4-8, представленные в 8ЕЦ ΙΌ №: 216; аминокислоты 49, представленные в любой из 8ЕЦ ΙΌ №: 41-53, 67, 90-163, 165-215 и 217-247 и 359-378; аминокислоты
    - 252 032985
    4-10, представленные в 8ЕС ΙΌ №: 164; аминокислоты 4-11, представленные в любой из 8ЕС ГО №: 248288, 290-306 и 342; аминокислоты 4-12, представленные в 8ЕС ГО №: 289 или 307; и аминокислоты 4-13, представленные в любой из 8ЕС ГО №: 308-341 и 343-356.
  11. 11. Вариант полипептида Ес по п.10, в котором вставка в варианте фрагмента Ес имеет последовательность аминокислот, представленную в любой из 8ЕС ГО №: 41-45, 54-58, 97, 127, 180, 208, 216 и 221.
  12. 12. Вариант полипептида Ес по любому из пп.1-9, в котором вставка расположена между аминокислотами 384 и 385 согласно системе нумерации ЕС, и при этом указанная вставка содержит последовательность аминокислот, представленную в любой из 8ЕС ГО №: 13-24, 41-67, 90-356, 359-367, 369, 372, 373 и 375-379; аминокислоты 4-8, представленные в 8ЕС ГО №: 216; аминокислоты 4-9, представленные в любой из 8ЕС ГО №: 41-53, 67, 90-163, 165-215 и 217-247 и 359-378; аминокислоты 4-10, представленные в 8ЕС ГО №: 164; аминокислоты 4-11, представленные в любой из 8ЕС ГО №: 248-288, 290-306 и 342; аминокислоты 4-12, представленные в 8ЕС ГО №: 289 или 307; и аминокислоты 4-13, представленные в любой из 8ЕС ГО №: 308-341 и 343-356.
  13. 13. Вариант полипептида Ес по любому из пп.1-12, в котором вариант полипептида Ес является антителом, содержащим область νΗ, область Уь, область Сн2 и область Сн3, является одновалентным или двухвалентным или является димером или тетрамером.
  14. 14. Вариант полипептида Ес по любому из пп.1-13, в котором реакция связывания определяется методом интерферометрии биослоя.
  15. 15. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариант полипептида Ес по любому из пп.1-14.
  16. 16. Клетка-хозяин для экспрессии варианта полипептида Ес по любому из пп.1-14, где клеткахозяин содержит нуклеиновую кислоту по п.15.
  17. 17. Способ получения варианта полипептида Ес по любому из пп.1-14, указанный способ включает культивирование клетки-хозяина по п.16 в условиях, при которых нуклеиновая кислота экспрессируется, и выделение экспрессированного варианта полипептида Ес из культуральной среды или клеточной массы.
  18. 18. Способ увеличения времени полужизни полипептида Ес, содержащего фрагмент Ес 1дС человека по любому из пп.1-14, указанный способ включает следующие этапы:
    выбор сайта для вставки в петле 10 или рядом с указанной петлей; и встраивание пептида в выбранный сайт, причем указанный пептид содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из:
    (a) 8ЕС ГО №: 41-67, 90-356, 359-367, 369, 372, 373 и 375-379;
    (b) аминокислот 4-8, представленных в 8ЕС ГО №: 216;
    (c) аминокислот 4-9, представленных в любой из 8ЕС ГО №: 41-53, 67, 90-163, 165-215 и 217-247 и 359-378;
    (6) аминокислот 4-10, представленных в 8ЕС ГО №: 164;
    (е) аминокислот 4-11, представленных в любой из 8ЕС ГО №: 248-288, 290-306 и 342;
    (ί) аминокислот 4-12, представленных в 8ЕС ГО №: 289 или 307; и (д) аминокислот 4-13, представленных в любой из 8ЕС ГО №: 308-341 и 343-356.
  19. 19. Способ по п.18, в котором вставка расположена между аминокислотами 382 и 383, аминокислотами 383 и 384, аминокислотами 384 и 385 и аминокислотами 385 и 386 варианта фрагмента Ес согласно системе нумерации ЕС или в котором аминокислоты 384-386 делетированы и вставка расположена между аминокислотами 383 и 387 согласно системе нумерации ЕС.
  20. 20. Способ идентификации варианта фрагмента Ес 1дС человека по любому из пп.1-14, который обеспечивает увеличенное время полужизни ίη νίνο варианта полипептида Ес, который содержит указанный вариант фрагмента Ес, по сравнению с контрольным полипептидом Ес, указанный способ включает следующие этапы:
    (a) создание библиотеки нуклеиновых кислот, кодирующих фрагменты Ес, содержащие вставку, содержащую 4-20 отобранных случайным образом аминокислот в петле 10 или рядом с указанной петлей;
    (b) скрининг фрагментов Ес, закодированных в указанной библиотеке, для определения вариантов фрагментов Ес, которые (ί) при рН 6 связываются с ЬРсЯп с более высокой активностью связывания, чем контрольный фрагмент Ес, и (ίί) при рН 7,4 обладают слабой или не обладает активностью связывания для связывания с ЕЕсЕп;
    (c) конструирование нуклеиновой кислоты, кодирующей вариант полипептида Ес, содержащий идентифицированный на этапе (Ь) вариант фрагмента Ес, причем известно, что зависимость концентрации от времени для контрольного полипептида Ес, который содержит контрольный фрагмент Ес, в отличие от варианта фрагмента Ес, линейно снижается при введении животному ίη νίνο;
    (6) введение нуклеиновой кислоты, полученной на этапе (с), в клетку-хозяина и культивирование клетки-хозяина в условиях, при которых вариант полипептида Ес, кодируемый нуклеиновой кислотой, может экспрессироваться;
    (е) выделение варианта полипептида Ес из клеточной массы или культуральной клеточной среды;
    - 253 032985 (ί) введение варианта полипептида Гс животному и введение контрольного полипептида Гс другому животному и (д) отслеживание концентрации варианта полипептида Гс и контрольного полипептида Гс в периферической крови в течение определенного времени после введения, благодаря чему можно идентифицировать вариант фрагмента Гс, который обеспечивает большее время полужизни ΐη νίνο и большее воздействие варианта полипептида Гс.
  21. 21. Способ по п.20, в котором вставка согласно этапу (а) расположена в положении между 384 и 385 согласно системе нумерации ЕС, которая проиллюстрирована в табл. 1.
  22. 22. Применение варианта полипептида Гс по любому из пп.1-14 для лечения рака, аутоиммунных заболеваний, воспалительных заболеваний, метаболических заболеваний или неврологических заболеваний.
EA201491235A 2011-12-21 2012-12-17 Варианты полипептидов fc-pol с улучшенным связыванием неонатального рецептора fc EA032985B1 (ru)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161578780P 2011-12-21 2011-12-21
US201261585993P 2012-01-12 2012-01-12
US201261729050P 2012-11-21 2012-11-21
PCT/US2012/070146 WO2013096221A1 (en) 2011-12-21 2012-12-17 Variant fc-polypeptides with enhanced binding to the neonatal fc receptor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201491235A1 EA201491235A1 (ru) 2015-01-30
EA032985B1 true EA032985B1 (ru) 2019-08-30

Family

ID=47459187

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201491235A EA032985B1 (ru) 2011-12-21 2012-12-17 Варианты полипептидов fc-pol с улучшенным связыванием неонатального рецептора fc

Country Status (17)

Country Link
US (1) US9688756B2 (ru)
EP (1) EP2794650B1 (ru)
JP (2) JP6313712B2 (ru)
KR (1) KR102208698B1 (ru)
CN (1) CN104302665B (ru)
AR (1) AR089326A1 (ru)
AU (1) AU2012355435A1 (ru)
BR (1) BR112014015078A2 (ru)
CA (1) CA2859785A1 (ru)
EA (1) EA032985B1 (ru)
ES (1) ES2751386T3 (ru)
HK (1) HK1199270A1 (ru)
IL (1) IL233191A0 (ru)
MX (1) MX356402B (ru)
SG (1) SG11201403444UA (ru)
TW (1) TWI641622B (ru)
WO (1) WO2013096221A1 (ru)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2751386T3 (es) * 2011-12-21 2020-03-31 Amgen Inc Polipéptidos Fc variantes con unión potenciada al receptor de Fc neonatal
CA2903258C (en) 2013-03-15 2019-11-26 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
US20160257748A1 (en) 2013-09-25 2016-09-08 Amgen Inc. V-c-fc-v-c antibody
EP3114143B1 (en) 2014-03-05 2020-07-08 UCB Biopharma SRL Multimeric fc proteins
JP2017529853A (ja) 2014-09-25 2017-10-12 アムジエン・インコーポレーテツド プロテアーゼにより活性化可能な二重特異性タンパク質
AU2017325654B2 (en) * 2016-08-02 2024-09-05 Visterra, Inc. Engineered polypeptides and uses thereof
CN108101992B (zh) * 2017-12-31 2021-03-26 武汉班科生物技术股份有限公司 与新生的Fc受体结合增强的CH2结构域突变体及其制备方法与应用
SG11202101551TA (en) * 2018-05-17 2021-03-30 Immunome Inc Ch3 domain epitope tags
WO2020088164A1 (zh) 2018-11-01 2020-05-07 山东新时代药业有限公司 双特异性抗体及其用途
CN112142847B (zh) * 2019-02-22 2023-05-05 武汉友芝友生物制药股份有限公司 改造的Fc片段，包含其的抗体及其应用
EP3990493A1 (en) 2019-06-28 2022-05-04 Amgen Inc. Anti-cgrp receptor/anti-pac1 receptor bispecific antigen binding proteins
PE20221271A1 (es) 2019-11-04 2022-09-01 Alector Llc Moleculas de fusion del ecd de siglec-9 y metodos de uso de estas
CN112111475B (zh) * 2020-09-24 2021-07-20 江苏丰华生物制药有限公司 一种经上皮细胞转运能力增强的TNK-tPA融合蛋白及其应用
US20240218046A1 (en) * 2021-04-14 2024-07-04 Anjarium Biosciences Ag Fc-derived polypeptides
WO2023198806A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Ose Immunotherapeutics New class of molecules for selective clearance of antibody
WO2024102635A1 (en) 2022-11-07 2024-05-16 Alector Llc Uses of siglec-9 ecd fusion molecules in cancer treatment

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005047327A2 (en) * 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
WO2006036834A2 (en) * 2004-09-24 2006-04-06 Amgen Inc. MODIFIED Fc MOLECULES
US20080181887A1 (en) * 2000-12-12 2008-07-31 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
WO2008119096A1 (en) * 2007-03-30 2008-10-09 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. Transcytotic immunoglobulin
WO2009058492A2 (en) * 2007-10-31 2009-05-07 Xencor, Inc Fc variants with altered binding to fcrn

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
DE60143544D1 (de) * 2000-12-12 2011-01-05 Medimmune Llc Moleküle mit längeren halbwertszeiten, zusammensetzungen und deren verwendung
EP2364996B1 (en) * 2002-09-27 2016-11-09 Xencor Inc. Optimized FC variants and methods for their generation
AU2005304624B2 (en) 2004-11-12 2010-10-07 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US20070135620A1 (en) * 2004-11-12 2007-06-14 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
EA018897B1 (ru) * 2005-01-05 2013-11-29 Ф-Стар Биотехнологише Форшунгс- Унд Энтвиклунгсгез.М.Б.Х. Молекулы иммуноглобулина, содержащие модифицированные участки структурных петель, обладающие свойством связывания, и способ их получения
US7820790B2 (en) 2005-07-13 2010-10-26 Amgen Mountain View Inc. IL-6 binding proteins
TW200732350A (en) 2005-10-21 2007-09-01 Amgen Inc Methods for generating monovalent IgG
HUE028536T2 (en) 2008-01-07 2016-12-28 Amgen Inc Method for producing antibody to FC heterodimer molecules using electrostatic control effects
EP2297209A4 (en) 2008-06-03 2012-08-01 Abbott Lab IMMUNOGLOBULINS WITH TWO VARIABLE DOMAINS AND USES THEREOF
ES2751386T3 (es) * 2011-12-21 2020-03-31 Amgen Inc Polipéptidos Fc variantes con unión potenciada al receptor de Fc neonatal
US20140302037A1 (en) * 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
CA2903258C (en) * 2013-03-15 2019-11-26 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080181887A1 (en) * 2000-12-12 2008-07-31 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
WO2005047327A2 (en) * 2003-11-12 2005-05-26 Biogen Idec Ma Inc. NEONATAL Fc RECEPTOR (FcRn)-BINDING POLYPEPTIDE VARIANTS, DIMERIC Fc BINDING PROTEINS AND METHODS RELATED THERETO
WO2006036834A2 (en) * 2004-09-24 2006-04-06 Amgen Inc. MODIFIED Fc MOLECULES
WO2008119096A1 (en) * 2007-03-30 2008-10-09 F-Star Biotechnologische Forschungs- Und Entwicklungsges.M.B.H. Transcytotic immunoglobulin
WO2009058492A2 (en) * 2007-10-31 2009-05-07 Xencor, Inc Fc variants with altered binding to fcrn

Also Published As

Publication number Publication date
JP6313712B2 (ja) 2018-04-18
JP2015508395A (ja) 2015-03-19
AU2012355435A1 (en) 2014-07-17
EP2794650B1 (en) 2019-08-14
WO2013096221A1 (en) 2013-06-27
US20140356358A1 (en) 2014-12-04
TW201333042A (zh) 2013-08-16
IL233191A0 (en) 2014-07-31
AU2012355435A2 (en) 2014-07-24
MX2014007525A (es) 2014-10-17
US9688756B2 (en) 2017-06-27
KR20140114833A (ko) 2014-09-29
CN104302665A (zh) 2015-01-21
CA2859785A1 (en) 2013-06-27
SG11201403444UA (en) 2014-07-30
MX356402B (es) 2018-05-28
BR112014015078A2 (pt) 2017-06-13
CN104302665B (zh) 2019-04-23
EP2794650A1 (en) 2014-10-29
TWI641622B (zh) 2018-11-21
ES2751386T3 (es) 2020-03-31
JP2018064559A (ja) 2018-04-26
EA201491235A1 (ru) 2015-01-30
HK1199270A1 (en) 2015-06-26
AR089326A1 (es) 2014-08-13
KR102208698B1 (ko) 2021-01-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA032985B1 (ru) Варианты полипептидов fc-pol с улучшенным связыванием неонатального рецептора fc
JP6910380B2 (ja) 活性化可能な結合ポリペプチドおよびその同定方法ならびに使用
CA2698809C (en) Homogeneous antibody populations
JP2019532063A (ja) 低粘度の抗原結合タンパク質およびそれらの作製方法
EA022796B1 (ru) Антитело, способное связывать тимусный стромальный лимфопоэтин, нуклеиновая кислота, его кодирующая, экспрессирующий вектор, клетка-хозяин, гибридома, способ получения антитела и его применение
KR20180016972A (ko) Cd137에 결합하는 항체 치료제
EA017303B1 (ru) Модифицированные гуманизированные антитела против интерлейкина-18 и их применение
JP2018504893A (ja) Ｂｍｐ６を標的とする抗体のための組成物および方法
EA020464B1 (ru) Отдельные вариабельные домены антител против сывороточного альбумина
BR112013010688B1 (pt) combinações de anticorpos c-met
TW201323442A (zh) 低密度脂蛋白相關蛋白６（ｌｒｐ６）－半衰期延長構築體
EA017690B1 (ru) Мутанты fgf21 и их применение
TW201105345A (en) FGF21 mutants and uses thereof
KR20190013970A (ko) 혈청 알부민 결합 피브로넥틴 iii 형 도메인
BR112015009892B1 (pt) Anticorpo contra il-1 beta, seu método de produção e seu uso, sequência isolada de ácido nucleico, vetor, composição cosmética, de diagnóstico ou farmacêutica, e kit
AU2014269287A1 (en) Anti-TNF-alpha/CXCL10 double-targeting antibody and use thereof
EP4303231A1 (en) Bispecific antibody
JP2020532279A (ja) 抗ｇｉｔｒ抗体、その抗原結合性断片、およびその医薬用途
EA026119B1 (ru) Новое антитело против рецептора il-23 человека
WO2020226502A2 (en) Variant domains for multimerizing proteins and separation thereof
EP4177275A1 (en) Coagulation factor xi (fxi) binding protein
WO2008152537A2 (en) Humanized monoclonal antibodies against human epidermal growth factor receptor, use and method thereof
WO2020093990A1 (zh) 抗TNFα/抗IL‐17A天然抗体结构样异源二聚体形式双特异抗体及其制备
CA3208070A1 (en) Humanized antibodies against irhom2

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM