EA017690B1 - Мутанты fgf21 и их применение - Google Patents

Мутанты fgf21 и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA017690B1
EA017690B1 EA201001883A EA201001883A EA017690B1 EA 017690 B1 EA017690 B1 EA 017690B1 EA 201001883 A EA201001883 A EA 201001883A EA 201001883 A EA201001883 A EA 201001883A EA 017690 B1 EA017690 B1 EA 017690B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
ece21
pcp21
polypeptide
mutant
mutants
Prior art date
Application number
EA201001883A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201001883A1 (ru
Inventor
Эдвард Джон Белуски
Мюриэль Мэри Эллисон
Агнес Ева Гамбургер
Рэнди Айра Хехт
Ю-Шенг Ли
Марк Лео Михаелс
Джеонгун Сан
Джинг Ксу
Original Assignee
Амген Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40984291&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=EA017690(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Амген Инк. filed Critical Амген Инк.
Publication of EA201001883A1 publication Critical patent/EA201001883A1/ru
Publication of EA017690B1 publication Critical patent/EA017690B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/18—Growth factors; Growth regulators
    • A61K38/1825—Fibroblast growth factor [FGF]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/01—DNA viruses
    • C07K14/03—Herpetoviridae, e.g. pseudorabies virus
    • C07K14/05—Epstein-Barr virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Abstract

Изобретение предлагает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие мутантные полипептиды FGF21, мутантные полипептиды FGF21 как таковые, фармацевтические композиции, включающие мутантные полипептиды FGF21, и способы лечения метаболических заболеваний с применением таких нуклеиновых кислот, полипептидов или фармацевтических композиций.

Description

Настоящее изобретение относится к молекулам нуклеиновых кислот, кодирующим мутантные полипептиды ЕСЕ21, к мутантным полипептидам ЕСЕ21, к фармацевтическим композициям, содержащим мутантные полипептиды ЕСЕ21, и к способам лечения метаболических заболеваний с применением таких нуклеиновых кислот, полипептидов или фармацевтических композиций.
Предпосылки создания изобретения
ЕСЕ21 представляет собой секретируемый полипептид, принадлежащий к подсемейству факторов роста фибробластов (ЕСЕ), которые включают ЕСЕ19, ЕСЕ21 и ЕСЕ23 (Ной с1 а1., 2004, Ттепб Сспс1. 20: 563-69). Полипептид ЕСЕ21 является атипичным ЕСЕ в том отношении, что он независим от гепарина и функционирует как гормон в регуляции глюкозы, липидов и энергетического метаболизма.
ЕСЕ21 был выделен из библиотеки кДНК печени как секретируемый печеночный фактор. Он высоко экспрессируется в печени и поджелудочной железе, являясь единственным членом семейства ЕСЕ, экспрессируемым, главным образом, в печени. Трансгенные мыши с избыточной экспрессией ЕСЕ21 демонстрируют метаболические фенотипы замедленных темпов роста, низкого уровня глюкозы и триглицеридов в плазме, а также отсутствие связанного с возрастом сахарного диабета II типа, гиперплазии островковых клеток поджелудочной железы и ожирения. Фармакологическое введение рекомбинантного белка ЕСЕ21 в моделях грызунов и приматов приводит к нормализации уровня глюкозы в плазме, к снижению уровня триглицеридов и холестерина, а также к улучшению толерантности к глюкозе и чувствительности к инсулину. В дополнение к этому, ЕСЕ21 снижает вес тела и отложения телесного жира за счет увеличения потребления энергии, физической активности и скорости метаболизма. Экспериментальные исследования дают подтверждение фармакологическому введению ЕСЕ21 для лечения сахарного диабета II типа, ожирения, дислипидемии и других метаболических состояний или заболеваний у человека.
ЕСЕ21 человека имеет короткий период полувыведения ίη νίνο. У мышей период полувыведения ЕСЕ21 человека составляет от 1 до 2 ч, а у обезьян супото1ди8 период полувыведения составляет от 2,5 до 3 ч. При разработке белкового препарата ЕСЕ21 для применения в качестве лекарства при лечении сахарного диабета II типа было бы желательно увеличить период полувыведения. Белки ЕСЕ21, имеющие удлиненный период полувыведения, позволили бы реже вводить дозы лекарства больным, получающим такие препараты. Описание таких белков приводится в настоящем документе.
Сущность изобретения
Настоящее раскрытие сущности изобретения относится к выделенному полипептиду, содержащему аминокислотную последовательность 8ЕС Ш N0: 4, кроме того включающему замещение любой аминокислоты на остаток аланина в положении 45, остаток лейцина в положении 86, остаток лейцина в положении 98, остаток аланина в положении 111, остаток аланина в положении 129, остаток глицина в положении 170, остаток пролина в положении 171, остаток серина в положении 172 или их комбинации. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения выделенный полипептид включает замещение любой аминокислоты на остаток лейцина в положении 98, остаток пролина в положении 171 или одновременно остаток лейцина в положении 98 и остаток пролина в положении 171. В другом варианте осуществления изобретения выделенный полипептид включает замещение любой аминокислоты как на остаток лейцина в положении 98, так и на остаток пролина в положении 171.
Настоящее раскрытие изобретения также представляет выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность 8ЕС Ш N0: 4, имеющую: (а) как минимум одно аминокислотное замещение, которое представляет собой: (ί) остаток глутамина, изолейцина или лизина в положении 19, (ίί) остаток гистидина, лейцина или фениланина в положении 20, (ίίί) остаток изолейцина, фениланина, тирозина или валина в положении 21, (ίν) остаток изолейцина, фенилаланина или валина в положении 22, (ν) остаток аланина или аргинина в положении 150, (νί) остаток аланина или валина в положении 151, (νίί) остаток гистидина, лейцина, фениланина или валина в положении 152, (νίίί) остаток аланина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, пролина или серина в положении 170, (ίχ) остаток аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, лизина, серина, треонина, триптофана или тирозина в положении 171, (х) остаток лейцина или треонина в положении 172, (χί) остаток аргинина или глутаминовой кислоты в положении 173, или (Ь) как минимум одно аминокислотное замещение, которое представляет собой: (ί) остаток аргинина, глутаминовой кислоты или лизина в положении 26, (ίί) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина в положении 45, (ίίί) остаток треонина в положении 52, (ίν) остаток цистеина, глутаминовой кислоты, глицина или серина в положении 58, (ν) остаток аланина, аргинина, глутаминовой кислоты или лизина в положении 60, (νί) остаток аланина, аргинина, цистеина или гистидина в положении 78, (νίί) остаток цистеина или треонина в положении 86, (νίίί) остаток аланина, аргинина, глутаминовой кислоты, лизина или серина в положении 88, (ίχ) остаток аргинина, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина в положении 98, (х) остаток аргинина, аспарагиновой кислоты, цистеина или глутаминовой кислоты в положении 99, (χί) остаток лизина или треонина в положении 111, (χίί) остаток аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, гистидина или лизина в положении 129 или (χίίί) остаток аргинина, глута
- 1 017690 миновой кислоты, гистидина, лизина или тирозина в положении 134, а также их комбинации. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотный остаток в положении 98 представлен аргинином, а аминокислотный остаток в положении 171 представлен пролином, а в другом варианте осуществления изобретения полипептид может включать аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, но в которой как минимум одно аминокислотное замещение из (а)(1)-(х1) и (Ь)(1)-(хш) далее не модифицируется.
Настоящее раскрытие изобретения далее представляет выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, имеющую как минимум одно аминокислотное замещение, которое представляет собой: (а) остаток глутамина, лизина или изолейцина в положении 19, (Ь) остаток гистидина, лейцина или фенилаланина в положении 20, (с) остаток изолейцина, фенилаланина, тирозина или валина в положении 21, (б) остаток изолейцина, фенилаланина или валина в положении 22, (е) остаток аланина или аргинина в положении 150, (1) остаток аланина или валина в положении 151 (д) остаток гистидина, лейцина, фенилаланина или валина в положении 152, (11) остаток аланина, аспарагиновой кислоты или пролина в положении 170, (ί) остаток аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутаминовой кислоты, глутамина, глицина, гистидина, лизина, серина, треонина, триптофана или тирозина в положении 171, (|) остаток лейцина в положении 172 или (к) остаток аргинина или глутаминовой кислоты в положении 173 либо их комбинации. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотный остаток в положении 171 представлен пролином, а в другом варианте осуществления изобретения полипептид может включать аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, но в которой как минимум одно аминокислотное замещение из (а)-(к) далее не модифицируется.
Настоящее раскрытие изобретения дополнительно представляет выделенный полипептид, включающий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, имеющую как минимум одно аминокислотное замещение, которое представляет собой: (а) остаток аргинина, глутаминовой кислоты или лизина в положении 26, (Ь) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина в положении 45, (с) остаток треонина в положении 52, (б) остаток глутаминовой кислоты, глицина или серина в положении 58, (е) остаток аланина, аргинина, глутаминовой кислоты или лизина в положении 60, (1) остаток аланина, аргинина или гистидина в положении 78, (д) остаток аланина в положении 88, (1) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, глутамина, лизина или треонина в положении 98, (ί) остаток аргинина, аспарагиновой кислоты, цистеина или глутаминовой кислоты в положении 99, (|) остаток лизина или треонина в положении 111, (к) остаток аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина, гистидина или лизина в положении 129 или (1) остаток аргинина, глутаминовой кислоты, гистидина, лизина или тирозина в положении 134, а также их комбинации. В одном из вариантов осуществления изобретения аминокислотный остаток в положении 98 представлен аргинином, а в другом варианте осуществления изобретения полипептид может включать аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, но в которой как минимум одно аминокислотное замещение из (а)-(1) далее не модифицируется.
В различных вариантах осуществления изобретения полипептиды, раскрытые в данном документе, могут дополнительно включать как минимум одно аминокислотное замещение, которое представляет собой: (а) фенилаланин, пролин, аланин, серин или глицин в положении 179, (Ь) глутаминовую кислоту, глицин, пролин или серин в положении 180 или (с) лизин, глицин, треонин, аланин, лейцин или пролин в положении 181, а также могут дополнительно включать от 1 до 10 аминокислотных остатков слитых с Сконцом полипептида, которые могут быть представлены любой аминокислотой, например одним или более остатков, выбранных из группы, состоящей из глицина, пролина и их комбинаций.
В различных вариантах осуществления изобретения полипептиды, раскрытые в данном документе, могут включать: (а) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, (Ь) карбоксиконцевое усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, или (с) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего.
В некоторых вариантах осуществления изобретения полипептиды, раскрытые в данном документе, могут быть ковалентно связаны с одним или более полимеров, таких как РЕС. В других вариантах осуществления изобретения полипептиды по настоящему изобретению могут быть слиты с гетерологичной аминокислотной последовательностью, в необязательном порядке, через линкер, такой как ССССС8ССС8СССС8 (8ЕЦ ΙΌ N0: 23). Гетерологичная аминокислотная последовательность может представлять собой константный домен фС или его фрагмент, такой как аминокислотная последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 13. Такие гибридные полипептиды, раскрытые в данном документе, также могут образовывать мультимеры.
Настоящее раскрытие изобретения также представляет фармацевтическую композицию, включающую полипептиды, раскрытые в данном документе, и фармацевтически приемлемый формообразующий агент. Такие фармацевтические композиции можно применять в способе лечения метаболического забо
- 2 017690 левания, а указанный способ включает введение больному человеку, нуждающемуся в лечении, фармацевтической композиции, соответствующей настоящему изобретению. Метаболические заболевания, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, включают сахарный диабет и ожирение.
Также предлагаются выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие полипептиды, раскрытые в данном документе, а также предлагаются векторы, включающие такие молекулы нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева, включающие такие молекулы нуклеиновых кислот.
Также раскрыты усеченные формы полипептида 8ЕО ΙΌ N0: 4. В различных вариантах осуществления изобретения полипептид может включать: (а) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, (Ь) карбоксиконцевое усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, или (с) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего.
Настоящее раскрытие изобретения дополнительно предлагает выделенный гибридный белок, который может включать: (а) константный домен 1д6, (Ь) линкерную последовательность, слитую с константным доменом 1д6, и (с) мутант Е6Е21, слитый с линкерной последовательностью и включающий аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 4, в которой остаток аргинина был замещен остатком лейцина в положении 98, а остаток глицина был замещен остатком пролина в положении 171. В одном из вариантов осуществления изобретения линкерная последовательность может включать 666668666866608 (8Е0 ΙΌ N0: 23), а в другом варианте осуществления изобретения константный домен 1д6 может включать 8Е0 ΙΌ N0: 13. Еще в одном варианте осуществления изобретения линкерная последовательность включает 666668666866668 (8Е0 ΙΌ N0: 23), а константный домен 1д6 включает аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ N0: 13. Еще в одном варианте осуществления изобретения вконец линкера слит с С-концом константного домена 1д6, а №конец мутанта Е6Е21 слит с Сконцом линкера. Раскрытый гибридный белок может образовывать мультимеры.
В различных вариантах осуществления гибридного белка мутантный компонент Е6Е21 может включать как минимум одно аминокислотное замещение, которое представляет собой: (а) фенилаланин, пролин, аланин, серин или глицин в положении 179, (Ь) глутаминовую кислоту, глицин, пролин или серин в положении 180 или (с) лизин, глицин, треонин, аланин, лейцин или пролин в положении 181, а также может дополнительно включать от 1 до 10 аминокислотных остатков, слитых с С-концом мутанта Е6Е21, и от 1 до 10 аминокислотных остатков, которые могут быть представлены любой аминокислотой, например одним или более остатков, выбранных из группы, состоящей из глицина, пролина и их комбинаций.
В других вариантах осуществления изобретения гибридного белка мутантный компонент Е6Е21 может включать: (а) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, (Ь) карбоксиконцевое усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего, или (с) аминоконцевое усечение не более 8 аминокислотных остатков и карбоксиконцевое усечение не более 12 аминокислотных остатков, при этом полипептид способен понижать уровень глюкозы в крови млекопитающего. Еще в одном варианте осуществления мутантный компонент Е6Е21 гибридного белка может включать аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности 8Е0 ΙΌ N0: 4, но в которой остатки аргинина и лизина далее не модифицируются.
Настоящее раскрытие изобретения также представляет фармацевтическую композицию, включающую гибридный белок, раскрытый в данном документе, и фармацевтически приемлемый формообразующий агент. Такие фармацевтические композиции можно применять в способе лечения метаболического заболевания, а указанный способ включает введение больному человеку, нуждающемуся в лечении, фармацевтической композиции, соответствующей настоящему изобретению. Метаболические заболевания, которые можно лечить в соответствии с настоящим изобретением, включают сахарный диабет и ожирение.
Также предлагаются выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие гибридный белок, раскрытый в данном документе, а также предлагаются векторы, включающие такие молекулы нуклеиновых кислот, и клетки-хозяева, включающие такие молекулы нуклеиновых кислот.
Специфические варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны из последующего более подробного описания некоторых вариантов осуществления изобретения и из формулы изобретения.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1А, 1В показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на усеченных мутантах Е6Е21 7-181 и 8-181 (фиг. 1А) и усеченных мутантах Е6Е21 1-172, 1-171, 1-169 и 1-164 (фиг. 1В); каждая панель показывает результаты, полученные на контрольных образцах Е6Е21 человека.
На фиг. 2 показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на контроль
- 3 017690 ных образцах Р0Р21 человека и на усеченных мутантах Р0Р21 3-181, 4-181, 5-181, 7-181, 8-181, 1-180, 1178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181 и 1-149.
На фиг. 3 показаны значения уровня глюкозы в крови, измеряемого у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенный столбец), контрольный Р0Р21 человека (пустой столбец) или усеченные мутанты Р0Р21 8-181 (серый столбец) и 9-181 (столбец с шахматными клетками).
На фиг. 4 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови, измеряемого у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенные кружки), контрольный Рс-Р0Р21 дикого типа (^Т) (пустые кружки) или усеченные гибридные белки Рс-РСР21. включающие аминокислотные остатки 5-181 (закрашенные треугольники) или 7-181 (пустые треугольники).
На фиг. 5 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови, измеряемого у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенные кружки), контрольный Р0Р21-Рс (\УТ) (пустые кружки), усеченный гибридный белок Р0Р21-Рс, включающий аминокислотные остатки 1-175 (закрашенные треугольники), или усеченный белок Рс-Р0Р21, включающий остатки 1-171 (пустые треугольники).
На фиг. 6Ά-6Ό показаны результаты анализа контрольного образца Рс(5)Р0Р21 человека (фиг. 6А) и образцов Рс(5)Р0Р21, полученных от мышей через 6 ч (образец Ό6, фиг. 6В), 24 ч (образец Ό24, фиг. 6С) и 48 ч (образец Ό48, фиг. 6Ό) после инъекции с применением комбинированного способа жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (ЬС-М8).
На фиг. 7Ά-7Ό показаны результаты анализа контрольного образца Р0Р21(3)Расе человека (фиг. 7А) и образцов Р0Р21(3)Расе, полученных от мышей через 6 ч (образец Ό6, фиг. 7В), 24 ч (образец Ό24, фиг. 7С) и 48 ч (образец Ό48, фиг. 7Ό) после инъекции, способом ЬС-М8.
На фиг. 8Ά-8Ό показаны результаты анализа контрольного образца Расе(15)Р0Р21 (фиг. 8 А) и образцов Расе(15)Р0Р21, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 8В), 24 ч (фиг. 8С) и 48 ч (фиг. 8Ό) после инъекции, способом ЬС-М8.
На фиг. 9Ά-Ό показаны результаты анализа контрольного образца Р0Р21(15)Расе (фиг. 9 А) и образцов Р0Р21(15)Расе, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 9В), 24 ч (фиг. 9С) и 48 ч (фиг. 9Ό) после инъекции, способом ЬС-М8.
На фиг. 10А, 10В показаны сайты расщепления, идентифицированные анализом ЬС-М8 гибридных белков Расе(15)Р0Р21 (фиг. 10А, 81 У) ГО N0:24) и Р0Р21(15)Расе (фиг. 10В, 81 У) ГО N0:25), введенных мышам путем инъекции.
На фиг. 11 показаны результаты измерений уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенный столбец), Расе(15)Р0Р21 (пустой столбец) или такие мутанты Расе(15)Р0Р21, как Расе(15)Р0Р21 6 170Е (серый столбец), Расе(15)Р0Р21 Р171А (столбец с шахматными клетками), Расе(15)Р0Р21 8172Ь (пустой столбец с диагональными полосками), Расе(15)Р0Р21 0170Е/Р171А/8172Б (закрашенный столбец с горизонтальными полосками) или Расе(15)Р0Р21 0151А (пустой столбец с диагональными полосками).
На фиг. 12 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам измерений у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенные кружки), Расе(15)Р0Р21 (пустые кружки) или такие мутанты Расе(15)Р0Р21, как Расе(15)Р0Р21 0170Е (закрашенные треугольники),
Расе(15)Р0Р21 Р171А (пустые треугольники), Расе(15)Р0Р21 8172Ь (закрашенные ромбы),
Расе(15)Р0Р21 0170Е/Р171А/8172Ь (пустые ромбы) или Расе(15)Р0Р21 0151А (закрашенные квадраты).
На фиг. 13 показаны результаты измерений уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенный столбец), Рс(15)Р0Р21 (пустой столбец) или такие мутанты Рс(15)Р0Р21, как Рс(15)Р0Р21 Р150А/0151А/Л52У (серый столбец), Рс(15)Р0Р21 0170Е (пустой столбец с диагональными полосками), Рс(15)Р0Р21 0170Е/Р171А (серый столбец с диагональными полосками) или Ес(15)Е0Е21 0170Е/8172Б (пустой столбец с диагональными полосками).
На фиг. 14 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам измерений у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенные квадраты), Ес(15)Е0Е21 (пустые квадраты) или такие мутанты Рс(15)Р0Р21, как Рс(15)Р0Р21 Р150А/0151А/1152У (закрашенные перевернутые треугольники), Рс(15)Р0Р21 0170Е (пустые перевернутые треугольники), Рс(15)Р0Р21 0170Е/Р171А (закрашенные кружки) или Рс(15)Р0Р21 0170Е/8172Б (пустые кружки).
На фиг. 15 показаны результаты измерений уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенный столбец) или такие мутанты Рс(15)Р0Р21, как Рс(15)Р0Р21 0170Е (пустой столбец), Рс(15)Р0Р21 0170А (серый столбец), Рс(15)Р0Р21 0170С (пустой столбец с диагональными полосками), Рс(15)Р0Р21 0170Ό (серо-белый столбец), Рс(15)Р0Р21 0170Ν (закрашенный столбец с диагональными полосками) или Рс(15)Р0Р21 01708 (пустой столбец с диагональными полосками).
На фиг. 16 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам измерений у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенные кружки) или такие мутанты Рс(15)Р0Р21, как Рс(15)Р0Р21 0170Е (пустые кружки), Рс(15)Р0Р21 0170А (закрашенные треугольники), Рс(15)Р0Р21 0170С (пустые треугольники), Рс(15)Р0Р21 0170Ό (закрашенные ромбы), Рс(15)Р0Р21 0170Ν (пустые ромбы) или Рс(15)Р0Р21 01708 (перевернутые пустые треугольники).
На фиг. 17 показаны результаты измерений уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъ- 4 017690 екции вводили РВ8 (закрашенный столбец) или такие мутанты Рс(15)РСР21, как Рс(15)РСР21 С170Е (пустой столбец), Рс(15)РСР21 Р171Е (серый столбец), Рс(15)РСР21 Р171Н (закрашенный столбец с диагональными полосками), Рс(15)РСР21 Р171О (пустой столбец с диагональными полосками),
Рс(15)РСР21 Р171Т (столбец с шахматными клетками) или Рс(15)РСР21 Ρ171Υ (серый столбец с диагональными полосками).
На фиг. 18 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам измерений у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (закрашенные кружки) или такие мутанты Рс(15)РСР21, как Рс(15)РСР21 С170Е (пустые кружки), Рс(15)РСР21 Р171Е (закрашенные треугольники), Рс(15)РСР21 Р171Н (пустые треугольники), Рс(15)РСР21 Р171О (закрашенные ромбы), Рс(15)РСР21 Р171Т (пустые ромбы) или Рс(15)РСР21 Р17Ш (закрашенные квадраты).
На фиг. 19Ά-19Ό показаны результаты анализа контрольного образца РСР21(15)Рс (фиг. 19А) и образцов, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 19В), 24 ч (фиг. 19С) и 48 ч (фиг. 19Ό) после инъекции, способом ЬС-М8.
На фиг. 20Ά-20Ό показаны результаты анализа контрольного образца Рс(15)РСР21 С170Е (фиг. 20А) и образцов Рс(15)РСР21 С170Е, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 20В), 24 ч (фиг. 20С) и 48 ч (фиг. 20Ό) после инъекции, способом ЬС-М8.
На фиг. 21Ά-21Ό показаны результаты анализа контрольного образца Рс(15)РСР21 Р171А (фиг. 21А) и образцов Рс(15)РСР21 Р171А, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 21В), 24 ч (фиг. 21С) и 48 ч (фиг. 21Ό) после инъекции, способом ЬС-М8.
На фиг. 22А-22Э показаны результаты анализа контрольного образца Рс(15)РСР21 8172Ь (фиг. 22А) и образцов Рс(15)РСР21 8172Ь, полученных от мышей через 6 ч (фиг. 22В), 24 ч (фиг. 22С) и 48 ч (фиг. 22Ό) после инъекции, способом ЬС-М8.
На фиг. 23А-23О показаны сайты расщепления, идентифицированные анализом ЬС-М8 гибридных белков Рс(15)РСР21 (фиг. 23А, 8ЕО ГО N0: 24), Рс(15)РСР21 С170Е (фиг. 23В, 8ЕО ГО N0: 26), Рс(15)РСР21 Р171А (фиг. 23С, 8ЕО ГО N0: 27) и Рс(15)РСР21 8172Ь (фиг. 23Ό, 8ЕО ГО N0: 28), введенных мышам путем инъекции.
На фиг. 24А-24С показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на таких мутантах РСР21, как РСР21 Ь99В, РСР21 Ь99О и РСР21 А111Т (фиг. 24А), на таких мутантах РСР21, как РСР21 А129П, РСР21 А129Р и РСР21 А134К (фиг. 24В), и на таких мутантах РСР21, как РСР21 А134Υ, РСР21 А134Е и РСР21 А129К (фиг. 24С), при этом каждая панель показывает результаты, полученные на контрольных образцах РСР21 человека.
На фиг. 25А-25Э показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на таких мутантах Рс-РСР21, как Рс-РСР21 Р171С, Рс-РСР21 Р1718 и Рс-РСР21 Р171Т (фиг. 25А), на таких мутантах Рс-РСР21, как Рс-РСР21 Р17ГГ, Рс-РСР21 Р171№ и Рс-РСР21 Р171С (фиг. 25В), на таких мутантах Рс(15)РСР21, как Рс(15)РСР21 А45К/С170Е и РСР21 А45К (фиг. 25С), и на таких мутантах Рс(15)РСР21, как Рс(15)РСР21 Р171Е и Рс(15)РСР21 А45К/С170Е (фиг. 25Ό), при этом каждая панель показывает результаты, полученные на контрольных образцах РСР21 человека.
На фиг. 26 А, 26В показана агрегация как функция времени для зрелого РСР21 дикого типа и для разных мутантов РСР21, фиг. 26 А показывает процентное изменение агрегации для контрольного РСР21 (^Т, закрашенные ромбы) и РСР21 А45К (закрашенные кружки) после инкубации 65 мг/мл белка при 4°С в течение 1, 2 и 4 дней, тогда как фиг. 26В показывает процентное изменение агрегации для контрольного РСР21 (№Т) и вариантов РСР21 Р78С, Р78В, Ь86Т, Ь86В, Ь98С, Ь98В, А111Т, А129П, А129Р, А129К, А134К, А134Υ и А134Е (все маркированы на графике) после инкубации 65 мг/мл белка при 4°С в течение 1, 6 и 10 дней.
На фиг. 27 показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на контрольном РСР21 человека и на таких мутантах РСР21, как РСР21 А45К, РСР21 Ь52Т и РСР21 Ь58Е.
На фиг. 28А представлен график, показывающий изменение уровня агрегации для таких мутантов Рс(15)РСР21, как Рс(15)РСР21 6-181/С170Е (закрашенные ромбы), Рс(15)РСР21 А45К/С170Е (пустые квадраты), Рс(15)РСР21 Р171Е (закрашенные треугольники), Рс(15)РСР21 Р171А (крестики),
Рс(15)РСР21 С 170Е (пустые треугольники) и для контрольного РСР21 (закрашенные кружки), после инкубации при 4°С в течение 1, 4 и 8 дней, а фиг. 28В представляет собой гистограмму, также показывающую результаты инкубации.
На фиг. 29 показаны результаты измерения уровня глюкозы в крови у мышей, которым путем инъекции вводили РВ8 (носитель) (закрашенные кружки) или такие мутанты Рс(15)РСР21, как Рс(15)РСР21 А45К/С170Е (пустые кружки), Рс(15)РСР21 А45К/Р171С (закрашенные треугольники) или Рс(15)РСР21 Б98Р/Р171С (пустые треугольники).
На фиг. 30 представлен график, показывающий результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на РСР21 человека (закрашенные кружки, сплошная линия), на Рс-РСР21 (пустые кружки, сплошная линия) и на Рс-РСР21 Б98Р/Р171С (закрашенные треугольники, пунктирная линия).
На фиг. 31 представлен график, показывающий процентную величину агрегатов с высоким молекулярным весом, наблюдаемых после девяти дней выдерживания при комнатной температуре (фиг. 31А) и 4°С (фиг. 31В) для РСР21 (закрашенные кружки, сплошная линия), Рс-РСР21 (пустые кружки, сплошная
- 5 017690 линия) и Ес-Е6Е21 Ь98В/Р1716 (закрашенные треугольники, пунктирная линия).
На фиг. 32 представлена серия трасс ΜΑΕΌΙ при масс-спектрометрии, показывающая наблюдаемые изменения Ес-Е 6Е21 Ь98В/Р1716 в различных точках на протяжении 168-часового промежутка времени.
На фиг. 33 представлен график, показывающий процентное изменение уровня глюкозы в крови у мышей оЬ/оЬ для контрольного носителя РВ8 (пустые кружки), зрелого Е6Е21 дикого типа (закрашенные квадраты) и таких мутантов Е6Е21, как Ь98К, Р1716 (перевернутые закрашенные треугольники), Ь98К, Р1716, 182Р (пустые ромбы) и Ь98К, Р1716, 1826 (закрашенные кружки).
На фиг. 34 представлен график, показывающий процентное изменение уровня глюкозы в крови у мышей оЬ/оЬ для контрольного носителя РВ8 (закрашенные кружки) и таких мутантов Е6Е21, как Ь98К, Р1716 (закрашенные треугольники), Ь98К, Р1716, 1826, 1836 (пустые треугольники), Ь98К, Р1716, 1826 (закрашенные ромбы) и Ь98К, Р1716, 182Р (пустые ромбы).
На фиг. 35 представлен график, показывающий процентное изменение уровня глюкозы в крови у мышей оЬ/оЬ для контрольного носителя РВ8 (пустые кружки) и таких мутантов Е6Е21, как Ь98К, Р1716 (закрашенные квадраты), Ь98В, Р1716, Υ1798 (пустые треугольники), Ь98К, Р1716, Υ179Α (перевернутые закрашенные треугольники), Ь98В, Р1716, 1808 (пустые ромбы) и Ь98В, Р1716, Α1806 (закрашенные кружки).
На фиг. 36 представлен график, показывающий процентное изменение уровня глюкозы в крови у мышей оЬ/оЬ для контрольного носителя РВ8 (закрашенные кружки) и таких мутантов Е6Е21, как Ь98К, Р1716 (пустые квадраты), Ь98К, Р1716, Υ179Е (закрашенные треугольники) и Ь98В, Р1716, А180Е (пустые ромбы).
На фиг. 37 представлена диаграмма, отображающую схему шестинедельного исследования с повышением дозы, проведенного на обезьянах резус. На указанной диаграмме полутоновые символы обозначают взятия крови натощак, а фактурные символы обозначают взятия крови после кормления.
На фиг. 38Λ-38Ω представлена серия графиков, отображающих рандомизацию обезьян резус по профилям 06ТТ, АИС (площади под кривой) 06ТТ и весу тела. Фиг. 38А отображает базовый уровень глюкозы в 06ТТ1, при этом закрашенные квадраты соответствуют группе А, закрашенные кружки на сплошной линии соответствуют группе В, а пустые кружки на пунктирной линии соответствуют группе С перед распределением испытуемых соединений и носителя по группам. На фиг. 38В отображен базовый уровень глюкозы в 06ТТ2, при этом закрашенные квадраты соответствуют группе А, закрашенные кружки на сплошной линии соответствуют группе В, а пустые кружки на пунктирной линии соответствуют группе С распределением испытуемых соединений и носителя по группам. На фиг. 38С показан базовый уровень глюкозы в 06ТТ 1 и 06ТТ 2 в терминах АИС, при этом фактурный столбец соответствует группе А, полутоновой столбец соответствует группе В, а пустой столбец соответствует группе С. Фиг. 38Ό показывает базовый вес тела, при этом фактурный столбец соответствует группе А, полутоновой столбец соответствует группе В, а пустой столбец соответствует группе С.
На фиг. 39 представлен график, показывающий влияние носителя, Е6Е21 и Ес-Е6Е21(К.6) на вес тела у обезьян резус, при этом полутоновые столбцы 1 и 2 соответствуют 1-й и 2-й неделям на низкой дозе, пустые столбцы 3 и 4 соответствуют 3-й и 4-й неделям на средней дозе, закрашенные столбцы 5 и 6 соответствуют 5-й и 6-й неделям на высокой дозе, а фактурные столбцы 7, 8 и 9 соответствуют периоду отмывания (с 7-й по 9-ю неделю).
На фиг. 40 представлен график, показывающий процентное изменение уровня инсулина натощак по отношению к базовому уровню у обезьян резус для носителя, Е6Е21 и Ес-Е6Е21(К.6), при этом полутоновые столбцы 1 и 2 соответствуют 1-й и 2-й неделям на низкой дозе, пустые столбцы 3 и 4 соответствуют 3-й и 4-й неделям на средней дозе, закрашенные столбцы 5 и 6 соответствуют 5-й и 6-й неделям на высокой дозе, а фактурные столбцы 7 и 8 соответствуют 7-й и 8-й неделе в период отмывания.
На фиг. 41 представлен график, показывающий влияние носителя, Е6Е21 и Ес-Е6Е21(К.6) при введении высокой дозы на уровень инсулина у обезьян резус после кормления на 5-й и 6-й неделе исследования, при этом закрашенные столбцы соответствуют 5-й неделе, а полутоновые столбцы соответствуют 6-й неделе.
На фиг. 42 представлен график, показывающий профили глюкозы в ходе теста 06ТТ5 (пероральный тест на толерантность к глюкозе), проведенного в конце двухнедельного лечения высокими дозами Ес-Е6Е21(К.6), при этом закрашенные кружки на сплошной линии соответствуют носителю, пустые квадраты на пунктирной линии соответствуют Е6Е21, а закрашенные треугольники на сплошной линии соответствуют Ес-Е6Е21(К.6).
На фиг. 43 представлен график, показывающий профили инсулина в ходе теста 06ТТ5, проведенного в конце двухнедельного лечения высокими дозами Ес-Е6Е21(К6), при этом закрашенные кружки на сплошной линии соответствуют носителю, пустые квадраты на пунктирной линии соответствуют Е6Е21, а закрашенные треугольники на сплошной линии соответствуют Ес-Е6Е21(К6).
На фиг. 44 представлен график, показывающий АИС 1-3 глюкозы в ходе теста 06ТТ, проведенном в конце каждого периода введения доз (низкой, средней и высокой дозы) обезьянам резус, при этом пустые столбцы соответствуют АИС3, рассчитанной по результатам измерений глюкозы в 06ТТ3, закра
- 6 017690 шенные столбцы соответствуют АИС4. рассчитанной по результатам измерений глюкозы в ОСТТ4. а полутоновые столбцы соответствуют АИС5. рассчитанной по результатам измерений глюкозы в ОСТТ5.
На фиг. 45 представлен график. показывающий влияние носителя. Р0Р21 и Рс-РОР21(ВО) на процентное изменение уровня триглицеридов в плазме по сравнению с базовым уровнем в каждой группе обезьян резус. при этом полутоновые столбцы 1 и 2 соответствуют 1-й и 2-й неделям на низкой дозе. пустые столбцы 3 и 4 соответствуют 3-й и 4-й неделям на средней дозе. закрашенные столбцы 5 и 6 соответствуют 5-й и 6-й неделям на высокой дозе. а фактурные столбцы 7. 8 и 9 соответствуют периоду отмывания (с 7-й по 9-ю неделю).
На фиг. 46 представлен график. показывающий уровень триглицеридов в плазме после кормления в каждой группе обезьян резус по результатам измерений на пятой и шестой неделях лечения носителем. РОР21 или Рс-РОР21(ВО) в высокой дозе. при этом полутоновые столбцы соответствуют 5-й неделе. а закрашенные столбцы соответствуют 6-й неделе.
Фиг. 47 представляет собой график. показывающий индивидуальный уровень РОР21 у обезьяны по результатам измерений перед началом введения доз. а также в 5. 12. 19 и 26 дни при взятии образцов приблизительно через 21 ч после каждой инъекции.
На фиг. 48 представлен график. показывающий индивидуальный уровень Рс-РОР21(ВО) у обезьяны по результатам измерений перед началом введения доз. а также в 5. 12. 19 и 26 дни при взятии образцов приблизительно через 5 дней после каждой инъекции.
На фиг. 49 представлен график. показывающий средние концентрации РОР21 и Рс-РОР21(ВО) по результатам измерений в ходе трех тестов ОСТТ. проведенных после введения каждой дозы (низкой. средней и высокой). при этом полутоновые столбцы соответствуют ОСТТ3 с низкой дозой. закрашенные столбцы соответствуют ОСТТ4 со средней дозой. а пустые столбцы соответствуют ОСТТ5 с высокой дозой.
Подробное описание изобретения
Белок человека БСБ21. обладающий улучшенными свойствами. в частности удлиненным периодом полувыведения и/или уменьшенной агрегацией. может быть изготовлен способами. раскрытыми в настоящем описании и стандартными способами молекулярной биологии. Факультативно можно дополнительно увеличить период полувыведения. гибридизируя антитело или его часть с Ν-концевым или Сконцевым участком последовательности БСБ21 дикого типа. Также можно дополнительно увеличить период полувыведения или уменьшить агрегацию белка БСБ21 дикого типа. вводя в этот белок аминокислотные замещения. Такие модифицированные белки упоминаются в данном документе как мутанты или мутанты БСБ21 и формируют варианты осуществления настоящего изобретения.
Способы рекомбинантных нуклеиновых кислот. упоминаемые в данном описании. включая примеры. в целом представляют собой способы. сформулированные в опубликованных источниках 8атЬтоок с1 а1.. Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬота1оту Мапиа1 (Со1б 8ртшд НагЬог ЬаЬота1оту Ргекк. 1989) или Сштеи! Рто1осо1к ίη Мо1еси1аг Вю1оду (АикиЬе1 е1 а1.. ебк.. Сгееи РиЬНкйегк 1ис. аиб \УПеу аиб 8оик 1994). причем оба указанных источника включены в настоящее описание в качестве ссылки с любой целью.
1. Общие термины и определения.
Термин выделенная молекула нуклеиновой кислоты относится к молекуле нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. которая: (1) была отделена как минимум приблизительно от 50% белков. липидов. углеводов или других материалов. вместе с которыми она встречается в природе. когда тотальную нуклеиновую кислоту выделяют из клеток-источников. (2) не сцеплена со всем полинуклеотидом или частью полинуклеотида. с которыми выделенная молекула нуклеиновой кислоты сцеплена в природе.
(3) функционально связана с полинуклеотидом. с которым она не связана в природе. или (4) не встречается в природе как часть большей полинуклеотидной последовательности. Предпочтительно. чтобы выделенная молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению была. по существу. свободна от любых других загрязняющих молекул нуклеиновой кислоты или от других загрязнений. которые обнаруживаются в природном окружении и которые могли бы помешать ее применению в выработке полипептида или ее терапевтическому. диагностическому. профилактическому применению или применению в научно-исследовательских целях.
Термин вектор употребляется для обозначения любой молекулы (например. нуклеиновой кислоты. плазмиды или вируса). используемой для переноса кодирующей информации в клетку-хозяина.
Термин вектор экспрессии относится к вектору. который пригоден для трансформации клеткихозяина и содержит последовательности нуклеиновой кислоты. которые направляют и/или контролируют экспрессию вставленных гетерологичных последовательностей нуклеиновой кислоты. Экспрессия включает. но не ограничиваясь ими. такие процессы как транскрипция. трансляция и сплайсинг РНК. если присутствуют интроны.
Термин функционально связанный (-ая. -ое) употребляется в данном документе для обозначения компоновки фланкирующих последовательностей. при этом фланкирующие последовательности. описанные таким образом. сконфигурированы или собраны так. что выполняют свою обычную функцию. Итак. фланкирующая последовательность. функционально связанная с кодирующей последовательностью. может быть способной вызывать репликацию. транскрипцию и/или трансляцию кодирующей по
- 7 017690 следовательности. Например, кодирующая последовательность функционально связана с промотором, если промотор способен управлять транскрипцией этой кодирующей последовательности. Фланкирующая последовательность не обязательно должна примыкать к кодирующей последовательности до тех пор, пока она правильно функционирует. Так, например, между промоторной последовательностью и кодирующей последовательностью могут быть вставлены промежуточные не транслируемые, но еще транскрибируемые последовательности, при этом промоторная последовательность, по-прежнему, может считаться функционально связанной с кодирующей последовательностью.
Термин клетка-хозяин употребляется для обозначения клетки, которая была трансформирована или способна к трансформации последовательностью нуклеиновой кислоты, после чего она экспрессирует представляющий интерес ген. Этот термин включает потомство родительской клетки независимо от того, идентично ли оно или не идентично первоначальному родителю по морфологии или генетической структуре до тех пор, пока клетка экспрессирует избранный ген.
Термин выделенный полипептид относится к полипептиду по настоящему изобретению, который:
(1) был отделен как минимум приблизительно от 50% полинуклеотидов, липидов, углеводов или других материалов, вместе с которыми он встречается в природе, когда его выделяют из клеток-источников, (2) не связан (посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия) со всем полипептидом или частью полипептида, с которыми выделенный полипептид связан в природе, (3) функционально связан (посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия) с полипептидом, с которым он не связан в природе, или (4) не встречается в природе. Предпочтительно, чтобы выделенный полипептид был, по существу, свободен от любых других загрязняющих полипептидов или от других загрязнений, которые обнаруживаются в природном окружении и которые могли бы помешать его применению в терапевтических, диагностических, профилактических или научно-исследовательских целях.
Термин встречающийся в природе применительно к таким биологическим материалам, как молекулы нуклеиновых кислот, полипептиды, клетки-хозяева и т.п., относится к материалам, которые встречаются в природе и не подвергаются манипуляциям со стороны человека. Сходным образом, термин не встречающийся в природе при использовании в данном документе относится к материалу, который не встречается в природе либо был структурно модифицирован или синтезирован человеком. При использовании по отношению к нуклеотидам термин встречающийся в природе относится к таким основаниям, как аденин (А), цитозин (С), гуанин (С), тимин (Т) и урацил (И). При использовании по отношению к аминокислотам термин встречающаяся в природе относится к следующим 20 аминокислотам: аланин (А), цистеин (С), аспарагиновая кислота (Ό), глутаминовая кислота (Е), фенилаланин (Е), глицин (С), гистидин (Н), изолейцин (I), лизин (К), лейцин (Ь), метионин (М), аспарагин (Ν), пролин (Р), глутамин (О), аргинин (К), серин (8), треонин (Т), валин (V), триптофан (А) и тирозин (Υ).
Термин полипептид ЕСЕ21 относится к встречающемуся в природе полипептиду дикого типа, экспрессируемому у человека. В целях этого раскрытия изобретения термин полипептид ЕСЕ21 может использоваться взаимозаменяемо любого полноразмерного полипептида ЕСЕ21, например 8ЕС ΙΌ N0: 2, который состоит из 209 аминокислотных остатков и который кодируется нуклеотидной последовательностью 8ЕС ΙΌ N0: 1; любая зрелая форма полипептида, 8ЕС ΙΌ N0: 4, которая состоит из 181 аминокислотного остатка и которая кодируется нуклеотидной последовательностью 8ЕС ΙΌ N0: 3, в которой 28 аминокислотных остатков на аминоконце полноразмерного полипептида ЕСЕ21 (например, составляющих сигнальный пептид) были удалены, а также их варианты. Термины мутант полипептида ЕСЕ21 и мутант ЕСЕ21 относятся к варианту полипептида ЕСЕ21, в котором природная аминокислотная последовательность ЕСЕ21 была модифицирована. Такие модификации включают, но не ограничиваясь ими, одно или более аминокислотных замещений, включая замещения на аналоги аминокислот, не встречающиеся в природе, и усечения. Таким образом, мутанты полипептида ЕСЕ21 включают, но не ограничиваясь ими, сайт-специфические мутанты ЕСЕ21, усеченные полипептиды ЕСЕ21, мутанты ЕСЕ21, устойчивые к протеолизу, мутанты ЕСЕ21 с пониженной агрегацией, комбинаторные мутанты ЕСЕ21 и гибридные белки ЕСЕ21, как описано в данном документе. В целях идентификации специфических усечений и аминокислотных замещений в мутантах ЕСЕ21 по настоящему изобретению нумерация усеченных или мутированных аминокислотных остатков соответствует нумерации в зрелом полипептиде ЕСЕ21, состоящем из 181 аминокислотного остатка.
В других вариантах осуществления настоящего изобретения мутант полипептида ЕСЕ21 включает аминокислотную последовательность, которая как минимум на 85% идентична аминокислотной последовательности 8ЕС ΙΌ N0: 4, но в которой специфические остатки, придающие мутантному полипептиду ЕСЕ21 желательные свойства, например устойчивость к протеолизу, увеличенный период полувыведения, сниженную агрегацию или их комбинации, не были дополнительно модифицированы. Иными словами, за исключением тех остатков в мутантной последовательности ЕСЕ21, которые были модифицированы для придания полипептиду устойчивости к протеолизу, сниженной способности к агрегации или других свойств, модифицированными могут быть приблизительно 15% всех других аминокислотных остатков в мутантной последовательности ЕСЕ21. Например, в мутанте ЕСЕ21 С173Е могут быть модифицированы до 15% всех других аминокислотных остатков в дополнение к остатку глутаминовой кислоты, который был замещен на глутамин в положении 173. В других вариантах осуществления изобретения
- 8 017690 мутантный полипептид РСР21 включает аминокислотную последовательность, которая как минимум приблизительно на 90% или приблизительно на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 4, но в которой специфические остатки, придающие мутантному полипептиду РСР21 свойства устойчивости к протеолизу или пониженной способности к агрегации, не были дополнительно модифицированы. Такие мутанты полипептида РСР21 обладают как минимум одним видом активности полипептида РСР21 дикого типа.
Настоящее изобретение также охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутант полипептида РСР21. включающий аминокислотную последовательность, которая как минимум приблизительно на 85% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 4, но в которой специфические остатки, придающие мутантному полипептиду РСР21 желательные свойства, например устойчивость к протеолизу, увеличенный период полувыведения, сниженную агрегацию или их комбинации, не были дополнительно модифицированы. Иными словами, за исключением нуклеотидов, кодирующих те остатки в мутантной последовательности РСР21, которые были модифицированы для придания полипептиду устойчивости к протеолизу, сниженной способности к агрегации или других свойств, модифицированными могут быть приблизительно 15% всех других нуклеотидов в мутантной последовательности, кодирующей РСР21. Например, в молекуле, кодирующей мутант РСР21 Р173Е, могут быть модифицированы до 15% всех других нуклеотидов в дополнение к нуклеотидам, кодирующим остаток глутаминовой кислоты, который был замещен на глутамин в положении 173. Настоящее изобретение также охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую мутантный полипептид РСР21, включающий аминокислотную последовательность, которая как минимум приблизительно на 90% или приблизительно на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 4, но в которой специфические остатки, придающие мутантному полипептиду РСР21 свойства устойчивости к протеолизу или пониженной способности к агрегации, не были дополнительно модифицированы. Такие мутанты РСР21 обладают как минимум одним видом активности полипептида РСР21 дикого типа.
Настоящее изобретение также охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, которая как минимум приблизительно на 85% идентична нуклеотидной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 3, но в которой нуклеотиды, кодирующие аминокислотные остатки, которые придают кодируемому мутантному полипептиду РСР21 устойчивость к протеолизу, пониженную способность к агрегации или другие желательные свойства, не были дополнительно модифицированы. Говоря другими словами, за исключением тех остатков в мутантной последовательности РСР21, которые были модифицированы для придания полипептиду устойчивости к протеолизу, сниженной способности к агрегации или других свойств, модифицированными могут быть приблизительно 15% всех других аминокислотных остатков в мутантной последовательности РСР21. Например, в мутанте РСР21 Ц173Е могут быть модифицированы до 15% всех других аминокислотных остатков в дополнение к остатку глутаминовой кислоты, который был замещен на глутамин в положении 173. Далее, настоящее изобретение охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, включающую нуклеотидную последовательность, которая как минимум приблизительно на 90% или приблизительно на 95, 96, 97, 98 или 99% идентична аминокислотной последовательности 8ЕЦ ГО N0: 3, но в которой нуклеотиды, кодирующие аминокислотные остатки, которые придают кодируемому мутантному полипептиду РСР21 свойства устойчивости к протеолизу или пониженной способности к агрегации, не были дополнительно модифицированы. Такие молекулы нуклеиновых кислот кодируют мутанты РСР21, обладающие как минимум одним видом активности полипептида РСР21 дикого типа.
Термин биологически активный мутант полипептида РСР21 относится к любому мутантному полипептиду РСР21, описанному в данном документе, который обладает активностью полипептида РСР21 дикого типа, в частности способностью понижать уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина в крови, уменьшать вес тела и улучшать толерантность к глюкозе, потребление энергии или чувствительность к инсулину независимо от числа модификаций, введенных в мутант полипептида РСР21. Мутантные полипептиды РСР21, обладающие в некоторой степени пониженным уровнем активности РСР21 по сравнению с полипептидом РСР21 дикого типа, могут, тем не менее, считаться биологически активными мутантами полипептида РСР21.
Каждый из терминов эффективное количество и терапевтически эффективное количество относится к мутантному полипептиду РСР21, применяемому для поддержания наблюдаемого уровня одного или более видов биологической активности полипептида РСР21 дикого типа, в частности способности понижать уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина в крови, снижать вес тела или улучшать толерантность к глюкозе, потребление энергии или чувствительность к инсулину.
Термин фармацевтически приемлемый носитель или физиологически приемлемый носитель при использовании в данном документе относится к одному или более рецептурных материалов, пригодных для осуществления или улучшения доставки мутантного полипептида РСР21.
Термин антиген относится к молекуле или части молекулы, которые способны связываться с антителом и, кроме того, их можно использовать на животных для выработки антител, которые способны связывать эпитоп антигена. Антиген может иметь один или более эпитопов.
Термин нативный Рс относится к молекуле или последовательности, включающей последова
- 9 017690 тельность неантигенсвязывающего фрагмента и полученной в результате расщепления целого антитела или выработанной другими средствами как в мономерной, так и в мультимерной форме, которая может содержать шарнирный участок. Предпочтительный первоначальный иммуноглобулиновый источник нативного Ес имеет человеческое происхождение и представляет собой любой из иммуноглобулинов, хотя более предпочтительны 1дО1 и 1дО2. Нативные молекулы Ес состоят из мономерных полипептидов, которые могут быть соединены в димерные или мультимерные формы посредством ковалентной (т.е. по типу дисульфидных связи) и нековалентной ассоциации. Число межмолекулярных дисульфидных связей между мономерными субъединицами нативных молекул Ес варьируется от 1 до 4 в зависимости от класса (например, 1дС. 1дА и 1дЕ) или подкласса (например, 1дО1, 1дО2, 1дС3. 1дА1 и 1дСА2). Один из примеров нативного Ес представляет собой дисульфидно связанный димер, полученный в результате папаинового расщепления 1дС (см. ЕШкоп с1 а1., 1982, Ыис1е1с Ас1бк Кек. 10: 4071-9). Термин нативный Ес при использовании в данном документе обобщает мономерные, димерные и мультимерные формы. Пример полипептидной последовательности Ес представлен в 8ЕО Ш N0: 13.
Термин вариант Ес относится к молекуле или последовательности, которые модифицированы из нативного Ес, но еще включают сайт связывания для рецептора утилизации, ЕсКп (рецептор Ес новорожденных). Международные патентные публикации №№ XV 0 97/34631 и XV0 96/32478 описывают типичные варианты Ес, а также их взаимодействие с рецептором утилизации, в связи с чем указанные публикации включены в этот документ в качестве ссылки. Таким образом, термин вариант Ес может включать молекулу или последовательность, которые гуманизированы из нативного Ес нечеловеческого происхождения. Кроме того, нативный Ес включает участки, которые можно удалить, поскольку они обеспечивают структурные признаки биологической активности, не являющиеся необходимыми для гибридных молекул мутантов Е0Е21, соответствующих настоящему изобретению. Таким образом, термин вариант Ес включает молекулу или последовательность, в которых один или более сайтов или остатков нативного Ес утрачены или модифицированы, что влияет на: (1) образование дисульфидных связей, (2) несовместимость с выбранной клеткой-хозяином, (3) Ν-концевую гетерогенность при экспрессии в выбранной клетке-хозяине, (4) гликозилирование, (5) взаимодействие с комплементом, (6) связывание с другим рецептором Ес, нежели рецептор утилизации, или (7) антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЭСС). Варианты Ес более подробно описаны в данном документе ниже.
Термин домен Ес охватывает нативный Ес, варианты Ес и их последовательности в соответствии с данными выше определениями. Как в отношении вариантов Ес, так и в отношении нативных молекул Ес термин домен Ес включает молекулы в мономерной или мультимерной форме, полученные в результате расщепления целого антитела или выработанные другими средствами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Ес может быть соединен с Е0Е21 или мутантом Е0Е21 (включая усеченную форму Е0Е21 или мутанта Е0Е21) посредством, например, ковалентной связи между доменом Ес и последовательностью Е0Е21. Такие составные белки могут образовывать мультимеры через ассоциацию доменов Ес, при этом как составные белки, так и их мультимеры являются аспектом настоящего изобретения.
2. Сайт-специфические мутанты Е0Е21.
Термин сайт-специфический мутант Е0Е21 или замещенный мутант Е0Е21 относится к мутантному полипептиду Е0Е21, имеющему аминокислотную последовательность, которая отличается от аминокислотной последовательности природного полипептида Е0Е21, например 8Е0 Ш N0:2, 8Е0 Ш N0: 4 и их вариантов. Сайт-специфические мутанты Е0Е21 можно создавать, вводя аминокислотные замещения, консервативные или неконсервативные, и используя как встречающиеся, так и не встречающиеся в природе аминокислоты в специфических положениях полипептида Е0Е21.
Консервативное аминокислотное замещение может включать замещение нативного аминокислотного остатка (т.о. остатка, обнаруживаемого в данном положении полипептидной последовательности Е0Е21 дикого типа) на ненативный остаток (т.н. остаток, который не обнаруживается в данном положении полипептидной последовательности Е0Е21 дикого типа), при этом не происходит никаких влияний или происходят очень незначительные влияния на полярность или заряд аминокислотного остатка в данном положении. Консервативные аминокислотные замещения также охватывают не встречающиеся в природе аминокислотные остатки, которые обычно встраиваются посредством химического пептидного синтеза, а не синтеза в биологических системах. Они включают пептидомиметики и другие реверсированные или инвертированные формы аминокислотных компонентов.
Встречающиеся в природе аминокислотные остатки можно подразделить на классы, основываясь на общих свойствах боковой цепи:
(1) гидрофобные: норлейцин (попеисше), Мер А1а, Уа1, Ьеи, Не;
(2) нейтральные гидрофильные: Сук, 8ет, Тйт;
(3) кислотные: Акр, О1и;
(4) основные: Акп, О1п, Н1к, Ьук, Агд;
(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: О1у, Рго; и (6) ароматические: Тгр, Туг, Рйе.
Консервативные замещения могут включать замену члена одного из этих классов другим членом
- 10 017690 того же класса. Неконсервативные замещения могут включать замену члена одного из этих классов другим членом другого класса.
Желательные аминокислотные замещения (как консервативные, так и неконсервативные) могут определить компетентные специалисты в данной области в то время, когда такие замены понадобятся. Типичный (но не ограничивающий) список аминокислотных замещений представлен в табл. 1.
Таблица 1
Аминокислотные замещения
3. Усеченные полипептиды РСР21.
Один из вариантов осуществления настоящего изобретения относится к усеченным формам зрелого полипептида РОР21. Этот вариант осуществления настоящего изобретения возник в связи с попыткой выявить усеченные полипептиды РОР21, которые способны обеспечивать активность, равную активности не усеченных форм зрелого полипептида РОР21, а в некоторых случаях превосходящую ее.
При использовании в настоящем описании термин усеченный полипептид РОР21 относится к полипептиду РОР21, в котором были удалены аминокислотные остатки из аминоконцевого (или Ν’концевого участка) полипептида РОР21, были удалены аминокислотные остатки из карбоксиконцевого (или С-концевого) участка полипептида РОР21 или были удалены аминокислотные остатки как из аминоконцевого, так и из карбоксиконцевого участков полипептида РОР21. Различные усечения, раскрытые в настоящем документе, были подготовлены так, как это изложено в примерах 3 и 6.
Активность полипептидов РОР21, усеченных на Ν-конце, и полипептидов РОР21, усеченных на Сконце, можно оценивать, применяя анализ на ЕЬК-люциферазу ίη νίίτο, как это описано в примере 4. Специфические подробности анализов ίη νίίτο, которые можно применять для исследования активности усеченных полипептидов РОР21, можно найти в примере 4.
Активность усеченных полипептидов Р0Р21 по настоящему изобретению также можно оценивать в анализе ίη νίνο, таком как анализ на мышах оЬ/оЬ, описанный в примерах 5 и 7. В целом, для оценки активности усеченного полипептида Р0Р21 ίη νίνο этот усеченный полипептид можно ввести животному, используемому для тестирования, внутрибрюшинно. После нужного периода инкубации (например, 1 ч или более) можно взять образец крови и измерить уровень глюкозы. Специфические подробности анализов ίη νίνο, которые можно применять для исследования активности усеченных полипептидов Р0Р21, можно найти в примерах 5 и 7.
- 11 017690
a. Ν-концевые усечения.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения Ν-концевые усечения включают 17 или 8 аминокислотных остатков из Ν-концевого участка зрелого полипептида ЕСЕ21. Как продемонстрировано в примере 5 и на фиг. 3, усеченные полипептиды ЕСЕ21. имеющие концевые усечения длиной менее 9 аминокислотных остатков. сохраняют способность зрелого полипептида ЕСЕ21 понижать уровень глюкозы в крови субъекта.
В соответствии с этим. в специфических вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает усеченные формы зрелого полипептида ЕСЕ21 или мутантных полипептидов ЕСЕ21. имеющих Νконцевые усечения 1-7 или 8 аминокислотных остатков.
b. С-концевые усечения.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения С-концевые усечения включают 111 или 12 аминокислотных остатков из С-концевого участка зрелого полипептида ЕСЕ21. Как продемонстрировано в примере 4 и на фиг. 1В. усеченные полипептиды ЕСЕ21. имеющие С-концевые усечения длиной менее 13 аминокислотных остатков. демонстрируют эффективность на уровне как минимум 50% эффективности ЕСЕ21 дикого типа в анализе на ЕЬК-люциферазу ίη νίίτο. указывающую на то. что эти мутанты ЕСЕ21 сохраняют способность зрелого полипептида ЕСЕ21 понижать уровень глюкозы в крови субъекта. В соответствии с этим. в специфических вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает усеченные формы зрелого полипептида ЕСЕ21 или мутантных полипептидов ЕСЕ21. имеющих С-концевые усечения 1-11 или 12 аминокислотных остатков.
c. Ν-концевые и С-концевые усечения.
С некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения усеченные полипептиды ЕСЕ21 могут иметь сочетанные Ν-концевые и С-концевые усечения. Усеченные полипептиды ЕСЕ21. имеющие сочетание Ν-концевых и С-концевых усечений. сохраняют активность соответствующих усеченных полипептидов ЕСЕ21. имеющих только Ν-концевые или С-концевые усечения. Говоря иначе. усеченные полипептиды ЕСЕ21. имеющие как Ν-концевые усечения длиной менее 9 аминокислотных остатков. так и С-концевые усечения длиной менее 13 аминокислотных остатков. обладают такой же или даже большей активностью по снижению уровня глюкозы в крови. чем усеченные полипептиды ЕСЕ21. имеющие только Ν-концевые усечения длиной менее 9 аминокислотных остатков или С-концевые усечения длиной менее 13 аминокислотных остатков. В соответствии с этим. в специфических вариантах осуществления настоящее изобретение охватывает усеченные формы зрелого полипептида ЕСЕ21 или мутантных полипептидов ЕСЕ21. имеющих Ν-концевые усечения 1-7 или 8 аминокислотных остатков и С-концевые усечения 1-11 или 12 аминокислотных остатков.
Как и в отношении всех мутантов ЕСЕ21 по настоящему изобретению. усеченные полипептиды ЕСЕ21 могут в необязательном порядке включать аминоконцевой остаток метионина. который можно ввести посредством направленной мутации или в результате процесса бактериальной экспрессии.
Усеченные полипептиды ЕСЕ21 по настоящему изобретению можно изготовить так. как это описано в примерах 3 и 6. Средний специалист в данной области. знакомый со стандартными методиками молекулярной биологии. сможет употребить свои знания вместе со сведениями. представленными в настоящем раскрытии изобретения. чтобы изготовлять и применять усеченные полипептиды ЕСЕ21 по настоящему изобретению. Для рекомбинантной ДНК. олигонуклеотидного синтеза. тканевой культуры и трансформации можно использовать стандартные методики (например. электропорацию. липофекцию); см.. например. публикацию ЗашЬтоок с1 а1.. Мо1еси1аг Οΐοηίη^: А каЬогаЮгу Мапиа1.. выше. которая включена в этот документ в качестве ссылки с любой целью. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей. как это общепринято в данной области техники или описано в настоящем документе. Если не представлены специальные определения. номенклатура. используемая в данном документе применительно к лабораторным процедурам и методикам аналитической химии. синтетической органической химии. медицинской и фармацевтической химии. представлена хорошо известной и общепринятой номенклатурой в данной области. Для химического синтеза. химических анализов. изготовления фармацевтических препаратов. рецептурных составов. их доставки и для лечения больных можно использовать стандартные методики.
Усеченные полипептиды ЕСЕ21 по настоящему изобретению также можно соединять с другим компонентом. который способен придать усеченному полипептиду ЕСЕ21 дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения усеченный полипептид ЕСЕ21 может быть соединен с последовательностью Ес. Такое слияние можно осуществить. применяя известные способы молекулярной биологии и/или руководящие указания. представленные в данном документе. Преимущества таких составных полипептидов. а также способы изготовления таких составных полипептидов будут обсуждаться в данном документе более подробно.
4. Мутанты ЕСЕ21. устойчивые к протеолизу.
Как указано в примере 8. было обнаружено. что зрелый ЕСЕ21 подвергается разрушению ίη νίνο. которое. в конечном итоге. является результатом протеолитической атаки. Было обнаружено. что разрушение зрелого ЕСЕ21 ίη νίνο укорачивает эффективный период его полувыведения. а это. в свою очередь. отрицательно влияет на терапевтический потенциал молекулы. В соответствии с этим. было прове
- 12 017690 дено целенаправленное исследование по идентификации мутантов РСР21, которые проявляют устойчивость к протеолизу. В результате этого исследования было определено, что сайты в молекуле зрелого полипептида РСР21, которые особенно чувствительны к протеолизу, включают аминокислотные остатки в положениях 4-5, 20-21, 151-152 и 171-172.
Было проведено широкое, но сфокусированное и целенаправленное исследование по идентификации специфических замещений, которые устраняют наблюдаемый протеолитический эффект, хотя при этом не влияют на активность белка в недопустимой степени. Табл. 8 и 11 представляют некоторые из полученных и протестированных мутантов. Как описано в примерах 13 и 14, не все мутанты РСР21 демонстрируют идеальный профиль: одни мутанты, приобретая устойчивость к протеолизу, утрачивали или снижали полезную активность РСР21, а другие мутанты сохраняли активность РСР21, но не приобретали устойчивости к протеолизу. Некоторые мутанты, включая, например, РСР21 Р171С, сохраняли уровень активности, сходный с РСР21 дикого типа, и в то же время демонстрировали устойчивость к протеолитическому разрушению.
Один из критериев отбора при идентификации желательных мутантов РСР21. устойчивых к протеолизу, заключался в том, чтобы активность мутанта РСР21 была, по существу, такой же или даже большей по сравнению с активностью РСР21 дикого типа. Следовательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения направлен на мутанты РСР21, которые устойчивы к протеолизу, но при этом сохраняют активность, которая, по существу, не отличается от активности РСР21 дикого типа или превышает ее. Хотя в некоторых случаях это менее желательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения связан с мутантами РСР21, которые устойчивы к протеолизу, но проявляют в некоторой степени сниженную активность. В некоторых случаях может оказаться желательным поддерживать протеолиз, вследствие чего мутанты РСР21, которые допускают некоторую степень протеолиза, формируют еще один вариант осуществления настоящего изобретения.
Как и все мутанты РСР21 по настоящему изобретению, мутанты РСР21, устойчивые к протеолизу, можно изготовить так, как описано в данном документе. Специалисты в данной области, например, знающие стандартные методики молекулярной биологии, смогут употребить свои знания вместе со сведениями, представленными в настоящем раскрытии изобретения, чтобы изготовлять и применять мутанты РСР21, устойчивые к протеолизу, в соответствии с настоящим изобретением. Для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, тканевой культуры и трансформации можно использовать стандартные методики (например, электропорацию, липофекцию); см., например, публикацию 8атЬтоок с1 а1., Мо1еси1аг С1ошпд: А БаЬогаЮгу Мапиа1., выше, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки с любой целью. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей, как это общепринято в данной области техники или описано в настоящем документе. Если не представлены специальные определения, номенклатура, используемая в данном документе применительно к лабораторным процедурам и методикам аналитической химии, синтетической органической химии, медицинской и фармацевтической химии, представлена хорошо известной и общепринятой номенклатурой в данной области. Для химического синтеза, химических анализов, изготовления фармацевтических препаратов, рецептурных составов, их доставки и для лечения больных можно использовать стандартные методики.
Мутанты РСР21, устойчивые к протеолизу, можно соединять с другим компонентом, который способен придать мутанту РСР21, устойчивому к протеолизу, дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения устойчивый к протеолизу мутант РСР21 можно соединить с последовательностью Рс 1дС, например 8Е0 ГО N0: 13. Такое слияние можно осуществить, применяя известные способы молекулярной биологии и/или руководящие указания, представленные в данном документе. Преимущества таких составных полипептидов, а также способы изготовления таких составных полипептидов известны и будут обсуждаться в данном документе более подробно.
5. Мутанты РСР21 с пониженной агрегацией.
Как описано в примере 15, одним из свойств полипептида РСР21 дикого типа является его склонность к агрегации. При концентрации свыше приблизительно 5 мг/мл степень агрегации высока при комнатной температуре. Как показано и описано в данном документе, степень агрегации для полипептида РСР21 дикого типа зависит как от концентрации, так и от температуры.
Агрегация может создать проблемы при работе с РСР21 дикого типа в этих концентрациях, например, в контексте составления терапевтической композиции. В соответствии с этим, было проведено целенаправленное исследование по идентификации мутантов РСР21, которые проявляют пониженную склонность к агрегации. Затем выявленные мутанты РСР21 были протестированы на склонность к агрегации в различных концентрациях.
Было проведено широкое, но сфокусированное и целенаправленное исследование по идентификации специфических замещений, которые устраняют наблюдаемый эффект агрегации для РСР21 дикого типа, но при этом не влияют на активность белка в недопустимой степени. Подход к идентификации подходящих мутантов с пониженной агрегацией описан в примере 15. В табл. 16 представлены некоторые полученные и протестированные мутанты. Как показано в примере 17, не все мутанты РСР21 проявляют идеальный профиль. Одни мутанты, такие как РСР21 Р58Е, имели сниженную активность РСР21 и
- 13 017690 не исследовались далее, а другие мутанты, такие как ЕСЕ21 А134Е, сохраняли активность ЕСЕ21. но не приобретали свойства пониженной склонности к агрегации. В то же время некоторые мутанты. такие как ЕСЕ21 Ь98К, не только сохраняли активность ЕОЕ21. но и демонстрировали пониженную агрегацию. Один мутант. Е0Е21 А45К. неожиданно проявил повышенную активность Е0Е21 наряду с пониженной склонностью к агрегации.
Один из критериев отбора при идентификации желательных мутантов Е0Е21. не склонных к агрегации. заключался в том. чтобы активность мутанта Е0Е21 была. по существу. сходной или даже большей по сравнению с активностью Е0Е21 дикого типа. Следовательно. еще один вариант осуществления настоящего изобретения направлен на мутанты Е0Е21. имеющие пониженную склонность к агрегации. но в то же время сохраняющие активность Е0Е21. которая сходна с активностью Е0Е21 дикого типа или превышает ее. Несмотря на то что в некоторых случаях это менее желательно. еще один вариант осуществления настоящего изобретения связан с мутантами Е0Е21. которые имеют пониженную склонность к агрегации. но проявляют в некоторой степени сниженную активность Е0Е21. В некоторых случаях может оказаться желательным поддерживать определенный уровень агрегации. вследствие чего мутанты Е0Е21. которые допускают некоторую степень агрегации. формируют еще один вариант осуществления настоящего изобретения.
Как и все мутанты Е0Е21 по настоящему изобретению. мутанты Е0Е21. обладающие пониженной склонностью к агрегации. можно изготовить так. как описано в данном документе. Средние специалисты в данной области. знакомые со стандартными методиками молекулярной биологии. смогут употребить свои знания вместе со сведениями. представленными в настоящем раскрытии изобретения. чтобы изготовлять и применять мутанты Е0Е21 с пониженной склонностью к агрегации. соответствующие настоящему изобретению. Для рекомбинантной ДНК олигонуклеотидного синтеза тканевой культуры и трансформации можно использовать стандартные методики (например. электропорацию. липофекцию); см.. например. 8атЬгоок с1 а1.. Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1.. выше. которая включена в этот документ в качестве ссылки с любой целью. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей. как это общепринято в данной области техники или описано в настоящем документе. Если не представлены специальные определения. номенклатура. используемая в данном документе применительно к лабораторным процедурам и методикам аналитической химии. синтетической органической химии. медицинской и фармацевтической химии. представлена хорошо известной и общепринятой номенклатурой в данной области. Для химического синтеза. химических анализов. изготовления фармацевтических препаратов. рецептурных составов. их доставки и для лечения больных можно использовать стандартные методики. Мутанты Е0Е21. не склонные к агрегации. можно соединять с другим компонентом. который способен придать мутанту Е0Е21. не склонному к агрегации. дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения не склонный к агрегации мутант Е0Е21 можно соединить с последовательностью Ес ΙβΟ. например 8ЕО ΙΌ N0: 13. Такое слияние можно осуществить. применяя известные способы молекулярной биологии и/или руководящие указания. представленные в данном документе. Преимущества таких составных полипептидов. а также способы изготовления таких составных полипептидов обсуждаются в данном документе более подробно.
6. Комбинированные мутанты Е0Е21.
Как описано в данном документе. последовательность Е0Е21 дикого типа обладает некоторыми свойствами. которые создают значительные проблемы при использовании Е0Е21 в качестве терапевтической молекулы. Среди этих проблем необходимо упомянуть чувствительность белка к разрушению и его склонность к агрегации в высоких концентрациях. После всесторонних попыток идентифицировать такие полипептиды Е0Е21. которые преодолевают каждую из этих проблем. было проведено целенаправленное исследование для определения того. можно ли скомбинировать аминокислотные замещения. придающие белку устойчивость к протеолизу. и замещения. понижающие склонность к агрегации. чтобы добиться аддитивного или синергического эффекта таких замещений в одной полипептидной последовательности. поддерживая при этом такой уровень активности. который соответствует активности Е0Е21 дикого типа или превосходит ее. Эта задача сложна для решения. поскольку в данной области знаний известно. что введение множественных мутаций в определенный полипептид иногда может отрицательно сказаться на экспрессии. активности и последующей выработке белка в производственных масштабах.
Неожиданно. как это продемонстрировано в примерах 19 и 20. было обнаружено. что желательные свойства нескольких мутантов Е0Е21. действительно. можно комбинировать аддитивным или синергическим образом. чтобы получить такой мутант Е0Е21. который обладает улучшенными фармацевтическими свойствами. В данном документе раскрыты мутанты Е0Е21. которые устойчивы к протеолизу. имеют пониженную степень агрегации. но при этом сохраняют такую активность. которая соответствует активности Е0Е21 дикого типа или превосходит ее.
Один из критериев отбора при идентификации желательных комбинированных мутантов Е0Е21 заключался в том. чтобы активность мутанта Е0Е21 была. по существу. сходной или даже большей по сравнению с активностью Е0Е21 дикого типа. Следовательно. еще один вариант осуществления настоящего изобретения направлен на мутанты Е0Е21. устойчивые к протеолизу и имеющие пониженную
- 14 017690 склонность к агрегации, но в то же время сохраняющие активность ЕСЕ21, которая сходна с активностью ЕСЕ21 дикого типа или превышает ее. Хотя в некоторых случаях это менее желательно, еще один вариант осуществления настоящего изобретения связан с мутантами ЕСЕ21, которые устойчивы к протеолизу и имеют пониженную склонность к агрегации, но проявляют в некоторой степени сниженную активность ЕСЕ21. В некоторых случаях может оказаться желательным поддерживать определенный уровень протеолиза и/или агрегации, вследствие чего мутанты ЕСЕ21, которые допускают некоторую степень протеолиза и/или агрегации, формируют еще один вариант осуществления настоящего изобретения.
Как и все мутанты ЕСЕ21 по настоящему изобретению, комбинированные мутанты ЕСЕ21, соответствующие этому изобретению, можно изготовить так, как описано в данном документе. Средние специалисты в данной области, знакомые со стандартными методиками молекулярной биологии, смогут употребить свои знания вместе со сведениями, представленными в настоящем раскрытии изобретения, чтобы изготовлять и применять комбинированные мутанты ЕСЕ21, соответствующие настоящему изобретению. Для рекомбинантной ДНК, олигонуклеотидного синтеза, тканевой культуры и трансформации можно использовать стандартные методики (например, электропорацию, липофекцию); см., например, 8ашЬгоок с1 а1., Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬога1огу Мапиа1., выше, которая включена в этот документ в качестве ссылки с любой целью. Ферментативные реакции и методики очистки можно проводить в соответствии со спецификациями производителей, как это общепринято в данной области техники или описано в настоящем документе. Если не представлены специальные определения, номенклатура, используемая в данном документе применительно к лабораторным процедурам и методикам аналитической химии, синтетической органической химии, медицинской и фармацевтической химии, представлена хорошо известной и общепринятой номенклатурой в данной области. Для химического синтеза, химических анализов, изготовления фармацевтических препаратов, рецептурных составов, их доставки и для лечения больных можно использовать стандартные методики.
Комбинированные мутанты ЕСЕ21, соответствующие настоящему изобретению, можно соединять с другим компонентом, который способен придать комбинированному мутанту ЕСЕ21 дополнительные свойства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения комбинированный мутант ЕСЕ21 можно соединить с последовательностью Ес 1дС. например 8ЕО ΙΌ N0: 13. Такое слияние можно осуществить, применяя известные способы молекулярной биологии и/или руководящие указания, представленные в данном документе. Преимущества таких составных полипептидов, а также способы изготовления таких составных полипептидов обсуждаются в данном документе более подробно.
7. Составные белки ЕСЕ21.
При использовании в данном документе термин составной полипептид ЕСЕ21 или составной белок ЕСЕ21 относится к соединению одного или более аминокислотных остатков (например, с образованием гетерологичного белка или пептида) на Ν-конце или С-конце любого мутантного полипептида ЕСЕ21, описанного в данном документе.
Гетерологичные пептиды и полипептиды включают, но не ограничиваясь ими, эпитоп, позволяющий выявить и/или выделить мутантный полипептид ЕСЕ21, трансмембранный рецепторный белок или его часть, такую как внеклеточный домен или трансмембранный и внутриклеточный домен, лиганд или часть лиганда, которые связываются с трансмембранным рецепторным белком, фермент или часть фермента, которые каталитически активны, пептид или полипептид, которые стимулируют олигомеризацию, например домен лейциновой застежки, пептид или полипептид, которые повышают стабильность, например, константный участок иммуноглобулина, функциональное или нефункциональное антитело либо его тяжелая или легкая цепь, а также полипептид, который обладает активностью, в частности терапевтической активностью, отличной от мутантных полипептидов ЕСЕ21 по настоящему изобретению. Настоящее изобретение также охватывает мутантов ЕСЕ21, соединенных с сывороточным альбумином человека (Н8А).
Составные белки ЕСЕ21 можно изготовить посредством соединения гетерологичных последовательностей или на Ν-конце, или на С-конце мутантного полипептида ЕСЕ21. Как описано в данном документе, гетерологичная последовательность может представлять собой аминокислотную последовательность или полимер, не содержащий аминокислот. Гетерологичные последовательности можно соединять с мутантным полипептидом ЕСЕ21 или напрямую, или через линкер/адаптерную молекулу. Линкер или адаптерная молекула могут представлять собой один или более аминокислотных остатков (или -меров), например 1-8 или 9 остатков (или -меров), предпочтительно от 10 до 50 аминокислотных остатков (или -меров), например 10-20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 остатков (или -меров) и более предпочтительно от 15 до 35 аминокислотных остатков (или -меров). Линкер или адаптерную молекулу также можно сконструировать с сайтом расщепления для рестрикционной ДНК-эндонуклеазы или для протеазы, что позволяет разделять соединенные компоненты.
а. Соединения с Ес.
В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мутантный полипептид ЕСЕ21 соединен с одним или более доменов участка Ес иммуноглобулина 1дС человека. Антитела включают две функционально независимые части, вариабельный домен, известный как ЕаЬ, который связывает антиген, и константный домен, известный как Ес, который вовлечен в такие эффекторные функции как ак
- 15 017690 тивация комплемента и атака фагоцитарными клетками. Домен Рс имеет длинный период полувыведения из сыворотки, тогда как домен РаЬ является короткоживущим (ί,’αροη с1 а1., 1989, №1иге 337: 525-31). При соединении с терапевтическим белком домен Рс может обеспечить более длительный период полувыведения или встроить такие функции, как связывание рецептора Рс, связывание белка А, фиксация комплемента и, возможно, даже перенос через плаценту (Οιροη с1 а1., 1989).
Фармакокинетический анализ ίη νίνο указывает на то, что РСР21 человека имеет короткий период полувыведения, который составляет у мышей приблизительно 1 ч, что связано с быстрым клиренсом и разрушением ίη νίνο. Следовательно, для удлинения периода полувыведения РСР21 последовательность Рс присоединяли к Ν- или С-концевому участку полипептида ЕСЕ21. Слияние участка Рс с ЕСЕ21 дикого типа, в особенности присоединение Рс к Ν-концу РСР21 дикого типа, вопреки ожиданиям, не удлиняло период полувыведения, однако это привело к исследованию протеолитического распада РСР21 ίη νίνο и к идентификации мутантов РСР21, которые были устойчивы к такому распаду. Такие мутанты, описанные в примерах 8 и 11, проявляют больший период полувыведения по сравнению с РСР21 дикого типа. Эти и другие составные белки РСР21 формируют варианты осуществления настоящего изобретения.
По всему тексту настоящего раскрытия изобретения обозначение Рс-РСР21 относится к составному белку, в котором последовательность Рс присоединена к Ν-концу РСР21. Сходным образом, обозначение Рс-РСР21 относится к составному белку, в котором последовательность Рс присоединена к С-концу РСР21.
Полученный в результате такого слияния составной белок РСР21 можно очистить, например, применяя колонку для аффинной хроматографии с белком А. Было обнаружено, что пептиды и белки, к которым присоединен участок Рс, проявляют ίη νίνο значительно более длительный период полувыведения по сравнению с негибридизированными аналогами. К тому же слияние с участком Рс создает возможность для димеризации/мультимеризации составного полииептида. Участок Рс может представлять собой участок Рс, встречающийся в природе, но также может подвергаться изменениям для улучшения определенных качеств, таких как терапевтические качества, время циркуляции или сниженная агрегация.
Полезные модификации белковых терапевтических средств за счет слияния с доменом Рс антитела подробно обсуждаются в Международной патентной публикации \νϋ 00/024782, содержание которой включено в этот документ в качестве ссылки во всей полноте. Этот документ обсуждает сцепление с транспортировщиком, таким как полиэтиленгликоль (ПЭГ), декстран или участок Рс.
Ь. Линкеры составных белков.
При формировании составных белков по настоящему изобретению можно, но не обязательно, использовать линкер. Если линкер представлен, его химическая структура не принципиальна, поскольку он, в первую очередь, служит спейсером. Линкер может состоять из аминокислот, сцепленных друг с другом посредством пептидных связей. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения линкер составлен из 1-20 аминокислот, сцепленных посредством пептидных связей, при этом аминокислоты выбраны из 20 аминокислот, встречающихся в природе. В различных вариантах осуществления изобретения от 1 до 20 аминокислот выбраны из глицина, серина, аланина, пролина, аспарагина, глутамина и лизина. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер составлен из большинства аминокислот, которые не испытывают стерических затруднений, таких как глицин и аланин. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкеры представляют собой полиглицины (такие как (С1у)4 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 29) и (С1у)5 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 30)), полиаланины, комбинации глицина и аланина (такие как поли(С1у-А1а)) или комбинации глицина и серина (такие как поли(О1у-8ег)). Другие подходящие линкеры включают: (61у)5-8ег-(61у)3-8ег-(61у)4-8ег (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 23), (61у)4-8ег-(61у)4-8ег-(61у)4-8ег (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 31), (О1у)э-Ьу8-(О1у)4 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 32), (61у)э-А8П-61у-8ег-(61у)2 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 33), (61у)3-Су8-(61у)4 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 34) и С1у-Рга-А5п-С1у-С1у (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 35). Несмотря на то что было обнаружено, что для составных белков РСР21 особенно хорош линкер из 15 аминокислот, настоящее изобретение рассматривает линкеры любой длины или любого состава.
Линкеры, описанные в данном документе, типичны, но настоящее изобретение также рассматривает линкеры, которые намного длиннее и могут включать другие аминокислотные остатки. Непептидные линкеры также рассматриваются в настоящем изобретении. Например, можно использовать алкильные линкеры, такие как -ХН-(СН2)8-С(О)-, в котором 5 = от 2 до 20. Далее, такие алкильные линкеры могут быть замещены любой стерически незатрудненной группой, включая, но не ограничиваясь ими, низший алкил (например, С1-С6), низший ацил, галоген (например, С1, Вг), СК, ΝΗ2 или фенил. Типичным непептидным линкером является полиэтиленгликолевый линкер, который имеет молекулярный вес от 100 до 5000 кДа, например от 100 до 500 кДа.
8. Химически модифицированные мутанты РСР21.
Химически модифицированные формы мутантных полипептидов РСР21, описанные в данном документе, включая усеченные формы РСР21, описанные в данном документе, могут быть изготовлены квалифицированным специалистом с учетом информации, представленной в этом раскрытии изобретения. Такие химически модифицированные мутанты РСР21 изменены таким образом, что они отличаются от не модифицированных мутантов РСР21 или по типу, или по локализации молекул, естественным образом прикрепленных к мутанту РСР21. Химически модифицированные мутанты РСР21 могут включать
- 16 017690 молекулы, образующиеся посредством удаления одной или более химических групп, прикрепленных естественным образом.
В одном из вариантов осуществления изобретения мутантные полипептиды Е6Е21 по настоящему изобретению могут быть модифицированы посредством ковалентного присоединения одного или более полимеров. Например, в типичном случае отобранный полимер растворим в воде, поэтому белок, к которому он присоединяется, не выпадает в осадок в водной среде, такой как физиологическая среда. В сферу пригодных полимеров включены смеси полимеров. В целях терапевтического использования препарата, являющегося конечным продуктом, предпочтительно, чтобы полимер был фармацевтически приемлемым. Нерастворимые в воде полимеры, конъюгированные с мутантными полипептидами Е6Е21 по настоящему изобретению, также формируют один из аспектов изобретения.
Типичные полимеры могут иметь любой молекулярный вес и быть разветвленными или неразветвленными. Каждый типичные полимер имеет средний молекулярный вес приблизительно от 2 до 100 кДа (термин приблизительно указывает на то, что в препаратах водорастворимых полимеров вес некоторых молекул будет отличаться в большую или меньшую сторону от заявленного молекулярного веса). Предпочтительно, чтобы средний молекулярный вес каждого полимера составлял приблизительно от 5 до 50 кДа, более предпочтительно приблизительно от 12 до 40 кДа и наиболее предпочтительно приблизительно от 20 до 35 кДа.
Подходящие водорастворимые полимеры или их смеси включают, но не ограничиваясь ими, N сцепленные или О-сцепленные углеводы, сахара, фосфаты, полиэтиленгликоль (ПЭГ) (включая такие формы ПЭГ, которые были использованы для получения производных белков, включая моно(С1-С10), алкокси- или арилоксиполиэтиленгликоль), монометоксиполиэтиленгликоль, декстран (такой как декстран низкого молекулярного веса, например приблизительно 6 кДа), целлюлозу или другие полимеры на углеводной основе, поли-Щ-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиоли (например, глицерин) и поливиниловый спирт. Настоящее изобретение также охватывает бифункциональные поперечно сшитые молекулы, которые могут быть использованы для получения ковалентно связанных мультимеров мутантных полипептидов Е6Е21. Настоящее изобретение также охватывает мутанты Е6Е21, ковалентно присоединенные к полисиаловой кислоте.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения мутант Е6Е21 ковалентно или химически модифицирован с присоединением одного или более водорастворимых полимеров, включая, но не ограничиваясь ими, полиэтиленгликоль (ПЭГ), полиоксиэтиленгликоль или пропиленгликоль; см., например, патенты США №№ 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 и 4179337. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения мутант Е6Е21 содержит один или более полимеров, включая, но не ограничиваясь ими, монометоксиполиэтиленгликоль, декстран, целлюлозу, другой полимер на углеводной основе, полиЩ-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимера полипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиоли (например, глицерин), поливиниловый спирт или смеси таких полимеров.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения мутант Е6Е21 ковалентно модифицирован субъединицами ПЭГ. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или более водорастворимых полимеров связаны в одном или более специфических положений (например, на N конце) мутанта Е6Е21. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или более водорастворимых полимеров в случайном порядке прикреплены к одной или более боковых цепей мутанта Е6Е21. В некоторых вариантах осуществления изобретения ПЭГ используется для улучшения терапевтической производительности мутанта Е6Е21. Некоторые из таких способов обсуждаются, например, в патенте США № 6133426, который включен в этот документ в качестве ссылки с любой целью.
В тех вариантах осуществления настоящего изобретения, где полимером является ПЭГ, группа ПЭГ может иметь любой подходящий молекулярный вес и может быть линейной или разветвленной. Предпочтительно, чтобы средний молекулярный вес группы ПЭГ варьировался в приблизительном диапазоне от 2 до 100 кДа и более предпочтительно приблизительно от 5 до 50 кДа, например 10, 20, 30, 40 или 50 кДа. Группы ПЭГ обычно прикрепляются к мутанту Е6Е21 посредством ацилирования или восстановительного алкилирования через реактивную группу на компоненте ПЭГ (например, альдегидную, амино, тиоловую или эфирную группу), взаимодействующую с реактивной группой на мутанте Е6Е21 (например, альдегидной, амино или эфирной группой).
ПЭГилирование (или пегилирование) полипептидов, включая мутанты Е6Е21 по настоящему изобретению, может специфически осуществляться с применением любых реакций пегилирования, известных в данной области знаний. Такие реакции описаны, например, в следующих ссылках: ЕгапсЬ с1 а1., 1992, Еоснх оп Сго\\111 Еас!ог§ 3: 4-10, европейские патенты №№ 0154316 и 0401384, патент США № 4179337. Например, пегилирование можно осуществить посредством реакции ацилирования или реакции алкилирования с реактивной молекулой полиэтиленгликоля (или аналогичного реактивного водорастворимого полимера), как описано в данном документе. Для реакций ацилирования выбранный полимер должен иметь одну реактивную эфирную группу. Для восстановительного алкилирования выбранный полимер должен иметь одну реактивную альдегидную группу. Реактивным альдегидом является, напри
- 17 017690 мер, пропиональдегид полиэтиленгликоля, который стабилен в воде, либо его моно С1-С10-алкокси или арилокси производные (см., например, патент США № 5252714).
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полезная стратегия присоединения группы ПЭГ к полипептиду включает комбинирование через образование конъюгатной связи в растворе между пептидом и компонентом ПЭГ, при этом каждый из них несет особую функциональность с взаимной реактивностью по отношению друг к другу. Пептиды можно легко приготовить с помощью традиционного твердофазного синтеза. Пептиды предварительно активированы, то есть имеют соответствующую функциональную группу в специфическом сайте. Перед реакцией с компонентом ПЭГ предшественники очищают и получают их полные характеристики. Сшивание пептида с ПЭГ обычно происходит в водной фазе, и его можно легко мониторировать посредством обращенно-фазовой аналитической ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография). Пегилированные пептиды можно легко очистить посредством препаративной ВЭЖХ и охарактеризовать посредством аналитической ВЭЖХ, аминокислотного анализа и лазерной десорбционной масс-спектрометрии.
Полисахаридные полимеры представляют собой еще один тип водорастворимого полимера, который можно применять для модификации белка. Следовательно, мутанты ЕСЕ21 по настоящему изобретению, соединенные с полисахаридным полимером, формируют варианты осуществления настоящего изобретения. Декстраны представляют собой полисахаридные полимеры, состоящие из отдельных субъединиц глюкозы, преимущественно соединенных альфа 1-6 связями. Декстран, как таковой, доступен в широком диапазоне молекулярного веса и легко доступен в диапазоне молекулярного веса приблизительно от 1 до 70 кДа. Декстран является подходящим водорастворимым полимером для применения в качестве носителя самостоятельно или в комбинации с другим носителем (например, Ес); см., например, Международную патентную публикацию № XV0 96/11953. В ней было описано применение декстрана, конъюгированного с терапевтическими или диагностическими иммуноглобулинами; см., например, Европейскую патентную публикацию № 0315456, которая включена в этот документ в качестве ссылки. Настоящее изобретение также охватывает применение декстрана с молекулярным весом приблизительно от 1 до 20 кДа.
В целом, химическую модификацию можно проводить в любых подходящих условиях, которые способствуют реакции белка с активированной молекулой полимера. Способы приготовления химически модифицированных полипептидов обычно включают следующие этапы: (а) реакция полипептида с активированной молекулой полимера (такой как реактивное эфирное или альдегидное производное молекулы полимера) в таких условиях, при которых мутантный полипептид ЕСЕ21 прикрепляется к одной или более молекул полимера, и (Ь) получение продуктов реакции. Оптимальные условия реакции можно определить, основываясь на известных параметрах и желательном результате. Например, чем больше соотношение между молекулами полимера и белка, тем больше процентный показатель присоединения молекул полимера. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения химически модифицированные мутанты ЕСЕ21 могут иметь единичный компонент, представленный молекулой полимера на аминоконце (см., например, патент США № 5234784).
В другом варианте осуществления настоящего изобретения мутантные полипептиды ЕСЕ21 могут быть химически соединены с биотином. Затем комплексам биотина с мутантными полипептидами ЕСЕ21 дают возможность связываться с авидином, что приводит к образованию тетравалента авидин/биотин/мутантный полипептид ЕСЕ21.
Мутантные полипептиды ЕСЕ21 также можно ковалентно соединять с динитрофенолом (ЭОТ) или тринитрофенолом (Т№), а полученные в результате конъюгаты, осаждаемые антителами фМ типа антиЭОТ или анти-Т№ образуют декамерные конъюгаты с валентностью 10.
В целом, состояния, которые можно облегчить или модулировать введением химически модифицированных мутантов ЕСЕ21 по настоящему изобретению, включают те же состояния, которые описаны в данном документе для мутантных полипептидов ЕСЕ21. Однако химически модифицированные мутанты ЕСЕ21, раскрытые в данном документе, могут обладать дополнительными видами активности, усиленной или ослабленной биологической активностью или другими свойствами, такими как удлиненный или укороченный период полувыведения по сравнению с немодифицированными мутантами ЕСЕ21.
9. Терапевтические композиции мутантов ЕСЕ21 и их введение.
Терапевтические композиции, включающие мутанты ЕСЕ21, относятся к сфере настоящего изобретения и специфически рассматриваются в свете идентификации различных мутантных последовательностей ЕСЕ21, проявляющих улучшенные свойства. Такие фармацевтические композиции с мутантами ЕСЕ21 могут включать терапевтически эффективное количество мутантного полипептида ЕСЕ21 в смеси с фармацевтически или физиологически приемлемым формообразующим агентом, подобранным в соответствии с предполагаемым способом введения.
Предпочтительно, чтобы приемлемые формообразующие материалы были нетоксичными для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях.
Фармацевтическая композиция может содержать формообразующие материалы для модификации, поддержания или сохранения, например, рН, осмолярности, вязкости, прозрачности, цвета, изотоничности, запаха, стерильности, стабильности, скорости разложения или высвобождения, адсорбции или пе
- 18 017690 нетрации композиции. Соответствующие формообразующие материалы включают, но не ограничиваясь ими, аминокислоты (такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин), противомикробные средства, антиоксиданты (такие как аскорбиновая кислота, сульфит натрия или гидросульфит натрия), буферы (такие как бораты, бикарбонаты, трис-НС1, цитраты, фосфаты или другие органические кислоты), наполнители (такие как маннит или глицин), хелатообразующие агенты (такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ΕΌΤΑ)), комплексообразующие агенты (такие как кофеин, поливинилпирролидон, бета-циклодекстрин или гидроксипропил-бета-циклодекстрин), заполнители, моносахариды, дисахариды и другие углеводы (такие как глюкоза, манноза или декстрины), белки (такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины), красящие, вкусоароматические или разбавляющие агенты, эмульгирующие агенты, гидрофильные полимеры (такие как поливинилпирролидон), полипептиды низкого молекулярного веса, солеобразующие противоионы (такие как натрий), консерванты (такие как бензалконий хлорид, бензойная кислота, салициловая кислота, тимеросал, фенилэтиловый спирт, метилпарабен, пропилпарабен, хлоргексидин, сорбиновая кислота или перекись водорода), растворители (такие как глицерин, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль), сахарные спирты (такие как маннит или сорбит), суспендирующие агенты, сурфактанты или смачивающие агенты (такие как плюроники, ПЭГ, эфиры сорбита, полисорбаты, такие как полисорбат 20 или полисорбат 80, тритон, трометамин, лецитин, холестерин или тилоксапол), агенты, усиливающие стабильность (такие как сахароза или сорбит), агенты, усиливающие тоничность (такие как галиды щелочных металлов, предпочтительно хлорид натрия или калия, маннит, сорбит), транспортировщики для доставки, разбавители, наполнители и/или фармацевтические адъюванты (см., например, Кеттдоп'к Рйагтасеибса1 ЗДепсек (181Н Еб., А.К. Сеппаго, еб., Маск РиЫйЫпд Сотрапу 1990) и последующие издания той же книги, которые включены в этот документ в качестве ссылки с любой целью).
Оптимальную фармацевтическую композицию вполне может определить квалифицированный специалист в зависимости, например, от намеченного способа введения, формата доставки и желательной дозы (см., например, КеттдЮпЗ Рйагтасеибса1 Заепсед выше). Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения ш νί\Ό и скорость клиренса ш νί\Ό мутантного полипептида ЕСЕ21.
Основной транспортировщик или носитель в фармацевтической композиции может быть водным или не водным по своей природе. Например, подходящим транспортировщиком или носителем для инъекций может быть вода, физиологический солевой раствор или искусственная спинно-мозговая жидкость, возможно с добавлением других материалов, общепринятых в композициях для парентерального введения. Другими типичными транспортировщиками являются забуференный физиологический раствор или физиологический раствор, смешанный с сывороточным альбумином. Другими типичными фармацевтическими композициями являются буфер трис с приблизительным значением рН 7,0-8,5 или ацетатный буфер с приблизительным значением рН 4,0-5,5, которые дополнительно могут включать сорбит или его подходящий заменитель. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиции с мутантным полипептидом ЕСЕ21 можно приготовить для хранения, смешивая выбранную композицию, имеющую желательную степень чистоты, с факультативными формообразующими агентами (КеттдЮпЗ Рйагтасеибса1 Заепсед выше) в виде лиофилизированной таблетки или водного раствора. Кроме того, фармацевтический продукт с мутантным полипептидом ЕСЕ21 может выпускаться в виде лиофилизата с применением соответствующих наполнителей, таких как сахароза.
Фармацевтические композиции с мутантным полипептидом ЕСЕ21 могут быть подобраны для парентеральной доставки. В альтернативном варианте можно подобрать композиции для ингаляции или для доставки через пищеварительный тракт, например пероральной. Изготовление таких фармацевтически приемлемых композиций относится к квалификации специалистов, работающих в данной области.
Формообразующие компоненты представлены в таких концентрациях, которые приемлемы в месте введения композиции. Например, буферы применяют для поддержания рН композиции на физиологическом уровне или несколько ниже, обычно в приблизительном диапазоне рН от 5 до 8.
Когда речь идет о парентеральном введении, терапевтическая композиция для применения по настоящему изобретению может представлять собой апирогенный, парентерально приемлемый водный раствор, содержащий желательный мутантный полипептид ЕСЕ21 и фармацевтически приемлемый транспортировщик. Особенно подходящим транспортировщиком для парентеральных инъекций является стерильная дистиллированная вода, в которой растворяют мутантный полипептид ЕСЕ21, получая в результате стерильный изотонический раствор, законсервированный соответствующим образом. Еще один препарат может включать лекарственный состав из желательной молекулы с таким агентом как инъекционный микросферы, биологически распадающиеся частицы, полимерные соединения (такие как полимолочная кислота или полигликолевая кислота), капельки или липосомы, обеспечивающие управляемое и длительное высвобождение продукта, который модно доставлять посредством депонированных инъекций. Также можно использовать гиалуроновую кислоту, что может стимулировать длительное пребывание композиции в кровотоке. Другие подходящие средства для введения желательной молекулы включают имплантируемые приспособления для доставки лекарств.
В одном из вариантов осуществления изобретения может быть составлена фармацевтическая ком
- 19 017690 позиция для ингаляции. Например, мутантный полипептид ЕСЕ21 может быть оформлен в виде сухого порошка для ингаляции. Также можно приготовить ингаляционные растворы мутантного полипептида ЕСЕ21 с пропеллентом для аэрозольной доставки. Еще в одном варианте осуществления изобретения растворы можно распылять при помощи небулайзера. Пульмональное (легочное) введение более подробно описано в Международной патентной публикации № А0 94/20069, которая описывает пульмональное введение химически модифицированных белков.
Также рассматривается возможность перорального введения некоторых лекарственных составов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мутантные полипептиды ЕСЕ21, которые вводят таким способом, можно вводить в лекарственные составы вместе с носителями или без носителей, которые обычно используют при изготовлении твердых лекарственных форм, таких как таблетки и капсулы. Например, можно сконструировать капсулу для высвобождения активной части лекарственного состава в том отделе желудочно-кишечного тракта, где биологическая доступность лекарства будет максимальной, а распад до попадания в системный кровоток будет минимальным. Для того чтобы облегчить всасывание мутантного полипептида ЕСЕ21, в лекарственный состав можно включить дополнительные агенты. Можно также использовать разбавители, вкусоароматические вещества, воски с низкой температурой плавления, растительные масла, смазки, суспендирующие агенты, агенты для распада таблеток и связующие вещества.
Фармацевтическая композиция другого типа может включать эффективное количество мутантного полипептида ЕСЕ21 в смеси с нетоксичными наполнителями, которые удобны для производства таблеток. Растворяя таблетки в стерильной воде или другом подходящем носителе, можно приготовить растворы в стандартной дозовой форме. Подходящие наполнители включают, но не ограничиваясь ими, инертные разбавители, такие как карбонат кальция, карбонат или бикарбонат натрия, лактозу или фосфат кальция, связующие агенты, такие как крахмал, желатин или гуммиарабик, а также смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновую кислоту или тальк. Квалифицированным специалистам будут очевидны дополнительные варианты фармацевтических композиций с мутантными полипептидами ЕСЕ21, включая лекарственные составы с замедленным или контролируемым высвобождением мутантных полипептидов ЕСЕ21. Компетентным специалистам также должны быть известны методики составления многих других средств с замедленным или контролируемым высвобождением, таких как липосомные носители, биологически разрушаемые микрочастицы, пористый бисер и депонированные инъекции (см., например, такие ссылки, как Международная патентная публикация № А0 93/15722, которая описывает контролируемое высвобождение пористых полимерных микрочастиц для доставки фармацевтических композиций, АЬеНкс & 8скетепбетап, 2008, Ιηΐ. 1. Ркагт. 364: 298-327, а также ЕгеФегд & Ζΐκι, 2004, Ιηΐ. 1. Рйагт, 282: 1-18, в которых обсуждается изготовление и применение микросфер/микрочастиц).
Дополнительные примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые полимерные матрицы в виде изделий с определенной формой, например пленок или микрокапсул. Матрицы с замедленным высвобождением могут включать сложные полиэфиры, гидрогели, полилактиды (патент США № 3773919 и европейский патент № 0058481), сополимеры Ь-глутаминовой кислоты и гамма-этил-Ь-глутамата (81бтап е1 а1., 1983, В1оро1утегк 22: 547-56), поли(2-гидроксиэтилметакрилат) (Ьапдег е1 а1., 1981, 1. Вютеб. Ма1ег. Кек. 15: 167-277 и Ьапдег, 1982, Скет. Теск. 12: 98-105), этиленвинилацетат (Ьапдег е1 а1., выше) или поли-Э(-)-3-гидроксибутировую кислоту (европейский патент № 0133988). Композиции с замедленным высвобождением также могут включать липосомы, которые можно изготовить любым из множества способов, известных в данной области техники; см., например, Ер81еш е1 а1., 1985, Ргос. №И. Асаб. 8с1. И.8.А. 82: 3688-92 и европейские патенты №№ 0036676, 0088046 и 0143949.
Типичная фармацевтическая композиция с мутантным полипептидом ЕСЕ21, применяемая для введения 1п νίνο, должна быть стерильной. Этого можно достичь пропусканием через мембраны для стерильной фильтрации. При изготовлении лиофилизированной композиции стерилизацию с применением этого способа можно проводить или до лиофилизации, или после лиофилизации и восстановления. Композицию для парентерального введения можно хранить в лиофилизированном виде или в растворе. В дополнение к этому, парентеральную композицию обычно помещают в контейнер, имеющий стерильный порт доступа, например, в мешок для внутривенного раствора или во флакон с пробкой, которую можно проколоть иглой для подкожной инъекции.
После составления фармацевтической композиции ее можно хранить в стерильных флаконах в виде раствора, суспензии, геля, эмульсии, твердого вещества, обезвоженного или лиофилизированного порошка. Такие лекарственные составы можно хранить или в готовой для применения форме, или в такой форме, которая требует восстановления перед введением (например, в лиофилизированной).
В специфическом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на наборы для изготовления модулей разовых доз, предназначенных для введения. Такие наборы могут включать как первый контейнер с сухим белком, так и второй контейнер с водным составом. В сферу этого изобретения также входят наборы, включающие однокамерные и многокамерные предварительно заполненные шприцы (например, шприцы с жидкостью и шприцы с лиофилизатом).
- 20 017690
Эффективное количество фармацевтической композиции с мутантным полипептидом ЕСЕ21 для терапевтического применения будет зависеть, например, от терапевтической ситуации и целевых объектов терапии. Квалифицированный специалист поймет, что подходящие уровни доз для лечения будут варьироваться, что частично зависит от вводимой молекулы, от показания для применения мутантного полипептида ЕСЕ21, от способа введения, а также от габаритов больного (веса тела, площади поверхности тела или размера органа) и от его/ее медицинского статуса (возраста и общего состояния здоровья). В соответствии с этим клиницист, стремясь добиться оптимального терапевтического эффекта, может титровать дозу и изменять способ введения лекарства.
Типичная доза может варьироваться в приблизительном диапазоне от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг или более в зависимости от вышеупомянутых факторов. В других вариантах осуществления изобретения доза может варьироваться в приблизительном диапазоне от 0,1 мкг/кг до 100 мг/кг, от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или от 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 мкг/кг до 100 мг/кг. В других вариантах осуществления изобретения доза может составлять 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 мкг/кг или 10 мг/кг.
Частота введения доз будет зависеть от фармакокинетических параметров мутантного полипептида ЕСЕ21 в применяемом лекарственном составе. В типичном случае клиницист будет вводить композицию так, чтобы была достигнута доза, позволяющая добиться желательного лечебного эффекта. Следовательно, композицию можно вводить в виде разовой дозы, а также двух или более доз, разделенных по времени (которые могут содержать одно и то же или разное количество нужной молекулы), либо посредством непрерывного вливания через имплантируемое приспособление или катетер. Дальнейшую доводку правильной дозы обычно проводит средний специалист, что находится в пределах его компетенции и входит в сферу его повседневных задач. Правильную дозу устанавливают, исходя из соответствующих данных по дозовой зависимости реакции на лечение.
Способ введения фармацевтической композиции соответствует известным способам, например перорально, через инъекцию: внутривенную, внутрибрюшинную, внутримозговую (интрапаренхиматозную или интравентрикулярную), внутримышечную, внутриглазную, внутриартериальную, интрапортальную (в воротную вену), внутрь повреждения, а также через системы с длительным высвобождением (которые могут быть инъекционными или представлять собой имплантируемые приспособления). При желании композиции можно вводить болюсной инъекцией, непрерывным вливанием или через имплантируемое приспособление.
Альтернативно или в дополнение к этому, композицию можно вводить местно через имплантацию мембраны, губки или другого подходящего материала, который впитывает или инкапсулирует нужную молекулу. При использовании имплантируемого приспособления это приспособление можно имплантировать в любую подходящую ткань или орган, при этом доставка нужной молекулы может происходить через диффузию, рассчитанный по времени болюс или в виде непрерывного введения.
10. Возможности терапевтического применения мутантных полипептидов ЕСЕ21.
Мутантные полипептиды ЕСЕ21 можно применять для лечения, диагностики, облегчения или профилактики многих заболеваний или патологических состояний, включая нарушения обмена веществ, но не ограничиваясь ими. В одном из вариантов осуществления изобретения нарушение обмена веществ, подлежащее лечению, представляет собой сахарный диабет, например диабет II типа. В другом варианте осуществления изобретения нарушением обмена веществ является ожирение. Другие варианты осуществления изобретения направлены на такие метаболические состояния или нарушения как дислипидемия, гипертония, гепатостеатоз, в частности неалкогольный гепатостеатоз ЩА8Н), сердечно-сосудистое заболевание, в частности атеросклероз, и возрастные изменения обмена веществ.
В прикладном варианте осуществления изобретения такое заболевание/патологическое состояние, как сахарный диабет или ожирение, можно лечить посредством введения больному, нуждающемуся с таком лечении, мутантного полипептида ЕСЕ21 в терапевтически эффективной дозе, как описано в данном документе. Введение можно осуществить в соответствии со способами, описанными в данном документе, в частности посредством внутривенной инъекции, внутрибрюшинной инъекции, внутримышечной инъекции или перорально в виде таблеток или жидкого лекарственного состава. В большинстве ситуаций нужную дозу может определить клиницист, как описано в данном документе, при этом нужная доза представляет собой терапевтически эффективную дозу мутантного полипептида ЕСЕ21. Квалифицированному специалисту будет очевидно, что терапевтически эффективная доза мутантного полипептида ЕСЕ21 будет зависеть, кроме всего прочего, от графика введения, от стандартной дозы вводимого антигена, от того, вводят ли молекулу нуклеиновой кислоты или полипептида в комбинации с другими терапевтическими средствами, от иммунного статуса и общего состояния здоровья реципиента. Термин терапевтически эффективная доза при использовании в данном документе означает, что количество мутантного полипептида ЕСЕ21, вызывающее биологическую или медицинскую реакцию в тканевой системе, в организме животного или человека, которое пытается определить исследователь, лечащий врач или другой клиницист, вызывает облегчение симптомов заболевания или расстройства, подлежащего лечению.
- 21 017690
11. Антитела.
В объеме настоящего изобретения рассматриваются антитела и фрагменты антител, которые специфично связываются с мутантными полипептидами РОР21 по настоящему изобретению, но не дают специфического связывания с полипептидами РОР21 дикого типа. Антитела могут быть поликлональными, включая специфические поликлональные, моноклональными (МЛЬ), рекомбинантными, химерными, гуманизированными, такими как антитела с пересаженным гипервариабельным участком (СЭЯ), антителами человека, одноцепочечными и/или биспецифическими, а также могут представлять собой их фрагменты, варианты или химически модифицированные молекулы. Фрагменты антител включают те части антитела, которые специфически связываются с эпитопом на мутантном полипептиде РОР21. Примеры таких фрагментов включают фрагменты РаЬ и Р(аЬ'), полученные в результате ферментативного расщепления полноразмерных антител. Другие связывающие фрагменты включают фрагменты, полученные методиками рекомбинантных ДНК, такими как экспрессия рекомбинантных плазмид, содержащих последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие вариабельные участки антитела.
Поликлональные антитела, направленные против мутантного полипептида РОР21, обычно вырабатывают у животных (например, кроликов или мышей) посредством множественных подкожных или внутрибрюшинных инъекций мутантного полипептида РОР21 и адъюванта. Может оказаться полезным конъюгировать мутантный полипептид РОР21 с белковым носителем, который является иммуногеном для иммунизированного биологического вида, таким как гемоцианин лимфы улитки, сывороточный альбумин, тиреоглобулин крупного рогатого скота или соевый ингибитор трипсина. Для усиления иммунного ответа также используют агрегирующие агенты, такие как квасцы. После иммунизации у животных берут образцы крови и проводят анализ сыворотки на титр антитела против мутантного РОР21.
Моноклональные антитела, направленные на мутантные полипептиды РОР21, можно производить любым способом, который предусматривает выработку молекул антитела непрерывной клеточной линией в культуре. Примеры подходящих способов для выработки моноклональных антител включают способы гибридомы, описанные КоЫег е! а1., 1975, №ш.1ге 256: 495-97, и способ гибридомы из В-клеток человека (Ко/Ьог, 1984, 1. 1ттипо1. 133: 3001; Вгобеиг е! а1., Мопос1опа1 АпбЬобу Ргобисбоп Тес11пк|ие5 апб Лрр11са!юп8 51-63 (Магсе1 Оеккег, 1пс., 1987). Настоящее изобретение также предлагает клеточные линии, которые вырабатывают моноклональные антитела, реагирующие с мутантными полипептидами Р0Р21.
Моноклональные антитела по изобретению можно модифицировать для применения в качестве лекарственных средств. В одном из вариантов осуществления изобретения моноклональное антитело представляет собой химерное антитело, в котором часть тяжелой (Н) и/или легкой (Ъ) цепи идентична или гомологична соответствующей последовательности в антителах, полученных от определенного биологического вида или принадлежащих к особому классу/подклассу антител, тогда как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующей последовательности в антителах, полученных от другого биологического вида или принадлежащих к другому классу/подклассу антител. Сюда же можно включить фрагменты таких антител, которые способны проявлять нужную биологическую активность; см., например, патент США № 4816567, Моткоп е! а1., 1985, Ргос. №111 Асаб. 8сг И.8.А. 81: 6851-55.
В другом варианте осуществления моноклональное антитело по изобретению представляет собой гуманизированное антитело. Способы гуманизации антител, происходящих не от человека, хорошо известны в данной области техники; см., например, патенты США №№ 5585089 и 5693762. Обычно гуманизированное антитело имеет один или более аминокислотных остатков, встроенных в него из источника нечеловеческого происхождения. Гуманизацию можно провести, например, применяя способы, описанные в данной области техники (см., например, 1опе8 е! а1., 1986, УШие 321: 522-25; ШесНтапп е! а1., 1998, №ιΙιιιό 332: 323-27; УегНоеуеп е! а1., 1988, 8с1епсе 239: 1534-36), посредством замещения как минимум части гипервариабельного участка антитела грызуна соответствующими участками из антитела человека.
Изобретение также охватывает антитела человека, которые связывают мутантные полипептиды Р0Р21 по настоящему изобретению. Используя трансгенных животных (например, мышей), которые способны вырабатывать набор антител человека при отсутствии эндогенной выработки иммуноглобулина, такие антитела получают, иммунизируя животных антигеном мутанта Р0Р21 (т.е. антигеном, имеющим как минимум 6 смежных аминокислот), факультативно соединенных с носителем; см., например, 1акоЬоуЙ8 е! а1., 1993, Ргос. №И. Асаб. 8с1. И.8.А. 90: 2551-55; .ТакоЬоуйк е! а1., 1993, УИнге 362: 255-58; Вгиддегтапп е! а1., 1993, Уеаг ш 1ттипо. 7: 33. В одном из способов таких трансгенных животных получают, выводя из строя эндогенные локусы, кодирующие у них тяжелые и легкие цепи иммуноглобулина, и вставляя в их геном локусы, кодирующие белки тяжелых и легких цепей человека. Затем частично модифицированных животных, т. е. животных, имеющих неполный комплект модификаций, скрещивают, чтобы получить животное, имеющее все нужные модификации иммунной системы. При введении иммуногена эти трансгенные животные вырабатывают антитела с аминокислотными последовательностями человека (скорее чем, например, с мышиными), включая вариабельные участки, которые иммуноспецифичны для этих антигенов; см., например, международные патентные публикации №№ XV0 96/33735 и \У0 94/02602. Дополнительные способы описаны в патенте США № 5545807, международных патентных
- 22 017690 публикациях №№ XV0 91/10741 и XV0 90/04036, а также в европейском патенте № 0546073. Антитела человека также можно вырабатывать посредством экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках-хозяевах или экспрессии в клетках гибридомы, как описано в данном документе.
В альтернативном варианте осуществления изобретения антитела человека также можно получать из библиотек фагового дисплея (см., например, НоодепЬоот с1 а1., 1991, 1. Мо1. Вю1. 227: 381; Магкк с1 а1., 1991, 1. Мо1. Вю1. 222: 581). Эти процессы имитируют иммунный отбор через демонстрацию репертуара антител на поверхности нитевидного бактериофага и последующий отбор фага посредством его связывания с антигеном выбора. Одна из таких методик описана в международной патентной публикации № XV0 99/10494, которая описывает выделение высокоаффинных и функциональных агонистических антител для МРЬ- и ткк-рецепторов с применением такого подхода.
Химерные антитела, антитела с пересаженным СЭВ и гуманизированные антитела обычно получают рекомбинантными способами. Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела, вводят в клетки-хозяева и экспрессируют, применяя материалы и процедуры, описанные в данном документе. В одном из вариантов осуществления изобретения антитела вырабатывают в клетках-хозяевах млекопитающего, таких как клетки СНО. Моноклональные (например, человеческие) антитела можно получать посредством экспрессии рекомбинантной ДНК в клетках-хозяевах или в клетках гибридомы, как описано в данном документе.
Антитела против мутанта Е6Е21 по изобретению можно использовать в любом известном способе анализа для выявления и количественной оценки мутантных полипептидов Е6Е21, таком как анализы конкурентного связывания, прямые и непрямые сэндвич-анализы и анализы иммунопреципитации (см., например, публикацию 8о1а, Мопос1опа1 АпйЬоЛек: А Мапиа1 о£ Тес11пк|ие5 147-158 (СВС Рге55, 1пс., 1987), включенную в этот документ в качестве ссылки во всей полноте ее содержания). Антитела будут связывать мутантные полипептиды Е6Е21 с аффинностью, которая соответствует используемому методу анализа.
При диагностическом использовании в некоторых вариантах осуществления изобретения антитела против мутантов Е6Е21 можно пометить выявляемым компонентом. Выявляемый компонент может представлять собой любой компонент, который способен создавать прямым или непрямым образом поддающийся выявлению сигнал. Например, выявляемым компонентом может быть радиоизотоп, такой как 3Н, 14С, 32Р, 358, 125Ι, 99Тс, 'ΐΐ'ΐ или 676а, флуоресцентное или хемилюминесцентное соединение, такое как флуоресцинизотиоцианат, родамин или люциферин, а также фермент, такой как щелочная фосфатаза, βгалактозидаза или пероксидаза хрена (Вауег е1 а1., 1990, Ме111. Επζ. 184: 138-63).
Анализы с конкурентным связыванием основаны на способности меченого стандарта (например, мутантного полипептида Е6Е21 или его иммунологически реактивной части) конкурировать с испытуемым анализируемым продуктом (например, мутантным полипептидом Е6Е21) за связывание с ограниченным количеством антитела против мутанта Е6Е21. Количество мутантного полипептида Е6Е21 в испытуемом образце обратно пропорционально количеству стандарта, который вступает в связь с антителами. Для того чтобы облегчить определение количества связанного стандарта, антитела обычно инсобилизируют (переводят в нерастворимую форму) до или после конкуренции, чтобы стандарт и анализируемый продукт, связанные с антителами, было удобно отделить от стандарта и анализируемого продук та, оставшихся несвязанными.
Сэндвич-анализы обычно включают использование двух антител, каждое из которых способно связываться с самостоятельной иммуногенной частью или эпитопом белка, подлежащего выявлению или количественной оценке. В сэндвич-анализе тестируемый образец анализируемого продукта обычно связывается с первым антителом, которое иммобилизовано на твердой опоре, а затем второе антитело связывается с анализируемым продуктом, формируя таким образом комплекс из трех частей, см., например, патент США № 4376110. Второе антитело, само по себе, может быть мечено выявляемым компонентом (прямые сэндвич-анализы) или измеряться с применением антитела против иммуноглобулина, которое мечено выявляемым компонентом (непрямые сэндвич-анализы). Например, одним из типов сэндвичанализа является твердофазный иммуноферментный анализ (ЕЫ8А), в котором выявляемый компонент представляет собой фермент.
Антитела против мутанта Е6Е21 по настоящему изобретению также полезны для получения визуальных изображений ш у1уо. Антитело, меченное выявляемым компонентом, можно ввести животному предпочтительно в кровоток с последующей оценкой наличия и локализации меченого антитела в организме хозяина. Антитело можно пометить любым компонентом, который поддается выявлению у животного способами ядерного магнитного резонанса, радиологии или другими средствами выявления, известными в данной области техники.
Антитела к мутантам Е6Е21 по изобретению можно использовать как лекарственные средства. Терапевтические агенты обычно являются агонистами или антагонистами в том смысле, что они либо усиливают, либо ослабляют соответственно как минимум одну из биологических активностей мутантного полипептида Е6Е21. В одном из вариантов осуществления антагонистические антитела по изобретению представляют собой антитела или их связывающие фрагменты, которые способны к специфическому связыванию с мутантным полипептидом Е6Е21 и которые способны подавлять или устранять функцио
- 23 017690 нальную активность мутантного полипептида РСР21 ίη угуо или ίη νίΙΐΌ. В некоторых вариантах осуществления изобретения антагонистическое антитело будет подавлять функциональную активность мутантного полипептида РСР21 как минимум приблизительно на 50% и предпочтительно как минимум приблизительно на 80%. Еще в одном варианте осуществления изобретения антитело против мутанта способно вмешиваться во взаимодействие между мутантным полипептидом РСР21 и рецептором РСР, таким образом подавляя или устраняя активность мутантного полипептида РСР21 ίη νίΙΐΌ или ίη у1уо. Агонистические и антагонистические антитела против мутанта РСР21 идентифицируют скринирующими анализами, которые хорошо известны в данной области техники.
Изобретение также относится к набору, включающему антитела против мутанта РСР21 и другие реактивы, полезные для выявления уровня мутантного полипептида РСР21 в биологических образцах. Такие реактивы могут включать выявляемую метку, блокирующую сыворотку, положительные и отрицательные контрольные образцы, а также реактивы для выявления.
Примеры
Приведенные ниже примеры иллюстрируют специфические варианты осуществления изобретения и различные варианты его применения. Они сформулированы только в целях пояснения, и их не следует воспринимать как ограничивающие сферу действия изобретения каким-либо образом.
Пример 1. Изготовление конструкций для экспрессии РСР21.
Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую зрелый полипептид РСР21, получали посредством амплификации в полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, имеющих нуклеотидные последовательности, которые соответствуют 5'- и З'-концам последовательности зрелого РСР21. Табл. 2 перечисляет праймеры, использованные амплификации последовательности зрелого РСР21.
Таблица 2
Праймеры ПЦР для конструкции РСР21
Праймер Последовательность 5Е(? Ю ΝΟ:
Смысловой 5'~АССАС6ААТААСАТАТОСАТССААТТООАСАТТСТТСТСС-3’ 5
Антисмысловой 5'-ТАОТ<лАССТСОААТТСТТАООААСССТАССТ6С-3' 6
Праймеры, использованные для изготовления конструкции, экспрессирующей РСР21, включали сайты рестрикционной эндонуклеазы для направленного клонирования последовательности в подходящий вектор экспрессии (например, рЕТЗО (Шуадеп/ЕМЭ Вюзаепсез; Сан-Диего, штат Калифорния) или рАМСЗЗ (Атдеп; Саузенд Оукс, штат Калифорния)). Вектор экспрессии рАМСЗЗ содержит низкокопийную точку начала репликации В-100, модифицированный промотор 1ас и ген устойчивости к канамицину. Вектор экспрессии рЕТЗ0 содержит точку начала репликации, полученную из рВВЗ22, индуцируемый промотор Т7 ген устойчивости к канамицину. Было обнаружено, что экспрессия из рАМСЗЗ выше, но рЕТЗ0 является более надежным вектором для клонирования. Таким образом, большинство конструкций, описанных в настоящей патентной заявке, сначала были созданы в рЕТЗ0, а затем скринированы на эффективность. После этого отобранные последовательности были перенесены в рАМСЗЗ для дальнейшей амплификации.
Последовательность РСР21 была амплифицирована в реакционной смеси, содержащей 40,65 мкл бН20, 5 мкл реакционного буфера РГииИга II Кеасбоп ВиГГег (10х), 1,25 мкл смеси 6ΝΤΡ (40 мМ-4х10 мМ), 0,1 мкл матрицы (100 нг/мл), 1 мкл праймера 1 (10 мкм), 1 мкл праймера 2 (10 мкм) и 1 мкл соединяющей ДНК-полимеразы Н8 РГиИНта II (81та!адепе, Ла-Хойя, штат Калифорния). Реакции амплификации проводили с нагреванием в течение 2 мин при 95°С, сопровождающимся десятью циклами при 95°С в течение 20 с, 60°С в течение 20 с (с дополнительным вычитанием 1°С на цикл) и 72°С в течение 15 с на килобазу нужного продукта, после чего проводили 20 циклов при 94°С в течение 20 с, 55°С в течение 20 с и 72°С в течение 15 с на килобазу нужного продукта, а затем 72°С в течение З мин. Продукты амплификации расщепляли рестрикционными эндонуклеазами №е1, Ирп1 и ЕсоК!, вшивали в подходящий вектор, а затем встраивали в компетентную клетку для ее трансформации.
Пример 2. Очистка белков РСР21, полученных из бактерий.
В последующих примерах различные белки РСР21, включая полипептид РСР21 дикого типа, усеченные полипептиды РСР21, мутанты РСР21 и гибридные белки РСР21, были экспрессированы в бактериальной системе экспрессии. После экспрессии, которая описана ниже, белки РСР21 были очищены, как описано в этом примере, если специально не указано иное.
Для очистки полипептида РСР21 дикого типа, усеченных полипептидов РСР21 и мутантов РСР21 от бактериальных телец включений дважды отмытые тельца включений (О^У(В) солюбилизировали в солюбилизационном буфере, содержащем гуанидина гидрохлорид и ΌΤΤ в буфере Тпз при рН 8,5, затем перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре и солюбилизированную смесь добавляли к буферу для рефолдинга, содержащему мочевину, аргинин, цистеин и цистамина гидрохлорид при рН 9,5, а затем перемешивали 24 ч при 5°С (см., например, С1агке, 1998, Сигг. 0рш. Вю!есйпо1. 9: 157-6З; Маппа11 е! а1., 2007, Вю!есйпо1 Вюепд. 97: 152З-З4; Кибо1р11 е! а1., 1997, Ро1бшд рто!еш8, Рто!еш Рипсбоп: А РгасЦса1 Арртоасй (Сте1дй!оп, еб., №\ν Уотк, [КБ Ргезз) 57-99 и НЫЬазЫ е! а1., 2005, Рто!ет Ехрг. РипГ. 42: 16).
- 24 017690
После солюбилизации и рефолдинга смесь пропускали через фильтр с размером ячеек 0.45 мкм. Затем концентрацию пула рефолдинга увеличивали приблизительно в 10 раз. используя для этого отделяющую кассету Ра11 Отеда с молекулярным весом 10 кДа при трансмембранном давлении (ТМР) 20 ркк а также проводили диафильтрацию с 3 об. колонки 20 мМ Тпк. рН 8.0 при ТМР 20 ркЕ
После этого очищенный образец подвергали анионообменной хроматографии (АЕХ) с применением смолы О ЗерНагоке НР. Линейный солевой градиент от 0 до 250 мМ №1С1 в 20 мМ Тпк прогоняли при рН 8.0 и температуре 5°С. Пиковые фракции анализировали методом ЗОЗ-РАСЕ и объединяли.
Затем пул элюата АЕХ подвергали хроматографии гидрофобного взаимодействия (Н1С) с применением смолы РНеиу1 ЗерНагоке НР. Белок элюировали. применяя понижающийся линейный градиент от 0.7 до 0 М сульфата аммония при рН 8.0 и температуре окружающей среды. Пиковые фракции анализировали методом Ьу 808-РАСЕ (ЪаеттН. 1970. №Циге 227: 680-85) и объединяли.
Концентрацию пула Н1С увеличивали до 7 мг/мл. применяя для этого отделяющую кассету Ра11 Отеда 0.2 м2 с молекулярным весом 10 кДа при ТМР 20 ρκί. Проводили диафильтрацию концентрата с 5 об. колонки 10 мМ КРО4. 5% сорбита. рН 8.0 при ТМР 20 ρκί. а восстановленный концентрат разбавляли до 5 мг/мл. Наконец. раствор фильтровали через позидиновую мембрану Ра11 т1ш-К1ееирас 0.2 мкМ.
Для очистки составных белков ЕСЕ21 и составных мутантных белков ЕСЕ21 от бактериальных телец включений дважды отмытые тельца включений (О^1В) солюбилизировали в солюбилизационном буфере. содержащем гуанидина гидрохлорид и ОТТ в буфере Тпк при рН 8.5. затем перемешивали в течение 1 ч при комнатной температуре и солюбилизированную смесь добавляли к буферу для рефолдинга. содержащему мочевину. аргинин. цистеин и цистамина гидрохлорид при рН 9.5. а затем перемешивали 24 ч при 5°С (см.. например. С1агке. 1998. Сигг. Орт. Вю1есНио1. 9: 157-63; Маииа11 е! а1.. 2007. Вю1есНио1. Вюеид. 97: 1523-34; Кибо1рН е! а1. 1997. Ео1бтд рго!етк. Рго1ет РиисНои: А РгасЕса1 АрргоасН (Сге1дН1ои. еб.. Νονν Уогк. 1КЬ Ргекк) 57-99 и 1кН1ЬакН1 е! а1.. 2005. Рго1ет Ехрг. РипЕ 42: 1-6).
После солюбилизации и рефолдинга смесь подвергали диализу в 5 об. 20 мМ Тпк. рН 8.0 применяя диализную трубку 10 кДа. Уровень рН диализированного перевернутого материала доводили до 5.0 при помощи 50% уксусной кислоты. а затем осветляли материал центрифугированием в течение 30 мин при 4К.
После этого осветленный образец подвергали анионообменной хроматографии (АЕХ) с применением смолы О ЗерНагоке НР. Линейный солевой градиент от 0 до 250 мМ №1С1 в 20 мМ Тпк прогоняли при 8.0 и температуре 5°С. Пиковые фракции анализировали методом ЗОЗ-РАСЕ (ЬаеттН. 1970. №Циге 227: 680-85) и объединяли.
Затем пул элюата АЕХ подвергали хроматографии гидрофобного взаимодействия (Н1С) с применением смолы РНеиу1 ЗерНагоке НР. Белок элюировали. применяя понижающийся линейный градиент от 0.6 до 0 М сульфата аммония при рН 8.0 и температуре окружающей среды. Пиковые фракции анализировали методом ЗОЗ-РАСЕ и объединяли.
После этапа Н1С пул подвергали диализу в 60 об. 10 мМ Тпк. 2.2% сахарозы. 3.3% сорбита при рН 8.5. Концентрацию диализированного пула увеличивали до 5 мг/мл. применяя устройство 1итЬокер. Наконец. раствор фильтровали через позидиновую мембрану Ра11 т1ш-К1ееирас 0.2 мкМ.
Пример 3. Изготовление и экспрессия усеченных белков ЕСЕ21.
Конструкции. кодирующие усеченные белки ЕСЕ21 и перечисленные в табл. 3. были получены посредством амплификации в ПЦР вектора экспрессии ЕСЕ21 дикого типа. как описано ниже (конструкция вектора экспрессии ЕСЕ21 дикого типа описана в примере 1).
Таблица 3
Усечения ЕСЕ21
Аминокислотные остатки Число усеченных остатков*
С-концевые усечения
1-180 1
1-179 2
1-178 3
- 25 017690
1-177 4
1-176 5
1-175 6
1 - 174 7
1-173 8
1 - 172 9
1 - 171 10
1 - 169 12
1 - 168 13
1 -167 14
1-166 15
1 - 165 16
1-164 17
1 - 160 21
1-156 25
1 - 152 29
1 - 149 32
1-113 68
Ν-концевые усечения
2-181 1
3-181 2
4-181 3
5-181 4
6-181 5
7-181 6
8-181 7
9-181 8
С- и Ν-концевые усечения
5-174 11
7-172 17
9-169 20
9-149 40
15-169 26
15-149 46
15-113 82
* по отношению к зрелому полипептиду ЕОЕ21
Усеченные белковые конструкции ЕСЕ21 были изготовлены с применением праймеров. имеющих последовательности. которые гомологичны участкам. расположенным выше и ниже кодона (или кодонов). подлежащего делеции (что приводит к усечению). Праймеры. использованные в таких реакциях амплификации. также обеспечивали приблизительно 15 нуклеотидов перекрывающейся последовательности. что позволяло рециркуляризировать амплифицированный продукт. а именно весь вектор. теперь содержащий нужный мутант.
Типичная усеченная конструкция ЕСЕ21. кодирующая белок ЕСЕ21. в котором утрачен остаток гистидина в положении 1 зрелой последовательности ЕСЕ21 (т.е. усеченный мутант 2-181). была изготовлена с применением праймеров. показанных в табл. 4.
- 26 017690
Таблица 4
Праймеры ПЦР для изготовления типичного усеченного мутанта ЕСЕ21
Праймер Последовательность 8Е<> ГО N0?
Смысловой 5'-С0А0АТАТАСАТ АТОСС ААТТССАСАТТСТТСТССАТТАТТ-3' 7
Антисмысловой 5'-САТАТСТАТАТСТССТТСТТАААСТТАААСАААА-3' 8
Праймеры, показанные в табл. 4, рассчитаны на делецию остатка гистидина, как показано ниже, при этом верхняя последовательность (8ЕЭ ΙΌ N0: 10) является частью зрелого полипептида ЕСЕ21, включающей Ν-концевой метионин, вторая последовательность является смысловым праймером (8ЕЭ ΙΌ N0: 7), третья и четвертая последовательности (8ЕЭ ΙΌ N0: 11 и 8ЕЭ ΙΌ N0: 12) являются частями конструкции, экспрессирующей ЕСЕ21, а пятая последовательность является антисмысловым праймером (8ЕЭ ΙΌ N0: 9):
МеГН1зРго11еРгоАзр8ег5егРгоЬеи
51-СЙАСАТАТАСАТАТС---СААТТССАСАТТСТТСТССАТТАТТ
ТТТТСТТТААСТТТ7\АСААССАСАТАТАСАТАТССАТССААТТССАСАТТСТТСТССАТТАТТ ААААСАААТТСАААТТСТТССТСТАТАТСТАТАССТАСОТТААСЗТСТААЗААСАСЗТААТАА ААААСАААТТеАААТТСТТССТСТАТАТ6ТАТАС-5'
Усеченные конструкции белка ЕСЕ21 были изготовлены с применением, по существу, тех же условий ПЦР, что описаны в примере 1. Продукты амплификации были подвергнуты расщеплению рестрикционной эндонуклеазой Όρηί, а затем введены в компетентные клетки для их трансформации. Полученные в результате клоны были секвенированы, чтобы подтвердить отсутствие ошибок, вызванных полимеразой.
Усеченные белки ЕСЕ21 были экспрессированы посредством трансформации компетентных клеток ВЬ21 (ЭЕ3) или ВЬ21 81аг Цпуйгодеп, Карлсбад, штат Калифорния) конструкцией, кодирующей частично усеченный белок ЕСЕ21. Трансформанты выращивали в течение ночи с ограниченной аэрацией в среде ТВ с добавлением 40 мкг/мл канамицина, аэрировали на следующее утро и после короткого периода восстановления индуцировали в 0,4 мМ ΙΡΤΟ. Мутанты ЕСЕ21 собирали центрифугированием через 1820 ч после индукции.
Пример 4. Активность усеченных белков ЕСЕ21 ίη уйго.
Были проведены эксперименты по идентификации усеченных белков ЕСЕ21, которые сохраняют активность ЕСЕ21 дикого типа в анализе на ЕЬК-люциферазу ίη νίΙΐΌ. Табл. 5 показывает в сводном виде результаты, полученные для белков ЕСЕ21, имеющих усечения на №конце, С-конце или как на Оконце, так и на С-конце. Анализы на ЕЬК-люциферазу проводили с использованием рекомбинантной системы почечных клеток человека 293Т, в которой клетки 293Т избыточно экспрессируют генные конструкции бета-клото и репортера люциферазы. Эти конструкции также содержат последовательности, кодирующие САЬ4-ЕЫ<1 и 5хиА8-Ьис, репортер люциферазы, управляемый промотором, который содержит тандемные копии сайта связывания Са14. Бета-клото представляет собой корецептор, который востребован ЕСЕ21 для активации его ЕСЕ-рецепторов и индуцирования трансдукции внутриклеточного сигнала, который, в свою очередь, приводит к фосфорилированию Егк и ЕЬК. Активность люциферазы регулируется уровнем фосфорилированного Егк/ЕЬК1 и используется для непрямого мониторирования и количественной оценки активности ЕСЕ21.
Анализы на ЕЬК-люциферазу проводили, культивируя клетки 293Т в присутствии разных концентраций полипептида ЕСЕ21 дикого типа или мутантного полипептида ЕСЕ21 в течение 6 ч, после чего проводили оценку клеточных лизатов на активность люциферазы. На фиг. 1А, 1В показывают результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы, проведенного на усеченных мутантах ЕСЕ21 7-181 и 8-181 (фиг. 1А) и усеченных мутантах ЕСЕ21 1-172, 1-171, 1-169 и 1-164 (фиг. 1В). Люминесценция, полученная в анализах на активность ЕЬК-люциферазы в каждом из усеченных мутантов ЕСЕ21: 3-181, 4-181, 5181, 7-181, 8-181, 1-180, 1-178, 1-177, 1-176, 1-175, 1-174, 1-173, 1-172, 9-181 и 1-149, показана на фиг. 2.
Мутантные полипептиды ЕСЕ21 сравнивали со стандартом ЕСЕ21 дикого типа, а мутанты, показывающие эффективность, составляющую как минимум 50% эффективности ЕСЕ21 дикого типа, считали не утратившими активность ЕСЕ21 (в табл. 5 они помечены символом
- 27 017690
Таблица 5
Усеченные белки Р0Р21: анализ ίη νίίΓΟ
С-концевые усечения
Аминокислотные остатки Эффективность Активность (+/-)
1 - 180 93,2% +
1-178 95,0% Ч-
1-177 112,0% +
1 - 176 104,8% 4-
1-174 104,6% +
1 - 173 96,1% +
1 - 172 97,5% +
1 - 171 113,0% +
1 - 169 84,9% +
1 - 167 20% -
1 - 166 20% -
1 - 165 10% -
Ν-концевые усечения
Аминокислотные остатки Эффективность Активность (+/-)
2-181 112,5% +
3- 181 130,3%
4-181 117,0% +
5-181 119,6% +
7-181 74,2% +
8-181 24,9% -
9-181 12,5% -
Собирательный взгляд на результаты, представленные в табл. 5 указывает на то, что С-концевые делеции 14 или более аминокислотных остатков (т.е. белка Р0Р21 с С-концевым усечением, состоящим из аминокислотных остатков 1-167 и более коротких белков) приводят к элиминации активности Р0Р21. В дополнение к этому, таблица 5 указывает на то, что Ν-концевые делеции 7 или более аминокислотных остатков (т.е. белка Р0Р21 с Ν-концевым усечением, состоящим из аминокислотных остатков 8-181 и более коротких белков) приводят к элиминации активности Р0Р21. Не удивительно, что усеченные белки Р0Р21, имеющие как Ν-концевые усечения от 8 до 14 остатков, так и С-концевые усечения от 12 до 32 остатков по результатам анализов на ЕБК-люциферазу утрачивали активность.
В соответствии с данными, представленными в табл. 5, усеченные полипептиды Р0Р21, имеющие Ν-концевые усечения менее 7 аминокислотных остатков, составляют варианты осуществления настоящего изобретения. Сходным образом, усеченные полипептиды Р0Р21, имеющие С-концевые усечения менее 13 аминокислотных остатков, составляют варианты осуществления настоящего изобретения.
Пример 5. Активность усеченных белков Р0Р21 ίη νίνο.
Белок Р0Р21 обладает множеством видов биологической активности, включая способность понижать в крови уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина, уменьшать вес тела, а также улучшать толерантность к глюкозе, потребление энергии и чувствительность к инсулину. Далее усеченные полипептиды Р0Р21 были проанализированы на активность Р0Р21 ίη νίνο посредством введения усеченных полипептидов Р0Р21 инсулинорезистентным мышам оЬ/оЬ и измерения способности частично усеченных полипептидов Р0Р21 понижать уровень глюкозы в крови. Тестируемый усеченный полипептид Р0Р21 впрыскивали внутрибрюшинно 8-недельным мышам оЬ/оЬ (1аск§оп ЬаЬога!огу) и после разовой инъекции брали у животных образцы крови в разных точках времени, например через 0, 6, 24, 72, 120 и 168 ч после инъекции. Уровень глюкозы в крови измеряли глюкометром 0пеТоис11 (Ьйе8сап, 1пс. Милпитас, штат Калифорния) и результаты измерений выражали в виде процентного изменения уровня глюкозы по сравнению с начальным уровнем глюкозы в крови (т.е. в точке времени 0).
Результаты одного из экспериментов представлены на фиг. 3, которая отображает количество глюкозы в крови, выявленное у мышей, которым впрыскивали усеченные мутанты Р0Р21 8-181 и 9-181. Этот эксперимент продемонстрировал, что усеченные составные белки Р0Р21, включающие аминокислотные остатки 8-181, проявляют активность по снижению уровня глюкозы в крови ίη νίνΌ, однако эта активность несколько меньше по сравнению с активностью Р0Р21 дикого типа через 3 и 6 ч после инъекции, но усеченные составные белки Р0Р21, включающие аминокислотные остатки 9-181, не проявляют
- 28 017690 такой активности. Таким образом. анализ эффектов. производимых усеченными полипептидами ЕСЕ21 ίη νίνο. показал. что делеция до 7 аминокислот с Ν-конца зрелого ЕСЕ21 не аннулирует биологическую активность молекулы (в отличие от анализа ίη νίίτο. результаты которого позволяли предположить. что делеция 7 аминокислот с Ν-конца зрелого ЕСЕ21 аннулирует такую активность).
Различные результаты. полученные для отдельных полипептидов ЕСЕ21 с Ν-концевыми усечениями (например. ЕСЕ218-181) в анализах ίη νίίτο и ίη νίνο. можно объяснить взаимодействием ЕСЕ21 с бета-клото и рецептором ЕСЕ при осуществлении сигнальной трансдукции. Более конкретно. ЕСЕ21 активирует двойной комплекс рецептора. включающий корецептор бета-клото и рецептор ЕСЕ (ЕСЕК). который инициирует сигнальный каскад. включающий тирозинкиназу. Было показано. что Ν-конец ЕСЕ21 вовлечен в связывание и активацию ЕСЕК. тогда как С-конец ЕСЕ21 необходим для взаимодействия с бета-клото (У1е еί а1.. 2009 ЕЕВЗ ЬеИ. 583:19-24). Анализ на ЕЬК-люциферазу ίη νίίτο был проведен с почечными клетками 293. в которых избыточно экспрессируется корецептор бета-клото. а ЕСЕК экспрессируется на нормальном уровне. Количество ЕСЕК по сравнению с количеством бета-клото относительно мало. следовательно. соотношение между бета-клото и ЕСЕК в клетках 293 не является физиологическим. что может повлиять на формирование рецепторного комплекса. и. в конечном итоге. на связывание лиганда и активацию ЕСЕК. Клеточная система 293 ίη νίίτο. по-видимому. более уязвима к полипептидам ЕСЕ21 с Ν-концевыми усечениями. следовательно. она могла давать потерю результатов при анализе активности нескольких протестированных мутантов с Ν-концевыми усечениями. в частности ЕСЕ21 8-181. Таким образом. при определении того. сохраняет ли определенный мутант ЕСЕ21 с Νконцевым усечением активность ЕСЕ21 дикого типа. активность этого мутанта ЕСЕ21 в анализе ίη νίνο рассматривалась как диспозитивная (допускающая выбор из нескольких вариантов). В соответствии с этим. усеченные полипептиды ЕСЕ21. имеющие Ν-концевые усечения менее 8 аминокислотных остатков. охватываются изобретением.
Пример 6. Изготовление и экспрессия усеченных составных белков ЕСЕ21.
Поскольку период полувыведения белка можно увеличить. соединяя белок с последовательностью Ес. были изготовлены и проанализированы составные белки. включающие усеченные полипептиды ЕСЕ21. Усеченные составные белки ЕСЕ21. перечисленные в табл. 6. были изготовлены из амплифицированных последовательностей ЕСЕ21 посредством ПЦР типа ЗОЕ (сплайсинг генов с удлинением перекрывания).
Составные белки ЕСЕ21 были изготовлены таким образом. что участок Ес гена иммуноглобулина человека 1дС1 (ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 13) был присоединен или к Ν-концу. или к С-концу белка ЕСЕ21.
Таблица 6
Усеченные составные белки ЕСЕ21
Аминокислотные остатки Расположение Ге Линкер
С-концевые усечения
1-178 -νη2 15
1 - 175 -νη2 14
1 - 175 -СООН 15
1 - 171 -νη2 15
1 - 171 -СООН 15
1 - 170 -СООН 15
Ν-концевые усечения
5-181 -ΝΗ2 15
5-181 -СООН 15
7-181 -νη2 15
7- 181 -СООН 15
С- и Ν-концевые усечения
5-175 -νη2 15
5- 175 -СООН 15
5- 171 -νη2 15
5- 171 -СООН 15
6- 170 -СООН 15
- 29 017690
В частности, конструкции составного белка Е6Е21 (включая конструкции, кодирующие усеченные составные белки Е6Е21) были изготовлены в серин из трех реакций амплификации с применением, по существу, тех же условий реакции, которые были описаны в примере 1. В первой реакции была сконструирована пара праймеров для выработки последовательности, содержащей сайт клонирования Шс! участок Ес и линкерную последовательность. Во второй реакции была сконструирована пара праймеров для выработки последовательности, содержащей перекрывающуюся часть линкера, часть кодирующей последовательности Е6Е21 и сайт клонирования ЕсоШ. Наконец, в третьей реакции была сконструирована пара праймеров для сцепления продуктов двух первых реакций. Типичный набор праймеров для конструирования составного белка Ес-Е6Е21 1-181 приведен в табл. 7.
Таблица 7
Праймеры ПЦР для изготовления типичной конструкции составного белка Е6Е21
Праймер Последовательность 8Ер ГО ΝΟ:
Реакция 1
Смысловой 5'-А66АОСААТААСАТАТ06АСААААСТСАСАСАТС-3' 14
Антисмысловой 5'-ООАТССАССАССАССССТАССАС-3' 15
Реакция 2
Смысловой 5’-ССТССТС6ТССАТСССАТССААТТССАОАТТСТТСТССА-3 16
Антисмысловой 5'-ТА6ТОАССТССААТТСТТАССААСС6ТАОСТ6О-3’ 17
Реакция 3
Смысловой 5'-АС6А6СААТААСАТАТ6САСААААСТСАСАСАТ(ЛЗ' 14
Антисмыслово! 5'-ТАСТСАОСТССААТТСТТАСОАА<ЗС6ТАОСТ06-3' 17
Продукт последней реакции был расщеплен рестрикционными эндонуклеазами N661 и ЕсоКТ, вшит в вектор рЕТ30, а затем введен в компетентные клетки для их трансформации. Полученные в результате клоны были секвенированы, чтобы подтвердить отсутствие ошибок, вызванных полимеразой.
Пример 7. Активность усеченных составных белков Е6Е21 ίη у1уо.
Были созданы и проанализированы на активность ίη у1уо составные белки, включающие усеченную последовательность Е6Е21, соединенную с последовательностью Ес. Усеченные составные белки Е6Е21 были изготовлены посредством присоединения молекулы Ес 1д61 или к ^концевому, или к Сконцевому участку усеченного белка Е6Е21 для образования целой непрерывной последовательности. Для различения между ^концевыми и С-концевыми слияниями составные белки Е6Е21, в которых молекула Ес была присоединена к ^концевому участку белка Е6Е21, будут обозначаться Ес-Е6Е21, а составные белки, в которых молекула Ес была присоединена к ^концевому участку белка Е6Е21, будут обозначаться Е6Е21-Ес.
Белок Е6Е21 обладает множеством видов биологической активности, включая способность понижать в крови уровень глюкозы, инсулина, триглицеридов или холестерина, уменьшать вес тела, а также улучшать толерантность к глюкозе, потребление энергии и чувствительность к инсулину. Для оценки активности Е6Е21 ίη у1уо полипептиды Е6Е21, мутантные полипептиды Е6Е21 и составные полипептиды Е6Е21 вводили инсулинорезистентным мышам оЬ/оЬ с последующим измерением способности определенного белка Е6Е21 понижать уровень глюкозы в крови. Тестируемый полипептид Е6Е21, мутантный полипептида Е6Е21 или составной полипептид Е6Е21 впрыскивали внутрибрюшинно 8-недельным мышам оЬ/оЬ Цаскьоп ЬаЬога1огу) и после разовой инъекции брали у животных образцы крови в разных точках времени, например через 0, 6, 24, 72, 120 и 168 ч после инъекции. Уровень глюкозы в крови измеряли глюкометром 0пеТоисй (Ь1£е8сап, 1пс. Милпитас, штат Калифорния) и результаты измерений выражали в виде процентного изменения уровня глюкозы по сравнению с начальным уровнем глюкозы в крови (т. е. в точке времени 0).
Результаты одного из экспериментов представлены на фиг. 4, которая отображает процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у мышей, которым впрыскивали контрольный РВ8, контрольный Ес-Е6Е21 дикого типа с аминокислотными остатками 1-181 или усеченные составные белки Ес-Е6Е21, включающие аминокислотные остатки 5-181 или 7-181. Этот эксперимент продемонстрировал, что усеченные составные белки Ес-Е6Е21, включающие аминокислотные остатки 5-181 или 7-181,
- 30 017690 проявляют такую активность по снижению глюкозы в крови. которая сходна с активностью Ес-ЕСЕ21 дикого типа через 6 ч после инъекции. Таким образом. анализ действия усеченных полипептидов ЕСЕ21 ίη у1уо показал. что делеция до 6 аминокислот с Ν-конца зрелого ЕСЕ21 не влияет на биологическую активность молекулы. Однако анализ ίη у1уо также показал. что способность усеченных полипептидов ЕСЕ21 понижать уровень глюкозы в крови снижалась. при этом содержание глюкозы в крови возвращалось к исходному уровню через 24 ч после инъекции (для ЕСЕ21 дикого типа были получены сходные результаты). Было обнаружено. что короткая активность ίη у1уо является результатом протеолитического разрушения Б6Б21. как это описано в примере 8.
Результаты другого эксперимента представлены на фиг. 5. которая отображает процентное изменение уровня глюкозы в крови. наблюдаемое у мышей. которым впрыскивали контрольный РВ8. контрольный ЕСЕ21-ЕС дикого типа с аминокислотными остатками 1-181. усеченный составной белок ЕСЕ21-Ес. включающий аминокислотные остатки 1-175. или усеченный белок Ес-ЕСЕ21. включающий аминокислотные остатки 1-171. Этот эксперимент продемонстрировал. что ЕСЕ21-Ес дикого типа. включающий аминокислотные остатки 1-181. обладает длительной активностью по снижению глюкозы. приводящую к снижению уровня глюкозы в крови приблизительно на 30% в промежутке времени от 24 до 120 ч после инъекции. Усеченный белок Ес-ЕСЕ21. включающий аминокислотные остатки 1-171. проявляет замедленную активность по снижению глюкозы в крови. которая. очевидно. проявляется только через 72 ч после инъекции. Однако наблюдаемая активность почти не отличается от активности ЕСЕ21ЕС дикого типа. Усеченный составной белок ЕСЕ21-Ес. включающий аминокислотные остатки 1-175. неактивен ίη у1уо в отношении снижения глюкозы в крови.
При совместном рассмотрении экспериментов с усечением. описанных в данном документе. было выявлено. что усеченные составные белки ЕСЕ21. имеющие Ν-концевое усечение. проявляют активность по снижению глюкозы в крови. которая сходна с составным белком ЕСЕ21 дикого типа. и далее. что усеченные составные белки ЕСЕ21. в которых молекула Ес была присоединена к Ν-концевому участку усеченного белка ЕСЕ21. более активны. чем составные белки. в которых молекула Ес была присоединена к С-концевому участку усеченного белка ЕСЕ21.
Пример 8. Наблюдаемое разрушение ЕСЕ21 ίη у1уо.
Разрушение ЕСЕ21. прежде всего. наблюдалось при использовании конструкций для составного белка ЕСЕ21 Ес. как это описано в примере 7. Фармакокинетический анализ ίη у1уо показал. что ЕСЕ21 человека имеет короткий период полувыведения у мышей. составляющий приблизительно 1 ч. что является следствием быстрого клиренса и разрушения ίη у1уо. Следовательно. для удлинения периода полувыведения ЕСЕ21 к Ν-или С-концевому участку полипептида ЕСЕ21 присоединяли последовательность Ес. Однако присоединение участка Ес не полностью разрешает проблему полувыведения. поскольку составные белки ЕСЕ21. к Ν- или С-концу которых присоединена последовательность Рс (и в особенности слияния Рс-РСР21, т.е. такие структуры. в которых последовательность Ес присоединена к Ν-концу зрелого ЕСЕ21). не проявляют ожидаемой эффективности ίη у1уо. а вместо этого. согласно имеющимся данным. сохраняют активность по снижению глюкозы в крови у мышей оЬ/оЬ не более 24 ч. Как показано на фиг. 4. составные белки Ес-ЕСЕ21 снижали уровень глюкозы в крови приблизительно на 30-40% через 6 ч после инъекции. но через 24 ч содержание глюкозы в крови возвращалось к исходному уровню.
Впоследствии изучали протеолитическое разрушение ЕСЕ21 дикого типа. при этом было обнаружено. что быстрая потеря активности составных белков Ес-ЕСЕ21 ίη у1уо происходит в результате разрушения ЕСЕ21 ίη у1уо. Протеолитическое разрушение приводит к снижению биологической активности молекулы ίη у1уо. то есть укорачивает эффективный период полувыведения. следовательно. такое разрушение отрицательно влияет на терапевтическое применение этой молекулы. В соответствии с этим наблюдаемое разрушение составных белков ЕСЕ21 Ес привело к изучению протеолитического разрушения ЕСЕ21 ίη у1уо и к поиску таких мутантов ЕСЕ21. которые были бы устойчивы к подобному разрушению.
Для того чтобы определить сайты разрушения. были проведены анализ БС-М8 и секвенирование по Эдману на ЕСЕ21 человека дикого типа и составных белках ЕСЕ21. наблюдаемых в разных точках времени после инъекции самцам мышей С57В6. Секвенирование по Эдману помогало подтвердить. подвергался ли Ν-концевой участок или С-концевой участок белка разрушению. Было обнаружено. что при слиянии последовательности Ес с Ν-концом ЕСЕ21 человека разрушение в пептиде происходило между аминокислотными остатками 151 и 152 и между аминокислотными остатками 171 и 172 человеческой части составной молекулы ЕСЕ21 (приведенная выше нумерация остатков основана на зрелой последовательности ЕСЕ21 и не включает участок Ес составного белка). Было обнаружено. что в первую очередь происходит разрушение в сайте 171-172. вслед за которым происходит разрушение в сайте 151-152. Разрушение в сайте 171-172. по-видимому. является стадией. которая определяет скорость процесса. то есть играет роль в темпах полувыведения молекулы. Кроме того. было обнаружено. что. если последовательность Ес была присоединена к С-концу ЕСЕ21. разрушение в пептиде происходило в связке между аминокислотными остатками 4 и 5 и между аминокислотными остатками 20 и 21. В результате этих экспериментов было определено. что последовательность Ес. по-видимому. защищает от разрушения ту часть последовательности ЕСЕ21. которая примыкает к Ес. Далее анализ разрушения ЕСЕ21 дикого типа и составных белков Ес-ЕСЕ21 ίη у1уо был проведен на обезьянах суηото1ди8. Эти исследования подтвердили.
- 31 017690 что сайт расщепления ЕСЕ21 в аминокислотных остатках 171-172 является мажорным сайтом разрушения у обезьян, причем этот сайт разрушения законсервирован между мышиными и приматами.
Пример 9. Идентификация мутантов ЕСЕ21, устойчивых к протеолизу.
Подходящие мутанты ЕСЕ21 были идентифицированы посредством определения в экспериментах тех положений в последовательности ЕСЕ21 дикого типа, которые являются сайтами мажорной протеолитической активности, после чего в эти сайты были внесены специфические аминокислотные замещения. Аминокислотные замещения были основаны на консервации последовательности ЕСЕ21 с другими биологическими видами (как это описано в примере 8) и биохимической консервации с другими аминокислотными остатками. Перечень аминокислотных замещений, которые были введены или могут быть внесены в белок ЕСЕ21 дикого типа, представлен в табл. 8, хотя табл. 8 является только примером, то есть вполне возможны и другие замещения. Номера положений, представленные в табл. 8, соответствуют положениям остатков в зрелом белке ЕСЕ21, который состоит из 181 аминокислотного остатка.
Таблица 8 Мутированные аминокислотные остатки в ЕСЕ21
Положение аминокислоты Нативный остаток Мутации
19 Аг§ 6111, Не, Буз
20 Туг ΗΪ5, Беи, РЬе
21 Беи Не, РНе. Туг, Уа1
22 Туг Не, Рке, Уа1
150 Рго А1а, Агд
151 О1у А1а, Уа1
152 Не Ηί8, Беи, РЬе, Уа1
170 О1у А1а, Азп, Азр, Суз, Спп, 61и, Рго, Зег
171 Рго А1а, Агд, Азп, Азр, Суз, 61и, Οίη, 61у, Н1з, Буз, 8ег, ТЬг, Тгр, Туг
172 8ег Беи, ТЬг
173 С1п Аге,, 61и
Пример 10. Анализ разрушения Ес-ЕСЕ21 и ЕСЕ21-Ес ίη νίνο.
Стабильность составных белков ЕСЕ21 Ес ίη νίνο определяли посредством впрыскивания мышам составного белка, взятия у этих мышей проб крови в разных точках времени и анализа сыворотки методом жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии (БС-М8). Более конкретно, мышам внутрибрюшинно впрыскивали 10 мг/кг Ес(5)ЕСЕ21 (экспрессированного в Е. сой и очищенного, как описано в примере 2) или ЕСЕ21(3)Ес (экспрессированного в клетках млекопитающего и очищенного в соответствии со стандартными процедурами). Образцы крови от мышей получали через 6, 24 и 48 ч после инъекции (табл. 9) и собирали в пробирки с ЕИТЛ, предварительно обработанные коктейлями с ингибиторами протеаз (Косйе И1адпо8Йс8). Плазму отделяли центрифугированием образцов на скорости 12000 д в течение 10 мин. Белки ЕСЕ21 аффинно очищали от крови с использованием агарозной смолы против Ес человека.
Таблица 9
Образцы ЕСЕ21
Образец Введенный белок Взятие крови
Рс-Р0Р21 6 часов
ϋ24 Рс-Р0Р21 24 часа
ϋ48 Рс-РОР21 48 часов
Е6 РОР21-Ес 6 часов
Е24 Р0Р21 -Рс 24 часа
Е48 РОР2ЕРс 48 часов
Перед анализом аффинно очищенных образцов способом БС-М8 в качестве эталона анализировали стандарты белков Ес-ЕСЕ21 и ЕСЕ21-Ес. Белковые стандарты либо были редуцированы трис-[2карбоксиэтил]фосфином (ТСЕР), либо не были редуцированы. Редуцированные и не редуцированные стандарты анализировали методом БС-М8, используя колонку АСЕ циано 0,3 ммх30 см с распылением элюата в масс-спектрометрическую ионную ловушку БС'О С1а881с. Поскольку развернутые спектры редуцированных образцов были чище, перед анализом БС-М8 аффинно очищенные образцы были редуци
- 32 017690 рованы.
Наблюдаемые массы редуцированного стандарта Рс(5)РСР21 и образцов Ό6, Ό24 и Ό48 показаны на фиг. 6Λ-6Ω. Наблюдаемые массы редуцированного стандарта РСР21(3)Рс и образцов Е6, Е24 и Е48 показаны на фиг. 7А-7Э. Некоторые элюаты стандартов и образцов были подвергнуты секвенированию по Эдману для подтверждения №конца белков и фрагментов в соответствии с определением в анализе ЬС-М8. Результаты анализа стандартов и образцов методом ЬС-М8 показаны в табл. 10.
Таблица 10
Результаты анализа ЬС-М8 и предсказанные фрагменты
Образец ГСЕ21 Основные наблюдаемые массы Фрагмент Интактный Νкоиец?
Стандарт Рс(5)РСР21 45,339 Е>а 1-414 Да
ϋ6 45,338 Оа 44,317 Оа 1-414 1-404 Да
ϋ24 44,321 Оа 1-404 Да
048 44,327 Оа 42,356 Оа 1-404 9 Да
Стандарт РСР21(3)Рс 46,408 Оа (гликозилированный, СОР) 44,964 Оа (не гликозилированный) 1-410 1-410 Да
Е6 45,963 Оа (гликозилированный, СЮР) 44,516 Эа (не гликозилированный) 5-410 5-410 Нет
Е24 45,963 Оа (гликозилированный, 5-410 Нет
СОР) 44,526 Оа (не гликозилированный) 44,130 Оа ( ц1усоьу1а(ес1. СОР) 5-410 21-410
Е48 45,984 Оа 44,130 Оа 44,022 Оа 5-410? 21-410 Нет
Как показано в табл. 10, все аффинно очищенные образцы демонстрировали некоторую степень разрушения только через 6 ч циркуляции. После 24-часовой циркуляции основной продукт Рс-РСР21 представлял собой фрагмент, состоящий из аминокислотных остатков 1-404, что наблюдалось как в образцах Ό, так и в образцах Е. Однако в образцах Е основной продукт РСР21-Рс представлял собой фрагмент, состоящий из аминокислотных остатков 5-410. В обоих протестированных составных белках РСР21-часть составного белка была более чувствительна к разрушению, чем Рс-часть белка.
Пример 11. Изготовление и экспрессия мутантов и составных белков РСР21, устойчивых к протеолизу.
Конструкции, кодирующие мутанты РСР21, перечисленные в табл. 11, были получены посредством амплификации в ПЦР вектора экспрессии РСР21 дикого типа, как описано ниже (конструкция вектора экспрессии РСР21 дикого типа описана в примере 1). Цель этих экспериментов заключалась в создании мутантов РСР21, которые устойчивы к протеолизу и проявляют удлиненный период полувыведения.
- 33 017690
Таблица 11
Мутанты ЕСЕ21, устойчивые к протеолизу
Мутация (мутации) Рс Линкер
Κ19Ι
Β.19Ι СООН 15
К19К
К19К соон 15
К.190
К.190 СООН 15
К19К, Υ20Η
К19К, Υ20Η •соон 15
К19К, Ε21Ι
К19К, Ь211 •соон 15
К19К, Υ20Η, Ε21Ι
К19К, Υ20Η, Ε21Ι -соон 15
Υ20Ρ
Υ20Ρ соон 15
Υ20Η
Υ20Η •соон 15
У20Ь
У20Б .соон 15
Υ20Η, Ε21Ι
Υ20Η, Ε21Ι -соон 15
Б211
Ь2П соон 15
Ь21Р
Ь21Р соон 15
Ь21У
Ь21У •соон 15
Ь21У
[21Υ соон 15
Υ22Ρ
Υ22Ρ соон 15
Υ22Ι
Υ22Ι соон 15
Υ22Ύ
Υ22ν -соон 15
Р150А
Р150А -ΝΗ2 15
Р150К ΝΗ2 15
Р150А, О151А
Р150А, О151А ΝΗ2 15
- 34 017690
Р150А, Ι152ν
Ρ150Α, 1152У -ΝΗ2 15
Ρ150Α, Ο151Α, 1152У
Ρ150Α, 0151 А, 1152У -ΝΗ2 15
Ο151Α
0151Α -ΝΗ2 15
<315ΐν
О151У -ΝΗ2 15
Ο151Α, 1152У
0151 А, П52У -ΝΗ2 15
1152Ρ
1152Ρ -ΝΗ2 15
Ϊ152Η.
Ι152Η -ΝΗ2 15
П52Ь
1152Ь -ΝΗ2 15
1152У
Ο170Α
Ο170Α -ΝΗ2 15
О170С
О170С -ΝΗ2 15
01700
Ο170ϋ -ΝΗ2 15
С170Е
Ο170Ε -ΝΗ2 15
ΟΠΟΝ
ΟΠΟΝ -ΝΗ2 15
ОПОР
Ο170Ρ -ΝΗ2 15
ΟΠΟφ
01700 -ΝΗ2 15
01708
- 35 017690
01703 -ΝΗ2 15
О170Е, Р171А
О170Е, ΡΪ71Α -ΝΗ2 15
О170Е, 8172Ь
О170Е, 8172Ь -ΝΙΙ2 15
О170Е, Р171А, 8172Ь
О170Е, Р171А, 8172Ь -ΝΗ2 15
Р171А
Р171А -ΝΗ2 15
Р171С -ΝΗ2 15
Р17ГО -ΝΗ2 15
Р171Е -ΝΗ2 15
Р1710 -ΝΗ2 15
Р171Н -ΝΗ2 15
Р171К -ΝΗ2 15
Ρ171Ν -ΝΗ2 15
Р171Ц -ΝΗ2 15
Р1718 -ΝΗ2 15
Р171Т -ΝΗ2 15
Ρ171Χν -ΝΗ2 15
Ρ171Υ -ΝΗ2 15
Р171А, 3172Б
Р171А, 8172Ь -ΝΗ2 15
8172Е -ΝΗ2 15
8172Т
8172Т -ΝΗ2 15
Ц173Е
Ц173Е -ΝΗ2 15
Ц173К
ф173Р -ΝΗ2 15
Мутантные конструкции ЕСЕ21 были изготовлены с применением праймеров, имеющих последовательности, которые гомологичны участкам, расположенным выше и ниже кодона (или кодонов), подлежащего мутированию. Праймеры, использованные в таких реакциях амплификации, также обеспечивали приблизительно 15 нуклеотидов перекрывающейся последовательности, что позволяло рециркуляризировать амплифицированный продукт, а именно весь вектор, теперь содержащий нужный мутант.
Типичная мутантная конструкция ЕСЕ21, кодирующая мутант ЕСЕ21, имеющий остаток глутаминовой кислоты в положении 170 вместо нативного остатка глицина (т.е. мутант С170Е), была изготовлена с применением праймеров, показанных в табл. 12.
Таблица 12
Праймеры ПЦР для изготовления типичного мутанта ЕСЕ21
Праймер Последовательность 8ЕЦ ТО ΝΟ:
Смысловой 5’-АТООТООААССТТСССАОООССОААСС-3’ 18
Антисмысловой 5'-О<ЗААООТТССАССАТССТСАОАОООТССОА-3 19
Праймеры, показанные в табл. 12, рассчитаны на замещение остатка глицина остатком глутаминовой кислоты, как показано ниже, при этом первая последовательность представляет собой смысловой праймер (5>ЕЦ ГО N0: 18), вторая и третья последовательности (8ЕЦ ГО N0: 20 и 8ЕЦ ГО N0: 22) являются частями конструкции, экспрессирующей ЕСЕ2Е а четвертая последовательность является антисмысловым праймером (8ЕЦ ГО N0: 21):
- 36 017690
5'-АТССТС6ААССТТСССА66ССССААСС
СТССТСббАСССТСТСАССАТССТСееАССТТСССАббеСССААСССССА 6А66А6ССТСССАСАСТСеТАССАСССТССААСССТССССССТТСССССТ АСССТееСАСАСТСеТАССАССТТССААСС-31
Конструкции мутанта РСР21 были изготовлены с применением, по существу, тех же условий ПЦР, что описаны в примере 1. Продукты амплификации были подвергнуты расщеплению рестрикционной эндонуклеазой Όρη1, а затем введены в компетентные клетки для их трансформации. Полученные в результате клоны были секвенированы, чтобы подтвердить отсутствие ошибок, вызванных полимеразой. Составные белки Рс-РСР21 и РСР21-Рс были созданы в соответствии с описанием, приведенным в данном документе, например, в примере 6.
Мутанты РСР21 были экспрессированы посредством трансформации компетентных клеток ВЬ21 (ЭЕ3) или ВЬ21 8(аг (ΙηνίΙ годен. Карлсбад, штат Калифорния) конструкцией, кодирующей специфический мутант. Трансформанты выращивали в течение ночи с ограниченной аэрацией в среде ТВ с добавлением 40 мкг/мл канамицина, аэрировали на следующее утро и после короткого периода восстановления индуцировали в 0,4 мМ ΙΡΤΟ. Мутантные полипептиды РСР21 собирали центрифугированием через 18-20 ч после индукции.
Мутанты РСР21 также анализировали на предсказанную иммуногенность. Иммунные реакции против белков усиливаются за счет процессинга антигена и его презентации в сайте связывания главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса ΙΙ. Это взаимодействие необходимо для помощи Т-клеток в созревании антител, распознающих белок. После того как были охарактеризованы сайты связывания молекул МНС класса ΙΙ, стало возможным предсказание того, имеют ли белки специфические последовательности, которые способны связываться с серией распространенных аллелей человека. На основе литературных ссылок и структур кристаллов МНС класса ΙΙ были созданы компьютерные алгоритмы, позволяющие определить, имеет ли линейная аминокислотная последовательность пептида потенциал для разрушения иммунотолерантности. Компьютерная программа ΤЕΡIΤΟΡЕ была использована для определения того, могут ли точковые мутации в конкретных мутантах РСР21 увеличить количество специфических Т-клеток у большинства людей. Основываясь на результатах анализа линейной белковой последовательности каждого мутанта РСР21, нельзя было предсказать усиление иммуногенности для какого либо мутанта.
Пример 12. Влияние линкерной последовательности на разрушение РСР21.
Для того чтобы определить, влияет ли присутствие удлиненного аминокислотного линкера между последовательностью Рс и последовательностью РСР21 на разрушение РСР21, мышам впрыскивали составные белки РСР21, в которых участок Рс был отделен от последовательности РСР21 линкером из 15 аминокислот, имеющим последовательность ССССС8ССС8СССС8 (8ЕО ΙΌ ΝΟ: 23), после чего у мышей брали кровь в разных точках времени и проводили анализ сыворотки методом ЬС-М8. В частности, мышам впрыскивали Рс(15)РСР21 или РСР21(15)Рс (полученные из Е. той) в дозе 23 мг/кг, образцы крови брали через 6, 24 и 48 ч, а взятую кровь аффинно очищали, используя агарозную смолу против Рс человека.
Перед анализом аффинно очищенных образцов способом ЬС-М8 в качестве эталона анализировали стандарты белков Р, Рс(15)РСР21 и РСР21(15)Рс. Стандарты белков либо были редуцированы ТСЕР, либо не были редуцированы. Как редуцированные, так и не редуцированные стандарты анализировали методом ЬС-М8, используя колонку АСЕ циано 0,3 ммх30 см с распылением элюата в массспектрометрическую ионную ловушку БСО С1а881с. Поскольку развернутые спектры редуцированных образцов были чище, перед анализом ЬС-М8 аффинно очищенные образцы были редуцированы.
Наблюдаемые массы редуцированного стандарта Рс(15)РСР21 и соответствующих аффинно очищенных образцов, взятых в разных точках времени, показаны на фиг. 8Λ-8Ό. Наблюдаемые массы редуцированного стандарта РСР21(15)Рс и соответствующих аффинно очищенных образцов, взятых в разных точках времени, показаны на фиг. 9Α-9Ό. Некоторые элюаты стандартов и образцов были подвергнуты секвенированию по Эдману для подтверждения Ν-конца белков и помощи в предсказании идентичности фрагментов, наблюдаемых посредством ЬС-М8. Результаты анализа стандартов и образцов методом ЬСМ8, а также индикация предсказанных фрагментов показаны в табл. 13.
- 37 017690
Таблица 13
Результаты анализа ЬС-МЗ и предсказанные фрагменты
Образец ЕСГ21 Основные наблюдаемые массы Процентная доля от общей величины Фрагмент Интактный Νконец?
Стандарт Рс(15)РСТ21 46002 Ра 100% 1-424 Да
Рс(15)РОР21 46000 Оа 65% 1-424 Да
6 часов 44978 Оа 35% 1-414
Рс(15)РОР21 44978 Оа 85% 1-414 Да
24 часа 43022 Оа 15% 1-394
Рс(15)РСР21 44976 Оа 60% 1-414 Да
48 часов 43019 0а 40% 1-394
Стандарт РОР21(15)Рс 45999 Эа 100% 1-424 Да
РСгР21(15)Рс 6 часов 45870 Оа 100% 1 -423 Да
РОР21(15)Рс 45869 Оа 40% 1 -423 Несколько
24 часа 45301 Оа 43460 Оа 35% 25% 6-423 22-423
РОР21(15)Рс 45870 0а 15% 1 -423 Несколько
48 часов 45297 Оа 43461 Оа 20% 65% 6-423 22-423
Как показано в табл. 13. все аффинно очищенные образцы демонстрировали некоторую степень разрушения только через 6 ч циркуляции. После 24 ч циркуляции основными продуктами Ес(15)ЕСЕ21 были фрагменты. состоящие из аминокислотных остатков 1-414 (85% образца) и 1-394 (15% образца). а основными продуктами ЕСЕ21(15)Ес были фрагменты. состоящие из аминокислотных остатков 1-423 (40% образца). 6-423 (35% образца) и 22-423 (25% образца). Идентифицированные точки расщепления для белков Ес(15)ЕСЕ21 и ЕСЕ21(15)Ес показаны на фиг. 10А и 10В соответственно.
Пример 13. Активность устойчивых к протеолизу мутантов Ес(15)ЕСЕ21 ίη νίνο через 1-7 дней после инъекции.
Как описано в данном документе. протеолитическое расщепление составных белков ЕСЕ21 Ес зависит от ориентации последовательности Ес. при этом окончание Ес составного белка более стабильно. чем окончание ЕСЕ21 составного белка (т.е. было обнаружено. что Ν-концевая часть составных белков ЕсЕСЕ21 и С-концевая часть составных белков ЕСЕ21-Ес более стабильны). Например. расщепление было идентифицировано в положениях 5 и 21 белка ЕСЕ21-Ес и в положениях 151 и 171 белка ЕС-ЕСЕ21.
В результате этих наблюдений было проведено исследование по идентификации мутантов ЕСЕ21. устойчивых к протеолизу. Анализ белков Ес-ЕСЕ21 методом ЬС-МЗ показывает. что протеолитическое разрушение ίη νίνο в первую очередь происходит между аминокислотными остатками 171-172 с последующим разрушением между аминокислотными остатками 151-152. Блокируя протеолитическое разрушение в положении 171. можно предотвратить разрушение в положении 151. что эффективно увеличивает период полувыведения молекулы. Однако устойчивые к протеолизу мутанты. у которых расщепление в положении 151 предотвращено. по-прежнему. могут обладать в положении 171 остатками. чувствительными к атаке протеазы. что приводит к потере молекулой 10 последних аминокислот. которые. как известно. вовлечены в связывание корецептора бета-клото. являющегося детерминантом аффинности рецептора к лиганду и мощности ίη νίίτο и ίη νίνο. Следовательно. мутационные изменения аминокислотных остатков. окружающих положение 171 в зрелом ЕСЕ21. по-видимому. более важны для улучшения стабильности ίη νίνο. мощности и эффективности молекулы.
Активность отдельных мутантов Ес(15)ЕСЕ21. устойчивых к протеолизу ίη νίνο. оценивали. впрыскивая внутрибрюшинно мутант ЕСЕ21 мышам οΕοΚ затем у мышей брали образцы крови через 0. 0.25. 1. 3. 5 и 7 дней после инъекции и измеряли в образцах уровень глюкозы. Результаты одного из экспериментов показаны на фиг. 11. которая отображает уровень глюкозы в крови. измеренный у мышей после инъекции контрольного РВЗ. контрольного Ес(15)ЕСЕ21 или таких мутантов Ес(15)ЕСЕ21. как Ес(15)ЕСЕ21 С170Е. Ес(15)ЕСЕ21 Р171А. Ес(15)ЕСЕ21 З172Ь. Ес(15)ЕСЕ21 С170Е/Р171А/З172Ь или Ес(15)ЕСЕ21 С151А. Фиг. 12 показывает процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам этого эксперимента. Этот эксперимент демонстрирует. что мутанты Ес(15)ЕСЕ21 С170Е. Ес(15)ЕСЕ21
- 38 017690
Р171А, Рс(15)Р0Р21 8172Б и Рс(15)Р0Р21 0170Е/Р171А/8172Б проявляют длительную активность по снижению уровня глюкозы в крови (до 5 дней), которая превосходит активность Рс-Р0Р21 дикого типа. Мутант Рс(15)Р0Р21 0151А лишь немного улучшал длительность активности по снижению уровня глюкозы в крови по сравнению с составным белком Рс-Р0Р21 дикого типа. Неожиданно было обнаружено, что, хотя мутант Рс(15)-Р0Р21 8172Б неустойчив к протеолизу и, следовательно, имеет сходный профиль разрушения с полипептидом Рс(15)Р0Р21 дикого типа, этот мутант демонстрирует улучшенную эффективность ίη νί\Ό по сравнению с полипептидом Рс(15)Р0Р21 дикого типа.
Результаты другого эксперимента представлены на фиг. 13, которая отображает уровень глюкозы в крови, измеренный у мышей после инъекции контрольного РВ8, контрольного Рс(15)Р0Р21 или таких мутантов Рс(15)Р0Р21, как Рс(15)Р0Р21 Р150А/0151А/1152У, Рс(15)Р0Р21 0170Е, Рс(15)Р0Р21 0170Е/Р171А или Рс(15)Р0Р21 0170Е/8172Б. Фиг. 14 показывает процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам этого эксперимента. Как и в эксперименте, описанном выше, составной белок Рс-Р0Р21 дикого типа и мутант Рс(15)Р0Р21 Р150А/0151А/1152У не проявляли длительной активности по снижению уровня глюкозы в крови, возможно, вследствие того, что все еще могло происходить разрушение в сайте 171, а уровень глюкозы в крови животных, которым впрыскивали эти белки, возвращался к исходному не более чем через 24 ч после инъекции. Однако мутанты Рс(15)Р0Р21 0170Е, Рс(15)Р0Р21 0170Е/Р171А и Рс(15)Р0Р21 0170Е/8172Б проявляли максимальную активность по снижению уровня глюкозы в крови до 5 дней после инъекции, что превосходит эффекты составного белка РсР0Р21 дикого типа и мутанта Рс(15)Р0Р21 Р150А/0151А/1152У.
Результаты еще одного эксперимента показаны на фиг. 15, которая отображает уровень глюкозы в крови, измеренный у мышей после инъекции контрольного РВ8, или таких мутантов Рс(15)Р0Р21, как Рс(15)Р0Р21 0170Е, Рс(15)Р0Р21 0170А, Рс(15)Р0Р21 0170С, Рс(15)Р0Р21 0170Ό, Рс(15)Р0Р21 0170Ν или Рс(15)Р0Р21 01708. Фиг. 16 показывает процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам этого эксперимента. Все мутанты Р0Р21, протестированные в этом эксперименте, проявляли длительную активность по снижению уровня глюкозы в крови (до 5 дней после инъекции).
Результаты еще одного эксперимента показаны на фиг. 17, которая отображает уровень глюкозы в крови, измеренный у мышей после инъекции контрольного РВ8 или таких мутантов Рс(15)Р0Р21, как Рс(15)Р0Р21 0170Е, Рс(15)Р0Р21 Р171Е, Рс(15)Р0Р21 Р171Н, Рс(15)Р0Р21 Р171р, Рс(15)Р0Р21 Р171Т или Рс(15)Р0Р21 Р171У. Фиг. 18 показывает процентное изменение уровня глюкозы в крови по результатам этого эксперимента. Все мутанты Р0Р21, протестированные в этом эксперименте, демонстрировали улучшенную активность по снижению уровня глюкозы в крови при сопоставлении с Рс-Р0Р21 дикого типа.
Пример 14. Разрушение устойчивых к протеолизу мутантов Рс(15)Р0Р21 ίη νί\Ό через 6-120 дней после инъекции.
Стабильность отобранных мутантов Р0Р21 ίη νί\Ό анализировали, впрыскивая мышам мутант Р0Р21, после чего у мышей брали образцы крови в разных точках времени и проводили анализ сыворотки методом БС-М8. Более конкретно, мышам впрыскивали либо мутанты Рс(15)Р0Р21 0170Е, Рс(15)Р0Р21 Р171А, либо мутант Рс(15)Р0Р21 8172Б (полученные из Е. сой, как это описано в примере 2), причем каждый мутант перед инъекцией разбавляли приблизительно в 180 мкл 10 мМ НС1, а образцы крови брали через 6, 24, 48, 72 и 120 ч. Белки Р0Р21 аффинно очищали от крови, используя колонку с агарозной смолой против Рс человека. Образцы элюировали из колонки, используя 10 мМ НС1. Все конструкции Р0Р21 включали участок Рс и линкер из 15 аминокислот в аминоконцевой области белка Р0Р21. Мышам также впрыскивали контрольный Р0Р21 дикого типа.
Перед анализом аффинно очищенных образцов способом БС-М8 в качестве эталона анализировали необработанный Р0Р21 дикого типа и необработанные мутанты Р0Р21. Все стандарты и образцы по точкам времени были редуцированы ТСЕР, а затем проанализированы методом БС-М8 с применением колонки АСЕ циано 0,3 ммх30 см и последующим распылением элюата в масс-спектрометрическую ионную ловушку БС’О С1а881с. Аффинно очищенные образцы были разбавлены ацетатом аммония, редуцированы ТСЕР, а затем проанализированы методом БС-М8, как описано выше.
Наблюдаемые массы Рс(15)Р0Р21 дикого типа через 0, 6, 24 и 48 ч после инъекции показаны на фиг. 19Λ-19Ω соответственно. Наблюдаемые массы Рс(15)Р0Р21 0170Е через 0, 6, 24 и 48 ч после инъекции показаны на фиг. 20А-20Э соответственно. Наблюдаемые массы Рс(15)Р0Р21 Р171А через 0, 6, 24 и 48 ч после инъекции показаны на фиг. 21Λ-21Ω соответственно. Наблюдаемые массы Рс(15)Р0Р21 8172Б через 0, 6, 24 и 48 ч после инъекции показаны на фиг. 22А-22Э соответственно.
Было обнаружено, что все образцы, взятые через 72 и 120 ч, содержат компонент фибриногена высокого молекулярного веса (>200 кДа по результатам нередуцирующего анализа 8П8-РА0Е), который представлен намного обильнее, чем остальной составной белок Рс(15)Р0Р21. Результаты анализа БС-М8 для других стандартов и образцов представлены в табл. 14.
- 39 017690
Таблица 14
Результаты анализа ЬС-М8 и предсказанные фрагменты
Образец ГСГ21 Основные наблюдаемые массы Процентная доля от общей величины Фрагмент Эдман
Стандарт Рс(15)РОР21 45994 Оа 100% 1-424
Ес(15)Р<ЗР21 \ντ 46001 Оа 80% 1-424 Нет
6 часов 44987 Оа 20% 1-414
Рс(15)РСР21 'λ'Τ 24 часа 44979 Оа -100% 1-414 Нет
Ес(15)РОР21 \\'Т 48 часов 44980 0а -100% 1-414
Стандарт Рс(15)РСР21 О170Е 46068 Оа 100% 1-424
Рс(15)РОР21 С170Е 6 часов 46078 Оа 100% 1-424 Нет
Гс(15)РСР21 О170Е 24 часа 46074 Оа 45761 Оа 80% 20% 1-424 1- 421 Нет
Рс(15)Р6Р21 О170Е 48 часов 46072 Оа 45760 Оа -60% -40% 1-424 1- 421 Нет
Стандарт Рс(15)РОР21 Р171А 45970 Оа 100% 1-424
Рс(15)РОР21 Р171А 6 часов 45980 Оа 100% 1-424 Нет
Рс(15)РСГ21 Р171А 24 часа 45973 Оа 45657 Ба -70% -30% 1-424 1- 421 Нет
Рс(15)РОР21 Р171А 48 часов 45992 Оа 45673 Оа -50% -50% 1-424 1-421 Нет
Стандарт Рс(15)РОР21 8172Л 46022 Оа 100% 1-424
Рс(15)РСР21 817211 6 часов 46027 Оа 100% 1-424 Нет
Рс(15)РСР21 5172Ь 24 часа 44984 Оа 100% 1-414 Нет
- 40 017690
Рс(15)РСР21 8172Ь 48 часов 44985 Ра 100% 1-414 Нет
Как показано в табл. 14, разрушение Рс(15)РСР21 дикого типа и мутанта 8172Ь выглядят сходно в том отношении, что после 24 ч циркуляции основной продукт составного белка представлял собой фрагмент, состоящий из аминокислотных остатков 1-414. Продукты разрушения мутантов Рс(15)РСР21 С170Е и Рс(15)РСР21 Р171А также выглядят сходно в том отношении, что образцы, взятые через 24 ч циркуляции, содержат 70-80% интактного белка (аминокислоты 1-424) и 20-30% фрагмента, состоящего из аминокислотных остатков 1-421.
Даже спустя 48 ч мутанты Рс(15)РСР21 С170Е и Рс(15)РСР21 Р171А все еще сохраняли интактный белок, но в то же время демонстрировали увеличение количества фрагментов, состоящих из аминокислотных остатков 1-421. Как наблюдалось в предыдущих анализах конструкций Рс-РСР21, выявлялось разрушение компонента РСР21 составного белка, а компонент Р оставался стабильным. Сайты расщепления, идентифицированные для белка дикого типа, Рс(15)РСР21 С170Е, Рс(15)РСР21 Р171А и Рс(15)РСР21 8172Ь, показаны на фиг. 23А-23Э соответственно.
Пример 15. Идентификация мутантов РСР21 с пониженной агрегацией.
Одним из свойств РСР21 дикого типа является склонность к агрегации. Мутанты РСР21 с пониженной агрегацией были выявлены на основе двух гипотез. Первая гипотеза заключается в том, что применительно к РСР21 агрегацию (или димеризацию) запускают гидрофобные взаимодействия и ваандервальсовы взаимодействия между молекулами РСР21, вызванные гидрофобными остатками, которые подвергаются воздействию гидрофильной водоосновной среды растворителя. Вторая гипотеза заключается в том, что эти открытые гидрофобные остатки могут быть замещены для создания вариантов точковых мутаций с пониженной агрегацией без нарушения активности РСР21.
Для идентификации открытых гидрофобных остатков в РСР21 был использован системный рациональный подход белковой инженерии. Поскольку не были известны рентгеновские или ЯМР-структуры РСР21, которые можно было бы использовать для идентификации открытых гидрофобных остатков, для создания трехмерной модели гомологии РСР21 с применением компьютерной программы моделирования МОЕ (молекулярная операционная среда, Сйетюа1 Сотрийид Сгоир, Монреаль, Квебек, Канада) была использована рентгенокристаллическая структура РСР19 (1Р^А) высокого разрешения (1,3 А), полученная из банка данных по белкам (РОВ). В качестве матричного шаблона был выбран РСР 19, поскольку среди белков, депонированных в РОВ, именно РСР 19 является белком, наиболее родственным РСР21 по гомологии аминокислотной последовательности. Доступность для растворителя была рассчитана следующим способом с применением программы МОЕ. Первое измерение площади поверхности (8А1) было определено как доступная площадь поверхности остатков в А2. Наряду с тем что определенный аминокислотный остаток появляется в первичной последовательности белка много раз, каждое появление остатка может иметь разную площадь поверхности вследствие различий, среди всего прочего, в близости остатка к поверхности белка, в ориентации боковой цепи остатка и в пространственном расположении прилегающих аминокислотных остатков. Следовательно, проводят второе измерение площади поверхности (8А2), в котором представляющий интерес остаток извлечен из структуры белка наряду с его окружением, то есть прилегающими остатками. Эти пространственно прилегающие остатки виртуально мутировали в глицины, чтобы удалить их боковые цепи, а затем вычисляли 8А2 для представляющего интерес остатка, получая размер общей площади поверхности для этого остатка в его специфической конформации. Затем, вычисляя отношение 8А1 к 8А2 (8А1/8А2), можно получить процентный показатель возможной площади поверхности для того остатка, который фактически открыт.
Для дальнейшего анализа были отобраны несколько гидрофобных остатков, которые в значительной степени открыты для растворителя, и в этих остатках осуществлены виртуальные мутации с их замещением другими встречающимися в природе аминокислотными остатками. Изменения термостабильности белка, происходящие в результате различных замещений, были рассчитаны на модели РСР21 с применением интерактивной сетевой версии программы СИР8АТ (Со1одие Ишуегкйу РгоРет 81аЫ1Пу Аиа1у818 Тоо1к [Инструменты кельнского университета для анализа стабильности белков]) в соответствии с инструкциями, представленными на веб-сайте СИР8АТ; см. РайЫЬаи е! а1., 2006, ШЛею Ас1бк Кек, 34: ХУ239-42; РайЫЬаи е! а1., 2007, ВМС 81гис1. Вю1. 7:54. При конструировании вариантов точковых мутаций для снижения агрегации были исключены значительно дестабилизирующие или гидрофобные мутации. В качестве кандидатов на роль мутантов РСР21 с пониженной агрегацией рассматривались стабилизирующие (или, в редких случаях, немного дестабилизирующие) замещения, которые приводят к улучшению гидрофильных и/или ионных характеристик.
Сводка данных, полученных через этот рациональный подход белковой инженерии, представлена в табл. 15, где также перечислены типичные мутанты РСР21 с ожидаемой пониженной склонностью к белковой агрегации и улучшенной стабильностью.
- 41 017690
Таблица 15
Расчетное влияние мутантов ЕСЕ21 на стабильность
№ остатка остаток \УТ Мутация Стабилизация (ккал/моль)
26 А К Е К 1,25 1,54 2,016
45 А Т 0,66
<2 0,71
к 1,8
Е 2,34
К 1,59
52 Ь т -0,33
58 Ь с 0,16
8 -0,15
С 1,0
Е 0,08
60 Р А 1,3
К 1,51
Е 0,66
К. 1,31
78 Р А 0,14
С 2,48
К 0,08
н 0,13
86 Е т с 0,18 4,1
88 Р А 8 2,52 3,08
- 42 017690 цией.
98 Ь
99 ь
111 А
129 А
134 А
К 2,88
Е 1,48
Т 0,49
Ц 0,17
к -0,19
с 3,08
Е 0,84
К 3,4
С 7,34
Е 2,0
ϋ 1,01
К. 1,61
т 0,47
к -0,12
<3 3,93
к 1,02
N 3,76
Е 3,01
ϋ 3,76
К 1,68
н 2,9
к 5,37
¥ 4,32
Е 5,13
К. 6,18
н 2,86
Пример 16. Изготовление и экспрессия мутантов и составных белков РСР21 с пониженной агрегаКонструкции, кодирующие мутанты РСР21, которые перечислены в табл. 16, были получены посредством амплификации в ПЦР вектора экспрессии РСР21 дикого типа, как описано в примере 11 (конструкция вектора экспрессии РСР21 дикого типа описана в примере 1). Составные белки были изготовлены, как описано в данном документе, в частности, в примере 6.
- 43 017690
Таблица 16
Мутанты ЕСЕ21 с пониженной агрегацией
Мутация (мутации) Рс Линкер
А26Е
А26К
А26К.
А45Е
А45К
А45К -ΝΗ2 15
А45К -ΝΗ2 15
А450 -ΝΗ2 15
А45Т -ΝΗ2 15
А45К, Е98Н -ΝΗ2 15
52Т
Ь58С
Ь58Е
Ь58О
Ь588
Р60А
Р60Е
Р60К
Р60К
Р78А
Р78С
Р78Н
Р78К.
Ь86С
Ь86Т
Р88А
Р88Е
- 44 017690
Агрегацию разных белков РСР21, включая РСР21 дикого типа, усеченные полипептиды РСР21, мутанты РСР21 и составные белки РСР21, оценивали посредством эксклюзионной хроматографии (8ЕС). Анализируемые образцы инкубировали при 4°С, комнатной температуре или З7°С в течение разного времени, а затем подвергали анализу методом 8ЕС. Эксперименты проводили в системе НРБС Весктап, оснащенной колонкой 8ЕС. Для РСР21 дикого типа использовали колонку Т080НАА8 Т8К-Се1 С2000 8ЕС с 2хРВ8, содержащую 2% изопропиловый спирт в мобильной фазе. Для составных белков РСР21 Рс и мутантных полипептидов РСР21 использовали колонку Т080НАА8 Т8К-Се1 СЗ000 8ЕС с 2хРВ8 в мобильной фазе.
Пример 17. Активность 1п νίΙΐΌ мутантов РСР21 с пониженной агрегацией.
Были проведены эксперименты по идентификации мутантов с пониженной агрегацией, которые сохраняют активность РСР21 дикого типа в анализе на ЕБК-люциферазу 1п У1!го. Анализы на ЕБКлюциферазу проводили, как это описано в примере 4. На фиг. 24А-24С показаны результаты анализа на активность ЕЕК-люциферазы, проведенного на таких мутантах РСР21, как РСР21 Б99В РСР21 Б99Э и РСР21 А111Т (фиг. 24А), на таких мутантах РСР21, как РСР21 А129Э, РСР21 А129Ц и РСР21 А1З4К (фиг. 24В), и на таких мутантах РСР21, как РСР21 А1З4У, РСР21 А1З4Е и РСР21 А129К (фиг. 24С). Результаты этих экспериментов демонстрируют, что некоторые из мутантов с пониженной агрегацией не проявляют отрицательного влияния на активность РСР21 по результатам анализов на ЕБК-люциферазу.
Пример 18. Изготовление и экспрессия комбинированных мутантов Рс(15)РСР21, демонстрирующих удлиненное полувыведение и пониженную агрегацию.
Были изготовлены и конъюгированы с молекулами Рс ЦС1 многие комбинированные мутанты РСР21, демонстрирующие пониженную агрегацию и удлиненный период полувыведения за счет подрыва протеолитического разрушения. Эти мутанты РСР21 были изготовлены, по существу, как это описано в примере 11.
Пример 19. Исследования 1п νίΙΐΌ по изучению мутантов Рс(15)РСР21, демонстрирующих удлиненное полувыведение и пониженную агрегацию.
Были проведены эксперименты по идентификации комбинированных мутантов РСР21, которые сохраняют активность РСР21 дикого типа в анализе на ЕБК-люциферазу 1п У1!го. Анализ на ЕБК
- 45 017690 люциферазу проводили. как это описано в примере 4.
На фиг. 25Λ-25Ω показаны результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы. проведенного на таких мутантах Ес-ЕСЕ21. как Ес-ЕСЕ21 Р171С. Ес-ЕСЕ21 Р171З и Ес-ЕСЕ21 Р171Т (фиг. 25А). на таких мутантах Ес-ЕСЕ21. как Ес-ЕСЕ21 Р171У. Ес-ЕСЕ21 Р171№ и Ес- ЕСЕ21 Р171С (фиг. 25В). на таких мутантах Ес(15)ЕСЕ21. как Ес(15)ЕСЕ21 А45К/С170Е и ЕСЕ21 А45К (фиг. 25С). и на таких мутантах Ес(15)ЕСЕ21. как Ес(15)ЕСЕ21 Р171Е и Ес(15)ЕСЕ21 А45К/С170Е (фиг. 25Ό). Результаты этих экспериментов демонстрируют. что мутации. направленные на улучшение стабильности или как стабильности. так и растворимости. не теряют активность ш νίΙΐΌ по сравнению с Ес-ЕСЕ21 дикого типа. Интересно. что мутант ЕСЕ21 А45К продемонстрировал более высокую мощность по сравнению с Ес-ЕСЕ21 дикого типа.
На фиг. 26А показано процентное изменение агрегации для контрольного ЕСЕ21 (\УТ) и мутанта ЕСЕ21 А45К после инкубации 65 мг/мл белка при 4°С в течение 1. 2 и 4 дней. Данные показывают. что мутация А45К приводит к снижению агрегации мутантного белка по сравнению с белком дикого типа.
Фиг. 26В показывает процентное изменение агрегации для контрольного ЕСЕ21 (\¥Т). а также таких мутантов ЕСЕ21. как Р78С. Р78К. Ь86Т. Ь86К. Ь98С. Ь98К, А111Т. А129О. А129Ц. А129К. А134К. А134У и А134Е после инкубации 65 мг/мл белка при 4°С в течение 1. 6 и 10 дней. Данные показывают. что мутации Ь86К, Ь98С. Ь98К А111Т. Л129Ц и А129К приводят к снижению агрегации мутантного белка по сравнению с белком дикого типа.
Фиг. 27 показывает результаты анализа активности ЕЬК-люциферазы. проведенного на контрольном ЕСЕ21 человека и на таких мутантах ЕСЕ21. как ЕСЕ21 А45К. ЕСЕ21 Ь52Т и ЕСЕ21 Ь58Е. Этот эксперимент демонстрирует. что мутант ЕСЕ21 А45К сохраняет полную эффективность ЕСЕ21 дикого типа и проявляет даже большую мощность по сравнению с ЕСЕ21 дикого типа. Однако мутанты ЕСЕ21 Ь52Т и ЕСЕ21 Ь58Е показывают меньшую мощность и эффективность по сравнению с ЕСЕ21 дикого типа.
На фиг. 28А. 28В показано изменение уровня агрегации для таких мутантов Ес(15)ЕСЕ21. как Ес(15)ЕСЕ216-181/С170Е. Ес(15)ЕСЕ21 А45К/С170Е. Ес(15)ЕСЕ21 Р171Е. Ес(15)ЕСЕ21 Р171А. Ес(15)ЕСЕ21 С170Е и контрольного ЕСЕ21 после их инкубации при 4°С в течение 1. 4 и 8 дней. Этот эксперимент демонстрирует. что после 8-дневного периода мутант Ес(15)ЕСЕ21 А45К/С170Е проявлял меньшую агрегацию по сравнению с мутантами Ес(15)ЕСЕ21 С 170Е или Ес(15)ЕСЕ21 Р171Е. но все три мутанта проявляли меньшую агрегацию по сравнению с контрольным Ес(15)ЕСЕ21. Табл. 17 показывает процентную величину агрегации. полученную для контрольного Ес-ЕСЕ21 и мутанта Ес-ЕСЕ21 А45К/С170Е после инкубации при 4°С или при комнатной температуре (КТ) в течение 0. 2. 3. 4 или 7 дней.
Таблица 17 Процентная величина агрегации для Ес-ЕСЕ21 и мутанта Ес-ЕСЕ21
Образец день 0 день 2 день 3 день 4 день 7
Рс-РСР21 λ¥Τ 32 мг/мл 4°С 1,12 1,71 1,89 2,14 2,32
КТ 1,12 6,09 7,94 9,57 12,59
Рс-Р0Р21 А45К/О170Е 33 мг/мл 4°С 0,45 0,77 0,88 1,03 1,24
кт 0,45 3,86 5,22 6,62 8,60
Пример 20. Изготовление и экспрессия комбинированных составных мутантов Ес-ЕСЕ21.
Как описано выше. стабильность и растворимость ЕСЕ21 можно модулировать при внесении специфических усечений и аминокислотных замещений. В дополнение к этому. стабильность ЕСЕ21 можно дополнительно увеличить за счет соединения таких модифицированных белков ЕСЕ21 с участком Ес гена иммуноглобулина человека 1дС1. Кроме того. комбинируя вышеуказанные модификации. можно создать молекулы ЕСЕ21. обладающие как улучшенной стабильностью. так и улучшенной растворимостью. Последовательности нуклеиновых кислот. кодирующих комбинированные мутанты ЕСЕ21. перечисленные в табл. 18. были изготовлены по методикам. описанным выше.
- 46 017690
Таблица 18
Комбинированные мутанты ЕСЕ21
Аминокислотные остатки Мутация, направленная на устойчивость к протеолизу Мутация, направленная на уменьшение агрегации Ес Линкер
1-181 О170Е А45К -ΝΗ2 15
1-181 О170Е 1,98К -ΝΗ2 15
1-181 О170Е А45К, Ь98К -ΝΗ2 15
1-181 Р171С А45К -ΝΗ2 15
1-181 Р1718 А45К -ΝΗ2 15
1-181 Р171О Е98К -ΝΗ2 15
1-181 Р1718 Ь98К -ΝΗ2 15
1-181 Р171О А45К, Ь98Р. -ΝΗ2 15
1-178 О170Е -ΝΗ2 15
6-181 О170Е -ΝΗ2 15
6-181 О170Е А45К -ΝΗ2 15
6-181 О170Е Ь98К -ΝΗ2 15
6-181 Р171О -ΝΗ2 15
6-181 Р171С Е98К -ΝΗ2 15
7-181 О170Е -ΝΗ2 15
На фиг. 29 показаны результаты измерения уровня глюкозы в крови у мышей, которым впрыскивали такие комбинированные мутанты Ес(15)ЕСЕ21, как Ес(15)ЕСЕ21 А45К/С170Е, Ес(15)ЕСЕ21 А45К/Р171С или Ес(15)ЕСЕ21 Ь98К/Р171С.
В другом эксперименте такой мутант ЕСЕ21, как Ес(15)ЕСЕ21 Б98К/Р171С исследовали параллельно со зрелым ЕСЕ21 и Ес-ЕСЕ21 дикого типа. В одном из экспериментов рекомбинантные клетки линии 293Т культивировали в присутствии разных концентраций ЕСЕ21, Ес-ЕСЕ21 или Ес-ЕСЕ21Ь98К/Р171С в течение 6 ч. Затем клеточные лизаты анализировали на активность люциферазы. Как показано на фиг. 30, Ес-ЕСЕ21 Ь98К/Р171С имел сходную активность с Ес-ЕСЕ21, а это указывало на то, что внесение двух точковых мутаций не изменяет активность молекулы ш νίΙΐΌ.
Еще в одном эксперименте стабильность Ес-ЕСЕ21 Б98К/Р171С в концентрации 65 мг/мл оценивали в течение девяти дней при двух разных температурах, а именно при комнатной температуре и при 4°С, параллельно с ЕСЕ21 и Ес-ЕСЕ21. По окончании периода инкубации клеточные лизаты анализировали методом ЗЕС-НРЬС для определения профиля агрегации по времени при разных температурах. Данные, показанные на фиг. 31А и 31В, свидетельствуют о том, что скорость формирования агрегатов значительно снижалась для мутанта Ес-ЕСЕ21 Б98К/Р171С при комнатной температуре (закрашенные треугольники, пунктирная линия на фиг. 31 А) и при 4°С (закрашенные треугольники, пунктирная линия на фиг. 31В).
Пример 21. Устойчивые к протеолизу мутанты ЕСЕ21, содержащие С-концевые мутации.
Также проводили исследования стабильности комбинированных мутантов ш νί\Ό. В частности, стабильность ш νί\Ό мутанта Ес-ЕСЕ21 Б98К/Р171С сравнивали со стабильностью Ес-ЕСЕ21 в мышиной модели и модели супото1ди§. На обоих биологических видах были получены сходные результаты. В исследовании на обезьянах супото1ди§ белки Ес-ЕСЕ21 Б98К/Р171С и Ес-ЕСЕ21 впрыскивали внутривенно в дозе 23,5 мг/кг, после чего собирали аликвотные пробы сыворотки и плазмы в разных точках времени до 840 ч после введения дозы. Анализировали точки времени до 168 ч. Образцы для разных точек времени аффинно очищали с применением реактивов против Ес, а затем анализировали методом массспектометрии МАБ-ЭЕ Сравнение результатов двух анализов выявило хорошую корреляцию между ними.
При анализе данных, полученных способом иммуноаффинность-МАЬПф было обнаружено, что в результате мутации Р171 в Р171С обрезание молекулы Ес-ЕСЕ21 Б98К/Р171С в сайте Р171 элиминировалось. Однако для мутанта Ес-ЕСЕ21 Б98К/Р171С наблюдалось минорное и медленное разрушение, приводящее к утрате до трех С-концевых остатков (фиг. 32). Минорные расщепления в трех С-концевых остатках также наблюдались для других мутантов ЕСЕ21 после того, как более чувствительный сайт расщепления между аминокислотными остатками 171 и 172 был заблокирован, как это показано на фиг. 20 и 21. Расщепление трех С-концевых остатков может представлять остановку отщепления от С
- 47 017690 концевого участка молекулы карбоксипептидазой последовательным (от остатка к остатку) образом или специфическую атаку протеазы в аминокислотных остатках 178 и 179 с неспецифическим расщеплением в аминокислотных остатках 179-180 и 180-181. Утрата 2-3 аминокислот на С-конце может вызывать уменьшенное связывание бета-клото и, в конечном итоге, снижение мощности и уменьшение активности молекулы ш у1уо; см., например, У1е е! а1., 2009, РЕВ8 Ье!!. 583:19-24. Для адресного анализа очевидного разрушающего эффекта карбоксипептидазы на С-конце исследовали влияние добавления колпачка аминокислотного остатка к различным мутантным полипептидам РСР21. С применением методик, описанных в данном документе, были изготовлены и проанализированы многие конструкции, включая те, что представлены в табл. 19. Табл. 19 приводит сводку результатов анализа на ЕЬК-люциферазу ш νίΙΐΌ.
Подходящие аминокислотные колпачки могут иметь длину от 1 до 15 аминокислот, например 1, 2, 3, 4, 5, 10 или 15 аминокислот. В колпачке может быть использовано любое число аминокислот любого типа, например один остаток пролина, один остаток глицина, два остатка глицина, пять остатков глицина, а также другие комбинации. Дополнительные примеры колпачков представлены в непосредственном примере и в табл. 19.
В дополнение к этому, для адресного анализа очевидной атаки протеазы в аминокислотных остатках 178 и 179 исследовали мутации аминокислотных остатков в положениях 179, 180 и 181. И вновь с применением методик, описанных в данном документе, были изготовлены и проанализированы многие конструкции, включая те, что представлены в табл. 19. Также исследовали влияние комбинаций колпачка и мутаций в этих сайтах. Табл. 19 приводит в сводном виде типичные конструкции, которые были изготовлены и проанализированы ш У1!го на активность ЕЬК-люциферазы способом, который описан в данном документе. В соответствии с терминологией, использованной в данном документе, 11Рс означает последовательность Рс человека (например, 8ЕЦ ΙΌ N0: 13), Ь15 относится к линкеру, имеющему 15 аминокислотных остатков (например, 8ЕЦ ΙΌ N0: 23).
Таблица 19
Эффективность и значения ЕС50 для полипептидов ЕСЕ21 с С-концевыми модификациями
| Конструкции Эффективность ЕС50(нМ)
ЬиРОР21 0,4 100,0 %
ЪРсХ15.11РОР2ЦЕ98К, Р171О) 2,5 76,1 %
11РсХ15.11РОР21(Е98К, Р171О, Υ179Ρ) 2,6 78,3 %
ЬрсХ15.ЬР6Р21(Ь98К, Р1716,1-180)
ЬРсХ15.ЬЕ6Г21(Е98К, Р1716, 1-179) 7,8 77,4 %
ЬРсХ15.ЬРОР21(Ь98К, Р171С, А180Е) 1,9 79,6 %
ЬРсХ15.ЬРОР2ЦЬ98К, Р171О, 8181 К) 130 87,9 %
О8О5О86868.НЕ6Е21XI 5.11Рс
МКЕОО.ЬГОР21Х15.ЪРс 834 83,1 %
11РсХ15.11РСР21(Е98К, Р171С, 8181Р, Р182) 272 69,9%
ЪРсХ15.ЬРСР21(Е98К,Р171С,А180О) 3,25 76,9 %
ЬРсХ15.ЬРОР21(Ь98К, Р171О, 81810) 3,43 77,3 %
ЪРсХ15.11ГОР21(Х98К, Р1710,1-182)
1106121(1.98Н. РЗ 710, 0182)
ИГсХ15.ЬЕОР21 (Ь98К, Р1710, Υ179Ρ) 428 44,4 %
НРсХ15.11Р6Р21(Ь98К, Р1710, Υ179Ο) 61 82,6 %
ЬРсХ15ЬРСР21(Ь98К, ΡΙ710, Υ1798) 25,3 74,8 %
ЬРсХ15.ЬРОР21(Ь98К, Р171О, Υ179Α) 43,2 79,6 %
ЬГсХ15.ЬРОР21(Ь98К, Р171О, 8181Т) 3,07 77,6 %
ЬРсХ 15 ΧΡ0Ε21 (Ь9 8К, Р! 710, 8181 А) 2,66 73,5 %
ЬРсХ15.ЬРОР2](Ь98К, Ρ17ΙΟ, 8181Х) 3,46 72,6 %
НРсХ 15,1106021 (Ь98В, ΡΙ710, 8181Р) 33,8 79,5 %
ЬРсХ15.ЬРОР21(Ь98К, Р171О, А180Р) 617 77,1%
ЬРс.Ы5.ЬЕОР21(Р98К, Р171О, А1808) 2,18 84,7 %
НР6Р21 (1.9810. Р171О, Ο66ΟΟΙ82-6)
йРс.Ы5.йГОР21(Ь98К, Р171О, Р182) 6,1 85,9 %
ЬРсХ15.ЬРОР21(Ь98К, Р171О, 0182) 6,5 71,1 %
ЬрсХ15.ЬРОР21(1-178, Ь98К, Р1710) 167 63,9 %
НРсХ15.ЬРОР21(Ь98К, Р171О, 60182-3) 1941 84,2 %
КРсХ15.ЬРОР21(Ь98К, Р171О, 6СССО182-6) 4307 99.7%
На фиг. 33 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови, наблюдаемое у диабетических
- 48 017690 мышей 6Ь/6Ь (фон С57В6). которым впрыскивали контрольный РВ8. нативный ЕСЕ21 дикого типа. ЕсЕСЕ21 (Ь98К. Р1710) и две закрытые колпачками молекулы. к С-концевому участку которых был добавлен или остаток пролина. или остаток глицина. т.е. Рс-Е0Р21 (Ь98К. Р1710. 182Р) и Рс-Е0Р21 (Ь98К. Р171С. 1820). В непосредственном примере. когда остаток добавляли к С-концу полипептида ЕСЕ21 дикого типа или мутантного. остаток упоминается в том положении. которое он занимает в результирующем белке. Так. обозначение 1820 указывает на то. что остаток глицина присоединен к Сконцевому остатку 181 зрелого полипептида дикого типа или мутанта. Фиг. 33 показывает. что нативный ЕСЕ21 снижал уровень глюкозы в крови в течение 6 ч. тогда как три изученных мутанта Ес-ЕСЕ21 демонстрировали длительную активность по снижению глюкозы в крови в течение как минимум 120 ч. Белок Ес-Е СЕ21 (Ь98К. Р1710. 182Р). молекула которого включала добавление остатка пролина на Сконце компонента ЕСЕ21 составного белка. оказался наиболее мощным и приводил к самому низкому уровню глюкозы в крови по сравнению с Рс-Е6Р21 (Ь98К. Р1710) и Рс-Е6Р21 (Ь98К..Р1710. 1820).
В последующем эксперименте изучали активность ίη у1уо молекул Рс-Е0Р21 (Ь98К. Р1710. 1820) и Рс-Е0Р21 (Ь98К. Р1710. 182Р). сопоставляя ее с активностью ίη у1уо закрытой колпачком молекулы. которая включала два остатка глицина. добавленных на С-конце. а именно Рс-Е0Р21 (Ь98К. Р1710. 1820 1830). Фиг. 34 показывает результаты этого эксперимента. Фиг. 34 отображает процентное изменение уровня глюкозы в крови. наблюдаемое у мышей оЬ/оЬ. которым впрыскивали контрольный РВ8. ЕсЕ0Е21 (Ь98К. Р1710). Ес-Е0Е21 (Ь98К. Р1710. 1820 1830). Ес-Е0Е21 (Ь98К. Р1710. 1820) и Ес-Е0Е21 (Ь98К. Р1710. 182Р).
Как показано на фиг. 34. все исследованные молекулы демонстрировали длительную активность по снижению глюкозы при сравнении с контрольным РВ8. Этот эксперимент подтвердил предыдущие результаты (фиг. 33). свидетельствующие о том. что Ес-ЕСЕ21 (Ь98К. Р1710. 182Р) с добавлением пролина на С-конце демонстрирует немного большую активность по снижению уровня глюкозы при сравнении с молекулой без пролинового колпачка. например Ес-ЕСЕ21 (Ь98К. Р1710). Однако оказалось. что добавление двух остатков глицина на С-конце. например Рс-Е0Р21 (Ь98К. Р1710. 1820 1830). снижает мощность молекулы ίη у1уо и уменьшает длительность эффекта ίη у1уо по снижению уровня глюкозы.
На фиг. 35 показано процентное изменение уровня глюкозы в крови. наблюдаемое у диабетических мышей 6Ь/6Ь (фон С57В6). которым впрыскивали контрольный РВ8 или такие мутантные полипептиды Е0Е21. как Ес-Е0Е21 (Ь98К. Р1710). Ес-Е0Е21 (Ь98К. Р1710. Υ 1798). Ес-Е0Е21 (Ь98К. Р1710. Υ179Α). Рс-Е0Р21 (Ь98К. Р1710. А1808) и Рс-Е0Р21 (Ь98К. Р1710. А1800). Все мутанты продемонстрировали сходную активность по снижению уровня глюкозы. а также сходную длительность эффекта.
Фиг. 36 отображает процентное изменение уровня глюкозы в крови. наблюдаемое у диабетических мышей 6Ь/6Ь (фон С57В6). которым впрыскивали контрольный носитель. Рс-Е0Р21 (Ь98К. Р1710). ЕсЕ0Е21 (Ь98К. Р1710. Υ179Р) и Ес-Е0Е21 (Ь98К. Р1710. А180Е). По сравнению с белком Ес-Е0Е21 (Ь98К. Р1710) белок Рс-Е0Р21 (Ь98К. Р1710. Υ 179Е) был менее эффективен в понижении уровня глюкозы в крови. Однако Рс-Е0Р21 (Ь98К. Р1710. А180Е). в котором было произведено мутационное замещение аланина на глутаминовую кислоту в положении 180. оказался более эффективным. чем Ес-Е0Е21 (Ь98К. Р1710) и вызывал дополнительное снижение уровня глюкозы на 20% по сравнению с Рс-Е0Р21 (Ь98К. Р1710). Эти данные позволяют предположить. что мутация А180Е может детерминировать уменьшенное С-концевое разрушение ίη у1уо. то есть улучшенную мощность и эффективность молекулы ίη У1Уо.
Пример 22. Исследование на обезьянах резус.
С применение методологии. описанной в данном документе. была создана конструкция Ес-линкерЕСЕ21. Эта конструкция включала последовательность Ес 1д01 (8Е0 ΙΌ Ν0: 13). соединенную на Сконце с линкерной последовательностью (01у)5-8ег-(01у)3-8ег-(01у)4-8ег (8Е0 ΙΩ Ν0: 23). которая далее была присоединена на С-конце к Ν-концу зрелой последовательности ЕСЕ21 (8Е0 ΙΌ Ν0: 4) с двумя внесенными в последнюю мутациями. Ь98К и Р1710. Затем эта конструкция была экспрессирована и очищена. как описано в данном документе. и была выделена в димерной форме белка. каждый мономер которого был сцеплен через межмолекулярные дисульфидные связи между участками Ес каждого мономера. Эта молекула упоминается в непосредственном примере как Рс-Е0Р21(Κ.0). имеет аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ Ν0: 36 и кодируется последовательностью 8Е0 ΙΌ Ν0: 37. В этом примере обозначение ЕСЕ21 относится к зрелой форме ЕСЕ21. а именно к 8Е0 ΙΌ Ν0: 4.
22.1. Схема исследования.
Конструкцию Рс-Е0Р21(Κ.0) вводили хронически и подкожно (8С) самцам обезьян резус без диабета и с индексом массы тела (ВМЦ > 35. Две других группы обезьян (η=10 на группу) получали либо зрелый ЕСЕ21 (т.е. 8Е0 ΙΌ Ν0: 4). либо контрольный носитель.
Перед началом введения любого испытуемого соединения животные проходили акклиматизацию в течение 42 дней. а затем их делили на группы численностью по 10 особей и вводили посредством множественных 8С инъекций испытуемые соединения или контрольное вещество по принципу слепого исследования. как это отображено графически на фиг. 37. Вкратце. каждому животному делали в день одну инъекцию испытуемого соединения или носителя. ЕСЕ21 вводили ежедневно. тогда как Рс-Е0Р21(Κ.0) вводили еженедельно. Дозы Рс-Е0Р21(Κ.0) и ЕСЕ21 повышали каждые 2 недели. как это показано на
- 49 017690 фиг. 37. По ходу всего исследования контролировали вес тела и потребление пищи. Научноисследовательская организация, работающая по контракту (СК0), не была осведомлена о проводимом лечении.
Перед началом лечения проводили два пероральных теста на толерантность к глюкозе (06ТТ). Результаты 06ТТ1 использовали для разделения животных на три равноценные группы, основываясь на равномерном распределении по таким признакам, как площадь под кривой (АИС) и вес тела.
Результаты второго 06ТТ (06ТТ2) использовали для подтверждения сортировки по итогам первого 06ТТ (06ТТ1). Те обезьяны, для которых профиль 06ТТ, полученный в первом тесте (06ТТ1), отличался от профиля, полученного в следующем тесте (06ТТ2), были исключены из исследования. Результаты 06ТТ1 и 06ТТ2 показаны на фиг. 38А и 38В, а результаты измерений АИС показаны на фиг. 38С. Исходный вес тела показан на фиг. 38Ό и в табл. 20.
06ТТ 3, 4 и 5 проводили через каждые 2 недели по окончании лечения каждой из трех доз (низкой, средней и высокой). Образцы крови от животных собирали натощак еженедельно и использовали их для измерения уровней глюкозы, инсулина, триглицеридов, а также уровня испытуемого соединения. Образца крови также собирали еженедельно в течение 3-недельного периода отмывания. Начальные результаты 06ТТ1 и 06ТТ2 показали ожидаемый профиль глюкозы у здоровых животных с максимальным уровнем глюкозы в плазме через 30 мин и продемонстрировали стабильность АИС в 3 разных группах.
Исходные биохимические показатели плазмы натощак показаны в табл. 20. Биохимические измерения в плазме проводили на образцах крови, полученных перед началом лечения.
Таблица 20
Исходные показатели веса тела, уровней глюкозы, инсулина и триглицеридов в плазме натощак в трех группах обезьян резус
Носитель РСЕ21 Рс-РОР21(К.О)
N 10 10 10
Вес тела (кг) 8,5 ± 0,5 8,7 ± 0,4 8,5 ± 0,4
Глюкоза в плазме (мг/дл) 91,9 ±4,8 94,8 ± 5,3 82,2 ±3,7
Инсулин (пг/мл) 942,6 ± 121 4 976,1 ± 107 7 1023,4 ±205,1
Триглицериды (мг/дл) 44,4 ± 4,8 58,6 ±5,2 71,7 ±9,8
Были выбраны три разных уровня дозы: низкие дозы составляли 0,1 и 0,3 мг/кг, средние дозы - 0,3 и 1 мг/кг, а высокие дозы - 1 и 5 мг/кг для Е6Е21 и Ес-Е6Е21 (КС) соответственно. Уровни дозы были выбраны на основе наблюдаемой дозовой реакции у мышей, а схема введения доз основывалась на ожидаемой частоте инъекций для человека. Для средней и низкой доз были использованы эквимолярные дозы Е6Е21, а высокую дозу Ес-Е6Е21(К6) увеличили до 5 мг/кг (вместо 3 мг/кг, что соответствовало дозе, эквимолярной 1 мг/кг для Е6Е21).
22.2. Влияние испытуемых соединений на вес тела.
В этом эксперименте для оценки влияния испытуемых соединений на вес тела, измеряемый еженедельно, в трех разных группах обезьян резус еженедельно рассчитывали процентное изменение веса тела по сравнению с исходным. Вес тела также измеряли в течение трехнедельного периода отмывания. В табл. 20 указаны исходные значения веса тела для каждой группы.
Вес тела контролировали по ходу всего исследования как до, так и после выведения испытуемых соединений. Процентное изменение веса тела по сравнению с начальным у животных, получавших носитель, нарастало, тогда как у животных, получавших Ес-Е6Е21(К6) и Е6Е21, на протяжении 6-недельного периода лечения вес тела снижался с эффектом дозовой зависимости, как это показано на фиг. 39. Как ранее наблюдалось у грызунов (Хи е! а1., Э|аЬе1е5 58(1):250-9 (2009)), лечение Е6Е21 снижало вес тела на уровне статистической значимости. Ес-Е6Е21(К6) имел большую экспозицию по сравнению с Е6Е21 (на фиг. 48 и 47 соответственно), и это позволяло дать полученным наблюдениям такое возможное объяснение, что Ес-Е6Е21(К6) демонстрировал более выраженное снижение веса тела по сравнению с Е6Е21.
22.3. Влияние испытуемых соединений на уровень инсулина.
Уровень инсулина измеряли в образцах крови, полученных после ночного перерыва в приеме пищи (натощак) или после дневного кормления.
Уровень инсулина в плазме у обезьян резус, получавших носитель, Е6Е21 или Ес-Е6Е21(К6), измеряли натощак еженедельно, включая 3-недельный период отмывания. Образцы крови натощак собирали приблизительно через пять дней после последней инъекции Ес-Е6Е21(К6) и приблизительно через 21 ч после последней инъекции Е6Е21.
Уровень инсулина в плазме после приема пищи у обезьян резус измеряли на пятой и шестой неделе лечения либо носителем, либо Е6Е21 в высокой дозе. Образцы крови после приема пищи собирали приблизительно через три дня после последней инъекции Ес-Е6Е21(К6) и приблизительно через 2 ч после последней инъекции Е6Е21. Фиг. 40 показывает влияние носителя, Е6Е21 и Ес-Е6Е21(К6) на уровень инсулина в крови натощак на протяжении всего девятинедельного исследования, тогда как фиг. 41 отображает уровень инсулина после приема пищи, определенный в образцах, которые были получены на 5-й
- 50 017690 и 6-й неделях.
Вкратце, в двух самых высоких дозах как ЕСЕ21, так и Ес-ЕСЕ21(КС) статистически значимо понижали уровень инсулина натощак и после приема пищи. То наблюдение, что уровень инсулина у животных, получавших ЕСЕ21 и Ес-ЕСЕ21(КС), снижался, а повышения уровня инсулина не происходило, свидетельствует о повышенной чувствительности к инсулину.
22.4. Влияние испытуемых соединений на 0СТТ (глюкоза и инсулин).
Три теста 0СТТ (0СТТ 3, 4 и 5) были проведены после начала лечения. В тесте 0СТТ5 профили уровней глюкозы и инсулина измеряли у животных, которые в течение 6 недель получали носитель, ЕСЕ21 или Ес-ЕСЕ21(КС), в соответствии с последними двумя неделями режима повышения дозы (высокая доза). Тест 0СТТ5 проводили приблизительно через 7 дней после последней инъекции ЕсЕСЕ21(КС) и приблизительно через 21 ч после последней инъекции ЕСЕ21. Профили глюкозы и инсулина в тесте 0СТТ5 показаны на фиг. 42 и 43 соответственно. Животные, получавшие Ес-ЕСЕ21(КС), демонстрировали улучшенный клиренс глюкозы, сравнимый с 5 животными, получавшими носитель, только при самой высокой дозе и в последней точке времени при проведении измерений, как это показано на фиг. 42. В конце периода введения последней дозы Ес-ЕСЕ21(КС) показал самое сильное улучшение клиренса глюкозы. ЕСЕ21 не показал улучшения клиренса глюкозы. Ес-ЕСЕ21(КС) имел большую экспозицию по сравнению с ЕСЕ21 (на фиг. 48 и 47 соответственно), и это позволяло дать полученным наблюдениям такое возможное объяснение, что Ес-ЕСЕ21(КС) демонстрировал более выраженный эффект в отношении клиренса глюкозы по сравнению с ЕСЕ21. Уровень инсулина по результатам теста 0СТТ5 был статистически значимо снижен в последней точке времени проведения изменений у животных, получавших Ес-ЕСЕ21(КС), по сравнению с животными, получавшими носитель.
Процентное изменение АИС глюкозы по сравнению с исходным рассчитывали для трех 0СТТ (0СТТ 3, 4 и 5), проведенных в конце периода введения каждой дозы (низкой, средней и высокой) в трех разных группах обезьян резус, как это показано на фиг. 44. Тест 0СТТ5 проводили приблизительно через семь дней после последней инъекции Ес-ЕСЕ21(КС) и через 21 ч после последней инъекции ЕСЕ21, и полученные результаты показали, что Ес-ЕСЕ21(КС) статистически значимо улучшал АИС5. Исходные показатели теста 0СТТ для каждой группы показаны на фиг. 38С.
Уровень глюкозы в плазме натощак измеряли в те дни, когда не проводили тесты 0СТТ. Не было выявлено каких-либо значимых статистических различий между тремя группами животных по результатам измерений уровня глюкозы натощак.
22.5. Влияние испытуемых соединений на уровень триглицеридов.
Процентное изменение уровня триглицеридов натощак в плазме у обезьян резус, получавших носитель, ЕСЕ21 или Ес-ЕСЕ21(КС), рассчитывали еженедельно, включая 3-недельный период отмывания. Образцы крови натощак собирали приблизительно через пять дней после последней инъекции ЕсЕСЕ21(КС) и приблизительно через 21 ч после последней инъекции ЕСЕ21. Уровень триглицеридов измеряли каждую неделю после начала лечения, процентные изменения по сравнению с начальным уровнем показаны на фиг. 45, и исходные величины натощак показаны в табл. 20.
Как отображено на фиг. 45, животные, получавшие либо Ес-ЕСЕ21 (КС), либо ЕСЕ21, демонстрировали снижение уровня триглицеридов с эффектом дозовой зависимости, причем Ес-ЕСЕ21(КС) имел более выраженный понижающий эффект по сравнению с ЕСЕ21.
На фиг. 46 показан уровень триглицеридов в плазме в образцах, полученных от обезьян резус после приема пищи на пятой и шестой неделе лечения носителем, Ес-ЕСЕ21(КС) или ЕСЕ21. Образцы крови после приема пищи собирали приблизительно через 3 дня после последней инъекции Ес-ЕСЕ21(КС) и приблизительно через 2 ч после последней инъекции ЕСЕ21. Уровень триглицеридов в плазме после приема пищи у животных, получавших ЕСЕ21 и Ес-ЕСЕ21(КС), был статистически значимо снижен по сравнению с животными, получавшими носитель (фиг. 46).
22.6. Концентрация испытуемых соединений.
Экспозицию испытуемых соединений, вводимых на приблизительно эквивалентном уровне молярной дозы, оценивали на протяжении всего исследования. Концентрацию Ес-ЕСЕ21(КС) измеряли перед введением дозы и приблизительно через 5 дней после последней инъекции. Уровень ЕСЕ21 измеряли перед введением дозы, а также через 5, 12, 19 и 26 дней. Образцы крови получали приблизительно через 21 ч после последней инъекции.
Показатели индивидуальной концентрации испытуемых соединений у каждой обезьяны отображены на фиг. 47 и 48. Как показано на фиг. 47, большинство животных в группе, получавшей ЕСЕ21, имели концентрацию ниже порога количественного определения. Фиг. 48 показывает, что животные в группе, получавшей Ес-ЕСЕ21(КС), имели определяемый уровень Ес-ЕСЕ21(КС) в каждой дозовой фазе (две еженедельные дозы одинаковой интенсивности). Средняя концентрация в каждой дозовой фазе для ЕсЕСЕ21(КС) увеличивалась примерно пропорционально дозе от 0,3 до 5 мг/кг. Имеется минимальное накопление, о чем свидетельствует устойчивая концентрация после первой и второй еженедельной дозы в каждой фазе повышения дозы для обоих соединений. В фазе после лечения (период отмывания) уровень Ес-ЕСЕ21(КС) был определяемым приблизительно до 47-го дня (12 дней после последней дозы), а после этого падал ниже порога количественного определения (ЪЬ0О).
- 51 017690
Экспозицию испытуемых соединений также мониторировали при каждом 0СТТ. ЕСЕ21 не поддавался определению в ходе тестов 0СТТ 3 и 4, после лечения ЕСЕ21 в низкой и средней дозах. Однако по результатам 0СТТ5, т.е. после лечения высокой дозой, наблюдался определяемый уровень. Пропорциональное дозе увеличение уровня Ес-ЕСЕ21(КС) наблюдалось от третьего до пятого 0СТТ при увеличении дозы, как это показано на фиг. 49.
Данные об уровнях соединений подтверждают, что животные подвергались воздействию ожидаемого количества каждого соединения, а именно ЕСЕ21 и Ес-ЕСЕ21(КС), в режиме повышения дозы. В отношении измеряемого количества ЕСЕ21 наблюдалась большая вариабельность, которая представляла собой ожидаемый результат, учитывая то, что сбор образцов проводили приблизительно через 21 ч после последней дозы, а период полувыведения ЕСЕ21 составляет приблизительно 1 ч.
22.7. Выводы.
ЕСЕ21 понижал уровень триглицеридов натощак и после приема пищи, уровень инсулина, и уменьшал вес тела в самых высоких дозах. Ес-ЕСЕ21(КС) улучшал показатели тестов 0СТТ и понижал уровень инсулина в самой высокой дозе, а также с эффектом дозовой зависимости понижал уровень триглицеридов в плазме натощак и после приема пищи, как и вес тела. Как ЕСЕ21, так и Ес-ЕСЕ21(КС) снижали показатели по многим метаболическим параметрам у обезьян резус, не отягощенных сахарным диабетом. Уровень инсулина и триглицеридов снижался одинаково при лечении ЕСЕ21 и Ес-ЕСЕ21(КС), если уровень циркулирующих соединений находился в сходном диапазоне (в состоянии животных после приема пищи). Вследствие улучшенных характеристик Ес-ЕСЕ21 (КС) превосходил ЕСЕ21 в отношении большинства измеряемых параметров, а для эффективного воздействия на метаболические параметры его можно было вводить один раз в неделю.
Хотя настоящее изобретение было описано на основе различных вариантов его осуществления, квалифицированные специалисты поймут, что вполне возможны его вариации и модификации. Таким образом, надо понимать, что прилагаемая формула изобретения охватывает все равноценные вариации, которые относятся к сфере действия настоящего изобретения, заявленного в данном документе. В дополнение к этому, следует упомянуть, что заголовки разделов, использованные в данном документе, даны только в организационных целях и на должны восприниматься как ограничивающие описанный здесь предмет обсуждения.
Все источники, процитированные в этой заявке, явным образом включены в настоящий документ в качестве ссылок.

Claims (15)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Изолированный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 4, где полипептид включает а) остаток аргинина в положении 98 последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 4 и Ь) остаток глицина в положении 171 последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 4.
  2. 2. Изолированный полипептид по п.1, дополнительно включающий мутацию в положении 180.
  3. 3. Составной полипептид, включающий полипептид по п.1, присоединенный к гетерологичному полипептиду.
  4. 4. Составной полипептид по п.3, в котором гетерологичный полипептид представляет собой Ес полипептид.
  5. 5. Составной полипептид по п.4, в котором Ес полипептид содержит аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 13.
  6. 6. Составной полипептид по п.5, в котором полипептид присоединен к Ес полипептиду через линкер.
  7. 7. Составной полипептид по п.6, в котором линкер представляет собой ССССС8ССС8СССС8 (8ЕО ΙΌ N0: 23).
  8. 8. Составной полипептид по п.7, включающий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 38.
  9. 9. Составной полипептид по п.6, в котором линкер представляет собой СССС8СССС8СССС8 (8ЕО ΙΌ N0: 31).
  10. 10. Составной полипептид по п.9, включающий аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ N0: 36.
  11. 11. Составной полипептид, кодируемый нуклеотидами 1-1272 последовательности 8ЕЦ ΙΌ N0: 37.
  12. 12. Мультимер, включающий две или более копий составного полипептида по п.8.
  13. 13. Фармацевтическая композиция, содержащая составной полипептид по п.8 и фармацевтически приемлемый агент для приготовления лекарственной формы.
  14. 14. Мультимер, включающий две или более копий составного полипептида по п.10.
  15. 15. Фармацевтическая композиция, содержащая составной полипептид по п.10 и фармацевтически приемлемый агент для приготовления лекарственной формы.
EA201001883A 2008-06-04 2009-06-03 Мутанты fgf21 и их применение EA017690B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US5891908P 2008-06-04 2008-06-04
US5886108P 2008-06-04 2008-06-04
US16436409P 2009-03-27 2009-03-27
US17573609P 2009-05-05 2009-05-05
PCT/US2009/046113 WO2009149171A2 (en) 2008-06-04 2009-06-03 Fgf21 mutants and uses thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201001883A1 EA201001883A1 (ru) 2011-06-30
EA017690B1 true EA017690B1 (ru) 2013-02-28

Family

ID=40984291

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201270758A EA024751B8 (ru) 2008-06-04 2009-06-03 Мутанты fgf21 и их применение
EA201690946A EA034847B1 (ru) 2008-06-04 2009-06-03 Мутанты fgf21 и их применение
EA201001883A EA017690B1 (ru) 2008-06-04 2009-06-03 Мутанты fgf21 и их применение

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201270758A EA024751B8 (ru) 2008-06-04 2009-06-03 Мутанты fgf21 и их применение
EA201690946A EA034847B1 (ru) 2008-06-04 2009-06-03 Мутанты fgf21 и их применение

Country Status (23)

Country Link
US (9) US8034770B2 (ru)
EP (1) EP2296690B1 (ru)
JP (5) JP2011523561A (ru)
KR (2) KR101651697B1 (ru)
CN (1) CN102143758B (ru)
AR (1) AR072009A1 (ru)
AU (1) AU2009256232B2 (ru)
BR (2) BR122020010972B1 (ru)
CA (1) CA2726589C (ru)
CL (1) CL2010001346A1 (ru)
CO (1) CO6341566A2 (ru)
CR (1) CR11851A (ru)
EA (3) EA024751B8 (ru)
IL (1) IL209395A (ru)
JO (1) JOP20190083A1 (ru)
MA (1) MA33142B1 (ru)
MX (2) MX346396B (ru)
MY (1) MY152721A (ru)
NZ (1) NZ590050A (ru)
PE (1) PE20100253A1 (ru)
SG (1) SG193860A1 (ru)
TW (2) TWI526220B (ru)
WO (1) WO2009149171A2 (ru)

Families Citing this family (104)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104163864B (zh) 2007-03-30 2017-08-01 Ambrx公司 经修饰fgf‑21多肽和其用途
JOP20190083A1 (ar) 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
EA201990619A1 (ru) 2008-10-10 2019-07-31 Амген Инк. Fgf21 мутанты и их применение
WO2010065439A1 (en) * 2008-12-05 2010-06-10 Eli Lilly And Company Variants of fibroblast growth factor 21
UY32607A (es) * 2009-05-05 2010-12-31 Amgen Inc Mutantes de fgf21 y usos del mismo
EP2427207B1 (en) 2009-05-05 2017-08-16 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
JP2012530493A (ja) 2009-06-17 2012-12-06 アムジエン・インコーポレーテツド キメラポリペプチドおよびその使用
WO2011006072A2 (en) * 2009-07-10 2011-01-13 Northwestern University Cardioprotective role of hepatic cells and hepatocyte secretory factors in myocardial ischemia
CN101993485B (zh) * 2009-08-20 2013-04-17 重庆富进生物医药有限公司 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途
MX2012006397A (es) 2009-12-02 2012-11-30 Amgen Inc PROTEINAS DE ENLACE QUE ENLAZAN A FGFR1C HUMANO, ß-KLOTHO HUMANA Y TANTO FGFR1C HUMANO COMO ß-KLOTHO HUMANA.
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
WO2011107494A1 (de) 2010-03-03 2011-09-09 Sanofi Neue aromatische glykosidderivate, diese verbindungen enthaltende arzneimittel und deren verwendung
CA2796055A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Amgen Inc. Human fgf receptor and .beta.-klotho binding proteins
DE102010015123A1 (de) 2010-04-16 2011-10-20 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Benzylamidische Diphenylazetidinone, diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel und deren Verwendung
EP2558115B1 (en) 2010-04-16 2019-07-31 The Salk Institute for Biological Studies Methods for treating metabolic disorders using fgf
US8530413B2 (en) 2010-06-21 2013-09-10 Sanofi Heterocyclically substituted methoxyphenyl derivatives with an oxo group, processes for preparation thereof and use thereof as medicaments
TW201215388A (en) 2010-07-05 2012-04-16 Sanofi Sa (2-aryloxyacetylamino)phenylpropionic acid derivatives, processes for preparation thereof and use thereof as medicaments
TW201221505A (en) 2010-07-05 2012-06-01 Sanofi Sa Aryloxyalkylene-substituted hydroxyphenylhexynoic acids, process for preparation thereof and use thereof as a medicament
TW201215387A (en) 2010-07-05 2012-04-16 Sanofi Aventis Spirocyclically substituted 1,3-propane dioxide derivatives, processes for preparation thereof and use thereof as a medicament
JP2013536233A (ja) 2010-08-23 2013-09-19 アムジエン・インコーポレーテツド グルコキナーゼ調節タンパク質と相互作用する糖尿病治療用の化合物
RU2013118441A (ru) 2010-11-05 2014-12-10 КовЭкс Текнолоджиз Айэлэнд Лимитед Антидиабетические соединения
CN102464712A (zh) * 2010-11-11 2012-05-23 重庆富进生物医药有限公司 缺失型人成纤维细胞生长因子21变异体及其偶联物
US20140155415A1 (en) 2011-04-05 2014-06-05 Michael David BARTBERGER Benzodioxepine and benzodioxine compounds that interact with glucokinase regulatory protein for the treatment of diabetes
US8754044B2 (en) 2011-05-03 2014-06-17 Northwestern University Neuroprotection by hepatic cells and hepatocyte secretory factors
KR102077721B1 (ko) 2011-07-01 2020-02-14 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 대사성 장애 및 질환의 치료를 위한 조성물, 용도 및 방법
MX2014002260A (es) * 2011-08-31 2014-08-18 Amgen Inc Factor de crecimiento de fibroblasto 21 para usar en el tratamiento de diabetes tipo 1.
EP2567959B1 (en) 2011-09-12 2014-04-16 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-styryl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
WO2013037390A1 (en) 2011-09-12 2013-03-21 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-styryl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
TWI593708B (zh) * 2011-09-26 2017-08-01 諾華公司 治療代謝病症之融合蛋白質
EP2760862B1 (en) 2011-09-27 2015-10-21 Sanofi 6-(4-hydroxy-phenyl)-3-alkyl-1h-pyrazolo[3,4-b]pyridine-4-carboxylic acid amide derivatives as kinase inhibitors
AR087973A1 (es) * 2011-10-04 2014-04-30 Lilly Co Eli Variantes del factor 21 del crecimiento de fibroblastos
CN102558358A (zh) * 2011-12-30 2012-07-11 张海涛 人成纤维细胞生长因子21融合蛋白及其突变体的制备与应用
WO2013123444A1 (en) 2012-02-17 2013-08-22 Amgen Inc. Sulfonyl compounds that interact with glucokinase regulatory protein
US9475856B2 (en) 2012-03-02 2016-10-25 New York University Chimeric FGF21 proteins with enhanced binding affinity for β-klotho for the treatment of type II diabetes, obesity, and related metabolic disorders
WO2013173382A1 (en) 2012-05-15 2013-11-21 Amgen Inc. Benzothiophene sulfonamides and other compounds that interact with glucokinase regulatory protein
WO2013172967A1 (en) 2012-05-17 2013-11-21 Extend Biosciences, Inc Carriers for improved drug delivery
US9474785B2 (en) 2012-06-07 2016-10-25 New York University Chimeric fibroblast growth factor 19 proteins and methods of use
US9464126B2 (en) 2012-06-07 2016-10-11 New York University Chimeric fibroblast growth factor 21 proteins and methods of use
US9657075B2 (en) 2012-06-07 2017-05-23 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
TWI513705B (zh) * 2012-06-11 2015-12-21 Lilly Co Eli 纖維母細胞生長因子２１蛋白質
AU2013274639A1 (en) 2012-06-11 2014-11-06 Eli Lilly And Company Fibroblast growth factor 21 variants
AR092076A1 (es) * 2012-08-22 2015-03-18 Lilly Co Eli Proteinas homodimericas
EP3798228A1 (en) 2012-11-28 2021-03-31 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for treatment of metabolic disorders and diseases
US9290557B2 (en) 2012-11-28 2016-03-22 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Compositions comprising variants and fusions of FGF19 polypeptides
US9273107B2 (en) 2012-12-27 2016-03-01 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Uses and methods for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
ES2915851T3 (es) 2012-12-27 2022-06-27 Ngm Biopharmaceuticals Inc Péptidos quiméricos de FGF19 para usar en el tratamiento de trastornos de ácidos biliares
WO2014130659A1 (en) 2013-02-22 2014-08-28 New York University Chimeric fibroblast growth factor 23 proteins and methods of use
WO2014149699A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Eli Lilly And Company Bifunctional protein
CN103191415A (zh) * 2013-04-03 2013-07-10 哈尔滨博翱生物医药技术开发有限公司 成纤维细胞生长因子-21成熟肽在制备治疗高血压的药物中的应用
EP3057605A1 (en) 2013-10-18 2016-08-24 Novartis AG Methods of treating diabetes and related disorders
WO2015061331A1 (en) 2013-10-21 2015-04-30 Salk Institute For Biological Studies Chimeric fibroblast growth factor (fgf) 2/fgf1 peptides and methods of use
JP6621752B2 (ja) 2013-10-21 2019-12-18 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ 変異した線維芽細胞増殖因子（ｆｇｆ）１および使用方法
CA2927592C (en) 2013-10-28 2020-08-18 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Fgf-19 variants for treating a fgf-19 dependent cancer or tumor
EP3097122B9 (en) 2014-01-24 2020-11-11 NGM Biopharmaceuticals, Inc. Antibodies binding beta klotho domain 2 and methods of use thereof
JP6712230B2 (ja) 2014-03-11 2020-06-17 ノバルティス アーゲー リポジストロフィーおよびインスリン産生の欠損またはインスリンシグナル伝達の欠損と関連する代謝性障害を処置する方法
US10519240B2 (en) 2014-03-25 2019-12-31 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-FGFR1c antibody-FGF21 fusion proteins
WO2015183890A2 (en) * 2014-05-28 2015-12-03 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the treatment of metabolic disorders and diseases
US10456449B2 (en) 2014-06-16 2019-10-29 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods and uses for modulating bile acid homeostasis and treatment of bile acid disorders and diseases
US9616109B2 (en) 2014-10-22 2017-04-11 Extend Biosciences, Inc. Insulin vitamin D conjugates
US9789197B2 (en) 2014-10-22 2017-10-17 Extend Biosciences, Inc. RNAi vitamin D conjugates
CA2964463C (en) 2014-10-22 2024-02-13 Extend Biosciences, Inc. Therapeutic vitamin d conjugates
IL251834B2 (en) 2014-10-23 2023-09-01 Ngm Biopharmaceuticals Inc Pharmaceutical compositions containing peptide variants and methods of using them
PL3412302T3 (pl) 2014-10-24 2021-11-02 Bristol-Myers Squibb Company Zmodyfikowane polipeptydy fgf-21 i ich zastosowania
WO2016073855A1 (en) 2014-11-07 2016-05-12 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders and prediction of clinical sensitivity to treatment of bile acid-related disorders
KR102427527B1 (ko) 2014-12-23 2022-08-01 노보 노르디스크 에이/에스 Fgf21 유도체 및 그것의 용도
KR20160088656A (ko) 2015-01-16 2016-07-26 주식회사유한양행 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
US11638745B2 (en) 2015-05-20 2023-05-02 University of Pittsburgh—Of the Commonwealth Cvctom of Hierher Education Method to improve neurologic outcomes in temperature managed patients
US10800843B2 (en) 2015-07-29 2020-10-13 Ngm Biopharmaceuticals, Inc. Beta klotho-binding proteins
KR102668200B1 (ko) * 2015-10-28 2024-05-23 주식회사유한양행 지속형 fgf21 융합 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
KR102670157B1 (ko) * 2015-10-28 2024-05-29 주식회사유한양행 이중 작용 단백질 및 이를 포함하는 약학적 조성물
AU2016344134A1 (en) 2015-10-30 2018-05-31 Salk Institute For Biological Studies Treatment of steroid-induced hyperglycemia with fibroblast growth factor (FGF) 1 analogs
CA3082794A1 (en) 2015-11-09 2017-05-18 Ngm Biopharmaceuticals Inc. Methods for treatment of bile acid-related disorders
TW201731867A (zh) * 2015-12-02 2017-09-16 賽諾菲公司 Ｆｇｆ２１變異體
WO2017116207A1 (ko) * 2015-12-31 2017-07-06 한미약품 주식회사 Fgf21 아날로그, fgf21 결합체, 및 이의 용도
US20190142963A1 (en) * 2016-04-15 2019-05-16 Richard D. DiMarchi Fgf21 c-terminal peptide optimization
MA45797A (fr) 2016-08-01 2021-04-21 Hope Medicine Nanjing Co Ltd Mutant de mg53, son procédé de préparation et ses utilisations
CN106279437B (zh) 2016-08-19 2017-10-31 安源医药科技（上海）有限公司 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途
CN107759694B (zh) 2016-08-19 2023-01-13 安源医药科技（上海）有限公司 双特异性抗体及其制备方法与用途
US11123438B2 (en) 2016-08-19 2021-09-21 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Linker peptide for constructing fusion protein
EP3503882A4 (en) 2016-08-26 2020-07-29 NGM Biopharmaceuticals, Inc. METHOD FOR TREATING FIBROBLAST GROWTH FACTOR-19-MEDIATED CARCINOMAS AND TUMORS
AU2017358289A1 (en) 2016-11-10 2019-06-20 Yuhan Corporation Pharmaceutical composition for preventing or treating hepatitis, hepatic fibrosis, and hepatic cirrhosis comprising fusion proteins
WO2018115401A1 (en) 2016-12-22 2018-06-28 Sanofi Fgf21 compound / glp-1r agonist combinations with optimized activity ratio
CN108619490A (zh) * 2017-03-22 2018-10-09 天士力医药集团股份有限公司 一种长效化突变的人源成纤维生长因子的新用途
MX2019012331A (es) * 2017-04-21 2020-01-23 Yuhan Corp Metodo para producir proteinas de doble funcion y sus derivados.
CN107056925B (zh) * 2017-04-28 2022-01-14 中国科学院合肥物质科学研究院 人fgf21突变体、其制备方法及用途
AU2018297285A1 (en) 2017-07-06 2020-01-30 Yale University Compositions and methods for treating or preventing endocrine FGF-linked diseases
CN111050786A (zh) 2017-09-08 2020-04-21 百时美施贵宝公司 用于治疗非酒精性脂肪性肝炎(nash)的方法的修饰的成纤维细胞生长因子21(fgf-21)
CN115109166A (zh) * 2017-11-24 2022-09-27 浙江道尔生物科技有限公司 一种治疗代谢疾病的多结构域活性蛋白
CN111518770B (zh) 2017-12-19 2023-01-06 北京吉源生物科技有限公司 一种表达glp1和fgf21的干细胞及其用途
CN110128525B (zh) * 2018-02-08 2022-08-26 广东东阳光药业有限公司 Fgf21变体、融合蛋白及其应用
JP7492463B2 (ja) 2018-07-03 2024-05-29 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー Ｆｇｆ－２１製剤
CA3123325A1 (en) * 2019-03-05 2020-09-10 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. A polypeptide molecule and application thereof
US11427623B1 (en) 2019-05-28 2022-08-30 89Bio Ltd. Methods of treatment using mutant FGF-21 peptide conjugates
US11542309B2 (en) 2019-07-31 2023-01-03 Salk Institute For Biological Studies Fibroblast growth factor 1 (FGF1) mutant proteins that selectively activate FGFR1B to reduce blood glucose
US20220016211A1 (en) 2020-01-08 2022-01-20 Bristol-Myers Squibb Company Fgf-21 conjugate formulations
JP7392491B2 (ja) * 2020-01-21 2023-12-06 トヨタ自動車株式会社 電源システム
US11981718B2 (en) 2020-05-27 2024-05-14 Ampsource Biopharma Shanghai Inc. Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation
WO2022032187A1 (en) 2020-08-07 2022-02-10 Bristol-Myers Squibb Company Fgf21 combined with ccr2/5 antagonists for the treatment of fibrosis
US20240123031A1 (en) 2020-11-25 2024-04-18 Bristol-Myers Squibb Company Methods of treating liver diseases
WO2023035817A1 (zh) 2021-09-08 2023-03-16 北京志道生物科技有限公司 一种fgf21突变蛋白及其应用
CA3233918A1 (en) 2021-10-13 2023-04-20 Mariana N. Dimitrova Pharmaceutical compositions of efruxifermin
CN113980147B (zh) * 2021-11-26 2023-07-28 中国药科大学 一种聚多肽与fgf21融合蛋白突变体及其应用
WO2023173021A2 (en) * 2022-03-11 2023-09-14 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions for the treatment of alcohol toxicity
WO2024059507A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 Akero Therapeutics, Inc. Fgf21 mutant polypeptides

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005061712A1 (en) * 2003-12-10 2005-07-07 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2006028595A2 (en) * 2004-09-02 2006-03-16 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2006065582A2 (en) * 2004-12-14 2006-06-22 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2007110079A2 (en) * 2006-03-29 2007-10-04 Enkam Pharmaceuticals A/S Targeted delivery of fgfr ligands into the brain

Family Cites Families (174)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4263428A (en) 1978-03-24 1981-04-21 The Regents Of The University Of California Bis-anthracycline nucleic acid function inhibitors and improved method for administering the same
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
IE52535B1 (en) 1981-02-16 1987-12-09 Ici Plc Continuous release pharmaceutical compositions
US4436366A (en) 1981-02-17 1984-03-13 E. I. Du Pont De Nemours And Company End capping an optical fiber
AR230173A1 (es) 1981-06-29 1984-03-01 American Cyanamid Co Instrumento para ligaciones quirurgicas
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
EP0088046B1 (de) 1982-02-17 1987-12-09 Ciba-Geigy Ag Lipide in wässriger Phase
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
EP0133968B1 (en) 1983-07-29 1989-06-07 Mitsubishi Denki Kabushiki Kaisha Solid state overcurrent detector
HUT35524A (en) 1983-08-02 1985-07-29 Hoechst Ag Process for preparing pharmaceutical compositions containing regulatory /regulative/ peptides providing for the retarded release of the active substance
US4615885A (en) 1983-11-01 1986-10-07 Terumo Kabushiki Kaisha Pharmaceutical composition containing urokinase
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
DE3572982D1 (en) 1984-03-06 1989-10-19 Takeda Chemical Industries Ltd Chemically modified lymphokine and production thereof
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
CA1310924C (en) 1986-04-24 1992-12-01 Francis P. Mccormick Infective drug delivery system
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4970154A (en) 1987-10-09 1990-11-13 Baylor College Of Medicine Method for inserting foreign genes into cells using pulsed radiofrequency
ATE106249T1 (de) 1987-11-05 1994-06-15 Hybritech Inc Polysaccharidmodifizierte immunglobuline mit reduziertem immunogenem potential oder verbesserter pharmakokinetik.
US4892538A (en) 1987-11-17 1990-01-09 Brown University Research Foundation In vivo delivery of neurotransmitters by implanted, encapsulated cells
US5106627A (en) 1987-11-17 1992-04-21 Brown University Research Foundation Neurological therapy devices
US5158881A (en) 1987-11-17 1992-10-27 Brown University Research Foundation Method and system for encapsulating cells in a tubular extrudate in separate cell compartments
US5011472A (en) 1988-09-06 1991-04-30 Brown University Research Foundation Implantable delivery system for biological factors
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
ATE135370T1 (de) 1988-12-22 1996-03-15 Kirin Amgen Inc Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5288855A (en) * 1989-01-23 1994-02-22 Farmitalia Carlo Erba Extracellular form of the human fibroblast growth factor receptor
DK0481000T3 (da) * 1989-07-06 1999-11-15 Univ California Receptorer for fibroblastvækstfaktorer
US5676954A (en) 1989-11-03 1997-10-14 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
US5272071A (en) 1989-12-22 1993-12-21 Applied Research Systems Ars Holding N.V. Method for the modification of the expression characteristics of an endogenous gene of a given cell line
ES2151463T5 (es) 1989-12-22 2012-10-29 Merck Serono Sa Constructos de ADN para la activación y la modificación de la expresión de genes endógenos
WO1991010470A1 (en) 1990-01-08 1991-07-25 Brown University Research Foundation Devices and methods for enhanced delivery of active factors
JP3068180B2 (ja) 1990-01-12 2000-07-24 アブジェニックス インコーポレイテッド 異種抗体の生成
US5672510A (en) 1990-01-19 1997-09-30 Genetic Therapy, Inc. Retroviral vectors
ES2204886T3 (es) 1990-07-06 2004-05-01 Gencell S.A. Receptores de factor de crecimiento fibroblastico.
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5217889A (en) 1990-10-19 1993-06-08 Roninson Igor B Methods and applications for efficient genetic suppressor elements
US5252714A (en) 1990-11-28 1993-10-12 The University Of Alabama In Huntsville Preparation and use of polyethylene glycol propionaldehyde
US5229501A (en) * 1991-01-11 1993-07-20 Chiron Corporation Expression and use of human fibroblast growth factor receptor
US6565841B1 (en) 1991-03-15 2003-05-20 Amgen, Inc. Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor
IL100219A0 (en) 1991-12-02 1992-09-06 Yeda Res & Dev Variable region within fibroblast growth factor receptors that confers ligand specificity
WO1993015722A1 (en) 1992-02-07 1993-08-19 Syntex (Usa) Inc. Controlled delivery of pharmaceuticals from preformed porous microparticles
US5234784A (en) 1992-04-01 1993-08-10 Eastman Kodak Company Method of making a projection viewable transparency comprising an electrostatographic toner image
US5364791A (en) 1992-05-14 1994-11-15 Elisabetta Vegeto Progesterone receptor having C. terminal hormone binding domain truncations
CA2136439A1 (en) * 1992-06-18 1994-01-06 Michael Philip Nova Process for detection of neoplastic disease
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
US5474914A (en) 1992-07-29 1995-12-12 Chiron Corporation Method of producing secreted CMV glycoprotein H
US5489743A (en) 1993-01-19 1996-02-06 Amgen Inc. Transgenic animal models for thrombocytopenia
US5581476A (en) 1993-01-28 1996-12-03 Amgen Inc. Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs
AU6700594A (en) 1993-05-07 1994-12-12 Sterling Winthrop Inc. Lactose-hydrolyzed milk and milk products with improved taste and suppressed sweetness
US6664107B1 (en) 1993-05-26 2003-12-16 Ontario Cancer Institute, University Health Network CD45 disrupted nucleic acid
WO1994028122A1 (en) 1993-05-26 1994-12-08 Ontario Cancer Institute Transgenic mammals lacking expression of particular cd45 isoforms
US5654168A (en) 1994-07-01 1997-08-05 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline-inducible transcriptional activator and tetracycline-regulated transcription units
AU684524B2 (en) 1993-06-14 1997-12-18 Tet Systems Holding Gmbh & Co. Kg Tight control of gene expression in eucaryotic cells by tetracycline-responsive promoters
US5589362A (en) 1993-06-14 1996-12-31 Basf Aktiengesellschaft Tetracycline regulated transcriptional modulators with altered DNA binding specificities
WO1995005452A2 (en) 1993-08-12 1995-02-23 Cytotherapeutics, Inc. Improved compositions and methods for the delivery of biologically active molecules using genetically altered cells contained in biocompatible immunoisolatory capsules
US5658785A (en) 1994-06-06 1997-08-19 Children's Hospital, Inc. Adeno-associated virus materials and methods
US5484720A (en) 1994-09-08 1996-01-16 Genentech, Inc. Methods for calcium phosphate transfection
US5824784A (en) 1994-10-12 1998-10-20 Amgen Inc. N-terminally chemically modified protein compositions and methods
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
DE69637481T2 (de) 1995-04-27 2009-04-09 Amgen Fremont Inc. Aus immunisierten Xenomäusen stammende menschliche Antikörper gegen IL-8
WO1996037609A1 (en) 1995-05-26 1996-11-28 Zeneca Limited A gene switch comprising an ecdysone receptor
JPH11506722A (ja) 1995-06-07 1999-06-15 ベイラー・カレッジ・オブ・メディスン 細胞に核酸を送達するための核酸運搬体
US5849303A (en) 1995-06-07 1998-12-15 American Home Products Corporation Recombinant feline Immunodeficiency virus subunit vaccines employing baculoviral-expressed envelope glycoproteins derived from isolate NCSU-1 and their use against feline immunodeficiency virus infection
WO1996041865A1 (en) 1995-06-07 1996-12-27 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Rapamcycin-based regulation of biological events
ATE465149T1 (de) 1996-02-28 2010-05-15 Ariad Pharma Inc Synthetische rapamycinderivate als multimerisierende wirkstoffe für chimere proteine mit von immunophilin abgeleiteten domänen
EP0904107B1 (en) 1996-03-18 2004-10-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
US5679559A (en) 1996-07-03 1997-10-21 University Of Utah Research Foundation Cationic polymer and lipoprotein-containing system for gene delivery
US6214795B1 (en) * 1996-11-12 2001-04-10 Praecis Pharmaceuticals, Inc. Peptide compounds useful for modulating FGF receptor activity
CA2276108C (en) * 1996-12-26 2009-03-03 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Novel peptide, novel dna, and novel antibody
US6133426A (en) 1997-02-21 2000-10-17 Genentech, Inc. Humanized anti-IL-8 monoclonal antibodies
US6342220B1 (en) 1997-08-25 2002-01-29 Genentech, Inc. Agonist antibodies
KR100506786B1 (ko) 1997-11-25 2005-08-08 제넨테크, 인크. 섬유아세포 성장인자-19
US6150098A (en) 1998-02-20 2000-11-21 Amgen Inc. Methods for identifying novel secreted mammalian polypeptides
ZA200007412B (en) 1998-05-15 2002-03-12 Imclone Systems Inc Treatment of human tumors with radiation and inhibitors of growth factor receptor tyrosine kinases.
NL1010174C1 (nl) 1998-09-24 2000-03-27 Busschers Metaalbedrijf Bv Inrichting en werkwijze voor het buigen van buisvormig en staafvormig materiaal.
US6548634B1 (en) * 1998-09-30 2003-04-15 Chiron Corporation Synthetic peptides having FGF receptor affinity
US6660843B1 (en) 1998-10-23 2003-12-09 Amgen Inc. Modified peptides as therapeutic agents
US6369109B1 (en) 1998-10-28 2002-04-09 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung Des Offentlichen Rechts Betulinic acid and derivatives thereof useful for the treatment of neuroectodermal tumor
WO2000027885A1 (fr) 1998-11-05 2000-05-18 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Nouveau popypeptide chimerique
AU3224700A (en) 1999-02-08 2000-08-25 Chiron Corporation Fibroblast growth factor receptor-immunoglobulin fusion
AU3755900A (en) 1999-03-15 2000-10-04 Chiron Corporation Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing diseases of the eye
CA2311201A1 (en) 1999-08-05 2001-02-05 Genset S.A. Ests and encoded human proteins
US7459540B1 (en) * 1999-09-07 2008-12-02 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
US7408047B1 (en) * 1999-09-07 2008-08-05 Amgen Inc. Fibroblast growth factor-like polypeptides
AU7368100A (en) 1999-09-10 2001-04-10 Curagen Corporation Fibroblast growth factor polypeptide and nucleic acids encoding same
WO2001032678A1 (en) 1999-11-05 2001-05-10 Smithkline Beecham Corporation sbgFGF-19a
US6254671B1 (en) 1999-11-15 2001-07-03 Engelhard Corporation Very green-shade yellow metallized disazo pigment
US6716626B1 (en) 1999-11-18 2004-04-06 Chiron Corporation Human FGF-21 nucleic acids
ES2335386T3 (es) 1999-11-18 2010-03-26 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Gen fgf-21 humano y productos de expresion genica.
WO2001038357A2 (en) 1999-11-22 2001-05-31 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Jaffa, a novel fibroblast growth factor family member and uses therefor
US7108984B2 (en) * 2000-01-12 2006-09-19 Mount Sinai School Of Medicine Methods of identifying modulators of the FGF receptor
WO2001049849A1 (en) 2000-01-05 2001-07-12 Zymogenetics, Inc. Novel fgf homolog zfgf11
US20020081663A1 (en) 2000-01-05 2002-06-27 Conklin Darrell C. Novel FGF homolog ZFGF11
WO2001072957A2 (en) 2000-03-31 2001-10-04 Nobuyuki Itoh Fibroblast growth factor-like molecules and uses thereof
JP2002112772A (ja) 2000-07-10 2002-04-16 Takeda Chem Ind Ltd 新規ポリペプチドおよびそのｄｎａ
IL139380A0 (en) 2000-10-31 2001-11-25 Prochon Biotech Ltd Active variants of fibroblast growth factor
US20060223114A1 (en) * 2001-04-26 2006-10-05 Avidia Research Institute Protein scaffolds and uses thereof
US20030157561A1 (en) 2001-11-19 2003-08-21 Kolkman Joost A. Combinatorial libraries of monomer domains
US20040018499A1 (en) 2001-06-06 2004-01-29 Lal Preeti G Extracellular messengers
EP1423428B2 (en) 2001-06-20 2012-11-14 Fibron Ltd. Antibodies that block fgfr3 activation, methods of screening for and uses thereof
JP4444652B2 (ja) 2001-07-11 2010-03-31 マキシゲン・ホールディングズ・リミテッド Ｇ−ｃｓｆ結合体
US20040259780A1 (en) * 2001-07-30 2004-12-23 Glasebrook Andrew Lawrence Method for treating diabetes and obesity
WO2003038054A2 (en) * 2001-10-31 2003-05-08 New York University Structure-based design and synthesis of fgf inhibitors and fgf modulator compounds
CA2468610A1 (en) 2002-01-15 2003-07-24 Eli Lilly And Company Method for reducing morbidity and mortality in critically ill patients
ES2363765T3 (es) * 2002-01-31 2011-08-16 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Agonistas de fgfr.
EP1332761A1 (en) * 2002-01-31 2003-08-06 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Agonists of fibroblast growth factor receptors (FGFR)
IL149562A0 (en) * 2002-05-09 2002-11-10 Prochon Ltd Fgf variants and methods for use thereof
JP2003334088A (ja) 2002-05-22 2003-11-25 Pharma Design Inc ヒト由来の新規Ｋｌｏｔｈｏ様タンパク質及びその遺伝子
WO2004022095A1 (en) 2002-09-04 2004-03-18 Abtech Anti-idiotypic antibodies as vegf or fgf agonists for bone therapy
JP2006515747A (ja) 2002-11-01 2006-06-08 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫関連疾患の治療のための組成物と方法
AU2003287918A1 (en) 2002-12-20 2004-07-14 Enkam Pharmaceuticals A/S Method of modulation of interaction between receptor and ligand
TWI300430B (en) 2003-01-10 2008-09-01 Ritek Corp Optical recording medium dye and optical recording medium using thereof
WO2004083381A2 (en) 2003-03-13 2004-09-30 Indiana University Advanced Research & Technology Institute Fibroblast growth factor receptor-1 polynucleotides, polypeptides, and mutants
JP2006240990A (ja) 2003-05-15 2006-09-14 Kirin Brewery Co Ltd ｋｌｏｔｈｏタンパク質および抗ｋｌｏｔｈｏタンパク質抗体ならびにそれらの用途
JP4629047B2 (ja) 2003-06-12 2011-02-09 イーライ リリー アンド カンパニー Ｇｌｐ−１アナログ複合タンパク質
CN1802167A (zh) 2003-06-12 2006-07-12 伊莱利利公司 融合蛋白质
WO2005019258A2 (en) 2003-08-11 2005-03-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the treatment of immune related diseases
JP4049723B2 (ja) 2003-09-04 2008-02-20 沖電気工業株式会社 窒化物半導体素子の製造方法及び窒化物半導体素子の製造装置
JP4686465B2 (ja) 2003-10-16 2011-05-25 イムクローン・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 繊維芽細胞増殖因子レセプター−１阻害物質及びその治療方法
WO2005066211A2 (en) 2003-12-19 2005-07-21 Five Prime Therapeutics, Inc. Fibroblast growth factor receptors 1, 2, 3, and 4 as targets for therapeutic intervention
US20090111742A1 (en) 2004-01-26 2009-04-30 Alexei Kharitonenkov Use of fgf-21 and thiazolidinedione for treating type 2 diabetes
WO2005091944A2 (en) 2004-03-17 2005-10-06 Eli Lilly And Company Glycol linked fgf-21 compounds
JP4505631B2 (ja) 2004-03-31 2010-07-21 独立行政法人産業技術総合研究所 ヘパラン硫酸糖鎖を付加したヘパリン結合性タンパク質、その製造方法及びそれを含有する医薬組成物
EP2194064A1 (en) 2004-05-13 2010-06-09 Eli Lilly &amp; Company FGF-21 fusion proteins
WO2006028714A1 (en) 2004-09-02 2006-03-16 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
EP1796709A4 (en) 2004-10-07 2009-10-28 Univ California ANALOGUE OF SHK-TOXIN AND ITS USE AS SELECTIVE INHIBITORS OF KV1.3-KALIUM CHANNELS
DK2586456T3 (en) 2004-10-29 2016-03-21 Ratiopharm Gmbh Conversion and glycopegylation of fibroblast growth factor (FGF)
US20080261875A1 (en) 2005-01-21 2008-10-23 Eli Lilly And Company Method For Treating Cardiovascular Disease
US20060193299A1 (en) * 2005-02-25 2006-08-31 Cicso Technology, Inc., A California Corporation Location-based enhancements for wireless intrusion detection
JP2006246823A (ja) 2005-03-11 2006-09-21 Kyoto Univ 造血因子としてのＦｇｆ２１の使用
WO2006130527A2 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Novartis Ag Mutations and polymorphisms of fibroblast growth factor receptor 1
NZ565511A (en) * 2005-07-22 2011-03-31 Five Prime Therapeutics Inc Compositions and methods of treating disease with FGFR fusion proteins
JP2009504183A (ja) 2005-08-15 2009-02-05 ジェネンテック・インコーポレーテッド 遺伝子破壊、それに関連する組成物および方法
US7395962B2 (en) 2005-10-28 2008-07-08 United Parcel Service Of America, Inc. Pick up notice and method of using same
WO2007055789A2 (en) 2005-10-31 2007-05-18 Neose Technologies, Inc. Expression of soluble therapeutic proteins
WO2007056789A1 (en) 2005-11-16 2007-05-24 Dier Corporation As Trustee For The Reid Family Superannuation Trust New frame assemblies for security screens
US20110191871A1 (en) 2006-02-28 2011-08-04 Trustees Of Boston University Methods to identify factors associated with muscle growth and uses thereof
US8101721B2 (en) 2006-06-15 2012-01-24 Fibron Ltd. Antibodies blocking fibroblast growth factor receptor activation and methods of use thereof
EP2049144B8 (en) 2006-07-21 2015-02-18 ratiopharm GmbH Glycosylation of peptides via o-linked glycosylation sequences
US20100075375A1 (en) * 2006-10-03 2010-03-25 Novo Nordisk A/S Methods for the purification of polypeptide conjugates
US20110008347A1 (en) 2006-12-01 2011-01-13 Agency For Science ,Technology And Research Cancer-related protein kinases
CN104163864B (zh) 2007-03-30 2017-08-01 Ambrx公司 经修饰fgf‑21多肽和其用途
EP2550972B1 (en) * 2007-04-02 2018-02-21 Genentech, Inc. A Klotho-beta agonist antibody for use in the treatment of diabetes mellitus or insulin resistance
US8697369B2 (en) * 2007-04-06 2014-04-15 National Institute Of Advanced Industrial Science And Technology Method for screening a test substance for activating a receptor associated with FGF 21 activity
US7537903B2 (en) 2007-04-23 2009-05-26 Board Of Regents, The University Of Texas System FGF21 upregulates expression of GLUT-1 in a βklotho-dependent manner
US20100330062A1 (en) 2007-05-08 2010-12-30 Koeffler H Phillip Klotho protein and related compounds for the treatment and diagnosis of cancer
JP2010529954A (ja) 2007-05-22 2010-09-02 ノバルティス アーゲー Ｆｇｆ２１関連障害を処置、診断および検出する方法
US8481497B2 (en) 2007-05-29 2013-07-09 Sapporo Medical University Therapeutic agent for cancer, and method for treatment of cancer
EP2162535A4 (en) 2007-06-04 2011-02-23 Novo Nordisk As O-linked glycosylation using N-acetylglucosamine transferases
EP3260129A1 (en) 2007-08-03 2017-12-27 Eli Lilly and Company An fgf-21 compound and a glp-1 compound for use in the treatment of obesity
US20090038530A1 (en) 2007-08-08 2009-02-12 Thieu Truong Watercraft drogue system
US8426396B2 (en) 2008-01-08 2013-04-23 Shriners Hospitals For Children Treatment for achondroplasia
TW200936156A (en) * 2008-01-28 2009-09-01 Novartis Ag Methods and compositions using Klotho-FGF fusion polypeptides
WO2009117622A2 (en) 2008-03-19 2009-09-24 Ambrx, Inc. Modified fgf-23 polypeptides and their uses
JOP20190083A1 (ar) * 2008-06-04 2017-06-16 Amgen Inc بولي ببتيدات اندماجية طافرة لـfgf21 واستخداماتها
WO2010006214A1 (en) 2008-07-09 2010-01-14 Ambrx, Inc. Fgf-21 neutralizing antibodies and their uses
WO2010017198A2 (en) 2008-08-04 2010-02-11 Five Prime Therapeutics, Inc. Fgfr extracellular domain acidic region muteins
EA201990619A1 (ru) * 2008-10-10 2019-07-31 Амген Инк. Fgf21 мутанты и их применение
EP2427207B1 (en) 2009-05-05 2017-08-16 Amgen, Inc Fgf21 mutants and uses thereof
UY32607A (es) 2009-05-05 2010-12-31 Amgen Inc Mutantes de fgf21 y usos del mismo
JP2012530493A (ja) 2009-06-17 2012-12-06 アムジエン・インコーポレーテツド キメラポリペプチドおよびその使用
JP6016636B2 (ja) 2009-10-15 2016-10-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド 改変したレセプター特異性を持つキメラ線維芽細胞増殖因子
MX2012006397A (es) 2009-12-02 2012-11-30 Amgen Inc PROTEINAS DE ENLACE QUE ENLAZAN A FGFR1C HUMANO, ß-KLOTHO HUMANA Y TANTO FGFR1C HUMANO COMO ß-KLOTHO HUMANA.
UA109888C2 (uk) 2009-12-07 2015-10-26 ІЗОЛЬОВАНЕ АНТИТІЛО АБО ЙОГО ФРАГМЕНТ, ЩО ЗВ'ЯЗУЄТЬСЯ З β-КЛОТО, РЕЦЕПТОРАМИ FGF І ЇХНІМИ КОМПЛЕКСАМИ
CA2796055A1 (en) 2010-04-15 2011-10-20 Amgen Inc. Human fgf receptor and .beta.-klotho binding proteins
US9023791B2 (en) 2010-11-19 2015-05-05 Novartis Ag Fibroblast growth factor 21 mutations
KR102077721B1 (ko) 2011-07-01 2020-02-14 엔지엠 바이오파마슈티컬스, 아이엔씨. 대사성 장애 및 질환의 치료를 위한 조성물, 용도 및 방법
EP2548570A1 (en) 2011-07-19 2013-01-23 Sanofi Pharmaceutical composition for treating a metabolic syndrome
MX2014002260A (es) * 2011-08-31 2014-08-18 Amgen Inc Factor de crecimiento de fibroblasto 21 para usar en el tratamiento de diabetes tipo 1.
ES2915851T3 (es) 2012-12-27 2022-06-27 Ngm Biopharmaceuticals Inc Péptidos quiméricos de FGF19 para usar en el tratamiento de trastornos de ácidos biliares

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005061712A1 (en) * 2003-12-10 2005-07-07 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2006028595A2 (en) * 2004-09-02 2006-03-16 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2006065582A2 (en) * 2004-12-14 2006-06-22 Eli Lilly And Company Muteins of fibroblast growth factor 21
WO2007110079A2 (en) * 2006-03-29 2007-10-04 Enkam Pharmaceuticals A/S Targeted delivery of fgfr ligands into the brain

Also Published As

Publication number Publication date
JOP20190083A1 (ar) 2017-06-16
WO2009149171A2 (en) 2009-12-10
JP2021052780A (ja) 2021-04-08
BRPI0911385B8 (pt) 2021-09-14
JP6810190B2 (ja) 2021-01-06
WO2009149171A4 (en) 2010-05-06
US11840558B2 (en) 2023-12-12
US8642546B2 (en) 2014-02-04
US8410051B2 (en) 2013-04-02
EA034847B1 (ru) 2020-03-27
US20120087920A1 (en) 2012-04-12
TWI526220B (zh) 2016-03-21
US20210317176A1 (en) 2021-10-14
US20120003216A1 (en) 2012-01-05
IL209395A (en) 2014-08-31
US10011642B2 (en) 2018-07-03
CA2726589A1 (en) 2009-12-10
IL209395A0 (en) 2011-01-31
KR101651697B1 (ko) 2016-08-29
EA024751B8 (ru) 2020-01-31
TW201219052A (en) 2012-05-16
US20160168223A1 (en) 2016-06-16
KR20160046929A (ko) 2016-04-29
SG193860A1 (en) 2013-10-30
CN102143758B (zh) 2015-11-25
JP7191076B2 (ja) 2022-12-16
EP2296690A2 (en) 2011-03-23
BR122020010972B1 (pt) 2021-05-18
CA2726589C (en) 2017-06-13
US20090305986A1 (en) 2009-12-10
PE20100253A1 (es) 2010-04-10
JP6960832B2 (ja) 2021-11-05
US20190023757A1 (en) 2019-01-24
US20120093815A1 (en) 2012-04-19
TWI403519B (zh) 2013-08-01
JP2011523561A (ja) 2011-08-18
AR072009A1 (es) 2010-07-28
BRPI0911385B1 (pt) 2021-04-13
EA201690946A1 (ru) 2017-05-31
US8361963B2 (en) 2013-01-29
US9273106B2 (en) 2016-03-01
AU2009256232A1 (en) 2009-12-10
EP2296690B1 (en) 2016-11-30
WO2009149171A3 (en) 2010-03-11
EA201270758A1 (ru) 2013-12-30
MY152721A (en) 2014-11-28
CO6341566A2 (es) 2011-11-21
JP6250714B2 (ja) 2017-12-20
US20140243503A1 (en) 2014-08-28
AU2009256232B2 (en) 2011-12-22
KR101787300B1 (ko) 2017-10-18
MX2010013333A (es) 2011-04-05
US8034770B2 (en) 2011-10-11
CR11851A (es) 2011-05-13
NZ590050A (en) 2012-08-31
BRPI0911385A2 (pt) 2019-03-26
EA024751B1 (ru) 2016-10-31
US11072640B2 (en) 2021-07-27
MA33142B1 (fr) 2012-03-01
MX346396B (es) 2017-03-16
TW201010715A (en) 2010-03-16
US20240076333A1 (en) 2024-03-07
JP2019187417A (ja) 2019-10-31
EA201001883A1 (ru) 2011-06-30
JP2018082699A (ja) 2018-05-31
CL2010001346A1 (es) 2011-06-03
CN102143758A (zh) 2011-08-03
KR20110025810A (ko) 2011-03-11
JP2016128449A (ja) 2016-07-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA017690B1 (ru) Мутанты fgf21 и их применение
EA021425B1 (ru) Мутанты fgf21 и их применение
JP2018529729A (ja) 胆汁酸障害の処置
AU2011253868A1 (en) FGF21 mutants and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KG MD TJ TM