ES2204886T3 - Receptores de factor de crecimiento fibroblastico. - Google Patents
Receptores de factor de crecimiento fibroblastico.Info
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Abstract
SE PRESENTA LA CLONACION COMPLETA DE CADN DE DOS GENES HUMANOS PREVIAMENTE DESIGNADOS FLG Y BEK. ESTOS GENES CODIFICAN DOS RECEPTORES DE SUPERFICIES SIMILARES PERO DISTINTOS COMPUESTOS DE UN DOMINIO EXTRACELULAR CON TRES REGIONES TIPO INMUNOGLOBULINA, UNA DOMINIO DE TRANSMEMBRANA SENCILLO Y UNA PORCION CITOPLASMICA QUE CONTIENE UN DOMINIO DE QUINASA DE TIROSINA CON UNA INSERCION DE QUINASA TIPICA. LA EXPRESION DE ESTOS DOS CADN EN LAS CELULAS DE NIH-3T3 TRANSFECTADAS LLEVA A LA BIOSINTESIS DE PROTEINAS DE 150 KDA Y 135 KDA PARA FLG Y BEK RESPECTIVAMENTE. LOS EXPERIMENTOS DE ENLACE DIRECTO CON INHIBICION DEL ENLACE ENTRE FGF (AFGF) ACIDICO RADIOETIQUETADO, FGF (BFGF) BASICO O KFGF Y LOS FACTORES DE CRECIMIENTO NATIVOS Y LOS ANALISIS DE SCATACHARD DE LOS DATOS DE ENLACE INDICARON QUE BEK Y FLG SE ENLAZAN A AFGF, BFGF O KFGF CON UNAS CONSTANTES DE DISOCIACION DE (2-15) X 1011M. LA GRAN AFINIDAD AL ENLACE DE LOS TRES FACTORES DE CRECIMIENTO DISTINTOS A CADA UNO DE LOS DOS RECEPTORES DIFERENTESREPRESENTA UNA DOBLE REDUNDANCIA UNICA SIN PRECEDENTES ENTRE LAS INTERACCIONES DEL RECEPTOR/FACTOR DE CRECIMIENTO DE POLIPEPTIDOS. SE PRESENTA EL USO DE CELULAS HUESPED TRANSFORMADAS QUE EXPRESAN EXCESIVAMENTE A FLG O A BEK O LOS FRAGMENTOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS DE LAS MISMAS PARA LA SELECCION DE MEDICAMENTOS.
Description
Receptores de factor de crecimiento
fibroblástico.
La invención se refiere a una clase única de
receptores de factor de crecimiento de fibroblastos, a ácidos
nucleicos que los codifican y a la expresión de los receptores de
factor de crecimiento en sistemas recombinantes. La invención se
refiere, igualmente, a la utilización de los receptores expresados
o a fragmentos de los mismos en selecciones de medicamentos
candidatos, que actúan como antagonistas de los receptores.
La familia del factor de crecimiento de los
fibroblastos (FGF) comprende siete proteínas emparentadas que
enlazan la heparina, que comprenden el FGF ácido (aFGF), el FGF
básico (bFGF), int-2, hst/kFGF,
FGF-5, FGF-6 y KGF. Los miembros de
la familia de los FGF comparten una identidad de secuencia de
aminoácidos de aproximadamente 30-55%, una
estructura genética similar y pueden transformar células en cultivo
cuando son sobre expresadas en células transfectantes. Los FGF
prototípicos aFGF y bFGF son los primeros que han sido purificados,
secuenciados y clonados. Estos son mitógenos, in vitro para
una variedad de células de origen mesenquimatoso y neuroectodérmico.
In vivo, los FGF pueden inducir la formación del mesoderma en
embriones de Xenopus en desarrollo y que tienen una
actividad angiógena potente (citada en la recopilación de Burgess
et Maciag, Ann, Rev. Biochem. 58:575-606
(1989)).
La respuesta de las células a los FGF está
mediatizada por un enlace sobre una activación de receptores
específicos de superficie celular que tienen una actividad
intrínseca de tirosina kinasa. Los receptores son proteínas,
frecuentemente glicosiladas que sirven como componentes integrantes
de las membranas celulares. De manera típica, los receptores tienen
un campo extracelular situado en la superficie celular, que puede
realizar una interacción específica con substancias conocidas como
ligandos. Los factores de crecimiento de los fibroblastos son
ejemplos de ligandos. Como consecuencia de la unión del ligando con
el dominio extracelular, es activada una segunda región del
receptor, situada sobre la superficie intracelular de la membrana
(es decir, el dominio citoplásmico) para permitir una reacción con
otras moléculas intracelulares. El dominio citoplasmático comprende
una región catalítica, que es una región que tiene una actividad
enzimática. Haciendo referencia en particular al receptor del factor
de crecimiento de los fibroblastos, descrito en la presente
memoria, el dominio catalítico es una tirosina proteica kinasa. El
substrato de esta kinasa puede ser el propio receptor (es decir una
autofosforilación) u otras proteínas intracelulares, tales como la
fosfolipasa C-\gamma. El dominio de kinasa de
ciertos receptores puede estar interrumpido por una inserción de
hasta 100 residuos de aminoácidos, hidrofilazos en su mayor parte.
Esta inserción puede actuar para modular la interacción del receptor
con ciertos substratos celulares y proteínas efectoras. El dominio
citoplásmico se termina en una región de cola en la extremidad
COOH. Esta secuencia es la mas divergente entre todos los RTK
conocidos. Se han cartografiado varios puntos de autofosforilación
en esta región y la región puede actuar ejerciendo un control
negativo sobre la función de señal con kinasa. La región catalítica
está separada de la membrana propiamente dicha por un dominio
próximo a la membrana. La presente observación favorece la idea de
que esta región está implicada en la modulación de la función del
receptor por estímulos heterólogos, un proceso que se conoce como
una transmodulación del receptor. Uniendo los dominios
extracelulares y citoplasmáticos se encuentra una región que
atraviesa la membrana apropiada conocida como el dominio
transmembranal. Se piensa que la interacción del ligando activa el
dominio citoplasmático induciendo un cambio de la conformación como
para una agregación o para otros mecanismos. De este modo, un
receptor actúa como transductor molecular, traduciendo un suceso
extracelular, (unión con un ligando) y en una respuesta intracelular
(actividad enzimática citoplasmática).
Como se ha mencionado anteriormente, la
substancia que es enlazada por el receptor es conocida como el
ligando; un término que tiene una significación por definición
únicamente con referencia a su equivalente, el receptor. Igualmente,
el término "ligando" no implica ninguna dimensión particular
de molécula, ninguna particularidad estructural o de composición
diferente de que la substancia puede enlazarse o interactuar de
otro modo con el receptor de una manera tal que el receptor
transmita la información sobre la presencia del ligando a una
molécula intracelular diana. Una definición funcional de este tipo
excluye, necesariamente, substancias que pueden enlazarse con un
dominio extracelular pero no pueden actuar sobre la activación del
receptor. En resumen, todas las substancias que puedan enlazarse
con los receptores no son ligandos, pero todos los ligandos pueden
enlazarse con un receptor.
Como se ha mencionado anteriormente, se han
identificado receptores que tienen una actividad biológica que
puede evaluarse en función de una interacción con un ligando.
Generalmente, la actividad es enzimática y está localizada en el
dominio citoplasmático. Un grupo de receptores adecuado para la
invención tiene una actividad intrínseca de tirosina proteica kinasa
(PTK).
La figura 1 presenta una representación
esquemática de varios receptores conocidos del factor de
crecimiento que presentan una actividad de PTK. Los receptores del
factor de crecimiento presentan una actividad de PTK, o los
receptores de tirosina kinasa (RTK), tienen una topología molecular
similar. Todos ellos tienen un dominio extracelular importante
glicosilado de enlace del ligando, una única región transmembranal
hidrófoba y un dominio citoplasmático que contiene un dominio
catalítico de PTK. Debido a su configuración, los RTK pueden
considerarse como enzimas alostéricas asociadas con una membrana.
En contra de lo que ocurre en el caso de los enzimas alostéricos
solubles en agua, la topología de los RTK impone que el dominio de
enlace del ligando y la actividad de PTK estén separados por la
membrana plasmática. Como consecuencia, la activación del receptor
debida a un enlace de un ligando extracelular, debe traducirse a
través de la barrera membranal en una actividad de funciones del
dominio intracelular.
Sobre la base de una similitud entre la secuencia
y las características estructurales distintas, se pueden clasificar
estos receptores en subclases (figura 1). Las particularidades
estructurales características de las cuatro subclases comprenden dos
secuencias de repetición ricas en cisteína, en el dominio
extracelular de los receptores monómeros de subclase I, estructuras
heterotetrámeras \alpha_{2}\beta_{2} enlazadas por
disulfuro con secuencias similares ricas en cisteína en los RTK de
subclase II, y cinco o tres repeticiones de tipo inmunoglobulina en
los dominios extracelulares de los RTK de las subclases III y IV,
respectivamente. El dominio de tirosina kinasa de las dos últimas
subclases está interrumpido por secuencias hidrófilas de inserción
de longitud diferente. La disponibilidad de clones de ADNc de RKT ha
hecho posible el inicio de análisis detallados de
estructura/función de los mecanismos de acción de las membranas de
las familias de RTK. (Citadas en la recopilación de Ullrich y
Schlessinger, Cell 61:203-221 (1990)). Los
pasajes y ejemplos correspondientes flg están destinados a
fines ilustrativos únicamente.
La invención se basa en el descubrimiento de un
clon parcial de ADNc humano de un gen de tipo fms (flg :
fms-like gene) que codifica una tirosina
proteica kinasa, cuyo dominio de kinasa está interrumpido al nivel
de una posición similar a las inserciones de kinasa de los
receptores de tirosinas kinasa CSF-1 y PDGF (Ruta
et al., Oncogene, 3:9-15 (1988)).
Ulteriormente, han sido aislados ADNc de longitud completa de
flg de pollo por clonación con sondas oligonucleotídicas
específicas de flg (Lee et al., Science,
245:57-60 (1989)) y con anticuerpos
antifosfotirosina (Pasquale et Singer, Proc. Natl. Acad. Sci.,
U.S.A. 86:5449-5453 (1989)). Flg es un
receptor de PGF sobre la base de cuatro criterios: 1) el receptor
purificado de un extracto de embrión de pollo por transferencia de
afinidad sobre bFGF inmovilizado es el producto del gen flg
de pollo, 2) un antisuero anti-péptido flg
inmunoprecipita [^{125}I]aFGF reticulado sobre proteínas
de 130 y 150 kDa en células de rapto microsarcoma A204, 3) un
antisuero anti-peptídico flg inmunoprecipita
proteínas de tamaño similar que están específicamente fosforiladas
sobre tirosina durante un tratamiento de células vivas con aFGF o
con bFGF, y 4) proteínas de 130 y 150 kDa inmunoprecipitadas con
antisuero anti-péptido flg a partir de
lisados de células tratadas con aFGF sufren una fosforilación sobre
tirosina in vitro.
Un segundo receptor supuesto del FGF es el
producto del gen murina de kinasa expresado por una bacteria
(bek : bacterially expressed kinase), se
obtiene un clon parcial por selección de un banco de expresión de
ADNc de hígado de ratón con anticuerpos
anti-fosfotirosina (Kornbluth et al.,
Mol. Cell. Biol. 8:5541-5544 (1988)). Las
secuencias de los citados aminoácidos del clon parcial de
bek y la región correspondiente de flg son idénticas
en un 85%. Sin embargo, no se sabe claramente si bek
representa el homólogo murina del gen flg humano u otro gen
emparentado de manera estrecha. La invención proporciona clones de
ADNc de longitud completa por bek y flg, ambos
humanos, sus secuencias completas, deducidas, de aminoácidos y
demuestra en células transfectadas, que ambos bek y
flg enlazan específicamente aFGF, bFGF y
k-FGF y con una afinidad elevada.
La función de receptor focaliza cada vez mas las
tentativas de concepción racional de los medicamentos. Moléculas
que afectan un enlace de receptor-ligando, una
activación de receptor y/o una interacción con la diana intracelular
del receptor son todas ellas candidatas potenciales para agentes
terapéuticos. Una selección a gran escala está limitada por los
procedimientos clásicos en los cuales los medicamentos candidatos
son evaluados sobre células aisladas o en explantes de tejido. Las
muestras de tejido o las células aisladas, que contienen los
receptores diana, son de obtención costosa, están presentes en
cantidad limitada y son difíciles de mantener en un estado
funcionalmente viable. Además, frecuentemente es difícil
administrar de manera fiable y reproducible el medicamento candidato
a las muestras de tejido. Se han realizado análisis de selección
que utilizan explantes primarios en cultivo de tejido a una escala
mayor que la que es posible con muestras de tejido. Sin embargo, es
mas difícil de analizar un efecto fisiológico y los análisis están
sometidos a interferencias procedentes de numerosas fuentes, por
ejemplo el medio de cultivo o las condiciones de cultivo.
Finalmente, los análisis que utilizan receptores aislados de
materiales naturales presentan el inconveniente de que el receptor
está sometido a una variabilidad natural y que las fuentes
naturales apropiadas pueden no estar siempre disponibles. El objeto
de la presente descripción consiste en proporcionar moléculas de
receptores en una forma adaptable a protocolos de selección a gran
escala.
La invención proporciona una proteína receptora o
fragmentos de la misma, en forma aislada, que comprende un dominio
citoplasmático con una actividad de proteína kinasa, una inserción
de kinasa, un dominio transmembranal y un dominio extracelular que
presentan tres repeticiones de tipo inmunoglobulina y equivalentes
biológicamente activos de esta.
Otro aspecto de la invención consiste en una
secuencia aislada de ADN, que codifica proteína receptora o
fragmentos de la misma, comprendiendo dicha proteína un dominio
citoplasmático, que presenta una actividad de la proteína kinasa,
una inserción de kinasa, un único dominio transmembranal y un
dominio extracelular, que tiene tres repeticiones de tipo
inmunoglobulina y equivalentes biológicamente activos de la
misma.
Otro aspecto de la invención es un vector que
comprende un ADNc que codifica una proteína receptora,
comprendiendo dicha proteína un dominio citoplasmático, que presenta
una actividad de la proteína kinasa, una inserción de kinasa, un
único dominio transmembranal y un dominio extracelular, que tiene
tres repeticiones de tipo inmunoglobulina.
Otro aspecto de la invención es una célula
huésped transformada por el vector descrito anteriormente.
Otro aspecto de la invención es una composición
terapéutica, que comprende el dominio extracelular o un fragmento
de este de una proteína receptora humana, que comprende un dominio
citoplasmático, que presenta una actividad de la proteína kinasa,
una inserción de kinasa, un único dominio transmembranal y un
dominio extracelular, que tiene tres repeticiones de tipo
inmunoglobulina y una cantidad eficaz para inhibir respuestas
celulares indeseables por mediación del factor del crecimiento que
se une con la heparina y un vector farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención es una composición
terapéutica, que comprende el dominio extracelular o un fragmento
de este de una proteína receptora humana, que comprende un dominio
citoplasmático, que presenta una actividad de la proteína kinasa,
una inserción de kinasa, un único dominio transmembranal y un
dominio extracelular, que tiene tres repeticiones de tipo
inmunoglobulina y una cantidad eficaz para inhibir el enlace de un
patógeno oportunista sobre células humanas que portan dicha
proteína receptora y un vector farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la invención es un procedimiento
para el tratamiento de un paciente que sufre una enfermedad
caracterizada por una respuesta celular indeseable por intermedio
del factor de crecimiento que se une con la heparina que comprende
la administración a un paciente de este tipo de una cantidad eficaz
de la composición según la reivindicación 16.
Otro aspecto de la invención consiste en un
procedimiento para el tratamiento de un paciente que sufre una
infección de un patógeno oportunista, pudiéndose enlazar dicho
patógeno con un receptor del factor de crecimiento que se une con la
heparina, que comprende la administración a un paciente de este
tipo de una cantidad eficaz de la composición según la
reivindicación 18.
Otro aspecto de la invención consiste en un
procedimiento para la selección de medicamentos que inhiben una
unión del factor de crecimiento de los fibroblastos sobre receptores
celulares, que comprende las etapas que consisten en:
- (a)
- incubar el medicamento con células huésped que pueden sobreexpresar receptores del factor de crecimiento de los fibroblastos en presencia de un factor de crecimiento de los fibroblastos y
- (b)
- medir la capacidad del medicamento para inhibir la unión del factor de crecimiento de los fibroblastos.
Un aspecto final de la invención consiste en un
procedimiento para la selección de medicamentos que inhiben la
unión de patógenos oportunistas sobre receptores del factor de
crecimiento de los fibroblastos, que comprende las etapas que
consisten en:
- (a)
- incubar el medicamento con células huésped, que puede sobreexpresar receptores del factor de crecimiento de los fibroblastos en presencia de dicho patógeno y
- (b)
- medir la capacidad del medicamento para inhibir una unión del patógeno.
La figura 1 presenta una representación
esquemática de las subclases de receptor de tirosina kinasa.
La figura 2 ilustra los esquemas de aminoácidos y
las similitudes estructurales entre flg y bek
humanos.
A) Se han representado las secuencias de
aminoácidos de los flg y bek humanos tal como se han
deducido de los clones de ADNc. Únicamente se muestran los residuos
de la secuencia bek que difieren de los de flg. Los
sobrelineados en trazo continuo subrayan los péptidos señal
presumidos y las secuencias transmembranales mientras que los
sobrelineados en trazos discontinuos señalan la región de inserción
de kinasa. Un punto lleno está colocado sobre residuos cisteína
conservados, que definen dominios de tipo Ig. Los triángulos
invertidos están colocados sobre los puntos potenciales de
glicosilación relacionada con Asn. Los paréntesis abiertos rodean
la "caja ácida" y las flechas opuestas delimitan el dominio de
tirosina kinasa.
B) Se ha ilustrado el grado de identidad de los
aminoácidos entre las diferentes regiones de las proteínas
flg y bek humanas. Las cajas negras llenas representan
el dominio citoplasmático cortado de kinasa y los bucles
representan los dominios extracelulares de tipo Ig. Las secuencias
de nucleótidos han sido sometidos al banco de datos EMBL. Los ADNc
de bek y flg humanos han recibido, respectivamente,
los números de registro X52 6832 y X52 833.
La figura 3 ilustra una transferencia de Northern
que pone de manifiesto la expresión de ARNmflg y
bek.
Se someten cuatro \mug de ARN totales,
procedentes de diferentes líneas celulares, a un análisis de
Northern para la expresión de flg (panel A) o para la
expresión de bek (panel B). Se muestra una ilustración de un
autorradiograma de los cromatogramas obtenidos. Los ARN proceden de
las líneas celulares: de raptomiosarcoma A204 (línea 1); de
glioblastoma U563 (línea 2); de HUVEC (línea 3), de teratocarcinoma
NTERA-2 (línea 4).
La figura 4 ilustra el marcaje metabólico de
líneas celulares que sobreexpresan flg y bek con la
[^{35}S]-metionina.
Se marcan células de NFlg26, NBek8 y NNeo 4 de
control con [^{35}S]-metionina en presencia de
(líneas 2, 4, 6, 8) o en ausencia de (líneas 1, 3, 5, 7)
tunicamicina como se ha descrito en el ejemplo 2. Se
inmunoprecipitan los lisados celulares con el anti-flg-1
(líneas 1-4) o con el anti-bek-1 (líneas
5-8) y se les somete a un SDS-PAGE y
una autorradiografía. Se presenta una ilustración del
autorradiograma obtenido. Los lisados proceden de: células de
control Neo 4 (líneas 1, 2, 5, 6), células Flg 26 (líneas 3, 4);
células Bek 8 (líneas 7, 8). Se han indicado las posiciones de los
patrones de peso molecular. Una inmunoprecipitación en presencia de
péptido antigénico correspondiente elimina por completo la
precipitación de las proteínas específicas flg y bek
(dados no representados).
La figura 5 ilustra la reticulación de
[^{125}I]FGF sobre células que sobreexpresan flg y
bek.
B) Se reticula [^{125}I]aFGF (líneas
1-3) y [^{125}I]bFGF (líneas
4-6) de manera covalente sobre monocapas de células
de control NFlg26 (líneas 3, 6), Nbek8 (líneas 3, 6) y Nneo 4
(líneas 1, 4) como se ha descrito en el ejemplo 3. A continuación
se lisan las células, se les somete a un SDS-PAGE y
se expone el gel en una película de rayos X. Se presenta una
ilustración del autorradiograma obtenido.
B) Se reticula [^{125}I]aFGF (líneas
1-3) y [^{125}I]kFGF (líneas
4-6) de manera covalente sobre monocapas de células
NNeo 4 (líneas 1, 4), NFlg26 (líneas 2, 5) y NBek13 (líneas 3, 6) y
se les analiza como en la figura 5A.
La figura 6 ilustra un análisis de Scatchard de
un enlace de FGF sobre líneas celulares que sobreexpresan
flg y bek.
B) Se realiza un análisis de enlace con
saturación de [^{125}I]aFGF (-- --y) de
[^{125}I]bFGF (o- - -o) sobre células flg26 (panel
A) y bek8 (panel B) como se ha descrito en el ejemplo 3. El
conteo del ruido de fondo en presencia de un exceso molar de 100
veces uno u otro de los ligandos son siempre menores que el 10% de
los impulsos/minuto totales en cada punto. La escala sobre el
análisis de Scatchard es idéntica en cada panel.
B) Análisis de enlace de saturación de
[^{125}I]kFGF sobre flg26 (panel A) y bek13
(panel B). Análisis como en la figura 6A.
La figura 7 ilustra la secuencia completa de
nucleótidos y de aminoácidos de flg.
La figura 8 ilustra la secuencia completa de
nucleótidos y de aminoácidos de bek.
Tal como se han utilizado en la presente
descripción, los términos siguientes tienen los significados
siguientes:
Nucleótido - - Unidad monómera de ADN o de
ARN que comprende una parte de azúcar (pentosa), un fosfato, y una
base heterocíclica nitrogenada. La base está enlazada con la parte
azúcar a través del carbono glicosídico (carbono 1' de la pentosa) y
la combinación de la base y del azúcar se denomina un nucleósido.
La base caracteriza el nucleósido. Las cuatro bases del ADN son la
adenina ("A"), la guanina ("G"), la citosina ("C"),
y la timina ("T"). Las cuatro bases de ARN son A, G, C y el
uracilo ("U").
Secuencia de ADN - - Disposición lineal de
nucleótidos enlazados entre sí por enlaces fosfodiéster entre los
carbonos 3' y 5' de pentosas adyacentes. El ADN heterólogo es un ADN
que puede ser introducido en un organismo huésped a partir de una
fuente que no cambia normalmente el ADN con este huésped, por
ejemplo, un ADN humano utilizado para transformar E.
coli.
Codon - - Secuencia de ADN de tres
nucleótidos (un triplete) que codifica a través de un ARNm, un
aminoácido, una señal de inicio de traducción o una señal de
detención de traducción. Por ejemplo los tripletes de nucleótidos
de ADN TTA, TTG, CTT, CTC, CTA y CTG codifican el aminoácido
leucina ("Leu"), TAG, TAA y TGA son señales de detención de la
traducción y ATG es una señal de inicio de traducción.
Cuadro de lecturas - - Grupo de codones
durante la traducción del ARNm en secuencias de aminoácidos.
Durante la traducción, el cuadro de lectura apropiado debe ser
mantenido. Por ejemplo, la secuencia de ADN GCTGGTTGTAAG puede
expresarse teóricamente en tres cuadros o fases de lectura, que
dan, respectivamente, una secuencia diferente de aminoácidos:
GCT GGT TGT AAG - -
Ala-Gly-Cys-Lys
G CTG GTT GTA AG - -
Leu-Val-Val
GC TGG TTG TAA G - -
Trp-Leu-(STOP).
Sin embargo, únicamente los cuadros de lectura
anteriores codifican la información genética correcta. La señal de
inicio de traducción es reconocida por el ribosoma y por los
factores de inicio accesorios para fijar el cuadro de lectura
correcto.
Polipéptido - - Disposición lineal de
aminoácidos enlazados entre sí a través de enlaces peptídicos en
los agrupamientos \alpha-aminados y carboxi de
aminoácidos adyacentes.
Genoma - - ADN entero de una célula o de
un virus. Este comprende, entre otras cosas, los genes
estructurales que codifican polipéptidos individuales así como
secuencias de regulación, como secuencias de operador, de promotor
y de enlace y de interacción con el ribosoma, principalmente
secuencias tales como las secuencias de
Shine-Dalgarno.
Gen estructural - - Secuencia de ADN que
codifica su matriz o su ARN mensajero ("ARNm") para una
secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido
específico. Los genes estructurales pueden tener tanto ARN como
producto primario como ARN de transferencia (ARNt) o ARN
ribosómicos (ARNr).
Transcripción - - Proceso de producción de
un ARN a partir de un gen estructural.
Traducción - - Proceso de producción de un
polipéptido a partir de un ARNm.
Expresión - - Proceso sufrido por un gen
estructural para producir un producto. En el caso de un producto
proteico, consiste en una combinación de una transcripción y de una
traducción.
Plásmido - - Secuencia de ADN de doble
hebra no cromosómica que comprende un "replicón" intacto de
modo que el plásmido es replicado en una célula huésped. Cuando el
plásmido está colocado en un organismo unicelular, las
características de este organismo pueden ser modificadas o
transformadas como resultado del ADN del plásmido. Por ejemplo, un
plásmido que porte el gen de resistencia a la tetraciclina
(Tet^{R}) transforma una célula, anteriormente sensible a la
tetraciclina, en una célula que es resistente a la misma. Una
célula transformada por un plásmido se denomina un
"transformante".
Fago o bacteriófago - - Virus bacterianos,
muchos de los cuales comprenden secuencias de ADN encapsuladas en
una cubierta o vaina proteica ("cápside").
Vehículo de clonación - - Plásmido, ADN de
fago u otra secuencia de ADN que puede replicarse en una célula
huésped, caracterizada por un punto o por un pequeño número de
puntos de reconocimiento de endonucleasa, al nivel de los cuales
pueden cortarse secuencias de ADN de este tipo de una manera que
puede ser determinada para la inserción de un ADN heterólogo sin
pérdida concomitante de una función biológica esencial del ADN, por
ejemplo, la replicación, la producción de proteínas de la cubierta
o una pérdida de regiones de control de la expresión tales como
promotores o puntos de enlace, y que contiene un marcador genético
que puede seleccionarse de manera apropiada para una utilización en
la identificación de células transformadas, por ejemplo, una
resistencia a la tetraciclina o una resistencia a la ampicilina. Un
vehículo de clonación se denomina frecuentemente un vector.
Clonación - - Procedimiento para la
obtención de una población de organismos o de secuencias de ADN
procedente de un organismo o de una secuencia de este tipo mediante
una reproducción asexuada o una replicación de ADN.
Replicón - - ADN requerido para una
replicación en un organismo particular, que comprende un origen de
replicación.
Molécula de ADN recombinante - - Molécula
que comprende segmentos de ADN de diferentes genomas unidos de
extremidad a extremidad y que tienen la capacidad de infectar
ciertas células huésped y de mantenerse en las mismas.
Secuencia de control de expresión - -
Secuencia de nucleótidos, que controla y que regula la expresión de
genes estructurales cuando éstos están enlazados de manera funcional
con estos genes. Estos comprenden el sistema lac, regiones
mayores de operador y de promotor del fago lambda, la región de
control de las proteínas de cubierta vírica y otras secuencias
conocidas por controlar la expresión de genes de células
procariotas o eucariotas y sus virus.
Mutación - - Cambio hereditario de la
información genética de un organismo.
Mutante - - Organismo que presenta una
mutación. Generalmente expresa un fenotipo que puede ser discernido
por comparación con una cepa patrón de referencia de la especie a la
que pertenece el organismo o de una población de tipo silvestre de
este organismo.
Tal como se utiliza en la presente descripción,
bek y flg designan receptores del factor de
crecimiento de los fibroblastos o sus fragmentos producidos por
sistemas de cultivo celulares o exentos de células, bajo formas
reactivas que tienen una capacidad de influenciar un crecimiento
celular, una diferenciación y una respuesta in vitro como lo
hacen los bek y flg nativos.
En la naturaleza pueden existir diferentes alelos
de bek y de flg. Estas variaciones pueden
caracterizarse por diferencias al nivel de la secuencia de
nucleótidos del gen estructural que codifica proteínas defunción
biológica idéntica. Es posible producir análogos que presenten
substituciones, deleciones, adiciones o reemplazamientos únicos o
múltiples de aminoácidos.
\newpage
Las abreviaturas de aminoácidos con una y con
tres letras, utilizadas en la presente descripción, tienen los
siguientes significados:
A | Ala | Alanina |
C | Cys | Cisteína |
D | Asp | Ácido aspártico |
E | Glu | Ácido glutámico |
F | Phe | Fenilalanina |
G | Gly | Glicina |
H | His | Histidina |
I | Ile | Isoleucina |
K | Lys | Lisina |
L | Leu | Leucina |
M | Met | Metionina |
N | Asn | Asparagina |
P | Pro | Prolina |
Q | Gln | Glutamina |
R | Arg | Arginina |
S | Ser | Serina |
T | Thr | Treonina |
V | Val | Valina |
W | Trp | Triptofano |
Y | Tyr | Tirosina |
B | Asx | Asp o Asn, sin distinción |
Z | Glx | Glu o Gln, sin distinción |
X | X | Aminoácido no determinado o atípico. |
Para facilitar la explicación, la invención puede
considerarse como que presenta tres formas de realización distintas
pero en correlación. Una primera forma de realización implica la
clonación y la identificación de ADNc de longitud completa que
codifica la proteína receptora humana bek. Una segunda forma
de realización comprende la expresión de los productos del gen
humano bek en células huésped recombinantes y, una tercera
forma de realización comprende la utilización de los productos
obtenidos por vía recombinante para, además, un análisis del
receptor bek y una selección de medicamento.
En general, se conocen las técnicas de ingeniería
genética. (Véase: Methods in Enzymology, (Academia Press,
New York, volúmenes 65 y 68 (1979); 100 y 101 (1983)) y las
referencias citadas en la misma. Puede encontrarse un estudio
técnico en profundidad, que presenta formas de realización en
metodología de ingeniería genética mas comúnmente utilizadas, en
Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor Laboratory (1982) y en Current Protocols in Molecular
Biology, volúmenes I y II, Ausubel, et al., editores
Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, (1987).
Pueden clonarse genes que codifican diferentes
polipéptidos incorporando un fragmento de ADN que codifica el
polipéptido en un vehículo de ADN recombinante, por ejemplo,
vectores bacterianos o víricos, y transformando un huésped
apropiado. Este huésped es, de manera típica, una cepa de
Escherichia coli (E. coli), sin embargo, según el
producto deseado, pueden utilizarse huéspedes eucariotas. Se aíslan
los clones que incorporan los vectores recombinantes y se les puede
hacer crecer y pueden ser utilizados para producir los polipéptidos
deseados a gran escala.
Varios grupos de investigadores han aislado
mezclas de ARN mensajero (ARNm) a partir de células eucariotas y
han utilizado una serie de reacciones enzimáticas para sintetizar
copias de ADN de doble hebra, que son complementarios de esta mezcla
de ARNm. (Wewer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 83:7137-7141 (1986)). En la primera
reacción, se transcribe el ARNm en un ADN complementario de hebra
simple (ADNc) por una ADN polimerasa, dirigida por un ARN,
igualmente denominada transcriptasa inversa. Una transcriptasa
inversa sintetizada un ADN en el sentido 5'-3',
utiliza desoxirribo-nucleósidos
5'-trifosfatos como precursores, y requiere a la
vez, una matriz y una hebra de inicio, debiendo tener esta última
una extremidad 3-hidroxilo libre. Los productos de
transcriptasa inversa, independientemente de que sean copias
parciales o completas de la matriz de ARNm, presentan,
frecuentemente, horquillas de cabello parcialmente de doble hebra
("bucles") al nivel de su actividad III. En la segunda
reacción, estos "bucles en forma de horquilla de cabello"
pueden utilizarse como puntos de inicio para ADN polimerasas. El
ADN preformado es requerido, a la vez, como matraz y como iniciador
durante la reacción de la ADN polimerasa. La ADN polimerasa
requiere la presencia de una hebra de ADN que presente un
agrupamiento 3'-hidroxilo libre, con el que se unen
los nuevos nucleótidos para extender la cadena en el sentido
5'-3'. Los productos de reacción secuenciales de
este tipo de transcriptasa inversa y de ADN polimerasa, presentan
también un bucle en una extremidad. El vértice del bucle o "punto
de repliegue" del ADN de doble hebra, creado de este modo, es
substancialmente un segmento de hebra simple. En la tercera
reacción, este segmento de hebra simple es cortado por la nucleasa
S1 específica de una hebra simple para generar un segmento de ADN
de hebra doble en la "extremidad franca". Este procedimiento
general puede ser aplicado a cualquier mezcla de ARNm y ha sido
descrito por Buell, et al., J. Biol. Chem., 253:2483
(1978).
La mezcla de ADNc de doble hebra obtenida
(ADNc-db) se inserta en vehículos de clonación por
medio de cualquiera de la numerosas técnicas conocidas, que depende
al menos en parte del vehículo particular utilizado. Se examinan
con gran detalle diversos procedimientos de inserción en Methods
In Enzymology, 68:16-18 (1980), y las
referencias citadas en el mismo.
Una vez que los segmentos de ADN han sido
insertados, se utiliza el vehículo de clonación para transformar un
huésped apropiado. Estos vehículos de clonación confieren,
habitualmente, la característica de resistencia a un antibiótico al
huésped. Los huéspedes de este tipo son, generalmente, células
procariotas. En ese momento, únicamente algunos de los huéspedes
transformados o transfectados contienen el ADNc deseado. La suma de
todos los huéspedes transformados o transfectados, constituye un
"banco" de genes. El banco global de ADNc-db
creado mediante este procedimiento proporciona una muestra
representativa de la información codificante presente en la mezcla
de ARNm utilizada como material de partida.
Si está disponible una secuencia
oligonucleotídica apropiada, puede ser utilizada para identificar
clones de interés de la manera siguiente. Se hacen crecer células
individuales transformadas o transfectadas en forma de colonias
sobre un papel de filtro de nitrocelulosa. Estas colonias son
lisadas; el ADN liberado se enlaza de manera estrecha con papel de
filtro por calentamiento. A continuación se incuba el papel de
filtro con una sonda oligonucleotídica marcada, que es
complementaria del gen estructural de interés. La sonda realiza una
hibridación con el ADNc con el que es complementaria y, se
identifica por autorradiografía. Los clones correspondientes se
caracterizan para identificar un clon o una combinación de clones
que contenga toda la información estructural de la proteína deseada.
La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés
se aísla y se reinserta en un vector de expresión. El vector de
expresión porta el gen clonado bajo un control de regulación de los
elementos específicos de control procariota o eucariota que
permiten la expresión eficaz (transcripción y traducción) del
ADNc-db. Como consecuencia, esta técnica general es
aplicable, únicamente, a las proteínas para las que se conoce al
menos una parte de su secuencia de aminoácidos o de ADN para la cual
está disponible una sonda oligonucleotídica. Véase, en general,
Maniatis, et al., supra.
Se han desarrollado, mas recientemente,
procedimientos para identificar clones específicos sondando
colonias de bacterias o de placas de fago con anticuerpos
específicos de la proteína codificada de interés. Este
procedimiento puede ser utilizado únicamente con vectores de
clonación "vector de expresión" dado que se requiere la
elaboración del producto proteico. El gen estructural se inserta en
el vector por el lado de las secuencias genéticas de regulación, que
controla la expresión de la proteína. Las células son lisadas, bien
mediante procedimientos químicos o bien mediante una función
suministrada por la célula o por el vector huésped, y la proteína
es detectada por un anticuerpo específico y un sistema de detección
como un inmunoensayo enzimático. Un ejemplo a este respecto es el
sistema \lambdagt_{11} descrito por Young y Davis, Proc.
Nat. Acad. Sci. U.S.A., 80:1194-1198 (1983) y
Young y Davis, Science, 222:778 (1983).
Como se ha mencionado anteriormente, un clon de
ADNc parcial de flg humano es conocido por el trabajo
anterior de la solicitante. Un análisis ulterior de la secuencia de
nucleótidos del clon ADNc parcial de flg humano de origen,
C51, así como de varios aislados independientes suplementarios, ha
revelado que cada uno de los clones parciales presenta una secuencia
en 5' idéntica, que corresponde a un punto EcoRI cortado que
existe en la naturaleza. Esto sugiere que, en la construcción del
banco de ADNc, este punto EcoRI no está protegido por la
EcoRI metilasa antes de un corte por EcoRI. Se
piensa, por ejemplo, que la extremidad 5' del ADNc de flg se
encuentra sobre un fragmento EcoRI sin recubrimiento clonado
de manera independiente. La técnica de reacción en cadena por
polimerasa (PCR) anclada (Loh, et al., Science, 243:
217-220 (1989)) es utilizada para confirmar esto y
para obtener 170 pares de bases (pb) suplementarias de la secuencia
de nucleótidos de flg aguas arriba del punto EcoRI
interno. Una segunda serie de reacciones de PCR, que utilizan
puntos de inicio en esta nueva secuencia conjuntamente con los
puntos de inicio oligonucleótidos específicos de un brazo
\lambdagt_{11} amplia el interés de un clon flg 5'
procedente del mismo banco de ADNc de HUVEC. Puesto que se han
encontrado de manera ocasional mutaciones de secuencia generadas
por PCR, este segundo producto de PCR ha sido radiomarcado y se ha
utilizado como sonda para seleccionar de nuevo el banco de ADNc de
HUVEC en \lambdagt_{11}. Se obtiene un clon de 700 pb que se
extiende desde el punto EcoRI interno hasta la región no
traducida en 5'. La secuencia deducida completa de aminoácidos de
flg humano está representada en la figura 2A.
Las secuencias publicadas de los clones parciales
de ADNc murino bek y humano flg (Kornbluth, et
al., 1988 supra; Ruta, et al., 1988 supra)
son altamente homólogas con una divergencia significativa observada
únicamente en la inserción de kinasa (identidad del 50%) y en la
extremidad COOH. Aun cuando las pequeñas diferencias de secuencia
podrían haber sido atribuidas a una divergencia interespecie, se
observa que las inserciones mucho mas importantes de kinasa de los
receptores PDGF humanos y murinos (tipo B) son idénticas en un 85%
(Yarden, et al., Nature, 323:226-232
1986); Claesson-Welsh, et al., Mol. Cell.
Biol., 8:3476-3486 (1988)), lo que sugiere que
bek podría ser, de hecho, un producto de gen diferente de
flg. Para clonar bek, se selecciona un banco de ADNc
de tronco cerebral humano en \lambdagt_{11} con un
oligonucleótido radiomarcado de 33 bases que corresponde a los 11
codones de extremidad COOH de bek murino (Kornbluth, et
al., 1988, supra). Este corresponde a la extensión mas
larga de no identidad entre las secuencias publicadas de bek
y flg. Se identifican treinta y dos clones, entre los
cuales está secuenciado bek5, que contiene un inserto de ADNc
de 3,2 kb. La secuencia deducida de los aminoácidos establece
claramente que es muy similar pero diferente de flg, y que no
presenta las aproximadamente 25 pb de secuencias de péptido señal,
principalmente el inicio de traducción ATG. Se obtienen clones con
recubrimiento seleccionando de nuevo el banco de tronco cerebral con
un fragmento de ADNc de 750 pb correspondiente a la región 5' de
bek5. La secuencia deducida completa de aminoácidos de
bek humano está representada en la figura 2A. Los detalles
específicos de la clonación de flg y bek se
encuentran en el ejemplo 1.
Flg y bek son productos de gen
similares aunque distintos (figura 2B), con particularidades
estructurales compartidas por la familia de
PDGF/CSF-1/c-kit de receptores
enlazados con tirosina kinasas (Ullrich y Schlessinger, 1990,
supra). Sus secuencias codificantes comprenden una secuencia
de péptido señal hidrófoba de 21 aminoácidos, un dominio
extracelular de 356 (bek) y de 355 (flg) aminoácidos,
un dominio transmembranal de 21 aminoácidos y un dominio
citoplasmático de 423 (bek) y de 425 (flg)
aminoácidos. Los dominios extracelulares de flg y de
bek contienen tres dominios "de tipo inmunoglobulina"
(Ig) de tamaño y localización similares. De manera interesante, la
identidad de secuencia de aminoácidos en y alrededor de los
primeros dominios de Ig es mucho menor (43%) que la que se observa
en y alrededor de los dominios segundo y tercero de Ig (74%). Ocho
puntos potenciales de glicosilación enlazada con N están situados
en posiciones idénticas en los dominios extracelulares de flg
y de bek. Flg contiene un punto suplementario de
glicosilación enlazado con N sobre el aminoácido 185. Los autores
Lee, et al., (1989) han señalado una región en el dominio
extracelular de flg de pollo, que presenta 8 aminoácidos,
ácidos, próximos. Esta "caja ácida" está presente igualmente en
flg humano y en bek humano, y comprende 8 y 5
residuos ácidos, respectivamente, los dominios citoplasmáticos de
bek y de flg comprenden largas regiones próximas a la
membrana seguidas por dominios catalíticos conservados de kinasa que
están ocupados por inserciones de 14 aminoácidos. Los dominios de
kinasa están seguidos por colas divergentes de extremidad carboxi.
La identidad global entre bek y flg es del 71%,
siendo la región de identidad mas elevada (88%) el dominio de
kinasa.
Se determina la expresión de los ARNm de
flg y de bek en diferentes líneas celulares mediante
análisis de transferencia de Northern con sondas de ADNc de
bek y de flg que corresponden a una parte de sus
regiones no traducidas entre 3' no homólogas. En células de
raptomiosarcoma A204, se observan dos transcripciones de
flg con aproximadamente 4,3 y 4,2 kg, pero no se detecta
ARNm de bek (figura 3). Las células HUVEC y de
teratocarcinoma humano NTERA 2 expresan únicamente, las
transcripciones de flg con 4,2 y 4,3 kb, respectivamente. El
significado de las transcripciones distintas de 4,3 y de 4,2 kb de
flg es desconocido en la actualidad. Pueden estar
emparentados con los clones de flg aislados que, en
comparación de las figuras 2A y 2B, representan una deleción del
bucle de cisteína de la extremidad amino del dominio extracelular.
Se observa un transcrito de bek de 4,4 kg únicamente en la
línea celular de teratocarcinoma. Otros investigadores han mostrado
que el ARNm de bek es expresado en el hígado, los pulmones,
el cerebro y los riñones de ratones adultos pero está ausente en el
corazón de la rata (Kornbluth et al., 1988, supra).
La proteína flg de pollo ha sido observada en el intersticio,
el cerebro, en la molleja, en el corazón, en los músculos
esqueléticos, y en los fibroblastos embrionales, pero únicamente en
el cerebro de pollos adultos (Pasquale et Singer, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A., 86:5449-5453 (1989)).
Tomados en conjunto, estos rasurados muestran que bek y
flg no son expresados de manera coordenada.
Los ADNc-db de flg y de
bek pueden insertarse en vectores de expresión según
cualquiera de las numerosas técnicas conocidas. En general se pueden
encontrar los procedimientos en Maniatis, et al., (1982),
supra, y Ausubel, et al., (1987), supra. En
general, el vector se hace lineal al menos por medio de una
endonucleasa de restricción, que producirá al menos dos extremidades
francas o cohesivas. Se realiza una ligación o unión del
ADNc-db en el punto de inserción del vector.
Si se utilizan células procariotas u otras
células que contengan un material substancial de pared celular, el
procedimiento mas común para la transformación por el vector de
expresión es un tratamiento previo con cloruro de calcio, como se ha
descrito por Cohen, R.N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
U.S.A., 69:2110 (1972). Si se utilizan células sin barreras de
pared celular como células huésped, se realiza la transfección
según el procedimiento de precipitación al fosfato de calcio
descrito por Graham et Van der Eb, Virology, 52:456 (1973).
Se pueden utilizar, con éxito, otros procedimientos para introducir
el ADN en células tales como inyección nuclear, una infección
vírica, una electroporación o una fusión de protoplasto. A
continuación se cultivan las células sobre medio selectivo y son
producidas las proteínas que son codificadas por el vector de
expresión.
La expresión "vectores de expresión" hace
referencia a vectores que pueden transcribir y traducir las
secuencias de ADN que contienen cuando secuencias de este tipo están
enlazadas con otras secuencias de regulación que pueden afectar a
su expresión. Estos vectores de expresión deben poderse replicar en
los organismos o sistemas huésped bien en forma de epitomas, de
bacteriófagos o bien en forma de una parte integrante del ADN
cromosómico. Una forma de vector de expresión es el bacteriófago,
virus que se alojan y se replican normalmente en bacterias. Un fago
particularmente deseable con esta finalidad comprende el fago
\lambdagt_{10} y el fago \lambdagt_{11} descritos por Yound
et Davis, supra. \lambdagt_{11} es un vector de ADN
recombinante general que puede producir polipéptidos específicos por
el ADN insertado.
Para minimizar la degradación, durante una
inducción por un análogo sintético de la lactosa (IPTG), se
sintetizan proteínas extrañas o partes de las mismas, fusionadas con
la proteína procariota \beta-galactosidasa. La
utilización de células huésped que no presentan vías de degradación
proteica puede aumentar igualmente, la duración de vida de las
nuevas proteínas producidas a partir de los clones
\lambdagt_{11} inducidos. La expresión propia de un ADN extraño
en los clones \lambdagt_{11} dependerá de la orientación propia
y del cuadro de lectura del ADN insertado con relación al promotor
y al codon de iniciación de traducción de la
\beta-galactosidasa.
Otra forma de vector de expresión útil en
técnicas de ingeniería genética, es el plásmido - un ADN de doble
hebra circular no integrado (extracromosómico). Cualquier otra
forma de vector de expresión, que tenga una función equivalente, es
apropiada para una utilización en el procedimiento de la invención.
Los vectores recombinantes y la metodología divulgadas en la
presente descripción, son apropiados para una utilización en
células huésped que cubren una amplia gama de organismos
procariotas y eucariotas. Se prefieren células procariotas para la
clonación de secuencias de ADN y en la construcción de vectores.
Por ejemplo, la cepa K12 de E. coli HB101 (ATCC nº 339 694),
es particularmente útil. Evidentemente, pueden utilizarse otras
cepas microbianas. Se utilizan vectores que contengan secuencias de
replicación y de control que procedan de especies compatibles con la
célula o con el sistema huésped en combinación con estos huéspedes.
El vector porta, habitualmente, un origen de replicación, así como
características que pueden proporcionar una selección de fenotipo en
células transformadas. Por ejemplo, se puede transformar E.
coli utilizando el vector pBR322, que contiene genes para una
resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina (Bolivar, et
al., Gene, 2:95 (1977)).
Estos genes de resistencia a los antibióticos
proporcionan un medio de identificación de las células
transformadas. El vector de expresión puede contener, igualmente,
elementos de control que se pueden utilizar par la expresión del
gen de interés. Elementos de control procariotas comunes,
utilizados para la expresión de secuencias de ADN extraño en E.
coli comprenden los promotores y las secuencias de regulación
que proceden de los operones de la
\beta-galactosidasa y del triptofano (trp)
de E. coli, así como los promotores pR y pL del bacteriófago
\lambda. Igualmente se han utilizado combinaciones de estos
elementos (por ejemplo, TAC, que es una fusión del promotor trp con
el operador lactosa). Igualmente se han descubierto y se han
utilizado otros promotores y se han publicado detalles relativos a
sus secuencias de nucleótidos lo que permite que un experto en la
técnica pueda combinarlos y explotarlos de manera funcional.
Además de los procariotas, se pueden utilizar,
igualmente, microorganismos eucarióticos, tales como cultivos de
levadura. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común de
panificado es la que se utiliza mas comúnmente entre los
microorganismos eucariotas, aún cuando un cierto número de otras
cepas estén disponibles comúnmente. Promotores de levadura
apropiados para la expresión de secuencias de ADN extrañas en una
levadura, que comprende los promotores de la
3-fosfoglicerato kinasa u otros enzimas
glicolíticos. Vectores apropiados de expresión pueden contener
señales de detención, que proporcionan la poliadenilación y la
detención de la transcripción de ARNm del gen clonado. Cualquier
vector que contenga un promotor compatible con una levadura, un
organismo de replicación y una secuencia apropiada de detención es
apropiado para la expresión de bek o de flg.
Igualmente pueden utilizarse líneas celulares
procedentes de organismos pluricelulares como huéspedes. En
principio, cualquier cultivo celular de este tipo puede ser
utilizado, independientemente de que proceda de una fuente
vertebrada o invertebrada. Sin embargo, se ha mostrado el interés
máximo para células de vertebrados, y la propagación de células de
vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un
modo de operación de rutina estos últimos años. Ejemplos de
huéspedes útiles de este tipo comprenden las líneas celulares VERO,
HeLa, C127 o 3T3 murinas; de ovario de hámster chino (CHO), W138,
BHK, COS-7 y MDCK. Las células 3T3 murinas y CHO son
particularmente preferidas. Los vectores de expresión para células
de este tipo comprenden, habitualmente, un origen de replicación,
un promotor situado delante del gen a ser expresado, sitios de
engarce de ARN (si es necesaria) y secuencias de detención de la
transcripción.
Para una utilización en células de mamífero, las
funciones de control (promotores y activadores) sobre los vectores
de expresión están proporcionadas frecuentemente por un material
vírico. Por ejemplo, promotores comúnmente utilizados proceden de
polioma, del aminovirus 2 y, en el caso mas frecuente, del virus de
simio 40 (SV40). Igualmente pueden utilizarse promotores eucariotas,
tales como el promotor de gen murino de la metalotioneina (Paulakis
et Hamer, Proc. Natl. Acad. Sci., 80:397-401
(1983)) Además, se pueden utilizar igualmente, y esto es deseable
frecuentemente, el promotor o la secuencias de control que están
asociadas naturalmente con las secuencia genética deseada, con la
condición de que la secuencia de control de este tipo sean
compatibles con el sistema huésped. Para aumentar la velocidad de
transcripción, pueden añadirse igualmente secuencias de activador
eucariota a la construcción. Estas secuencias pueden obtenerse a
partir de una variedad de células animales o de retrovirus oncógenos
como el virus del sarcoma murino.
Se puede proporcionar un origen de las
replicación por construcción del vector para que comprenda un
origen exógeno, como el que esta proporcionado por el SV40 u otras
cepas víricas, o puede ser proporcionado por un mecanismo de
replicación cromosómica de la célula huésped. Si el vector está
integrado en el cromosoma celular huésped, esto último es
frecuentemente suficiente.
Las células huésped pueden dar bek o
flg que pueden ser de diversas composiciones químicas. La
proteína es producida presentando una metionima como primer
aminoácido. Esta metionina está presente debido al codon de partida
ATG existente de manera natural en el origen del gen estructural o
por una construcción delante de un segmento del gen estructural. La
proteína puede seleccionarse igualmente por vía intracelular o
extracelular, dando lugar al amino-ácido que se observa de manera
natural en la extremidad aminada de la proteína. La proteína puede
producirse conjuntamente con su propio péptido señal o con un
heterólogo, pudiéndose seleccionar específicamente el polipéptido
señal en un ámbito intracelular o extracelular. Finalmente, se
puede producir bek o flg mediante una expresión
directa bajo una forma madura sin tener que eliminar por selección
cualquier polipéptido extraño.
La expresión "células huésped recombinantes"
hace referencia a células que han sido transformadas por vectores
construidos utilizando técnicas de ingeniería genética. Como se ha
definido en la presente descripción, se puede producir bek o
flg como consecuencia de esta transformación. Bek o
flg o sus fragmentos producidos por células de este tipo son
citados en referencia como "bek o flg
recombinante".
Los detalles de la expresión de flg y de
bek están dados en el ejemplo 2.
Las líneas celulares que sobreexpresan bek
y flg proporcionadas en la presente descripción, son útiles
para estudiar una interacción ligando/receptor así como en un
programa de selección de medicamentos concebidos de manera
racional. Puntos potenciales de acción de agentes terapéuticos
comprenden, pero sin carácter limitativo, una unión
receptor/ligando, una transducción de señal, una interacción
receptor/diana.
De este modo se pueden evaluar medicamentos al
nivel de su capacidad para inhibir un enlace de ligando natural
mediante una inhibición competitiva u otros mecanismos. Como
variante, se pueden utilizar las células que sobreexpresan
bek y flg como fuente de inmunógeno para producir
anticuerpos, como anticuerpos monoclonales, que pueden igualmente
ser evaluados al nivel de su capacidad para efectuar un enlace de
ligando o una agregación de receptores. Igualmente se puede utilizar
el sistema para evaluar medicamentos que afecten a las
interacciones kinasa/diana. Estos medicamentos, conocidos como
trifostinas, tienen como punto de acción la fosforilación de dianas
celulares para el dominio de receptor de kinasa, principalmente la
autofosforilación del propio receptor. Para que el enlace del
ligando y la actividad de kinasa se encuentren en dominios
distintos, no es necesario expresar la secuencia entera del
receptor para evaluar los efectos de medicamentos sobre las
actividades identificadas anteriormente. De este modo, la invención
se refiere a la expresión de fragmentos biológicamente activos de
flg y de bek. Por ejemplo, se pueden utilizar de
manera útil los productos de clonación y de la expresión de un ADNc
que codifique los 377 primeros aminoácidos de bek o los 376
primeros aminoácidos de flg (es decir los dominios
extracelulares mas trans-membranales) o los 423
aminoácidos de bek o los 425 aminoácidos de flg de
extremidad COOH para evaluar un ligando y trifostinas,
respectivamente. El ejemplo 3 ilustra varias de estas
aplicaciones.
También, en otra forma de realización, el dominio
extracelular solo o subdominios de este pueden utilizarse como
inhibidores de infección por patógenos oportunistas tales como el
virus del herpes de tipo I u otros patógenos que utilizan bek
o flg endógeno como medio de infección de su célula diana.
Se ha descrito que la entrada del
HSV-1 en células queda aumentada de manera espectacular en líneas celulares que presenten flg sobreexpresado en su superficie (R.J. Kaner, et al., Science 248:1410-1413 (1990)). De este modo, pueden utilizarse las líneas celulares con sobreexpresión para seleccionar medicamentos inhibidores midiendo un enlace reducido del virus (análisis directo) o por una infectividad reducida o una reducción del virus del medio en presencia o en ausencia de medicamentos candidatos tales como fragmentos de los propios receptores.
HSV-1 en células queda aumentada de manera espectacular en líneas celulares que presenten flg sobreexpresado en su superficie (R.J. Kaner, et al., Science 248:1410-1413 (1990)). De este modo, pueden utilizarse las líneas celulares con sobreexpresión para seleccionar medicamentos inhibidores midiendo un enlace reducido del virus (análisis directo) o por una infectividad reducida o una reducción del virus del medio en presencia o en ausencia de medicamentos candidatos tales como fragmentos de los propios receptores.
La invención proporciona las secuencias completas
de ADNc humano de dos receptores del factor de crecimiento de los
fibroblastos. Aun cuando una secuencia de ADNc parcial de una
extremidad de proteína kinasa humana flg sea conocida (Ruta,
et al., supra (1988)) como lo es la secuencia parcial
de la proteína kinasa murina bek (Kornbluth, et al.,
supra (1988)), las secuencias completas de las formas
humanas de estos genes no están disponibles. Sin las secuencias
completas, la extensión del punto funcional del enlace del ligando
y el grado de homología entre flg y bek no pueden ser
evaluados de manera apropiada. Como se ha divulgado en la presente
descripción, flg y bek son productos genéticos
similares pero distintos, que presentan una afinidad elevada para
aFGF, bFGF y k-FGF. Los genes de bek y
flg están localizados sobre cromosomas diferentes y son
expresados de manera diferente en diferentes líneas celulares y
tejidos.
Flg y bek muestran particularidades
estructurales compartidas por los receptores de tirosina kinasa
PDGF y
\hbox{CSF-1,}principalmente un dominio de tirosina kinasa cortado y una región extracelular que comprende múltiples dominios de tipo inmunoglobulina. Sin embargo, los receptores del FGF son distintos en el plano estructural de los receptores PDGF y CSF-1 desde varios puntos de vista:
1) los dominios extracelulares de los receptores
del FGF comprenden 3 dominios de inmunoglobulina (Ig), mientras que
los de los receptores PDGF y CSF-1 comprenden 5
dominios de Ig. Desde este punto de vista los receptores del FGF se
parecen al receptor de IL-1, cuya región
extracelular comprende tres dominios de Ig (Sims, et al.,
Science, 241:585-589 (1988));
2) la región próxima a la membrana de los
receptores del FGF, 87 (flg) y 89 (bek) aminoácidos,
es significativamente mas larga que la de los receptores PDGF y
CSF-1 (49 y 51 aminoácidos, respectivamente);
3) el dominio de inserción de kinasa de los
receptores del FGF comprende únicamente 14 aminoácidos mientras que
las inserciones de kinasa de los receptores PDGF y
CSF-1 son mucho mas importantes (104 y 70
aminoácidos, respectivamente) (Hanks, et al., Science,
241:42-52 (1988)). Un residuo tirosina consensus y
un sitio potencial de autofosforilación en el dominio de kinasa del
receptor PDGF se conservan en los dos receptores del FGF (residuo
654 de flg, residuo 657 de bek). La presencia de
motivos comunes entre los receptores de una variedad de ligandos
distintos, en el plano biológico, refuerza el argumento de que, por
razones estructurales y/o de funcionamiento, estos han sido
sometidos a fuertes tensiones al nivel de la evolución (Ullrich y
Schlessinger, Cell 60:203-221 (1990)).
\newpage
Células NIH 3T3, transfectadas por vectores de
expresión de mamíferos, que contienen las secuencias que codifican
bien flg o bien bek, que dirigen la síntesis de
glicoproteínas, presentan pesos moleculares aparentes de 150.000 y
de 135.000, respectivamente. Cuando se sintetiza en presencia de
tunicamicina, el peso molecular de la proteína flg mayor es
de 110 kDa mientras que el de la bek es de 90 kDa.
Precedentemente se han observado dos proteínas flg de 90 y
110 kDa en inmunoprecipitados de células de rabdomiosarcoma humano
marcadas sobre el plano metabólico, tratadas con la tunicamicina
(Ruta, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.,
86:8722-8726 (1989)). Aun cuando sea imposible
excluir por completo un mecanismo que implique una proteolisis, las
proteínas flg de 90 y 110 kDa en células de rabdomiosarcoma
pueden representar productos de traducción primaria reales. Reid,
et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
87:1596-1600 (1990)) han informado recientemente el
aislamiento de dos ADNc de flg murinos distintos, uno de los
cuales es, aparentemente, el homólogo de ADNc de flg humano
divulgado en la presente descripción y un segundo ADNc mas corto,
que presenta una deleción de la región que codifica el primer
dominio del tipo Ig mediante un engarce alternativo. Además de los
clones de longitud completa divulgados en la presente descripción,
se pueden recuperar otros clones de ADNc que parece que codifican
formas truncadas de flg y de bek a partir de bancos de
ADNc de HUVEC y de cerebro humano. Se aísla una variante de
flg que no presenta el primer dominio de tipo Ig pero que,
por otra parte, está intacto. Otras variantes de ADNc comprenden
una versión truncada de bek que codifica una única
secuencia, un dominio único de "tipo Ig" y un codon de
detención y una variante de flg que codifica dos dominios de
"tipo Ig". Estos dos clones pueden representar formas
decretadas de bek o de flg. Una comparación de las
secuencias de nucleótidos de estos clones con los ADNc de flg
y de bek que codifican receptores que presentan tres
dominios "de tipo Ig" sugiere que proceden de genes
estructurales de flg y de bek por un engarce
alternativo. Como consecuencia es posible que la especie de peso
molecular menor de flg inmunoprecipitado a partir de lisatos
de células de rabdomiosarcoma, represente una forma real de
flg que es generada por un engarce alternativo. De manera
interesante, las células de rabdomiosarcoma A204 expresan dos ARNm
diferentes de flg que podrían representar las formas
engarzadas de manera alternativa, mientras que las células
NTERA-2 y endoteliales parece que expresan de manea
diferente los ARNm alternativos de flg.
Se ha depositado un cultivo puro sobre el plano
biológico de la cepa siguiente en la American Type Culture
Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, habiéndole
sido atribuido el número de registro indicado después de un ensayo
fructuoso de viabilidad, y una vez que han sido pagadas las tasas
requeridas. El acceso a dicho cultivo será posible durante la
tramitación de la solicitud de patente a una persona determinada
por el comisario habilitado para ello según los artículos 37 C.F.R.
\NAK1.14 y 35 U.S.C. \NAK122. Cualquier restricción sobre la
disponibilidad del citado cultivo para el público, será eliminada
de manera irrevocable cuando se produzca la concesión de una patente
basada sobre la solicitud de patente y dicho cultivo permanecerá
disponible de manera permanente durante un período de al menos
cinco años tras la solicitud mas reciente de un suministro de una
muestra y, en cualquier caso, durante un período de al menos 30
años desde la fecha del depósito. Si el cultivo se tornase no viable
o se destruyese por inadvertencia, será reemplazado por uno o
varios cultivos viables con la misma descripción taxonómica.
Cepa/plásmido ATCC nº | Fecha del depósito |
E.coli/pGC37 | |
E.coli/pflgFL24. |
Conviene señalar que, para facilitar el
almacenamiento, los vectores de la presente invención han sido
depositados en forma de huéspedes bacterianos transformados. Sin
embargo este un procedimiento de rutina para un experto en la
técnica para cultivar las células bacterianas, recuperar los
vectores y utilizarlos para transformar otras células huésped tales
como células 3T3 murinas como se ha descrito en la presente
descripción.
Los ejemplos siguientes están dados a título de
ilustración de la presente invención. La presente invención no está
restringida únicamente a estos ejemplos.
El ejemplo ilustra la clonación de ADNc de
flg y de bek de longitud completa. Como se han
mencionado anteriormente, se aísla un clon parcial por selección en
un banco de ADNc procedente de ARNm endoteliales humanos con una
sonda basada en un producto de gen de transformación retroviral
(para detalles véase Ruta, et al., 1988 supra). De
manera específica, se utiliza el encogen V-fms (la
forma activada del receptor de tirosina kinasa
CSF-1) como sonda para seleccionar 10^{6} placas
bajo pequeña restricción. Se detectan quince clones
\lambdagt_{11} positivos y se purifican cinco por placa y
también son analizados. Un clon, C51 es denominado gel de tipo fms
(flg: fms-like gene). Como se ha
descrito anteriormente en la presente descripción, el fragmento
faltante en 5' se recupera mediante una combinación de PCR y de
técnicas clásicas de clonación.
Se realiza la técnica de reacción con polimerasa
en cadena (PCR) (Saiki, et al., Science. 230:
1350-1354 (1985)) con 100 pmoles de cada iniciador
oligonucleotídico, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,01%,
cada uno entre dATP, dGTP, dCTP y dTTP 0,2 mM,
Tris-HCl 10 mM, pH 8,3 (a 25ºC) y 2,5 U de ADN
polímerasa Taq (Perkin-Elmer Cetus) en un volumen
final de 0,1 ml. Salvo indicación en contra, todas las reacciones
han sido realizadas durante 30 ciclos con tiempos de ciclo de 94ºC
durante 1,5 minutos, 60ºC durante 1,5 minutos y 72ºC durante 4
minutos.
Se sintetizan todos los iniciadores
oligonucleotídicos sobre un sintetizador de ADN Applied Biosystems
380A utilizando una química patrón perfectamente conocida con
cianoetilfósforoamidato.
Los oligonucleótidos presentan las secuencias
siguientes:
1 | AN | GCATGCGCGCGGCCGCGGAGGCC |
2 | aNpolyC | GCATGCGCGCGGCCGCGGAGG (C)_{14} |
3 | Flg-1 | ACATCCAGCTGGTATGTGTG |
4 | Flg-2 | TACGGTCGACCGTACTCATTCTCCACAATGCA |
5 | Flg-PE-165non | GCCATTTTTCAACCAGCGC |
6 | Flg-PE-141non | GGGGTTTGGGGTCCCACTGGAA |
7 | GT11-R1 | TGACACCAGACCAACTGGTAATGG |
8 | GT11-R3 | TAATGGTAGCGACCGGCGCTCAGC |
9 | 3'mbek | TCATGTTTTAACACTGCCGTTTATGTGTGGATA |
10 | Bek4A | GGAATTCAAGCTTCTAGACCACCATGGTCAGCTGGGGTCGTTTCA |
11 | Bek1B | TCCTATTGTTGGGCCCCAAGTGCA. |
Se obtiene el ADNc de flg en 5' del sitio
EcoRI interno (extremidad 5' de pC51, Ruta, et al.,
1988 supra) con PCR anclado (Loh, et al., 1989
supra) utilizándose un iniciador Flg-1 para
iniciar específicamente una síntesis de ADNc de primera hebra a
partir de 50 \mum de ARN totales de célula endotelial humana.
Tras extensión homopolimérica dG a la primera hebra con una
desoxinucleotidilo transferasa en extremidad, se realiza una
amplificación con PCR (30 ciclos) con los iniciadores
Flg-2, AN, y 10 pmoles de ANpolyC con tiempos de
ciclo de 94ºC durante 1,5 minutos, 50ºC durante 2 minutos y 72ºC
durante 4 minutos. Se obtiene un único producto de PCR que extiende
la secuencia de C51 de 170 pb en el sentido 5'. Se utiliza la nueva
secuencia para construir los dos oligonucleótidos que se utilizan
con los oligonucleótidos específicos de un brazo \lambdagt_{11}
para amplificar con PCR, clones de flg 5' contenidos en el
banco de células endoteliales. La segunda reacción de PCR se realiza
con 2 x 10^{6} fagos y los oligonucleótidos
Flg-PE-165non y
GT11-R1. La tercera reacción utiliza 5 \mul de la
reacción precedente como matriz para los iniciadores
oligonucleotídicos Flg-PE-141non y
GT11-R3. El producto de 560 pb de las tercera
reacción se ha hecho con extremidad franca por incubación con la ADN
polimerasa T4 y se ha clonado en el sitio SmaI a la vez con
pGem-1 (Stratagene) y M13mp19 y se ha secuenciado.
El producto de PCR flg 5' en pGem-1 se ha
cortado, radiomarcado mediante iniciadores hexámeros aleatorios
(Feinberg & Vogelstein, Anal. Biochem., 137:266 (1984)),
y se le utiliza para seleccionar de nuevo el banco de ADNc de HUVEC
para obtener un clon de ADNc exento de artefactos potenciales
generados por la PCR. Únicamente se detecta un clon en 2 x 10^{6}
fagos recombinantes seleccionados. Un análisis de secuencia de
nucleótidos de la inserción de ADNc de este clon revela que su
secuencia es idéntica al producto generado por PCR y que está
terminado en el sitio EcoRI compartido por el clon parcial de
flg pC51. Se digiere este ADNc con EcoRI y
SacI que corta a 50 pb en 5' del inicio de traducción ATG, y
se clona el fragmento EcoRI/SacI de 650 pb en
pGem-1 cortado de manera similar. Se construye un
ADNc de flg de longitud completa clonando el inserto de
flg EcoRI 3' de pC51 en el sitio EcoRI de este
clon de flg 5'. Se corta el ADNc de longitud completa con
SmaI/ApaI, se vuelven francas las extremidades con la
ADN polimerasa T4 y se le clona en un sitio EcoRV de pMJ30.
pMJ30 procede de la substitución por un brazo de unión que contiene
un punto de clonación EcoRV de la inserción de aFGF en p267
(Jaye, et al., EMBO, J., 7:963-969
(1988)).
Se selecciona un banco de ADNc de tronco cerebral
humano con una edad de un día en \lambdagt_{11} (Kamholz, et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.,
83:4962-4966 (1986)) con un oligonucleótido
anti-sentido de 33 bases (3'mbek) complementario de
la extremidad 3' de la secuencia parcial que codifica bek
murino (Kornbluth, et al., 1988 supra). Se aíslan
treinta y dos clones positivos de ADNc a partir de una selección de
1,5 x 10^{6} placas recombinantes y se elige el clon mas largo,
\lambdabek5, para un análisis ulterior. Se digiere \lambdabek5
con EcoRI y se subclonan los fragmentos EcoRI de 2,2
kb en 5' y 1,0 kb en 3' separadamente en vectores M13mp19 y
pGem-1 para manipulaciones ulteriores.
Se aíslan clones de ADNc para la extremidad 5' de
bek humano seleccionando el banco de tronco cerebral una
segunda vez con un fragmento de 750 pb de extremidad 5' de
\lambdabek5. Se radiomarca el fragmento por traslación de la
incisión de simple hebra y se le utiliza para seleccionar 1,5 x
10^{6} placas. Se detectan cincuenta y cuatro placas que realizan
una hibridación y una, \lambdabek78, recubre el clon de ADNc de
origen y se extiende 218 pb mas lejos en el sentido 5'.
\newpage
Se dejan crecer células A204 (rabdomiosarcoma
humano), U563 (gliobastoma humano) y NTERA-2 cl.D1
(teratocarcinoma humano) en DMEM con suero fetal de vaca al 10%. Se
dejan crecer células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC)
en el medio 199 que contiene suero fetal de vaca al 10%, 10 U/ml de
heparina (Upjohn) y 5 ng/ml de aFGF recombinante. Se aíslan los ARN
totales de las células NTERA2cl.D1 con la guanidina HCl (Wang,
et al., Dev. Biol. 107:75-86
(1985)) y células A204, HUVEC y U563 con el isotiocianato de
guanidina (Chirgwin, et al., Biochem.
18:5294-89 (1979)). Se cuantifica el ARN por su
absorbancia óptica a 260 nm. Se fraccionan muestras que contienen 4
\mug de ARN totales sobre un gel de agarosa al 1,25%, que contiene
formaldehído, se les transfiere sobre nitrocelulosa y a
continuación se les sonda esencialmente como se ha descrito (Seed,
en: Genetic Engineering, Setlow et al., editores,
volumen 4, páginas 91-102, Plenum Press New York,
1982)) utilizándose sondas generadas por iniciadores hexámeros
aleatorios (Feinberg y Vogelstein, Anal. Biochem. 137:256
(1984)). La sonda flg es un fragmento de 550 pb
ApaI/EcoRI completamente contenido en la región no
codificante en 3'. La sonda bek es un fragmento de 850 pb
Tth111I/EcoRI contenido enteramente en la región no
codificante en 3'.
Este ejemplo ilustra la expresión de flg y
bek de longitud completa en un vector de expresión de
mamífero.
Como se ha mencionado en el ejemplo precedente,
se corta el clon de flg de longitud completa con
SmaI/ApaI. Se vuelven francas sus extremidades con la
ADN polimerasa T4 y se le clona en un sitio EcoRV de
plásmido de expresión pMJ30. Obteniéndose pMJ30 por la substitución
con un brazo de unión de la inserción de aFGF en p267 (Jaye, et
al., EMBO J. 7:963-969 (1988)). De este
modo, pMJ30, que contiene la secuencia flg de longitud
completa, se denomina pflgFL24.
Se prepara el ADNc de bek humano para una
expresión de mamífero amplificando un fragmento de 276 pb de
\lambdaBek78 con los iniciadores oligonucleotí-dicos Bek4A y
Bek1B. Tras digestión con HindIII y BclI, se une el
fragmento 5' de 222 pb al subclon de 2,2 kb de \lambdabek5 al
nivel de un sitio único BclI en la región de recubrimiento. El
fragmento amplificado con PCR añade puntos de restricción y una
secuencia favorable de iniciación de traducción inmediatamente aguas
arriba del codon iniciador presumido ATG. Ulteriormente se inserta
el fragmento 3' EcoRI de ADNc de bek de 1,0 kb. Para
una introducción en células NIH 3T3, se subclona un fragmento de 2,5
kb, que contiene las región completa que codifica bek humano
en pMJ30. Se determina la secuencia de nucleótidos de todos los
clones sobre las dos hebras por detención de la cadena (Sanger,
et al., Ann. N.Y. Acad. Sci.,
51:660-672 (1977)). De este modo, pMJ30, que
contiene una secuencia bek de longitud completa, se denomina
pGC37.
Se dejan crecer células NIH 3T3 en el medio de
Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero de vaca al 10%. Se
transfectan las células NIH 3T3 con coprecipitados al fosfato de
calcio con 1 \mug de pSV2neo o bien 1 \mug de pSV2neo con 20
\mug de vectores de expresión que contiene la secuencia
codificante completa bien del ADNc de flg o bien del ADNc del
bek. Conviene señalar que pSV2neo proporciona simplemente un
marcador que puede ser seleccionado y que se puede utilizar
cualquier otro sistema equivalente de
co-transfección. Se seleccionan clones individuales
en 500 \mug/ml de Geneticina (Gibco) y se les mantiene en un
medio que contiene 200 \mug/ml de Geneticina.
Se insertan separadamente las regiones
codificantes de los ADNc de bek y de flg en un vector
de expresión de mamífero inmediatamente aguas abajo del promotor del
SV40 y del activador de citomegalovirus. Se cotransfectan las
células NIH 3T3 con una mezcla 1:20 de pSV2neo (Southern y Berg,
J. Mol. Appl. Gen., 1:327-341 (1982)) y un
vector de expresión bien de bek o bien de flg y se
seleccionan los transfectantes por crecimiento en presencia de 500
\mug/ml de Geneticina (Gibco). Se seleccionan aproximadamente 50
clones de cada uno al nivel de una sobreexpresión de receptores del
FGF por reticulación con [^{125}I]aFGF. Como control sirven
células NIH 3T3 transfectadas únicamente con pSV2neo. De esta forma
se identifican, a la vez, clones de células transfectadas por
bek y por flg que muestran un enlace acrecentado de
aFGF, lo que indica que bek y flg son ambos
receptores del aFGF. Se elige un clon transfectado con bek,
Nbek8, y un clon transfectado con flg Nflg26, para un
análisis ulterior basado sobre su expresión acrecentada de
receptores del aFGF.
Los productos de traducción de los vectores de
expresión flg y bek se analizan con un marcaje
metabólico de células Nbek8 y Nflg26 con la
[^{35}S]-metionina, preparando extractos
celulares y llevando a cabo la inmunoprecipitación con antisueros
anti-péptido específicos de bek y de
flg.
Se sintetizan péptidos que corresponden a los 15
aminoácidos de extremidad COOH de flg
(Flg-1) o a los 17 aminoácidos de la extremidad COOH
de bek (Bek-1) y se cortan con hemocianina
de patela, utilizando el reactivo de reticulación
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida.
A continuación se inmunizan conejos con estos reactivos emulsionados
en el adyuvante completo de Freund para generar los antisueros
policlonales Anti-Flg-1 y
Anti-Bek-1.
Se lavan células con una confluencia de 90% que
han crecido en cajas de cultivo para tejido de 10 cm (Falcon) con
DME exento de metionina y se incuban durante 6 horas en DME exento
de metionina que contiene suero de vaca al 10% y 100 \muCi/ml de
[^{35}S]-metionina (Amersham). A continuación se
lavan tres veces las células con PBS (Gibco) y se raspan en 0,5 ml
de tampón de lisis (Hepes 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol al
10%, Triton X-100 al 1%, MgCl_{2} 1,5 mM, EDTA 1
mM, aprotinina 1 \mug/ml, leupeptina 1 \mug/ml, fluoruro de
fenilmetilsulfonilo 1 mM) y se incuban durante 15 minutos sobre
hielo. Se centrifugan los lisatos durante 15 minutos en una
centrifugadora de Eppendorf a 4ºC. Se dejan hinchar tres mg de
Sefarosa-proteína A para muestreo y se lavan con
Hepes 20 mM, pH 7,5 y a continuación se mezclan durante 30 minutos,
a temperatura ambiente, con el antisuero anti- péptido de conejo
correspondiente (Anti-Flg-1 y
Anti-Bek-1), seguido por tres
lavados con tampón HNTG (Hepes 2 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton
X-100 al 0,1%, glicerol al 10%). A continuación se
incuban los complejos de Sefarosa-proteína
A/anticuerpos con los lisatos celulares clarificados respectivos
durante 60 minutos en tampón HNTG a 4ºC, se lavan dos veces con
Hepes 50 mM, pH 8,0 NaCl 500 mM, Triton X-100 al
0,2%, y EGTA 5 nM, dos veces con Hepes 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM,
Triton X-100 a 0,1%, EGTA 5 mM y SDS a 0,1% y
finalmente dos veces con Tris-HCl 10 mM pH 8 y
Triton X-100 al 0,1%. Se añade tampón de muestreo
de Laemmli (Laemmli, Nature 227:680-685
(1970)) a los inmunoprecipitados lavados, que se llevan a
continuación a ebullición durante 4 minutos y se separan sobre un
gel de SDS-poliacrilamida (al 7%). Se realizan
autorradiogramas de los geles secados sobre una película Kodak
X-Omat (Eastman Kodak Co., Rochester, NY).
Se someten los inmunoprecipitados a un
SDS-PAGE seguido por una autorradiografía (figura
4). Se inmunoprecipita específicamente una banda de 150 kDa a partir
de células transfectadas por flg con un antisuero
anti-péptido flg (línea 3) mientras que el
antisuero anti-péptido bek inmunoprecipita,
de manera específica, una banda de 135 kDa (línea 7) de células
transfectadas por bek. Una inmunoprecipitación en presencia
del péptido antigénico correspondiente elimina por completo la
precipitación de proteínas específicas flg y bek. Las
secuencias de los citados aminoácidos de flg y bek
predicen proteínas maduras de base de 89 437 y de 89 750 daltons
respectivamente; una glicosilación al nivel de puntos potenciales
en los dominios extracelulares daría formas de pesos moleculares
mayores. Un tratamiento de células NFlg26 y Bek8 con la
tunicamicina con el fin de bloquear una glicosilación, da productos
bek y flg de pesos moleculares reducidos, mas
coherentes con sus dimensiones predichas de proteínas de base
(líneas 4 y 8). Los resultados demuestran que tanto bek como
flg son glicoproteínas. Aún cuando la dimensión mas
importante de flg en comparación con bek sea coherente
con el número de sitios potenciales de glicosilación enlazada con N
(9 con relación a 8), en cada uno, el producto flg aislado de
células tratadas con la tunicamicina, migra mas lentamente que lo
predicho a partir de su secuencia de aminoácidos. La razón de esta
migración mas lenta no es conocida pero probablemente no es debida a
la construcción de flg recombinante, dado que flg de
NFlg26 y células de rabdomiosarcoma A204 tienen pesos moleculares
aparentes idénticos, tanto antes como después de un tratamiento con
la tunicamicina.
No se detecta proteína bek o flg en
inmunoprecipitados de células de control (líneas 1, 2, 5 y 6). En
experimentos previos, se inmunoprecipita la proteína flg
reticulada al FGF a partir de células NIH 3T3 2,2 (Ruta, et
al., 1989 supra), que expresan claramente un flg
endógeno. La imposibilidad de detectar flg en experiencias
de control se debe, principalmente, al pequeño número de células
analizadas y a los cortos tiempos de exposición de autorradiografía
permitidos con la utilización de las líneas celulares que
sobreexpresan bek y flg.
El nivel de base de los receptores endógenos del
factor de crecimiento de los fibroblastos varía de un tipo celular
a otro. Células 3T3 contienen aproximadamente 5-10
000 receptores de este tipo, pero algunos subclones 3T3, tales como
células 3T3 2.2 pueden contener hasta 30 000 receptores por célula.
El término células con "sobreexpresión" tal como se utiliza en
la presente descripción, hace referencia a células que presentan
aproximadamente 50 000 receptores o mas. Una transfección inicial de
células 3T3 con el plásmido divulgado anteriormente da células que
presentan aproximadamente 50 000 receptores/célula. Sin embargo, en
el transcurso del tiempo de cultivo, se pueden seleccionar clones
que presentan unas expresión de 300 000 receptores/célula o por
encima de este valor. Si se transfectan células CHO deficientes en
DHFR y si se les amplifica por una selección al metotrexato, se
extiende hasta que éstas produzcan incluso un millón de receptores
por célula o por encima de este valor.
Se somete a radio yodación aFGF de origen bovino,
purificado como se ha descrito anteriormente (Burgess, et
al., J.Biol. Chem., 260:11 389-11 392
(1985)), bFGF recombinante humano (una aportación del Dr.
Moscatelli) y kFGF recombinante humano (una aportación del Dr.
Claudio Basilico) utilizando el protocolo de Enzymobeads (BioRad).
Se determina la actividad específica del ligando radiomarcado con
una dilución de radioisótopo utilizando el competidor no marcado
respectivo. Las concentraciones en ligando no marcado se determinan
por análisis de aminoácidos (Jaye, et al., 1987
supra). La actividad específica de las diferentes
preparaciones de [^{125}I]aFGF varía entre 130
000-760 000 (impulsos/-minuto)/ng y la actividad
específica de [^{125}I]bFGF varía entre 50
000-500 000 (impulsos/minuto)/ng. La actividad
específica de [^{125}I]kFGF varía entre 50
000-200 000 (impulsos/minuto)/ng.
Se realiza el análisis de enlace como sigue:
Se colocan cajas de 24 pocillos recubiertas con
fibronectina, que contienen 1 x 10^{5} células/pocillo sobre
hielo y se enjuagan los pocillos dos veces con tampón frío de enlace
(DMEM, BSA 1 mg/ml, heparina 5 U/ml, Hepes 50 mM, pH 7,4). Se
incuban las cajas sobre hielo con 1 ml de tampón helado de enlace
durante 20 minutos seguido por 2 horas a 4ºC con diluciones en serie
de [^{125}I]FGF en tampón frío de enlace sin heparina. Se
obtiene el enlace no específico utilizando las mismas diluciones de
serie pero en presencia de un exceso molar de 100 veces de aFGF no
radioactivo. Tras incubación, se colocan las células sobre hielo y
se enjuagan dos veces con tampón helado de enlace, sin heparina, y
a continuación se solubilizan en NaOH 0,3 N 37ºC, 15 minutos. Cuando
se utiliza [^{125}I]bFGF se colocan las células sobre
hielo tras la incubación, se lavan tres veces con PBS, dos veces con
1 ml de NaCl 2 M en Hepes 20 mM, pH 7,5 y dos veces con 1 ml de
NaCl 2 M en acetato de sodio 20 mM, pH 4,0. La radioactividad
liberada por el lavado ácido NaCl 2M representa el enlace específico
con los sitios de alta afinidad (Moscatelli, J. Cell.
Physiol., 131:123-130 (1987).
Se dejan crecer células NFlg26, NBek8 y NNeo4 en
cajas de cultivo de tejido de 60 mm recubiertas con fibronectina
humana. En la confluencia, se lavan las células dos veces con
tampón de enlace (DMEM que contiene BSA al 0,2% y Hepes 20 mM, pH
7,5) y se incuban durante 90 minutos a 4ºC con tampón de enlace que
contiene 25 ng/ml de [^{125}I]aFGF, de
[^{125}I]bFGF o de [^{125}I]kFGF. Tras un lavado,
una vez, con tampón de enlace y, una vez, con PBS, se incuban de
nuevo las células durante 20 minutos a 4ºC con PBS que contiene
suberato de disuccinimidilo 0,3 mM (Pierce) como agente de
reticulación (preparado en forma de una solución de base de 30 mM en
DMSO). A continuación se lavan las células, una vez, con Hepes 10
mM, pH 7,5 glicina 200 mM, EDTA 2 mM, una vez con PBS y a
continuación se raspa en PBS y se recogen por centrifugado en una
centrifugadora de Eppendorf. Se lisan los culotes celulares en 100
\mul de tampón de lisis (Hepes 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton
X-100 al 1%, glicerol al 10%, MgCl_{2} 1,5 mM,
EDTA 1 mM, aprotinina 1 \mug/ml, leupeptina 1 \mug/ml y PMSF 1
mM), se incuban durante 15 minutos sobre hielo y se centrifugan
durante 15 minutos a 4ºC en una centrifugadora de Eppendorf. Se
mezclan volúmenes aproximadamente iguales de los sobrenadantes de
cada muestra con tampón de muestreo de Laemmli (Laemmli,
Nature, 227:680-685 (1970)), se les hierve
durante 4 minutos y se fraccionan sobre gel de
SDS-poliacrilamida al 7%. Los geles se colorean con
azul brillante de Coomassie para verificar que todas las muestras
contienen cantidades aproximadamente iguale de proteínas. Se llevan
a cabo autorradiogramas de los geles secos sobre une película Kodak
X-Omat.
La posibilidad de seleccionar clones al nivel de
una sobreexpresión de bek y de flg mediante una
reticulación de afinidad con [^{125}I]aFGF sugiere que
tanto bek como flg enlazan aFGF con una alta
afinidad. El enlace de [^{125}I]aFGF,
[^{125}I]bFGF y [^{125}I]kFGF se analiza en
paralelo sobre células que sobreexpresan bek y flg.
Tras incubación de las células con [^{125}I]aFGF,
[^{125}I]bFGF o [^{125}I]kFGF, se reticulan
complejos de receptor-FGF de manera covalente con
suberato de disuccinimidilo, se solubilizan, y se someten a un
SDS-PAGE y a una autorradiografía (figura 5). Se ha
reticulado una banda única de 165 kDa a la vez con aFGF y con bFGF
en líneas celulares que sobreexpresan flg (líneas 2 y 5). De
manera similar se ha reticulado única banda de 150 kDa a la vez con
aFGF y con bFGF en líneas celulares que sobreexpresen bek
(líneas 3 y 6). Tras substracción del peso molecular de los ligandos
(aproximadamente 15 kDa), la dimensión de la banda reticulada en
las líneas celulares que sobreexpresan flg y bek (150
y 135 kDa, respectivamente) corresponden exactamente a la dimensión
de las proteína flg y bek inmunoprecipitadas (figura
4). La dimensión aparente, ligeramente mayor de las bandas cuando se
ha reticulado [^{125}I]kFGF (figura 5B), en comparación
con la dimensión cuando se ha reticulado aFGF o bFGF (figura 5A), se
debe a la diferencia de dimensión del kFGF (22 kD) con relación a
aFGF y a bFGF (16 kD). No se ha observado cualquier producto de
reticulación en células de control, lo que la solicitante atribuye
de nuevo al corto tiempo de exposición autorradiográfica permitido
por la intensidad de las señales obtenidas con las líneas celulares
con sobreexpresión.
Se somete a una radioyodación y se purifica sobre
Sefarosa-heparina, FGF ácido y básico como se ha
descrito anteriormente. Se establecen las constantes de disociación
de bek y de flg para aFGF y bFGF mediante un análisis
de enlace a saturación de las líneas celulares con sobreexpresión
con los ligandos yodados. Un enlace tanto de aFGF como de bFGF sobre
bek y flg es específico y saturable (figura 6A,
inserciones). Además, está completamente eliminado un enlace de
[^{125}I] aFGF y [^{125}I]bFGF con saturación en
presencia del exceso molar de 100 veces bien de aFGF o bien de bFGF,
lo que indica que cada ligando sufre una competición eficaz del
otro para un enlace sobre los mismos sitios. Un análisis de
Scatchard (Ann. N. Y. Acad. Sci. 51:660-672
(1949)) de los datos de enlace para una experiencia típica (figura
6A) indica que las células que sobreexpresan flg portan,
aproximadamente, 55 000 receptores por célula con afinidades de 24
pM y 47 pM para aFGF y bFGF, respectivamente. Igualmente, las
células que sobreexpresan bek portan aproximadamente 64 000
receptores por célula con afinidades de 47 pM y de 82 pM para aFGF
y bFGF, respectivamente. El kFGF se enlaza con flg y con
bek con afinidades de 320 y de 80 pM, respectivamente
(figura 6B). El kFGF se enlaza igualmente con bek con una
afinidad similar a la del bFGF pero se enlace con flg con una
afinidad 4 veces menor que la del bFGF. Los datos de experimento
suplementarios dan K_{d} aparentes de aFGF para flg en el
intervalo de 20- 80 pM y para bek en el intervalo de
40-100 pM. Se observa una variación similar de las
K_{D} del enlace de bFGF con flg (50-150
pM) y con bek (90-150 pM) pero en cualquier
experimento bFGF muestra siempre una afinidad aproximadamente dos
veces menor bien para con flg o bien para con bek en
comparación con aFGF. La gama de valores procede probablemente de
las determinaciones de la actividad específica y de la integridad
biológica de las diferentes preparaciones de los ligandos yodados.
Sin embargo, los datos demuestran claramente que bek y
flg enlazan aFGF con elevadas afinidades, similares y enlazan
bFGF con una afinidad aproximadamente 2 veces menor que la de aFGF.
Estas conclusiones están reforzadas por experimentos de competición
(dilución de isótopos) en los cuales se ponen en competición
cantidades crecientes de aFGF o de bFGF no radioactivo para un
enlace de [^{125}I]aFGF y [^{125}I]bFGF sobre
células que sobreexpresan flg y bek.
Las células transformadas, biológicamente activa,
pueden utilizarse para seleccionar compuestos al nivel de su
eficacia para inhibir el enlace de los FGF con sus receptores. Tras
haber establecido los parámetros de una interacción
ligando/-receptor en ausencia de inhibidores potenciales,
constituye un simple trabajo de rutina la preincubación de las
células con una muestra de ensayo que contenga un compuesto a ser
evaluado, añadir FGF marcado y medir la reducción del enlace del
FGF, si es que se produce.
Son posibles análisis alternativos. Por ejemplo,
en lugar de medir directamente un enlace de FGF, se puede analizar
el efecto del FGF (es decir un suceso intracelular). Un suceso de
este tipo es una fosforilación de proteína bien del propio receptor
o bien de otro blanco intracelular tal como la fosfolipasa
C-\gamma. Se puede medir la aparición de una
proteína fosforilada mediante la reactividad de proteínas de este
tipo con un anticuerpo anti-fosfotirosina.
La invención se refiere a líneas celulares útiles
para la evaluación de medicamento, y no a cualquier análisis
particular utilizado. Como se ha mencionado precedentemente, no es
necesario expresar la molécula entera de receptor para proporcionar
un sistema útil de selección. Por ejemplo, se ha descubierto que un
dominio extracelular que presenta una deleción del primer dominio de
Ig y de la "caja ácida" puede incluso enlazar un ligando FGF.
Como se ha mencionado anteriormente, se pueden utilizar células
huésped que expresen el dominio citoplasmático como fuente cómoda de
proteína kinasa para la evaluación de trifostinas candidatas. Para
este fin se ha revelado útil E. coli transformada con un
plásmido que contenga únicamente el dominio citoplasmático. Puesto
que la invención proporciona la secuencia intacta de flg y
bek, constituye una cuestión de rutina para el experto en la
materia producir fragmentos de diferentes dominios con ayuda de
técnicas de PCR o de síntesis peptídica en fase sólida y evaluar
éstos al nivel de su capacidad para enlazar un ligando o para
fosforilar proteínas.
Agentes terapéuticos potenciales comprenden, pero
sin quedar limitados por ello, pequeñas moléculas orgánicas,
fragmentos del propio receptor o anticuerpos que inhiben el enlace
del ligando con el dominio extracelular o que afectan a la actividad
de la proteína kinasa.
Los compuestos que presentan una actividad de
inhibición son potencialmente útiles como agentes terapéuticos para
el tratamiento de estados enfermizos caracterizados por respuestas
celulares indeseables mediadas por el FGF. Entre los estados
enfermizos que se han revelado como caracterizados por respuestas
de este tipo se encuentran el cáncer, específicamente ciertas formas
de cáncer de mama, la soriasis, la artritis, la aterosclerosis y la
hipertrofia prostática benigna.
Los agentes terapéuticos de la invención se
pueden administrar solos o en combinación con vectores
farmacéuticamente aceptables, cuya proporción está determinada por
la solubilidad y la naturaleza química del compuesto, la vía de
administración elegida y la práctica farmacéutica usual. Por
ejemplo, se pueden administrar por vía oral en forma de comprimidos
o de cápsulas que contengan excipientes tales como almidón,
lactosa, ciertos tipos de arcilla y otros. Se pueden administrar por
vía sublingual en forma de tabletas o pastillas en las cuales el
ingrediente activo está mezclado con azúcar o con jarabes de maíz,
agentes aromatizantes y colorantes; a continuación se deshidrata
suficientemente como para hacerle apropiado para una compresión y
una forma sólida. Se pueden administrar por vía oral en forma de
soluciones que pueden contener agentes colorantes y aromatizantes o
pueden ser inyectados por vía parenteral, es decir intramuscular,
intravenosa o subcutánea. Para una administración parenteral, se
pueden utilizar en forma de una solución estéril que contenga otros
solutos, por ejemplo, una cantidad suficiente de sales o de glucosa
como para que la solución sea isotónica.
El médico determinará la dosis de los presentes
agentes terapéuticos que será mas apropiada y que variará según la
vía de administración y el compuesto particular elegido, y además,
variará según el paciente particular sometido al tratamiento. Es
deseable generalmente comenzar el tratamiento con dosis pequeñas
substancialmente menores que la dosis óptima del compuesto y
aumentar la dosis progresivamente hasta la obtención del efecto
óptimo en las circunstancias particulares. Se observará, en
general, que cuando la composición sea administrada por vía oral, se
requerirán cantidades mayores de agente activo para producir el
mismo efecto que una cantidad inferior administrada por vía
parenteral.
Claims (32)
1. Proteína receptora bek humana aislada,
que comprende un dominio citoplasmático, que presenta una actividad
de la proteína kinasa, una inserción de kinasa, un dominio
transmembranal y un dominio extracelular que tiene tres repeticiones
de tipo inmunoglobulina y que tiene la secuencia de aminoácidos
como muestra la figura 2A.
2. Fragmento proteico del receptor según la
reivindicación 1, que no tiene mas que un dominio extracelular y un
dominio transmembranal.
3. Fragmento proteico del receptor según la
reivindicación 1, que no tiene mas que un dominio
citoplasmático.
4. Secuencia de ADN o de ARNm aislada, que
codifica una proteína receptora bek humana, presentando
dicha proteína un dominio citoplásmico, que presenta una actividad
de la proteína kinasa, una inserción de kinasa, un dominio
transmembranal y un dominio extracelular que tiene tres
repeticiones de tipo imunoglobulina, teniendo dicha proteína la
secuencia de aminoácidos como muestra la figura 2A.
5. ADN según la reivindicación 4, que tiene la
secuencia nucleotídica de la figura 8.
6. ADN aislado, que codifica el fragmento de la
reivindicación 2.
7. ADN aislado, que codifica el fragmento de la
reivindicación 3.
8. Vector que comprende el ADN según una
cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.
9. Vector según la reivindicación 8,
caracterizado porque dicho vector es un vector de
expresión.
10. Célula huésped recombinante, transformada por
el vector según una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9.
11. Célula huésped según la reivindicación 10,
caracterizada porque dicha célula huésped es una célula
procariota.
12. Célula huésped según la reivindicación 10,
caracterizada porque dicha célula huésped es una célula
eucariota.
13. Célula huésped según la reivindicación 11,
caracterizada porque dicho huésped es Escherichia,
Bacillus o Streptomyces.
14. Célula huésped según la reivindicación 12,
caracterizada porque el huésped es una célula de levadura o
de vertebrado en cultivo.
15. Célula huésped según la reivindicación 14,
caracterizada porque la célula huésped es una célula de
ratón en cultivo.
16. Composición terapéutica, que comprende el
dominio extracelular de una proteína receptora bek humana
que presenta la secuencia de aminoácido como muestra la figura 2A,
en una cantidad eficaz para inhibir las respuestas celulares
indeseables mediadas por el factor de crecimiento que se enlaza a
la heparina, y un soporte farmacéuticamente aceptable.
17. Composición según la reivindicación 16,
caracterizada porque dicha respuesta indeseable se elige del
grupo constituido por angiogenesis y vascularización de tumores
estimuladas por factores de crecimiento, por efectos mitógenos
durante la soriasis, por artritis, por aterosclerosis, por
hipertrofia prostática benigna.
18. Composición terapéutica que comprende el
dominio extracelular de una proteína receptora bek humana,
que presenta la secuencia de aminoácidos como muestra la figura 2A,
en una cantidad eficaz para inhibir el enlace de un patógeno
oportunista a las células humanas que portan dicha proteína
receptora y un soporte farmacéuticamente aceptable.
19. Composición según la reivindicación 18,
caracterizada porque dicho patógeno es un virus.
20. Composición según la reivindicación 19,
caracterizada porque dicho virus es el virus del herpes
simples.
21. Utilización de un dominio extracelular de una
proteína receptora bek humana que presenta la secuencia de
aminoácidos como muestra la figura 2A, en una cantidad eficaz para
inhibir las respuestas celulares indeseables mediadas por el factor
de crecimiento que se enlaza con la heparina, para la preparación
de una composición terapéutica destinadas al tratamiento de un
paciente afectado por la enfermedad caracterizada por una
respuesta celular indeseable mediada por el factor de crecimiento
que se enlaza con la heparina, caracterizada porque dicha
respuesta indeseable se elige del grupo constituido por
angiogenesis y vascularización de tumores estimuladas por factores
de crecimiento, por efectos mitógenos durante la soriasis, por
artritis, por aterosclerosis y por hipertrofia prostática
benigna.
22. Utilización de un dominio extracelular de una
proteína receptora bek humana, que presenta la secuencia de
aminoácidos como lo muestra la figura 2A, en una cantidad eficaz
para inhibir el enlace de un patógeno oportunista a las células
humanas que portan dicha proteína receptora, para la preparación de
una composición terapéutica destinada al tratamiento de un paciente
afectado por una infección por patógeno oportunista, siendo capaz
dicho patógeno de enlazarse con un receptor del factor de
crecimiento que se enlaza con la heparina.
23. Procedimiento in vitro de selección de
medicamentos que inhiben el enlace del factor de crecimiento de los
fibroblastos a los receptores bek celulares que presentan la
secuencia de aminoácidos como muestra la figura 2A y que comprende
las etapas que consisten en:
- a)
- incubar el medicamento con células huésped susceptibles de sobreexpresar los receptores del factor de crecimiento de los fibroblastos en presencia de un factor de crecimiento de los fibroblastos y
- b)
- medir la capacidad del medicamento para inhibir el enlace del factor de crecimiento de los fibroblastos.
24. Procedimiento según la reivindicación 23,
caracterizado porque dicha capacidad inhibidora se mide por
detención del enlace reducido de FGF marcado por un reactivo
detectable por el análisis.
25. Procedimiento según la reivindicación 24,
caracterizado porque dicho reactivo es un isótopo
radioactivo.
26. Procedimiento según la reivindicación 23,
caracterizado porque dicha capacidad para inhibir se mide
por detección de una disminución de la respuesta intracelular
mediada por FGF.
27. Procedimiento in vitro de selección de
medicamentos que inhiben el enlace de patógenos oportunistas a los
receptores bek celulares, que presentan la secuencia de
aminoácidos como muestra la figura 2A, que comprende las etapas que
consisten en:
- (a)
- incubar el medicamento con células huésped susceptibles de sobreexpresar los receptores bek que presentan la secuencia de aminoácidos como muestra la figura 2A, en presencia de dicho patógeno, y
- (b)
- medir la capacidad del medicamento para inhibir el enlace del patógeno.
28. Procedimiento según la reivindicación 27,
caracterizado porque dicha capacidad inhibidora se mide por
detección del enlace reducido de un patógeno marcado con un
reactivo detectable por el análisis.
29. Procedimiento según la reivindicación 28,
caracterizado porque dicho reactivo es un isótopo
radioactivo.
30. Procedimiento según la reivindicación 27,
caracterizado porque dicha capacidad inhibidora se mide por
detección de una reducción del poder infeccioso del patógeno.
31. Procedimiento según la reivindicación 27,
caracterizado porque dicho patógeno es un virus.
32. Procedimiento según la reivindicación 31,
caracterizado porque dicho virus es el virus del herpes
simplex.
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