ES2204886T3 - Receptores de factor de crecimiento fibroblastico. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA LA CLONACION COMPLETA DE CADN DE DOS GENES HUMANOS PREVIAMENTE DESIGNADOS FLG Y BEK. ESTOS GENES CODIFICAN DOS RECEPTORES DE SUPERFICIES SIMILARES PERO DISTINTOS COMPUESTOS DE UN DOMINIO EXTRACELULAR CON TRES REGIONES TIPO INMUNOGLOBULINA, UNA DOMINIO DE TRANSMEMBRANA SENCILLO Y UNA PORCION CITOPLASMICA QUE CONTIENE UN DOMINIO DE QUINASA DE TIROSINA CON UNA INSERCION DE QUINASA TIPICA. LA EXPRESION DE ESTOS DOS CADN EN LAS CELULAS DE NIH-3T3 TRANSFECTADAS LLEVA A LA BIOSINTESIS DE PROTEINAS DE 150 KDA Y 135 KDA PARA FLG Y BEK RESPECTIVAMENTE. LOS EXPERIMENTOS DE ENLACE DIRECTO CON INHIBICION DEL ENLACE ENTRE FGF (AFGF) ACIDICO RADIOETIQUETADO, FGF (BFGF) BASICO O KFGF Y LOS FACTORES DE CRECIMIENTO NATIVOS Y LOS ANALISIS DE SCATACHARD DE LOS DATOS DE ENLACE INDICARON QUE BEK Y FLG SE ENLAZAN A AFGF, BFGF O KFGF CON UNAS CONSTANTES DE DISOCIACION DE (2-15) X 1011M. LA GRAN AFINIDAD AL ENLACE DE LOS TRES FACTORES DE CRECIMIENTO DISTINTOS A CADA UNO DE LOS DOS RECEPTORES DIFERENTESREPRESENTA UNA DOBLE REDUNDANCIA UNICA SIN PRECEDENTES ENTRE LAS INTERACCIONES DEL RECEPTOR/FACTOR DE CRECIMIENTO DE POLIPEPTIDOS. SE PRESENTA EL USO DE CELULAS HUESPED TRANSFORMADAS QUE EXPRESAN EXCESIVAMENTE A FLG O A BEK O LOS FRAGMENTOS BIOLOGICAMENTE ACTIVOS DE LAS MISMAS PARA LA SELECCION DE MEDICAMENTOS.

Description

Receptores de factor de crecimiento fibroblástico.

Campo de la invención

La invención se refiere a una clase única de receptores de factor de crecimiento de fibroblastos, a ácidos nucleicos que los codifican y a la expresión de los receptores de factor de crecimiento en sistemas recombinantes. La invención se refiere, igualmente, a la utilización de los receptores expresados o a fragmentos de los mismos en selecciones de medicamentos candidatos, que actúan como antagonistas de los receptores.

Descripción de la técnica anterior

La familia del factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF) comprende siete proteínas emparentadas que enlazan la heparina, que comprenden el FGF ácido (aFGF), el FGF básico (bFGF), int-2, hst/kFGF, FGF-5, FGF-6 y KGF. Los miembros de la familia de los FGF comparten una identidad de secuencia de aminoácidos de aproximadamente 30-55%, una estructura genética similar y pueden transformar células en cultivo cuando son sobre expresadas en células transfectantes. Los FGF prototípicos aFGF y bFGF son los primeros que han sido purificados, secuenciados y clonados. Estos son mitógenos, in vitro para una variedad de células de origen mesenquimatoso y neuroectodérmico. In vivo, los FGF pueden inducir la formación del mesoderma en embriones de Xenopus en desarrollo y que tienen una actividad angiógena potente (citada en la recopilación de Burgess et Maciag, Ann, Rev. Biochem. 58:575-606 (1989)).

La respuesta de las células a los FGF está mediatizada por un enlace sobre una activación de receptores específicos de superficie celular que tienen una actividad intrínseca de tirosina kinasa. Los receptores son proteínas, frecuentemente glicosiladas que sirven como componentes integrantes de las membranas celulares. De manera típica, los receptores tienen un campo extracelular situado en la superficie celular, que puede realizar una interacción específica con substancias conocidas como ligandos. Los factores de crecimiento de los fibroblastos son ejemplos de ligandos. Como consecuencia de la unión del ligando con el dominio extracelular, es activada una segunda región del receptor, situada sobre la superficie intracelular de la membrana (es decir, el dominio citoplásmico) para permitir una reacción con otras moléculas intracelulares. El dominio citoplasmático comprende una región catalítica, que es una región que tiene una actividad enzimática. Haciendo referencia en particular al receptor del factor de crecimiento de los fibroblastos, descrito en la presente memoria, el dominio catalítico es una tirosina proteica kinasa. El substrato de esta kinasa puede ser el propio receptor (es decir una autofosforilación) u otras proteínas intracelulares, tales como la fosfolipasa C-\gamma. El dominio de kinasa de ciertos receptores puede estar interrumpido por una inserción de hasta 100 residuos de aminoácidos, hidrofilazos en su mayor parte. Esta inserción puede actuar para modular la interacción del receptor con ciertos substratos celulares y proteínas efectoras. El dominio citoplásmico se termina en una región de cola en la extremidad COOH. Esta secuencia es la mas divergente entre todos los RTK conocidos. Se han cartografiado varios puntos de autofosforilación en esta región y la región puede actuar ejerciendo un control negativo sobre la función de señal con kinasa. La región catalítica está separada de la membrana propiamente dicha por un dominio próximo a la membrana. La presente observación favorece la idea de que esta región está implicada en la modulación de la función del receptor por estímulos heterólogos, un proceso que se conoce como una transmodulación del receptor. Uniendo los dominios extracelulares y citoplasmáticos se encuentra una región que atraviesa la membrana apropiada conocida como el dominio transmembranal. Se piensa que la interacción del ligando activa el dominio citoplasmático induciendo un cambio de la conformación como para una agregación o para otros mecanismos. De este modo, un receptor actúa como transductor molecular, traduciendo un suceso extracelular, (unión con un ligando) y en una respuesta intracelular (actividad enzimática citoplasmática).

Como se ha mencionado anteriormente, la substancia que es enlazada por el receptor es conocida como el ligando; un término que tiene una significación por definición únicamente con referencia a su equivalente, el receptor. Igualmente, el término "ligando" no implica ninguna dimensión particular de molécula, ninguna particularidad estructural o de composición diferente de que la substancia puede enlazarse o interactuar de otro modo con el receptor de una manera tal que el receptor transmita la información sobre la presencia del ligando a una molécula intracelular diana. Una definición funcional de este tipo excluye, necesariamente, substancias que pueden enlazarse con un dominio extracelular pero no pueden actuar sobre la activación del receptor. En resumen, todas las substancias que puedan enlazarse con los receptores no son ligandos, pero todos los ligandos pueden enlazarse con un receptor.

Como se ha mencionado anteriormente, se han identificado receptores que tienen una actividad biológica que puede evaluarse en función de una interacción con un ligando. Generalmente, la actividad es enzimática y está localizada en el dominio citoplasmático. Un grupo de receptores adecuado para la invención tiene una actividad intrínseca de tirosina proteica kinasa (PTK).

La figura 1 presenta una representación esquemática de varios receptores conocidos del factor de crecimiento que presentan una actividad de PTK. Los receptores del factor de crecimiento presentan una actividad de PTK, o los receptores de tirosina kinasa (RTK), tienen una topología molecular similar. Todos ellos tienen un dominio extracelular importante glicosilado de enlace del ligando, una única región transmembranal hidrófoba y un dominio citoplasmático que contiene un dominio catalítico de PTK. Debido a su configuración, los RTK pueden considerarse como enzimas alostéricas asociadas con una membrana. En contra de lo que ocurre en el caso de los enzimas alostéricos solubles en agua, la topología de los RTK impone que el dominio de enlace del ligando y la actividad de PTK estén separados por la membrana plasmática. Como consecuencia, la activación del receptor debida a un enlace de un ligando extracelular, debe traducirse a través de la barrera membranal en una actividad de funciones del dominio intracelular.

Sobre la base de una similitud entre la secuencia y las características estructurales distintas, se pueden clasificar estos receptores en subclases (figura 1). Las particularidades estructurales características de las cuatro subclases comprenden dos secuencias de repetición ricas en cisteína, en el dominio extracelular de los receptores monómeros de subclase I, estructuras heterotetrámeras \alpha_{2}\beta_{2} enlazadas por disulfuro con secuencias similares ricas en cisteína en los RTK de subclase II, y cinco o tres repeticiones de tipo inmunoglobulina en los dominios extracelulares de los RTK de las subclases III y IV, respectivamente. El dominio de tirosina kinasa de las dos últimas subclases está interrumpido por secuencias hidrófilas de inserción de longitud diferente. La disponibilidad de clones de ADNc de RKT ha hecho posible el inicio de análisis detallados de estructura/función de los mecanismos de acción de las membranas de las familias de RTK. (Citadas en la recopilación de Ullrich y Schlessinger, Cell 61:203-221 (1990)). Los pasajes y ejemplos correspondientes flg están destinados a fines ilustrativos únicamente.

La invención se basa en el descubrimiento de un clon parcial de ADNc humano de un gen de tipo fms (flg : fms-like gene) que codifica una tirosina proteica kinasa, cuyo dominio de kinasa está interrumpido al nivel de una posición similar a las inserciones de kinasa de los receptores de tirosinas kinasa CSF-1 y PDGF (Ruta et al., Oncogene, 3:9-15 (1988)). Ulteriormente, han sido aislados ADNc de longitud completa de flg de pollo por clonación con sondas oligonucleotídicas específicas de flg (Lee et al., Science, 245:57-60 (1989)) y con anticuerpos antifosfotirosina (Pasquale et Singer, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 86:5449-5453 (1989)). Flg es un receptor de PGF sobre la base de cuatro criterios: 1) el receptor purificado de un extracto de embrión de pollo por transferencia de afinidad sobre bFGF inmovilizado es el producto del gen flg de pollo, 2) un antisuero anti-péptido flg inmunoprecipita [^{125}I]aFGF reticulado sobre proteínas de 130 y 150 kDa en células de rapto microsarcoma A204, 3) un antisuero anti-peptídico flg inmunoprecipita proteínas de tamaño similar que están específicamente fosforiladas sobre tirosina durante un tratamiento de células vivas con aFGF o con bFGF, y 4) proteínas de 130 y 150 kDa inmunoprecipitadas con antisuero anti-péptido flg a partir de lisados de células tratadas con aFGF sufren una fosforilación sobre tirosina in vitro.

Un segundo receptor supuesto del FGF es el producto del gen murina de kinasa expresado por una bacteria (bek : bacterially expressed kinase), se obtiene un clon parcial por selección de un banco de expresión de ADNc de hígado de ratón con anticuerpos anti-fosfotirosina (Kornbluth et al., Mol. Cell. Biol. 8:5541-5544 (1988)). Las secuencias de los citados aminoácidos del clon parcial de bek y la región correspondiente de flg son idénticas en un 85%. Sin embargo, no se sabe claramente si bek representa el homólogo murina del gen flg humano u otro gen emparentado de manera estrecha. La invención proporciona clones de ADNc de longitud completa por bek y flg, ambos humanos, sus secuencias completas, deducidas, de aminoácidos y demuestra en células transfectadas, que ambos bek y flg enlazan específicamente aFGF, bFGF y k-FGF y con una afinidad elevada.

La función de receptor focaliza cada vez mas las tentativas de concepción racional de los medicamentos. Moléculas que afectan un enlace de receptor-ligando, una activación de receptor y/o una interacción con la diana intracelular del receptor son todas ellas candidatas potenciales para agentes terapéuticos. Una selección a gran escala está limitada por los procedimientos clásicos en los cuales los medicamentos candidatos son evaluados sobre células aisladas o en explantes de tejido. Las muestras de tejido o las células aisladas, que contienen los receptores diana, son de obtención costosa, están presentes en cantidad limitada y son difíciles de mantener en un estado funcionalmente viable. Además, frecuentemente es difícil administrar de manera fiable y reproducible el medicamento candidato a las muestras de tejido. Se han realizado análisis de selección que utilizan explantes primarios en cultivo de tejido a una escala mayor que la que es posible con muestras de tejido. Sin embargo, es mas difícil de analizar un efecto fisiológico y los análisis están sometidos a interferencias procedentes de numerosas fuentes, por ejemplo el medio de cultivo o las condiciones de cultivo. Finalmente, los análisis que utilizan receptores aislados de materiales naturales presentan el inconveniente de que el receptor está sometido a una variabilidad natural y que las fuentes naturales apropiadas pueden no estar siempre disponibles. El objeto de la presente descripción consiste en proporcionar moléculas de receptores en una forma adaptable a protocolos de selección a gran escala.

Resumen de la invención

La invención proporciona una proteína receptora o fragmentos de la misma, en forma aislada, que comprende un dominio citoplasmático con una actividad de proteína kinasa, una inserción de kinasa, un dominio transmembranal y un dominio extracelular que presentan tres repeticiones de tipo inmunoglobulina y equivalentes biológicamente activos de esta.

Otro aspecto de la invención consiste en una secuencia aislada de ADN, que codifica proteína receptora o fragmentos de la misma, comprendiendo dicha proteína un dominio citoplasmático, que presenta una actividad de la proteína kinasa, una inserción de kinasa, un único dominio transmembranal y un dominio extracelular, que tiene tres repeticiones de tipo inmunoglobulina y equivalentes biológicamente activos de la misma.

Otro aspecto de la invención es un vector que comprende un ADNc que codifica una proteína receptora, comprendiendo dicha proteína un dominio citoplasmático, que presenta una actividad de la proteína kinasa, una inserción de kinasa, un único dominio transmembranal y un dominio extracelular, que tiene tres repeticiones de tipo inmunoglobulina.

Otro aspecto de la invención es una célula huésped transformada por el vector descrito anteriormente.

Otro aspecto de la invención es una composición terapéutica, que comprende el dominio extracelular o un fragmento de este de una proteína receptora humana, que comprende un dominio citoplasmático, que presenta una actividad de la proteína kinasa, una inserción de kinasa, un único dominio transmembranal y un dominio extracelular, que tiene tres repeticiones de tipo inmunoglobulina y una cantidad eficaz para inhibir respuestas celulares indeseables por mediación del factor del crecimiento que se une con la heparina y un vector farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención es una composición terapéutica, que comprende el dominio extracelular o un fragmento de este de una proteína receptora humana, que comprende un dominio citoplasmático, que presenta una actividad de la proteína kinasa, una inserción de kinasa, un único dominio transmembranal y un dominio extracelular, que tiene tres repeticiones de tipo inmunoglobulina y una cantidad eficaz para inhibir el enlace de un patógeno oportunista sobre células humanas que portan dicha proteína receptora y un vector farmacéuticamente aceptable.

Otro aspecto de la invención es un procedimiento para el tratamiento de un paciente que sufre una enfermedad caracterizada por una respuesta celular indeseable por intermedio del factor de crecimiento que se une con la heparina que comprende la administración a un paciente de este tipo de una cantidad eficaz de la composición según la reivindicación 16.

Otro aspecto de la invención consiste en un procedimiento para el tratamiento de un paciente que sufre una infección de un patógeno oportunista, pudiéndose enlazar dicho patógeno con un receptor del factor de crecimiento que se une con la heparina, que comprende la administración a un paciente de este tipo de una cantidad eficaz de la composición según la reivindicación 18.

Otro aspecto de la invención consiste en un procedimiento para la selección de medicamentos que inhiben una unión del factor de crecimiento de los fibroblastos sobre receptores celulares, que comprende las etapas que consisten en:

(a)

incubar el medicamento con células huésped que pueden sobreexpresar receptores del factor de crecimiento de los fibroblastos en presencia de un factor de crecimiento de los fibroblastos y

(b)

medir la capacidad del medicamento para inhibir la unión del factor de crecimiento de los fibroblastos.

Un aspecto final de la invención consiste en un procedimiento para la selección de medicamentos que inhiben la unión de patógenos oportunistas sobre receptores del factor de crecimiento de los fibroblastos, que comprende las etapas que consisten en:

(a)

incubar el medicamento con células huésped, que puede sobreexpresar receptores del factor de crecimiento de los fibroblastos en presencia de dicho patógeno y

(b)

medir la capacidad del medicamento para inhibir una unión del patógeno.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 presenta una representación esquemática de las subclases de receptor de tirosina kinasa.

La figura 2 ilustra los esquemas de aminoácidos y las similitudes estructurales entre flg y bek humanos.

A) Se han representado las secuencias de aminoácidos de los flg y bek humanos tal como se han deducido de los clones de ADNc. Únicamente se muestran los residuos de la secuencia bek que difieren de los de flg. Los sobrelineados en trazo continuo subrayan los péptidos señal presumidos y las secuencias transmembranales mientras que los sobrelineados en trazos discontinuos señalan la región de inserción de kinasa. Un punto lleno está colocado sobre residuos cisteína conservados, que definen dominios de tipo Ig. Los triángulos invertidos están colocados sobre los puntos potenciales de glicosilación relacionada con Asn. Los paréntesis abiertos rodean la "caja ácida" y las flechas opuestas delimitan el dominio de tirosina kinasa.

B) Se ha ilustrado el grado de identidad de los aminoácidos entre las diferentes regiones de las proteínas flg y bek humanas. Las cajas negras llenas representan el dominio citoplasmático cortado de kinasa y los bucles representan los dominios extracelulares de tipo Ig. Las secuencias de nucleótidos han sido sometidos al banco de datos EMBL. Los ADNc de bek y flg humanos han recibido, respectivamente, los números de registro X52 6832 y X52 833.

La figura 3 ilustra una transferencia de Northern que pone de manifiesto la expresión de ARNmflg y bek.

Se someten cuatro \mug de ARN totales, procedentes de diferentes líneas celulares, a un análisis de Northern para la expresión de flg (panel A) o para la expresión de bek (panel B). Se muestra una ilustración de un autorradiograma de los cromatogramas obtenidos. Los ARN proceden de las líneas celulares: de raptomiosarcoma A204 (línea 1); de glioblastoma U563 (línea 2); de HUVEC (línea 3), de teratocarcinoma NTERA-2 (línea 4).

La figura 4 ilustra el marcaje metabólico de líneas celulares que sobreexpresan flg y bek con la [^{35}S]-metionina.

Se marcan células de NFlg26, NBek8 y NNeo 4 de control con [^{35}S]-metionina en presencia de (líneas 2, 4, 6, 8) o en ausencia de (líneas 1, 3, 5, 7) tunicamicina como se ha descrito en el ejemplo 2. Se inmunoprecipitan los lisados celulares con el anti-flg-1 (líneas 1-4) o con el anti-bek-1 (líneas 5-8) y se les somete a un SDS-PAGE y una autorradiografía. Se presenta una ilustración del autorradiograma obtenido. Los lisados proceden de: células de control Neo 4 (líneas 1, 2, 5, 6), células Flg 26 (líneas 3, 4); células Bek 8 (líneas 7, 8). Se han indicado las posiciones de los patrones de peso molecular. Una inmunoprecipitación en presencia de péptido antigénico correspondiente elimina por completo la precipitación de las proteínas específicas flg y bek (dados no representados).

La figura 5 ilustra la reticulación de [^{125}I]FGF sobre células que sobreexpresan flg y bek.

B) Se reticula [^{125}I]aFGF (líneas 1-3) y [^{125}I]bFGF (líneas 4-6) de manera covalente sobre monocapas de células de control NFlg26 (líneas 3, 6), Nbek8 (líneas 3, 6) y Nneo 4 (líneas 1, 4) como se ha descrito en el ejemplo 3. A continuación se lisan las células, se les somete a un SDS-PAGE y se expone el gel en una película de rayos X. Se presenta una ilustración del autorradiograma obtenido.

B) Se reticula [^{125}I]aFGF (líneas 1-3) y [^{125}I]kFGF (líneas 4-6) de manera covalente sobre monocapas de células NNeo 4 (líneas 1, 4), NFlg26 (líneas 2, 5) y NBek13 (líneas 3, 6) y se les analiza como en la figura 5A.

La figura 6 ilustra un análisis de Scatchard de un enlace de FGF sobre líneas celulares que sobreexpresan flg y bek.

B) Se realiza un análisis de enlace con saturación de [^{125}I]aFGF (-- --y) de [^{125}I]bFGF (o- - -o) sobre células flg26 (panel A) y bek8 (panel B) como se ha descrito en el ejemplo 3. El conteo del ruido de fondo en presencia de un exceso molar de 100 veces uno u otro de los ligandos son siempre menores que el 10% de los impulsos/minuto totales en cada punto. La escala sobre el análisis de Scatchard es idéntica en cada panel.

B) Análisis de enlace de saturación de [^{125}I]kFGF sobre flg26 (panel A) y bek13 (panel B). Análisis como en la figura 6A.

La figura 7 ilustra la secuencia completa de nucleótidos y de aminoácidos de flg.

La figura 8 ilustra la secuencia completa de nucleótidos y de aminoácidos de bek.

Descripción detallada de la invención

Tal como se han utilizado en la presente descripción, los términos siguientes tienen los significados siguientes:

Nucleótido - - Unidad monómera de ADN o de ARN que comprende una parte de azúcar (pentosa), un fosfato, y una base heterocíclica nitrogenada. La base está enlazada con la parte azúcar a través del carbono glicosídico (carbono 1' de la pentosa) y la combinación de la base y del azúcar se denomina un nucleósido. La base caracteriza el nucleósido. Las cuatro bases del ADN son la adenina ("A"), la guanina ("G"), la citosina ("C"), y la timina ("T"). Las cuatro bases de ARN son A, G, C y el uracilo ("U").

Secuencia de ADN - - Disposición lineal de nucleótidos enlazados entre sí por enlaces fosfodiéster entre los carbonos 3' y 5' de pentosas adyacentes. El ADN heterólogo es un ADN que puede ser introducido en un organismo huésped a partir de una fuente que no cambia normalmente el ADN con este huésped, por ejemplo, un ADN humano utilizado para transformar E. coli.

Codon - - Secuencia de ADN de tres nucleótidos (un triplete) que codifica a través de un ARNm, un aminoácido, una señal de inicio de traducción o una señal de detención de traducción. Por ejemplo los tripletes de nucleótidos de ADN TTA, TTG, CTT, CTC, CTA y CTG codifican el aminoácido leucina ("Leu"), TAG, TAA y TGA son señales de detención de la traducción y ATG es una señal de inicio de traducción.

Cuadro de lecturas - - Grupo de codones durante la traducción del ARNm en secuencias de aminoácidos. Durante la traducción, el cuadro de lectura apropiado debe ser mantenido. Por ejemplo, la secuencia de ADN GCTGGTTGTAAG puede expresarse teóricamente en tres cuadros o fases de lectura, que dan, respectivamente, una secuencia diferente de aminoácidos:

GCT GGT TGT AAG - - Ala-Gly-Cys-Lys

G CTG GTT GTA AG - - Leu-Val-Val

GC TGG TTG TAA G - - Trp-Leu-(STOP).

Sin embargo, únicamente los cuadros de lectura anteriores codifican la información genética correcta. La señal de inicio de traducción es reconocida por el ribosoma y por los factores de inicio accesorios para fijar el cuadro de lectura correcto.

Polipéptido - - Disposición lineal de aminoácidos enlazados entre sí a través de enlaces peptídicos en los agrupamientos \alpha-aminados y carboxi de aminoácidos adyacentes.

Genoma - - ADN entero de una célula o de un virus. Este comprende, entre otras cosas, los genes estructurales que codifican polipéptidos individuales así como secuencias de regulación, como secuencias de operador, de promotor y de enlace y de interacción con el ribosoma, principalmente secuencias tales como las secuencias de Shine-Dalgarno.

Gen estructural - - Secuencia de ADN que codifica su matriz o su ARN mensajero ("ARNm") para una secuencia de aminoácidos característica de un polipéptido específico. Los genes estructurales pueden tener tanto ARN como producto primario como ARN de transferencia (ARNt) o ARN ribosómicos (ARNr).

Transcripción - - Proceso de producción de un ARN a partir de un gen estructural.

Traducción - - Proceso de producción de un polipéptido a partir de un ARNm.

Expresión - - Proceso sufrido por un gen estructural para producir un producto. En el caso de un producto proteico, consiste en una combinación de una transcripción y de una traducción.

Plásmido - - Secuencia de ADN de doble hebra no cromosómica que comprende un "replicón" intacto de modo que el plásmido es replicado en una célula huésped. Cuando el plásmido está colocado en un organismo unicelular, las características de este organismo pueden ser modificadas o transformadas como resultado del ADN del plásmido. Por ejemplo, un plásmido que porte el gen de resistencia a la tetraciclina (Tet^{R}) transforma una célula, anteriormente sensible a la tetraciclina, en una célula que es resistente a la misma. Una célula transformada por un plásmido se denomina un "transformante".

Fago o bacteriófago - - Virus bacterianos, muchos de los cuales comprenden secuencias de ADN encapsuladas en una cubierta o vaina proteica ("cápside").

Vehículo de clonación - - Plásmido, ADN de fago u otra secuencia de ADN que puede replicarse en una célula huésped, caracterizada por un punto o por un pequeño número de puntos de reconocimiento de endonucleasa, al nivel de los cuales pueden cortarse secuencias de ADN de este tipo de una manera que puede ser determinada para la inserción de un ADN heterólogo sin pérdida concomitante de una función biológica esencial del ADN, por ejemplo, la replicación, la producción de proteínas de la cubierta o una pérdida de regiones de control de la expresión tales como promotores o puntos de enlace, y que contiene un marcador genético que puede seleccionarse de manera apropiada para una utilización en la identificación de células transformadas, por ejemplo, una resistencia a la tetraciclina o una resistencia a la ampicilina. Un vehículo de clonación se denomina frecuentemente un vector.

Clonación - - Procedimiento para la obtención de una población de organismos o de secuencias de ADN procedente de un organismo o de una secuencia de este tipo mediante una reproducción asexuada o una replicación de ADN.

Replicón - - ADN requerido para una replicación en un organismo particular, que comprende un origen de replicación.

Molécula de ADN recombinante - - Molécula que comprende segmentos de ADN de diferentes genomas unidos de extremidad a extremidad y que tienen la capacidad de infectar ciertas células huésped y de mantenerse en las mismas.

Secuencia de control de expresión - - Secuencia de nucleótidos, que controla y que regula la expresión de genes estructurales cuando éstos están enlazados de manera funcional con estos genes. Estos comprenden el sistema lac, regiones mayores de operador y de promotor del fago lambda, la región de control de las proteínas de cubierta vírica y otras secuencias conocidas por controlar la expresión de genes de células procariotas o eucariotas y sus virus.

Mutación - - Cambio hereditario de la información genética de un organismo.

Mutante - - Organismo que presenta una mutación. Generalmente expresa un fenotipo que puede ser discernido por comparación con una cepa patrón de referencia de la especie a la que pertenece el organismo o de una población de tipo silvestre de este organismo.

Tal como se utiliza en la presente descripción, bek y flg designan receptores del factor de crecimiento de los fibroblastos o sus fragmentos producidos por sistemas de cultivo celulares o exentos de células, bajo formas reactivas que tienen una capacidad de influenciar un crecimiento celular, una diferenciación y una respuesta in vitro como lo hacen los bek y flg nativos.

En la naturaleza pueden existir diferentes alelos de bek y de flg. Estas variaciones pueden caracterizarse por diferencias al nivel de la secuencia de nucleótidos del gen estructural que codifica proteínas defunción biológica idéntica. Es posible producir análogos que presenten substituciones, deleciones, adiciones o reemplazamientos únicos o múltiples de aminoácidos.

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Las abreviaturas de aminoácidos con una y con tres letras, utilizadas en la presente descripción, tienen los siguientes significados:

A	Ala	Alanina
C	Cys	Cisteína
D	Asp	Ácido aspártico
E	Glu	Ácido glutámico
F	Phe	Fenilalanina
G	Gly	Glicina
H	His	Histidina
I	Ile	Isoleucina
K	Lys	Lisina
L	Leu	Leucina
M	Met	Metionina
N	Asn	Asparagina
P	Pro	Prolina
Q	Gln	Glutamina
R	Arg	Arginina
S	Ser	Serina
T	Thr	Treonina
V	Val	Valina
W	Trp	Triptofano
Y	Tyr	Tirosina
B	Asx	Asp o Asn, sin distinción
Z	Glx	Glu o Gln, sin distinción
X	X	Aminoácido no determinado o atípico.

Para facilitar la explicación, la invención puede considerarse como que presenta tres formas de realización distintas pero en correlación. Una primera forma de realización implica la clonación y la identificación de ADNc de longitud completa que codifica la proteína receptora humana bek. Una segunda forma de realización comprende la expresión de los productos del gen humano bek en células huésped recombinantes y, una tercera forma de realización comprende la utilización de los productos obtenidos por vía recombinante para, además, un análisis del receptor bek y una selección de medicamento.

Clonación de flg y de bek humanos

En general, se conocen las técnicas de ingeniería genética. (Véase: Methods in Enzymology, (Academia Press, New York, volúmenes 65 y 68 (1979); 100 y 101 (1983)) y las referencias citadas en la misma. Puede encontrarse un estudio técnico en profundidad, que presenta formas de realización en metodología de ingeniería genética mas comúnmente utilizadas, en Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) y en Current Protocols in Molecular Biology, volúmenes I y II, Ausubel, et al., editores Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, (1987).

Pueden clonarse genes que codifican diferentes polipéptidos incorporando un fragmento de ADN que codifica el polipéptido en un vehículo de ADN recombinante, por ejemplo, vectores bacterianos o víricos, y transformando un huésped apropiado. Este huésped es, de manera típica, una cepa de Escherichia coli (E. coli), sin embargo, según el producto deseado, pueden utilizarse huéspedes eucariotas. Se aíslan los clones que incorporan los vectores recombinantes y se les puede hacer crecer y pueden ser utilizados para producir los polipéptidos deseados a gran escala.

Varios grupos de investigadores han aislado mezclas de ARN mensajero (ARNm) a partir de células eucariotas y han utilizado una serie de reacciones enzimáticas para sintetizar copias de ADN de doble hebra, que son complementarios de esta mezcla de ARNm. (Wewer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83:7137-7141 (1986)). En la primera reacción, se transcribe el ARNm en un ADN complementario de hebra simple (ADNc) por una ADN polimerasa, dirigida por un ARN, igualmente denominada transcriptasa inversa. Una transcriptasa inversa sintetizada un ADN en el sentido 5'-3', utiliza desoxirribo-nucleósidos 5'-trifosfatos como precursores, y requiere a la vez, una matriz y una hebra de inicio, debiendo tener esta última una extremidad 3-hidroxilo libre. Los productos de transcriptasa inversa, independientemente de que sean copias parciales o completas de la matriz de ARNm, presentan, frecuentemente, horquillas de cabello parcialmente de doble hebra ("bucles") al nivel de su actividad III. En la segunda reacción, estos "bucles en forma de horquilla de cabello" pueden utilizarse como puntos de inicio para ADN polimerasas. El ADN preformado es requerido, a la vez, como matraz y como iniciador durante la reacción de la ADN polimerasa. La ADN polimerasa requiere la presencia de una hebra de ADN que presente un agrupamiento 3'-hidroxilo libre, con el que se unen los nuevos nucleótidos para extender la cadena en el sentido 5'-3'. Los productos de reacción secuenciales de este tipo de transcriptasa inversa y de ADN polimerasa, presentan también un bucle en una extremidad. El vértice del bucle o "punto de repliegue" del ADN de doble hebra, creado de este modo, es substancialmente un segmento de hebra simple. En la tercera reacción, este segmento de hebra simple es cortado por la nucleasa S1 específica de una hebra simple para generar un segmento de ADN de hebra doble en la "extremidad franca". Este procedimiento general puede ser aplicado a cualquier mezcla de ARNm y ha sido descrito por Buell, et al., J. Biol. Chem., 253:2483 (1978).

La mezcla de ADNc de doble hebra obtenida (ADNc-db) se inserta en vehículos de clonación por medio de cualquiera de la numerosas técnicas conocidas, que depende al menos en parte del vehículo particular utilizado. Se examinan con gran detalle diversos procedimientos de inserción en Methods In Enzymology, 68:16-18 (1980), y las referencias citadas en el mismo.

Una vez que los segmentos de ADN han sido insertados, se utiliza el vehículo de clonación para transformar un huésped apropiado. Estos vehículos de clonación confieren, habitualmente, la característica de resistencia a un antibiótico al huésped. Los huéspedes de este tipo son, generalmente, células procariotas. En ese momento, únicamente algunos de los huéspedes transformados o transfectados contienen el ADNc deseado. La suma de todos los huéspedes transformados o transfectados, constituye un "banco" de genes. El banco global de ADNc-db creado mediante este procedimiento proporciona una muestra representativa de la información codificante presente en la mezcla de ARNm utilizada como material de partida.

Si está disponible una secuencia oligonucleotídica apropiada, puede ser utilizada para identificar clones de interés de la manera siguiente. Se hacen crecer células individuales transformadas o transfectadas en forma de colonias sobre un papel de filtro de nitrocelulosa. Estas colonias son lisadas; el ADN liberado se enlaza de manera estrecha con papel de filtro por calentamiento. A continuación se incuba el papel de filtro con una sonda oligonucleotídica marcada, que es complementaria del gen estructural de interés. La sonda realiza una hibridación con el ADNc con el que es complementaria y, se identifica por autorradiografía. Los clones correspondientes se caracterizan para identificar un clon o una combinación de clones que contenga toda la información estructural de la proteína deseada. La secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína de interés se aísla y se reinserta en un vector de expresión. El vector de expresión porta el gen clonado bajo un control de regulación de los elementos específicos de control procariota o eucariota que permiten la expresión eficaz (transcripción y traducción) del ADNc-db. Como consecuencia, esta técnica general es aplicable, únicamente, a las proteínas para las que se conoce al menos una parte de su secuencia de aminoácidos o de ADN para la cual está disponible una sonda oligonucleotídica. Véase, en general, Maniatis, et al., supra.

Se han desarrollado, mas recientemente, procedimientos para identificar clones específicos sondando colonias de bacterias o de placas de fago con anticuerpos específicos de la proteína codificada de interés. Este procedimiento puede ser utilizado únicamente con vectores de clonación "vector de expresión" dado que se requiere la elaboración del producto proteico. El gen estructural se inserta en el vector por el lado de las secuencias genéticas de regulación, que controla la expresión de la proteína. Las células son lisadas, bien mediante procedimientos químicos o bien mediante una función suministrada por la célula o por el vector huésped, y la proteína es detectada por un anticuerpo específico y un sistema de detección como un inmunoensayo enzimático. Un ejemplo a este respecto es el sistema \lambdagt_{11} descrito por Young y Davis, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 80:1194-1198 (1983) y Young y Davis, Science, 222:778 (1983).

Como se ha mencionado anteriormente, un clon de ADNc parcial de flg humano es conocido por el trabajo anterior de la solicitante. Un análisis ulterior de la secuencia de nucleótidos del clon ADNc parcial de flg humano de origen, C51, así como de varios aislados independientes suplementarios, ha revelado que cada uno de los clones parciales presenta una secuencia en 5' idéntica, que corresponde a un punto EcoRI cortado que existe en la naturaleza. Esto sugiere que, en la construcción del banco de ADNc, este punto EcoRI no está protegido por la EcoRI metilasa antes de un corte por EcoRI. Se piensa, por ejemplo, que la extremidad 5' del ADNc de flg se encuentra sobre un fragmento EcoRI sin recubrimiento clonado de manera independiente. La técnica de reacción en cadena por polimerasa (PCR) anclada (Loh, et al., Science, 243: 217-220 (1989)) es utilizada para confirmar esto y para obtener 170 pares de bases (pb) suplementarias de la secuencia de nucleótidos de flg aguas arriba del punto EcoRI interno. Una segunda serie de reacciones de PCR, que utilizan puntos de inicio en esta nueva secuencia conjuntamente con los puntos de inicio oligonucleótidos específicos de un brazo \lambdagt_{11} amplia el interés de un clon flg 5' procedente del mismo banco de ADNc de HUVEC. Puesto que se han encontrado de manera ocasional mutaciones de secuencia generadas por PCR, este segundo producto de PCR ha sido radiomarcado y se ha utilizado como sonda para seleccionar de nuevo el banco de ADNc de HUVEC en \lambdagt_{11}. Se obtiene un clon de 700 pb que se extiende desde el punto EcoRI interno hasta la región no traducida en 5'. La secuencia deducida completa de aminoácidos de flg humano está representada en la figura 2A.

Las secuencias publicadas de los clones parciales de ADNc murino bek y humano flg (Kornbluth, et al., 1988 supra; Ruta, et al., 1988 supra) son altamente homólogas con una divergencia significativa observada únicamente en la inserción de kinasa (identidad del 50%) y en la extremidad COOH. Aun cuando las pequeñas diferencias de secuencia podrían haber sido atribuidas a una divergencia interespecie, se observa que las inserciones mucho mas importantes de kinasa de los receptores PDGF humanos y murinos (tipo B) son idénticas en un 85% (Yarden, et al., Nature, 323:226-232 1986); Claesson-Welsh, et al., Mol. Cell. Biol., 8:3476-3486 (1988)), lo que sugiere que bek podría ser, de hecho, un producto de gen diferente de flg. Para clonar bek, se selecciona un banco de ADNc de tronco cerebral humano en \lambdagt_{11} con un oligonucleótido radiomarcado de 33 bases que corresponde a los 11 codones de extremidad COOH de bek murino (Kornbluth, et al., 1988, supra). Este corresponde a la extensión mas larga de no identidad entre las secuencias publicadas de bek y flg. Se identifican treinta y dos clones, entre los cuales está secuenciado bek5, que contiene un inserto de ADNc de 3,2 kb. La secuencia deducida de los aminoácidos establece claramente que es muy similar pero diferente de flg, y que no presenta las aproximadamente 25 pb de secuencias de péptido señal, principalmente el inicio de traducción ATG. Se obtienen clones con recubrimiento seleccionando de nuevo el banco de tronco cerebral con un fragmento de ADNc de 750 pb correspondiente a la región 5' de bek5. La secuencia deducida completa de aminoácidos de bek humano está representada en la figura 2A. Los detalles específicos de la clonación de flg y bek se encuentran en el ejemplo 1.

Flg y bek son productos de gen similares aunque distintos (figura 2B), con particularidades estructurales compartidas por la familia de PDGF/CSF-1/c-kit de receptores enlazados con tirosina kinasas (Ullrich y Schlessinger, 1990, supra). Sus secuencias codificantes comprenden una secuencia de péptido señal hidrófoba de 21 aminoácidos, un dominio extracelular de 356 (bek) y de 355 (flg) aminoácidos, un dominio transmembranal de 21 aminoácidos y un dominio citoplasmático de 423 (bek) y de 425 (flg) aminoácidos. Los dominios extracelulares de flg y de bek contienen tres dominios "de tipo inmunoglobulina" (Ig) de tamaño y localización similares. De manera interesante, la identidad de secuencia de aminoácidos en y alrededor de los primeros dominios de Ig es mucho menor (43%) que la que se observa en y alrededor de los dominios segundo y tercero de Ig (74%). Ocho puntos potenciales de glicosilación enlazada con N están situados en posiciones idénticas en los dominios extracelulares de flg y de bek. Flg contiene un punto suplementario de glicosilación enlazado con N sobre el aminoácido 185. Los autores Lee, et al., (1989) han señalado una región en el dominio extracelular de flg de pollo, que presenta 8 aminoácidos, ácidos, próximos. Esta "caja ácida" está presente igualmente en flg humano y en bek humano, y comprende 8 y 5 residuos ácidos, respectivamente, los dominios citoplasmáticos de bek y de flg comprenden largas regiones próximas a la membrana seguidas por dominios catalíticos conservados de kinasa que están ocupados por inserciones de 14 aminoácidos. Los dominios de kinasa están seguidos por colas divergentes de extremidad carboxi. La identidad global entre bek y flg es del 71%, siendo la región de identidad mas elevada (88%) el dominio de kinasa.

Se determina la expresión de los ARNm de flg y de bek en diferentes líneas celulares mediante análisis de transferencia de Northern con sondas de ADNc de bek y de flg que corresponden a una parte de sus regiones no traducidas entre 3' no homólogas. En células de raptomiosarcoma A204, se observan dos transcripciones de flg con aproximadamente 4,3 y 4,2 kg, pero no se detecta ARNm de bek (figura 3). Las células HUVEC y de teratocarcinoma humano NTERA 2 expresan únicamente, las transcripciones de flg con 4,2 y 4,3 kb, respectivamente. El significado de las transcripciones distintas de 4,3 y de 4,2 kb de flg es desconocido en la actualidad. Pueden estar emparentados con los clones de flg aislados que, en comparación de las figuras 2A y 2B, representan una deleción del bucle de cisteína de la extremidad amino del dominio extracelular. Se observa un transcrito de bek de 4,4 kg únicamente en la línea celular de teratocarcinoma. Otros investigadores han mostrado que el ARNm de bek es expresado en el hígado, los pulmones, el cerebro y los riñones de ratones adultos pero está ausente en el corazón de la rata (Kornbluth et al., 1988, supra). La proteína flg de pollo ha sido observada en el intersticio, el cerebro, en la molleja, en el corazón, en los músculos esqueléticos, y en los fibroblastos embrionales, pero únicamente en el cerebro de pollos adultos (Pasquale et Singer, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:5449-5453 (1989)). Tomados en conjunto, estos rasurados muestran que bek y flg no son expresados de manera coordenada.

Expresión de flg y de bek en células recombinantes

Los ADNc-db de flg y de bek pueden insertarse en vectores de expresión según cualquiera de las numerosas técnicas conocidas. En general se pueden encontrar los procedimientos en Maniatis, et al., (1982), supra, y Ausubel, et al., (1987), supra. En general, el vector se hace lineal al menos por medio de una endonucleasa de restricción, que producirá al menos dos extremidades francas o cohesivas. Se realiza una ligación o unión del ADNc-db en el punto de inserción del vector.

Si se utilizan células procariotas u otras células que contengan un material substancial de pared celular, el procedimiento mas común para la transformación por el vector de expresión es un tratamiento previo con cloruro de calcio, como se ha descrito por Cohen, R.N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69:2110 (1972). Si se utilizan células sin barreras de pared celular como células huésped, se realiza la transfección según el procedimiento de precipitación al fosfato de calcio descrito por Graham et Van der Eb, Virology, 52:456 (1973). Se pueden utilizar, con éxito, otros procedimientos para introducir el ADN en células tales como inyección nuclear, una infección vírica, una electroporación o una fusión de protoplasto. A continuación se cultivan las células sobre medio selectivo y son producidas las proteínas que son codificadas por el vector de expresión.

La expresión "vectores de expresión" hace referencia a vectores que pueden transcribir y traducir las secuencias de ADN que contienen cuando secuencias de este tipo están enlazadas con otras secuencias de regulación que pueden afectar a su expresión. Estos vectores de expresión deben poderse replicar en los organismos o sistemas huésped bien en forma de epitomas, de bacteriófagos o bien en forma de una parte integrante del ADN cromosómico. Una forma de vector de expresión es el bacteriófago, virus que se alojan y se replican normalmente en bacterias. Un fago particularmente deseable con esta finalidad comprende el fago \lambdagt_{10} y el fago \lambdagt_{11} descritos por Yound et Davis, supra. \lambdagt_{11} es un vector de ADN recombinante general que puede producir polipéptidos específicos por el ADN insertado.

Para minimizar la degradación, durante una inducción por un análogo sintético de la lactosa (IPTG), se sintetizan proteínas extrañas o partes de las mismas, fusionadas con la proteína procariota \beta-galactosidasa. La utilización de células huésped que no presentan vías de degradación proteica puede aumentar igualmente, la duración de vida de las nuevas proteínas producidas a partir de los clones \lambdagt_{11} inducidos. La expresión propia de un ADN extraño en los clones \lambdagt_{11} dependerá de la orientación propia y del cuadro de lectura del ADN insertado con relación al promotor y al codon de iniciación de traducción de la \beta-galactosidasa.

Otra forma de vector de expresión útil en técnicas de ingeniería genética, es el plásmido - un ADN de doble hebra circular no integrado (extracromosómico). Cualquier otra forma de vector de expresión, que tenga una función equivalente, es apropiada para una utilización en el procedimiento de la invención. Los vectores recombinantes y la metodología divulgadas en la presente descripción, son apropiados para una utilización en células huésped que cubren una amplia gama de organismos procariotas y eucariotas. Se prefieren células procariotas para la clonación de secuencias de ADN y en la construcción de vectores. Por ejemplo, la cepa K12 de E. coli HB101 (ATCC nº 339 694), es particularmente útil. Evidentemente, pueden utilizarse otras cepas microbianas. Se utilizan vectores que contengan secuencias de replicación y de control que procedan de especies compatibles con la célula o con el sistema huésped en combinación con estos huéspedes. El vector porta, habitualmente, un origen de replicación, así como características que pueden proporcionar una selección de fenotipo en células transformadas. Por ejemplo, se puede transformar E. coli utilizando el vector pBR322, que contiene genes para una resistencia a la ampicilina y a la tetraciclina (Bolivar, et al., Gene, 2:95 (1977)).

Estos genes de resistencia a los antibióticos proporcionan un medio de identificación de las células transformadas. El vector de expresión puede contener, igualmente, elementos de control que se pueden utilizar par la expresión del gen de interés. Elementos de control procariotas comunes, utilizados para la expresión de secuencias de ADN extraño en E. coli comprenden los promotores y las secuencias de regulación que proceden de los operones de la \beta-galactosidasa y del triptofano (trp) de E. coli, así como los promotores pR y pL del bacteriófago \lambda. Igualmente se han utilizado combinaciones de estos elementos (por ejemplo, TAC, que es una fusión del promotor trp con el operador lactosa). Igualmente se han descubierto y se han utilizado otros promotores y se han publicado detalles relativos a sus secuencias de nucleótidos lo que permite que un experto en la técnica pueda combinarlos y explotarlos de manera funcional.

Además de los procariotas, se pueden utilizar, igualmente, microorganismos eucarióticos, tales como cultivos de levadura. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común de panificado es la que se utiliza mas comúnmente entre los microorganismos eucariotas, aún cuando un cierto número de otras cepas estén disponibles comúnmente. Promotores de levadura apropiados para la expresión de secuencias de ADN extrañas en una levadura, que comprende los promotores de la 3-fosfoglicerato kinasa u otros enzimas glicolíticos. Vectores apropiados de expresión pueden contener señales de detención, que proporcionan la poliadenilación y la detención de la transcripción de ARNm del gen clonado. Cualquier vector que contenga un promotor compatible con una levadura, un organismo de replicación y una secuencia apropiada de detención es apropiado para la expresión de bek o de flg.

Igualmente pueden utilizarse líneas celulares procedentes de organismos pluricelulares como huéspedes. En principio, cualquier cultivo celular de este tipo puede ser utilizado, independientemente de que proceda de una fuente vertebrada o invertebrada. Sin embargo, se ha mostrado el interés máximo para células de vertebrados, y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un modo de operación de rutina estos últimos años. Ejemplos de huéspedes útiles de este tipo comprenden las líneas celulares VERO, HeLa, C127 o 3T3 murinas; de ovario de hámster chino (CHO), W138, BHK, COS-7 y MDCK. Las células 3T3 murinas y CHO son particularmente preferidas. Los vectores de expresión para células de este tipo comprenden, habitualmente, un origen de replicación, un promotor situado delante del gen a ser expresado, sitios de engarce de ARN (si es necesaria) y secuencias de detención de la transcripción.

Para una utilización en células de mamífero, las funciones de control (promotores y activadores) sobre los vectores de expresión están proporcionadas frecuentemente por un material vírico. Por ejemplo, promotores comúnmente utilizados proceden de polioma, del aminovirus 2 y, en el caso mas frecuente, del virus de simio 40 (SV40). Igualmente pueden utilizarse promotores eucariotas, tales como el promotor de gen murino de la metalotioneina (Paulakis et Hamer, Proc. Natl. Acad. Sci., 80:397-401 (1983)) Además, se pueden utilizar igualmente, y esto es deseable frecuentemente, el promotor o la secuencias de control que están asociadas naturalmente con las secuencia genética deseada, con la condición de que la secuencia de control de este tipo sean compatibles con el sistema huésped. Para aumentar la velocidad de transcripción, pueden añadirse igualmente secuencias de activador eucariota a la construcción. Estas secuencias pueden obtenerse a partir de una variedad de células animales o de retrovirus oncógenos como el virus del sarcoma murino.

Se puede proporcionar un origen de las replicación por construcción del vector para que comprenda un origen exógeno, como el que esta proporcionado por el SV40 u otras cepas víricas, o puede ser proporcionado por un mecanismo de replicación cromosómica de la célula huésped. Si el vector está integrado en el cromosoma celular huésped, esto último es frecuentemente suficiente.

Las células huésped pueden dar bek o flg que pueden ser de diversas composiciones químicas. La proteína es producida presentando una metionima como primer aminoácido. Esta metionina está presente debido al codon de partida ATG existente de manera natural en el origen del gen estructural o por una construcción delante de un segmento del gen estructural. La proteína puede seleccionarse igualmente por vía intracelular o extracelular, dando lugar al amino-ácido que se observa de manera natural en la extremidad aminada de la proteína. La proteína puede producirse conjuntamente con su propio péptido señal o con un heterólogo, pudiéndose seleccionar específicamente el polipéptido señal en un ámbito intracelular o extracelular. Finalmente, se puede producir bek o flg mediante una expresión directa bajo una forma madura sin tener que eliminar por selección cualquier polipéptido extraño.

La expresión "células huésped recombinantes" hace referencia a células que han sido transformadas por vectores construidos utilizando técnicas de ingeniería genética. Como se ha definido en la presente descripción, se puede producir bek o flg como consecuencia de esta transformación. Bek o flg o sus fragmentos producidos por células de este tipo son citados en referencia como "bek o flg recombinante".

Los detalles de la expresión de flg y de bek están dados en el ejemplo 2.

Aplicaciones de líneas celulares que sobreexpresan flg y bek

Las líneas celulares que sobreexpresan bek y flg proporcionadas en la presente descripción, son útiles para estudiar una interacción ligando/receptor así como en un programa de selección de medicamentos concebidos de manera racional. Puntos potenciales de acción de agentes terapéuticos comprenden, pero sin carácter limitativo, una unión receptor/ligando, una transducción de señal, una interacción receptor/diana.

De este modo se pueden evaluar medicamentos al nivel de su capacidad para inhibir un enlace de ligando natural mediante una inhibición competitiva u otros mecanismos. Como variante, se pueden utilizar las células que sobreexpresan bek y flg como fuente de inmunógeno para producir anticuerpos, como anticuerpos monoclonales, que pueden igualmente ser evaluados al nivel de su capacidad para efectuar un enlace de ligando o una agregación de receptores. Igualmente se puede utilizar el sistema para evaluar medicamentos que afecten a las interacciones kinasa/diana. Estos medicamentos, conocidos como trifostinas, tienen como punto de acción la fosforilación de dianas celulares para el dominio de receptor de kinasa, principalmente la autofosforilación del propio receptor. Para que el enlace del ligando y la actividad de kinasa se encuentren en dominios distintos, no es necesario expresar la secuencia entera del receptor para evaluar los efectos de medicamentos sobre las actividades identificadas anteriormente. De este modo, la invención se refiere a la expresión de fragmentos biológicamente activos de flg y de bek. Por ejemplo, se pueden utilizar de manera útil los productos de clonación y de la expresión de un ADNc que codifique los 377 primeros aminoácidos de bek o los 376 primeros aminoácidos de flg (es decir los dominios extracelulares mas trans-membranales) o los 423 aminoácidos de bek o los 425 aminoácidos de flg de extremidad COOH para evaluar un ligando y trifostinas, respectivamente. El ejemplo 3 ilustra varias de estas aplicaciones.

También, en otra forma de realización, el dominio extracelular solo o subdominios de este pueden utilizarse como inhibidores de infección por patógenos oportunistas tales como el virus del herpes de tipo I u otros patógenos que utilizan bek o flg endógeno como medio de infección de su célula diana. Se ha descrito que la entrada del
HSV-1 en células queda aumentada de manera espectacular en líneas celulares que presenten flg sobreexpresado en su superficie (R.J. Kaner, et al., Science 248:1410-1413 (1990)). De este modo, pueden utilizarse las líneas celulares con sobreexpresión para seleccionar medicamentos inhibidores midiendo un enlace reducido del virus (análisis directo) o por una infectividad reducida o una reducción del virus del medio en presencia o en ausencia de medicamentos candidatos tales como fragmentos de los propios receptores.

La invención proporciona las secuencias completas de ADNc humano de dos receptores del factor de crecimiento de los fibroblastos. Aun cuando una secuencia de ADNc parcial de una extremidad de proteína kinasa humana flg sea conocida (Ruta, et al., supra (1988)) como lo es la secuencia parcial de la proteína kinasa murina bek (Kornbluth, et al., supra (1988)), las secuencias completas de las formas humanas de estos genes no están disponibles. Sin las secuencias completas, la extensión del punto funcional del enlace del ligando y el grado de homología entre flg y bek no pueden ser evaluados de manera apropiada. Como se ha divulgado en la presente descripción, flg y bek son productos genéticos similares pero distintos, que presentan una afinidad elevada para aFGF, bFGF y k-FGF. Los genes de bek y flg están localizados sobre cromosomas diferentes y son expresados de manera diferente en diferentes líneas celulares y tejidos.

Flg y bek muestran particularidades estructurales compartidas por los receptores de tirosina kinasa PDGF y

\hbox{CSF-1,}

principalmente un dominio de tirosina kinasa cortado y una región extracelular que comprende múltiples dominios de tipo inmunoglobulina. Sin embargo, los receptores del FGF son distintos en el plano estructural de los receptores PDGF y CSF-1 desde varios puntos de vista:

1) los dominios extracelulares de los receptores del FGF comprenden 3 dominios de inmunoglobulina (Ig), mientras que los de los receptores PDGF y CSF-1 comprenden 5 dominios de Ig. Desde este punto de vista los receptores del FGF se parecen al receptor de IL-1, cuya región extracelular comprende tres dominios de Ig (Sims, et al., Science, 241:585-589 (1988));

2) la región próxima a la membrana de los receptores del FGF, 87 (flg) y 89 (bek) aminoácidos, es significativamente mas larga que la de los receptores PDGF y CSF-1 (49 y 51 aminoácidos, respectivamente);

3) el dominio de inserción de kinasa de los receptores del FGF comprende únicamente 14 aminoácidos mientras que las inserciones de kinasa de los receptores PDGF y CSF-1 son mucho mas importantes (104 y 70 aminoácidos, respectivamente) (Hanks, et al., Science, 241:42-52 (1988)). Un residuo tirosina consensus y un sitio potencial de autofosforilación en el dominio de kinasa del receptor PDGF se conservan en los dos receptores del FGF (residuo 654 de flg, residuo 657 de bek). La presencia de motivos comunes entre los receptores de una variedad de ligandos distintos, en el plano biológico, refuerza el argumento de que, por razones estructurales y/o de funcionamiento, estos han sido sometidos a fuertes tensiones al nivel de la evolución (Ullrich y Schlessinger, Cell 60:203-221 (1990)).

\newpage

Células NIH 3T3, transfectadas por vectores de expresión de mamíferos, que contienen las secuencias que codifican bien flg o bien bek, que dirigen la síntesis de glicoproteínas, presentan pesos moleculares aparentes de 150.000 y de 135.000, respectivamente. Cuando se sintetiza en presencia de tunicamicina, el peso molecular de la proteína flg mayor es de 110 kDa mientras que el de la bek es de 90 kDa. Precedentemente se han observado dos proteínas flg de 90 y 110 kDa en inmunoprecipitados de células de rabdomiosarcoma humano marcadas sobre el plano metabólico, tratadas con la tunicamicina (Ruta, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 86:8722-8726 (1989)). Aun cuando sea imposible excluir por completo un mecanismo que implique una proteolisis, las proteínas flg de 90 y 110 kDa en células de rabdomiosarcoma pueden representar productos de traducción primaria reales. Reid, et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87:1596-1600 (1990)) han informado recientemente el aislamiento de dos ADNc de flg murinos distintos, uno de los cuales es, aparentemente, el homólogo de ADNc de flg humano divulgado en la presente descripción y un segundo ADNc mas corto, que presenta una deleción de la región que codifica el primer dominio del tipo Ig mediante un engarce alternativo. Además de los clones de longitud completa divulgados en la presente descripción, se pueden recuperar otros clones de ADNc que parece que codifican formas truncadas de flg y de bek a partir de bancos de ADNc de HUVEC y de cerebro humano. Se aísla una variante de flg que no presenta el primer dominio de tipo Ig pero que, por otra parte, está intacto. Otras variantes de ADNc comprenden una versión truncada de bek que codifica una única secuencia, un dominio único de "tipo Ig" y un codon de detención y una variante de flg que codifica dos dominios de "tipo Ig". Estos dos clones pueden representar formas decretadas de bek o de flg. Una comparación de las secuencias de nucleótidos de estos clones con los ADNc de flg y de bek que codifican receptores que presentan tres dominios "de tipo Ig" sugiere que proceden de genes estructurales de flg y de bek por un engarce alternativo. Como consecuencia es posible que la especie de peso molecular menor de flg inmunoprecipitado a partir de lisatos de células de rabdomiosarcoma, represente una forma real de flg que es generada por un engarce alternativo. De manera interesante, las células de rabdomiosarcoma A204 expresan dos ARNm diferentes de flg que podrían representar las formas engarzadas de manera alternativa, mientras que las células NTERA-2 y endoteliales parece que expresan de manea diferente los ARNm alternativos de flg.

Depósito de cepas útiles en la práctica de la invención

Se ha depositado un cultivo puro sobre el plano biológico de la cepa siguiente en la American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, habiéndole sido atribuido el número de registro indicado después de un ensayo fructuoso de viabilidad, y una vez que han sido pagadas las tasas requeridas. El acceso a dicho cultivo será posible durante la tramitación de la solicitud de patente a una persona determinada por el comisario habilitado para ello según los artículos 37 C.F.R. \NAK1.14 y 35 U.S.C. \NAK122. Cualquier restricción sobre la disponibilidad del citado cultivo para el público, será eliminada de manera irrevocable cuando se produzca la concesión de una patente basada sobre la solicitud de patente y dicho cultivo permanecerá disponible de manera permanente durante un período de al menos cinco años tras la solicitud mas reciente de un suministro de una muestra y, en cualquier caso, durante un período de al menos 30 años desde la fecha del depósito. Si el cultivo se tornase no viable o se destruyese por inadvertencia, será reemplazado por uno o varios cultivos viables con la misma descripción taxonómica.

Cepa/plásmido ATCC nº	Fecha del depósito
E.coli/pGC37
E.coli/pflgFL24.

Conviene señalar que, para facilitar el almacenamiento, los vectores de la presente invención han sido depositados en forma de huéspedes bacterianos transformados. Sin embargo este un procedimiento de rutina para un experto en la técnica para cultivar las células bacterianas, recuperar los vectores y utilizarlos para transformar otras células huésped tales como células 3T3 murinas como se ha descrito en la presente descripción.

Los ejemplos siguientes están dados a título de ilustración de la presente invención. La presente invención no está restringida únicamente a estos ejemplos.

Ejemplo 1

El ejemplo ilustra la clonación de ADNc de flg y de bek de longitud completa. Como se han mencionado anteriormente, se aísla un clon parcial por selección en un banco de ADNc procedente de ARNm endoteliales humanos con una sonda basada en un producto de gen de transformación retroviral (para detalles véase Ruta, et al., 1988 supra). De manera específica, se utiliza el encogen V-fms (la forma activada del receptor de tirosina kinasa CSF-1) como sonda para seleccionar 10^{6} placas bajo pequeña restricción. Se detectan quince clones \lambdagt_{11} positivos y se purifican cinco por placa y también son analizados. Un clon, C51 es denominado gel de tipo fms (flg: fms-like gene). Como se ha descrito anteriormente en la presente descripción, el fragmento faltante en 5' se recupera mediante una combinación de PCR y de técnicas clásicas de clonación.

Amplificación por PCR e iniciadores oligonucleotídicos

Se realiza la técnica de reacción con polimerasa en cadena (PCR) (Saiki, et al., Science. 230: 1350-1354 (1985)) con 100 pmoles de cada iniciador oligonucleotídico, KCl 50 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, gelatina al 0,01%, cada uno entre dATP, dGTP, dCTP y dTTP 0,2 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,3 (a 25ºC) y 2,5 U de ADN polímerasa Taq (Perkin-Elmer Cetus) en un volumen final de 0,1 ml. Salvo indicación en contra, todas las reacciones han sido realizadas durante 30 ciclos con tiempos de ciclo de 94ºC durante 1,5 minutos, 60ºC durante 1,5 minutos y 72ºC durante 4 minutos.

Se sintetizan todos los iniciadores oligonucleotídicos sobre un sintetizador de ADN Applied Biosystems 380A utilizando una química patrón perfectamente conocida con cianoetilfósforoamidato.

Los oligonucleótidos presentan las secuencias siguientes:

1	AN	GCATGCGCGCGGCCGCGGAGGCC
2	aNpolyC	GCATGCGCGCGGCCGCGGAGG (C)_{14}
3	Flg-1	ACATCCAGCTGGTATGTGTG
4	Flg-2	TACGGTCGACCGTACTCATTCTCCACAATGCA
5	Flg-PE-165non	GCCATTTTTCAACCAGCGC
6	Flg-PE-141non	GGGGTTTGGGGTCCCACTGGAA
7	GT11-R1	TGACACCAGACCAACTGGTAATGG
8	GT11-R3	TAATGGTAGCGACCGGCGCTCAGC
9	3'mbek	TCATGTTTTAACACTGCCGTTTATGTGTGGATA
10	Bek4A	GGAATTCAAGCTTCTAGACCACCATGGTCAGCTGGGGTCGTTTCA
11	Bek1B	TCCTATTGTTGGGCCCCAAGTGCA.

Aislamiento de clones flg 5'

Se obtiene el ADNc de flg en 5' del sitio EcoRI interno (extremidad 5' de pC51, Ruta, et al., 1988 supra) con PCR anclado (Loh, et al., 1989 supra) utilizándose un iniciador Flg-1 para iniciar específicamente una síntesis de ADNc de primera hebra a partir de 50 \mum de ARN totales de célula endotelial humana. Tras extensión homopolimérica dG a la primera hebra con una desoxinucleotidilo transferasa en extremidad, se realiza una amplificación con PCR (30 ciclos) con los iniciadores Flg-2, AN, y 10 pmoles de ANpolyC con tiempos de ciclo de 94ºC durante 1,5 minutos, 50ºC durante 2 minutos y 72ºC durante 4 minutos. Se obtiene un único producto de PCR que extiende la secuencia de C51 de 170 pb en el sentido 5'. Se utiliza la nueva secuencia para construir los dos oligonucleótidos que se utilizan con los oligonucleótidos específicos de un brazo \lambdagt_{11} para amplificar con PCR, clones de flg 5' contenidos en el banco de células endoteliales. La segunda reacción de PCR se realiza con 2 x 10^{6} fagos y los oligonucleótidos Flg-PE-165non y GT11-R1. La tercera reacción utiliza 5 \mul de la reacción precedente como matriz para los iniciadores oligonucleotídicos Flg-PE-141non y GT11-R3. El producto de 560 pb de las tercera reacción se ha hecho con extremidad franca por incubación con la ADN polimerasa T4 y se ha clonado en el sitio SmaI a la vez con pGem-1 (Stratagene) y M13mp19 y se ha secuenciado. El producto de PCR flg 5' en pGem-1 se ha cortado, radiomarcado mediante iniciadores hexámeros aleatorios (Feinberg & Vogelstein, Anal. Biochem., 137:266 (1984)), y se le utiliza para seleccionar de nuevo el banco de ADNc de HUVEC para obtener un clon de ADNc exento de artefactos potenciales generados por la PCR. Únicamente se detecta un clon en 2 x 10^{6} fagos recombinantes seleccionados. Un análisis de secuencia de nucleótidos de la inserción de ADNc de este clon revela que su secuencia es idéntica al producto generado por PCR y que está terminado en el sitio EcoRI compartido por el clon parcial de flg pC51. Se digiere este ADNc con EcoRI y SacI que corta a 50 pb en 5' del inicio de traducción ATG, y se clona el fragmento EcoRI/SacI de 650 pb en pGem-1 cortado de manera similar. Se construye un ADNc de flg de longitud completa clonando el inserto de flg EcoRI 3' de pC51 en el sitio EcoRI de este clon de flg 5'. Se corta el ADNc de longitud completa con SmaI/ApaI, se vuelven francas las extremidades con la ADN polimerasa T4 y se le clona en un sitio EcoRV de pMJ30. pMJ30 procede de la substitución por un brazo de unión que contiene un punto de clonación EcoRV de la inserción de aFGF en p267 (Jaye, et al., EMBO, J., 7:963-969 (1988)).

Aislamiento de clones de ADNc de bek humano con recubrimiento

Se selecciona un banco de ADNc de tronco cerebral humano con una edad de un día en \lambdagt_{11} (Kamholz, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83:4962-4966 (1986)) con un oligonucleótido anti-sentido de 33 bases (3'mbek) complementario de la extremidad 3' de la secuencia parcial que codifica bek murino (Kornbluth, et al., 1988 supra). Se aíslan treinta y dos clones positivos de ADNc a partir de una selección de 1,5 x 10^{6} placas recombinantes y se elige el clon mas largo, \lambdabek5, para un análisis ulterior. Se digiere \lambdabek5 con EcoRI y se subclonan los fragmentos EcoRI de 2,2 kb en 5' y 1,0 kb en 3' separadamente en vectores M13mp19 y pGem-1 para manipulaciones ulteriores.

Se aíslan clones de ADNc para la extremidad 5' de bek humano seleccionando el banco de tronco cerebral una segunda vez con un fragmento de 750 pb de extremidad 5' de \lambdabek5. Se radiomarca el fragmento por traslación de la incisión de simple hebra y se le utiliza para seleccionar 1,5 x 10^{6} placas. Se detectan cincuenta y cuatro placas que realizan una hibridación y una, \lambdabek78, recubre el clon de ADNc de origen y se extiende 218 pb mas lejos en el sentido 5'.

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Aislamiento de ARN y análisis de Northern

Se dejan crecer células A204 (rabdomiosarcoma humano), U563 (gliobastoma humano) y NTERA-2 cl.D1 (teratocarcinoma humano) en DMEM con suero fetal de vaca al 10%. Se dejan crecer células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) en el medio 199 que contiene suero fetal de vaca al 10%, 10 U/ml de heparina (Upjohn) y 5 ng/ml de aFGF recombinante. Se aíslan los ARN totales de las células NTERA2cl.D1 con la guanidina HCl (Wang, et al., Dev. Biol. 107:75-86 (1985)) y células A204, HUVEC y U563 con el isotiocianato de guanidina (Chirgwin, et al., Biochem. 18:5294-89 (1979)). Se cuantifica el ARN por su absorbancia óptica a 260 nm. Se fraccionan muestras que contienen 4 \mug de ARN totales sobre un gel de agarosa al 1,25%, que contiene formaldehído, se les transfiere sobre nitrocelulosa y a continuación se les sonda esencialmente como se ha descrito (Seed, en: Genetic Engineering, Setlow et al., editores, volumen 4, páginas 91-102, Plenum Press New York, 1982)) utilizándose sondas generadas por iniciadores hexámeros aleatorios (Feinberg y Vogelstein, Anal. Biochem. 137:256 (1984)). La sonda flg es un fragmento de 550 pb ApaI/EcoRI completamente contenido en la región no codificante en 3'. La sonda bek es un fragmento de 850 pb Tth111I/EcoRI contenido enteramente en la región no codificante en 3'.

Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra la expresión de flg y bek de longitud completa en un vector de expresión de mamífero.

Como se ha mencionado en el ejemplo precedente, se corta el clon de flg de longitud completa con SmaI/ApaI. Se vuelven francas sus extremidades con la ADN polimerasa T4 y se le clona en un sitio EcoRV de plásmido de expresión pMJ30. Obteniéndose pMJ30 por la substitución con un brazo de unión de la inserción de aFGF en p267 (Jaye, et al., EMBO J. 7:963-969 (1988)). De este modo, pMJ30, que contiene la secuencia flg de longitud completa, se denomina pflgFL24.

Se prepara el ADNc de bek humano para una expresión de mamífero amplificando un fragmento de 276 pb de \lambdaBek78 con los iniciadores oligonucleotí-dicos Bek4A y Bek1B. Tras digestión con HindIII y BclI, se une el fragmento 5' de 222 pb al subclon de 2,2 kb de \lambdabek5 al nivel de un sitio único BclI en la región de recubrimiento. El fragmento amplificado con PCR añade puntos de restricción y una secuencia favorable de iniciación de traducción inmediatamente aguas arriba del codon iniciador presumido ATG. Ulteriormente se inserta el fragmento 3' EcoRI de ADNc de bek de 1,0 kb. Para una introducción en células NIH 3T3, se subclona un fragmento de 2,5 kb, que contiene las región completa que codifica bek humano en pMJ30. Se determina la secuencia de nucleótidos de todos los clones sobre las dos hebras por detención de la cadena (Sanger, et al., Ann. N.Y. Acad. Sci., 51:660-672 (1977)). De este modo, pMJ30, que contiene una secuencia bek de longitud completa, se denomina pGC37.

Se dejan crecer células NIH 3T3 en el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con suero de vaca al 10%. Se transfectan las células NIH 3T3 con coprecipitados al fosfato de calcio con 1 \mug de pSV2neo o bien 1 \mug de pSV2neo con 20 \mug de vectores de expresión que contiene la secuencia codificante completa bien del ADNc de flg o bien del ADNc del bek. Conviene señalar que pSV2neo proporciona simplemente un marcador que puede ser seleccionado y que se puede utilizar cualquier otro sistema equivalente de co-transfección. Se seleccionan clones individuales en 500 \mug/ml de Geneticina (Gibco) y se les mantiene en un medio que contiene 200 \mug/ml de Geneticina.

Se insertan separadamente las regiones codificantes de los ADNc de bek y de flg en un vector de expresión de mamífero inmediatamente aguas abajo del promotor del SV40 y del activador de citomegalovirus. Se cotransfectan las células NIH 3T3 con una mezcla 1:20 de pSV2neo (Southern y Berg, J. Mol. Appl. Gen., 1:327-341 (1982)) y un vector de expresión bien de bek o bien de flg y se seleccionan los transfectantes por crecimiento en presencia de 500 \mug/ml de Geneticina (Gibco). Se seleccionan aproximadamente 50 clones de cada uno al nivel de una sobreexpresión de receptores del FGF por reticulación con [^{125}I]aFGF. Como control sirven células NIH 3T3 transfectadas únicamente con pSV2neo. De esta forma se identifican, a la vez, clones de células transfectadas por bek y por flg que muestran un enlace acrecentado de aFGF, lo que indica que bek y flg son ambos receptores del aFGF. Se elige un clon transfectado con bek, Nbek8, y un clon transfectado con flg Nflg26, para un análisis ulterior basado sobre su expresión acrecentada de receptores del aFGF.

Los productos de traducción de los vectores de expresión flg y bek se analizan con un marcaje metabólico de células Nbek8 y Nflg26 con la [^{35}S]-metionina, preparando extractos celulares y llevando a cabo la inmunoprecipitación con antisueros anti-péptido específicos de bek y de flg.

Se sintetizan péptidos que corresponden a los 15 aminoácidos de extremidad COOH de flg (Flg-1) o a los 17 aminoácidos de la extremidad COOH de bek (Bek-1) y se cortan con hemocianina de patela, utilizando el reactivo de reticulación 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida. A continuación se inmunizan conejos con estos reactivos emulsionados en el adyuvante completo de Freund para generar los antisueros policlonales Anti-Flg-1 y Anti-Bek-1.

Se lavan células con una confluencia de 90% que han crecido en cajas de cultivo para tejido de 10 cm (Falcon) con DME exento de metionina y se incuban durante 6 horas en DME exento de metionina que contiene suero de vaca al 10% y 100 \muCi/ml de [^{35}S]-metionina (Amersham). A continuación se lavan tres veces las células con PBS (Gibco) y se raspan en 0,5 ml de tampón de lisis (Hepes 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, glicerol al 10%, Triton X-100 al 1%, MgCl_{2} 1,5 mM, EDTA 1 mM, aprotinina 1 \mug/ml, leupeptina 1 \mug/ml, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM) y se incuban durante 15 minutos sobre hielo. Se centrifugan los lisatos durante 15 minutos en una centrifugadora de Eppendorf a 4ºC. Se dejan hinchar tres mg de Sefarosa-proteína A para muestreo y se lavan con Hepes 20 mM, pH 7,5 y a continuación se mezclan durante 30 minutos, a temperatura ambiente, con el antisuero anti- péptido de conejo correspondiente (Anti-Flg-1 y Anti-Bek-1), seguido por tres lavados con tampón HNTG (Hepes 2 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 0,1%, glicerol al 10%). A continuación se incuban los complejos de Sefarosa-proteína A/anticuerpos con los lisatos celulares clarificados respectivos durante 60 minutos en tampón HNTG a 4ºC, se lavan dos veces con Hepes 50 mM, pH 8,0 NaCl 500 mM, Triton X-100 al 0,2%, y EGTA 5 nM, dos veces con Hepes 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Triton X-100 a 0,1%, EGTA 5 mM y SDS a 0,1% y finalmente dos veces con Tris-HCl 10 mM pH 8 y Triton X-100 al 0,1%. Se añade tampón de muestreo de Laemmli (Laemmli, Nature 227:680-685 (1970)) a los inmunoprecipitados lavados, que se llevan a continuación a ebullición durante 4 minutos y se separan sobre un gel de SDS-poliacrilamida (al 7%). Se realizan autorradiogramas de los geles secados sobre una película Kodak X-Omat (Eastman Kodak Co., Rochester, NY).

Se someten los inmunoprecipitados a un SDS-PAGE seguido por una autorradiografía (figura 4). Se inmunoprecipita específicamente una banda de 150 kDa a partir de células transfectadas por flg con un antisuero anti-péptido flg (línea 3) mientras que el antisuero anti-péptido bek inmunoprecipita, de manera específica, una banda de 135 kDa (línea 7) de células transfectadas por bek. Una inmunoprecipitación en presencia del péptido antigénico correspondiente elimina por completo la precipitación de proteínas específicas flg y bek. Las secuencias de los citados aminoácidos de flg y bek predicen proteínas maduras de base de 89 437 y de 89 750 daltons respectivamente; una glicosilación al nivel de puntos potenciales en los dominios extracelulares daría formas de pesos moleculares mayores. Un tratamiento de células NFlg26 y Bek8 con la tunicamicina con el fin de bloquear una glicosilación, da productos bek y flg de pesos moleculares reducidos, mas coherentes con sus dimensiones predichas de proteínas de base (líneas 4 y 8). Los resultados demuestran que tanto bek como flg son glicoproteínas. Aún cuando la dimensión mas importante de flg en comparación con bek sea coherente con el número de sitios potenciales de glicosilación enlazada con N (9 con relación a 8), en cada uno, el producto flg aislado de células tratadas con la tunicamicina, migra mas lentamente que lo predicho a partir de su secuencia de aminoácidos. La razón de esta migración mas lenta no es conocida pero probablemente no es debida a la construcción de flg recombinante, dado que flg de NFlg26 y células de rabdomiosarcoma A204 tienen pesos moleculares aparentes idénticos, tanto antes como después de un tratamiento con la tunicamicina.

No se detecta proteína bek o flg en inmunoprecipitados de células de control (líneas 1, 2, 5 y 6). En experimentos previos, se inmunoprecipita la proteína flg reticulada al FGF a partir de células NIH 3T3 2,2 (Ruta, et al., 1989 supra), que expresan claramente un flg endógeno. La imposibilidad de detectar flg en experiencias de control se debe, principalmente, al pequeño número de células analizadas y a los cortos tiempos de exposición de autorradiografía permitidos con la utilización de las líneas celulares que sobreexpresan bek y flg.

El nivel de base de los receptores endógenos del factor de crecimiento de los fibroblastos varía de un tipo celular a otro. Células 3T3 contienen aproximadamente 5-10 000 receptores de este tipo, pero algunos subclones 3T3, tales como células 3T3 2.2 pueden contener hasta 30 000 receptores por célula. El término células con "sobreexpresión" tal como se utiliza en la presente descripción, hace referencia a células que presentan aproximadamente 50 000 receptores o mas. Una transfección inicial de células 3T3 con el plásmido divulgado anteriormente da células que presentan aproximadamente 50 000 receptores/célula. Sin embargo, en el transcurso del tiempo de cultivo, se pueden seleccionar clones que presentan unas expresión de 300 000 receptores/célula o por encima de este valor. Si se transfectan células CHO deficientes en DHFR y si se les amplifica por una selección al metotrexato, se extiende hasta que éstas produzcan incluso un millón de receptores por célula o por encima de este valor.

Ejemplo 3 Radioyodación y enlace del FGF

Se somete a radio yodación aFGF de origen bovino, purificado como se ha descrito anteriormente (Burgess, et al., J.Biol. Chem., 260:11 389-11 392 (1985)), bFGF recombinante humano (una aportación del Dr. Moscatelli) y kFGF recombinante humano (una aportación del Dr. Claudio Basilico) utilizando el protocolo de Enzymobeads (BioRad). Se determina la actividad específica del ligando radiomarcado con una dilución de radioisótopo utilizando el competidor no marcado respectivo. Las concentraciones en ligando no marcado se determinan por análisis de aminoácidos (Jaye, et al., 1987 supra). La actividad específica de las diferentes preparaciones de [^{125}I]aFGF varía entre 130 000-760 000 (impulsos/-minuto)/ng y la actividad específica de [^{125}I]bFGF varía entre 50 000-500 000 (impulsos/minuto)/ng. La actividad específica de [^{125}I]kFGF varía entre 50 000-200 000 (impulsos/minuto)/ng.

Se realiza el análisis de enlace como sigue:

Se colocan cajas de 24 pocillos recubiertas con fibronectina, que contienen 1 x 10^{5} células/pocillo sobre hielo y se enjuagan los pocillos dos veces con tampón frío de enlace (DMEM, BSA 1 mg/ml, heparina 5 U/ml, Hepes 50 mM, pH 7,4). Se incuban las cajas sobre hielo con 1 ml de tampón helado de enlace durante 20 minutos seguido por 2 horas a 4ºC con diluciones en serie de [^{125}I]FGF en tampón frío de enlace sin heparina. Se obtiene el enlace no específico utilizando las mismas diluciones de serie pero en presencia de un exceso molar de 100 veces de aFGF no radioactivo. Tras incubación, se colocan las células sobre hielo y se enjuagan dos veces con tampón helado de enlace, sin heparina, y a continuación se solubilizan en NaOH 0,3 N 37ºC, 15 minutos. Cuando se utiliza [^{125}I]bFGF se colocan las células sobre hielo tras la incubación, se lavan tres veces con PBS, dos veces con 1 ml de NaCl 2 M en Hepes 20 mM, pH 7,5 y dos veces con 1 ml de NaCl 2 M en acetato de sodio 20 mM, pH 4,0. La radioactividad liberada por el lavado ácido NaCl 2M representa el enlace específico con los sitios de alta afinidad (Moscatelli, J. Cell. Physiol., 131:123-130 (1987).

Reticulación covalente de [^{125}I]FGF ácido de [^{125}I]FGF básico y de [^{125}I]kFGF sobre células intactas

Se dejan crecer células NFlg26, NBek8 y NNeo4 en cajas de cultivo de tejido de 60 mm recubiertas con fibronectina humana. En la confluencia, se lavan las células dos veces con tampón de enlace (DMEM que contiene BSA al 0,2% y Hepes 20 mM, pH 7,5) y se incuban durante 90 minutos a 4ºC con tampón de enlace que contiene 25 ng/ml de [^{125}I]aFGF, de [^{125}I]bFGF o de [^{125}I]kFGF. Tras un lavado, una vez, con tampón de enlace y, una vez, con PBS, se incuban de nuevo las células durante 20 minutos a 4ºC con PBS que contiene suberato de disuccinimidilo 0,3 mM (Pierce) como agente de reticulación (preparado en forma de una solución de base de 30 mM en DMSO). A continuación se lavan las células, una vez, con Hepes 10 mM, pH 7,5 glicina 200 mM, EDTA 2 mM, una vez con PBS y a continuación se raspa en PBS y se recogen por centrifugado en una centrifugadora de Eppendorf. Se lisan los culotes celulares en 100 \mul de tampón de lisis (Hepes 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 al 1%, glicerol al 10%, MgCl_{2} 1,5 mM, EDTA 1 mM, aprotinina 1 \mug/ml, leupeptina 1 \mug/ml y PMSF 1 mM), se incuban durante 15 minutos sobre hielo y se centrifugan durante 15 minutos a 4ºC en una centrifugadora de Eppendorf. Se mezclan volúmenes aproximadamente iguales de los sobrenadantes de cada muestra con tampón de muestreo de Laemmli (Laemmli, Nature, 227:680-685 (1970)), se les hierve durante 4 minutos y se fraccionan sobre gel de SDS-poliacrilamida al 7%. Los geles se colorean con azul brillante de Coomassie para verificar que todas las muestras contienen cantidades aproximadamente iguale de proteínas. Se llevan a cabo autorradiogramas de los geles secos sobre une película Kodak X-Omat.

La posibilidad de seleccionar clones al nivel de una sobreexpresión de bek y de flg mediante una reticulación de afinidad con [^{125}I]aFGF sugiere que tanto bek como flg enlazan aFGF con una alta afinidad. El enlace de [^{125}I]aFGF, [^{125}I]bFGF y [^{125}I]kFGF se analiza en paralelo sobre células que sobreexpresan bek y flg. Tras incubación de las células con [^{125}I]aFGF, [^{125}I]bFGF o [^{125}I]kFGF, se reticulan complejos de receptor-FGF de manera covalente con suberato de disuccinimidilo, se solubilizan, y se someten a un SDS-PAGE y a una autorradiografía (figura 5). Se ha reticulado una banda única de 165 kDa a la vez con aFGF y con bFGF en líneas celulares que sobreexpresan flg (líneas 2 y 5). De manera similar se ha reticulado única banda de 150 kDa a la vez con aFGF y con bFGF en líneas celulares que sobreexpresen bek (líneas 3 y 6). Tras substracción del peso molecular de los ligandos (aproximadamente 15 kDa), la dimensión de la banda reticulada en las líneas celulares que sobreexpresan flg y bek (150 y 135 kDa, respectivamente) corresponden exactamente a la dimensión de las proteína flg y bek inmunoprecipitadas (figura 4). La dimensión aparente, ligeramente mayor de las bandas cuando se ha reticulado [^{125}I]kFGF (figura 5B), en comparación con la dimensión cuando se ha reticulado aFGF o bFGF (figura 5A), se debe a la diferencia de dimensión del kFGF (22 kD) con relación a aFGF y a bFGF (16 kD). No se ha observado cualquier producto de reticulación en células de control, lo que la solicitante atribuye de nuevo al corto tiempo de exposición autorradiográfica permitido por la intensidad de las señales obtenidas con las líneas celulares con sobreexpresión.

Análisis de enlace en el equilibrio de flg y bek radiomarcados con factores de crecimiento de los fibroblastos ácido, básico y k

Se somete a una radioyodación y se purifica sobre Sefarosa-heparina, FGF ácido y básico como se ha descrito anteriormente. Se establecen las constantes de disociación de bek y de flg para aFGF y bFGF mediante un análisis de enlace a saturación de las líneas celulares con sobreexpresión con los ligandos yodados. Un enlace tanto de aFGF como de bFGF sobre bek y flg es específico y saturable (figura 6A, inserciones). Además, está completamente eliminado un enlace de [^{125}I] aFGF y [^{125}I]bFGF con saturación en presencia del exceso molar de 100 veces bien de aFGF o bien de bFGF, lo que indica que cada ligando sufre una competición eficaz del otro para un enlace sobre los mismos sitios. Un análisis de Scatchard (Ann. N. Y. Acad. Sci. 51:660-672 (1949)) de los datos de enlace para una experiencia típica (figura 6A) indica que las células que sobreexpresan flg portan, aproximadamente, 55 000 receptores por célula con afinidades de 24 pM y 47 pM para aFGF y bFGF, respectivamente. Igualmente, las células que sobreexpresan bek portan aproximadamente 64 000 receptores por célula con afinidades de 47 pM y de 82 pM para aFGF y bFGF, respectivamente. El kFGF se enlaza con flg y con bek con afinidades de 320 y de 80 pM, respectivamente (figura 6B). El kFGF se enlaza igualmente con bek con una afinidad similar a la del bFGF pero se enlace con flg con una afinidad 4 veces menor que la del bFGF. Los datos de experimento suplementarios dan K_{d} aparentes de aFGF para flg en el intervalo de 20- 80 pM y para bek en el intervalo de 40-100 pM. Se observa una variación similar de las K_{D} del enlace de bFGF con flg (50-150 pM) y con bek (90-150 pM) pero en cualquier experimento bFGF muestra siempre una afinidad aproximadamente dos veces menor bien para con flg o bien para con bek en comparación con aFGF. La gama de valores procede probablemente de las determinaciones de la actividad específica y de la integridad biológica de las diferentes preparaciones de los ligandos yodados. Sin embargo, los datos demuestran claramente que bek y flg enlazan aFGF con elevadas afinidades, similares y enlazan bFGF con una afinidad aproximadamente 2 veces menor que la de aFGF. Estas conclusiones están reforzadas por experimentos de competición (dilución de isótopos) en los cuales se ponen en competición cantidades crecientes de aFGF o de bFGF no radioactivo para un enlace de [^{125}I]aFGF y [^{125}I]bFGF sobre células que sobreexpresan flg y bek.

Selección de medicamento

Las células transformadas, biológicamente activa, pueden utilizarse para seleccionar compuestos al nivel de su eficacia para inhibir el enlace de los FGF con sus receptores. Tras haber establecido los parámetros de una interacción ligando/-receptor en ausencia de inhibidores potenciales, constituye un simple trabajo de rutina la preincubación de las células con una muestra de ensayo que contenga un compuesto a ser evaluado, añadir FGF marcado y medir la reducción del enlace del FGF, si es que se produce.

Son posibles análisis alternativos. Por ejemplo, en lugar de medir directamente un enlace de FGF, se puede analizar el efecto del FGF (es decir un suceso intracelular). Un suceso de este tipo es una fosforilación de proteína bien del propio receptor o bien de otro blanco intracelular tal como la fosfolipasa C-\gamma. Se puede medir la aparición de una proteína fosforilada mediante la reactividad de proteínas de este tipo con un anticuerpo anti-fosfotirosina.

La invención se refiere a líneas celulares útiles para la evaluación de medicamento, y no a cualquier análisis particular utilizado. Como se ha mencionado precedentemente, no es necesario expresar la molécula entera de receptor para proporcionar un sistema útil de selección. Por ejemplo, se ha descubierto que un dominio extracelular que presenta una deleción del primer dominio de Ig y de la "caja ácida" puede incluso enlazar un ligando FGF. Como se ha mencionado anteriormente, se pueden utilizar células huésped que expresen el dominio citoplasmático como fuente cómoda de proteína kinasa para la evaluación de trifostinas candidatas. Para este fin se ha revelado útil E. coli transformada con un plásmido que contenga únicamente el dominio citoplasmático. Puesto que la invención proporciona la secuencia intacta de flg y bek, constituye una cuestión de rutina para el experto en la materia producir fragmentos de diferentes dominios con ayuda de técnicas de PCR o de síntesis peptídica en fase sólida y evaluar éstos al nivel de su capacidad para enlazar un ligando o para fosforilar proteínas.

Agentes terapéuticos potenciales comprenden, pero sin quedar limitados por ello, pequeñas moléculas orgánicas, fragmentos del propio receptor o anticuerpos que inhiben el enlace del ligando con el dominio extracelular o que afectan a la actividad de la proteína kinasa.

Los compuestos que presentan una actividad de inhibición son potencialmente útiles como agentes terapéuticos para el tratamiento de estados enfermizos caracterizados por respuestas celulares indeseables mediadas por el FGF. Entre los estados enfermizos que se han revelado como caracterizados por respuestas de este tipo se encuentran el cáncer, específicamente ciertas formas de cáncer de mama, la soriasis, la artritis, la aterosclerosis y la hipertrofia prostática benigna.

Los agentes terapéuticos de la invención se pueden administrar solos o en combinación con vectores farmacéuticamente aceptables, cuya proporción está determinada por la solubilidad y la naturaleza química del compuesto, la vía de administración elegida y la práctica farmacéutica usual. Por ejemplo, se pueden administrar por vía oral en forma de comprimidos o de cápsulas que contengan excipientes tales como almidón, lactosa, ciertos tipos de arcilla y otros. Se pueden administrar por vía sublingual en forma de tabletas o pastillas en las cuales el ingrediente activo está mezclado con azúcar o con jarabes de maíz, agentes aromatizantes y colorantes; a continuación se deshidrata suficientemente como para hacerle apropiado para una compresión y una forma sólida. Se pueden administrar por vía oral en forma de soluciones que pueden contener agentes colorantes y aromatizantes o pueden ser inyectados por vía parenteral, es decir intramuscular, intravenosa o subcutánea. Para una administración parenteral, se pueden utilizar en forma de una solución estéril que contenga otros solutos, por ejemplo, una cantidad suficiente de sales o de glucosa como para que la solución sea isotónica.

El médico determinará la dosis de los presentes agentes terapéuticos que será mas apropiada y que variará según la vía de administración y el compuesto particular elegido, y además, variará según el paciente particular sometido al tratamiento. Es deseable generalmente comenzar el tratamiento con dosis pequeñas substancialmente menores que la dosis óptima del compuesto y aumentar la dosis progresivamente hasta la obtención del efecto óptimo en las circunstancias particulares. Se observará, en general, que cuando la composición sea administrada por vía oral, se requerirán cantidades mayores de agente activo para producir el mismo efecto que una cantidad inferior administrada por vía parenteral.

Claims (32)

1. Proteína receptora bek humana aislada, que comprende un dominio citoplasmático, que presenta una actividad de la proteína kinasa, una inserción de kinasa, un dominio transmembranal y un dominio extracelular que tiene tres repeticiones de tipo inmunoglobulina y que tiene la secuencia de aminoácidos como muestra la figura 2A.

2. Fragmento proteico del receptor según la reivindicación 1, que no tiene mas que un dominio extracelular y un dominio transmembranal.

3. Fragmento proteico del receptor según la reivindicación 1, que no tiene mas que un dominio citoplasmático.

4. Secuencia de ADN o de ARNm aislada, que codifica una proteína receptora bek humana, presentando dicha proteína un dominio citoplásmico, que presenta una actividad de la proteína kinasa, una inserción de kinasa, un dominio transmembranal y un dominio extracelular que tiene tres repeticiones de tipo imunoglobulina, teniendo dicha proteína la secuencia de aminoácidos como muestra la figura 2A.

5. ADN según la reivindicación 4, que tiene la secuencia nucleotídica de la figura 8.

6. ADN aislado, que codifica el fragmento de la reivindicación 2.

7. ADN aislado, que codifica el fragmento de la reivindicación 3.

8. Vector que comprende el ADN según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7.

9. Vector según la reivindicación 8, caracterizado porque dicho vector es un vector de expresión.

10. Célula huésped recombinante, transformada por el vector según una cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9.

11. Célula huésped según la reivindicación 10, caracterizada porque dicha célula huésped es una célula procariota.

12. Célula huésped según la reivindicación 10, caracterizada porque dicha célula huésped es una célula eucariota.

13. Célula huésped según la reivindicación 11, caracterizada porque dicho huésped es Escherichia, Bacillus o Streptomyces.

14. Célula huésped según la reivindicación 12, caracterizada porque el huésped es una célula de levadura o de vertebrado en cultivo.

15. Célula huésped según la reivindicación 14, caracterizada porque la célula huésped es una célula de ratón en cultivo.

16. Composición terapéutica, que comprende el dominio extracelular de una proteína receptora bek humana que presenta la secuencia de aminoácido como muestra la figura 2A, en una cantidad eficaz para inhibir las respuestas celulares indeseables mediadas por el factor de crecimiento que se enlaza a la heparina, y un soporte farmacéuticamente aceptable.

17. Composición según la reivindicación 16, caracterizada porque dicha respuesta indeseable se elige del grupo constituido por angiogenesis y vascularización de tumores estimuladas por factores de crecimiento, por efectos mitógenos durante la soriasis, por artritis, por aterosclerosis, por hipertrofia prostática benigna.

18. Composición terapéutica que comprende el dominio extracelular de una proteína receptora bek humana, que presenta la secuencia de aminoácidos como muestra la figura 2A, en una cantidad eficaz para inhibir el enlace de un patógeno oportunista a las células humanas que portan dicha proteína receptora y un soporte farmacéuticamente aceptable.

19. Composición según la reivindicación 18, caracterizada porque dicho patógeno es un virus.

20. Composición según la reivindicación 19, caracterizada porque dicho virus es el virus del herpes simples.

21. Utilización de un dominio extracelular de una proteína receptora bek humana que presenta la secuencia de aminoácidos como muestra la figura 2A, en una cantidad eficaz para inhibir las respuestas celulares indeseables mediadas por el factor de crecimiento que se enlaza con la heparina, para la preparación de una composición terapéutica destinadas al tratamiento de un paciente afectado por la enfermedad caracterizada por una respuesta celular indeseable mediada por el factor de crecimiento que se enlaza con la heparina, caracterizada porque dicha respuesta indeseable se elige del grupo constituido por angiogenesis y vascularización de tumores estimuladas por factores de crecimiento, por efectos mitógenos durante la soriasis, por artritis, por aterosclerosis y por hipertrofia prostática benigna.

22. Utilización de un dominio extracelular de una proteína receptora bek humana, que presenta la secuencia de aminoácidos como lo muestra la figura 2A, en una cantidad eficaz para inhibir el enlace de un patógeno oportunista a las células humanas que portan dicha proteína receptora, para la preparación de una composición terapéutica destinada al tratamiento de un paciente afectado por una infección por patógeno oportunista, siendo capaz dicho patógeno de enlazarse con un receptor del factor de crecimiento que se enlaza con la heparina.

23. Procedimiento in vitro de selección de medicamentos que inhiben el enlace del factor de crecimiento de los fibroblastos a los receptores bek celulares que presentan la secuencia de aminoácidos como muestra la figura 2A y que comprende las etapas que consisten en:

a)

incubar el medicamento con células huésped susceptibles de sobreexpresar los receptores del factor de crecimiento de los fibroblastos en presencia de un factor de crecimiento de los fibroblastos y

b)

medir la capacidad del medicamento para inhibir el enlace del factor de crecimiento de los fibroblastos.

24. Procedimiento según la reivindicación 23, caracterizado porque dicha capacidad inhibidora se mide por detención del enlace reducido de FGF marcado por un reactivo detectable por el análisis.

25. Procedimiento según la reivindicación 24, caracterizado porque dicho reactivo es un isótopo radioactivo.

26. Procedimiento según la reivindicación 23, caracterizado porque dicha capacidad para inhibir se mide por detección de una disminución de la respuesta intracelular mediada por FGF.

27. Procedimiento in vitro de selección de medicamentos que inhiben el enlace de patógenos oportunistas a los receptores bek celulares, que presentan la secuencia de aminoácidos como muestra la figura 2A, que comprende las etapas que consisten en:

(a)

incubar el medicamento con células huésped susceptibles de sobreexpresar los receptores bek que presentan la secuencia de aminoácidos como muestra la figura 2A, en presencia de dicho patógeno, y

(b)

medir la capacidad del medicamento para inhibir el enlace del patógeno.

28. Procedimiento según la reivindicación 27, caracterizado porque dicha capacidad inhibidora se mide por detección del enlace reducido de un patógeno marcado con un reactivo detectable por el análisis.

29. Procedimiento según la reivindicación 28, caracterizado porque dicho reactivo es un isótopo radioactivo.

30. Procedimiento según la reivindicación 27, caracterizado porque dicha capacidad inhibidora se mide por detección de una reducción del poder infeccioso del patógeno.

31. Procedimiento según la reivindicación 27, caracterizado porque dicho patógeno es un virus.

32. Procedimiento según la reivindicación 31, caracterizado porque dicho virus es el virus del herpes simplex.