ES2327440T3 - Factor recombinante de crecimiento de las celulas endoteliales vasculares-d (vegf-d). - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo específicamente reactivo con una secuencia madura de VEGF-D derivada de un fragmento contenido dentro de los residuos 92-205 de SEQ ID NO. 5 para inhibición de la angiogénesis y/o neovascularización o para inhibición de la proliferación de células endoteliales en un mamífero.

Description

Factor recombinante de crecimiento de las células endoteliales vasculares-D (VEGF-D).

Esta invención se refiere a usos de una porción de un nuevo factor de crecimiento endotelial vascular. Se describen también DNA modificante del factor, composiciones farmacéuticas y diagnósticas y métodos que utilizan o se derivan del factor.

Antecedentes de la invención

La angiogénesis es un proceso fundamental requerido para el crecimiento y desarrollo normales de los tejidos, e implica la proliferación de capilares nuevos a partir de vasos sanguíneos preexistentes. La angiogénesis no sólo está implicada en el desarrollo embrionario y el crecimiento, reparación y regeneración normales de los tejidos, sino que está implicada también en el ciclo reproductor femenino, el establecimiento y mantenimiento del embarazo, y en la reparación de heridas y fracturas. Además de la angiogénesis que tiene lugar en el individuo normal, están implicados sucesos angiogénicos en cierto número de procesos patológicos, particularmente el crecimiento y la metástasis de los tumores, y otras condiciones en las cuales la proliferación de vasos sanguíneos, especialmente del sistema microvascular, está incrementada, tales como retinopatía diabética, psoriasis y artropatías. La inhibición de la angiogénesis es útil en la prevención o el alivio de estos procesos patológicos.

Por otra parte, la promoción de la angiogénesis es deseable en situaciones en las cuales la vascularización debe establecerse o extenderse, por ejemplo después de trasplante de tejidos u órganos, o para estimular el establecimiento de la circulación colateral en el infarto tisular o la estenosis arterial, tal como en la enfermedad cardiaca coronaria y la tromboangitis obliterante.

Debido al papel crucial de la angiogénesis en tantos procesos patológicos, los factores implicados en el control de la angiogénesis han sido investigados intensamente. Se ha demostrado que cierto número de factores de crecimiento están involucrados en la regulación de la angiogénesis; éstos incluyen factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factor \alpha del crecimiento transformante (TGF\alpha), y factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF). Véase por ejemplo, Folkman et al, "Angiogenesis", J. Biol. Chem., 1992, 267, 10931-10934 para una revisión.

Se ha sugerido que una familia particular de factores de crecimiento endotelial específicos de células y sus receptores correspondientes es fundamentalmente responsable de la estimulación del crecimiento y la diferenciación de las células endoteliales, y de ciertas funciones de las células diferenciadas. Estos factores son miembros de la familia PDGF, y parecen actuar por la vía de tirosina-quinasas receptoras endoteliales (RTKs). Hasta ahora, se han identificado cuatro subtipos de factor de crecimiento endotelial vascular. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), conocido actualmente como VEGF-A, ha sido aislado de varias fuentes. VEGF-A exhibe actividad mitógena altamente específica contra las células endoteliales y puede estimular la secuencia total de sucesos que conducen a la angiogénesis. Adicionalmente, el mismo presenta actividad quimioatractiva frente a los monocitos, puede inducir el activador del plasminógeno y el inhibidor del activador del plasminógeno en las células endoteliales, y puede influir también en la permeabilidad vascular. Debido a la última actividad, se hace referencia a veces al mismo como factor de permeabilidad vascular (VTF). El aislamiento y las propiedades de VEGF han sido revisados; véase Ferrara et al, Ferrara et al, "The Vascular Endothelial Growth Factor Family of Polypeptides", J. Cellular Biochem., 1991 47 211-218 y Connolly, "Vascular Permeability Factor: A Unique Regulator of Blood Vessel Function", J. Cellular Biochem., 1991 47 219-223.

En fecha más reciente, se han identificado tres miembros adicionales de la familia VEGF. Éstos se designan VEGF-B, descrito en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US96/02957 (W0 96/26736) por Ludwig Institute for Cancer Research y la Universidad de Helsinki, VEGF-C, descrito en Joukov et al, The EMBO Journal, 1996 15 290-298, y VEGF2, descrito en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US94/05291 (WO 95/24473) por Human Genome Sciences, Inc. VEGF-B tiene propiedades angiogénicas y de otros tipos estrechamente similares a las de VEGF, pero está distribuido y expresado en los tejidos de modo distinto que VEGF. En particular, VEGF-B se expresa muy intensamente en el corazón, y sólo débilmente en el pulmón, en tanto que sucede lo contrario en el caso de VEGF. Esto sugiere que VEGF y VEGF-B, a pesar del hecho de que se coexpresan en muchos tejidos, pueden tener diferencias funcionales.

VEGF-B se aisló utilizando una técnica de cribado con trampa de interacción co-híbrida de levadura, cribado para proteínas celulares que podrían interaccionar con la proteína tipo I de fijación de ácido retinoico celular (CRABP-I). Su aislamiento y sus características se describen en detalle en PCT/US 96/02597 y en Olofsson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. 1996, 93, 2576-2581.

VEGF-C se aisló de medios acondicionados de la línea de células de adenocarcinoma de próstata PC-3 (CRL1435) por cribado respecto a la capacidad del medio para producir la fosforilación de la tirosina de la tirosina-quinasa del receptor específico de las células endoteliales Flt, utilizando células transfectadas para expresar Flt4. VEGF-C se purificó utilizando cromatografía de afinidad con Flt4 recombinante, y se clonó a partir de una biblioteca de cDNA de PC-3. Su aislamiento y características se describen en detalle en Joukov et al, The EMBO Journal, 1996, 15, 290-298.

VEGF2 se aisló de una línea de células de cáncer de mama humano altamente tumorígena, independiente de estrógenos. Si bien se afirma que esta molécula tiene aproximadamente 22% de homología a PDGF y 30% de homología a VEGF, el método de aislamiento del gen que codifica VEGF2 no está claro, y no se ha descrito caracterización alguna de la actividad biológica.

Los factores de crecimiento endotelial vascular parecen actuar por fijación a tirosina-quinasas receptoras de la familia de los receptores de PDGF. Han sido identificadas 5 tirosina-quinasas receptoras específicas de las células endoteliales, a saber Flt-1 (VEGFR-1), KDR/Flk-1 (VEGFR-2), Flt4 (VEGFR-3), Tie y Tek/Tie-2. Todas éstas tienen la actividad intrínseca de la tirosina-quinasa que es necesaria para la transducción de señales. El papel esencial, específico en la vasculogénesis y angiogénesis de Flt-1, Flk-1, Tie y Tek/Tie-2 ha sido demostrado por mutaciones direccionadas que desactivan estos receptores en embriones de ratón. VEGFR-1 y VEGFR-2 fijan VEGF con afinidad alta, y VEGFR-1 fija también VEGF-B y el factor de crecimiento de la placenta (PlGF). Se ha demostrado que VEGF-C es el ligando para Flt4 (VEGFR-3), y activa también VEGFR-2 (Joukov et al, 1996). Un ligando para Tek/Tie-2 ha sido descrito por Regeneron Pharmaceuticals, Inc.); sin embargo, el ligando para Tie no ha sido identificado todavía.

El receptor Flt-4 se expresa en los endotelios venoso y linfático del feto, y predominantemente en los endotelios linfáticos del adulto (Kaipainen et al, Cancer Res, 1994 54 6571-6577; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 1995 92, 3566-3570). Se ha sugerido que VEGF-C puede tener una función primaria en el endotelio linfático y una función secundaria en la regulación de la angiogénesis y la permeabilidad que es compartida con VEGF (Joukov, et al, 1996).

Los autores de la presente invención han aislado ahora cDNA humano que codifica una nueva proteína de la familia de los factores de crecimiento endotelial vascular. La nueva proteína, designada VEGF-D, tiene semejanzas estructurales con otros miembros de esta familia.

Sumario de la invención

La invención proporciona un anticuerpo para usos como se indica en las reivindicaciones 1 a 8 y un polipéptido para usos como se indica en las reivindicaciones 9 a 15.

De acuerdo con un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo específicamente reactivo con una secuencia madura de VEGF-D derivada de un fragmento contenido dentro de los residuos 92-205 de SEQ ID NO: 5, para inhibir la angiogénesis y/o la neovascularización, o para inhibir la proliferación de células endoteliales en un mamífero.

De acuerdo con un segundo aspecto, la invención proporciona un anticuerpo específicamente reactivo con una secuencia madura de VEGF-D derivada de un fragmento contenido dentro de los residuos 92-205 de SEQ ID NO: 5, para prevenir o aliviar el crecimiento y/o la metástasis de los tumores.

De acuerdo con un tercer aspecto, la invención proporciona un polipéptido que comprende una secuencia de amino-ácidos que corresponde a una secuencia madura de VEGF-D derivada de un fragmento contenido dentro de los residuos 92-205 de SEQ ID NO: 5, para estimulación de la angiogénesis y/o la neovascularización, o para estimulación de la proliferación de células endoteliales en un mamífero.

Se describe en esta memoria un factor de crecimiento aislado que tiene la capacidad de estimular y/o intensificar la proliferación de células endoteliales, secuencias de DNA aisladas que codifican el factor de crecimiento, y composiciones útiles para aplicaciones diagnósticas y/o terapéuticas.

Se describe también una molécula de ácido nucleico aislada y purificada que codifica un nuevo polipéptido, designado VEGF-D, que es estructuralmente homólogo a VEGF, VEGF-B y VEGF-C. La molécula de ácido nucleico puede ser un cDNA que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 o SEQ ID NO. 7. Se describen también moléculas de DNA de secuencia tal que se hibridan en condiciones severas con el DNA de SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 o SEQ ID NO. 7. La molécula de DNA capaz de hibridarse en condiciones severas puede codificar la porción de VEGF-D desde el residuo de aminoácido 93 al residuo de aminoácido 201, enlazado operativamente de modo opcional a una secuencia de DNA que codifica el péptido FLAG^{TM}.

El cDNA pude comprender la secuencia expuesta en SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 o SEQ ID NO. 7.

Se describe en esta memoria un polipéptido que posee la secuencia característica de aminoácidos:

\vskip1.000000\baselineskip

Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys

(SEQ ID NO. 2),

\vskip1.000000\baselineskip

teniendo dicho polipéptido la capacidad de estimular la proliferación de células endoteliales, y comprendiendo dicho polipéptido una secuencia de aminoácidos que corresponde sustancialmente a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO. 3, o un fragmento o análogo de la misma que tiene la capacidad de estimular una o más de proliferación, diferenciación, migración o supervivencia de células endoteliales.

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Se hace referencia aquí a estas capacidades como "actividades biológicas de VEGF-D" y pueden ser testadas fácilmente por métodos conocidos en la técnica. El polipéptido puede tener la capacidad para estimular proliferación o diferenciación de células endoteliales, con inclusión, pero sin carácter limitante, de la proliferación o diferenciación de las células endoteliales vasculares y/o células endoteliales linfáticas.

El polipéptido puede tener la secuencia indicada en SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 8 o SEQ ID NO. 9.

Un fragmento preferido del polipéptido de acuerdo con la invención es la porción de VEGF-D desde el residuo de aminoácido 93 al residuo de aminoácido 201, enlazada opcionalmente al péptido FLAG^{TM}. En el caso en que el fragmento está enlazado a FLAG^{TM}, el fragmento es VEGFD\DeltaN\DeltaC, como se define en esta memoria.

Se describen también en esta memoria polipéptidos que comprenden sustituciones conservadoras, inserciones o deleciones, pero que retienen todavía la actividad biológica de VEGF-D. La persona experta en la técnica será perfectamente conocedora de métodos que pueden utilizarse fácilmente para generar tales polipéptidos, por ejemplo el uso de mutagénesis orientada, o escisión enzimática y ligación específicas. La persona experta conocerá también que compuestos peptidomiméticos o compuestos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos están reemplazados por un aminoácido no existente naturalmente o un análogo de aminoácido pueden retener los aspectos requeridos de la actividad biológica de VEGF-D. Tales compuestos pueden producirse y testarse fácilmente por métodos conocidos en la técnica.

Se describen también formas variantes del polipéptido VEGF-D que resultan de corte y empalme (remodelación) alternativos, como se sabe que existen en el caso de VEGF, y variantes alélicas existentes naturalmente de la secuencia de ácido nucleico codificante de VEGF-D. Las variantes alélicas son bien conocidas en la técnica, y representan formas alternativas o una secuencia de ácido nucleico que comprenden sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos, pero que no conducen a alteración funcional sustancial alguna del polipéptido codificado.

Como se utiliza en esta memoria, "VEGF-D" se refiere colectivamente a los polipéptidos de SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 8 y SEQ ID NO. 9 y fragmentos o análogos de los mismos que tienen la actividad biológica de VEGF-D como se define en esta memoria.

Tales formas variantes de VEGF-D pueden prepararse por direccionamiento de regiones no esenciales del polipéptido VEGF-D para modificación. Estas regiones no esenciales se espera que caigan fuera de las regiones fuertemente conservadas indicadas en las figuras de esta memoria, especialmente en la Figura 2 y la Figura 10. En particular, los factores de crecimiento de la familia PDGF, con inclusión de VEGF, son dímeros, y VEGF-B, VEGF-C, PlGF, PDFG-A y PDGF-B exhiben una conservación completa de 8 residuos cisteína en los dominios N-terminales, es decir, los dominios semejantes a PDGF (Olofsson et al, 1996; Joukov et al, 1996). Estas cisteínas se cree que están implicadas en la formación de enlaces disulfuro intra- e inter-moleculares. Adicionalmente, existen otros residuos cisteína altamente, pero no totalmente, conservados en los dominios C-terminales. Los bucles 1, 2 y 3 de cada subunidad, que están formados por enlaces disulfuro intra-moleculares, están implicados en la fijación a los receptores para la familia PDGF/VEGF de factores de crecimiento (Andersson et al: Growth Factors, 1995, 12, 159-164). Como se muestra en esta memoria, las cisteínas conservadas en los miembros previamente conocidos de la familia VEGF están conservadas también en VEGF-D.

La persona experta en la técnica es por tanto perfectamente sabedora de que estos residuos cisteína deberían preservarse en cualquier forma variante propuesta, y que los sitios activos presentes en los bucles 1, 2 y 3 deberían estar preservados también. En cambio, puede esperarse que otras regiones de la molécula tengan menor importancia para la función biológica, y por consiguiente representen dianas adecuadas para modificación. Los polipéptidos modificados pueden testarse fácilmente en cuanto a su capacidad para exhibir la actividad biológica de VEGF-D por procedimientos de ensayo de actividad rutinarios tales como tests de proliferación celular.

Se contempla que algunos polipéptidos VEGF-D modificados tendrán la capacidad de fijarse a células endoteliales, es decir a receptores VEGF-D, pero serán incapaces de estimular la proliferación, diferenciación, migración o supervivencia de las células endoteliales. Estos polipéptidos modificados se espera que sean capaces de actuar como inhibidores competitivos o no competitivos de VEGF-D, y sean útiles en situaciones en las que es deseable la prevención o reducción de la acción de VEGF-D. A dichas variantes de VEGF-D fijadoras de receptores pero no mitógenas, no inductoras de diferenciación, no inductoras de migración o no promotoras de supervivencia de VEGF-D se hace referencia en esta memoria como "variantes de fijación de receptores pero inactivas en otros aspectos".

Se describe en esta memoria un ácido nucleico purificado y aislado que codifica un polipéptido o fragmento de polipéptido descrito en esta memoria. El ácido nucleico puede ser DNA, DNA genómico, cDNA o RNA, y puede ser monocatenario o bicatenario. El ácido nucleico puede aislarse de una fuente celular o tisular, o de origen recombinante o sintético. Debido a la degeneración del código genético, la persona experta en la técnica apreciará que son posibles muchas secuencias codificantes de este tipo, en donde cada secuencia codifica la secuencia de aminoácidos que se muestra en SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 8 o SEQ ID NO. 9, un fragmento activo o análogo de las mismas, o una variante de fijación de receptores pero inactiva o parcialmente inactiva de las mismas en otros aspectos.

Se describen también en esta memoria vectores que comprenden el cDNA o un ácido nucleico como se describe en esta memoria, y células hospedadoras transformadas o transfectadas con ácidos nucleicos o vectores como se describen en esta memoria. Estas células son particularmente adecuadas para expresión del polipéptido de la invención, e incluyen células de insecto tales como células Sf9, que pueden obtenerse de la American Type Culture Collection (ATCC SRL-171), transformadas con un vector de baculovirus, y la línea de células de riñón embrionario humano 293EBNA transfectada por un plásmido de expresión adecuado. Los vectores pueden ser vectores de expresión en los cuales un ácido nucleico descrito en esta memoria está conectado operativamente a uno o más promotores apropiados y/u otras secuencias de control, tales que las células hospedadoras apropiadas transformadas o transfectadas con los vectores son capaces de expresar el polipéptido de la invención. Otros vectores pueden ser los adecuados para transfección de células de mamífero, o para terapia génica, tales como vectores de adenovirus o retrovirus, o liposomas. Una diversidad de vectores de este tipo se conocen en la técnica.

Un método de construcción de un vector capaz de expresar un polipéptido codificado por un ácido nucleico descrito en esta memoria comprende los pasos de conectar operativamente el ácido nucleico a uno o más promotores apropiados y/u otras secuencias de control como se ha descrito arriba.

Un método de construcción de un polipéptido de acuerdo con la invención comprende los pasos de expresar un ácido nucleico o vector descrito en esta memoria en una célula hospedadora, y aislar el polipéptido de la célula hospedadora o del medio de crecimiento de la célula hospedadora. El vector de expresión puede comprender adicionalmente una secuencia que codifica un marcador de afinidad, tal como FLAG^{TM} o hexahistidina, a fin de facilitar la purificación del polipéptido por cromatografía de afinidad.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo específicamente reactivo con un polipéptido de la invención. Tales anticuerpos son útiles como inhibidores o agonistas de VEGF-D y como agentes de diagnóstico para detección y cuantificación de VEGF-D. Pueden utilizarse anticuerpos policlonales o monoclonales. Pueden generarse anticuerpos monoclonales y policlonales contra los polipéptidos de la invención utilizando métodos estándar en la técnica. Para algunos propósitos, por ejemplo en los casos en que debe utilizarse un anticuerpo monoclonal para inhibir los efectos de VEGF-D en una situación clínica, puede ser deseable utilizar anticuerpos monoclonales humanizados o quiméricos. Métodos para la producción de éstos, con inclusión de métodos de DNA recombinante, son asimismo bien conocidos en la técnica.

Un anticuerpo de acuerdo con la invención puede marcarse convenientemente.

Los polipéptidos o anticuerpos de acuerdo con la invención pueden marcarse con un marcador detectable, y utilizarse para propósitos diagnósticos. Análogamente, el polipéptido de la invención así marcado puede utilizarse para identificar su receptor correspondiente in situ. El polipéptido o anticuerpo puede acoplarse covalentemente o no covalentemente o un agente adecuado supermagnético, paramagnético, electrónicamente denso, ecogénico o radiactivo para producción de imágenes. Para uso en ensayos diagnósticos, pueden utilizarse marcadores radiactivos o no radiactivos, incluyendo los últimos marcadores enzimáticos o marcadores del sistema biotina/avidina.

Aplicaciones clínicas de la invención incluyen aplicaciones diagnósticas, aceleración de la angiogénesis en la curación de las heridas, trasplante de tejidos u órganos, o para establecimiento de circulación colateral en el infarto tisular o estenosis arterial, tal como estenosis de arterias coronarias, e inhibición de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer o de la retinopatía diabética. La cuantificación de VEGF-D en especímenes de biopsias de cáncer puede ser útil como indicador del riesgo metastásico futuro.

Dado que VEGF-D se expresa en alta proporción en el pulmón, y aumenta también la permeabilidad vascular, el mismo es relevante para una diversidad de condiciones pulmonares. Podrían utilizarse ensayos de VEGF-D en la diagnosis de diversos trastornos del pulmón. Podría utilizarse también VEGF-D en el tratamiento de trastornos pulmonares para mejorar la circulación sanguínea en el pulmón y/o el intercambio de gases entre los pulmones y el torrente sanguíneo. Análogamente, podría utilizarse VEGF-D para mejorar la circulación sanguínea en el corazón y la permeabilidad al O_{2} gaseoso en casos de insuficiencia cardíaca. De modo análogo, podría utilizarse VEGF-D para mejorar el flujo sanguíneo y el intercambio de gases en la enfermedad obstructiva crónica de las vías aéreas.

Inversamente, los antagonistas (v.g. anticuerpos y/o inhibidores) de VEGF-D podrían utilizarse para el tratamiento en condiciones tales como la insuficiencia cardíaca congestiva, que implican acumulaciones de fluido en, por ejemplo, el pulmón, como resultado aumentos en la permeabilidad vascular, por ejercer un efecto de compensación de la permeabilidad vascular a fin de contrarrestar la acumulación de fluido.

VEGF-D se expresa también en el intestino delgado y el colon, y podrían utilizarse administraciones de VEGF-D para tratar los síndromes de malabsorción en el tracto intestinal como resultado de sus actividades de aumento de la circulación sanguínea y aumento de la permeabilidad vascular.

Se describe en esta memoria un método de estimulación de la angiogénesis y/o neovascularización en un mamífero que se encuentra en necesidad de dicho tratamiento, que comprende el paso de administrar al mamífero una dosis eficaz de VEGF-D, o un fragmento o análogo del mismo que tiene la capacidad de estimular la proliferación de células endoteliales.

VEGF-D puede administrarse junto con, o en asociación con, uno o más de VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, PlGF, PDGF, FGF y/o heparina.

Inversamente, se describe también un método de inhibición de la angiogénesis y/o neovascularización en un mamífero que se encuentra en necesidad de un tratamiento estético, que comprende el paso de administrar al mamífero una cantidad eficaz de un antagonista de VEGF-D. El antagonista puede ser cualquier agente que inhiba la acción de VEGF-D, sea por prevención de la fijación de VEGF-D a su receptor correspondiente o la célula diana, o por inhibición de la activación del transductor de la señal desde el receptor a su sitio de acción celular. Antagonistas adecuados incluyen, pero sin carácter limitante, anticuerpos dirigidos contra VEGF-D; inhibidores competitivos o no competitivos de la fijación de VEGF-D al receptor de VEGF-D, tales como las variantes de VEGF-D de fijación de receptores pero no mitógenas a que se ha hecho referencia arriba; y secuencias de nucleótidos antisentido complementarias a al menos una parte de la secuencia de DNA que codifica VEGF-D.

Un método de detección de VEGF-D en una muestra biológica comprende el paso de poner en contacto la muestra con un reactivo capaz de fijarse a VEGF-D, y detectar la fijación. Preferiblemente, el reactivo capaz de fijarse a VEGF-D es un anticuerpo dirigido contra VEGF-D, más preferiblemente un anticuerpo monoclonal. La fijación y/o la extensión de la fijación pueden ser detectadas por medio de un marcador detectable; marcadores adecuados se han expuesto anteriormente.

En el caso en que debe utilizarse VEGF-D o un antagonista para propósitos terapéuticos, la dosis y ruta de aplicación dependerán de la afección a tratar, y estarán a discreción del médico o veterinario encargado del tratamiento. Rutas adecuadas incluyen inyección subcutánea, intramuscular o intravenosa, aplicación tópica, implantes, etc. La aplicación tópica de VEGF-D puede utilizarse de manera análoga a VEGF.

Se describen también medios de diagnóstico/pronóstico típicamente en forma de kits de test. Por ejemplo, un kit de test diagnóstico/pronóstico comprende un anticuerpo para VEGF-D y medios para la detección, y puede comprender también medios para evaluación de la fijación entre el anticuerpo y VEGF-D. El anticuerpo o el VEGF-D se marca con un marcador detectable, y el anticuerpo o el VEGF-D se fija al sustrato, de tal modo que puede establecerse la interacción VEGF-D-anticuerpo por determinación de la cantidad de marcador unida al sustrato después de la fijación entre el anticuerpo y el VEGF-D. Los medios diagnóstico/pronóstico pueden proporcionarse como un kit ELISA convencional.

Alternativamente, los medios diagnóstico/pronóstico pueden comprender medios de reacción en cadena de polimerasa para establecer la estructura de la secuencia genómica de un gen VEGF-D de un individuo sometido a test y comparar esta estructura de secuencia con la descrita en esta solicitud a fin de detectar cualesquiera anormalidades, con vistas a establecer si cualquier aberración en la expresión de VEGF-D está relacionada con una condición de enfermedad dada.

Un método de detección de aberraciones en la estructura del gen VEGF-D en un individuo sometido a test que pueden estar asociadas con una condición de enfermedad en dicho individuo sometido a test comprende proporcionar una muestra de DNA de dicho individuo sometido a test; poner en contacto la muestra de DNA con un juego de iniciadores específicos para DNA de VEGF-D enlazados operativamente a una polimerasa y amplificar selectivamente el DNA de VEGF-D de la muestra por reacción en cadena de polimerasa, y comparar la secuencia de nucleótidos del DNA de VEGF-D amplificado de la muestra con las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4. Un kit de test comprende un par de iniciadores específicos para DNA de VEGF enlazados operativamente a una polimerasa, donde dicha polimerasa es capaz de amplificar selectivamente el DNA de VEGF-D a partir de una muestra de DNA.

Otro aspecto de la invención concierne al uso de un anticuerpo o un polipéptido de acuerdo con la invención en la provisión de una composición farmacéutica que comprende o bien el polipéptido VEGF-D de la invención que promueve la proliferación de células endoteliales o un anticuerpo para el mismo. Composiciones que comprenden polipéptido VEGF-D de acuerdo con la invención pueden comprender opcionalmente además uno o más de VEGF, VEGF-B y VEGF-C, y/o heparina.

Un dímero de proteína comprende el polipéptido VEGF-D, particularmente un dímero enlazado por disulfuro. Los dímeros de proteína incluyen tanto homodímeros del polipéptido VEGF-D como heterodímeros de VEGF-D y VEGF, VEGF-B, VEGF-C, PlGF o PDGF.

Un método para aislamiento de VEGF-D comprende el paso de exponer una célula que expresa VEGF-D a heparina a fin de facilitar la liberación de VEGF-D de la célula, y purificar el VEGF-D así liberado.

Se describe en esta memoria un vector que comprende una secuencia de nucleótidos antisentido que es complementaria a al menos una parte de una secuencia de DNA que codifica VEGF-D o un fragmento o análogo del mismo que promueve la proliferación de células endoteliales. Un vector de este tipo que comprende una secuencia antisentido puede utilizarse para inhibir, o al menos mitigar, la expresión de VEGF-D. El uso de un vector de este tipo para inhibir la expresión de VEGF-D se ve favorecido en casos en que la expresión de VEGF-D está asociada con una enfermedad, por ejemplo donde determinados tumores producen VEGF-D a fin de proporcionar angiogénesis. La transformación de tales células tumorales con un vector que contiene una secuencia de nucleótidos antisentido podría suprimir o retardar la angiogénesis, e inhibir o retardar así el crecimiento del tumor.

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Polinucleótidos tales como los arriba descritos, fragmentos de dichos polinucleótidos, y variantes de tales polinucleótidos con semejanza suficiente a la cadena no codificante de dichos polinucleótidos para hibridarse a la misma en condiciones severas son útiles todos ellos para identificar, purificar, y aislar polinucleótidos que incluyen otras formas de VEGF-D de mamífero no humanas. Condiciones de hibridación severas ilustrativas son como sigue: hibridación a 42ºC en 5X SSC, NaPO_{4} 20 mM, pH 6,8, 50% formamida; y lavado a 42ºC en 0,2X SSC. Los expertos en la técnica comprenderán que es deseable variar estas condiciones empíricamente basándose en la longitud y el contenido de bases nucleotídicas GC de las secuencias a hibridar, y que existen fórmulas para determinar dicha variación. Véase por ejemplo Sambrook et al, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989).

Se comprenderá claramente que los ácidos nucleicos y polipéptidos descritos en esta memoria y los polipéptidos de la invención pueden prepararse por medios sintéticos o por medios recombinantes, o pueden purificarse a partir de fuentes naturales.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra una comparación entre las secuencias de VEGF-D humano y VEGF_{165} humana (Figura 1a), VEGF-B humana (Figura 1b), VEGF-C humana (Figura 1c) y PlGF (Figura 1d). El recuadro indica residuos que coinciden exactamente con los de VEGF-D humano.

La Figura 2 muestra alineaciones de secuencia entre las secuencias de VEGF-D humano, VEGF_{165} humana, VEGF-B humana, VEGF-C humana y PlGF humana. Los recuadros indican residuos que coinciden exactamente con los de la secuencia VEGF-D; y

La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de VEGF-D humano (SEQ ID NO: 3), como se predice a partir de la secuencia de cDNA (SEQ ID NO: 1). Los recuadros indican sitios potenciales para glicosilación unida a N.

La Figura 4 muestra la secuencia de nucleótidos de una segunda secuencia de cDNA que codifica VEGF-D humano (SEQ ID NO 4), aislada por hibridación a partir de una biblioteca de cDNA de pulmón comercial humana; este cDNA contiene la región codificante entera para VEGF-D humano.

La Figura 5 muestra la secuencia de aminoácidos para VEGF-D humano (SEQ ID NO 5) deducida de la secuencia del cDNA de la Figura 4.

La Figura 6 muestra la secuencia de nucleótidos de cDNA codificante de VEGF-D1 de ratón (SEQ ID NO 6), aislada por cribado de hibridación para una biblioteca de cDNA de pulmón de ratón disponible comercialmente.

La Figura 7 muestra la secuencia de nucleótidos de cDNA codificante de VEGF-2 de ratón (SEQ ID NO 7), aislada de la misma biblioteca que en la Figura 6.

La Figura 8 muestra las secuencias de aminoácidos deducidas para VEGF-D1 (SEQ ID NO 8) y VEGF-D2 (SEQ ID NO 9)) de ratón.

La Figura 9 muestra una comparación entre las secuencias de aminoácidos deducidas de VEGF-D1 de ratón, VEGF-D2 de ratón y VEGF-D humano.

La Figura 10 muestra alineaciones de secuencias entre las secuencias de aminoácidos de VEGF-D humano, VEGF_{165} humana, VEGF-B humana, VEGF-C humana y PlGF humana, y

la Figura 11 muestra los resultados de un bioensayo en el cual se testó el medio acondicionado de células COS que expresan VEGF-A o VEGF-D respecto a capacidad para fijarse al dominio extracelular de un receptor quimérico expresado en células Ba/F3.

La Figura 12 muestra los resultados del análisis por inmunoprecipitación y transferencia Western de péptidos VEGF-D.

(A) Se transfectaron pEFBOSVEGFDfullFLAG y pCDNA-1VEGF-A en células COS y se marcaron biosintéticamente con ^{35}S-cisteína/metionina durante 4 horas. Los sobrenadantes de estos cultivos se sometieron a inmunoprecipitación con gel M2 o con un antisuero dirigido a VEGF-A acoplado a la proteína A. Las cuentas lavadas se eluyeron con un volumen igual de tampón de muestra 2 x SDS-PAGE y se hirvieron. Las muestras se resolvieron luego por SDS-PAGE al 12%. Las pistas marcadas con un asterisco (*) indican donde se redujeron las muestras con ditiotreitol y se alquilaron con yodoacetamida. Se indican los marcadores de peso molecular. fA y fB indican las especies de 43 kD y 25 kD inmunoprecipitadas por el gel M2 a partir de las células COS que expresaban pEFBOSVEGFDfullFLAG.

(B) Análisis por transferencia Western de VEGFD\Delta\alphaN\alphaC). Se combinó una parte alícuota del material eluido de la columna de afinidad M2 (fracción #3, VEGFD\alphaN\alphaC) con 2 x tampón de muestra SDS-PAGE y se resolvió en un gel de SDS-PAGE al 15%. Las proteínas se transfirieron luego a membrana de nitrocelulosa y se sondaron con anticuerpo monoclonal M2 o con un anticuerpo de control coincidente en isotipo (Neg). Se revelaron las transferencias utilizando un anticuerpo secundario anti-ratón-HRP de cabra y quimioluminiscencia (ECL, Amersham). El VEGFD\DeltaN\DeltaC monómero se designa por la punta de flecha, al igual que la forma dímera supuesta de este péptido (VEGFD\DeltaN\DeltaC''). Se indican los marcadores de peso molecular.

La Figura 13 muestra los resultados del análisis de VEGFD\DeltaN\DeltaC utilizando el bioensayo VEGFR2. La
VEGFD\DeltaN\DeltaC recombinante, y el material purificado por cromatografía de afinidad de M2, se evaluaron durante el bioensayo VEGFR2. Células del bioensayo (10^{4}), lavadas para eliminar IL-3, se incubaron con partes alícuotas de medio acondicionado a partir de células COS transfectadas con VEGF-D, fracción #1 de la columna de afinidad (volumen vacío) o fracción #3 de la columna de afinidad (que contenía VEGFD\DeltaN\DeltaC). Todas las muestras se testaron a una concentración inicial de 20% (es decir 1/5) seguida por diluciones al doble. Las células se dejaron incubar durante 48 horas a 37ºC en una atmósfera humidificada con 10% de CO_{2}. La proliferación celular se cuantificó por la adición de 1 \muCi de ^{3}H-timidina y recuento de la cantidad incorporada a lo largo de un periodo de 4 horas.

La Figura 14 muestra la estimulación de la fosforilación de la tirosina del receptor VEGFR3 (Flt4) en células NIH3T3 por el sobrenadante de cultivo de células HF infectadas con un vector recombinante de baculovirus transformado con VEGF-D.

La Figura 15 muestra la estimulación de la fosforilación de la tirosina del receptor VEGFR2 (KDR) en células PAE por el sobrenadante de cultivo preparado como en la Figura 14.

La Figura 16 muestra el efecto mitógeno de VEGFD\DeltaN\DeltaC en células endoteliales de aorta de bovino (BAEs). Se trataron BAEs con la fracción #3 que contenía VEGFD\DeltaN\DeltaC y, como control positivo, VEGF-A purificado como se describe en el texto. El resultado obtenido utilizando medio sin factor de crecimiento añadido se designa "Control de Medio".

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Descripción detallada de la invención

La invención se describirá a continuación en detalle con referencia a las Figuras, y a los ejemplos no limitantes siguientes. Algunos de los ejemplos son comparativos en la medida en que los mismos no corresponden a la invención tal como se reivindica.

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Ejemplo 1

(Comparativo)

Se ha especulado que no se encontrarán más miembros de la familia VEGF debido a que no existen receptores huérfanos conocidos en la familia VEGFR. Adicionalmente, los inventores no conocen con certeza sugestión alguna en la técnica anterior de que puedan existir otros miembros de una familia de este tipo.

Se llevó a cabo incidentalmente una investigación por ordenador de bases de datos de ácido nucleico para otro proyecto, utilizando como materias de investigación las secuencias de aminoácidos de VEGF, VEGF-B, VEGF-C y PlGF. Se identificaron varias secuencias de cDNA por esta investigación. Una de estas secuencias, Acceso a GenBank No. H24828, codificaba un polipéptido que era similar en estructura a la región C-terminal de VEGF-C enriquecida en cisteína. Esta secuencia se obtuvo de la base de datos de marcadores de secuencia expresados (dbEST), y para los propósitos de esta memoria descriptiva se designa XPT. El cDNA de XPT se había aislado de una biblioteca de cDNA humana designada "Soares Breast 3NbHBst", que se construyó utilizando mRNA de un tejido mamario de hembra humana adulta. Hasta donde puede comprobarse este era tejido mamario normal. La secuenciación del DNA de XPT se realizó de acuerdo con el Análisis Molecular Integrado del Consorcio de Expresión del Genoma (IMAGE Consortium), que solicita bibliotecas de cDNA de laboratorios de todo el mundo, dispone los clones de cDNA, y proporciona los mismos a otras organizaciones para secuenciación.

La secuencia XPT que se muestra en la base de datos tenía una longitud de 419 nucleótidos, y codificaba una secuencia de aminoácidos similar a los 100 aminoácidos C-terminales de VEGF-C, es decir aproximadamente los residuos 250 a 350, utilizando el sistema de numeración de Joukov et al (1996). Se encuentran análogamente regiones ricas en cisteína en otras proteínas, que carecen totalmente de relación en función con la familia VEGF, por ejemplo la proteína secretada semejante a seda sp185 sintetizada en las glándulas salivares del jején Chironomus tentans. Esta proteína es codificada por el gen BR3, localizado en un anillo de Balbiani, un "puff" de cromosomas específico de tejido encontrado en los cromosomas politénicos de la glándula salivar del jején (Dignam y Case: Gene, 1990, 88, 133-140; Paulsson et al, J. Mol. Biol., 1990 211, 331-349). Se afirma en Joukov et al (1996) que el resto estructural semejante a sp185 en VEGF-C puede plegarse en un dominio independiente, que se cree se encuentra al menos parcialmente escindido después de la biosíntesis, y que existe al menos un resto cisteína del tipo sp185 en la región C-terminal de VEGF.

La Figura 3 de Joukov et al muestra que los dos tercios finales de la región C-terminal rica en cisteína de VEGF-C no están alineados con VEGF o PlGF y de hecho podrían considerarse como una extensión C-terminal de VEGF-C que no está presente en VEGF o PlGF. La secuencia codificada por XPT es similar a esta extensión. Dado que el cDNA de XPT estaba truncado en su extremo 5', no era posible deducir o predecir cualquier secuencia de aminoácidos para regiones N-terminales respecto al dominio rico en cisteína. Así, la porción de VEGF-C que es similar a la secuencia derivada de XPT no se extiende a las regiones de VEGF-C que están conservadas entre otros miembros de la familia VEGF.

Como se ha descrito arriba, no era posible predecir si la región N-terminal de polipéptido codificado por un ácido nucleico de XPT de longitud total (en lo que se diferencia del cDNA truncado de XPT consignado en dbEST) podría mostrar cualquier homología adicional con cualquier miembro de la familia VEGF, en particular VEGF-C, que tiene 250 aminoácidos N-terminales adicionales. Por ejemplo, la proteína existente naturalmente codificada por un ácido nucleico de XPT de longitud total podría haber sido el homólogo humano de la proteína de la glándula salivar del jején. Alternativamente, el tipo de resto rico en cisteína codificado por el cDNA de XPT truncado podría estar distribuido ampliamente entre las proteínas, al igual que muchos dominios estructurales. Por ejemplo, agrupaciones de residuos cisteína pueden estar implicadas en la fijación de metales, formación de enlaces disulfuro intramoleculares para promover el plegado exacto de las proteínas, o la formación de enlaces disulfuro intermoleculares para ensamblaje de subunidades de proteínas en complejos (Dignam y Chase, 1990). Con objeto de determinar si el cDNA truncado de XPT se derivaba de secuencias codificantes de una molécula afín a VEGF, fue necesario aislar un cDNA de longitud mucho mayor.

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Ejemplo 2 Clonación de cDNA Codificante de VEGF-D (comparativo)

Una muestra del cDNA de XPT consignada en dbEST se obtuvo de la American Type Culture Collection, que es un suministrador registrado de clones de cDNA obtenidos por el IMAGE Consortium. La identidad del cDNA de XPT se confirmó por secuenciación de nucleótidos, utilizando el método de terminación de cadenas didesoxi (Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463-5467).

El cDNA de XPT se utilizó como sonda de hibridación para cribar una biblioteca de cDNA de mama humana, que se obtuvo comercialmente de Clontech. Se aisló un clon positivo, y este clon se secuenció luego en ambas cadenas. Se recopiló la secuencia de nucleótidos, y se identificó un marco de lectura abierto. La secuencia de ácido nucleico se expone en SEQ ID NO. 1. El polipéptido codificado por esta secuencia se designó VEGF-D, y su secuencia deducida de aminoácidos, designada SEQ ID NO. 3, se presenta en la Figura 3. En la Figura 3, los sitios supuestos de glicosilación enlazados a N, con la secuencia de consenso N-X-S/T, en la cual X es cualquier aminoácido, se indican por los recuadros.

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Ejemplo 3 Características de VEGF-D (comparativo)

La secuencia de aminoácidos de VEGF-D se comparó con las de VEGF-A_{165}, VEGF-B, VEGF-C y PlGF humanas. Estas comparaciones se exponen en las Figuras 1a a d respectivamente. Se calculó el grado de homología de secuencia se calculó, y si las lagunas en la secuencia introducidas para los propósitos de alineación no se consideran en el cálculo, VEGF-D tiene identidad de 31% con VEGF, identidad de 48% con respecto a VEGF-C, identidad de 28% con respecto a VEGF-B e identidad de 32% con respecto a PlGF. Así pues, la proteína más estrechamente afín identificada era VEGF-C.

Búsquedas por ordenador de las bases de datos de ácido nucleico GenBank, EMBL y SwissProt no revelaron ninguna secuencia de proteína idéntica a VEGF-D. Como era de esperar por la alineación de secuencias a que se ha hecho referencia anteriormente, la proteína más estrechamente afín encontrada en esta base de datos era VEGF-C. Se realizaron también búsquedas de dbEST, pero no revelaron secuencia alguna que abarcara la región codificante completa de VEGF-D. La secuencia de VEGF-D no está relacionada con la del ligando 1 de Tie-2 como se describe en WO 96/11269.

Es importante tener en cuenta que las únicas homologías detectadas se encontraban al nivel de la secuencia de aminoácidos. Por tanto, no habría sido posible aislar el cDNA o gDNA codificante de VEGF-D por métodos tales como hibridación a baja severidad con una secuencia de ácido nucleico codificante de otro miembro de la familia VEGF.

VEGF-D parece ser el más estrechamente relacionado con los VEGF-C de todos los miembros de la familia VEGF. Dado que la secuencia de aminoácidos de VEGF-D incluye el resto semejante a sp185 rico en cisteína que se encuentra en VEGF-C, el polipéptido de la invención puede jugar un papel funcional importante en los endotelios linfáticos. Si bien no se pretende quedar ligados por mecanismo propuesto alguno, se cree que VEGF-C y VEGF-D pueden constituir una matriz de tipo seda sobre la cual pueden crecer las células endoteliales. Los vasos linfáticos no tienen membrana basal alguna, por lo que la matriz de tipo seda puede formar un material base semejante a una membrana. Esto puede ser importante en la promoción del crecimiento celular y/o en la diferenciación celular, y puede ser relevante para el cáncer, especialmente las metástasis, la terapia con fármacos, la prognosis del cáncer, etc.

Ejemplo 4 Características Biológicas de VEGF-D (comparativo)

La secuencia de cDNA de VEGF-D se utilizó para predecir la secuencia de aminoácidos deducida de VEGF-D, las características bioquímicas del polipéptido codificado, con inclusión de los números de aminoácidos fuertemente básicos, fuertemente ácidos, hidrófobos y polares, el peso molecular, el punto isoeléctrico, la carga a pH 7, y el análisis de la composición de la proteína total. Este análisis se realizó utilizando el programa de análisis de proteínas Protean, Version 1.20 (DATASTAR). Estos resultados se resumen a continuación en las Tablas 1 y 2. La Tabla 1 muestra también el uso de codones.

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TABLA 1 Secuencia de DNA Traducida del cóntigo x de VEGF-D (1,978) Con el Código Genético Estándar

Peso molecular 37056, 60 Daltons

425 aminoácidos

46 aminoácidos básicos fuertes (+)(K, R)

41 aminoácidos ácidos fuertes (-)(D, E)

79 aminoácidos hidrófobos (A, I, L, F, W, V)

108 aminoácidos polares (N, C, Q, S, T, Y)

Punto Isoeléctrico 7,792

Carga a pH 7,0 6,371

El número total de bases traducidas es 978

%A = 28,73 [281]

%G = 23,11 [226]

%T = 23,21 [227]

%C = 24,95 [244]

% Ambiguo = 0,00 [0]

%A+T = 51,94 [508]

% C+G = 48,06 [470]

Temp. de fusión Davis, Botstein, Roth, ºC

84,09

Temp. Wallace, ºC

3384,00

TABLA 1 (continuación)

1

Cóntigo 2:

Longitud del cóntigo:

2379 bases

Longitud media/secuencia:

354 bases

Longitud total de la secuencia:

4969 bases

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TABLA 2 Clase Estructural Predicha de la Proteína Total: Modificación de Deléage & Roux de Nishikawa & Ooi 1987

2

TABLA 2 (continuación) Análisis de Composición de la Proteína Total

3

Este análisis predice un peso molecular para el monómero de VEGF-D no procesado de 37 kilodaltons (kD), comparado con los valores determinados experimentalmente (para los péptidos totalmente procesados) de 20 a 27 kD para monómeros de VEGF-A, 21 kD para el monómero de VEGF-B y 23 kD para el monómero de VEGF-C.

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Ejemplo 5

(Comparativo)

El aislamiento original de un cDNA para VEGF-D, descrito en el Ejemplo 2 implicaba el cribado de hibridación de una biblioteca de cDNA de mama humano. Dado que se aisló de este modo únicamente un solo clon de cDNA para VEGF-D, no fue posible confirmar la estructura del cDNA por comparación con otros cDNAs de VEGF-D aislados independientemente. El trabajo descrito en este ejemplo, que implicaba aislamiento de clones de cDNA de VEGF-D humano adicionales, se llevó a cabo con objeto de confirmar la estructura del cDNA de VEGF-D humano. Adicionalmente, se aislaron clones de cDNA de VEGF-D de ratón.

Dos bibliotecas de cDNA que se habían obtenido comercialmente de Stratagene, una para pulmón humano y una para pulmón de ratón (números de catálogo 937210 y 936307, respectivamente), se utilizaron para cribado de hibridación con una sonda de cDNA de VEGF-D. La sonda, que abarcaba desde los nucleótidos 1817 a 2495 de CDNA para VEGF-D humano descrito en el Ejemplo 2, se generó por reacción en cadena de polimerasa (PCR) utilizando un plásmido que contenía el cDNA de VEGF-D como molde y los dos oligonucleótidos siguientes:

4

Aproximadamente dos millones de bacteriófagos recombinantes se cribaron con esta sonda de cada una de las dos bibliotecas de cDNA. Se aislaron subsiguientemente nueve clones de cDNA humanos y seis de ratón para VEGF-D.

Dos de los nueve clones humanos de cDNA para VEGF-D se secuenciaron completamente utilizando el método de terminación de cadenas didesoxi (Sanger et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463-5467). Los dos cDNAs contenían la región codificante entera para VEGF-D humano, y eran idénticos excepto que uno de los clones era cinco nucleótidos más largo que el otro en el término 5'. La secuencia de nucleótidos del cDNA más corto se muestra en la Figura 4, y se designa como SEQ ID NO. 4. La secuencia de aminoácidos para VEGF-D humano (hVEGF-D) deducida de este cDNA tenía una longitud de 354 residuos, y se muestra en la Figura 5; ésta se designa como SEQ ID NO. 5. Se determinaron también las secuencias de las regiones 5' de cinco de los otros clones de cDNA de VEGF-D humanos. Para cada clon, la secuencia que se caracterizó contenía más de 100 nucleótidos de DNA inmediatamente aguas abajo del sitio de comienzo de la traducción de la región codificante. En todos los casos, las secuencias de estas regiones eran idénticas a regiones correspondientes del cDNA de VEGF-D humano que se muestra en la Figura 4.

Los seis clones de cDNA de ratón para VEGF-D se secuenciaron completamente. Sólo dos de los clones contenían una región codificante entera para VEGF-D; los otros clones estaban truncados. Las secuencias de nucleótidos de los dos clones con la región codificante entera son diferentes, y codifican secuencias de aminoácidos de tamaños diferentes. La secuencia de aminoácidos más larga se designa como mVEGF-D1, y la secuencia más corta se designa mVEGF-D2. Las secuencias de nucleótidos de los cDNAs que codifican un mVEGF-1 y mVEGF-2 se muestran en las Figuras 6 y 7 respectivamente. Las secuencias de aminoácidos deducidas para mVEGF-D1 y mVEGF-2 se muestran en la Figura 8. Estas secuencias se designan respectivamente SEQ ID Nos. 6, 7, 8 y 9. Las diferencias entre las secuencias de aminoácidos son:

i) una inserción de cinco aminoácidos (DFSFE) después del residuo 30 en mVEGF-D1 en comparación con mVEGF-D2;

ii) divergencia completa de los extremos C-terminales después del residuo 317 en mVEGF-D1 y el residuo 312 en VEGF-D2, que da como resultado que mVEGF-D1 sea considerablemente más larga.

Tres de los cuatro cDNAs truncados para VEGF-D de ratón codificaban la región C-terminal, pero no los 50 aminoácidos N-terminales. Estos tres cDNAs codificaban un extremo C-terminal para VEGF-D que es idéntico al correspondiente a mVEGF-D2. El otro cDNA truncado codificaba únicamente la mitad N-terminal de VEGF-D. La secuencia de aminoácidos deducida de este cDNA contenía los cinco aminoácidos DFSFE inmediatamente después del residuo 30 encontrado en mVEGF-D1, pero no en mVEGF-D2.

Como se ha descrito arriba, la secuencia total del clon de cDNA de VEGF-D humano considerado en este ejemplo ha sido validada por comparación con la correspondiente a un segundo clon humano. Adicionalmente, se encontró que la secuencia del extremo 5' de la región codificante era idéntica en otros cinco clones de cDNA de VEGF-D humanos. En contraste, la secuencia consignada en el Ejemplo 2 contenía la mayor parte de la región codificante para VEGF-D, pero era incorrecta cerca del extremo 5' de esta región. Esto era debido probablemente a que el cDNA de VEGF-D estaba truncado cerca del extremo 5' de la región codificante y en dicho punto se había ligado con otro cDNA no identificado, y por consiguiente los primeros 30 codones de la secuencia codificante verdadera para VEGF-D habían sido delecionados y reemplazados con un residuo metionina. Este residuo metionina se definió como el aminoácido N-terminal de la secuencia de VEGF-D presentada en el Ejemplo 2.

Las regiones N-terminales de las secuencias de aminoácidos deducidas de VEGF-D1 y VEGF-D2 de ratón son muy similares a la deducida para VEGF-D humano (véase la Figura 9). Esto indica también que la secuencia de aminoácidos correcta deducida para VEGF-D humano es la consignada en este ejemplo. Los 25 aminoácidos N-terminales de VEGF-D humano forman una región extremadamente hidrófoba, lo cual es consistente con la idea de que parte de esta región puede ser una secuencia señal para la secreción de proteínas. La Figura 10 muestra la alineación de la secuencia de VEGF-D humano con las secuencias de otros miembros de la familia VEGF de factores de crecimiento, a saber VEGF_{165} humana (hVEGF_{165}), VEGF-B humana (hVEGF-B), VEGF-C humana (hVEGF-C) y Factor de Crecimiento Placentario humano (hPlGF). Cuando las lagunas en las alineaciones se ignoran para los propósitos de cálculo, se encuentra que VEGF-D humano tiene una identidad de 31% en la secuencia de aminoácidos con VEGF_{165} humano, 28% de identidad con VEGF-B humano, 48% de identidad con VEGF-C y 32% de identidad con PlGF humano. Claramente, VEGF-C es el miembro de esta familia que está más estrechamente relacionado con VEGF-D.

Las diferencias en secuencia para VEGF-D1 y VEGF-D2 de ratón se originan muy probablemente por remodelación diferencial de mRNA. Los 41 residuos de aminoácidos C-terminales de VEGF-D1 están delecionados en VEGF-D2, y están reemplazados con 9 residuos que no están relacionados estrechamente con la secuencia de VEGF-D1. Por consiguiente, 4 residuos cisteína presentes cerca del término C de VEGF-D1 están delecionados en VEGF-D2. Este cambio puede alterar las estructuras terciaria o cuaternaria de la proteína, o puede afectar a la localización de la proteína en la célula o el entorno extracelular. El extremo C-terminal de VEGF-D humano se asemeja al de la VEGF-D1 de ratón, no a la VEGF-D2 de ratón. La pequeña inserción de 5 aminoácidos después del residuo 30 en VEGF-D1 de ratón, que no está presente en VEGF-D2 de ratón o en VEGF-D humano, puede influir en el procesamiento proteolítico de la proteína.

VEGF-D está altamente conservada entre ratón y hombre. 85% de los residuos de aminoácidos de VEGF-D humano son idénticos en VEGF-D1 de ratón. Es probable que esto refleje la conservación de la función de las proteínas. Funciones supuestas para VEGF-D han sido propuestas en esta memoria. Aunque no se han encontrado formas alternativas de cDNA de VEGF-D humano, es posible que la variación de DNA de remodelación que da lugar a numerosas formas de mRNA para VEGF-D de ratón pueda ocurrir también en los tejidos humanos.

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Ejemplo 6 Expresión de VEGF-D en células COS (comparativo)

Un fragmento del cDNA humano para VEGF-D, que abarca desde el nucleótido 1 al 1520 de la secuencia que se muestra en la Figura 4 y que contiene la región codificante entera, se insertó en el vector de expresión de mamífero pCDNA1-amp. Se utilizó el vector para transfectar transitoriamente células COS por el método DEAE-Dextrano como se ha descrito previamente (Aruffo y Seed, 1987) y los medios de cultivo de células acondicionados resultantes, recogidos después de 7 días de incubación, se concentraron utilizando concentradores Amicon (Centricon 10, con un punto de corte por peso molecular de 10.000) de acuerdo con el fabricante. Los plásmidos utilizados para las transfecciones eran el constructo de expresión para VEGF-D humano y, como control positivo, un constructo fabricado por inserción de cDNA de VEGF-A de ratón en pcDNA1-amp. Los medios acondicionados se testaron en dos bioensayos diferentes, como se describe más adelante, y los resultados demuestran que las células COS expresaban y secretaban de hecho VEGF-D biológicamente activa.

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Ejemplo 7 Bioensayo para Capacidad de VEGF-D para Fijación al Receptor-2 de VEGF (comparativo)

Como se muestra en el Ejemplo 5, VEGF-D está estrechamente relacionada en estructura primaria con otros miembros de la familia VEGF. La mayoría de los miembros de esta familia de proteínas son mitógenos y/o quimiotácticos para las células endoteliales (Keck et al, 1989; Leung et al, 1989; Joukov et al, 1996; Olofsson et al, 1996). Además, VEGF-A (conocido previamente como VEGF), el primer miembro de la familia VEGF que se describe en la bibliografía, es un inductor potente de la permeabilidad vascular (Keck et al, 1989). Dado que la estructura de las proteínas es un determinante importante de la función de las mismas, parece probable que VEGF-D pudiera ser mitógeno también para las células endoteliales o inducir permeabilidad vascular. Por esta razón, se testó VEGF-D humano en un bioensayo para la determinación de su capacidad para fijarse al receptor-2 de VEGF (VEGFR2; conocido también como Flk-1), un receptor específico de las células endoteliales que, cuando es activado por VEGF-A, se cree que da lugar a una señal mitógena (Strawn et al, 1996).

Un bioensayo para la detección de factores de crecimiento que se fijan a VEGFR2 ha sido desarrollado en la línea de células Ba/F3 dependiente de factores, y se describe en la Solicitud de Patente previa de los mismos inventores, No. PCT/US95/16755. Estas células crecen en presencia de interleuquina-3 (IL-3); sin embargo, la eliminación de este factor da como resultado la muerte celular en el transcurso de 48 horas. Si se transfecta a las células Ba/F3 otro receptor capaz de suministrar un estímulo de crecimiento, las células pueden ser rescatadas por el factor de crecimiento específico que activa dicho receptor cuando se cultivan las células en medio de carece de IL-3. En el caso específico de tirosina-quinasas de tipo receptor (v.g. VEGFR2), pueden utilizarse receptores quiméricos que contienen el dominio extracelular de la tirosina-quinasa receptora y los dominios transmembranal y citoplásmico del receptor eritropoyetina (EpoR). En este caso, la estimulación con el ligando (v.g. VEGF), que se fija al dominio extracelular del receptor quimérico, da como resultado una señalización por el dominio citoplásmico de EpoR y el rescate subsiguiente de la línea de células en medio de crecimiento que carece de IL-3. La construcción del receptor quimérico utilizado en este estudio, constituido por el dominio extracelular de VEGFR2 de ratón y los dominios transmembranal y citoplásmico de EpoR, y el bioensayo propiamente dicho se describen más adelante.

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Construcción del Plásmido i) Construcción de un plásmido para generación de receptores quiméricos VEGFR2

Para obtener un constructo plasmídico con el cual pudiera ligarse fácilmente DNA codificante del dominio extracelular de VEGFR2 de ratón con DNA codificante de otros dominios proteínicos, se utilizó mutagénesis orientada a fin de generar un sitio de la enzima de restricción BglII en la posición del cDNA de VEGFR2 de ratón que codificaba la unión del dominio extracelular y el dominio transmembranal. El clon de longitud total del cDNA de VEGFR2 de ratón descrito por Oelrichs et al (1993) se subclonó en el vector de expresión de mamífero pCDNA1-amp, utilizando el sitio de la enzima de restricción BstXI. Se generó DNA monocatenario UTP+ utilizando el origen de replicación M13, y se utilizó éste como molde para generar cDNA de VEGFR2 de ratón que contenía el sitio BglII en la posición deseada. El plásmido que contenía el cDNA de VEGFR2 alterado se designó pVEGFR2Bgl. Los fragmentos de DNA que codifican los dominios transmembranal y citoplásmico de cualquier receptor pueden insertarse en el sitio BglII de pVEGFR2bgl a fin de generar vectores VEGFR2 quiméricos.

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ii) Construcción del receptor quimérico VEGFR2/EpoR

El cDNA de EpoR de ratón se subclonó en el vector de expresión pCDNA1-amp, y se generó DNA monocatenario como molde para mutagénesis. Se insertó un sitio de la enzima de restricción BglII en el cDNA de EpoR en la posición codificante de la unión de los dominios transmembranal y extracelular de EpoR para permitir la ligación directa de este fragmento de DNA con el cDNA modificado codificante del dominio extracelular de VEGFR2 en pVEGFR2Bgl. Adicionalmente, se eliminó un sitio BglII en el dominio citoplásmico de EpoR por una sustitución silenciosa de un solo nucleótido. El fragmento de DNA que codificaba los dominios transmembranal y citoplásmico de EpoR se utilizó luego para reemplazar la porción de pVEGFR2Bgl codificante de los dominios transmembranal y citoplásmico de VEGFR2. De este modo se generó un solo marco de lectura que codificaba el receptor quimérico constituido por el dominio extracelular de VEGFR2 y los dominios transmembranal y citoplásmico de EpoR.

El fragmento de DNA que codificaba el receptor quimérico se subclonó en el vector de expresión pBOS, y se cotransfectó en la línea de células Ba/F3 con el plásmido pgk-neo en una relación de 1:20. Las células que expresaban la proteína VEGFR2-EpoR se seleccionaron por análisis mediante citometría de flujo utilizado un anticuerpo monoclonal para el dominio extracelular de VEGFR2 (MAb 4H3). Este anticuerpo monoclonal se describe en la Solicitud de Patente Australiana No. PM 3794 presentada el 10 de febrero de 1994. Se seleccionaron líneas de células que expresaban niveles mayores de VEGFR2-EpoR por cultivo de las células en 5 \mug/ml de MAb 4H3 o 25 ng/ml de VEGF recombinante. Se utilizó para el bioensayo una línea de células que expresaba niveles elevados de VEGFR2-EpoR, designada Ba/F3-NYK-EpoR.

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El Bioensayo

Las células Ba/F3-NYK-EpoR arriba descritas se lavaron tres veces en PBS para eliminar totalmente IL-3 y se resuspendieron a una concentración de 1000 células por 13,5 \mul de medio de cultivo y se dosificaron partes alícuotas de 13,5 \mul por pocillo de una placa Terasaki de 60 pocillos. Se diluyeron luego medios acondicionados de células COS transfectadas en el medio de cultivo de las células. Como línea de células de control insensible se utilizaron células que expresaban un receptor quimérico constituido por el dominio extracelular Tie2 del receptor de células endoteliales y los dominios transmembranal y citoplásmico de EpoR. Las células se incubaron por espacio de 48-96 horas, durante cuyo tiempo las células incubadas exclusivamente en el medio de cultivo de células habían muerto y se registró la supervivencia/proliferación relativa observada en los otros pocillos (es decir en presencia de medio acondicionado de células COS) por recuento de las células viables presentes por pocillo.

El medio acondicionado de células COS que se había transfectado transitoriamente con plásmidos de expresión se concentró 30 veces y se utilizó en el bioensayo de VEGFR2. El medio concentrado acondicionado de células COS transfectadas con pCDNA1-amp se utilizó como control negativo.

Los resultados se muestran en la Figura 11, representándose el porcentaje de medio acondicionado de células COS concentrado 30 veces en el medio de incubación (vol/vol) en función del número de células viables en el pocillo después de 48 horas de incubación. Claramente, el medio acondicionado que contenía VEGF-A o VEGF-D era capaz de promover la supervivencia celular en este ensayo, lo que indicaba que ambas proteínas pueden fijarse a VEGFR2 y activarlo.

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Ejemplo 8 Ensayo de Permeabilidad Vascular (comparativo)

VEGF-D humano, preparada como en el Ejemplo 6 y concentrada 30 veces, se testó en el ensayo de permeabilidad vascular de Miles (Miles y Miles, 1952) realizado en cobayos anestesiados (albino/blanco, 300-400 g). El medio concentrado acondicionado para células COS transfectadas con pCDNA1-amp se utilizó de nuevo como control negativo. Se anestesiaron cobayos con hidrato de cloral (3,6 g/100 ml; 0,1 ml por 10 g de peso corporal). Los lomos de los animales se afeitaron luego cuidadosamente con maquinillas de esquilar. Se suministró a los animales una inyección intracardíaca del colorante Azul Evans (0,5% en MT PBS, 0,5 ml) utilizando una aguja 23G, y se inyectaron luego por vía intradérmica con 100-150 \mul de medio concentrado acondicionado con células COS. Después de 15-20 min, se sacrificaron los animales y se extirpó la capa de la piel del lomo para dejar al descubierto los vasos sanguíneos subyacentes. Para la cuantificación, el área de cada inyección se extirpó y se calentó a 45ºC en 2-5 ml de formamida. Los sobrenadantes resultantes, que contenían el colorante extravasado, se examinaron luego espectrofotométricamente a 620 nm.

Para el animal 1, la absorbancia a 620 nm procedente de la inyección de medio concentrado 30 veces acondicionado con VEGF-A era 0,178, la correspondiente al medio concentrado 30 veces acondicionado de VEGF-D era 0,114, y la correspondiente al medio concentrado 30 veces de células transfectadas con pCDNA1-amp era 0,004. Para el animal 2, los medios concentrados 30 veces se diluyeron 4 veces en medio de cultivo de células antes de la inyección intradérmica. La absorbancia a 620 nm para el medio acondicionado con VEGF-A era 0,141, la correspondiente a la muestra acondicionada con VEGF-D era 0,116 y la correspondiente a una muestra coincidente respecto al contenido de suero como control negativo era 0,017. La extravasación incrementada de colorante observada para los animales, tanto en presencia de VEGF-A como de VEGF-D demostró que ambas proteínas inducían fuertemente la permeabilidad vascular.

Los datos aquí expuestos indican que VEGF-D es una proteína secretada que, al igual que VEGF-A, se fija a y activa VEGFR2 y puede inducir permeabilidad vascular.

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Ejemplo 9 Bioactividades de los Polipéptidos VEGF-D Internos

La secuencia de aminoácidos deducida para VEGF-D incluye una región central que es similar en secuencia a todos los restantes miembros de la familia VEGF (aproximadamente los residuos 101 a 196 de la secuencia de aminoácidos de VEGF-D humano como se muestra en la alineación de la Figura 10). Por esta razón, se pensó que la porción bioactiva de VEGF-D podría residir en la región conservada. Con objeto de testar esta hipótesis, se estudió la biosíntesis de VEGF-D, y la región conservada de VEGF-D humano se expresó en células de mamífero, se purificó y se testó en bioensayos como se describe más adelante.

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Construcción de plásmidos

Un fragmento de DNA que codificaba la porción de VEGF-D humano desde el residuo 93 al 201, es decir, con las regiones N- y C-terminales eliminadas, se amplificó por reacción en cadena de polimerasa con DNA-polimerasa Pfu, utilizando como molde un plásmido que comprendía cDNA de VEGF-D humano de longitud total. El fragmento de DNA amplificado, cuya secuencia se confirmó por secuenciación de nucleótidos se insertó luego en el vector de expresión pEFBOSSFLAG para originar un plásmido designado pEFBOSVEGFD\DeltaN\DeltaC. El vector pEFBOSSFLAG contiene DNA codificante de la secuencia señal para secreción de proteína por el gen de interleuquina-3 (IL-3) y el octapéptido FLAG^{TM}. El octapéptido FLAG^{TM} puede ser reconocido por anticuerpos disponibles comercialmente tales como el anticuerpo monoclonal M2 (IBI/Kodak). El fragmento PCR de VEGF-D se insertó en el vector de tal manera que la secuencia señal de IL-3 se encontraba inmediatamente aguas arriba de la secuencia FLAG^{TM}, que se encontraba a su vez inmediatamente aguas arriba de la secuencia VEGF-D. Las tres secuencias citadas se encontraban en el mismo marco de lectura, por lo que la traducción de mRNA resultante de la transfección de pEFBOSVEGFD\DeltaN\DeltaC en células de mamífero podría dar lugar a una proteína que tuviera la secuencia señal de IL-3 en su término N, seguido por el octapéptido FLAG^{TM} y la secuencia VEGF-D. La escisión de la secuencia señal y la secreción subsiguiente de la proteína por la célula podría dar lugar a un polipéptido de VEGF-D que está marcado con el octapéptido FLAG^{TM} adyacente al término N. Esta proteína se designó VEGFD\DeltaN\DeltaC.

Adicionalmente, se construyó un segundo plásmido, designado pEFBOSVEGFDfullFLAG, en el cual la secuencia codificante de longitud total de VEGF-D humano estaba insertada en pEFBOSIFLAG de tal modo que la secuencia para el octapéptido FLAG^{TM} se encontraba inmediatamente aguas arriba de, y en el mismo marco de lectura que la secuencia codificante de VEGF-D. El plásmido pEFBOSIFLAG carece de la secuencia señal de IL-3, por lo que la secreción de la proteína de fusión VEGF-D/FLAG estaba dirigida por la secuencia señal de VEGF-D. Se diseñó pEFBOSVEGFDfullFLAG para dirigir la expresión en células de mamífero de VEGF-D de longitud total que estaba marcada en el terminal C con el octapéptido FLAG^{TM}. Esta proteína se designa VEGFDfullFLAG, y es útil para el estudio de la biosíntesis de VEGF-D.

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Análisis del Procesamiento de VEGF-D Posterior a la Traducción

Para examinar si el polipéptido VEGF-D se procesa para dar una proteína madura y totalmente activa, se transfectó transitoriamente pEFBOSVEGFDfullFLAG en células COS (Aruffo y Seed, 1987). La expresión en células COS seguida por marcación biosintética con ^{354}S-metionina/cisteína e inmunoprecipitación con gel M2 ha demostrado la presencia de especies de aproximadamente 43 kd (fA) y 25 kd (fB) (Figura 12A). Estas bandas son consistentes con la idea de que VEGF-D se escinde para dar un fragmento C-terminal (marcado con FLAG^{TM}) y un péptido interno (que corresponde aproximadamente a la proteína VEGFD\DeltaN\DeltaC). La reducción de los inmunoprecipitados (M2*) proporciona cierta reducción de la banda fA, lo que indica el potencial para enlaces disulfuro entre los dos fragmentos.

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Expresión y Purificación del Polipéptido Interno VEGF-D

Se utilizó el plásmido pEFBOSVEGFD\DeltaN\DeltaC para transfectar transitoriamente células COS por el método DEAE-Dextrano como se ha descrito previamente (Aruffo y Seed, 1987). El medio de cultivo de células acondicionado resultante (aproximadamente 150 ml), recogido después de 7 días de incubación, se sometió a cromatografía de afinidad utilizando una resina a la cual se había acoplado el anticuerpo monoclonal M2. Resumidamente, el medio se hizo pasar por lotes a través de una columna de anticuerpo M2 de 1 ml durante aproximadamente 4 horas a 4ºC. La columna se lavó luego concienzudamente con Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM antes de la elución con el péptido FLAG^{TM} libre a 25 \mug/ml en el mismo tampón. El material resultante se utilizó para los bioensayos descritos más adelante.

Con objeto de detectar el VEGFD\DeltaN\DeltaC purificado, las fracciones eluidas de la columna de afinidad M2 se sometieron a análisis por transferencia Western. Partes alícuotas de las fracciones de la columna se combinaron con tampón de muestra 2 x SDS-PAGE, se hirvieron y se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 15%. Las fracciones resueltas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y los sitios de fijación inespecíficos se bloquearon por incubación en Tris-NaCl/Tween 20 (TST) y polvo de leche desnatada al 10% (BLOTTO). Las membranas se incubaron luego con el anticuerpo monoclonal M2 o el anticuerpo de control a 3 \mug/ml durante 2 h a la temperatura ambiente, seguido por lavado concienzudo en TST. Las membranas se incubaron luego con un antisuero secundario anti-ratón de cabra conjugado a HRP durante 1 hora a la temperatura ambiente, seguido por lavado en tampón TST. La detección de las especies de proteínas se realizó utilizando un reactivo quimioluminiscente (ECL, Amersham) (Figura 12B).

En condiciones no reductoras, se detectó una especie de peso molecular aproximadamente 23 kD (VEGFD\DeltaN\DeltaC) por el anticuerpo M2. Esto es consistente con el peso molecular predicho para este fragmento interno (12.800) más glicosilación unida a N; VEGFD\DeltaN\DeltaC contiene dos sitios de glicosilación potenciales enlazados a N. Se detectó también una especie de aproximadamente 40 kD, y puede representar un dímero no covalente de la proteína de 23 kD (VEGFD\DeltaN\DeltaC).

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Bioensayos

El bioensayo para la capacidad de los polipéptidos de fijarse al receptor-2 de VEGF se describe en detalle en el Ejemplo 7. Partes alícuotas de las fracciones eluidas de la columna de afinidad M2, que contenían la proteína VEGFD\DeltaN\DeltaC, se diluyeron en medio y se testaron en el bioensayo de VEGFR2 como se ha descrito previamente. La fracción #3 de la columna de afinidad, que se demostró contenía la proteína VEGFD\DeltaN\DeltaC purificada (Figura 12B), demostró una aptitud clara para inducir proliferación de la línea de células del bioensayo a una dilución de 1/100 de la fracción purificada (Figura 13). En comparación, el volumen vacío de la columna de afinidad (fracción #1) no exhibía actividad alguna, mientras que el medio acondicionado original VEGFD\DeltaN\DeltaC exhibía solamente una actividad débil.

El ensayo de permeabilidad vascular (Miles y Miles, 1952) se describe resumidamente en el Ejemplo 8. Partes alícuotas de VEGFD\DeltaN\DeltaC purificado, y muestras del volumen vacío de la columna de afinidad M2 (control negativo) se combinaron con medio y se inyectaron intradérmicamente en la piel de cobayos. Las regiones de la piel en los sitios de inyección se extirparon, y se eluyó el colorante extravasado. La absorbancia del colorante extravasado a 620 nm originado por la inyección de VEGFD\DeltaN\DeltaC purificado era 0,131 \pm 0,09. En comparación, el valor para la absorbancia originada por la inyección de una muestra del volumen vacío era 0,092 \pm 0,020. Por consiguiente, VEGFD\DeltaN\DeltaC inducía permeabilidad vascular, si bien el efecto era sólo marginal.

Debido a su capacidad para fijarse a VEGFR2 y su menor inducción de la permeabilidad vascular comparada con VEGF-D de longitud total, puede decirse que VEGF-D\DeltaN\DeltaC reduce relativamente la inducción de la permeabilidad vascular por VEGF-D a causa de inhibición competitiva. En este sentido, puede pensarse que el fragmento VEGF-D\DeltaN\DeltaC es un antagonista para VEGF-D en lo que respecta a la inducción de permeabilidad vascular.

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Sumario

Dos factores han conducido a los autores de la invención a explorar fragmentos internos de VEGF-D en cuanto a actividad intensificada. En primer lugar, es la región central de VEGF-D la que exhibe homología de aminoácidos con todos los restantes miembros de la familia VEGF. En segundo lugar, el procesamiento proteolítico que da lugar a polipéptidos bioactivos internos ocurre para otros factores de crecimiento tales como PDGF-BB. Adicionalmente, la actividad observada con la proteína VEGF-D de longitud total en células COS era menor que para el medio acondicionado correspondiente de células COS transfectadas con VEGF-A.

Se predijo que la secuencia madura de VEGF-D podría derivarse de un fragmento contenido dentro de los residuos 92-205, con escisión en FAA^TFY e IIRR^SIQI.

El análisis por inmunoprecipitación de VEGF-DfullFLAG expresada en células COS producía especies consistentes con la escisión proteolítica interna del polipéptido VEGF-D en estos sitios. Por esta razón, se produjo una forma truncada de VEGF-D, con las regiones terminales N y C eliminadas (VEGFD\DeltaN\DeltaC) y se expresó en células COS. Esta proteína se identificó y se purificó utilizando el anticuerpo M2. La proteína VEGFD\DeltaN\DeltaC era detectada también por el anticuerpo A2, que reconoce un péptido dentro del fragmento 92-205 de VEGF-D (no representado). Se evaluó VEGFD\DeltaN\DeltaC por el bioensayo VEGFR2 y el ensayo de permeabilidad vascular de Miles, y se demostró que se fija al receptor VEGFR2 y activa el mismo en un bioensayo diseñado para detectar la reticulación del dominio extracelular de VEGFR2. La inducción de permeabilidad vascular por este polipéptido en un ensayo Miles era en el mejor de los casos marginal, en contraste con el efecto de VEGF-A.

Ejemplo 10 VEGF-D se Fija a VEGFR-3 y lo Activa

El cDNA de VEGF-D humano se clonó en vectores lanzadera de baculovirus para la producción de VEGF-D recombinante. Además de los vectores lanzadera de baculovirus, que contenían el cDNA de VEGF-D sin modificar (al que se hace referencia como "VEGF-D de longitud total"), se ensamblaron dos vectores lanzadera de baculovirus, en los cuales el cDNA de VEGF-D se modificó de las maneras siguientes.

En un constructo (al que se hace referencia como "VEGF-D-H_{6} de longitud total") se añadió un marcador histidina C-terminal. En el otro constructo, se eliminaron los polipéptidos N- y C-terminales supuestos, se fusionó el péptido señal melitina en marco con el término N, y se añadió un marcador histidina al término C del dominio de homología de VEGF restante (al que se hace referencia como "\DeltaN\DeltaC-MELsp-VEGF-D-H_{6}").

Para cada uno de los tres constructos, se amplificaron clones de baculovirus de dos o tres transfecciones independientes. El sobrenadante de células High Five (HF) se recogió 48 horas después de la infección con stocks de título de virus alto. El sobrenadante se ajustó a pH 7 con NaOH y se diluyó con un volumen de D-MEM (0,2% FCS).

Se testaron las muestras respecto a su aptitud para estimular la fosforilación de la tirosina de VEGFR-3 (receptor Flt4) en las células NIH3T3, como ha sido descrito por Joukov et al, 1996. El sobrenadante de las células no infectadas y el sobrenadante de las células infectadas con la variante corta de remodelación de VEGF-C, que no estimula la fosforilación de la tirosina de VEGFR-3, se utilizaron como control negativo. Como control positivo se utilizó VEGF-C modificada del mismo modo que \DeltaN\DeltaC-melSP-VEGF-D-H_{5}. Los resultados se muestran en la Figura 14.

La aparición de bandas nuevas a 125 y 195 kD indica fosforilación, y por consiguiente activación del receptor.

Ejemplo 11 VEGF-D se Fija a VEGFR-2 y la Activa

Se clonó cDNA de VEGF-D humano modificado y sin modificar en vectores lanzadera de baculovirus para la producción de VEGF-D recombinante como se describe en el Ejemplo 10.

Para cada uno de los tres constructos de VEGF-D, VEGF-D-H_{6} de longitud total, y \DeltaN\DeltaC-melSP-VEGF-D-H_{6}, se amplificaron clones de baculovirus de dos o tres transfecciones independientes. El sobrenadante de las células High Five (HF) se recogió 48 horas después de la infección con stocks de alto título de virus. El sobrenadante se ajustó a pH 7 con NaOH y se diluyó con un volumen de D-MEM (0,2% FCS).

Los sobrenadantes acondicionados con las proteínas marcadas con histidina se testaron respecto a su aptitud para estimular la fosforilación de la tirosina del receptor KDR de acuerdo con Joukov et al (1996). KDR es el homólogo humano de flk1 (VEGFR-2).

El sobrenadante de las células no infectadas y el sobrenadante de las células infectadas con el mutante 156S de VEGF-C, que no estimula KDR, se utilizaron como controles negativos. Como controles positivos se utilizaron VEGF_{165} y VEGF-C modificados del mismo modo que \DeltaN\DeltaC-melSP-VEGF-D-H_{6}. Los resultados se muestran en la Figura 15.

La aparición de una nueva banda a aproximadamente 210 kD indica fosforilación, y por consiguiente activación, del receptor.

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Ejemplo 12 Análisis de la Expresión del Gen VEGF-D

Con objeto de caracterizar el patrón de expresión del gen VEGF-D en los embriones humano y de ratón, se utilizaron cDNAs de VEGF-D como sondas de hibridación para análisis por transferencia Northern de RNA humano poliadenilado y para análisis de hibridación in situ con embriones de ratón.

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Expresión del gen en el Adulto Humano

Un fragmento de 1,1 kb del cDNA de VEGF-D humano representado en la Figura 4 (SEQ ID NO. 4) que abarcaba desde el sitio EcoRV al término 3' (nucleótidos 911 a 2029) se marcó con [\alpha-^{32}P]dATP utilizando el sistema de marcación de DNA Megaprime (Amersham) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizó esta sonda para cribar transferencias Northern de tejidos múltiples humanos (Clontech) por hibridación, asimismo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estas transferencias contenían RNA poliadenilado obtenido de tejidos de humanos adultos que estaban aparentemente exentos de enfermedad. La autorradiografía con las transferencias marcadas reveló que el mRNA de VEGF-D era muy abundante en corazón, pulmón y músculo esquelético. El mRNA de VEGF-D exhibía una abundancia intermedia en bazo, ovario, intestino delgado y colon, y su abundancia era escasa en riñón, páncreas, timo, próstata y testículos. No se detectó mRNA alguno de VEGF-D en el RNA de cerebro, placenta, hígado o leucocitos de sangre periférica. En la mayoría de los tejidos en los que se detectó mRNA de VEGF-D, el tamaño del transcrito era 2,3 kb. La única excepción era el músculo esquelético, donde se detectaron dos transcritos de VEGF-D de 2,3 kb y 2,8 kb. En el músculo esquelético, el transcrito de 2,3 kb era más abundante que el transcrito de 2,8 kb.

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Expresión del gen en embriones de ratón

Con objeto de generar una sonda de RNA antisentido para mRNA de VEGF-D de ratón, se insertó el cDNA de VEGF-D2 de ratón representado en la Figura 7 (SEQ ID NO. 7) en el vector de transcripción pBluescriptIIKS+ (Stratagene). El plásmido resultante se digirió completamente con la endonucleasa de restricción FokI y se utilizó luego como molde para una reacción de transcripción in vitro con RNA-polimerasa T3. Esta reacción de transcripción dio lugar a una sonda de RNA antisentido para mRNA de VEGF-D cuya secuencia era complementaria a la región del cDNA de VEGF-D2 (Figura 7) desde el término 3' hasta el sitio de escisión por FokI más próximo al término 3' (nucleótidos 1135 a 700). Esta sonda de RNA antisentido se hibridó en condiciones de alta severidad con secciones de tejidos incrustadas en parafina generadas a partir de embriones de ratón en el día post-coital 15,5. La hibridación y el lavado se realizaron esencialmente como se ha descrito con anterioridad (Achen et al, 1995).

Después de lavado y secado, se expusieron los portaobjetos a película de autorradiografía durante 6 días.

El revelado de la película de autorradiografía demostró que el mRNA de VEGF-D está localizado en el pulmón en desarrollo de los embriones del día 15,5 post-coital. La señal para mRNA de VEGF-D en el pulmón era fuerte y muy específica. Las hibridaciones de control con sonda de sentido no producían ruido de fondo detectable alguno en pulmón o ningún otro tejido.

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Sumario

El gen VEGF-D se expresa extensamente en el humano adulto, pero por supuesto no se expresa de manera ubicua. La expresión más fuerte se detectó en corazón, pulmón y músculo esquelético. En los embriones de ratón, el día 15,5 post-coital, se detectaba una expresión fuerte y específica del gen VEGF-D en el pulmón. Estos datos sugieren que VEGF-D puede jugar un papel en el desarrollo del pulmón, y que la expresión del gen VEGF-D en el pulmón persiste en el adulto, al menos en los humanos. La expresión del gen en otros tejidos en el humano adulto sugiere que VEGF-D puede desempeñar otras funciones en otros tejidos adultos.

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Ejemplo 13 VEGF-D es Mitógeno para las Células Endoteliales

Algunos miembros de la familia VEGF de proteínas, a saber VEGF-A (Leung et al, 1989) y VEGF-B (Olofsson et al, 1996), son mitógenos para las células endoteliales. Con objeto de testar la capacidad mitógena de VEGFD\DeltaN\DeltaC para las células endoteliales, se expresó y purificó esta proteína por cromatografía de afinidad como se describe en el Ejemplo 9. La fracción #3, eluida de la columna de afinidad M2, que contenía VEGFD\DeltaN\DeltaC, se diluyó en relación 1 a 10 en medio de cultivo de células que contenía 5% de suero y se aplico a células endoteliales de aorta de bovino (BAEs) que se habían propagado en medio que contenía 10% de suero. Las BAEs se habían sembrado en cápsulas de 24 pocillos a una densidad de 10.000 células por pocillo el día antes de la adición de VEGFD\DeltaN\DeltaC, y tres días después de la adición de este polipéptido se disociaron las células con tripsina y se contaron. Se incluyó en el experimento VEGF-A purificado como control positivo. Los resultados se muestran en la Figura 16. La adición de la fracción #3 al medio de cultivo de células condujo a un aumento de 2,4 veces en el número de BAEs después de tres días de incubación, resultado que era comparable al obtenido con VEGF-A. Claramente, VEGFD\DeltaN\DeltaC es mitógeno para las células endoteliales.

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Ejemplo 14 Localización del Gen VEGF-D en los Cromosomas Humanos

Con objeto de generar sondas de hibridación para localización del gen VEGF-D en los cromosomas humanos, se aisló un clon de DNA genómico humano para VEGF-D a partir de una biblioteca de DNA genómico humano (Clontech). La biblioteca genómica se cribó por hibridación con el cDNA de VEGF-D humano que se muestra en la Figura 4, utilizando métodos estándar (Sambrook et al, 1989). Se demostró que uno de los clones así aislados contenía parte del gen VEGF-D por hibridación a numerosos oligonucleótidos que se derivaban en secuencia del cDNA de VEGF-D humano. Una región del clon genómico, de aproximadamente 13 kb de tamaño, se purificó en gel de agarosa, se marcó por traslación de la mella con biotina-14-dATP y se hibridó in situ a una concentración final de 20 ng/\mul hasta metafases de dos varones humanos normales. Se modificó el método de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) respecto al descrito previamente (Callen et al, 1990) en el sentido de que los cromosomas se tiñeron antes del análisis con yoduro de propidio (como contratinción) y DAPI (para identificación de los cromosomas). Las imágenes de las operaciones de metafase se capturaron con una cámara CCD refrigerada, utilizando el sistema de recogida y mejora de imágenes CytoVision Ultra (Applied Imaging Int. Ltd.). Las señales FISH y el patrón de bandas DAPI se combinaron para análisis.

Se examinaron 15 metafases del primer varón normal respecto a señal fluorescente. Diez de las metafases exhibían señal en una cromátida (tres células) o ambas cromátidas (siete células) del cromosoma X en la banda p22.1. Se observaron un total de 9 puntos de ruido de fondo inespecíficos en estas 15 metafases. Se obtuvo un resultado similar por la hibridación de la sonda a 15 metafases del segundo varón normal, en las que se observó la señal en Xp22.1 en una sola cromátida en 7 células y en ambas cromátidas en 4 células. En conclusión, el gen VEGF-D humano está localizado en el cromosoma X en la banda p22.1.

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Ejemplo 15 Localización del gen VEGF-D Murino en los Cromosomas del Ratón (comparativo)

La localización cromosómica en el ratón del gen VEGF-D se determinó por análisis de retrocruzamiento interespecífico utilizando progenie generada por apareamiento de hembras (C57BL/6J x Mus spretus)F1 y machos CB7BL/67 como se ha descrito previamente (Copeland y Jenkins, 1991). Este panel de mapeado de retrocruzamiento interespecífico ha sido tipificado para más de 2400 loci que están bien distribuidos entre todos los autosomas así como en el cromosoma X (Copeland y Jenkins, 1991). Se digirieron los DNAs de C57BL/6J y M. spretus con varias enzimas y se analizaron por hibridación de transferencia Southern respecto a polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción informativos (RFLPs) utilizando una sonda de cDNA de VEGF-D de ratón de 1,3 kb esencialmente como se ha descrito (Jenkins et al, 1982). Se detectaron fragmentos de 7,1, 6,3, 4,7, 2,5 y 2,2 kb en DNA de C57BL/6J digerido con TaqI y se detectaron fragmentos principales de 7,1, 3,7, 2,7 y 2,2 kb en DNA de M. spretus digerido con TaqI. La presencia o ausencia de los fragmentos 3,7 y 2,7 específicos de M. spretus TaqI, que se cosegregaban, se siguió en los ratones generados por retrocruzamiento. Los resultados del mapeado indicaban que el gen VEGF-D está localizado en la región distal del cromosoma X del ratón enlazado a Bik, DxPasI y Ptmb4. Aunque se analizaron 89 ratones para todos los marcadores, se tipificaron hasta 133 ratones para algunos pares de marcadores. Cada locus se analizó en combinaciones por pares respecto a frecuencias de recombinación utilizando los datos adicionales. Las relaciones del número total de ratones que exhibían cromosomas recombinantes al número total de ratones analizados para cada par de loci y el orden más probable de los genes son: centrómero - Btk - 14/121 - DxPasI - 3/99 - VEGF-D - 5/133 - Ptmb4. Las frecuencias de recombinación [expresadas con distancias genéticas en centiMorgans (cM) \pm el error estándar], calculadas utilizando Map Manager (versión 2.6.5), son - Btk - 11,6 \pm 2,9 - DxpasI - 3,0 \pm 1,7 - VEGF-D - 3,8 \pm 1,7 - Ptmb4. Una descripción de las sondas y RFLPs para los loci enlazados al gen VEGF-D, con inclusión de Btk, DxPasI y Ptmb4, ha sido comunicada previamente (Hacfliger et al, 1992; Holloway et al, 1997).

Los autores de la invención han comparado el presente mapa interespecífico del cromosoma X con un mapa compuesto de enlaces de ratón que consigna la localización en el mapa de muchas mutaciones no clonadas (proporcionado por Mouse Genome Database, una base de datos computerizada mantenida en la Jackson Library, Bar Harbor, ME). El gen VEGF-D mapeaba en una región del mapa compuesto que carece de mutaciones de ratón con un fenotipo que podría esperarse para una alteración en el caso del locus de un mitógeno de células endoteliales. La región distal del cromosoma X del ratón comparte una región de homología con la rama corta de los cromosomas X humanos (Mouse Genome Database). La ubicación del gen VEGF-D en este intervalo en el ratón sugiere que el homólogo humano mapeará a Xp22. Esto es consistente con el análisis FISH de los inventores, que ha localizado el gen humano en Xp22.1.

Numerosos estados de enfermedad son causados por mutaciones en genes desconocidos que se han mapeado a Xp22.1 y las posiciones que rodean inmediatamente esta región en el humano. Estos estados de enfermedad incluyen el síndrome de Kallmann, albinismo ocular (tipo Nettleship-Falls), albinismo ocular y sordera sensorineural, síndrome de Partington, displasia espondiloepifisaria (tardía), retinitis pigmentosa 15, disgenesis gonadal (tipo hembra XY), síndrome catarático-dental de Nance-Horan, retinosquisis, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, producción de células F, hipomagnesemia, queratosis folicular espinulosa decalvans, síndrome de Coffin-Lowry, dermoides corneales, hipofosfatemia, agammaglobulinemia, síndrome de Aicardi, hipofosfatemia hereditaria II, retardo mental (no dismórfico), síndrome G de Opitz, trastorno pigmentario (reticulado), inversión sexual sensible a la dosificación, hipoplasia suprarrenal, retinitis pigmentosa-6, sordera 4 (sensorineural congénita) y síndrome de Wilson-Turner. Las posiciones de los genes implicados en estos estados de enfermedad se documentan en el mapa de genes OMIM, que ha sido publicado por Dr. Victor McKusick y colaboradores en la Universidad Johns Hopkins (EE.UU.).

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Bioensayos para determinar la función de VEGF-D

Otros ensayos se conducen para evaluar si VEGF-D tiene actividades similares a VEGF en relación con la función de las células endoteliales, la angiogénesis y la curación de las heridas. Pueden realizarse también ensayos adicionales, dependiendo de los resultados de los estudios de distribución de la fijación de receptores.

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I. Ensayos de Función de las Células Endoteliales a) Proliferación de células endoteliales

Se realizan ensayos de crecimiento de células endoteliales por métodos por métodos bien conocidos en la técnica, v.g., los de Ferrara & Henzel (1989), Gospodarowicz et al (1989), y/o Claffey et al, Biochim. Biophys. Acta, 1995 1246 1-9.

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b) Ensayo de adhesión celular

Se testa el efecto de VEGF-D sobre la adhesión de granulocitos polimorfonucleares a células endoteliales.

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c) Quimiotaxis

Se utiliza el ensayo estándar de quimiotaxis de la cámara de Boyden para testar el efecto de VEGF-D sobre la quimiotaxis.

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d) Ensayo del activador del plasminógeno

Se testan células endoteliales en cuanto al efecto de VEGF-D sobre el activador del plasminógeno y la producción de inhibidores del activador del plasminógeno, utilizando el método de Pepper et al (1991).

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e) Ensayo de Migración de las Células Endoteliales

Se ensaya la capacidad de VEGF-D para estimular las células endoteliales a migrar y formar tubos como se describe en Montesano et al (1986). Alternativamente, puede utilizarse el ensayo del gel tridimensional de colágeno descrito por Joukov et al (1996) o una membrana gelatinizada en una cámara de Boyden modificada (Glaser et al 1980).

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II. Ensayo de Angiogénesis

La aptitud de VEGF-D para inducir una respuesta angiogénica en la membrana corioalantoica del pollo se testa como se describe en Leung et al (1989). Alternativamente, puede utilizarse el ensayo de la córnea de la rata, de Rastinejad et al (1989); este es un método aceptado para ensayo de la angiogénesis in vivo, y los resultados son transferibles fácilmente a otros sistemas in vivo.

\vskip1.000000\baselineskip

III. Curación de las Heridas

La capacidad de VEGF-D para estimular la curación de las heridas se testa en el modelo más importante clínicamente disponible, como se describe en Schilling et al (1959) y como ha sido utilizado por Hunt et al (1967).

\vskip1.000000\baselineskip

IV. El Sistema Hemopoyético

Se conocen en la técnica una diversidad de ensayos in vitro e in vivo que utilizan poblaciones específicas de células del sistema hemopoyético, y se reseñan a continuación. En especial, son particularmente convenientes una diversidad de ensayos in vitro de células madre murinas que utilizan células purificadas en clasificadores de células activados por fluorescencia:

\vskip1.000000\baselineskip

a) Células Madre Repobladoras

Éstas son células capaces de repoblar la médula ósea de ratones irradiados letalmente, y tienen el fenotipo Lin^{-}, Rh^{h1}, Ly-6A/E^{+}, c-kit^{+}. Se testa VEGF-D en estas células sea solas, o por co-incubación con otros factores, seguido por medida de la proliferación celular por incorporación de ^{3}H-timidina.

\vskip1.000000\baselineskip

b) Células Madre de Etapa Tardía

Estas son células que tienen comparativamente poca capacidad de repoblación de la médula ósea, pero pueden generar D13 CFU-S. Estas células tienen el fenotipo Lin^{-}, Rh^{h1}, Ly-6A/E^{+}, c-kit^{+}. Se incuba VEGF-D con estas células durante cierto periodo de tiempo, se inyecta en receptores irradiados letalmente, y se cuenta el número de colonias D13 en el bazo.

\vskip1.000000\baselineskip

c) Células Enriquecidas en Progenitor

Estas son células que responden in vitro a factores de crecimiento simples y tienen el fenotipo Lin^{-}, Rh^{h1}, Ly-6A/E^{+}, c-kit^{+}. Este ensayo indicará si VEGF-D puede actuar directamente sobre células progenitoras hemopoyéticas. VEGF-D se incuba con estas células en cultivos de agar, y se cuenta el número de colonias presentes después de 7-14 días.

\vskip1.000000\baselineskip

V. Ateroesclerosis

Las células musculares lisas juegan un papel crucial en el desarrollo o la iniciación de la ateroesclerosis, requiriendo un cambio de su fenotipo desde un estado contráctil a un estado sintético. Macrófagos, células endoteliales, linfocitos T y plaquetas juegan todos ellos un papel en el desarrollo de las placas ateroescleróticas por influir en el crecimiento y las modulaciones fenotípicas de la célula muscular lisa. Un ensayo in vitro que utiliza una cámara Rose modificada en el cual se siembran diferentes tipos de células en cubreobjetos enfrentados mide la tasa de proliferación y las modulaciones fenotípicas de las células musculares lisas en un entorno multicelular, y se utiliza para evaluar el efecto de VEGF-D sobre las células musculares lisas.

\vskip1.000000\baselineskip

VI. Metástasis

La capacidad de VEGF-D para inhibir las metástasis se ensaya utilizando el modelo del carcinoma de pulmón de Lewis, utilizando por ejemplo el método de Cao et al (1995).

\vskip1.000000\baselineskip

VII. VEGF-D en Otros Tipos de Células

Los efectos de VEGF-D sobre la proliferación, diferenciación y función de otros tipos de células, tales como las células hepáticas, el músculo y otras células cardiacas, células endocrinas y osteoblastos pueden ensayarse fácilmente por métodos conocidos en la técnica, tales como la absorción de ^{3}H-timidina por cultivos in vitro. La expresión de VEGF-D en estos y otros tejidos puede medirse por técnicas tales como transferencia Northern e hibridación o por hibridación in situ.

\vskip1.000000\baselineskip

VIII. Construcción de Variantes y Análogos de VEGF-D

VEGF-D es un miembro de la familia PDGF de factores de crecimiento que exhibe un alto grado de homología con los otros miembros de la familia PDGF. VEGF-D contiene ocho residuos cisteína conservados que son característicos de esta familia de factores de crecimiento. Estos residuos cisteína conservados forman enlaces disulfuro intercatenarios que producen la estructura de nudos de la cisteína, y enlaces disulfuro intracatenarios que forman los dímeros de proteína que son característicos de los miembros de la familia de factores de crecimiento PDGF. VEGF-D interaccionará con los receptores de factores de crecimiento de la proteína tirosina-quinasa.

En contraste con las proteínas en que se conoce poco o nada acerca de la estructura proteínica y los sitios activos necesarios para la fijación de receptores y la actividad consiguiente, el diseño de mutantes activos de VEGF-D se ve facilitado notablemente por el hecho de que se sabe mucho acerca de los sitios activos y aminoácidos importantes de los miembros de la familia de factores de crecimiento PDGF.

Artículos publicados que dilucidan las relaciones estructura/actividad de miembros de la familia de factores de crecimiento PDGF incluyen, para PDGF: Oestman et al, J. Biol. Chem., 1991 266 10073-10077; Andersson et al, J. Biol. Chem., 1992 267 11260-1266; Oefner et al, EMBO J., 1992 11 3921-3926; Flemming et al, Molecular and Cell Biol., 1993 13 4066-4076 y Andersson et al, Growth Factors, 1995 12 159-164; y para VEGF: Kim et al, Growth Factors, 1992 7 53-64; Pötgens et al, J. Biol. Chem., 1994 269 32879-32885 y Claffey et al, Biochem. Biophys. Acta, 1995 1246 1-9. Partiendo de estas publicaciones es evidente que, debido a los ocho restos cisteína conservados, los miembros de la familia de factores de crecimiento PDGF exhiben una estructura plegada anudada y dimerización características, que dan como resultado la formación de tres regiones de bucle expuestas en cada extremo de la molécula dimerizada, en las cuales puede esperarse que estén localizados los sitios activos de fijación de los receptores.

Basándose en esta información, una persona experta en las técnicas de la biotecnología puede diseñar mutantes de VEGF-D con una probabilidad muy alta de retención de la actividad de VEGF-D por la conservación de los ocho residuos cisteína responsables de la configuración plegada anudada y de la dimerización, así como por la conservación, o realización únicamente de sustituciones conservadoras de aminoácidos en las secuencias probables de los receptores en la región del bucle 1, bucle 2 y bucle 3 de la estructura de la proteína.

La formación de mutaciones deseadas en sitios específicamente direccionados en una estructura de proteína está considerada como una técnica estándar en el arsenal del químico especialista en proteínas (<biblio>). Ejemplos de dicha mutagénesis orientada con VEGF pueden encontrarse en Pötgens et al, J. Biol. Chem., 1994 269 32879-32885 y Claffey et al, Biochim. Biophys. Acta, 1995 1246 1-9. De hecho, la mutagénesis orientada es tan común que están disponibles comercialmente kits para facilitar tales procedimientos (v.g., Promega 1994-1995 Catalog., páginas 142-145).

La actividad de proliferación de las células endoteliales de los mutantes de VEGF-D puede confirmarse fácilmente por procedimientos de cribado bien establecidos. Por ejemplo, puede utilizarse un procedimiento análogo al ensayo mitótico de las células endoteliales descrito por Claffey et al, (Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1246, 1-9). Análogamente, pueden testarse los efectos de VEGF-D sobre la proliferación de otros tipos de células, sobre la diferenciación celular y sobre las metástasis humanas, utilizando métodos que son bien conocidos en la técnica.

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Referencias

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Andersson, M., Östman, A., Bäckström, G., Hellman, U., George-Nascimento, C., Westermark, B. and Heldin, C-H. J. Biol. Chem., 1992 267 11260-1266

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Flemming, S.V., Andersson, M., Westermark, B., Heldin, C-H. and Östman, A. Molecular and Cell Biol., 1993 13 4066-4076

Glaser, B.M. and D'Amore, P.A. Nature, 1980 288 483-484

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Hunt et al Am. J. Surgery, 1967 114 302-307

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Leung, D.W., Cachianes, G., Kuang, W-J., Goeddel, D.V. and Ferrara, N. Science, 1989 246 1306-1309

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Montesano, R., Vassalli, J.D., Baird, A., Guillemin, R. and Orci, L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1986 83
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Oefner, C., D'Arcy, A., Winkler, F.K., Eggimann, B. and Hosang, M. EMBO Journal, 1992 11 3921-3926

Oelrichs, R.B., Reid, H.H., Bernard, O., Ziemiecki, A. and Wilks, A.F. Oncogene, 1993 8 11-18

Oestman, A., Andersson, M., Hellman, U. and Heldin, C-H. J. Biol. Chem., 1991 266 10073-10077

Olofsson, B., Pajusola, K., Kaipainen, A., von Euler, G., Joukov, V., Saksela, O., Orpana, A., Pettersson, R.F., Alitalo, K. and Eriksson, U. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1996. 93 2576-2581

Pepper, M.S., Ferrara, N. Orci, L. and Montesano. R. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1991 181 902-906

Pötgens, A.J., Lubsen, N.H., van Altena, M.C., Vermeulen, R., Bakker, A., Schoenmakers, J.G.G., Ruiter, D.J. and de Waal, R.M.W. J. Biol. Chem., 1994 269 32879-32885

Rastinejad, F., Plverini, P.J. and Bouck, N.P. Cell, 1989 56 345-355

Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York

Schilling et al Surgery, 1959 46 702-710

Strawn, L.M., McMahon, G., App, H., Schreck, R., Kuchler, W.R., Longhi, M.P., Hui, T.H., Tang, C., Levitzki, A., Gazit, A., Chen, I., Keri, G., Orfi, L., Risau, W., Flamme, I., Ullrich, A., Hirth, K.P. and Shawver, L.K. Cancer Res., 1996 56 3540-3545

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: LUGWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: FACTOR DE CRECIMIENTO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 11

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Evenson, McKeown, Edwards & Lenahan, P.L.L.C.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1200 G Street, NW, Suite 700

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Washington

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: DC

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: Estados Unidos de América

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 20005

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DE PROCURADOR/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: EVANS, Joseph D.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 1064/42983PCT

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO (202) 628-8800

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: (202) 628-8844

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX: N/A

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2846 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: Mama humana

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

5

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 13 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 325 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: Mama humana

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 2029 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: Pulmón humano

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

11

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 354 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: Pulmón humano

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

12

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1325 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: Pulmón de ratón

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1135 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: Pulmón de ratón

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 358 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: Pulmón de ratón

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

18

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 321 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO: Pulmón de ratón

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

TIPO DE TEJIDO:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: Ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASE DE CADENA: Simple

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(D)

TOPOLOGÍA: Lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: Oligonucleótido

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(vi)

FUENTE ORIGINAL:

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(F)

TIPO DE TEJIDO:

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

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23

Claims (15)

1. Un anticuerpo específicamente reactivo con una secuencia madura de VEGF-D derivada de un fragmento contenido dentro de los residuos 92-205 de SEQ ID NO. 5 para inhibición de la angiogénesis y/o neovascularización o para inhibición de la proliferación de células endoteliales en un mamífero.

2. Uso de un anticuerpo específicamente reactivo con una secuencia madura de VEGF-D derivada de un fragmento contenido dentro de los residuos 92-205 de SEQ ID NO. 5 en la fabricación de una composición farmacéutica para inhibición de la angiogénesis y/o neovascularización o para inhibición de la proliferación de células endoteliales en un mamífero.

3. Un anticuerpo para inhibición de la angiogénesis y/o neovascularización o para inhibición de la proliferación de células endoteliales de acuerdo con la reivindicación 1; o el uso de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, en donde el anticuerpo o la composición farmacéutica tiene por objeto inhibir la angiogénesis y/o neovascularización en el tratamiento del cáncer, tal como crecimiento y metástasis de tumores, retinopatía diabética, psoriasis y/o
artropatías.

4. Un anticuerpo para inhibición de la angiogénesis y/o neovascularización o para inhibición de la proliferación de células endoteliales de acuerdo con la reivindicación 1; o el uso de un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la inhibición de la proliferación de células endoteliales es la inhibición de la proliferación de células endoteliales de vasos linfáticos.

5. Un anticuerpo específicamente reactivo con una secuencia madura de VEGF-D derivada de un fragmento contenido dentro de los residuos 92-205 de SEQ ID NO. 5 para prevención o alivio del crecimiento y/o metástasis de tumores.

6. Un anticuerpo para inhibición de la angiogénesis y/o neovascularización o para inhibición de la proliferación de células endoteliales de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 5; o el uso de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde el fragmento comprende los residuos de aminoácidos 93-201 de SEQ ID NO. 5.

7. Un anticuerpo para inhibición de la angiogénesis y/o neovascularización o para inhibición de la proliferación de células endoteliales de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 6; o el uso de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 y 6, en donde el fragmento está constituido por los residuos de aminoácidos 93-201 de SEQ ID NO. 5.

8. Un anticuerpo para inhibición de la angiogénesis y/o neovascularización o para inhibición de la proliferación de células endoteliales de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 7; o el uso de un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, 6 y 7, en donde dicho anticuerpo se selecciona del grupo constituido por un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.

9. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia madura de VEGF-D derivada de un fragmento contenido dentro de los residuos 92-205 de SEQ ID NO. 5 para estimulación de la angiogénesis y/o neovascularización o la estimulación de la proliferación de células endoteliales en un mamífero.

10. Uso de un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos correspondiente a una secuencia madura de VEGF-D derivada de un fragmento contenido dentro de los residuos 92-205 de SEQ ID NO. 5 en la fabricación de una composición farmacéutica para estimulación de la angiogénesis y/o neovascularización o la estimulación de la proliferación de células endoteliales en un mamífero.

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la composición farmacéutica comprende adicionalmente al menos otra sustancia seleccionada del grupo constituido por VEGF, VEGF-B, VEGF-C, PIGF, PDGF y heparina.

12. Un polipéptido para estimulación de la angiogénesis y/o neovascularización o estimulación de la proliferación de células endoteliales de acuerdo con la reivindicación 9, o el uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde el polipéptido o la composición farmacéutica tiene por objeto la aceleración de la angiogénesis en la curación de las heridas, trasplante de tejidos u órganos, o para establecimiento de la circulación colateral en infartos tisulares o estenosis arterial, tal como la enfermedad de las arterias coronarias.

13. Un polipéptido para estimulación de la angiogénesis y/o neovascularización o estimulación de la proliferación de células endoteliales de acuerdo con la reivindicación 9; o el uso de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 10 o la reivindicación 11, en donde la estimulación de la proliferación de células endoteliales es la estimulación de la proliferación de células endoteliales en los vasos linfáticos.

14. Un polipéptido para estimulación de la angiogénesis y/o neovascularización o estimulación de la proliferación de células endoteliales de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9, 12 y 13; o el uso de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde el fragmento polipeptídico comprende los residuos de aminoácidos 93-201 de SEQ ID NO. 5.

15. Un polipéptido para estimulación de la angiogénesis y/o neovascularización o estimulación de la proliferación de células endoteliales de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9 y 12 a 14; o el uso de un polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, en donde el fragmento polipeptídico está constituido por residuos de los aminoácidos 93-201 de SEQ ID NO. 5.