ES2390107T3

ES2390107T3 - Factor recombinante de crecimiento de las células endoteliales vasculares-D (VEGF-D)

Info

Publication number: ES2390107T3
Application number: ES09162873T
Authority: ES
Inventors: Marc G. Achen; Andrew F. Wilks; Steven A. Stacker; Kari Alitalo
Original assignee: Vegenics Pty Ltd
Current assignee: Vegenics Pty Ltd
Priority date: 1996-08-23
Filing date: 1997-08-21
Publication date: 2012-11-06
Anticipated expiration: 2017-08-21
Also published as: US20060177428A1; EP2107109B1; AU729880B2; US20030114658A1; AU4079697A; US8227410B2; US20080058258A1; AU729880C; JP2001517075A; DE69734359T2; EP0956339B1; US20130345409A1; US20120322105A1; US20080145366A1; EP1749836A2; US7410639B2; DE69739469D1; US20030125537A1; EP0956339A1; US6689580B1

Abstract

Un polipéptido aislado que tiene la capacidad de estimular la proliferación de células endoteliales en un mamífero, en donde dicho polipéptido está constituido por la secuencia de un VEGF-D maduro que está contenida en el fragmento comprendido entre los residuos de aminoácidos 92 y 205 de SEQ ID NO: 5 de VEGF-D.

Description

Factor recombinante de crecimiento de las celulas endoteliales vasculares-D (VEGF-D)

Esta invencion se refiere a polipeptidos VEGF-D maduros, a DNA que codifica dichos polipeptidos y a composiciones farmaceuticas y diagnosticas y metodos que utilizan o se derivan de los polipeptidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La angiogenesis es un proceso fundamental requerido para el crecimiento y desarrollo normales de los tejidos, e implica la proliferacion de capilares nuevos a partir de vasos sanguineos preexistentes. La angiogenesis no solo esta implicada en el desarrollo embrionario y el crecimiento, reparacion y regeneracion normales de los tejidos, sino que esta implicada tambien en el ciclo reproductor femenino, el establecimiento y mantenimiento del embarazo, y en la reparacion de heridas y fracturas. Ademas de la angiogenesis que tiene lugar en el individuo normal, estan implicados sucesos angiogenicos en cierto numero de procesos patologicos, particularmente el crecimiento y la metastasis de los tumores, y otras condiciones en las cuales la proliferacion de vasos sanguineos, especialmente del sistema microvascular, esta incrementada, tales como retinopatia diabetica, psoriasis y artropatias. La inhibicion de la angiogenesis es util en la prevencion o el alivio de estos procesos patologicos.

Por otra parte, la promocion de la angiogenesis es deseable en situaciones en las cuales la vascularizacion debe establecerse o extenderse, por ejemplo despues de trasplante de tejidos u organos, o para estimular el establecimiento de la circulacion colateral en el infarto tisular o la estenosis arterial, tal como en la enfermedad cardiaca coronaria y la tromboangitis obliterante.

Debido al papel crucial de la angiogenesis en tantos procesos patologicos, los factores implicados en el control de la angiogenesis han sido investigados intensamente. Se ha demostrado que cierto numero de factores de crecimiento estan involucrados en la regulacion de la angiogenesis; estos incluyen factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs), factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), factor a del crecimiento transformante (TGFa), y factor de crecimiento de los hepatocitos (HGF). Vease por ejemplo, Folkman et at, "Angiogenesis", J. Biol. Chem., 1992, 267, 10931-10934 para una revision.

Se ha sugerido que una familia particular de factores de crecimiento endotelial especificos de celulas y sus receptores correspondientes es fundamentalmente responsable de la estimulacion del crecimiento y la diferenciacion de las celulas endoteliales, y de ciertas funciones de las celulas diferenciadas. Estos factores son miembros de la familia PDGF, y parecen actuar por la via de tirosina-quinasas receptoras endoteliales (RTKs). Hasta ahora, se han identificado cuatro subtipos de factor de crecimiento endotelial vascular. El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), conocido actualmente como VEGF-A, ha sido aislado de varias fuentes. VEGF-A exhibe actividad mitogena altamente especifica contra las celulas endoteliales y puede estimular la secuencia total de sucesos que conducen a la angiogenesis. Adicionalmente, el mismo presenta actividad quimioatractiva frente a los monocitos, puede inducir el activador del plasminogeno y el inhibidor del activador del plasminogeno en las celulas endoteliales, y puede influir tambien en la permeabilidad vascular. Debido a la ultima actividad, se hace referencia a veces al mismo como factor de permeabilidad vascular (VTF). El aislamiento y las propiedades de VEGF han sido revisados; vease Ferrara et at, Ferrara et at, "The Vascular Endothelial Growth Factor Family of Polypeptides", J. Cellular Biochem., 1991 47 211218 y Connolly, "Vascular Permeability Factor: A Unique Regulator of Blood Vessel Function", J. Cellular Biochem., 1991 47 219-223.

En fecha mas reciente, se han identificado tres miembros adicionales de la familia VEGF. Estos se designan VEGF-B, descrito en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US96/02957 (W0 96/26736) por Ludwig Institute for Cancer Research y la Universidad de Helsinki, VEGF-C, descrito en Joukov et at, The EMBO Journal, 1996 15 290298, y VEGF2, descrito en la Solicitud de Patente Internacional No. PCT/US94/05291 (WO 95/24473) por Human Genome Sciences, Inc. VEGF-B tiene propiedades angiogenicas y de otros tipos estrechamente similares a las de VEGF, pero esta distribuido y expresado en los tejidos de modo distinto que VEGF. En particular, VEGF-B se expresa muy intensamente en el corazon, y solo debilmente en el pulmon, en tanto que sucede lo contrario en el caso de VEGF. Esto sugiere que VEGF y VEGF-B, a pesar del hecho de que se coexpresan en muchos tejidos, pueden tener diferencias funcionales.

VEGF-B se aislo utilizando una tecnica de cribado con trampa de interaccion co-hibrida de levadura, cribado para proteinas celulares que podrian interaccionar con la proteina tipo I de fijacion de acido retinoico celular (CRABP-I). Su aislamiento y sus caracteristicas se describen en detalle en PCT/US 96/02597 y en Olofsson et at, Proc. Natl. Acad. Sci. 1996, 93, 2576-2581.

VEGF-C se aislo de medios acondicionados de la linea de celulas de adenocarcinoma de prostata PC-3 (CRL1435) por cribado respecto a la capacidad del medio para producir la fosforilacion de la tirosina de la tirosinaquinasa del receptor especifico de las celulas endoteliales Flt, utilizando celulas transfectadas para expresar Flt4. VEGF-C se purifico utilizando cromatografia de afinidad con Flt4 recombinante, y se clono a partir de una biblioteca de cDNA de PC-3. Su aislamiento y caracteristicas se describen en detalle en Joukov et at, The EMBO Journal, 1996, 15, 290-298.

VEGF2 se aislo de una linea de celulas de cancer de mama humano altamente tumorigena, independiente de estrogenos. Si bien se afirma que esta molecula tiene aproximadamente 22% de homologia a PDGF y 30% de homologia a VEGF, el metodo de aislamiento del gen que codifica VEGF2 no esta claro, y no se ha descrito caracterizacion alguna de la actividad biologica.

Los factores de crecimiento endotelial vascular parecen actuar por fijacion a tirosina-quinasas receptoras de la familia de los receptores de PDGF. Han sido identificadas 5 tirosina-quinasas receptoras especificas de las celulas endoteliales, a saber Flt-1 (VEGFR-1), KDR/Flk-1 (VEGFR-2), Flt4 (VEGFR-3), Tie y Tek/Tie-2. Todas estas tienen la actividad intrinseca de la tirosina-quinasa que es necesaria para la transduccion de senales. El papel esencial, especifico en la vasculogenesis y angiogenesis de Flt-1, Flk-1, Tie y Tek/Tie-2 ha sido demostrado por mutaciones direccionadas que desactivan estos receptores en embriones de raton. VEGFR-1 y VEGFR-2 fijan VEGF con afinidad alta, y VEGFR-1 fija tambien VEGF-B y el factor de crecimiento de la placenta (PlGF). Se ha demostrado que VEGF-C es el ligando para Flt4 (VEGFR-3), y activa tambien VEGFR-2 (Joukov et at, 1996). Un ligando para Tek/Tie-2 ha sido descrito por Regeneron Pharmaceuticals, Inc.); sin embargo, el ligando para Tie no ha sido identificado todavia.

El receptor Flt-4 se expresa en los endotelios venoso y linfatico del feto, y predominantemente en los endotelios linfaticos del adulto (Kaipainen et at, Cancer Res, 1994 54 6571-6577; Proc Natl. Acad. Sci. USA, 1995 92, 3566-3570). Se ha sugerido que VEGF-C puede tener una funcion primaria en el endotelio linfatico y una funcion secundaria en la regulacion de la angiogenesis y la permeabilidad que es compartida con VEGF (Joukov, et at, 1996).

Los autores de la presente invencion han aislado ahora cDNA humano que codifica una nueva proteina de la familia de los factores de crecimiento endotelial vascular. La nueva proteina, designada VEGF-D, tiene semejanzas estructurales con otros miembros de esta familia.

SUMARIO DE LA INVENCION

La invencion proporciona en general un polipeptido aislado que tiene la capacidad de estimular la proliferacion de celulas endoteliales en un mamifero, en donde dicho polipeptido esta constituido por la secuencia de un VEGF-D maduro que esta contenida en el fragmento comprendido entre los residuos de aminoacidos 92 y 205 de SEQ ID NO: 5 de VEGF-D, secuencias de DNA aisladas que codifican el polipeptido (con la condicion de que el polipeptido codificado no sea VEGF-D de longitud total (SEQ ID NO: 5)), un anticuerpo especificamente reactivo con el polipeptido, y composiciones utiles para aplicaciones diagnosticas y/o terapeuticas. Se describe tambien una molecula de acido nucleico aislada y purificada que codifica un nuevo polipeptido, designado VEGF-D, que es estructuralmente homologo a VEGF, VEGF-B y VEGF-C. La molecula de acido nucleico puede ser un cDNA que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 o SEQ ID NO. 7. Se describen tambien moleculas de DNA de secuencia tal que se hibridan en condiciones severas con el DNA de SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 o SEQ ID NO. 7. Preferiblemente, la molecula de DNA capaz de hibridarse en condiciones severas codifica la porcion de VEGF-D desde el residuo de aminoacido 93 al residuo de aminoacido 201, enlazado operativamente de modo opcional a una secuencia de DNA que codifica el peptido FLAGTM.

El cDNA pude comprender la secuencia expuesta en SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6 o SEQ ID NO. 7.

Se describe en esta memoria un polipeptido que posee la secuencia caracteristica de aminoacidos

Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys (SEQ ID NO. 2),

teniendo dicho polipeptido la capacidad de estimular la proliferacion de celulas endoteliales, y comprendiendo dicho polipeptido una secuencia de aminoacidos que corresponde sustancialmente a la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO. 3, o un fragmento o analogo de la misma que tiene la capacidad de estimular una o mas de proliferacion, diferenciacion, migracion o supervivencia de celulas endoteliales. Se hace referencia aqui a estas capacidades como "actividades biologicas de VEGF-D" y pueden ser testadas facilmente por metodos conocidos en la tecnica. Preferiblemente, el polipeptido de la invencion tiene la capacidad para estimular proliferacion de celulas endoteliales, con inclusion, pero sin caracter limitante, de la proliferacion de las celulas endoteliales vasculares y/o celulas endoteliales linfaticas.

Se describen tambien polipeptidos que tienen la secuencia indicada en SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 8 o SEQ ID NO. 9.

Un fragmento preferido del polipeptido de la invencion es la porcion de VEGF-D desde el residuo de aminoacido 93 al residuo de aminoacido 201, enlazada opcionalmente al peptido FLAGTM. En el caso en que el fragmento esta enlazado a FLAGTM, el fragmento es VEGFDLNLC, como se define en esta memoria.

Se describen tambien en esta memoria polipeptidos que comprenden sustituciones conservadoras, inserciones o deleciones, pero que retienen todavia la actividad biologica de VEGF-D. La persona experta en la tecnica sera perfectamente conocedora de metodos que pueden utilizarse facilmente para generar tales polipeptidos, por ejemplo el uso de mutagenesis orientada, o escision enzimatica y ligacion especificas. La persona experta conocera tambien que compuestos peptidomimeticos o compuestos en los cuales uno o mas residuos de aminoacidos estan reemplazados por un aminoacido no existente naturalmente o un analogo de aminoacido pueden retener los aspectos requeridos de la actividad biologica de VEGF-D. Tales compuestos pueden producirse y testarse facilmente por metodos conocidos en la tecnica.

Adicionalmente, se describen tambien formas variantes del polipeptido VEGF-D que resultan de corte y empalme (remodelacion) alternativos, como se sabe que existen en el caso de VEGF, y variantes alelicas existentes naturalmente de la secuencia de acido nucleico codificante de VEGF-D. Las variantes alelicas son bien conocidas en la tecnica, y representan formas alternativas o una secuencia de acido nucleico que comprenden sustitucion, delecion o adicion de uno o mas nucleotidos, pero que no conducen a alteracion funcional sustancial alguna del polipeptido codificado.

Como se utiliza en esta memoria, "VEGF-D" se refiere colectivamente a los polipeptidos de SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 8 y SEQ ID NO. 9 y fragmentos o analogos de los mismos que tienen la actividad biologica de VEGF-D como se define en esta memoria.

Tales formas variantes de VEGF-D pueden prepararse por direccionamiento de regiones no esenciales del polipeptido VEGF-D para modificacion. Estas regiones no esenciales se espera que caigan fuera de las regiones fuertemente conservadas indicadas en las figuras de esta memoria, especialmente en la Figura 2 y la Figura 10. En particular, los factores de crecimiento de la familia PDGF, con inclusion de VEGF, son dimeros, y VEGF-B, VEGF-C, PlGF, PDFG-A y PDGF-B exhiben una conservacion completa de 8 residuos cisteina en los dominios N-terminales, es decir, los dominios semejantes a PDGF (Olofsson et at, 1996; Joukov et at, 1996). Estas cisteinas se cree que estan implicadas en la formacion de enlaces disulfuro intra- e inter-moleculares. Adicionalmente, existen otros residuos cisteina altamente, pero no totalmente, conservados en los dominios C-terminales. Los bucles 1, 2 y 3 de cada subunidad, que estan formados por enlaces disulfuro intra-moleculares, estan implicados en la fijacion a los receptores para la familia PDGF/VEGF de factores de crecimiento (Andersson et at: Growth Factors, 1995, 12, 159164). Como se muestra en esta memoria, las cisteinas conservadas en los miembros previamente conocidos de la familia VEGF estan conservadas tambien en VEGF-D.

La persona experta en la tecnica es por tanto perfectamente sabedora de que estos residuos cisteina deberian preservarse en cualquier forma variante propuesta, y que los sitios activos presentes en los bucles 1, 2 y 3 deberian estar preservados tambien. En cambio, puede esperarse que otras regiones de la molecula tengan menor importancia para la funcion biologica, y por consiguiente representen dianas adecuadas para modificacion. Los polipeptidos modificados pueden testarse facilmente en cuanto a su capacidad para exhibir la actividad biologica de VEGF-D por procedimientos de ensayo de actividad rutinarios tales como tests de proliferacion celular.

Se contempla que algunos polipeptidos VEGF-D modificados tendran la capacidad de fijarse a celulas endoteliales, es decir a receptores VEGF-D, pero seran incapaces de estimular la proliferacion, diferenciacion, migracion o supervivencia de las celulas endoteliales. Estos polipeptidos modificados se espera que sean capaces de actuar como inhibidores competitivos o no competitivos de VEGF-D, y sean utiles en situaciones en las que es deseable la prevencion o reduccion de la accion de VEGF-D. A dichas variantes de VEGF-D fijadoras de receptores pero no mitogenas, no inductoras de diferenciacion, no inductoras de migracion o no promotoras de supervivencia de VEGF-D se hace referencia en esta memoria como "variantes de fijacion de receptores pero inactivas en otros aspectos".

De acuerdo con un tercer aspecto, la invencion proporciona un acido nucleico purificado y aislado que codifica un polipeptido o fragmento de polipeptido de la invencion (con la condicion de que el polipeptido codificado no sea VEGF-D de longitud total (SEQ ID NO: 5)). El acido nucleico puede ser DNA, DNA genomico, cDNA o RNA, y puede ser monocatenario o bicatenario. El acido nucleico puede aislarse de una fuente celular o tisular, o de origen recombinante o sintetico. Debido a la degeneracion del codigo genetico, la persona experta en la tecnica apreciara que son posibles muchas secuencias codificantes de este tipo, en donde cada secuencia codifica la secuencia de aminoacidos que se muestra en SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 8 o SEQ ID NO. 9, un fragmento activo o analogo de las mismas, o una variante de fijacion de receptores pero inactiva o parcialmente inactiva de las mismas en otros aspectos.

Un cuarto aspecto de la invencion proporciona vectores que comprenden el cDNA de la invencion o un acido nucleico de acuerdo con el tercer aspecto de la invencion, y celulas hospedadoras transformadas o transfectadas con acidos nucleicos o vectores de la invencion. Estas celulas son particularmente adecuadas para expresion del polipeptido de la invencion, e incluyen celulas de insecto tales como celulas Sf9, que pueden obtenerse de la American Type Culture Collection (ATCC SRL-171), transformadas con un vector de baculovirus, y la linea de celulas de rinon embrionario humano 293EBNA transfectada por un plasmido de expresion adecuado. Los vectores preferidos de la invencion son vectores de expresion en los cuales un acido nucleico de acuerdo con la invencion esta conectado operativamente a uno o mas promotores apropiados y/u otras secuencias de control, tales que las celulas hospedadoras apropiadas transformadas o transfectadas con los vectores son capaces de expresar el polipeptido de la invencion. Otros vectores preferidos son los adecuados para transfeccion de celulas de mamifero, o para terapia genica, tales como vectores de adenovirus o retrovirus, o liposomas. Una diversidad de vectores de este tipo se conocen en la tecnica.

La invencion proporciona tambien un metodo de construccion de un vector capaz de expresar un polipeptido codificado por un acido nucleico de acuerdo con la invencion, que comprende los pasos de conectar operativamente el acido nucleico a uno o mas promotores apropiados y/u otras secuencias de control como se ha descrito arriba.

La invencion proporciona adicionalmente un metodo de construccion de un polipeptido de acuerdo con la invencion, que comprende los pasos de expresar un acido nucleico o vector de la invencion en una celula hospedadora, y aislar el polipeptido de la celula hospedadora o del medio de crecimiento de la celula hospedadora. En una realizacion preferida de este aspecto de la invencion el vector de expresion comprende adicionalmente una secuencia que codifica un marcador de afinidad, tal como FLAGTM o hexahistidina, a fin de facilitar la purificacion del polipeptido por cromatografia de afinidad.

En un aspecto adicional mas, la invencion proporciona un anticuerpo especificamente reactivo con un polipeptido de la invencion. Tales anticuerpos son utiles como inhibidores o agonistas de VEGF-D y como agentes de diagnostico para deteccion y cuantificacion de VEGF-D. Pueden utilizarse anticuerpos policlonales o monoclonales. Pueden generarse anticuerpos monoclonales y policlonales contra los polipeptidos de la invencion utilizando metodos estandar en la tecnica. Para algunos propositos, por ejemplo en los casos en que debe utilizarse un anticuerpo monoclonal para inhibir los efectos de VEGF-D en una situacion clinica, puede ser deseable utilizar anticuerpos monoclonales humanizados o quimericos. Metodos para la produccion de estos, con inclusion de metodos de DNA recombinante, son asimismo bien conocidos en la tecnica.

Un anticuerpo de acuerdo con la invencion puede marcarse convenientemente.

Los polipeptidos o anticuerpos de acuerdo con la invencion pueden marcarse con un marcador detectable, y utilizarse para propositos diagnosticos. Analogamente, el polipeptido de la invencion asi marcado puede utilizarse para identificar su receptor correspondiente in situ. El polipeptido o anticuerpo puede acoplarse covalentemente o no covalentemente o un agente adecuado supermagnetico, paramagnetico, electronicamente denso, ecogenico o radiactivo para produccion de imagenes. Para uso en ensayos diagnosticos, pueden utilizarse marcadores radiactivos o no radiactivos, incluyendo los ultimos marcadores enzimaticos o marcadores del sistema biotina/avidina.

Aplicaciones clinicas de la invencion incluyen aplicaciones diagnosticas, aceleracion de la angiogenesis en la curacion de las heridas, trasplante de tejidos u organos, o para establecimiento de circulacion colateral en el infarto tisular o estenosis arterial, tal como estenosis de arterias coronarias, e inhibicion de la angiogenesis en el tratamiento del cancer o de la retinopatia diabetica. La cuantificacion de VEGF-D en especimenes de biopsias de cancer puede ser util como indicador del riesgo metastasico futuro.

Dado que VEGF-D se expresa en alta proporcion en el pulmon, y aumenta tambien la permeabilidad vascular, el mismo es relevante para una diversidad de condiciones pulmonares. Podrian utilizarse ensayos de VEGF-D en la diagnosis de diversos trastornos del pulmon. Podria utilizarse tambien VEGF-D en el tratamiento de trastornos pulmonares para mejorar la circulacion sanguinea en el pulmon y/o el intercambio de gases entre los pulmones y el torrente sanguineo. Analogamente, podria utilizarse VEGF-D para mejorar la circulacion sanguinea en el corazon y la permeabilidad al O2 gaseoso en casos de insuficiencia cardiaca. De modo analogo, podria utilizarse VEGF-D para mejorar el flujo sanguineo y el intercambio de gases en la enfermedad obstructiva cronica de las vias aereas.

Inversamente, los antagonistas (v.g. anticuerpos y/o inhibidores) de VEGF-D podrian utilizarse para el tratamiento en condiciones tales como la insuficiencia cardiaca congestiva, que implican acumulaciones de fluido en, por ejemplo, el pulmon, como resultado aumentos en la permeabilidad vascular, por ejercer un efecto de compensacion de la permeabilidad vascular a fin de contrarrestar la acumulacion de fluido.

VEGF-D se expresa tambien en el intestino delgado y el colon, y podrian utilizarse administraciones de VEGF-D para tratar los sindromes de malabsorcion en el tracto intestinal como resultado de sus actividades de aumento de la circulacion sanguinea y aumento de la permeabilidad vascular.

Se describe en esta memoria un metodo de estimulacion de la angiogenesis y/o neovascularizacion en un mamifero que se encuentra en necesidad de dicho tratamiento, que comprende el paso de administrar al mamifero una dosis eficaz de VEGF-D, o un fragmento o analogo del mismo que tiene la capacidad de estimular la proliferacion de celulas endoteliales.

VEGF-D puede administrarse junto con, o en asociacion con, uno o mas de VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, PlGF, PDGF, FGF y/o heparina.

Inversamente, se describe tambien un metodo de inhibicion de la angiogenesis y/o neovascularizacion en un mamifero que se encuentra en necesidad de un tratamiento estetico, que comprende el paso de administrar al mamifero una cantidad eficaz de un antagonista de VEGF-D. El antagonista puede ser cualquier agente que inhiba la accion de VEGF-D, sea por prevencion de la fijacion de VEGF-D a su receptor correspondiente o la celula diana, o por inhibicion de la activacion del transductor de la senal desde el receptor a su sitio de accion celular. Antagonistas adecuados incluyen, pero sin caracter limitante, anticuerpos dirigidos contra VEGF-D; inhibidores competitivos o no competitivos de la fijacion de VEGF-D al receptor de VEGF-D, tales como las variantes de VEGF-D de fijacion de receptores pero no mitogenas a que se ha hecho referencia arriba; y secuencias de nucleotidos antisentido complementarias a al menos una parte de la secuencia de DNA que codifica VEGF-D.

Un metodo de deteccion de VEGF-D en una muestra biologica comprende el paso de poner en contacto la muestra con un reactivo capaz de fijarse a VEGF-D, y detectar la fijacion. Preferiblemente, el reactivo capaz de fijarse a VEGF-D es un anticuerpo dirigido contra VEGF-D, mas preferiblemente un anticuerpo monoclonal. La fijacion y/o la extension de la fijacion pueden ser detectadas por medio de un marcador detectable; marcadores adecuados se han expuesto anteriormente.

En el caso en que debe utilizarse VEGF-D o un antagonista para propositos terapeuticos, la dosis y ruta de aplicacion dependeran de la afeccion a tratar, y estaran a discrecion del medico o veterinario encargado del tratamiento. Rutas adecuadas incluyen inyeccion subcutanea, intramuscular o intravenosa, aplicacion topica, implantes, etc. La aplicacion topica de VEGF-D puede utilizarse de manera analoga a VEGF.

Se describen tambien medios de diagnostico/pronostico tipicamente en forma de kits de test. Por ejemplo, un kit de test diagnostico/pronostico comprende un anticuerpo para VEGF-D y medios para la deteccion, y puede comprender tambien medios para evaluacion de la fijacion entre el anticuerpo y VEGF-D. El anticuerpo o el VEGF-D se marca con un marcador detectable, y el anticuerpo o el VEGF-D se fija al sustrato, de tal modo que puede establecerse la interaccion VEGF-D-anticuerpo por determinacion de la cantidad de marcador unida al sustrato despues de la fijacion entre el anticuerpo y el VEGF-D. Los medios diagnostico/pronostico pueden proporcionarse como un kit ELISA convencional.

Alternativamente, los medios diagnostico/pronostico pueden comprender medios de reaccion en cadena de polimerasa para establecer la estructura de la secuencia genomica de un gen VEGF-D de un individuo sometido a test y comparar esta estructura de secuencia con la descrita en esta solicitud a fin de detectar cualesquiera anormalidades, con vistas a establecer si cualquier aberracion en la expresion de VEGF-D esta relacionada con una condicion de enfermedad dada.

Un metodo de deteccion de aberraciones en la estructura del gen VEGF-D en un individuo sometido a test que pueden estar asociadas con una condicion de enfermedad en dicho individuo sometido a test comprende proporcionar una muestra de DNA de dicho individuo sometido a test; poner en contacto la muestra de DNA con un juego de iniciadores especificos para DNA de VEGF-D enlazados operativamente a una polimerasa y amplificar selectivamente el DNA de VEGF-D de la muestra por reaccion en cadena de polimerasa, y comparar la secuencia de nucleotidos del DNA de VEGF-D amplificado de la muestra con las secuencias de nucleotidos expuestas en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4. Un kit de test comprende un par de iniciadores especificos para DNA de VEGF enlazados operativamente a una polimerasa, donde dicha polimerasa es capaz de amplificar selectivamente el DNA de VEGF-D a partir de una muestra de DNA.

Otro aspecto de la invencion concierne al uso de un polipeptido o un anticuerpo de acuerdo con la invencion en la provision de una composicion farmaceutica que comprende o bien el polipeptido VEGF-D de la invencion que promueve la proliferacion de celulas endoteliales o un anticuerpo para el mismo. Composiciones que comprenden polipeptido VEGF-D de acuerdo con la invencion pueden comprender opcionalmente ademas uno o mas de VEGF, VEGF-B y VEGF-C, y/o heparina.

Un dimero de proteina comprende el polipeptido VEGF-D, particularmente un dimero enlazado por disulfuro. Los dimeros de proteina incluyen tanto homodimeros del polipeptido VEGF-D como heterodimeros de VEGF-D y VEGF, VEGF-B, VEGF-C, PlGF o PDGF.

Un metodo para aislamiento de VEGF-D comprende el paso de exponer una celula que expresa VEGF-D a heparina a fin de facilitar la liberacion de VEGF-D de la celula, y purificar el VEGF-D asi liberado.

Se describe en esta memoria un vector que comprende una secuencia de nucleotidos antisentido que es complementaria a al menos una parte de una secuencia de DNA que codifica VEGF-D o un fragmento o analogo del mismo que promueve la proliferacion de celulas endoteliales. Un vector de este tipo que comprende una secuencia antisentido puede utilizarse para inhibir, o al menos mitigar, la expresion de VEGF-D. El uso de un vector de este tipo para inhibir la expresion de VEGF-D se ve favorecido en casos en que la expresion de VEGF-D esta asociada con una enfermedad, por ejemplo donde determinados tumores producen VEGF-D a fin de proporcionar angiogenesis. La transformacion de tales celulas tumorales con un vector que contiene una secuencia de nucleotidos antisentido podria suprimir o retardar la angiogenesis, e inhibir o retardar asi el crecimiento del tumor.

Polinucleotidos tales como los arriba descritos, fragmentos de dichos polinucleotidos, y variantes de tales polinucleotidos con semejanza suficiente a la cadena no codificante de dichos polinucleotidos para hibridarse a la misma en condiciones severas son utiles todos ellos para identificar, purificar, y aislar polinucleotidos que incluyen otras formas de VEGF-D de mamifero no humanas. Condiciones de hibridacion severas ilustrativas son como sigue: hibridacion a 42°C en 5X SSC, NaPO4 20 mM, pH 6,8, 50% formamida; y lavado a 42°C en 0,2X SSC. Los expertos en la tecnica comprenderan que es deseable variar estas condiciones empiricamente basandose en la longitud y el contenido de bases nucleotidicas GC de las secuencias a hibridar, y que existen formulas para determinar dicha variacion. Vease por ejemplo Sambrook et at, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Second Edition, Cold Spring Harbor, Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory (1989).

Se comprendera claramente que los acidos nucleicos y polipeptidos de la invencion pueden prepararse por medios sinteticos o por medios recombinantes, o pueden purificarse a partir de fuentes naturales.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra una comparacion entre las secuencias de VEGF-D humano y VEGF165 humana (Figura 1a), VEGF-B humana (Figura 1b), VEGF-C humana (Figura 1c) y PlGF (Figura 1d). El recuadro indica residuos que coinciden exactamente con los de VEGF-D humano.

La Figura 2 muestra alineaciones de secuencia entre las secuencias de VEGF-D humano, VEGF165 humana, VEGF-B humana, VEGF-C humana y PlGF humana. Los recuadros indican residuos que coinciden exactamente con los de la secuencia VEGF-D; y

La Figura 3 muestra la secuencia de aminoacidos de VEGF-D humano (SEQ ID NO: 3), como se predice a partir de la secuencia de cDNA (SEQ ID NO: 1). Los recuadros indican sitios potenciales para glicosilacion unida a

N.

La Figura 4 muestra la secuencia de nucleotidos de una segunda secuencia de cDNA que codifica VEGF-D humano (SEQ ID NO 4), aislada por hibridacion a partir de una biblioteca de cDNA de pulmon comercial humana; este cDNA contiene la region codificante entera para VEGF-D humano.

La Figura 5 muestra la secuencia de aminoacidos para VEGF-D humano (SEQ ID NO 5) deducida de la secuencia del cDNA de la Figura 4.

La Figura 6 muestra la secuencia de nucleotidos de cDNA codificante de VEGF-D1 de raton (SEQ ID NO 6), aislada por cribado de hibridacion para una biblioteca de cDNA de pulmon de raton disponible comercialmente.

La Figura 7 muestra la secuencia de nucleotidos de cDNA codificante de VEGF-2 de raton (SEQ ID NO 7), aislada de la misma biblioteca que en la Figura 6.

La Figura 8 muestra las secuencias de aminoacidos deducidas para VEGF-D1 (SEQ ID NO 8) y VEGF-D2 (SEQ ID NO 9)) de raton.

La Figura 9 muestra una comparacion entre las secuencias de aminoacidos deducidas de VEGF-D1 de raton, VEGF-D2 de raton y VEGF-D humano.

La Figura 10 muestra alineaciones de secuencias entre las secuencias de aminoacidos de VEGF-D humano, VEGF165 humana, VEGF-B humana, VEGF-C humana y PlGF humana, y

la Figura 11 muestra los resultados de un bioensayo en el cual se testo el medio acondicionado de celulas COS que expresan VEGF-A o VEGF-D respecto a capacidad para fijarse al dominio extracelular de un receptor quimerico expresado en celulas Ba/F3.

La Figura 12 muestra los resultados del analisis por inmunoprecipitacion y transferencia Western de peptidos VEGF-D.

(A): Se transfectaron pEFBOSVEGFDfuttFLAG y pCDNA-1VEGF-A en celulas COS y se marcaron biosinteticamente con 35S-cisteina/metionina durante 4 horas. Los sobrenadantes de estos cultivos se sometieron a inmunoprecipitacion con gel M2 o con un antisuero dirigido a VEGF-A acoplado a la proteina A. Las cuentas lavadas se eluyeron con un volumen igual de tampon de muestra 2 x SDS-PAGE y se hirvieron. Las muestras se resolvieron luego por SDS-PAGE al 12%. Las pistas marcadas con un asterisco (*) indican donde se redujeron las muestras con ditiotreitol y se alquilaron con yodoacetamida. Se indican los marcadores de peso molecular. fA y fB indican las especies de 43 kD y 25 kD inmunoprecipitadas por el gel M2 a partir de las celulas COS que expresaban pEFBOSVEGFDfuttFLAG.

(B): Analisis por transferencia Western de VEGFDLaNaC). Se combino una parte alicuota del material eluido de la columna de afinidad M2 (fraccion #3, VEGFDaNaC) con 2 x tampon de muestra SDS-PAGE y se resolvio en un gel de SDS-PAGE al 15%. Las proteinas se transfirieron luego a membrana de nitrocelulosa y se sondaron con anticuerpo monoclonal M2 o con un anticuerpo de control coincidente en isotipo (Neg). Se revelaron las transferencias utilizando un anticuerpo secundario anti-raton-HRP de cabra y quimioluminiscencia (ECL, Amersham). El VEGFDLNLC monomero se designa por la punta de flecha, al igual que la forma dimera supuesta de este peptido (VEGFDLNLC"). Se indican los marcadores de peso molecular.

La Figura 13 muestra los resultados del analisis de VEGFDLNLC utilizando el bioensayo VEGFR2. La VEGFDLNLC recombinante, y el material purificado por cromatografia de afinidad de M2, se evaluaron durante el bioensayo VEGFR2. Celulas del bioensayo (104), lavadas para eliminar IL-3, se incubaron con partes alicuotas de medio acondicionado a partir de celulas COS transfectadas con VEGF-D, fraccion #1 de la columna de afinidad (volumen vacio) o fraccion #3 de la columna de afinidad (que contenia VEGFDLNLC). Todas las muestras se testaron a una concentracion inicial de 20% (es decir 1/5) seguida por diluciones al doble. Las celulas se dejaron incubar durante 48 horas a 37°C en una atmosfera humidificada con 10% de CO2. La proliferacion celular se cuantifico por la adicion de 1 !Ci de 3H-timidina y recuento de la cantidad incorporada a lo largo de un periodo de 4 horas.

La Figura 14 muestra la estimulacion de la fosforilacion de la tirosina del receptor VEGFR3 (Flt4) en celulas NIH3T3 por el sobrenadante de cultivo de celulas HF infectadas con un vector recombinante de baculovirus transformado con VEGF-D.

La Figura 15 muestra la estimulacion de la fosforilacion de la tirosina del receptor VEGFR2 (KDR) en celulas PAE por el sobrenadante de cultivo preparado como en la Figura 14.

La Figura 16 muestra el efecto mitogeno de VEGFDLNLC en celulas endoteliales de aorta de bovino (BAEs). Se trataron BAEs con la fraccion #3 que contenia VEGFDLNLC y, como control positivo, VEGF-A purificado como se describe en el texto. El resultado obtenido utilizando medio sin factor de crecimiento anadido se designa "Control de Medio".

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La invencion se describira a continuacion en detalle con referencia a las Figuras, y a los ejemplos no limitantes siguientes. Algunos de los ejemplos son comparativos en la medida en que los mismos no corresponden a la invencion tal como se reivindica.

Ejemplo 1 (comparativo)

Se ha especulado que no se encontraran mas miembros de la familia VEGF debido a que no existen receptores huerfanos conocidos en la familia VEGFR. Adicionalmente, los inventores no conocen con certeza sugestion alguna en la tecnica anterior de que puedan existir otros miembros de una familia de este tipo.

Se llevo a cabo incidentalmente una investigacion por ordenador de bases de datos de acido nucleico para otro proyecto, utilizando como materias de investigacion las secuencias de aminoacidos de VEGF, VEGF-B, VEGF-C y PlGF. Se identificaron varias secuencias de cDNA por esta investigacion. Una de estas secuencias, Acceso a GenBank No. H24828, codificaba un polipeptido que era similar en estructura a la region C-terminal de VEGF-C enriquecida en cisteina. Esta secuencia se obtuvo de la base de datos de marcadores de secuencia expresados (dbEST), y para los propositos de esta memoria descriptiva se designa XPT. El cDNA de XPT se habia aislado de una biblioteca de cDNA humana designada "Soares Breast 3NbHBst", que se construyo utilizando mRNA de un tejido mamario de hembra humana adulta. Hasta donde puede comprobarse este era tejido mamario normal. La secuenciacion del DNA de XPT se realizo de acuerdo con el Analisis Molecular Integrado del Consorcio de Expresion del Genoma (IMAGE Consortium), que solicita bibliotecas de cDNA de laboratorios de todo el mundo, dispone los clones de cDNA, y proporciona los mismos a otras organizaciones para secuenciacion.

La secuencia XPT que se muestra en la base de datos tenia una longitud de 419 nucleotidos, y codificaba una secuencia de aminoacidos similar a los 100 aminoacidos C-terminales de VEGF-C, es decir aproximadamente los residuos 250 a 350, utilizando el sistema de numeracion de Joukov et at (1996). Se encuentran analogamente regiones ricas en cisteina en otras proteinas, que carecen totalmente de relacion en funcion con la familia VEGF, por ejemplo la proteina secretada semejante a seda sp185 sintetizada en las glandulas salivares del jejen Chironomus tentans. Esta proteina es codificada por el gen BR3, localizado en un anillo de Balbiani, un "puff" de cromosomas especifico de tejido encontrado en los cromosomas politenicos de la glandula salivar del jejen (Dignam y Case: Gene, 1990, 88, 133-140; Paulsson et at, J. Mol. Biol., 1990 211, 331-349). Se afirma en Joukov et at (1996) que el resto estructural semejante a sp185 en VEGF-C puede plegarse en un dominio independiente, que se cree se encuentra al menos parcialmente escindido despues de la biosintesis, y que existe al menos un resto cisteina del tipo sp185 en la region C-terminal de VEGF.

La Figura 3 de Joukov et at muestra que los dos tercios finales de la region C-terminal rica en cisteina de VEGF-C no estan alineados con VEGF o PlGF y de hecho po-drian considerarse como una extension C-terminal de VEGF-C que no esta presente en VEGF o PlGF. La secuencia codificada por XPT es similar a esta extension. Dado que el cDNA de XPT estaba truncado en su extremo 5', no era posible deducir o predecir cualquier secuencia de aminoacidos para regiones N-terminales respecto al dominio rico en cisteina. Asi, la porcion de VEGF-C que es similar a la secuencia derivada de XPT no se extiende a las regiones de VEGF-C que estan conservadas entre otros miembros de la familia VEGF.

Como se ha descrito arriba, no era posible predecir si la region N-terminal de polipeptido codificado por un acido nucleico de XPT de longitud total (en lo que se diferencia del cDNA truncado de XPT consignado en dbEST) podria mostrar cualquier homologia adicional con cualquier miembro de la familia VEGF, en particular VEGF-C, que tiene 250 aminoacidos N-terminales adicionales. Por ejemplo, la proteina existente naturalmente codificada por un acido nucleico de XPT de longitud total podria haber sido el homologo humano de la proteina de la glandula salivar del jejen. Alternativamente, el tipo de resto rico en cisteina codificado por el cDNA de XPT truncado podria estar distribuido ampliamente entre las proteinas, al igual que muchos dominios estructurales. Por ejemplo, agrupaciones de residuos cisteina pueden estar implicadas en la fijacion de metales, formacion de enlaces disulfuro intramoleculares para promover el plegado exacto de las proteinas, o la formacion de enlaces disulfuro intermoleculares para ensamblaje de subunidades de proteinas en complejos (Dignam y Chase, 1990). Con objeto de determinar si el cDNA truncado de XPT se derivaba de secuencias codificantes de una molecula afin a VEGF, fue necesario aislar un cDNA de longitud mucho mayor.

Ejemplo 2 Clonacion de cDNA Codificante de VEGF-D

Una muestra del cDNA de XPT consignada en dbEST se obtuvo de la American Type Culture Collection, que es un suministrador registrado de clones de cDNA obtenidos por el IMAGE Consortium. La identidad del cDNA de XPT se confirmo por secuenciacion de nucleotidos, utilizando el metodo de terminacion de cadenas didesoxi (Sanger et at, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463-5467).

El cDNA de XPT se utilizo como sonda de hibridacion para cribar una biblioteca de cDNA de mama humana, que se obtuvo comercialmente de Clontech. Se aislo un clon positivo, y este clon se secuencio luego en ambas cadenas. Se recopilo la secuencia de nucleotidos, y se identifico un marco de lectura abierto. La secuencia de acido nucleico se expone en SEQ ID NO. 1. El polipeptido codificado por esta secuencia se designo VEGF-D, y su secuencia deducida de aminoacidos, designada SEQ ID NO. 3, se presenta en la Figura 3. En la Figura 3, los sitios supuestos de glicosilacion enlazados a N, con la secuencia de consenso N-X-S/T, en la cual X es cualquier aminoacido, se indican por los recuadros.

Ejemplo 3 Caracteristicas de VEGF-D (comparativo)

La secuencia de aminoacidos de VEGF-D se comparo con las de VEGF-A165, VEGF-B, VEGF-C y PlGF humanas. Estas comparaciones se exponen en las Figuras 1a a d respectivamente. Se calculo el grado de homologia de secuencia se calculo, y si las lagunas en la secuencia introducidas para los propositos de alineacion no se consideran en el calculo, VEGF-D tiene identidad de 31% con VEGF, identidad de 48% con respecto a VEGF-C, identidad de 28% con respecto a VEGF-B e identidad de 32% con respecto a PlGF. Asi pues, la proteina mas estrechamente afin identificada era VEGF-C.

Busquedas por ordenador de las bases de datos de acido nucleico GenBank, EMBL y SwissProt no revelaron ninguna secuencia de proteina identica a VEGF-D. Como era de esperar por la alineacion de secuencias a que se ha hecho referencia anteriormente, la proteina mas estrechamente afin encontrada en esta base de datos era VEGF-C. Se realizaron tambien busquedas de dbEST, pero no revelaron secuencia alguna que abarcara la region codificante completa de VEGF-D. La secuencia de VEGF-D no esta relacionada con la del ligando 1 de Tie-2 como se describe en WO 96/11269.

Es importante tener en cuenta que las unicas homologias detectadas se encontraban al nivel de la secuencia de aminoacidos. Por tanto, no habria sido posible aislar el cDNA o gDNA codificante de VEGF-D por metodos tales como hibridacion a baja severidad con una secuencia de acido nucleico codificante de otro miembro de la familia VEGF.

VEGF-D parece ser el mas estrechamente relacionado con los VEGF-C de todos los miembros de la familia VEGF. Dado que la secuencia de aminoacidos de VEGF-D incluye el resto semejante a sp185 rico en cisteina que se encuentra en VEGF-C, el polipeptido de la invencion puede jugar un papel funcional importante en los endotelios linfaticos. Si bien no se pretende quedar ligados por mecanismo propuesto alguno, se cree que VEGF-C y VEGF-D pueden constituir una matriz de tipo seda sobre la cual pueden crecer las celulas endoteliales. Los vasos linfaticos no tienen membrana basal alguna, por lo que la matriz de tipo seda puede formar un material base semejante a una membrana. Esto puede ser importante en la promocion del crecimiento celular y/o en la diferenciacion celular, y puede ser relevante para el cancer, especialmente las metastasis, la terapia con farmacos, la prognosis del cancer, etc.

Ejemplo 4 Caracteristicas Biologicas de VEGF-D

La secuencia de cDNA de VEGF-D se utilizo para predecir la secuencia de aminoacidos deducida de VEGF-D, las caracteristicas bioquimicas del polipeptido codificado, con inclusion de los numeros de aminoacidos fuertemente basicos, fuertemente acidos, hidrofobos y polares, el peso molecular, el punto isoelectrico, la carga a pH 7, y el analisis de la composicion de la proteina total. Este analisis se realizo utilizando el programa de analisis de proteinas Protean, Version 1.20 (DATASTAR). Estos resultados se resumen a continuacion en las Tablas 1 y 2. La Tabla 1 muestra tambien el uso de codones.

Tabla 1

Secuencia de DNA Traducida del contigo x de VEGF-D (1,978) Con el Codigo Genetico Estandar

Peso molecular 37056, 60 Daltons 425 aminoacidos 46 aminoacidos basicos fuertes (+)(K, R) 41 aminoacidos acidos fuertes (-)(D, E) 5 79 aminoacidos hidrofobos (A, I, L, F, W, V) 108 aminoacidos polares (N, C, Q, S, T, Y) Punto Isoelectrico 7,792 Carga a pH 7,0 6,371 El numero total de bases traducidas es 978 10 %A = 28,73 [281] %G = 23,11 [226] %T = 23,21 [227] %C = 24,95 [244] % Ambiguo = 0,00 [0] 15 %A+T = 51,94 [508] % C+G = 48,06 [470] Temp. de fusion Davis, Botstein, Roth, °C 84,09 Temp. Wallace, °C 3384,00

Contigo 2: Longitud del contigo: 2379 bases Longitud media/secuencia: 354 bases Longitud total de la secuencia: 4969 bases Tabla 2 Clase Estructural Predicha de la Proteina Total: Modificacion de Deleage & Roux de Nishikawa & Ooi 1987

Analisis: Proteina�ootal

Peso molecular: 37056,60 p.m.

Longitud: 325

1 microgramo =: 26,986 pMoles

Coeficiente de Extincion Molar: 30.200 ± 5%

1 A(280) =: 1,23 mg/ml

Punto Isoelectrico: 7,79

Carga a pH 7: 6,37

Tabla 2 (cont.)

Analisis de Composicion de la Proteina Total

Aminoacido(s): Recuento numerico % en Peso % por Frecuencia

Cargados (RKHYCDE) Ácidos (DS) Básicos (KR) Polares (NCQSTY) Hidrófobos (AILFWV)

Este analisis predice un peso molecular para el monomero de VEGF-D no procesado de 37 kilodaltons (kD), 5 comparado con los valores determinados experimentalmente (para

los peptidos totalmente procesados) de 20 a 27 kD para monomeros de VEGF-A, 21 kD para el monomero de VEGF-B y 23 kD para el monomero de VEGF-C.

Ejemplo 5

El aislamiento original de un cDNA para VEGF-D, descrito en el Ejemplo 2 implicaba el cribado de

10 hibridacion de una biblioteca de cDNA de mama humano. Dado que se aislo de este modo unicamente un solo clon de cDNA para VEGF-D, no fue posible confirmar la estructura del cDNA por comparacion con otros cDNAs de VEGF-D aislados independientemente. El trabajo descrito en este ejemplo, que implicaba aislamiento de clones de cDNA de VEGF-D humano adicionales, se llevo a cabo con objeto de confirmar la estructura del cDNA de VEGF-D humano. Adicionalmente, se aislaron clones de cDNA de VEGF-D de raton.

Dos bibliotecas de cDNA que se habian obtenido comercialmente de Stratagene, una para pulmon humano y una para pulmon de raton (numeros de catalogo 937210 y 936307, respectivamente), se utilizaron para cribado de hibridacion con una sonda de cDNA de VEGF-D. La sonda, que abarcaba desde los nucleotidos 1817 a 2495 de CDNA para VEGF-D humano descrito en el Ejemplo 2, se genero por reaccion en cadena de polimerasa (PCR) utilizando un plasmido que contenia el cDNA de VEGF-D como molde y los dos oligonucleotidos siguientes:

Aproximadamente dos millones de bacteriofagos recombinantes se cribaron con esta sonda de cada una de las dos bibliotecas de cDNA. Se aislaron subsiguientemente nueve clones de cDNA humanos y seis de raton para VEGF-D.

Dos de los nueve clones humanos de cDNA para VEGF-D se secuenciaron completamente utilizando el metodo de terminacion de cadenas didesoxi (Sanger et at, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, 74, 5463-5467). Los dos cDNAs contenian la region codificante entera para VEGF-D humano, y eran identicos excepto que uno de los clones era cinco nucleotidos mas largo que el otro en el termino 5'. La secuencia de nucleotidos del cDNA mas corto se muestra en la Figura 4, y se designa como SEQ ID NO. 4. La secuencia de aminoacidos para VEGF-D humano (hVEGF-D) deducida de este cDNA tenia una longitud de 354 residuos, y se muestra en la Figura 5; esta se designa como SEQ ID NO. 5. Se determinaron tambien las secuencias de las regiones 5' de cinco de los otros clones de cDNA de VEGF-D humanos. Para cada clon, la secuencia que se caracterizo contenia mas de 100 nucleotidos de DNA inmediatamente aguas abajo del sitio de comienzo de la traduccion de la region codificante. En todos los casos, las secuencias de estas regiones eran identicas a regiones correspondientes del cDNA de VEGF-D humano que se muestra en la Figura 4.

Los seis clones de cDNA de raton para VEGF-D se secuenciaron completamente. Solo dos de los clones contenian una region codificante entera para VEGF-D; los otros clones estaban truncados. Las secuencias de nucleotidos de los dos clones con la region codificante entera son diferentes, y codifican secuencias de aminoacidos de tamanos diferentes. La secuencia de aminoacidos mas larga se designa como mVEGF-D1, y la secuencia mas corta se designa mVEGF-D2. Las secuencias de nucleotidos de los cDNAs que codifican un mVEGF-1 y mVEGF-2 se muestran en las Figuras 6 y 7 respectivamente. Las secuencias de aminoacidos deducidas para mVEGF-D1 y mVEGF-2 se muestran en la Figura 8. Estas secuencias se designan respectivamente SEQ ID Nos. 6, 7, 8 y 9. Las diferencias entre las secuencias de aminoacidos son:

i) una insercion de cinco aminoacidos (DFSFE) despues del residuo 30 en mVEGF-D1 en comparacion con mVEGF-D2;

ii) divergencia completa de los extremos C-terminales despues del residuo 317 en mVEGF-D1 y el residuo 312 en VEGF-D2, que da como resultado que mVEGF-D1 sea considerablemente mas larga.

Tres de los cuatro cDNAs truncados para VEGF-D de raton codificaban la region C-terminal, pero no los 50 aminoacidos N-terminales. Estos tres cDNAs codificaban un extremo C-terminal para VEGF-D que es identico al correspondiente a mVEGF-D2. El otro cDNA truncado codificaba unicamente la mitad N-terminal de VEGF-D. La secuencia de aminoacidos deducida de este cDNA contenia los cinco aminoacidos DFSFE inmediatamente despues del residuo 30 encontrado en mVEGF-D1, pero no en mVEGF-D2.

Como se ha descrito arriba, la secuencia total del clon de cDNA de VEGF-D humano considerado en este ejemplo ha sido validada por comparacion con la correspondiente a un segundo clon humano. Adicionalmente, se encontro que la secuencia del extremo 5' de la region codificante era identica en otros cinco clones de cDNA de VEGF-D humanos. En contraste, la secuencia consignada en el Ejemplo 2 contenia la mayor parte de la region codificante para VEGF-D, pero era incorrecta cerca del extremo 5' de esta region. Esto era debido probablemente a que el cDNA de VEGF-D estaba truncado cerca del extremo 5' de la region codificante y en dicho punto se habia ligado con otro cDNA no identificado, y por consiguiente los primeros 30 codones de la secuencia codificante verdadera para VEGF-D habian sido delecionados y reemplazados con un residuo metionina. Este residuo metionina se definio como el aminoacido N-terminal de la secuencia de VEGF-D presentada en el Ejemplo 2.

Las regiones N-terminales de las secuencias de aminoacidos deducidas de VEGF-D1 y VEGF-D2 de raton son muy similares a la deducida para VEGF-D humano (vease la Figura 9). Esto indica tambien que la secuencia de aminoacidos correcta deducida para VEGF-D humano es la consignada en este ejemplo. Los 25 aminoacidos Nterminales de VEGF-D humano forman una region extremadamente hidrofoba, lo cual es consistente con la idea de que parte de esta region puede ser una secuencia senal para la secrecion de proteinas. La Figura 10 muestra la alineacion de la secuencia de VEGF-D humano con las secuencias de otros miembros de la familia VEGF de factores de crecimiento, a saber VEGF165 humana (hVEGF165), VEGF-B humana (hVEGF-B), VEGF-C humana (hVEGF-C) y Factor de Crecimiento Placentario humano (hPlGF). Cuando las lagunas en las alineaciones se ignoran para los propositos de calculo, se encuentra que VEGF-D humano tiene una identidad de 31% en la secuencia de aminoacidos con VEGF165 humano, 28% de identidad con VEGF-B humano, 48% de identidad con VEGF-C y 32% de identidad con PlGF humano. Claramente, VEGF-C es el miembro de esta familia que esta mas estrechamente relacionado con VEGF-D.

Las diferencias en secuencia para VEGF-D1 y VEGF-D2 de raton se originan muy probablemente por remodelacion diferencial de mRNA. Los 41 residuos de aminoacidos C-terminales de VEGF-D1 estan delecionados en VEGF-D2, y estan reemplazados con 9 residuos que no estan relacionados estrechamente con la secuencia de VEGF-D1. Por consiguiente, 4 residuos cisteina presentes cerca del termino C de VEGF-D1 estan delecionados en VEGF-D2. Este cambio puede alterar las estructuras terciaria o cuaternaria de la proteina, o puede afectar a la localizacion de la proteina en la celula o el entorno extracelular. El extremo C-terminal de VEGF-D humano se asemeja al de la VEGF-D1 de raton, no a la VEGF-D2 de raton. La pequena insercion de 5 aminoacidos despues del residuo 30 en VEGF-D1 de raton, que no esta presente en VEGF-D2 de raton o en VEGF-D humano, puede influir en el procesamiento proteolitico de la proteina.

VEGF-D esta altamente conservada entre raton y hombre. 85% de los residuos de aminoacidos de VEGF-D humano son identicos en VEGF-D1 de raton. Es probable que esto refleje la conservacion de la funcion de las proteinas. Funciones supuestas para VEGF-D han sido propuestas en esta memoria. Aunque no se han encontrado formas alternativas de cDNA de VEGF-D humano, es posible que la variacion de DNA de remodelacion que da lugar a numerosas formas de mRNA para VEGF-D de raton pueda ocurrir tambien en los tejidos humanos.

Ejemplo 6 Expresion de VEGF-D en celulas COS

Un fragmento del cDNA humano para VEGF-D, que abarca desde el nucleotido 1 al 1520 de la secuencia que se muestra en la Figura 4 y que contiene la region codificante entera, se inserto en el vector de expresion de mamifero pCDNA1-amp. Se utilizo el vector para transfectar transitoriamente celulas COS por el metodo DEAE-Dextrano como se ha descrito previamente (Aruffo y Seed, 1987) y los medios de cultivo de celulas acondicionados resultantes, recogidos despues de 7 dias de incubacion, se concentraron utilizando concentradores Amicon (Centricon 10, con un punto de corte por peso molecular de 10.000) de acuerdo con el fabricante. Los plasmidos utilizados para las transfecciones eran el constructo de expresion para VEGF-D humano y, como control positivo, un constructo fabricado por insercion de cDNA de VEGF-A de raton en pcDNA1-amp. Los medios acondicionados se testaron en dos bioensayos diferentes, como se describe mas adelante, y los resultados demuestran que las celulas COS expresaban y secretaban de hecho VEGF-D biologicamente activa.

Ejemplo 7 Bioensayo para Capacidad de VEGF-D para Fijacion al Receptor-2 de VEGF

Como se muestra en el Ejemplo 5, VEGF-D esta estrechamente relacionada en estructura primaria con otros miembros de la familia VEGF. La mayoria de los miembros de esta familia de proteinas son mitogenos y/o quimiotacticos para las celulas endoteliales (Keck et at, 1989; Leung et at, 1989; Joukov et at, 1996; Olofsson et at, 1996). Ademas, VEGF-A (conocido previamente como VEGF), el primer miembro de la familia VEGF que se describe en la bibliografia, es un inductor potente de la permeabilidad vascular (Keck et at, 1989). Dado que la estructura de las proteinas es un determinante importante de la funcion de las mismas, parece probable que VEGF-D pudiera ser mitogeno tambien para las celulas endoteliales o inducir permeabilidad vascular. Por esta razon, se testo VEGF-D humano en un bioensayo para la determinacion de su capacidad para fijarse al receptor-2 de VEGF (VEGFR2; conocido tambien como Flk-1), un receptor especifico de las celulas endoteliales que, cuando es activado por VEGF-A, se cree que da lugar a una senal mitogena (Strawn et at, 1996).

Un bioensayo para la deteccion de factores de crecimiento que se fijan a VEGFR2 ha sido desarrollado en la linea de celulas Ba/F3 dependiente de factores, y se describe en la Solicitud de Patente previa de los mismos inventores, No. PCT/US95/16755. Estas celulas crecen en presencia de interleuquina-3 (IL-3); sin embargo, la eliminacion de este factor da como resultado la muerte celular en el transcurso de 48 horas. Si se transfecta a las celulas Ba/F3 otro receptor capaz de suministrar un estimulo de crecimiento, las celulas pueden ser rescatadas por el factor de crecimiento especifico que activa dicho receptor cuando se cultivan las celulas en medio de carece de IL-3. En el caso especifico de tirosina-quinasas de tipo receptor (v.g. VEGFR2), pueden utilizarse receptores quimericos que contienen el dominio extracelular de la tirosina-quinasa receptora y los dominios transmembranal y citoplasmico del receptor eritropoyetina (EpoR). En este caso, la estimulacion con el ligando (v.g. VEGF), que se fija al dominio extracelular del receptor quimerico, da como resultado una senalizacion por el dominio citoplasmico de EpoR y el rescate subsiguiente de la linea de celulas en medio de crecimiento que carece de IL-3. La construccion del receptor quimerico utilizado en este estudio, constituido por el dominio extracelular de VEGFR2 de raton y los dominios transmembranal y citoplasmico de EpoR, y el bioensayo propiamente dicho se describen mas adelante.

Construcci6n det Ptasmido

i) Construccion de un plasmido para generacion de receptores quimericos VEGFR2

Para obtener un constructo plasmidico con el cual pudiera ligarse facilmente DNA codificante del dominio extracelular de VEGFR2 de raton con DNA codificante de otros dominios proteinicos, se utilizo mutagenesis orientada a fin de generar un sitio de la enzima de restriccion BglII en la posicion del cDNA de VEGFR2 de raton que codificaba la union del dominio extracelular y el dominio transmembranal. El clon de longitud total del cDNA de VEGFR2 de raton descrito por Oelrichs et at (1993) se subclono en el vector de expresion de mamifero pCDNA1amp, utilizando el sitio de la enzima de restriccion BstXI. Se genero DNA monocatenario UTP+ utilizando el origen de replicacion M13, y se utilizo este como molde para generar cDNA de VEGFR2 de raton que contenia el sitio BglII en la posicion deseada. El plasmido que contenia el cDNA de VEGFR2 alterado se designo pVEGFR2Bgl. Los fragmentos de DNA que codifican los dominios transmembranal y citoplasmico de cualquier receptor pueden insertarse en el sitio BglII de pVEGFR2bgl a fin de generar vectores VEGFR2 quimericos.

ii) Construccion del receptor quimerico VEGFR2/EpoR

El cDNA de EpoR de raton se subclono en el vector de expresion pCDNA1-amp, y se genero DNA monocatenario como molde para mutagenesis. Se inserto un sitio de la enzima de restriccion BglII en el cDNA de EpoR en la posicion codificante de la union de los dominios transmembranal y extracelular de EpoR para permitir la ligacion directa de este fragmento de DNA con el cDNA modificado codificante del dominio extracelular de VEGFR2 en pVEGFR2Bgl. Adicionalmente, se elimino un sitio BglII en el dominio citoplasmico de EpoR por una sustitucion silenciosa de un solo nucleotido. El fragmento de DNA que codificaba los dominios transmembranal y citoplasmico de EpoR se utilizo luego para reemplazar la porcion de pVEGFR2Bgl codificante de los dominios transmembranal y citoplasmico de VEGFR2. De este modo se genero un solo marco de lectura que codificaba el receptor quimerico constituido por el dominio extracelular de VEGFR2 y los dominios transmembranal y citoplasmico de EpoR.

El fragmento de DNA que codificaba el receptor quimerico se subclono en el vector de expresion pBOS, y se cotransfecto en la linea de celulas Ba/F3 con el plasmido pgk-neo en una relacion de 1:20. Las celulas que expresaban la proteina VEGFR2-EpoR se seleccionaron por analisis mediante citometria de flujo utilizado un anticuerpo monoclonal para el dominio extracelular de VEGFR2 (MAb 4H3). Este anticuerpo monoclonal se describe en la Solicitud de Patente Australiana No. PM 3794 presentada el 10 de febrero de 1994. Se seleccionaron lineas de celulas que expresaban niveles mayores de VEGFR2-EpoR por cultivo de las celulas en 5 !g/ml de MAb 4H3 o 25 ng/ml de VEGF recombinante. Se utilizo para el bioensayo una linea de celulas que expresaba niveles elevados de VEGFR2-EpoR, designada Ba/F3-NYK-EpoR.

Et Bioensayo

Las celulas Ba/F3-NYK-EpoR arriba descritas se lavaron tres veces en PBS para eliminar totalmente IL-3 y se resuspendieron a una concentracion de 1000 celulas por 13,5 !l de medio de cultivo y se dosificaron partes alicuotas de 13,5 !l por pocillo de una placa Terasaki de 60 pocillos. Se diluyeron luego medios acondicionados de celulas COS transfectadas en el medio de cultivo de las celulas. Como linea de celulas de control insensible se utilizaron celulas que expresaban un receptor quimerico constituido por el dominio extracelular Tie2 del receptor de celulas endoteliales y los dominios transmembranal y citoplasmico de EpoR. Las celulas se incubaron por espacio de 48-96 horas, durante cuyo tiempo las celulas incubadas exclusivamente en el medio de cultivo de celulas habian muerto y se registro la supervivencia/proliferacion relativa observada en los otros pocillos (es decir en presencia de medio acondicionado de celulas COS) por recuento de las celulas viables presentes por pocillo.

El medio acondicionado de celulas COS que se habia transfectado transitoriamente con plasmidos de expresion se concentro 30 veces y se utilizo en el bioensayo de VEGFR2. El medio concentrado acondicionado de celulas COS transfectadas con pCDNA1-amp se utilizo como control negativo.

Los resultados se muestran en la Figura 11, representandose el porcentaje de medio acondicionado de celulas COS concentrado 30 veces en el medio de incubacion (vol/vol) en funcion del numero de celulas viables en el pocillo despues de 48 horas de incubacion. Claramente, el medio acondicionado que contenia VEGF-A o VEGF-D era capaz de promover la supervivencia celular en este ensayo, lo que indicaba que ambas proteinas pueden fijarse a VEGFR2 y activarlo.

Ejemplo 8 Ensayo de Permeabilidad Vascular (comparativo)

VEGF-D humano, preparada como en el Ejemplo 6 y concentrada 30 veces, se testo en el ensayo de permeabilidad vascular de Miles (Miles y Miles, 1952) realizado en cobayos anestesiados (albino/blanco, 300-400 g). El medio concentrado acondicionado para celulas COS transfectadas con pCDNA1-amp se utilizo de nuevo como control negativo. Se anestesiaron cobayos con hidrato de cloral (3,6 g/100 ml; 0,1 ml por 10 g de peso corporal). Los lomos de los animales se afeitaron luego cuidadosamente con maquinillas de esquilar. Se suministro a los animales una inyeccion intracardiaca del colorante Azul Evans (0,5% en MT PBS, 0,5 ml) utilizando una aguja 23G, y se inyectaron luego por via intradermica con 100-150 !l de medio concentrado acondicionado con celulas COS. Despues de 15-20 min, se sacrificaron los animales y se extirpo la capa de la piel del lomo para dejar al descubierto los vasos sanguineos subyacentes. Para la cuantificacion, el area de cada inyeccion se extirpo y se calento a 45°C en 2-5 ml de formamida. Los sobrenadantes resultantes, que contenian el colorante extravasado, se examinaron luego espectrofotometricamente a 620 nm.

Para el animal 1, la absorbancia a 620 nm procedente de la inyeccion de medio concentrado 30 veces acondicionado con VEGF-A era 0,178, la correspondiente al medio concentrado 30 veces acondicionado de VEGF-D era 0,114, y la correspondiente al medio concentrado 30 veces de celulas transfectadas con pCDNA1-amp era 0,004. Para el animal 2, los medios concentrados 30 veces se diluyeron 4 veces en medio de cultivo de celulas antes de la inyeccion intradermica. La absorbancia a 620 nm para el medio acondicionado con VEGF-A era 0,141, la correspondiente a la muestra acondicionada con VEGF-D era 0,116 y la correspondiente a una muestra coincidente respecto al contenido de suero como control negativo era 0,017. La extravasacion incrementada de colorante observada para los animales, tanto en presencia de VEGF-A como de VEGF-D demostro que ambas proteinas inducian fuertemente la permeabilidad vascular.

Los datos aqui expuestos indican que VEGF-D es una proteina secretada que, al igual que VEGF-A, se fija a y activa VEGFR2 y puede inducir permeabilidad vascular.

Ejemplo 9 Bioactividades de los Polipeptidos VEGF-D Internos

La secuencia de aminoacidos deducida para VEGF-D incluye una region central que es similar en secuencia a todos los restantes miembros de la familia VEGF (aproximadamente los residuos 101 a 196 de la secuencia de aminoacidos de VEGF-D humano como se muestra en la alineacion de la Figura 10). Por esta razon, se penso que la porcion bioactiva de VEGF-D podria residir en la region conservada. Con objeto de testar esta hipotesis, se estudio la biosintesis de VEGF-D, y la region conservada de VEGF-D humano se expreso en celulas de mamifero, se purifico y se testo en bioensayos como se describe mas adelante.

Construcci6n de ptasmidos

Un fragmento de DNA que codificaba la porcion de VEGF-D humano desde el residuo 93 al 201, es decir, con las regiones N-y C-terminales eliminadas, se amplifico por reaccion en cadena de polimerasa con DNApolimerasa Pfu, utilizando como molde un plasmido que comprendia cDNA de VEGF-D humano de longitud total. El fragmento de DNA amplificado, cuya secuencia se confirmo por secuenciacion de nucleotidos se inserto luego en el vector de expresion pEFBOSSFLAG para originar un plasmido designado pEFBOSVEGFDLNLC. El vector pEFBOSSFLAG contiene DNA codificante de la secuencia senal para secrecion de proteina por el gen de interleuquina-3 (IL-3) y el octapeptido FLAGTM. El octapeptido FLAGTM puede ser reconocido por anticuerpos disponibles comercialmente tales como el anticuerpo monoclonal M2 (IBI/Kodak). El fragmento PCR de VEGF-D se inserto en el vector de tal manera que la secuencia senal de IL-3 se encontraba inmediatamente aguas arriba de la secuencia FLAGTM, que se encontraba a su vez inmediatamente aguas arriba de la secuencia VEGF-D. Las tres secuencias citadas se encontraban en el mismo marco de lectura, por lo que la traduccion de mRNA resultante de la transfeccion de pEFBOSVEGFDLNLC en celulas de mamifero podria dar lugar a una proteina que tuviera la secuencia senal de IL-3 en su termino N, seguido por el octapeptido FLAGTM y la secuencia VEGF-D. La escision de la secuencia senal y la secrecion subsiguiente de la proteina por la celula podria dar lugar a un polipeptido de VEGF-D que esta marcado con el octapeptido FLAGTM adyacente al termino N. Esta proteina se designo VEGFDLNLC.

Adicionalmente, se construyo un segundo plasmido, designado pEFBOSVEGFDfuttFLAG, en el cual la secuencia codificante de longitud total de VEGF-D humano estaba insertada en pEFBOSIFLAG de tal modo que la secuencia para el octapeptido FLAGTM se encontraba inmediatamente aguas arriba de, y en el mismo marco de lectura que la secuencia codificante de VEGF-D. El plasmido pEFBOSIFLAG carece de la secuencia senal de IL-3, por lo que la secrecion de la proteina de fusion VEGF-D/FLAG estaba dirigida por la secuencia senal de VEGF-D. Se diseno pEFBOSVEGFDfuttFLAG para dirigir la expresion en celulas de mamifero de VEGF-D de longitud total que estaba marcada en el terminal C con el octapeptido FLAGTM. Esta proteina se designa VEGFDfuttFLAG, y es util para el estudio de la biosintesis de VEGF-D.

Anatisis det Procesamiento de VEGF-D Posterior a ta Traducci6n

Para examinar si el polipeptido VEGF-D se procesa para dar una proteina madura y totalmente activa, se transfecto transitoriamente pEFBOSVEGFDfuttFLAG en celulas COS (Aruffo y Seed, 1987). La expresion en celulas COS seguida por marcacion biosintetica con 354S-metionina/cisteina e inmunoprecipitacion con gel M2 ha demostrado la presencia de especies de aproximadamente 43 kd (fA) y 25 kd (fB) (Figura 12A). Estas bandas son consistentes con la idea de que VEGF-D se escinde para dar un fragmento C-terminal (marcado con FLAGTM) y un peptido interno (que corresponde aproximadamente a la proteina VEGFDLNLC). La reduccion de los inmunoprecipitados (M2*) proporciona cierta reduccion de la banda fA, lo que indica el potencial para enlaces disulfuro entre los dos fragmentos.

Expresi6n y Purificaci6n det Potipeptido Interno VEGF-D

Se utilizo el plasmido pEFBOSVEGFDLNLC para transfectar transitoriamente celulas COS por el metodo DEAE-Dextrano como se ha descrito previamente (Aruffo y Seed, 1987). El medio de cultivo de celulas acondicionado resultante (aproximadamente 150 ml), recogido despues de 7 dias de incubacion, se sometio a cromatografia de afinidad utilizando una resina a la cual se habia acoplado el anticuerpo monoclonal M2. Resumidamente, el medio se hizo pasar por lotes a traves de una columna de anticuerpo M2 de 1 ml durante aproximadamente 4 horas a 4°C. La columna se lavo luego concienzudamente con Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM antes de la elucion con el peptido FLAGTM libre a 25 !g/ml en el mismo tampon. El material resultante se utilizo para los bioensayos descritos mas adelante.

Con objeto de detectar el VEGFDLNLC purificado, las fracciones eluidas de la columna de afinidad M2 se sometieron a analisis por transferencia Western. Partes alicuotas de las fracciones de la columna se combinaron con tampon de muestra 2 x SDS-PAGE, se hirvieron y se cargaron en un gel de SDS-poliacrilamida al 15%. Las fracciones resueltas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y los sitios de fijacion inespecificos se bloquearon por incubacion en Tris-NaCl/Tween 20 (TST) y polvo de leche desnatada al 10% (BLOTTO). Las membranas se incubaron luego con el anticuerpo monoclonal M2 o el anticuerpo de control a 3 !g/ml durante 2 h a la temperatura ambiente, seguido por lavado concienzudo en TST. Las membranas se incubaron luego con un antisuero secundario anti-raton de cabra conjugado a HRP durante 1 hora a la temperatura ambiente, seguido por lavado en tampon TST. La deteccion de las especies de proteinas se realizo utilizando un reactivo quimioluminiscente (ECL, Amersham) (Figura 12B).

En condiciones no reductoras, se detecto una especie de peso molecular aproximadamente 23 kD (VEGFDLNLC) por el anticuerpo M2. Esto es consistente con el peso molecular predicho para este fragmento interno (12.800) mas glicosilacion unida a N; VEGFDLNLC contiene dos sitios de glicosilacion potenciales enlazados a N. Se detecto tambien una especie de aproximadamente 40 kD, y puede representar un dimero no covalente de la proteina de 23 kD (VEGFDLNLC).

Bioensayos

El bioensayo para la capacidad de los polipeptidos de fijarse al receptor-2 de VEGF se describe en detalle en el Ejemplo 7. Partes alicuotas de las fracciones eluidas de la columna de afinidad M2, que contenian la proteina VEGFDLNLC, se diluyeron en medio y se testaron en el bioensayo de VEGFR2 como se ha descrito previamente. La fraccion #3 de la columna de afinidad, que se demostro contenia la proteina VEGFDLNLC purificada (Figura 12B), demostro una aptitud clara para inducir proliferacion de la linea de celulas del bioensayo a una dilucion de 1/100 de la fraccion purificada (Figura 13). En comparacion, el volumen vacio de la columna de afinidad (fraccion #1) no exhibia actividad alguna, mientras que el medio acondicionado original VEGFDLNLC exhibia solamente una actividad debil.

El ensayo de permeabilidad vascular (Miles y Miles, 1952) se describe resumidamente en el Ejemplo 8. Partes alicuotas de VEGFDLNLC purificado, y muestras del volumen vacio de la columna de afinidad M2 (control negativo) se combinaron con medio y se inyectaron intradermicamente en la piel de cobayos. Las regiones de la piel en los sitios de inyeccion se extirparon, y se eluyo el colorante extravasado. La absorbancia del colorante extravasado a 620 nm originado por la inyeccion de VEGFDLNLC purificado era 0,131 ± 0,09. En comparacion, el valor para la absorbancia originada por la inyeccion de una muestra del volumen vacio era 0,092 ± 0,020. Por consiguiente, VEGFDLNLC inducia permeabilidad vascular, si bien el efecto era solo marginal.

Debido a su capacidad para fijarse a VEGFR2 y su menor induccion de la permeabilidad vascular comparada con VEGF-D de longitud total, puede decirse que VEGF-DLNLC reduce relativamente la induccion de la permeabilidad vascular por VEGF-D a causa de inhibicion competitiva. En este sentido, puede pensarse que el fragmento VEGF-DLNLC es un antagonista para VEGF-D en lo que respecta a la induccion de permeabilidad vascular.

Sumario

Dos factores han conducido a los autores de la invencion a explorar fragmentos internos de VEGF-D en cuanto a actividad intensificada. En primer lugar, es la region central de VEGF-D la que exhibe homologia de aminoacidos con todos los restantes miembros de la familia VEGF. En segundo lugar, el procesamiento proteolitico que da lugar a polipeptidos bioactivos internos ocurre para otros factores de crecimiento tales como PDGF-BB. Adicionalmente, la actividad observada con la proteina VEGF-D de longitud total en celulas COS era menor que para el medio acondicionado correspondiente de celulas COS transfectadas con VEGF-A.

Se predijo que la secuencia madura de VEGF-D podria derivarse de un fragmento contenido dentro de los residuos 92-205, con escision en FAAATFY e IIRRASIQI.

El analisis por inmunoprecipitacion de VEGF-DfuttFLAG expresada en celulas COS producia especies consistentes con la escision proteolitica interna del polipeptido VEGF-D en estos sitios. Por esta razon, se produjo una forma truncada de VEGF-D, con las regiones terminales N y C eliminadas (VEGFDLNLC) y se expreso en celulas COS. Esta proteina se identifico y se purifico utilizando el anticuerpo M2. La proteina VEGFDLNLC era detectada tambien por el anticuerpo A2, que reconoce un peptido dentro del fragmento 92-205 de VEGF-D (no representado). Se evaluo VEGFDLNLC por el bioensayo VEGFR2 y el ensayo de permeabilidad vascular de Miles, y se demostro que se fija al receptor VEGFR2 y activa el mismo en un bioensayo disenado para detectar la reticulacion del dominio extracelular de VEGFR2. La induccion de permeabilidad vascular por este polipeptido en un ensayo Miles era en el mejor de los casos marginal, en contraste con el efecto de VEGF-A.

Ejemplo 10 VEGF-D se Fija a VEGFR-3 y lo Activa

El cDNA de VEGF-D humano se clono en vectores lanzadera de baculovirus para la produccion de VEGF-D recombinante. Ademas de los vectores lanzadera de baculovirus, que contenian el cDNA de VEGF-D sin modificar (al que se hace referencia como "VEGF-D de longitud total"), se ensamblaron dos vectores lanzadera de baculovirus, en los cuales el cDNA de VEGF-D se modifico de las maneras siguientes.

En un constructo (al que se hace referencia como "VEGF-D-H6 de longitud total") se anadio un marcador histidina C-terminal. En el otro constructo, se eliminaron los polipeptidos N- y C-terminales supuestos, se fusiono el peptido senal melitina en marco con el termino N, y se anadio un marcador histidina al termino C del dominio de homologia de VEGF restante (al que se hace referencia como "LNLC-MELsp-VEGF-D-H6").

Para cada uno de los tres constructos, se amplificaron clones de baculovirus de dos o tres transfecciones independientes. El sobrenadante de celulas High Five (HF) se recogio 48 horas despues de la infeccion con stocks de titulo de virus alto. El sobrenadante se ajusto a pH 7 con NaOH y se diluyo con un volumen de D-MEM (0,2% FCS).

Se testaron las muestras respecto a su aptitud para estimular la fosforilacion de la tirosina de VEGFR-3 (receptor Flt4) en las celulas NIH3T3, como ha sido descrito por Joukov et at, 1996. El sobrenadante de las celulas no infectadas y el sobrenadante de las celulas infectadas con la variante corta de remodelacion de VEGF-C, que no estimula la fosforilacion de la tirosina de VEGFR-3, se utilizaron como control negativo. Como control positivo se utilizo VEGF-C modificada del mismo modo que LNLC-melSP-VEGF-D-H5. Los resultados se muestran en la Figura

14.

La aparicion de bandas nuevas a 125 y 195 kD indica fosforilacion, y por consiguiente activacion del receptor.

Ejemplo 11 VEGF-D se Fija a VEGFR-2 y la Activa

Se clono cDNA de VEGF-D humano modificado y sin modificar en vectores lanzadera de baculovirus para la produccion de VEGF-D recombinante como se describe en el Ejemplo 10.

Para cada uno de los tres constructos de VEGF-D, VEGF-D-H6 de longitud total, y LNLC-melSP-VEGF-D-H6, se amplificaron clones de baculovirus de dos o tres transfecciones independientes. El sobrenadante de las celulas High Five (HF) se recogio 48 horas despues de la infeccion con stocks de alto titulo de virus. El sobrenadante se ajusto a pH 7 con NaOH y se diluyo con un volumen de D-MEM (0,2% FCS).

Los sobrenadantes acondicionados con las proteinas marcadas con histidina se testaron respecto a su aptitud para estimular la fosforilacion de la tirosina del receptor KDR de acuerdo con Joukov et at (1996). KDR es el homologo humano de flk1 (VEGFR-2).

El sobrenadante de las celulas no infectadas y el sobrenadante de las celulas infectadas con el mutante 156S de VEGF-C, que no estimula KDR, se utilizaron como controles negativos. Como controles positivos se utilizaron VEGF165 y VEGF-C modificados del mismo modo que LNLC-melSP-VEGF-D-H6. Los resultados se muestran en la Figura 15.

La aparicion de una nueva banda a aproximadamente 210 kD indica fosforilacion, y por consiguiente activacion, del receptor.

Ejemplo 12 Analisis de la Expresion del Gen VEGF-D

Con objeto de caracterizar el patron de expresion del gen VEGF-D en los embriones humano y de raton, se utilizaron cDNAs de VEGF-D como sondas de hibridacion para analisis por transferencia Northern de RNA humano poliadenilado y para analisis de hibridacion in situ con embriones de raton.

Expresi6n det gen en et Adutto Humano

Un fragmento de 1,1 kb del cDNA de VEGF-D humano representado en la Figura 4 (SEQ ID NO. 4) que abarcaba desde el sitio EcoRV al termino 3' (nucleotidos 911 a 2029) se marco con [a-32P]dATP utilizando el sistema de marcacion de DNA Megaprime (Amersham) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se utilizo esta sonda para cribar transferencias Northern de tejidos multiples humanos (Clontech) por hibridacion, asimismo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Estas transferencias contenian RNA poliadenilado obtenido de tejidos de humanos adultos que estaban aparentemente exentos de enfermedad. La autorradiografia con las transferencias marcadas revelo que el mRNA de VEGF-D era muy abundante en corazon, pulmon y musculo esqueletico. El mRNA de VEGF-D exhibia una abundancia intermedia en bazo, ovario, intestino delgado y colon, y su abundancia era escasa en rinon, pancreas, timo, prostata y testiculos. No se detecto mRNA alguno de VEGF-D en el RNA de cerebro, placenta, higado o leucocitos de sangre periferica. En la mayoria de los tejidos en los que se detecto mRNA de VEGF-D, el tamano del transcrito era 2,3 kb. La unica excepcion era el musculo esqueletico, donde se detectaron dos transcritos de VEGF-D de 2,3 kb y 2,8 kb. En el musculo esqueletico, el transcrito de 2,3 kb era mas abundante que el transcrito de 2,8 kb.

Expresi6n det gen en embriones de rat6n

Con objeto de generar una sonda de RNA antisentido para mRNA de VEGF-D de raton, se inserto el cDNA de VEGF-D2 de raton representado en la Figura 7 (SEQ ID NO. 7) en el vector de transcripcion pBluescriptIIKS+ (Stratagene). El plasmido resultante se digirio completamente con la endonucleasa de restriccion FokI y se utilizo luego como molde para una reaccion de transcripcion in vitro con RNA-polimerasa T3. Esta reaccion de transcripcion dio lugar a una sonda de RNA antisentido para mRNA de VEGF-D cuya secuencia era complementaria a la region del cDNA de VEGF-D2 (Figura 7) desde el termino 3' hasta el sitio de escision por FokI mas proximo al termino 3' (nucleotidos 1135 a 700). Esta sonda de RNA antisentido se hibrido en condiciones de alta severidad con secciones de tejidos incrustadas en parafina generadas a partir de embriones de raton en el dia post-coital 15,5. La hibridacion y el lavado se realizaron esencialmente como se ha descrito con anterioridad (Achen et at, 1995).

Despues de lavado y secado, se expusieron los portaobjetos a pelicula de autorradiografia durante 6 dias.

El revelado de la pelicula de autorradiografia demostro que el mRNA de VEGF-D esta localizado en el pulmon en desarrollo de los embriones del dia 15,5 post-coital. La senal para mRNA de VEGF-D en el pulmon era fuerte y muy especifica. Las hibridaciones de control con sonda de sentido no producian ruido de fondo detectable alguno en pulmon o ningun otro tejido.

Sumario

El gen VEGF-D se expresa extensamente en el humano adulto, pero por supuesto no se expresa de manera ubicua. La expresion mas fuerte se detecto en corazon, pulmon y musculo esqueletico. En los embriones de raton, el dia 15,5 post-coital, se detectaba una expresion fuerte y especifica del gen VEGF-D en el pulmon. Estos datos sugieren que VEGF-D puede jugar un papel en el desarrollo del pulmon, y que la expresion del gen VEGF-D en el pulmon persiste en el adulto, al menos en los humanos. La expresion del gen en otros tejidos en el humano adulto sugiere que VEGF-D puede desempenar otras funciones en otros tejidos adultos.

Ejemplo 13 VEGF-D es Mitogeno para las Celulas Endoteliales

Algunos miembros de la familia VEGF de proteinas, a saber VEGF-A (Leung et at, 1989) y VEGF-B (Olofsson et at, 1996), son mitogenos para las celulas endoteliales. Con objeto de testar la capacidad mitogena de VEGFDLNLC para las celulas endoteliales, se expreso y purifico esta proteina por cromatografia de afinidad como se describe en el Ejemplo 9. La fraccion #3, eluida de la columna de afinidad M2, que contenia VEGFDLNLC, se diluyo en relacion 1 a 10 en medio de cultivo de celulas que contenia 5% de suero y se aplico a celulas endoteliales de aorta de bovino (BAEs) que se habian propagado en medio que contenia 10% de suero. Las BAEs se habian sembrado en capsulas de 24 pocillos a una densidad de 10.000 celulas por pocillo el dia antes de la adicion de VEGFDLNLC, y tres dias despues de la adicion de este polipeptido se disociaron las celulas con tripsina y se contaron. Se incluyo en el experimento VEGF-A purificado como control positivo. Los resultados se muestran en la Figura 16. La adicion de la fraccion #3 al medio de cultivo de celulas condujo a un aumento de 2,4 veces en el numero de BAEs despues de tres dias de incubacion, resultado que era comparable al obtenido con VEGF-A. Claramente, VEGFDLNLC es mitogeno para las celulas endoteliales.

Ejemplo 14 Localizacion del Gen VEGF-D en los Cromosomas Humanos

Con objeto de generar sondas de hibridacion para localizacion del gen VEGF-D en los cromosomas humanos, se aislo un clon de DNA genomico humano para VEGF-D a partir de una biblioteca de DNA genomico humano (Clontech). La biblioteca genomica se cribo por hibridacion con el cDNA de VEGF-D humano que se muestra en la Figura 4, utilizando metodos estandar (Sambrook et at, 1989). Se demostro que uno de los clones asi aislados contenia parte del gen VEGF-D por hibridacion a numerosos oligonucleotidos que se derivaban en secuencia del cDNA de VEGF-D humano. Una region del clon genomico, de aproximadamente 13 kb de tamano, se purifico en gel de agarosa, se marco por traslacion de la mella con biotina-14-dATP y se hibrido in situ a una concentracion final de 20 ng/!l hasta metafases de dos varones humanos normales. Se modifico el metodo de hibridacion in situ con fluorescencia (FISH) respecto al descrito previamente (Callen et at, 1990) en el sentido de que los cromosomas se tineron antes del analisis con yoduro de propidio (como contratincion) y DAPI (para identificacion de los cromosomas). Las imagenes de las operaciones de metafase se capturaron con una camara CCD refrigerada, utilizando el sistema de recogida y mejora de imagenes CytoVision Ultra (Applied Imaging Int. Ltd.). Las senales FISH y el patron de bandas DAPI se combinaron para analisis.

Se examinaron 15 metafases del primer varon normal respecto a senal fluorescente. Diez de las metafases exhibian senal en una cromatida (tres celulas) o ambas cromatidas (siete celulas) del cromosoma X en la banda p22.1. Se observaron un total de 9 puntos de ruido de fondo inespecificos en estas 15 metafases. Se obtuvo un resultado similar por la hibridacion de la sonda a 15 metafases del segundo varon normal, en las que se observo la senal en Xp22.1 en una sola cromatida en 7 celulas y en ambas cromatidas en 4 celulas. En conclusion, el gen VEGF-D humano esta localizado en el cromosoma X en la banda p22.1.

Ejemplo 15 Localizacion del gen VEGF-D Murino en los Cromosomas del Raton (comparativo)

La localizacion cromosomica en el raton del gen VEGF-D se determino por analisis de retrocruzamiento interespecifico utilizando progenie generada por apareamiento de hembras (C57BL/6J x Mus spretus)F1 y machos CB7BL/67 como se ha descrito previamente (Copeland y Jenkins, 1991). Este panel de mapeado de retrocruzamiento interespecifico ha sido tipificado para mas de 2400 loci que estan bien distribuidos entre todos los autosomas asi como en el cromosoma X (Copeland y Jenkins, 1991). Se digirieron los DNAs de C57BL/6J y M. spretus con varias enzimas y se analizaron por hibridacion de transferencia Southern respecto a polimorfismos de longitud de fragmentos de restriccion informativos (RFLPs) utilizando una sonda de cDNA de VEGF-D de raton de 1,3 kb esencialmente como se ha descrito (Jenkins et at, 1982). Se detectaron fragmentos de 7,1, 6,3, 4,7, 2,5 y 2,2 kb en DNA de C57BL/6J digerido con TaqI y se detectaron fragmentos principales de 7,1, 3,7, 2,7 y 2,2 kb en DNA de M. spretus digerido con TaqI. La presencia o ausencia de los fragmentos 3,7 y 2,7 especificos de M. spretus TaqI, que se cosegregaban, se siguio en los ratones generados por retrocruzamiento. Los resultados del mapeado indicaban que el gen VEGF-D esta localizado en la region distal del cromosoma X del raton enlazado a Bik, DxPasI y Ptmb4. Aunque se analizaron 89 ratones para todos los marcadores, se tipificaron hasta 133 ratones para algunos pares de marcadores. Cada locus se analizo en combinaciones por pares respecto a frecuencias de recombinacion utilizando los datos adicionales. Las relaciones del numero total de ratones que exhibian cromosomas recombinantes al numero total de ratones analizados para cada par de loci y el orden mas probable de los genes son: centromero -Btk - 14/121 - DxPasI - 3/99 -VEGF-D - 5/133 - Ptmb4. Las frecuencias de recombinacion [expresadas con distancias geneticas en centiMorgans (cM) ± el error estandar], calculadas utilizando Map Manager (version 2.6.5), son - Btk - 11,6 ± 2,9 -DxpasI - 3,0 ± 1,7 - VEGF-D - 3,8 ± 1,7 - Ptmb4. Una descripcion de las sondas y RFLPs para los loci enlazados al gen VEGF-D, con inclusion de Btk, DxPasI y Ptmb4, ha sido comunicada previamente (Hacfliger et at, 1992; Holloway et at, 1997).

Los autores de la invencion han comparado el presente mapa interespecifico del cromosoma X con un mapa compuesto de enlaces de raton que consigna la localizacion en el mapa de muchas mutaciones no clonadas (proporcionado por Mouse Genome Database, una base de datos computerizada mantenida en la Jackson Library, Bar Harbor, ME). El gen VEGF-D mapeaba en una region del mapa compuesto que carece de mutaciones de raton con un fenotipo que podria esperarse para una alteracion en el caso del locus de un mitogeno de celulas endoteliales. La region distal del cromosoma X del raton comparte una region de homologia con la rama corta de los cromosomas X humanos (Mouse Genome Database). La ubicacion del gen VEGF-D en este intervalo en el raton sugiere que el homologo humano mapeara a Xp22. Esto es consistente con el analisis FISH de los inventores, que ha localizado el gen humano en Xp22.1.

Numerosos estados de enfermedad son causados por mutaciones en genes desconocidos que se han mapeado a Xp22.1 y las posiciones que rodean inmediatamente esta region en el humano. Estos estados de enfermedad incluyen el sindrome de Kallmann, albinismo ocular (tipo Nettleship-Falls), albinismo ocular y sordera sensorineural, sindrome de Partington, displasia espondiloepifisaria (tardia), retinitis pigmentosa 15, disgenesis gonadal (tipo hembra XY), sindrome cataratico-dental de Nance-Horan, retinosquisis, enfermedad de Charcot-Marie-Tooth, produccion de celulas F, hipomagnesemia, queratosis folicular espinulosa decalvans, sindrome de Coffin-Lowry, dermoides corneales, hipofosfatemia, agammaglobulinemia, sindrome de Aicardi, hipofosfatemia hereditaria II, retardo mental (no dismorfico), sindrome G de Opitz, trastorno pigmentario (reticulado), inversion sexual sensible a la dosificacion, hipoplasia suprarrenal, retinitis pigmentosa-6, sordera 4 (sensorineural congenita) y sindrome de Wilson-Turner. Las posiciones de los genes implicados en estos estados de enfermedad se documentan en el mapa de genes OMIM, que ha sido publicado por Dr. Victor McKusick y colaboradores en la Universidad Johns Hopkins (EE.UU.).

BIOENSAYOS PARA DETERMINAR LA FUNCION DE VEGF-D

Otros ensayos se conducen para evaluar si VEGF-D tiene actividades similares a VEGF en relacion con la funcion de las celulas endoteliales, la angiogenesis y la curacion de las heridas. Pueden realizarse tambien ensayos adicionales, dependiendo de los resultados de los estudios de distribucion de la fijacion de receptores.

I. Ensayos�ee�ncn6i�n�ee�las�Celclas�Eneoteliales

a) Protiferaci6n de cetutas endotetiates

Se realizan ensayos de crecimiento de celulas endoteliales por metodos por metodos bien conocidos en la tecnica, v.g., los de Ferrara & Henzel (1989), Gospodarowicz et at (1989), y/o Claffey et at, Biochim. Biophys. Acta, 1995 1246 1-9. b) Ensayo de adhesi6n cetutar

Se testa el efecto de VEGF-D sobre la adhesion de granulocitos polimorfonucleares a celulas endoteliales.

c) Quimiotaxis

Se utiliza el ensayo estandar de quimiotaxis de la camara de Boyden para testar el efecto de VEGF-D sobre la quimiotaxis.

d) Ensayo det activador det ptasmin6geno

Se testan celulas endoteliales en cuanto al efecto de VEGF-D sobre el activador del plasminogeno y la produccion de inhibidores del activador del plasminogeno, utilizando el metodo de Pepper et at (1991).

e) Ensayo de Migraci6n de tas Cetutas Endotetiates

Se ensaya la capacidad de VEGF-D para estimular las celulas endoteliales a migrar y formar tubos como se describe en Montesano et at (1986). Alternativamente, puede utilizarse el ensayo del gel tridimensional de colageno descrito por Joukov et at (1996) o una membrana gelatinizada en una camara de Boyden modificada (Glaser et at 1980).

II.�Ensayo�ee Angiogenesis

La aptitud de VEGF-D para inducir una respuesta angiogenica en la membrana corioalantoica del pollo se testa como se describe en Leung et at (1989). Alternativamente, puede utilizarse el ensayo de la cornea de la rata, de Rastinejad et at (1989); este es un metodo aceptado para ensayo de la angiogenesis in vivo, y los resultados son transferibles facilmente a otros sistemas in vivo.

III.�Ccra6i�n�ee las�eerieas

La capacidad de VEGF-D para estimular la curacion de las heridas se testa en el modelo mas importante clinicamente disponible, como se describe en Schilling et at (1959) y como ha sido utilizado por Hunt et at (1967).

IV.�El�Sistema�eemopoyeti6o

Se conocen en la tecnica una diversidad de ensayos in vitro e in vivo que utilizan poblaciones especificas de celulas del sistema hemopoyetico, y se resenan a continuacion. En especial, son particularmente convenientes una diversidad de ensayos in vitro de celulas madre murinas que utilizan celulas purificadas en clasificadores de celulas activados por fluorescencia:

a) Cetutas Madre Repobtadoras

Estas son celulas capaces de repoblar la medula osea de ratones irradiados letalmente, y tienen el fenotipo Lin-, Rhh1, Ly-6A/E+, c-kit+. Se testa VEGF-D en estas celulas sea solas, o por co-incubacion con otros factores, seguido por medida de la proliferacion celular por incorporacion de 3H-timidina.

b) Cetutas Madre de Etapa Tardfa

Estas son celulas que tienen comparativamente poca capacidad de repoblacion de la medula osea, pero pueden generar D13 CFU-S. Estas celulas tienen el fenotipo Lin-, Rhh1, Ly-6A/E+, c-kit+. Se incuba VEGF-D con estas celulas durante cierto periodo de tiempo, se inyecta en receptores irradiados letalmente, y se cuenta el numero de colonias D13 en el bazo.

c) Cetutas Enriquecidas en Progenitor

Estas son celulas que responden in vitro a factores de crecimiento simples y tienen el fenotipo Lin-, Rhh1, Ly-6A/E+, c-kit+. Este ensayo indicara si VEGF-D puede actuar directamente sobre celulas progenitoras hemopoyeticas. VEGF-D se incuba con estas celulas en cultivos de agar, y se cuenta el numero de colonias presentes despues de 7-14 dias.

V. Ateroes6lerosis

Las celulas musculares lisas juegan un papel crucial en el desarrollo o la iniciacion de la ateroesclerosis, requiriendo un cambio de su fenotipo desde un estado contractil a un estado sintetico. Macrofagos, celulas endoteliales, linfocitos T y plaquetas juegan todos ellos un papel en el desarrollo de las placas ateroescleroticas por influir en el crecimiento y las modulaciones fenotipicas de la celula muscular lisa. Un ensayo in vitro que utiliza una camara Rose modificada en el cual se siembran diferentes tipos de celulas en cubreobjetos enfrentados mide la tasa de proliferacion y las modulaciones fenotipicas de las celulas musculares lisas en un entorno multicelular, y se utiliza para evaluar el efecto de VEGF-D sobre las celulas musculares lisas.

VI. Metastasis

La capacidad de VEGF-D para inhibir las metastasis se ensaya utilizando el modelo del carcinoma de pulmon de Lewis, utilizando por ejemplo el metodo de Cao et at (1995).

VII.�VEFnDD�en�otros�oipos ee�Celclas

Los efectos de VEGF-D sobre la proliferacion, diferenciacion y funcion de otros tipos de celulas, tales como las celulas hepaticas, el musculo y otras celulas cardiacas, celulas endocrinas y osteoblastos pueden ensayarse facilmente por metodos conocidos en la tecnica, tales como la absorcion de 3H-timidina por cultivos in vitro. La expresion de VEGF-D en estos y otros tejidos puede medirse por tecnicas tales como transferencia Northern e hibridacion o por hibridacion in situ.

VIII. Constrc66i�n �ee�Variantes y Analogos�ee�VEFnDD

VEGF-D es un miembro de la familia PDGF de factores de crecimiento que exhibe un alto grado de homologia con los otros miembros de la familia PDGF. VEGF-D contiene ocho residuos cisteina conservados que son caracteristicos de esta familia de factores de crecimiento. Estos residuos cisteina conservados forman enlaces disulfuro intercatenarios que producen la estructura de nudos de la cisteina, y enlaces disulfuro intracatenarios que forman los dimeros de proteina que son caracteristicos de los miembros de la familia de factores de crecimiento PDGF. VEGF-D interaccionara con los receptores de factores de crecimiento de la proteina tirosina-quinasa.

En contraste con las proteinas en que se conoce poco o nada acerca de la estructura proteinica y los sitios activos necesarios para la fijacion de receptores y la actividad consiguiente, el diseno de mutantes activos de VEGF-D se ve facilitado notablemente por el hecho de que se sabe mucho acerca de los sitios activos y aminoacidos importantes de los miembros de la familia de factores de crecimiento PDGF.

Articulos publicados que dilucidan las relaciones estructura/actividad de miembros de la familia de factores de crecimiento PDGF incluyen, para PDGF: Oestman et at, J. Biol. Chem., 1991 266 10073-10077; Andersson et at,

J. Biol. Chem., 1992 267 11260-1266; Oefner et at, EMBO J., 1992 11 3921-3926; Flemming et at, Molecular and Cell Biol., 1993 13 4066-4076 y Andersson et at, Growth Factors, 1995 12 159-164; y para VEGF: Kim et at, Growth Factors, 1992 7 53-64; P6tgens et at, J. Biol. Chem., 1994 269 32879-32885 y Claffey et at, Biochem. Biophys. Acta, 1995 1246 1-9. Partiendo de estas publicaciones es evidente que, debido a los ocho restos cisteina conservados, los miembros de la familia de factores de crecimiento PDGF exhiben una estructura plegada anudada y dimerizacion caracteristicas, que dan como resultado la formacion de tres regiones de bucle expuestas en cada extremo de la molecula dimerizada, en las cuales puede esperarse que esten localizados los sitios activos de fijacion de los receptores.

Basandose en esta informacion, una persona experta en las tecnicas de la biotecnologia puede disenar mutantes de VEGF-D con una probabilidad muy alta de retencion de la actividad de VEGF-D por la conservacion de los ocho residuos cisteina responsables de la configuracion plegada anudada y de la dimerizacion, asi como por la conservacion, o realizacion unicamente de sustituciones conservadoras de aminoacidos en las secuencias probables de los receptores en la region del bucle 1, bucle 2 y bucle 3 de la estructura de la proteina.

La formacion de mutaciones deseadas en sitios especificamente direccionados en una estructura de proteina esta considerada como una tecnica estandar en el arsenal del quimico especialista en proteinas ( biblio»). Ejemplos de dicha mutagenesis orientada con VEGF pueden encontrarse en P6tgens et at, J. Biol. Chem., 1994 269 32879-32885 y Claffey et at, Biochim. Biophys. Acta, 1995 1246 1-9. De hecho, la mutagenesis orientada es tan comun que estan disponibles comercialmente kits para facilitar tales procedimientos (v.g., Promega 1994-1995 Catalog., paginas 142-145).

La actividad de proliferacion de las celulas endoteliales de los mutantes de VEGF-D puede confirmarse facilmente por procedimientos de cribado bien establecidos. Por ejemplo, puede utilizarse un procedimiento analogo al ensayo mitotico de las celulas endoteliales descrito por Claffey et at, (Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1246, 1-9). Analogamente, pueden testarse los efectos de VEGF-D sobre la proliferacion de otros tipos de celulas, sobre la diferenciacion celular y sobre las metastasis humanas, utilizando metodos que son bien conocidos en la tecnica.

REFERENCIAS

REALIZACIONES ADICIONALES

Las siguientes realizaciones se describen pero no se reivindican como parte de la invencion.

1.: Una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica un polipeptido que comprende una secuencia de aminoacidos que corresponde sustancialmente a la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 8 o SEQ ID NO. 9, teniendo dicho polipeptido la capacidad de estimular la permeabilidad vascular o la proliferacion de celulas endoteliales, o un fragmento o analogo del mismo que tiene la capacidad de estimular al menos una actividad biologica seleccionada del grupo constituido por angiogenesis, permeabilidad vascular, proliferacion, diferenciacion, migracion o supervivencia de celulas endoteliales, o que tiene la capacidad de fijarse a las celulas endoteliales pero es incapaz de estimular al menos una de dichas actividades biologicas.

2.: Una molecula de acido nucleico de acuerdo con la realizacion 1, en donde dicha molecula de acido nucleico comprende una secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos: Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys (SEQ ID NO. 2).

3.: Una molecula de acido nucleico de acuerdo con la realizacion 1, en donde dichas celulas endoteliales se seleccionan del grupo constituido por celulas endoteliales vasculares y celulas endoteliales linfaticas.

4.: Una molecula de acido nucleico de acuerdo con la realizacion 1, que es un DNA genomico.

5.: Una molecula de acido nucleico de acuerdo con la realizacion 1, que es un cDNA.

6.: Una molecula de acido nucleico de acuerdo con la realizacion 5, que comprende la secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, o una secuencia de DNA que se hibrida con una de las secuencias anteriores en condiciones severas.

7.: Una molecula de acido nucleico de acuerdo con la realizacion 6, que comprende la secuencia de acido nucleico de SEQ ID NO.4.

8.: Una molecula de acido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 7, que codifica un polipeptido que tiene la capacidad de estimular la permeabilidad vascular o la proliferacion de celulas endoteliales.

9.: Una molecula de acido nucleico de acuerdo con la realizacion 1, que codifica un polipeptido que comprende los residuos de aminoacidos desde 64 hasta 172 de SEQ ID NO: 3 o los residuos de aminoacidos desde 93 hasta 201 de SEQ ID NO: 5.

10.: Una molecula de acido nucleico de acuerdo con la realizacion 9, en donde dicho polipeptido comprende adicionalmente una secuencia peptidica de marcador de afinidad.

11.: Una molecula de acido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 7, que codifica un polipeptido que tiene la capacidad de fijarse a celulas endoteliales pero es incapaz de estimular la proliferacion de celulas endoteliales.

12.: Una molecula de acido nucleico de acuerdo con la realizacion 11, en donde dichas celulas endoteliales se seleccionan del grupo constituido por celulas endoteliales vasculares y celulas endoteliales linfaticas.

13.: Una molecula de acido nucleico de acuerdo con la realizacion 1, en donde dicha molecula de acido nucleico es una molecula de DNA humano.

14.: Un vector que comprende un acido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 13.

15.: Una celula hospedadora transformada o transformada con un vector de acuerdo con la realizacion 14.

16.: Un polipeptido aislado que comprende una secuencia de aminoacidos que corresponde sustancialmente a la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ ID NO. 3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 8 o SEQ ID NO. 9, teniendo dicho polipeptido la capacidad de estimular la permeabilidad vascular o la proliferacion de celulas endoteliales, o un fragmento o analogo del mismo que tiene la capacidad de estimular al menos una actividad biologica de celulas endoteliales seleccionada del grupo constituido por proliferacion celular, diferenciacion celular, migracion celular, supervivencia celular y permeabilidad vascular, o que tiene la capacidad de fijarse a las celulas endoteliales pero es incapaz de estimular al menos una de dichas actividades biologicas.

17.: Un polipeptido de acuerdo con la realizacion 16, en donde dicho polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos: Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys (SEQ ID NO. 2).

18.: Un polipeptido de acuerdo con la realizacion 16, en donde dichas celulas endoteliales se seleccionan del grupo constituido por celulas endoteliales vasculares y celulas endoteliales linfaticas.

19.: Un polipeptido de acuerdo con la realizacion 16, que comprende una secuencia de aminoacidos que corresponde sustancialmente a SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5.

20.: Un polipeptido de acuerdo con la realizacion 19, que comprende una secuencia de aminoacidos que corresponde sustancialmente a SEQ ID NO: 5.

21.: Un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 16 a 20, que tiene la capacidad de estimular la proliferacion de celulas endoteliales.

22.: Un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 16 a 20, que tiene la capacidad de inducir la diferenciacion de celulas endoteliales.

23.: Un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 16 a 20, que tiene la capacidad de inducir la permeabilidad vascular.

24.: Un polipeptido de acuerdo con la realizacion 16, que comprende los residuos de aminoacidos desde 64 hasta 172 de SEQ ID NO: 3 o desde 93 hasta 201 de SEQ ID NO: 5.

25.: Un polipeptido de acuerdo con la realizacion 24, que comprende adicionalmente una secuencia peptidica de marcador de afinidad.

26.: Un polipeptido de acuerdo con la realizacion 16 o 17, que tiene la capacidad de fijarse a celulas endoteliales pero es incapaz de estimular la proliferacion de celulas endoteliales.

27.: Un polipeptido de acuerdo con la realizacion 26, en donde dichas celulas endoteliales se seleccionan del grupo constituido por celulas endoteliales vasculares y celulas endoteliales linfaticas.

28.: Un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 16 a 20, en donde dicho polipeptido es una proteina humana.

29.: Un anticuerpo especificamente reactivo con un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 16 a 28.

30.: Un anticuerpo de acuerdo con la realizacion 29, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo policlonal.

31.: Un anticuerpo de acuerdo con la realizacion 29, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

32.: Un anticuerpo de acuerdo con la realizacion 29, en donde dicho anticuerpo esta marcado con un marcador detectable.

33.: Un metodo de construccion de un polipeptido de acuerdo con la realizacion 16, comprendiendo dicho metodo los pasos de: cultivar una celula hospedadora transformada o transfectada con un vector que comprende una secuencia de acido nucleico que codifica dicho polipeptido conectada operativamente a una secuencia promotora de manera tal que la secuencia de acido nucleico que codifica dicho polipeptido se exprese; y aislar dicho polipeptido de dicha celula hospedadora o de un medio de crecimiento en el que dicha celula hospedadora se cultive.

34.: Un metodo de aislamiento de VEGF-D que comprende el paso de exponer una celula que exprese VEGF-D a heparina para facilitar la liberacion de VEGF-D de la celula, y purificar el VEGF-D liberado de este modo.

35.: Un metodo de construccion de un vector capaz de expresar un polipeptido codificado por una molecula de acido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 1 a 9, comprendiendo dicho metodo insertar dicha molecula de acido nucleico en un vector en una posicion en la que dicha molecula de acido nucleico este conectada operativamente con al menos un promotor.

36.: Un vector que comprende una secuencia de nucleotidos antisentido, siendo dicha secuencia de nucleotidos antisentido complementaria a al menos una parte de una secuencia de DNA genomico de VEGF-D o una secuencia de RNA de VEGF-D o una secuencia de cDNA que codifica VEGF-D o un fragmento o analogo del mismo que

promueve al menos una bioactividad seleccionada entre permeabilidad vascular, proliferacion de celulas endoteliales y diferenciacion de celulas endoteliales, en donde dicho vector puede utilizarse para inhibir dicha bioactividad.

37.: Un metodo de estimulacion de la proliferacion de celulas endoteliales que comprende poner en contacto celulas endoteliales con una cantidad estimuladora de la proliferacion de celulas endoteliales eficaz de un polipeptido de acuerdo con la realizacion 16.

38.: Un metodo de acuerdo con la realizacion 37, en donde dichas celulas endoteliales se seleccionan del grupo constituido por celulas endoteliales vasculares y celulas endoteliales linfaticas.

39.: Un metodo de estimulacion de al menos una bioactividad seleccionada entre proliferacion de celulas endoteliales, diferenciacion de celulas endoteliales y permeabilidad vascular, in vivo en un mamifero, comprendiendo dicho metodo administrar a dicho mamifero una cantidad estimuladora de la bioactividad eficaz de un polipeptido de acuerdo con la realizacion 16,que tiene la capacidad de estimular dicha bioactividad.

40.: Un metodo de acuerdo con la realizacion 39, en donde dicho polipeptido comprende los residuos de aminoacidos desde 64 hasta 172 de SEQ ID NO: 3 o los residuos de aminoacidos desde 93 hasta 201 de SEQ ID NO: 5.

41.: Un metodo de acuerdo con la realizacion 39, en donde se estimula la proliferacion de celulas endoteliales de vasos linfaticos.

42.: Un metodo de estimulacion de al menos una bioactividad seleccionada entre angiogenesis y neovascularizacion en un mamifero, comprendiendo dicho metodo el paso de administrar a dicho mamifero una cantidad estimuladora de la angiogenesis o neovascularizacion eficaz de un polipeptido de acuerdo con la realizacion 16, teniendo dicho polipeptido la capacidad de estimular la proliferacion de celulas endoteliales.

43.: Un metodo de acuerdo con la realizacion 42, en donde dicho polipeptido comprende los residuos de aminoacidos desde 64 hasta 172 de SEQ ID NO: 3 o los residuos de aminoacidos desde 93 hasta 201 de SEQ ID NO: 5.

44.: Un metodo de acuerdo con la realizacion 43, en donde dicho polipeptido comprende adicionalmente una secuencia peptidica de marcador de afinidad.

45.: Un metodo de acuerdo con la realizacion 32, que comprende adicionalmente administrar conjuntamente al menos una sustancia seleccionada del grupo constituido por VEGF, VEGF-B, VEGF-C, PIGF, PDGF, FGF y heparina.

46.: Un metodo de inhibicion de una bioactividad seleccionada entre angiogenesis y neovascularizacion en un mamifero, comprendiendo dicho metodo el paso de administrar a dicho mamifero una cantidad inhibitoria de la angiogenesis o la neovascularizacion eficaz de un antagonista de VEGF-D.

47.: Un metodo de acuerdo con la realizacion 46, en donde dicho antagonista de VEGF-D comprende un anticuerpo especifico para VEGF-D.

48.: Un metodo de acuerdo con la realizacion 46, en donde dicho antagonista de VEGF-D comprende un polipeptido que se fija a celulas endoteliales pero que es incapaz de estimular al menos una actividad biologica seleccionada entre proliferacion de celulas endoteliales, diferenciacion de celulas endoteliales y permeabilidad vascular.

49.: Un metodo de acuerdo con la realizacion 48, en donde dichas celulas endoteliales se seleccionan del grupo constituido por celulas endoteliales vasculares y celulas endoteliales linfaticas.

50.: Un metodo de inhibicion de la expresion de VEGF-D en un mamifero que comprende el paso de transformar celulas diana que expresan VEGF-D con un vector de acuerdo con la realizacion 36.

51.: Una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 16 a 24 y un portador o adyuvante farmaceuticamente aceptable.

52.: Una composicion farmaceutica de acuerdo con la realizacion 51, que comprende adicionalmente al menos una sustancia seleccionada del grupo constituido por VEGF, VEGF-B, VEGF-C, PIGF, PDGF y heparina.

53.: Una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 29 a 32 y un portador o adyuvante farmaceuticamente aceptable.

54.: Una composicion farmaceutica de acuerdo con la realizacion 53, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

55.: Un dimero de proteina que comprende un primer polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 16 a 24 y un segundo polipeptido.

56.: Un dimero de proteina de acuerdo con la realizacion 55, en donde dicho dimero de proteina es un homodimero en el que el segundo polipeptido es identico al primer polipeptido.

57.: Un dimero de proteina de acuerdo con la realizacion 55, en donde dicho dimero de proteina es un heterodimero en el que el segundo polipeptido se selecciona entre VEGF, VEGF-B, VEGF-C, PIGF y PDGF.

58.: Un metodo de deteccion de VEGF-D en una muestra biologica, que comprende el paso de poner en contacto la muestra con un reactivo capaz de fijarse a VEGF-D, y detectar la fijacion de dicho reactivo.

59.: Un metodo de acuerdo con la realizacion 58, en donde dicho reactivo comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 29 a 32.

60.: Un metodo de modulacion de la permeabilidad vascular en un mamifero, comprendiendo dicho metodo administrar a dicho mamifero una cantidad moduladora de la permeabilidad vascular eficaz de un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 16 a 24, o un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 29 a 32.

61.: Un metodo de acuerdo con la realizacion 60, que comprende administrar a dicho mamifero un polipeptido de acuerdo con la realizacion 16, el cual tiene la capacidad de estimular la proliferacion de celulas endoteliales.

62.: Un metodo de acuerdo con la realizacion 60, que comprende administrar a dicho mamifero un polipeptido de acuerdo con la realizacion 16, el cual tiene la capacidad de fijarse a celulas endoteliales pero que es incapaz de estimular la proliferacion de celulas endoteliales.

63.: Un metodo de activacion del receptor-2 de VEGF, que comprende el paso de exponer las celulas que contienen dicho receptor a una dosis activadora del receptor eficaz de VEGF-D.

64.: Un metodo de activacion del receptor-3 de VEGF, que comprende el paso de exponer las celulas que contienen dicho receptor a una dosis activadora del receptor eficaz de VEGF-D.

65.: Un metodo de acuerdo con la realizacion 63 o 64, en donde dicho metodo se lleva a cabo in vivo.

66.: Un metodo de acuerdo con la realizacion 63 o 64, en donde dicho metodo se lleva a cabo in vitro.

67.: Un kit de test diagnostico o pronostico que comprende un reactivo de fijacion especifico para VEGF-D y medios para detectar la fijacion de dicho reactivo.

68.: Un kit de test de acuerdo con la realizacion 67, en donde dicho reactivo de fijacion especifico comprende un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las realizaciones 29 a 32.

69.: Un kit de test diagnostico o pronostico que comprende un par de iniciadores especificos para DNA de VEGF-D enlazados operativamente a una polimerasa, con lo que dicha polimerasa puede amplificar selectivamente el DNA de VEGF-D a partir de una muestra de DNA.

70.: Un metodo de deteccion de aberraciones en la estructura del gen VEGF-D en un individuo sometido a test que comprende los pasos de: proporcionar una muestra de DNA de dicho individuo sometido a test; poner en contacto dicha muestra con un juego de iniciadores especificos para DNA de VEGF-D enlazados operativamente a una polimerasa y amplificar selectivamente el DNA de VEGF-D de dicha muestra por reaccion en cadena de polimerasa; y comparar la secuencia de nucleotidos del DNA de VEGF-D amplificado de dicha muestra con una secuencia de nucleotidos como las expuestas en SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 4.

71.: Un antagonista de VEGF-D que tiene la capacidad de inhibir al menos una actividad biologica inducida por VEGF-D seleccionada entre permeabilidad vascular, proliferacion de celulas endoteliales y diferenciacion de celulas

endoteliales, fijandose dicho antagonista a VEGF-D o a un receptor de VEGF-D pero teniendo una menor capacidad que VEGF-D para estimular dicha actividad biologica.

72.: Un antagonista de VEGF-D de acuerdo con la realizacion 71, en donde dicho antagonista comprende un anticuerpo que se fija selectivamente a VEGF-D.

73.: Un antagonista de VEGF-D de acuerdo con la realizacion 72, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

74.: Un antagonista de VEGF-D de acuerdo con la realizacion 71, en donde dicho antagonista comprende un fragmento o analogo del polipeptido VEGF-D que se fija a un receptor de VEGF-D, pero tiene una menor capacidad para estimular dicha actividad biologica.

75.: Un metodo para mejorar la circulacion sanguinea y/o el intercambio de gases en el pulmon de un mamifero, comprendiendo dicho metodo administrar a dicho mamifero una cantidad eficaz de VEGF-D que mejore la circulacion sanguinea y/o el intercambio de gases.

76.: Un metodo para tratar la acumulacion de fluido en el corazon y/o el pulmon debida a aumentos de la permeabilidad vascular en un mamifero, comprendiendo dicho metodo administrar a dicho mamifero una cantidad reductora de la permeabilidad vascular eficaz de un antagonista de VEGF-D.

77.: Un metodo para tratar un sindrome de malabsorcion intestinal en un paciente que sufra dicho sindrome, comprendiendo dicho metodo administrar a dicho paciente una cantidad eficaz de VEGF-D que aumente la permeabilidad vascular y/o la circulacion sanguinea intestinal.

78.: Un anticuerpo de acuerdo con la realizacion 29, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

79.: Un anticuerpo de acuerdo con la realizacion 29, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo quimerico.

LISTADO DE SECUENCIAS

(1) INFORMACION GENERAL:

(i): SOLICITANTE: LUGWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH

(ii): TiTULO DE LA INVENCION: FACTOR DE CRECIMIENTO

(iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 11

(iv): DIRECCION DE CORRESPONDENCIA:

(A): DESTINATARIO: Evenson, McKeown, Edwards & Lenahan, P.L.L.C.

(B): CALLE: 1200 G Street, NW, Suite 700

(C): CIUDAD: Washington

(D): ESTADO: DC

(E): PAiS: Estados Unidos de America

(F): CODIGO POSTAL: 20005

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.25

(vi): DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

(A): NUMERO DE SOLICITUD:

(B): FECHA DE PRESENTACION:

(C): CLASIFICACION:

(viii) INFORMACION DE PROCURADOR/AGENTE:

(A): NOMBRE: EVANS, Joseph D.

(C): REFERENCIA/NUMERO DE EXPEDIENTE: 1064/42983PCT

(iv) INFORMACION DE TELECOMUNICACIONES:

(A): TELEFONO (202) 628-8800

(B): TELEFAX: (202) 628-8844

(C): TELEX: N/A

(2): INFORMACION PARA SEQ ID NO 1:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 2846 pares de bases

(B): TIPO: Acido nucleico

(C): CLASE DE CADENA: Simple

(D): TOPOLOGiA: Lineal

(ii): TIPO DE MOLECULA: cDNA

(iii) HIPOTETICA: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(F) TIPO DE TEJIDO: Mama humana

(xi): DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

(2): INFORMACION PARA SEQ ID NO: 2:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 13 aminoacidos

(B): TIPO: Aminoacido

(C): CLASE DE CADENA: simple

(D): TOPOLOGiA: Lineal

(ii): TIPO DE MOLECULA: Peptido

(iii) HIPOTETICA: NO

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

(2): INFORMACION PARA SEQ ID NO: 3:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 325 aminoacidos

(B): TIPO: Aminoacido

(C): CLASE DE CADENA: Simple

(D): TOPOLOGiA: Lineal

(ii): TIPO DE MOLECULA: Proteina

(iii) HIPOTETICA: NO

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(F) TIPO DE TEJIDO: Mama humana

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

(2): INFORMACION PARA SEQ ID NO: 4:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 2029 pares de bases

(B): TIPO: Acido nucleico

(C): CLASE DE CADENA: Simple 5 (D) TOPOLOGiA: Lineal

(ii) TIPO DE MOLECULA: cDNA

(iii) HIPOTETICA: NO

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(F): TIPO DE TEJIDO: Pulmon humano 10 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 354 aminoacidos

(B): TIPO: Aminoacido 5 (C) CLASE DE CADENA: Simple

(D) TOPOLOGiA: Lineal

(ii) TIPO DE MOLECULA: Proteina

(iii) HIPOTETICA: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL: 10 (F) TIPO DE TEJIDO: Pulmon humano

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 1325 pares de bases

(B): TIPO: Acido nucleico 15 (C) CLASE DE CADENA: Simple

(D) TOPOLOGiA: Lineal

(ii) TIPO DE MOLECULA: cDNA

(iii) HIPOTETICA: NO

(vi): FUENTE ORIGINAL: 20 (F) TIPO DE TEJIDO: Pulmon de raton

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

(2): INFORMACION PARA SEQ ID NO: 7: 10 (i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 1135 pares de bases

(B): TIPO: Acido nucleico

(C): CLASE DE CADENA: Simple

(D): TOPOLOGiA: Lineal 15 (ii) TIPO DE MOLECULA: cDNA

(iii) HIPOTETICA: NO

(vi) FUENTE ORIGINAL:

(F) TIPO DE TEJIDO: Pulmon de raton

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 8:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 358 aminoacidos

(B): TIPO: Aminoacido 5 (C) CLASE DE CADENA: Simple

(D) TOPOLOGiA: Lineal

(ii): TIPO DE MOLECULA: Proteina

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(F): TIPO DE TEJIDO: Pulmon de raton 10 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 9:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A) LONGITUD: 321 aminoacidos

(B): TIPO: Aminoacido 5 (C) CLASE DE CADENA: Simple

(D) TOPOLOGiA: Lineal

(ii): TIPO DE MOLECULA: Proteina

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(F): TIPO DE TEJIDO: Pulmon de raton 10 (xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

(2): INFORMACION PARA SEQ ID NO: 10:

(i): CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

(B): TIPO: Acido nucleico

(C): CLASE DE CADENA: Simple

(D): TOPOLOGiA: Lineal

(ii): TIPO DE MOLECULA: Oligonucleotido

(vi): FUENTE ORIGINAL:

(F) TIPO DE TEJIDO:

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

(2): INFORMACION PARA SEQ ID NO: 11:

(i) CARACTERiSTICAS DE LA SECUENCIA:

(A): LONGITUD: 20 pares de bases 15 (B) TIPO: Acido nucleico

(C): CLASE DE CADENA: Simple

(D): TOPOLOGiA: Lineal

(ii) TIPO DE MOLECULA: Oligonucleotido

(vi): FUENTE ORIGINAL: 20 (F) TIPO DE TEJIDO:

(xi) DESCRIPCION DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

Claims

REIVINDICACIoNES

1.

Un polipeptido aislado que tiene la capacidad de estimular la proliferacion de celulas endoteliales en un mamifero, en donde dicho polipeptido esta constituido por la secuencia de un VEGF-D maduro que esta contenida en el fragmento comprendido entre los residuos de aminoacidos 92 y 205 de SEQ ID NO: 5 de VEGF-D.
2.

Un polipeptido aislado de acuerdo con la reivindicacion 1, que esta constituido por los residuos de aminoacidos desde 92 hasta 205 de SEQ ID NO: 5.
3.

Un polipeptido aislado de acuerdo con la reivindicacion 1, que esta constituido por los residuos de aminoacidos desde 93 hasta 201 de SEQ ID NO: 5.
4.

Una molecula de acido nucleico aislada que codifica el polipeptido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, con la condicion de que el polipeptido codificado no sea VEGF-D de longitud total (SEQ ID NO: 5).
5.

Una molecula de acido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicacion 4, que es un DNA genomico.
6.

Una molecula de acido nucleico aislada de acuerdo con la reivindicacion 4, que es un cDNA.
7.

Un vector que comprende una molecula de acido nucleico de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.
8.

Un vector de acuerdo con la reivindicacion 7, en donde el acido nucleico es un cDNA que codifica el polipeptido de la reivindicacion 3 y esta conectado operativamente a un DNA que codifica la secuencia senal para secrecion de proteina por el gen de interleuquina-3 (IL-3).
9.

Una celula hospedadora transformada o transfectada con un vector de acuerdo con la reivindicacion 7 o la reivindicacion 8.
10.

Un anticuerpo especificamente reactivo con un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
11.

Un metodo de construccion de un vector capaz de expresar un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, comprendiendo dicho metodo insertar el acido nucleico de una cualquiera de las reivindicaciones 5 o 6 en un vector en una posicion en la que dicha molecula de acido nucleico este conectada operativamente con al menos un promotor y/u otras secuencias de control.
12.

Un polipeptido aislado que tiene la capacidad de estimular la proliferacion de celulas endoteliales en un mamifero de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para utilizar en la estimulacion de la angiogenesis y/o la neovascularizacion en un mamifero.
13.

Un polipeptido para utilizar de acuerdo con la reivindicacion 12, para su uso en la aceleracion de la angiogenesis en la curacion de las heridas, trasplante de tejidos u organos; o para el establecimiento de la circulacion colateral en infartos tisulares o estenosis arterial.
14.

Un polipeptido para utilizar de acuerdo con la reivindicacion 12, en donde las celulas endoteliales son celulas endoteliales de vasos linfaticos.
15.

Una composicion farmaceutica que comprende un polipeptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 10.

FIG.2

Proteina eepresaea

Anti6cerpo�I�P

HMW ΔNΔC-melSP-VEGF-C-H6 Variante de remodelación de VEGF-C No infectada VEGF-D #1 de longitud total VEGF-D #2 de longitud total

VEGF-D #3 de longitud total ΔNΔC-melSP-VEGF-D-H6 #1 VEGF-D-H6 #1 de longitud total

VEGF-3 (sin procesar)