JP2003517265A - 血管内皮増殖因子ｄを発現する発現ベクターおよび細胞系、およびメラノーマを治療する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を含む発現ベクター、ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を安定に発現する細胞系、および、これらの発現ベクターおよび宿主細胞を用いてポリペプチドを作る方法に関する。本発明はまた、メラノーマまたはＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍および種々の疾患を治療および軽減する方法にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景および概要 本発明は、ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を含む発現ベクタ
ー、ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を安定に発現する細胞系、
および、これらの発現ベクターおよび宿主細胞を用いてポリペプチドを作る方法
に関する。本発明はまた、メラノーマおよび種々の疾患を治療および軽減する方
法にも関する。

【０００２】 発明の背景 血管新生は、組織の正常な成長および発達のために必要な基礎的なプロセスで
あり、既存の血管からの新しい毛細血管の増殖に関与する。血管新生は胚の発生
および正常な組織の成長、修復、および再生に関わっているだけでなく、女性の
生殖のサイクル、妊娠の確立および維持に、そして創傷および骨折の修復にも関
与している。正常な個体において起こる血管新生の他に、血管形成の現象は、特
に腫瘍増殖および転移、そしてとりわけ微小血管系の血管増殖が増加するような
その他の状態、例えば糖尿病性網膜症、乾癬および関節症などの多くの病理学的
プロセスに関与している。血管新生の阻害はそのような病理学的プロセスを防止
または軽減することにおいて有用である。

【０００３】 一方、血管新生(angiogenesis)の促進は、例えば、組織または器官の移植の後
、あるいは、虚血性心疾患および閉塞性血栓性血管炎(thromboangitis oblitera
ns)などの組織梗塞または動脈狭窄において側副循環の確立を刺激するために、
血管新生（vascularization）が確立または伸展されるべき状況において望まし
い。

【０００４】 血管新生は非常に多くの生理学的および病理学的プロセスにおいて重大な役割
を持つことから、血管新生の調節に関与する因子について集中的に研究されてき
た。多くの増殖因子が血管新生の調節に関与していることが示されている。これ
らには、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ト
ランスフォーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）
が含まれる。例えば、概説として、フォークマン（Folkman）他, J. Biol. Chem
., 1992 267 10931-10934を参照されたい。

【０００５】 特定のファミリーの内皮細胞−特異的増殖因子およびそれらに対応する受容体
は、主に内皮細胞の増殖および分化の刺激について、そして分化細胞のある機能
についての原因であるということが示唆されている。これらの因子はＰＤＧＦフ
ァミリーのメンバーであり、第一に内皮の受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）を
介して作用するようである。今までにいくつかの血管内皮増殖因子ファミリーメ
ンバーが同定されている。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、複数のソースから
単離されているホモダイマーの糖タンパク質である。ＶＥＧＦは内皮細胞に対し
て高度に特異的な分裂促進活性を示し、血管新生に通じる全ての一連の現象を刺
激することができる。さらにそれは、単球に対する強い化学誘引物質活性を有し
ており、内皮細胞におけるプラスミノーゲンアクチベーターおよびプラスミノー
ゲンアクチベーターインヒビターを誘導することができ、また、微小血管の透過
性にも影響することができる。後者の活性のために、それは血管透過因子（ＶＰ
Ｆ）と称されることもある。ＶＥＧＦの単離および性質について概説されている
；ファーララ（Ferrara）他, J. Cellular Biochem., 1991 47 211-218およびコ
ノリー（Connolly）, J. Cellular Biochem., 1991 47 219-223を参照されたい
。

【０００６】 より最近では、ＶＥＧＦファミリーの６つのさらなるメンバーが同定された。
これらは以下のように命名されている。即ち、ＶＥＧＦ−Ｂ、これはLudwig Ins
titute for Cancer Research および The University of Helsinki によって、
国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７（ＷＯ９６／２６７３６）において
、そして、米国特許５，８４０，６９３号および５，６０７，９１８号において
記載されている；ＶＥＧＦ−Ｃ、これはヨウコフ（Joukov）他, The EMBO Journ
al, 1996 15 290-298において記載されている；ＶＥＧＦ−D、これは国際特許出
願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）において記載されて
いる；胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、これはマグリオーネ（Maglione）他, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 1991 88 9267-9271 において記載されている；ＶＥＧＦ
２、これはHuman Genome Sciences, Inc によって国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９
４／０５２９１（ＷＯ９５／２４４７３）において記載されている；そしてＶＥ
ＧＦ３、これはHuman Genome Sciences, Inc によって国際特許出願ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９５／０７２８３（ＷＯ９６／３９４２１）において記載されている。それぞ
れが３０％から４５％のＶＥＧＦとのアミノ酸配列アイデンティティを示す。Ｖ
ＥＧＦファミリーメンバーは、システインノットモチーフを形成する６つのシス
テイン残基を含むＶＥＧＦホモロジードメインを共有している。ＶＥＧＦファミ
リーの機能の特性には、異なる程度の、内皮細胞に対する分裂促進性、血管透過
性の誘導、そして、血管形成およびリンパ脈管形成(lymphangiogenic)の性質が
含まれる。

【０００７】 ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦと類似の血管形成およびその他の性質を有している
が、ＶＥＧＦとは異なる組織において分布および発現している。特に、ＶＥＧＦ
−Ｂは、心臓において非常に強く発現しており、肺においては弱くしか発現して
いないが、ＶＥＧＦの場合は逆である。これは、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ−Ｂは、多
くの組織において共発現している(co-expressed)という事実にもかかわらず、機
能の差を有している可能性があるということを示唆するものである。

【０００８】 ＶＥＧＦ−Ｂは、酵母共ハイブリッド(co-hybrid)相互作用トラップスクリー
ニング技術を用いて、細胞のレチノイン酸−結合タンパク質タイプＩ（ＣＲＡＢ
Ｐ−Ｉ）と相互作用する可能性のある細胞のタンパク質をスクリーニングするこ
とによって単離された。その単離および特性は、ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２５９７
およびオロフソン（Olofsson）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996 93 2576
-2581において詳細に記載されている。

【０００９】 ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦＲ−３を発現するようにトランスフェクト(transfe
ct)された細胞を用いて、内皮細胞−特異的受容体チロシンキナーゼＶＥＧＦＲ
−３（Ｆｌｔ４）のチロシンリン酸化を引き起こす培地の能力についてスクリー
ニングすることによって、ＰＣ−３前立腺癌細胞系（ＣＲＬ１４３５）のならし
培地(培養上清conditioned medium)から単離された。ＶＥＧＦ−Ｃは組換えＶＥ
ＧＦＲ−３を用いたアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され、そ
してＰＣ−３ ｃＤＮＡライブラリーからクローニングされた。その単離および
特性は、ヨウコフ（Joukov）他, The EMBO Journal, 1996 15 290-298において
詳細に記載されている。

【００１０】 ＶＥＧＦ−Ｄは、Clontechから販売されているヒト乳房ｃＤＮＡライブラリー
から、ハイブリダイゼーションプローブとして"Soares Breast 3NbHBst"と命名
されているヒトｃＤＮＡライブラリーから得たＥＳＴ(expressed sequence tag)
を用いてスクリーニングすることによって単離された(アーヘン（Achen）他, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998 95 548-553)。その単離および特性は、国際特
許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６において詳細に記載されている。

【００１１】 ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６において、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃと命名された
、ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的に活性のフラグメントの単離についても記載されてい
る。このフラグメントは、アフィニティータグペプチドＦＬＡＧ（登録商標）に
連結した、ＶＥＧＦ−Ｄアミノ酸残基９３から２０１からなる。国際特許出願Ｐ
ＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）の全体の開示を参考文献
として本出願に合体させる。

【００１２】 ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦファミリーのその他のメンバーに対する構造的な類
似性を有している。しかし、そのような構造的な類似性にもかかわらず、それは
、構造的および機能的にＶＥＧＦファミリーのその他のメンバーから区別される
。ヒトＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦ−Ｃに対して４８％しか同一ではなく、ＶＥＧＦ
−ＣはＶＥＧＦ−Ｄと最も密接に関連している、ファミリーのメンバーである。

【００１３】 ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子は成人のヒトにおいて広く発現しているが、必ず至るとこ
ろに発現しているという訳ではない。ＶＥＧＦ−Ｄは、心臓、肺および骨格筋に
おいて強く発現している。中度のレベルのＶＥＧＦ−Ｄが、脾臓、卵巣、小腸お
よび大腸において発現しており、腎臓、膵臓、胸腺、前立腺および精巣において
はより低い発現が起こっている。脳、胎盤、肝臓または末梢血白血球からのＲＮ
ＡにおいてはＶＥＧＦ−Ｄ ｍＲＮＡは検出されなかった。

【００１４】 ＰｌＧＦは、末期 (term)胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離された。その単
離および特性は、マグリオーネ（Maglione）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1991 88 9267-9271において詳細に記載されている。現在その生物学的機能につ
いてはあまり理解されていない。

【００１５】 ＶＥＧＦ２は、高度に腫瘍形成性の(tumorgenic)、エストロゲン−非依存性ヒ
ト乳癌細胞系から単離された。この分子はＰＤＧＦに対して約２２％のホモロジ
ーを、そしてＶＥＧＦに対して３０％のホモロジーを有するといわれているが、
ＶＥＧＦ２をコードする遺伝子の単離方法は不明暸であり、生物学的活性の特徴
づけについては開示されていない。

【００１６】 ＶＥＧＦ３は、大腸組織に由来するｃＤＮＡライブラリーから単離された。Ｖ
ＥＧＦ３はＶＥＧＦに対して約３６％のアイデンティティおよび６６％の類似度
を有するといわれている。ＶＥＧＦ３をコードする遺伝子の単離方法は不明暸で
あり、生物学的活性の特徴づけについては開示されていない。

【００１７】 血管内皮増殖因子は第一に受容体チロシンキナーゼに結合することによって作
用すると思われる。５つの内皮細胞−特異的受容体チロシンキナーゼ、すなわち
、ＶＥＧＦＲ−１（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）、Ｖ
ＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ−４）、ＴｉｅおよびＴｅｋ／Ｔｉｅ−２、が同定されて
いる。これらのすべてはシグナル伝達に必要な固有のチロシンキナーゼ活性を有
している。ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３、ＴｉｅおよびＴ
ｅｋ／Ｔｉｅ−２の血管形成および血管新生における、重要な特異的な役割が、
マウス胚においてこれらの受容体を不活性化する標的化(targeted) 突然変異に
よって実証されている。

【００１８】 ＶＥＧＦ類に結合することが知られている受容体チロシンキナーゼは、ＶＥＧ
ＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３のみである。ＶＥＧＦＲ−１と
ＶＥＧＦＲ−２とは、ＶＥＧＦに高いアフィニティーで結合し、ＶＥＧＦＲ−１
は、ＶＥＧＦ−Ｂにも結合する。ＶＥＧＦ−ＣはＶＥＧＦＲ−３に対するリガン
ドであることが示されており、ＶＥＧＦＲ−２も活性化する（ヨウコフ（Joukov
）他, The EMBO Journal, 1996 15 290-298)。ＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦ−Ｃと受
容体特異性を共有する（アーヘン（Achen）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1
998 95 548-553)。Ｔｅｋ／Ｔｉｅ−２に対するリガンドは記載されている（Reg
eneron Pharmaceuticals, Inc. による国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２９
３５（ＷＯ９６／１１２６９））；しかしながら、Ｔｉｅに対するリガンドは同
定されていない。

【００１９】 ＶＥＧＦ−ＤとＶＥＧＦ−Ｃの一次翻訳産物は、中心のＶＥＧＦホモロジード
メイン（ＶＨＤ）に加えて、長いＮ−末端およびＣ−末端ポリペプチド延長を有
している。ＶＥＧＦ−Ｃの場合、これらのポリペプチド延長はプロペプチドであ
り、プロペプチドはタンパク分解性に切断されて、ＶＨＤのみからなりＶＥＧＦ
Ｒ−２およびＶＥＧＦＲ−３に対して結合する能力のある分泌される形態を生じ
る（ヨウコフ（Joukov）他, The EMBO Journal, 1996 15 290-298; ヨウコフ（J
oukov）他, EMBO J., 1997 16 3898-3911)。同様に、ＶＨＤのみからなる組換え
型のＶＥＧＦ−Ｄは、これらの受容体に結合して活性化すること、および内皮細
胞に対して分裂促進的であることが示されたが、ＶＥＧＦ−Ｄプロセシングにつ
いては特徴づけられていない（アーヘン（Achen）他, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1998 95 548-553)。

【００２０】 最近、新規な１３０−１３５ｋＤａのＶＥＧＦ−Ａアイソフォーム特異的受容
体が精製およびクローニングされた（ソーカー（Soker）他, Cell, 1998 92 735
-745)。このＶＥＧＦ受容体は、エキソン７にコードされる配列を介して、ヘパ
リンに対して弱いアフィニティーを示すＶＥＧＦ−Ａ₁₆₅アイソフォームに特異
的に結合することが判明した（ソーカー（Soker）他, Cell, 1998 92 735-745)
。驚いたことに、この受容体は初期の神経形態形成(neuromorphogenesis)に関与
する受容体である、ヒトニューロピリン(neuropilin)−１（ＮＰ−１）と同一で
あることが示された。ＰｌＧＦ−２もＮＰ−１と相互作用すると思われる（ミッ
ドガル（Midgal）他, J. Biol. Chem., 1998 273 22272-22278)。

【００２１】 遺伝子ターゲッテッイング研究により、胚の発生のために、ＶＥＧＦＲ−１、
ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３が絶対的に必要であることが実証された。
これらの研究は、ＶＥＧＦＲ−１は血管内皮管形成において役割を果たすという
こと、ＶＥＧＦＲ−２は内皮／造血細胞の分化および有糸分裂誘発のために重要
であること、そしてＶＥＧＦＲ−３は血管の再構築の調節、大血管の形成および
リンパ脈管形成(lymphangiogenesis)に関与しているということを示すものであ
る。これらの受容体の機能は、ムストネン（Mustonen）およびアリタロ（Alital
o）, J. Cell Biol., 1995 129 895-898において概説されている。

【００２２】 ＶＥＧＦＲ−３は、胎児においては静脈およびリンパの内皮において発現して
おり、成体においては主にリンパの内皮において発現している（カイパイネン（
Kaipainen）他, Cancer Res, 1994 54 6571-6577; Proc. Natl. Acad. Sci. USA
, 1995 92 3566-3570)。ＶＥＧＦＲ−３は、リンパ管の出現の前の胚の心臓血管
系の発達において重要な役割を有する（デュモン（Dumont）他, Science, 1998
282 946-949)。ＶＥＧＦ−Ｃはリンパ内皮において第一の機能を有しており、血
管新生および透過性の調節において、ＶＥＧＦと共有される第二の機能を有して
いる可能性があるということが示唆されている（ヨウコフ（Joukov）他, The EM
BO Journal, 1996 15 290-298)。

【００２３】 発明の概要 本発明は、概して、ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を含む発
現ベクター、ＶＥＧＦ−Ｄおよびその生物学的に活性の誘導体を安定に発現する
細胞系、およびそれらの発現ベクターおよび宿主細胞を用いてポリペプチドを作
る方法を提供する。本発明はまた、概して、メラノーマまたはＶＥＧＦ−Ｄを発
現する腫瘍および種々の疾患を治療および軽減する方法を提供する。

【００２４】 第一の側面によると、本発明は、ＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的
活性を有するそのフラグメントまたはアナログを安定に発現する哺乳類の細胞系
を提供する。本発明の細胞系によって産生されるＶＥＧＦ−Ｄは随意に、アフィ
ニティー精製およびＶＥＧＦ−Ｄの局在化を補助するために、ＦＬＡＧ（登録商
標）、ヘキサヒスチジン(hexahistidine)、またはＩ−ＳＰＹ（商標）などのエ
ピトープタグ(tag)に連結される。好ましくは哺乳類の細胞系は、２９３−ＥＢ
ＮＡヒト胎児性(embryonal)腎臓細胞系である。好ましくは、発現されるＶＥＧ
Ｆ−Ｄは、本明細書において記載されるような、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａ
ｇ、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＣＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ、またはＶＥＧＦ
−Ｄ△Ｃである。

【００２５】 “ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性”という語句は、内皮細胞増殖、分化、遊走、
生存（残存）または血管透過性のうち一以上を刺激する能力を意味するものと理
解されるべきものである。

【００２６】 ＶＥＧＦ−Ｄの好適なフラグメントは、ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６の配列
番号５の、アミノ酸残基９３からアミノ酸残基２０１のＶＥＧＦ−Ｄの部分（す
なわち、ＶＥＧＦホモロジードメイン（ＶＨＤ））（配列番号１）であり、随意
にＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに連結したものである。フラグメントがＦＬＡ
Ｇ（登録商標）に連結している場合、そのフラグメントを、本明細書では、ＶＥ
ＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃと称する。

【００２７】 本明細書で用いられる、“ＶＥＧＦ−Ｄ”という語は、国際特許出願ＰＣＴ／
ＵＳ９７／１４６９６において定義されている、配列番号３、配列番号５、配列
番号８、および配列番号９のポリペプチドのすべて、および本明細書において定
義されているＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナ
ログを集合的に指す。

【００２８】 第二の側面によると、本発明は、哺乳類の発現ベクターＡｐｅｘ−３に挿入さ
れた、ＶＥＧＦ−ＤをコードするヒトｃＤＮＡの配列を含む発現ベクターを提供
する。好ましくは、発現ベクターは、本明細書において記載する、ｐＶＤＡｐｅ
ｘＦｕｌｌＮＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＣＦｌａｇ、ｐＶＤＡｐｅｘ△Ｎ
△Ｃ、またはｐＶＤＡｐｅｘ△Ｃである。

【００２９】 好ましくは、発現ベクターは、ＦＬＡＧ（登録商標）、ヘキサヒスチジン、ま
たはＩ−ＳＰＹ（商標）などのアフィニティータグをコードする配列も含む。

【００３０】 本発明は更に、本発明によるポリペプチドを作る方法を提供する。この方法は
、宿主細胞において本発明の発現ベクターを発現させる工程、および、宿主細胞
から、または、宿主細胞の増殖培地からポリペプチドを単離する工程、を有する
。本発明のこの側面の１つの好適な態様において、発現ベクターはさらに、アフ
ィニティークロマトグラフィーによるポリペプチドの精製を促進するために、Ｆ
ＬＡＧ（登録商標）、ヘキサヒスチジン、またはＩ−ＳＰＹ（商標）などの、ア
フィニティータグをコードする配列を含む。

【００３１】 保存的な(conservative)置換、挿入、または欠失を含むがそれでもなおＶＥＧ
Ｆ−Ｄの生物学的活性を保持するポリペプチドは、明らかに本発明の枠内に含ま
れるということが理解されるべきである。当業者であれば、例えば部位特異的突
然変異誘発の利用、または、特異的な酵素での切断および連結（ライゲーション
）などの、そのようなポリペプチドを産生するために容易に用いることができる
方法についてよく知っているであろう。また、当業者であれば、ペプチド疑似の
(peptidomimetic)化合物、または、１または複数のアミノ酸残基が、非−自然発
生アミノ酸またはアミノ酸アナログによって置換された化合物が、ＶＥＧＦ−Ｄ
の生物学的活性の必要とされる側面を保持することができるであろうということ
も知っているであろう。そのような化合物は、当業者に周知の方法によって容易
に作ることおよびテストすることができ、それらはまた、本発明の枠内に含まれ
る。

【００３２】 さらに、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｂについて起こることが知られているよう
な、選択的スプライシングの結果として起こる、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの変
異体形態、および、ＶＥＧＦ−Ｄをコードする核酸配列の自然に発生する対立遺
伝子の変異体も、本発明の枠内に含まれる。対立遺伝子の変異体は当業者に周知
であり、コードされるポリペプチドの代替の（オルターナティブな）形態を表す
。

【００３３】 ＶＥＧＦ−Ｄのそのような変異体形態は、修飾のためにＶＥＧＦ−Ｄポリペプ
チドの非−必須領域をターゲッティングすることによって調製することができる
。これらの非−必須領域は、強く保存された領域の外側になると予想される。特
に、ＶＥＧＦを含む、ＰＤＧＦファミリーの増殖因子は二量体であり、そして、
ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰＤＧＦ−ＡおよびＰ
ＤＧＦ−Ｂは、ＰＤＧＦ−様ドメインにおける８つのシステイン残基の完全な保
存を示す（オロフソン（Olofsson）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996 93
2576-2581; ヨウコフ（Joukov）他, The EMBO Journal, 1996 15 290-298)。こ
れらシステインは分子内および分子間のジスルフィド結合に関与すると考えられ
ている。分子内のジスルフィド結合によって形成される、各サブユニットのルー
プ１、２および３は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリーの増殖因子の受容体に対す
る結合に関与している（アンダーソン（Andersson）他, Growth Factors, 1995 12 159-164)。上述のように、以前に知られているＶＥＧＦファミリーのメンバ
ーにおいて保存されているシステインは、ＶＥＧＦ−Ｄにおいても保存されてい
る。

【００３４】 したがって当業者であれば、提案されるあらゆる変異体形態においてこれらの
システイン残基が保存されるべきであるということ、およびループ１、２および
３にある活性部位も保存されるべきであるということについてよく知っているで
あろう。しかし、この分子のその他の領域は、生物学的機能にとってより重要性
が低いということを予想することができ、そしてそれゆえ修飾のための適切なタ
ーゲットを提供することができる。修飾されたポリペプチドは、ＶＥＧＦ−Ｄの
生物学的活性を示すそれらの能力について、細胞増殖テストなどのルーチン活性
アッセイ手順によって容易にテストすることができる。

【００３５】 修飾されたＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドには、内皮細胞、すなわちＶＥＧＦ−Ｄ
受容体に対して結合する能力を有するが、内皮細胞増殖、分化、遊走、または生
存（残存）を刺激することができない、または、血管透過性を誘導することがで
きないものがあると予想される。これらの修飾されたポリペプチドは、競合的ま
たは非−競合的なＶＥＧＦ−Ｄの阻害剤として作用することができ、ＶＥＧＦ−
Ｄ作用の防止または低下が望ましい状況において有用であると予想される。した
がって、そのような受容体−結合性であるが非−分裂促進的、非−分化誘導性、
非−遊走誘導性、または非−生存（残存）促進性の、ＶＥＧＦ−Ｄの変異体もま
た、本発明の枠内に含まれ、そして本明細書において、“受容体−結合性の、し
かしその他の点では不活性または妨害性の変異体”と称される。

【００３６】 同様に修飾されたＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドには、ＶＥＧＦ−Ｄに結合する能
力を有し、二量体（ダイマー）の、内皮細胞におけるＶＥＧＦ−Ｄ受容体（例え
ば、ＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３）に対する結合を妨げるものがあると
予想される。したがってこれら二量体は、内皮細胞増殖、分化、遊走、または生
存（残存）を刺激することができず、または、血管透過性を誘導することができ
ない。これらの修飾されたポリペプチドは、競合的または非−競合的なＶＥＧＦ
−Ｄの阻害剤として作用することができ、ＶＥＧＦ−Ｄ作用の防止または低下が
望ましい状況において有用であると予想される。したがって、そのようなＶＥＧ
Ｆ−Ｄ−結合性であるが非−分裂促進的、非−分化誘導性、非−遊走誘導性、ま
たは非−生存（残存）促進性の、ＶＥＧＦ−Ｄの変異体もまた、本発明の枠内に
含まれ、そして本明細書において、“ＶＥＧＦ−Ｄ−結合性の、しかしその他の
点では不活性または妨害性の変異体”と称される。

【００３７】 第三の側面によると、本発明は、悪性のメラノーマまたはＶＥＧＦ−Ｄを発現
する腫瘍の治療または軽減方法を提供する。この方法は、メラノーマまたは腫瘍
の付近においてＶＥＧＦ−Ｄの発現または活性を阻害する工程を有する。ＶＥＧ
Ｆ−Ｄ発現の局所的な阻害は、例えばアンチセンス核酸またはＶＥＧＦ−Ｄをコ
ードする三本鎖ＤＮＡの使用によって達成することができる。代わりに、上述の
ような、ＶＥＧＦ−Ｄに対して結合してＶＥＧＦ−Ｄ受容体に対する結合を妨げ
る能力を有するか、あるいは、ＶＥＧＦ−Ｄ受容体に結合するが、内皮細胞増殖
、分化、遊走、または生存（残存）を刺激することができない、ＶＥＧＦ−Ｄ変
異体ポリペプチドを、競合的または非−競合的なＶＥＧＦ−Ｄの阻害剤として利
用することができる。ＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−３に対
する小分子阻害剤、およびＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＥＧＦＲ−２またはＶＥＧＦＲ−３
に対する抗体も利用することができる。

【００３８】 上記の方法の利用はまた、乾癬におけるように、ＶＥＧＦ−Ｄの発現が増加し
ているか持続的であるような非−悪性の状態においても考えられる。発生中のマ
ウス胚の皮膚におけるＶＥＧＦ−Ｄの分布に基づくと、上部真皮(upper dermis)
における血管の増殖が一貫した、そして顕著な組織病理学的な特徴である、乾癬
などの高い表皮細胞ターンオーバー皮膚疾患(high epidermal cell turnover de
rmatoses)の開始または存続において、ＶＥＧＦ−Ｄが役割を果たしているとい
うことがありうる。

【００３９】 本発明のさらなる側面において、ＶＥＧＦ−Ｄは内皮細胞阻害活性を有する毒
素または薬剤と結合され、それは、例えばＶＥＧＦＲ−２およびＶＥＧＦＲ−３
などのＶＥＧＦ−Ｄ受容体を発現する、増殖している血管およびリンパの内皮細
胞に標的化される(targeted)。したがって、腫瘍増殖などの多くの病理学的状態
にとって重要なものである血管の増殖をブロックすることができる。

【００４０】 第五の側面によると、本発明は皮膚移植の受け入れおよび／または治癒を増強
する方法を提供する。この方法は、有効量の、ＶＥＧＦ−Ｄ、またはＶＥＧＦ−
Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログによって、血管新生
およびリンパ脈管形成(lymphangiogenesis)を刺激する工程を有する。

【００４１】 第六の側面によると、本発明は皮膚に対する外科または外傷の創傷の治癒を刺
激する方法を提供する。この方法は、有効量の、ＶＥＧＦ−Ｄ、またはＶＥＧＦ
−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログによって、血管新
生およびリンパ脈管形成を刺激する工程を有する。

【００４２】 前記した本発明の最後の２つの側面は、火傷の治療において、および形成外科
において、特に有用であろうと考えられる。

【００４３】 本発明の別の側面において、リンパ浮腫の治療または軽減のためにリンパ脈管
形成を刺激するための方法が提供される。この方法は、有効量の、ＶＥＧＦ−Ｄ
、またはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログ
によって、リンパ脈管形成を刺激する工程を有する。リンパ浮腫ほど醜くなる疾
患はあまりない。リンパ浮腫は、組織を満たす体液の排出に関与するリンパ管の
閉塞（妨害物）がある場合に起こる。この閉塞の結果、組織の中にリンパ液また
は脂肪性の体液が蓄積し、そしてその結果として肢および組織の怒張が起こる。
最終的な結果は、局所性の感染症、不快感および変形（奇形）のためにしばしば
グロテスクであり、そして激しく無力化する。リンパ浮腫にはいくつかの原因が
ある。最も注目すべきは、リンパ節閉塞または手術中の除去に関連する乳癌であ
る。再発性の感染症およびその他の形態の手術もリンパ浮腫に関連する。有意な
割合のリンパ浮腫の患者は、同一とみなしうるもの(identifiable precitant)を
有さない。ＶＥＧＦ−Ｄの量を増加させることによって、リンパ脈管形成が誘導
され、そしてリンパ液および脂肪性の体液の蓄積が軽減するであろう。

【００４４】 胚形成の間のＶＥＧＦ−Ｄ合成の不適当なダウンレギュレーションは、無汗性
外胚葉性異形成を含む付属器構造異常発育においても重要である可能性がある。
通常は真皮における汗腺は、血管新生化した(vascularized)脂肪性の結合組織に
よって囲まれている。おそらくはＶＥＧＦ−Ｄの欠乏によって、血管の供給が損
なわれるか、または補充することができない場合、汗腺低酸素血症および機能不
全が起こるであろう。これらの病変はおそらく、発生のなんらかの段階における
分化細胞のＶＥＧＦ−Ｄを産生する能力の欠如、または、遮断剤を産生する分化
している付属器細胞の近くの血管におけるＶＥＧＦ−Ｄ受容体に対する遮断剤の
産生によるものであろう。したがって、本発明は脂肪性の結合組織の血管新生(v
ascularization)を刺激することによって、無汗性外胚葉性異形成を治療または
軽減するための方法を提供する。この方法は、有効量の、ＶＥＧＦ−Ｄ、または
ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを投与す
る工程を有する。

【００４５】 ＶＥＧＦ−Ｄの欠乏またはＶＥＧＦ−Ｄに対する応答の欠乏に関連する可能性
がある更に別の疾患は、強皮症である。強皮症は、血管新生および／または線維
芽細胞機能における変化によると考えられる、皮膚の肥厚およびコラーゲン化(c
ollagenization)の増加によって特徴づけられる結合組織の珍しい障害である。
ＶＥＧＦ−Ｄの欠乏またはＶＥＧＦ−Ｄに対する応答の不足による内皮細胞への
障害（ダメージ）は、おそらく血管が修復できないことに寄与する要因であろう
。血管が修復できないため、連続性の血小板凝集が観察され、そして引き続いて
線維芽細胞に対して分裂促進的な作用を有する増殖因子が放出される。この結果
、コラーゲン産生が増加する。強皮症における全身的な器官の関与にも同様の考
慮があてはまる。したがって、本発明は、血管内皮細胞の増殖を刺激することに
よって強皮症を治療または軽減する方法を提供する。この方法は、有効量の、Ｖ
ＥＧＦ−Ｄ、またはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまた
はアナログを投与する工程を有する。

【００４６】 第七の側面によると、本発明は、血管透過性を誘導せずに、内皮細胞の増殖、
遊走、生存（残存）および分化、そしてリンパ脈管形成から選択される、ＶＥＧ
Ｆ−Ｄの少なくとも１つの生物活性を刺激する方法を提供する。この方法は、生
物活性を刺激する量の完全にプロセシングされたＶＥＧＦ−Ｄを投与する工程を
有する。

【００４７】 本発明のさらなる側面では、ＶＥＧＦ−Ｄの受容体−結合特異性を調節する方
法を提供する。この方法は、プロセシングされていない(unprocessed) ＶＥＧＦ
−Ｄをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを発現させる工程、およ
び、コードされるＶＥＧＦ−Ｄをプロセシングしてタンパク分解性にプロセシン
グされた形態のＶＥＧＦ−Ｄを産生するために、少なくとも１つのタンパク分解
量（proteolytic amount）の酵素を供給する工程を有する。

【００４８】 本明細書での目的のため、“完全にプロセシングされたＶＥＧＦ−Ｄ”という
語句はＮ−末端およびＣ−末端プロペプチドを有さないＶＥＧＦ−Ｄポリペプチ
ドを意味し、“タンパク分解性にプロセシングされた形態のＶＥＧＦ−Ｄ” と
いう語句はＮ−末端および／またはＣ−末端プロペプチドを有さないＶＥＧＦ−
Ｄポリペプチドを意味し、そして、“プロセシングされていないＶＥＧＦ−Ｄ”
という語句はＮ−末端およびＣ−末端プロペプチドの両方を備えたＶＥＧＦ−
Ｄポリペプチドを意味するということが、明らかに理解されるであろう。

【００４９】 本発明はまた、生物学的サンプルにおいてＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍を検出
する方法も提供する。この方法は、前記サンプルをＶＥＧＦ−Ｄに対する特異的
結合性試薬に接触させる工程、ＶＥＧＦ−Ｄに対する前記特異的結合性試薬の結
合のために時間を与える工程、および前記結合を検出する工程を有する。好適な
態様において、ＶＥＧＦ−Ｄに対する特異的結合性試薬は抗体であり、結合およ
び／または結合の程度は、検出可能な標識を備えた抗体によって検出される。癌
バイオプシー標本におけるＶＥＧＦ−Ｄの定量化は将来の転移のリスクの指標と
して有用であろう。

【００５０】 本発明による抗体を検出可能な標識で標識して、診断の目的のために利用する
ことができる。抗体は、イメージングのために、適当な超磁性(supermagnetic)
、パラ磁性(paramagnetic)、高電子密度、エコジェニック(ecogenic)、または放
射性剤と共有結合的または非−共有結合的に結合させるとよい。診断上のアッセ
イにおける使用のために、放射性標識または非−放射性標識を用いてもよい。放
射性標識の例には、¹²⁵Ｉまたは³²Ｐなどの放射性の原子または基が含まれる。
非−放射性標識の例には、西洋わさびペルオキシダーゼなどの酵素標識、または
フルオレセイン−５−イソチオシアナート（ＦＩＴＣ）などの蛍光定量的標識が
含まれる。標識化は、直接的であっても間接的であってもよく、また、共有結合
性であっても非−共有結合性であってもよい。

【００５１】 ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を誘導するポリペプチドまたは抗体は、適当な製
薬の担体と組み合わせて使用することができる。ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を
阻害するポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストまたは抗体も、適当な製薬
の担体と組み合わせて使用することができる。そのような組成物は、治療的に有
効な量の抗体および薬学で受け入れられる担体またはアジュバントを含む。その
ような担体の例には、塩類溶液、緩衝食塩水、鉱物油、タルク、ブドウ糖、水、
グリセロール、エタノール、増粘剤、安定剤、懸濁剤、およびそれらの組み合わ
せが含まれるがそれらに限定されるものではない。そのような組成物は、溶液、
懸濁液、錠剤、カプセル剤、クリーム、こう薬(salves)、軟膏剤（ointments）
の形態、またはその他の従来の形態とすればよい。製剤形態は投与方法に適する
ように選択される。ポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストまたは抗体が治
療の目的のために使用される場合、適用用量および経路は患者の性質および治療
される状態に依存するであろうし、主治医または獣医師の考え次第のものとなる
であろう。適当な経路には、皮下の、筋肉内の、腹腔内の、または静脈内の注射
、局所適用、インプラントなどが含まれる。ＶＥＧＦ−Ｄの局所適用はＶＥＧＦ
と類似の方法において行えばよい。

【００５２】 本明細書での目的において、“からなる”という語は“含むが限定されるもの
ではない”ことを意味することが明らかに理解されるであろう。それに対応する
意味が“からなる”という語にあてはまる。

【００５３】 好適実施例の詳細な説明 例１ ＶＥＧＦ−Ｄ誘導体を安定に発現する細胞系 ＶＥＧＦ−Ｄの誘導体を構成的に発現する細胞系を産生するために、ヒトＶＥ
ＧＦ−Ｄ ｃＤＮＡの領域を哺乳類の発現ベクターＡｐｅｘ−３（エヴァンス（
Evans）他, Mol. Immunol., 1995 32 1183-1195)に挿入した。このベクターを２
９３−ＥＢＮＡヒト胎児性(embryonal)腎臓細胞にトランスフェクトした(transf
ected)場合、エピソームとして(episomally)維持した。ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの
発現のために、ＩＬ−３シグナル配列、ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドお
よびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃをコードする配列を含む、ｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦ−Ｄ
△Ｎ△Ｃの領域をＡｐｅｘ−３のＸｂａＩ部位に挿入した（国際特許出願ＰＣＴ
／ＵＳ９７／１４６９６における例９を参照）。その結果得られたプラスミドを
ｐＶＤＡｐｅｘ△Ｎ△Ｃと命名した。これは図１において図式的に図示されてい
る。Ｎ−末端にＦＬＡＧ（登録商標）がタグ付加された（tagged）全長ヒトＶＥ
ＧＦ−Ｄの誘導体である、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇの発現のため、また
、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃと命名された、アミノ酸残基２から２０２からなるヒトＶＥ
ＧＦ−Ｄの切形の(truncated)誘導体の発現のために、同様のタイプのコンスト
ラクトを作成した。これらのＶＥＧＦ−Ｄ誘導体のための発現コンストラクトを
、それぞれｐＶＤＡｐｅｘＦｕｌｌＮＦｌａｇおよびｐＶＤＡｐｅｘ△Ｃと命名
した。これらもまた、図１において図式的に示されている。ＩＬ−３ ＳＳは、
インターロイキン−３シグナル配列を表し、矢印は、サイトメガロウイルスプロ
モーター（ＣＭＶ）から発現カセットへと進行する、転写の方向を表す。これら
のベクターをヒト胎児(embryo)腎臓細胞系２９３−ＥＢＮＡの細胞に、リン酸カ
ルシウム法によってトランスフェクトし、そして安定なトランスフェクタントを
ハイグロマイシンの存在下で選抜した。高レベルのＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌ
ａｇ、ＶＥＧＦ−Ｄ△ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを発現する細胞系を、引き
続いて、図２に示すように、代謝標識、免疫沈降およびウエスタンブロット分析
によって同定した。

【００５４】 図２において、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃおよ
びＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃを発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞系を代謝的に標識し、なら
し培地(培養上清conditioned medium)サンプルにおけるタンパク質を、抗−ＦＬ
ＡＧ抗体（Ｍ２）またはＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦホモロジードメインに対して特
異的な抗血清（Ａ２）によって、免疫沈降した。沈降したタンパク質をＳＤＳ−
ＰＡＧＥによって分析し、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇおよびＶＥＧＦ−Ｄ
△Ｎ△Ｃの場合にはオートラジオグラフィーによって可視化し、また、ＶＥＧＦ
−Ｄ△Ｃの場合にはＭ２抗体によるウエスタンブロット分析で検出した。矢印は
ＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の位置を示す。これらの誘導体は親の(parental) ２９３−
ＥＢＮＡ細胞に由来するコントロール上清からは検出されなかった（データは示
さない）。分子量マーカーの（ｋＤａにおける）位置を各パネルの右側に示す。
ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃのウエスタンブロット分析によって検出されたおよそ５０ｋＤ
ａのバンドは、免疫グロブリン重鎖に対応する。

【００５５】 多数のＶＥＧＦ−Ｄ誘導体が、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇおよびＶＥＧ
Ｆ−Ｄ△Ｃを発現する細胞の上清において検出された。これらの誘導体は、ＶＥ
ＧＦ−Ｄの生合成の一部として起こるタンパク分解性プロセシングの結果として
形成される。ＶＥＧＦ−ＤＮＦｕｌｌＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−Ｄ△ＣおよびＶＥＧ
Ｆ−Ｄ△Ｎ△Ｃを発現する細胞系は、少なくとも２０回継代する間、ハイグロマ
イシン選抜下で維持し、そしてＶＥＧＦ−Ｄ誘導体を発現させ続けた。

【００５６】 例２ ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの可溶性のＶＥＧＦ受容体への結合 ＶＥＧＦ−ＤとＶＥＧＦ受容体との間の相互作用をさらに評価するため、ＶＥ
ＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを、ヒトＶＥＧＦＲ−１、ヒトＶＥＧＦＲ−２およびヒトＶＥ
ＧＦＲ−３の細胞外ドメインを含む可溶性の免疫グロブリン融合タンパク質に対
して結合するその能力についてテストした。対応するＶＥＧＦ−Ｃのフラグメン
ト、ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃを比較のために使用した。結合実験のために、２９３
Ｔヒト胎児性腎臓細胞を、リン酸カルシウム（Ｃａ−ホスフェイト）法を用いて
、可溶性の受容体−免疫グロブリン融合タンパク質であるＶＥＧＦＲ−１−Ｉｇ
、ＶＥＧＦＲ−２−ＩｇまたはＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇをコードするプラスミドに
よってトランスフェクトした。これらの融合タンパク質において、関連するＶＥ
ＧＦ受容体の細胞外ドメインを、ヒトＩｇＧ₁のＦｃ部分に融合させた。トラン
スフェクションの後、細胞を２４時間インキュベートし、０．２％ウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）を含有するダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ：Dulbecco
's Modified Eagle's Medium）で洗浄し、そして２４時間飢餓させた。次に培地
を収集し、遠心分離によって清澄にし、そして融合タンパク質をプロテインＡセ
ファロースビーズを用いて沈降させた。このセファロースビーズを次に、Ｃａ−
ホスフェイト法を用いてヒトＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃ
またはヒトＶＥＧＦ₁₆₅をコードする発現プラスミドによってトランスフェクト
された２９３−ＥＢＮＡ細胞からの、９００μｌの代謝的に³⁵Ｓ−標識された培
地とともに、室温で３時間インキュベートした。２９３−ＥＢＮＡ細胞の代謝標
識は基本的に記載されているようにして行った（ヨウコフ（Joukov）他, 1997)
。セファロースビーズを次に結合緩衝液（リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の０．
５％ ＢＳＡ、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０、１μｇ／ｍｌ ヘパリン）で４℃
で２回、そしてＰＢＳで１回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉサンプル緩衝液中でボイル
し、そして次にタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。結果を図３に
示す。

【００５７】 図３において、標識されたＶＥＧＦ₁₆₅、ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△ＣおよびＶＥＧ
Ｆ−Ｄ△Ｎ△Ｃの、ＶＥＧＦＲ−１−Ｉｇ、ＶＥＧＦＲ−２−ＩｇおよびＶＥＧ
ＦＲ−３−Ｉｇによる沈降を上記のように行った。沈降のために用いた融合タン
パク質を右に示す。“ベクター”は、ＶＥＧＦ類をコードする配列を欠く発現ベ
クターによってトランスフェクトされた細胞に由来する培地からの沈降の結果を
示す。分子量マーカーをは、ｋＤａにて示されている。

【００５８】 ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃについて予想されるサイズ（およそ２２ｋＤａ）のポリ
ペプチドが、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを発現する細胞の培地から、ＶＥＧＦＲ−２
−ＩｇおよびＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇによって沈降した。対照的に、同じ培地から
、ＶＥＧＦＲ−１−Ｉｇによってはこのサイズのタンパク質は沈降しなかった。
ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃの沈降についても基本的に同じ結果が観察された。予想さ
れたように、およそ２４ｋＤａの主なポリペプチドが、ＶＥＧＦ₁₆₅を発現する
細胞の培地から、ＶＥＧＦＲ−１−ＩｇおよびＶＥＧＦＲ−２−Ｉｇによって沈
降したが、ＶＥＧＦＲ−３−Ｉｇによっては沈降しなかった。ＶＥＧＦ類をコー
ドする配列を欠く発現ベクターによってトランスフェクトされた細胞の培地から
は、３つの融合タンパク質によって、いずれの標識されたタンパク質も沈降しな
かった。これらのデータは、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△ＣはＶＥＧＦＲ−２およびＶＥ
ＧＦＲ−３には結合することができるがＶＥＧＦＲ−１には結合することができ
ないということを示している。したがって、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃは、ＶＥＧＦ
Ｒ−２およびＶＥＧＦＲ−３に対する受容体−結合特異性において、ＶＥＧＦ−
Ｃ△Ｎ△Ｃと似ている。

【００５９】 例３ マウス胚におけるＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子発現のin situハイブリダイゼーシ
ョン研究 マウスＶＥＧＦ−Ｄ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド１から３４０に対応する放射
能標識したアンチセンスＲＮＡプローブを用いたin situハイブリダイゼーショ
ンによって、ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子発現のパターンを研究した。マウスＶＥＧＦ−
Ｄ１ ｃＤＮＡの配列を図４に示す。アンチセンスＲＮＡは、Ｔ３ ＲＮＡポリ
メラーゼおよび［³⁵Ｓ］ＵＴＰαｓを用いたインビトロの転写によって合成した
。マウスＶＥＧＦ−Ｄは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６において
完全に記載されている。このアンチセンスＲＮＡプローブを、交尾後１５．５日
のマウス胚のパラフィン−包埋した組織切片にハイブリダイズさせた。標識され
た切片を２日間オートラジオグラフィーにかけた。その結果得られた、アンチセ
ンスＲＮＡおよび（ネガティブコントロールとして）相補的なセンスＲＮＡに対
してハイブリダイズした切片についてのオートラジオグラフを、図５に示す。図
５において、“Ｌ”は肺を表し、“Ｓｋ”は皮膚を表す。そして図示されたこれ
ら２つの組織切片は連続的な切片である。ＶＥＧＦ−Ｄ ｍＲＮＡに対する強い
シグナルが、発生中の肺において検出され、そして、皮膚に付随していた。コン
トロールセンスＲＮＡを用いた場合は、シグナルは検出されなかった。

【００６０】 図６において、矢状の(sagittal)組織切片をＶＥＧＦ−ＤアンチセンスＲＮＡ
プローブにハイブリダイズさせ、そして引き続いて写真乳剤とともにインキュベ
ートし、現像および染色した。顕微鏡的な分析によってＶＥＧＦ−Ｄ ｍＲＮＡ
は発生中の肺の間葉細胞において大量にあるということが明らかにされた（図６
Ａ−Ｃ）。対照的に、気管支および細気管支（気管支梢）の上皮細胞、そして気
管支を囲む発生中の平滑筋細胞は、ネガティブであった。気管支動脈の内皮細胞
もネガティブであった。図６Ａにおいて、顕微鏡写真の暗い領域は、肺（Ｌｕ）
におけるＶＥＧＦ−Ｄ ｍＲＮＡに対する強いシグナルを示す。肝臓（Ｌｉ）お
よび肋骨（Ｒ）も示されている。図６Ｂは、より高い拡大率における肺を示す。
顕微鏡写真の明るい領域は、気管支（Ｂｒ）および気管支動脈（ＢＡ）を示す。
黒い長方形の輪郭は、図６Ｃに示される切片の領域を示すものであるが、図６Ｃ
はより高い拡大率のものである。図６Ｃは、気管支の上皮細胞（Ｅｐ）、上皮細
胞層を囲む発生中の平滑筋細胞（ＳＭ）および間葉細胞（Ｍｅｓ）を示す。間葉
細胞に付随する銀粒子が大量であることが明らかである。図６Ｄにおいて、顕微
鏡写真の暗い領域は、肢芽を示す。線維芽細胞および発生中のメラノサイトに富
む組織の領域における皮膚のすぐ下に、強いシグナルが位置していた。図６Ａお
よびＤについての拡大率はｘ４０であり、図６Ｂについての拡大率はｘ２００で
あり、図６Ｃについての拡大率はｘ５００であった。

【００６１】 ここに示した結果は、ＶＥＧＦ−Ｄは血管およびリンパ管の増殖を、発生中の
肺および皮膚のすぐに下側の領域へと誘引している可能性があることを示唆する
ものである。皮膚の近くでＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子が発現していることにより、ＶＥ
ＧＦ−Ｄは悪性のメラノーマに関連する血管新生を誘導することにおいて役割を
果たしている可能性があると考えられる。悪性のメラノーマは非常に高度に血管
新生化された(vascularized)腫瘍である。このことは、例えばＶＥＧＦ−Ｄまた
はＶＥＧＦ−Ｄ受容体−２またはＶＥＧＦ−Ｄ受容体−３に対する抗体を用いた
、ＶＥＧＦ−Ｄ発現の局所的な阻害が、悪性のメラノーマの治療において有用で
あることを示唆するものである。アンチセンス核酸または三本鎖ＤＮＡなどのそ
の他の好適なＶＥＧＦ−Ｄ活性の阻害剤も利用することができる。

【００６２】 例４ ヒトＶＥＧＦ−Ｄに結合するモノクローナル抗体の産生 ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに対するモノクローナル抗体をマウスにおいて産生させ
た。ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃは、ＶＥＧＦ−ＤのＶＨＤのアミノ酸配列を含み、Ｖ
ＥＧＦファミリーの他のすべてのメンバーと配列において似ている。それゆえ、
ＶＥＧＦ−Ｄの生理活性の部分はおそらくＶＨＤにおいて存在すると考えられて
いる。ヒトＶＥＧＦ−Ｄの残基９３から２０１の切形の(truncated)部分、すな
わち、Ｎ−末端領域およびＣ−末端領域が除去された部分をコードするＤＮＡフ
ラグメントを、テンプレートとして全長ヒトＶＥＧＦ−Ｄ ｃＤＮＡを含むプラ
スミドを使用した、Ｐｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを用いたポリメラーゼ連鎖反応
（ＰＣＲ）によって増幅した。増幅されたＤＮＡフラグメントの配列をヌクレオ
チドシークエンシングによって確認し、そして発現ベクターｐＥＦＢＯＳＳＦＬ
ＡＧ（The Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research (WEHI), M
elbourne, Australiaの Dr. Clare McFarlane から寄贈）に挿入し、ｐＥＦＢＯ
ＳＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃと命名したプラスミドを生じさせた。ｐＥＦＢＯＳＳＦ
ＬＡＧベクターは、インターロイキン−３（ＩＬ−３）遺伝子からのタンパク質
分泌のためのシグナル配列およびＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド(Sigma-A
ldrich)をコードするＤＮＡを含むものである。ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペ
プチドはＭ２モノクローナル抗体(Sigma-Aldrich)などの市販の抗体によって認
識され得る。ＶＥＧＦ−Ｄ ＰＣＲフラグメントをこのベクターに、ＩＬ−３シ
グナル配列がＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドのすぐに上流になり、ＦＬＡ
Ｇ（登録商標）オクタペプチドが切形のＶＥＧＦ−Ｄ配列のすぐに上流になるよ
うに挿入した。これら３つのすべての配列は同じ読み枠になっており、したがっ
てｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの哺乳類の細胞へのトランスフェクション
の結果としておこるｍＲＮＡの翻訳により、そのＮ−末端にＩＬ−３シグナル配
列を、続いてＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド、および切形のＶＥＧＦ−Ｄ
配列を有するタンパク質が生じることになる。シグナル配列の切断およびそれに
引き続く細胞からのタンパク質の分泌により、Ｎ−末端に隣接してＦＬＡＧ（登
録商標）オクタペプチドがタグ付加された(tagged)、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチド
が生じることになる。このタンパク質をＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃと命名した。ＶＥ
ＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを、プラスミドｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃによって一
過性にトランスフェクトされたＣＯＳ細胞の培地から、抗−ＦＬＡＧ（登録商標
）アフィニティークロマトグラフィーによって精製した。（国際特許出願ＰＣＴ
／ＵＳ９７／１４６９６における例９を参照）。

【００６３】 精製したＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを用いて雌のＢａｌｂ／ｃマウスを免疫した。
免疫されるマウスから脾臓細胞を収集する８５日前（腹腔内）、７１日前（腹腔
内）および４日前（静脈内）に免疫し、引き続いてこれら脾臓細胞をマウスミエ
ローマＰ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３（ＮＳ−１）細胞に融合させた。最初の２回の
免疫化には、ＰＢＳとTiterMaxアジュバント(＃R-1 Research adjuvant; CytRx
Corp., Norcross, GA)との１：１混合物中で、およそ１０μｇのＶＥＧＦ−Ｄ
△Ｎ△Ｃを注射し、３回目の免疫化にはＰＢＳ中の、３５μｇのＶＥＧＦ−Ｄ△
Ｎ△Ｃを用いた。

【００６４】 エンザイムイムノアッセイ（酵素免疫測定法）を用いて精製したＶＥＧＦ−Ｄ
△Ｎ△Ｃについてハイブリドーマをスクリーニングすることによって、ＶＥＧＦ
−Ｄ△Ｎ△Ｃに対するモノクローナル抗体を選抜した。簡単に説明すると、９６
ウェルマイクロタイタープレートを、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃでコーティングし、
そしてハイブリドーマ上清を添加し、４℃で２時間インキュベートした。続いて
、０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ中で６回洗浄した。次に西洋わさび
ペルオキシダーゼ結合(conjugated)抗−マウスＩｇ(Bio-Rad, Hercules, CA)と
ともに４℃で１時間インキュベーションを行った。洗浄後、２，２’−アジノ−
ジ−（３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸（ＡＢＴＳ;2,2'-azino-di-(3-et
hylbenz-thiazoline sulfonic acid)基質システム(Zymed, San Francisco, CA)
によってアッセイを明らかにし、そしてマルチウェルプレートリーダー(multiwe
ll plate reader)(Flow Laboratories MCC/340, McLean, VA)で４０５ｎｍの吸
光度を判断することによってアッセイを数量化した。６つの抗体をさらなる分析
のために選択し、限界希釈（法）によって２回サブクローニングした。これらの
抗体を、２Ｆ８、３Ｃ１０、４Ａ５、４Ｅ１０、４Ｈ４および５Ｆ１２と命名し
た。これら抗体のアイソタイプを、Ｉｓｏｓｔｒｉｐ（商標）アイソタイピング
(isotyping)キット(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)を用いて判定した
。抗体２Ｆ８、４Ａ５、４Ｅ１０および５Ｆ１２はＩｇＧ₁クラスであり、４Ｈ
４および３Ｃ１０はＩｇＭクラスのものであった。６つのすべての抗体がκ軽鎖
を含んでいた。

【００６５】 ハイブリドーマ細胞系を、５％ ｖ／ｖ ＩｇＧ−除去(depleted)血清(Gibco
BRL, Gaithersburg, MD)、５ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μｇ／ｍｌ ゲンタ
マイシンおよび１０μｇ／ｍｌ 組換えＩＬ−６を含有するＤＭＥＭ中で培養し
た。ダービー（Darby）他, J. Immunol. Methods, 1993 159 125-129 の技法に
したがって、プロテインＧ−セファロースを用いたアフィニティークロマトグラ
フィーによって、抗体２Ｆ８、４Ａ５、４Ｅ１０および５Ｆ１２を精製し、そし
て収率を２８０ｎｍにおける吸収を測定することによって評価した。

【００６６】 例５ ヒト腫瘍の免疫組織化学的分析のための、ヒトＶＥＧＦ−Ｄに対するモノ
クローナル抗体の使用 腫瘍形成におけるＶＥＧＦ−Ｄの役割を評価するために、上述のＭＡｂをヒト
の悪性のメラノーマの免疫組織化学的分析のために使用した。この分析のために
、４つのＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂ、２Ｆ８、５Ｆ１２、４Ａ５および４Ｅ１０を使
用した。ＬＭＭ７７４と命名された、顆粒球コロニー刺激因子の受容体に対して
産生されたＭＡｂ（レイトン（Layton）他, Growth Factors, 1997 14 117-130)
をネガティブコントロールとして使用した。これら（４つ）のＶＥＧＦ−Ｄ Ｍ
Ａｂと同様に、ＬＭＭ７７４は、マウスＩｇＧ₁アイソタイプのものであり、そ
れゆえアイソタイプ−一致(matched)コントロール抗体として役立った。これら
のＭＡｂを、２つのランダムに選ばれた浸潤性の悪性のメラノーマに対して免疫
組織化学によってテストした。皮膚の悪性のメラノーマの、ホルマリン固定およ
びパラフィン包埋した組織からの厚さ５マイクロメーターの切片を、テスト組織
として用いた。切片を脱ろう(dewaxed)および再水和(rehydrated)し、そしてＰ
ＢＳで洗浄した。１：５０に希釈された正常なウサギ血清を、各切片に対して２
０分間与えた(applied)。過剰の血清を取り除き(blotted off)、そして一次抗体
、すなわちクルードに(crudely)至適化された１：１００および１：２００の希
釈度のＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂおよびＬＭＭ７７４を、切片に与え、そして室温で
一晩、湿室においてインキュベートした。切片を再びＰＢＳ中で５分間洗浄し、
続いてＰＢＳ中の１：４００の希釈度の、ビオチン標識したウサギ抗−マウス抗
体(DAKO Corp., Carpinteria, CA)を室温で３５分間与えた。切片を次にｔｒｉ
ｓ緩衝食塩水（ＴＢＳ）中で５分間洗浄し、そしてＴＢＳ中、１：５００の希釈
度にて、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ(Silenus, Australia)を
与えた。切片をＴＢＳ中で５分間洗浄し、そして高速赤色基質(the fast red su
bstrate)(Sigma, St. Louis, MO)を室温で２０分間与えた。切片を水中で洗浄し
、そしてマウントした(mounted)。赤色の反応産物を用いたのは、メラニンを産
生する腫瘍の解釈における混同を回避するためである。ＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂを
省略したステップ省略コントロール、およびＬＭＭ７７４抗体を用いたアイソタ
イプ−一致(mathed)コントロールを、実験に含ませた。

【００６７】 図７Ａ−Ｃは、同じメラノーマサンプルでの結果を示し、図７Ｄおよび７Ｅは
、同じバッチにおいて染色した異なる腫瘍についての結果を示す。免疫反応性の
メラノーマ細胞の島が、（１）図７Ａおよび７Ｂにおける矢印で示された部分の
内側によって示され、免疫反応性の血管が、（２）７Ｃにおける矢印で示された
部分の内側によって示されている。７Ｅにおいて、異なるレベルのＶＥＧＦ−Ｄ
を有するメラノーマ細胞が明らかとなっている。図７Ａ、７Ｄおよび７Ｅにおけ
る拡大率はおよそｘ６０であり、図７Ｂおよび７Ｃにおける拡大率はおよそｘ３
００である。

【００６８】 陽性の（ポジティブな）反応が４つのすべてのＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂについて
みられ、それらは基本的に同じ染色パターンであった。図７Ａ−Ｃおよび７Ｅに
示す結果は、ＭＡｂ ２Ｆ８によるものである。光学顕微鏡的な検査による染色
パターンの評価によって、メラノーマの大部分にわたってむらがある染色が示さ
れた。大きい方の腫瘍では、浸潤性の部分の周囲における腫瘍細胞の小さい島に
おいて（図７Ａおよび７Ｂ）、および表皮内の腫瘍細胞の巣(nests)において、
染色がより明白であり、腫瘍の中心の浸潤性の部分においては、染色はより薄い
かまたは検出不可能であった。陽性（ポジティブ）に反応する腫瘍細胞の近くの
乳頭および網状の真皮における小さい毛細血管サイズの血管では、内皮細胞の細
胞質において抗体に対するむらがある粒状の反応が示された（図７Ｃ）。小さい
方の腫瘍についての反応は、腫瘍塊(tumor mass) 全体を通じて、分布において
より均等であった（図７Ｅ）。腫瘍の外側の不定な距離にある、免疫反応性の腫
瘍細胞から離れている中部および深部の網状の真皮および皮下の組織における血
管は、ＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂとの反応を示さなかった。ＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂに
よる結果とは対照的に、同じ腫瘍におけるＬＭＭ７７４コントロールは陰性（ネ
ガティブ）であり（図７Ｄ）、ステップ省略コントロールも陰性（ネガティブ）
であった。

【００６９】 いくつかの腫瘍について、ＶＥＧＦ合成および分泌は低酸素の腫瘍細胞におい
て開始されうること、および、腫瘍は血管の近くの内皮細胞におけるＶＥＧＦＲ
−２の発現も誘導することができることが示されている（プレート（Plate）他,
Cancer Res., 1993 53 5822-5827)。このように、腫瘍血管新生を誘導するため
のパラクリンシステムが確立しており、それによって腫瘍において分泌されるＶ
ＥＧＦは、間質に拡散して標的内皮細胞におけるＶＥＧＦＲ−２に結合し、そし
てその結果、内皮細胞増殖を誘導する。メラノーマにおいてＶＥＧＦ−Ｄが局在
しているという結果は、ＶＥＧＦ−Ｄが悪性のメラノーマにおいて同様の機能を
果たしている可能性があることを示すものである。テストされた両方の臨床サン
プルにおいて、ＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂはメラノーマ細胞におけるＶＥＧＦ−Ｄを
検出した。これら腫瘍細胞はＶＥＧＦ−Ｄを産生している可能性が非常に高い。
さらに、ＶＥＧＦ−Ｄは、プロデューサー腫瘍細胞の付近における血管の内皮細
胞において検出されたが、より遠い血管では検出されなかった。ＶＥＧＦ−Ｄは
、おそらく腫瘍血管においてしばしば発現しているＶＥＧＦ−Ｄに対する受容体
であるＶＥＧＦＲ−２との相互作用のために、これらの内皮細胞に局在している
のであろう（プレート（Plate）他, Cancer Res., 1993 53 5822-5827)。ＶＥＧ
Ｆ−Ｄが腫瘍の付近におけるリンパ管においても局在しているかどうかを評価す
るために、さらなる免疫組織化学的分析が必要であろう。そのようなシナリオは
ありうる。というのは、リンパ内皮細胞は、ＶＥＧＦ−Ｄに対する高アフィニテ
ィー受容体であるＶＥＧＦＲ−３を発現しているからである（ヨウコフ（Joukov
）他, The EMBO Journal, 1996 15 290-298)。

【００７０】 前記の諸結果は、メラノーマ細胞がＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子を発現することができ
るということを示すものである。交尾後１５．５日のマウス胚の、in situハイ
ブリダイゼーションによる分析は、発生中のメラノサイトおよび線維芽細胞に富
む領域における、発生中の皮膚のすぐ下でのＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子の発現を示すも
のであった（例３および図５および図６）。したがって、胚発生における場合の
ように、トランスフォームされたメラノサイトは、ＶＥＧＦ−Ｄに対する遺伝子
を発現する能力を再獲得している可能性がある。もし発癌トランスフォーメーシ
ョン以外の現象が、メラノサイトにおけるＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子発現を誘導するこ
とができるとすれば、このタンパク質は、炎症または血管および／またはリンパ
管の増殖によって特徴づけられる、他のタイプの皮膚障害においても関与してい
る可能性がある。治療的な設定において、組織損傷に応じてＶＥＧＦ−Ｄを適用
することは、再生中の皮膚の近くの血管およびリンパ管の増殖を刺激するために
有用であろう。同様に、血管新生およびリンパ脈管形成を刺激するためにＶＥＧ
Ｆ−Ｄを適用することは、皮膚移植法の成功性を高めるために有用であろう。こ
れらは、火傷およびその他の外傷の傷害などの多様な状態の治療、外科的な瘢痕
の回避または減少、美容整形など、において利用される。

【００７１】 例６ ＶＥＧＦ−Ｃに対して結合する能力についての抗体のテスト 前述のエンザイムイムノアッセイ（酵素免疫測定法）を用いて、ＶＥＧＦ−Ｃ
△Ｎ△Ｃに結合する能力について、６つのＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂをテストした。
ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃは、ＶＥＧＦ−ＣのＶＥＧＦホモロジードメイン（残基１
０３から２１５）からなり、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃに最も似ているＶＥＧＦ−Ｃ
の領域である。Ｃ−末端に６ｘヒスチジンタグを加えたＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃを
、発現ベクターｐＩＣ９(Invitrogen, San Diego, CA)を用いて製造業者の指示
に従って、酵母ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの菌株ＧＳ１１５中で発現させ、Ｎｉ−Ｎ
ＴＡ スーパーフロー(Superflow) 樹脂(QIAGEN, Valencia, CA)を用いて精製し
た。このイムノアッセイによってテストした６つの抗体の内、４Ｅ１０のみがＶ
ＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃに結合した。

【００７２】 例７ ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦ−Ｃと類似の様式でタンパク分解性にプロセシ
ングされる ＶＥＧＦ−Ｄのタンパク分解性プロセシングを研究するために、２９３−ＥＢ
ＮＡ細胞を、ｐＶＤＡｐｅｘ△Ｃ、ｐＶＤＡｐｅｘＦｕｌｌＮＦｌａｇ、ｐＶＤ
Ａｐｅｘ△Ｎ△Ｃ（例１および図１）、およびｐＶＤＡｐｅｘＦｕｌｌＣＦｌａ
ｇによって安定にトランスフェクトした。これらの発現コンストラクトはそれぞ
れ、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃ、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△
Ｃ（例１および図１）およびＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＣＦｌａｇをコードするもの
である（図８）。ＶＥＧＦ−Ｄの構造上のドメインを、図８の最上部に示す。“
ＳＳ”は、タンパク質分泌のためのシグナル配列を示し、Ｎ−末端プロおよびＣ
−末端プロは、プロペプチドを示し、そしてＶＨＤは、ＶＥＧＦホモロジードメ
インを示す。その下方に、ＶＥＧＦ−Ｄにおける特徴づけされた推定上のタンパ
ク分解性(proteolytic)切断部位が矢印によってしるしを付けられて示されてい
る。可能性のあるＮ−結合型グリコシル化部位は、星印によってしるしを付けら
れている。Ａ２抗血清（下記）を産生するために免疫原として使用されたＶＥＧ
Ｆ−Ｄの領域は、黒いバーによって示されている。図の下側半分は、２９３−Ｅ
ＢＮＡ細胞において発現された、ＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の一次翻訳産物を示してい
る。簡明さのために、タンパク質分泌のためのシグナル配列は省略してある。Ｆ
ＬＡＧオクタペプチドエピトープは、丸で囲まれた“Ｆ”によって示されている
。プラスミドｐＶＤＡｐｅｘＦｕｌｌＣＦｌａｇは、タンパク質分泌のための内
因性のＶＥＧＦ−Ｄシグナル配列に対するＤＮＡが保持されており、翻訳開始の
ための“Ｋｏｚａｋ”コンセンサス配列が至適化され、ＶＥＧＦ−Ｄの開始コド
ンのすぐ後に、３つのアミノ酸“Ａ−Ｒ−Ｌ”の挿入が必要となっているという
点をのぞいては、ｐＶＤＡｐｅｘＦｕｌｌＮＦｌａｇ（例１）と類似の方法によ
って構築された。このコンストラクトは、タンパク質のＣ−末端において、アミ
ノ酸“Ａ−Ｒ−Ｑ”、それに続いてＦＬＡＧオクタペプチド配列もコードするも
のであった。２９３−ＥＢＮＡ細胞系は、ＶＥＧＦ−Ｃをタンパク分解性にプロ
セシングする能力を有しており（ヨウコフ（Joukov）他, EMBO J., 1997 16 389
8-3911)、このことのよって、これらトランスフェクトされた細胞に由来するＶ
ＥＧＦ−Ｄ誘導体の分析を、細胞の生合成およびプロセシングの間に行うことが
可能になる。

【００７３】 ＶＥＧＦ−Ｄ誘導体を、安定にトランスフェクトされた２９３−ＥＢＮＡ細胞
のならし培地（培養上清）から、Ｍ２（抗−ＦＬＡＧ）ゲル(Sigma-Aldrich)で
のアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、製造業者の指示に従って
、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドを用いて溶出した。ＦＬＡＧ（登録商標）ペプ
チドを、遠心濃縮機(Amicon, Beverly, MA)を用いて除去した。Ｍ２アフィニテ
ィーカラムから溶出されたフラクションのアリコットを、精製された種の正体を
確認するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色によって分析するか、あるいは
Ｍ２抗体(Sigma-Aldrich)によってイムノブロットした。

【００７４】 種々のＶＥＧＦ−Ｄ誘導体を発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞のＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅによる分析は、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドがタンパク分解性にプロセシングさ
れていることを示すものである。ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇを発現する２
９３−ＥＢＮＡ細胞からの培地を用いた精製により、Ｎ−末端にＦＬＡＧオクタ
ペプチドを備えたＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドのみの、または、ＦＬＡＧ（登録商
標）−タグ付加された(tagged)ポリペプチドに共有結合的にあるいは非−共有結
合的に結合した誘導体の、特異的な分析が可能になった（図８および図１１）。

【００７５】 ＶＨＤ内にある、ヒトＶＥＧＦ−Ｄの残基１９０から２０５の領域に対応する
合成ペプチド、ＫＣＬＰＴＡＰＲＨＰＹＳＩＩＲＲ（配列番号３）（ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９７／１４６９６の配列番号５）に対する、Ａ２と命名されたポリクローナル
抗血清をウサギにおいて産生させた。

【００７６】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析のために、精製ＶＥＧＦ−Ｄ
誘導体を含有するサンプルを、２ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液と１：１の
割合で混合し、ボイルし、そしてＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した（レームリ
（Laemmli）, Nature, 1970 227 680-685)。タンパク質を次にＩｍｍｏｂｉｌｏ
ｎ−Ｐメンブラン(Millipore, Bedford, MA)にトランスファーし、そして非−特
異的な結合部位を、３％ ＢＳＡ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５
）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０中でインキュベー
ションすることによってブロッキングした。ブロットを次に１：２０００の希釈
度のＡ２抗血清とともに室温で２時間インキュベートするか、あるいはその代わ
りに、製造業者によって記載されているようにしてＭ２（抗−ＦＬＡＧ）抗体と
ともにインキュベートした。緩衝液（３％ ＢＳＡ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０２％ Ｔｗｅｅｎ２０
）中で洗浄した後、ブロットを抗−ウサギＩｇ西洋わさびペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰ）結合体または抗−マウスＩｇ ＨＲＰ結合体(Biorad, Hercules, CA)によ
ってプローブ（探索）し、化学発光(ECL, Amersham, UK)を用いて現像した。

【００７７】 ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇを発現する細胞によって分泌されるタンパク
質の、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色による分析によって、プロ
セシングされていないＶＥＧＦ−Ｄの予想されるサイズである、およそ５３ｋＤ
ａの種、および、およそ３１および２９ｋＤａの２つのポリペプチドが明らかに
された（図９Ａ）。（ｋＤａにおける）分子量マーカーのサイズは、各パネルの
左側に示され、ＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の位置は（ｋＤａにおける分子量とともに）
、右側に矢印によってしるしを付けられている。この結果はＶＨＤのＣ−末端近
くで起こる、タンパク分解性切断現象と一致している。このモデルによると、お
よそ５３ｋＤａのポリペプチドは、プロセシングされていないＶＥＧＦ−Ｄを表
すものであり、およそ３１ｋＤａのポリペプチドは、Ｎ−末端プロペプチドおよ
びＶＨＤからなる（すなわち、Ｃ−末端プロペプチドを欠いている）ものであろ
う。Ｎ−末端プロペプチドおよびＶＨＤからなるポリペプチドの予想されるサイ
ズは確かにおよそ３１ｋＤａである。というのは、グリコシル化されているＶＨ
Ｄはおよそ２１ｋＤａであることが以前に示されており（アーヘン（Achen）他,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998 95 548-553; ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９
６の図１２ｂ）、ＦＬＡＧ−タグ付加された(tagged) Ｎ−末端延長の予想され
るサイズはおよそ１０ｋＤａであるからである。もしＶＥＧＦ−Ｄのプロセシン
グに、ＶＨＤのＣ−末端の近くでの切断に加えて、ＶＨＤのＮ−末端の近くでの
切断が関与しているとすれば、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇを発現する細胞
は、Ｎ−末端延長のみからなる１０ｋＤａのＦＬＡＧ−タグ付加されたポリペプ
チドも分泌するはずである。銀染色によって評価した場合（図９Ａ）、これら細
胞によって分泌されるＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の中に１０ｋＤａのポリペプチドは検
出されなかったが、それは、Ｍ２抗体を用いた同じ材料のウエスタンブロット分
析によって明瞭に検出された（図９Ｂ）。銀染色によって検出されたおよそ２９
ｋＤａのポリペプチドは、同じサンプルにおいてＡ２ポリクローナル抗血清を用
いたウエスタンブロットによっては検出されなかった（図９Ｃ）。したがってこ
れはＣ−末端プロペプチドを表すものであろう。このことを、このポリペプチド
のＮ−末端アミノ酸によって確認した。すなわち、このポリペプチドのＮ−末端
配列は“ＳＩＱＩＰＥＥＤ”（配列番号４）であると確認され、この配列は、Ｖ
ＥＧＦ−Ｃとの比較に基づいて予想されるＶＨＤのＣ−末端切断部位のすぐに近
くのものである。したがって、ＶＥＧＦ−ＤにおけるＣ−末端切断部位は、アル
ギニン２０５のすぐ後に位置する（“Ｒ↓ＳＩＱＩＰＥＥＤ”）（配列番号５）
。このおよそ２９ｋＤａのポリペプチドは、おそらく、Ｎ−末端およびＣ−末端
プロペプチドの間の鎖間ジスルフィド結合のために、アフィニティー−精製され
た物質中に存在していたのであろう（ＶＥＧＦ−Ｄプロセシングのスキーム（模
式図）については図１１を参照）。

【００７８】 ＶＨＤのＮ−末端の近くでのＶＥＧＦ−Ｄのタンパク分解性切断の可能性をさ
らに調べるために、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃを発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞によって
分泌されるタンパク質を精製し、上記のように分析した。ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃのた
めのコンストラクトは、Ｃ−末端延長が欠失しておりＦＬＡＧによって置換され
ている、ＶＥＧＦ−Ｄ誘導体を発現させる（図８）。これら細胞からのならし培
地（培養上清）は、銀染色によって評価した場合、およそ３１および２１ｋＤａ
の、２つのＦＬＡＧ−タグ付加されたポリペプチドを含んでいた（図９Ｄ）。こ
の結果は、ＶＨＤのＮ−末端近く、即ちプロセシングされていないＶＥＧＦ−Ｄ
のＮ−末端からおよそ１０ｋＤａのところで起こる、Ｎ−末端切断現象と一致し
たものである。したがって、およそ３１ｋＤａのポリペプチドは、Ｎ−末端延長
とＶＨＤとからなり、一方、およそ２１ｋＤａのポリペプチドは、ＶＨＤのみか
らなるものであろう。およそ３１およびおよそ２１ｋＤａのバンドの両方が、Ｍ
２抗体によるウエスタンブロット分析によって検出されたという知見は、このモ
デルと一致している（図９Ｅ）。また、予想されたように、これら両方のバンド
は、Ａ２抗血清によるウエスタンブロット分析によっても検出された（データは
示さない）。

【００７９】 ＶＥＧＦ−ＤにおけるＮ−末端タンパク分解性切断部位の正確な位置を判定す
るために、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃを発現する細胞の上清から精製された、およそ２１
ｋＤａのポリペプチドに対してＮ−末端アミノ酸シークエンシングを行った。ア
フィニティー−精製されたタンパク質のＮ−末端アミノ酸シークエンシングは、
Hewlett-Packardタンパク質シークエンサー、モデルＧ１０００Ａ(Hewlett-Pack
ard Palo Alto, CA)を用いて行った。このポリペプチドのＮ−末端配列は不均一
であった。材料のおよそ８０％を代表する主な配列は、“ＦＡＡＴＦＹ”（配列
番号６）で始まっており、材料の１０−１５％を代表する少ない方の配列は、“
ＫＶＩＤＥＥ”（配列番号７）で始まっていた。したがって、予想されたように
、およそ２１ｋＤａのポリペプチドのＮ−末端は、ＶＨＤのＮ−末端とほぼ同じ
位置に位置している。ＶＥＧＦ−Ｄの主な（メジャー）Ｎ−末端切断部位はアル
ギニン８８のすぐ後に位置しており（“Ｒ↓ＦＡＡＴＦＹ”）（配列番号８）、
そして少ない方の（マイナー）切断部位はロイシン９９のすぐ後にある（“Ｌ↓
ＫＶＩＤＥＥ”）（配列番号９）（図８）。

【００８０】 例８ ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃは主に非−共有結合性の二量体の形態で存在する 一般に、ＶＥＧＦファミリーメンバーはジスルフィド−結合したホモ二量体と
して存在する。しかし、ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃは、主に非−共有結合性の二量体
の形態で存在する（ヨウコフ（Joukov）他, EMBO J., 1997 16 3898-3911)。Ｖ
ＥＧＦ−Ｄの成熟した形態である、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎｐｒｏ△Ｃｐｒｏも、ジス
ルフィド−結合した二量体ではない。というのは、このポリペプチドはＳＤＳ−
ＰＡＧＥで、還元条件下および非−還元条件下においてほとんど全く同じに移動
するからである。成熟した形態のＶＥＧＦ−Ｄの性質をテストするために、アフ
ィニティー−精製したＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃをサイズ排除クロマトグラフィーに
かけた。サイズ排除クロマトグラフィーは、アフィニティー−精製したタンパク
質をＴＳＫＧ２０００ＳＷ（７．５ｘ６０ｍｍ Ｉｄ）カラム(LKB Bromo, Swed
en)にローディングすることによって行った。カラムをＰＢＳで平衡化した。タ
ンパク質を流速０．２５ｍｌ／分で溶出し、１分間のフラクションを収集した。
タンパク質の溶出は２１５ｎｍでモニターした。見かけ上の分子量（各ピークの
上に括弧内で示す）が、７３ｋＤａ（ピーク１）、４９ｋＤａ（ピーク２）およ
び２５ｋＤａ（ピーク３）である３つの主なピークがカラムから溶出した。そし
てこれらのピークにおける全タンパク質の比を分光光度的に評価したところ、お
よそ、１：２．１：０．９であった（図１０Ａ）。見かけ上の分子量は、既知の
タンパク質：ウシ血清アルブミン二量体、ウシ血清アルブミン、卵白アルブミン
およびトリプシンインヒビター(Sigma Aldrich Pty Ltd, Australia)から作成し
た検量線を用いて判定した。これらのピークに対応するフラクションをプールし
、遠心濃縮機を用いて１００μｌまで濃縮し、そして還元条件下でのＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥによって分析し、銀染色した（図１０Ｂ）。トラック１、２および３は、
それぞれピーク１、２および３からのタンパク質に対応する。ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ
△Ｃサブユニットの位置は図１０Ｂにおいて左側に示されており、（ｋＤａにお
ける）分子量マーカーの位置は右側に示されている。

【００８１】 ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃサブユニット（およそ２１ｋＤａ）は、ピーク２におい
て最も大量であり、ピーク３においては容易に検出可能であり、そしてピーク１
からは検出不可能であった（図１０Ｂ）。ピーク１における主な種は、Ｍ２アフ
ィニティークロマトグラフィーによって精製されたタンパク質のサンプルにおい
てしばしば検出される混入物であり、Ｍ２抗体またはＡ２抗血清によるウエスタ
ンブロット分析によっては検出することのできない（データは示さない）、７３
ｋＤａのタンパク質であった。この７３ｋＤａのタンパク質は、ＶＥＧＦ−Ｄを
コードする配列を欠くＡｐｅｘ−３プラスミドによってトランスフェクトされた
２９３−ＥＢＮＡ細胞からの上清を用いたコントロールＭ２アフィニティー精製
においても観察された（データは示さない）。サイズ排除クロマトグラフィーか
ら判定された見かけ上の分子量は、ピーク２および３におけるタンパク質はそれ
ぞれＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ二量体およびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ単量体であること
を示すものであった。したがって、そのサブユニットが還元条件下または非−還
元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて分離する、非−共有結合性の二量体が、
ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃのアフィニティー−精製された調製物における主な分子種
であった。

【００８２】 ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの二量体の形態および単量体の形態が、ＶＥＧＦＲ−２
に結合する能力を、カラムから溶出したフラクションを用いて評価し、ＶＥＧＦ
Ｒ−２に結合する能力について、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１６７５５に
記載のＢａ／Ｆ３細胞バイオアッセイを用いてアッセイした。ピーク３における
ＶＥＧＦＲ−２−結合活性は、ピーク２におけるもののおよそ２％であり、この
ことは、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ非−共有結合性ホモ二量体は単量体よりも生理活
性が大きいことを示している。ピーク１におけるＶＥＧＦＲ−２結合活性は、ピ
ーク２におけるもののおよそ１％であり、このことは、おそらくこのピークにお
ける少量のＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ非−共有結合性ホモ二量体を反映している。明
らかに二量体の形態のＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃの方が、単量体の形態のものより、
はるかによくＶＥＧＦＲ−２に結合する。

【００８３】 例６において示されるデータは、ＶＥＧＦ−Ｄがタンパク分解性にプロセシン
グされること、および、タンパク分解性切断の部位が、ＶＥＧＦ−Ｃにおけるも
のと位置において同じではないが、類似していることを実証するものである。タ
ンパク分解性プロセシングはおそらくかなりの生物学的な重要性を有するもので
ある。というのは、異なるＶＥＧＦ−Ｄ誘導体は、ＶＥＧＦ受容体を活性化する
ことに関して異なる能力を有しているからである。完全にプロセシングされたＶ
ＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３との両方に結合してそれらを活性
化する（アーヘン（Achen）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998 95 548-553
) 一方、プロセシングされていない形態のＶＥＧＦ−ＤはＶＥＧＦＲ−３を活性
化するが、ＶＥＧＦＲ−２は活性化しない（ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６の図
１４および図１５）。したがって、段階的なタンパク分解性プロセシングは、イ
ンビボでＶＥＧＦ−Ｄの受容体−結合特異性を調節する方法である可能性がある
。

【００８４】 サイズ排除クロマトグラフィーはまた、アフィニティー−精製されたＶＥＧＦ
−Ｄ△Ｎ△Ｃは主に非−共有結合性の二量体であるが、小部分は単量体であるこ
とを実証するものであった。二量体の形態のみがＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメイ
ンを含むキメラの受容体を強く活性化することができた。この知見は、細胞表面
受容体チロシンキナーゼの活性化が受容体二量体化に関与するとすれば、予想さ
れたものであった。おそらく、二量体のリガンドは１分子あたり２つの受容体結
合部位を提供する一方、単量体の形態は１つしか提供しない。したがって、二量
体のリガンドは受容体の二量体化を引き起こすことができるが、単量体のリガン
ドはそれができないのである。

【００８５】 ２９３−ＥＢＮＡ細胞によって行われ、単量体および二量体を生じさせる、Ｖ
ＥＧＦ−Ｄのプロセシングについてのスキームを図１１に示す。２つの異なる形
態のプロセシングされていないＶＥＧＦ−Ｄが細胞から分泌される：１つは単量
体であり（左側）、もう１つは逆平行の(anti-parallel)ジスルフィド−結合し
た二量体であってＮ−末端およびＣ−末端プロペプチドの間にジスルフィド架橋
を有するものである（右側）。矢印は、細胞内の形態から、ＶＨＤのＮ−末端お
よびＣ−末端における段階的なタンパク分解性プロセシングの産物へと導くもの
であり、最後にはＶＨＤの非−共有結合性の二量体および単量体からなるＶＥＧ
Ｆ−Ｄの成熟した形態が生じる。ここに記載された細胞系からのＶＥＧＦ−Ｄの
誘導体の分析は、ＶＨＤからのＣ−末端プロペプチドの切断の方が、Ｎ−末端プ
ロペプチドの切断よりも効率的におこるということを示唆するものである。簡明
さのため、タンパク分解性プロセシングから生じるすべてのありうる誘導体を示
してはいない。図１１において、Ｎ−プロはＮ−末端プロペプチドを示す；Ｃ−
プロは、Ｃ−末端プロペプチド；ＶＨＤは、ＶＥＧＦホモロジードメイン；灰色
の箱は、ドメイン間の非−共有結合性の相互作用；−Ｓ−は、サブユニット間の
ジスルフィド架橋；Ｎ−は、ポリペプチドのＮ−末端；そして、矢印は、タンパ
ク分解性切断部位のおよその位置を表す。

【００８６】 例９ ＶＥＧＦ−Ｄおよび血管透過性 アフィニティー−精製したヒトＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃを、Ｍｉｌｅｓアッセイ
を用いて血管透過性を誘導する能力についてテストした。Ｍｉｌｅｓアッセイ（
マイルズ，エイ・エイ（Miles, A. A.）およびマイルズ，イー・エム（Miles, E
. M.）, J. Physiol., 1952 118 228-257)は、麻酔したモルモットを用いて行っ
た。透過性因子によって誘導される血管外遊出の定量化のために、サンプル注射
の領域を切除し、そしてホルムアミド中、４２℃で３日間のインキュベーション
によってエバンスブルー色素を抽出した。抽出された色素の量を、６２０ｎｍで
のサンプルの吸光度を判断することによって分光光度的に定量化した。ＶＥＧＦ
−Ｄ△Ｎ△Ｃを用いたのは、ヒトＶＥＧＦ−ＣのＶＨＤ（ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃ
）が血管透過性を誘導することが知られていたためである（ヨウコフ（Joukov）
他, EMBO J., 1997 16 3898-3911)。精製したマウスＶＥＧＦ₁₆₄をポジティブコ
ントロールとして含めた。予想されたように、マウスＶＥＧＦ₁₆₄は血管透過性
を強く誘導した。検出可能な血管透過性を誘導した、マウスＶＥＧＦ₁₆₄の最も
低い濃度は６０ｎｇ／ｍｌであった。同様に、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃも血管
透過性を誘導したが、検出可能な活性を示す最も低い濃度は２５０ｎｇ／ｍｌで
あった。対照的に、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃは、１μｇ／ｍｌという高さのタンパ
ク質濃度においてさえも、活性を示さなかった。これらの結果はヒトＶＥＧＦ−
Ｄ△Ｎ△Ｃは、モルモットにおける血管透過性の誘導物質ではないということを
示すものである。

【００８７】 ＶＥＧＦ−ＤとＶＥＧＦ−Ｃとは、一次構造および受容体−結合特異性におけ
る類似性のために、ＶＥＧＦファミリーのサブファミリーのメンバーであるとみ
なされている（アーヘン（Achen）他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998 95 5
48-553)。これら２つの分子のプロセシングのメカニズムは似ているが、同じで
はない。しかし、これら２つの増殖因子は、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃは血管透過性
を誘導しないという知見によって例証されるように、生物活性において相違を示
す。対照的に、ＶＥＧＦ−Ｃ△Ｎ△Ｃは、ＶＥＧＦほど強力ではないが血管透過
性を誘導する（ヨウコフ（Joukov）他, EMBO J., 1997 16 3898-3911)。

【００８８】 上述の記載および諸例は、単に本発明を例示するために記載されたものであり
、限定されることを意図するものではない。本発明の精神及び本質を組み込んだ
開示された実施態様を改変することが当業者になされうるものであり、本発明は
請求の範囲およびその均等物の枠内に入るすべての改変を含むものであると広く
解釈されるべきである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ２９３−ＥＢＮＡ細胞におけるヒトＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の発現のためのＡｐｅｘ
−３プラスミドコンストラクトの概略のマップを示す図

【図２】 ＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の、２９３−ＥＢＮＡ細胞による発現を示す図

【図３】 可溶性のＶＥＧＦ受容体−免疫グロブリン融合タンパク質による、ＶＥＧＦ−Ｄ
の沈降を示す図

【図４】 市販のマウス肺ｃＤＮＡライブラリーからハイブリダイゼーションスクリーニン
グによって単離された、マウスＶＥＧＦ−Ｄ１をコードするｃＤＮＡのヌクレオ
チド配列（配列番号２）を示す図

【図５】 ＶＥＧＦ−ＤアンチセンスおよびセンスＲＮＡとハイブリダイズさせた、交尾後
１５．５日のマウス組織切片の露出２日後に得たオートラジオグラフを示す図

【図６】 交尾後１５．５日のマウス胚におけるＶＥＧＦ−Ｄ ｍＲＮＡの分布の、in sit
uハイブリダイゼーションによる分析の結果を示す図

【図７】 ＶＥＧＦ−Ｄモノクローナル抗体を用いた免疫組織化学による、ヒトの悪性のメ
ラノーマの分析を示す図

【図８】 ＶＥＧＦ−ＤおよびいくつかのＶＥＧＦ−Ｄ誘導体の、構造上のドメインの概略
表示を提供する図

【図９】 ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇ（Ａ、ＢおよびＣ）およびＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃ（
ＤおよびＥ）を発現する２９３−ＥＢＮＡ細胞によって分泌されるＶＥＧＦ−Ｄ
誘導体の分析を示す図

【図１０】 サイズ排除クロマトグラフィーおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ
△Ｃの分析を示す図

【図１１】 ＶＥＧＦ−Ｄプロセシングの機序の概略表示を提供する図

【手続補正書】

【提出日】平成１３年４月２７日（２００１．４．２７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８８

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００８８】 上述の記載および諸例は、単に本発明を例示するために記載されたものであり
、限定されることを意図するものではない。本発明の精神及び本質を組み込んだ
開示された実施態様を改変することが当業者になされうるものであり、本発明は
請求の範囲およびその均等物の枠内に入るすべての改変を含むものであると広く
解釈されるべきである。 ［配列表］ SEQUENCE LISTING <110> LUDWIG INSTITUTE FOR CANCER RESEARCH <120> EXPRESSION VECTORS AND CELL LINES EXPRESSING VASCULAR ENDOTHELIAL GROWTH FACTOR D, AND METHOD OF TREATING MELANOMAS <130> US98/27373-Ludwig Inst for Cancer Res <140> PCT/US98/27373 <141> 1998-12-23 <150> AU PP 1131 <151> 1997-12-24 <150> US 60/087,392 <151> 1998-05-29 <160> 10 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 109 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Phe Tyr Asp Ile Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu Trp Gln Arg 1 5 10 15 Thr Gln Cys Ser Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu 20 25 30 Gly Lys Ser Thr Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe 35 40 45 Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr 50 55 60 Ser Thr Ser Tyr Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu 65 70 75 80 Thr Ser Val Pro Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly 85 90 95 Cys Lys Cys Leu Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser 100 105 <210> 2 <211> 1325 <212> DNA <213> Murinae gen. sp. <400> 2 ggagaatgcc ttttgcaaca cttttcagta gctgcctgga aacaactgct tagtcatcgg 60 tagacattta aaatattcaa aatgtatgga gaatggggaa tggggaatat cctcatgatg 120 ttccatgtgt acttggtgca gggcttcagg agcgaacatg gaccagtgaa ggatttttct 180 tttgagcgat catcccggtc catgttggaa cgatctgaac aacagatccg agcagcttct 240 agtttggagg agttgctgca aatcgcgcac tctgaggact ggaagctgtg gcgatgccgg 300 ttgaagctca aaagtcttgc cagtatggac tcacgctcag catcccatcg ctccaccaga 360 tttgcggcaa ctttctatga cactgaaaca ctaaaagtta tagatgaaga atggcagagg 420 acccaatgca gccctagaga gacatgcgta gaagtcgcca gtgagctggg gaagacaacc 480 aacacattct tcaagccccc ctgtgtaaat gtcttccggt gtggaggctg ctgcaacgaa 540 gagggtgtga tgtgtatgaa cacaagcacc tcctacatct ccaaacagct ctttgagata 600 tcagtgcctc tgacatcagt gcccgagtta gtgcctgtta aaattgccaa ccatacgggt 660 tgtaagtgct tgcccacggg cccccgccat ccttactcaa ttatcagaag atccattcag 720 accccagaag aagatgaatg tcctcattcc aagaaactct gtcctattga catgctgtgg 780 gataacacca aatgtaaatg tgttttgcaa gacgagactc cactgcctgg gacagaagac 840 cactcttacc tccaggaacc cactctctgt ggaccgcaca tgacgtttga tgaagatcgc 900 tgtgagtgcg tctgtaaagc accatgtccg ggagatctca ttcagcaccc ggaaaactgc 960 agttgctttg agtgcaaaga aagtctggag agctgctgcc aaaagcacaa gatttttcac 1020 ccagacacct gcagctgtga ggacagatgt ccttttcaca ccagaacatg tgcaagtaga 1080 aagccagcct gtggaaagca ctggcgcttt ccaaaggaga caagggccca gggactctac 1140 agccaggaga acccttgatt caacttcctt tcaagtcccc ccatctctgt cattttaaac 1200 agctcactgc tttgtcaagt tgctgtcact gttgcccact accccttgaa catgtgcaaa 1260 cacagacaca cacacacaca cacacacaga gcaactagga ttatgttttc taggtgctgc 1320 ctaag 1325 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Lys Cys Leu Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser Ile Ile Arg Arg 1 5 10 15 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ser Ile Gln Ile Pro Glu Glu Asp 1 5 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Arg Ser Ile Gln Ile Pro Glu Glu Asp 1 5 <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Phe Ala Ala Thr Phe Tyr 1 5 <210> 7 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Lys Val Ile Asp Glu Glu 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Arg Phe Ala Ala Thr Phe Tyr 1 5 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu 1 5 <210> 10 <211> 354 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Tyr Arg Glu Trp Val Val Val Asn Val Phe Met Met Leu Tyr Val 1 5 10 15 Gln Leu Val Gln Gly Ser Ser Asn Glu His Gly Pro Val Lys Arg Ser 20 25 30 Ser Gln Ser Thr Leu Glu Arg Ser Glu Gln Gln Ile Arg Ala Ala Ser 35 40 45 Ser Leu Glu Glu Leu Leu Arg Ile Thr His Ser Glu Asp Trp Lys Leu 50 55 60 Trp Arg Cys Arg Leu Arg Leu Lys Ser Phe Thr Ser Met Asp Ser Arg 65 70 75 80 Ser Ala Ser His Arg Ser Thr Arg Phe Ala Ala Thr Phe Tyr Asp Ile 85 90 95 Glu Thr Leu Lys Val Ile Asp Glu Glu Trp Gln Arg Thr Gln Cys Ser 100 105 110 Pro Arg Glu Thr Cys Val Glu Val Ala Ser Glu Leu Gly Lys Ser Thr 115 120 125 Asn Thr Phe Phe Lys Pro Pro Cys Val Asn Val Phe Arg Cys Gly Gly 130 135 140 Cys Cys Asn Glu Glu Ser Leu Ile Cys Met Asn Thr Ser Thr Ser Tyr 145 150 155 160 Ile Ser Lys Gln Leu Phe Glu Ile Ser Val Pro Leu Thr Ser Val Pro 165 170 175 Glu Leu Val Pro Val Lys Val Ala Asn His Thr Gly Cys Lys Cys Leu 180 185 190 Pro Thr Ala Pro Arg His Pro Tyr Ser Ile Ile Arg Arg Ser Ile Gln 195 200 205 Ile Pro Glu Glu Asp Arg Cys Ser His Ser Lys Lys Leu Cys Pro Ile 210 215 220 Asp Met Leu Trp Asp Ser Asn Lys Cys Lys Cys Val Leu Gln Glu Glu 225 230 235 240 Asn Pro Leu Ala Gly Thr Glu Asp His Ser His Leu Gln Glu Pro Ala 245 250 255 Leu Cys Gly Pro His Met Met Phe Asp Glu Asp Arg Cys Glu Cys Val 260 265 270 Cys Lys Thr Pro Cys Pro Lys Asp Leu Ile Gln His Pro Lys Asn Cys 275 280 285 Ser Cys Phe Glu Cys Lys Glu Ser Leu Glu Thr Cys Cys Gln Lys His 290 295 300 Lys Leu Phe His Pro Asp Thr Cys Ser Cys Glu Asp Arg Cys Pro Phe 305 310 315 320 His Thr Arg Pro Cys Ala Ser Gly Lys Thr Ala Cys Ala Lys His Cys 325 330 335 Arg Phe Pro Lys Glu Lys Arg Ala Ala Gln Gly Pro His Ser Arg Lys 340 345 350 Asn Pro

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/06 Ａ６１Ｐ 43/00 １１１ 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ 43/00 １１１ Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＪＰ，ＫＲ，ＮＺ (72)発明者 スタッカー，スティーヴン，アラン オーストラリア ヴィクトリア 3050 ピ ー・オー・ボックス 2008 ルードヴィッ ヒ・インスティテュート・フォア・キャン サー・リサーチ メルボルン・チューマ ー・バイオロジー・ブランチ ロイヤル・ メルボルン・ホスピタル (72)発明者 アリタロ，カリ フィンランド エスエフ‐00014 ユニバ −シティ・オブ・ヘルシンキ ピー・オ ー・ボックス 26 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA04 CA09 DA03 EA04 FA02 FA15 GA11 HA01 4B065 AA93X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 BA01 BA08 BA13 BA21 BA23 CA18 DB57 NA14 ZA331 ZA892 ZB262

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＶＥＧＦ−Ｄ、または、ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有す
   るそのフラグメントまたはアナログを、安定に発現するヒト細胞系。
2. 【請求項２】 前記細胞系によって産生されるＶＥＧＦ−Ｄが、エピトープ
   タグに連結している、請求項１の細胞系。
3. 【請求項３】 前記エピトープタグが、ＦＬＡＧ（登録商標）、ヘキサヒス
   チジン(hexahistidine)、またはＩ−ＳＰＹ（商標）である、請求項２の細胞系
   。
4. 【請求項４】 ２９３−ＥＢＮＡ胎児性腎臓細胞系である、請求項１、請求
   項２または請求項３のヒト細胞系。
5. 【請求項５】 発現されるＶＥＧＦ−Ｄが、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａ
   ｇ、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＣＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ、またはＶＥＧＦ
   −Ｄ△Ｃである、請求項１、請求項２、請求項３または請求項４の細胞系。
6. 【請求項６】 ＶＥＧＦ−Ｄのフラグメントが、配列番号１のアミノ酸配列
   からなるＶＥＧＦ−Ｄの部分である、請求項１の細胞系。
7. 【請求項７】 ＶＥＧＦ−Ｄのフラグメントが、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプ
   チドに連結した、配列番号１のアミノ酸配列からなるＶＥＧＦ−Ｄの部分である
   、請求項１の細胞系。
8. 【請求項８】 哺乳類の発現ベクターに挿入された、配列番号１のアミノ酸
   配列からなるポリペプチドまたはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラ
   グメントまたはアナログをコードするヒトＤＮＡ配列を含む、発現ベクター。
9. 【請求項９】 前記発現ベクターがＡｐｅｘ−３である、請求項８の発現ベ
   クター。
10. 【請求項１０】 前記発現ベクターがｐＶＤＡｐｅｘ△Ｎ△Ｃである、請求
    項８または請求項９の発現ベクター。
11. 【請求項１１】 さらにアフィニティータグをコードする配列を含む、請求
    項８または請求項９の発現ベクター。
12. 【請求項１２】 前記アフィニティータグが、ＦＬＡＧ（登録商標）、ヘキ
    サヒスチジン(hexahistidine)、またはＩ−ＳＰＹ（商標）である、請求項１１
    の発現ベクター。
13. 【請求項１３】 請求項８または請求項９または請求項１０または請求項１
    １または請求項１２のベクターでトランスフォーム(transform)またはトランス
    フェクト(transfect)された宿主細胞。
14. 【請求項１４】 配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはＶ
    ＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを作る方法
    であって、宿主細胞中で請求項８または請求項９の発現ベクターを発現させる工
    程、および、宿主細胞から、または、宿主細胞の増殖培地からポリペプチドを単
    離する工程、を有する配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはＶ
    ＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを作る方法
    。
15. 【請求項１５】 前記発現ベクターがさらにアフィニティータグをコードす
    る配列を含むものである、請求項１４の方法。
16. 【請求項１６】 前記アフィニティータグが、ＦＬＡＧ（登録商標）、ヘキ
    サヒスチジン、またはＩ−ＳＰＹ（商標）である、請求項１５の方法。
17. 【請求項１７】 悪性のメラノーマの治療または軽減方法であって、メラノ
    ーマの付近においてＶＥＧＦ−Ｄの発現または活性を阻害するために有効な阻害
    量(inhibitory amount)のＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストを投与する工程を含む、
    悪性のメラノーマの治療または軽減方法。
18. 【請求項１８】 前記ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストが、アンチセンス核酸ま
    たはＶＥＧＦ−Ｄをコードする三本鎖ＤＮＡである、請求項１７の方法。
19. 【請求項１９】 前記ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストが、ＶＥＧＦ−Ｄ変異体
    ポリペプチドである、請求項１７の方法。
20. 【請求項２０】 前記ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストが、ＶＥＧＦ−Ｄに特異
    的に反応する、抗体またはそのＦ（ａｂ’）₂、Ｆ（ａｂ’）若しくはＦ（ａｂ
    ）フラグメントを含む組成物である、請求項１７の方法。
21. 【請求項２１】 前記抗体が、モノクローナル抗体、Ｆ（ａｂ’）₂、Ｆ（
    ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）フラグメントまたはそのキメラ(chimeric)モノクローナル
    抗体である、請求項２０の方法。
22. 【請求項２２】 ＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍の治療または軽減方法であっ
    て、前記腫瘍の付近において有効な阻害量(inhibitory amount)のＶＥＧＦ−Ｄ
    アンタゴニストを投与する工程を含む、ＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍の治療また
    は軽減方法。
23. 【請求項２３】 ＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍の治療または軽減方法であっ
    て、腫瘍阻害活性を有する毒素または薬剤に結合した(conjugated)有効な阻害量
    (inhibitory amount)の、ＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｄ受容体結合活性(bind
    ing activity)に結合する能力のあるそのフラグメントまたはアナログを投与す
    る工程を含む、ＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍の治療または軽減方法。
24. 【請求項２４】 皮膚移植の受け入れ(acceptance)および／または治癒を増
    強する方法であって、血管新生およびリンパ脈管形成(lymphangiogenesis)を刺
    激するのに有効な量の、ＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有す
    るそのフラグメントまたはアナログを投与する工程を含む、皮膚移植の受け入れ
    および／または治癒を増強する方法。
25. 【請求項２５】 皮膚に対する外科または外傷の創傷の治癒を刺激する方法
    であって、血管新生およびリンパ脈管形成(lymphangiogenesis)を刺激するのに
    有効な量の、ＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラ
    グメントまたはアナログを投与する工程を含む、皮膚に対する外科または外傷の
    創傷の治癒を刺激する方法。
26. 【請求項２６】 ＶＥＧＦ−Ｄの受容体−結合特異性を調節する方法であっ
    て、プロセシングされていないＶＥＧＦ−Ｄをコードするヌクレオチド配列を含
    む発現ベクターを発現させる工程、および、発現されたプロセシングされていな
    いＶＥＧＦ−Ｄをプロセシングして、タンパク分解性にプロセシングされた形態
    のＶＥＧＦ−Ｄを産生するために、少なくとも１つのタンパク分解量(proteolyt
    ic amount)の酵素を供給する工程、を有する、ＶＥＧＦ−Ｄの受容体−結合特異
    性を調節する方法。
27. 【請求項２７】 ＶＥＧＦ−Ｄのタンパク分解フラグメントを作成する方法
    であって、プロセシングされていないＶＥＧＦ−Ｄをコードするヌクレオチド配
    列を含む発現ベクターを発現させる工程、および、発現されたプロセシングされ
    ていないＶＥＧＦ−Ｄをプロセシングして、タンパク分解性にプロセシングされ
    たＶＥＧＦ−Ｄのフラグメントを産生するために、少なくとも１つのタンパク分
    解量(proteolytic amount)の酵素を供給する工程、を有する、ＶＥＧＦ−Ｄのタ
    ンパク分解フラグメントを作成する方法。
28. 【請求項２８】 生物学的サンプルにおいてＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍を
    検出する方法であって、前記サンプルをＶＥＧＦ−Ｄに対する特異的結合性試薬
    に接触させる工程、前記特異的結合性試薬のＶＥＧＦ−Ｄに対する結合のために
    時間を与える工程、および前記結合を検出する工程、を有する、生物学的サンプ
    ルにおいてＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍を検出する方法。
29. 【請求項２９】 前記特異的結合性試薬が第一(first)抗体である、請求項
    ２８の生物学的サンプルにおいてＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍を検出する方法。
30. 【請求項３０】 前記結合を検出可能な標識を備えた第二抗体によって検出
    する、請求項２９の生物学的サンプルにおいてＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍を検
    出する方法。
31. 【請求項３１】 リンパ浮腫の治療または軽減方法であって、リンパ脈管形
    成を刺激するのに有効な量の、ＶＥＧＦ−Ｄ、または、ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的
    活性を有するそのフラグメントまたはアナログを投与する工程を含む、リンパ浮
    腫の治療または軽減方法。
32. 【請求項３２】 乾癬の治療または軽減方法であって、有効な阻害量のＶＥ
    ＧＦ−Ｄアンタゴニストを投与する工程を含む、乾癬の治療または軽減方法。
33. 【請求項３３】 強皮症の治療または軽減方法であって、内皮の増殖を刺激
    するのに有効な量の、ＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有する
    そのフラグメントまたはアナログを投与する工程を含む、強皮症の治療または軽
    減方法。
34. 【請求項３４】 無汗性外胚葉性異形成の治療または軽減方法であって、血
    管新生を刺激するのに有効な量の、ＶＥＧＦ−ＤまたはＶＥＧＦ−Ｄの生物学的
    活性を有するそのフラグメントまたはアナログを投与する工程を含む、無汗性外
    胚葉性異形成の治療または軽減方法。
35. 【請求項３５】 血管透過性を誘導せずに、内皮細胞の増殖、遊走、生存お
    よび分化、および、リンパ脈管形成から選択される、ＶＥＧＦ−Ｄの少なくとも
    １つの生物活性を刺激する方法であって、生物活性を刺激する量の完全にプロセ
    シングされたＶＥＧＦ−Ｄを投与する工程を含む、ＶＥＧＦ−Ｄの少なくとも１
    つの生物活性を刺激する方法。
36. 【請求項３６】 配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチド、または
    、ＶＥＧＦ−Ｄの生物学的活性を有するそのフラグメントまたはアナログを、安
    定に発現する哺乳類の細胞系。
37. 【請求項３７】 前記細胞系によって産生されるポリペプチドがエピトープ
    タグに連結している、請求項３６の哺乳類の細胞系。
38. 【請求項３８】 前記エピトープタグが、ＦＬＡＧ（登録商標）、ヘキサヒ
    スチジン、またはＩ−ＳＰＹ（商標）である、請求項３７の哺乳類の細胞系。
39. 【請求項３９】 前記エピトープタグが、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドで
    ある、請求項３７または請求項３８の哺乳類の細胞系。
40. 【請求項４０】 発現するポリペプチドが、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃである、
    請求項３６、請求項３７、請求項３８または請求項３９の哺乳類の細胞系。
41. 【請求項４１】 ２９３−ＥＢＮＡヒト胎児性腎臓細胞系である、請求項３
    ６、請求項３７、請求項３８、請求項３９または請求項４０の哺乳類の細胞系。
42. 【請求項４２】 ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌＮＦｌａｇ、ＶＥＧＦ−ＤＦｕｌｌ Ｃ Ｆｌａｇ、ＶＥＧＦ−Ｄ△Ｎ△Ｃ、またはＶＥＧＦ−Ｄ△Ｃを安定に発現する
    哺乳類の細胞系。
43. 【請求項４３】 ２９３−ＥＢＮＡヒト胎児性腎臓細胞系である、請求項４
    ２の哺乳類の細胞系。
44. 【請求項４４】 ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストが、ＶＥＧＦ−Ｄに特異的に
    反応するキメラ(chimeric)抗体である、請求項１７の方法。