ES2234818T3 - Procedimiento para tratar canceres que expresan el factor de crecimiento endotelial d. - Google Patents

Abstract

El uso de un antagonista de VEGF-D que impide la unión de VEGF-D a su correspondiente receptor para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una enfermedad neoplásica caracterizado porque dicha enfermedad neoplásica se selecciona del grupo formado por carcinoma ductal de mama, carcinoma epidermoide, cáncer de próstata y cáncer de endometrio.

Description

Procedimientos para tratar cánceres que expresan el factor de crecimiento endotelial D.

Antecedentes de la invención

La invención se refiere en general a medicamentos para tratar y aliviar diversos cánceres.

Los dos componentes principales del sistema vascular de los mamíferos son las células endoteliales y las células musculares lisas. Las células endoteliales forman el recubrimiento de la superficie interna de todos los vasos sanguíneos y linfáticos del mamífero. La formación de nuevos vasos sanguíneos se puede producir mediante dos procesos diferentes, vasculogenia y angiogenia (véase la revisión de Risau, W., Nature 386: 671-674, 1997). La vasculogenia se caracteriza por la diferenciación in situ de precursores de células endoteliales a células endoteliales maduras y por la asociación de estas células para formar vasos, como ocurre en la formación del plexo vascular primario en las primeras fases del desarrollo embrionario. Por el contrario, la angiogenia, la formación de vasos sanguíneos mediante crecimiento y ramificación de vasos preexistentes, es importante en las fases posteriores de la embriogenia y es responsable del crecimiento de los vasos sanguíneos que se produce en el adulto. La angiogenia es un proceso fisiológicamente complejo que supone la proliferación de las células endoteliales, la degradación de la matriz extracelular, la ramificación de los vasos y los posteriores episodios de adhesión celular. En el adulto la angiogenia está muy controlada, y en condiciones normales está limitada al sistema reproductor femenino. Sin embargo, se puede activar la angiogenia en respuesta a la lesión tisular. De manera importante, los tumores sólidos son capaces de inducir angiogenia en el tejido circundante, promoviendo de esta manera el crecimiento tumoral y facilitando la formación de metástasis (Folkman J, Nature Med., 1:27-31, 1995). Se está muy lejos de comprender los mecanismos moleculares subyacentes a los complejos procesos de angiogenia.

La angiogenia también participa en diversas situaciones patológicas, en las que es importante o participa directamente en diferentes secuelas de la enfermedad. Algunos ejemplos incluyen la neovascularización que se asocia a varias enfermedades hepáticas, las secuelas neovasculares de la diabetes, las secuelas neovasculares de la hipertensión, la neovascularización después de un traumatismo, la neovascularización debida a un traumatismo craneal, la neovascularización en las infecciones hepáticas crónicas (por ejemplo, hepatitis crónica), la neovascularización debida a un traumatismo por calor o por frío, la disfunción relacionada con el exceso de hormonas, la producción de hemangiomas y la reestenosis después de la angioplastia.

Debido a la función crucial de la angiogenia en tantos procesos fisiológicos y patológicos, se han investigado de manera intensiva los factores que participan en el control de la angiogenia. Se ha mostrado que diversos factores de crecimiento participan en la regulación de la angiogenia; incluyen los factores de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDFG) el factor de transformación del crecimiento alfa (TGF\alpha) y el factor de crecimiento de hepatocitos (HGF) véase, por ejemplo, una revisión en Folkman y col., J. Biol. Chem., 267: 10.931-10.934, 1972.

Se ha propuesto que una familia particular de factores de crecimiento específicos de células endoteliales, los factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y sus correspondientes receptores, es el principal responsable de la estimulación del crecimiento y de la diferenciación de las células endoteliales, y de algunas funciones de las células diferenciadas. Estos factores son miembros de la familia PDFG/VEGF, y parecen actuar principalmente a través de las tirosina cinasas del receptor endotelial (RTK). La familia PDFG/VEGF de factores de crecimiento pertenece a la superfamilia de factores de crecimiento unida a la cistina, que también incluye las neurotrofinas y el factor-\beta de crecimiento en transformación.

Se han identificado ocho proteínas diferentes en la familia PDFG/VEGF, que son dos PDFG (A y B), VEGF y cinco miembros que están muy relacionados con VEGF. Los cinco miembros que están muy relacionados con VEGF son: VEGF-B, descrito en la Solicitud de Patente Internacional PCT/US96/02957 (WO96/26736) y en las Patentes de EE.UU. 5.840.693 y 5.607.918 del Ludwig Institute for Cancer Research y la Universidad de Helsinki; VEGF-C o VEGF 2, descrito en Joukov y col., EMBO J, 15:290-298, 1996; Lee y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:1988-1992, 1996, y en las Patentes de EE.UU. 5.932.500 y 5.935.540 de Human Genome Sciences, Inc.; VEGF-D, descrito en la Solicitud de Patente Internacional nº PCT/US97/14696 (WO98/07832) y en Achen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:548-553, 1998; el factor de crecimiento placentario (PIGF), descrito en Maglione y col., Proc Natl Acad Sci USA, 88:9267-9271, 1991; y VEGF3, descrito en la Solicitud de Patente Internacional número PCT/US95/07283 (WO96/39.421) por Human Genome Sciences, Inc. Cada miembro de la familia VEGF tiene una identidad de la secuencia de aminoácidos entre 30% y 45% con VEGF. Los miembros de la familia VEGF muestran una homología del dominio VEGF que contiene los seis residuos de cisteína del motivo de nudo de cisteína. Las características funcionales de la familia VEGF incluyen grados variables de mitogenia para las células endoteliales, inducción de la permeabilidad vascular, y propiedades angiógenas y linfangiógenas.

El factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) es una glucoproteína homodimérica que se ha aislado a partir de diferentes fuentes. El ayuste alternativo del ARNm de un solo gen de VEGF da lugar a 5 isoformas de VEGF. VEGF muestra una actividad mitógena muy específica para las células endoteliales. VEGF tiene funciones reguladoras importantes en la formación de nuevos vasos sanguíneos en la vasculogenia embrionaria y en la angiogenia durante la vida adulta (Carmeliet y col. Nature, 380:435-439, 1996; Ferrara y col., Nature, 380:439-442, 1996; revisado en Ferrara y Davis-Smyth, Endocrine Rev., 18:4-25, 1997). Se ha mostrado el significado de la función de VEGF en estudios que muestran que la inactivación de un solo alelo de VEGF produce la muerte del embrión debido a una alteración del desarrollo de la vasculatura (Carmeliet y col. Nature, 380:435-439, 1996; Ferrara y col., Nature, 380:439-442, 1996). Se ha revisado el aislamiento de las propiedades de VEGF; véase Ferrara y col., J. Cellular Biochem., 47:211-218, 1991 y Connolly, J. Cellular Biochem., 47:219-223, 1991.

Además, VEGF tiene una actividad quimiotáctica intensa para los monocitos, puede inducir el activador del plasminógeno y el inhibidor del activador del plasminógeno en las células endoteliales, y también puede inducir la permeabilidad microvascular. Debido a esta última actividad, a veces se denomina factor de permeabilidad vascular (VPG). VEGF también es quimiotáctico para algunas células hematopoyéticas. La literatura reciente indica que VEGF bloquea la maduración de las células dendríticas y de esta manera reduce la eficacia de la respuesta inmunitaria a los tumores (muchos tumores secretan VEGF) (Gabrilovich y col., Blood, 92:4150-4166, 1998; Gabrilovich y col., Clinical Cancer Research, 5:2963-2970, 1999).

VEGF-B tiene unas propiedades angiógenas y de otro tipo similares a las de VEGF, aunque se distribuye y se expresa en los tejidos de manera diferente a VEGF. En particular, VEGF-B se expresa de manera muy intensa en el corazón, y sólo débilmente en el pulmón, mientras que ocurre lo contrario para VEGF. Esto indica que VEGF, VEGF y VEGF-B, a pesar del hecho de que se coexpresan en muchos tejidos, pueden tener diferencias funcionales.

VEGF-B se aisló usando una técnica de cribado en trampa mediante interacción con cohíbridos en levaduras haciendo el cribado de proteínas celulares que podrían interactuar con la proteína celular fijadora de ácido retinoico de tipo I (CRABP-I). Su aislamiento y sus características se describen en detalle en el documento PCT/US96/02957 (WO96/26736), en las Patentes de EE.UU. 5.840.693 y 5.607.918 Ludwig Institute for Cancer Research y la Universidad de Helsinki, y en Olofsson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2576-2581, 1996.

VEGF-C se aisló de medios acondicionados de la línea celular del adenocarcinoma de próstata PC-3 (CRL1435) mediante cribado de la capacidad del medio de producir fosforilación del receptor de tirosina cinasa específico de la célula endotelial VEGFR-3 (Flt4), usando células transfectadas para expresar VEGFR-3. Se purificó VEGF-C usando cromatografía de afinidad con VEGFR recombinante, y se clonó a partir de una biblioteca de ADNc de PC-3. Su aislamiento y características se describen en detalle en Joukov y col. EMBO J, 15:290-298, 1996.

VEGF-D se aisló de una biblioteca de ADNc de mama humana, comercialmente disponible de Clontech, mediante cribado con una cola de secuencia expresada obtenida de una biblioteca de ADNc humano denominada "Soares Breast 3NbHBst" como sonda de hibridación (Achen y col., Proc Natl Acad Sci USA, 95:548-553, 1998). Su aislamiento y características se describen con detalle en la Solicitud de Patente Internacional nº PCT/US97/14.696 (WO98/07832).

En el documento PCT/US97/14.696 también se describe el aislamiento de un fragmento biológicamente activo de VEGF-D, denominado VEGF-D\DeltaN\DeltaC. El fragmento está formado por los residuos de aminoácidos 93 a 201 de VEGF-D unidos al péptido de la cola de afinidad FLAG®. Toda la descripción de la Solicitud de Patente Internacional PCT/US97/14.696 (WO98/07832) se incorpora a la presente solicitud como referencia.

El gen de VEGF-D se expresa de manera extensa en el ser humano adulto, pero evidentemente no se expresa de manera ubicua. VEGF-D se expresa de manera intensa en corazón, pulmón y músculo esquelético. Se expresan niveles intermedios de VEGF-D en bazo, ovarios, intestino delgado y colon, y hay una menor expresión en riñón, páncreas, timo, próstata y testículos. No se detectó ARNm de VEGF-D en el ARN procedente de cerebro, placenta, hígado o leucocitos de sangre periférica.

PIGF se aisló de una biblioteca de ADNc de placenta a término. Su aislamiento y características se describen en detalle en Maglione y col., Proc Natl Acad Sci USA, 88:9267-9271, 1991. En la actualidad no se comprenden bien sus funciones biológicas.

VEGF3 se aisló de una biblioteca de ADNc procedente de tejido de colon. Se ha afirmado que VEGF3 tiene una identidad de aproximadamente 36% y una similitud de aproximadamente 66% con VEGF. No está claro el procedimiento de aislamiento del gen que codifica VEGF3, y no se ha descrito ninguna caracterización de su actividad biológica.

La similitud entre dos proteínas se determina comparando la secuencia de aminoácidos y las sustituciones conservadas de aminoácidos de una de las proteínas respecto a la secuencia de la segunda proteína, mientras que la identidad se determina sin incluir las sustituciones de aminoácidos conservados.

Una función importante del sistema linfático es proporcionar el retorno de los líquidos desde los tejidos y transportar muchas sustancias extravasculares de nuevo hacia la sangre. Además, durante el proceso de maduración los linfocitos abandonan la sangre, migran a través de los órganos linfáticos y de otros tejidos, y entran en los vasos linfáticos, y vuelven a la sangre a través del conducto torácico. Unas vénulas especializadas, las vénulas endoteliales altas (VEA), se unen de nuevo a los linfocitos y producen su extravasación hacia los tejidos. De esta manera los vasos linfáticos, y especialmente los ganglios linfáticos, tienen una función importante en la inmunología y en el desarrollo de las metástasis de diferentes tumores. Al contrario que los vasos sanguíneos, no está tan claro el origen embrionario del sistema linfático y hay al menos tres teorías diferentes sobre su origen. Es difícil identificar los vasos linfáticos debido a la ausencia de marcadores específicos conocidos disponibles de los mismos.

Los vasos linfáticos se estudian habitualmente con linfografía. En la linfografía se inyecta un medio de contraste radiológico directamente en un vaso linfático. El medio de contraste se distribuye a lo largo de los vasos de drenaje eferente del sistema linfático y se recoge en los ganglios linfáticos. El medio de contraste puede permanecer hasta medio año en los ganglios linfáticos, y durante este período el análisis radiológico permite el seguimiento del tamaño y de la arquitectura de los ganglios linfáticos. Este diagnóstico es especialmente importante en los pacientes que tienen metástasis en los ganglios linfáticos y en las neoplasias linfáticas, como linfoma. Sin embargo, son necesarias en la materia mejoras de los materiales y de los procedimientos para visualizar los tejidos linfáticos.

Como se ha observado más arriba, los miembros de la familia PDFG/VEGF actúan principalmente uniéndose a las tirosina cinasas del receptor. En general las tirosina cinasas del receptor son glucoproteínas que están formadas por un dominio extracelular capaz de unirse a un factor de crecimiento específico, un dominio transmembrana que habitualmente es la porción alfa-helicoidal que la proteína, un dominio yuxtamembrana, que es el punto en el que se puede regular el receptor mediante, por ejemplo, fosforilación de las proteínas, un dominio tirosina cinasa, que ese componente enzimático del receptor y una cola carboxiterminal, que en muchos receptores participa en el reconocimiento y en la unión de los sustratos de la tirosina cinasa.

Se han identificado cinco tirosina cinasas del receptor específicas de células endoteliales, a saber, VEGF-1(Flt-1), VEGF-2(KDR/Flk-1), VEGF-3 (Flt-4),Tie y Tie/Tek-2. Estos receptores difieren en su especificidad y afinidad. Todos ellos tienen la actividad tirosina cinasa intrínseca que es necesaria para la transducción de señales.

Las únicas tirosina cinasas del receptor que se sabe que se unen a los VEGF son VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3. VEGFR-1 y VEGFR-2 se unen a VEGF con una elevada afinidad, y VEGFR-1 también se une a VEGF-B y a PIGF. También se ha mostrado que VEGF-C es un ligando de VEGFR-3, y también activa a VEGFR-2. (Joukov y col., EMBO J, 15:290-298, 1996). VEGF-D se une tanto a VEGFR-2 como VEGFR-3 (Achen y col., Proc Natl Acad Sci USA, 95:548-553, 1998). Se ha descrito un ligando de Tie/Tek-2 en la Solicitud de Patente Internacional nº PCT/US95/12.935 (WO96/11.269) de Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Todavía no ser identificado el ligando de Tie.

Recientemente se ha purificado y clonado un nuevo receptor específico de la isoforma de VEGF de 130-135 kD (Soker y col., Cell, 92:735-745, 1998). Se encontró que el receptor de VEGF se une específicamente a la isoforma VEGF_{165} mediante la secuencia codificada por el exón 7, que muestra una débil afinidad por heparina (Soker y col., Cell, 92:735-745, 1998). Sorprendentemente se mostró que el receptor era idéntico a la neuropilina humana 1 (NP-1), un receptor que participa en la neuromorfogenia de las primeras etapas. PIGF-2 también parece interactuar con NP-1 (Migdal y col. J. Biol. Chem., 273: 22.272-22.278, 1998).

VEGFR-1, VEGFR-2 y VEGFR-3 se expresan de manera diferente en las células endoteliales. En general en el endotelio de los vasos sanguíneos se expresa tanto VEGFR-1 como VEGFR-2 (Oelrichs y col., Oncogene, 8: 11-18, 1992; Kaipainen y col., J. Exp. Med, 178:2077-2088, 1993; Dumont y col., Dev. Dyn., 203:80-92, 1995; Fong y col., Dev. Dyn., 207:1-10, 1996), y VEGFR-3 se expresa principalmente en el endotelio linfático de los tejidos adultos (Kaipainen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9, 3566-3570, 1995). VEGFR-3 también se expresa en la vasculatura sanguínea que rodea los tumores.

Aunque VEGFR-1 se expresa principalmente en las células endoteliales durante el desarrollo, también se puede encontrar en las células precursoras hematopoyéticas durante las etapas tempranas de la embriogenia (Fong y col., Nature, 376:66-70, 1995). En los adultos los monocitos y los macrófagos también expresan este receptor (Barleon y col., Blood, 87:3336-3343, 1995). En los embriones la mayor parte de los vasos, por no decir todos, expresan VEGFR-1 (Braier y col., Dev. Dyn., 204:228-239, 1995; Fong y col., Dev. Dyn., 207:1-10, 1996).

El receptor VEGFR-3 se expresa de manera extensa en las células endoteliales durante las fases tempranas del desarrollo embrionario, pero a medida que progresa la embriogenia queda restringido al endotelio venoso y posteriormente al endotelio linfático (Kaipainen y col., Cancer Res., 54:6571-6577, 1994; Kaipainen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9, 3566-3570, 1995). VEGFR-3 se expresa en las células endoteliales linfáticas de los tejidos adultos. Este receptor es esencial para el desarrollo vascular durante la embriogenia.

Se ha demostrado la función esencial y específica en la vasculogenia, angiogenia y/o linfangiogenia de VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, Tie y Tie/Tek mediante mutaciones dirigidas que inactivan estos receptores en embriones de ratón. La alteración de los genes de VEGFR produce el desarrollo aberrante de la vasculatura, lo que da lugar a la muerte del embrión hacia la mitad de la gestación. El análisis de los embriones que son portadores de un gen VEGFR-1 completamente inactivado indica que este receptor es necesario para la organización funcional del endotelio (Fong y col., Nature, 376:66-70, 1995). Sin embargo, la deleción del dominio tirosina cinasa intercelular de VEGFR-1 genera ratones viables con una vasculatura normal (Hiratsuka y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:9349-9354, 1998). Aún se deben explicar las razones subyacentes a estas diferencias, aunque indican que no es necesaria la señalización del receptor a través de la tirosina cinasa para la función adecuada de VEGFR-1. El análisis de ratones homocigotos con alelos inactivados de VEGFR-2 indica que este receptor es necesario para la proliferación de las células endoteliales, hematopoyesis y vasculogenia (Shalaby y col., Nature, 376:62-66, 1995; Shalaby y col., Cell, 89:981-990, 1997). La inactivación dirigida de las dos copias del gen VEGFR-3 en ratones da lugar a la formación de vasos sanguíneos defectuosos que se caracterizan por unos vasos organizados grandes con organización anómala y con una luz defectuosa, lo que da lugar a acumulación de líquido en la cavidad pericárdica y a insuficiencia cardiovascular el día 9,5 después del coito (Dumont y col., Science, 282:946-949, 1998). De acuerdo con estos hallazgos se ha propuesto que es necesario VEGFR-3 para la maduración de las redes vasculares primarias para que se conviertan en vasos sanguíneos de mayor tamaño. Sin embargo, no se pudo estudiar en estos ratones la función de VEGFR-3 en el desarrollo de la vasculatura linfática porque los embriones murieron antes de que apareciera el sistema linfático. Sin embargo, se asume que VEGFR-3 participa en el desarrollo de la vasculatura linfática y de la linfangiogenia dada su expresión específica en las células endoteliales linfáticas durante la embriogenia y la vida adulta. Esto está apoyado por el hallazgo de que la expresión ectópica de VEGF-C, un ligando de VEGFR-3, en la piel de ratones transgénicos de lugar a la proliferación de las células endoteliales linfáticas y al aumento del tamaño vascular en ratones. Además esto indica que VEGF-C puede tener una función primaria en el endotelio linfático y una función secundaria en la angiogenia y en la regulación de la permeabilidad, que comparte con VEGF (Joukov y col., EMBO J, 15:290-298, 1996).

Además, se han identificado proteínas similares a VEGF que son codificadas por cuatro cepas diferentes del virus orf. Ésta es la primera vez que se ha descrito que un virus codifica una proteína parecida a VEGF. Las dos primeras cepas son NZ2 y NZ7 y se describen en Lyttle, J. Virol., 68:84-92, 1994. Una tercera es D1701 y está descrita en Meyer y col., EMBO J., 18:363-374, 1999. La cuarta cepa es NZ10, y se describe en la Solicitud de Patente Internacional PCT/US99/25.869. Se mostró que estas proteínas víricas parecidas a VEGF se unen al VEGFR-2 del endotelio del huésped (oveja/cabra/ser humano), y que esta unión es importante para el desarrollo de la infección (Meyer y col., EMBO J., 18:363-374, 1999; Ogawa y col., J. Biol. Chem., 273: 31.273-31.282, 1988; y Solicitud de Patente Internacional PCT/US99/25.869). Estas proteínas muestran similitud de la secuencia de aminoácidos con VEGF y entre sí.

El virus ORF es un tipo de especie de del género parapoxvirus que produce una dermatitis pustulosa muy contagiosa en ovejas y en cabras y que se transmite fácilmente a los seres humanos. La dermatitis pustulosa inducida por la infección por el virus orf se caracteriza por dilatación de los vasos sanguíneos, tumefacción del área local y una marcada proliferación de las células endoteliales que tapizan los vasos sanguíneos. Estas características se ven en todas las especies infectadas por el virus orf y pueden dar lugar a la formación de un crecimiento pseudotumoral o a un nódulo debido a la replicación del virus en las células de la epidermis. Generalmente las infecciones por el virus orf se resuelven en unas pocas semanas, aunque se ven infecciones graves que no se resuelven sin intervención quirúrgica en personas que tienen una alteración de la inmunidad.

Hay un gran interés en el desarrollo de agentes farmacológicos que puedan antagonizar las acciones mediadas por el receptor de los VEGF (Martiny-Baron y Marme, Curr. Opin. Biotechnol. 6:675-680, 1995). Se ha mostrado que los anticuerpos monoclonales frente a VEGF suprimen el crecimiento tumoral in vivo inhibiendo la angiogenia asociada al tumor (Kim y col., Nature, 362,841-844, 1993). Se han observado efectos inhibidores similares sobre el crecimiento tumoral en sistemas modelo que se originan por la expresión de ARN no codificador de VEGF (Saleh y col., Cancer Res., 56: 393-41, 1996) o un mutante dominante-negativo de VEGFR-2 (Millauer y col., Nature, 367:576-579,
1994).

Sin embargo, los estudios de inhibición con anticuerpos neutralizantes indicaron que pueden participar otros factores angiógenos además de VEGF (Kim y col., Nature, 362,841-844, 1993). Además, la actividad de factores angiógenos diferentes a VEGF en el melanoma maligno vine indicada por el hallazgo de que no todos los melanomas expresan VEGF (Issa, R. y col., Lab. Invest., 79:417-425, 1999).

Actualmente se están aclarando las funciones biológicas de los diferentes miembros de la familia VEGF. Tienen particular interés las propiedades de VEGF-D y de VEGF-C. Estas proteínas se unen tanto a VEGFR-2 como a
VEGFR-3, que están localizados en las células endoteliales vasculares y linfáticas, respectivamente, y están relacionadas entre sí en su estructura primaria (identidad de aminoácidos de 48%). Ambos factores son mitógenos para las células endoteliales in vitro. Recientemente se ha mostrado que VEGF-C es angiógeno en el modelo de córnea de ratón y en la membrana corioalantoidea aviar (Cao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14.381-14.394, 1998), y puede inducir la angiogenia en el contexto de la isquemia tisular (Witzenbichler y col., Am. J. Pathol., 153:381-394, 1998). Además, VEGF-C estimula la linfangiogenia en la membrana corioalantoidea aviar (Oh y col., Dev. Biol., 188,96-109, 1997) y en un modelo de ratón transgénico (Jeltsch y col., Science, 276:1423-1425, 1997). Se mostró que VEGF-D era angiógeno en la córnea de conejo (Marconcini y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:9671-9676, 1999). Todavía no se ha descrito la capacidad linfangiógena de VEGF-D; sin embargo, puesto que VEGF-D, al igual que VEGF-C, se une a VEGFR-3, que es un receptor que se piensa que actúa en la señalización de la linfangiogenia (Taipale y col., Curr. Topics Micro. Immunol., 237:85-96, 1999) y lo activa, es muy probable que VEGF-D sea linfangiógeno. VEGF-D y VEGF-C pueden tener una importancia particular en la malignidad de los tumores, puesto que las metástasis se pueden diseminar a través de los vasos sanguíneos o de los vasos linfáticos; por lo tanto, las moléculas que estimulan la angiogenia o la linfangiogenia podrían contribuir a la formación de neoplasias malignas. Ya se ha mostrado que esto ocurre así en el caso de VEGF. Se debe señalar que la expresión del gen de VEGF-D es inducida por pEFBOSVGEGF-Fos, un factor de transcripción que se sabe que es importante para el desarrollo de neoplasias (Orlandini y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:11.675-11.680, 1996). Se especula que el mecanismo mediante el cual pEFBOSVGEGF-Fos contribuye a la formación de neoplasias es la activación de genes que codifican factores angiógenos. Las células tumorales deficitarias en pEFBOSVGEGF-Fos no experimentan progresión maligna, probablemente debido a la incapacidad de inducir la angiogenia (Saez y col., Cell, 82:721-732, 1995). Esto indica la existencia de un factor
angiógeno activado por pEFBOSVGEGF-Fos durante la progresión tumoral.

Como se muestra en la Figura 1, la forma intracelular predominante de VEGF-D es un propéptido homodimérico que está formado por el dominio de homología de VEGF-PDFG (VHD) y los propéptidos N- y C-terminales, y tiene la secuencia de ID. SEC. Nº 2. Después de su secreción este polipéptido se escinde proteolíticamente (Stacker, S.A., y col., J. Biol. Chem., 274:32.127-32.136, 1999). El procesado proteolítico (en las posiciones que se señalan con cabezas de flecha negras) da lugar a formas parcialmente procesadas y a una forma madura y totalmente procesada que está formada por dímeros de VHD. El VHD, que tiene la secuencia de ID. SEC. Nº 3 (es decir, residuos 93 a 201 del VEGF-D completo), contiene puntos de unión tanto para VEGFR-2 como para VEGFR-3. La forma madura se une tanto a VEGFR-2 como a VEGFR-3 con una afinidad mucho mayor que la forma no procesada (Stacker, S.A., y col., J. Biol. Chem., 274:32.127-32.136, 1999).

No se ha estudiado la localización de la proteína VEGF-D en los cánceres humanos debido a la ausencia de anticuerpos específicos frente a VHD o frente a VEGF-D. Los anticuerpos frente a los propéptidos N- y C-terminales son inadecuados porque estas regiones se escinden del VHD bioactivo y se localizarían en un lugar diferente al VHD (Stacker, S.A., y col., J. Biol. Chem., 274:32.127-32.136, 1999).

Resumen de la invención

La invención se refiere en general a medicamentos para tratar y aliviar diversos cánceres.

Según un primer aspecto, la presente invención proporciona un medicamento para tratar un organismo que sufre una enfermedad neoplásica que se caracteriza por la expresión de VEGF-D por un tumor seleccionado de carcinoma ductal de mama, carcinoma epidermoide, tumores de próstata y cáncer de endometrio.

Los antagonistas de VEGF-que pueden inhibir la expresión de VEGF-D, como con el uso de una composición que comprende un ácido nucleico no codificador o ADN de triple hebra que codifica VEGF-D.

Los antagonistas de VEGF-que también pueden inhibir la actividad de VEGF-D, como con el uso de compuestos que comprenden anticuerpos y/o inhibidores competitivos o no competitivos de la unión de VEGF-D tanto en la formación de dímeros como en la unión al receptor. Estos antagonistas de VEGF-D incluyen un polipéptido modificado de VEGF-D, como se describe más adelante, que tiene la capacidad de unirse a VEGF-D e impedir su unión a los receptores de VEGF-D, o que tiene la capacidad de unirse a los receptores de VEGF-D, pero que no puede estimular la proliferación, diferenciación, migración o supervivencia de las células endoteliales. También se pueden usar pequeñas moléculas que inhiben VEGF-D, VEGFR-2 o VEGFR-3 y anticuerpos dirigidos frente a VEGF-D, VEGFR-2 o VEGFR-3.

Se contempla que algunos polipéptidos modificados de VEGF-D tendrán la capacidad de unirse a los receptores de VEGF-D de las células que incluyen, aunque no se limitan a ellas, células endoteliales, células del tejido conectivo, miofibroblastos y/o células mesenquimatosas, pero que serán incapaces de estimular la proliferación, diferenciación, migración, motilidad o supervivencia celular o de inducir proliferación vascular, formación del tejido conectivo o curación de las heridas. Se espera que estos polipéptidos modificados puedan actuar como inhibidores competitivos o no competitivos de los polipéptidos VEGF-D y de los factores de crecimiento de la familia PDFG/VEGF, y que sean útiles en situaciones en las que es deseable la prevención o la reducción de la acción del polipéptido VEGF-D o de los factores de crecimiento de la familia PDFG/VEGF. Así, estas variantes del polipéptido VEGF-D que se unen al receptor pero que no son mitógenos, no inducen a diferenciación, no inducen la migración, no inducen la motilidad, no promueven la supervivencia, no promueven la formación de tejido conectivo, no inducen la curación de las heridas y no inducen la proliferación vascular también están en el ámbito de la invención, y se denominan en la presente solicitud "variante de unión al receptor pero por lo demás inactiva". Como VEGF-D forma un dímero para activar sus receptores, se contempla que un monómero comprende la "variante de unión al receptor pero por lo demás inactiva" del polipéptido VEGF-D arriba mencionada y un segundo monómero comprende un VEGF-D de tipo natural o un factor de crecimiento de tipo natural de la familia PDFG/VEGF. Así, estos dímeros se pueden unir a su correspondiente receptor pero no pueden inducir la señalización corriente
abajo.

También se contempla que hay otros polipéptidos VEGF-D modificados que pueden impedir la unión de un polipéptido VEGF-D de tipo natural o un factor de crecimiento de tipo natural de la familia PDFG/VEGF a su correspondiente receptor en las células que incluyen, aunque no están limitadas a ellas, células endoteliales, células del tejido conectivo (como fibroblastos), miofibroblastos y/o células mesenquimatosas. Así, estos dímeros serán incapaces de estimular la proliferación, diferenciación, migración o supervivencia de las células endoteliales y de inducir la permeabilidad vascular, y/o de estimular la proliferación y/o la diferenciación y/o la motilidad de las células del tejido conectivo, de los miofibroblastos o de las células mesenquimatosas. Se espera que estos polipéptidos modificados puedan actuar como inhibidores competitivos o no competitivos de VEGF-D o de un factor de crecimiento de la familia PDFG/VEGF, y que sean útiles en situaciones en las que es deseable la prevención o la reducción de la acción de VEGF-D o de un factor de crecimiento de la familia PDFG/VEGF. Esas situaciones incluyen el remodelado tisular que tiene lugar durante la invasión de las células tumorales en una población celular mediante formación de un tumor primario o metastásico. Así, estas variantes de factor de crecimiento VEGF-D que se unen al factor de crecimiento VEGF-D o a un factor de crecimiento de la familia PDFG/VEGF pero que no son mitógenos, no inducen a diferenciación, no inducen la migración, no inducen la movilidad, no promueven la supervivencia, no promueven el tejido conectivo, no inducen la curación de las heridas y no inducen la proliferación vascular también están en el ámbito de la invención, y en esta solicitud se denominan "variantes formadoras del dímero del factor de crecimiento VEGF-D pero por lo demás inactivas o que producen interferencia".

Las posibles formas modificadas del polipéptido VEGF-D se pueden preparar dianizando regiones esenciales del polipéptido VEGF-D para su modificación. Se espera que estas regiones esenciales caigan dentro del dominio de homología PDFG/VEGF altamente conservado (VHD). En particular, los factores de crecimiento de la familia PDFG/VEGF, incluyendo VEGF, son diméricos, y VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF, PDFG-A y PDFG-B muestran la conservación completa de ocho residuos de cisteína en el VHD (Olofsson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2576-2581, 1996; Joukov y col., EMBO J, 15:290-298, 1996). Se piensa que estas cisteínas participan en la formación de puentes disulfuro intramoleculares e intermoleculares. Además, hay más residuos de cisteína muy conservados, aunque no completamente, en los dominios C-terminales. Los bucles 1, 2 y 3 de cada subunidad VHD, que se forman mediante la formación de puentes disulfuro intramoleculares, participan en la unión a los receptores de los factores de crecimiento de la familia PDFG/VEGF (Andersson y col., Growth Factors, 12:159-164, 1995). Se puede estudiar fácilmente la capacidad de los polipéptidos modificados de inhibir la actividad biológica de VEGF-D mediante procedimientos rutinarios de ensayos de la actividad como el ensayo de proliferación de las células endotelia-
les.

Los antagonistas de VEGF-D útiles en la invención también pueden incluir moléculas que comprenden polipéptidos que corresponden a los dominios de unión a VEGF-D de VEGFR-2 (Klk1) o de VEGFR-3 (Flt4). Por ejemplo, las proteínas de fusión a IgG solubles que describen Achen y col., Proc Natl Acad Sci USA, 95:548-553, 1998, que contienen los dominios extracelulares del VEGFR-2 humano y de VEGFR-3 humano y que se unen a VEGF-D\DeltaN\DeltaC se podrían usar de manera adecuada como antagonistas de VEGF-D.

También se pueden producir medicamentos para tratar y aliviar varios cánceres dianizando un tumor que expresa VEGF-D, VEGFR-2 y/o VEGFR-3 para conseguir su muerte. Esto supondría el acoplamiento de un agente fármaco citotóxico a un polipéptido de la invención, un anticuerpo dirigido frente a VEGF-D, VEGFR-2 VEGFR-3 o una pequeña molécula dirigida frente a VEGF-D, VEGFR-2 o VEGFR-3, a fin de matar un tumor que expresa VEGF-D, VEGFR-2 y/o VEGFR-3. Esos fármacos citotóxicos incluyen, aunque no están limitadas a ellas, toxinas de plantas (por ejemplo, cadena A de ricina, saporina), toxinas bacterianas o fúngicas (por ejemplo, toxina diftérica) o radionucleótidos (por ejemplo, astato 211, bismuto 212, ytrio 90, yodo 131, tecnecio 99), fármacos alquilantes (por ejemplo, clorambucil), fármacos antimitóticos (por ejemplo, alcaloides de la vinca) y fármacos que producen intercalación del ADN (por ejemplo, adriamicina).

Los polipéptidos, antagonistas de VEGF-D o anticuerpos que inhiben la actividad biológica de VEGF-D también se pueden emplear en combinación con sales no tóxicas farmacéuticamente aceptables de los mismos, y un vehículo o un adyuvante sólido o líquido farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica preferida inhibirá una actividad biológica inducida por al menos VEGF-D o interferirá con la misma.

Los ejemplos de un vehículo o un adyuvante de este tipo incluyen, aunque no están limitados a ellos, suero salino tamponado, solución de Ringer, aceite mineral, talco, almidón de maíz, gelatina, lactosa, sacarosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, fosfato dicálcico, cloruro sódico, ácido alginoico, dextrosa, agua, glicerol, etanol, espesantes, estabilizantes, agentes dispersantes y combinaciones de los mismos. Esas composiciones pueden estar en forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, cápsulas, cremas, pomadas, elixires, jarabes, obleas, ungüentos u otras formas convencionales. Por supuesto, se puede ajustar la formulación según principios conocidos para adecuarse al modo de administración. Las composiciones que comprenden un péptido de la invención contendrán desde aproximadamente 0,1% a 90% en peso del compuesto activo, y más generalmente desde aproximadamente 10% a
30%.

La dosis y la vía de administración dependerán de la naturaleza del paciente y de la enfermedad que se va a tratar, y estarán a la discreción del médico o veterinario responsable. Las vías adecuadas incluyen oral, inyección subcutánea, intramuscular, intraperitoneal o intravenosa, administración parenteral, aplicación tópica, implantes, etcétera. Por ejemplo, se administra una cantidad eficaz de un péptido o anticuerpo de la invención a un organismo que necesita el mismo en una dosis entre 0,1 y 100 mg/kg de peso corporal, y más preferentemente entre 1 y 10 mg/kg de peso corporal. Para los anticuerpos humanizados, que típicamente muestran una semivida circulante larga, se contempla específicamente la administración a intervalos que van desde una vez al día a una vez al mes, y más preferentemente una vez a la semana o una vez cada dos semanas o una vez cada tres semanas. La monitorización de la progresión del tratamiento, de los efectos adversos del paciente y de las concentraciones de anticuerpos circulantes proporcionará una guía adicional del régimen posológico óptimo. Los datos de ensayos clínicos publicados y en realización para otros tratamientos antineoplásicos basados en anticuerpos (por ejemplo, anti-HER-2, receptor anti-EGF) también proporcionan una guía sobre el régimen posológico útil. La aplicación tópica de VEGF-D puede ser usada de manera análoga a VEGF.

Claramente se podrá comprender que para los objetivos de esta especificación la frase "VEGF-D totalmente procesado" se refiere a la forma madura del polipéptido VEGF-D, es decir, el dominio de homología de VEGF (VHD), que tiene la secuencia ID. SEC. Nº: 3, que carece de los propéptidos N- y C-terminales. La frase "forma procesada proteolíticamente de VEGF-D" se refiere a un polipéptido VEGF-D que carece del propéptido N- y/o C-terminal, y la fase "VEGF-D no procesado" se refiere a un polipéptido VEGF-D completo que tiene la secuencia ID. SEC. Nº: 2 y que tiene los propéptidos N-y C-terminales.

El polipéptido VEGF-D completo que tiene la secuencia ID. SEC. Nº: 2 puede estar opcionalmente unido al péptido FLAG®. Cuando el péptido VEGF-D completo está unido a FLAG®, en la presente solicitud el fragmento se denomina VEGF-D-FULL-N-FLAG. Un fragmento preferido de VEGF-D es la porción de VEGF-D desde el residuo del aminoácido 93 al residuo del aminoácido 201 (es decir, el VHD (ID. SEC. Nº: 3)), ocasionalmente unido al péptido FLAG®. Cuando fragmento está unido a FLAG®, el fragmento se denomina en esta solicitud VEGF-
D\DeltaN\DeltaC.

Se debe entender que la expresión "actividad biológica de VEGF-D" se refiere a la capacidad de estimular una o más de la proliferación, diferenciación, migración o supervivencia de las células endoteliales o la permeabilidad vascular.

Claramente se debe comprender que los polipéptidos que comprenden sustituciones, inserciones o deleciones conservadoras, pero que siguen manteniendo la actividad biológica de VEGF-D, están en el ámbito de la invención. Las personas expertas en la materia conocerán procedimientos que se pueden usar fácilmente para generar esos polipéptidos, por ejemplo el uso de mutagenia dirigida, o escisión y ligadura enzimáticas específicas. La persona experta también sabrá que los compuestos péptidomiméticos o los compuestos en los que uno o más residuos de aminoácidos son sustituidos por un aminoácido que no aparece en la naturaleza o por un análogo de un aminoácido pueden conservar los aspectos necesarios de la actividad biológica de VEGF-D. Esos compuestos se pueden hacer y estudiar fácilmente mediante procedimientos conocidos en la materia, y también están en el ámbito de la inven-
ción.

Preferentemente cuando se usa la sustitución de un aminoácido, esta sustitución es conservadora, es decir, un aminoácido es sustituido por otro de tamaño similar y con propiedades de carga similares.

Como se usa en la presente solicitud, el término "sustitución conservadora" se refiere a la sustitución de un residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar. Los ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de un residuo hidrófobo como isoleucina, valina, leucina, alanina, cisteína, glicina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina, norleucina o metionina por otro, o la sustitución de un residuo polar por otro, como la sustitución de arginina por lisina, ácido glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y similares. Los aminoácidos hidrófilos neutros que se pueden sustituir entre sí incluyen asparagina, glutamina, serina y treonina. El término "sustitución conservadora" también incluye el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido original no sustituido.

Como tal, se debe comprender que en el contexto de la presente invención en la materia se reconoce que la sustitución conservadora es la sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades similares. En la siguiente Tabla A, de WO97/09433, se presentan ejemplos de sustituciones conservadoras.

TABLA A Sustituciones conservadoras I

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Características de la cadena lateral \+  \hskip3.5cm  \+
Aminoácido\cr  Alifática\+\+\cr  No polar \+ \+ G A P\cr  \+ \+ I L
V\cr  Polar  -  sin carga \+ \+  C S T M\cr  \+ \+ N
Q\cr  Polar  -  cargada \+ \+ D E\cr  \+ \+ K R\cr 
Aromática \+ \+ H F W Y\cr  Otra \+ \+ M Q D
E\cr}

De manera alternativa, los aminoácidos conservadores se pueden agrupar como describe Lehninger (Biochemistry, 2ª edición; Worth Publishers, Inc., NY:NY (1976)), según se presenta en la siguiente Tabla B.

\newpage

TABLA B Sustituciones conservadoras II

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Características de la cadena lateral \+  \hskip3.5cm  \+ 
Aminoácido\cr  No polar (hidrófobo)\+\+\cr  a. Alifática: \+ \+ A L
I V P\cr  b. Aromática: \+ \+ F W\cr  c. Que contiene azufre: \+ \+
M\cr  d. Indefinida: \+ \+ G\cr  Polar sin carga\+\+\cr  a.
Hidroxilo: \+ \+ S T Y\cr  b. Amidas: \+ \+ N Q\cr  c. Sulfihidrilo:
\+ \+ C\cr  d. Indefinida: \+ \+ G\cr  Con carga positiva (básica):
\+ \+ K R H\cr  Con carga negativa (ácida): \+ \+ D
E\cr}

En la siguiente Tabla C se presentan ejemplos de sustituciones conservadoras.

TABLA C

\vskip1.000000\baselineskip

1

\newpage

Las posibles formas variantes del polipéptido VEGF-D que se pueden deber a ayuste alternativo, al igual que se sabe que ocurre con VEGF y con VEGF-D, y las variantes alélicas naturales de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica VEGF-D, están incluidas dentro del ámbito en el ámbito de la invención. Las variantes alélicas son bien conocidas en la materia, y representan formas alternativas de una secuencia de ácidos nucleicos que comprenden sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos, pero que no producen ninguna alteración sustancial de la función del polipéptido codificado.

Esas formas variantes de VEGF-D se pueden preparar dianizando regiones no esenciales del polipéptido VEGF-D para su modificación. Se espera que estas regiones no esenciales estén fuera de las regiones muy conservadas. En particular, los factores de crecimiento de la familia PDFG/VEGF, incluyendo VEGF, son diméricos, y VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, PIGF, PDFG-A y PDFG-D muestran la conservación completa de ocho residuos de cisteína en los dominios N-terminales, es decir, los dominios similares a PDFG/VEGF (Olofsson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:2576-2581, 1996). Se piensa que estas cisteínas participan en la formación de puentes disulfuro intramoleculares e intermoleculares. Además, hay otros residuos de cisteína muy conservados, aunque no completamente, en los dominios C-terminales. Los bucles 1, 2 y 3 de cada subunidad VHD, que están formados por puentes disulfuro intramoleculares, participan en la unión a los receptores de la familia PDFG/VEGF de factores de crecimiento (Andersson y col., Growth Factors, 12:159-164, 1995).

Por lo tanto, las personas expertas en la materia saben bien estos residuos de cisteína se deben conservar en cualquier forma variante propuesta, y que los puntos activos presentes en los bucles 1, 2 y 3 también se deben conservar. Sin embargo, se puede esperar que otras regiones de la molécula tengan una menor importancia para su función biológica, y por lo tanto ofrecen dianas adecuadas para su modificación. Se puede estudiar fácilmente la capacidad de los polipéptidos modificados de mostrar la actividad biológica de VEGF-D mediante los procedimientos de ensayos rutinarios de actividad como el ensayo de proliferación de células endoteliales.

Se ha mostrado que hay una intensa señal de VEGF-D en un subconjunto de células hematopoyéticas. Estas células fluyen hacia las regiones periféricas de algunos tumores en un tipo de respuesta inflamatoria. Por lo tanto, la inhibición de este proceso sería útil cuando sea deseable impedir esta respuesta inflamatoria.

Según otro aspecto de la invención, la invención se refiere a un medicamento para tratar un organismo, por ejemplo un mamífero, que sufre una enfermedad neoplásica que se caracteriza por la expresión de VEGF-D por un tumor que se selecciona de carcinoma ductal de mama, carcinoma epidermoide, cáncer de próstata o cáncer de endometrio, que comprende la administración de una cantidad eficaz de un antagonista de VEGF-D en la vecindad de dicho tumor para impedir la unión de VEGF-D a su receptor correspondiente. Si se desea, se puede administrar simultáneamente un fármaco citotóxico con un antagonista de VEGF-D. Un antagonista preferido de VEGF-D es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a VEGF-D y bloquea la unión de VEGF-D al receptor 2 de VEGF o al receptor 3 de VEGF, especialmente un anticuerpo que se une al dominio de homología de VEGF de VEGF-D.

Se comprenderá claramente que para los objetivos de esta especificación la expresión "que comprende" significa "que incluye pero que no está limitado a". Se aplica el correspondiente significado a la palabra "comprende".

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es la representación esquemática del procesado de VEGF-D.

La Figura 2 muestra la especificidad del AcMo 4A5 por el dominio de homología de VEGF/PDFG (VHD) del VEGF-D humano, según se evalúa mediante análisis de inmunotransferencia Western.

La Figura 3 muestra autorradiografías obtenidas después de dos días de exposición a secciones de tejido de ratón de 15,5 días post-coito hibridadas con ARN codificador y no codificador de VEGF-D.

Las Figuras 4A-4D muestran los resultados del análisis de la distribución del ARNm de VEGF-D en el embrión de ratón a los 15,5 días después del coito mediante hibridación in situ.

Las Figuras 5A-5F muestran la localización de VEGF-D en el carcinoma epidermoide pulmón.

Las Figuras 6A-6F muestran la localización de VEGF-D en el carcinoma ductal de mama in situ.

La Figura 7 muestra la localización de VEGF-D en el adenocarcinoma de endometrio in situ.

La Figura 8 muestra los resultados del análisis de tumores en ratones SCID que se producen mediante la inyección de células 293 progenitoras no transfectadas (denominadas "293") y de células 293 transfectadas con un vector de expresión que codifica VEGF-D-FULL-N-FLAG (denominadas "VEGF-D-293").

La Figura 9 muestra el aumento de la velocidad de crecimiento en tumores de células procedentes de células VEGF-D\DeltaN\DeltaC.

La Figura 10 muestra un tumor producido por células VEGF-D\DeltaN\DeltaC.

La Figura 11 muestra un tumor normal.

La Figura 12 muestra disminución de la velocidad de crecimiento en tumores procedentes de células VEGF-D\DeltaN\DeltaC.

Descripción detallada de formas de realización preferidas Ejemplo 1 Producción de anticuerpos monoclonales que se unen al VEGF-D humano

A fin de detectar el dominio de homología de VEGF/PDFG (VHD) en lugar de los propéptidos N- y C-terminal, se cultivaron en ratones anticuerpos monoclonales frente a la forma madura de VEGF-D (residuos 93 a 201 del VEGF-D completo (ID. SEC. Nº: 2), es decir, con eliminación de las regiones N- y C-terminal). Se amplificó un fragmento de ADN que codifica los residuos 93 a 201 mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con ADN polimerasa Pfu, usando como plantilla un plásmido que comprende el ADNc del VEGF-D humano completo (ID. SEC. Nº:1). El fragmento de ADN amplificado, cuya corrección se confirmó mediante secuenciado de los nucleótidos, se insertó posteriormente en el vector de expresión pEFBOSSFLAG (regalo de la Dra. Clare McFarlane y del Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research (WEHI), Melbourne, Australia) para obtener un plásmido denominado pEFBOSVGEGF-D\DeltaN\DeltaC. El vector pEFBOSVGEGF contiene ADN y codifica la secuencia de señales para la secreción de proteínas por el gen de la interleucina-3(IL-3) y el octapéptido FLAG® (Sigma-Aldrich). El octapéptido FLAG® se puede reconocer con anticuerpos disponibles comercialmente como el anticuerpo monoclonal M2 (Sigma-Aldrich). El fragmento VEGF-D PCR se insertó en el vector de modo que la secuencia de la señal de IL-3 estaba inmediatamente corriente arriba del octapéptido FLAG®, que a su vez estaba inmediatamente corriente arriba de la secuencia truncada de VEGF-D. Las tres secuencias estaban en el mismo marco de lectura, de modo que la traducción del ARNm que se producía por la transfección de pEFBOSVGEGF-D\DeltaN\DeltaC en células de mamífero daría lugar a una proteína que tendría la secuencia de la señal de IL-3 en su extremo N-terminal, seguida del octapéptido FLAG® y de la secuencia del VEGF-D truncado. La escisión de la secuencia de señal y la posterior secreción de la proteína desde la célula daría lugar a un polipéptido VEGF-D que está marcado con el octapéptido FLAG® adyacente al extremo N-terminal. Se purificó el VEGF-D\DeltaN\DeltaC mediante cromatografía de afinidad anti-FLAG® a partir del medio de células COS que se habían transfectado de manera transitoria con el plásmido pEFBOSVGEGF-D\DeltaN\DeltaC. (Véase el Ejemplo 9 de la Solicitud de Patente Internacional número PCT/US97/14696).

Se usó el VEGF-D\DeltaN\DeltaC purificado para inmunizar ratones hembra Balb/C el día 85 (por vía intraperitoneal), 71 (intraperitoneal) y 4 (intravenosa) antes de la recogida de las células esplénicas de los ratones inmunizados y la posterior fusión de estas células esplénicas con células de mieloma murino P3X63Ag8.653 (NS-1). Para las dos primeras inmunizaciones se inyectaron aproximadamente 10 \mug de VEGF-D\DeltaN\DeltaC en una mezcla 1:1 de STF y complemento de TiterMax (#R-1 Research Adjuvant; CytRx Corp., Norcross, GA), mientras que para la tercera inmunización se usaron 35 \mug de VEGF-DANAC en STF.

Se seleccionaron los anticuerpos monoclonales frente a VEGF-D\DeltaN\DeltaC haciendo cribado de los hibridomas que tenían VEGF-D\DeltaN\DeltaC purificado usando un inmunoensayo enzimático. Brevemente, se recubrieron placas de microtítulo de 96 pocillos con VEGF-D\DeltaN\DeltaC, y se añadieron sobrenadantes de hibridoma y se incubaron durante dos horas a 4ºC, seguido de seis lavados en STF con Tween 20 al 0,02%. A continuación se incubó con Ig anti-ratón conjugada con peroxidasa de rabanito (Bio-Rad, Hercules, CA) durante una hora a 4ºC. Después del lavado, se reveló el ensayo con el sistema de sustrato de ácido 2,2'-azino-di(3-etilbenzotiazolinsulfónico) (ABTS) (Zymed, San VEGF, CA), y se cuantificó el ensayo leyendo la absorbancia a 450 nm en un lector de placas de múltiples pocillos (Flow Laboratories MCC/340, McLean, VA). Se seleccionaron seis anticuerpos para el análisis posterior y se subclonaron dos veces mediante deglución limitante. Estos anticuerpos se denominaron 2F8, 3C10, 4A5, 4E10, 4H4 y 5F12. Se determinaron los isotipos de los anticuerpos usando un kit de isotipado Isostrip^{TM} (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Los anticuerpos 2F8, 4A5, 4E10 y 5F12 eran de la clase IgG_{1}, mientras que 4H4 y 3C10 eran de la clase IgM. Los seis anticuerpos contenían la cadena ligera kappa.

Se cultivaron líneas celulares de hibridoma en medio DMEM que contenía suero deplecionado de IgG al 5% v/v (Gibco BRL, Galthesburg, MD), L-glutamina 5 mM, gentamicina 50 \mug/ml e IL-6 recombinante 10 \mug/ml. Los anticuerpos 2F8, 4A5, 4E10 y 5F12 se purificaron mediante cromatografía de afinidad usando proteína de G-Sepharose según las técnicas de Darby, J. Immunol. Methods., 159:125-129, 1993, y se evaluó el rendimiento midiendo la absorción a 281 nm.

Ejemplo 2 Especificidad de 4A5

Se evaluó la especificidad del AcMo 4A5 (que a partir de ahora se denomina VD1) por el VHD del VEGF-D humano mediante análisis de transferencia Western. Los derivados de VEGF-D que se usaron fueron VEGF-D\DeltaN\DeltaC, formado por los residuos de los aminoácidos 93 a 201 del VEGF-D humano marcado en el extremo N-terminal con el octapéptido FLAG® (Ejemplo 1), VEGF-D-FULL-N-FLAG, formado por VEGF-D completo marcado en el extremo N-terminal con FLAG® (Stacker, S.A., y col., J. Biol. Chem., 274:32.127-32.136, 1999) y VEGF-D-CPRO, formado por el propéptido C-terminal, antes de los residuos de los aminoácidos 206 a 354, que también se marcó con FLAG® en el extremo N-terminal. Estas proteínas se expresaron en células 293-EBNA-1, se purificaron mediante cromatografía de afinidad con el AcMo M2 (anti-FLAG®) (IBI/Kodak, New Haven, CT) usando el procedimiento que se presenta en Achen y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:548-553, 1998. Se analizaron 50 ng de VEGF-D-FULL-N-FLAG (FM), VEGF-D\DeltaN\DeltaC (\Delta\Delta) y de VEGF-D-CPRO (CP) purificados mediante SDS-PAGE (reductora) y mediante inmunotransferencia Western usando el AcMo VD1 y un AcMo M2 biotinilado como control (el anticuerpo que se usó para la inmunotransferencia se indica en la parte inferior del panel de la Figura 2). Los análisis mediante SDS-Page y mediante inmunotransferencia Western se realizaron como se describe en, Stacker, S.A., y col., J. Biol. Chem., 274:32.127-32.136, 1999.

Como se muestra en la Figura 2, la especie predominante de la muestra de VEGF-D-FULL-N-FLAG está formada por VEGF-D no procesado (M_{r} \sim53 K), VEGF-D parcialmente procesado que contiene tanto el propéptido N-terminal como el VHD (\sim31 K) y el propéptido N-terminal (\sim10 K) (Stacker, S.A., y col., J. Biol. Chem., 274:32.127-32.136, 1999), todos los cuales se detectan con el AcMo M2 porque están marcados con el octapéptido FLAG® (flechas de la izquierda, los números representan M_{r} en K y los superíndices indican la muestra en la que se detecta la banda). Del mismo modo, VEFG-D\DeltaN\DeltaC (\sim21 K.) y VEGF-D-CPRO (dos bandas de \sim31 y \sim29 K que se originan debido a la glucosilación diferencial) se detectan con M2 (flechas de la izquierda) porque estos polipéptidos también están marcados con FLAG®. VD1 detecta al VEGF-D no procesado, al VEGF-D parcialmente procesado y al VEFG-D\DeltaN\DeltaC, pero no al propéptido N-terminal (\sim10 K) de la preparación de VEFG-D-FULL-N-FLAG, ni el propéptido C-terminal de la muestra de VEGF-D-CPRO (\sim31 y \sim29 K.). Los resultados con VEFG-D-FULL-N-FLAG se analizaron con exposiciones largas (L) y cortas (C). Las posiciones de los marcadores de peso molecular se muestran a la derecha en la Figura 2.

Así, el AcMo VD1 se une al VEGF-D no procesado, a las formas parcialmente procesadas que contienen el VHD y al VEGF-D totalmente procesado, pero no a los propéptidos N- o C-terminales. Además, el AcMo VD1 fue capaz de producir inmunoprecipitación del VEFG-D\DeltaN\DeltaC humano nativo, pero no del VHD del VEGF-C humano (VEGF-C\DeltaN\DeltaC) (Joukov y col., EMBO J, 16:3898-3911, 1997) en un inmunoensayo enzimático que indica que VD1 es específico para VEGF-D.

Ejemplo 3 Estudios de hibridación in situ de la expresión del gen de VEGF-D en embriones de ratón

Se estudió el patrón de expresión del gen de VEGF-D mediante hibridación in situ usando una sonda de ARN no codificador radiomarcada que correspondía a los nucleótidos 1 a 340 del ADNc de VEGF-D1 de ratón (ID. SEC. Nº: 4). El ARN no codificador se sintetizó mediante transcripción in vitro con ARN polimerasa T3 y [^{35}S]UTP_{\alpha s}. El VEGF-D de ratón se describe totalmente en la Solicitud de Patente Internacional PCT/US97/14696 (WO98/07832). Esta sonda de ARN no codificador se hibridó con secciones de tejido incluidas en parafina de embriones de ratón el día 15,5 después del coito. Las secciones marcadas se sometieron a autorradiografía durante dos días. En la Figura 3 se muestran las autorradiografías resultantes para las secciones que se hibridaron con el ARN no codificador y con el ARN codificador complementario (como control negativo). En la Figura 3, "L" Se refiere al pulmón y "Sk" Se refiere a la piel, y las dos secciones tisulares que se muestran son secciones seriadas. Se detectaron señales intensas del ARNm de VEGF-D en el pulmón en desarrollo y se asociaron a la piel. No se detectaron señales usando el ARN codificador control.

En las figuras 4A-4D se hibridaron secciones tisulares sagitales con la sonda de ARN no codificador de VEGF-D y posteriormente se incubaron con una emulsión fotográfica, se revelaron y se tiñeron. La amplificación de las Figuras 4A y 4D es de 40x, para la Figura 4B es de 200x y para la Figura 4C es de 500x.

En la Figura 4A, la micrografía de campo oscuro muestra una señal intensa para el ARNm de VEGF-D en el pulmón (Lu) También se muestran el hígado (Li) y las costillas (R). La Figura 4B muestra el pulmón a mayor aumento. Esta micrografía de campo claro muestra un bronquio (Br) y una arteria bronquial (BA). El perfil negro de un rectángulo señala la región de la sección que se muestra en la Figura 4C, pero con un mayor aumento. La Figura 4C muestra las células epiteliales del bronquio (Ep), las células musculares lisas en desarrollo (SM) que rodean a la capa de células epiteliales y las células mesenquimatosas (Mes). Es evidente la abundancia de granos de plata asociados a las células mesenquimatosas. Así, el análisis microscópico revela que el ARNm de VEGF-D es abundante en las células mesenquimatosas del pulmón en desarrollo (Figuras 4A-4C). Por el contrario, las células epiteliales de los bronquios y de los bronquíolos son negativas, al igual que las zonas musculares lisas en desarrollo que rodean a los bronquios. Las células endoteliales de las arterias bronquiales también son negativas.

En la Figura 4D una micrografía de campo oscuro muestra el esbozo de una extremidad. Se localizó una señal intensa inmediatamente debajo de la piel en una región de tejido rica en fibroblastos y en melanocitos en desarrollo.

Estos resultados indican que VEGF-D puede atraer el crecimiento de los vasos sanguíneos linfáticos hacia el pulmón en desarrollo y hacia la región inmediatamente inferior a la piel.

Ejemplo 4 VEGF-D en el cáncer de pulmón

Se piensa que la neoangiogenia es un indicador pronóstico útil en el carcinoma no microcítico de pulmón (CNMP) (Fontanini y col., Clin. Cancer Res., 3:861-865, 1997). Por lo tanto, se analizó la localización de VEGF-D en un caso de carcinoma epidermoide de pulmón mediante inmunohistoquímica (Figuras 5A-5F). Se realizó la inmunohistoquímica usando anticuerpos frente a la actina alfa del músculo liso (DAKO Corp., Carpinteria, CA) para realizar la inmunotinción. El AcMo anti-VEGF-D que se usó para realizar la inmunotinción en las Figuras 5A y 5D fue VD1(4A5). La Figura 5A muestra que VEGF-D se detecta en las células tumorales que forman una isla en el centro de la micrografía, en células que tapizan el gran vaso adyacente y en las células del interior del estroma desmoplásico. El estroma desmoplásico está indicado por un corchete negro y el recuadro punteado indica la región que se muestra en la imagen de gran aumento de la Figura 5D. Las células inmunopositivas del estroma pueden ser miofibroblastos.

La Figura 5B muestra que se detecta VEGFR-2 en las células que tapizan el gran vaso. Sin embargo, estos vasos fueron negativos para VEGFR-3 en este tumor. El recuadro punteado señala la región que se muestra a mayor aumento en la Figura 5E. La tinción control de una sección tisular del mismo caso en el que se había preincubado el AcMo frente a VEGF-D con un exceso molar de 40 veces del VHD del VEGF-D humano no dio ninguna señal (Figura 5C).

Como se ha mencionado más arriba, las células inmunopositivas del estroma desmoplásico pueden ser miofibroblastos. Por lo tanto, se inmunotiñó el estroma desmoplásico usando AcMo específicos para la actina alfa del músculo liso que detectan los miofibroblastos. Como se ve en la Figura 5F, el estroma da una tinción positiva, lo que indica la presencia de miofibroblastos. La secreción de un factor angiógeno por los componentes del estroma puede actuar amplificando el estímulo angiógeno que genera el tumor.

Ejemplo 5 VEGF-D en el cáncer de mama

También se analizó la localización de VEGF-D en el carcinoma ductal de mama in situ mediante inmunohistoquímica, cuyos resultados se muestran en las Figuras 6A-6F. Se realizó la inmunohistoquímica usando AcMo específicos para la actina alfa del músculo liso (DAKO Corp., Carpinteria, CA), y también se usó para la inmunotinción la molécula de adhesión plaquetaria/ endotelial (PECAM) (DAKO Corp., Carpinteria, CA). El AcMo anti-VEGF-D que se usó para realizar la inmunotinción de la Figura 6A era VD1 (4A5).

Como se ve en la Figura 6, se detectó VEGF-D en células tumorales de los conductos y de pequeños vasos denominados "en collar" (señalados con cabezas de flecha negras) inmediatamente adyacentes a la lámina basal de los conductos llenos de tumor. Los vasos en collar también son positivos para VEGFR-2 (Figura 6C), VEGFR-3 (figura 6D) y PECAM (Figura 6E), como indican las cabezas de fechas negras. PECAM es un marcador clásico del endotelio y también se encuentra en las plaquetas y en los leucocitos. PECAM participa en la migración de los leucocitos a los focos inflamatorios (Muller y col., J. Exp. Med, 178:449-460, 1993). La tinción con anticuerpos frente a PECAM en los vasos en "collar" ayuda a confirmar que esas estructuras son vasos. El borde del conducto se identifica mediante la tinción para actina alfa del músculo liso (Figura 6B), que detecta los miofibroblastos. La tinción control de una sección tisular seriada que se muestra en la Figura 6A, en la que se había preincubado el AcMo frente a VEGF-D con un exceso molar de 40 veces del VHD del VEGF-D humano no dio ninguna señal (Figura 6F). Estos hallazgos indican que VEGF-D, secretado por las células tumorales, podría activar sus receptores en los vasos de la vecindad, y de esta manera participaría en la atracción del crecimiento de los vasos en collar en sus posiciones muy cerca de los conductos. Esto podría ser importante tanto para el crecimiento de los tumores sólidos como para la diseminación metastásica.

Ejemplo 6 VEGF-D en el cáncer de endometrio

También se detectó VEGF-D en el adenocarcinoma de endometrio (Figura 7). Se realizó la inmunohistoquímica usando el AcMo anti-VEGF-D VD1 (4A5). Se vio una tinción moderada para VEGF-D en las células tumorales glandulares (GL), se vio una reactividad muy intensa en los miofibroblastos del estroma desmoplásico (DM) en el borde invasivo progresivo del tumor y una intensa reactividad en el endotelio y en las paredes de los vasos sanguíneos adyacentes (flechas negras) en el miometrio (Myo). De manera interesante, la reactividad a VEGF-D fue particularmente intensa en los miofibroblastos del estroma desmoplásico, lo que indica que las células tumorales glandulares pueden inducir la expresión de VEGF-D en estos fibroblastos, que amplificarían el potencial angiógeno del tumor. Como también se detectó expresión de VEGF-D en las células del estroma desmoplásico en el carcinoma de pulmón (Figura 5-A), puede ocurrir que diversos tumores puedan inducir VEGF-D en los componentes del estroma. Esto es análogo al pulmón en desarrollo, en el que las células mesenquimatosas, probablemente precursoras de fibroblastos, expresan intensamente el gen de VEGF-D. Por lo tanto, señales de tejidos embrionarios y de tejidos tumorales pueden inducir la expresión de VEGF-D en los fibroblastos.

Ejemplo 7 Función de VEGF-D en el desarrollo tumoral

A fin de generar líneas celulares que sobreexpresan de manera constitutiva derivados de VEGF-D, se insertaron regiones del ADNc del VEGF-D humano en el vector de expresión en mamíferos Apex-3 (Evans y col., Mol. Immunol., 32:1183-1195, 1995). Este vector se mantiene episómicamente cuando se transfecta en líneas de células renales embrionarias humanas 293-EBNA. Para la expresión de VEGF-D maduro, se insertó la región de pEFBOSVEGF-D\DeltaN\DeltaC que contenía las secuencias que codifican la secuencia de la señal de IL-3, el octapéptido FLAG® y el VEGF-D maduro en el punto XBai de Apex-3 (véase el Ejemplo 9 de la Solicitud de Patente Internacional PCT/US971/14.698) (WO98/07832)). El plásmido resultante se denominó pVDA-pexD\DeltaN\DeltaC (Stacker, S.A., y col., J. Biol. Chem., 274:32.127-32.136, 1999, y véase el Ejemplo 1 de la Solicitud de Patente Internacional PCT/US98/27.373). Se hizo un constructo similar para la expresión del VEGF-D completo no procesado marcado en el extremo N-terminal con FLAG®. En este constructo, el ADN que codifica la secuencia de la señal de VEGF-D para la secreción de proteínas había sido eliminada y sustituida por ADN que codifica la secuencia de la señal de IL-3, seguida del octapéptido FLAG® y de dos aminoácidos (Thr-Arg) inmediatamente corriente arriba y en el mismo marco de lectura que el ADN que codifica los residuos 24-354 del VEGF-D. Este constructo se denominó pVDAApexFULL-N-FLAG (Stacker, S.A., y col., J. Biol. Chem., 274:32.127-32.136, 1999, y véase el Ejemplo 1 de la Solicitud de Patente Internacional PCT/US98/27.373). Estos vectores se transfectaron en células de la línea celular de riñón embrionario humano 293EBNA-1 por el procedimiento de fosfato cálcico o con Fugene®, según las instrucciones del fabricante (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania), y se seleccionaron transfectantes estables en presencia de DMEM complementado con higromicina 100 \mug/ml. Posteriormente se identificaron líneas celulares que expresan concentraciones elevadas de VEFG-D-FULL-N-FLAG y de VEGF-D\DeltaN\DeltaC mediante marcado metabólico, inmunoprecipitación y análisis de inmunotransferencia Western (Stacker, S.A., y col., J. Biol. Chem., 274:32.127-32.136, 1999, y véase el Ejemplo 1 de la Solicitud de Patente Internacional PCT/US98/27.373).

Se inyectaron 2 x 10^{7} células 293 transfectadas o células 293 progenitoras no transfectadas en STF por vía subcutánea en ratones SCID de 6 a 8 semanas de edad (ARC, Perth, Australia) por vía subcutánea en la almohadilla grasa mamaria. Se permitió que los tumores crecieran y se midieron con calibres digitales, en un periodo de tres semanas. Los experimentos se interrumpieron después de tres semanas, cuando el primer animal alcanzó el máximo tamaño que permite el Comité Institucional de Ética. Se calculó el tamaño del tumor como anchura x longitud x 0,6 x (anchura x longitud)/2.

La Figura 8 muestra los resultados del análisis de los tumores en ratones SCID producidos por la inyección de células 293 progenitoras y de células 293 no transfectadas (denominadas "293") o de células 293 transfectadas con el constructo que codifica VEFG-D-FULL-N-FLAG (denominadas "VEGF-D-293"). Hay una diferencia significativa entre los tumores procedentes de las células 293-VEFG-D-FULL-N-FLAG y los que proceden de las células 293 no transfectadas. Después de tres semanas el tamaño tumoral medio de los tumores del grupo de 293-VEFG-D-FULL-N-FLAG fue de 937 \pm 55,5 mm^{3} (media \pm desviación típica, n=8), en comparación con 136 \pm 230 mm^{3} para las células no transfectadas (n=8). De manera interesante, los tumores que se generaron a partir de células 293 transfectadas con un constructo que codifica VEGF-D\DeltaN\DeltaC no tuvieron un tamaño significativamente diferente (50 \pm 76 mm^{3}, n=7) respecto a los que procedían de células 293 no transfectadas.

Además, el aspecto macroscópico de los tumores procedentes de las células 293 no transfectadas fue el de una superficie blanca pálida, en comparación con los tumores procedentes de las células 293-VEFG-D-FULL-N-FLAG, que tenían un aspecto hemorrágico, y era evidente la presencia de vasos sanguíneos en todo el tumor.

También se analizaron secciones mediante inmunohistoquímica con un anticuerpo monoclonal anti-PECAM (Pharmingen, San Diego, CA), un marcador de células endoteliales. Las secciones de los tumores que se habían generado con células 293-VEFG-D-FULL-N-FLAG demostraron un marcado aumento de la expresión de PECAM en comparación con los tumores que se habían generado con células progenitoras 293 no transfectadas. Este análisis confirma la abundancia mucho mayor de vasos sanguíneos en los tumores que expresan VEGF-D completo no procesado.

Este experimento indica que la forma no procesada de VEGF-D es capaz de inducir la angiogenia tumoral y el crecimiento de un tumor sólido in vivo. De manera interesante, los tumores procedentes de células que expresan la forma madura y totalmente procesada de VEGF-D no mostraron ningún aumento del crecimiento en comparación con las células progenitoras 293 no transfectadas. Esto indica la importancia de los propéptidos (N-pro y C-pro) en el VEGF-D para la localización o funcionamiento correctos del VHD de VEGF-D. Una explicación de este resultado es que los propéptidos participan en la asociación con la matriz, y sólo cuando el VEGF-D está situado correctamente sobre los proteoglucanos de sulfato de heparina de la matriz extracelular o de la superficie celular el factor de crecimiento puede inducir la angiogenia y/o la linfangiogenia. Una explicación alternativa es que los propéptidos aumentan la semivida del VHD del VEGF-D in vivo.

Ejemplo 8 Inducción por VEGF-D de la angiogenia tumoral

Para determinar si VEGF-D participa en la angiogenia tumoral, se generaron líneas celulares 293EBNA que expresan VEGF o VEGF-D. Las células 293EBNA normalmente no expresan concentraciones detectables de VEGF, VEGF-C ni de VEGF-D, los ligandos que activan VEGFR-2 y VEGFR-3 (Stacker, S.A., y col., Growth Factors, 17:1-11, 1999). Las células 293EBNA produjeron tumores de aspecto epitelioide de crecimiento lento y mal vascularizados en ratones inmunodeficientes. El análisis de inmunotransferencia Western de medio condicionado procedente de las líneas celulares 293EBNA generadas in vitro mostró que se secretaban las formas maduras de los factores de crecimiento activos.

Se colocaron ratones hembras de entre 6 y 21 semanas de edad SCID o SCID/nod (Animal Resources Center, Canning Vale, Australia; Austin Research Institute, Australia; y Eliza Hall Institute for Medical Research, Australia) en grupos de 6 a 10 ratones y se les inyectaron por vía subcutánea en la almohadilla grasa mamaria líneas celulares que expresan VEGF-293, VEGF-D-293, o líneas celulares 293 controles a una concentración de 2,0-2,5 x 10^{7} en el medio de cultivo. Se analizó el crecimiento tumoral y la morfología en un plazo de 35 días. Se midieron los tumores con calibres digitales y se calculó el volumen tumoral con la fórmula volumen = longitud x anchura^{2} x 0,52. Se sacrificó a los factores entre 3 y 5 semanas después de la inyección con líneas celulares, y se resecaron los tumores para su examen. Los tumores asociados a los factores VEGF-D-293 y 293 se resecaron después de la muerte el día 25 y se pesaron.

Las células VEGF-293 producían tumores que tenían una mayor velocidad de crecimiento que los que producían las células 293 controles. Los tumores VEGF-293 estaban muy vascularizados y tenían edema extenso, lo que es compatible con que VEGF es un potente factor de la angiogenia tumoral e inductor de la permeabilidad vascular. Las células VEGF-D-293 también mostraron estimulación del crecimiento in vivo y los tumores estaban muy vascularizados en comparación con los tumores controles 293, aunque no mostraron datos macroscópicos ni microscópicos de edema.

El crecimiento tumoral que se produce por la inyección de células VEGF-D-293 se bloqueó mediante la inyección peritoneal dos veces a la semana del anticuerpo monoclonal VD1, que es un anticuerpo específico frente a la región bioactiva de VEGF-D y que bloquea la unión de VEGF-D a VEGFR-2 y VEGFR-3. Sin embargo, el crecimiento tumoral no se vio afectado por el tratamiento con un anticuerpo control que tenía el mismo isotipo.

El tratamiento con el anticuerpo VD1 redujo la abundancia de vasos en los tumores, según se evaluó mediante inmunohistoquímica para el marcador de las células endoteliales PECAM-1. La inmunotransferencia Western demostró la expresión de VEGF-D y de VEGF en tumores VEGF-D-293 y VEGF-293, respectivamente, y también que VEGF no estaba estimulado en los tumores VEGF-D-293. El análisis del peso de los tumores después de la muerte demostró una diferencia significativa entre los tumores VEGF-D-293 (0,49 \pm 22 g, n=7; media \pm DT) y los tumores 293 controles (0,123 \pm 0,118 g, n=9, p=0,01).

Ejemplo 9 Inducción por VEGF-D de linfangiogenia tumoral

Como las metástasis a los ganglios linfáticos locales a través de los vasos linfáticos son una etapa frecuente en la diseminación de los tumores sólidos, se realizaron experimentos para determinar si VEGF-D inducía la linfangiogenia tumoral, o si la expresión de VEGF-D en las células tumorales daba lugar a la diseminación del tumoral hacia los ganglios linfáticos.

Para analizar la función de VEGF-D en la diseminación tumoral, se indujeron tumores VEGF-D-293 en ratones SCID/nod (Animal Resources Center, Canning Vale, Australia; Austin Research Institute, Australia; y Eliza Hall Institute for Medical Research, Australia). Los análisis autópsicos mostraron que los animales que tenían tumores VEGF-D-293 habían presentado lesiones metastásicas en el ganglio linfático axilar lateral y/o en los ganglios linfáticos inguinales superficiales en 14 de 23 animales, en comparación con 0 de 16 animales que tenían tumores VEGF-293 y en 0 de 14 animales que tenían tumores 293. En algunos casos la diseminación metastásica de las células tumorales desde el tumor primario en ratones se pudo ver como un reguero de células tumorales en los linfáticos de la piel entre el tumor primario y el ganglio axilar lateral.

El tratamiento de ratones que albergaban tumores VEGF-D-293 con el anticuerpo monoclonal VD1 (Tabla 1) bloqueó la diseminación metastásica a los ganglios linfáticos. Ninguno de los siete ratones a los que se trató durante 25 días con VD1 mostró diseminación metastásica, mientras que 6 de 10 ratones a los que se trató con un anticuerpo monoclonal del mismo isotipo mostraron diseminación linfática. Estos resultados indican que VEGF-D puede promover la diseminación metastásica de estos tumores a través de los linfáticos.

TABLA 1

3

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{135mm}  ^{a}  Se inyectaron anticuerpos
monoclonales purificados dos veces a la semana durante el transcurso
del experimento, comenzando un día después de la inyección de las
células tumorales. VD1 es un anticuerpo monoclonal neutralizador de
VEGF-D.\end{minipage} \cr 
 \begin{minipage}[t]{135mm}  ^{b} LMM774 es un anticuerpo
monoclonal control con compatibilidad de isotipo que no bloquea
VEGF-D.\end{minipage} \cr}

Los datos muestran que la expresión de VEGF-D puede promover la diseminación metastásica de las células tumorales a través de la red linfática. VEGF-D indujo la formación de vasos linfáticos en los tumores, como se detectó mediante inmunohistoquímica para el marcador específico de los linfáticos LYVE-1, probablemente a través del receptor linfático VEGFR-3, aunque no se puede excluir la activación de heterodímeros de VEGFR-3-VEGFR-2. La expresión de factores linfangiógenos por sí misma es suficiente para inducir la formación de vasos linfáticos el centro de un tumor y para facilitar la diseminación metastásica a los ganglios linfáticos.

VEGF-D se localizó en las células tumorales y endoteliales de los vasos en los cánceres de pulmón y de mama (véanse los Ejemplo 5-6).

Ejemplo 10 Variabilidad de las características de los tumores inducidos por diferentes formas de VEGF-D

Además de la determinación de la función de VEGF-D en la angiogenia y la linfangiogenia tumorales, se usaron los procedimientos del ejemplo 10 y 11 para producir y evaluar tumores que expresan diferentes formas de VEGF-D que representan la escisión de los propéptidos N-, C- y N- y C-terminales. Las líneas celulares que se inyectaron en los ratones eran 293EBNA, VEGF-D-293, VEGF-D\DeltaN\DeltaC-293, VEGF-D\DeltaC-293 (células que expresan VEGF-D pero que carecen del propéptido C-terminal), y células VEGF-D\DeltaN-293 (células que expresan VEGF-D y que carecen del propéptido N-terminal).

Los tumores que se producen por las células VEGF-D\DeltaN crecen más rápidamente que los tumores producidos por las células control. En el examen morfológico los tumores eran de color rojo y contenían una reacción vascular significativa, incluyendo un componente líquido sustancial que no se vio en los tumores controles. Los tumores producidos por las células VEGF-D\DeltaN tenían diferencias significativas en cuanto al crecimiento y las características morfológicas respecto a los tumores controles.

El gráfico de la Figura 9 muestra el aumento de la velocidad de crecimiento de los tumores procedentes de células VEGF-D\DeltaN. La tendencia a la acumulación de líquido en los tumores producidos por las células VEGF-D\DeltaN se puede ver en la Figura 10, que es una fotografía de un tumor de este tipo. Esto se puede comparar con la fotografía de la Figura 11, que representa un tumor normal como el que está producido por las células control.

Los tumores producidos por las células VEGF-D\DeltaC crecieron de una manera similar a los producidos por las células controles y no mostraron una formación excesiva de líquido.

Los tumores producidos por las células VEGF-D\DeltaN\DeltaC crecieron muy lentamente en comparación con los tumores controles. Los tumores VEGF-D\DeltaN\DeltaC se formaron en aproximadamente 70 días, en comparación con un promedio de 30-35 días para los tumores controles y de 20-25 días para los tumores VEGF-D\DeltaN. El examen de estos tumores mostró que tenían una menor respuesta vascular, y tenían menos vasos sanguíneos que los tumores de acuerdo con la tinción con PECAM-1. Los tumores desarrollaron redes linfáticas, como se muestra con la tinción con LYVE-1, e indujeron la formación de metástasis linfáticas. El gráfico de la Figura 12 muestra la menor velocidad de crecimiento de los tumores procedentes de células VEGF-D\DeltaN\DeltaC.

En el carcinoma epidermoide de pulmón y en el carcinoma ductal de mama in situ (CDMIS) se observaron patrones de tinción similares a los que se ven en los melanomas, porque se detectó VEGF-D en las células tumorales y en los vasos adyacentes. Los vasos próximos a los conductos llenos de tumor en el CDMIS y cerca de los islotes de células tumorales en el carcinoma de pulmón también eran positivos a VEGFR-2, lo que una vez más indica que esté ligando y su receptor pueden contribuir al control de la angiogenia tumoral de manera paracrina.

Estos resultados también indican que VEGF-D puede participar en la estimulación del crecimiento de los vasos linfáticos que están en la vecindad del melanoma maligno, porque los vasos positivos para VEGFR-3, que es un receptor de VEGF-D que se expresa en el endotelio linfático de los tejidos adultos normales, también eran positivos para VEGF-D. Se vieron patrones de tinción similares en el CDMIS, porque algunos de los vasos positivos para VEGF-D que rodeaban a los conductos rellenos de tumor también eran positivos para VEGFR-3. Se piensa que la señalización a través de VEGFR-3 es importante para la linfangiogenia (Taipale y col., Curr. Topics Micro. Immunol., 237:85-96, 1999), aunque este receptor puede estar activado en los capilares vasculares sanguíneos en el cáncer (Valtola, R., y col., Am. J. Path., 154:1381-1390, 1999). Por lo tanto, el sistema regulador paracrino formado por VEGF-D y VEGFR-3 podría estimular tanto la linfangiogenia como la angiogenia en el cáncer. Según esto, la ruta de diseminación metastásica de un tumor puede estar determinada en parte por su capacidad de inducir angiogenia y linfangiogenia. Si es así, la expresión por las células tumorales de factores de crecimiento solubles que son puramente angiógenos (por ejemplo, VEGF) en contraposición a los que también pueden inducir linfangiogenia (por ejemplo, VEGF-D) podría ser un determinante importante de la ruta de diseminación metastásica.

Claims (5)

1. El uso de un antagonista de VEGF-D que impide la unión de VEGF-D a su correspondiente receptor para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una enfermedad neoplásica caracterizado porque dicha enfermedad neoplásica se selecciona del grupo formado por carcinoma ductal de mama, carcinoma epidermoide, cáncer de próstata y cáncer de endometrio.

2. El uso según la reivindicación 1, en el que dicho antagonista de VEGF-D se administra simultáneamente con un agente fármaco citotóxico.

3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el que dicho antagonista comprende además al menos un vehículo o adyuvante farmacéutico.

4. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho antagonista es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a VEGF-D y bloquea la unión de VEGF-D al receptor 2 de VEGF o al receptor 3 de VEGF.

5. El uso según la reivindicación 4, en el que dicho anticuerpo se une al dominio de homología de VEGF de VEGF-D.