ES2234818T3 - Procedimiento para tratar canceres que expresan el factor de crecimiento endotelial d. - Google Patents
Procedimiento para tratar canceres que expresan el factor de crecimiento endotelial d.Info
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Abstract
El uso de un antagonista de VEGF-D que impide la unión de VEGF-D a su correspondiente receptor para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de una enfermedad neoplásica caracterizado porque dicha enfermedad neoplásica se selecciona del grupo formado por carcinoma ductal de mama, carcinoma epidermoide, cáncer de próstata y cáncer de endometrio.
Description
Procedimientos para tratar cánceres que expresan
el factor de crecimiento endotelial D.
La invención se refiere en general a medicamentos
para tratar y aliviar diversos cánceres.
Los dos componentes principales del sistema
vascular de los mamíferos son las células endoteliales y las células
musculares lisas. Las células endoteliales forman el recubrimiento
de la superficie interna de todos los vasos sanguíneos y linfáticos
del mamífero. La formación de nuevos vasos sanguíneos se puede
producir mediante dos procesos diferentes, vasculogenia y angiogenia
(véase la revisión de Risau, W., Nature 386:
671-674, 1997). La vasculogenia se caracteriza por
la diferenciación in situ de precursores de células
endoteliales a células endoteliales maduras y por la asociación de
estas células para formar vasos, como ocurre en la formación del
plexo vascular primario en las primeras fases del desarrollo
embrionario. Por el contrario, la angiogenia, la formación de vasos
sanguíneos mediante crecimiento y ramificación de vasos
preexistentes, es importante en las fases posteriores de la
embriogenia y es responsable del crecimiento de los vasos sanguíneos
que se produce en el adulto. La angiogenia es un proceso
fisiológicamente complejo que supone la proliferación de las células
endoteliales, la degradación de la matriz extracelular, la
ramificación de los vasos y los posteriores episodios de adhesión
celular. En el adulto la angiogenia está muy controlada, y en
condiciones normales está limitada al sistema reproductor femenino.
Sin embargo, se puede activar la angiogenia en respuesta a la lesión
tisular. De manera importante, los tumores sólidos son capaces de
inducir angiogenia en el tejido circundante, promoviendo de esta
manera el crecimiento tumoral y facilitando la formación de
metástasis (Folkman J, Nature Med.,
1:27-31, 1995). Se está muy lejos de
comprender los mecanismos moleculares subyacentes a los complejos
procesos de angiogenia.
La angiogenia también participa en diversas
situaciones patológicas, en las que es importante o participa
directamente en diferentes secuelas de la enfermedad. Algunos
ejemplos incluyen la neovascularización que se asocia a varias
enfermedades hepáticas, las secuelas neovasculares de la diabetes,
las secuelas neovasculares de la hipertensión, la neovascularización
después de un traumatismo, la neovascularización debida a un
traumatismo craneal, la neovascularización en las infecciones
hepáticas crónicas (por ejemplo, hepatitis crónica), la
neovascularización debida a un traumatismo por calor o por frío, la
disfunción relacionada con el exceso de hormonas, la producción de
hemangiomas y la reestenosis después de la angioplastia.
Debido a la función crucial de la angiogenia en
tantos procesos fisiológicos y patológicos, se han investigado de
manera intensiva los factores que participan en el control de la
angiogenia. Se ha mostrado que diversos factores de crecimiento
participan en la regulación de la angiogenia; incluyen los factores
de crecimiento de fibroblastos (FGF), el factor de crecimiento
derivado de plaquetas (PDFG) el factor de transformación del
crecimiento alfa (TGF\alpha) y el factor de crecimiento de
hepatocitos (HGF) véase, por ejemplo, una revisión en Folkman y
col., J. Biol. Chem., 267:
10.931-10.934, 1972.
Se ha propuesto que una familia particular de
factores de crecimiento específicos de células endoteliales, los
factores de crecimiento endotelial vascular (VEGF), y sus
correspondientes receptores, es el principal responsable de la
estimulación del crecimiento y de la diferenciación de las células
endoteliales, y de algunas funciones de las células diferenciadas.
Estos factores son miembros de la familia PDFG/VEGF, y parecen
actuar principalmente a través de las tirosina cinasas del receptor
endotelial (RTK). La familia PDFG/VEGF de factores de crecimiento
pertenece a la superfamilia de factores de crecimiento unida a la
cistina, que también incluye las neurotrofinas y el
factor-\beta de crecimiento en transformación.
Se han identificado ocho proteínas diferentes en
la familia PDFG/VEGF, que son dos PDFG (A y B), VEGF y cinco
miembros que están muy relacionados con VEGF. Los cinco miembros que
están muy relacionados con VEGF son: VEGF-B,
descrito en la Solicitud de Patente Internacional PCT/US96/02957
(WO96/26736) y en las Patentes de EE.UU. 5.840.693 y 5.607.918 del
Ludwig Institute for Cancer Research y la Universidad de Helsinki;
VEGF-C o VEGF 2, descrito en Joukov y col., EMBO
J, 15:290-298, 1996; Lee y col., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 93:1988-1992, 1996,
y en las Patentes de EE.UU. 5.932.500 y 5.935.540 de Human Genome
Sciences, Inc.; VEGF-D, descrito en la Solicitud de
Patente Internacional nº PCT/US97/14696 (WO98/07832) y en Achen y
col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
95:548-553, 1998; el factor de crecimiento
placentario (PIGF), descrito en Maglione y col., Proc Natl Acad
Sci USA, 88:9267-9271, 1991; y VEGF3,
descrito en la Solicitud de Patente Internacional número
PCT/US95/07283 (WO96/39.421) por Human Genome Sciences, Inc. Cada
miembro de la familia VEGF tiene una identidad de la secuencia de
aminoácidos entre 30% y 45% con VEGF. Los miembros de la familia
VEGF muestran una homología del dominio VEGF que contiene los seis
residuos de cisteína del motivo de nudo de cisteína. Las
características funcionales de la familia VEGF incluyen grados
variables de mitogenia para las células endoteliales, inducción de
la permeabilidad vascular, y propiedades angiógenas y
linfangiógenas.
El factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF) es una glucoproteína homodimérica que se ha aislado a partir
de diferentes fuentes. El ayuste alternativo del ARNm de un solo gen
de VEGF da lugar a 5 isoformas de VEGF. VEGF muestra una actividad
mitógena muy específica para las células endoteliales. VEGF tiene
funciones reguladoras importantes en la formación de nuevos vasos
sanguíneos en la vasculogenia embrionaria y en la angiogenia durante
la vida adulta (Carmeliet y col. Nature,
380:435-439, 1996; Ferrara y col.,
Nature, 380:439-442, 1996; revisado en
Ferrara y Davis-Smyth, Endocrine Rev.,
18:4-25, 1997). Se ha mostrado el significado
de la función de VEGF en estudios que muestran que la inactivación
de un solo alelo de VEGF produce la muerte del embrión debido a una
alteración del desarrollo de la vasculatura (Carmeliet y col.
Nature, 380:435-439, 1996; Ferrara y
col., Nature, 380:439-442, 1996). Se
ha revisado el aislamiento de las propiedades de VEGF; véase Ferrara
y col., J. Cellular Biochem.,
47:211-218, 1991 y Connolly, J. Cellular
Biochem., 47:219-223, 1991.
Además, VEGF tiene una actividad quimiotáctica
intensa para los monocitos, puede inducir el activador del
plasminógeno y el inhibidor del activador del plasminógeno en las
células endoteliales, y también puede inducir la permeabilidad
microvascular. Debido a esta última actividad, a veces se denomina
factor de permeabilidad vascular (VPG). VEGF también es
quimiotáctico para algunas células hematopoyéticas. La literatura
reciente indica que VEGF bloquea la maduración de las células
dendríticas y de esta manera reduce la eficacia de la respuesta
inmunitaria a los tumores (muchos tumores secretan VEGF)
(Gabrilovich y col., Blood,
92:4150-4166, 1998; Gabrilovich y col.,
Clinical Cancer Research, 5:2963-2970,
1999).
VEGF-B tiene unas propiedades
angiógenas y de otro tipo similares a las de VEGF, aunque se
distribuye y se expresa en los tejidos de manera diferente a VEGF.
En particular, VEGF-B se expresa de manera muy
intensa en el corazón, y sólo débilmente en el pulmón, mientras que
ocurre lo contrario para VEGF. Esto indica que VEGF, VEGF y
VEGF-B, a pesar del hecho de que se coexpresan en
muchos tejidos, pueden tener diferencias funcionales.
VEGF-B se aisló usando una
técnica de cribado en trampa mediante interacción con cohíbridos en
levaduras haciendo el cribado de proteínas celulares que podrían
interactuar con la proteína celular fijadora de ácido retinoico de
tipo I (CRABP-I). Su aislamiento y sus
características se describen en detalle en el documento
PCT/US96/02957 (WO96/26736), en las Patentes de EE.UU. 5.840.693 y
5.607.918 Ludwig Institute for Cancer Research y la Universidad de
Helsinki, y en Olofsson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
93:2576-2581, 1996.
VEGF-C se aisló de medios
acondicionados de la línea celular del adenocarcinoma de próstata
PC-3 (CRL1435) mediante cribado de la capacidad del
medio de producir fosforilación del receptor de tirosina cinasa
específico de la célula endotelial VEGFR-3 (Flt4),
usando células transfectadas para expresar VEGFR-3.
Se purificó VEGF-C usando cromatografía de afinidad
con VEGFR recombinante, y se clonó a partir de una biblioteca de
ADNc de PC-3. Su aislamiento y características se
describen en detalle en Joukov y col. EMBO J,
15:290-298, 1996.
VEGF-D se aisló de una biblioteca
de ADNc de mama humana, comercialmente disponible de Clontech,
mediante cribado con una cola de secuencia expresada obtenida de una
biblioteca de ADNc humano denominada "Soares Breast 3NbHBst"
como sonda de hibridación (Achen y col., Proc Natl Acad Sci
USA, 95:548-553, 1998). Su aislamiento y
características se describen con detalle en la Solicitud de Patente
Internacional nº PCT/US97/14.696 (WO98/07832).
En el documento PCT/US97/14.696 también se
describe el aislamiento de un fragmento biológicamente activo de
VEGF-D, denominado
VEGF-D\DeltaN\DeltaC. El fragmento está formado
por los residuos de aminoácidos 93 a 201 de VEGF-D
unidos al péptido de la cola de afinidad FLAG®. Toda la descripción
de la Solicitud de Patente Internacional PCT/US97/14.696
(WO98/07832) se incorpora a la presente solicitud como
referencia.
El gen de VEGF-D se expresa de
manera extensa en el ser humano adulto, pero evidentemente no se
expresa de manera ubicua. VEGF-D se expresa de
manera intensa en corazón, pulmón y músculo esquelético. Se expresan
niveles intermedios de VEGF-D en bazo, ovarios,
intestino delgado y colon, y hay una menor expresión en riñón,
páncreas, timo, próstata y testículos. No se detectó ARNm de
VEGF-D en el ARN procedente de cerebro, placenta,
hígado o leucocitos de sangre periférica.
PIGF se aisló de una biblioteca de ADNc de
placenta a término. Su aislamiento y características se describen en
detalle en Maglione y col., Proc Natl Acad Sci USA,
88:9267-9271, 1991. En la actualidad no se
comprenden bien sus funciones biológicas.
VEGF3 se aisló de una biblioteca de ADNc
procedente de tejido de colon. Se ha afirmado que VEGF3 tiene una
identidad de aproximadamente 36% y una similitud de aproximadamente
66% con VEGF. No está claro el procedimiento de aislamiento del gen
que codifica VEGF3, y no se ha descrito ninguna caracterización de
su actividad biológica.
La similitud entre dos proteínas se determina
comparando la secuencia de aminoácidos y las sustituciones
conservadas de aminoácidos de una de las proteínas respecto a la
secuencia de la segunda proteína, mientras que la identidad se
determina sin incluir las sustituciones de aminoácidos
conservados.
Una función importante del sistema linfático es
proporcionar el retorno de los líquidos desde los tejidos y
transportar muchas sustancias extravasculares de nuevo hacia la
sangre. Además, durante el proceso de maduración los linfocitos
abandonan la sangre, migran a través de los órganos linfáticos y de
otros tejidos, y entran en los vasos linfáticos, y vuelven a la
sangre a través del conducto torácico. Unas vénulas especializadas,
las vénulas endoteliales altas (VEA), se unen de nuevo a los
linfocitos y producen su extravasación hacia los tejidos. De esta
manera los vasos linfáticos, y especialmente los ganglios
linfáticos, tienen una función importante en la inmunología y en el
desarrollo de las metástasis de diferentes tumores. Al contrario que
los vasos sanguíneos, no está tan claro el origen embrionario del
sistema linfático y hay al menos tres teorías diferentes sobre su
origen. Es difícil identificar los vasos linfáticos debido a la
ausencia de marcadores específicos conocidos disponibles de los
mismos.
Los vasos linfáticos se estudian habitualmente
con linfografía. En la linfografía se inyecta un medio de contraste
radiológico directamente en un vaso linfático. El medio de contraste
se distribuye a lo largo de los vasos de drenaje eferente del
sistema linfático y se recoge en los ganglios linfáticos. El medio
de contraste puede permanecer hasta medio año en los ganglios
linfáticos, y durante este período el análisis radiológico permite
el seguimiento del tamaño y de la arquitectura de los ganglios
linfáticos. Este diagnóstico es especialmente importante en los
pacientes que tienen metástasis en los ganglios linfáticos y en las
neoplasias linfáticas, como linfoma. Sin embargo, son necesarias en
la materia mejoras de los materiales y de los procedimientos para
visualizar los tejidos linfáticos.
Como se ha observado más arriba, los miembros de
la familia PDFG/VEGF actúan principalmente uniéndose a las tirosina
cinasas del receptor. En general las tirosina cinasas del receptor
son glucoproteínas que están formadas por un dominio extracelular
capaz de unirse a un factor de crecimiento específico, un dominio
transmembrana que habitualmente es la porción
alfa-helicoidal que la proteína, un dominio
yuxtamembrana, que es el punto en el que se puede regular el
receptor mediante, por ejemplo, fosforilación de las proteínas, un
dominio tirosina cinasa, que ese componente enzimático del receptor
y una cola carboxiterminal, que en muchos receptores participa en el
reconocimiento y en la unión de los sustratos de la tirosina
cinasa.
Se han identificado cinco tirosina cinasas del
receptor específicas de células endoteliales, a saber,
VEGF-1(Flt-1),
VEGF-2(KDR/Flk-1),
VEGF-3 (Flt-4),Tie y
Tie/Tek-2. Estos receptores difieren en su
especificidad y afinidad. Todos ellos tienen la actividad tirosina
cinasa intrínseca que es necesaria para la transducción de
señales.
Las únicas tirosina cinasas del receptor que se
sabe que se unen a los VEGF son VEGFR-1,
VEGFR-2 y VEGFR-3.
VEGFR-1 y VEGFR-2 se unen a VEGF con
una elevada afinidad, y VEGFR-1 también se une a
VEGF-B y a PIGF. También se ha mostrado que
VEGF-C es un ligando de VEGFR-3, y
también activa a VEGFR-2. (Joukov y col., EMBO
J, 15:290-298, 1996).
VEGF-D se une tanto a VEGFR-2 como
VEGFR-3 (Achen y col., Proc Natl Acad Sci
USA, 95:548-553, 1998). Se ha descrito un
ligando de Tie/Tek-2 en la Solicitud de Patente
Internacional nº PCT/US95/12.935 (WO96/11.269) de Regeneron
Pharmaceuticals, Inc. Todavía no ser identificado el ligando de
Tie.
Recientemente se ha purificado y clonado un nuevo
receptor específico de la isoforma de VEGF de
130-135 kD (Soker y col., Cell,
92:735-745, 1998). Se encontró que el
receptor de VEGF se une específicamente a la isoforma VEGF_{165}
mediante la secuencia codificada por el exón 7, que muestra una
débil afinidad por heparina (Soker y col., Cell,
92:735-745, 1998). Sorprendentemente se
mostró que el receptor era idéntico a la neuropilina humana 1
(NP-1), un receptor que participa en la
neuromorfogenia de las primeras etapas. PIGF-2
también parece interactuar con NP-1 (Migdal y col.
J. Biol. Chem., 273: 22.272-22.278,
1998).
VEGFR-1, VEGFR-2
y VEGFR-3 se expresan de manera diferente en las
células endoteliales. En general en el endotelio de los vasos
sanguíneos se expresa tanto VEGFR-1 como
VEGFR-2 (Oelrichs y col., Oncogene, 8:
11-18, 1992; Kaipainen y col., J. Exp. Med,
178:2077-2088, 1993; Dumont y col., Dev.
Dyn., 203:80-92, 1995; Fong y col.,
Dev. Dyn., 207:1-10, 1996), y
VEGFR-3 se expresa principalmente en el endotelio
linfático de los tejidos adultos (Kaipainen y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 9, 3566-3570, 1995).
VEGFR-3 también se expresa en la vasculatura
sanguínea que rodea los tumores.
Aunque VEGFR-1 se expresa
principalmente en las células endoteliales durante el desarrollo,
también se puede encontrar en las células precursoras
hematopoyéticas durante las etapas tempranas de la embriogenia (Fong
y col., Nature, 376:66-70, 1995). En
los adultos los monocitos y los macrófagos también expresan este
receptor (Barleon y col., Blood,
87:3336-3343, 1995). En los embriones la
mayor parte de los vasos, por no decir todos, expresan
VEGFR-1 (Braier y col., Dev. Dyn.,
204:228-239, 1995; Fong y col., Dev.
Dyn., 207:1-10, 1996).
El receptor VEGFR-3 se expresa de
manera extensa en las células endoteliales durante las fases
tempranas del desarrollo embrionario, pero a medida que progresa la
embriogenia queda restringido al endotelio venoso y posteriormente
al endotelio linfático (Kaipainen y col., Cancer Res.,
54:6571-6577, 1994; Kaipainen y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 9,
3566-3570, 1995). VEGFR-3 se expresa
en las células endoteliales linfáticas de los tejidos adultos. Este
receptor es esencial para el desarrollo vascular durante la
embriogenia.
Se ha demostrado la función esencial y específica
en la vasculogenia, angiogenia y/o linfangiogenia de
VEGFR-1, VEGFR-2,
VEGFR-3, Tie y Tie/Tek mediante mutaciones dirigidas
que inactivan estos receptores en embriones de ratón. La alteración
de los genes de VEGFR produce el desarrollo aberrante de la
vasculatura, lo que da lugar a la muerte del embrión hacia la mitad
de la gestación. El análisis de los embriones que son portadores de
un gen VEGFR-1 completamente inactivado indica que
este receptor es necesario para la organización funcional del
endotelio (Fong y col., Nature,
376:66-70, 1995). Sin embargo, la deleción
del dominio tirosina cinasa intercelular de VEGFR-1
genera ratones viables con una vasculatura normal (Hiratsuka y col.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
95:9349-9354, 1998). Aún se deben explicar
las razones subyacentes a estas diferencias, aunque indican que no
es necesaria la señalización del receptor a través de la tirosina
cinasa para la función adecuada de VEGFR-1. El
análisis de ratones homocigotos con alelos inactivados de
VEGFR-2 indica que este receptor es necesario para
la proliferación de las células endoteliales, hematopoyesis y
vasculogenia (Shalaby y col., Nature,
376:62-66, 1995; Shalaby y col., Cell,
89:981-990, 1997). La inactivación dirigida
de las dos copias del gen VEGFR-3 en ratones da
lugar a la formación de vasos sanguíneos defectuosos que se
caracterizan por unos vasos organizados grandes con organización
anómala y con una luz defectuosa, lo que da lugar a acumulación de
líquido en la cavidad pericárdica y a insuficiencia cardiovascular
el día 9,5 después del coito (Dumont y col., Science,
282:946-949, 1998). De acuerdo con estos
hallazgos se ha propuesto que es necesario VEGFR-3
para la maduración de las redes vasculares primarias para que se
conviertan en vasos sanguíneos de mayor tamaño. Sin embargo, no se
pudo estudiar en estos ratones la función de VEGFR-3
en el desarrollo de la vasculatura linfática porque los embriones
murieron antes de que apareciera el sistema linfático. Sin embargo,
se asume que VEGFR-3 participa en el desarrollo de
la vasculatura linfática y de la linfangiogenia dada su expresión
específica en las células endoteliales linfáticas durante la
embriogenia y la vida adulta. Esto está apoyado por el hallazgo de
que la expresión ectópica de VEGF-C, un ligando de
VEGFR-3, en la piel de ratones transgénicos de lugar
a la proliferación de las células endoteliales linfáticas y al
aumento del tamaño vascular en ratones. Además esto indica que
VEGF-C puede tener una función primaria en el
endotelio linfático y una función secundaria en la angiogenia y en
la regulación de la permeabilidad, que comparte con VEGF (Joukov y
col., EMBO J, 15:290-298, 1996).
Además, se han identificado proteínas similares a
VEGF que son codificadas por cuatro cepas diferentes del virus orf.
Ésta es la primera vez que se ha descrito que un virus codifica una
proteína parecida a VEGF. Las dos primeras cepas son NZ2 y NZ7 y se
describen en Lyttle, J. Virol.,
68:84-92, 1994. Una tercera es D1701 y está
descrita en Meyer y col., EMBO J.,
18:363-374, 1999. La cuarta cepa es NZ10, y
se describe en la Solicitud de Patente Internacional
PCT/US99/25.869. Se mostró que estas proteínas víricas parecidas a
VEGF se unen al VEGFR-2 del endotelio del huésped
(oveja/cabra/ser humano), y que esta unión es importante para el
desarrollo de la infección (Meyer y col., EMBO J.,
18:363-374, 1999; Ogawa y col., J. Biol.
Chem., 273: 31.273-31.282, 1988; y
Solicitud de Patente Internacional PCT/US99/25.869). Estas proteínas
muestran similitud de la secuencia de aminoácidos con VEGF y entre
sí.
El virus ORF es un tipo de especie de del género
parapoxvirus que produce una dermatitis pustulosa muy contagiosa en
ovejas y en cabras y que se transmite fácilmente a los seres
humanos. La dermatitis pustulosa inducida por la infección por el
virus orf se caracteriza por dilatación de los vasos sanguíneos,
tumefacción del área local y una marcada proliferación de las
células endoteliales que tapizan los vasos sanguíneos. Estas
características se ven en todas las especies infectadas por el virus
orf y pueden dar lugar a la formación de un crecimiento
pseudotumoral o a un nódulo debido a la replicación del virus en las
células de la epidermis. Generalmente las infecciones por el virus
orf se resuelven en unas pocas semanas, aunque se ven infecciones
graves que no se resuelven sin intervención quirúrgica en personas
que tienen una alteración de la inmunidad.
Hay un gran interés en el desarrollo de agentes
farmacológicos que puedan antagonizar las acciones mediadas por el
receptor de los VEGF (Martiny-Baron y Marme,
Curr. Opin. Biotechnol. 6:675-680,
1995). Se ha mostrado que los anticuerpos monoclonales frente a VEGF
suprimen el crecimiento tumoral in vivo inhibiendo la
angiogenia asociada al tumor (Kim y col., Nature,
362,841-844, 1993). Se han observado efectos
inhibidores similares sobre el crecimiento tumoral en sistemas
modelo que se originan por la expresión de ARN no codificador de
VEGF (Saleh y col., Cancer Res., 56:
393-41, 1996) o un mutante
dominante-negativo de VEGFR-2
(Millauer y col., Nature,
367:576-579,
1994).
1994).
Sin embargo, los estudios de inhibición con
anticuerpos neutralizantes indicaron que pueden participar otros
factores angiógenos además de VEGF (Kim y col., Nature,
362,841-844, 1993). Además, la actividad de
factores angiógenos diferentes a VEGF en el melanoma maligno vine
indicada por el hallazgo de que no todos los melanomas expresan VEGF
(Issa, R. y col., Lab. Invest.,
79:417-425, 1999).
Actualmente se están aclarando las funciones
biológicas de los diferentes miembros de la familia VEGF. Tienen
particular interés las propiedades de VEGF-D y de
VEGF-C. Estas proteínas se unen tanto a
VEGFR-2 como a
VEGFR-3, que están localizados en las células endoteliales vasculares y linfáticas, respectivamente, y están relacionadas entre sí en su estructura primaria (identidad de aminoácidos de 48%). Ambos factores son mitógenos para las células endoteliales in vitro. Recientemente se ha mostrado que VEGF-C es angiógeno en el modelo de córnea de ratón y en la membrana corioalantoidea aviar (Cao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14.381-14.394, 1998), y puede inducir la angiogenia en el contexto de la isquemia tisular (Witzenbichler y col., Am. J. Pathol., 153:381-394, 1998). Además, VEGF-C estimula la linfangiogenia en la membrana corioalantoidea aviar (Oh y col., Dev. Biol., 188,96-109, 1997) y en un modelo de ratón transgénico (Jeltsch y col., Science, 276:1423-1425, 1997). Se mostró que VEGF-D era angiógeno en la córnea de conejo (Marconcini y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:9671-9676, 1999). Todavía no se ha descrito la capacidad linfangiógena de VEGF-D; sin embargo, puesto que VEGF-D, al igual que VEGF-C, se une a VEGFR-3, que es un receptor que se piensa que actúa en la señalización de la linfangiogenia (Taipale y col., Curr. Topics Micro. Immunol., 237:85-96, 1999) y lo activa, es muy probable que VEGF-D sea linfangiógeno. VEGF-D y VEGF-C pueden tener una importancia particular en la malignidad de los tumores, puesto que las metástasis se pueden diseminar a través de los vasos sanguíneos o de los vasos linfáticos; por lo tanto, las moléculas que estimulan la angiogenia o la linfangiogenia podrían contribuir a la formación de neoplasias malignas. Ya se ha mostrado que esto ocurre así en el caso de VEGF. Se debe señalar que la expresión del gen de VEGF-D es inducida por pEFBOSVGEGF-Fos, un factor de transcripción que se sabe que es importante para el desarrollo de neoplasias (Orlandini y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:11.675-11.680, 1996). Se especula que el mecanismo mediante el cual pEFBOSVGEGF-Fos contribuye a la formación de neoplasias es la activación de genes que codifican factores angiógenos. Las células tumorales deficitarias en pEFBOSVGEGF-Fos no experimentan progresión maligna, probablemente debido a la incapacidad de inducir la angiogenia (Saez y col., Cell, 82:721-732, 1995). Esto indica la existencia de un factor
angiógeno activado por pEFBOSVGEGF-Fos durante la progresión tumoral.
VEGFR-3, que están localizados en las células endoteliales vasculares y linfáticas, respectivamente, y están relacionadas entre sí en su estructura primaria (identidad de aminoácidos de 48%). Ambos factores son mitógenos para las células endoteliales in vitro. Recientemente se ha mostrado que VEGF-C es angiógeno en el modelo de córnea de ratón y en la membrana corioalantoidea aviar (Cao y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:14.381-14.394, 1998), y puede inducir la angiogenia en el contexto de la isquemia tisular (Witzenbichler y col., Am. J. Pathol., 153:381-394, 1998). Además, VEGF-C estimula la linfangiogenia en la membrana corioalantoidea aviar (Oh y col., Dev. Biol., 188,96-109, 1997) y en un modelo de ratón transgénico (Jeltsch y col., Science, 276:1423-1425, 1997). Se mostró que VEGF-D era angiógeno en la córnea de conejo (Marconcini y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:9671-9676, 1999). Todavía no se ha descrito la capacidad linfangiógena de VEGF-D; sin embargo, puesto que VEGF-D, al igual que VEGF-C, se une a VEGFR-3, que es un receptor que se piensa que actúa en la señalización de la linfangiogenia (Taipale y col., Curr. Topics Micro. Immunol., 237:85-96, 1999) y lo activa, es muy probable que VEGF-D sea linfangiógeno. VEGF-D y VEGF-C pueden tener una importancia particular en la malignidad de los tumores, puesto que las metástasis se pueden diseminar a través de los vasos sanguíneos o de los vasos linfáticos; por lo tanto, las moléculas que estimulan la angiogenia o la linfangiogenia podrían contribuir a la formación de neoplasias malignas. Ya se ha mostrado que esto ocurre así en el caso de VEGF. Se debe señalar que la expresión del gen de VEGF-D es inducida por pEFBOSVGEGF-Fos, un factor de transcripción que se sabe que es importante para el desarrollo de neoplasias (Orlandini y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:11.675-11.680, 1996). Se especula que el mecanismo mediante el cual pEFBOSVGEGF-Fos contribuye a la formación de neoplasias es la activación de genes que codifican factores angiógenos. Las células tumorales deficitarias en pEFBOSVGEGF-Fos no experimentan progresión maligna, probablemente debido a la incapacidad de inducir la angiogenia (Saez y col., Cell, 82:721-732, 1995). Esto indica la existencia de un factor
angiógeno activado por pEFBOSVGEGF-Fos durante la progresión tumoral.
Como se muestra en la Figura 1, la forma
intracelular predominante de VEGF-D es un propéptido
homodimérico que está formado por el dominio de homología de
VEGF-PDFG (VHD) y los propéptidos N- y
C-terminales, y tiene la secuencia de ID. SEC. Nº 2.
Después de su secreción este polipéptido se escinde
proteolíticamente (Stacker, S.A., y col., J. Biol. Chem.,
274:32.127-32.136, 1999). El procesado
proteolítico (en las posiciones que se señalan con cabezas de flecha
negras) da lugar a formas parcialmente procesadas y a una forma
madura y totalmente procesada que está formada por dímeros de VHD.
El VHD, que tiene la secuencia de ID. SEC. Nº 3 (es decir, residuos
93 a 201 del VEGF-D completo), contiene puntos de
unión tanto para VEGFR-2 como para
VEGFR-3. La forma madura se une tanto a
VEGFR-2 como a VEGFR-3 con una
afinidad mucho mayor que la forma no procesada (Stacker, S.A., y
col., J. Biol. Chem.,
274:32.127-32.136, 1999).
No se ha estudiado la localización de la proteína
VEGF-D en los cánceres humanos debido a la ausencia
de anticuerpos específicos frente a VHD o frente a
VEGF-D. Los anticuerpos frente a los propéptidos N-
y C-terminales son inadecuados porque estas regiones
se escinden del VHD bioactivo y se localizarían en un lugar
diferente al VHD (Stacker, S.A., y col., J. Biol. Chem.,
274:32.127-32.136, 1999).
La invención se refiere en general a medicamentos
para tratar y aliviar diversos cánceres.
Según un primer aspecto, la presente invención
proporciona un medicamento para tratar un organismo que sufre una
enfermedad neoplásica que se caracteriza por la expresión de
VEGF-D por un tumor seleccionado de carcinoma ductal
de mama, carcinoma epidermoide, tumores de próstata y cáncer de
endometrio.
Los antagonistas de VEGF-que
pueden inhibir la expresión de VEGF-D, como con el
uso de una composición que comprende un ácido nucleico no
codificador o ADN de triple hebra que codifica
VEGF-D.
Los antagonistas de VEGF-que
también pueden inhibir la actividad de VEGF-D, como
con el uso de compuestos que comprenden anticuerpos y/o inhibidores
competitivos o no competitivos de la unión de VEGF-D
tanto en la formación de dímeros como en la unión al receptor. Estos
antagonistas de VEGF-D incluyen un polipéptido
modificado de VEGF-D, como se describe más adelante,
que tiene la capacidad de unirse a VEGF-D e impedir
su unión a los receptores de VEGF-D, o que tiene la
capacidad de unirse a los receptores de VEGF-D, pero
que no puede estimular la proliferación, diferenciación, migración o
supervivencia de las células endoteliales. También se pueden usar
pequeñas moléculas que inhiben VEGF-D,
VEGFR-2 o VEGFR-3 y anticuerpos
dirigidos frente a VEGF-D, VEGFR-2 o
VEGFR-3.
Se contempla que algunos polipéptidos modificados
de VEGF-D tendrán la capacidad de unirse a los
receptores de VEGF-D de las células que incluyen,
aunque no se limitan a ellas, células endoteliales, células del
tejido conectivo, miofibroblastos y/o células mesenquimatosas, pero
que serán incapaces de estimular la proliferación, diferenciación,
migración, motilidad o supervivencia celular o de inducir
proliferación vascular, formación del tejido conectivo o curación de
las heridas. Se espera que estos polipéptidos modificados puedan
actuar como inhibidores competitivos o no competitivos de los
polipéptidos VEGF-D y de los factores de crecimiento
de la familia PDFG/VEGF, y que sean útiles en situaciones en las que
es deseable la prevención o la reducción de la acción del
polipéptido VEGF-D o de los factores de crecimiento
de la familia PDFG/VEGF. Así, estas variantes del polipéptido
VEGF-D que se unen al receptor pero que no son
mitógenos, no inducen a diferenciación, no inducen la migración, no
inducen la motilidad, no promueven la supervivencia, no promueven la
formación de tejido conectivo, no inducen la curación de las heridas
y no inducen la proliferación vascular también están en el ámbito de
la invención, y se denominan en la presente solicitud "variante de
unión al receptor pero por lo demás inactiva". Como
VEGF-D forma un dímero para activar sus receptores,
se contempla que un monómero comprende la "variante de unión al
receptor pero por lo demás inactiva" del polipéptido
VEGF-D arriba mencionada y un segundo monómero
comprende un VEGF-D de tipo natural o un factor de
crecimiento de tipo natural de la familia PDFG/VEGF. Así, estos
dímeros se pueden unir a su correspondiente receptor pero no pueden
inducir la señalización corriente
abajo.
abajo.
También se contempla que hay otros polipéptidos
VEGF-D modificados que pueden impedir la unión de un
polipéptido VEGF-D de tipo natural o un factor de
crecimiento de tipo natural de la familia PDFG/VEGF a su
correspondiente receptor en las células que incluyen, aunque no
están limitadas a ellas, células endoteliales, células del tejido
conectivo (como fibroblastos), miofibroblastos y/o células
mesenquimatosas. Así, estos dímeros serán incapaces de estimular la
proliferación, diferenciación, migración o supervivencia de las
células endoteliales y de inducir la permeabilidad vascular, y/o de
estimular la proliferación y/o la diferenciación y/o la motilidad de
las células del tejido conectivo, de los miofibroblastos o de las
células mesenquimatosas. Se espera que estos polipéptidos
modificados puedan actuar como inhibidores competitivos o no
competitivos de VEGF-D o de un factor de crecimiento
de la familia PDFG/VEGF, y que sean útiles en situaciones en las que
es deseable la prevención o la reducción de la acción de
VEGF-D o de un factor de crecimiento de la familia
PDFG/VEGF. Esas situaciones incluyen el remodelado tisular que tiene
lugar durante la invasión de las células tumorales en una población
celular mediante formación de un tumor primario o metastásico. Así,
estas variantes de factor de crecimiento VEGF-D que
se unen al factor de crecimiento VEGF-D o a un
factor de crecimiento de la familia PDFG/VEGF pero que no son
mitógenos, no inducen a diferenciación, no inducen la migración, no
inducen la movilidad, no promueven la supervivencia, no promueven el
tejido conectivo, no inducen la curación de las heridas y no inducen
la proliferación vascular también están en el ámbito de la
invención, y en esta solicitud se denominan "variantes formadoras
del dímero del factor de crecimiento VEGF-D pero por
lo demás inactivas o que producen interferencia".
Las posibles formas modificadas del polipéptido
VEGF-D se pueden preparar dianizando regiones
esenciales del polipéptido VEGF-D para su
modificación. Se espera que estas regiones esenciales caigan dentro
del dominio de homología PDFG/VEGF altamente conservado (VHD). En
particular, los factores de crecimiento de la familia PDFG/VEGF,
incluyendo VEGF, son diméricos, y VEGF, VEGF-B,
VEGF-C, VEGF-D, PIGF,
PDFG-A y PDFG-B muestran la
conservación completa de ocho residuos de cisteína en el VHD
(Olofsson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
93:2576-2581, 1996; Joukov y col., EMBO
J, 15:290-298, 1996). Se piensa que estas
cisteínas participan en la formación de puentes disulfuro
intramoleculares e intermoleculares. Además, hay más residuos de
cisteína muy conservados, aunque no completamente, en los dominios
C-terminales. Los bucles 1, 2 y 3 de cada subunidad
VHD, que se forman mediante la formación de puentes disulfuro
intramoleculares, participan en la unión a los receptores de los
factores de crecimiento de la familia PDFG/VEGF (Andersson y col.,
Growth Factors, 12:159-164, 1995). Se
puede estudiar fácilmente la capacidad de los polipéptidos
modificados de inhibir la actividad biológica de
VEGF-D mediante procedimientos rutinarios de ensayos
de la actividad como el ensayo de proliferación de las células
endotelia-
les.
les.
Los antagonistas de VEGF-D útiles
en la invención también pueden incluir moléculas que comprenden
polipéptidos que corresponden a los dominios de unión a
VEGF-D de VEGFR-2 (Klk1) o de
VEGFR-3 (Flt4). Por ejemplo, las proteínas de fusión
a IgG solubles que describen Achen y col., Proc Natl Acad Sci
USA, 95:548-553, 1998, que contienen los
dominios extracelulares del VEGFR-2 humano y de
VEGFR-3 humano y que se unen a
VEGF-D\DeltaN\DeltaC se podrían usar de manera
adecuada como antagonistas de VEGF-D.
También se pueden producir medicamentos para
tratar y aliviar varios cánceres dianizando un tumor que expresa
VEGF-D, VEGFR-2 y/o
VEGFR-3 para conseguir su muerte. Esto supondría el
acoplamiento de un agente fármaco citotóxico a un polipéptido de la
invención, un anticuerpo dirigido frente a VEGF-D,
VEGFR-2 VEGFR-3 o una pequeña
molécula dirigida frente a VEGF-D,
VEGFR-2 o VEGFR-3, a fin de matar un
tumor que expresa VEGF-D, VEGFR-2
y/o VEGFR-3. Esos fármacos citotóxicos incluyen,
aunque no están limitadas a ellas, toxinas de plantas (por ejemplo,
cadena A de ricina, saporina), toxinas bacterianas o fúngicas (por
ejemplo, toxina diftérica) o radionucleótidos (por ejemplo, astato
211, bismuto 212, ytrio 90, yodo 131, tecnecio 99), fármacos
alquilantes (por ejemplo, clorambucil), fármacos antimitóticos (por
ejemplo, alcaloides de la vinca) y fármacos que producen
intercalación del ADN (por ejemplo, adriamicina).
Los polipéptidos, antagonistas de
VEGF-D o anticuerpos que inhiben la actividad
biológica de VEGF-D también se pueden emplear en
combinación con sales no tóxicas farmacéuticamente aceptables de los
mismos, y un vehículo o un adyuvante sólido o líquido
farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica preferida
inhibirá una actividad biológica inducida por al menos
VEGF-D o interferirá con la misma.
Los ejemplos de un vehículo o un adyuvante de
este tipo incluyen, aunque no están limitados a ellos, suero salino
tamponado, solución de Ringer, aceite mineral, talco, almidón de
maíz, gelatina, lactosa, sacarosa, celulosa microcristalina, caolín,
manitol, fosfato dicálcico, cloruro sódico, ácido alginoico,
dextrosa, agua, glicerol, etanol, espesantes, estabilizantes,
agentes dispersantes y combinaciones de los mismos. Esas
composiciones pueden estar en forma de soluciones, suspensiones,
comprimidos, cápsulas, cremas, pomadas, elixires, jarabes, obleas,
ungüentos u otras formas convencionales. Por supuesto, se puede
ajustar la formulación según principios conocidos para adecuarse al
modo de administración. Las composiciones que comprenden un péptido
de la invención contendrán desde aproximadamente 0,1% a 90% en peso
del compuesto activo, y más generalmente desde aproximadamente 10%
a
30%.
30%.
La dosis y la vía de administración dependerán de
la naturaleza del paciente y de la enfermedad que se va a tratar, y
estarán a la discreción del médico o veterinario responsable. Las
vías adecuadas incluyen oral, inyección subcutánea, intramuscular,
intraperitoneal o intravenosa, administración parenteral, aplicación
tópica, implantes, etcétera. Por ejemplo, se administra una cantidad
eficaz de un péptido o anticuerpo de la invención a un organismo que
necesita el mismo en una dosis entre 0,1 y 100 mg/kg de peso
corporal, y más preferentemente entre 1 y 10 mg/kg de peso corporal.
Para los anticuerpos humanizados, que típicamente muestran una
semivida circulante larga, se contempla específicamente la
administración a intervalos que van desde una vez al día a una vez
al mes, y más preferentemente una vez a la semana o una vez cada dos
semanas o una vez cada tres semanas. La monitorización de la
progresión del tratamiento, de los efectos adversos del paciente y
de las concentraciones de anticuerpos circulantes proporcionará una
guía adicional del régimen posológico óptimo. Los datos de ensayos
clínicos publicados y en realización para otros tratamientos
antineoplásicos basados en anticuerpos (por ejemplo,
anti-HER-2, receptor
anti-EGF) también proporcionan una guía sobre el
régimen posológico útil. La aplicación tópica de
VEGF-D puede ser usada de manera análoga a VEGF.
Claramente se podrá comprender que para los
objetivos de esta especificación la frase "VEGF-D
totalmente procesado" se refiere a la forma madura del
polipéptido VEGF-D, es decir, el dominio de
homología de VEGF (VHD), que tiene la secuencia ID. SEC. Nº: 3, que
carece de los propéptidos N- y C-terminales. La
frase "forma procesada proteolíticamente de
VEGF-D" se refiere a un polipéptido
VEGF-D que carece del propéptido N- y/o
C-terminal, y la fase "VEGF-D no
procesado" se refiere a un polipéptido VEGF-D
completo que tiene la secuencia ID. SEC. Nº: 2 y que tiene los
propéptidos N-y C-terminales.
El polipéptido VEGF-D completo
que tiene la secuencia ID. SEC. Nº: 2 puede estar opcionalmente
unido al péptido FLAG®. Cuando el péptido VEGF-D
completo está unido a FLAG®, en la presente solicitud el fragmento
se denomina
VEGF-D-FULL-N-FLAG.
Un fragmento preferido de VEGF-D es la porción de
VEGF-D desde el residuo del aminoácido 93 al residuo
del aminoácido 201 (es decir, el VHD (ID. SEC. Nº: 3)),
ocasionalmente unido al péptido FLAG®. Cuando fragmento está unido a
FLAG®, el fragmento se denomina en esta solicitud VEGF-
D\DeltaN\DeltaC.
D\DeltaN\DeltaC.
Se debe entender que la expresión "actividad
biológica de VEGF-D" se refiere a la capacidad de
estimular una o más de la proliferación, diferenciación, migración o
supervivencia de las células endoteliales o la permeabilidad
vascular.
Claramente se debe comprender que los
polipéptidos que comprenden sustituciones, inserciones o deleciones
conservadoras, pero que siguen manteniendo la actividad biológica de
VEGF-D, están en el ámbito de la invención. Las
personas expertas en la materia conocerán procedimientos que se
pueden usar fácilmente para generar esos polipéptidos, por ejemplo
el uso de mutagenia dirigida, o escisión y ligadura enzimáticas
específicas. La persona experta también sabrá que los compuestos
péptidomiméticos o los compuestos en los que uno o más residuos de
aminoácidos son sustituidos por un aminoácido que no aparece en la
naturaleza o por un análogo de un aminoácido pueden conservar los
aspectos necesarios de la actividad biológica de
VEGF-D. Esos compuestos se pueden hacer y estudiar
fácilmente mediante procedimientos conocidos en la materia, y
también están en el ámbito de la inven-
ción.
ción.
Preferentemente cuando se usa la sustitución de
un aminoácido, esta sustitución es conservadora, es decir, un
aminoácido es sustituido por otro de tamaño similar y con
propiedades de carga similares.
Como se usa en la presente solicitud, el término
"sustitución conservadora" se refiere a la sustitución de un
residuo de aminoácido por otro residuo biológicamente similar. Los
ejemplos de sustituciones conservadoras incluyen la sustitución de
un residuo hidrófobo como isoleucina, valina, leucina, alanina,
cisteína, glicina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina,
norleucina o metionina por otro, o la sustitución de un residuo
polar por otro, como la sustitución de arginina por lisina, ácido
glutámico por ácido aspártico, o glutamina por asparagina, y
similares. Los aminoácidos hidrófilos neutros que se pueden
sustituir entre sí incluyen asparagina, glutamina, serina y
treonina. El término "sustitución conservadora" también incluye
el uso de un aminoácido sustituido en lugar de un aminoácido
original no sustituido.
Como tal, se debe comprender que en el contexto
de la presente invención en la materia se reconoce que la
sustitución conservadora es la sustitución de un aminoácido por otro
aminoácido que tiene propiedades similares. En la siguiente Tabla A,
de WO97/09433, se presentan ejemplos de sustituciones
conservadoras.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ Características de la cadena lateral \+ \hskip3.5cm \+ Aminoácido\cr Alifática\+\+\cr No polar \+ \+ G A P\cr \+ \+ I L V\cr Polar - sin carga \+ \+ C S T M\cr \+ \+ N Q\cr Polar - cargada \+ \+ D E\cr \+ \+ K R\cr Aromática \+ \+ H F W Y\cr Otra \+ \+ M Q D E\cr}
De manera alternativa, los aminoácidos
conservadores se pueden agrupar como describe Lehninger
(Biochemistry, 2ª edición; Worth Publishers, Inc., NY:NY (1976)),
según se presenta en la siguiente Tabla B.
\newpage
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+\hfil#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ Características de la cadena lateral \+ \hskip3.5cm \+ Aminoácido\cr No polar (hidrófobo)\+\+\cr a. Alifática: \+ \+ A L I V P\cr b. Aromática: \+ \+ F W\cr c. Que contiene azufre: \+ \+ M\cr d. Indefinida: \+ \+ G\cr Polar sin carga\+\+\cr a. Hidroxilo: \+ \+ S T Y\cr b. Amidas: \+ \+ N Q\cr c. Sulfihidrilo: \+ \+ C\cr d. Indefinida: \+ \+ G\cr Con carga positiva (básica): \+ \+ K R H\cr Con carga negativa (ácida): \+ \+ D E\cr}
En la siguiente Tabla C se presentan ejemplos de
sustituciones conservadoras.
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Las posibles formas variantes del polipéptido
VEGF-D que se pueden deber a ayuste alternativo, al
igual que se sabe que ocurre con VEGF y con VEGF-D,
y las variantes alélicas naturales de la secuencia de ácidos
nucleicos que codifica VEGF-D, están incluidas
dentro del ámbito en el ámbito de la invención. Las variantes
alélicas son bien conocidas en la materia, y representan formas
alternativas de una secuencia de ácidos nucleicos que comprenden
sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos, pero que
no producen ninguna alteración sustancial de la función del
polipéptido codificado.
Esas formas variantes de VEGF-D
se pueden preparar dianizando regiones no esenciales del polipéptido
VEGF-D para su modificación. Se espera que estas
regiones no esenciales estén fuera de las regiones muy conservadas.
En particular, los factores de crecimiento de la familia PDFG/VEGF,
incluyendo VEGF, son diméricos, y VEGF, VEGF-B,
VEGF-C, VEGF-D, PIGF,
PDFG-A y PDFG-D muestran la
conservación completa de ocho residuos de cisteína en los dominios
N-terminales, es decir, los dominios similares a
PDFG/VEGF (Olofsson, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
93:2576-2581, 1996). Se piensa que estas
cisteínas participan en la formación de puentes disulfuro
intramoleculares e intermoleculares. Además, hay otros residuos de
cisteína muy conservados, aunque no completamente, en los dominios
C-terminales. Los bucles 1, 2 y 3 de cada subunidad
VHD, que están formados por puentes disulfuro intramoleculares,
participan en la unión a los receptores de la familia PDFG/VEGF de
factores de crecimiento (Andersson y col., Growth Factors,
12:159-164, 1995).
Por lo tanto, las personas expertas en la materia
saben bien estos residuos de cisteína se deben conservar en
cualquier forma variante propuesta, y que los puntos activos
presentes en los bucles 1, 2 y 3 también se deben conservar. Sin
embargo, se puede esperar que otras regiones de la molécula tengan
una menor importancia para su función biológica, y por lo tanto
ofrecen dianas adecuadas para su modificación. Se puede estudiar
fácilmente la capacidad de los polipéptidos modificados de mostrar
la actividad biológica de VEGF-D mediante los
procedimientos de ensayos rutinarios de actividad como el ensayo de
proliferación de células endoteliales.
Se ha mostrado que hay una intensa señal de
VEGF-D en un subconjunto de células hematopoyéticas.
Estas células fluyen hacia las regiones periféricas de algunos
tumores en un tipo de respuesta inflamatoria. Por lo tanto, la
inhibición de este proceso sería útil cuando sea deseable impedir
esta respuesta inflamatoria.
Según otro aspecto de la invención, la invención
se refiere a un medicamento para tratar un organismo, por ejemplo un
mamífero, que sufre una enfermedad neoplásica que se caracteriza por
la expresión de VEGF-D por un tumor que se
selecciona de carcinoma ductal de mama, carcinoma epidermoide,
cáncer de próstata o cáncer de endometrio, que comprende la
administración de una cantidad eficaz de un antagonista de
VEGF-D en la vecindad de dicho tumor para impedir la
unión de VEGF-D a su receptor correspondiente. Si se
desea, se puede administrar simultáneamente un fármaco citotóxico
con un antagonista de VEGF-D. Un antagonista
preferido de VEGF-D es un anticuerpo monoclonal que
se une específicamente a VEGF-D y bloquea la unión
de VEGF-D al receptor 2 de VEGF o al receptor 3 de
VEGF, especialmente un anticuerpo que se une al dominio de homología
de VEGF de VEGF-D.
Se comprenderá claramente que para los objetivos
de esta especificación la expresión "que comprende" significa
"que incluye pero que no está limitado a". Se aplica el
correspondiente significado a la palabra "comprende".
La Figura 1 es la representación esquemática
del procesado de VEGF-D.
La Figura 2 muestra la especificidad del AcMo
4A5 por el dominio de homología de VEGF/PDFG (VHD) del
VEGF-D humano, según se evalúa mediante análisis de
inmunotransferencia Western.
La Figura 3 muestra autorradiografías obtenidas
después de dos días de exposición a secciones de tejido de ratón de
15,5 días post-coito hibridadas con ARN codificador
y no codificador de VEGF-D.
Las Figuras 4A-4D muestran los
resultados del análisis de la distribución del ARNm de
VEGF-D en el embrión de ratón a los 15,5 días
después del coito mediante hibridación in situ.
Las Figuras 5A-5F muestran la
localización de VEGF-D en el carcinoma epidermoide
pulmón.
Las Figuras 6A-6F muestran la
localización de VEGF-D en el carcinoma ductal de
mama in situ.
La Figura 7 muestra la localización de
VEGF-D en el adenocarcinoma de endometrio in
situ.
La Figura 8 muestra los resultados del análisis
de tumores en ratones SCID que se producen mediante la inyección de
células 293 progenitoras no transfectadas (denominadas "293") y
de células 293 transfectadas con un vector de expresión que codifica
VEGF-D-FULL-N-FLAG
(denominadas "VEGF-D-293").
La Figura 9 muestra el aumento de la velocidad
de crecimiento en tumores de células procedentes de células
VEGF-D\DeltaN\DeltaC.
La Figura 10 muestra un tumor producido por
células VEGF-D\DeltaN\DeltaC.
La Figura 11 muestra un tumor normal.
La Figura 12 muestra disminución de la
velocidad de crecimiento en tumores procedentes de células
VEGF-D\DeltaN\DeltaC.
A fin de detectar el dominio de homología de
VEGF/PDFG (VHD) en lugar de los propéptidos N- y
C-terminal, se cultivaron en ratones anticuerpos
monoclonales frente a la forma madura de VEGF-D
(residuos 93 a 201 del VEGF-D completo (ID. SEC. Nº:
2), es decir, con eliminación de las regiones N- y
C-terminal). Se amplificó un fragmento de ADN que
codifica los residuos 93 a 201 mediante la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) con ADN polimerasa Pfu, usando como
plantilla un plásmido que comprende el ADNc del
VEGF-D humano completo (ID. SEC. Nº:1). El fragmento
de ADN amplificado, cuya corrección se confirmó mediante secuenciado
de los nucleótidos, se insertó posteriormente en el vector de
expresión pEFBOSSFLAG (regalo de la Dra. Clare McFarlane y del
Walter and Eliza Hall Institute for Medical Research (WEHI),
Melbourne, Australia) para obtener un plásmido denominado
pEFBOSVGEGF-D\DeltaN\DeltaC. El vector
pEFBOSVGEGF contiene ADN y codifica la secuencia de señales para la
secreción de proteínas por el gen de la
interleucina-3(IL-3) y el
octapéptido FLAG® (Sigma-Aldrich). El octapéptido
FLAG® se puede reconocer con anticuerpos disponibles comercialmente
como el anticuerpo monoclonal M2 (Sigma-Aldrich). El
fragmento VEGF-D PCR se insertó en el vector de modo
que la secuencia de la señal de IL-3 estaba
inmediatamente corriente arriba del octapéptido FLAG®, que a su vez
estaba inmediatamente corriente arriba de la secuencia truncada de
VEGF-D. Las tres secuencias estaban en el mismo
marco de lectura, de modo que la traducción del ARNm que se producía
por la transfección de
pEFBOSVGEGF-D\DeltaN\DeltaC en células de
mamífero daría lugar a una proteína que tendría la secuencia de la
señal de IL-3 en su extremo
N-terminal, seguida del octapéptido FLAG® y de la
secuencia del VEGF-D truncado. La escisión de la
secuencia de señal y la posterior secreción de la proteína desde la
célula daría lugar a un polipéptido VEGF-D que está
marcado con el octapéptido FLAG® adyacente al extremo
N-terminal. Se purificó el
VEGF-D\DeltaN\DeltaC mediante cromatografía de
afinidad anti-FLAG® a partir del medio de células
COS que se habían transfectado de manera transitoria con el plásmido
pEFBOSVGEGF-D\DeltaN\DeltaC. (Véase el Ejemplo 9
de la Solicitud de Patente Internacional número PCT/US97/14696).
Se usó el
VEGF-D\DeltaN\DeltaC purificado para inmunizar
ratones hembra Balb/C el día 85 (por vía intraperitoneal), 71
(intraperitoneal) y 4 (intravenosa) antes de la recogida de las
células esplénicas de los ratones inmunizados y la posterior fusión
de estas células esplénicas con células de mieloma murino
P3X63Ag8.653 (NS-1). Para las dos primeras
inmunizaciones se inyectaron aproximadamente 10 \mug de
VEGF-D\DeltaN\DeltaC en una mezcla 1:1 de STF y
complemento de TiterMax (#R-1 Research Adjuvant;
CytRx Corp., Norcross, GA), mientras que para la tercera
inmunización se usaron 35 \mug de VEGF-DANAC en
STF.
Se seleccionaron los anticuerpos monoclonales
frente a VEGF-D\DeltaN\DeltaC haciendo cribado
de los hibridomas que tenían
VEGF-D\DeltaN\DeltaC purificado usando un
inmunoensayo enzimático. Brevemente, se recubrieron placas de
microtítulo de 96 pocillos con
VEGF-D\DeltaN\DeltaC, y se añadieron
sobrenadantes de hibridoma y se incubaron durante dos horas a 4ºC,
seguido de seis lavados en STF con Tween 20 al 0,02%. A continuación
se incubó con Ig anti-ratón conjugada con peroxidasa
de rabanito (Bio-Rad, Hercules, CA) durante una hora
a 4ºC. Después del lavado, se reveló el ensayo con el sistema de
sustrato de ácido
2,2'-azino-di(3-etilbenzotiazolinsulfónico)
(ABTS) (Zymed, San VEGF, CA), y se cuantificó el ensayo leyendo la
absorbancia a 450 nm en un lector de placas de múltiples pocillos
(Flow Laboratories MCC/340, McLean, VA). Se seleccionaron seis
anticuerpos para el análisis posterior y se subclonaron dos veces
mediante deglución limitante. Estos anticuerpos se denominaron 2F8,
3C10, 4A5, 4E10, 4H4 y 5F12. Se determinaron los isotipos de los
anticuerpos usando un kit de isotipado Isostrip^{TM} (Boehringer
Mannheim, Indianapolis, IN). Los anticuerpos 2F8, 4A5, 4E10 y 5F12
eran de la clase IgG_{1}, mientras que 4H4 y 3C10 eran de la clase
IgM. Los seis anticuerpos contenían la cadena ligera kappa.
Se cultivaron líneas celulares de hibridoma en
medio DMEM que contenía suero deplecionado de IgG al 5% v/v (Gibco
BRL, Galthesburg, MD), L-glutamina 5 mM, gentamicina
50 \mug/ml e IL-6 recombinante 10 \mug/ml. Los
anticuerpos 2F8, 4A5, 4E10 y 5F12 se purificaron mediante
cromatografía de afinidad usando proteína de
G-Sepharose según las técnicas de Darby, J.
Immunol. Methods., 159:125-129, 1993, y
se evaluó el rendimiento midiendo la absorción a 281 nm.
Se evaluó la especificidad del AcMo 4A5 (que a
partir de ahora se denomina VD1) por el VHD del
VEGF-D humano mediante análisis de transferencia
Western. Los derivados de VEGF-D que se usaron
fueron VEGF-D\DeltaN\DeltaC, formado por los
residuos de los aminoácidos 93 a 201 del VEGF-D
humano marcado en el extremo N-terminal con el
octapéptido FLAG® (Ejemplo 1),
VEGF-D-FULL-N-FLAG,
formado por VEGF-D completo marcado en el extremo
N-terminal con FLAG® (Stacker, S.A., y col., J.
Biol. Chem., 274:32.127-32.136, 1999) y
VEGF-D-CPRO, formado por el
propéptido C-terminal, antes de los residuos de los
aminoácidos 206 a 354, que también se marcó con FLAG® en el extremo
N-terminal. Estas proteínas se expresaron en células
293-EBNA-1, se purificaron mediante
cromatografía de afinidad con el AcMo M2
(anti-FLAG®) (IBI/Kodak, New Haven, CT) usando el
procedimiento que se presenta en Achen y col., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 95:548-553, 1998. Se analizaron
50 ng de
VEGF-D-FULL-N-FLAG
(FM), VEGF-D\DeltaN\DeltaC (\Delta\Delta) y
de VEGF-D-CPRO (CP) purificados
mediante SDS-PAGE (reductora) y mediante
inmunotransferencia Western usando el AcMo VD1 y un AcMo M2
biotinilado como control (el anticuerpo que se usó para la
inmunotransferencia se indica en la parte inferior del panel de la
Figura 2). Los análisis mediante SDS-Page y mediante
inmunotransferencia Western se realizaron como se describe en,
Stacker, S.A., y col., J. Biol. Chem.,
274:32.127-32.136, 1999.
Como se muestra en la Figura 2, la especie
predominante de la muestra de
VEGF-D-FULL-N-FLAG
está formada por VEGF-D no procesado (M_{r}
\sim53 K), VEGF-D parcialmente procesado que
contiene tanto el propéptido N-terminal como el VHD
(\sim31 K) y el propéptido N-terminal (\sim10 K)
(Stacker, S.A., y col., J. Biol. Chem.,
274:32.127-32.136, 1999), todos los cuales se
detectan con el AcMo M2 porque están marcados con el octapéptido
FLAG® (flechas de la izquierda, los números representan M_{r} en K
y los superíndices indican la muestra en la que se detecta la
banda). Del mismo modo, VEFG-D\DeltaN\DeltaC
(\sim21 K.) y VEGF-D-CPRO (dos
bandas de \sim31 y \sim29 K que se originan debido a la
glucosilación diferencial) se detectan con M2 (flechas de la
izquierda) porque estos polipéptidos también están marcados con
FLAG®. VD1 detecta al VEGF-D no procesado, al
VEGF-D parcialmente procesado y al
VEFG-D\DeltaN\DeltaC, pero no al propéptido
N-terminal (\sim10 K) de la preparación de
VEFG-D-FULL-N-FLAG,
ni el propéptido C-terminal de la muestra de
VEGF-D-CPRO (\sim31 y \sim29
K.). Los resultados con
VEFG-D-FULL-N-FLAG
se analizaron con exposiciones largas (L) y cortas (C). Las
posiciones de los marcadores de peso molecular se muestran a la
derecha en la Figura 2.
Así, el AcMo VD1 se une al VEGF-D
no procesado, a las formas parcialmente procesadas que contienen el
VHD y al VEGF-D totalmente procesado, pero no a los
propéptidos N- o C-terminales. Además, el AcMo VD1
fue capaz de producir inmunoprecipitación del
VEFG-D\DeltaN\DeltaC humano nativo, pero no del
VHD del VEGF-C humano
(VEGF-C\DeltaN\DeltaC) (Joukov y col., EMBO
J, 16:3898-3911, 1997) en un inmunoensayo
enzimático que indica que VD1 es específico para
VEGF-D.
Se estudió el patrón de expresión del gen de
VEGF-D mediante hibridación in situ usando
una sonda de ARN no codificador radiomarcada que correspondía a los
nucleótidos 1 a 340 del ADNc de VEGF-D1 de ratón
(ID. SEC. Nº: 4). El ARN no codificador se sintetizó mediante
transcripción in vitro con ARN polimerasa T3 y
[^{35}S]UTP_{\alpha s}. El VEGF-D de
ratón se describe totalmente en la Solicitud de Patente
Internacional PCT/US97/14696 (WO98/07832). Esta sonda de ARN no
codificador se hibridó con secciones de tejido incluidas en parafina
de embriones de ratón el día 15,5 después del coito. Las secciones
marcadas se sometieron a autorradiografía durante dos días. En la
Figura 3 se muestran las autorradiografías resultantes para las
secciones que se hibridaron con el ARN no codificador y con el ARN
codificador complementario (como control negativo). En la Figura 3,
"L" Se refiere al pulmón y "Sk" Se refiere a la piel, y
las dos secciones tisulares que se muestran son secciones seriadas.
Se detectaron señales intensas del ARNm de VEGF-D en
el pulmón en desarrollo y se asociaron a la piel. No se detectaron
señales usando el ARN codificador control.
En las figuras 4A-4D se
hibridaron secciones tisulares sagitales con la sonda de ARN no
codificador de VEGF-D y posteriormente se incubaron
con una emulsión fotográfica, se revelaron y se tiñeron. La
amplificación de las Figuras 4A y 4D es de 40x, para la Figura 4B es
de 200x y para la Figura 4C es de 500x.
En la Figura 4A, la micrografía de campo oscuro
muestra una señal intensa para el ARNm de VEGF-D en
el pulmón (Lu) También se muestran el hígado (Li) y las costillas
(R). La Figura 4B muestra el pulmón a mayor aumento. Esta
micrografía de campo claro muestra un bronquio (Br) y una arteria
bronquial (BA). El perfil negro de un rectángulo señala la región de
la sección que se muestra en la Figura 4C, pero con un mayor
aumento. La Figura 4C muestra las células epiteliales del bronquio
(Ep), las células musculares lisas en desarrollo (SM) que rodean a
la capa de células epiteliales y las células mesenquimatosas (Mes).
Es evidente la abundancia de granos de plata asociados a las células
mesenquimatosas. Así, el análisis microscópico revela que el ARNm de
VEGF-D es abundante en las células mesenquimatosas
del pulmón en desarrollo (Figuras 4A-4C). Por el
contrario, las células epiteliales de los bronquios y de los
bronquíolos son negativas, al igual que las zonas musculares lisas
en desarrollo que rodean a los bronquios. Las células endoteliales
de las arterias bronquiales también son negativas.
En la Figura 4D una micrografía de campo oscuro
muestra el esbozo de una extremidad. Se localizó una señal intensa
inmediatamente debajo de la piel en una región de tejido rica en
fibroblastos y en melanocitos en desarrollo.
Estos resultados indican que
VEGF-D puede atraer el crecimiento de los vasos
sanguíneos linfáticos hacia el pulmón en desarrollo y hacia la
región inmediatamente inferior a la piel.
Se piensa que la neoangiogenia es un indicador
pronóstico útil en el carcinoma no microcítico de pulmón (CNMP)
(Fontanini y col., Clin. Cancer Res.,
3:861-865, 1997). Por lo tanto, se analizó la
localización de VEGF-D en un caso de carcinoma
epidermoide de pulmón mediante inmunohistoquímica (Figuras
5A-5F). Se realizó la inmunohistoquímica usando
anticuerpos frente a la actina alfa del músculo liso (DAKO Corp.,
Carpinteria, CA) para realizar la inmunotinción. El AcMo
anti-VEGF-D que se usó para realizar
la inmunotinción en las Figuras 5A y 5D fue VD1(4A5). La
Figura 5A muestra que VEGF-D se detecta en las
células tumorales que forman una isla en el centro de la
micrografía, en células que tapizan el gran vaso adyacente y en las
células del interior del estroma desmoplásico. El estroma
desmoplásico está indicado por un corchete negro y el recuadro
punteado indica la región que se muestra en la imagen de gran
aumento de la Figura 5D. Las células inmunopositivas del estroma
pueden ser miofibroblastos.
La Figura 5B muestra que se detecta
VEGFR-2 en las células que tapizan el gran vaso. Sin
embargo, estos vasos fueron negativos para VEGFR-3
en este tumor. El recuadro punteado señala la región que se muestra
a mayor aumento en la Figura 5E. La tinción control de una sección
tisular del mismo caso en el que se había preincubado el AcMo frente
a VEGF-D con un exceso molar de 40 veces del VHD del
VEGF-D humano no dio ninguna señal (Figura 5C).
Como se ha mencionado más arriba, las células
inmunopositivas del estroma desmoplásico pueden ser miofibroblastos.
Por lo tanto, se inmunotiñó el estroma desmoplásico usando AcMo
específicos para la actina alfa del músculo liso que detectan los
miofibroblastos. Como se ve en la Figura 5F, el estroma da una
tinción positiva, lo que indica la presencia de miofibroblastos. La
secreción de un factor angiógeno por los componentes del estroma
puede actuar amplificando el estímulo angiógeno que genera el
tumor.
También se analizó la localización de
VEGF-D en el carcinoma ductal de mama in situ
mediante inmunohistoquímica, cuyos resultados se muestran en las
Figuras 6A-6F. Se realizó la inmunohistoquímica
usando AcMo específicos para la actina alfa del músculo liso (DAKO
Corp., Carpinteria, CA), y también se usó para la inmunotinción la
molécula de adhesión plaquetaria/ endotelial (PECAM) (DAKO Corp.,
Carpinteria, CA). El AcMo
anti-VEGF-D que se usó para realizar
la inmunotinción de la Figura 6A era VD1 (4A5).
Como se ve en la Figura 6, se detectó
VEGF-D en células tumorales de los conductos y de
pequeños vasos denominados "en collar" (señalados con cabezas
de flecha negras) inmediatamente adyacentes a la lámina basal de los
conductos llenos de tumor. Los vasos en collar también son positivos
para VEGFR-2 (Figura 6C), VEGFR-3
(figura 6D) y PECAM (Figura 6E), como indican las cabezas de fechas
negras. PECAM es un marcador clásico del endotelio y también se
encuentra en las plaquetas y en los leucocitos. PECAM participa en
la migración de los leucocitos a los focos inflamatorios (Muller y
col., J. Exp. Med, 178:449-460, 1993).
La tinción con anticuerpos frente a PECAM en los vasos en
"collar" ayuda a confirmar que esas estructuras son vasos. El
borde del conducto se identifica mediante la tinción para actina
alfa del músculo liso (Figura 6B), que detecta los miofibroblastos.
La tinción control de una sección tisular seriada que se muestra en
la Figura 6A, en la que se había preincubado el AcMo frente a
VEGF-D con un exceso molar de 40 veces del VHD del
VEGF-D humano no dio ninguna señal (Figura 6F).
Estos hallazgos indican que VEGF-D, secretado por
las células tumorales, podría activar sus receptores en los vasos de
la vecindad, y de esta manera participaría en la atracción del
crecimiento de los vasos en collar en sus posiciones muy cerca de
los conductos. Esto podría ser importante tanto para el crecimiento
de los tumores sólidos como para la diseminación metastásica.
También se detectó VEGF-D en el
adenocarcinoma de endometrio (Figura 7). Se realizó la
inmunohistoquímica usando el AcMo
anti-VEGF-D VD1 (4A5). Se vio una
tinción moderada para VEGF-D en las células
tumorales glandulares (GL), se vio una reactividad muy intensa en
los miofibroblastos del estroma desmoplásico (DM) en el borde
invasivo progresivo del tumor y una intensa reactividad en el
endotelio y en las paredes de los vasos sanguíneos adyacentes
(flechas negras) en el miometrio (Myo). De manera interesante, la
reactividad a VEGF-D fue particularmente intensa en
los miofibroblastos del estroma desmoplásico, lo que indica que las
células tumorales glandulares pueden inducir la expresión de
VEGF-D en estos fibroblastos, que amplificarían el
potencial angiógeno del tumor. Como también se detectó expresión de
VEGF-D en las células del estroma desmoplásico en el
carcinoma de pulmón (Figura 5-A), puede ocurrir que
diversos tumores puedan inducir VEGF-D en los
componentes del estroma. Esto es análogo al pulmón en desarrollo, en
el que las células mesenquimatosas, probablemente precursoras de
fibroblastos, expresan intensamente el gen de
VEGF-D. Por lo tanto, señales de tejidos
embrionarios y de tejidos tumorales pueden inducir la expresión de
VEGF-D en los fibroblastos.
A fin de generar líneas celulares que
sobreexpresan de manera constitutiva derivados de
VEGF-D, se insertaron regiones del ADNc del
VEGF-D humano en el vector de expresión en mamíferos
Apex-3 (Evans y col., Mol. Immunol.,
32:1183-1195, 1995). Este vector se mantiene
episómicamente cuando se transfecta en líneas de células renales
embrionarias humanas 293-EBNA. Para la expresión de
VEGF-D maduro, se insertó la región de
pEFBOSVEGF-D\DeltaN\DeltaC que contenía las
secuencias que codifican la secuencia de la señal de
IL-3, el octapéptido FLAG® y el
VEGF-D maduro en el punto XBai de
Apex-3 (véase el Ejemplo 9 de la Solicitud de
Patente Internacional PCT/US971/14.698) (WO98/07832)). El plásmido
resultante se denominó pVDA-pexD\DeltaN\DeltaC
(Stacker, S.A., y col., J. Biol. Chem.,
274:32.127-32.136, 1999, y véase el Ejemplo 1
de la Solicitud de Patente Internacional PCT/US98/27.373). Se hizo
un constructo similar para la expresión del VEGF-D
completo no procesado marcado en el extremo
N-terminal con FLAG®. En este constructo, el ADN que
codifica la secuencia de la señal de VEGF-D para la
secreción de proteínas había sido eliminada y sustituida por ADN que
codifica la secuencia de la señal de IL-3, seguida
del octapéptido FLAG® y de dos aminoácidos (Thr-Arg)
inmediatamente corriente arriba y en el mismo marco de lectura que
el ADN que codifica los residuos 24-354 del
VEGF-D. Este constructo se denominó
pVDAApexFULL-N-FLAG (Stacker, S.A.,
y col., J. Biol. Chem.,
274:32.127-32.136, 1999, y véase el Ejemplo 1
de la Solicitud de Patente Internacional PCT/US98/27.373). Estos
vectores se transfectaron en células de la línea celular de riñón
embrionario humano 293EBNA-1 por el procedimiento de
fosfato cálcico o con Fugene®, según las instrucciones del
fabricante (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania), y se
seleccionaron transfectantes estables en presencia de DMEM
complementado con higromicina 100 \mug/ml. Posteriormente se
identificaron líneas celulares que expresan concentraciones elevadas
de
VEFG-D-FULL-N-FLAG
y de VEGF-D\DeltaN\DeltaC mediante marcado
metabólico, inmunoprecipitación y análisis de inmunotransferencia
Western (Stacker, S.A., y col., J. Biol. Chem.,
274:32.127-32.136, 1999, y véase el Ejemplo 1
de la Solicitud de Patente Internacional PCT/US98/27.373).
Se inyectaron 2 x 10^{7} células 293
transfectadas o células 293 progenitoras no transfectadas en STF por
vía subcutánea en ratones SCID de 6 a 8 semanas de edad (ARC, Perth,
Australia) por vía subcutánea en la almohadilla grasa mamaria. Se
permitió que los tumores crecieran y se midieron con calibres
digitales, en un periodo de tres semanas. Los experimentos se
interrumpieron después de tres semanas, cuando el primer animal
alcanzó el máximo tamaño que permite el Comité Institucional de
Ética. Se calculó el tamaño del tumor como anchura x longitud x 0,6
x (anchura x longitud)/2.
La Figura 8 muestra los resultados del análisis
de los tumores en ratones SCID producidos por la inyección de
células 293 progenitoras y de células 293 no transfectadas
(denominadas "293") o de células 293 transfectadas con el
constructo que codifica
VEFG-D-FULL-N-FLAG
(denominadas "VEGF-D-293"). Hay
una diferencia significativa entre los tumores procedentes de las
células
293-VEFG-D-FULL-N-FLAG
y los que proceden de las células 293 no transfectadas. Después de
tres semanas el tamaño tumoral medio de los tumores del grupo de
293-VEFG-D-FULL-N-FLAG
fue de 937 \pm 55,5 mm^{3} (media \pm desviación típica, n=8),
en comparación con 136 \pm 230 mm^{3} para las células no
transfectadas (n=8). De manera interesante, los tumores que se
generaron a partir de células 293 transfectadas con un constructo
que codifica VEGF-D\DeltaN\DeltaC no tuvieron un
tamaño significativamente diferente (50 \pm 76 mm^{3}, n=7)
respecto a los que procedían de células 293 no transfectadas.
Además, el aspecto macroscópico de los tumores
procedentes de las células 293 no transfectadas fue el de una
superficie blanca pálida, en comparación con los tumores procedentes
de las células
293-VEFG-D-FULL-N-FLAG,
que tenían un aspecto hemorrágico, y era evidente la presencia de
vasos sanguíneos en todo el tumor.
También se analizaron secciones mediante
inmunohistoquímica con un anticuerpo monoclonal
anti-PECAM (Pharmingen, San Diego, CA), un marcador
de células endoteliales. Las secciones de los tumores que se habían
generado con células
293-VEFG-D-FULL-N-FLAG
demostraron un marcado aumento de la expresión de PECAM en
comparación con los tumores que se habían generado con células
progenitoras 293 no transfectadas. Este análisis confirma la
abundancia mucho mayor de vasos sanguíneos en los tumores que
expresan VEGF-D completo no procesado.
Este experimento indica que la forma no procesada
de VEGF-D es capaz de inducir la angiogenia tumoral
y el crecimiento de un tumor sólido in vivo. De manera
interesante, los tumores procedentes de células que expresan la
forma madura y totalmente procesada de VEGF-D no
mostraron ningún aumento del crecimiento en comparación con las
células progenitoras 293 no transfectadas. Esto indica la
importancia de los propéptidos (N-pro y
C-pro) en el VEGF-D para la
localización o funcionamiento correctos del VHD de
VEGF-D. Una explicación de este resultado es que los
propéptidos participan en la asociación con la matriz, y sólo cuando
el VEGF-D está situado correctamente sobre los
proteoglucanos de sulfato de heparina de la matriz extracelular o de
la superficie celular el factor de crecimiento puede inducir la
angiogenia y/o la linfangiogenia. Una explicación alternativa es que
los propéptidos aumentan la semivida del VHD del
VEGF-D in vivo.
Para determinar si VEGF-D
participa en la angiogenia tumoral, se generaron líneas celulares
293EBNA que expresan VEGF o VEGF-D. Las células
293EBNA normalmente no expresan concentraciones detectables de VEGF,
VEGF-C ni de VEGF-D, los ligandos
que activan VEGFR-2 y VEGFR-3
(Stacker, S.A., y col., Growth Factors,
17:1-11, 1999). Las células 293EBNA
produjeron tumores de aspecto epitelioide de crecimiento lento y mal
vascularizados en ratones inmunodeficientes. El análisis de
inmunotransferencia Western de medio condicionado procedente de las
líneas celulares 293EBNA generadas in vitro mostró que se
secretaban las formas maduras de los factores de crecimiento
activos.
Se colocaron ratones hembras de entre 6 y 21
semanas de edad SCID o SCID/nod (Animal Resources Center, Canning
Vale, Australia; Austin Research Institute, Australia; y Eliza Hall
Institute for Medical Research, Australia) en grupos de 6 a 10
ratones y se les inyectaron por vía subcutánea en la almohadilla
grasa mamaria líneas celulares que expresan
VEGF-293,
VEGF-D-293, o líneas celulares 293
controles a una concentración de 2,0-2,5 x 10^{7}
en el medio de cultivo. Se analizó el crecimiento tumoral y la
morfología en un plazo de 35 días. Se midieron los tumores con
calibres digitales y se calculó el volumen tumoral con la fórmula
volumen = longitud x anchura^{2} x 0,52. Se sacrificó a los
factores entre 3 y 5 semanas después de la inyección con líneas
celulares, y se resecaron los tumores para su examen. Los tumores
asociados a los factores VEGF-D-293
y 293 se resecaron después de la muerte el día 25 y se pesaron.
Las células VEGF-293 producían
tumores que tenían una mayor velocidad de crecimiento que los que
producían las células 293 controles. Los tumores
VEGF-293 estaban muy vascularizados y tenían edema
extenso, lo que es compatible con que VEGF es un potente factor de
la angiogenia tumoral e inductor de la permeabilidad vascular. Las
células VEGF-D-293 también mostraron
estimulación del crecimiento in vivo y los tumores estaban
muy vascularizados en comparación con los tumores controles 293,
aunque no mostraron datos macroscópicos ni microscópicos de
edema.
El crecimiento tumoral que se produce por la
inyección de células VEGF-D-293 se
bloqueó mediante la inyección peritoneal dos veces a la semana del
anticuerpo monoclonal VD1, que es un anticuerpo específico frente a
la región bioactiva de VEGF-D y que bloquea la unión
de VEGF-D a VEGFR-2 y
VEGFR-3. Sin embargo, el crecimiento tumoral no se
vio afectado por el tratamiento con un anticuerpo control que tenía
el mismo isotipo.
El tratamiento con el anticuerpo VD1 redujo la
abundancia de vasos en los tumores, según se evaluó mediante
inmunohistoquímica para el marcador de las células endoteliales
PECAM-1. La inmunotransferencia Western demostró la
expresión de VEGF-D y de VEGF en tumores
VEGF-D-293 y
VEGF-293, respectivamente, y también que VEGF no
estaba estimulado en los tumores
VEGF-D-293. El análisis del peso de
los tumores después de la muerte demostró una diferencia
significativa entre los tumores
VEGF-D-293 (0,49 \pm 22 g, n=7;
media \pm DT) y los tumores 293 controles (0,123 \pm 0,118 g,
n=9, p=0,01).
Como las metástasis a los ganglios linfáticos
locales a través de los vasos linfáticos son una etapa frecuente en
la diseminación de los tumores sólidos, se realizaron experimentos
para determinar si VEGF-D inducía la linfangiogenia
tumoral, o si la expresión de VEGF-D en las células
tumorales daba lugar a la diseminación del tumoral hacia los
ganglios linfáticos.
Para analizar la función de
VEGF-D en la diseminación tumoral, se indujeron
tumores VEGF-D-293 en ratones
SCID/nod (Animal Resources Center, Canning Vale, Australia; Austin
Research Institute, Australia; y Eliza Hall Institute for Medical
Research, Australia). Los análisis autópsicos mostraron que los
animales que tenían tumores
VEGF-D-293 habían presentado
lesiones metastásicas en el ganglio linfático axilar lateral y/o en
los ganglios linfáticos inguinales superficiales en 14 de 23
animales, en comparación con 0 de 16 animales que tenían tumores
VEGF-293 y en 0 de 14 animales que tenían tumores
293. En algunos casos la diseminación metastásica de las células
tumorales desde el tumor primario en ratones se pudo ver como un
reguero de células tumorales en los linfáticos de la piel entre el
tumor primario y el ganglio axilar lateral.
El tratamiento de ratones que albergaban tumores
VEGF-D-293 con el anticuerpo
monoclonal VD1 (Tabla 1) bloqueó la diseminación metastásica a los
ganglios linfáticos. Ninguno de los siete ratones a los que se trató
durante 25 días con VD1 mostró diseminación metastásica, mientras
que 6 de 10 ratones a los que se trató con un anticuerpo monoclonal
del mismo isotipo mostraron diseminación linfática. Estos resultados
indican que VEGF-D puede promover la diseminación
metastásica de estos tumores a través de los linfáticos.
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{ \begin{minipage}[t]{135mm} ^{a} Se inyectaron anticuerpos monoclonales purificados dos veces a la semana durante el transcurso del experimento, comenzando un día después de la inyección de las células tumorales. VD1 es un anticuerpo monoclonal neutralizador de VEGF-D.\end{minipage} \cr \begin{minipage}[t]{135mm} ^{b} LMM774 es un anticuerpo monoclonal control con compatibilidad de isotipo que no bloquea VEGF-D.\end{minipage} \cr}
Los datos muestran que la expresión de
VEGF-D puede promover la diseminación metastásica de
las células tumorales a través de la red linfática.
VEGF-D indujo la formación de vasos linfáticos en
los tumores, como se detectó mediante inmunohistoquímica para el
marcador específico de los linfáticos LYVE-1,
probablemente a través del receptor linfático
VEGFR-3, aunque no se puede excluir la activación de
heterodímeros de
VEGFR-3-VEGFR-2. La
expresión de factores linfangiógenos por sí misma es suficiente para
inducir la formación de vasos linfáticos el centro de un tumor y
para facilitar la diseminación metastásica a los ganglios
linfáticos.
VEGF-D se localizó en las células
tumorales y endoteliales de los vasos en los cánceres de pulmón y de
mama (véanse los Ejemplo 5-6).
Además de la determinación de la función de
VEGF-D en la angiogenia y la linfangiogenia
tumorales, se usaron los procedimientos del ejemplo 10 y 11 para
producir y evaluar tumores que expresan diferentes formas de
VEGF-D que representan la escisión de los
propéptidos N-, C- y N- y C-terminales. Las líneas
celulares que se inyectaron en los ratones eran 293EBNA,
VEGF-D-293,
VEGF-D\DeltaN\DeltaC-293,
VEGF-D\DeltaC-293 (células que
expresan VEGF-D pero que carecen del propéptido
C-terminal), y células
VEGF-D\DeltaN-293 (células que
expresan VEGF-D y que carecen del propéptido
N-terminal).
Los tumores que se producen por las células
VEGF-D\DeltaN crecen más rápidamente que los
tumores producidos por las células control. En el examen morfológico
los tumores eran de color rojo y contenían una reacción vascular
significativa, incluyendo un componente líquido sustancial que no se
vio en los tumores controles. Los tumores producidos por las células
VEGF-D\DeltaN tenían diferencias significativas en
cuanto al crecimiento y las características morfológicas respecto a
los tumores controles.
El gráfico de la Figura 9 muestra el aumento de
la velocidad de crecimiento de los tumores procedentes de células
VEGF-D\DeltaN. La tendencia a la acumulación de
líquido en los tumores producidos por las células
VEGF-D\DeltaN se puede ver en la Figura 10, que es
una fotografía de un tumor de este tipo. Esto se puede comparar con
la fotografía de la Figura 11, que representa un tumor normal como
el que está producido por las células control.
Los tumores producidos por las células
VEGF-D\DeltaC crecieron de una manera similar a
los producidos por las células controles y no mostraron una
formación excesiva de líquido.
Los tumores producidos por las células
VEGF-D\DeltaN\DeltaC crecieron muy lentamente en
comparación con los tumores controles. Los tumores
VEGF-D\DeltaN\DeltaC se formaron en
aproximadamente 70 días, en comparación con un promedio de
30-35 días para los tumores controles y de
20-25 días para los tumores
VEGF-D\DeltaN. El examen de estos tumores mostró
que tenían una menor respuesta vascular, y tenían menos vasos
sanguíneos que los tumores de acuerdo con la tinción con
PECAM-1. Los tumores desarrollaron redes linfáticas,
como se muestra con la tinción con LYVE-1, e
indujeron la formación de metástasis linfáticas. El gráfico de la
Figura 12 muestra la menor velocidad de crecimiento de los tumores
procedentes de células VEGF-D\DeltaN\DeltaC.
En el carcinoma epidermoide de pulmón y en el
carcinoma ductal de mama in situ (CDMIS) se observaron
patrones de tinción similares a los que se ven en los melanomas,
porque se detectó VEGF-D en las células tumorales y
en los vasos adyacentes. Los vasos próximos a los conductos llenos
de tumor en el CDMIS y cerca de los islotes de células tumorales en
el carcinoma de pulmón también eran positivos a
VEGFR-2, lo que una vez más indica que esté ligando
y su receptor pueden contribuir al control de la angiogenia tumoral
de manera paracrina.
Estos resultados también indican que
VEGF-D puede participar en la estimulación del
crecimiento de los vasos linfáticos que están en la vecindad del
melanoma maligno, porque los vasos positivos para
VEGFR-3, que es un receptor de
VEGF-D que se expresa en el endotelio linfático de
los tejidos adultos normales, también eran positivos para
VEGF-D. Se vieron patrones de tinción similares en
el CDMIS, porque algunos de los vasos positivos para
VEGF-D que rodeaban a los conductos rellenos de
tumor también eran positivos para VEGFR-3. Se piensa
que la señalización a través de VEGFR-3 es
importante para la linfangiogenia (Taipale y col., Curr. Topics
Micro. Immunol., 237:85-96, 1999), aunque
este receptor puede estar activado en los capilares vasculares
sanguíneos en el cáncer (Valtola, R., y col., Am. J. Path.,
154:1381-1390, 1999). Por lo tanto, el
sistema regulador paracrino formado por VEGF-D y
VEGFR-3 podría estimular tanto la linfangiogenia
como la angiogenia en el cáncer. Según esto, la ruta de diseminación
metastásica de un tumor puede estar determinada en parte por su
capacidad de inducir angiogenia y linfangiogenia. Si es así, la
expresión por las células tumorales de factores de crecimiento
solubles que son puramente angiógenos (por ejemplo, VEGF) en
contraposición a los que también pueden inducir linfangiogenia (por
ejemplo, VEGF-D) podría ser un determinante
importante de la ruta de diseminación metastásica.
Claims (5)
1. El uso de un antagonista de
VEGF-D que impide la unión de VEGF-D
a su correspondiente receptor para la fabricación de un medicamento
para su uso en el tratamiento de una enfermedad neoplásica
caracterizado porque dicha enfermedad neoplásica se
selecciona del grupo formado por carcinoma ductal de mama, carcinoma
epidermoide, cáncer de próstata y cáncer de endometrio.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que
dicho antagonista de VEGF-D se administra
simultáneamente con un agente fármaco citotóxico.
3. El uso según la reivindicación 1 ó 2, en el
que dicho antagonista comprende además al menos un vehículo o
adyuvante farmacéutico.
4. El uso según cualquiera de las
reivindicaciones 1-3, en el que dicho antagonista es
un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a
VEGF-D y bloquea la unión de VEGF-D
al receptor 2 de VEGF o al receptor 3 de VEGF.
5. El uso según la reivindicación 4, en el que
dicho anticuerpo se une al dominio de homología de VEGF de
VEGF-D.
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