JP2003525248A - 血管内皮成長因子ｄを発現する癌の治療、スクリーニング、及び検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 腫瘍によるＶＥＧＦ−Ｄの発現によって特徴付けられるメラノーマ及び種々の癌を治療、緩和する方法であって、ＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍細胞を有する生物をスクリーニングし、ＶＥＧＦ−Ｄの結合を防止するために有効量のＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストを投与する方法；腫瘍細胞、血管内皮細胞、リンパ管内皮細胞、及び／又は潜在的腫瘍性成長細胞の上又は内のＶＥＧＦ−Ｄの検出が腫瘍形成疾患を示す腫瘍形成疾患をスクリーニングする方法；ＶＥＧＦ−Ｄ又はそのフラグメント又は類似物を投入することによって生物の正常組織の血管化を促進、維持する方法；腫瘍によるＶＥＧＦ−Ｄの発現が転移リスクを示す腫瘍の転移リスクのスクリーニング方法；及び、組織サンプル上又は中のＶＥＧＦ−Ｄの検出が腫瘍形成疾患の転移を示す腫瘍形成疾患の微小転移巣の検出方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 発明の背景 本発明は、一般に、メラノーマ及び種々の癌を治療、緩和する方法、腫瘍形成
疾患のスクリーニング方法、及び、正常組織の血管新生を促進、維持する方法に
関する。

【０００２】 哺乳動物の血管系の二つの主要な構成要素は、内皮細胞と平滑筋細胞である。
内皮細胞は、哺乳動物のすべての血管とリンパ管との内表面のライニングを形成
する。新しい血管の形成は、二つの異なるプロセス、即ち、脈管形成（ｖａｓｃ
ｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）又は血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）によって起
こりうる（リソー（Ｒｉｓａｕ）Ｗ，Ｎａｔｕｒｅ ３８６：６７１−６７４（
１９９７）を参照）。脈管形成は、内皮細胞前駆体の成熟内皮細胞への本来の位
置における（ｉｎ ｓｉｔｕ）分化と、初期胚の一次脈管叢の形成において起こ
るもののような、これらの細胞の血管を形成するための連携作用とによって特徴
付けられる。これに対して、血管新生、即ち、既存の血管の成長と分岐とによる
血管の形成は、後の胚形成において重要であり、成体において起こる血管の成長
を司る。血管新生は、内皮細胞の増殖、細胞外マトリクスの分解、血管の分岐、
それに続く細胞付着事象を含む生理学的に複雑なプロセスである。成体において
血管新生は厳密に制御され、正常な状況では女性の生殖系に限定される。しかし
ながら、血管新生は、組織損傷に応答してスイッチ・オンされることが可能であ
る。重要な事実として、固形腫瘍は周囲の組織において血管新生を誘発させるこ
とができ、これによって、腫瘍の成長を維持し転移の形成を容易にする（フォー
クマン（Ｆｏｌｋｍａｎ），Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．１：２７−３１，（１
９９５））。複雑な血管新生プロセスの背後に存在する分子機構についてはほと
んど理解されていない。

【０００３】 血管新生は、又、それが疾患の様々な後遺症に役割を果す、又は、それらに直
接関わる、多数の病理状態にも関係している。いくつかの具体例として、種々の
肝臓疾患に関連する新血管新生（ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）、糖
尿病の新血管新生後遺症、高血圧症の新血管新生後遺症、外傷後の新血管新生、
頭部外傷による新血管新生、慢性肝感染（例えば、慢性肝炎）の新血管新生、高
温又は低温外傷による新血管新生、ホルモンの過多に関連する機能障害、血管腫
の形成、及び血管形成術後の再狭窄、が挙げられる。

【０００４】 血管新生は非常に多くの生理的又は病理的プロセスにおいて重要な役割を果す
ものである為、血管新生の制御に関連する要因について鋭意研究されてきた。血
管新生の調節には、多数の成長因子が関連していることが示されており、これら
には、繊維芽細胞生長因子（ＦＧＦｓ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ト
ランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦα）、及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）が含
まれる。例えば、フォルクマン（Ｆｏｌｋｍａｎ）等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ
．，２６７：１０９３１−１０９３４（１９９２）を参照。

【０００５】 内皮細胞特異的成長因子の特定のファミリ、即ち、血管内皮成長因子（ＶＥＧ
Ｆｓ）とそれらに対応するレセプタとが、内皮細胞成長及び分化の刺激と分化細
胞の或る種の機能との主要な原因となっていることが示唆された。これらの因子
は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリのメンバであり、内皮のレセプタチロシンキナ
ーゼ（ＲＴＫｓ）を介して作用するものと考えられる。成長因子の前記ＰＤＧＦ
／ＶＥＧＦファミリは、成長因子のシステイン−ノットスーパーファミリに属し
、それは、又、ニューロトロフィン（ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ）とトランス
ホーミング増殖因子−βを含む。

【０００６】 ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリにおいて８種類のタンパク質が同定されている。
即ち、二つのＰＤＧＦ（Ａ及びＢ）と、ＶＥＧＦと、ＶＥＧＦに密接に関連する
５つのメンバである。ＶＥＧＦに密接に関連する５つのメンバとは、ルードヴィ
ッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサー・リサーチ（Ｌｕｄｗｉｇ Ｉ
ｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）とヘルシンキ大
学の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７（ＷＯ ９６／２６７３６）及
び米国特許５，８４０，６９３号及び５，６０７，９１８号に記載のＶＥＧＦ−
Ｂ、ジューコフ（Ｊｏｕｋｏｖ）他のＥＭＢＯ Ｊ．１５：２９０−２９８（１
９９６）、リー（Ｌｅｅ）他のＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９３：１９８８−１９９２（１９９６）及びヒュ−マン・ゲノム・サ
イエンシーズ（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）社の米国特許５
，９３２，５４０号及び５，９３５，５４０号に記載のＶＥＧＦ−Ｃ又はＶＥＧ
Ｆ２、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ ９８／０７８３２）
及びアチェン（Ａｃｈｅｎ）他のＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
． ＵＳＡ ９５：５４８−５５３（１９９８）に記載のＶＥＧＦ−Ｄ、マグリ
オーネ（Ｍａｇｌｉｏｎｅ）他のＰｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
． ＵＳＡ ８８：９２６７−９２７１（１９９１）に記載の胎盤成長因子（Ｐ
ｌＧＦ）、そしてヒュ−マン・ゲノム・サイエンシーズ社の国際特許出願ＰＣＴ
／ＵＳ９５／０７２８３（ＷＯ９６／３９４２１）に記載のＶＥＧＦ３である。
各ＶＥＧＦファミリメンバは、ＶＥＧＦに対して３０％〜４５％のアミノ酸配列
同一性を有する。これらＶＥＧＦファミリメンバは、前記システイン−ノット
モチーフを形成する６つのシステイン残基を含むＶＥＧＦホモロジードメインを
共有している。ＶＥＧＦファミリの機能的特徴としては、内皮細胞に対する様々
なレベルのマイトジェン活性、血管透過性の誘発、及び血管新生及びリンパ管形
成特性がある。

【０００７】 血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、複数のソースから単離されているホモダイ
マー糖タンパク質である。一つのＶＥＧＦ遺伝子のオルタレイトな（ａｌｔｅｒ
ａｔｉｖｅ）ｍＲＮＡスプライシングによって５つのイソ型のＶＥＧＦが得られ
る。ＶＥＧＦは内皮細胞に対する高度に特異的なマイトジェン活性を示す。ＶＥ
ＧＦは、胚時期の脈管形成と成体期の血管新生中の新しい血管形成において重要
な調節機能を有する（カルメリート（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）他， Ｎａｔｕｒｅ
，３８０:４３５−４３９， １９９６; フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）他，
Ｎａｔｕｒｅ，３８０: ４３９−４４２，１９９６， フェラーラ（Ｆｅｒｒ
ａｒａ）及びデイビス−スミス（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ）， Ｅｎｄｏｃｒｉ
ｎｅ Ｒｅｖ．，１８: ４−２５，１９９７にレビュー）。ＶＥＧＦが果たす
役割の重要性は、一つのＶＥＧＦ対立遺伝子の不活性化によって、血管系の発達
不全によって胚が致死することを示す研究に現わされている（カルメリート（Ｃ
ａｒｍｅｌｉｅｔ）他， Ｎａｔｕｒｅ，３８０: ４３５−４３９， １９９
６; フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ）他，Ｎａｔｕｒｅ， ３８０: ４３９−４
４２， １９９６）。ＶＥＧＦの単離と性質は、既にレビューされている。フェ
ラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ））他， Ｊ． Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．
，４７: ２１１−２１８， １９９１及びコノリ（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）， Ｊ
． Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４７: ２１９−２２３， １９９
１を参照。

【０００８】 更に、ＶＥＧＦは、単球に対して強い化学誘引活性を示し、内皮細胞中でプラ
スミノゲン アクチベータ及びプラスミノゲン アクチベータ インヒビタを誘
発し、更に、微小血管透過性を誘発することができる。後者の活性により、それ
は、時として脈管透過性因子（ＶＰＦ）と称される。ＶＥＧＦは、又、ある種の
造血細胞に対して化学走性である。最近の文献に、ＶＥＧＦが樹状細胞の成熟を
阻止し、それによって、腫瘍に対する免疫応答の効果を低減させることが示され
ている（多くの腫瘍はＶＥＧＦを分泌する）（ガブリロビッチ（Ｇａｂｒｉｌｏ
ｖｉｃｈ）他， Ｂｌｏｏｄ ９２: ４１５０−４１６６， １９９８; ガブ
リロビッチ（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ）他， Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．ｅａｒｃｈ ５: ２９６３−２９７０， １９９９）。

【０００９】 ＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦに類似の血管新生及びその他の性質を有するが、組
織における分布と発現はＶＥＧＦと異なる。特に、ＶＥＧＦ−Ｂは、心臓で強く
発現し、肺では弱くしか発現せず、これに対してＶＥＧＦはその反対である。こ
のことは、ＶＥＧＦとＶＥＧＦ−Ｂとは、それらが多く組織において共発現する
という事実にも拘わらず、機能的な相違を有する可能性があることを示唆してい
る。

【００１０】 ＶＥＧＦ−Ｂは、細胞レチノイン酸結合タンパク質タイプ−Ｉ（ＣＲＡＢＰ−
Ｉ）と相互作用する可能性のある細胞タンパク質のスクリーニングによる酵母コ
−ハイブリッド相互作用トラップスクリーニング技術を使用して単離された。そ
の単離と特徴付けは、ルードヴィッヒ・インスティテュート・フォア・キャンサ
ー・リサーチとヘルシンキ大学のＰＣＴ／ＵＳ９６／０２９５７（ＷＯ９６／２
５７３６），米国特許第５，８４０，６９３号及び第５，６０７，９１８号、及
びオロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９３: ２５７６−２５８１， １９９６に詳細に記載
されている。

【００１１】 ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦＲ−３を発現するようにトランスフェクトされた細
胞を使用し、培地の内皮細胞特異性レセプタチロシンキナーゼＶＥＧＦＲ−３（
Ｆｌｔ４）のチロシンリン酸化を導出する能力によるスクリーニングによって、
ＰＣ−３前立腺癌細胞系（ＣＲＬ１４３５）の調節培地から単離された。ＶＥＧ
Ｆ−Ｃは、組換えＶＥＧＦＲ−３との親和性クロマトグラフィを使用して精製さ
れ、ＰＣ−３ｃＤＮＡライブラリから単離された。その単離と特徴付けは、ジョ
ーコブ（Ｊｏｕｋｏｖ）他， ＥＭＢＯ Ｊ．，１５: ２９０−２９８， １
９９６に詳細に記載されている。

【００１２】 ＶＥＧＦ−Ｄは、ハイブリダイゼーションプローブとして“Ｓｏａｒｅｓ Ｂ
ｒｅａｓｔ ３ＮｂＨＢｓｔt”と命名されたヒトｃＤＮＡライブラリから得ら
れた発現配列タグを用いたスクリーニングによって、クローンテック社から市販
されているヒト胸部ｃＤＮＡライブラリから単離された（アチェン（Ａｃｈｅｎ
）他，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５: ５
４８−５５３， １９９８）。その単離と特徴付けは、国際特許出願ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）に詳細に記載されている。

【００１３】 ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６において、ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣと名づけられ
たＶＥＧＦ−Ｄの生理活性フラグメントの単離も記載されている。このフラグメ
ントは、前記親和性タグペプチドＦＬＡＧ（登録商標）に結合されたＶＥＧＦ−
Ｄアミノ酸残基９３−２０１から成る。前記国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１
４６９６ （ＷＯ９８／０７８３２）の全開示内容をここに参考文献として合体
させる。

【００１４】 ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝は成体ヒトにおいて広く発現するが、もちろん、至るところ
に発現するものではない。ＶＥＧＦ−Ｄは、心臓と、肺と骨格筋において強く発
現する。中間レベルのＶＥＧＦ−Ｄが、脾臓と、卵巣と、小腸と、結腸で発現し
、より低いレベルの発現は、腎臓、すい臓、胸腺、前立腺、睾丸で起こる。脳、
胎盤、肝臓又は末しょう血液白血球からのＲＮＡからはＶＥＧＦ−Ｄ ｍＲＮＡ
は検出されなかった。

【００１５】 Ｐ１ＧＦは、ある期間の（ｔｅｒｍ）胎盤ｃＤＮＡライブラリから単離された
。その単離と特徴付けは、マグリオネ（Ｍａｇｌｉｏｎｅ）他，Ｐｒｏｃ． Ｎ
ａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８８: ９２６７−９２７１，
１９９１に詳細に記載されている。現在において、その生物学的機能はよく理解
されていない。

【００１６】 ＶＥＧＦ３は、結腸組織由来のｃＤＮＡから単離された。ＶＥＧＦ３は、ＶＥ
ＧＦに対して約３６％の同一性と６６％の類似性とを有するといわれている。Ｖ
ＥＧＦ３をコードする遺伝子の単離方法は明らかでなく、その生理活性の特徴付
けは開示されていない。

【００１７】 二つのタンパク質間の類似性は、それらのタンパク質の一方のアミノ酸配列と
同類アミノ酸置換とを、第２のタンパク質の配列と比較することによって算定さ
れ、これに対して同一性は、同類アミノ酸置換を含まずに測定される。

【００１８】 リンパ系の主な機能は、組織からの流体の戻りを提供し、多くの血管外物質を
血液に戻すことにある。更に、成熟の過程中にリンパ球は血液を離れ、リンパ器
官及びその他の組織を通って移動しリンパ管に入り、胸管を介して血液に戻る。
専門の小静脈である高内皮小静脈（ＨＥＶ）が再びリンパ球に結合し、それらの
組織内への管外溢出を起こす。リンパ管、特に、リンパ節は、これによって、免
疫、及び、種々の腫瘍の転移の発達に重要な役割を果たしている。血管と違って
、リンパ系の胚起源はそれほど明らかでなく、その起源に関して少なくとも三種
類の理論が存在する。リンパ管は、それに対して利用可能な特異的マーカが存在
しないために、同定することが困難である。

【００１９】 リンパ管は、最も一般的には、リンパ系造影法を使用して研究される。リンパ
系造影法において、Ｘ線コントラスト媒質がリンパ管に直接注入される。このコ
ントラスト媒質は、リンパ系の輸出排官に沿って分散し、リンパ節に集められる
。コントラスト媒質は、リンパ節中に最大半年間とどまることができ、その間に
、Ｘ線分析によって、リンパ節のサイズと構造をフォローすることが可能である
。この診断は、リンパ節における転移や、リンパ腫等のリンパ悪性腫瘍を有する
癌患者において特に重要である。しかしながら、当該技術において、リンパ組織
を造影するためのより良い材料と方法が必要とされている。

【００２０】 上述したように、前記ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリメンバは、主として、レセ
プタチロシンキナーゼに結合することによって作用する。一般に、レセプタチロ
シンキナーゼは糖タンパク質であり、特定の成長因子（単数又は複数）に結合可
能な細胞外ドメインと、通常はそのタンパク質のアルファヘリックス部分である
経膜ドメインと、レセプタが、例えば、タンパク質リン酸化によって調節される
ことが可能な膜近傍ドメインと、レセプタの酵素成分であるチロシンキナーゼド
メインと、多くのレセプタにおいて、チロシンキナーゼの基質認識と結合とに関
与するカルボキシル−末端テールとから成る。

【００２１】 ５つの内皮細胞特異性レセプタチロシンキナーゼ、すなわち、ＶＥＧＦＲ−１
（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ−２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１），ＶＥＧＦＲ−３（Ｆ
ｌｔ４），Ｔｉｅ及びＴｅｋ／Ｔｉｅ−２が同定されている。これらのレセプタ
は、その特異性と親和性において互いに異なる。これらのすべては、シグナル伝
達に必要な、内因性のチロシンキナーゼ活性を有する。

【００２２】 ＶＥＧＦ群（ＶＥＧＦｓ）に結合することが知られているレセプタチロシンキ
ナーゼは、ＶＥＧＦＲ−１，ＶＥＧＦＲ−２、ＶＥＧＦＲ−３のみである。ＶＥ
ＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２は、高い親和性でＶＥＧＦと結合し、ＶＥＧＦ−１
は、更に、ＶＥＧＦ−ＢとＰｌＧＦとにも結合する。ＶＥＧＦ−Ｃは、ＶＥＧＦ
Ｒ−３のリガンドであることが示されており、それは、更にＶＥＧＦＲ−２を活
性化する（ジョーコブ（Ｊｏｕｋｏｖ）他，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ
， １５: ２９０−２９８， １９９６）。ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦＲ−２
とＶＥＧＦＲ−３との両方に結合する（アチェン（Ａｃｈｅｎ）他，Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５: ５４８−５５３，
１９９８）。Ｔｅｋ／Ｔｉｅ−２のリガンドは、リジェネロン ファーマシュー
ティカル（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）社の国際特
許出願ＰＣＴ／ＵＳ９５／１２９３５ （ＷＯ９６／１１２６９）に記載されて
いる。Ｔｉｅのリガンドはまだ同定されていない。

【００２３】 最近、新規な１３０−１３５ｋＤａ ＶＥＧＦイソ型特異性レセプタが精製さ
れ、クローニングされた（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）他，Ｃｅｌｌ， ９２: ７
３５−７４５， １９９８）。このＶＥＧＦレセプタは、ヘパリンに対して弱い
親和性を示す、エクソン７コード化配列を介してＶＥＧＦ_１６５イソ型に特異的
に結合することが分かった（ソーカー（Ｓｏｋｅｒ）他，Ｃｅｌｌ， ９２:
７３５−７４５， １９９８）。驚くべきことに、このレセプタは、初期の神経
形態形成に関与するレセプタである、ヒトのニューロピリン−１（ＮＰ−１）と
同じであることが示された。ＰｌＧＦ−２も、ＮＰ−１と相互作用するようであ
る（ミグダル（Ｍｉｇｄａｌ）他，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３:
２２２７２−２２２７８， １９９８）。

【００２４】 ＶＥＧＦＲ−１，ＶＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３は内皮細胞において異な
る発現を示す。一般に、ＶＥＧＦＲ−１とＶＥＧＦＲ−２とは共に、血管内皮中
に発現し（オエルリッシュ（Ｏｅｌｒｉｃｈｓ）他，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， ８:
１１−１８， １９９２; カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）他，Ｊ．
Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １７８: ２０７７−２０８８， １９９３; デュモン
ト（Ｄｕｍｏｎｔ）他，Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．， ２０３: ８０−９２， １９
９５; フォン（Ｆｏｎｇ）他，Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．， ２０７: １−１０，
１９９６）、ＶＥＧＦＲ−３は、ほとんど、成体組織のリンパ内皮中に発現する
（カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）他，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ
． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９: ３５６６−３５７０， １９９５）。ＶＥＧＦ
Ｒ−３は、又、腫瘍の周囲の血管系にも発現する。

【００２５】 ＶＥＧＦＲ−１は、主として発達中において内皮細胞に発現するものではある
が、それは、胚形成の初期段階中に造血前駆細胞中にも見つけることができる（
フォン（Ｆｏｎｇ）他，Ｎａｔｕｒｅ， ３７６: ６６−７０， １９９５）
。成体において、単球と、マクロファージも、このレセプタを発現する（バーレ
オン（Ｂａｒｌｅｏｎ）他，Ｂｌｏｏｄ， ８７: ３３３６−３３４３， １
９９５）。胚においては、ＶＥＧＦＲ−１が、全部ではないが、大半の脈管によ
って発現する（ブレア（Ｂｒｅｉｅｒ）他，Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．， ２０４:
２２８−２３９， １９９５; フォン（Ｆｏｎｇ）他，Ｄｅｖ． Ｄｙｎ．，
２０７: １−１０， １９９６）。

【００２６】 レセプタＶＥＧＦＲ−３は、初期の胚発達中では内皮細胞に広く発現するが、
胚形成が進むにつれて、静脈内皮と、更に、その後は、リンパ内皮とに次第に限
定されてくる（カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）他，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ
． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９２: ３５６６−３５７０， １９９
５，カイパイネン（Ｋａｉｐａｉｎｅｎ）他，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５４：
６５７１−６５７７）。ＶＥＧＦＲ−３は、成体組織においてはリンパ内皮細胞
に発現する。このレセプタは、胚形成中の脈管発達に必須である。

【００２７】 ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２，ＶＥＧＦＲ−３，Ｔｉｅ及びＴｅｋ／Ｔｉ
ｅ−２の脈管形成、血管新生及び／又はリンパ管形成中における必須の特異的な
役割は、マウス胚中でこれらのレセプタを不活性化する標的変異によって立証さ
れている。ＶＥＧＦＲ遺伝子の破壊によって、血管系の発達に異常が起こり、こ
れによって、懐胎期間中の胚の致死が起こる。完全に不活性化されたＶＥＧＦＲ
−１遺伝子を有する胚の分析は、このレセプタが内皮の機能組織化に必要である
ことを示唆している（フォン（Ｆｏｎｇ）他，Ｎａｔｕｒｅ， ３７６: ６６
−７０， １９９５）。しかしながら、ＶＥＧＦＲ−１の細胞間チロシンキナー
ゼドメインの欠失からは、正常な血管系を備えた生育可能なマウスが生まれる（
ヒラツカ（Ｈｉｒａｔｓｕｋａ）他，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓ
ｃｉ． ＵＳＡ， ９５: ９３４９−９３５４， １９９８）。これらの相違
の理由は説明されるべきものとして残っているが、このチロシンキナーゼを通じ
たレセプタ信号は、ＶＥＧＦＲ−１の適切な機能を必要としないことが示唆され
ている。ＶＥＧＦＲ−２の不活性化対立遺伝子を有する同型接合体マウスの分析
は、このレセプタが内皮細胞増殖、造血、及び脈管形成に必要であることを示唆
している（シャラビ（Ｓｈａｌａｂｙ）他，Ｎａｔｕｒｅ， ３７６: ６２−
６６， １９９５; シャラビ（Ｓｈａｌａｂｙ）他，Ｃｅｌｌ， ８９: ９８
１−９９０， １９９７）。マウス内のＶＥＧＦＲ−３の両方のコピーの標的不
活性化によって、性交後９．５日において心膜腔での流体蓄積と心血管不全とな
る、ルーメンが異常化した異常組織大脈管によって特徴付けられる血管形成欠陥
が生じた（デュモント（Ｄｕｍｏｎｔ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８２: ９４
６−９４９， １９９８）。これらの知見に基づき、ＶＥＧＦＲ−３は、一次血
管網がより大きな血管に成熟するために必要であるということが提案されている
。しかしながら、これらのマウスにおいては、リンパ管系の発達におけるＶＥＧ
ＦＲ−３の役割は研究することはできなかった。その理由は、リンパ系が現れる
前に胚が死亡したからである。それでも、ＶＥＧＦＲ−３は、胚及び成体時期中
におけるリンパ内皮細胞におけるその特異的発現により、リンパ管系の発達とリ
ンパ管形成とにおいて役割を果たしていると推定される。これは、ＶＥＧＦＲ−
３のリガンドであるＶＥＧＦ−Ｃの、トランスジェニックマウスの皮膚における
異所性発現によって、皮膚におけるリンパ内皮細胞増幅と脈管の拡大とが生じた
という知見によって支持される。更に、このことは、ＶＥＧＦ−Ｃがリンパ内皮
において一次機能を有し、ＶＥＧＦと共通の、血管新生と透過性調節とにおける
二次機能を有している可能性があることを示唆している（ジョーコブ（Ｊｏｕｋ
ｏｖ）他，ＥＭＢＯ Ｊ．，１５: ２９０−２９８， １９９６）。

【００２８】 更に、４種類の株のオルフ（ｏｒｆ）ウイルスによってコードされるＶＥＧＦ
様タンパク質が同定されている。これは、ＶＥＧＦ様タンパク質をコードすると
報告された最初のウイルスである。最初の二つの株はＮＺ２とＮＺ７であり、こ
れらは、リトル（Ｌｙｔｔｌｅ）他， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．， ６８: ８４−
９２， １９９４に記載されている。第３のものはＤ１７０１であり、これは、
メイヤー（Ｍｅｙｅｒ）他，ＥＭＢＯ Ｊ．，１８：３６３−３７４， １９９
９に記載されている。第４の株はＮＺ１０であり、これは、国際特許出願ＰＣＴ
／ＵＳ９９／２５８６９に記載されている。これらのウイルス性ＶＥＧＦ様タン
パク質は、ホスト（ヒツジ／ヤギ／ヒト）の内皮上でＶＥＧＦＲ−２に結合し、
この結合が感染の発展に重要であることが示された（メイヤー（Ｍｅｙｅｒ），
ＥＭＢＯ Ｊ．，１８: ３６３−３７４， １９９９; オガワ（Ｏｇａｗａ
）他， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７３: ３１２７３−３１２８２
， １９８８;及び国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／２５８６９）。これらのタ
ンパク質は、ＶＥＧＦと互いとに対してアミノ酸配列類似性を示している。

【００２９】 前記オルフウイルスは、ヒツジとヤギにおいて高感染性膿疱性皮膚炎を引き起
こすパラポックスウイルス属であり、ヒトにも容易に感染可能である。オルフウ
イルス感染によって引き起こされる膿疱性皮膚炎は、血管の拡張、局所の腫脹、
血管を形成する内皮細胞の顕著な増殖によって特徴付けられる。これら特徴は、
オルフによって感染されたすべての種に見られ、皮膚細胞中のウイルス複製によ
る、腫瘍様成長又は小塊の形成をもたらす可能性がある。一般に、オルフウイル
ス感染は、２−３週間で消散するが、外科的介在処置無しでは消散しない重度の
感染も、免疫不全個体に見られる。

【００３０】 ＶＥＧＦ群（ＶＥＧＦｓ）のレセプタ媒介作用に拮抗可能な薬剤の開発が非常
に注目されている（マルティニー―バロン（Ｍａｒｔｉｎｙ−Ｂａｒｏｎ）及び
マルメ（Ｍａｒｍｅ）， Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６
: ６７５−６８０， １９９５）。ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体は、
腫瘍関連血管新生を抑制することによってイン・ヴィヴォで腫瘍の成長を抑える
ことが示された（キム（Ｋｉｍ）他，Ｎａｔｕｒｅ ３６２: ８４１−８４４
， １９９３）。ＶＥＧＦのアンチセンスＲＮＡ（サレー（Ｓａｌｅｈ）他，Ｃ
ａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６: ３９３−４０１， １９９６）又は、優性陰性
ＶＥＧＦＲ−２突然変異体（ミラウアー（Ｍｉｌｌａｕｅｒ）他，Ｎａｔｕｒｅ
３６７: ５７６−５７９， １９９４）の発現から得られたモデル系におい
て、類似の抑制効果が観察された。

【００３１】 しかしながら、中和抗体での腫瘍抑制研究は、ＶＥＧＦ以外のその他の血管新
生因子が関与しているかもしれないということを示唆した（キム（Ｋｉｍ） Ｋ
．他，Ｎａｔｕｒｅ ３６２: ８４１−８４４， １９９３）。更に、悪性メ
ラノーマにおけるＶＥＧＦ以外の血管新生因子の活性は、すべてのメラノーマが
ＶＥＧＦを発現するわけではないという知見によって示唆されている（イッサ（
Ｉｓｓａ） Ｒ．他，Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７９: ４１７−４２５，
１９９９）。

【００３２】 前記ＶＥＧＦファミリの異なるメンバの生物機能は、現在明らかにされつつあ
る。そのなかで特に注目されるのが、ＶＥＧＦ−ＤとＶＥＧＦ−Ｃとの特性であ
る。これらのタンパク質は、それぞれ、血管内皮細胞とリンパ内皮細胞とに局在
し、互いに一次構造が密接に関連する（４８％のアミノ酸同一性）、ＶＥＧＦＲ
−２とＶＥＧＦＲ−３との両方に結合する。これら両因子は、イン・ヴィトロに
おいて内皮細胞に対してマイトジェン活性がある。最近、ＶＥＧＦ−Ｃが、マウ
スの角膜モデルと、トリの絨毛尿膜とにおいて血管新生性であり（カオ（Ｃａｏ
）他，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５: １４
３８９−１４３９４， １９９８）、組織虚血状態において血管新生を誘発させ
ることが可能である（ウィッエンヴィクラー（Ｗｉｔｚｅｎｂｉｃｈｌｅｒ）他
，Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ． １５３: ３８１−３９４， １９９８）こ
とが示された。更に、ＶＥＧＦ−Ｃは、トリの絨毛尿膜（オー（Ｏｈ）他，Ｄｅ
ｖ． Ｂｉｏｌ． １８８: ９６−１０９， １９９７）と、トランスジェニ
ックマウスモデル（ジェルッシュ（Ｊｅｌｔｓｃｈ）他， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２
７６: １４２３−１４２５， １９９７）とにおいてリンパ管新生（ｌｙｍｐ
ｈａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を刺激した。ＶＥＧＦ−Ｄは、ラビット角膜にお
いて血管新生性であることが示された（マルコンシニ（Ｍａｒｃｏｎｃｉｎｉ）
他，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９６: ９６７
１−９６７６， １９９９）。ＶＥＧＦ−Ｄのリンパ管新生能力は今のところ報
告されていないが、ＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦ−Ｃと同様に、リンパ管新生のた
めのシグナルと考えられているレセプタであるＶＥＧＦＲ−３に結合しこれを活
性化することからすると（タイペール（Ｔａｉｐａｌｅ）他，Ｃｕｒ． Ｔｏｐ
ｉｃｓ Ｍｉｃｒｏ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３７: ８５−９６， １９９９
）、ＶＥＧＦ−Ｄがリンパ管新生性である可能性は高い。ＶＥＧＦ−ＤとＶＥＧ
Ｆ−Ｃは、腫瘍の悪性に対して特に重要であるかもしれない。というのは、転移
は血管又はリンパ管のいずれかを介して広がることができ、従って、血管新生又
はリンパ管新生のいずれかを刺激する分子は、悪性に対して貢献している可能性
があるからである。これは、ＶＥＧＦの場合はそうであることが既に示されてい
る。ＶＥＧＦ−Ｄ発現が、悪性に対して重要であることが知られている転写因子
であるｃ−Ｆｏｓによって誘発されるということは銘記に値する（オーランディ
ニ（Ｏｒｌａｎｄｉｎｉ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ
． ＵＳＡ ９３: １１６７５−１１６８０， １９９６）。ｃ−Ｆｏｓが悪
性に寄与するメカニズムは、血管新生因子をコードする遺伝子のアップレギュレ
ーションであると推測される。ｃ−Ｆｏｓが欠如した腫瘍細胞は、おそらくは、
血管新生を誘発させることが不能であることにより、悪性進行することができな
い（シーザ（Ｓｅａｚ）Ｅ．他，Ｃｅｌｌ ８２:７２１−７３２， １９９５
）。このことは、腫瘍進行中にアップレギュレートされる血管新生因子の存在を
示唆している。

【００３３】 図１に示すように、主要な細胞間形態のＶＥＧＦ−Ｄは、ＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ
相同性ドメイン（ＶＨＤ）と、Ｎ−及びＣ−末端プロペプチドとから成るホモダ
イマープロペプチドであり、配列識別番号２の配列を有する。分泌後、このポリ
ペプチドは、タンパク質分解的に劈開される（スタッカー（Ｓｔａｃｋｅｒ）Ｓ
．Ａ．他，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７４: ３２１２７−３２１３６，
１９９９）。タンパク質分解的プロセッシング（黒色の矢印によって示される
位置での）によって、部分的にプロセッシングされた形態と前記ＶＨＤのダイマ
ーから成る、完全にプロセッシングされた成熟形態とが生じる。配列識別番号３
の配列を有するＶＨＤ（すなわち、全長ＶＥＧＦ−Ｄの残基９３〜２０１）は、
ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３との両方に対する結合部位を含んでいる。前記
成熟形態は、未プロセッシング形態よりもはるかに高い親和性でＶＥＧＦＲ−２
とＶＥＧＦＲ−３との両方に結合する（スタッカー（Ｓｔａｃｋｅｒ）Ｓ．Ａ．
他，Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７４: ３２１２７−３２１３６， １９９
９）。

【００３４】 ヒトの癌におけるＶＥＧＦ−Ｄタンパク質の局在性は、ＶＥＧＦ−ＤのＶＨＤ
に対する特異的な抗体の欠如により、まだ研究されていない。Ｎ−又はＣ−末端
プロペプチドに対する抗体では、これらの領域は生理活性ＶＨＤから劈開され、
ＶＨＤと局在性が異なるため不適切である（スタッカー（Ｓｔａｃｋｅｒ）Ｓ．
Ａ．他，Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７４: ３２１２７−３２１３６， １
９９９）。

【００３５】 発明の要旨 本発明は、一般に、メラノーマ及び種々の癌を治療、緩和する方法、腫瘍形成
疾患のスクリーニング方法、及び、正常組織の血管新生を維持する方法、に関す
る。

【００３６】 第１の態様によれば、本発明は、非限定的に、メラノーマ、乳腺管癌（ｂｒｅ
ａｓｔ ｄｕｃｔｕａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮癌、前立腺腫瘍及び
子宮内膜癌を含む、腫瘍によるＶＥＧＦ−Ｄの発現によって特徴付けられる腫瘍
性疾患を患う生物を治療する方法を提供する。この方法は、ＶＥＧＦ−Ｄ発現腫
瘍細胞の存在又は不在を測定するべく生物をスクリーニングする工程と、そのス
クリーニングによってＶＥＧＦ−Ｄを発現している腫瘍を有すると判断された生
物を選択する工程と、ＶＥＧＦ−Ｄのその対応のレセプタへの結合を阻止するた
めに前記腫瘍の近傍に、ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストを有効量投与する工程、と
を有する。

【００３７】 ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストは、アンチセンス核酸又はＶＥＧＦ−Ｄをコード
する三本鎖ＤＮＡを有する組成物を使用すること等によってＶＥＧＦ−Ｄ活性を
阻止することができる。

【００３８】 ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストは、又、抗体、及び／又は、ダイマー形成及びレ
セプタ結合の両方におけるＶＥＧＦ−Ｄの結合の競合性又は非競合性抑制剤を有
する組成物を使用すること等によって、ＶＥＧＦ−Ｄ活性を抑制することもでき
る。これらのＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ｄに結合する能力を有
しＶＥＧＦ−Ｄレセプタへの結合を阻止する、又は、ＶＥＧＦ−Ｄレセプタに結
合する能力は有するが内皮細胞増殖、分化、移動、又は生存を刺激することはで
きない、後述するもののようなＶＥＧＦ−Ｄ修飾ポリペプチドを含む。ＶＥＧＦ
−Ｄ，ＶＥＧＦＲ−２又はＶＥＧＦＲ−３に対する小分子インヒビタ、及び、Ｖ
ＥＧＦ−Ｄ，ＶＥＧＦＲ−２，又はＶＥＧＦＲ−３に対する抗体も使用可能であ
る。

【００３９】 ある種の修飾ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドは、非限定的に、内皮細胞、結合組織
細胞、筋線維芽細胞及び／又は間葉系細胞を含む細胞上でＶＥＧＦ−Ｄに結合す
る能力は有するが、細胞増殖、分化、移動、運動性、又は生存を刺激したり、血
管増殖、結合組織発達又は損傷治療を誘発させることはできないと予想される。
これらの修飾ポリペプチドは、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチド及びＶＥＧＦ／ＰＤＧ
Ｆファミリの成長因子の競合性又は非競合性抑制剤として作用することができ、
ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチド又はＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリ成長因子作用の防止
又は低減が望ましい状況において有用なものであると予測される。従って、その
ようなレセプタ結合性ではあるが、非分化誘発性、非移動誘発性、非運動誘発性
、非生存促進性、非結合組織発達促進性、非損傷治癒又は非血管増殖誘発性の、
ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドのバリアントを、ここで、「レセプタ結合性であるが
、その他の点では不活性のバリアント」と称する。ＶＥＧＦ−Ｄは、そのレセプ
タを活性化するためにダイマーを形成するので、一つのモノマーが、上述した「
レセプタ結合性であるが、その他の点では不活性のバリアント」ＶＥＧＦ−Ｄポ
リペプチドで、第２のモノマーが野生型ＶＥＧＦ−Ｄ又は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ
ファミリの野生型成長因子であるものが考えられる。したがって、これらのダイ
マーは、その対応のレセプタには結合することができるが、下流側のシグナリン
グを誘発させることはできない。

【００４０】 更に、内皮細胞、結合組織細胞（線維芽細胞等）、筋線維芽細胞、及び／又は
間葉系細胞を含む細胞を非限定的に含む細胞上で、野生型ＶＥＧＦ−Ｄ又はＰＤ
ＧＦ／ＶＥＧＦファミリの野生型成長因子のその対応のレセプタに対する結合を
阻止することが可能なその他の修飾ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドが存在すると考え
られる。従って、これらのダイマーは、内皮細胞増殖、分化、移動、生存を刺激
したり、血管透過性を誘発したり、及び／又は、結合組織細胞、筋線維芽細胞又
は間葉系細胞の増殖及び／又は分化及び／又は運動性を刺激したりすることはで
きない。これらの修飾ポリペプチドは、ＶＥＧＦ−Ｄ成長因子又はＶＥＧＦ／Ｐ
ＤＧＦファミリの成長因子の競合性又は非競合性抑制剤として作用することがで
き、ＶＥＧＦ−Ｄ成長因子又はＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリ成長因子作用の防止
又は低減が望ましい状況において有用なものであると予測される。そのような状
況としては、一次又は転移腫瘍形成による腫瘍細胞の正常細胞集団への侵入中に
起こる組織リモデリングがある。従って、それらのＶＥＧＦ−Ｄ又はＰＤＧＦ／
ＶＥＧＦファミリ成長因子結合性であるが、非分裂誘発性、非分化誘発性、非移
動誘発性、非運動誘発性、非生存促進性、非結合組織発達促進性、非損傷治癒又
は非血管増殖誘発性である、ＶＥＧＦ−Ｄ成長因子のバリアントも、本発明の範
囲に含まれ、ここで、「ＶＥＧＦ−Ｄ成長因子−ダイマー形成性であるが、その
他に点では不活性又は妨害性のバリアント」と称する。

【００４１】 前記ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの可能な修飾形態は、ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチ
ドの修飾のための必須領域を標的化することによって作成することができる。こ
れらの必須領域は、強力に保存されたＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ相同性ドメイン（ＶＨ
Ｄ）に含まれると予想される。特に、ＶＥＧＦを含むＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミ
リの成長因子は、ダイマー性であり、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，
ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰｌＧＦ，ＰＤＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦ−Ｂは、前記ＶＨＤ中の８
つのシステイン残基の完全な保存を示す（オロフソン（Ｏｌｏｆｓｓｏｎ）他，
Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９９６ ９３
２５７６−２５８１; ジョーコブ（Ｊｏｕｋｏｖ）他，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９
９６ １５ ２９０−２９８）。これらのシステインは、分子内又は分子間ジス
ルフィド結合に関係していると考えられている。更に、Ｃ末端ドメインにおいて
完全ではないが強力に保存されたシステイン残基が存在する。細胞内ジスルフィ
ド結合によって形成される、各ＶＨＤサブユニットのループ１，２及び３は、Ｐ
ＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリの成長因子のレセプタへの結合に関与している（アン
ダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）他，Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ， １９９
５ １２ １５９−１６４）。修飾ポリペプチドのＶＥＧＦ−Ｄの生理活性を阻
止する能力は、内皮細胞増殖アッセイ等の標準的な活性アッセイ手法によって容
易にテストすることができる。

【００４２】 本発明において有用なＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストは、更に、ＶＥＧＦＲ−２
（Ｆｌｋ１）又はＶＥＧＦＲ−３（Ｆｌｔ４）のＶＥＧＦ−Ｄ結合ドメインに対
応するポリペプチドを有する分子を含むことができる。例えば、アチェン（Ａｃ
ｈｅｎ）他，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９５
: ５４８−５５３，１９９８に記載されている、ヒトＶＥＧＦＲ−２及びヒト
ＶＥＧＦＲ−３の細胞外ドメインを含み、ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣに結合する溶解
性Ｉｇ融合タンパク質は、ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストとして好適に使用可能で
ある。

【００４３】 メラノーマ及び種々の癌を治療、緩和する方法は、又、ＶＥＧＦ−Ｄ，ＶＥＧ
ＦＲ−２及び／又はＶＥＧＦＲ−３を発現する腫瘍を、その死滅のために、標的
化することによっても可能である。これは、ＶＥＧＦ−Ｄ，ＶＥＧＦＲ−２又は
ＶＥＧＦＲ−３を発現している腫瘍を殺傷するために、細胞毒物を、本発明のポ
リペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄ，ＶＥＧＦＲ−２又はＶＥＧＦＲ−３に対する抗体、
又は、ＶＥＧＦ−Ｄ，ＶＥＧＦＲ−２又はＶＥＧＦＲ−３に対する小分子に結合
させることによる。そのような細胞毒物としては、非限定的に、植物毒素（例え
ば、リチン（ｒｉｃｉｎ）Ａ鎖、サポリン）、バクテリア又は菌類毒（例えば、
ジフテリア毒素）又は放射性ヌクレオチド（例えば、２１１−アスタチン、２１
２−ビスマス、９０−イットリウム、１３１−ヨウ素、９９−テクニチウム）、
アルキル化剤（例えば、クロラムブシル（ｃｈｌｏｒａｍｂｕｃｉｌ））、抗有
糸分裂剤（例えば、ビンカ アルカロイド）、及びＤＮＡインターカレータ（例
えば、アドリアマイシン）がある。

【００４４】 ＶＥＧＦ−Ｄの生理活性を阻止する、前記ポリペプチド、ＶＥＧＦ−Ｄアンタ
ゴニスト又は抗体は、更に、それと、薬用的に許容可能な非毒性塩、及び薬用許
容可能な固体又は液体キャリア又は補助薬（ａｄｊｕｖａｎｔ）との組み合わせ
で使用することも可能である。好適な薬用組成物は、少なくともＶＥＧＦ−Ｄに
よって誘発される生理活性を阻止又はそれに干渉する。

【００４５】 そのようなキャリア又は補助薬の具体例としては、非限定的に、食塩水、緩衝
食塩水、リンガー溶液、鉱物油、タルク、コーンスターチ、ゼラチン、ラクトー
ス、スクロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、リン酸二カル
シウム、塩化ナトリウム、アルギン酸、デキストロース、水、グリセロール、エ
タノール、シックナー、安定剤、沈殿防止剤、そしてこれらの組み合わせがある
。それらの組成物は、溶液、懸濁液、タブレット、カプセル、クリーム、軟膏、
エリキシル、シロップ、ウエハー、軟こう剤、又は、その他の従来形状のものと
することができる。その製剤形態は、もちろん、その投与形態に応じて公知の原
理で調節することが可能である。本発明のペプチドを含む組成物は、前記活性組
成物（単数又は複数）を、約０．１〜９０重量％、最も一般的には、約１０〜３
０重量％含む。

【００４６】 投与量及び投与経路は、患者の性質及び治療される状態に応じたものとされ、
担当の医師又は獣医の自由裁量で決められる。適当な投与経路としては、経口、
皮下、筋肉内、腹膜内又は静脈内注射、非経口、局所塗布、移植等である。例え
ば、有効量の本発明のペプチド又は抗体は、それを必要とする生物に対して、約
０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重の投
与量で投与される。通常、長い循環半減期を示す人化抗体の場合、毎日〜毎月、
より好ましくは、毎週又は２週間毎、又は３週間毎の範囲の間隔での投与が具体
的に考えられる。治療の進展、患者の副作用、及び循環抗体レベルをモニターす
ることによっても、最適な投与養生法が案内される。他の抗体ベースの癌治療（
例えば、抗ＨＥＲ２，抗ＥＧＦレセプタ）に関して刊行されている現行の臨床実
験からのデータも、有用な投与量養生法ガイドを提供する。ＶＥＧＦ−Ｄの局所
塗布は、ＶＥＧＦと同様に使用することができる。

【００４７】 第２の態様によれば、本発明は、腫瘍形成成長部分又はその周囲の血管におけ
る血管内皮細胞の増加によって特徴付けられる、腫瘍形成疾患のスクリーニング
及び／又は診断方法を提供する。この方法は、腫瘍形成成長部分又はその周囲の
血管内皮細胞の増加によって特徴付けられる腫瘍形成疾患状態にあることが疑わ
れる生物からサンプルを得る工程と、前記サンプルをＶＥＧＦ−Ｄに特異的に結
合する化合物を有する組成物に露出させる工程と、前記サンプルを洗浄する工程
と、前記サンプル中の前記化合物の存在、量又は分布を検出することによって前
記疾患をスクリーニングする工程とを有し、潜在的腫瘍形成成長部分又はその周
囲の血管内皮細胞中、又は細胞上のＶＥＧＦ−Ｄの検出が腫瘍形成疾患を表す。
この方法は、更に、前記サンプルを、ＶＥＧＦＲ−２及び／又はＶＥＧＦＲ−３
に特異的に結合する第２の化合物に露出させる工程を有することができ、ここで
、前記スクリーニング工程は、ＶＥＧＦ−Ｄに結合する前記化合物と、血管内皮
細胞に結合した前記第２化合物を検出して、潜在的腫瘍形成成長部分内又はその
周囲の、ＶＥＧＦ−ＤとＶＥＧＦＲ−２及び／又はＶＥＧＦＲ−３との両方を有
する血管内皮細胞の存在、量又は分布を測定する。

【００４８】 この明細書の目的のために、「サンプル」という用語は、非限定的に、組織サ
ンプル、血液、血清、プラスマ、尿、腹水、又は、胸水を得ることを含むことが
明瞭に理解されるであろう。好ましくは、前記組織はヒト組織であり、前記化合
物は、好ましくはモノクローナル抗体である。前記第２化合物の使用は、医師が
、腫瘍中、又はその近傍で前記血管上に見つかったＶＥＧＦ−Ｄが、レセプタ媒
介取込みによって起こるものであることを確認するのに役立つことが理解される
であろう。これは、腫瘍細胞によって分泌されたＶＥＧＦ−Ｄは、標的内皮細胞
に結合し、その中で蓄積するという仮説を支持するものであり、これによってパ
ラクリンメカニズム調節腫瘍血管新生が確立される。

【００４９】 第３の態様によれば、本発明は、ＶＥＧＦ−Ｄの発現の増加によって特徴付け
られる腫瘍形成疾患をスクリーニング及び／又は診断する方法を提供する。この
方法は、ＶＥＧＦ−Ｄの発現の増加によって特徴付けられる疾患状態にあること
が疑われる生物からサンプルを得る工程と、前記サンプルをＶＥＧＦ−Ｄに特異
的に結合する化合物を有する組成物に露出させる工程と、前記サンプルを洗浄す
る工程と、前記サンプル中の前記化合物の存在、量又は分布を検出することによ
って前記疾患をスクリーニングする工程とを有し、潜在的腫瘍形成成長部分内又
はその周囲でのＶＥＧＦ−Ｄの検出は、腫瘍形成疾患を表すか、もしくは、潜在
的腫瘍形成成長部分内又はその周囲の血管内皮細胞内又は細胞上のＶＥＧＦ−Ｄ
の検出は、腫瘍形成疾患を表す。

【００５０】 第４の態様によれば、本発明は、リンパ管内皮細胞の変化によって特徴付けら
れる腫瘍形成疾患をスクリーニング及び／又は診断する方法を提供する。この方
法は、リンパ管内皮細胞の増加によって特徴付けられる疾患状態にあることが疑
われる生物からサンプルを得る工程と、前記サンプルをＶＥＧＦ−Ｄに特異的に
結合する化合物を有する組成物に対して露出させる工程と、前記サンプルを洗浄
する工程と、前記組織サンプル中の前記組成物の存在、量又は分布を検出するこ
とによって前記疾患をスクリーニングする工程とを有し、潜在的腫瘍形成成長部
分内又はその周囲のリンパ管内皮細胞上又は細胞内のＶＥＧＦ−Ｄの検出は、腫
瘍形成疾患を表す。この方法は、更に、前記組織サンプルを、ＶＥＧＦＲ−３に
特異的に結合する第２の化合物に対して露出させる工程を有し、ここで、前記ス
クリーニング工程において、ＶＥＧＦ−Ｄに結合する前記化合物と、リンパ管内
皮細胞に結合した前記第２化合物とを検出して、潜在的腫瘍形成成長部分内又は
その周囲でのＶＥＧＦ−ＤとＶＥＧＦＲ−３との両方を有するリンパ管内皮細胞
の存在、量又は分布を測定する。

【００５１】 前記第２化合物の使用は、医師が、腫瘍内又はその近傍で前記リンパ管上に見
つかったＶＥＧＦ−Ｄが、レセプタ媒介取込みによって起こるものであることを
確認するのに役立つことが理解されるであろう。これは、腫瘍細胞によって分泌
されたＶＥＧＦ−Ｄは、標的リンパ管内皮細胞に結合し、その中で蓄積するとい
う仮説を支持するものであり、これによってパラクリンメカニズム調節腫瘍リン
パ管新生が確立される。

【００５２】 第５の態様によれば、本発明は、生物の組織の脈管形成を維持する方法であっ
て、そのような治療を必要とする前記生物に対して、有効量のＶＥＧＦ−Ｄ又は
ＶＥＧＦ−Ｄの生理活性を有するそのフラグメント又はアナログを投与する方法
を提供する。

【００５３】 この第５の態様は、ＶＥＧＦ−Ｄ／ＶＥＧＦｓが、患者、特に、その末梢血管
が萎縮状態にある可能性のある高齢の患者の組織において限定的である場合に重
要であると考えられる。有効量のＶＥＧＦ−Ｄでの治療によって、老化／損傷血
管における内皮細胞の増殖を刺激することによって、血管系の健全性を維持する
のに役立つ。

【００５４】 好ましくは、前記ＶＥＧＦ−Ｄは、全長の、未プロセッシング状態のＶＥＧＦ
−Ｄ、又は、完全にプロセッシングされた、成熟形状のＶＥＧＦ−Ｄ、更に、こ
こに定義されるＶＥＧＦ−Ｄの生理活性を有する、前記全長及び成熟形状のＶＥ
ＧＦ−Ｄの両方のフラグメント又はアナログとして発現する。

【００５５】 本明細書において、「完全にプロセッシングされたＶＥＧＦ−Ｄ」という語句
は、成熟形態のＶＥＧＦ−Ｄポリペプチド、すなわち、Ｎ−及びＣ−末端プロペ
プチドの無い、配列識別番号３の配列を有するＶＥＧＦ相同性ドメイン（ＶＨＤ
）を意味するものであることが明瞭に理解されるであろう。「タンパク質分解プ
ロセッシングされた形態のＶＥＧＦ−Ｄ」という語句は、Ｎ−及び／又はＣ−末
端プロペプチドの無いＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドを意味し、「未プロセッシング
のＶＥＧＦ−Ｄ」という語句は、Ｎ−末端プロペプチドとＣ−末端プロペプチド
との両方を備えた配列識別番号２の配列を有する全長ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチド
を意味する。

【００５６】 配列識別番号２の配列を有する前記全長ＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドは、オプシ
ョンとして、ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに連結させることができる。前記全
長ＶＥＧＦ−ＤポリペプチドがＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに連結される場合
、そのフラグメントを、ここで、ＶＥＧＦ−Ｄ−ＦＵＬＬ−Ｎ−ＦＬＡＧと称す
る。ＶＥＧＦ−Ｄの好適なフラグメントは、アミノ酸残基９３からアミノ酸残基
２０１までのＶＥＧＦ−Ｄの部分（すなわち、ＶＨＤ（配列識別番号３））であ
り、オプションとしてＦＬＡＧ（登録商標）ペプチドに連結される。フラグメン
トがＦＬＡＧ（登録商標）に連結されている場合、そのフラグメントを、ここで
、ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣと称する。

【００５７】 前記「ＶＥＧＦ−Ｄの生理活性」という表現は、内皮細胞増殖、分化、移動、
生存又は血管透過性のいずれか一つ又は複数を刺激する能力を意味するものと理
解される。

【００５８】 同類置換、挿入又は欠失を有するが、それでもＶＥＧＦ−Ｄの生理活性を保持
しているポリペプチドが、本発明の範囲に含まれることは明らかである。当業者
にとって、そのようなポリペプチドを作り出すために使用可能な方法、例えば、
部位特異的突然変異や特異的酵素劈開及びライゲーションは周知であろう。当業
者には、又、ペプチド擬似化合物、又は、単数又は複数のアミノ酸残基が非自然
発生アミノ酸又はアミノ酸アナログによって置換された化合物は、ＶＥＧＦ−Ｄ
の生理活性の必要な要素を保持可能であることも周知であろう。そのような化合
物は、当該技術において公知の方法によって容易に製造、テストすることができ
、それらも又、本発明の範囲に含まれる。

【００５９】 好ましくは、アミノ酸置換が使用される場合、その置換は、同類、すなわち、
一つのアミノ酸は、類似のサイズで、電荷特性が類似のものによって置き換えら
れる。

【００６０】 ここでの使用において、「同類置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔ
ｉｔｕｔｉｏｎ）」という用語は、アミノ酸残基の、別の生物学的に類似の残基
による置換を指す。同類置換の具体例としては、イソロイシン、バリン、ロイシ
ン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプロ
ファン、チロシン、ノルロイシン、又はメチオニン等の疎水性残基の、別の残基
との置換や、ある極性の残基の別の極性の残基との置換、例えば、リジンに対す
るアルギニンの置換、アスパラギン酸に対するグルタミン酸の置換、アスパラギ
ンに対するグルタミンの置換等がある。互いに置換可能な中性の親水性アミノ酸
には、アスパラギン、グルタミン、セリン、及びスレオニンがある。「同類置換
」という用語は、更に、置換されない親のアミノ酸の代わりに、置換されたアミ
ノ酸を使用することも含む。

【００６１】 従って、本発明の文脈において、同類置換は、当該技術において、一つのアミ
ノ酸を、それに類似の性質を有する別のアミノ酸によって置換すること、として
認識されているものと理解される。同類置換の具体例を、ＷＯ９７／０９４３３
から引用する次の表Ａに示す。

【００６２】

【表１】

【００６３】 或いは、同類アミノ酸は、下記の表Ｂに示されているように、レーニンジャー
（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ）， （Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， 第２版; Ｗｏｒ
ｔｈ Ｐｕｂｐｌｉｓｈｅｒｓ， Ｉｎｃ． ＮＹ：ＮＹ （１９７５）， ｐ
ｐ．７１−７７）に記載されているようにグループ分けすることができる。

【００６４】

【表２】

【００６５】 同類置換の具体例を下記の表Ｃに示す。

【００６６】

【表３】

【００６７】 ＶＥＧＦとＶＥＧＦ−Ｂで起こることが知られている、オルタナティブなスプ
ライシングから得ることができるＶＥＧＦ−Ｄポリペプチドの可能なバリアント
形態と、ＶＥＧＦ−Ｄをコードする核酸配列の自然発生対立遺伝子バリアントは
、本発明の範囲に含まれる。対立遺伝子バリアントは周知であり、単数又は複数
のヌクレオチドの置換、欠失、又は追加を有するが、そのコードされたポリペプ
チドの機能に大きな変化がない別形態の核酸配列をいう。

【００６８】 そのようなＶＥＧＦ−Ｄのバリアント形態は、修飾のためにＶＥＧＦ−Ｄポリ
ペプチドの非必須領域を標的化することによって作成することができる。これら
の非必須領域は、強力に保存された領域の範囲外にあるものと予想される。特に
、ＶＥＧＦを含む、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリの成長因子は、ダイマー性であ
り、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ，ＶＥＧＦ−Ｃ，ＶＥＧＦ−Ｄ，ＰｌＧＦ、ＰＤＧ
Ｆ−Ａ及びＰＤＧＦ−Ｂは、Ｎ末端ドメイン、すなわち、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦ様
ドメインの８つのシステイン残基の完全な保存を示す（オロフソン（Ｏｌｏｆｓ
ｓｏｎ）他，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， １９
９６ ９３ ２５７６−２５８１; ジョーコブ（Ｊｏｕｋｏｖ）他，ＥＭＢＯ
Ｊ．，１９９６ １５ ２９０−２９８）。これらのシステインは、分子内及
び分子間ジスルフィド結合に関与していると考えられている。更に、Ｃ末端ドメ
インには、別の、強力ではあるが、完全にではなく保存されたシステイン残基が
存在する。分子内ジスルフィド結合によって形成される、各ＶＨＤサブユニット
のループ１，２及び３は、ＰＤＧＦ／ＶＥＧＦファミリの成長因子のレセプタへ
の結合に関与している（アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ）他，Ｇｒｏｗｔｈ
Ｆａｃｔｏｒｓ， １９９５ １２ １５９−１６４）。

【００６９】 当業者には、これらのシステイン残基が、すべての提案されるバリアント形態
において保存されるはずであり、かつ、ループ１，２及び３に存在する活性部位
もまた保存されるはずである、ということは周知である。しかしながら、前記分
子の他の領域は、生物機能に関して重要性が低いものであると予測でき、従って
、修飾のための適切な標的を提供するものである。修飾ポリペプチドの、ＶＥＧ
Ｆ−Ｄの生理活性を示す能力は、内皮細胞増殖アッセイ等の標準的な活性アッセ
イ手法によって容易にテストすることができる。

【００７０】 ＶＥＧＦ−Ｄの強力なシグナルが、造血細胞のサブセットに存在することが示
されている。これらの細胞は、一種の炎症反応によって、ある種の腫瘍の周部領
域に多量に侵入する。従って、このプロセスを抑制することは、この炎症反応を
阻止することが望ましい場合に有用であろう。

【００７１】 従って、本発明の第６の態様は、これらの腫瘍のこの造血細胞のサブセットに
よって起こる前記炎症反応を抑制する方法であって、この造血細胞のサブセット
によるＶＥＧＦ−Ｄの発現又は活性を抑制する工程を有する方法を提供する。こ
の種の炎症反応を抑制することは、例えば関節炎等の自己免疫疾患の治療に使用
可能であると考えられる。

【００７２】 本発明による抗体は、更に、検出可能な標識によって標識化し、診断目的のた
めに利用することができる。この抗体は、イメージングの為に、適当な、超磁性
、常磁性、高電子密度、エコジェニック（ｅｃｏｇｅｎｉｃ）、又は放射性の物
質に、共有又は非共有的に結合させることができる。診断アッセイ用として、放
射性又は非放射性標識を使用することができる。放射性標識の具体例としては、 ^１２５ Ｉや^３２Ｐ等の、放射性原子又は基がある。非放射性標識の具体例として
は、ホースラディシュペルオキシダーゼ等の酵素標識又は、フルオレセイン−５
−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）等の蛍光標識がある。標識は、直接的又は間
接的、共有結合的又は非共有結合的に行うことができる。

【００７３】 本発明の更に別の態様によれば、本発明は、ＶＥＧＦ−Ｄの発現によって特徴
付けられる腫瘍形成疾患、例えば、悪性メラノーマ、乳腺管癌、扁平上皮癌、前
立腺癌及び子宮内膜癌を患う生物、例えば哺乳動物、を治療する方法に関し、こ
の方法は、ＶＥＧＦ−Ｄがその対応するレセプタに結合することを防止するため
に、前記腫瘍の近傍に、有効量のＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストを投与する工程を
有する。所望の場合には、細胞毒素を前記ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストと共に投
与することができる。好適なＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストは、ＶＥＧＦ−Ｄに特
異的に結合し、ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦレセプタ−２又はＶＥＧＦレセプタ−３
への結合を阻止するモノクローナル抗体、特に、ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦ相同性
ドメインに結合する抗体である。

【００７４】 更に別の態様において、本発明は、転移リスクについて腫瘍をスクリーニング
する方法であって、腫瘍サンプルをＶＥＧＦ−Ｄに特異的に結合する化合物を有
する組成物に対して露出させる工程と、前記サンプルを洗浄する工程と、前記サ
ンプル中の前記化合物の存在、量又は分布を検出することによって転移リスクを
スクリーニングする工程とを有し、前記腫瘍によるＶＥＧＦ−Ｄの発現が転移リ
スクを示す方法に関する。本発明のこの態様に使用される好適な化合物は、ＶＥ
ＧＦ−Ｄに特異的に結合するモノクローナル抗体、特に、ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧ
Ｆ相同性ドメインに結合し、検出可能な標識によってラベルされた抗体である。

【００７５】 本発明の更に別の態様は、ＶＥＧＦ−Ｄの発現の増加によって特徴付けられる
腫瘍形成疾患状態の微小転移巣を検出する方法であって、前記腫瘍形成疾患状態
にある生物の、腫瘍形成成長部分から離間した部位、例えば、前記腫瘍形成成長
部分の周囲の組織からのリンパ節、からの組織サンプルを得る工程と、前記サン
プルを、ＶＥＧＦ−Ｄに特異的に結合する化合物を有する組成物に対して露出さ
せる工程と、前記サンプルを洗浄する工程と、前記組織サンプル中の前記化合物
の存在、量、又は分布を検出することによって前記腫瘍形成疾患の前記転移をス
クリーニングする工程とを有し、前記組織サンプル中のＶＥＧＦ−Ｄの検出が前
記腫瘍形成疾患の転移を表す方法に関する。ここでも、好適な化合物は、ＶＥＧ
Ｆ−Ｄに特異的に結合するモノクローナル抗体、特に、ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦ
相同性ドメインに結合し、検出可能な標識によってラベルされた抗体である。

【００７６】 この明細書の目的のために、「有する“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”」という語は
、「非限定的に含む」ということを意味することが明瞭に理解されるであろう。
「有する“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”」という語にも対応の意味が当てはまる。

【００７７】 好適実施例の詳細な説明例１ ヒトＶＥＧＦ−Ｄに結合するモノクローナル抗体の製造 Ｎ−及びＣ−末端プロペプチドではなくＶＥＧＦ／ＰＤＧＦ相同性ドメイン（
ＶＨＤ）を検出するために、成熟形態のヒトＶＥＧＦ−Ｄに対するモノクローナ
ル抗体（全長ＶＥＧＦ−Ｄ（配列識別番号２）の残基９３〜２０１、すなわち、
Ｎ−及びＣ−末端領域を除去したもの）を、マウス内で作製した。残基９３〜２
０１をコードするＤＮＡフラグメントを、全長ヒトＶＥＧＦ−ＤｃＤＮＡを有す
るプラスミド（配列識別番号１）をテンプレートとして使用して、ＰｆｕＤＮＡ
ポリメラーゼによるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。次に、
その正確性をヌクレオチド配列決定によって確認した、前記増幅ＤＮＡフラグメ
ントを、発現ベクタｐＥＦＢＯＳＳＦＬＡＧ（Ｗａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚ
ａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ （ＷＥＨＩ），メルボルン、オーストラリアのクレア マクファーレン（Ｃ
ｌａｒｅ ＭｃＦａｒｌｅｎｅ）博士から贈与）に挿入し、ｐＥＦＢＯＳＶＥＧ
Ｆ−ＤΔＮΔＣと名づけるプラスミドを得た。前記ｐＥＦＢＯＳＳＦＬＡＧベク
タは、インターロイキン−３（ＩＬ−３）遺伝子由来のタンパク質分泌のシグナ
ル配列をコードするＤＮＡと、ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド（Ｓｉｇｍ
ａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含んでいる。前記ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド
は、Ｍ２モノクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）等の市販の抗体に
よって認識することができる。ＩＬ−３シグナル配列が切頭（ｔｒｕｎｃａｔｅ
ｄ）ＶＥＧＦ−Ｄ配列のすぐ上流側にある前記ＦＬＡＧ配列（登録商標）からす
ぐ上流側となるように、前記ＶＥＧＦ−Ｄ ＰＣＲフラグメントを前記ベクタに
挿入した。三つのすべての配列は同じ読み取り枠にあったので、ｐＥＢＯＳＶＥ
ＧＦ−ＤΔＮΔＣを哺乳動物細胞にトランスフェクションすることにより生じる
ｍＲＮＡが翻訳されると、前記ＩＬ−３シグナル配列をそのＮ末端として、そし
て、そのあとに、前記ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドと、前記切断ＶＥＧ
Ｆ−Ｄ配列とを有するタンパク質が得られるということになる。前記シグナル配
列の劈開と、その後の前記細胞からのタンパク質の分泌によって、Ｎ末端に近接
してＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドによってタグされたＶＥＧＦ−Ｄポリ
ペプチドが得られるということになる。ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣを、あらかじめプ
ラスミドｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣによって一時的にトランスフェクト
しておいたＣＯＳ細胞の培地からの抗ＦＬＡＧ（登録商標）親和性クロマトグラ
フィによって精製した（国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６の例９を参
照）。

【００７８】 精製ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣを使用して、免疫化したマウスから脾臓細胞を収穫
する前８５日（腹腔内）、７１日（腹腔内）、及び４日（静脈内）にメスＢｌｂ
／Ｃマウスを免疫化し、その後、これらの脾臓細胞をマウスメラノーマｐ３Ｘ６
３Ａｇ８．６５３（ＮＳ−１）細胞に融合させた。最初の二回に免疫では、ＰＢ
ＳとＴｉｔｅｒＭａｘ補助薬（＃Ｒ−１ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｄｊｕｖａｎｔ
; ＣｙｔＲｘ Ｃｏｒｐ．， Ｎｏｒｃｒｏｓｓ， ＧＡ）との１：１の混合
物中の約１０μgのＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣを注射したのに対して、第３回目の免
疫では、ＰＢＳ中の３５μgのＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣを使用した。

【００７９】 酵素イムノアッセイを使用した精製ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣ上でのハイブリドー
マのスクリーニングによってＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣに対するモノクローナル抗体
を選択した。簡単に説明すると、９６ウェルマイクロタイタプレートを、ＶＥＧ
Ｆ−ＤΔＮΔＣでコーティングし、ハイブリドーマ上清を添加し、４℃で２時間
インキュベートし、その後０．０２％のツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を含むＰＢ
Ｓ中で６回洗浄した。その後、ホースラディシュペルオキシダーゼ結合抗マウス
Ｉｇ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ， Ｈｅｒｃｕｌｅｓ， ＣＡ）でのインキュベーション
を、４℃で１時間行った。洗浄後、前記アッセイを、２，２´−アジノ−ジ−（
３−エチルベンズ−チアゾリンスルホン酸）（ＡＢＴＳ）基質系（Ｚｙｍｅｄ，
サンフランシスコ、ＣＡ）によって現像し、アッセイを、マルチウェルプレー
トリーダ（Ｆｌｏｗ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＭＣＣ／３４０， ＭｃＬｅ
ａｎ， ＶＡ）で４０５ｎｍの吸光度を読み取ることによって定量化した。更な
る分析のために６つの抗体を選択し、これらを限界希釈によって２回サブクロー
ン化した。これらの抗体を、２Ｆ８， ３Ｃ１０，４Ａ５， ４Ｅ１０， ４Ｈ
４， ５Ｆ１２と命名した。これらの抗体のアイソタイプを、Ｉｓｏｓｔｒｉｐ
アイソタイピングキット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ， インデ
ィアナポリス、ＩＮ）を使用して測定した。抗体２Ｆ８，４Ａ５，４Ｅ１０，５
Ｆ１２は、ＩｇＧ_１クラスであったのに対して、４Ｈ４と３Ｃ１０とは、ＩｇＭ
クラスであった。６つの抗体はすべてカッパ軽鎖を含んでいた。

【００８０】 ハイブリドーマ細胞系を、５％ｖ／ｖのＩｇＧ枯渇血清（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ
， Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ， ＭＤ）、５ｍＭ Ｌ−グルタミン、５０μｇ
／ｍｌのゲンタマイシン、そして１０μｌ／ｍｌの組換えＩＬ−６を含有するＤ
ＭＥＭ中で増殖させた。抗体２Ｆ８，４Ａ５，４Ｅ１０，５Ｆ１２を、ダーベイ
（Ｄａｒｂｙ）他，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ １５９: １２
５−１２９， １９９３の技術によってプロテインＧ−セファロースを使用した
親和性クロマトグラフィによって精製し、その収量を２８０ｎｍでの吸光度を測
定することによって評価した。

【００８１】例２ ４Ａ５の特異性 ヒトＶＥＧＦ−ＤのＶＨＤに対するＭＡｂ ４Ａ５（ＶＤ１と改名）の特異性
をウェスタンブロッティング分析によって評価した。使用したＶＥＧＦ−Ｄの誘
導体は、前記ＦＬＡＧオクタペプチドによってＮ末端がタグされたヒトＶＥＧＦ
−Ｄのアミノ酸残基５９３−２０１から成るＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣ（例１）と、
Ｎ末端がＦＬＡＧ（登録商標）によってタグされた全長ＶＥＧＦ−Ｄから成るＶ
ＥＧＦ−Ｄ−ＦＵＬＬ−Ｎ−ＦＬＡＧ（スタッカー（Ｓｔａｃｋｅｒ）Ｓ．Ａ．
他， Ｊ． Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４: ３２１２７−３２１３６， １９
９９）と、これもＮ末端がＦＬＡＧ（登録商標）によってタグされた、アミノ酸
残基２０６−３５４のＣ末端プロペプチドからなるＶＥＧＦ−Ｄ−ＣＰＲＯとで
あった。これらのタンパク質を、２９３−ＥＢＮＡ−１細胞中に発現させ、アチ
ェン（Ａｃｈｅｎ）Ｍ．他，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ９５: ５４８−５５３， １９９８に記載の手法を使用したＭ２（抗
ＦＬＡＧ（登録商標））ＭＡｂ（ＩＢＩ／Ｋｏｄａｋ，ニューヘブン、ＣＴ）の
親和性クロマトグラフィによって精製した。各５０ナノグラムの、精製ＶＥＧＦ
−Ｄ−ＦＵＬＬ−Ｎ−ＦＬＡＧ（ＦＮ）， ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣ（ΔΔ）、及
びＶＥＧＦ−Ｄ−ＣＰＲＯ（ＣＰ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（還元）と、ＶＤ１
ＭＡｂと対照としてビオチニル化Ｍ２ ＭＡｂを使用したウェスタンブロッティ
ングとによって分析した（ブロッティングに使用した抗体を、図２のパネルの下
部に示す）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウェスタンブロッティング分析とは、スタッカ
ー（Ｓｔａｃｋｅｒ）Ｓ．Ａ．他， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４: ３２
１２７−３２１３６，１９９９に記載されている要領で行った。

【００８２】 図２に図示されているように、ＶＥＧＦ−Ｄ−ＦＵＬＬ−Ｎ−ＦＬＡＧのサン
プル中において優勢な種は、未プロセッシングＶＥＧＦ−Ｄ（Ｍｒ〜５３Ｋ）、
Ｎ末端プロペプチドとＶＨＤ（〜３１Ｋ）との両方を含む部分プロセッシングＶ
ＥＧＦ−Ｄと、Ｎ末端プロペプチド（〜１０Ｋ）とから成り（スタッカー（Ｓｔ
ａｃｋｅｒ）Ｓ．Ａ．他，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４: ３２１２７−３
２１３６， １９９９）、これらはすべて、ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチ
ドによってタグされていることによって、Ｍ２ ＭＡｂによって検出される（左
側への矢印、数字はＫでのＭｒを表し、添字は、そのバンドが検出されるサンプ
ルを示す）。同様に、ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣ（〜２１Ｋ）と、ＶＥＧＦ−Ｄ−Ｃ
ＰＲＯ（異なるグリコシレート化によって生じる〜３１と〜２９Ｋの二つのバン
ド）は、これらのポリペプチドもＦＬＡＧ（登録商標）によってタグされている
ため、Ｍ２（左側への矢印）によって検出される。ＶＤ１は、未プロセッシング
ＶＥＧＦ−Ｄ、部分プロセッシングＶＥＧＦ−Ｄ及びＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣは検
出するが、ＶＥＧＦ−Ｄ−ＦＵＬＬ−Ｎ−ＦＬＡＧ調整物中のＮ末端プロペプチ
ド（〜１０Ｋ）や、ＶＥＧＦ−Ｄ−ＣＰＲＯサンプル（〜３１及び〜２９Ｋ）中
のＣ末端プロペプチドは検出しない。ＶＥＧＦ−Ｄ−ＦＵＬＬ−Ｎ−ＦＬＡＧで
の結果を、長時間（Ｌ）及び短時間（Ｓ）露出によって分析した。分子量マーカ
の位置は、図２の右側に示されている。

【００８３】 従って、ＭＡｂ ＶＤ１は、未プロセッシングＶＥＧＦ−Ｄ、ＶＨＳを含む部
分プロセッシング形態と完全プロセッシングＶＥＧＦ−Ｄとには結合するが、Ｎ
−又はＣ−末端プロペプチドには結合しない。更に、ＭＡｂ ＶＤ１は、酵素イ
ムノアッセイにおいて天然ヒトＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣは免疫沈降させるが、ヒト
ＶＥＧＦ−Ｃ（ＶＥＧＦ−ＣΔＮΔＣ）のＶＨＤは免疫沈降させず（ジューコフ
（Ｊｏｕｋｏｖ）Ｖ．他，ＥＭＢＯ Ｊ １６: ３８９８−３９１１， １９
９７）、ＶＤ１がＶＥＧＦ−Ｄに対して特異的であることを示している。

【００８４】例３ マウス胚におけるＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子発現のイン・サイチュ ハイブリダ イゼーション研究 ＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子発現のバターンを、マウスＶＥＧＦ−Ｄ１ ｃＤＮＡのヌ
クレオチド１−３４０（配列識別番号４）に対応する放射標識アンチセンスＲＮ
Ａプローブを使用したイン・サイチュ ハイブリダイゼーションによって調べた
。このアンチセンスＲＮＡは、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼと［^３５Ｓ］ＵＴＰα
ｓとのイン・ヴィトロ転写によって合成されたものである。マウスＶＥＧＦ−Ｄ
は、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）に完
全に記載されている。このアンチセンスＲＮＡプローブを、性交後１５．５日の
マウス胚のパラフィン包埋組織部分にハイブリダイズした。標識部分を、２日間
オートラジオグラフィにかけた。前記アンチセンスＲＮＡと、相補的なセンスＲ
ＮＡ（ネガティブ対照実験として）とにハイブリダイズされた部分から得られた
オートラジオグラフを、図３に示す。図３において、“Ｌ”は、肺を示し、“Ｓ
ｋ”は皮膚を示し、二つの組織部分が連続部分として図示されている。ＶＥＧＦ
−Ｄ ｍＲＮＡに対する強いシグナルが、発達中の肺に検出され、皮膚と関連つ
けられた。前記対照実験 センスＲＮＡを使用した場合はシグナルは検出されな
かった。

【００８５】 図４Ａ−４Ｄにおいて、矢状組織断面を、前記ＶＥＧＦ−ＤアンチセンスＲＮ
Ａプローブとハイブリダイズし、その後、写真乳剤とインキュベートし、現像し
、染色した。図４Ａと４Ｄの倍率は×４０、図４Ｂでは×２００、そして図４Ｃ
では×５００である。

【００８６】 図４Ａにおいて、暗視野顕微鏡写真図は、肺（Ｌｕ）においてＶＥＧＦ−Ｄ
ｍＲＮＡの強いシグナルを示している。肝臓（Ｌｉ）と肋骨（Ｒ）も図示されて
いる。図４Ｂは、肺をより高い倍率で示している。この明視野顕微鏡写真図は、
気管支（Ｂｒ）と気管支動脈（ＢＡ）を示している。矩形の黒色のアウトライン
は、図４Ｃに図示されている断面をより高い倍率で示している。図４Ｃは、気管
支の内皮細胞（Ｅｐ）、内皮細胞層を取り巻く成長中の平滑筋細胞（ＳＭ）、間
葉系細胞（Ｍｅｓ）を図示している。間葉系細胞に関連する銀粒子が多量に存在
することが明らかである。従って、顕微鏡分析は、発達中の肺の間葉系細胞にＶ
ＥＧＦ−Ｄ ｍＲＮＡが豊富に存在していることを示している（図４Ａ−４Ｃ）
。これに対して、気管支と細気管支の内皮細胞は陰性であり、気管支を取り巻く
発達中の平滑筋細胞も同様であった。気管支動脈の内皮細胞も陰性であった。

【００８７】 図４Ｄにおいて、暗視野顕微鏡写真は、肢芽を図示している。線維芽細胞と発
達中のメラニン形成細胞の豊富な組織の領域において皮膚の真下に強いシグナル
が位置していた。

【００８８】 これらの結果は、ＶＥＧＦ−Ｄが、血管及びリンパ管を、発達中の肺と皮膚の
真下の領域とに誘引することができるということを示している。胚の皮膚近傍に
おけるＶＥＧＦ−Ｄ遺伝子の発現により、ＶＥＧＦ−Ｄは、悪性メラノーマに関
連する血管新生を誘発するのに役割を果たしている可能性があると考えられる。
悪性メラノーマは、非常に高度に血管化した腫瘍である。このことは、例えば、
ＶＥＧＦ−Ｄ又はＶＥＧＦレセプタ−２又はＶＥＧＦレセプタ−３抗体を使用し
たＶＥＧＦ−Ｄ発現の局所的抑制が、悪性メラノーマの治療に有用であることを
示唆している。アンチセンス核酸又は３本鎖ＤＮＡ等のその他適当なＶＥＧＦ−
Ｄ活性のインヒビタを使用することも可能である。

【００８９】例４ ヒト腫瘍の免疫組織化学的分析のためのヒトＶＥＧＦ−Ｄに対するモノク ローナル抗体の使用 腫瘍血管新生におけるＶＥＧＦ−Ｄの役割を評価するために、ＶＥＧＦ−Ｄ
ＭＡｂである，４Ａ５，５Ｆ１２及び２Ｆ８（それぞれ、ＶＤ１， ＶＤ２，及
びＶＤ３と改名する）を、１５のランダムに選択された浸潤性悪性メラノーマの
免疫組織化学的分析に使用した。更にこの分析には、ヒトＶＥＧＦ−２に対する
ＭＡｂｓ（Ｓｉｇｍａ， Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とＶＥＧＦＲ−３に
対するポリクローナル抗体（アフィニティ精製抗ヒトＦｌｔ−４抗体；Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ，ミネアポリス、ＭＮ）も使用した。ＬＭＭ７７４と命名された
、顆粒球コロニー刺激因子のレセプタに対して作製されたＭＡｂ（ライトン（Ｌ
ａｙｔｏｎ）他， Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １４: １１７−１３０，
１９９７）をネガティブ対照実験として使用した。ＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂと同
様、ＬＭＭ７７４は、マウスＩｇＧ_１アイソタイプであり、従って、アイソタイ
プ合致対照抗体として作用した。ホルマリンで固定しパラフィン包埋した皮膚悪
性メラノーマ組織の５マイクロメートル厚の断面を、テスト組織として使用した
。これらの断面を、脱蝋し、再水化し、次にＰＢＳで洗浄した。一次抗体を、イ
ンキュベーション時間に応じて５−４０μｇ／ｍｌの濃度で組織断面とインキュ
ベートした。一次抗体を省略したステップ省略対照実験を平行して行い、更に、
組織断面とのインキュベーション前に、抗ＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂｓが、４０倍の
モル過剰のＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣと、室温で１時間インキュベートされた吸着対
照実験も行った。ＬＭＭ７７４を用いたアイソタイプ合致対照実験も行った。ア
ルカリフォスファターゼ結合二次抗体の検出を、ファスチト・レッド・サブスト
レート（Ｆａｓｔ Ｒｅｄ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）（Ｓｉｇｍａ，セントルイス
，ＭＯ）を使用して行った。いくつかのケースにおいて、組織断面を、免疫組織
化学的分析の前に、０．２５％過マンガン酸カリウム中での３時間のインキュベ
ーションと、その後の、１％シュウ酸中での６分間のインキュベーションとによ
ってメラニンを漂白した。これらのケースにおいて、ペルオキシダーゼ結合二次
抗体の検出は、３，３´−ジアミノベンザジン（ＤＡＢ）（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ
．， Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ， ＣＡ）を使用して行った。

【００９０】 実質的に同じ染色パターンで、三つのＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂすべてで陽性反応
が見られた。ＶＥＧＦ−Ｄ免疫反応性が、テストされた１５のメラノーマのうち
、１３で検出された。これらのメラノーマは、病巣全部を通した均質な染色から
、病巣の浸潤性周部での反応の局在に渡る、反応パターンを示した。

【００９１】 図５Ａ−５Ｈは、異なる反応パターンを例示する二つの腫瘍からの免疫組織化
学的分析の結果を示している。図５Ａと５Ｂの抗体検出は、ファスト・レッド・
サブストレート（赤色は陽性シグナルを示す）でのものであり、図５Ｃ−５Ｈに
おいては、前記ＤＡＢ（茶色が陽性シグナルを示す）でのものである。図５Ｃ−
５Ｈに図示されている組織断面は、抗体とのインキュベーションの前に、メラニ
ンを漂白した。図５Ｅと５Ｇとを除いて、すべてのパネルで使用されたＶＥＧＦ
−Ｄ抗体は、ＶＤ１（４Ａ５）であった。図５Ａ中の縮尺バーは１５０μｍを示
し、図５Ｂ−５Ｄにおいては２０μｍ、そして図５Ｅ−５Ｈでは１０μｍを表す
。

【００９２】 図５Ａ及び５Ｂに見られるように、前記第１のメラノーマの大部分を通じて不
均質な染色が明らかであった。この腫瘍において、検出されたＶＥＧＦ−Ｄ染色
は、腫瘍の主部分の浸潤性部分の周部の腫瘍細胞の皮内巣（白い矢印）において
より顕著であり、中央部分では顕著でないか検出不能である。ＶＥＧＦ−Ｄは、
又、陽性反応腫瘍細胞に近接した乳頭状及び網状真皮の小毛細管サイズの脈管（
白い矢印）（図５Ｂ）と、毛細血管前及び後毛細管小静脈サイズであるより壁厚
の大きな血管でも検出される。

【００９３】 図５Ｃに見られるように、前記第２のメラノーマにおいて、ＶＥＧＦ−Ｄは、
腫瘍塊全体を通じてより均一に分布し、腫瘍の血管と腫瘍細胞とにおいて検出さ
れた。陰性染色であったストロマの領域は、黒い星印で示されている。

【００９４】 上述した腫瘍の両方において、腫瘍から離間した上皮毛細管及び他の血管、そ
して、腫瘍から離間した中間及び深くの網状皮膚と汗腺とは、非常に弱い管壁染
色を示すか、もしくは管壁染色を示さず、免疫反応性腫瘍細胞の近傍の小脈管に
見られる顆粒状の細胞質内皮細胞染色を示さなかった。非腫瘍形成性結合性メラ
ニン形成細胞も陰性であり、ＶＥＧＦ−Ｄが成体皮膚においてこの細胞タイプに
は発現しないということを示している。図５Ｃの組織の連続断面対照である図５
Ｄは、前記吸着対照実験が陰性であったことを示している。段階的除去対照実験
と、アイソタイプ合致対照実験も陰性であった。

【００９５】 成体組織のリンパ管の内皮細胞上に発現するＶＥＧＦ−ＤのレセプタであるＶ
ＥＧＦＲ−３の局在性について悪性メラノーマの断面を分析した（リンボウサッ
キ（Ｌｙｍｂｏｕｓｓａｋｉ）Ａ．他，Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈｏｌ．， １５
３: ３９４−４０３， １９９８）。図５Ｅに見られるように、ＶＥＧＦＲ−
３は、メラノーマの薄壁脈管（白色の矢印）の内皮細胞に検出された。腫瘍細胞
の近傍のＶＥＧＦＲ−３陽性脈管は、連続断面の免疫組織化学分析で評価した時
、ＶＥＧＦ−Ｄも陽性であり（図５Ｆ）、これらの脈管のＶＥＧＦ−Ｄ免疫反応
性が、内皮細胞へのレセプタ媒介取込みによって発生する可能性があることを示
唆した。ＶＥＧＦＲ−２の局在性に関しても断面を免疫組織化学的に分析した。
ＶＥＧＦＲ−２は、腫瘍の血管の内皮においてアップレギュレートされることが
知られている（プレート（Ｐｌａｔｅ）Ｋ．他， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５
３: ５８２２−５８２７， １９９３）。図５Ｇに見られるように、ＶＥＧＦ
Ｒ−２は、血管の内皮（白色矢印）と、その近傍のメラノーマとに検出された。
ＶＥＧＦＲ−２について免疫陽性であった脈管の一部は、ＶＥＧＦ−Ｄに関して
も陽性であり（図５Ｈの白色矢印）、これは腫瘍細胞へのＶＥＧＦ−Ｄの取込み
がこのレセプタによっても媒介される可能性があることを示唆している。

【００９６】例５ 肺癌におけるＶＥＧＦ−Ｄ 新血管新生は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の有用な予後指標であると考えら
れている（フォンタニーニ（Ｆｏｎｔａｎｉｎｉ）Ｇ．他，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃ
ｅｒ Ｒｅｓ． ３: ８６１−８６５， １９９７）。従って、ＶＥＧＦ−Ｄ
の局在性を、免疫組織化学分析によって、肺の扁平上皮癌の場合について分析し
た（図６Ａ−６Ｆ）。免疫組織化学分析は、アルファ平滑筋アクチンに対する抗
体（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）が免疫染色する
ためにも使用されたことを除き、例４と同様に行われた。図６Ａ及び６Ｄにおい
て免疫染色に使用された抗ＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂはＶＤ１（４Ａ５）であった。
図６Ａは、ＶＥＧＦ−Ｄが、顕微鏡写真の中心の島を形成する腫瘍細胞と、隣接
する大脈管をライニングする細胞と、線維形成性ストロマ内の細胞とにおいて検
出されたことを示している。線維形成性ストロマは黒色ブラケット内に図示され
ており、破線のボックスは図６Ｄにおいて高い倍率で図示されている領域を示し
ている。ストロマの免疫陽性細胞は、筋線維芽細胞であるかもしれない。

【００９７】 図６Ｂは、ＶＥＧＦＲ−２が、大脈管をライニングする細胞に検出されること
を示している。しかしながら、これらの脈管は、この腫瘍においてＶＥＧＦＲ−
３に関しては陰性であった。破線のボックスは図６Ｅにおいて高い倍率で図示さ
れている領域を示している。ＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂが、４０倍のモル過剰のヒト
ＶＥＧＦ−ＤのＶＨＤと予めインキュベートされた同じケースからの組織断面の
対照染色では、シグナルがなかった（図６Ｃ）。

【００９８】 上述したように、線維形成性ストロマの免疫陽性細胞は、筋線維芽細胞である
かもしれない。従って、線維形成性ストロマを、筋線維芽細胞を検出するアルフ
ァ平滑筋アクチンに対して特異的なＭＡｂｓを使用して免疫染色した。図６Ｆに
見られるように、ストロマは陽性に染色され、筋線維芽細胞の存在を示した。ス
トロマ成分による脈管形成因子の分泌は、腫瘍によって発生する血管新生刺激を
増幅するのに役立つかもしれない。

【００９９】例６ 乳癌におけるＶＥＧＦ−Ｄ ＶＥＧＦ−Ｄの局在性を、免疫組織化学分析によってイン・サイチュで乳腺管
癌も分析した。その結果を図７Ａ−７Ｆに示す。この免疫組織化学分析は、アル
ファ平滑筋アクチン（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ， Ｃ
Ａ）と、血小板／内皮固着分子（ＰＥＣＡＭ） （ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．， Ｃ
ａｒｐｉｎｔｅｒｉａ， ＣＡ）とに対して特異的なＭＡｂｓを免疫染色するた
めにも使用したことを除いて、例４と同様に行った。図７Ａにおいて免疫染色に
使用された抗ＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂはＶＤ１（４Ａ５）であった。

【０１００】 図７Ａに見られるように、ＶＥＧＦ−Ｄは、管路と、腫瘍で満たされた脈管の
基底板の間近のいわゆる「ネックレス」脈管（黒色矢印で示す）とにおいて検出
された。前記ネックレス脈管は、黒色矢印によって示されているように、ＶＥＧ
ＦＲ−２（図７Ｃ），ＶＥＧＦＲ−３（図７Ｃ）及びＰＥＣＡＭ（図７Ｅ）とに
おいても陽性であった。ＰＥＣＡＭは、内皮の古典的マーカであり、血小板と白
血球とにも見られる。ＰＥＣＡＭは、白血球の炎症部位への移動に役割を果たす
（ミューラー（Ｍｕｌｌｅｒ）他， Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７８: ４
４９−４６０）。前記「ネックレス」脈管上のＰＥＣＡＭ抗体染色は、これらの
構造が脈管であることを確認することに役立つ。前記管路のエッジは、筋線維芽
細胞を検出するアルファ平滑筋アクチン（図７Ｂ）の染色によって見分けられる
。ＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂが、４０倍のモル過剰のヒトＶＥＧＦ−ＤのＶＨＤと予
めインキュベートされた、図７Ａに図示されたものに続く組織断面の対照染色で
は、シグナルがなかった（図７Ｆ）。これらの知見は、腫瘍細胞によって分泌さ
れるＶＥＧＦ−Ｄが近傍の脈管上でそのレセプタを活性化し、これによって、ネ
ックレス脈管が管路を非常に近い位置に引き付けることに役割を果たしている可
能性があることを示唆している。これは、固形癌の成長と転移の拡がりとの両方
に重要である可能性がある。

【０１０１】例７ 子宮内膜癌におけるＶＥＧＦ−Ｄ ＶＥＧＦ−Ｄは、子宮内膜腺癌にも検出された（図８）。抗ＶＥＧＦ−Ｄ Ｍ
Ａｂ ＶＤ１（４Ａ５）を使用して、例４と同様に免疫組織化学分析を行った。
中程度のＶＥＧＦ−Ｄの染色が腺腫瘍細胞（ＧＬ）に見られ、非常に強力な反応
性が腫瘍の進行侵入エッジにおいて線維形成性ストロマ（ＤＭ）の筋線維芽細胞
に見られ、内皮と隣接する子宮筋層（Ｍｙｏ）の血管の壁（黒色矢印）とにおい
て強い反応性が見られた。興味深いことに、ＶＥＧＦ−Ｄ反応性は、線維形成性
ストロマの筋線維芽細胞において特に強力で、前記腺腫瘍細胞が、腫瘍の血管新
生潜在能力を増幅するであろうこれらの線維芽細胞においてＶＥＧＦ−Ｄ発現を
誘発させることが可能であることを示唆している。線維形成性ストロマの細胞に
おけるＶＥＧＦ−Ｄの発現は、肺癌でも検出されたことから（図６Ａ）、いくつ
かの腫瘍は、ストロマ成分においてＶＥＧＦ−Ｄを誘発させることが可能である
のかもしれない。これは、おそらくは線維芽細胞前駆体である間葉系細胞が、Ｖ
ＥＧＦ−Ｄ遺伝子を強力に発現する発達中の肺に類似している。従って、胚組織
と腫瘍組織との両方からのシグナルが、線維芽細胞においてＶＥＧＦ−Ｄの発現
を誘発させることができる。

【０１０２】例８ 非腫瘍形成組織におけるＶＥＧＦ−Ｄ 結腸等の細胞ターンオーバ及び／又は代謝負荷が高い組織は、広範囲の脈管網
を必要とする。従って、免疫組織化学分析によって、ヒトの結腸のＶＥＧＦ−Ｄ
の局在性を分析した。その結果を、図９Ａ−９Ｆに示す。免疫組織化学分析は、
アルファ平滑筋アクチンに対する抗体（ＤＡＫＯ Ｃｏｒｐ．， Ｃａｒｐｉｎ
ｔｅｒｉａ，ＣＡ）が免疫染色するためにも使用されたことを除き、例４と同様
に行われた。図示されているすべての組織断面について、検出はＤＡＢ（茶色は
陽性シグナルを示す）で行われ、図９Ａ，９Ｂ，９Ｃ及び９Ｆでは、ＶＥＧＦ−
Ｄ抗体はＶＤ１（４Ａ５）であった。明瞭化のために、図９Ａ，９Ｂ，９Ｄ及び
９Ｆにおいて対比染色は省略されている。図９Ａ中の縮尺バーは１２０μｍを示
し、図９Ｂ，９Ｄ及び９Ｆにおいては４０μｍ、そして図９Ｃと９Ｅでは６μｍ
を表す。

【０１０３】 ＶＥＧＦ−Ｄは、粘膜下組織の血管に局在していた（図９Ａ）。より高い倍率
の分析は、脈管平滑筋（白色矢印）は染色されているが、小動脈の内皮細胞（黒
色矢印）は染色されていないことを示している（図９Ｂ及び９Ｃ）。アルファ平
滑筋アクチンに対して特異的な抗体での染色によって、図９Ａ−９Ｃに図示され
たものに対する連続断面の脈管平滑筋（白色矢印）は検出されるが、内皮細胞（
黒色矢印）は検出されない（図９Ｄ及び９Ｅ）。この染色は、ＶＥＧＦ−Ｄ反応
性が小動脈の脈管平滑筋細胞にあったことを示している。更に、これらの内皮細
胞は、ＶＥＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３とのいずれに対しても免疫反応性を示さ
ず、これは、これらの細胞がレセプタ媒介的にＶＥＧＦ−Ｄを蓄積することがで
きないということを示している。ＶＥＧＦ−Ｄ ＭＡｂを、４０倍モル過剰のヒ
トＶＥＧＦ−ＤのＶＨＤと予めインキュベーションすることによって、脈管平滑
筋の染色は完全に阻止される（図９Ｆ）。

【０１０４】 結腸は、そのうちのいくつかは血管損傷を引き起こす種々の攻撃に晒されるの
で、粘膜下組織のＶＥＧＦ−Ｄは、血管再生に対する準備として脈管平滑筋によ
って作り出されるのかもしれない。血管損傷に応答して内皮細胞が活性化すると
、これらの血管の内皮細胞のＶＥＧＦＲ−２のアップレギュレートによって、脈
管平滑筋によって作り出されたＶＥＧＦ−Ｄは、内皮細胞増殖と脈管修復とを誘
発させることが可能となる。動脈損傷に対する小動脈と小管の内皮によるＶＥＧ
Ｆ−２の増加調節は、虚血性発作との関連においてすでに報告されている（イッ
サ（Ｉｓｓａ）Ｒ．他， Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ ７９: ４１７−４２５，
１９９９）。

【０１０５】例９ 腫瘍の発達におけるＶＥＧＦ−Ｄの役割 ＶＥＧＦ−Ｄの誘導体を本質的に過剰発現する細胞系を作り出すために、ヒト
ＶＥＧＦ−ＤｃＤＮＡの領域を、哺乳類発現ベクタＡｐｅｘ−３ （エバンス（
Ｅｖａｎｓ）他，Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １９９５ ３２ １１８３−
１１９５）に挿入した。このベクタは、２９３−ＥＢＮＡヒト胚腎臓細胞にトラ
ンスフェクトされたときに、エピゾームで保持される。成熟ＶＥＧＦ−Ｄの発現
のために、ＩＬ−３シグナル配列と前記ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチドと
前記成熟ＶＥＧＦ−Ｄとをコードする配列を含むｐＥＦＢＯＳＶＥＧＦ−ＤΔＮ
ΔＣを、Ａｐｅｘ−３のＸｂａＩ部位に挿入した（国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９
７／１４６９６（ＷＯ９８／０７８３２）の例９を参照）。その結果得られたプ
ラスミドを、ｐＶＤＡｐｅｘＤΔＮΔＣと命名した（スタッカー（Ｓｔａｃｋｅ
ｒ）Ｓ．Ａ．他，Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７４: ３２１２７−３２１３
６， １９９９、そして国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／２７３７３の例１を参
照）。この国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／２７３７３の全開示内容をここに参
考文献として合体させる。Ｎ−末端がＦｌａｇ（登録商標）によってタグされた
未プロセッシング全長ＶＥＧＦ−Ｄの発現のための類似のコンストラクトを作成
した。このコンストラクトにおいて、タンパク質分泌のためのＶＥＧＦ−Ｄシグ
ナル配列をコードするＤＮＡを削除し、これをＩＬ−３シグナル配列をコードす
るＤＮＡ、その後に、ＦＬＡＧ（登録商標）オクタペプチド、更に、ＶＥＧＦ−
Ｄの残基２４−３５４をコードするＤＮＡのすぐ上流側をそれと同じ解読枠の二
つのアミノ酸（Ｔｈｒ−Ａｒｇ）とによって置換した。このコンストラクトを、
ｐＶＤＡｐｅｘＦｕｌｌ−Ｎ−Ｆｌａｇと命名した（スタッカー（Ｓｔａｃｋｅ
ｒ）Ｓ．Ａ．他， Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７４: ３２１２７−３２１３
６， １９９９、そして国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／２７３７３の例１を参
照）。これらのベクタを、リン酸カルシウム法によって、又は、製造業者（Ｒｏ
ｃｈｅｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ， Ｍａｎｎｈｅｉｍ，
ドイツ）の指示に従ってＦｕｇｅｎｅ（登録商標）を用いて、ヒト胚腎臓細胞系
２９３ＥＢＮＡ−１の細胞にトランスフェクトし、安定的なトランスフェクト細
胞を、１００μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを添加したＤＭＥＭの存在下で選択
した。その後、高レベルのＶＥＧＦ−Ｄ−ＦＵＬＬ−Ｎ−ＦｌａｇとＶＥＧＦ−
ＤΔＮΔＣを発現する細胞系を、代謝標識、免疫沈降、及びウェスタンブロッテ
ィング分析とによって同定した（スタッカー（Ｓｔａｃｋｅｒ）Ｓ．Ａ．他，
Ｊ Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ ２７４: ３２１２７−３２１３６， １９９９、
及び国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９８／２７３７３の例１を参照）。

【０１０６】 ６乃至８週齢のＳＣＩＤマウス（ＡＲＣ，Ｐｅｒｔｈ，オーストラリア）の乳
房脂肪パッドに、ＰＢＳ中の、２ｘ１０^７のトランスフェクトされた２９３細胞
と又は未トランスフェクト親２９３細胞を皮下注射した。腫瘍を成長させ、３週
間に渡ってデジタルカリパスで測定した。第１の動物が規定倫理委員会（Ｉｎｓ
ｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｅｔｈｉｃｓ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって許された
最大サイズに達した３週間後に実験を終了した。腫瘍サイズは、幅×長さ×０．
６×（幅×長さ）／２として測定した。

【０１０７】 図１０は、未トランスフェクト親２９３細胞（“２９３”と命名）又はＶＥＧ
Ｆ−Ｄ−ＦＵＬＬ−Ｎ−ＦＬＡＧをコードする前記コンストラクトをトランスフ
ェクトされた２９３細胞（“ＶＥＧＦ−Ｄ−２９３”と命名）の注射によって発
生したＳＣＩＤマウスの腫瘍の分析結果を示している。２９３−ＶＥＧＦ−Ｄ−
ＦＵＬＬ−Ｎ−ＦＬＡＧ細胞から誘発された腫瘍と、未トランスフェクト親２９
３細胞から誘発された腫瘍との間には大きな違いがある。３週間後、未トランス
フェクト親２９３細胞の１３６±２３０ｍｍ^３と比較して（ｎ＝８）、２９３−
ＶＥＧＦ−Ｄ−ＦＵＬＬ−Ｎ−ＦＬＡＧグループの平均腫瘍サイズは、９３７±
５５５ｍｍ^３（平均±ＳＤ，ｎ＝８）であった。興味深いことに、ＶＥＧＦ−Ｄ
ΔＮΔＣをコードするコンストラクトでトランスフェクトされた２９３細胞から
発生した腫瘍は、サイズにおいて５０±７６ｍｍ^３（ｎ＝７）であり、未トラン
スフェクト親２９３細胞からのものと大きな違いがなかった。

【０１０８】 更に、その腫瘍全体を通して血管が存在することによって血液色の外観を有し
ていた２９３−ＶＥＧＦ−Ｄ−ＦＵＬＬ−Ｎ−ＦＬＡＧ細胞から誘発された腫瘍
と比較して、未トランスフェクト親２９３細胞から誘発された腫瘍の顕微鏡的な
外観は薄白表面を有していた。

【０１０９】 又、断面を、内皮細胞のマーカである抗−ＰＥＣＡＭモノクローナル抗体（Ｐ
ｈａｒｍｉｎｇｅｎ， サンジェゴ，ＣＡ）での免疫組織化学分析によって分析
した。２９３−ＶＥＧＦ−Ｄ−ＦＵＬＬ−Ｎ−ＦＬＡＧ細胞から誘発された腫瘍
の断面は、未トランスフェクト親２９３細胞から誘発された腫瘍と比較して、Ｐ
ＥＣＡＭ発現の顕著な増加を示した。この分析は、未プロセッシング全長ＶＥＧ
Ｆ−Ｄを発現する腫瘍において血管が遥かに多く存在することを確認するもので
ある。

【０１１０】 この実験は、未プロセッシング形態のＶＥＧＦ−Ｄは、腫瘍血管新生と、イン
・ヴィヴォでの固形癌の成長を誘発させることができることを示している。興味
深いことに、成熟した完全プロセッシング形態のＶＥＧＦ−Ｄを発現する細胞か
らの腫瘍は、未トランスフェクト親２９３細胞と比較して成長の増加を示さなか
った。このことは、ＶＥＧＦ−ＤのＶＨＤの正確な局在化又は機能のための、プ
ロペプチド（Ｎ−プロ及びＣ−プロ）のＶＥＧＦ−Ｄにおける重要性を示唆して
いる。この結果の説明は、これらプロペプチドがマトリックス結合に関与してお
り、ＶＥＧＦ−Ｄが細胞外マトリックス又は細胞表面ヘパリン硫酸プロテオグリ
カン上に正確に位置するときにのみ、その成長因子は血管新生及び／又はリンパ
管新生を誘発させることができるということである。別の説明は、前記プロペプ
チドは、イン・ヴィヴォにおいてＶＥＧＦ−Ｄ ＶＨＤの半減期を延長させると
いうことである。

【０１１１】例１０ 腫瘍血管形成のＶＥＧＦ−Ｄ誘発 ＶＥＧＦ−Ｄが、腫瘍血管新生において役割を果たしているか否かを調べるた
めに、ＶＥＧＦ又はＶＥＧＦ−Ｄを発現する２９３ＥＢＮＡ細胞系を作った。２
９３ＥＢＮＡ細胞は、通常は、ＶＥＧＦＲ−２及び／又はＶＥＧＦＲ−３を活性
化するリガンドである、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ又はＶＥＧＦ−Ｄを検出可能な
レベルで発現しない（スタッカー（Ｓｔａｃｋｅｒ）Ｓ．Ａ．他， Ｇｒｏｗｔ
ｈ Ｆａｃｔｏｒｓ １７: １−１１ （１９９９））。２９３ＥＢＮＡ細胞
は免疫不全マウス内でゆっくり成長し、血管化が不良な類上皮様の腫瘍を作り出
す。イン・ヴィトロで作り出された２９３ＥＢＮＡ細胞系からの調整培地のウェ
スタンブロッティング分析は、成熟形態の活性成長因子が分泌されていることを
示した。

【０１１２】 ６〜２１週齢のメスＳＣＩＤ又はＳＣＩＤ／ｎｏｄマウス（Ａｎｉｍａｌ Ｒ
ｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｃａｎｎｉｎｇ Ｖａｌｅ， オーストラ
リア; Ａｕｓｔｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， オースト
ラリア及びＷａｌｔｅｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ
ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， オーストラリア）を６〜１０
匹のマウスのグループに分け、その乳房脂肪パッドに、ＶＥＧＦ−２９３，ＶＥ
ＧＦ−Ｄ−２９３を発現する細胞系又は対照２９３細胞系を、培養液中２．０−
２．５×１０^７の濃度で、皮下注射した。腫瘍の成長とその形態を３５日間に亘
って分析した。腫瘍は、デジタルカリパスで測定し、腫瘍の体積は、式：体積＝
長さ×幅^２×０．５２によって計算した。細胞系の注射後３〜５週間で、前記マ
ウスを安楽死させ、腫瘍を検査のために除去した。ＶＥＧＦ−Ｄ−２９３腫瘍と
２９３腫瘍を、死後、２５日目に切除し、その重さを量った。

【０１１３】 ＶＥＧＦ−２９３細胞は、対照２９３細胞と比較して、高い成長率で腫瘍を生
成した。ＶＥＧＦ−２９３腫瘍は、広範囲な浮腫によって高度に血管化され、こ
れは、ＶＥＧＦは強力な腫瘍血管新生因子であり、血管透過性の誘発因子である
ということと一致している。ＶＥＧＦ−Ｄ−２９３細胞は、又、イン・ヴィヴォ
で高い成長も示し、それらの腫瘍は、対照２９３腫瘍と比較してより高度に血管
化されたが、浮腫の痕跡は明白にも又は顕微鏡によっても示さなかった。

【０１１４】 ＶＥＧＦ−Ｄ−２９３細胞の注射から発生した腫瘍成長は、ＶＥＧＦ−ＤのＶ
ＥＧＦＲ−２及びＶＥＧＦＲ−３への結合を阻止する、ＶＥＧＦ−Ｄの生理活性
領域に対して特異的な抗体であるモノクローナル抗体ＶＤ１の週２回の腹腔内注
射によって阻止された。しかしながら、腫瘍成長は、対照の、アイソタイプ合致
抗体での処理には影響されなかった。

【０１１５】 内皮細胞マーカＰＥＣＡＭ−１による免疫組織化学分析を用いた評価によると
、ＶＤ１抗体での処理によって腫瘍内の血管が減少した。ウェスタンブロッティ
ング分析は、ＶＥＧＦ−Ｄ−２９３及びＶＥＧＦ−２９３腫瘍におけるＶＥＧＦ
−Ｄ及びＶＥＧＦの発現を、それぞれ示し、更に、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ−Ｄ−
２９３腫瘍中においてアップレギュレートされていないことを示した。死後の腫
瘍重量測定の分析は、ＶＥＧＦ−Ｄ−２９３腫瘍（０．４９±０．２２ｇ，ｎ＝
７；平均±ＳＤ）と対照２９３腫瘍（０．１２３±０．１１８ｇ，ｎ＝９，ｐ＝
０．０１）との間の大きな違いを示した。

【０１１６】例１１ ＶＥＧＦ−Ｄによる腫瘍リンパ管新生の誘発 リンパ管を介した局所リンパ節への転移は、固形腫瘍の拡がりにおける一般的
段階であるので、ＶＥＧＦ−Ｄ誘発腫瘍リンパ管新生、又は、腫瘍細胞における
ＶＥＧＦ−Ｄの発現によって腫瘍のリンパ節への拡がり、が起こるか否かを調べ
るために実験を行った。

【０１１７】 腫瘍の拡大におけるＶＥＧＦ−Ｄの役割を分析するために、ＶＥＧＦ−Ｄ−２
９３腫瘍を、ＳＣＩＤ／ＮＯＤマウス（Ａｎｉｍａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｃ
ｅｎｔｅｒ， Ｃａｎｎｉｎｇ Ｖａｌｅ， オーストラリア; Ａｕｓｔｉ
ｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ， オーストラリア及びＷａｌｔｅ
ｒ ａｎｄ Ｅｌｉｚａ Ｈａｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃ
ａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， オーストラリア）中に誘発させた。死後分析は、Ｖ
ＥＧＦ−２９３腫瘍の動物では１６匹中０匹の割合、そして２９３腫瘍の動物で
は１４匹中０匹の割合であったのに対して、ＶＥＧＦ−Ｄ−２９３腫瘍を有する
動物の場合は２３匹中１４の割合で、外側腋窩リンパ節及び／又は浅鼡径リンパ
節に転移病巣を発達させていたことを示した。一部のケースにおいて、ＳＣＩＤ
／ＮＯＤマウスの一次腫瘍からの転移性腫瘍細胞の拡大は、一次腫瘍と外側腋窩
節との間の皮膚のリンパ管における腫瘍細胞の痕として明白であった。

【０１１８】 ＶＥＧＦ−Ｄ−２９３腫瘍を有するマウスのＶＤ１モノクローナル抗体による
処理（表１）によって、リンパ節への転移拡大が阻止された。ＶＤ１で２５日間
以上処理された７匹のマウスはいずれも、リンパ管拡大を示さなかったのに対し
て、対照アイソタイプ合致モノクローナル抗体で治療された１０匹のマウスのう
ちの６匹はリンパ節への拡大を示した。これらの結果は、ＶＥＧＦ−Ｄは、リン
パ管を通じてこれらの腫瘍の転移拡大を促進させうるということを示している。

【０１１９】

【表４】

【０１２０】 これらのデータは、ＶＥＧＦ−Ｄの発現が、リンパ管網を介して腫瘍細胞の転
移拡大を促進することが可能であることを示している。ＶＥＧＦ−Ｄは、恐らく
リンパ管レセプタＶＥＧＦＲ−３を介して、リンパ管−特異的マーカＬＹＶＥ−
１の免疫組織化学分析によって検出されるように、腫瘍のリンパ管の形成を誘発
させた。但し、ＶＥＧＦＲ−３−ＶＥＧＦＲ−２−ヘテロダイマの活性化は除外
できない。リンパ管新生因子の発現だけでも、腫瘍の中心部におけるリンパ管の
形成を誘発し、リンパ節への転移性拡大を容易にするのに十分である。

【０１２１】 ＶＥＧＦ−Ｄは、腫瘍細胞と、悪性メラノーマ、肺癌、及び乳癌の脈管内皮と
に局在していた（例４−６を参照）。

【０１２２】例１２ 異なる形態のＶＥＧＦ−Ｄによって誘発される腫瘍性質の変化 腫瘍血管新生とリンパ管新生とにおけるＶＥＧＦ−Ｄの役割の決定に加えて、
例１０及び１１の方法を使用して、Ｎ，Ｃの劈開と、ＮとＣの両方の末端プロペ
プチドを表す異なる形態のＶＥＧＦ−Ｄを発現する腫瘍を作成、評価した。マウ
スに注射された細胞系は、２９３ＥＢＮＡ、ＶＥＧＦ−Ｄ−２９３、ＶＥＧＦ−
ＤΔＮΔＣ−２９３，ＶＥＧＦ−ＤΔＣ−２９３（Ｃ末端プロペプチドを欠くＶ
ＥＧＦ−Ｄを発現する細胞）、及びＶＥＧＦ−ＤΔＮ−２９３（Ｎ末端プロペプ
チドを欠くＶＥＧＦ−Ｄを発現する細胞）であった。

【０１２３】 ＶＥＧＦ−ＤΔＮ細胞によって作られた腫瘍は、対照細胞によって作られた腫
瘍よりも急速に成長した。形態検査したところ、前記腫瘍は外観が赤色で、対照
細胞には見られない大量の流体成分を含む、かなりの血管反応を有していた。Ｖ
ＥＧＦ−ＤΔＮ細胞によって作られた腫瘍は、対照細胞によって作られた腫瘍と
は、成長と形態特性とにおいて大きな違いがあった。

【０１２４】 図１１のグラフは、ＶＥＧＦ−ＤΔＮ細胞からの腫瘍における成長の高い速度
を示している。ＶＥＧＦ−ＤΔＮ細胞によって作られた腫瘍における流体蓄積の
傾向は、そのような腫瘍の写真である図１２に見ることができる。これは、対照
細胞によって作られた腫瘍等の普通腫瘍を示す図１３の写真と対比させることが
できる。

【０１２５】 ＶＥＧＦ−ＤΔＣ細胞によって作られた腫瘍は、対照細胞によって作られた腫
瘍と同じように成長し、過剰な流体形成は示さなかった。

【０１２６】 ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣ細胞によって作られた腫瘍は、対照細胞によって作られ
た腫瘍と比較して非常にゆっくりと成長した。対照細胞の平均３０〜３５日、Ｖ
ＥＧＦ−ＤΔＮ細胞の平均２０〜２５日と比較して、ＶＥＧＦ−ＤΔＮΔＣ腫瘍
は約７０日で形成された。これらの腫瘍を調べたところ、それらは、ＰＥＣＡＭ
−１染色によって、対照細胞よりも少数の血管を有することにより低い血管反応
を有していた。これらの腫瘍は、ＬＹＶＥ−１染色によって示されるように、リ
ンパ管網を発達させ、リンパ管転移の形成を誘発させた。図１４のグラフは、Ｖ
ＥＧＦ−ＤΔＮΔＣ細胞からの腫瘍の低い成長速度を図示している。

【０１２７】 ＶＥＧＦ−Ｄの強いシグナルが免疫陽性腫瘍細胞の近くの血管の内皮細胞には
検出されたが、腫瘍細胞から離れた脈管では検出されなかったことから、悪性メ
ラノーマにおけるＶＥＧＦ−Ｄの局在化は、腫瘍血管新生におけるこの分子の役
割と一致している。このことは、腫瘍又はその近傍の血管にみられるＶＥＧＦ−
Ｄは、レセプタ媒介取込みによって生じるものである可能性を示唆しており、こ
れは、腫瘍細胞によって分泌されたＶＥＧＦ−Ｄは、標的内皮細胞に結合し、そ
れに蓄積するという仮説を支持するものであり、これによってパラクリンメカニ
ズム調節腫瘍血管新生が確立される。腫瘍細胞及び腫瘍血管におけるＶＥＧＦの
局在性の類似のパターンがすでに報告されている（プレート（Ｐｌａｔｅ）Ｋ．
他， Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ４: ２０７−２１８， １９９４）
。ＶＥＧＦ−Ｄは腫瘍血管新生において役割を果たしているという仮説は、ＶＥ
ＧＦ−Ｄのレセプタ，ＶＥＧＦＲ−２が、腫瘍の血管の内皮細胞においてアップ
レギュレートされるという知見と一致している（プレート（Ｐｌａｔｅ）Ｋ．他
， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５３: ５８２２−５８２７， １９９３）。事
実、ここで研究されたメラノーマ中に検出されたＶＥＧＦ−Ｄ免疫陽性血管の一
部は、ＶＥＧＦＲ−２に対しても陽性であった。ＶＥＧＦＲ−２を介したシグナ
リングは、腫瘍血管新生を維持するために必須であり（ミラウアー（Ｍｉｌｌａ
ｕｅｒ）Ｂ．他， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５６: １６１５−１６２０，
１９９６）、イン・ヴィヴォにおけるＶＥＧＦ−Ｄの血管新生活性（マルコンシ
ニ（Ｍａｒｃｏｎｃｉｎｉ）他， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃ
ｉ． ＵＳＡ ９６: ９６７１−９６７６， １９９９）は、このレセプタに
よって媒介されている可能性が非常に高い。メラノーマに見られるものと類似の
染色パターンが、ＶＥＧＦ−Ｄが腫瘍細胞とその近傍の血管とに検出されたこと
により、肺の扁平上皮細胞癌とイン・サイチュ乳腺癌（ＢＤＣＩＳ）とに観察さ
れた。ＢＤＣＩＳの腫瘍充満管路と肺癌の腫瘍細胞の島とに近傍の脈管は、ＶＥ
ＧＦＲ−２に対しても陽性であり、ここでも、このリガンドとレセプタが、パラ
クリン的に腫瘍血管新生の制御に貢献している可能性があることを示唆した。

【０１２８】 これらの結果は、又、正常な成体組織のリンパ内皮上に発現するＶＥＧＦ−Ｄ
のレセプタであるＶＥＧＦＲ−３に対して陽性である脈管はＶＥＧＦ−Ｄに対し
ても陽性であったため、ＶＥＧＦ−Ｄは、悪性メラノーマの近傍のリンパ管の成
長を刺激することに役割を果たしている可能性があることを示唆している。前記
腫瘍充満管路を取り囲むＶＥＧＦ−Ｄ陽性脈管の一部はＶＥＧＦＲ−３に対して
も陽性であったため、類似の染色パターンがＢＤＣＩＳにも見られた。ＶＥＧＦ
Ｒ−３を介したシグナリングは、リンパ管新生にとって重要であると考えられて
いる（タイペール（Ｔａｉｐａｌｅ）Ｊ．他， Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏ
Ｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３７: ８５−９６， １９９９）。但し、この
レセプタは、癌において毛細血管においてアップレギュレートされうる（ボルト
ーラ（Ｖｏｌｔｏｌａ）Ｒ．他， Ａｍ． Ｊ． Ｐａｔｈ． １５４: １３
８１−１３９０， １９９９）。それゆえ、ＶＥＧＦ−ＤとＶＥＧＦＲ−３とか
ら成るパラクリン調節系は、癌におけるリンパ管新生と血管新生との両方を刺激
する可能性がある。従って、腫瘍が転移するルートは、部分的に、血管新生及び
／又はリンパ管新生を誘発させるその能力によって測定することができる。もし
そうであるならば、リンパ管新生も誘発させることが可能なもの（例えば、ＶＥ
ＧＦ−Ｄ）に対して、純粋に血管新生性である可溶性成長因子（例えばＶＥＧＦ
）の腫瘍細胞による発現は、転移拡大のルートの重要な決定要素である可能性が
ある。

【０１２９】 ＶＥＧＦ−Ｄは、更に、非腫瘍原性組織における血管維持においても役割を果
たしている可能性がある。結腸の粘膜下組織の小動脈において、ＶＥＧＦ−Ｄは
、内皮ではなく、血管平滑筋において局在した。内皮におけるＶＥＧＦ−Ｄの不
在は、恐らく、内皮細胞におけるＶＥＧＦ−ＤレセプタであるＶＥＧＦＲ−２及
びＶＥＧＦＲ−３の発現の欠如によるものである。脈管損傷に応答する内皮の活
性化は、恐らく、内皮細胞によるＶＥＧＦＲ−２の発現を誘発させるのに十分で
あり（イッサ（Ｉｓｓａ） Ｒ他，Ｌａｂ． Ｉｎｖｅｓｔ． ７９: ４１７
−４２５， １９９９）、これが、脈管平滑筋によって作り出されたＶＥＧＦ−
Ｄが、内皮細胞増殖を誘発させ、これによって脈管修復に影響を与えることを可
能にさせる。

【０１３０】 以上の記載と例は、単に本発明を例示するために記載されたものであり、それ
を限定することを意図されたものではない。当業者は、本発明の制振及び本質を
具体化してここに開示された実施例の改変を見出すことができるであろうから、
本発明は、付随の請求項の範囲及びその均等物に含まれるすべてのバリエーショ
ンを含むものと広く解釈されるべきである。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＶＥＧＦ−Ｄプロセッシングの略図。

【図２】 図２は、ウェスタンブロッティング分析による、ヒトＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦ／
ＰＤＧＦ相同性ドメイン（ＶＨＤ）に対するＭＡｂ ４Ａ５の特異性を示す。

【図３】 図３は、ＶＥＧＦ−Ｄアンチセンス及びセンスＲＮＡとハイブリダイズされたマ
ウスの性交後１５．５日の組織断面に対する２日間の露出後にとられたオートラ
ジオグラフを示す。

【図４】 図４Ａ〜４Ｄは、イン・サイチュ ハイブリダイゼーションによる、性交後１５
．５日のマウス胚におけるＶＥＧＦ ｍ−ＲＮＡの分布の分析結果を示す。

【図５】 図５Ａ〜５Ｈは、異なる反応パターンを例示する、二つの悪性メラノーマからの
免疫組織化学分析の結果を示す。

【図６】 図６Ａ〜６Ｆは、肺の扁平上皮癌におけるＶＥＧＦ−Ｄの局在性を示す。

【図７】 図７Ａ〜７Ｆは、イン・サイチュでの乳腺管癌におけるＶＥＧＦ−Ｄの局在性を
示す。

【図８】 図８は、イン・サイチュでの子宮内膜癌におけるＶＥＧＦ−Ｄの局在性を示す。

【図９】 図９Ａ〜９Ｆは、正常な結腸組織におけるＶＥＧＦ−Ｄの局在性を示す。

【図１０】 図１０は、未トランスフェクション親２９３細胞（“２９３”として示す）と、
ＶＥＧＦ−Ｄ−ＦＵＬＬ−Ｎ−ＦＬＡＧをコードする発現ベクタをトランスフェ
クトされた２９３細胞（“ＶＥＧＦ−Ｄ−２９３”として示す）とのインジェク
ションの結果得られたＳＣＩＤマウスの腫瘍の分析結果を示す。

【図１１】 図１１は、ＶＥＧＦ−ＤΔＮ細胞によって作られた腫瘍を示す。

【図１２】 図１２は、通常の腫瘍を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｑ 1/02 Ａ６１Ｋ 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 スタッカー，スティーヴン オーストラリア ヴィクトリア 3050 パ ークヴィル ピー・オー・ボックス 2008 ロイヤル・メルボルン・ホスピタル ル ードヴィッヒ・インスティテュート・フォ ア・キャンサー・リサーチ Ｆターム(参考） 4B063 QA19 QQ02 QQ96 QS33 4C084 AA01 AA02 AA16 BA01 BA02 BA08 DB57 MA17 MA23 MA28 MA35 MA37 MA52 MA55 MA56 MA63 MA66 ZB26 4C085 AA14 BB11 CC23 GG02 GG03 GG04 GG05 GG06 GG08

Claims (44)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 腫瘍によるＶＥＧＦ−Ｄの発現によって特徴付けられる腫瘍
   性疾患を患う生物を治療する方法であって、以下の工程を有する、 ＶＥＧＦ−Ｄ発現腫瘍細胞の存在又は不在を測定するべく生物をスクリーニン
   グする工程、 そのスクリーニングによってＶＥＧＦ−Ｄを発現している腫瘍を有すると判断
   された生物を選択する工程、そして ＶＥＧＦ−Ｄのその対応のレセプタへの結合を阻止するために前記腫瘍の近傍
   に、ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニストを有効量投与する工程。
2. 【請求項２】 請求項１の方法であって、前記生物は哺乳動物である。
3. 【請求項３】 請求項１の方法であって、前記ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニスト
   は、細胞毒物と共に投与される。
4. 【請求項４】 請求項１の方法であって、前記アンタゴニストは、更に少な
   くとも一つの薬用キャリア又は補助薬を有する組成物として投与される。
5. 【請求項５】 請求項１の方法であって、前記腫瘍性疾患は、悪性メラノー
   マ、乳腺管癌、扁平上皮癌、前立腺癌及び子宮内膜癌から成るグループから選択
   される。
6. 【請求項６】 請求項１の方法であって、前記アンタゴニストは、ＶＥＧＦ
   −Ｄに特異的に結合し、ＶＥＧＦ−ＤのＶＥＧＦレセプタ−２又はＶＥＧＦレセ
   プタ−３への結合を阻止するモノクローナル抗体である。
7. 【請求項７】 請求項６の方法であって、前記抗体は、ＶＥＧＦ−ＤのＶＥ
   ＧＦ相同性ドメインに結合する。
8. 【請求項８】 ＶＥＧＦ−Ｄの発現の増加によって特徴付けられる腫瘍形成
   疾患をスクリーニングする方法であって、以下の工程を有する、 ＶＥＧＦ−Ｄの発現の増加によって特徴付けられる腫瘍形成疾患状態にあるこ
   とが疑われる生物からサンプルを得る工程、 前記サンプルを、ＶＥＧＦ−Ｄに特異的に結合する化合物を有する組成物に露
   出させる工程、 前記サンプルを洗浄する工程、そして 前記疾患を、前記組織サンプル中の前記化合物の存在、量又は分布を検出する
   ことによってスクリーニングする工程、ここで潜在的腫瘍形成成長部分又はその
   周囲の細胞中のＶＥＧＦ−Ｄの検出は腫瘍形成疾患を表す。
9. 【請求項９】 請求項８の方法であって、前記化合物は、ＶＥＧＦ−Ｄに特
   異的に結合するモノクローナル抗体である。
10. 【請求項１０】 請求項８の方法であって、前記抗体は、ＶＥＧＦ−ＤのＶ
    ＥＧＦ相同性ドメインに結合する。
11. 【請求項１１】 請求項８の方法であって、前記化合物は検出可能な標識を
    含む。
12. 【請求項１２】 請求項８の方法であって、前記腫瘍性疾患は、悪性メラノ
    ーマ、乳腺管癌、扁平上皮癌、前立腺癌及び子宮内膜癌から成るグループから選
    択される。
13. 【請求項１３】 請求項８の方法であって、前記サンプルは、ヒト組織サン
    プルである。
14. 【請求項１４】 ＶＥＧＦ−Ｄの発現の増加によって特徴付けられる腫瘍形
    成疾患をスクリーニングする方法であって、以下の工程を有する、 ＶＥＧＦ−Ｄの発現の増加によって特徴付けられる腫瘍形成疾患状態にあるこ
    とが疑われる生物からサンプルを得る工程、 前記サンプルを、ＶＥＧＦ−Ｄに特異的に結合する化合物を有する組成物に露
    出させる工程、 前記サンプルを洗浄する工程、そして 前記疾患を、前記サンプル中の前記化合物の存在、量又は分布を検出すること
    によってスクリーニングする工程、ここで、潜在的腫瘍形成成長部分又はその周
    囲の血管内皮細胞内、又は上のＶＥＧＦ−Ｄの検出は腫瘍形成疾患を表す。
15. 【請求項１５】 請求項１４の方法であって、前記化合物は、ＶＥＧＦ−Ｄ
    に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
16. 【請求項１６】 請求項１５の方法であって、前記抗体は、ＶＥＧＦ−Ｄの
    ＶＥＧＦ相同性ドメインに結合する。
17. 【請求項１７】 請求項１４の方法であって、前記化合物は検出可能な標識
    を含む。
18. 【請求項１８】 血管内皮細胞の増加によって特徴付けられる腫瘍形成疾患
    をスクリーニングする方法であって、以下の工程を有する、 血管内皮細胞の増加によって特徴付けられる腫瘍形成疾患状態にあることが疑
    われる生物からサンプルを得る工程、 前記サンプルを、ＶＥＧＦ−Ｄに特異的に結合する化合物を有する組成物に露
    出させる工程、 前記サンプルを洗浄する工程、そして 前記疾患を、前記サンプル中の前記化合物の存在、量又は分布を検出すること
    によってスクリーニングする工程、ここで、潜在的腫瘍形成成長部分又はその周
    囲の血管内皮細胞内、又は上のＶＥＧＦ−Ｄの検出は腫瘍形成疾患を表す。
19. 【請求項１９】 請求項１８の方法であって、前記化合物は、ＶＥＧＦ−Ｄ
    に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
20. 【請求項２０】 請求項１９の方法であって、前記抗体は、ＶＥＧＦ−Ｄの
    ＶＥＧＦ相同性ドメインに結合する。
21. 【請求項２１】 請求項１８の方法であって、前記化合物は検出可能な標識
    を含む。
22. 【請求項２２】 請求項１８の方法であって、更に、前記サンプルを、ＶＥ
    ＧＦＲ−２とＶＥＧＦＲ−３の少なくとも一方に特異的に結合する第２の化合物
    に露出させる工程を有し、ここで、前記スクリーニング工程は、ＶＥＧＦ−Ｄに
    結合する前記化合物と、血管内皮細胞に結合した前記第２化合物を検出して、潜
    在的腫瘍形成成長部分又はその周囲の、ＶＥＧＦ−ＤとＶＥＧＦＲ−２又はＶＥ
    ＧＦＲ−３との少なくとも一方との両方を有する血管内皮細胞の存在、量又は分
    布を測定する。
23. 【請求項２３】 リンパ管内皮細胞の増加によって特徴付けられる腫瘍形成
    疾患をスクリーニングする方法であって、以下の工程を有する、 リンパ管内皮細胞の増加によって特徴付けられる腫瘍形成疾患状態にあること
    が疑われる生物からサンプルを得る工程、 前記サンプルを、ＶＥＧＦ−Ｄに特異的に結合する化合物を有する組成物に露
    出させる工程、 前記サンプルを洗浄する工程、そして 前記疾患を、前記サンプル中の前記化合物の存在、量又は分布を検出すること
    によってスクリーニングする工程、ここで、潜在的腫瘍形成成長部分又はその周
    囲のリンパ管内皮細胞内又は上のＶＥＧＦ−Ｄの検出は腫瘍形成疾患を表す。
24. 【請求項２４】 請求項２３の方法であって、前記化合物は、ＶＥＧＦ−Ｄ
    に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
25. 【請求項２５】 請求項２４の方法であって、前記抗体は、ＶＥＧＦ−Ｄの
    ＶＥＧＦ相同性ドメインに結合する。
26. 【請求項２６】 請求項２３の方法であって、前記化合物は検出可能な標識
    を含む。
27. 【請求項２７】 請求項２３の方法であって、更に、前記サンプルを、ＶＥ
    ＧＦＲ−３に特異的に結合する第２の化合物に露出させる工程を有し、ここで、
    前記スクリーニング工程において、ＶＥＧＦ−Ｄに結合する前記化合物とリンパ
    管内皮細胞に結合した前記第２化合物とを検出し、潜在的腫瘍形成成長部分、又
    はその周囲の、ＶＥＧＦ−ＤとＶＥＧＦＲ−３との両方を有するリンパ管内皮細
    胞の存在、量又は分布を測定する。
28. 【請求項２８】 生物の組織の脈管形成を維持する方法であって、そのよう
    な治療を必要とする前記生物に対して、有効量の、ＶＥＧＦ−Ｄ、又は、ＶＥＧ
    Ｆ−Ｄの生理活性を有するそのフラグメント又はアナログを投与する工程を有す
    る。
29. 【請求項２９】 腫瘍によるＶＥＧＦ−Ｄの発現によって特徴付けられる腫
    瘍形成疾患を患う生物を治療する方法であって、ＶＥＧＦ−Ｄのその対応のレセ
    プタに対する結合を防止するために、前記腫瘍の近傍に、有効量のＶＥＧＦ−Ｄ
    アンタゴニストを投与する工程を有する。
30. 【請求項３０】 請求項２９の方法であって、前記生物は哺乳動物である。
31. 【請求項３１】 請求項２９の方法であって、前記ＶＥＧＦ−Ｄアンタゴニ
    ストは、細胞毒物と共に投与される。
32. 【請求項３２】 請求項２９の方法であって、前記アンタゴニストは、更に
    少なくとも一つの薬用キャリア又は補助薬を有する組成物として投与される。
33. 【請求項３３】 請求項２９の方法であって、前記腫瘍性疾患は、悪性メラ
    ノーマ、乳腺管癌、扁平上皮癌、前立腺癌及び子宮内膜癌から成るグループから
    選択される。
34. 【請求項３４】 請求項２９の方法であって、前記アンタゴニストは、ＶＥ
    ＧＦ−Ｄに特異的に結合し、ＶＥＧＦ−Ｄの、ＶＥＧＦレセプタ−２又はＶＥＧ
    Ｆレセプタ−３への結合を阻止するモノクローナル抗体である。
35. 【請求項３５】 請求項３４の方法であって、前記抗体は、ＶＥＧＦ−Ｄの
    ＶＥＧＦ相同性ドメインに結合する。
36. 【請求項３６】 腫瘍の転移リスクをスクリーニングする方法であって、以
    下の工程を有する、 腫瘍サンプルをＶＥＧＦ−Ｄに特異的に結合する化合物を有する組成物に対し
    て露出させる工程、 前記サンプルを洗浄する工程、そして 前記サンプル中の前記化合物の存在、量又は分布を検出することによって転移
    リスクをスクリーニングする工程、ここで、前記腫瘍によるＶＥＧＦ−Ｄの発現
    は、転移リスクを示す。
37. 【請求項３７】 請求項３６の方法であって、前記化合物は、ＶＥＧＦ−
    Ｄに特異的に結合するモノクローナル抗体である。
38. 【請求項３８】 請求項３７の方法であって、前記抗体は、ＶＥＧＦ−Ｄの
    ＶＥＧＦ相同性ドメインに結合する。
39. 【請求項３９】 請求項３６の方法であって、前記化合物は検出可能な標識
    を含む。
40. 【請求項４０】 ＶＥＧＦ−Ｄの発現の増加によって特徴付けられる腫瘍形
    成疾患状態の微小転移巣を検出する方法であって、以下の工程を有する、 前記腫瘍形成疾患状態にある生物の、腫瘍形成成長部分から離間した部位から
    の組織サンプルを得る工程、 前記サンプルを、ＶＥＧＦ−Ｄに特異的に結合する化合物を有する組成物に対
    して露出させる工程、 前記サンプルを洗浄する工程、そして 前記組織サンプル中の前記化合物の存在、量、又は分布を検出することによっ
    て前記腫瘍形成疾患の前記転移をスクリーニングする工程、ここで、前記組織サ
    ンプル中のＶＥＧＦ−Ｄの検出は前記腫瘍形成疾患の転移を示す。
41. 【請求項４１】 請求項４０の方法であって、前記組織サンプルは、前記腫
    瘍形成成長部分を取り囲む組織由来のリンパ節である。
42. 【請求項４２】 請求項４０の方法であって、前記化合物は、ＶＥＧＦ−Ｄ
    に特異的に結合するモノクローナル抗体である。
43. 【請求項４３】 請求項４２の方法であって、前記抗体は、ＶＥＧＦ−Ｄの
    ＶＥＧＦ相同性ドメインに結合する。
44. 【請求項４４】 請求項４０の方法であって、前記化合物は検出可能な標識
    を含む。