CN1360629A - 通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶akt诱导血管内皮生长因子(vegf) - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗性血管发生的方法和组合物。更具体的说,本发明致力于通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT诱导血管内皮生长因子(VEGF)的表达。本发明的组合物和方法优选包含编码AKT的核酸及其施用。

Description

通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT诱导 血管内皮生长因子(VEGF)

                      发明领域

本发明涉及用于治疗性血管发生的方法和组合物。更具体的说，本发明致力于通过丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶AKT诱导血管发生性蛋白质血管内皮生长因子(VEGF)的表达。本发明的组合物和方法优选包含编码AKT的核酸及其施用。

                     发明背景血管发生

血管发生是导致新血管发育的生物学过程。该过程包含多种细胞-细胞、细胞-基质、和细胞-细胞因子相互作用(Melillo等人，1997，新血管研究(Cardiovascular Research)35：480-489；Lewis等人，1997，新血管研究(Cardiovascular Research)35：490-497)。新血管网络的形成在成年生物体中通常是罕见的。但是，新血管结构可于多种病理性状况下发生，包括局部缺血、发炎、创伤愈合、肿瘤生长、糖尿病性视网膜病变、类风湿性关节炎、牛皮癣、和慢性创伤。

治疗性血管发生包括使用适当的血管发生性生长因子精确的刺激新血管发育。因此，治疗性血管发生可用于治疗多种局部缺血状况或刺激创伤愈合。局部缺血状况可影响心脏、下肢、皮瓣、外周神经、骨、或移植物。局部缺血状况包括脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、四肢缺血、外周动脉疾病、间歇性跛行、缺血性心肌病、和心肌缺血(WO97/14307)。

已证明，多种因子具有血管发生性活性。这些因子包括碱性和酸性成纤维细胞生长因子(bFGF和aFGF)、FGF-5(美国专利5,661,133)、内皮细胞生长因子(Pu等人，1993，循环(Circulation)88：208-2156)、促血管生成素(angiopoietin)、和VEGF(评论参阅Melillo等人，1997；和Lewis等人，1997)。

还有人提出，血管发生对于实体瘤及其转移的生长和维持而言是必需的(美国专利5,854,205)。为了刺激血管发生，肿瘤可上调多种血管发生性因子(包括VEGF)的生成。VEGF

血管内皮细胞生长因子是一类血管发生性多肽，也是血小板衍生的生长因子蛋白质家族的成员。这些蛋白质是糖基化阳离子二聚体，分子量约为46-48kDa。与其它血管发生性因子相比，VEGF的前面有天然信号序列，因而能够由完整细胞分泌。VEGF的其它名称包括血管通透因子(VPF)和c-fos诱导的生长因子(FIGF)。

已鉴定了VEGF的几种形式，包括VEGF₁₂₁(美国专利5,219,739)、VEGF₁₆₅(美国专利5,332,672)、VEGF₁₈₉(美国专利5,240,848)、VEGF₂₀₆、VEGF-2(WO95/24473和WO96/39515)、VEGF-B(美国专利5,607,918和5,840,693)、和VEGF-D(WO97/12972)。已显示，VEGF的多种形式在缺血组织中促进血管内皮细胞的有丝分裂，并增强侧副血管的形成和血流。

过渡金属离子(诸如CoCl₂)显示增强VEGF基因的表达并刺激血管形成(美国专利5,480,975)。Akt

AKT蛋白是在凋亡(程序化细胞死亡)中发挥作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。最近，已研究了细胞存活/死亡的调控所包括的两种细胞内信号途径。凋亡刺激激酶1(ASK1)的激活在多种细胞类型中导致凋亡(Ichijo等人，1997)，而包含磷酸肌醇3-激酶(PI3K)和Akt的途径导致细胞保护作用。已证明，ASK1活性是由肿瘤坏死因子-α(TNFα)治疗或Fas连接诱导的(Ichijo等人，1997；和Chang等人，1998)。ASK1显性失活突变体的过度表达抑制由TNFα或Fas连接诱导的凋亡，说明ASK1在TNFα或Fas连接诱导的凋亡过程中发挥重要作用。ASK1诱导凋亡的分子机制尚不清楚。已显示，ASK1的异位表达导致多种应激所激活信号途径的激活，诸如可介导ASK1所诱导凋亡的MKK4/JNK和MKK6/p38途径(Ichijo等人，1997)。

PI3K/Akt途径对于调控细胞存活/死亡而言似乎也是重要的(Kulik等人，1997；Franke等人，1997；Kauffmann-Zeh等人，1997；Hemmings，1997；和Dudek等人，1997)。存活因子，诸如血小板衍生的生长因子(PDGF)、神经生长因子(NGF)、和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，在多种状况下通过诱导PI3K活性而促进细胞存活(Kulik等人，1997；和Hemmings，1997)。激活的PI3K导致磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸(PtdIns(3，4，5)-P3)的生成，继而磷脂酰肌醇(3，4，5)-三磷酸结合含AH/PH结构域的丝氨酸/苏氨酸激酶Akt并诱导其活性(Franke等人，1995；Hemmings，1997b；Downward，1998；和ALessi等人，1996)。PI3K的特异抑制剂或Akt显性失活突变体消除这些生长因子或细胞因子促进存活的活性。另外，组成性的活性PI3K或Akt突变体的引入在细胞通常经历凋亡性细胞死亡的条件下促进细胞存活(Kulik等人，1997；和Dudek等人，1997)。这些观察结果证明，PI3K/Akt途径在细胞存活/凋亡的调控中发挥重要作用。

文献中已鉴定了人Akt蛋白激酶的两种异构体，Akt1和Akt2(Staal，1987)。美国临时申请60/125,108中描述了人Akt的第三种形式，命名为Akt3。Nakatani等人(1999，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)257：906-910)描述了Akt的另一种异构体。还鉴定了大鼠Akt序列(Konishi等人，1995)。

已显示，人Akt1的C末端第473位丝氨酸对于它的调控是必需的(Stokeo等人，1997；和Stephens等人，1998)。生长因子刺激后，PI3K激活。PI3K的产物PtdIns(3，4，5)-P结合Akt1，并引起Akt1由细胞质转移至细胞质内膜附近，在此第308位苏氨酸和第473位丝氨酸发生磷酸化(Downward，1998)。这些残基的磷酸化对于Akt1的激活是重要的。已显示，最近鉴定的蛋白激酶PDK1负责第308位苏氨酸的磷酸化，而磷酸化第473位丝氨酸的激酶尚未鉴定(Stokeo等人，1997；和Stephens等人，1998)。基因疗法

基因疗法包括通过将遗传信息引入患者(诸如引入患者受影响的细胞或器官)来校正缺陷或异常(突变、异常表达、等等)。可在体外将这种遗传信息引入细胞，然后再将经修饰细胞重新引入身体；或者，直接在体内引入适当位点。在这方面，文献中已描述了细胞转染和基因转移的不同技术(参阅Roemer和Friedman，1992，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)208：211)，包括“裸露DNA”的转染和包含DNA与DEAE-dextran(Pagano等人，1967，病毒学杂志(J.Virol.)1：891)、DNA与核蛋白(Kaneda等人，1989，科学(Science)243：375)、DNA与脂质(Felgner等人，1987，美国国家科学院进展(PNAS)84：7413)的复合物、使用脂质体(Fraley等人，1980，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)255：10431)、等等的多种技术。最近，使用病毒作为基因转移载体的应用有希望代替物理转染技术。在这方面，已测试了不同病毒感染某些细胞群体的能力，包括逆转录病毒、疱疹病毒、腺伴随病毒、和腺病毒。

已有人提出用于血管发生的基因疗法，具体采用VEGF编码序列(Melillo等人，1997；和Lewis等人，1997)。在兔后肢局部缺血模型中，将含VEGF₁₆₅ cDNA的质粒动脉内或肌肉内施用增加了侧副血流(Tsurumi等人，1996，循环(Circulation)94：3281-3290；Takeshita等人，1996，生物化学和生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Comm.)227：628-635)。在这种模型中，含人VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅、和VEGF₁₈₉cDNA的质粒也显示具有血管发生性活性(Takeshita等人，1996，实验室研究(Lab Invest.)75：487-501；和WO97/14307)。相似的，含VEGF₁₆₅编码序列的复制缺陷型腺病毒在小鼠中可诱导新血管形成(Muhlhauser等人，1995，循环研究(Circ.Res.)77：1077-1086)。在人类患者中，含VEGF₁₆₅序列的质粒显示在缺血的四肢(Isner等人，1996，柳叶刀(Lancet)348：370-374)和心脏(参阅《时代》(Time)杂志，1999年1月11日，第68-73页)中诱导血管发生。

本发明涉及用于刺激血管发生的另一种方法，其中并不是直接施用VEGF编码序列。更具体的说，申请人出乎意料的发现，VEGF生成是由Akt蛋白诱导的。因此，本发明致力于通过将Akt蛋白引入细胞来刺激细胞内的VEGF表达。细胞优选存在于患有局部缺血状况的患者体内，其结果是患者体内有益的侧副血管形成。

本文对任何参考文献的引用不应当解释为对这些参考文献作为本申请的“现有技术”的许可。

                        发明概述

本发明涉及用于刺激细胞内VEGF表达的方法和组合物。更具体的说，申请人出乎意料的发现，Akt蛋白能够刺激VEGF表达。在最优选的方面，细胞存在于患有局部缺血状况的患者体内，而且结果是患者体内有益的侧副血管形成。

因此，本发明的第一个目标涉及通过对细胞施用Akt蛋白从而在细胞内诱导VEGF表达的方法。蛋白质可以是任何Akt蛋白。Akt蛋白优选人Akt蛋白。Akt蛋白更优选人Akt1、Akt2、或Akt3。

施用Akt蛋白后生成的VEGF可以是能够刺激血管发生的任何形式的VEGF。VEGF优选VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉、VEGF₂₀₆、VEGF-2、VEGF-B、和VEGF-D。

一方面，对细胞施用Akt蛋白。在优选的实施方案中，对细胞施用编码Akt蛋白且可操作连接表达控制序列的核酸。核酸可以是质粒或病毒的一部分。优选的病毒载体是逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、和痘苗病毒。

可以单独施用Akt蛋白或编码Akt蛋白的核酸，或者与过渡金属离子和/或血管舒张剂联合施用。也可以与编码第二种血管发生性因子且可操作连接表达控制序列的核酸一起施用Akt蛋白或编码Akt蛋白的核酸。优选的血管发生性因子包括VEGF、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、内皮细胞生长因子、或促血管生成素。另一方面，可以对细胞施用超过一种形式的Akt蛋白。

本发明还涉及通过对患有局部缺血状况患者施用Akt蛋白从而在患者细胞内诱导VEGF表达的方法。局部缺血状况可以是脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、四肢缺血、心肌缺血、或者缺血性、特发性、或肥大性心肌病。蛋白质可以是任何Akt蛋白。Akt蛋白优选Akt1、Akt2、或Akt3。

施用Akt蛋白后生成的VEGF可以是能够刺激血管发生的任何形式的VEGF。VEGF优选VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉、VEGF₂₀₆、VEGF-2、VEGF-B、和VEGF-D。

一方面，对患者施用Akt蛋白。在优选的实施方案中，对患者施用编码Akt蛋白且可操作连接表达控制序列的核酸。核酸可以是质粒或病毒的一部分。优选的病毒载体是逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、和痘苗病毒。在最优选的实施方案中，通过穿心外膜手术施用或通过使用导管的经皮投递将编码Akt蛋白的核酸直接施用于心脏组织。

可以对患者单独施用Akt蛋白或编码Akt蛋白的核酸，或者与过渡金属离子和/或血管舒张剂联合施用。也可以与编码第二种血管发生性因子且可操作连接表达控制序列的核酸一起对患者施用Akt蛋白或编码Akt蛋白的核酸。优选的血管发生性因子包括VEGF、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、内皮细胞生长因子、或促血管生成素。另一方面，可以对细胞施用超过一种形式的Akt蛋白。

本发明还涉及包含编码Akt蛋白的核酸、过渡金属离子和/或血管舒张剂、和制药学可接受载体的药物组合物。核酸可以是质粒或病毒载体的一部分。优选的病毒载体是逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、和痘苗病毒。

另一方面，本发明涉及通过在患有肿瘤的患者体内抑制Akt活性水平由此抑制VEGF生成从而在患者体内抑制血管发生的方法。可以通过在反义核酸在胞内条件下与Akt mRNA发生杂交的条件下将Akt反义核酸引入患者细胞从而降低Akt水平。还可以通过以足以结合并灭活Akt的水平将特异结合Akt的胞内结合蛋白(诸如单链Fv抗体，scFv)引入患者细胞内从而降低Akt水平。在另一个实施方案中，可以通过施用编码Akt的显性失活形式的核酸从而降低Akt活性。优选直接对肿瘤细胞施用反义核酸、胞内结合蛋白或其编码核酸、或者显性失活Akt突变体。

                    图的简述图1：激活的Akt3突变体的构建

图1A：激活的Akt3的示意图。在同一读码框内，在人Akt3的全长编码序列的N端融合来自人Src基因的肉豆蔻酸化信号(Myr)，在C端融合HA标签(HA)(见实施例)。

图1B：激活的Akt3在HEK293细胞内的异位表达。用CMV6-MyrAkt3HA或仅用表达质粒CMV6转染HEK293细胞。转染后24小时，制备细胞裂解物，并用抗HA抗体进行免疫印渍。

图1C：激活的Akt3具有Akt活性。用激活的Akt3(MyrAkt3HA)的表达质粒或仅用表达载体CMV6转染HEK293细胞。转染后24小时，制备细胞裂解物，并用抗HA抗体进行免疫沉淀。以由GSK3衍生的肽作为底物，测量免疫沉淀物的Akt3激酶活性。Bkgd：来自未转染细胞的背景水平；CMV6：用CMV6转染的细胞；Akt3cak：用组成性激活的Akt3的表达质粒(CMV6-MyrAkt3HA)转染的细胞。图2：在HeLa细胞中Akt增加VEGF₁₆₅的分泌

用激活的小鼠Akt1(Akt1)或激活的人Akt3(Akt3)的表达质粒或者仅用CMV6载体转染HeLa细胞。转染后1天，给细胞换成低有丝分裂原培养基(DMEM-0.5％FBS)。16小时后，收集培养基用于VEGF ELISA测定法。A道：用0.4μg CMV6载体DNA转染的细胞(6孔组织培养板)；Akt1道：用0.4μg CMV6-mAkt1cak表达质粒转染的细胞(6孔组织培养板)；Akt3道：用激活人Akt3的表达质粒(Akt3)转染的细胞(6孔组织培养板)。图3：在人冠脉平滑肌细胞和人骨骼肌细胞中Akt增加VEGF₁₆₅的表达

图3A：以3×10⁸VP/ml(VP：病毒颗粒)的浓度，用绿色荧光蛋白(AV-GFP)、组成性有活性的小鼠Akt1(AV-mAkt1cak)、或组成性有活性的人Akt3(AV-hAkt3cak)的重组腺病毒，感染人骨骼肌细胞(HSKMC)过夜。感染后1天，收集培养基，并通过ELISA测定法测量培养基中的VEGF水平。

图3B：以3×10⁸VP/ml的浓度，用AV-GFP、AV-mAkt1cak、或AV-hAkt3cak，感染人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)过夜。感染后1天，收集培养基，并通过针对人VEGF的ELISA测定法测量培养基中的VEGF水平。

图3C：以3×10⁸VP/ml的浓度，用指定病毒感染HCASMC过夜。作为对照，将未感染细胞转变成缺氧条件。1天后，由这些细胞分离总RNA，并通过Northern印渍分析检测VEGF表达。图4：在大鼠心肌细胞中Akt增加VEGF表达

以3×10⁷VP/ml的浓度，用绿色荧光蛋白(AV-GFP)、组成性有活性的小鼠Akt1(AV-mAkt1cak)、或组成性有活性的人Akt3(AV-hAkt3cak)的重组腺病毒，感染新生心肌细胞过夜。作为对照，对未感染细胞进行24小时缺氧处理。感染后1天，分离总RNA，并通过Northern印渍分析检测VEGF表达。

                         发明详述

本发明有利的提供了用于在细胞内刺激VEGF表达的方法和组合物。因此，通过提供用于在缺血组织内刺激侧副血管形成的方法和设备，本发明能够治疗患者的局部缺血性疾病。更具体的说，本文显示Akt蛋白能刺激血管发生性蛋白质VEGF的表达。因此，本发明的第一个目标涉及通过将Akt蛋白引入细胞从而在细胞内刺激VEGF表达。在优选的方面，对患者施用编码Akt蛋白的核酸。

本发明还涉及通过对患有局部缺血状况患者施用Akt蛋白来治疗患者。优选对患者施用编码Akt蛋白的核酸，结果是患者缺血组织内有益的侧副血管形成。

下文各部分将更详细的阐明本发明的各个方面。分成多个部分的这种组织形式意欲促进对本发明的理解，而绝非意欲限制本发明。定义

下文定义的术语用于整篇说明书，应该有助于理解本发明的范围和实践。

在特定的实施方案中，术语“大约”或“大致”指指定数值或范围的20％以内，优选10％以内，更优选5％以内。

“核酸”指包含共价连接的亚单位核苷酸的聚合化合物。核酸包括多核糖核酸(RNA)和多脱氧核糖核酸(DNA)，二者可以是单链或者双链。DNA包括cDNA、基因组DNA、合成DNA、和半合成DNA。

“基因”指编码多肽的核苷酸集群，包括cDNA和基因组DNA核酸。

重组DNA分子”指经历了分子生物学操作的DNA分子。

“载体”指用于将核酸转移至宿主细胞内的任何方法。载体可以是复制子，它可附着另一种DNA片段从而使所附着片段得以复制。“复制子”指作为体内DNA自主复制单位使用即能够在其自身控制下进行复制的任何遗传元件，如质粒、噬菌体、粘粒、染色体、或病毒。术语“载体”包括用于在体外、离体、或体内将核酸引入细胞的病毒和非病毒方法。病毒载体包括逆转录病毒、腺伴随病毒、痘病毒、杆状病毒、痘苗病毒、单纯疱疹病毒、Epstein-Barr病毒、和腺病毒载体，下文将更详细的阐明。非病毒载体包括质粒、脂质体、带电脂质(细胞转染剂)、DNA-蛋白质复合物、和生物聚合物。除了核酸，载体还可以包含一种或多种调控区，和/或可用于选择、测量、和监测核酸转移结果(转移至哪种组织、表达持续时间、等等)的可选择标记物。

“克隆载体”是复制子，诸如质粒、噬菌体、或粘粒，它可附着另一种DNA片段从而使所附着片段得以复制。克隆载体可以是能在一种细胞类型中复制而在另一种细胞中表达(“穿梭载体”)。

“盒”指能够插入载体特异限制位点的DNA片断。DNA片断编码目的多肽，而盒及限制位点的设计要保证将盒插入正确转录和翻译的读码框。

当已将外源或异源DNA引入细胞内时，就说细胞已被所述DNA转染。当所转染的DNA引起表型改变时，就说细胞已被外源或异源DNA“转化”。转化的DNA可整合(共价连接)到组成细胞基因组的染色体DNA中。

“核酸分子”指核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷、或胞苷；RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷、或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式，或其任何磷酸酯类似物，诸如硫代磷酸酯和硫酯，可以是单链形式或双链螺旋。双链DNA-DNA、DNA-RNA、和RNA-RNA螺旋是可能的。术语“核酸分子”，特别是DNA或RNA分子，仅指分子的一级结构和二级结构，而并未将其限制于任何特定三级结构。因此，该术语包括(但不限于)线性或环状DNA分子(如限制片段)、质粒、和染色体中的双链DNA。在对特定双链DNA分子结构的讨论中，本文可根据正常惯例描述序列，即只给出沿DNA非转录链(即序列与mRNA同源的链)的5’至3’方向的序列。“重组DNA分子”指经历了分子生物学操作的DNA分子。

当单链形式的核酸分子在适当的温度和离子强度条件下能够与其它核酸分子退火时，就说核酸分子与另一种核酸分子(诸如cDNA、基因组DNA、或RNA)是“可杂交的”(参阅Sambrook等人，同上)。温度和离子强度条件决定了杂交的“严谨性”。对于初步筛选同源核酸，可使用对应Tm为55℃的低严谨性杂交条件，如5x SSC/0.1％ SDS/0.25％奶/无甲酰胺；或30％甲酰胺/5x SSC/0.5％ SDS。中严谨性杂交条件对应较高Tm，如40％甲酰胺/5x或6x SCC。高严谨性杂交条件对应最高Tm，如50％甲酰胺/5x或6x SCC。杂交要求两种核酸包含互补序列，当然，取决于杂交的严谨性，碱基之间的错配还是有可能的。对于核酸杂交而言，适当的严谨性取决于核酸长度和互补程度，变数是本领域众所周知的。两种核苷酸序列之间的相似或同源程度越高，具有这两种序列的核酸的杂交Tm值就越高。核酸杂交的相对稳定性(对应较高Tm)以如下顺序降低：RNA：RNA、DNA：RNA、DNA：DNA。对于长度超过100个核苷酸的杂合物，已经推导了用于计算Tm的方程(参阅Sambrook等人，同上，9.50-0.51)。对于与较短核酸(即寡核苷酸)的杂交，错配的位置变得更加重要，而寡核苷酸的长度决定了它的特异性(参阅Sambrook等人，同上，11.7-11.8)。优选的是，可杂交核酸的最小长度为至少大约10个核苷酸，优选至少大约15个核苷酸，更优选至少大约20个核苷酸。

在特定的实施方案中，术语“标准杂交条件”指Tm为55℃，并采用上文提出的条件。在优选的实施方案中，Tm为60℃；在更优选的实施方案中，Tm为65℃。

用于此处时，术语“寡核苷酸”指通常至少18个核苷酸长且可与编码Akt的基因组DNA分子、cDNA分子、或mRNA分子杂交的核酸。可标记寡核苷酸，如用³²P-核苷酸或已共价缀合标记物(诸如生物素)的核苷酸。在一个实施方案中，标记后的寡核苷酸可用作探针以检测Akt编码核酸的存在。在另一个实施方案中，寡核苷酸(可标记其中之一或二者)可用作PCR引物，用于克隆Akt的全长或片段，或用于检测Akt编码核酸的存在。在还有一个实施方案中，本发明的寡核苷酸可与AktDNA分子形成三股螺旋。一般说来，可合成制备寡核苷酸，优选使用核酸合成仪。因此，可用非天然存在的磷酸酯类似键(诸如硫酯键等)制备寡核苷酸。

DNA“骗码序列”指当置于适当调节序列的控制之下时，在体外或体内细胞中将转录并翻译成多肽的双链DNA序列。5’(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子决定了编码序列的边界。编码序列可以包括(但不限于)原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列、甚至合成DNA序列。若编码序列意欲在真核细胞中表达，则多腺苷酸化信号和转录终止序列通常将位于编码序列的3’端。

转录和翻译控制序列是DNA调节序列，诸如提供编码序列在宿主细胞的表达的启动子、增强子、终止子、等等。在真核细胞中，多腺苷酸化信号也是控制序列。

“启动子序列”指能结合细胞内RNA聚合酶并起始下游(3’方向)编码序列转录的DNA调控区。为了对本发明进行说明，启动子序列限定为在3’末端为转录起始位点，并向上游(5’方向)延伸，包括起始超过背景的可检测水平的转录所必需的最小数目碱基或元件。在启动子序列中可找到转录起始位点(可方便的确定，例如通过核酸酶S1作图)，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合结构域(共有序列)。

当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA时，然后它被剪接(若编码序列包含内含子)，并翻译成由编码序列编码的蛋白质，就说编码序列在细胞中处于转录和翻译控制序列的“控制之下”。

用于此处时，术语“同源”指具有“共同进化起源”的蛋白质之间的相互关系，包括来自超家族的蛋白质(如免疫球蛋白超家族)和来自不同物种的同源蛋白质(如肌球蛋白轻链等)(Reeck等人，1987，细胞(Cell)50：667)。这种蛋白质(及其编码基因)具有序列同源性，反映在它们的序列具有高度的相似性。

因此，术语“序列相似性”指具有或不具有共同进化起源的蛋白质的核酸或氨基酸序列之间的相同或一致程度(参阅Reeck等人，同上)。但是，在普通用法及本申请中，当用诸如“高度的”之类副词修饰时，术语“同源的”可以指序列相似性而非共同进化来源。

在特定的实施方案中，当两种DNA序列确定长度的至少大约50％(优选至少大约75％，最优选至少大约90％或95％)核苷酸匹配时，就说这两种DNA序列是“基本同源的”或“基本相似的”。使用可由序列数据库获得的标准软件比较序列，或者在例如为具体系统确定的严谨性条件下进行Southern杂交实验，由此可以鉴定基本同源的序列。适当杂交条件的确定属于本领域技术范围之内。参阅例如Maniatis等人，同上；《DNA克隆》(DNA Cloning)，第1和2卷，同上；《核酸杂交》(Nucleic Acid Hybridization)，同上。

“反义核酸”指与有义序列互补的核苷酸序列。反义核酸可用于下调或阻断由有义链编码的多肽的表达。

转录和翻译控制序列指提供编码序列在宿主细胞中的表达的DNA调控序列，如启动子、增强子、终止子、等等。在真核细胞中，多腺苷酸化信号是另一类控制序列。

“信号序列”包含于表达在细胞表面的蛋白质编码序列的开始。该序列编码信号肽，位于成熟多肽的N端，指导宿主细胞转运多肽。术语“转运信号序列”在本文中用于指这类信号序列。可找到与多种真核和原核生物天然蛋白质有关的转运信号序列，而且常常在两类生物体中都发挥功能。

“调控区”指调控第二种核酸序列表达的核酸序列。调控区可包括天然负责特定核酸表达的序列(同源区)，或者可包括来源不同却负责不同蛋白质或甚至合成蛋白质表达的序列(异源区)。特别的，序列可以是以特异或非特异方式、可诱导或非可诱导方式，刺激或抑制基因转录的真核或病毒基因的序列或衍生序列。调控区包括复制起点、RNA剪接位点、启动子、增强子、转录终止序列、指导多肽进入靶细胞分泌途径的信号序列、和启动子。

来自“异源来源”的调控区指与表达的核酸非天然相连的调控区。异源调控区包括来自不同物种的调控区、来自不同基因的调控区、杂合调控序列、和非天然存在而由本领域普通技术人员设计的调控序列。

“异源”DNA指非天然存在于细胞中或细胞染色体位点的DNA。异源DNA优选包括对细胞而言是外源的基因。

“同源重组”指将外源DNA序列插入另一种DNA分子，如将载体插入染色体。载体优选靶向用于同源重组的特异染色体位点。对于特异同源重组，载体将包含与染色体序列同源的足够长区域，从而得以互补结合并将载体掺入染色体。较长的同源区和较高程度的序列相似性可增加同源重组的效率。

“多肽”指包含共价连接的氨基酸残基的聚合混和物。氨基酸具有如下一般结构：

根据侧链R，将氨基酸分成7组：(1)脂肪族侧链，(2)含羟基OH的侧链，(3)含硫原子的侧链，(4)含酸性基团或酰胺基团的侧链，(5)含碱性基团的侧链，(6)含芳香环的侧链，和(7)脯氨酸，在这种氨基酸中侧链与氨基融合。本发明的多肽优选地包含至少大约14个氨基酸。

“蛋白质”指在活细胞中发挥结构性或功能性作用的多肽。

多肽或蛋白质的“变体”指由多肽或蛋白质衍生且保留该多肽或蛋白质的至少一种生物学特性的任何类似物、片段、衍生物、或突变体。自然界中可能存在多肽或蛋白质的不同变体。这些变体可以是特征为编码蛋白质的结构基因核苷酸序列中存在差异的等位基因变异，或者可以包括不同剪接或翻译后修饰。熟练技术人员能够产生具有一处或多处氨基酸替代、删除、添加、或取代的变体。这些变体可包括，但不限于，：(a)用保守或非保守氨基酸替代了一个或多个氨基酸残基的变体，(b)向多肽或蛋白质添加了一个或多个氨基酸的变体，(c)一个或多个氨基酸包含取代基的变体，和(d)多肽或蛋白质融合了另一种多肽(诸如血清清蛋白)的变体。本领域普通技术人员知道用于获得这些变体的技术，包括基因(遏制、删除、突变、等等)、化学、和酶技术。

若这些等位基因变异、类似物、片段、衍生物、突变体、和修饰(包括其它mRNA剪接形式和其它翻译后修饰形式)导致保留多肽任何生物学特性的多肽衍生物，则意欲将它们包括于本发明的范围之内。

“异源蛋白质”指细胞中非天然产生的蛋白质。

当超过大约40％的氨基酸相同或超过大约60％的氨基酸相似(功能相同)时，就说这两种氨基酸序列是“基本同源的”或“基本相似的”。优选通过使用例如GCG(Genetics Computer Group，GCG包程序手册，第7版，麦迪逊，威斯康星)累积程序进行比对来鉴定相似或同源序列。

术语“对应”在本文中用于指相似或同源序列，无论测量相似性或同源性的分子的确切位置是否相同或相似。核酸或氨基酸序列比对可包含间隔物。因此，术语“对应”指序列相似性，而非氨基酸残基或核苷酸碱基的编号。编码Akt蛋白的基因

本发明涵盖Akt蛋白或多肽，或者编码Akt蛋白或多肽的核酸在细胞中刺激VEGF表达的应用。Akt优选人Akt3蛋白或多肽，包括Akt的全长或天然存在形式或其能够刺激VEGF表达的任何片段。用于此处时，“Akt”指Akt多肽，而“akt”指编码Akt多肽的基因。

本领域知道多种小鼠和人Akt序列(参阅Coffer等人，1991，欧洲生化杂志(Eur.J.Biochem.)201：475-481；Jones等人，1991，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88：4171-4175；Bellacosa等人，1993，癌基因(Oncogene)8：745-754；GenBank编号M63167、X61037、和X65687；和美国临时申请号60/125,108)。Akt优选人Akt1(SEQ ID NO：11)、Akt2(SEQ ID NO：12)、或Akt3(SEQID NO：2)。本发明的优选Akt包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。本发明的优选核酸编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：11、或SEQ ID NO：12所示氨基酸序列。核酸更优选包含SEQ ID NO：1所示序列。Akt还可衍生自非人来源。

根据本发明，可采用本领域技术范围之内的传统分子生物学技术、微生物学技术、和重组DNA技术。文献中充分解释了这些技术。参阅例如Sambrook、Fritsch、和Maniatis，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第2版，1989，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约(本文“Sambrook等人，1989)；《DNA克隆：实践方法》(DNA Cloning：A Practical Approach)，第1和2卷，D.N.Glover编，1985；《寡核苷酸合成》(OligonucleotideSynthesis)，M.J.Gait编，1984；《核酸杂交》(Nucleic AcidHybridization)，B.D.Hames和S.J.Higgins编，1985；《转录和翻译》(Transcription And Translation)，B.D.Hames和S.J.Higgins编，1984；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture)，R.I.Freshney编，1986；《固定化细胞和酶》(Immobilized Cells And Enzymes)，IRL出版社，1986；B.Perval，《分子克隆实践指南》(A Practical GuideTo Molecular Cloning)，1984；F.M.Ausubel等人编，《分子生物学现行方案》(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley& Sons公司，1994。

可以由任何来源(特别是人cDNA或基因组文库)分离编码Akt的基因(无论是基因组DNA还是cDNA)。如上文所述，本领域众所周知用于获得akt基因的常用方法(参阅Sambrook等人，1989，同上)。

因此，任何动物细胞潜在的可作为核酸来源用于akt基因的分子克隆。可通过本领域知道的标准流程由克隆的DNA(如DNA“文库”)获得所述DNA，优选由高水平表达该蛋白质的组织(如心、胰、和骨骼肌cDNA)制备的cDNA文库；通过化学合成；通过cDNA克隆；或者通过由预定细胞纯化的基因组DNA或其片段的克隆获得该DNA(参阅例如Sambrook等人，1989，同上；D.M.Glover编，1985，《DNA克隆：实践方法》(DNA Cloning：A Practical Approach)，第1和2卷，MRL出版有限公司，牛津，英国)。除了编码区，由基因组DNA衍生的克隆可包含调控区和内含子DNA区；由cDNA衍生的克隆将不包含内含子序列。无论来源是什么，应将基因分子克隆到合适载体中用于扩增基因。

一旦制得该DNA片段，即可以大量方法实现对含预定akt基因的特定DNA片段的鉴定。例如，可通过与标记探针的核酸杂交筛选DNA片段(Benton和Davis，1977，科学(Science)196：180；Grunstein和Hogness，1975，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)72：3961)。这些与探针基本同源的DNA片段将发生杂交。如上文所述，同源程度越高，则可使用越严谨的杂交条件。在特定的实施方案中，使用Northern杂交条件鉴定akt基因的mRNA剪接变体。

可根据基因特性进行进一步的选择，如基因是否编码具有本文公开的Akt蛋白的等电性质、电泳性质、氨基酸组成、或部分氨基酸序列的蛋白质产物。因此，可通过基于其表达产物的物理学、化学或免疫学特性的测定法检测该基因的存在与否。例如，可根据它们产生的蛋白质是否具有与Akt相似或相同的电泳迁移、等电聚焦或非平衡pH凝胶电泳行为、蛋白水解消化图谱、或抗原特性来选择cDNA克隆或杂交选择正确mRNA的DNA克隆。在特定的实施方案中，针对人Akt特异表位产生的多克隆抗体识别表达的蛋白质。

本发明还涉及编码Akt能够刺激VEGF表达的等位基因变体、剪接变体、类似物、和衍生物的基因(如cDNA)的应用。Akt衍生物和类似物的生成和应用属于本发明范围之内。这些变体、类似物、衍生物、和同源物应保留刺激VEGF表达的能力。

通过替代、添加、或删除改变编码核酸序列以提供功能相当的分子，由此可制备Akt衍生物。优选制备相对于天然Akt而言功能活性增强或升高的衍生物。

由于核苷酸编码序列的简并性，编码与akt基因基本相同的氨基酸序列(包括含单个氨基酸变异的氨基酸序列)的其它DNA序列也可应用于本发明的实践。这些包括，但不限于，等位基因、来自其它物种的同源基因、和含全部或部分akt基因的核苷酸序列，所述核苷酸序列通过用编码原序列相同氨基酸残基的不同密码子替代而改变，由此产生沉默的变化。同样的，本发明的akt衍生物包括，但不限于，从一级氨基酸序列上看含全部或部分Akt蛋白氨基酸序列的那些，它们包括用序列中导致保守氨基酸替代的残基来替代功能相当的氨基酸残基而被改变的序列。例如，可用极性相似的另一氨基酸替代序列中的一个或多个氨基酸残基，它可用作功能同等物，产生沉默的改变。序列中氨基酸的替代物可选自该氨基酸所属类型的其它成员。例如，非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、和甲硫氨酸。含芳香环结构的氨基酸是苯丙氨酸、色氨酸、和酪氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、和谷氨酰胺。带正电的(碱性)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸、和组氨酸。带负电的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。预期这样的改变不会影响聚丙烯酰胺凝胶电泳测定的表观分子量或等电点。

特别优选的替代是：-用赖氨酸取代精氨酸，反之亦然，从而保持正电荷；-用谷氨酸取代天冬氨酸，反之亦然，从而保持负电荷；-用丝氨酸取代苏氨酸，从而保持游离羟基；和-用谷氨酰胺取代天冬酰胺，从而保持游离CONH2。

还可引入氨基酸替代，以便用具有特别优选特性的氨基酸进行替代。例如，可引入半胱氨酸以添加可能与其它半胱氨酸形成二硫键的位点。可引入组氨酸作为特别有催化活性的位点(即组氨酸可作为酸或碱，是生化催化中最常用的氨基酸)。也可引入脯氨酸，因为它具有特殊的平面结构，该结构在蛋白质结构中可诱导β-转角。

可通过本领域知道的多种方法产生编码本发明Akt衍生物和类似物的基因。导致它们产生的操作可于基因或蛋白质水平进行。例如，可通过本领域知道的许多策略中的任一种修饰克隆的Akt基因序列(Sambrook等，1989，同上)。可用限制性内切酶在适当位点切割此序列，根据需要还可进行其它酶促修饰、分离、和体外连接。产生编码Akt衍生物或类似物的基因时，应小心确保修饰后的基因保留在与Akt基因相同的翻译读码框内，而在编码所需活性的基因区内不被翻译终止信号打断。

另外，Akt编码核酸序列可在体外或在体内突变以产生和/或破坏翻译、起始、和/或终止序列，或产生编码区中的变异和/或形成新的限制性内切酶位点或破坏原先存在的位点，从而便于进一步的体外修饰。这些突变优选增强突变Akt基因产物的功能活性。可使用本领域知道的任何诱变技术，包括，但不限于，体外定点诱变(C.Hutchinson等人，1978，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)253：6551；Zoller和Smith，1984，DNA 3：479-488；Oliphant等人，1986，基因(Gene)44：177；Hutchinson等人，1986，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83：710)、TAB接头(Pharmacia)的使用，等等。PCR技术优选用于定位诱变(参阅Higuchi，1989，“用PCR加工DNA”，在《PCR技术：DNA扩增的原理和应用》(PCR Technology：Principles andApplicaiton for DNA Amplification)中，H.Erlich编，Stockton出版社，第6章，第61-70页)。

然后可将鉴定和分离后的DNA序列插入合适的克隆载体。可使用本领域知道的大量的载体-宿主系统。可用的载体包括，但不局限于，质粒或修饰后的病毒，但是载体系统必须与所使用的宿主细胞相容。载体的实例包括，但不限于，大肠杆菌噬菌体，诸如λ衍生物，或质粒，诸如pBR322衍生物或pUC质粒衍生物，如pGEX载体、pmal-c、pFLAG、等等。可通过将DNA片段连接到具有互补粘端的克隆载体内来实现克隆载体中的插入。但是，若克隆载体中不存在用于片段化DNA的互补限制性位点，则可酶促修饰DNA分子的末端。或者，可通过将核苷酸序列(接头)连接到DNA末端来产生任何预定位点；这些连接的接头可包含编码限制性内切酶识别序列的特殊化学合成寡核苷酸。可经转化、转染、感染、电穿孔、等等将重组分子引入宿主细胞，从而产生基因序列的许多拷贝。克隆的基因优选包含于穿梭载体质粒中，以供在克隆细胞(如大肠杆菌)中扩增，而且在需要时便于纯化用于随后插入适当的表达细胞系。例如，穿梭载体是能在超过一种类型的生物体中复制的载体，可通过连接来自大肠杆菌质粒的序列与来自酵母2μ质粒的序列制备既能在大肠杆菌中复制又能在酿酒酵母中复制的穿梭载体。Akt多肽的表达

可将编码Akt或其抗原性片段、衍生物、或类似物以及它的功能活性衍生物(包括嵌合蛋白质)的核苷酸序列插入适当的表达载体，即包含转录和翻译插入的蛋白质编码序列所必需的元件的载体。本文将这些元件称为“启动子”。因此，本发明核酸在本发明表达载体中可操作连接启动子。cDNA和基因组序列都可克隆并在这些调控序列的控制下表达。表达载体还优选包含复制起点。

可在重组表达载体上提供必需的转录和翻译信号，或者可由编码Akt和/或其侧翼区的天然基因提供。在一个优选的实施方案中，使用心脏特异启动子和/或特异趋向心脏细胞的载体将Akt的表达限制于心肌细胞。

潜在的宿主-载体系统包括，但不限于，感染了病毒(如痘苗病毒、腺病毒、等)的哺乳动物细胞系统；感染了病毒(如杆状病毒)的昆虫细胞系统；微生物，诸如含酵母载体的酵母；或用噬菌体、DNA、质粒DNA、或粘粒DNA转化的细菌。载体的表达元件在强度和特异性上都有所变化。取决于所用的宿主-载体系统，可使用大量合适的转化和翻译元件中的任一种。

在通过重组整合编码序列后，可在染色体上表达重组Akt蛋白或其功能片段、衍生物、嵌合构建物、或类似物。在这点上，可使用大量扩增系统中的任一种来实现高水平的稳定基因表达(参阅Sambrook等人，1989，同上)。

可在适当的细胞培养基中在供细胞表达Akt的条件下培养包含含Akt编码核酸的重组载体的细胞。上述用于将DNA片段插入克隆载体的任何方法都可用于构建包含具有适当转录/翻译控制信号和蛋白质编码序列的基因的表达载体。这些方法可包括体外重组DNA和合成技术，以及体内重组(遗传重组)。

可将编码Akt多肽的核酸可操作连接任何调控区(即本领域已知的启动子/增强子)并受其控制，但是这些调控元件必须在选择用于表达的宿主靶肿瘤处是有功能的。调控区可包含用于在宿主细胞中功能转录的启动子区，以及位于目的基因3’端且提供转录终止信号和多聚腺苷酸化位点的区域。所有这些元件构成了表达盒。

可用于本发明的启动子包括组成性启动子和可调控(可诱导)启动子。启动子有可能天然负责核酸的表达。它也可来自异源来源。具体而言，它可以是真核或病毒基因的启动子序列。例如，它可以是由预定感染的细胞基因组衍生的启动子序列。同样的，它可以是由病毒基因组衍生的启动子序列，诸如腺病毒(E1A和MLP)、巨细胞病毒、或劳氏肉瘤病毒。另外，可通过添加激活或调控序列或者能够发生组织特异或优势表达的序列来修饰启动子(烯醇化酶和GFAP启动子等等)。此外，当核酸不包含启动子序列时，可以插入启动子序列。

可用于实践本发明的启动子包括遍在启动子(如HPRT、波形蛋白、肌动蛋白、微管蛋白)、中间丝启动子(如桥粒蛋白、神经丝、角蛋白、GFAP)、治疗性基因启动子(如MDR型、CFTR、因子VIII)、组织特异启动子(如平滑肌细胞中的肌动蛋白启动子)、在分裂的细胞中优先激活的启动子、应答刺激的启动子(如类固醇激素受体、视黄酸受体)、四环素调控的转录调节物、巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、逆转录病毒LTR启动子、金属硫蛋白启动子、SV40启动子、腺病毒Ela启动子、和腺病毒主要晚期启动子(MLP)。WO96/01313、US5,168,062、和5,385,839(收入本文作为参考)中描述了四环素调控的转录调节物和CMV启动子。

更具体的说，可通过本领域已知的任何启动子/增强子元件控制Akt蛋白的表达，但是这些调控元件在选择用于表达的宿主中必须是有功能的。可用于控制基因表达的启动子包括，但不限于，SV40早期启动子区(Benoist和Chambon，1981，自然(Nature)290：304-310)、劳氏肉瘤病毒3’长末端重复片段中所含的启动子(Yamamoto等人，1980，细胞(Cell)22：787-797)、疱疹病毒胸苷激酶启动子(Wagner等人，1981，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)78：1441-1445)、金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等人，1982，自然(Nature)296：39-42)；原核表达载体，诸如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等人，1978，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75：3727-3731)或tac启动子(DeBoer等人，1983，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80：21-25)；也可参阅“来自重组细菌的有用蛋白质”(1980，科技美国人(Scientific American)242：74-94)；来自酵母或其它真菌的启动子元件，诸如Gal4启动子、ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子；和展示组织特异性并已用于转基因动物的动物转录控制区：在胰腺泡细胞中有活性的弹性蛋白酶I基因控制区(Swift等人，1984，细胞(Cell)38：639-646；Ornitz等人，1986，冷泉港生物学季度讨论会(Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.)50：399-409；MacDonald，1987，肝脏病学(Hepatology)7：425-515)；在胰腺β-细胞内有活性的胰岛素基因控制区(Hanahan，1985，自然(Nature)315：115-122)、在淋巴细胞内有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等人，1984，细胞(Cell)38：647-658；Adames等人，1985，自然(Nature)318：533-538；Alexander等人，1987，细胞分子生物学(Mol.Cell.Biol.)7：1436-1444)、在睾丸、乳房、淋巴、和肥大细胞中有活性的小鼠乳腺肿瘤病毒控制区(Leder等人，1986，细胞(Cell)45：485-495)、在肝中有活性的清蛋白基因控制区(Pinkert等人，1987，基因和发育(Gene andDevel.)1：268-276)、在肝中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等人，1985，细胞分子生物学(Mol.Cell.Biol.)5：1639-1648；Hammer等人，1987，科学(Science)235：53-58)、在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等人，1987，基因和发育(Gene and Devel.)1：161-171)、在骨髓细胞中有活性的β珠蛋白基因控制区(Mogram等人，1985，自然(Nature)315：338-340；Kollias等人，1986，细胞(Cell)46：89-94)、在脑的少突胶质细胞中有活性的髓鞘碱性蛋白基因控制区(Readhead等人，1987，细胞(Cell)48：703-712)、在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链2基因控制区(Sani，1985，自然(Nature)314：283-286)、和在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等人，1986，科学(Science)234：1372-1378)。

优选的是，或使用心脏特异启动子或使用特异趋向心脏细胞的载体，将Akt的表达限制于心肌细胞。

可通过5种常用方法鉴定包含Akt蛋白编码核酸的表达载体：(a)目的质粒DNA或特异mRNA的PCR扩增，(b)核酸杂交，(c)选择标记基因功能的存在或缺失，(d)用适当的限制性内切酶进行分析，和(e)插入序列的表达。在第一种方法中，可通过PCR扩增核酸以检测扩增产物。在第二种方法中，可用探针通过核酸杂交检测插入表达载体的外源基因的存在，所用探针含与插入的标记基因同源的序列。在第三种方法中，可以外源基因插入载体而引起的某些“选择标记”基因功能(如，β-半乳糖苷酶活性、胸苷激酶活性、对抗生素的抗性、转化表型、杆状病毒中包涵体的形成，等等)的存在或丢失为基础鉴定并选择重组载体/宿主系统。在另一个实施例中，若编码Akt的核酸插入载体的“选择标记”基因序列中，则通过选择标记基因功能的缺失可鉴定含Akt插入片段的重组体。在第四种方法中，通过适当的限制酶消化鉴定重组表达载体。在第五种方法中，假如表达蛋白质呈现功能活性构象，那么可通过测定重组体所表达的基因产物的活性、生化或免疫学特征来鉴定重组表达载体。

多种宿主/表达载体组合可用于表达Akt DNA序列。例如，有用的表达载体可包括染色体、非染色体、和合成的DNA序列片段。合适的载体包括SV40衍生物和已知的细菌质粒，如大肠杆菌质粒colE1、pCR1、pBR322、pMa1-C2、pET、pGEX(Smith等人，1988，基因(Gene)67：31-40)、pMB9及其衍生物，诸如RP4等质粒；噬菌体DNA，如噬菌体1的大量衍生物，如NM989，和其它噬菌体DNA，如M13和丝状单链噬菌体DNA；诸如2μm质粒等酵母质粒或其衍生物；可用于真核细胞的载体，诸如可用于昆虫或哺乳动物细胞的载体；由质粒与噬菌体DNA联合衍生的载体，诸如经修饰而应用噬菌体DNA或其它表达控制序列的质粒；等等。

例如，在杆状病毒表达系统中，既可使用非融合型转移载体，诸如，但不限于，pVL941(BamHI克隆位点；Summers)、pVL1393(BamHI、SmaI、XbaI、EcoRI、NotI、XmaIII、BglII、和PstI克隆位点；Invitrogen)、pVL1392(BglII、PstI、NotI、XmaIII、EcoRI、XbaI、SmaI、和BamHI克隆位点；Summers和Invitrogen)、和pBlueBacIII(BamHI、BglII、PstI、NcoI、和HindIII克隆位点，可用蓝/白重组体筛选；Invitrogen)；又可使用融合型转移载体，诸如，但不限于，pAc700(BamHI和KpnI克隆位点，其中BamHI识别位点开始于起始密码子；Summers)、pAc701和pAc702(与pAc700相同，具有不同的阅读框架)、pAc360(多角体蛋白起始密码子下游36bp处有BamHI克隆位点；Invitrogen(195))、和pBlueBacHisA、B、C(三种不同的阅读框架，具有BamHI、BglII、PstI、NcoI、和HindIII克隆位点，用于ProBond纯化的N-末端肽和蓝/白斑重组体筛选；Invitrogen(220))。

本发明试图使用的哺乳动物表达载体包括，含可诱导启动子诸如二氢叶酸还原酶(DHFR)启动子的载体，如包含DHFR表达载体的任何表达载体，或DHFR/氨甲喋呤共扩增载体，诸如pED(PstI、SalI、SbaI、SmaI、和EcoRI克隆位点，该载体既表达克隆基因又表达DHFR，参阅Kaufman，1991，分子生物学现行方案(Current Protocols inMolecular Biology)16.12)。或者，谷氨酰胺合成酶/甲硫氨酸磺基肟共扩增载体，诸如pEE14(HindIII、XbaI、SmaI、SbaI、EcoRI、和BclI克隆位点，其中载体表达谷氨酰胺合成酶和克隆基因；Celltech)。在另一个实施方案中，可使用在Epstein Barr病毒(EBV)控制下指导游离体基因表达的载体，诸如pREP4(BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、和KpnI克隆位点，组成性劳氏肉瘤病毒长末端重复片段(RSV-LTR)启动子、潮霉素选择标记；Invitrogen)、pCEP4(BamHI、SfiI、XhoI、NotI、NheI、HindIII、NheI、PvuII、和KpnI克隆位点，组成性人巨细胞病毒(hCMV)立即早期基因、潮霉素选择标记；Invitrogen)、pMEP4(KpnI、PvuI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、和BamHI克隆位点，可诱导的金属硫蛋白IIa基因启动子、潮霉素选择标记；Invitrogen)、pREP8(BamHI、XhoI、NotI、HindIII、NheI、和KpnI克隆位点，RSV-LTR启动子、组氨醇选择标记；Invitrogen)、pREP9(KpnI、NheI、HindIII、NotI、XhoI、SfiI、和BamHI克隆位点，RSV-LTR启动子、G418选择标记；Invitrogen)、和pEBVHis(RSV-LTR启动子、潮霉素选择标记、可通过ProBond树脂纯化并用肠激酶切割的N-末端肽；Invitrogen)。用于本发明的可选择哺乳动物表达载体包括pRc/CMV(HindIII、BstXI、NotI、SbaI、和ApaI克隆位点，G418选择；Invitrogen)、pRc/RSV(HindIII、SpeI、BstXI、NotI、和XbaI克隆位点，G418选择；Invitrogen)、等等。本发明使用的牛痘病毒哺乳动物表达载体(参阅Kaufman，1991，同上)包括，但不限于，pSC11(SmaI克隆位点，TK-和β-gal筛选)、pMJ601(SalI、SmaI、AflI、NarI、BspMII、BamHI、ApaI、NheI、SacII、KpnI、和HindIII克隆位点；TK-和β-gal筛选)、和pTKgptF1S(EcoRI、PstI、SalI、AccI、HindIII、SbaI、BamHI和Hpa克隆位点，TK或XPRT选择)。

本发明也可使用酵母表达系统来表达Akt蛋白。例如，非融合型pYES2载体(XbaI、SphI、ShoI、NotI、GstXI、EcoRI、BstXI、BamHI、SacI、KpnI、和HindIII克隆位点；Invitrogen)或融合型pYESHisA、B、C(XbaI、SphI、ShoI、NotI、BstXI、EcoRI、BamHI、SacI、KpnI、和HindIII克隆位点，用ProBond树脂纯化并用肠激酶切割的N-末端肽；Invitrogen)，只提及这两种可用于本发明的载体。

一旦鉴定并分离了特定的重组DNA分子，可使用本领域已知的几种方法进行扩增。一旦建立了合适的宿主系统和生长条件，就可增殖和制备一定量的重组表达载体。如上所述，可用的表达载体包括，但不限于，下列载体或其衍生物：人或动物病毒，诸如牛痘病毒或腺病毒；昆虫病毒，诸如杆状病毒；酵母载体；噬菌体载体(如λ)，以及质粒和粘粒DNA载体，这里只提到其中一些。

另外，可选择能够调节插入序列的表达或以预期的特异方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。不同的宿主细胞的蛋白质翻译和翻译后加工及修饰具有其特征性及特异性机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以保证所表达外源蛋白质的预期修饰和加工。酵母中的表达可产生生物学活性产物。真核细胞中的表达可提高“自然”折叠的可能性。此外，哺乳动物细胞中的表达可为重建或建立Akt活性提供工具。而且，不同的载体/宿主表达系统可不同程度影响加工反应，诸如蛋白水解切割。

通过本领域已知方法，将载体引入预期宿主细胞中，如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂转染(溶酶体融合)、基因枪、或DNA载体转移器(参阅如Wu等人，1992，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267：963-967；Wu和Wu，1988，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263：14621-14624；Hartmut等人，加拿大专利申请2,012,311，1990年3月15日提交)。

如上所述，通过收集培养液或溶解包涵体，如用去污剂处理，若需要还可以用超声波法或其它机械方法，可获得可溶形式的蛋白质。使用多种技术可分离溶解的或可溶的蛋白质，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、等电聚焦、双向凝胶电泳、层析法(如离子交换、亲和、免疫亲和、和大小排阻柱层析)、离心、差异溶解度、免疫沉淀、或用于蛋白质纯化的任何其它标准技术。基因疗法和转基因载体

如上所述，本发明涉及Akt蛋白刺激VEGF表达的能力，VEGF是一种诱导血管发生的蛋白质。因此，本发明包括通过对患有局部缺血状况患者施用编码Akt蛋白的核酸而进行的基因疗法。局部缺血状况可包括脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、四肢缺血、外周动脉疾病、间歇性跛行、心肌缺血、或者缺血性、特发性、或肥大性心肌病。

适当掺入载体中的Akt编码核酸，以及包含它们的药物组合物，可用于治疗缺血组织。它们可用于在体内在任何类型的缺血组织中转移并表达基因，尤其是心脏。此外，依照待治疗的病理学，可进行靶向治疗(具体而言，就是，可通过选择的载体确定趋向特定组织的转移，并通过选择的特定启动子确定表达)。本发明的核酸或载体可有利的用于在人或动物中，在体内或在细胞内，产生能够刺激VEGF蛋白表达的Akt蛋白。本发明由此有可能特异的、局部的、且有效的治疗局部缺血。

可单独施用编码Akt蛋白的核酸，或者与编码血管发生性因子的核酸联合。已知的血管发生性因子包括碱性和酸性成纤维细胞生长因子(bFGF和aFGF)、FGF-5(美国专利5,661,133)、内皮细胞生长因子(Pu等人，1993，循环(Circulation)88：208-2156)、促血管生成素、和VEGF(评论参阅Melillo等人，1997；和Lewis等人，1997)。已鉴定了VEGF的几种形式，包括VEGF₁₂₁(美国专利5,219,739)、VEGF₁₆₅(美国专利5,332,672)、VEGF₁₈₉(美国专利5,240,848)、VEGF₂₀₆、VEGF-2(WO95/24473和WO96/39515)、VEGF-B(美国专利5,607,918和5,840,693)、和VEGF-D(WO97/12972)。编码Akt蛋白的核酸还可与过渡金属离子联合施用，诸如CoCl₂，它显示可增强VEGF基因的表达并刺激血管形成(美国专利5,480,975)。

如上所述，“载体”是用于将本发明核酸转移至宿主细胞的任何工具。优选的载体是病毒载体，诸如逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、和腺伴随病毒。由此，用病毒载体或通过直接引入DNA，体内、离体或体外引入编码Akt蛋白或多肽的基因。通过将转基因载体靶向特异细胞可实现靶组织中的表达，诸如用病毒载体或受体配基，或用组织特异的启动子，或二者结合使用。

通常用于体内靶向和治疗流程的病毒载体是基于DNA的载体和逆转录病毒载体。本领域已知用于构建和使用病毒载体的方法(参阅Miller和Rosman，1992，生物技术(BioTechniques)7：980-990)。优选的病毒载体是复制缺陷型的，即它们在靶细胞中不能自主复制。一般而言，本发明范围内使用的复制缺陷型病毒载体基因组缺少至少一个病毒在感染细胞中复制所必需的区域。这些区域可用本领域技术熟练人员已知的任何技术或删除(全部或部分)或使其无功能。这些技术包括完全去除、替代(用其它序列，特别是插入的核酸)、部分删除、或向必需(对复制而言)区添加一个或多个碱基。使用遗传操作技术或通过诱变剂处理，可在体外(在分离DNA上)或原位进行这些技术。优选复制缺陷型病毒保留包装病毒颗粒所必需的基因组序列。

DNA病毒载体包括减毒的或缺陷型DNA病毒，诸如，但不限于，单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒、Epstein Barr病毒(EBV)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)、牛痘病毒、等等。优选完全或几乎完全缺失病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒在引入细胞后无复制能力，因而不会导致可能产生的病毒感染。使用缺陷型病毒载体得以施用于特异、局部区域的细胞，而不用担心该载体会感染其它细胞。因此可特异靶向特殊组织。具体载体的例子包括，但不限于，缺陷型疱疹病毒1(HSV1)载体(Kaplitt等人，1991，分子细胞神经科学(Molec.Cell.Neurosci.)2：320-330)、缺失糖蛋白L基因的缺陷型疱疹病毒载体(专利发表物RD371005A)、或其它缺陷型疱疹病毒载体(国际专利发表物WO94/21807，发表于1994年9月29日；国际专利发表物WO92/05263，发表于1994年4月2日)；减毒型腺病毒载体，诸如Stratford-Perricaudet等人描述的载体(1992，临床研究杂志(J.Clin.Invest.)90：626-630；也可参阅La Salle等人，1993，科学(Science)259：988-990)；以及缺陷型腺伴随病毒载体(Samulski等人，1987，病毒学杂志(J.Virol.)61：3096-3101；Samulski等人，1989，病毒学杂志(J.Virol.)63：3822-3828；Lebkowski等人，1988，分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)8：3988-3996)。

体内施用时，优选将适当的免疫抑制治疗与病毒载体(如腺病毒载体)结合使用，以避免病毒载体和感染细胞的免疫失活。例如，可施用诸如白介素-12(IL-12)、干扰素-γ(IFN-γ)、或抗CD4抗体等免疫抑制细胞因子来阻断对病毒载体的体液或细胞免疫应答(参阅如Wilson，1995，自然医学(Nature Medicine))。另外，采用经改造表达最小数量抗原的病毒载体是有利的。

自然的，本发明涵盖载体的投递，它将表达治疗有效量的Akt用于基因疗法。用于本文的术语“治疗有效量”指足以改善宿主的临床显著局部缺血状况的量。腺病毒载体

在优选的实施方案中，载体是腺病毒载体。腺病毒是真核DNA病毒，经修饰后可将本发明的核酸有效投递至多种细胞类型中。存在多种血清型的腺病毒。在本发明范围内，优选使用这些血清型中的2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或动物来源的腺病毒(参阅WO94/26914)。可用于本发明范围内的那些动物来源的腺病毒包括犬、牛、鼠(例如：May1，Beard等人，1990，病毒学(Virology)75：81)、羊、猪、禽、和猿(例如：SAV)来源的腺病毒。优选的动物来源腺病毒是犬腺病毒，更优选CAV2腺病毒(如Manhattan或A26/61株(ATCC VR-800))。

优选的本发明复制缺陷型腺病毒载体包含ITR、衣壳化序列、和目的核酸。更优选的是，至少腺病毒的E1区是非功能性的。E1区中的删除优选为Ad5腺病毒序列的第455-3329位核苷酸(PvuII-BglII片段)或第382-3446位核苷酸(HinfII-Sau3A片段)。也可修饰其它区域，特别是E3区(WO95/02697)、E2区(WO94/28938)、E4区(WO94/28152、WO94/12649、和WO95/02697)、或晚期基因L1-L5中的任一个。

在一个优选实施方案中，腺病毒载体在E1区有删除(Ad1.0)。EP185,573中公开了E1-删除的腺病毒的例子，该专利全文引入本文作为参考。在另一个优选实施方案中，腺病毒载体在E1和E4区有删除(Ad3.0)。WO95/02697和WO96/22378(收入本文作为参考)公开了E1/E4-删除的腺病毒的例子。在还有一个优选实施方案中，腺病毒载体在E1区有删除，并在其中插入了E4区和核酸序列(参阅FR94 13355，收入本文作为参考)。

通过本领域技术熟练人员已知的任何技术，可制备本发明复制缺陷型重组腺病毒(Levero等人，1991，基因(Gene)101：195；EP185 573；Graham，1984，欧洲分子生物学杂志(EMBO J.)3：2917)。具体而言，可通过腺病毒与其中携带目的DNA序列的质粒之间的同源重组进行制备。在腺病毒与质粒共转染进入适当细胞系后进行同源重组。采用的细胞系应优选(i)是所述元件可转化的，且(ii)包含能与复制缺陷型腺病毒部分基因组互补的序列，它优选以整合形式存在于细胞系中，从而避免发生重组的风险。如专利申请WO94/26914和WO95/02697所述，可用的细胞系例子是人胚胎肾细胞系293(Graham等人，1997，普通病毒学杂志(J.Gen.Virol.)36：59)，它包含整合在其基因组中的Ad5腺病毒左手部分基因组(12％)，和能弥补E1和E4功能的细胞系。使用本领域普通技术人员众所周知的标准分子生物学技术回收并纯化重组腺病毒。腺伴随病毒载体

腺伴随病毒(AAV)是相对较小的DNA病毒，它们能以稳定的定位方式整合到感染细胞的基因组中。它们能感染广谱的细胞而不影响细胞生长、形态、或分化，且它们看上去不涉及人的病理学。AAV基因组已被克隆、测序、并表征。它包含大约4700个碱基，且两末端含有约145个碱基的反向末端重复(ITR)区，作为病毒的复制起点。基因组的剩余部分分成两个具衣壳化功能的基本区：基因组的左手部分，含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因；基因组的右手部分，含编码病毒衣壳蛋白的cap基因。

已描述了来自AAV的载体用于在体外和在体内转移基因的应用(参阅WO91/18088；WO93/09239；US4,797,368、US5,139,941、EP488 528)。这些发表物描述了多种AAV衍生的构建物，其中rep和/或cap基因被删除并由目的基因取代，和这些构建物在体外(进入培养细胞)或在体内(直接进入生物体)用于转移所述目的基因的应用。通过将含目的核酸序列且该序列侧翼有两AAV反向末端重复(ITR)区的质粒与携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒共转染到感染了人辅助病毒(例如腺病毒)的细胞系中，可制备本发明复制缺陷型重组AAV。然后通过标准技术纯化产生的AAV重组体。

因此，本发明还涉及AAV衍生的重组病毒，其基因组包含编码Akt3且侧翼为AAV ITR的核酸序列。本发明还涉及包含编码Akt3且侧翼为两AAV ITR的核酸序列的质粒。这些质粒可用于转移核酸序列，在适当的情况中，可将质粒掺入脂质体载体(假病毒)。逆转录病毒载体

在另一个实施方案中，可将基因引入逆转录病毒载体中，例如参阅Anderson等人，美国专利5,399,346；Mann等人，1983，细胞(Cell)33：153；Temin等人，美国专利4,650,764；Temin等人，美国专利4,980,289；Markowitz等人，1988，病毒学杂志(J.Virol.)62：1120；Temin等人，美国专利5,124,263；EP453242，EP178220；Bernstein等人，1985，遗传工程学(Genet.Eng.)7：235；McCormick，1985，生物技术(BioTechnlogy)3：689；国际专利发表物WO95/07358，Dougherty等人于1995年3月16日发表；和Kuo等人，1993，血液学(Blood)82：845。逆转录病毒是感染分裂细胞的整合病毒。逆转录病毒基因组包含两个LTR、一个衣壳化序列、和三个编码区(gag、pol、和env)。在重组逆转录病毒载体中，gag、pol、和env基因通常全部或部分删除，并以异源目的核酸序列取代。可由不同类型的逆转录病毒构建这些载体，诸如HIV、MoMuLV(“鼠莫罗尼白血病病毒”)、MSV(“鼠莫罗尼肉瘤病毒”)、HaSV(“Harvey肉瘤病毒”)、SNV(”脾脏坏死病毒”)、RSV(“劳氏肉瘤病毒”)、和弗兰德病毒(Friendvirus)。WO95/02697公开了缺陷型逆转录病毒载体。

一般而言，为了构建含核酸序列的重组逆转录病毒，首先构建含LTR、衣壳化序列、和编码序列的质粒。将此构建物用于转染包装细胞系，该细胞系能反式提供质粒中缺陷的逆转录病毒功能。通常，包装细胞系由此能表达gag、pol、和env基因。这样的包装细胞系在现有技术中已有描述，特别是细胞系PA317(US4,861,719)；PsiCRIP细胞系(WO90/02806)、和GP+envAm-12细胞系(WO89/07150)。另外，重组逆转录病毒载体可在LTR中包含修饰以抑制转录活性，还可含其中可包含部分gag基因的衣壳化序列(Bender等人，1987，病毒学杂志(J.Virol.)61：1639)。通过本领域普通技术人员已知的标准方法，纯化重组逆转录病毒载体。

可构建逆转录病毒载体作为感染颗粒或用于单轮转染。在前一种情况中，修饰病毒以保留其中除负责致癌转化特性的基因之外的所有其它基因，并表达异源基因。制备非感染性病毒载体以破坏病毒包装信号，但保留包装共引入病毒所需的结构基因，所述病毒经改造包含异源基因和包装信号。因此，产生的病毒颗粒不能生产另外的病毒。

发表于1995年10月的国际专利发表物WO95/28494描述了靶向基因投递。非病毒载体

或者，通过脂转染可在体内引入载体。在过去十年中，越来越多将脂质体用于核酸的体外包装和转染。为解决脂质体介导转染中所遇困难和危险而设计的合成阳离子脂质，可用于制备脂质体，用于在体内转染编码标记物的基因(Felgner等人，1987，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)84：7413-7417；参阅Mackey等人，1988，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85：8027-8031；Ulmer等人，1993，科学(Science)259：1745-1748)。使用阳离子脂质可促进带负电荷核酸的包装，还促进它与带负电荷的细胞膜之间的融合(Felgner和Ringold，1989，科学(Science)337：387-388)。国际专利发表物WO95/18863和WO96/17823以及美国专利5,459,127描述了用于转移核酸的特别有用的脂质化合物和组合物。在体内应用脂转染将外源基因引入特异器官具有某些实际的好处。脂质体的分子靶向特异细胞是优势之一。已清楚在具细胞异质性的组织中定向转染特殊细胞类型是特别有利的，诸如胰、肝、肾、和脑。为了靶向目的，脂质可化学偶联其它分子(参阅Mackey等人，同上)。靶向肽(如激素或神经递质)和蛋白质(诸如抗体)或非肽分子都可化学偶联到脂质体上。

其它分子也可用于促进核酸的体内转染，诸如阳离子寡聚肽(如国际专利发表物WO95/21931)、由DNA结合蛋白衍生的肽(如国际专利发表物WO96/25508)、或阳离子聚合物(如国际专利发表物WO95/21931)。

还可以以裸露DNA质粒的形式将载体引入体内(参阅美国专利5,693,622、5,589,466、和5,580,859)。通过本领域已知方法，可将用于基因疗法的裸露DNA载体引入预期宿主细胞中，如转染、电穿孔、显微注射、转导、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、基因枪、或DNA载体转移器(参阅如Wu等人，1992，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)267：963-967；Wu和Wu，1988，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)263：14621-14624；Hartmut等，加拿大专利申请2,012,311，1990年3月15日提交；Williams等人，1991，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88：2726-2730)。也可使用受体介导的DNA投递方法(Curiel等人，1992，人类基因疗法(Hum.GeneTher.)3：147-154；Wu和Wu，1987，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)262：4429-4432)。优选的裸露DNA载体包括具有条件性复制起点的pCOS质粒(参阅WO97/10343)和缺乏复制起点和标记基因的小环质粒(参阅WO96/26270)。药物组合物和投递

本发明还涉及药物组合物。这些组合物可包含上文定义的Akt蛋白或多肽或者编码Akt蛋白或多肽的核酸，以及制药学可接受的载体或工具。本发明组合物特别适用于配制用于基因疗法的生物学物质。因此，在优选实施方案中，组合物包含编码人Akt蛋白或多肽的核酸。

组合物可包含Akt蛋白或编码Akt蛋白的核酸。组合物还可包含编码血管发生性因子的核酸。已知的血管发生性因子包括碱性和酸性成纤维细胞生长因子(bFGF和aFGF)、FGF-5(美国专利5,661,133)、内皮细胞生长因子(Pu等人，1993，循环(Circulation)88：208-2156)、促血管生成素、和VEGF(评论参阅Melillo等人，1997；和Lewis等人，1997)。已鉴定了VEGF的几种形式的编码核酸，包括VEGF₁₂₁(美国专利5,219,739)、VEGF₁₆₅(美国专利5,332,672)、VEGF₁₈₉(美国专利5,240,848)、VEGF₂₀₆、VEGF-2(WO95/24473和WO96/39515)、VEGF-B(美国专利5,607,918和5,840,693)、和VEGF-D(WO97/12972)。组合物还可包含过渡金属离子，诸如CoCl₂，其显示可增强VEGF基因的表达并刺激血管形成(美国专利5,480,975)。Akt蛋白或编码Akt蛋白的核酸还可与血管舒张剂联合施用。血管舒张剂的范例包括硝基血管舒张剂(如硝普盐、缓释硝酸甘油)、非特异血管舒张剂(如肼苯哒嗪、罂粟碱)、腺苷受体激动剂、钙通道阻断剂、α阻断剂(如哌唑嗪)、内源血管舒张剂肽或相关肽类似物(如物质P、CGRP)、K通道激活剂、ACE抑制剂或血管紧张肽受体阻断剂、内皮缩血管肽受体阻断剂或ECE抑制剂、和血管舒张剂前列腺素。

本发明的任何载体，不管是病毒或非病毒型的，都优选在制药学可接受的载体或工具中引入体内。术语“制药学可接受的”指分子实体和组合物在施用于人体时是生理上可忍受的，且通常不引起过敏或类似的不适反应，诸如胃部不适、头晕、等等。当用于本文时，术语“制药学可接受的”优选指联邦或州政府主管机构批准的，或列于美国药典或其它通常认可用于动物(特别是人)的药典中的。术语“载体”指稀释剂、佐剂、赋形剂、或与化合物一起施用的工具。这些制药学载体可以是无菌液体，诸如水或油，包括石油、动物、植物、或合成来源的油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、等等。优选采用水或盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液作为载体，对于可注射溶液尤其如此。《雷明顿药物科学》(Remington’s PharmacerticalSciences，E.W.Martin)描述了合适的制药学载体。

本发明药物组合物可配制用于局部、口服、非肠胃、鼻内、静脉内、肌肉内、皮下、眼内、等等施用。

药物组合物优选包含用于可注射配方的制药学可接受载体，具体而言，可以是无菌、等张盐水溶液(NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、NaCl、KCl、CaCl₂、MgCl₂、等等，或这些盐类的混和物)，或是干的(特别是冻干的)组合物，在适当情况中，加入无菌水或生理盐水后能够形成可注射溶液。

具体而言，组合物可以是等张、无菌盐水溶液(NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、NaCl、KCl、CaCl₂、MgCl₂、等等，或这些盐类的混和物)，或是干的(尤其是冻干的)组合物，根据情况，加入无菌水或生理盐水后能够形成可注射溶液。

优选的无菌可注射制剂可以是在无毒肠胃外可接受溶剂或稀释剂中配制而成的溶液或悬浮液。制药学可接受载体或工具的范例是盐水、缓冲盐水、等张盐水(如NaH₂PO₄、Na₂HPO₄、NaCl、KCl、CaCl₂、MgCl₂、等等，或这些盐类的混和物)、Ringer氏溶液、葡萄糖、水、无菌水、甘油、乙醇、及其联合。传统采用1，3-丁二醇和无菌不挥发油作为溶剂或悬浮介质。可采用任何温和的不挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸(诸如油酸)也在可注射制剂中应用。

根据不同参数，特别是根据施用模式、所述病理学、待表达的基因、或预期疗程，可调整用于施用的本发明核酸的剂量，不管是单独施用还是掺入载体。一般而言，在本发明重组病毒的情况中，以10⁴-10¹⁴pfu的剂量形式配制并施用，优选10⁶-10¹⁰pfu。术语“pfu”(噬斑形成单位)对应于病毒溶液的感染能力，通过感染合适的细胞培养物并测量(通常在48小时后)感染细胞形成的噬斑数目来测定pfu。文献中很好的记录了测定病毒溶液pfu滴度的技术。

本发明组合物可以非肠胃或穿粘膜途径引入，如口服、鼻吸、直肠、或穿皮给予。施用优选非肠胃途径，如静脉内注射，还包括，但不限于，小动脉内、肌肉内、皮内、皮下、腹膜内、心室内、和颅内施用。可通过直接注射到待治疗位点(特别是心脏)来引入组合物。

指向心脏的优选施用途径是直接注射到心脏内(美国专利5,693,622和5,661,133)。使用本领域可获得的技术可使心脏成像，诸如磁共振成像或计算机辅助断层照相，并通过立体定位注射至例如心肌缺血区域来施用治疗性组合物。

优选使用心脏特异启动子和/或特异趋向心脏细胞的载体将Akt的表达限制于心肌细胞。

还可通过导管的使用进行指向心脏的施用。美国专利5,851,521、5,652,225、5,328,470、5,698,531、5,707,969、5,830,879、和5,674,192描述了多种有孔气囊、双层气囊、和水凝胶导管。

在还有一个实施方案中，可在受控释放系统中投递包含Akt多肽或多肽编码核酸的组合物。例如，可使用静脉内输液、可植入渗透泵、穿皮贴剂、脂质体、或其它施用模式来施用核酸或多肽。在一个实施方案中，可使用泵(参阅Langer，同上；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14：201；Buchwald等人，1980，外科学(Surgery)88：507；Saudek等人，1989，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)321：574)。在另一个实施方案中，可使用聚合材料(参阅《受控释放的医学应用》(Medical Applications of Controlled Release)，Langer和Wise编，CRC出版社，伯克莱屯，佛罗里达，1974；《受控药物生物利用度，药物产品的设计和性能》(Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Desing and Performance)，Smolen和Ball编，Wiley出版社，纽约，1984；Ranger和Peppas，1983，高分子化学高分子科学评论杂志(J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.)23：61；还可参阅Levy等人，1985，科学(Science)228：190；During等人，神经学年鉴(Ann.Neurol.)25：351，1989；Howard等人，1989，神经外科学杂志(J.Neurosurg.)71：105)。在还有一个实施方案中，受控释放系统可置于治疗靶(即心脏)附近，由此只需要全身性剂量的一部分(参阅如Goodson，1984，《受控释放的医学应用》，同上，第2卷，第115-138页)。Langer(1990，科学(Science)249：1527-1533)的综述中讨论了其它受控释放系统。

因此，可通过静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、或皮下施用途径投递本发明组合物。或者，可通过鼻腔或口腔施用适当配制的组合物。通过以必需间隔(如每天、每12小时、等)提供治疗有效剂量(即足以在施用对象体内诱导代谢变化的剂量)，可确保持续供应生物学物质。这些参数将取决于待治疗疾病状况的严重程度、执行的其它行为(诸如更改食谱)、治疗对象的体重、年龄、和性别、以及本领域熟练技术人员参照标准的良好医学实践可容易测定的其它标准。

本发明还涉及通过抑制患有肿瘤患者体内Akt水平由此抑制VEGF生成从而抑制患者体内血管发生的方法。可以通过在反义核酸在胞内条件下与Akt mRNA发生杂交的条件下将Akt反义核酸引入患者细胞从而降低Akt水平。还可以通过以足以结合并灭活Akt的水平将特异结合Akt的胞内结合蛋白(诸如单链Fv抗体，scFv)引入患者细胞内从而降低Akt水平。在另一个实施方案中，可以通过施用编码显性失活形式Akt的核酸从而降低Akt活性。优选直接对肿瘤细胞施用反义核酸、胞内结合蛋白或其编码核酸、或者显性失活Akt突变体。

本发明反义序列与编码Akt蛋白的序列互补，并下调或阻断Akt蛋白的表达。优选实施方案包含反义多核苷酸分子。WO92/15680(将全部内容收入本文作为参考)公开了反义多核苷酸(编码反义RNA分子的DNA)的制备和应用，以及寡聚和遗传反义的应用。

本发明反义核酸优选能够与编码Akt蛋白的DNA序列的全部或部分或相应信使RNA特异杂交的RNA。本发明反义序列可衍生自DNA序列，它在细胞中的表达产生与人Akt mRNA的全部或一部分互补的RNA。可通过反向表达编码Akt蛋白的所有或部分序列来制备这些反义序列(EP140308)。任何长度的反义序列都适用于实践本发明，只要它能够下调或阻断Akt的表达即可。优选反义序列长度为至少20个核苷酸。

在这个优选实施方案的另一方面，核酸编码反义RAN分子。在这个实施方案中，核酸可操作连接能够表达核酸序列的信号，并利用(优选)重组载体构建物引入细胞中，一旦将载体导入细胞，该细胞将表达反义核酸。合适载体的范例包括质粒、腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、和疱疹病毒。

本发明的第二个实施方案是通过抑制Akt活性来特异抑制血管发生的方法，包括能够在转染细胞内表达与Akt选择性相互作用的胞内结合蛋白的编码核酸序列。WO94/29446和WO94/02610(将全部内容收入本文作为参考)公开了胞内结合蛋白编码基因的细胞转染。胞内结合蛋白包括能够在其表达的细胞内选择性结合Akt或与其相互作用，并中和所结合的Akt蛋白的功能的任何蛋白质。胞内结合蛋白优选抗体或抗体片段。

WO94/02610公开了抗体的制备和编码特殊抗体的核酸的鉴定。参照本领域熟练技术人员已知的技术，使用Akt蛋白或其片段，制备对该蛋白质特异的单克隆抗体。随后制备包含胞内结合蛋白或其片段的编码核酸且能够在宿主细胞中表达的载体以用于本发明的方法。用于向含Akt细胞投递胞内结合蛋白编码核酸的合适载体和方法包括上文所述的。编码Akt胞内结合蛋白的核酸序列还可包含用于将胞内结合蛋白靶向Akt细胞定位的定位信号编码序列和/或能够将胞内结合蛋白插入细胞质膜的序列的编码序列。可以将定位信号或插入序列置于胞内结合蛋白上的任何部位，只要它不干扰与Akt蛋白的结合即可。WO94/02610公开了定位信号的范例。

在另一个实施方案中，可通过施用编码显性失活形式Akt的核酸来降低Akt活性。Fujio等人(1990，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)274(23)：16349-16354)、Wang等人(1999，分子细胞生物学(Mol.Cell Biol.)19(6)：4008-4018)、Jiang等人(1999，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)96(5)：2077-2081)、和Gerber等人(1998，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)273(46)：30336-30343)描述了显性失活形式Akt的范例。

施用本发明范围内的生物学物质的生物体优选人，但可以是任何动物。因此，本领域普通技术人员可容易的领会，本发明的方法和药物组合物特别适合施用于任何动物，特别是哺乳动物，包括，但不限于，家畜(诸如猫或狗)、农畜(诸如，但不限于，牛、马、山羊、绵羊、和猪)、野生动物(或是在野地里或是在动物园里)、研究用动物(诸如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、狗、猫、等)、鸟类(诸如鸡、火鸡、鸣禽、等)即用于兽医学应用。

                         实施例

通过参照作为本发明示范而提供的下列非限制性实施例，可更好的理解本发明。常用分子生物学技术

本领域技术人员众所周知分子生物学的传统方法，诸如质粒DNA的制备性提取、质粒DNA的氯化铯梯度离心、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、DNA片段的电洗脱纯化、酚或酚/氯仿的蛋白质抽提、盐介质中DNA的乙醇或异丙醇沉淀、大肠杆菌的转化、等等，且文献中有详尽描述(Maniatis等人，《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1982；第2版，1989；F.M.Ausubel等人编，《分子生物学现行方案》(CurrentProtocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons公司，纽约，1987)。

传统的克隆载体包括pBR322和pUC类质粒，以及M13系列的噬菌体。这些都可购买获得(Bethesda Research Laboratories)。

为了进行连接，可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳根据大小分离DNA片段，用酚或酚/氯仿混和液抽提，用乙醇沉淀，然后在存在噬菌体T4 DNA连接酶(Biolabs)时参照供应商的推荐温育。

可用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段(Biolabs)参照供应商的说明书进行5’突出末端的补平。在存在噬菌体T4DNA聚合酶(Biolabs)时参照制造商的推荐进行3’突出末端的破坏。通过S1核酸酶的受控处理进行5’突出末端的破坏。

可参照Taylor等人(1985，核酸研究(Nucl.Acids Res.)13：8749-8764)开发的方法，使用Amersham销售的试剂盒，进行由合成寡脱氧核苷酸指导的体外诱变。

可使用“DNA热循环仪”(Perkin Elmer Cetus)，参照制造商的说明书，进行PCR(聚合酶催化的链式反应，R.K.Saiki等人，1985，科学(Science)230：1350-1354；K.B.Mullis和F.A.Faloona，1987，酶学方法(Meth.Enzym.)155：335-350)技术，即DNA片段的酶促扩增。

可参照Sanger等人(1977，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)74：5463-5467)开发的方法，使用Amersham销售的试剂盒，进行核苷酸序列的证实。

可使用Qiagen质粒纯化系统，参照制造商的指示，纯化质粒DNA。实施例1：人Akt3的克隆

此实施例描述了编码Akt3蛋白的核酸的克隆。实施例1.1：对cDNA文库筛选Akt3

数据库搜寻揭示，1个人cDNA克隆包含与人Akt1和Akt2同源但又不同的一段人cDNA序列。为了分离这种先前未知人Akt异构体(本文称为人Akt3)的全长编码序列，用对应于人Akt3的5’-UTR和N端编码区的cDNA探针筛选人心脏cDNA文库。

由Genome System购买了一个人cDNA克隆(ID#479072)。通过聚合酶链式反应(PCR)，使用如下引物对：AKT3-5’UTR-F3(5’TCC AAA CCC TAA AGC TGA TAT CAC 3’；SEQ ID NO：3)和AKT3-C-R1(5’CCT GGA TAG CTT CTG TCC ATT C 3’；SEQ ID NO：4).

由此cDNA扩增覆盖人Akt3部分5’-UTR(非翻译区)和部分5’-编码序列的片段。使用随机引物DNA标记试剂盒(Boerhinger Mannheim)，参照制造商的指示，用α-³²P-dCTP标记cDNA探针。使用Bio-Rad层析旋转柱，参照制造商的指示，纯化探针。

最初将超过1百万个噬菌体克隆用于cDNA噬菌体文库筛选(Clonetech，目录#HL5027t)。在添加20mg/ml四环素、0.2％麦芽糖、和10mM MgCl₂的LB中接种宿主细胞XL1-B，并于37℃温育过夜。如Maniatis(1989)所述，进行噬菌体感染和转膜。将滤膜变性，复性并烘烤，然后用杂交液于65℃预杂交4小时。向滤膜中加入变性形式(加热变性10分钟)的32P标记探针，并杂交过夜。杂交后，连续用2x SSC/0.1％ SDS、1x SSC/0.1％ SDS、和0.5x SSC/0.1％ SDS于65℃清洗滤膜。将滤膜空气干燥，并使Kodak X射线胶片曝光。此初次筛选后，选择阳性克隆用于二次和三次筛选。纯化获得的阳性噬菌体，并使用BM25.8-25宿主细胞，参照制造商(Boerhinger Mannheim)的指示，将噬菌体DNA转变成质粒DNA。

选择两个阳性克隆用于完整测序和进一步的表征。这两个克隆之一(9号克隆)包含人Akt3的部分5’-UTR和N端编码序列(第1-127位氨基酸)。另一个克隆(1号克隆)包含大部人Akt3序列(第15位氨基酸-C末端)和3’-UTR。通过融合这两种部分序列形成了全长cDNA序列。SEQ ID NO：1显示了编码人Akt3的完整序列。SEQ ID NO：2显示了对应的氨基酸序列。Akt3比Akt1和Akt2短，而且Akt3与Akt1或Akt2在C端序列上没有显著同源性。特别是，人Akt3 C端部分的最后14个氨基酸与人Akt1和Akt2中存在的不同。实施例2：Akt3表达质粒的构建

此实施例描述了含激活Akt3的表达质粒的构建。融合最初两种部分cDNA克隆(上文所述1号和9号克隆)以获得全长AKT3编码序列。将含人Src肉豆蔻酸化序列的DNA融合在全长Akt3序列的N末端。将HA标签序列融合在全长Akt3序列的C末端(用于检测表达)。将此嵌合MyrAkt3HA的序列置于CMV启动子的控制之下。完整构建物称为CMV6-MyrAkt3HA(图1A)。实施例2.1：CMV6-MyrAktHA

此实施例描述了能够表达Akt3和组成性有活性形式的人Akt3的质粒的构建。通过1号克隆的PCR扩增，使用如下引物对：hAKT3c19-PCR5(F)：(5’-ATG AGC GAT GTT ACC ATT GTG AAA GAA GGT TGG GTT CAG AAGAGG GGA GAA TAT ATA AAA AAC TGG AGG CCA AG-3’；SEQ ID NO：5)，该引物包含Akt3最初24个氨基酸的编码序列；和hAKT3 c11-PCR3：(5’-TTA TTT TTT CCA GGT ACC CAG CAT GCC-3’；SEQ ID NO：6).获得全长Akt3编码序列。

为了生成组成性有活性形式的Akt3，使用如下引物对：MyrAKT3Ha-F1(5’GCG CGC GAA TTC CCACC A  TGG GTA GCA ACA AGA GCA AGC CCA AGG ATG CCA GCC AGC GGC GCC GCAGCA GCG ATG TTA CCA TTG TGA AAG-3’；SEQ ID NO：7)，该引物包含Kozak序列(CCACC)、来自人src的肉豆蔻酸化序列(下划线)、和人Akt3的最初8个氨基酸(粗体)；和MyrAKT3Ha-R(5’-GCG CGC GGG CCC TTA GGC GTAGTC GGG GAC GTC GTA CGG GTA TTT TTT CCA GTT ACC CAG CAT GCC-3’；SEQ IDNO：8)，该引物包含HA标签的编码序列(粗体)，通过PCR扩增全长Akt3的编码序列。用EcoRI/ApaI消化PCR产物，并亚克隆到pCDNA3.1的EcoRI/ApaI位点中，产生pCDNA3-Myr-Akt-HA。通过PCR扩增MyrAktHA的编码序列，并亚克隆到载体CMV6的KpnI/EcoRI位点中。用于PCR反应的引物对是：CMV6-AKT3cat-F(5’-CGG GGT ACC ACC ATG GGT AGC AAC AAG AGC AAG CCC AAGGAT GCC AGC CAG-3’；SEQ ID NO：9)，和CMV6-AKT3cat-R(5’-CCG GAA TTC TTA GGC GTA GTC GGG GAC GTC-3’；SEQ IDNO：10).通过测序证实质粒。实施例2.2：人AKT3的表达

此实施例描述了人AKT3在组织培养物中的表达。在添加10％胎牛血清(FBS)的DME培养基中于37℃、5％ CO₂的恒温箱中培养HEK293细胞和COS-7细胞。

将质粒CMV6-[MyrAkt3HA]瞬时转染到HEK293细胞中。作为对照，用CMV6载体转染HEK293细胞。在这两种转染前1天，将细胞分成0.2×10⁶细胞/cm²的密度。使用脂转染胺试剂(LipofectAmine，Gibco BRL)，参照制造商的指示，进行转染。简而言之，在不含血清和抗生素的DME培养基中混和DNA。加入脂转染胺试剂(DNA∶脂转染胺试剂＝1mg∶4ml)。简单混和后，将DNA/脂转染胺试剂混和物于室温保持30分钟。用1xPBS清洗细胞，并暴露于DNA/脂转染胺试剂混和物3小时。转染后，用1xPBS清洗细胞2次，并换成DMEM-10％ FBS培养基。

转染后24小时，裂解细胞。用抗HA抗体免疫沉淀裂解物，并使用衍生自Akt1下游靶GSK-3的肽测定免疫沉淀物的激酶活性(Cross等人，1995)。转染后24小时，参照Cross等人(1995)的方法，进行Akt的体外激酶测定法。用1xPBS清洗细胞2次，并在裂解缓冲液(50mMTris/HCl(pH7.4)、1mM EDTA、1mM EGTA、0.5mM Na₃VO₄、0.1％ β-巯基乙醇、1％屈立通X-100、50mM NaF、5mM焦磷酸钠、10mM磷酸甘油钠、0.5mM PMSF、2μg/ml抑酶肽、2mg/ml亮抑酶肽、和1mM微囊藻素)中裂解。于4℃离心15分钟，除去不溶物。将细胞裂解物与多克隆抗HA抗体(BABCO)一起于4℃在旋转摇床上保温1小时。向裂解物中加入蛋白A-琼脂糖珠1小时。免疫沉淀后，将沉淀物用清洗液A(添加0.5M NaCl的裂解缓冲液)清洗3次，用清洗液B(50mM Tris/HCl(pH7.4)、0.03％ Brij35、0.1mM EGTA、和0.1％ β-巯基乙醇)清洗3次，再用激酶缓冲液(20mM MOPS(pH7.2)、25mM β-磷酸甘油钠(pH7.0)、1mM Na₃VO₄、1mM DTT)清洗3次。清洗后，将沉淀物重悬于40μl激酶反应混和物(100mM ATP、0.1mg/ml Crosstide底物肽(UBI)、20mM MgCl₂、10mM蛋白激酶A抑制剂/PKI(UBI)、和10mCig-32P-ATP)。于30℃反应30分钟。反应完全后，将混和物简单离心，并将30μl上清液上样至p81硝酸纤维素纸环(Gibco BRL)上。将硝酸纤维素纸用180mM磷酸清洗10分钟3次，再用丙酮清洗2分钟2次。使用闪烁计数仪监测纸的放射性。CMV6[MyrAkt3HA]转染样品的激酶活性比对照载体CMV6转染细胞高20倍，而后者与该测定法的背景水平相似(图1B)。

为了测试转染细胞中的MyrAkt3HA表达，将由转染细胞制备的裂解物进行抗HA抗体免疫印渍。如上所述，制备细胞裂解物，并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳。将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，然后用封闭液(1xPBS、0.2％吐温20、5％脱脂奶粉)于4℃处理过夜。将滤膜与小鼠单克隆抗HA抗体(在封闭液中1∶500稀释)一起于室温保温3小时。用封闭液清洗15分钟3次后，将滤膜与缀合HRP的兔抗小鼠IgG抗体(在封闭液中1∶1000稀释)一起于室温保温1小时。用封闭液清洗10分钟3次，并用1xPBS/0.2％吐温20清洗3次后，将滤膜在ECL(PIERCE)中参照制造商的指示显影，并使Kodak X射线胶片曝光。如图1C所示，在CMV6-[MyrAkt3HA]转染样品中存在大约60kDa的亮带(与MyrAkt1HA大小相似，资料未显示)，而在CMV6转染样品(阴性对照)中没有。综合起来看，这些资料证明CMV6-[MyrAkt3HA]的转染导致功能性Akt活性。实施例3：对VEGF表达的刺激

实施例3.1：细胞培养

在添加10％胎牛血清(FBS)的DME培养基中于37℃、5％ CO₂的恒温箱中培养HeLa细胞(ATCC)。人骨骼肌细胞(HSKMC)和人冠脉平滑肌细胞(HCSMC)购自Clonetics公司。

使用肌细胞分离系统(Worthington Biochemical公司)分离新生大鼠心肌细胞。简而言之，将由1-3日龄大鼠收集的心脏绞碎，用胰蛋白酶(终浓度50μg/ml)于4℃消化过夜，随后用胶原酶于37℃消化45分钟。研磨后，将混和物滤过细胞滤器。简单离心后，将细胞以0.3×10⁶细胞/ml的密度重悬于涂板培养基(DMEM∶M199＝4∶1，10％热灭活的马血清、5％胎牛血清、1x胰岛素-运铁蛋白-硒添加物(GibcoBRL)、和1x庆大霉素、100μg/ml BrdU)。24小时后，将细胞换成低有丝分裂原培养基(DMEM∶M199＝4∶1，1x庆大霉素)。

实施例3.2：转染

在转染前1天，将细胞分成0.2×10⁶细胞/cm²的密度。使用脂转染胺试剂参照制造商的指示进行转染。简而言之，在不含血清和抗生素的DME培养基中混和指定DNA，并加入脂转染胺试剂(DNA∶脂转染胺试剂＝1μg∶4μl)。简单旋涡震荡后，将DNA/脂转染胺试剂混和物于室温保持30分钟。用1xPBS清洗细胞，并暴露于DNA/脂转染胺试剂混和物3小时。转染后，用1xPBS清洗细胞2次，并换成DMEM-10％ FBS培养基。实施例3.3：重组腺病毒的构建

如Crouzet等人(1997，美国国家科学院进展(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)94：1414-1419)所述，构建包含组成性有活性的人Akt3(hAkt3cak)的重组腺病毒。将包含组成性有活性的人Akt3(N端包含来自c-src的肉豆蔻酸化序列)的cDNA亚克隆到pXL2996中，该质粒称为pXL2996-hAkt3cak。将来自pXL2996-hAkt3cak的hAkt3cak表达盒亚克隆到穿梭载体pXL3474中。通过电穿孔将hAkt3cak的这种穿梭质粒和腺病毒bgal的质粒DNA(pXL3215)引入细菌JM83细胞中。双重同源重组后，CsCl法纯化腺病毒-hAkt3cak的质粒DNA。将此DNA通过限制酶PacI消化线性化，并使用脂转染胺试剂转染到293细胞中。转染后3周，收集包含hAkt3cak的重组腺病毒(AV-hAKT3cak)，并在293细胞中扩增。使用细胞质毒性测定法(CPA)测定表达滴度。

使用标准方法学(上文所述)和Kenneth Walsh博士(Boston，MA)提供的方法制备包含组成性有活性的小鼠akt1的重组腺病毒(AV-mAkt1cak)。

在感染病毒前，在组织培养基中将病毒稀释至3×10⁷/m1。向6孔组织培养板的每个孔中加入1ml含病毒培养基，而向每个100mm培养皿中加入8ml含病毒培养基。感染过夜后，用1xPBS洗去培养基中的过量病毒，并将细胞换成标准培养基。实施例3.4：ELISA测定法

使用VEGF₁₆₅ ELISA检测试剂盒(R％D System公司，目录号DVE00)进行人VEGF ELISA测定法。收集培养基并通过简单离心澄清。加入测定稀释剂RD1W后，将样品加到每个适当孔中。然后将平板于室温保温2小时。用清洗缓冲液清洗每个孔3次。随后，用提供的缀合抗VEGF抗体处理每个孔于室温2小时。重复上述清洗步骤。加入底物并于室温保温20分钟。使用设定为450nm的微量读数仪测定光密度，而波长校正设为540nm。实施例3.5：RNA分离和Northern杂交

使用Ultraspec RNA分离试剂(Biotecx)分离总RNA。简而言之，向100mm组织培养板中的细胞加入1ml Ultraspec溶液。由平板上刮下细胞，并转移至不含RNA酶的离心管中。加入200μl氯仿后，将混和物漩涡震荡并于4℃离心。收集水溶液(上层)并用等体积的异丙醇沉淀RNA。用70％乙醇清洗并干燥后，将RNA溶于经DEPC处理的水中。在1％琼脂糖凝胶上分离20μg总RNA。电泳并转膜后，将印渍进行UV交联。

用使用随机引物DNA标记试剂盒(Boehringer Mannheim)产生的32P标记DNA探针进行杂交。于65℃杂交后，相继用2xSSC-0.1％ SDS和0.1xSSC-0.1％ SDS清洗印渍，并使Kodak X射线胶片曝光过夜。实施例3.6：Akt增加转染细胞的VEGF表达

用激活的小鼠Akt1(CMV6-mAkt1cak)、激活的人Akt3(CMV6-HAkt3)的表达质粒、或CMV6载体(作为对照)转染HeLa细胞。转染后，给细胞换成低有丝分裂原培养基(添加0.5％胎牛血清的DMEM)。16小时后，收集转染细胞的培养基并进行人VEGF165的ELISA。如图2所示，Akt1或Akt3转染细胞培养基中的VEGF水平显著高于载体CMV6转染细胞培养基(作为对照)。这些资料证明，组成性有活性的Akt1或Akt3在HeLa细胞中诱导VEGF165表达。实施例3.7：AV-mAkt1cak和AV-hAkt3cak在人骨骼肌细胞和人平滑肌细胞中诱导VEGF表达

用表达有活性小鼠Akt1(AV-mAkt1cak)或组成性有活性人Akt3(AV-hAKT3cak)的重组腺病毒感染人骨骼肌细胞(HSKMC)和人冠脉平滑肌细胞(HCASMC)。作为对照，用驱动绿色荧光蛋白表达的AV-GFP感染细胞。感染后1天，收集培养基并通过ELISA测量培养基中的VEGF水平。如图3A所示，AV-mAKT1cak和AV-hAKT3cak都在HSKMC中显著增加VEGF165表达，而AV-GFP感染具有少许影响或无影响。此外，如图3B所示，AV-mAkt1(cak)和AV-hAkt3cak在人冠状动脉平滑肌细胞(HCASMC)中诱导VEGF165。

为了评价Akt对VEGF信使RNA的影响，用表达mAkt1cak、hAkt3cak、或GFP的腺病毒感染HCASMC。作为阳性对照，将细胞换成缺氧条件24小时。分离总RNA并进行VEGF的Northern印渍分析。如图3C所示，缺氧处理显著诱导VEGF表达。另外，AV-mAkt1cak和AV-hAkt3cak而非AV-GFP显著增加VEGF的mRNA水平。这些资料指出，Akt通过增加mRNA水平而增加VEGF表达。实施例3.8：AV-mAkt1cak和AV-hAkt3cak在心肌细胞中诱导VEGF表达

用编码mAkt1cak(AV-mAkt1cak)、小鼠野生型Akt1(AV-mAkt1wt)、hAkt3cak(AV-mAkt3cak)的腺病毒、或AV-GFP(作为对照)感染新生大鼠心肌细胞。作为阳性对照，在缺氧条件下培养未感染细胞24小时。感染后1天，由这些细胞分离RNA并通过Norhtern印渍分析检测VEGF表达。如图3所示，AV-mAkt1cak或AV-hAkt3cak在心肌细胞中显著增加VEGF表达，而AV-GFP或AV-mAkt1wt对VEGF165表达具有少许影响或无影响。

本发明不限于本文所述具体实施方案的范围。事实上，本领域技术人员根据上述描述和附图将领会除本文所述外对本发明的多种更改。这些更改意欲属于所附权利要求的范围之内。

还应理解，为核酸或多肽给出的所有碱基大小或氨基酸大小和所有分子量都是大约的，且提供用于描述。

本文引用了很多出版物，其公开内容均全文引入本文作为参考。

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  Met Ser Asp Val Thr Ile Val Lys Glu Gly Trp Val Gln Lys Arg

    1               5                  10                  15gga gaa tat ata aaa aac tgg agg cca aga tac ttc ctt ttg aag aca   218Gly Glu Tyr Ile Lys Asn Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Thr

             20                  25                  30gat ggc tca ttc ata gga tat aaa gag aaa cct caa gat gtg gat tta   266Asp Gly Ser Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Lys Pro Gln Asp Val Asp Leu

         35                  40                  45cct tat ccc ctc aac aac ttt tca gtg gca aaa tgc cag tta atg aaa   314Pro Tyr Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Lys Cys Gln Leu Met Lys

     50                  55                  60aca gaa cga cca aag cca aac aca ttt ata atc aga tgt ctc cag tgg   362Thr Glu Arg Pro Lys Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp

 65                  70                  75act act gtt ata gag aga aca ttt cat gta gat act cca gag gaa agg   410Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Asp Thr Pro Glu Glu Arg80                  85                 90                   95gaa gaa tgg aca gaa gct atc cag gct gta gca gac aga ctg cag agg   458Glu Glu Trp Thr Glu Ala Ile Gln Ala Val Ala Asp Arg Leu Gln Arg

            100                 105                 110caa gaa gag gag aga atg aat tgt agt cca act tca caa att gat aat   506Gln Glu Glu Glu Arg Met Asn Cys Ser Pro Thr Ser Gln Ile Asp Asn

        115                 120                 125ata gga gag gaa gag atg gat gcc tct aca acc cat cat aaa aga aag   554Ile Gly Glu Glu Glu Met Asp Ala Ser Thr Thr His His Lys Arg Lys

    130                 135                 140aca atg aat gat ttt gac tat ttg aaa cta cta ggt aaa ggc act ttt   602Thr Met Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe

145                 150                 155ggg aaa gtt att ttg gtt cga gag aag gca agt gga aaa tac tat gct   650Gly Lys Val Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Ser Gly Lys Tyr Tyr Ala160                 165                 170                 175atg aag att ctg aag aaa gaa gtc att att gca aag gat gaa gtg gca   698Met Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp Glu Val Ala

            180                 185                 190cac act cta act gaa agc aga gta tta aag aac act aga cat ccc ttt   746His Thr Leu Thr Glu Ser Arg Val Leu Lys Asn Thr Arg His Pro Phe

        195                 200                 205tta aca tcc ttg aaa tat tcc ttc cag aca aaa gac cgt ttg tgt ttt   794Leu Thr Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr Lys Asp Arg Leu Cys Phe

    210                 215                 220gtg atg gaa tat gtt aat ggg ggc gag ctg ttt ttc cat ttg tcg aga   842Val Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser Arg

225                 230                 235gag cgg gtg ttc tct gag gac cgc aca cgt ttc tat ggt gca gaa att   890Glu Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Thr Arg Phe Tyr Gly Ala Glu Ile240                 245                250                  255gtc tct gcc ttg gac tat cta cat tcc gga aag att gtg tac cgt gat    938Val Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Gly Lys Ile Val Tyr Arg Asp

            260                 265                 270ctc aag ttg gag aat cta atg ctg gac aaa gat ggc cac ata aaa att    986Leu Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile Lys Ile

        275                 280                 285aca gat ttt gga ctt tgc aaa gaa ggg atc aca gat gca gcc acc atg   1034Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Thr Asp Ala Ala Thr Met

    290                 295                 300aag aca ttc tgt ggc act cca gaa tat ctg gca cca gag gtg tta gaa   1082Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val Leu Glu

305                 310                 315gat aat gac tat ggc cga gca gta gac tgg tgg ggc cta ggg gtt gtc   1130Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly Val Val320                 325                 330                 335atg tat gaa atg atg tgt ggg agg tta cct ttc tac aac cag gac cat   1178Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln Asp His

            340                 345                 350gag aaa ctt ttt gaa tta ata tta atg gaa gac att aaa ttt cct cga   1226Glu Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Asp Ile Lys Phe Pro Arg

        355                 360                 365aca ctc tct tca gat gca aaa tca ttg ctt tca ggg ctc ttg ata aag   1274Thr Leu Ser Ser Asp Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu Ile Lys

    370                 375                 380gat cca aat aaa cgc ctt ggt gga gga cca gat gat gca aaa gaa att   1322Asp Pro Asn Lys Arg Leu Gly Gly Gly Pro Asp Asp Ala Lys Glu Ile

385                 390                 395atg aga cac agt ttc ttc tct gga gta aac tgg caa gat gta tat gat   1370Met Arg His Ser Phe Phe Ser Gly Val Asn Trp Gln Asp Val Tyr Asp400                 405                 410                 415aaa aag ctt gta cct cct ttt aaa cct caa gta aca tct gag aca gat   1418Lys Lys Leu Val Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp

            420                 425                 430act aga tat ttt gat gaa gaa ttt aca gct cag act att aca ata aca   1466Thr Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Thr Ile Thr Ile Thr

        435                 440                 445cca cct gaa aaa tgt cag caa tca gat tgt ggc atg ctg ggt aac tgg    1514Pro Pro Glu Lys Cys Gln Gln Ser Asp Cys Gly Met Leu Gly Asn Trp

    450                 455                460aaa aaa taa taaaaagtaa gtttcaatag ctaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa    1570Lys Lys

465<210>2<211>465<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<400>2Met Ser Asp Val Thr Ile Val Lys Glu Gly Trp Val Gln Lys Arg Gly1               5                  10                  15Glu Tyr Ile Lys Asn Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Thr Asp

        20                   25                  30Gly Ser Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Lys Pro Gln Asp Val Asp Leu Pro

     35                  40                  45Tyr Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Lys Cys Gln Leu Met Lys Thr

 50                  55                  60Glu Arg Pro Lys Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp Thr65                  70                  75                  80Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Asp Thr Pro Glu Glu Arg Glu

             85                  90                  95Glu Trp Thr Glu Ala Ile Gln Ala Val Ala Asp Arg Leu Gln Arg Gln

        100                 105                 110Glu Glu Glu Arg Met Asn Cys Ser Pro Thr Ser Gln Ile Asp Asn Ile

    115                 120                 125Gly Glu Glu Glu Met Asp Ala Ser Thr Thr His His Lys Arg Lys Thr

130                 135                 140Met Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Gly145                 150                 155                 160Lys Val Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Ser Gly Lys Tyr Tyr Ala Met

            165                 170                 175Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp Glu Val Ala His

        180                 185                 190Thr Leu Thr Glu Ser Arg Val Leu Lys Asn Thr Arg His Pro Phe Leu

    195                 200                 205Thr Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr Lys Asp Arg Leu Cys Phe Val

210                 215                 220Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser Arg Glu225                 230                 235                 240Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Thr Arg Phe Tyr Gly Ala Glu Ile Val

            245                 250                 255Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Gly Lys Ile Val Tyr Arg Asp Leu

        260                 265                 270Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile Lys Ile Thr

    275                 280                 285Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Thr Asp Ala Ala Thr Met Lys

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            325                 330                 335Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln Asp His Glu

        340                 345                 350Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Asp Ile Lys Phe Pro Arg Thr

    355                 360                 365Leu Ser Ser Asp Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu Ile Lys Asp

370                 375                 380Pro Asn Lys Arg Leu Gly Gly Gly Pro Asp Asp Ala Lys Glu Ile Met385                 390                 395                 400Arg His Ser Phe Phe Ser Gly Val Asn Trp Gln Asp Val Tyr Asp Lys

            405                 410                 415Lys Leu Val Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp Thr

        420                 425                 430Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Thr Ile Thr Ile Thr Pro

    435                 440                 445Pro Glu Lys Cys Gln Gln Ser Asp Cys Gly Met Leu Gly Asn Trp Lys

450                 455                 460Lys465<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸引物<400>3tccaaaccct aaagctgata tcac                                       24<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸引物<400>4cctggatagc ttctgtccat tc                                           22<210>5<211>74<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸引物<400>5atgagcgatg ttaccattgt gaaagaaggt tgggttcaga agaggggaga atatataaaa  60aactggaggc caag                                                    74<210>6<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸引物<400>6ttattttttc caggtaccca gcatgcc                                      27<210>7<211>90<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸引物<400>7gcgcgcgaat tcccaccatg ggtagcaaca agagcaagcc caaggatgcc agccagcggc 60gccgcagcag cgatgttacc attgtgaaag                                  90<210>8<211>66<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸引物<400>8gcgcgcgggc ccttaggcgt agtcggggac gtcgtacggg tattttttcc agttacccag 60catgcc                                                            66<210>9<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸引物<400>9cggggtacca ccatgggtag caacaagagc aagcccaagg atgccagcca g          51<210>10<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成寡核苷酸引物<400>10ccggaattct taggcgtagt cggggacgtc                                  30<210>11<211>480<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<400>11Met Asn Glu Val Ser Val Ile LVs Glu Gly Trp Leu His Lys Arg Gly  1               5                  10                  15Glu Tyr Ile Lys Thr Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Ser Asp

         20                  25                  30Gly Ser Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Arg Pro Glu Ala Pro Asp Gln Thr

    35                   40                  45Leu Pro Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Glu Cys Gln Leu Met Lys

 50                  55                  60Thr Glu Arg Pro Arg Pro Asn Thr Phe Val Ile Arg Cys Leu Gln Trp65                  70                  75                  80Thr Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Asp Ser Pro Asp Glu Arg

             85                  90                  95Glu Glu Trp Met Arg Ala Ile Gln Met Val Ala Asn Ser Leu Lys Gln

        100                 105                 110Arg Ala Pro Gly Glu Asp Pro Met Asp Tyr Lys Cys Gly Ser Pro Ser

    115                 120                 125Asp Ser Ser Thr Thr Glu Glu Met Glu Val Ala Val Ser Lys Ala Arg

130                 135                 140Ala Lys Val Thr Met Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys145                 150                 155                 160Gly Thr Phe Gly Lys Val Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Thr Gly Arg

            165                 170                 175Tyr Tyr Ala Met Lys Ile Leu Arg Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp

        180                 185                190Glu Val Ala His Thr Val Thr Glu Ser Arg Val Leu Gln Asn Thr Arg

    195                 200                 205His Pro Phe Leu Thr Ala Leu Lys Tyr Ala Phe Gln Thr His Asp Arg

210                 215                 220Leu Cys Phe Val Met Glu Tyr Ala Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His225                 230                 235                 240Leu Ser Arg Glu Arg Val Phe Thr Glu Glu Arg Ala Arg Phe Tyr Gly

            245                 250                 255Ala Glu Ile Val Ser Ala Leu Glu Tyr Leu His Ser Arg Asp Val Val

        260                 265                 270Tyr Arg Asp Ile Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His

    275                 280                 285Ile Lys Ile Thr Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Ser Asp Gly

290                 295                 300Ala Thr Met Lys Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu305                 310                 315                 320Val Leu Glu Asp Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu

            325                 330                 335Gly Val Val Met Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn

        340                 345                 350Gln Asp His Glu Arg Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Glu Ile Arg

    355                 360                 365Phe Pro Arg Thr Leu Ser Pro Glu A la Lys Ser Leu Leu Ala Gly Leu

370                 375                  380Leu Lys Lys Asp Pro Lys Gln Arg Leu Gly Gly Gly Pro Ser Asp Ala385                 390                 395                 400Lys Glu Val Met Glu His Arg Phe Phe Leu Ser Ile Asn Trp Gln Asp

            405                 410                 415Val Val Gln Lys Lys Leu Leu Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser

        420                 425                 430Glu Val Asp Thr Arg Tyr Phe Asp Asp Glu Phe Thr Ala Gln Ser Ile

    435                 440                 445Thr Ile Thr Pro Pro Asp Arg Tyr Asp Ser Leu Gly Leu Leu Glu Leu

450                 455                 460Asp Gln Arg Thr His Phe Pro Gln Phe Ser Tyr Ser Ala Ser Ile Arg465                 470                 475                 480<210>12<211>465<212>PRT<213>人类(Homo sapiens)<400>12Met Ser Asp Val Thr Ile Val Lys Glu Gly Trp Val Gln Lys Arg Gly1               5                  10                  15Glu Tyr Ile Lys Asn Trp Arg Pro Arg Tyr Phe Leu Leu Lys Thr Asp

        20                   25                  30Gly Ser Phe Ile Gly Tyr Lys Glu Lys Pro Gln Asp Val Asp Leu Pro

    35                  40                   45Tyr Pro Leu Asn Asn Phe Ser Val Ala Lys Cys Gln Leu Met Lys Thr

 50                  55                  60Glu Arg Pro Lys Pro Asn Thr Phe Ile Ile Arg Cys Leu Gln Trp Thr65                  70                  75                  80Thr Val Ile Glu Arg Thr Phe His Val Asp Thr Pro Glu Glu Arg Glu

             85                  90                  95Glu Trp Thr Glu Ala Ile Gln Ala Val Ala Asp Arg Leu Gln Arg Gln

        100                 105                 110Glu Glu Glu Arg Met Asn Cys Ser Pro Thr Ser Gln Ile Asp Asn Ile

    115                 120                 125Gly Glu Glu Glu Met Asp Ala Ser Thr Thr His His Lys Arg Lys Thr

130                 135                 140Met Asn Asp Phe Asp Tyr Leu Lys Leu Leu Gly Lys Gly Thr Phe Gly145                 150                 155                 160Lys Val Ile Leu Val Arg Glu Lys Ala Ser Gly Lys Tyr Tyr Ala Met

            165                 170                 175Lys Ile Leu Lys Lys Glu Val Ile Ile Ala Lys Asp Glu Val Ala His

        180                 185                 190Thr Leu Thr Glu Ser Arg Val Leu Lys Asn Thr Arg His Pro Phe Leu

    195                 200                 205Thr Ser Leu Lys Tyr Ser Phe Gln Thr Lys Asp Arg Leu Cys Phe Val

210                 215                 220Met Glu Tyr Val Asn Gly Gly Glu Leu Phe Phe His Leu Ser Arg Glu225                 230                 235                 240Arg Val Phe Ser Glu Asp Arg Thr Arg Phe Tyr Gly Ala Glu Ile Val

            245                 250                 255Ser Ala Leu Asp Tyr Leu His Ser Gly Lys Ile Val Tyr Arg Asp Leu

        260                 265                 270Lys Leu Glu Asn Leu Met Leu Asp Lys Asp Gly His Ile Lys Ile Thr

    275                 280                 285Asp Phe Gly Leu Cys Lys Glu Gly Ile Thr Asp Ala Ala Thr Met Lys

290                 295                 300Thr Phe Cys Gly Thr Pro Glu Tyr Leu Ala Pro Glu Val Leu Glu Asp305                 310                 315                 320Asn Asp Tyr Gly Arg Ala Val Asp Trp Trp Gly Leu Gly Val Val Met

            325                 330                 335Tyr Glu Met Met Cys Gly Arg Leu Pro Phe Tyr Asn Gln Asp His Glu

        340                 345                 350Lys Leu Phe Glu Leu Ile Leu Met Glu Asp Ile Lys Phe Pro Arg Thr

    355                 360                 365Leu Ser Ser Asp Ala Lys Ser Leu Leu Ser Gly Leu Leu Ile Lys Asp

370                 375                 380Pro Asn Lys Arg Leu Gly Gly Gly Pro Asp Asp Ala Lys Glu Ile Met385                 390                 395                 400Arg His Ser Phe Phe Ser Gly Val Asn Trp Gln Asp Val Tyr Asp Lys

            405                 410                 415Lys Leu Val Pro Pro Phe Lys Pro Gln Val Thr Ser Glu Thr Asp Thr

        420                 425                 430Arg Tyr Phe Asp Glu Glu Phe Thr Ala Gln Thr Ile Thr Ile Thr Pro

    435                 440                 445Pro Glu Lys Cys Gln Gln Ser Asp Cys Gly Met Leu Gly Asn Trp Lys

450                 455                 460Lys465

Claims (42)

1.诱导细胞内VEGF表达的方法，该方法包括对细胞施用Akt蛋白。

2.权利要求1的方法，其中Akt蛋白选自Akt1、Akt2、和Akt3。

3.权利要求2的方法，其中Akt蛋白是Akt3。

4.权利要求1的方法，其中VEGF选自VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉、VEGF₂₀₆、VEGF-2、VEGF-B、和VEGF-D。

5.权利要求1的方法，其中所述施用包括将编码Akt蛋白且可操作连接表达控制序列的核酸引入细胞。

6.权利要求5的方法，其中所述核酸是质粒或病毒载体的一部分。

7.权利要求6的方法，其中所述核酸是质粒的一部分。

8.权利要求6的方法，其中所述病毒载体选自逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、和痘苗病毒。

9.权利要求5的方法，其中Akt在细胞内组成性表达。

10.权利要求1的方法，还包括施用过渡金属离子和/或血管舒张剂。

11.权利要求5的方法，还包括施用编码第二种血管发生性因子且可操作连接表达控制序列的核酸。

12.权利要求11的方法，其中第二种血管发生性因子选自VEGF、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、内皮细胞生长因子、和促血管生成素。

13.权利要求12的方法，其中VEGF选自VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉、VEGF₂₀₆、VEGF-2、VEGF-B、和VEGF-D。

14.权利要求12的方法，其中第二种血管发生性因子是内皮细胞生长因子。

15.权利要求2的方法，其中对细胞施用至少两种形式的Akt蛋白。

16.权利要求1的方法，其中细胞位于患有局部缺血状况患者的体内。

17.权利要求16的方法，其中局部缺血状况是脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、四肢缺血、心肌缺血、或者缺血性、特发性、或肥大性心肌病。

18.诱导患有局部缺血状况患者的细胞内VEGF表达的方法，该方法包括对患者施用Akt蛋白。

19.权利要求18的方法，其中Akt蛋白选自Akt1、Akt2、和Akt3。

20.权利要求19的方法，其中Akt蛋白是Akt3。

21.权利要求18的方法，其中VEGF选自VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉、VEGF₂₀₆、VEGF-2、VEGF-B、和VEGF-D。

22.权利要求18的方法，其中对患者施用编码Akt蛋白且可操作连接表达控制序列的核酸。

23.权利要求22的方法，其中所述核酸是质粒或病毒载体的一部分。

24.权利要求23的方法，其中所述核酸是质粒的一部分。

25.权利要求23的方法，其中所述病毒载体选自逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、和痘苗病毒。

26.权利要求22的方法，其中Akt在细胞内组成性表达。

27.权利要求18的方法，还包括对患者施用过渡金属离子和/或血管舒张剂。

28.权利要求18的方法，其中局部缺血状况是脑血管缺血、肾缺血、肺缺血、四肢缺血、心肌缺血、或者缺血性、特发性、或肥大性心肌病。

29.权利要求22的方法，还包括施用编码第二种血管发生性因子且可操作连接表达控制序列的核酸。

30.权利要求29的方法，其中第二种血管发生性因子选自VEGF、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、内皮细胞生长因子、和促血管生成素。

31.权利要求30的方法，其中VEGF选自VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉、VEGF₂₀₆、VEGF-2、VEGF-B、和VEGF-D。

32.权利要求30的方法，其中第二种血管发生性因子是内皮细胞生长因子。

33.权利要求16的方法，其中对患者施用至少两种形式的Akt蛋白。

34.包含编码Akt蛋白的核酸、过渡金属和/或血管舒张剂、和制药学可接受载体的药物组合物。

35.权利要求34的组合物，其中所述核酸是质粒或病毒载体的一部分。

36.权利要求35的组合物，其中所述核酸是质粒的一部分。

37.权利要求35的组合物，其中所述病毒载体选自逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、和痘苗病毒。

38.在患有肿瘤患者体内抑制血管发生的方法，包括抑制患者体内Akt活性水平，由此抑制VEGF的生成。

39.权利要求38的方法，包括在反义核酸在胞内条件下与AktmRNA发生杂交的条件下，将Akt反义核酸引入患者细胞内。

40.权利要求38的方法，包括以足以结合并灭活Akt的水平将可特异结合Akt的胞内结合蛋白引入患者细胞。

41.权利要求40的方法，其中胞内结合蛋白是单链Fv抗体(scFv)。

42.权利要求38的方法，包括引入编码Akt的显性失活形式的核酸。

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