CN1154507C - Hox和含有同源域的蛋白质结合的抑制及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明证明了BMP-2/4通过Smad 1与Hoxc-8 DNA结合域相互作用来除去Hoxc-8结合，以活化骨桥蛋白基因转录。因为在所有Hox和含有同源域的蛋白中DNA结合域是保守的，所以Smad 1可能和所有Hox或含有同源域的蛋白质相互作用。另外，本发明揭示了BMP-2/4信号途径中Smad 1-介导的转录机制，还提供了关于胚胎发育中Hox基因的转录作用的信息。
Description
背景技术
相关申请的交叉引用
本发明要求临时专利申请美国系列号60/080,859(1998年4月6日提交，现已放弃)的权益。
联邦基金说明
本发明的产生部分使用了国家卫生研究院补助项目DK53757获得的基金。因此，联邦政府对本发明具有一定的权力。
发明领域
本发明总的涉及转录调控领域。更具体的，本发明涉及Hox与含有同源域的蛋白质结合的抑制及其用途。
相关技术的描述
骨形态发生蛋白(BMP)(一种TGFβ亚类)是调控胚胎发育、脊椎动物图式发育(patterning)和间充质细胞分化的强大生长因子(10，11)。被鉴定为骨诱导生长因子的BMP-2/4，是脊椎动物骨骼发育中重要的信号分子(12-14)。骨形态发生蛋白信号传导途径的中心是Smad 1蛋白，它转位入核，通过骨形态发生蛋白受体的直接磷酸化来调控基因转录(1，3，4)。
在脊椎动物胚胎发育的各过程中，都涉及TGFβ超家族的生长因子。已深入研究了TGFβ对中胚层和骨骼发育的诱导和图式发育的作用。具体的说，TGFβ相关分子，BMP-2/4诱导骨骼图式发育，肢芽生长和骨骼细胞分化。在同一过程中还涉及Hox和含转录因子的同源域(homeodomain)，而且已提出，它们作为BMP-4的下游调控来介导其作用。然而，对于理解hox蛋白在胚胎发育中如何起作用几乎毫无进展。虽然hox蛋白是DNA结合蛋白，但关于其天然DNA反应元件和它们在转录中的作用几乎毫无所知。
在脊椎动物中，有39种含Hox同源框(homeobox)的转录因子基因，分成四个分开的染色体簇，它们在脊椎动物胚胎发育的过程和图式发育中起着关键作用(15，16)。这39种基因根据进化过程中祖先同源框簇的复制、序列相似性和簇中的位置再分成13个共生同源组(17)。已证明各共生同源组负责一具体胚胎功能域或结构的形态发生(16)。在Hox共生同源组VIII中有三个成员：Hoxb-8、Hoxc-8和H0xd-8(17)。在脊椎动物肢芽发育中需要Hox基因，具体说，已提出Hoxb-8是与激活Sonic hedgehog基因(四肢发育中的关键中介体)有关的一种转录因子(18，19)。另外，RNA印迹分析显示在人胚胎发育中脊髓、脊椎和四肢中高水平，心脏中低水平表达Hoxc-8(20)。BMP-2/4激活了Hox基因的表达，诱导成骨细胞分化，并控制发育中的四肢跨过前后(a-p)轴的图式发育(21)。
现有技术在刺激成骨细胞分化和骨形成的方法上是不足的。现有技术在通过Hox蛋白和/或含同源框的蛋白调控转录的方法上也是不足的。本发明填补了本领域中该长期的需要和要求。
发明简述
已将骨形态发生蛋白-2(BMP-2)鉴定为与诱导成骨细胞分化有关的一种骨诱导生长因子。骨形态发生蛋白信号传导途径的中心是Smad1蛋白，它转位入核，通过骨形态发生蛋白受体的直接磷酸化而激活成骨细胞专一性基因转录。本发明鉴定了Smad1与Hox和含同源域的蛋白(其常作为转录阻抑物)的专一性相互作用，其中Smad1和Hoxc-8的结合以剂量依赖方式抑制了Hoxc-8对其DNA结合位点的识别和结合。Smad1和Hoxc-8之间的专一性相互作用可用作抑制Hoxc-8和其DNA结合位点结合的靶，从而诱导成骨细胞分化并防止骨质疏松。Smad1和其它Hox蛋白或含同源框的蛋白的相互作用也可用来调控其它疾病，如癌症或心血管疾病。
在本发明的一个实施例中，提供了在个体中刺激骨形成的方法，包含的步骤为：诱导Smad1和含同源框转录因子之间的相互作用。优选的，该相互作用诱导了编码骨基质蛋白的BMP-反应性基因。该诱导导致成骨细胞和/或成软骨细胞分化，进而刺激骨形成。
在本发明的另一个实施例中，提供了一种诱导编码骨基质蛋白基因的方法，包含步骤：诱导Smad1和含同源框的转录因子之间的相互作用，其中该相互作用导致编码骨基质蛋白的基因的诱导。具体提供了一种诱导编码骨桥蛋白的基因的方法，包含步骤：诱导Smad1和Hoxc-8之间的相互作用。优选的，该相互作用导致除去转录阻抑物并诱导编码骨桥蛋白的基因。
在另一个本发明的实施例中，提供了筛选能刺激骨形成的化合物的方法，包含步骤：使细胞与一种化合物接触；确定该化合物抑制Hoxc-8和基因结合的能力。该结合的抑制导致基因的诱导，这表明该化合物能刺激骨形成。
在另一个本发明的实施例中，提供了一种在个体中调控疾病的方法，包含步骤：抑制含同源框的转录因子和调控疾病有关的基因的结合，其中该抑制除去了含同源框的蛋白对基因的转录性阻抑，并导致那些和调控疾病有关的基因的诱导。
下文对本发明优选例的描述将使本发明的其它和进一步的方面、特征和优点变得明显。这些实施例为了公开而给出。
附图简述
因此获得了上文陈述的本发明的特征、优点和目的，以及其它将变清楚的事情，而且可得到更详细的了解。通过参考某些在附图中描述的实施例可获得对上文简要总结的本发明的更具体的描述。这些图构成了说明书的一部分。然而要注意的是，附图说明了本发明的优选例，因此不是用来限制其范围。
图1显示了在一双杂交系统中Smad1和Hoxc-8的专一性相互作用。图1A显示了Smad1和Hoxc-8之间相互作用的双杂交生长试验。注意到在带有pGBT9-Smad1和PAC-Hoxc-8质粒的酵母(在缺少His、Leu和Trp的培养基上生长)中的专一性相互作用。图1B显示了双杂交试验的β-gal液体试验。测定了带有所示质粒的酵母菌的β-半乳糖苷酶的活性。图1C显示了在折叠实验中Smad1和Hoxc-8的专一性相互作用。用[35S]甲硫氨酸通过翻译来标记Hoxc-8蛋白，并和纯化的GST-Smad1或GST-蛋白一起培养。然后将样品和GST-Sepharose一起培养、洗涤、以SDS缓冲液洗脱并在10％SDS-PAGE凝胶上分离。
图2显示了Smad1和Hoxc-8相互作用抑制作为阻抑物的Hoxc-8功能。图2A显示Hoxc-8专一性结合Hox DNA结合元件。单用32P-标记的Hox结合元件(泳道1)或用GST(泳道2)和GST-Hoxc-8(泳道3-10)进行EMSA。泳道4-6和8-10含有5、25和100倍分子比过量的未标记Hox元件(探针-S)和MSX-2 DNA结合元件(探针-M)。图2B显示Smad1以剂量依赖性方式抑制Hoxc-8与其DNA结合元件的结合。单用32P-标记的Hox结合元件(泳道1)或用GST(泳道2)、GST-Smad1(泳道3)或GST-Hoxc-8蛋白(泳道4-8)和不同量的GST-Smad1(泳道5-8)进行EMSA。图2C显示了体内Smad1和3与Hoxc-8的相互作用。用或不用ALK3(Q233D)共转染FLAG-尾Smad1和-4和HA-尾Hoxc-8。用抗HA抗体免疫沉淀细胞裂解物，用抗-FLAG抗体蛋白质印迹试验分析了得到的复合物。用抗-FLAG抗体蛋白质印迹试验显示了Smad1和-4(中)的表达水平，并用抗-HA抗体显示了Hoxc-8(底部)的表达水平。
图3显示了骨桥蛋白启动子的Hoxc-8 DNA结合位点的性质。图3A显示了在图3B、3C、3D、3E、3F和3G中EMSA用的骨桥蛋白启动子的DNA探针。图3B显示OPN-2 DNA片段含有Hoxc-8结合位点。用不同的32P-标记DNA片段进行EMSA：OPN-1(泳道1-3)，OPN-2(泳道4-6)和OPN-3(泳道7-9)，和单与探针(泳道1、4和7)，GST(泳道2、5和8)或GST-Hoxc-8(泳道3、6和9)培育。图3C显示OPN-5是Hoxc-8的结合位点。用较小的32P-标记的DNA片段进行EMSA：OPN-4(泳道1-5)，OPN-5(泳道6-10)和OPN-6(泳道11-15)和单与探针(泳道1、6和11)，GST(泳道2、7和12)，GST-Smad1(泳道3、5、8、10、13和15)或GST-Hoxc-8(泳道4、5、9、10、14和15)培育。图3D显示Hoxc-8和OPN-5专一性结合。单用32P-标记的OPN-5(泳道1)或用GST-Hoxc-8(泳道2-8)进行EMSA。泳道3-5和6-8含有5、25和100倍分子比过量的未标记OPN-5和MSX-2 DNA结合元件(探针-M)。图3E显示Smad1以浓度依赖性方式抑制Hosxc-8和OPN-5的结合。单用32P-标记的OPN-5(泳道1)，用1.5微克GST(泳道2)，1.5微克GST-Smad1(泳道3)或0.2微克GST-Hoxc-8蛋白(泳道4-7)和不同量的GST-Smad1(泳道5-7分别是1.5、3和4.5微克)进行了EMSA。图3F显示Hox蛋白和Smad1和-4但不和Smad2和-3相互作用。测试了Hoxa-9和Hoxc-8 GST融合蛋白(0.2μg)在凝胶移位试验中与Smad1、-2、-3和-4或GST(3微克)相互作用的能力。图3G显示Smad不抑制Msx-1和Msx-2含同源域的蛋白与其关联DNA元件结合。将纯化的GST-Msx-1或-Msx-2(0.5μg)和探针-M以及不同Smad(3微克)一起培育。
图4显示BMP-2诱导的骨桥蛋白基因转录是由Hoxc-8结合位点介导的。图4A显示在转染试验中所用的构建物的示意性描述：OPN-266是天然骨桥蛋白构建物；Hox-pGL3含有和SV40启动子连接的骨桥蛋白Hox结合位点；mHox-pGL3含有突变的骨桥蛋白Hox结合位点。图4B显示BMP活化骨桥蛋白启动子。将OPN-266质粒和Hoxc-8、Smad1或Smad4质粒各单独或在存在或缺乏ALK3质粒的情况下联合这三种质粒转染入C3H10T1/2间充质细胞。图4C显示骨桥蛋白Hox结合位点介导了BMP-诱导的转录。将Hox-pGL3构建物和ALK6或ALK3共转染入C3H10T1/2间充质细胞。图4D显示Hox结合位点的突变废除了BMP刺激。将Hox-pGL3构建物或mHox-pGL3-pGL3对照质粒和ALK6、ALK3或Hoxc-8质粒共转染入C3H10T1/2间充质细胞中。分析了表B、C和D中细胞裂解物的荧光素酶活性(标准化为转染后48小时的Renilla荧光素酶水平)。实验以一式三份重复两次。
图5显示Smad1的N-末端区域和Hoxc-8相互作用。图5A显示了B组所示的凝胶移位试验中所用的纯化GST-Smad1片段的SDS-PAGE全貌图，和Smad1缺失构建物的示意性表现。在谷胱甘肽-琼脂糖上纯化了以氨基酸数目标出的细菌表达的GST重组Smad1蛋白。将谷胱甘肽洗脱物加到10％SDS-PAGE上，通过考马斯蓝染色(左)显现。用凝胶顶部泳道的分子量标记来确定各大小。图5B显示Smad1的两个区域赋予Hoxc-8结合的抑制作用。用纯化的GST融合蛋白和衍生自骨桥蛋白启动子～206到～180的[32P]-标记探针进行凝胶移位试验。泳道1，单为探针；泳道2-16，GST(泳道2)和探针，或仅有GST-Hoxc-8(泳道4)或存在各种大小的Smad1蛋白和GST-Hoxc-8(泳道5-16)。对两个区域(MH1的aa101-145和MH1-接头连接区的148-191)进行作图，(证明这两个区域)对相互作用已足够(泳道14和16)。图5C显示Hoxc-8和DNA结合受到Smad1片段抑制是剂量依赖性的。将Hoxc-8与相同探针在不存在(泳道1)和存在Smad1片段101-145(泳道2-4)或148-191(泳道5-7)时培育(在相连续泳道之间截短的Smad1浓度呈2-倍增加)。
图6显示Hoxc-8的同源域和Smad1相互作用。图6A显示用于相互作用研究的Hoxc-8的各种缺失突变的示意性说明。各突变物的大小用氨基酸残基标出。CR1，保守域1；HP，六肽；HDC，同源域及其C-末端延伸；和HD，同源域。图6B显示在酵母双杂交系统中Smad1和Hoxc-8之间的相互作用。用pACT2(对照)或含有标出的不同长短Hoxc-8 cDNA的pACT2，转化含有质粒pGBT9/Smad1的酵母菌株Y190。分析了转化子(克隆)的β-半乳糖苷酶活性，对细胞密度数值作了标准化。各条图代表平均数(三次独立测定的SD)。图6C显示Hoxc-8的同源域及其C-末端延伸涉及和Smad MH1区域的相互作用。将细菌表达的GST-HDC和图5中所用的相同探针在不存在(泳道4)和存在(泳道5-16)如顶部标出的不同Smad缺失一起培养。阴性对照包括单用探针(泳道1)，用GST(泳道2)，和用GST-Smad1(泳道3)。图6D显示Hoxc-8的同源域和各种Smad1衍生物相互作用。在与表C中相似的凝胶移位试验中分析了GST-HD的结合活力。
图7显示含有Hoxc-8相互作用区的Smad1功能域诱导骨细胞分化。图7A显示Smad1-NL，Smad1-L和Smad1-M的构建物。用pTet-Splice载体来产生Smad1-NL(aa3-276)，-L(aa145-276)和-M(aa 104-191)的四环素(Tet)-调控哺乳动物表达质粒。将核定位信号(NLS)与各构建物融合，使之表达截短的蛋白质进入核。图7B显示Smad1片段的表达是Tet调控的。将表A中显示的构建物永久转染入2T3成骨前体细胞，而在不存在或存在Tet下培养细胞2天后抽提出总RNA。将5毫克来自所标示克隆的RNA和[32P]-标记的相应cDNA探针用于狭线印迹杂交试验(Bio-Rad)。通过Tet撤除诱导各Smad1片段的表达。图7C显示Smad1的Hoxc-8相互作用域诱导了碱性磷酸酶的活性。将带有pTet-Splice载体(载体)，pTet/Splice/Smad1-NL(Smad1-NL)，-Smad1-L，或Smad1-M的2T3细胞在存在或不存在Tet下培养，在指定日裂解细胞(x-轴)。如本文所述测定碱性磷酸酶的活性，对于蛋白内容物数值作了标准化。各直方条代表至少3个独立的测量。图7D显示Smad1片段诱导了2T3克隆中矿物基质形成。将指定的稳定克隆在存在或不存在Tet或存在100ng/ml BMP-2(BMP-2)下培养12天。然后固定细胞，并用von Kossa法染色。在用BMP-2处理的细胞中，并在Smad1表达系的Hoxc-8相互作用域中形成了矿物晶体(黑点)。
图8显示Hoxc-8的过度表达诱导了高水平的碱性磷酸酶活性。用Hoxc-8的哺乳动物表达载体(pcDNA3/Hoxc-8)稳定转染2T3细胞。用狭线印迹杂交选出阳性克隆并如图7所述分析其碱性磷酸酶活性。显示了一式三份的平均值和SD。
图9显示提出的Smad1的Hoxc-8相互作用域模拟了BMP信号传导，并诱导骨细胞分化的机制的一种模式。Hoxc-8阻抑了处于基点的多能性和可自我更新的干细胞的基因转录。当Smad1-Hoxc-8相互作用域表达时，它们进入核并结合Hoxc-8。Smad1片段和Hoxc-8的相互作用抑制了Hoxc-8与骨标记基因(如骨桥蛋白)中其相关DNA元件结合，然后阻抑了Hoxc-8并激活基因转录，并因此诱导成骨细胞的形成。
发明详述
TGB-β超家族中的信号转导需要两类丝氨酸/苏氨酸跨膜激酶受体的相互作用。信号通过Smad蛋白的直接磷酸化介导。Smad2和Smad3通过TGFβ和活化素而磷酸化(2，3)，而Smad1和Smad5具体是由骨形态发生蛋白(它是TGF-β超家族的成员(4，5))诱导的。磷酸化后，Smad蛋白和共同伙伴，Smad4，相互作用，并转位入核，在核中该复合物征集DNA结合蛋白来激活专一性基因转录(4，6-9)。然而，还未鉴定出骨形态发生蛋白信号传导中涉及的DNA结合蛋白。
本发明证明Smad能专一性和Hoxc-8(同源域转录因子家族的成员之一)相互作用，以剂量依赖性方式抑制Hoxc-8与其DNA结合位点的结合。Hoxc-8作为转录阻抑物起作用，并在骨组织中优势表达。另外，从骨桥蛋白基因的5′侧翼区域确定了Hoxc-8结合位点，其表达由BMP-2/4迅速诱导。看来骨形态发生蛋白-诱导的骨桥蛋白基因转录是通过Hoxc-8结合位点介导的。
本发明针对一种在个体中刺激骨形成的方法，包含步骤：诱导Smad1和含同源框的转录因子之间的相互作用，其中该相互作用诱导了编码骨基质蛋白(导致成骨细胞和/或成软骨细胞分化，因而刺激骨形成)的BMP-反应性基因。诱导该相互作用的代表性方法包括Smad1的磷酸化，Smad1的过度表达，和含同源框的转录因子的突变。通常，含同源框的转录因子是Hoxc-8、Hoxa-9、Msx-1或Msx-2，而BMP-代表性基因可包括编码骨桥蛋白、涎蛋白、骨粘连蛋白或骨钙蛋白的基因。通常，该个体患骨质疏松。
本发明还针对一种诱导编码骨基质蛋白的基因的方法，包含步骤：诱导Smad1和含同源框转录因子之间的相互作用，其中该相互作用导致诱导编码骨基质蛋白的基因。上文描述了这种诱导的代表性方法，如代表性的含同源框的转录因子和BMP-反应性基因。具体的，本发明针对一种诱导编码骨桥蛋白基因的方法，包含步骤：诱导Smad1和Hoxc-8之间的相互作用，其中该相互作用导致除去编码骨桥蛋白的基因的转录阻抑，从而诱导编码骨桥蛋白的基因。
本发明还针对一种筛选刺激骨形成的化合物的方法，包含步骤：使细胞和一种化合物接触，并测定该化合物抑制Hoxc-8和基因结合的能力。结合的抑制导致基因诱导，这表示化合物刺激了骨形成。代表性化合物包括抗体及其片段、合成药物、合成蛋白或Smad1的磷酸化形式或其片段。结合的抑制可通过凝胶移位试验、转录、RNA印迹和蛋白质印迹等方法测定。如上所述，代表性基因编码骨桥蛋白、涎蛋白、骨粘连蛋白和骨钙蛋白的基因。
本发明还针对一种调控个体内疾病的方法，包含步骤：抑制含同源框的转录因子和个体细胞中涉及调控疾病的基因的结合。结合的抑制消除了含同源框蛋白对该基因的转录阻抑，从而导致诱导了涉及调控疾病的基因。就此而言，抑制可能是由于存在能结合含同源框的转录因子的化合物，从而抑制了该含同源框的转录因子的DNA结合活性。同上，代表性的化合物包括：抗体及其片段、合成药物、合成蛋白和Smad1的磷酸化形式或其片段。优选的含同源框的转录因子是Hoxc-8，Hoxa-9，Msx1和Msx2。该方法可用于患骨质疏松、癌症、心血管疾病和神经系统疾病的个人。本文所用的术语“BMP-诱导的基因活化”指任何能在BMP刺激后受诱导而表达的基因。本文所用的术语“Smad1”指任何与果蝇(Drosophila)母体蛋白同源的抗DPP或MAD的蛋白质。本文所用词组“Smad1和Hox之间的相互作用”或“Smad1和含同源域蛋白之间的相互作用”指任何在这两种蛋白之间的，导致Hox或含同源域的蛋白的转录阻抑物活性破坏的相互作用。本文所用的术语“hox蛋白的转录阻抑”或“含同源域蛋白的转录阻抑”指任何在存在hox蛋白或含同源域蛋白时其转录活性被阻抑的基因。
根据本发明，可使用本领域技术中的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。在文献中全面解释了这些技术。见例如：Maniatis，Fritsch & Sambrook.″分子克隆：实验手册″(1982)；″DNA克隆：实践方法″卷I和卷II(D.N.Glover编，1985)；″寡核苷酸合成″(M.J.Gait编，1984)；″核酸杂交″[B.D.Hames & S.J.Higgins编(1985)]；″转录和翻译″[B.D.Hames & S.J.Higgins编(1984)]；″动物细胞培养″[R.I.Freshney编(1986)]；″固定化细胞和酶″[IRL Press(1986)]；B.Perbal，″分子克隆实践指南″(1984)。因此，如果在本文中出现，下列术语将具有下文列出的定义。
“DNA分子”指脱氧核糖核苷酸(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶或胞嘧啶)以其单链形式或双链螺旋的多聚体形式。该术语仅指该分子的一级和二级结构，并不将其限制在任何具体三级形式中。因此，该术语包括尤其是在线性DNA分子(如限制性片段)，病毒，质粒和染色体中发现的双链DNA。在讨论本文的结构时，根据常规，仅给出DNA沿非转录链的5′到3′方向(即，具有和mRNA同源的序列的链)。
“载体”是一种复制子，如质粒、噬菌体或粘粒，在其上可结合其它DNA片段，从而致使结合片段复制。“复制子”是任何基因元件(如质粒、染色体、病毒)，它们在体内的作用是DNA复制的自主单位；即，能在自身控制下复制。“复制起始点”指那些参与DNA合成的DNA序列。“表达控制序列”是控制和调节另一条DNA序列转录和翻译的DNA序列。当RNA聚合酶将编码序列转录成mRNA，然后翻译成该编码序列编码的蛋白时，编码序列在细胞中与转录和翻译控制序列“可操纵性连接”，并“在其控制下”。
一般说，与宿主结合使用含有能促进有效转录和翻译插入的DNA片段的启动子序列的表达载体。通常表达载体含有复制起始点、启动子、终止子，以及能在转化细胞中提供表型选择的特殊基因。可根据本领域已知方法发酵并培养转化的宿主，来得到最佳细胞生长。
DNA“编码序列”是当置于合适调控序列的控制下，能在体内被转录并翻译成多肽的双链DNA序列。由5′(氨基)末端的起始密码子和3’(羧基)末端的翻译终止密码子确定编码序列的边界。编码序列可包括，但不限于：原核序列、真核mRNA的cDNA、来自真核生物(如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列、和合成的DNA序列。通常将聚腺苷酸信号和转录终止序列定位于编码序列的3′。“cDNA”定义为拷贝-DNA或互补-DNA，是mRNA转录物的反转录反应产物。“外显子”是从基因座转录的表达序列，而“内含子”是基因座的非表达序列。
转录和翻译控制序列是DNA调控序列，如启动子、增强子、阻抑子、聚腺苷酸化信号、终止子等，它们提供了在宿主细胞中编码序列的表达。“顺式-元件”或“DNA结合识别序列”是一种核苷酸序列，也称为“共有序列”或“基序”，它和能上调或下调具体基因座表达的其它蛋白相互作用。“信号序列”也可以包括在编码序列中。该序列编码信号肽，多肽的N-末端，它和宿主细胞通讯并将多肽指引向合适的细胞位置。可发现信号肽和原核生物和真核生物的各种天然蛋白结合在一起。
“启动子序列”是能在细胞中结合RNA聚合酶，并引发下游(3’方向)编码序列转录的一种DNA调控区域。为了明确本发明，启动子序列其3′末端以转录起始位点为边界，并向上游(5′方向)延伸包括引发高于背景的可检测水平转录所必需的最少数量的碱基或元件。在启动子序列中，将发现一个转录起始位点，以及负责RNA聚合酶结合的蛋白质结合区域(共有序列)。真核启动子通常，但不总是含有“TATA”盒和“CAT”盒。原核启动子除了-10和-35共有序列外，还含有Shine-Dalgarno序列。
术语“寡核苷酸”定义为包含两个或更多，优选三个以上脱氧核糖核苷酸的分子。它的确切大小将视许多因素而定，这些因素又由该寡核苷酸的最终功能和用途决定。本文所用的术语“引物”指当置于诱导合成引物延伸产物(其与核酸链互补)，即，存在核苷酸和DNA聚合酶等诱导剂，适合的温度和pH的条件下，能作为合成起始点的寡核苷酸(不论在纯化的限制性消化中天然存在的，或合成产生的)。引物可以是单链或双链的，而且必须足够长，从而在诱导剂存在下引发需要延伸产物的合成。引物的确切长度将视许多因素，包括温度。引物来源和方法的使用而定。例如，为了诊断应用，由靶序列的复杂程度而定，寡核苷酸引物通常含有15-25或更多个核苷酸，虽然它可含有较少的核苷酸。
挑选了与某具体靶DNA序列的两条不同链“基本”互补的本文的引物。这意味着该引物一定是充分互补，而和其各自相应的链杂交。因而，引物序列不需要反映模板的确切序列。例如，可将非互补核苷酸片段与引物的5′末端连接，而引物的剩余部分和该链互补。另外，如果引物序列和该序列充分互补，或与其杂交，并因而形成合成延伸产物的模板，可将非互补碱基或更长的序列散布在引物中。
本文所用的术语“限制性内切酶”和“限制性酶”指在特异性核酸序列处或附近切开双链DNA的酶。
“重组DNA技术”指用来联合两条异源DNA分子(通常是来自不同有机体的DNA体外连接的结果)的技术。重组DNA分子常用基因工程实验产生。同义的术语包括“基因剪接”、“分子克隆”和“基因工程”。这些操作的产物是“重组体”或“重组分子”。
当DNA被引入细胞内时，该细胞即为被外源或异源DNA“转化”或“转染”。转化DNA可以整合(共价连接)或不整合到细胞的基因组中。在原核细胞、酵母和哺乳动物细胞中，可使转化DNA维持在游离型元件如载体或质粒上。对于真核细胞，一个稳定转化的细胞是其中转化DNA已被稳定整合入染色体中，从而通过染色体复制被子细胞继承的细胞。真核细胞能够建立由一群含有转化DNA的子细胞形成的细胞系或克隆的能力，证明了这种稳定性。“克隆”是通过有丝分裂衍生自一个细胞或祖先的一群细胞。“细胞系”是一个能在体外稳定生长许多代的原代细胞的克隆。已经过外源DNA转化的植物或动物等生物体称为“转基因生物”。
本文所用的术语“宿主”指不仅包括原核动物，而且包括酵母、植物和动物细胞等真核细胞。使用本领域普通技术人员公知的任何技术可用重组DNA分子或基因转化宿主。一个优选例是用含有某基因编码序列的载体来作真核转化。原核宿主可包括：大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(S.tymphimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草杆菌(Bacillus subtilis)。真核宿主包括巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)等酵母，哺乳动物细胞和昆虫细胞，而更优选的，拟南芥(Arabidopsisthaliana)和烟草(Tobaccum nicotiana)等植物细胞。
当两条DNA序列的核苷酸相对于其DNA序列的确定长度至少75％(优选至少80％，最优选是至少90％或95％)互相匹配时，它们是“基本同源”的。可通过使用序列数据库中可得的标准软件，或在具体系统所确定的严紧条件下的DNA杂交实验中，比较诸序列，来鉴定基本同源的序列。确定合适的杂交条件在本领域技术人员能力范围内。见Maniatis等，同上；DNA克隆，卷I&II，同上；核酸杂交，同上。
DNA构建物的“异源”区域是一条较长的DNA分子中的可鉴定的DNA片段，没有发现它天然和较大的分子相结合。因此，当该异源区编码一个哺乳动物基因时，该基因侧翼常常有在来源生物体基因组中不侧接该哺乳动物基因组DNA的DNA。在另一个例子中，编码序列是其中的编码序列本身天然不存在的构建物(如其中基因组编码序列含有内含子，或具有和天然基因不同的密码子的合成序列)。等位基因突变或天然存在的突变事件不会产生本文所确定的DNA异源区。
本文用于多肽或抗体的“片段”，一般将是长度至少10个残基，更典型的是至少20个残基，而优选的是至少30(如50)个残基，但比全部的完整序列短的多肽或抗体。可用本领域技术人员已知的方法，如天然存在或重组物的酶消化，使用编码确定片段表达载体的重组DNA技术，或化学合成来产生这些片段。候选片段显示Smad1的特性(如与Hoxc-8结合)的能力可用本文所述方法评估。可采用本领域技术人员已知的标准方案，使用Smad1的纯化片段或Smad1的抗原性片段来产生抗体。
可用标准RNA印迹试验，根据本领域一般技术人员已知的常规RNA杂交技术来确定从植物或其它转基因组织中获得的细胞或组织中mRNA的相对量。另外，可用标准DNA印迹试验，根据本领域一般技术人员已知的常规DNA杂交技术来确定转基因系统中某基因的存在及其拷贝数。RNA印迹和DNA印迹都使用杂交探针，如含全长、单链DNA或该DNA序列长度为至少20(优选至少30，更优选至少50，而最优选至少100个连续核苷酸)的放射性标记的cDNA。可用本领域技术人员已知的许多不同方法之一来标记DNA杂交探针。
这些研究最常用的标记是放射性元素，酶，当暴露于紫外光时会放出荧光的化学物质和其它物质。许多荧光材料是已知的，而且可用作标记。这些材料包括：荧光素、罗丹明、金胺、Texas红、AMCA蓝和荧光黄。一种特殊检测材料是在山羊中制备的抗-兔抗体，并通过异硫氰酸键和荧光素偶联。还可用放射性元素或用酶标记蛋白质。可通过任何现在可行的计数程序检测放射性标记。优选的同位素可选自：3H、14C、32P、35S、36C1、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
类似的，酶标记也是有用的，而且能用任何目前所用的比色、分光光度、荧光分光光度、电流分析或气体定量技术检测。通过和桥连分子如碳二亚胺、二异氰酸、戊二醛和类似物反应，将酶与所选颗粒偶联。许多可用于这些过程的酶是已知的，而且可被利用。优选的是过氧化物酶、β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、葡糖氧化酶加过氧化物酶和碱性磷酸酶。参考以举例方式的美国专利No.3,654,090、3,850,752和4,016,043公开的其它标记材料和方法。
给出下列实施例是为了说明本发明的不同实施例，而不意味以任何方式限制本发明：
实施例1
双杂交文库筛选
将Smad1 cDNA克隆入pBGT9载体的SaH/PstI位点来产生pGBT9/Smad1诱饵质粒。用该诱饵质粒，按照厂商(Clontech，CA)提供的程序筛选了人U2 OS成骨细胞样pACT cDNA文库。为了确定Hoxc-8和Smad1的相互作用，将一条全长小鼠Hoxc-8 cDNA亚克隆入pACT载体的XhoI和RcoRI位点。用pBGT9/Smad1将pACT/Hoxc-8共转化入Y190，用菌落转移过滤试验和液体试验分析菌落的β-半乳糖苷酶表达。
实施例2
谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白的表达和纯化
通过限制性消化pGBT-Smad1(SalI/HindIII)和pCMV5-Smad3(BamHI/SalI)，然后分别插入pGEX-KG载体的SalI/HindIII和BamHI/SalI位点来产生GST-Smad1和-Smad3的GST融合构建物。用EcoRI/SalI消化从pCMV-Smad2和pCMV5-Smad4得到的GST-Smad2和-Smad4，然后分别插入pGEX-5X-2和pGEX-5X-1载体(Amersham Pharmacia Biotech)的EcoRI/SalI位点。用高保真性Pfu-Turbo DNA聚合酶(Stratagene)PCR扩增GST-Hoxc-8和GST-Hoxa-9，并分别克隆入pGEX-KG载体的BamHI/EcoRI和BamHI/XbaI位点。Dr.C.Abate-Shen(Center ofAdvanced Biotechnology and Medicine，Piscataway，NJ)提供了GST-Msx-1和-Msx-2表达质粒。将上述的GST构建物转化入BL21，并进行融合蛋白的表达和纯化。
实施例3
GST折叠试验
在[35S]甲硫氨酸存在下，使用TNT-偶联网织红细胞裂解系统，根据厂商(Promega)的程序，分别用线性化的Smad1或Hoxc-8 pBluescript(SK)质粒翻译了Smad1或Hoxc-8。用SDS-PAGE确认了标记的Smad1蛋白。
将含Smad1的裂解物(5微升)和等价量(1微克)GST或GST-Hoxc-8混合。另外，将含Hoxc-8的裂解物和GST单独或GST-Smad1混合。将样品在冰上培育30分钟，然后在各样品中加入稀释于NENT缓冲液(50微升)的GST-琼脂糖，然后4℃培育30分钟。在PBS/0.1％TritonX-100溶液中洗涤Sepharose珠四次，通过在2×SDS缓冲液中10℃培育5分钟洗脱结合的蛋白质。作为进样液，将体外翻译的标记的Smad1蛋白质裂解物(1微克)和洗脱样品一起加到12.5％SDS-PAGE上。
实施例4
免疫沉淀和蛋白质印迹
从pACT2/Hoxc-8将HA-尾的Hoxc-8亚克隆入哺乳动物表达载体pcDNA3(Invitrogen)的BglII/BamHI和XhoI中。Dr.Rik Derynck(加利福尼亚大学，旧金山，CA)提供了FLAG-尾的Smad1和Smad4的表达载体。Dr.JeffreyL.Wrana(Hospital for Sick Children，Canada)提供了用于组成性活化BMP IA型(ALK3)和IB(ALK6)受体的表达质粒。根据厂商指南(Promega)，使用Tfx-50用表达构建物转染COS-1细胞。转染48小时后裂解细胞，用抗-HA抗血清(Babco)免疫沉淀裂解物并用抗-FLAG M2(Eastman Kodak)免疫印迹。
实施例5
电泳迁移率变动分析(EMSA)
用从骨桥蛋白启动子序列(图3A)设计的引物作PCR产生DNA片段：OPN1、OPN2和OPN3。通过退火下列12对合成寡核苷酸来建立双链寡聚体：
5′-AGGGTAATTGGAGGC(SEQ ID No.1)和
5′-GCCTCCAATTACCCT-3′(SEQ ID no.2)(探针S)；
5′-CATGACCCCAATTAGTCCTGGCAGCA-3′(SEQ ID No.3)和
5′-CAGGGATCCATAAGGAAAGG-3′(SEQ ID No.4)(OPN-4)；
5′-GACATCGTTCATCAGTAATGCTTG-3′(SEQ ID No.5)和
5′-CAAGCATTACTGATGAACGATGTC-3′(SEQ ID No.6)(OPN-5)；
5′-GACATCGTTCATCAGTAATGCTTTG-3′(SEQ ID No.7)和
5′-CAAAGCATTACTGATGAACCATGTC-3′(SEQ ID No.8)(OPN-6)；
通过与T4激酶和[γ-32P]ATP的反应来放射性标记这些DNA片段或寡聚物。将结合反应物22℃和体积为19微升的75mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT，10mMTris-HCl(pH7.5)，6％牛血清白蛋白和25ng dI/dC中的指定蛋白质一起预培育20分钟。加入1微升DNA探针(0.5ng，50,000-100,000cpm)。反应物在4％聚丙烯酰胺凝胶上进行非变性电泳。
实施例6
转染
从CH10T1/2细胞基因组DNA PCR扩增了相对于转录起始点从区域-266到-1的骨桥蛋白启动子，并将其克隆入pGL-3基础载体(Promega)的SmaI和XhoI位点，产生荧光素酶报道构建物(OPN-266)。用相同策略构建了带有Hoxc-8结合位点(-290到-166)的Hox-pGL3报道子，但将其置于pGL3-对照载体(Promega)中。在Hox-pGL3中，用GCGG通过PCR置换Hox识别核心TAAT，来产生突变体Hox-pGL3(mHox-pGL)。
每个60-mm盘中接种2×105个C3H10T1/2细胞，次日用Tfx-50(Promega)和0.5微克荧光素酶表达质粒(pGL3-OPN170)以及表明的不同表达质粒共转染。用pcDNA3-β-gal质粒来平衡不同组中的DNA量。为了标准化效率，共转染了pRL-SV40质粒。使细胞接触Tfx-50和质粒的混合物1小时。然后使转染细胞与10％DMEM接触。48小时后，将细胞收集在1X被动裂解缓冲液中，用Promega′sDual-LuciferaseTM报道试验系统分析裂解液的荧光素酶活性。用Renilla荧光素酶活性在SV40启动子的控制下对数值作了标准化。图中显示了对照的相对值。
通过以PCR为基础的策略将编码与核定位信号(NLS)融合的不同形式的Smad1的质粒构建入巨细胞病毒(CMV)启动子为基础的哺乳动物表达载体，pCMV5。各构建物含有下列区域之一：Smad1-NL(氨基酸3-276)、Smad1-L(aa145-267)和Smad1-M(101-191)。从pACT2/Hoxc-8将Hoxc-8亚克隆入哺乳动物表达载体pcDNA3(Invitrogen)。用0.5mg OPN266荧光素酶报道质粒和不同的表达质粒，如所述使用Tfx-50(Shi和Yang等，1999)转染了C3H10T1/2细胞(12孔培养盘中5×104细胞/孔)。
实施例7
永久细胞系的建立
用Tet-调控表达系统(Gibco)在2T3成骨细胞前体细胞(Harris等，1996)中产生Smad1突变体表达细胞系。从pCMV5中将NLS-连接的Smad1-NL、Smad1-L或Smad1-M亚克隆入pTet-剪接载体(Gibco)。共转染2毫克pTet-剪接/Smad1-NL，Smad1-L，Smad1-M，或pTet-剪接(对照)，2mg的pTet-tTAk和40ng的pcDNA3(Clontech)，并通过在生长培养基中加入G418(400mg/ml)选出阳性克隆。使用5毫克总RNA和[α-32P]-dCTP标记探针，用狭线-印迹(Bio-Rad)来测定Smad1的表达缺失形式。
实施例8
骨标记基因表达
用STAT-60(Tel-试验)或用MicroPoly(a)Pure(Ambion)根据厂商说明书分离了对照和Smad1表达细胞系的总RNA或mRNA。用Rapid-Hyb缓冲液(Amersham)根据厂商指示进行了RNA印迹。用C3H10T1/2细胞的cDNA作为模板，PCR扩增了骨桥蛋白探针。Dr.Harris(Univ.ofTexas)友好提供了I(a)类胶原和osf-2/cbfal探针。
实施例9
碱性磷酸酶和矿物化骨基质形成试验
用碱性磷酸酶试验(Begley等，1993)和von Kossa染色(Bharagava等，1986)测定了骨细胞分化。
实施例10
酵母双杂交文库筛选
为了调查BMP-2/4诱导的基因活化中的转录机制，用酵母双杂交系统来鉴定BMP-2/4信号传导途径中与Smad1相互作用的转录因子。用与Gal4 DNA结合域融合的完整Smad1 cDNA作为诱饵质粒来筛选构建于pACT2质粒载体中的人U-2 OS成骨细胞样细胞文库。从25个阳性克隆中，DNA序列分析鉴定一个克隆为Hoxc-8，两个克隆为Smad4。
图1A说明两个杂交系统的生长性质，证明体内Smad1和Hoxc-8的专一性相互作用，它由β-gal液体试验(图1B)进一步确认。同时带有Smad1和Hoxc-8质粒的酵母菌能在缺乏Trp，Leu，和his的培养基上生长。当在该双杂交系统中测试与融合Gal4 DNA结合域融合的全长Hoxc-8时，显示了和Smad1强得多的相互作用(图1A和B)。
实施例11
Smad与Hoxc-8在体外和在COS-1细胞中相互作用
为了进一步确定体外这两种蛋白质之间的直接相互作用，还用[35S]甲硫氨酸-标记的Hoxc-8和GST-Smad1融合蛋白进行了谷胱甘肽S-转移酶(GST)折叠(pull down)实验。如图1C所示，Hoxc-8和纯化的GST-Smad1融合蛋白成功的共沉淀，但和GST单独不行，证明了这两种蛋白质之间的直接相互作用。
本发明证明Smad1和Hoxc-8之间的直接相互作用，并揭示了BMP-2/4-诱导的骨骼发育中Smad1-介导的转录机制。为了测试该相互作用对Hoxc-8 DNA结合能力的影响，在凝胶移位实验中测试了Hoxc-8蛋白的DNA结合性能。图2A显示纯化的GST-Hoxc-8融合蛋白与其DNA结合位点结合。用竞争性试验证明了该结合的专一性。未标记的Hoxc-8 DNA结合元件以剂量依赖的方式消除了Hoxc-8转移条带，而Msx-2 DNA结合元件(22)(另一种含同源域的蛋白质)的存在无作用(图2A)。显然，当将纯化的GST-Smad1蛋白加到结合反应中时，以剂量依赖性方式抑制了Hoxc-8结合条带(图2B)。因此，这些结果表明Smad1和Hoxc-8的相互作用阻碍了Hoxc-8与其DNA反应元件的结合。这看来反映了BMP-诱导的基因活化，因为已提出Hoxc-8是一种转录阻抑物。
BMP-2刺激Smad1的磷酸化，而磷酸化的Smad1接着与Smad4结合，并将复合物摄入核内。令人感兴趣的是，是否Smad1，Smad4，或Smad1和Smad4的复合物也在细胞中与Hoxc-8相互作用。用对于FLAG-Smad1、FLAG-Smad4、HA-Hoxc-8，和/或组成性活化BMP IA型受体，ALK3(Q233D)的表达质粒瞬时共转染COS-1细胞。用抗-HA抗体免疫沉淀细胞裂解物，并用抗-FLAG抗体免疫印迹分析。图2C证明Smad1(泳道3)、Smad4(泳道5)或两者(泳道7)是在细胞中与HA-Hoxc-8共沉淀的。ALK3(Q233D)的共转染增强了Smad1(泳道4)或Smad4(泳道6)与Hoxc-8的相互作用。然而，ALK3(Q233D)并不显著增强Smad1和Smad4复合物与Hoxc-8的相互作用(泳道8)。
这些结果显示，在COS-1细胞中，有或无BMP刺激的条件下Smad1和Smad4都与Hoxc-8相互作用，表明Smad1的磷酸化不是其与Hoxc-8相互作用所必需的。如果真是这种情况，那么该相互作用的BMP-依赖性调控是这些蛋白质胞内定位中固有的。Hox蛋白是定位在核内的同源域转录因子，而Smad1和Smad4在细胞质中。可能是仅当BMP受体诱导其磷酸化后，Smad1或复合物转移到核中时，才发生相互作用。
实施例12
骨桥蛋白启动子含有Hoxc-8结合元件
为了调查是否Smad1和Hoxc-8之间的相互作用结合DNA并调节转录活性，测试了BMP-2可诱导的基因。通过对启动子序列之间的比较，在4个BMP-2反应性骨基质蛋白基因，骨涎蛋白、骨桥蛋白、骨粘连蛋白和骨钙蛋白(它们作为成骨细胞分化的标记基因)中发现了推测的Hox结合位点。由于骨桥蛋白启动子的mRNA表达在C3H10T1/2间充质细胞对BMP-2的处理反应中，被迅速活化，所以检测了骨桥蛋白启动子。在骨桥蛋白基因5′侧翼区域的前382bp中有5个具有Ta/tAT的核心序列的推测Hox结合位点(图3A)。当凝胶移位试验中，在和纯化GST-Hoxc-8蛋白培育中使用了含有所有5个推测的Hox位点的从-382到-170(OPN-1)的212碱基对DNA片段时，观察到一条Hoxc-8结合条带，表明在骨桥蛋白启动子中仅有一个Hoxc-8结合位点(图3B)。随后用更短的探针(OPN-2和OPN-3)作凝胶移位试验，将Hoxc-8结合元件定位在从-206到-180(包括在OPN-2中)区域中(图3A和C)。当用了3个单一推测的Hox结合探针(OPN-4、-5和-6)时，Hxc-8仅和位于-206到-280的OPN-5结合。GST单独或GST-Smad1融合蛋白都不和该凝胶移位试验系列中使用的任何探针结合。当OPN-5中Hoxc-8结合位点的TAAT核心序列突变成GCCG(mOPN-5)时，废除了Hoxc-8结合。
用凝胶移位竞争试验测定了Hoxc-8与DNA结合的专一性(图3D)。未标记的Hoxc-8 DNA结合元件以浓度依赖性方式抑制了转移条带(图3E)，其中多100倍的特异性冷探针消除了Hoxc-8结合，而多100倍的Msx-2 DNA结合元件无作用。Msx-2是含同源域的蛋白质，但其不属于Hox家族。从骨钙蛋白启动子中鉴定到了Msx-2 DNA结合元件，其核心序列的侧翼区域与Hoxc-8结合位点不同。
对于骨桥蛋白启动子，鉴定到3个TAAT和2个TTAT推测的Hox位点。Hoxc-8仅与TAAT核心序列(-206到-180)中的一个结合，提示该侧翼区对于Hoxc-8结合也是重要的。Hoxc-8结合位点，包括其侧翼区，在鸡、小鼠、猪和人中是高度保守的。其它4个推测的Hox位点可能涉及其它同源域蛋白结合或不是真正的Hox结合位点。
实施例13
Smad1抑制Hox蛋白和DNA的结合
测试了纯化GST-Smad1与Hoxc-8相互作用对Hoxc-8 DNA结合活性的影响。当将GST-Hoxc-8蛋白及其DNA结合元件(OPN-5)与递增量的GST-Smad1蛋白一起培育时，以浓度依赖性方式抑制了Hoxc-8与DNA探针的结合。等量的GST蛋白对Hoxc-8结合活力没有影响。这些结果提示，Smad1与Hoxc-8的相互作用将Hoxc-8从其反应元件中驱赶出来。
因为TGF-β超家族的信号网络非常复杂，重要的是了解Hox和Smad蛋白之间相互作用的专一性。选择Hoxa-9作为具有明确特征的同源框DNA结合蛋白，来测试其与不同Smad蛋白的相互作用。两种其它的同源域蛋白，Msx-1和Msx-2，也出于相同目的用于凝胶移位试验。在Hox基因簇以外的其它基因座发现的Msx-1和Msx-2，和牙齿发育有关。这两个基因的表达都受到BMP-2和BMP-4的协同调节。
为了估计Smad和同源域蛋白之间相互作用的相对强度，在各凝胶移位试验中使用了等量的Hoxc-8和Hoxa-9或Msx-1和Msx-2蛋白，与固定量的不同Smad蛋白。Smad1和Smad4均抑制Hoxc-8和Hoxa-9结合，而两种Smad蛋白同时加入时，抑制增强。相反的，Smad2或Smad3都不和这两种Hox蛋白相互作用。任何Msx蛋白都不和4种Smad蛋白中的任一相互作用。GST不影响Hox或Msx蛋白结合。同源域，一高度保守的DNA结合基元，是Hoxc-8和Hoxa-9之间高度保守的区域，提示Smad1能与其它涉及BMP信号传递的Hox蛋白相互作用。
实施例14
Hox结合位点介导BMP-诱导的转录
为了测试是否Hoxc-8结合位点起BMP-2/4反应性元件的作用，将一条266bp的含Hoxc-8结合位点的骨桥蛋白启动子片段克隆入pGL3-基础的荧光素酶报道载体中，产生OPN-266报道质粒。C3H10T1/2间充质细胞中OPN-266构建物的转染显示当Smad1或Smad4表达质粒被共转染时，中等程度刺激了该报道活性。当将OPN-266报道构建物用ALK3(Q233D)、Smad1和Smad4表达质粒一起共转染时，显著增强了荧光素酶活性。另外，当过度表达Hoxc-8时，完全消除了ALK3(Q233D)诱导的转录活性。
为了进一步明确Hoxc-8结合位点的转录活性，将含有Hoxc-8结合位点的更短的骨桥蛋白启动子片段连接到在SV40启动子(Hox-pGL3)或tk最小启动子(Hox-tk)控制下的荧光素酶报道载体上。将Hox-pGL3构建物和ALK3(Q233D)或ALK6(Q203D)共转染入C3H10T1/2间充质细胞中，分别诱导了13-和11倍以上的荧光素酶报道活性。最重要的是，Hoxc-8的过度表达抑制了ALK3(Q233D)-诱导的或ALK6(Q203D)-诱导的报道活性。这些结果证明Hox结合位点介导了BMP信号传导，而Hoxc-8起了转录阻抑物的作用。最有趣的是，当Hox-tk构建物与Smad1、Smad4和组成性活化型IB BMP受体表达质粒(ALK6)一起被共转染入C3H10T1/2间充质细胞时，诱导的荧光素酶报道活性水平为20倍，表明Hoxc-8结合位点起了BMP-2/4反应性元件的作用。Smad1或Smad4表达质粒单独或与ALK6一起共转染，确实显著诱导了报道活性(图4B)。结果提示为了转位于核内，需要Smad4来与磷酸化的Smad1一起形成异源-寡聚物，而BMP-2/4通过Smad1与Hoxc-8蛋白相互作用，除去阻抑物Hoxc-8而激活基因转录。可能BMP-2/4通过除去Hoxc-8的转录阻抑来刺激间充质细胞分化成成骨细胞(图4C)。
为了证实是否Hoxc-8位点介导了BMP信号传导，将Hoxc-8结合位点的核心核苷酸从TAAT突变成GCCG而产生mHox-pGL3。该突变构建物的转染完全消除了ALK3(Q233D)-诱导的或ALK6(Q203D)-诱导的报道活性，并消除了C3H10T1/2细胞中的Hoxc-8抑制。这些结果确认了骨桥蛋白Hox结合位点是一种BMP反应性元件。
实施例15
MH1中的两个区域和Smad1接头对与Hoxc-8的相互作用的贡献
用双杂交研究在酵母中，用共免疫沉淀在哺乳动物细胞中，并在体外用折叠试验检测了Smad1和Hoxc-8之间的直接相互作用。为了测定介导蛋白-蛋白相互作用的区域，构建了一系列编码保守N-末端区域MH1(有(3-276)或无(1-169)接头(145-276))或保守C-末端区域MH2(有(145-466)或无(244-466)接头)的Smad1缺失。在酵母双杂交试验中测试了这些蛋白的结合。将野生型Smad1及其缺失突变体，以及空诱饵(对照，图5A)分别转化入含Hoxc-8捕获质粒的酵母细胞中，并测定了β-gal活性。携带MH1和/或接头域的野生型和突变体与Hoxc-8相互作用，并显示(与阴性对照比较)显著增加的β-gal活性，而单独的MH2域(276-466)不和Hoxc-8相互作用(图5A)。
先前，已显示Hoxc-8与衍生自骨桥蛋白启动子的23bp元件结合。凝胶移位试验显示，GST-Smad1融合蛋白以剂量依赖性方式抑制Hoxc-8与该元件的结合(Shi和Yang，1999)。如图6B所示，在细菌中表达了与GST融合的一套Smad1片段。在凝胶移位试验中分析了等量的纯化GST-Smad1野生型和截短的突变体(图6B)，对抑制Hoxc-8 DNA结合活性的区域进行作图。如图5C所示，由于加入了野生型Smad1(泳道5)和含有MH1(泳道5)或接头(泳道7)的突变Smad1，减弱了Hoxc-8的结合(泳道4)。在保留MH1和接头域的Smad1中观察到强烈的抑制(泳道6)。相反，当加入GST-MH2时，Hoxc-8的结合保持不变(泳道9)。注意，接头区对Hoxc-8结合DNA探针的抑制作用被MH2的存在所掩蔽(泳道8)。使用更小缺失的凝胶移位试验分辨出Smad1 MH1域和MH1-接头连接区中的两个与Hoxc-8相互作用的区域(148-191和101-145，图6B和C)(图6C，泳道11-16)。这两个片段都以剂量依赖性的方式抑制Hxc-8结合(图6D)。这些结果表明Smad1的N-末端中的这两个区域可说明Hoxc-8与其相关DNA元件结合的抑制。
实施例16
同源域负责Hoxc-8与Smad1结合
Hox蛋白具有普遍相似的同源域(HD)，含有高度保守的60个氨基酸的DNA结合基序(Sharley，等，1995)。除了在氨基酸(aa)149到209中的同源异型域处，Hoxc-8含有两个其它保守肽区域：一个八肽(aa1-8)和一个六肽(aa137-142)(Le Mouellic等，1988)。Leu-Met-Phe-Pro-Trp-Met六肽位于同源域的上游并被假定涉及与Hoxc-8辅助性辅因子相互作用(Phelan等，1995和Sharley等，1997)。最近的研究揭示Hoxb-1的五肽与其DNA结合伙伴，Pbx1蛋白之间直接接触(Piper等，1999)。
也用Hoxc-8捕获进行了缺失分析，以确定与Smad1结合的关键区域。将空捕获(对照，图6A)，Hoxc-8的全长形式，及其缺失突变体分别转化入含有Smad1诱饵质粒的酵母细胞，并随后分析了β-gal活性。图6A显示，当与阴性对照比较时，全长Hoxc-8(1-242)及其含同源域的缺失(137-242，151-242，和68-237)与Smad1的相互作用具有更高的β-gal活性。与全长Hoxc-8和含有氨基酸残基68-237的原始克隆(Shi和Yang，1999)的结合较强，表明HD以外的区域与相互作用有关。同源域的缺失消除了该相互作用，提示同源域可能直接涉及Hoxc-8-Smad1相互作用。aa1-8保守区(图6B中的CR1)和六肽(图6B中的HP)的缺失似乎不导致结合的显著下降。实际上，同源域单独(图6B，149-209)足够支持强相互作用。
为了确定同源域是与Smad1相互作用的区域，将编码同源域(149-209)或同源域与其C-末端侧翼序列(HDC，151-242，图6)的缺失子克隆入细菌表达载体，产生Hoxc-8融合蛋白的突变体。测试了Hoxc-8的含HD缺失突变体(图6B-D)在野生型或突变性Smad1存在下与DNA的结合。如图6D中所示，纯化的GST-HD和GST-HDC与DNA探针结合(分别是泳道4和9)。野生型Smad1(泳道5和10)和含有MH1和接头区的突变体(泳道6和11)抑制了结合，显示了对Hoxc-8结合的最强抑制(图9C，泳道7)。与用野生型Hoxc-8的凝胶移位试验相似，编码Smad1的MH1或接头部分(泳道7和8)的较小缺失也抑制了HDC的结合。令人感兴趣的是，只有编码氨基酸残基101-145(泳道12)的突变体抑制同源域的结合，但148-191(泳道13)不抑制，提示在Smad1-Hoxc-8相互作用中可能涉及一种以上的蛋白-蛋白接触。
实施例17
与Hoxc-8相互作用的两个Smad1功能域诱导了骨桥蛋白启动子活化
先前，已报道了Hoxc-8与266bp的骨桥蛋白启动子结合，并阻抑了报道基因转录(Shi和Yang等，1999)。在C3H10T1/2间充质细胞中Smad1、Smad4和BMPI型受体ALK3(Q233D)的组成性活化形式的共转染，诱导了报道基因转录。为了研究Smad1的Hoxc-8相互作用域的转录活性，将三个含有1或2个与核定位信号(NLS)融合的Hoxc-8相互作用域的cDNA片段克隆入CMV5B哺乳动物表达载体(图7A)。用含有氨基酸3-276(Smad1-NL)、145-276(Smad1-L)、或101-191(Smad1-M)和OPN-266(含有Hoxc-8结合位点的重组受体构建物)的Smad1表达质粒进行共转染(Shi和Yang等，1999)。全部三种含有1或两个Hoxc-8相互作用域的Smad1片段刺激了3-5倍的骨桥蛋白启动子活性(图7)。然而，Smad1M(aa101-191，缺失的Smad1)不能刺激启动子活性。因此，Smad1的Hoxc-8相互作用域模拟了BMP信号传导，并足够诱导基因转录。
实施例18
Smad1的Hoxc-8相互作用功能域诱导了骨细胞形成
为了测试是否Smad1与Hoxc-8之间的相互作用刺激成骨细胞分化，也将Smad1-NL、Smad1-L和Smad1-M克隆入四环素调控的表达系统。将这些质粒和对照载体永久性转染入2T3细胞(一种特性明确的成骨细胞前体细胞系)(Ghosh-Choudhury等，1996和Chen等，1998)。使用相应的cDNA探针，用狭线印迹和RNA杂交选出了5至10个四环素-调控的阳性克隆。图8B显示在三个克隆中，Smad1片段的表达受到四环素的调控。
碱性磷酸酶活性是骨形成的标志，而在祖细胞系中其活性的诱导标志着细胞进入成骨细胞谱系。通过撤除四环素，稳定表达Smad1-NL、Smad1-L或Smad1-M以时间依赖的方式有效刺激了碱性磷酸酶的活性，而在用pTet-Splice载体永久转染的对照细胞中碱性磷酸酶的活性保持不变(图9C)。最重要的是，在2T3细胞中，这些Smad1片段的稳定表达诱导了骨矿物化(图9D)。这些结构表明Smad1与Hoxc-8之间的相互作用引发了成骨细胞分化的全过程。
Hoxa-9蛋白也与骨桥蛋白Hox结合位点结合，而Smad1抑制其结合。已用酵母双杂交系统和凝胶移位试验对与Smad1相互作用的Hoxc-8该蛋白功能域进行了作图。Hoxc-8同源域，一个高度保守的DNA结合基序，与Smad1相互作用。这些结果提示Smad1可抑制大多数Hox和同源域蛋白与其DNA结合位点的结合。由于Hox和同源域蛋白均起了活化物和阻抑物的作用，取决于这些Hox和同源域蛋白的空间和时间表达以及相关启动子，BMP-2/4可以打开或关闭基因转录(图4D)。该精密的调控机制可解释为什么尚未确定BMP-2/4 DNA反应性元件的特征。因此，BMP-2/4可通过调节Hox或同源域蛋白与其DNA结合位点的结合来刺激间充质细胞分化。本发明证明了BMP诱导Smad1与Hoxc-8蛋白之间的相互作用，在前体细胞中刺激成骨细胞的分化。这些观察揭示了在胚胎骨骼发育中，BMP与Hox基因之间的作用和关系。
在本文中引用了下列参考文献：
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在本说明书中提到的任何专利或出版物表示本领域所在的本领域技术人员的水平。另外，这些专利和出版物以相同程度纳入本文，即各独立的专利和出版物是特意并独立的纳入本文作参考。
本领域技术人员容易理解，本发明非常适合实施目的并获得所述的结果和优点，而本文描述的代表性优选例的目的和方法、过程、处理、分子和具体的化合物，是示范性的，不是要限制本发明的范围。其改变和其它的用途对本领域技术人员是存在的，而且包含在权利要求范围确定的、本发明的精神中。
序列表
<110>Cao，Xu
Shi，xingming
Chang，Zhijie
<120>Hox和含有同源域的蛋白质结合的抑制及其用途
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<140>
<141>1999-04-05
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Claims (3)
1.一种在体外刺激成骨细胞分化和骨形成的方法，其特征在于，该方法包含步骤：
将编码Smadl的表达质粒转染入成骨细胞前体细胞，其中所述Smad1与Hoxc-8蛋白相互作用，抑制所述Hoxc8蛋白与含有Hoxc-8结合元件的基因的结合，从而刺激成骨细胞分化和骨形成。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有Hoxc-8结合元件的基因是选自骨桥蛋白，涎蛋白，骨粘连蛋白和骨钙蛋白。
3.一种体外诱导编码骨桥蛋白基因的方法，其特征在于，该方法包含步骤：
将编码Smad1的表达质粒转染入细胞，其中所述表达的Smad1与Hoxc-8蛋白相互作用，抑制所述Hoxc-8蛋白与所述骨基质蛋白基因的结合。
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