CN1146440C - 血管内皮生长因子-b - Google Patents

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Abstract

来自生长因子PDGF家族并具有促进血管内皮细胞有丝分裂和增殖性质的VEGF-B多肽，编码这些多肽的DNA序列，含有它们的药物组合物，以及与它们反应的抗体。所述的VEGF-B多肽可用于刺激血管生成以及用于诊断应用中。

Description

血管内皮生长因子-B
发明背景
血管生成，即从原有血管增殖新的毛细血管，是组织正常生长和发育所必需的基本过程，其是血管树的发育和分化以及各种基本生理过程如胚胎发生、体细胞生长、组织和器官修复和再生、黄体和子宫内膜的周期性生长和神经系统的发育和分化的先决条件。在女性生殖系统中，血管生成发生在发育的卵泡、排卵后的黄体以及怀孕的胎盘中。血管生成还作为机体修复过程的一部分而发生，例如在伤口愈合和骨折愈合中发生。血管生成还是肿瘤生长的因素，因为肿瘤必须持续刺激新的毛细血管的生长而生长。
毛细血管由内皮细胞和周皮细胞(pericyte)组成，这两种细胞携带了形成管、分支和整个毛细血管网的全部遗传信息。特定的血管生成分子可以起始这一过程。考虑到血管生成的生理学重要性，已做了很大的努力去分离、鉴别和纯化能刺激血管生成的因子。已纯化了许多刺激血管生成的多肽并鉴定了它们的分子特性、生化特性和生物学特性，这类血管生成调节剂的综述见Klagsbrun等人，“血管生成调节剂”，生理学年度综述53：217-39(1991)，以及Folkman等人，“血管生成”，生物化学杂志267：10931-934(1992)。最近的结果揭示了几种在血管系统的建立和保持中的内皮受体酪氨酸激酶(RTK)。
一种这类生长因子，其是高度特异的血管内皮细胞促分裂原，被命名为血管内皮生长因子(VEGF)，见Ferrara等人，“血管内皮生长因子多肽家族”，细胞生物化学杂志47：211-218(1991)；Connolly，“血管通透因子：血管功能的独特调节剂”，细胞生物化学杂志47：219-223(1991)。VEGF是一种强血管活性蛋白，其已在由许多细胞系如牛垂体滤泡细胞调节的培养基中检测到。VEGF是由两个24kD亚基组成的糖基化阳离子46-48kD二聚体，其被巯基还原剂失活，对酸性pH和加热有抗性并与固定化肝素结合。VEGF有时也称为血管通透因子(VPF)，因为皮内注射后它能增加血管的流体泄漏。它还被称为血管趋向蛋白(vasculotropin)。
已检测出四种不同的VEGF分子型，165个氨基酸类型的VEGF分子量约为46kD，其是在正常细胞和组织中发现的主要分子形式。还已知一种次丰富的较短的形式，其在116-159位缺失44个氨基酸(VEGF121)；一种较长的形式，其在116位插入了24个高度碱性的氨基酸残基(VEGF189)；以及另一种较长的形式，其带有一41个氨基酸的插入(VEGF206)，它包括了在VEGF189中发现的24个氨基酸插入。VEGF121和VEGF165是可溶性蛋白，而VEGF189和VEGF206似乎大多是细胞结合的。所有的VEGF同种型均是生物学活性的，例如，当皮下应用时，每种分子型均能诱导Evans蓝的外渗。
各种VEGF类型均由相同的基因编码并由信使RNA的不同剪接而得到，这一结论由人基因组DNA的Southern印迹分析得到支持，印迹分析显示使用针对VEGF165的探针或含VEGF206的插入的探针得到的限制图谱是相同的。分析推定的mRNA剪接区域的基因组克隆也显示与不同剪接一致的内含子/外显子结构。
VEGF的不同类型具有不同的化学性质，其可以调节细胞释放、区室化、生物应用性，并且还可能调节生长因子的信号性质。
对VEGF基因的核苷酸序列的分析显示VEGF是血小板衍生生长因子(PDGF)家族的一员。VEGF和PIGF是两种内皮RTK即flt-1(VEGF受体1，VEGFR1)和flk-1/KDR(VEGF受体2，VEGFR2)的配体。VEGF的氨基酸序列显示其与PDGF的A和B链的序列约有20％的同源性，以及在成熟PDGF两条链中发现的8个半胱氨酸残基的完全保守性。VEGF165、VEGF189和VEGF206在羧基末端区还含有另外8个半胱氨酸残基。VEGF的氨基端序列之前是对应于典型的信号序列的26个氨基酸。成熟蛋白直接由切除信号序列后产生，其不带任何间插序列原。在Asn74存在的潜在的糖基化位点与VEGF是一个糖蛋白的其它证据相一致，但是据报道该多肽即以糖基化形式又以去糖基化形式存在。
与其它细胞因子类似，VEGF根据发现其的特定生物学前后顺序可以有不同的作用。VEGF及其高亲和性受体flt-1和KDR/flk-1对于血管系统的形成和保持以及生理性和病理性血管生成是必须的。VEGF是强内皮细胞促分裂原并且在正常胚胎发育、伤口愈合和组织再生和重组过程中通过促进内皮细胞生长而在体内直接诱导血管生成。VEGF还涉及在病理过程中如实体瘤的生长和转移以及局部缺血诱导的视网膜疾病。VEGF的一个最重要的性质是其特异性。其在体外在1ng/ml时对于毛细血管内皮细胞和人脐静脉内皮细胞是促分裂性的，但是对于肾上腺皮质细胞、角膜或晶体上皮细胞、血管平滑肌细胞、角膜内皮细胞、粒细胞、角质形成细胞、BHK-21成纤维细胞、3T3细胞、大鼠胚胎成纤维细胞、人胎盘成纤维细胞和人肉瘤细胞却不是促分裂性的。因此，VEGF的靶细胞特异性仅限于血管内皮细胞。在角膜和愈合骨骼移植模型中，VEGF可以引起导致血管生成的一系列的事件并在体内刺激血管生成。其能够刺激从小血管和大血管中分离的内皮细胞的增殖。在卵巢黄体或在发育的脑中，VEGF mRNA的表达与毛细血管的生理性增殖在时间和空间上相关。VEGF的表达由供氧不足引发，因此内皮细胞增殖和血管生成似乎在局部缺血区域被特别刺激。VEGF还是单核细胞的强化学引诱物，另外，VEGF在内皮细胞中诱导纤溶酶原激活剂和纤溶酶原激活剂抑制剂。
肿瘤细胞释放血管生成分子如VEGF，抗VEGF的单克隆抗体已显示抑制某些类型的肿瘤如横纹肌肉瘤的生长，见Kim等人，“内皮生长因子诱导的血管生成在体内抑制肿瘤生长”，自然，362：841-844(1993)。这提示阻断VEGF作用对于治疗一般肿瘤，特别是高度血管化的攻击性肿瘤有潜在的治疗意义。
发明概述
本发明的一个目的在于提供一种新的具有促进内皮细胞增殖性质的生长因子。
本发明的另一目的在于提供编码一种新的促进内皮细胞增殖的生长因子的分离的DNA序列。
本发明的再一目的在于提供能用于诊断和/或治疗应用的新产物。
根据本发明，这些及其它目的通过提供编码具有下述特征性氨基酸序列(SEQ IDNO：16)并具有促进内皮细胞或中胚层细胞增殖特性的蛋白质的分离的DNA而达到，所述的特征性氨基酸序列为：
Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys所述的DNA选自图1和2的DNA(SEQ ID NO：1)、图3的DNA(SEQ ID NO：4)、图5的DNA(SEQ ID NO：6)、图7的DNA(SEQ ID NO：8)、图10的DNA(SEQ ID NO：10)、图12的DNA(SEQ ID NO：12)、图14的DNA(SEQ ID NO：14)，以及在严格条件下与至少一种上述DNA序列杂交的DNA。
根据本发明的其它方面，本发明的目的还通过提供具有下述特征性氨基酸序列并具有促进内皮细胞或中胚层细胞增殖特性的蛋白质而达到，所述的特征性氨基酸序列为：
Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys(SEQ ID NO：16)所述的蛋白质包括基本上与选自如下一组的氨基酸序列对应的氨基酸序列，所述的一组为图1的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)、图2的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)、图4的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)、图6的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)、图8的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)、图11的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)、图13的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)和图15的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。
根据本发明的其它方面，本发明的目的通过提供包括这种蛋白质的药物制备物而达到；以及通过提供与这种蛋白质反应或识别这种蛋白质的抗体而达到。
本发明的新的生长因子以下称为血管内皮生长因子B或VEGF-B，其与VEGF和胎盘生长因子(PIGF)具有紧密的结构相似性。所有的VEGF-B形式均含有如下特征性氨基酸序列：
Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys(SEQ ID NO：16)(其中Xaa代表可变的残基)，该序列是生长因子PDGF/VEGF家族的特征。这一特征性氨基酸序列可以在图4、6、8、11、13和15中的氨基酸70-82位发现。
本发明的临床应用包括诊断应用、在伤口愈合中加速血管生成以及抑制血管生成。对癌症活体检查样本中的VEGF-B的定量可以用作未来转移危象的指示。将VEGF-B制备物局部应用于慢性伤口可以加速血管生成和伤口愈合。VEGF-B可以以与VEGF类似的方式应用。
根据本发明的另外方面，本发明的目的可以通过提供典型地为试剂盒形式的诊断/预后工具。例如，在本发明的一个实施方案中提供了一种诊断/预后试剂盒，该试剂盒包括针对本发明的新的生长因子的抗体以及检测(更优选为评价)所述抗体与本发明的新的生长因子之间的结合的工具。在本发明的诊断/预后工具的一个优选实施方案中，抗体或新的生长因子是标记的，并且抗体或者新的生长因子是结合底物的，以便可以在抗体与生长因子结合后通过测定附着于底物的标记量来确定生长因子-抗体的相互作用。在本发明的一个特别优选的实施方案中，诊断/预后工具可以以常规的ELISA试剂盒的形式提供。
在另一个实施方案中，诊断/预后工具可以包括PCR工具，所述的PCR工具用于确定受试个体的VEGF-B基因的基因组序列结构，并将这一序列与本申请披露的序列对比以检测任何异常状态，从而确定是否VEGF-B的异常表达与给定的疾病状态相关。
本发明的再一方面涉及识别VEGF-B并被合适标记的抗体。
本发明的另一方面涉及提供一种包括VEGF-B或VEGF-B抗体的药物组合物，包括VEGF-B蛋白的组合物还可任选地包括VEGF或肝素或者两者都包括。
根据本发明的又一方面，提供了药物的制备，该药物包括VEGF-B蛋白和肝素用于治疗以缺乏血管生成或血管生成减少为特征的状态。
在另一方面，本发明涉及包括VEGF-B蛋白的蛋白二聚体，特别是二硫键键合的二聚体。本发明的蛋白二聚体包括VEGF-B蛋白的同二聚体和VEGF-B和VEGF的异二聚体。
根据本发明的再一方面，提供了一种用于促进VEGF和/或VEGF-B从细胞释放的方法，所述方法包括将表达一种或两种上述生长因子的细胞与肝素接触。
本发明的另一方面涉及提供一种载体，该载体包括与至少一部分本文披露的编码本发明的促进内皮细胞增殖的新的生长因子的DNA序列互补的反义核苷酸序列。根据本发明的再一方面，包括反义序列的这种载体可以用于抑制或至少降低VEGF-B的表达。当VEGF-B的表达与疾病相关时，例如当肿瘤产生VEGF-B以提供血管生成时，这种类型的载体在抑制VEGF-B的表达中的应用是有利的。用含反义核苷酸序列的载体转化这种肿瘤细胞将抑制或延缓血管生成，因此将抑制或延缓肿瘤生长。
附图简述
图1示出VEGF-B的(部分)cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)及由该cDNA的第一个读框编码的蛋白质区段的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)；
图2示出VEGF-B的(部分)cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)及由该cDNA的第二个读框编码的蛋白质区段的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)；
图3示出鼠VEGF-B167的全长cDNA克隆的编码区的核苷酸序列(SEQ IDNO：4)；
图4示出鼠VEGF-B167的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)；
图5示出VEGF-B174的cDNA克隆的编码区的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)；
图6示出VEGF-B174的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)；
图7示出VEGF-B112的cDNA克隆的编码区的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)；
图8示出VEGF-B112的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)；
图9示出mVEGF-B167、mVEGF-B164、hPlGF、mPDGF A和mPDGF B的氨基酸序列的对比；
图10示出人VEGF-B167的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)；
图11示出人VEGF-B167的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)；
图12示出鼠VEGF-B186的核苷酸序列(SEQ ID NO：12)；
图13示出鼠VEGF-B186的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)；
图14示出入VEGF-B186的核苷酸序列(SEQ ID NO：14)；
图15示出人VEGF-B186的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)；
图16示出鼠和人VEGF-B167和VEGF-B186的氨基酸序列的对比(SEQ IDNOS：5，11，13和15)；
图17示出小鼠和人的VEGF-B基因的示意性结构；
图18示出鼠VEGF-B167和VEGF-B186的亲水性分析；
图19示出生长因子VEGF/PDGF家族的系统发育分析；
图20示出对于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和牛毛细血管内皮(BCE)细胞由VEGF-B、VEGF和bFGF诱导的[3H]胸腺嘧啶的掺入；
图21是VEGF-B186转录物在几种小鼠和人组织中的表达的Northern印迹分析；
图22示出用鼠VEGF-B cDNA瞬时转染Cos-1细胞后对细胞培养基和去污剂溶解的细胞裂解物进行的免疫沉淀和SDS-PAGE分析的结果；
图23A示出对分别表达鼠VEGF-B186和人VEGF165的转染的Cos-1细胞的细胞培养基进行的免疫沉淀和SDS-PAGE分析的结果；
图23B示出对共表达鼠VEGF-B186和人VEGF165的Cos-1细胞的细胞培养基(M)和去污剂溶解的细胞裂解物(L)进行的免疫沉淀和SDS-PAGE分析的结果；
图23C示出对来自分别表达鼠VEGF-B186和人VEGF或同时表达两者的Cos-1细胞的细胞培养基以及来自模拟转染的对照细胞的细胞培养基进行的免疫沉淀和SDS-PAGE分析的结果；
图24是VEGF-B启动子-报道基因克隆的衍生示意图；以及
图25示出1.55kb长的人VEGF-B启动子片段的核苷酸序列(SEQ ID NO：17)。
优选实施方案的详细描述
因此本发明涉及新的血管内皮生长因子，以下称为VEGF-B生长因子，其具有VEGF的血管生成特性和其它特性，但是它在组织中的分布和表达与VEGF不同。
VEGF-B生长因子是血小板衍生生长因子家族的成员，并且是促进血管内皮细胞和/或中胚层细胞的有丝分裂和增殖的生长因子。它们通过与图1和2(SEQ IDNO：1)、图3(SEQ ID NO：4)、图5(SEQ ID NO：6)、图7(SEQ ID NO：8)、图10(SEQ ID NO：10)、图12(SEQ ID NO：12)或图14(SEQ ID NO：14)所示的任一种DNA序列相对应的或在严格条件下与之杂交的DNA序列的表达而产生。本发明的范围意在包括由在严格条件下与前述任一种DNA序列杂交的DNA序列编码的所有血管生成蛋白。合适的杂交条件包括，例如，50％甲酰胺、5×SSPE缓冲液、5×Denhardts溶液、0.5％SDS和100μg/ml鲑精DNA，42℃过夜，而后在55℃于2×SSC中洗2×30分钟。
本发明还涉及对应于前述任一种DNA序列或在严格条件下与前述任一种DNA序列杂交的分离的和/或纯化的DNA。
在另一方面，本发明涉及VEGF-B生长因子的抗体，特别是单克隆抗体。
据信VEGF-B蛋白与蛋白质酪氨酸激酶生长因子受体相互作用。这些受体的详情是本领域公知的(见，例如，Wilks，A.F.，“在发育、分化和癌症中的蛋白质酪氨酸激酶生长因子受体”，高级癌症研究60：43-73(1993))。
用Northern印迹分析测试了各种成年小鼠组织对于对应于VEGF-B的转录物的表达。mRNA的大小为1.3-1.4kb。用衍生自上述pPC67酵母表达载体的约0.9kbSalI/NotI片段探查小鼠多种组织Northern印迹(MTN，Clontech)。通过随机引导用32P-dCTP标记探针(比活为108-109cpm/μg DNA)。印迹在42℃用50％甲酰胺、5×SSPE缓冲液、2％SDS、10×Denhardts溶液、100μg/ml鲑精DNA和1×106cpm标记的探针/ml杂交过夜。在室温于含0.05％SDS的2×SSC中洗印迹2×30分钟，然后在52℃于含0.1％SDS的0.1×SSC中洗印迹2×20分钟。然后将印迹用增感屏于-70℃中曝光3天，使用Koda XAR胶卷。由目测检查胶卷确定的相对表达水平列于下表：
           表1VEGF-B转录物在成年小鼠中的分布
  组织 相对表达水平
  心脏 +++++
  脑 +++
  脾 (+)
  肺 ++
  肝 +
  骨骼肌 ++++
  肾 +++
  睾丸 (+)
+++++＝非常强的表达；++＝相对弱的表达；
++++＝强的表达；     +＝弱的表达；
+++＝中等的表达；    (+)＝非常弱的表达。
用鼠部分cDNA探查来自Clontech的人多种组织Northern印迹(MNT)以确定在各种人组织中的相对VEGF-B表达水平，转录物的大小为1.3-1.4kb，条件与上述用于鼠Northern印迹的条件相同。下表2列出了人Northern印迹的相对VEGF-B转录物水平，为了对比，表2还列出了来自各种文献中的VEGF在各种哺乳动物系统中的相对表达水平资料。
                            表2
    组织                   相对表达水平
   VEGF-B(Northern印迹)              VEGF(来自文献)
      人    人    鼠    豚鼠
心脏   +++++   ++   +++   +++
脑   +   +   +
胎盘   +
肺   +   ++++   ++
肝   (+)   ++   (+)   +
骨骼肌   ++++   +++   +
肾   +   ++   +   ++
胰   +++
脾   ++   -   +
胸腺   +   -
前列腺   +++
睾丸   ++   (+)
卵巢   +++   -
小肠   ++
结肠   +++
周围血白细胞   +
由表1和表2的比较可以看出鼠和人组织中VEGF-B转录物的表达水平相当类似，最高的表达水平均在心脏和骨骼肌中发现，在脑和肾中可以看出明显的差异。还应注意的是含高比例肌肉和上皮细胞的组织如前列腺、胰和结肠(它们会发生一些最常见的人肿瘤)表达相对高水平的VEGF-B。
人组织中VEGF和VEGF-B的相对表达水平的比较显示一些明显差异，VEGF在人心脏组织中表达很弱，但VEGF-B在同一组织中表达非常强，另一方面，VEGF在人肺组织中表达很强，但VEGF-B在人肺组织中只有弱表达。在相似的静脉中，人肝组织以中等强度表达VEGF，但VEGF-B仅微弱表达。这些数据证明尽管VEGF和VEGF-B有相似性，但是它们的作用并非完全相同。
VEGF-B转录物在小鼠和人组织中的表达还用Northern印迹进行了分析并与VEGF转录物的表达做了比较。将小鼠和人多种组织Northern(MTN)印迹(Clontech)与32P标记的小鼠VEGF-B探针(克隆pcif 2的约0.9kb SalI/NotI插入物)杂交，VEGF的表达用32P标记的VEGF165 cDNA作为探针进行分析。杂交在50％去离子甲酰胺、5×SSC pH7.0、1％SDS、5×Denhardt’s溶液和100μg/ml变性鲑精DNA中于42℃进行，在含0.5％SDS的2×SSC中于52℃洗滤膜2×30分钟，并用增感屏在-70℃将滤膜在柯达XAR胶卷上曝光2-5天。基本上按Korhonen等人，《血液》80，2548-55(1992)所述进行来自CBA小鼠的成年小鼠组织的原位杂交分析以及来自CBA和NMRI小鼠交配的胚胎的原位杂交分析。RNA探针(一个383bp反义探针和一个169bp有义探针)从含有衍生自pcif 2 cDNA克隆的440bp SalI/SacI片段的线性质粒产生。用T7和SP6 RNA聚合酶和[35S]UTP(Amersham Inc.)合成放射性标记的RNA。省略探针的碱裂解步骤。用苏木精负染。使用有义链和RNAse A处理的切片的对照杂交没有给出高于背景的信号。
在小鼠组织中，1.4kb VEGF-B转录物的最丰富表达在心脏、脑、骨骼肌和肾中检测到，主要3.7kb VEGF转录物在心脏、脑、肺、骨骼肌和肾中表达。在人组织中，1.4kb VEGF-B转录物和主要3.7kb及4.5kb VEGF转录物的最丰富表达在心脏、骨骼肌、胰和前列腺中检测到。因此，尽管存在明显的数量差异，但是看起来VEGF-B和VEGF在许多人和小鼠组织中共表达。
还在成年小鼠心脏和骨骼肌切片以及早期(E 10)小鼠胚胎切片中通过原位杂交检测了VEGF-B转录物的表达。在成年心脏中，VEGF-B转录物主要在心肌中表达，而在动脉平滑肌中未检测出特异信号。在成年横纹肌中，VEGF-B转录物由一些肌纤维表达，而其它一些肌纤维似乎缺乏该转录物。在E 10小鼠胚胎中，VEGF-B转录物主要在发育的心脏中检测到。成年小鼠心脏的心肌有一强信号。在横纹肌中，VEGF-B的表达在肌纤维亚群中可见，在E10小鼠胚胎的发育的心脏中也得到强信号。其它胚胎结构中VEGF-B转录物的表达水平较低或检测不到。总之，这些试验示出VEGF-B转录物主要在肌肉组织中表达。VEGF-B尤其在心脏和骨骼肌中丰富并在这些组织和其它组织中与VEGF共表达。在转染的细胞中，当共表达时VEGF-B与VEGF形成结合在细胞表面的、二硫键键合的同二聚体和异二聚体。使用VEGF-B186特异探针对几种小鼠和人组织中表达的VEGF-B186的Northern印迹分析示于图21。
VEGF-B基因的染色体位置通过体细胞杂合子的Southern印迹分析和聚合酶链反应分析和中期染色体的荧光原位杂交(FISH)确定。发现VEGF-B基因位于染色体11q13，与细胞周期蛋白D1基因相邻。另人感兴趣的是尽管细胞周期蛋白D1基因在一些人癌症中扩增，但在含有扩增的细胞周期蛋白D1的几种哺乳动物癌细胞系中未见VEGF-B基因扩增。然而，VEGF-B基因中的突变可能与血管畸形和/或心血管疾病有关。
除非另有说明，下述实施例使用Ausubel等人(编辑)，分子生物学方法，JohnWiley & Sons，纽约(1992)中公开的标准分子生物学技术和程序。
实施例1    带有两个读框的部分cDNA克隆
如下所述鉴定一个编码鼠VEGF-B的部分cDNA克隆。使用如Gyuris J.，GolemisE.，Chertkov H.和Brent R.，“Cdi1，一种与Cdk2结合的人G1和S期蛋白磷酸酶”，细胞75：791-803(1993)中所述的酵母两杂合子相互作用捕获筛选技术从一个cDNA文库(E14.5)中筛选可能与细胞视黄酸结合蛋白I型(CRABP-I)强相互作用的细胞蛋白，该cDNA文库衍生自从14.5天的小鼠胚胎分离的聚A+mRNA[Chevray P.和Nathans D.，“酵母中的蛋白相互作用克隆：与亮氨酸拉链Jun反应的哺乳动物蛋白的鉴定”，美国国家科学进展89：5789-93(1992)]。这一筛选技术涉及一种含有一个已知是转录惰性的结合域(“诱饵”(bait))的融合蛋白；没有本底转录并结合诱饵的报道基因；以及一个编码以嵌合体表达的蛋白的表达文库，所述蛋白的氨基端含有一个活化域和其它有用的基序(“上钩者”(prey))。这一筛选的文库是在酵母表达载体pPC67(得自约翰霍普金斯大学医学院的Pierre Chevray博士，725 North Wolfe St.，Baltimore，MD 21205)中的14.5天小鼠胚胎质粒文库。筛选中得到一个阳性cDNA克隆(pcif-2)，用熟知的常规技术对该阳性克隆测序，发现其编码与VEGF和PDGF家族生长因子其它成员高度同源的蛋白。将质粒pPC67中的这一约0.9kb SalI/NotI插入片段克隆到pBluescript中并用T7和T3载体引物及内部引物进行全测序，pBluescript质粒商购自Stratagene Inc.，LaJolla，加利福尼亚。发现该cDNA插入片段为886bp长，编码位于不同读框中的两个多肽，这两个多肽分别与VEGF的N末端和C末端同源。这一新的生长因子以下称为VEGF-B，这一克隆是部分的，缺少氨基末端区的几个氨基酸和整个信号序列。
图1示出这一VEGF-B部分cDNA克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)及其第一个读框编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。图1的DNA序列由在酵母表达载体pPC67中的克隆(pcif-2)的常规测序得到。这一克隆包含886碱基对并编码鼠VEGF-B的一部分。
分离的cDNA序列将与含VEGF-B基因的哺乳动物基因组DNA例如鼠或人的基因组DNA杂交。除了编码序列，基因组DNA还含有指导VEGF-B在一或多种特异组织中表达的一或多个启动子序列，因此，VEGF-B的编码序列可以与肌肉特异性启动子元件相连，该启动子元件特异于某些类型的肌肉纤维。
该核苷酸序列在两个不同的读框中翻译成两个不同的氨基酸序列。在编码序列的碱基对309-311处有一终止密码子(TGA)，因此，VEGF-B有几种剪接变异体。克隆的cDNA序列的5’末端编码与VEGF、PIGF、PDGF A和B的N-末端区显著同源的102个氨基酸长的蛋白。特别是，在这一族蛋白中有几个半胱氨酸残基是完全保守的。除了核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，图1还示出了此第一个蛋白的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。
在一不同读框中的此cDNA的C末端(碱基对308-475)的翻译产生一个与VEGF165、VEGF189和VEGF206的C末端部分高度同源的蛋白质。图2又示出了图1的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)，但是其示出了第二种蛋白的推导的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)，该蛋白是在第二个读框中编码并且为54个氨基酸长。因此，看起来VEGF-B基因使用初级转录物的不同剪接编码不同的蛋白质。该克隆的编码第二个肽的最后一部分可以作为VEGF-B其它剪接变异体中的功能蛋白表达。
上述蛋白可以与另外约5-10个氨基酸的N-末端序列以及约21-28个氨基酸的前导序列结合存在。因为这种结合的氨基酸序列显示促进内皮细胞的增殖的特性，并且编码这种结合的肽序列的DNA序列将在严格条件下与图1和2的DNA序列杂交，所以这种氨基酸序列和编码其的DNA属于本发明的范围。
实施例2    克隆小鼠VEGF-B的全长cDNA
使用实施例1中鉴定的cDNA克隆的约0.9kb SalI/NotI cDNA插入片段作为探针，通过标准技术筛选得自Stratagene Inc.，La Jolla，加利福尼亚的成年小鼠心脏λZAP-IIcDNA文库。如所建议的滴定文库并铺板，制备滤膜。在50％甲酰胺、5×SSPE、5×Denhardt’s溶液、1％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中于42℃进行预杂交后，在相同温度和含变性放射标记探针的相同溶液中以106cpm/ml杂交溶液杂交滤膜，探针用随机引物试剂盒(Amersham)标记，16小时后在含0.5％SDS的2×SSC中于52℃洗滤膜2×30分钟，用增感屏在-70℃使滤膜曝光过夜。阳性克隆再重新筛选两次，直至一个板上的所有空斑均为阳性。如厂商建议通过体内切割将来自几个阳性克隆的插入片段亚克隆入质粒pBluescript SK+。
几个克隆经限制酶分析作图发现分属两个不同的组，以Spe1/BamH1限制片段的长度为特征，第一组包括3个限制作图克隆，每个具有240bp Spe1/BamH1限制片段，另一组包括一个克隆，其具有340bp Spe1/BamH1限制片段。这一片段的分析见实施例5。
对显示240bp Spe1/BamH1限制片段的三个克隆进行完全或部分测序(测序酶2.0，美国生物化学品公司)，这些克隆的特征总结如下：
核苷酸序列分析揭示虽然长度不同但有两个cDNA克隆基本上是相同的，并且一个具有一突变。其中一个克隆是全长的且含有一个编码188个氨基酸残基(其中前21个氨基酸是可裂解信号序列)的开放读框，两个基本上相同的克隆的另一个在起始密码子的G处终止。这可以从对另外的G前序列为ACCAT的克隆的序列分析中推断出。两个克隆发现具有相同的编码区核苷酸序列，见图3所示(SEQ ID NO：4)，该图省略了在分离的克隆中不存在的起始密码子(TAG)中的开头的胸腺嘧啶和腺嘌呤。这两个cDNA克隆的编码区的开放读框的推导的氨基酸序列示于图4(SEQ IDNO：5)，由这一序列编码得到的蛋白以下称为VEGF-B167。在本文所用的蛋白质名称中，下标的数字代表没有信号序列的成熟蛋白中的氨基酸数。
如所预期的，由这两个克隆编码的氨基酸序列与实施例1的cDNA克隆推导的部分氨基酸序列的对比显示出惊人的相似性。然而，实施例1的克隆的两个开放读框，每个编码与VEGF的不同部分同源的氨基酸序列，在实施例2的这两个克隆中的同一读框中同时存在。实施例1的克隆的移码是由插入两个另外的腺嘌呤单位导致的，这两个腺嘌呤使实施例1的克隆的C末端移出读框。这种情况的原因目前尚未清楚，但是可能是由于克隆假象所致。
除了一个21bp插入外，第三个克隆的编码部分具有与前两个克隆相同的核苷酸序列，图5示出此第三个克隆的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)，为便于识别，该21个多出的碱基在图中以下划线示出，这一插入使成熟蛋白多出7个氨基酸残基。因此，由此较长cDNA编码得到的蛋白命名为VEGF-B174。由图5的cDNA编码的蛋白的氨基酸序列示于图6(SEQ ID NO：7)，图中为便于识别所述的7个多出的氨基酸也以下划线示出。该多出的氨基酸插入到剪接位点的序列中，并且对小鼠基因组DNA克隆的测序表明这些多出的氨基酸是正确可变剪接的结果。另外，基于已知的PDGF受体结合位点的位置，该插入在蛋白中的位点可能是受体结合位点部分。因此，该插入可能影响受体结合比能在影响刺激剂和/或不同受体的特异性中有重要作用。
实施例3  杂交体cDNA克隆
如前所述，实施例1的原始cDNA克隆不是全长的并可能含有假象。然而，如果加入编码VEGF-B167和/或VEGF-B174的克隆的最5’端核苷酸序列，则开放读框编码133个氨基酸的蛋白质，产生112个氨基酸的成熟蛋白，因此命名为VEGF-B112。编码VEGF-B112的杂交体cDNA序列(SEQ ID NO：8)示于图7，其对应的蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)示于图8。
图9示出用于比较目的的多氨基酸序列对比，其中有小鼠血管内皮生长因子B的167个氨基酸变异体(mVEGF167)、小鼠血管内皮生长因子(mVEGF164)、人胎盘生长因子(hPlGF)、小鼠血小板衍生生长因子A(mPDGF A)以及小鼠血小板衍生生长因子B(mPDGF B)，与小鼠VEGF-B167相同的氨基酸残基以方框框起。这些序列的同源性关系是明显的，图中清楚地示出属于生长因子PDGF/VEGF家族的生长因子的保守结构，并且证明VEGF-B是这一族的其它生长因子的结构同源体。氨基酸序列的配对比较示出小鼠VEGF-B与小鼠VEGF-B167有约43％的相同性，与人PlGF有约30％的相同性，与小鼠PDGF A和B有约20％的相同性。尤其应注意保守的半胱氨酸残基，可以看出五个生长因子的N-末端区域(即类PDGF区域)中的头八个半胱氨酸在这一家族的所有成员中是共享的，因此证明涉及分子内和分子间二硫键结合的这八个半胱氨酸残基在这些生长因子中是不变的。另外，小鼠VEGF-B167和VEGF164的C-末端区域也有八个另外的保守半胱氨酸残基和几个碱性氨基酸序列段的显著的相似性。
实施例4  人VEGF-B cDNA的克隆
根据标准程序，用小鼠VEGF-B克隆pcif 2的约0.9kb插入片段筛选在λgt11中的人纤维肉瘤cDNA文库HT1080(Clontech)的106个λ克隆。在几个阳性克隆中，对一个命名为H.1的克隆进行更仔细的分析，并测定其核苷酸序列，核苷酸序列示出其编码207个氨基酸形式的人VEGF-B。对这一同种型的分析在实施例6中有描述。基于H.1序列设计了两个寡核苷酸用于扩增对应于小鼠VEGF-B167同种型的推定的人cDNA的整个编码区，这两个寡核苷酸是：
5’-CACCATGAGCCCTCTGCTCC-3’ (正向)(SEQ ID NO：18)
5’-GCCATGTGTCACCTTCGCAG-3’ (反向)(SEQ ID NO：19)这些寡核苷酸用于经聚合酶链反应(PCR)扩增来自寡-dT引导的人红白血病细胞(HEL)RNA的人VEGF-B的整个编码区。将扩增产物克隆进TA克隆试剂盒(Invitrogen)的pCR II载体中并用标准技术测序，人VEGF-B cDNA克隆的核苷酸序列示于图10(SEQ ID NO：10)，人VEGF-B167的推导的氨基酸序列如图11所示(SEQ ID NO：11)。
实施例2的全长小鼠cDNA克隆和实施例4的全长人cDNA克隆均编码含N末端疏水推定信号序列的188个氨基酸多肽。与VEGF类似，信号肽酶裂解位点据信位于Ala 21和Pro 22之间，信号肽酶的推定裂解位点在图16中以箭头示出。因此，这两个克隆的加工后的VEGF-B多肽含有167个氨基酸。
实施例5
分析了具有实施例2分离的340bp Spe1/BamH1片段的克隆，发现其主要部分与具有240bp Spe1/BamH1片段的实施例2的前两个克隆相同，这一差异是由在序列的C末端部分有一插入存在所致。
这一340bp Spe1/BamH1 DNA片段编码含有207个氨基酸的另一小鼠VEGF-B同种型，编码这一蛋白的DNA编码部分(SEQ ID NO：12)示于图12，其翻译的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)示于图13。在切除21个氨基酸的前导序列后，成熟蛋白含有186个氨基酸并称为mVEGF-B186。这一同种型很明显是另外的DNA剪接的结果，如参照图17如下所述。
实施例6
发现如实施例4所述分离的H.1克隆编码人VEGF-B的207个氨基酸的同种型，编码这一蛋白的DNA编码部分(SEQ ID NO：14)示于图14，其翻译的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)示于图15。同样，这一称为hVEGF-B186的同种型似乎也是另外剪接的产物。
实施例5的mVEGF-B186和实施例6的hVEGF-B186在VEGF-B167编码序列的核苷酸414和415之间均包括一101bp的插入，插入后，这些cDNA克隆的核苷酸序列与对应的VEGF-B167序列相同。101bp插入的位置对应于VEGF中的外显子5-外显子6交界处，插入导致移码，使两个VEGF-B同种型的C末端区域完全不同。
起自SEQ ID NOS 11和15(这两个序列分别对应于两个主要的VEGF-B同种型，VEGF-B167和VEGF-B186)的氨基酸116的C末端氨基酸序列的不同反应在这两个同种型的不同的生物化学特征上。VEGF-B167的C末端区域呈强碱性(净电荷+13)并结合肝素，而VEGF-B186的C末端区域呈弱碱性(净电荷+5)并在其C末端有一段长疏水性氨基酸残基。VEGF-B186的疏水尾不会起转膜功能区的作用因为VEGF-B的这一变异体是从细胞中分泌的。因此，尽管N末端功能区相同，但是VEGF-B的这两种同种型具有非常不同的生物化学性质。VEGF-B186缺少强碱性肝素结合区使得蛋白能从细胞中自由分泌，然而，VEGF-B186的分泌是非常慢的，在使用转染细胞的脉冲追踪实验中，1个小时前在培养基中未发现VEGF-B186同二聚体。相反，在30分钟内VEGF同二聚体和VEGF-B186·VEGF二聚体就出现在培养基中。
图16示出以单字母代码表示的小鼠和人VEGF-B167和VEGF-B186的氨基酸序列对比(SEQ ID NOS：5、11、13 & 15)，相同的残基由方框框起，框外的是在小鼠和人VEGF-B167和VEGF-B186同种型之间不同的氨基酸残基。小鼠和人VEGF-B显示约88％的氨基酸序列同一性，并且特别是在C末端区是强碱性的。小鼠和人VEGF-B186的C末端区在氨基酸水平约85％相同。两种多肽均缺少用于N连接的糖基化作用的共有序列(N-X-T/S)。箭头示出在Ala21和Pro22之间的推定的信号肽酶裂解位点。除去信号序列，小鼠和人VEGF-B167氨基酸序列是高度同源的，在167个残基中仅有20个置换，置换集中在N末端，在氨基酸60和145两个区域内。在两种VEGF-B167蛋白的所有半胱氨酸残基均是不变的，但在VEGF-B167 C末端的8个半胱氨酸残基在VEGF-B167同种型中不是保守的。应注意的是，在残基66和129之间区域的小鼠和人序列除了一个进化保守的替换(Q105R)外均是相同的，这一点很重要，因为发现受体结合区在蛋白的这一部分(对比PDGF结构)，由此可推断在受体水平小鼠和人VEGF-B可能会显示交叉反应结合，因此显示相同或相似的生物学活性。
实施例7    小鼠和人的VEGF-B基因的外显子-内含子结构
通过限制作图和对采用人基因组DNA为模板的PCR反应得到的克隆PCR片段的核苷酸序列分析确定人VEGF-B基因的结构，但是第一个外显子和内含子是从基因组λ-克隆鉴定。小鼠基因的结构是通过限制作图和对使用不同引物组合扩增的克隆PCR片段的核苷酸序列分析而确定，在这些PCR扩增中使用一个含有整个小鼠VEGF-B基因的分离的λ克隆作为模板。
程序
如厂商建议从129/SwλFIX基因组文库(Stratagene，Inc.)中分离用于小鼠VEGF-B基因的几个λ克隆。使用pcif2 cDNA的为VEGF-B的约0.9kb SalI/NotI插入片段(SEQ ID NO：1)作为探针。从平板裂解物中分离几个阳性克隆的λDNA。其中一个阳性λ克隆(克隆10)作为BamH1片段亚克隆进pBluescript SK(Stratagene Inc.)，从此相同克隆中分离的DNA也用作PCR反应中的模板(100ngλDNA/反应)，用引物的不同组合扩增小鼠VEGF-B的编码部分。这些引物的核苷酸序列衍生自编码鼠VEGF-B167和鼠VEGF-B186的cDNA克隆。使用Taq DNA聚合酶(2.5U/反应)。产生的PCR片段直接克隆进TA-克隆载体pCR II(Invitrogen Inc.)。通过对亚克隆的BamH1基因组片段和克隆的PCR产物的核苷酸序列分析推出小鼠VEGF-B的外显子-内含子结构。
使用跨越人VEGF-B cDNA 5’序列的90bp PCR片段作为探针，在高度严格条件下通过筛选在EMBL-3 SP6/T7中的人基因组文库(Clontech)的1×106个克隆分离人基因组λ克隆。洗涤条件为：一次在1×SSC中室温洗30分钟，二次在1×SSC中65℃洗30分钟。PCR的引物为：
5’-CACCATGAGCCCTCTGCTCC-3’(正向)(SEQ ID NO：18)以及
5’-GGGCATCAGGCTGGGAGACAG-3’(反向)(SEQ ID NO：19)。阳性λ克隆作为SacI片段亚克隆进pGEM 3Z载体(Promega)并发现其携带该基因的5’区。人VEGF-B基因的其余部分用基因组DNA作为模板经PCR扩增，使用源自人cDNA序列的引物的不同组合，并使用Dynazyme DNA聚合酶(2.5U/反应，Finnzymes)。扩增的PCR片段直接克隆进TA-克隆载体pCR II(Invitrogen Inc.)。通过使用载体特异性引物或源自cDNA序列的合适引物进行核苷酸序列分析来确定外显子-内含子交界和小鼠和人VEGF-B基因的短内含子的长度。较大内含子的长度基于用琼脂糖凝胶电泳分析的扩增PCR片段的长度而计算。
结果
结果显示小鼠和人VEGF-B基因的编码部分跨越约4kb DNA，两个基因均分为长度从19bp(E7)至236bp(E6)的7个编码外显子。图17是小鼠和人VEGF-B基因结构的示意图，以碱基对表示大小的外显子框于框中，内含子的大小在框与框之间注明，内含子并非按比例尺示出，小鼠和人VEGF-B基因的非翻译侧翼区结构未确定并用灰框表示。两个基因中的外显子-内含子交界列于下表3：
                                       表3
    外显子长度              供体位点  内含子长度(bp) 受体位点
小鼠
E1             60   T CGC ACC CAG/gtacgtgcgta Arg Thr Gln     ≈590     tttcccacag/GCC CCT GTG TAla Pro Val S
E2             43   CAG AAG AAA G/gtaataatagGln Lys Lys V     287     ctgcccacag/TG GTG CCA TGal Val Pro Tr
E3             197   C CGA ATG CAG/gtaccagggcl Arg Met Gln     161     ctgagcacag/ATC CTC ATG AIle Leu Met I
E4             74   GT GAA TGC AG/gtgccagccays Glu Cys Ar     178     ctcctcctag/G GTT GCC ATAg Val Ala Ile
mVEGF-B186
E5             36   AG CCA GAC AG/gtgagtttttys pro Asp Ar     ≈200     ctcctcctag/G GTT GCC ATAg Val Ala Ile
E6A            211  外显子6中的终止密码子(TAG)     ---     ----------------
mVEGF-B167
E5             36  AG CCA GAC AG/gtgagtttttys Pro Asp Se     ≈300     cccactccag/C CCC AGG ATAr Pro Arg Ile
E6B            135  AC ACC TGT AG/gtaaggagtcsp Thr Cys Ar     ≈2.6kb     cactccccag/G TGC CGG AAGg Cys Arg Lys
E7             19  外显子7中的终止密码子(TGA)     ---     ----------------
人
E1             60   C CCC GCC CAG/gtacgtgcgga pro Ala Gln     ≈760     tctcccacag/GCC CCT GTC TAla Pro Val S
E2             43   CAG AGG AAA G/gtaatacttaGln Arg Lys V     275     ctgctcccag/TG GTG TCA TGal Val Ser Tr
E3             197   C CGG ATG CAG/gtactgggcal Arg Met Gln     244     ctgagcacag/ATC CTC ATG AIle Leu Met I
E4             74   GT GAA TGC AG/gtgccagccays Glu Cys Ar     ≈710     tacttttcag/A CCT AAA AAAg Pro Lys Lys
hVEGF-B186
E5             35   AG CCA GAC AG/gtgagtctttys Pro glu Ar     200     tcctccctag/G GCT GCC ACTg Ala Ala Thr
E6A            211   外显子6中的终止密码子(TAG)     ---     ----------------
hVEGF-B167
E5             36   AG CCA GAC AG/gtgagtctttys Pro Glu Se     ≈300     cccactccag/c CCC AGG CCCr Pro Arg Pro
E6B            135   AC ACC TGC AG/gtaggtttggsp Thr Cys Ar     736     ccctcctcag/G TGC CGG AAGg Cys Arg Lys
E7             19   外显子7中的终止密码子(TGA)     ---     ----------------
如前所述，外显子6含有一另外剪接受体位点，其使基因产生两种不同的转录物对应于不同的VEGF-B同种型。VEGF-B167使用外显子1-5，外显子6的最后部分以及外显子7(TGA)；VEGF-B186使用外显子1-5，外显子6的第一部分并在外显子6的最后部分终止(TAG)。在VEGF-B186中外显子7不翻译，因为外显子6的第一部分的插入产生了移码并在外显子6的最后部分产生了终止密码子，VEGF-B186的终止密码子(TAG)的位置在外显子6B中标出，VEGF-B167的终止密码子(TGA)的位置在外显子7中标出。
两个基因中的内含子从161bp至约2.6kb不等，在两个基因中每个外显子的长度以及剪接交界位置是相同的，所有剪接供体和受体位点均遵循不变的GT/AG规则，见Padgett等，生物化学年度综述，55：1119-50(1986)。在小鼠和人的基因中的唯一不同是小鼠基因中内含子1、4和6的长度较长。发现所有外显子-内含子交界处在VEGF-B和VEGF之间是保守的，但是VEGF-B基因中的内含子通常比VEGF基因中的内含子小。
VEGF-B中的外显子5之后的300bp内含子与VEGF中对应的内含子不同，其长度为3kb并含有在VEGF189和VEGF206转录物中发现的另外剪接的外显子，编码许多碱性氨基酸残基。当更仔细地分析VEGF-B中的这一内含子时，未能发现对应于VEGF第6个外显子的外显子，相反，发现这一内含子的3’末端以及随后的外显子与编码VEGF186的cDNA克隆的相应序列相同。这一点可用下列事实解释，即VEGF-B186的mRNA是在mRNA剪接过程中由另外剪接受体位点形成的，在这些mRNA中产生101bp内含子的插入。
图18示出鼠VEGF-B167和VEGF-B186的对比亲水性分析，该曲线是通过使用9个残基的序列窗根据Kyle和Dolittle而产生的。正如所预期的，亲水性/疏水性模式从氨基酸1至氨基酸115基本上是相同的，氨基酸115之后，亲水性/疏水性模式发生变化，这是因为通过插入外显子6的第一部分而发生了移码。因此，可以预期VEGF-B167和VEGF-B186及显示相似活性又显示不相似活性。
图19是显示生长因子VEGF/PDGF家族的5个成员的氨基酸序列的系统发育关系的枝杈图，图中由左至右置换或取代数逐渐下降。可以看出VEGF-B位于VEGF和血小板衍生生长因子(PDGF)之间。
图9和图16的多个氨基酸序列对比以及图19的系统发育分析是根据Hein，酶学方法，183卷，626-45页，学术出版社公司，圣地亚哥(1990)所述用PAM250距离图(distance table)进行。
实施例8  抗体产生
a.针对小鼠VEGF-B的抗血清
用与匙孔嘁血蓝蛋白偶联的、包含加工的VEGF-B的N-末端区域的18聚体寡肽免疫兔而产生针对小鼠VEGF-B的抗血清。使用SPDP(Pharmacia)引入半胱氨酸残基作为N-末端和C-末端残基以使肽与载体蛋白偶联，寡肽的序列为
      C-P-V-S-Q-F-D-G-P-S-H-Q-K-K-V-V-P-C(SEQ ID NO：21)每只兔皮下注射300μg用弗氏完全佐剂乳化的肽缀合物，每两个星期给予等量的用弗氏不完全佐剂乳化的抗原进行皮下加强免疫注射。第二次加强免疫注射后取血清。
b.针对人VEGF-B的抗血清
用包含下列N-末端区氨基酸残基序列(SEQ ID NO：22)的分支23聚体寡肽免疫兔制备针对人VEGF-B的抗肽抗血清，所述的序列为：
S-Q-P-D-A-P-G-H-Q-R-K-V-V-S-W-I-D-V-Y-T-R-A-T分支23聚体寡肽根据Tam，“合成肽疫苗设计：高密度多抗原肽系统的合成和性质”，美国国家科学进展，85卷，5409-413(1988)所述合成。在第一次免疫中，对兔皮下注射500μg用弗氏完全佐剂乳化的分支肽，在随后的加强免疫中，注射200μg用弗氏不完全佐剂乳化的抗原。在第二次和第三次加强免疫后用常规技术收集抗血清。
实施例9    VEGF-B167的生物化学性质、同二聚化以及与VEGF的异二聚化
在转染的人胎肾293EBNA细胞(Invitrogen，Inc.)中检测人VEGF-B167的生物化学性质。将编码人VEGF-B167和人VEGF165(见Keck等，科学，卷246，1309-312(1989))的cDNA插入片段分别克隆到pREP7表达载体(Invitrogen，Inc.)中，用磷酸钙沉淀法用各表达质粒经瞬时转染法而转染人胎肾293EBNA细胞(表达Epstein-Barr病毒核抗原-1)，并温育细胞48小时，作为对照，细胞还用含反向VEGF-B167 cDNA的表达载体转染。细胞单层在不含甲硫氨酸和不含半胱氨酸的培养基中温育30分钟，然后在相同培养基中用100μCi/ml[35S]甲硫氨酸和[35S]半胱氨酸(Promix，Amersham Inc.)标记细胞2小时。标记培养基用无血清的正常培养基替换，并追踪标记蛋白6小时，当有说明时在追踪中加入肝素(100μg/ml)。追踪期后收集培养基，将细胞溶于10mM Tris pH7.5，50mM NaCl，0.5％去氧胆酸钠，0.5％Nonidet P-40，0.1％SDS和0.1U/ml抑蛋白酶。
VEGF-B167在用含VEGF-B167 DNA的质粒转染的细胞中表达。将来自用肝素处理或未处理的细胞的培养物上清以及去污剂溶解的细胞裂解物的等份与实施例8得到的针对VEGF-B的特异抗肽抗血清进行免疫沉淀，并且除非另有说明在还原条件下用SDS-PAGE分析。数据显示，VEGF-B167同二聚体和VEGF-B167-VEGF165异二聚体通过肝素从细胞中释放出。通过肝素处理(1-100μg/ml)或1.2MNaCl处理，VEGF-B167从细胞中释放并在上清中发现。如果细胞未用肝素处理，VEGF-B167仍是细胞结合的并且未释放到培养基中。在相同条件下，不经肝素处理VEGF165同二聚体即从细胞中分泌并在培养物上清中发现。
在还原条件下，人VEGF-B167以Mr(分子量)为21kDa迁移。在非还原条件下对培养物上清的分析显示VEGF-B167以Mr为42kDa迁移，提示为二聚体结构。这些结果提示VEGF-B167可能通过与胞外硫酸乙酰肝素蛋白聚糖的离子相互作用而形成与细胞表面结合的二硫键键合的二聚体。这种结合易被C-末端碱性功能区调节，正如在较长的VEGF变异体中观察到的。
因为已显示VEGF可与PIGF形成异二聚体，决定测试是否VEGF165也能与VEGF-B167形成异二聚体。为此目的，用编码人VEGF165和人VEGF-B167的表达载体共转染293EBNA细胞，并使VEGF-B167和VEGF165联合表达。在肝素存在下追踪代谢标记的蛋白，并与针对VEGF-B167或VEGF165的抗血清进行免疫沉淀，针对人VEGF的抗血清来自R & D Systems。在非还原条件下，VEGF-B167·VEGF165异二聚体以Mr为42-46kDa迁移。结果显示VEGF-B能与VEGF形成二硫键键合的异二聚体，该异二聚体在肝素不存在时是细胞结合的。因为VEGF165同二聚体能有效地分泌到培养基中，因此VEGF-B似乎决定异二聚体的分泌。
VEGF-B在源细胞的内质网中正常合成并随后输出。重组VEGF-B的生产可如下进行：将编码VEGF-B蛋白的DNA序列与合适的可操纵连接的启动子和调控序列-起插入合适的载体，如公知的质粒pBR322或其衍生物，用得到的载体或现有技术中公知的其它系统转化或转染合适的宿主细胞如E.coli或Cos细胞，筛选表达VEGF-B的转化子或转染子，然后培养VEGF-B表达呈阳性的细胞系或细菌细胞菌株。根据待转化或转染的细胞类型可使用真核载体或原核载体。生产重组VEGF-B的特别优选的系统是杆状病毒-昆虫细胞系统，已证明其能以非常高的产率生产重组蛋白。
实施例10  用杆状病毒系统表达VEGF-B
10.1带有其本身信号肽的VEGF-B
a)克隆和转染
将完整的人VEGF-B167基因插入商购质粒pCRII(Invitrogen Corp.)中，然后将来自得到的质粒pCRII-VEGF-B167的Hind III-XbaI片段，该片段编码VEGF-B167的整个开放读框，克隆到pFASTBAC1，并且对3’和5’交界处测序。根据“ Bac-To-BacTM杆状病毒表达系统”(Life Technologies Inc.)的厂商指导制备Bacmid-DNA，并脂转染到Sf900II-适应的Sf9细胞(得自Christian Oker-Blom博士)，Sf9细胞来自美国典型培养物保藏中心保藏细胞株银行，Rockville，MD(ATCC CRL-1711)。随后在25cm2培养皿中用标准TMN-FH培养基培养转染的细胞。
b)分析蛋白质表达
转染后约72小时裂解细胞并用如实施例9所述的免疫沉淀和Western印迹分析1ml培养物上清和细胞裂解物中是否有表达的VEGF-B。来自四个独立转染的细胞培养物中的3个的细胞裂解物对于VEGF-B呈阳性，但是在Western印迹中的信号强度不同。发现在每种细胞裂解物中的表达的VEGF-B多肽的大小对应于实施例9的哺乳动物细胞表达的蛋白的大小。
通过感染细胞并从培养基中收集新的病毒而将来自给出最强Western印迹信号的细胞的病毒储液进行两轮扩增，分析得到的上清，还分析了未感染的细胞作为阴性对照。时间过程分析显示在感染后48-72小时之间收获的细胞含有最大量的VEGF-B，感染后96小时，由于病毒诱导的细胞裂解，还可在培养物上清中通过免疫沉淀和Western印迹分析检测到VEGF-B。重组VEGF-B可以在20％-40％(NH4)2SO4中从裂解物中沉淀出。
10.2带有蜂毒肽信号肽(pVTBac)的VEGF-B
a)克隆和转染
使用来自68-141位核苷酸的聚合酶链反应(PCR)片段在实施例10.1的质粒pCRII-VEGF-B167的信号裂解位点之后引入一BamHI限制位点。将来自此修饰的pCRII-VEGF-B167构建物的BamHI片段克隆到BamHI切开的pVTBac中(Tessier等，“与蜜蜂蜂毒肽信号肽融合的外源蛋白从昆虫细胞的增强分泌”，基因，卷98，177页(1991))。对3’和5’交界区测序。用含有人VEGF-B167基因的上述pVTBac载体和用线性化的杆状病毒DNA(InsectinTM，Invitrogen Corp.)共转染Sf9细胞，然后在TMN-FH培养基中培养转染细胞。
b)分析蛋白质表达
转染后48小时收集上清并用免疫沉淀初级筛选，分离到4个阳性空斑。
10.3将编码小鼠VEGF-B186的一cDNA插入片段(来自小鼠VEGF-B186 cDNA(SEQ ID NO：12)克隆的EcoR1酶切cDNA片段)克隆到pFASTBAC 1，来自来自小鼠VEGF-B167(SEQ ID NO：4)的EcoR1酶切cDNA片段也克隆到pFASTBAC 1，得到的质粒如上述10.1所述转化细菌，分离重组质粒并脂转染到Sf9和Sf21细胞。通过再进行几轮Sf21细胞的感染扩增含重组杆状病毒的上清，杆状病毒储液的最终滴度通过空斑滴定测定，发现每毫升储液上清为1×108和2×109个杆状病毒颗粒。
实施例11    重组VEGF-B的大规模生产
用实施例10的杆状病毒储液以每个细胞10个病毒颗粒的感染复数感染Sf21细胞(见Vaughn等，In Vitro，13：213-17(1977))，感染的Sf21细胞在摇瓶中培养并以每毫升无血清培养基(Sf900II，Gibco-BRL)2×106个细胞的密度接种96小时，然后收集培养基和细胞。用SDS-PAGE分析细胞裂解物和培养基样品，通过用考马氏亮蓝染色凝胶可看到总蛋白谱，用实施例8所述的抗人和小鼠VEGF-B的特异抗肽抗体通过免疫印迹可观察表达的VEGF-B同种型的存在。分析揭示人和小鼠的VEGF-B167多肽均为预计的21.5kDa，两个蛋白均留在感染细胞的胞内并未释放到培养基中。相反，小鼠VEGF-B186以二聚体的形式稳定地分泌到培养基中。VEGF-B186同二聚体以52-54 kDa迁移，提示昆虫细胞生产的蛋白质不象从转染的Cos-1细胞分泌的VEGF-B186一样被共价修饰。
实施例12    表达VEGF-B186的Cos-1细胞的转染和分析
将编码小鼠VEGF-B186和人VEGF165的cDNA插入片段克隆到pSG5表达载体中(Grenn等，核酸研究，16：369(1988))。在含10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺和合适的抗生素的最小基本培养基(MEM)中培养Cos-1细胞，将细胞在90mm培养皿上铺板以用于转染。通过磷酸钙沉淀法用表达载体(单独或联合)转染细胞，并温育36-48小时。细胞单层在不含甲硫氨酸和半胱氨酸的培养基中温育30分钟，然后在含100μCi/ml[35S]甲硫氨酸和[35S]半胱氨酸(Promix，Amersham Inc.)相同培养基中温育2小时。
为进行脉冲追踪实验，将细胞标记30分钟，用正常培养基洗2次，然后在无胎牛血清的MEM中温育最多至6小时，追踪期后收集培养基，将细胞溶于含50mM NaCl，0.5％去氧胆酸盐，0.5％nonidet P-40，和0.1％SDS的10mM Tris缓冲液pH7.5中。用来自实施例8a的针对小鼠VEGF-B的特异抗血清和购自R&D Systems的针对人VEGF的特异抗血清将培养基和细胞裂解物的样品进行免疫沉淀，沉淀物用SDS-PAGE分析。
实施例13    在转染的Cos-1细胞中表达的VEGF-B186的生物化学性质
在用合适的表达载体如实施例12所述瞬时转染的Cos-1细胞中检测小鼠VEGF-B186的生物化学性质。将细胞代谢标记，用针对VEGF-B的抗肽抗体免疫沉淀来自标记细胞的蛋白质，在还原条件下将沉淀物进行SDS-PAGE分析，分析了细胞培养基(M)和去污剂溶解的细胞裂解物(L)，结果示于图22。可以看出在还原条件下细胞结合的VEGF-B186以约Mr 24,000多肽迁移，相反，存在于转染细胞培养基中的VEGF-B186以约Mr 32,000多肽迁移，提示蛋白质在其胞内转运和分泌过程中被共价修饰。在用作对照的模拟转染的Cos-1细胞的细胞裂解物和培养基中未检到相应的分子。
在非还原条件下培养基的免疫沉淀和SDS-PAGE分析显示一约Mr 60,000的种类，提示VEGF-B186形成二硫键键合的同二聚体。在标记期间加入100ug/ml肝素不会影响VEGF-B186同二聚体从转染细胞中分泌或释放。
实施例14    VEGF-B186同二聚体的生物合成
通过脉冲追踪实验检测VEGF-B186同二聚体的生物合成。将转染Cos-1细胞代谢标记30分钟，然后追踪最高达4小时。对去污剂溶解的细胞裂解物的免疫沉淀和SDS-PAGE分析显示在整个追踪期间一直能测到细胞结合的约Mr24,000的蛋白种类，这一分子量蛋白种类的量的降低与培养基中存在的Mr32,000蛋白的增加相伴，在追踪1小时后，Mr32,000蛋白种类在培养基中出现。在4小时追踪期后得到分泌型VEGF-B186的最高水平。在细胞裂解物中未发现中间体，但是分泌型Mr32,000蛋白似乎稍有异质，这一修饰的实质目前尚未知，但是这一修饰缺少共有位点所以可排除N-键合的糖基化作用。
实施例15    由VEGF-B186形成异二聚体
如上所述，VEGF-B和VEGF在许多组织中共表达，并且在转染细胞中共表达时一直能形成VEGF-B167·VEGF165异二聚体。为检测VEGF-B186是否能与VEGF165形成异二聚体，如上所述用合适的表达载体单独或联合转染Cos-1细胞，将来自转染细胞的培养基中存在的代谢标记的蛋白用针对VEGF-B和VEGF的抗血清进行免疫沉淀。图23示出在还原条件下来自分别表达VEGF-B186和VEGF的瞬时转染的Cos-1细胞的培养基的免疫沉淀物的SDS-PAGE分析结果，可以看出抗血清分别特异于VEGF-B和VEGF，而没有可检测到的交叉反应性。
用VEGF-B186和VEGF165的表达载体共转染Cos-1细胞，将来自得到的共表达VEGF-B186和VEGF165的细胞的细胞培养基(M)和去污剂溶解的裂解物(L)进行免疫沉淀并在还原条件下进行SDS-PAGE分析，结果示于图23B，测试显示小鼠VEGF-B186和人VEGF165形成胞内的和分泌的异二聚体。
将来自表达小鼠VEGF-B186和人VEGF165的细胞的培养基单独或共同用针对VEGF-B和VEGF的抗体进行免疫沉淀并在非还原条件下用SDS-PAGE分析，作为对照，分析来自模拟转染细胞的细胞培养基，结果示于图23C。发现VEGF-B186形成分泌的二硫键键合的同二聚体，而VEGF-B186和VEGF165一起形成分泌的二硫键键合的异二聚体。
为分析与VEGF形成异二聚体是否影响VEGF-B186的分泌和释放，用经VEGF-B186和VEGF165的表达载体瞬时转染的Cos-1细胞进行脉冲追踪实验。在30分钟标记期后可以回收细胞结合的二硫键键合的异二聚体，30分钟追踪期后已可以从培养基中回收分泌的异二聚体，分泌的异二聚体在培养基中积累最长至标记后2小时，在4小时追踪时间点上培养基中的异二聚体的量下降，可能是由于复合物的降解。在整个追踪期内一些VEGF-B186·VEGF异二聚体保持为细胞结合形式。这些结果提示与VEGF-B186同二聚体的分泌相比与VEGF形成异二聚体促进了VEGF-B186的分泌。另外，在30分钟标记期后已存在异二聚体提示VEGF-B186同二聚体的慢释放不是由于VEGF-B186二聚化能力不足。
实施例16  分泌的VEGF-B186同二聚体的纯化
如下所述从杆状病毒感染的Sf21细胞的无血清培养基中分离分泌的VEGF-B186同二聚体：
a.初级分离
在培养基中的主要杂质蛋白是杆状病毒蛋白gp64/67，其是由杆状病毒感染细胞分泌的酸性蛋白，为除去这一蛋白，用超滤将培养基浓缩20倍然后过Sephadex G-25柱，该柱用含20mM NaCl的20mM磷酸盐缓冲液pH6.5平衡。洗脱的蛋白然后过用相同缓冲液平衡的CM-Sepharos(Pharmacia)离子交换柱，用磷酸盐缓冲液洗柱以除去未结合的蛋白，逐步增加洗脱缓冲液的NaCl浓度洗脱结合蛋白。主要gp64/67杆状病毒编码蛋白在这些条件下不与离子交换柱结合，而VEGF-B186同二聚体在NaCl浓度为90mM时洗脱。用SDS-PAGE分析洗脱组分，发现经此步骤分离的VEGF-B186同二聚体的纯度为5-15％。
b.纯化至均质
在偶联于FLPC系统(Pharmacia)的MonoS柱上将VEGF-B186同二聚体纯化至均质，用在20mM磷酸盐缓冲液pH6.5中的NaCl线性梯度洗脱结合蛋白。
实施例17
为发现两个VEGF-B剪接异构体是否有不同的组织分布以及是否还存在其它的异构体，用从小鼠脑、心脏、肝脏和肾脏以及从人胎心和骨骼肌提取的总RNA进行RT-PCR分析。用分别覆盖小鼠和人VEGF-B基因的外显子4-7和外显子3-7的4对特异引物经PCR分析转录物。
程序
用Chirgwin等，生物化学，18：5294-99(1979)公开的标准程序分离来自小鼠和人组织的总RNA。每反应用2-5μg总RNA使用禽髓细胞瘤病毒逆转录酶(20U/反应)进行第一链cDNA的合成，反应用寡(dT)18引导。这些反应的等份样品用作使用Taq DNA聚合酶(2.5U/反应)的PCR的模板，为扩增小鼠cDNA，使用两对引物，这些引物对是通过将定位于外显子4的通用5’引物
5’-CACAGCCAATGTGAATGCA(正向)(SEQ ID NO：23)与分别定位于外显子6B和7的两个不同3’引物(后一个引物在5’末端具有一个Bgl II位点和4个多出的碱基)
5’-GCTCTAAGCCCCGCCCTTGGCAATGGAGGAA(反向)(SEQ ID NO：24)和
5’-ACGTAGATCTTCACTTTCGCGGCTTCCG(反向)(SEQ ID NO：25)合并而得到的。用琼脂糖凝胶电泳分析后将扩增条带转移到尼龙滤膜(GenescreenPlus)上并依次与特异于外显子6A和6B的寡核苷酸探针杂交，寡核苷酸探针是5’-CTCTGTTCCGGGCTGGGACTCTA(外显子6A)(SEQ ID NO：26)和5’-TCAGGGCGTTGACGGCGCTGGGTGCAA(外显子6B)(SEQ ID NO：27)，用末端转移酶用[32P]dCTP标记寡核苷酸探针至高比活。使用1×106cpm标记探针/ml溶液，在含5×Denhard’s溶液、0.5％SDS和100μg/ml鲑精DNA的6×SSC中于37℃进行杂交，在相同温度下在含0.5％SDS的6×SSC中洗滤膜2×15分钟并曝光。
用于扩增人cDNA的两对引物是通过将两个不同5’引物即定位于外显子3的引物
5’-CCTGACGATGGCCTGGAGTGT(正向)(SEQ ID NO：28)和定位于外显子4的引物
5’-TGTCCCTGGAAGAACACAGCC(正向)(SEQ ID NO：29)与定位于外显子7的通用3’引物
5’-GCCATGTGTCACCTTCGCAG(反向)(SEQ ID NO：19)合并而得到的。用琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物的等份样品，将样品直接克隆到TA克隆载体pCR II(Invitrogen，Inc.)中，用核苷酸测序分析产生的质粒，GAPDH的扩增作为对照。
结果
扩增的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析显示分别为215和316bp的两条主带，这些大小与对应于VEGF-B167和VEGF-B186的两个mRNA一致。这两条带的亮度相同说明两个异构体在所有检测的小鼠和人组织中以几乎相同的水平表达。
为验证来自小鼠组织的扩增产物，将PCR扩增的DNA转移到滤膜并分别用对应于外显子6A和6B的特异性寡核苷酸探针探查，放射自显影显示外显子6特异性探针与316bp条带杂交而外显子6B特异性探针与215和316bp两条扩增条带均杂交。这些结果与外显子6的受体位点的可变应用以产生VEGF-B的两个异构体的结果一致，因此所有扩增产物与从VEGF-B167和VEGF-B186异构体的序列预期的相对应。
对从人胎心和肌肉分离的总RNA的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析可见329bp和430bp的两条主要扩增带。
总之，这些数据证明VEGF-B167和VEGF-B186是组织中的两个主要VEGF-B异构体。PCR产物谱和引物的定位提示如果还有更长的剪接VEGF-B异构体存在，则这种转录物使用比VEGF-B186情况下更略偏5’一侧的剪接受体位点。另外，没有检测到对应于缺乏肝素结合区的VEGF121的PCR产物，即对应于VEGF-B的外显子6的序列。然而，外显子5至外显子7的剪接将产生编码对应于VEGF121的VEGF-B异构体的转录物，这一推测的VEGF-B异构体可能在不是本实施例中分析的其它组织中表达。
实施例18  细胞增殖的刺激
通过在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和在牛毛细血管内皮(BCE)细胞中的[3H]胸腺嘧啶掺入分析确定VEGF-B167刺激内皮细胞增殖的能力。
如上所述在1μg/ml肝素存在下用VEGF-B167，VEGF165的表达载体或空白载体(模拟)转染293EBNA细胞。用各自培养基稀释来自这些细胞的条件培养基并施加到人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和牛毛细血管内皮(BCE)细胞并测定[3H]胸腺嘧啶的掺入。作为阳性对照将重组bFGF加到BCE细胞。
详细地说，转染48小时后，从在肝素(1μg/ml)存在下用合适的表达载体或空白载体(模拟)转染的293EBNA细胞收集含有人VEGF-B和VEGF165的条件培养基。第二代HUVEC以补加10％胎牛血清的M-199培养基在96孔板上铺板(4×103细胞/孔)并温育24小时。用生长培养基稀释条件培养基并刺激细胞48小时。将含10μCi/ml[3H]胸腺嘧啶(Amersham Inc.)的新鲜条件培养基加到细胞中，并继续刺激细胞48小时。细胞用PBS洗并胰酶化，掺入的放射活性用液闪计数测定。BCE细胞以补加10％胎牛血清的最小基本培养基(MEM)种于24孔板并生长至铺满，在补加3％胎牛血清的MEM中饥饿细胞72小时，将在无血清培养基中稀释的条件培养基加到细胞并刺激细胞24小时，在刺激的最后4小时加入[3H]胸腺嘧啶(1μCi/ml)。用bFGF的刺激是如上所述使用6ng/ml重组bFGF(Synergen Inc.)进行，用PBS洗细胞，用NaOH裂解，并用液闪计数测定掺入的放射活性。
图20是一条线图，示出与由来自模拟转染的细胞的条件培养基诱导的本底活性相比，在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和在牛毛细血管内皮(BCE)细胞中由VEGF-B167诱导的[3H]胸腺嘧啶掺入的倍数。为进行对比，由VEGF165和bFGF的诱导也示出。条线示出平行样品的平均值±标准偏差。在几个其它独立实验中得到相似结果。测试结果清楚地表明VEGF-B在HUVEC和BCE细胞中均诱导[3H]胸腺嘧啶掺入并在体外刺激内皮细胞的增殖，由此证明VEGF-B是一种内皮生长因子。
实施例19    人VEGF-B启动子DNA克隆的鉴定及活性
使用含有来自VEGF-B第一和第二个外显子的序列的5’PCR片段作为探针筛选在噬菌体λEMBL中的人基因组DNA文库，得到两个阳性克隆，将其中一个作为SacI片段亚克隆到Bluescript SKII质粒。得到一1.4kb片段，其含有约0.4kb存在于cDNA中的Nco I位点上游的序列(位于ATG翻译起始位点上游100bp之内)。
另外，将来自另一λ克隆的约6kb XhoI片段亚克隆到pGEMEX质粒，这一亚克隆含有约1.5kb的NcoI位点上游序列。将SacI/NcoI片段和一EcoRI(多接头)-NcoI片段以各自转录方向亚克隆到pGL3基本载体(Promega)中。将这些亚克隆的DNA以及来自含SV启动子的pGL3对照载体的DNA用磷酸钙沉淀法转染进HeLa细胞，转染后两天，测定转染细胞裂解物的萤光素酶活性。结果显示400bp SacI/NcoI片段具有相当于pGL3对照载体启动子活性的30％的启动子活性，而1.5kb片段仅给出背景活性。使用较强或更活化的启动子例如CMV启动子或延伸因子1-α启动子可以在人细胞和组织中给出更高的活性。克隆片段的结构示于图24。
对1.5kb的NcoI位点上游序列测序，得到的序列(SEQ ID NO：17)示于图25，该序列显示有一推断的沉默子(Weissman and Singer，分子及细胞生物学，11：4228-234(1991))，其由在核苷酸166-187位之间的两个8bp序列段组成(在图中由框框起)，这一沉默子可能导致1.5kb片段活性的相对缺乏。
实施例20    在黑素瘤、正常皮肤和肌肉中由RT-PCR分析VEGF-B mRNA
从赫尔辛基大学中心医院放射治疗和肿瘤学系的病人中获取正常皮肤及黑素瘤组织，手术切除后立即制得4个转移性黑素瘤样品并立即包埋于Tissue-tek(Miles)并在液氮中冷冻。正常皮肤样品得自进行乳腺癌手术及皮肤痣切除的自愿患者。所有样品均经病理学家检查以证实诊断。
用异硫氰酸胍程序(Chomczynski等，分析生物化学，162：156-159(1987))分离总RNA，用0.2μg随机六脱氧核苷酸引物、5单位鼠逆转录酶、作为模板的5μg总RNA以及第一链cDNA合成试剂盒(Pharmacia)合成cDNA，在37℃温育1小时后，将反应混合物储存于-70℃。PCR扩增的阴性对照样品类似制备只是不加逆转录酶。还测试了β-肌动蛋白作为内标，因为它组成型高水平表达，并且其表达在不同细胞中并无很大差别。
为PCR扩增，从VEGF-B和β-肌动蛋白基因中选择引物序列，引物序列如下：VEGF-B有义：5’-GCCATGTGTCACCTTCGCAG-3’(SEQ ID NO：19)VEGF-B反义：5’-TGTCCCTGGAAGAACACAGCC-3’(SEQ ID NO：29)β-肌动蛋白有义：5’-CGGGAAATCGTGCGTGACAT-3’(SEQ ID NO：30)β-肌动蛋白反义：5’-GGAGTTGAAGGTAGTTTCGTG-3’(SEQ ID NO：31)(β-肌动蛋白序列包括来自Ng等，分子细胞生物学5：2720-732(1985)的核苷酸2105-2125和2411-2432)。将来自cDNA反应产物的4μl等份样品在94℃加热5分钟并用作模板与20pmol引物、10×PCR缓冲液、1μl 20mM dNTPs和2.5UTaq聚合酶进行PCR扩增，用DEPC处理的水调整终体积为100μl。95℃1分钟变性，62℃45秒退火，72℃50秒聚合，VEGF-B共进行35个循环，β-肌动蛋白共进行25个循环。每5个循环后取15μl样品进行分析。
5μl PCR反应混合物的电泳在含溴乙锭的2％琼脂糖凝胶上进行，大小标记物DNA片段长度为24-726bp(ΦX174 DNA/HinfI标记物，来自Promega，Madison，WI，USA)。因此，测试样品包括4个转移性黑素瘤、肌肉、正常皮肤、阴性对照(不加逆转录酶)以及ΦX174 DNA/Hinf I大小标记物。对VEGF-B(PCR产物长度323和234bp)和β-肌动蛋白进行的RT-PCR分析的结果显示VEGF-B在所有研究的黑素瘤中均高表达，其表达水平类似于在肌肉组织中的表达水平，相反，在正常皮肤中的VEGF-B RNA非常少。从Northern印迹分析和杂交分析中可得出类似结论。
上述结果显示VEGF-B是一种新的内皮细胞生长因子，其在血管化特别是肌肉组织的血管化中起作用。使用Takeshita等，美国病理学杂志，147：1649-60(1995)中所述的技术通过动脉给予VEGF-B大丸药(bolus)可以促进局部缺血的心脏或四肢中的副动脉的生长。VEGF-B的细胞结合作用可以在调节血管化作用以及内皮细胞生长中有若干应用。在发育的胚胎和收缩组织中，细胞结合的VEGF-B在血管树的建立和保持过程中可以向生长过快的内皮细胞提供空间信号(cue)。它还可以通过其细胞结合作用支持成人血管中受损内皮的再生。通过使用Asahara等，循环，91(11)：2793-802(1995)所述的技术直接施用VEGF-B可以促进动脉损伤的重新内皮化作用。VEGF-B通过形成异二聚体而调节VEGF分泌的能力提示VEGF-B在VEGF信号传送作用(signalling)中的间接作用，从而调节受体结合和/或活化，如Potgens等，生物化学杂志269(52)：32879-85(1994)中损伤。这些生长因子形成多重异二聚化复合物可以提供内皮细胞调控信号的多种排列的基础。
VEGF-B可以作为内皮细胞体外群体化的生长因子。VEGF-B可以用于促进所需的血管生成，即形成新的血管和毛细血管，见Takeshita等，文献同上。例如，其可用于促进黄体和子宫内膜的发育以有助于妊娠的起始和/或维持。它还可以通过其对内皮细胞的作用而用于骨骼修复。给予VEGF-B还可用于支持胚胎发生以及体细胞生长和血管发育及分化。在伤口区局部施用VEGF-B可以用于促进伤口愈合，而口服给予VEGF-B可以用于加速胃溃疡和/或十二指肠溃疡的愈合。VEGF-B通过形成异二聚体而调节VEGF分泌的能力可在需要VEGF兴奋剂的疾病中提供VEGF-B的治疗作用，见Potgens等，文献同上。
VEGF-B可直接或通过改善血液供应而激发中皮细胞的增殖作用。
已发现VEGF-B在肿瘤如黑素瘤中过量表达，因此，VEGF-B表达的检测可以用作肿瘤诊断的工具，并且例如用单克隆抗体对VEGF-B表达的抑制作用可以用于阻止肿瘤生长。
分析肿瘤中的VEGF-B可以作为转移危象的指示，例如，以类似于Takahashi等，癌症研究，55：3964-68(1995)所述程序应用VEGF-B抗体以定量新生血管化和增殖可以用来指示结肠癌危象。通过组织化学分析体液或肿瘤本身的VEGF-B可以用作肿瘤预后因子。类似于Kondo等，生物化学和生物物理年报，1221(2)：211-14(1994)所述程序的ELISA可以用于检测VEGF-B正调节以作为肿瘤屏(screen)。使用Boocock等，国家癌症研究杂志，87：506-16(1995)所述的技术进行的VEGF-B表达的酶联免疫吸附分析可用作卵巢癌的诊断指示。类似于Weindel等，神经外科学，35：439-48(1994)所述的VEGF分析的VEGF-B表达分析可用作脑肿瘤中恶性的指示。
另外，因为肿瘤生长需要血管生成，所以给予VEGF-B还可以用于促进实验动物的肿瘤生长以测试抗致瘤性药物。VEGF-B还可用于增加肿瘤的供养不足区域的微血管化并使这些区域对辐射和辐射致敏药物等敏感。
VEGF-B的血管生成作用可用于治疗局部缺血症状，通过Bauters等，美国生理学杂志，267(4-Pt2)：H1263-71(1994)所述的技术给予VEGF-B的动脉内大丸药可以用于治疗下肢局部缺血并增加四肢充血。使用Mesri等，循环研究，76：161-67(1995)所述的程序可以在注射有由表达VEGF-B的病毒转导的成纤维细胞的组织中产生血管生成应答以治疗组织局部缺血(例如心肌局部缺血)。在动脉和/或静脉阻塞情况下，例如心肌梗塞、四肢缺血、深静脉血栓形成和/或产后血管问题，VEGF-B或兴奋剂可以用于刺激旁路循环的发育，见Takeshita等，文献同上。
VEGF-B/VEGF-B受体系统可用作检测体系以检测作为兴奋剂/拮抗剂的小分子从而开发新药。可以检测的小分子的例子包括但不限于有机化学品、肽和RNA分子。
通过将药物学有效量的VEGF-B蛋白与一种或多种合适的载体或佐剂如水、矿物油、聚乙二醇、淀粉、滑石粉、乳糖、增稠剂、稳定剂、悬浮剂等混合可以生产药物组合物，这种组合物可以为溶液、悬液、片剂、胶囊剂、乳液、油膏剂、软膏或其它常规形式。
如实施例7所证实，VEGF-B蛋白还可用于生产抗体，一般说来，可以使用常规的抗体生产技术来生产VEGF-B抗体，例如，可以通过用重组DNA表达得到的融合蛋白免疫而生产特异的单克隆抗体。
标记的单克隆抗体尤其可用于筛选与体内不正常VEGF-B水平相关的症状，例如，通过类似于Fava等，实验药物杂志，180：341-46(1994)所述的免疫荧光测定技术检测滑液和/或关节组织中的VEGF-B可以用作风湿性关节炎的诊断指示。使用如Aiello等，新英格兰药物杂志，331(22)：1480-87(1994)所述的技术对眼液中的VEGF-B进行放射免疫测定可用作糖尿病性视网膜病、虹膜新生血管化或视网膜静脉闭锁症的诊断标志。血液、尿或其它体液中的VEGF-B水平的免疫分析可用作为肿瘤标志，见Kondo等，文献同上。针对VEGF-B的这些单克隆抗体还可用于例如在哺乳动物中的快速增殖的依赖于血管生成的肿瘤中抑制与体内高水平VEGF-B相关的血管生成，从而可以阻止这类肿瘤的生长。使用类似于Kim等，自然，362(6243)：841-44(1993)所述的技术用特异于VEGF-B的单克隆抗体的治疗可以用于在体内抑制肿瘤生长。使用类似于Aasno等，癌症研究，55：5296-5301(1995)所述的程序静脉和/或皮下注射VEGF-B的单克隆抗体可以用于抑制实体肿瘤的新生血管化和原位和转移生长。对于治疗人类，优选对这些单克隆抗体进行交叉化(chiaserization)或人源化。可通过例如每星期两次腹膜内注射10-500μg、优选50-100μg单克隆抗体而进行治疗。
VEGF-B拮抗剂如抗体还可用于抑制糖尿病性视网膜病、银屑病、关节病和/或血管肿瘤如血管瘤中的新血管，见Aiello等，文献同上。
上述描述及实施例仅仅是举例描述本发明而非限制性的，由于本领域熟练技术人员对掺入本发明的实质和物质的所公开的实施方案可以作出修饰，所以本发明应理解为包括在所附权利要求书范围内的所有物质及其等价物。
                          序列表
(1)一般信息
(i)申请人：乌尔夫·埃里克松，比吉塔·奥洛夫松，卡里·阿利塔洛，卡特里·帕尤萨拉
(ii)发明名称：血管内皮生长因子-B及编码其的DNA
(iii)序列数：31
(iv)通讯地址：
    (A)收信人：Evenson，McKeown，Edwards & Lenahan
    (B)街道：1200 G Street，N.W.，Suite 700
    (C)城市：华盛顿
    (D)州：DC
    (E)国家：美国
    (F)邮编：20005
(v)计算机可读形式
    (A)媒介类型：软盘
    (B)计算机：IBM PC兼容机
    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.25
(vi)目前申请资料：
    (A)申请号：
    (B)申请日：1996年3月1日
(vii)在先申请资料：
    (A)申请号：US 08/397,651
    (B)申请日：1995年3月1日
(vii)在先申请资料：
    (A)申请号：US 08/469,427
    (B)申请日：1995年6月6日
(vii)在先申请资料：
    (A)申请号：US 08/569,063
    (B)申请日：1995年12月6日
(viii)律师/代理人信息：
    (A)姓名：EVANS，Joseph D.
    (B)注册号：26,269
    (C)案号/文档号：1064/41979PCT
(ix)电讯信息：
    (A)电话：(202)628-8800
    (B)传真：(202)628-8844
(2)SEQ ID NO：1的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：886bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：无
(vi)最初来源：
    (F)组织类型：小鼠胚胎
(vii)现来源：
(B)克隆：pcif2
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1CGGGACGCCC AGTGGTGCCA TGGATAGACG TTTATGCACG TGCCACATGC CAGCCCAGGG                 60AGGTGGTGGT GCCTCTGAGC ATGGAACTCA TGGGCAATGT GGTCAAACAA CTAGTGCCCA                120GCTGTGTGAC TGTGCAGCGC TGTGGTGGCT GCTGCCCTGA CGATGGCCTG GAATGTGTGC                180CCACTGGGCA ACACCAAGTC CGAATGCAGA TCCTCATGAT CCAGTACCCG AGCAGTCAGC                240TGGGGGAGAT GTCCCTGGAA GAACACAGCC AATGTGAATG CAGACCAAAA AAAAAAAGGA                300GAGTGCTGTG AAGCCAGACA GCCCCAGGAT CCTCTGCCCG CCTTGCACCC AGCGCCGTCA                360ACGCCCTGAC CCCCGGACCT GCCGCTGCCG CTGCAGACGC CGCCGCTTCC TCCATTGCCA                420AGGGCGGGGC TTAGAGCTCA ACCCAGACAC CTGTAGGTGC CGGAAGCCGC GAAAGTGACA                480AGCTGCTTTC CAGACTCCAC GGGCCCGGCT GCTTTTATGG CCCTGCTTCA CAGGGACGAA                540GAGTGGAGCA CAGGCAAACC TCCTCAGTCT GGGAGGTCAC TGCCCCAGGA CCTGGACCTT                600TTAGAGAGCT CTCTCGCCAT CTTTTATCTC CCAGAGCTGC CATCTAACAA TTGTCAAGGA                660ACCTCATGTC TCACCTCAGG GGCCAGGGTA CTCTCTCACT TAACCACCCT GGTCAAGTGA                720GCATCTTCTG GCTGGCTGTC TCCCCTCACT ATGAAAACCC CAAACTTCTA CCAATAACGG                780GATTTGGGTT CTGTTATGAT AACTGTGACA CACACACACA CTCACACTCT GATAAAAGAG                840AACTCTGATA AAAGAGATGG AAGACACTAA AAAAAAAAAA AAAAAA                               886
(2)SEQ ID NO：2的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：102个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假设：无
(vi)最初来源：
    (F)组织类型：小鼠胚胎
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Gly Arg Pro Val Val Pro Trp Ile Asp Val Tyr Ala Arg Ala Thr Cys1               5                   10                  15Gln Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Ser Met Glu Leu Met Gly Asn
        20                  25                  30Val Val Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly
    35                  40                  45Gly Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His
50                  55                  60Gln Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Gln Tyr Pro Ser Ser Gln Leu65                  70                  75                  80Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys
            85                  90                  95Lys Lys Arg Arg Val Leu
        100(2)SEQ ID NO：3的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：55个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假设：无
(vi)最初来源：
    (F)组织类型：小鼠胚胎
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3Lys Pro Asp Ser Pro Arg Ile Leu Cys Pro Pro Cys Thr Gln Arg Arg1               5                   10                  15Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg Arg
        20                  25                  30Phe Leu His Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr Cys
    35                  40                  45Arg Cys Arg Lys Pro Arg Lys
50                  55
(2)SEQ ID NO：4的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：565bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：无
(vi)最初来源：
    (F)组织类型：成年小鼠心脏
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4GAGCCCCCTG CTCCGTCGCC TGCTGCTTGT TGCACTGCTG CAGCTGGCTC GCACCCAGGC                 60CCCTGTGTCC CAGTTTGATG GCCCCAGCCA CCAGAAGAAA GTGGTGCCAT GGATAGACGT                120TTATGCACGT GCCACATGCC AGCCCAGGGA GGTGGTGGTG CCTCTGAGCA TGGAACTCAT                180GGGCAATGTG GTCAAACAAC TAGTGCCCAG CTGTGTGACT GTGCAGCGCT GTGGTGGCTG                240CTGCCCTGAC GATGGCCTGG AATGTGTGCC CACTGGGCAA CACCAAGTCC GAATGCAGAT                300CCTCATGATC CAGTACCCGA GCAGTCAGCT GGGGGAGATG TCCCTGGAAG AACACAGCCA                360ATGTGAATGC AGACCAAAAA AAAAGGAGAG TGCTGTGAAG CCAGACAGCC CCAGGATCCT                420CTGCCCGCCT TGCACCCAGC GCCGTCAACG CCCTGACCCC CGGACCTGCC GCTGCCGCTG                480CAGACGCCGC CGCTTCCTCC ATTGCCAAGG GCGGGGCTTA GAGCTCAACC CAGACACCTG                540TAGGTGCCGG AAGCCGCGAA AGTGA                                                      565
(2)SEQ ID NO：5的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：188个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假设：无
(vi)最初来源：
    (F)组织类型：成年小鼠心脏
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Leu Leu Gln Leu1               5                   10                  15Ala Arg Thr Gln Ala Pro Val Ser Gln Phe Asp Gly Pro Ser His Gln
        20                  25                  30Lys Lys Val Val Pro Trp Ile Asp Val Tyr Ala Arg Ala Thr Cys Gln
    35                  40                  45Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Ser Met Glu Leu Met Gly Asn Val
50                  55                  60Val Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly65                  70                  75                  80Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln
            85                  90                  95Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Gln Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly
        100                 105                 110Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys
    115                 120                 125Lys Glu Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Ile Leu Cys Pro Pro
130                 135                 140Cys Thr Gln Arg Arg Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg145                 150                 155                 160Cys Arg Arg Arg Arg Phe Leu His Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu
            165                 170                 175Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Pro Arg Lys
        180                 185
(2)SEQ ID NO：6的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：591bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：无
(vi)最初来源：
    (F)组织类型：成年小鼠心脏
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6ACCATGAGCC CCCTGCTCCG TCGCCTGCTG CTTGTTGCAC TGCTGCAGCT GGCTCGCACC                 60CAGGCCCCTG TGTCCCAGTT TGATGGCCCC AGCCACCAGA AGAAAGTGGT GCCATGGATA                120GACGTTTATG CACGTGCCAC ATGCCAGCCC AGGGAGGTGG TGGTGCCTCT GAGCATGGAA                180CTCATGGGCA ATGTGGTCAA ACAACTAGTG CCCAGCTGTG TGACTGTGCA GCGCTGTGGT                240GGCTGCTGCC CTGACGATGG CCTGGAATGT GTGCCCACTG GGCAACACCA AGTCCGAATG                300CAGGTACCAG GGCCTATGGG TCAGATCCTC ATGATCCAGT ACCCGAGCAG TCAGCTGGGG                360GAGATGTCCC TGGAAGAACA CAGCCAATGT GAATGCAGAC CAAAAAAAAA GGAGAGTGCT                420GTGAAGCCAG ACAGCCCCAG GATCCTCTGC CCGCCTTGCA CCCAGCGCCG TCAACGCCCT                480GACCCCCGGA CCTGCCGCTG CCGCTGCAGA CGCCGCCGCT TCCTCCATTG CCAAGGGCGG                540GGCTTAGAGC TCAACCCAGA CACCTGTAGG TGCCGGAAGC CGCGAAAGTG A                         591
(2)SEQ ID NO：7的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：195个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假设：无
(vi)最初来源：
    (F)组织类型：成年小鼠心脏
(xi)序列描述：  SEQ ID NO：7Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Leu Leu Gln Leu1               5                   10                  15Ala Arg Thr Gln Ala Pro Val Ser Gln Phe Asp Gly Pro Ser His Gln
        20                  25                  30Lys Lys Val Val Pro Trp Ile Asp Val Tyr Ala Arg Ala Thr Cys Gln
    35                  40                  45Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Ser Met Glu Leu Met Gly Asn Val
50                  55                  60Val Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly65                  70                  75                  80Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln
            85                  90                  95Val Arg Met Gln Val Pro Gly Pro Met Gly Gln Ile Leu Met Ile Gln
        100                 105                 110Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln
    115                 120                 125Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Lys Glu Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser
130                 135                 140Pro Arg Ile Leu Cys Pro Pro Cys Thr Gln Arg Arg Gln Arg Pro Asp145                 150                 155                 160Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg Cys Arg Arg Arg Arg Phe Leu His Cys
            165                 170                 175Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys
        180                 185                 190Pro Arg Lys
    195
(2)SEQ ID NO：8的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：405bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8ACCATGAGCC CCCTGCTCCG TCGCCTGCTG CTTGTTGCAC TGCTGCAGCT GGCTCGCACC         60CAGGCCCCTG TGTCCCAGTT TGATGGCCCC AGCCACCAGA AGAAAGTGGT GCCATGGATA        120GACGTTTATG CACGTGCCAC ATGCCAGCCC AGGGAGGTGG TGGTGCCTCT GAGCATGGAA        180CTCATGGGCA ATGTGGTCAA ACAACTAGTG CCCAGCTGTG TGACTGTGCA GCGCTGTGGT        240GGCTGCTGCC CTGACGATGG CCTGGAATGT GTGCCCACTG GGCAACACCA AGTCCGAATG        300CAGATCCTCA TGATCCAGTA CCCGAGCAGT CAGCTGGGGG AGATGTCCCT GGAAGAACAC      360AGCCAATGTG AATGCAGACC AAAAAAAAAA AGGAGAGTGC TGTGA                      405
(2)SEQ ID NO：9的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：133个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Leu Leu Gln Leu1               5                   10                  15Ala Arg Thr Gln Ala Pro Val Ser Gln Phe Asp Gly Pro Ser His Gln
        20                  25                  30Lys Lys Val Val Pro Trp Ile Asp Val Tyr Ala Arg Ala Thr Cys Gln
    35                  40                  45Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Ser Met Glu Leu Met Gly Asn Val
50                  55                  60Val Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly65                  70                  75                  80Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln
            85                  90                  95Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Gln Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly
        100                 105                 110Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys
    115                 120                 125Lys Arg Arg Val Leu
130
(2)SEQ ID NO：10的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：570bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：无
(vi)最初来源：
    (F)组织类型：人纤维瘤
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10ACCATGAGCC CTCTGCTCCG CCGCCTGCTG CTCGCCGCAC TCCTGCAGCT GGCCCCCGCC                60CAGGCCCCTG TCTCCCAGCC TGATGCCCCT GGCCACCAGA GGAAAGTGGT GTCATGGATA               120GATGTGTATA CTCGCGCTAC CTGCCAGCCC CGGGAGGTGG TGGTGCCCTT GACTGTGGAG               180CTCATGGGCA CCGTGGCCAA ACAGCTGGTG CCCAGCTGCG TGACTGTGCA GCGCTGTGGT                240GGCTGCTGCC CTGACGATGG CCTGGAGTGT GTGCCCACTG GGCAGCACCA AGTCCGGATG                300CAGATCCTCA TGATCCGGTA CCCGAGCAGT CAGCTGGGGG AGATGTCCCT GGAAGAACAC                360AGCCAGTGTG AATGCAGACC TAAAAAAAAG GACAGTGCTG TGAAGCCAGA CAGCCCCAGG                420CCCCTCTGCC CACGCTGCAC CCAGCACCAC CAGCGCCCTG ACCCCCGGAC CTGCCGCTGC                480CGCTGCCGAC GCCGCAGCTT CCTCCGTTGC CAAGGGCGGG GCTTAGAGCT CAACCCAGAC                540ACCTGCAGGT GCCGGAAGCT GCGAAGGTGA                                                 570
(2)SEQ ID NO：11的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：188个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(iii)假设：无
(vi)最初来源：
    (F)组织类型：人纤维瘤
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu1               5                   10                  15Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln
        20                  25                  30Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln
    35                  40                  45Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val
50                  55                  60Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly65                  70                  75                  80Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln
            85                  90                  95Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly
        100                 105                 110Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys
    115                 120                 125Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Ser Pro Arg Pro Leu Cys Pro Arg
130                 135                 140Cys Thr Gln His His Gln Arg Pro Asp Pro Arg Thr Cys Arg Cys Arg145                 150                 155                 160Cys Arg Arg Arg Ser Phe Leu Arg Cys Gln Gly Arg Gly Leu Glu Leu
            165                 170                 175Asn Pro Asp Thr Cys Arg Cys Arg Lys Leu Arg Arg
        180                 185
(2)SEQ ID NO：12的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：624bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(iii)假设：无
(vi)最初来源：
    (F)组织类型：小鼠
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12ATGAGCCCCC TGCTCCGTCG CCTGCTGCTT GTTGCACTGC TGCAGCTGGC TCGCACCCAG                 60GCCCCTGTGT CCCAGTTTGA TGGCCCCAGC CACCAGAAGA AAGTGGTGCC ATGGATAGAC                120GTTTATGCAC GTGCCACATG CCAGCCCAGG GAGGTGGTGG TGCCTCTGAG CATGGAACTC                180ATGGGCAATG TGGTCAAACA ACTAGTGCCC AGCTGTGTGA CTGTGCAGCG CTGTGGTGGC                240TGCTGCCCTG ACGATGGCCT GGAATGTGTG CCCACTGGGC AACACCAAGT CCGAATGCAG                300ATCCTCATGA TCCAGTACCC GAGCAGTCAG CTGGGGGAGA TGTCCCTGGA AGAACACAGC                360CAATGTGAAT GCAGACCAAA AAAAAAGGAG AGTGCTGTGA AGCCAGACAG GGTTGCCATA                420CCCCACCACC GTCCCCAGCC CCGCTCTGTT CCGGGCTGGG ACTCTACCCC GGGAGCATCC                480TCCCCAGCTG ACATCATCCA TCCCACTCCA GCCCCAGGAT CCTCTGCCCG CCTTGCACCC                540AGCGCCGTCA ACGCCCTGAC CCCCGGACCT GCCGCTGCCG CTGCAGACGC CGCCGCTTCC                600TCCATTGCCA AGGGCGGGGC TTAG                                                       624
(2)SEQ ID NO：13的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：207个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(vi)最初来源：
    (F)组织类型：小鼠
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Leu Leu Gln Leu1               5                   10                  15Ala Arg Thr Gln Ala Pro Val Ala Gln Phe Asp Gly Pro Ser His Gln
        20                  25                  30Lys Lys Val Val Pro Trp Ile Asp Val Tyr Ala Arg Ala Thr Cys Gln
    35                  40                  45Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Ser Met Glu Leu Met Gly Asn Val
50                  55                  60Val Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly65                  70                  75                  80Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln
            85                  90                  95Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Gln Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly
        100                 105                 110Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys
    115                 120                 125Lys Glu Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Val Ala Ile Pro His His Arg
130                 135                 140Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Thr Pro Gly Ala Ser145                 150                 155                 160Ser Pro Ala Asp Ile Ile His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Ser Ser Ala
            165                 170                 175Arg Leu Ala Pro Ser Ala Val Asn Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala
        180                 185                 190Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Ile Ala Lys Gly Gly Ala
    195                 200                 205
(2)SEQ ID NO：14的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：624bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(vi)最初来源：
    (F)组织类型：人
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14ATGAGCCCTC TGCTCCGCCG CCTGCTGCTC GCCGCACTCC TGCAGCTGGC CCCCGCCCAG         60GCCCCTGTCT CCCAGCCTGA TGCCCCTGGC CACCAGAGGA AAGTGGTGTC ATGGATAGAT        120GTGTATACTC GCGCTACCTG CCAGCCCCGG GAGGTGGTGG TGCCCTTGAC TGTGGAGCTC        180ATGGGCACCG TGGCCAAACA GCTGGTGCCC AGCTGCGTGA CTGTGCAGCG CTGTGGTGGC        240TGCTGCCCTG ACGATGGCCT GGAGTGTGTG CCCACTGGGC AGCACCAAGT CCGGATGCAG        300ATCCTCATGA TCCGGTACCC GAGCAGTCAG CTGGGGGAGA TGTCCCTGGA AGAACACAGC        360CAGTGTGAAT GCAGACCTAA AAAAAAGGAC AGTGCTGTGA AGCCAGACAG GGCTGCCACT        420CCCCACCACC GTCCCCAGCC CCGTTCTGTT CCGGGCTGGG ACTCTGCCCC CGGAGCACCC        480TCCCCAGCTG ACATCACCCA TCCCACTCCA GCCCCAGGCC CCTCTGCCCA CGCTGCACCC        540AGCACCACCA GCGCCCTGAC CCCCGGACCT GCCGCCGCCG CTGCCGACGC CGCAGCTTCC        600TCCGTTGCCA AGGGCGGGGC TTAG                                               624
(2)SEQ ID NO：15的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：207个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：蛋白质
(vi)最初来源：
    (F)组织类型：人
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15Met Ser Pro Leu Leu Arg Arg Leu Leu Leu Ala Ala Leu Leu Gln Leu1               5                   10                  15Ala Pro Ala Gln Ala Pro Val Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln
        20                  25                  30Arg Lys Val Val Ser Trp Ile Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr Cys Gln
    35                  40                  45Pro Arg Glu Val Val Val Pro Leu Thr Val Glu Leu Met Gly Thr Val
50                  55                  60Ala Lys Gln Leu Val Pro Ser Cys Val Thr Val Gln Arg Cys Gly Gly65                  70                  75                  80Cys Cys Pro Asp Asp Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Gly Gln His Gln
            85                  90                  95Val Arg Met Gln Ile Leu Met Ile Arg Tyr Pro Ser Ser Gln Leu Gly
        100                 105                 110Glu Met Ser Leu Glu Glu His Ser Gln Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys
    115                 120                 125Lys Asp Ser Ala Val Lys Pro Asp Arg Ala Ala Thr Pro His His Arg
130                 135                 140Pro Gln Pro Arg Ser Val Pro Gly Trp Asp Ser Ala Pro Gly Ala Pro145                 150                 155                 160Ser Pro Ala Asp Ile Thr His Pro Thr Pro Ala Pro Gly Pro Ser Ala
            165                 170                 175His Ala Ala Pro Ser Thr Thr Ser Ala Leu Thr Pro Gly Pro Ala Ala
        180                 185                 190Ala Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ser Ser Val Ala Lys Gly Gly Ala
    195                 200                 205
(2)SEQ ID NO：16的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：13个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16Pro Xaa Cys Val Xaa Xaa Xaa Arg Cys Xaa Gly Cys Cys1              5                    10
(2)SEQ ID NO：17的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：1550bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：DNA(线性)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17CTCGAGATCT GTTTGTTGTC TTGGAACAAT ACGGTTTAGA GGTGACTGGC GGGTGACGAG               60AACATATGCG AGTTCACCTA AGAGAAAAGC TGAATGAGGC AATGCCTCTT CCTGACCATA              120TCTCTTACTC AGATAACTAT AGAATTTATT GTCCAGTAAA GGGTATATTA AAAAATCATA              180TTAAAAGTCA TACAGTGAAG TTGTCCAGGG AAATCAAGAC TTAACAGTCT CACTCTGACA              240ATAATGAACA GGGGGATTCC CTCAAGATAG ACTAGGACAT GACCCCACAC TGGCAGGTAG              300TAGTACCAGA AAAGAACGCA TGGAAAATCT TTACCTTATG CTTGAGGTAG GGACCAGGCT              360AAAGTGAAGG CCAGACCTAA AATTCTATCT AAAATAAATC CACAATCGAA GAAAATATGT              420GGTGTACAGG TATAGAATGT CTTTACTGGA TCATTGAAAT AGTAAGATAA ATTCAACTTT              480TTACATTGTT TTCTTTTCCT CCAGTTAGGG CTTGAGACCT TCGTCTCTGG AGAGTGACTG              540TCAATTGGAG CCCTGCTTTC TGGGTTTCTG GCCAGGGGGG TTGTGGATGC TTAACATGTG              600CCTTTCACAG GACACTTCCT TACCCCAGCA GTGGCCANGT GTGCATCCCA CGACCAGGCC              660TCCCTCTCAC GGAACATCTG TTGAGACTAG GAGATGCCTG GTGACTGTTG CCTGACCTGT              720GTCCTGTGTA TTTCTGACAA GAGCCACTCT CAAAGACCCT GGCCAGGAGG AGAGTTAGGT              780TCCAGTGTAG GTCAGCTCAG ACAGATGGAG GCCACAGAAN CAAACATGGG AAATCACAGA              840AGTAGGTTTA TTACTCACAG ATCCCTATCC CAACCACCCA GGTGCCCTCT CCTCCAGGGC              900CAACAGAGGC ATCCTTCAGC AGGAGCGACA ACGGCTAGGG CAGCGGCAAG CCGCCACCAT              960CCGAGCCAAC CCAGGCCCCG AGATCGTGCC CCGGGGCGCC GGCCCCTGAG GGGCTCACCT             1020GGATGGGGCC TGCATGCGTT CCCGCTTTGC TTCCTTCCCT GGACGGCCCG CTCCCCCGAA             1080ACGCGCCGCC AATAAAGTGA TTCGCAGAGC TCGTGTGCGG CTCCCTCCTT AAGGCCCGAC             1140GCCCCCGGCC CCGGCCTCGC CAAGGGCAGC GCCCCGGCCT CCGGGTAGTG GCGGCCGGCG             1200ACTGGGGAGC CCAGCCTCCT GGGCGGTGCG TCCCCTTCCC CCTGCCGCGG CGGGAGGCGG             1260GAGGGGGTGT GTGGAGGAGG CGGGCCCCGC CGACGGCCTC GCCCCCCCAC CCCGCCGCCC             1320CGCCCCCGCC CCACGGGCCC GGTGGGGAGC GCGTGTCTGG GTCACATGAG CCGCCTGCCC             1380GCCAGCCCGG GCCCAGCCCC CCGCCGCCCC CGCCGTCCCC GCCGCCGCTG CCCGCCGCCA             1440CCGGCCGCCC GCCCGCCCGG CTCCTCCGGC CGCCTTCGCT GCGCTGCNTG CGCTGCCTGC             1500ACCCAGGGCT CGGGAGGGGG CCGCGGAGGA GCCGCCCCCC GCGCCCGGCC                        1550
(2)SEQ ID NO：18的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：18CACCATGAGC CCTCTGCTCC                           20
(2)SEQ ID NO：19的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：19GCCATGTGTC ACCTTCGCAG                           20
(2)SEQ ID NO：20的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：21bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：20GGGCATCAGG CTGGGAGACA G                         21
(2)SEQ ID NO：21的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：18个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：21Cys Pro Val Ser Gln Phe Asp Gly Pro Ser His Gln Lys Lys Val Val1               5                   10                  15Pro Cys
(2)SEQ ID NO：22的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：23个氨基酸
    (B)类型：氨基酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：22Ser Gln Pro Asp Ala Pro Gly His Gln Arg Lys Val Val Ser Trp Ile1               5                   10                  15Asp Val Tyr Thr Arg Ala Thr
        20
(2)SEQ ID NO：23的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：19bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：23CACAGCCAAT GTGAATGCA
                                        19
(2)SEQ ID NO：24的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：31bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：24GCTCTAAGCC CCGCCCTTGG CAATGGAGGA A            31
(2)SEQ ID NO：25的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：28bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：25ACGTAGATCT TCACTTTCGC GGCTTCCG                28
(2)SEQ ID NO：26的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：23bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：26CTCTGTTCCG GGCTGGGACT CTA                     23
(2)SEQ ID NO：27的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：27bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：27TCAGGGCGTT GACGGCGCTG GGTGCAA                 27
(2)SEQ ID NO：28的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：21bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：28CCTGACGATG GCCTGGAGTG T                       21
(2)SEQ ID NO：29的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：21bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：29TGTCCCTGGA AGAACACAGC C                 21
(2)SEQ ID NO：30的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：20bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：30CGGGAAATCG TGCGTGACAT                   20
(2)SEQ ID NO：31的信息
(i)序列特征：
    (A)长度：21bp
    (B)类型：核酸
    (C)链性：单链
    (D)拓朴结构：线性
(ii)分子类型：cDNA
(xi)序列描述：SEQ ID NO：31GGAGTTGAAG GTAGTTTCGT G                 21

Claims (62)

1、一种分离的核酸，其编码包括如下特征性氨基酸序列并具有促进内皮细胞或中胚层细胞增殖性质的蛋白质，所述的特征性氨基酸序列为：
Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys(SEQ ID NO：16)，所述的核酸选自图1和2的DNA(SEQ ID NO：1)，图3的DNA(SEQ ID NO：4)，图5的DNA(SEQ ID NO：6)，图7的DNA(SEQ ID NO：8)，图10的DNA(SEQ IDNO：10)，图12的DNA(SEQ ID NO：12)，图14的DNA(SEQ ID NO：14)，以及在严格条件下与至少一种前述DNA序列杂交的核酸，所述的严格条件为42℃、50％甲酰胺、5×SSC pH7.0或5×SSPE缓冲液、1％-2％SDS、5-10×Denhardt’s溶液和100μg/ml鲑精DNA。
2、权利要求1的核酸，其中所述的核酸是cDNA。
3、权利要求1的核酸，包括对应于图1和2的DNA(SEQ ID NO：1)的cDNA。
4、权利要求1的核酸，其中所述的核酸序列是哺乳动物DNA。
5、权利要求4的核酸，其中所述的核酸是小鼠DNA。
6、权利要求4的核酸，其中所述的核酸是人DNA。
7、权利要求1的核酸，其中所述的核酸编码一种促进血管内皮细胞增殖的蛋白质。
8、权利要求1的核酸，包括对应于图3的DNA(SEQ ID NO：4)的cDNA。
9、权利要求1的核酸，包括对应于图5的DNA(SEQ ID NO：6)的cDNA。
10、权利要求1的核酸，包括对应于图7的DNA(SEQ ID NO：8)的cDNA。
11、权利要求1的核酸，包括对应于图10的DNA(SEQ ID NO：10)的cDNA。
12、权利要求1的核酸，包括对应于图12的DNA(SEQ ID NO：12)的cDNA。
13、权利要求1的核酸，包括对应于图14的DNA(SEQ ID NO：14)的cDNA。
14、一种载体，包括与一启动子序列可操纵连接的权利要求1的核酸。
15、权利要求14的载体，其中所述的载体是真核载体。
16、权利要求14的载体，其中所述的载体是原核载体。
17、权利要求14的载体，其中所述的载体是质粒。
18、一种分离的蛋白质，其显示如下特征性氨基酸序列并具有促进内皮细胞或中胚层细胞增殖性质，所述的特征性氨基酸序列为：
Pro-Xaa-Cys-Val-Xaa-Xaa-Xaa-Arg-Cys-Xaa-Gly-Cys-Cys(SEQ ID NO：16)，所述的蛋白质包括基本上对应于选自如下一组的氨基酸序列的氨基酸序列，所述的组为图1的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，图2的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)，图4的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)，图6的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)，图8的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)，图11的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)，图13的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)，图15的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。
19、权利要求18的分离的蛋白质，其中所述的蛋白质包括对应于图1的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列。
20、权利要求18的分离的蛋白质，其中所述的蛋白质包括对应于图2的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列。
21、权利要求18的分离的蛋白质，其中所述的蛋白质包括对应于图4的氨基酸序列(SEQ ID NO：5)的氨基酸序列。
22、权利要求18的分离的蛋白质，其中所述的蛋白质包括对应于图6的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)的氨基酸序列。
23、权利要求18的分离的蛋白质，其中所述的蛋白质包括对应于图8的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)的氨基酸序列。
24、权利要求18的分离的蛋白质，其中所述的蛋白质包括对应于图11的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)的氨基酸序列。
25、权利要求18的分离的蛋白质，其中所述的蛋白质包括对应于图13的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)的氨基酸序列。
26、权利要求18的分离的蛋白质，其中所述的蛋白质包括对应于图15的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)的氨基酸序列。
27、权利要求18的分离的蛋白质，其中所述的蛋白质为哺乳动物蛋白质。
28、权利要求27的分离的蛋白质，其中所述的蛋白质是小鼠蛋白质。
29、权利要求27的分离的蛋白质，其中所述的蛋白质是人蛋白质。
30、权利要求18的分离的蛋白质，其中所述的蛋白质促进血管内皮细胞的增殖。
31、由选自如下一组的DNA表达而生产的分离的蛋白质，所述的组为图1和2的DNA(SEQ ID NO：1)，图3的DNA(SEQ ID NO：4)，图5的DNA(SEQ IDNO：6)，图7的DNA(SEQ ID NO：8)，图10的DNA(SEQ ID NO：10)，图12的DNA(SEQ ID NO：12)，图14的DNA(SEQ ID NO：14)，以及在严格条件下与至少一种前述DNA序列杂交的DNA，所述的严格条件为42℃、50％甲酰胺、5×SSCpH7.0或5×SSPE缓冲液、1％-2％SDS、5-10×Denhardt’s溶液和100μg/ml鲑精DNA。
32、一种药物组合物，包括促进内皮或中胚层细胞增殖有效量的权利要求18的蛋白质，以及至少一种常规的药物载体或稀释剂。
33、一种与权利要求18的蛋白质反应的抗体。
34、权利要求33的抗体，其中所述的抗体是单克隆抗体。
35、一种宿主细胞，其用权利要求14的载体转化或转染，从而所述的宿主细胞表达一种具有促进内皮细胞或中胚层细胞增殖性质的蛋白质。
36、权利要求35的转染的宿主细胞，其中所述的宿主细胞是真核细胞。
37、权利要求35的转染的宿主细胞，其中所述的宿主细胞是COS细胞。
38、权利要求35的转化的宿主细胞，其中所述的宿主细胞是原核细胞。
39、权利要求35的转化的宿主细胞，其中所述的宿主细胞是293EBNA细胞。
40、权利要求35的转化的宿主细胞，其中所述的宿主细胞是昆虫细胞。
41、一种用于定量检测测试样品中的VEGF-B的诊断工具，所述的工具包括权利要求33的抗体，该抗体与VEGF-B反应以检测样品中VEGF-B的量。
42、权利要求41的诊断工具，其中所述的抗体是标记抗体。
43、一种药物组合物，包括结合VEGF-B有效量的权利要求33的抗体，以及至少一种药物学可接受的载体或佐剂。
44、一种药物组合物，包括促进内皮或中胚层细胞增殖有效量的权利要求18的蛋白质，以及VEGF。
45、权利要求44的药物组合物，进一步包括肝素，肝素的量应足以保证促进细胞增殖量的所述的蛋白质游离存在，不与细胞结合。
46、权利要求32的药物组合物，进一步包括肝素，肝素的量应足以保证促进细胞增殖量的所述的蛋白质游离存在，不与细胞结合。
47、一种药物组合物，包括刺激血管生成有效量的权利要求18的蛋白质，以及肝素。
48、一种分离的蛋白质二聚体，包括权利要求18的蛋白质。
49、权利要求48的分离的蛋白质二聚体，其中所述的蛋白质二聚体是所述蛋白质的同二聚体。
50、权利要求48的分离的蛋白质二聚体，其中所述的蛋白质二聚体是所述蛋白质和VEGF的异二聚体。
51、权利要求48的分离的蛋白质二聚体，其中所述的蛋白质二聚体是二硫键键合的二聚体。
52、一种促进至少一种选自权利要求18的蛋白质和VEGF组成的一组的蛋白质从表达所述的至少一种蛋白质的细胞释放的方法，所述方法包括将细胞与肝素接触。
53、一种载体，其包括一种与权利要求1的核酸序列的至少一部分互补的反义核苷酸序列。
54、一种阻止VEGF-B从表达VEGF-B的细胞表达的方法，所述的方法包括用权利要求53的载体转染所述的细胞。
55、权利要求54的方法，其中所述的细胞是肿瘤细胞。
56、一种分离的核酸，包括对应于图25的序列(SEQ ID NO：17)的核苷酸序列或者在严格条件下与所述的核苷酸序列杂交的核酸，所述的严格条件为42℃、50％甲酰胺、5×SSC pH7.0或5×SSPE缓冲液、1％-2％SDS、5-10×Denhardt’s溶液和100μg/ml鲑精DNA。
57、一种用载体转化或转染从而使其表达VEGF-B蛋白的宿主细胞，所述的载体包括与合适的启动子可操纵连接的权利要求1的核酸序列。
58、权利要求57的宿主细胞，其中所述的VEGF-B蛋白包括基本上对应于选自如下一组的氨基酸序列的氨基酸序列，所述的组为图1的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，图2的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)，图4的氨基酸序列(SEQID NO：5)，图6的氨基酸序列(SEQ ID NO：7)，图8的氨基酸序列(SEQ ID NO：9)，图11的氨基酸序列(SEQ ID NO：11)，图13的氨基酸序列(SEQ ID NO：13)，图15的氨基酸序列(SEQ ID NO：15)。
59、一种用于在测试样品中检测VEGF-B的诊断工具，所述的工具包括至少一对与权利要求1的核酸序列互补的引物。
60、权利要求59的诊断工具，其中所述的引物为PCR引物，其用于经聚合酶链反应扩增测试的VEGF-B基因以实现测试的VEGF-B基因与权利要求1的核酸序列的序列对比。
61、一种从细胞获得至少一种选自权利要求18的蛋白质和VEGF组成的一组的蛋白质的方法，所述的细胞表达所述的至少一种蛋白质，所述方法包括
将细胞与肝素接触以诱导所述的至少一种蛋白质释放，以及
收集释放的蛋白质。
62、一种制备适于表达VEGF-B蛋白质的载体的方法，所述的方法包括将权利要求1的核苷酸序列以与合适的启动子呈可操纵连接关系掺入载体。
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