CN1327452A - 具有肝细胞增殖活性的成纤维细胞生长因子 - Google Patents

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Abstract

本发明发现并纯化了成纤维细胞生长因子(FGF)家族多肽的一个新增成员;发现该成员具有肝细胞特异的分裂原活性,这使其与其他FGF成员区分开来。编码此多肽的DNA分子可通过基因治疗的方式施用以体内刺激肝细胞的增殖,或替代地,可通过重组的方法生产这种多肽以用于细胞培养或用于治疗要求肝细胞再生和生长的肝病的治疗用途。

Description

具有肝细胞增殖活性的成纤维细胞生长因子
发明领域
本发明涉及一种多肽(此处指的是命名为“FGF16”的多肽)，该多肽为成纤维细胞生长因子家族新近发现的一员，以及涉及该多肽的同源物、类似物以及衍生物，还涉及编码这些多肽的核酸分子，涉及重组生产这些多肽的方法，涉及抗这些多肽的抗体以及这些多肽的使用方法，和这些多肽用于治疗目的的药用组合物。
发明背景
现在已知成纤维细胞生长因子(FGF)家族有至少14个成员，即FGF-1至FGF-10以及同源因子FHF-1至FHF-4。
最初被当作成纤维细胞促分裂原从大脑和垂体分离得到的FGF-1(aFGF)和FGF-2(bFGF)在发育中的和成体的组织中广泛地表达。这些多肽表现出多样的生物学活性，包括促血管生成，促有丝分裂，细胞分化和伤口愈合，参见Baird等Cancer Gells，第3卷，第239-243页(1991)和Burgess等，Annul Review of Biochemistry，第58卷，第575-606页(1989)。FGF-3(也称为”int-2”)，FGF-4(也称为“hst/kFGF”)，FGF-5和FGF-6最初都被鉴定为癌基因的产物：见Dickson等，Annual Reviewof the New Youk Academy of Sciences，第683卷，第18-26页(1991)；Yoshida等，Annual Reviews of the New York Academy of Sciences，第683卷，第27-37页(1991)；Goldfarb等，Annual Reviews of the NewYork Academy of Sciences，第683页，第38-52页(1991)；和Coulier等，Annual Reviews of the New York Academy of Sciences，第683卷，第53-61页(1991)。FGF-7(也称为“KGF”)是作为培养角化细胞的促分裂因子被分离的；参见Aaronson等，Annual Reviews of the NewYork Academy of Sciences，第683卷，第62-77页(1991)。FGF-8和FGF-9分别是作为雄激素诱导的生长因子和神经胶质细胞激活因子从小鼠乳腺癌细胞中和人神经胶质瘤细胞中分离得到的；参见Tanaka等，Proceeding of the National Academy of Sciences USA，第89卷，第8928-8932页(1991)；和Miyamoto等，Molecular Cell Biology，第13卷，第4251-4259页(1993)。FGF-10是通过基于同源性的聚合酶链式反应(PCR)从大鼠胚鉴定得到的；参见Yamasaki等，Journal ofBiological Chemistry，第271卷，第15918-15921页(1996)。这些FGF主要在胚胎发育过程中和一些成体组织中表达。
四种同源因子(或“FHF”)是通过联合使用随机cDNA测序，搜索存在的序列数据库和基于同源性的聚合酶链式反应从人视网膜鉴定得到的；参见Smallwood等，Proceedings of the National Academy ofSciences USA，第93卷，第9850-9857页(1996)。这些FHF主要在发育的和成熟的神经系统中表达。根据命名委员会(NomenclatureCommittee)的建议有人提出FHF-1，FHF-2，FHF-3和FHF-4，应分别命名为FGF-11，FGF-12，FGF-13和FGF-14；参见Coulier等，分子进化杂志，第44卷，第43-56页(1997)。
发明概述
简而言之，本发明包括了成纤维细胞生长因子(FGF)多肽家族的一新增成员，此处命名为FGF-16，的发现和鉴定，以及该多肽的肽片段及类似物，以及编码这些多肽的核酸分子(包括简并序列)。具有相似的生物学活性并保留了同样的生物学功能的上述多肽的化学衍生物(即多聚体)，片段和以及由该多肽的替代序列组成的类似物也包括在本发明的范围内。本发明的方面进而包括可用于表达该核酸分子和重组生产该肽段的载体和转化宿主。作为进一步的方面，本发明包括使用核酸分子或多肽在体内与体外刺激肝细胞的增殖和发育，包括用核酸以及编码的多肽治疗肝脏疾病。
附图简述
图1.此图(包括图1A与图1B)描述了大鼠FGF-16cDNA编码区从核苷酸17到核苷酸637(SEQ ID NO：1)的核酸序列，以及编码多肽预测的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)。核酸序列中的起始与终止密码子用下划线表示。在每个核苷酸之上的数字与每个氨基酸之下的数字分别代表核苷酸与氨基酸序列。
图2.此图比较了大鼠FGF-16与大鼠FGF-9(SEQ ID NO：3)的氨基酸序列。数字分别代表相应的氨基酸残基的位置。星号代表FGF-16与FGF-9中这些氨基酸残基是相同的。
图3.此图示明从转染了含大鼠FGF-16cDNA的重组杆状病毒Sf9细胞的裂解液中检测到了重组FGF-16。将感染了杆状病毒的Sf9细胞的培养基与细胞抽提物进行SDS聚丙烯酰胺凝胶(12.5％)电泳。重组大鼠FGF-16用抗E标记的抗体通过Western免疫印迹法进行检测。第1道，细胞裂解液；第2道，培养基。用预染色的宽范围蛋白质分子量标准(New England Biolabs，Beverly，Massachusetts)估计多肽的分子量。
图4.此图示明大鼠FGF-16mRNA在不同的成体组织中的表达。RNA的等份试样(每个10微克)在含甲醛的变性琼脂糖凝胶(1％)上进行电泳，然后转移到硝酸纤维素膜上。杂交用32P标记的大鼠FGF-16cDNA作为探针进行。28S和18S RNA分别用“28S”和“18S”标示。泳道“Br”，“He”，“Lu”，“Li”，“Ki”，“BA”和“WA”分别表示源自成体大脑，心脏，肺，肝，肾，褐色脂肪组织和白色脂肪组织的mRNA。
图5.此图由A，B和C组成，描述FGF-16mRNA在大鼠胚胎(E19)的矢状切片的定位。矢状切片与35S标记的反义(图5B)或有义(图5C)FGF-16cDNA探针杂交。该切片还用苏木精和曙红复染(图5A)。标记“He”和“BA”分别代表心脏组织和褐色脂肪组织。
图6.此图(由图6A和图6B组成)描述了全长人FGF-16cDNA编码区的核苷酸序列，开始于核苷酸23，终止于核苷酸643(SEQ ID NO：4)，以及编码多肽的预测氨基酸序列(SEQ ID NO：5)。核酸序列中的起始和终止密码子用下划线表示。
图7.此图，由A，B，C和D组成，示明了源自两只注射了对照缓冲液的小鼠的BrdU-标记的肝脏切片(分别为图7A和图7B)，与之相邻的是源自注射了大鼠FGF-16的des-34截短N-末端类似物(“des-N-34”)的小鼠的BrdU-标记的肝脏切片(分别为图7C和图7D)，注射剂量为每天每千克体重5毫克，注射7天。比较结果表明用des-N-34处理的小鼠的肝细胞BrdU标记明显升高。
发明详述
除了图1A和1B中的多肽(SEQ ID NO：2)和图6A和6B中的多肽(SEQ ID NO：5)外，这些多肽基本上的生物学对等物或具有其一种或多种重要生物学特性，如肝细胞增殖和生长活性，的片段(即“亚序列”)，类似物和衍生物也作为本发明的一部分包括在本发明中。“实质上的生物学对等物”意思是具有与此处所描述的多肽相同的特性，尽管程度可能不同。优选地是，这样的类似物能与抗图1A-1B和图6A-6B中的多肽的抗体交叉反应。术语“类似物”特指源自图1A-1B和图6A-6B中的全长多肽的线性氨基酸排列并呈现一个或多个氨基酸的替代，缺失和/或增加，并且同时是上述多肽实质上的生物学对等物或具有其一种或多种生物学特性的分子。
根据本发明尤为优选的多肽类似物与图1A-1B(SEQ ID NO：2)和图6A-6B(SEQ ID NO：5)中的多肽具有大于80％的同源性(即氨基酸残基的相同性)，最为优选的类似物同源性大于90％。
序列相同性百分数的确定可利用常用于比较两个多肽的氨基酸位置相似性，以得到两段序列的最优序列对比的常规方法。例如，利用已知的计算机程序如BLAST或FASTA对比两段多肽以使两个多肽相应的氨基酸匹配得最好(沿着一个或两个序列的全长或沿着一个序列或两个序列的既定部分)。这些程序提供了“缺省”开口补偿(“default”openingpenalty)和“缺省”缺口补偿(“default”gap penalty)，以及评分模型(scoring matrix)如PAM 250。一种标准的评分模型可以和计算机程序联合使用；参见Dayhoff等，在Atlas of Protein Sequence andStructure，第5卷，增刊3(1978)。然后可如下计算相同性百分率(或此处所用的“同源性”)：
((完全相同匹配的总数)/(对比区域的残基数，不包括任一端或两端的不相同残基以及和缺口相对的残基))×100
如上所述，根据本发明的多肽类似物典型地具有一个或多个氨基酸的取代，缺失和/或插入。通常替代是保守的，从而使之对蛋白质整体净电荷、极性或疏水性的影响很小或没有。保守替代的例子见下文。
             氨基酸的保守替代
             碱性：            精氨酸
                               赖氨酸
                               组氨酸
             酸性：            谷氨酸
                               天冬氨酸
             极性：            谷氨酰胺
                               天冬酰胺
             疏水：            亮氨酸
                               异亮氨酸
                              缬氨酸
             芳香：           苯丙氨酸
                              色氨酸
                              酪氨酸
             小：             甘氨酸
                              丝氨酸
                              丙氨酸
                              苏氨酸
                              甲硫氨酸
本发明的多肽可能有也可能没有氨基端的甲硫氨酸，这与其制备方式有关。通常，当多肽是以非分泌型细菌(如E.coli)菌株为宿主通过重组的方式生产时具有氨基端的甲硫氨酸。
本发明包括在内的多肽片段(即亚序列)为长度比全长序列短，但具有基本相同的生物学活性并在氨基端，羧基端和/或中间被截短的序列。
包含氨基酸截短序列的FGF-16类似物包括在从N端开始至约35位氨基酸的区域从全长成熟序列(207个氨基酸)省略一个或几个氨基酸残基的序列(在此用“des-N”类似物表示)。在从C端开始至约19位氨基酸的区域省略一个或几个氨基酸残基的截短类似物也包括在内(在此用“des-C”类似物表示)。在这些FGF-16多肽的C端截短序列中包括氨基酸残基在N端被省略的情况。
当在GFG-16的天然存在(即“天然”)氨基酸序列中替代或省略特定的氨基酸残基时优先选择相对保守的替代，以使对所需的生物学特性的负面影响不太严重。因此，例如，如果对已知或怀疑参与受体特异性或肝素结合的残基或区域的替换影响上述特性的话应避免这样的替换。在人和大鼠中FGF-16从酪氨酸147至酪氨酸161的区域被相信对受体的结合特性是重要的。对肝素结合重要的位点(大鼠的和人的)包括精氨酸68，苏氨酸69，天冬酰胺142，天冬酰胺166，赖氨酸167，精氨酸172，精氨酸176，谷氨酰胺181，赖氨酸182和苯丙氨酸183。
通常，根据本发明的多肽类似物，片段和衍生物的用途与SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：5相同，尤其是可用作肝细胞体内和体外增殖和生长的刺激因子。核酸
本发明还包括了编码上述任何多肽的核酸分子。因此除了图1A和1B(SEQ ID NO：1)与图6A和图6B(SEQ ID NO：4)中所示的特定序列的核酸分子外本发明还包括从上述序列简并的编码相同多肽的核酸序列(即相差一个或多个碱基)。此外本发明还包括编码此处所描述多肽具有生物学活性的前体、片段和衍生物的核酸分子。进而，本发明包括了编码互补(即反义)链的核酸分子，以及与图1A和1B或图6A和图6B中的核酸分子杂交(或者要不是由于密码子的简并造成的核酸序列差异的话能够杂交)的核酸分子，或能与它们的片段或简并序列或互补链杂交的核酸分子，上述杂交优选地是在相对严格条件下进行的(例如下文所描述的条件)。本发明还包括了可能编码与成熟多肽(即从宿主得到的加工后的多肽)编码区的5’或3’侧翼的另加氨基酸的核酸分子，如编码供选的pre/pro区(即负责多肽通过细胞膜分泌的序列)以替代“天然”pre/pro区的序列。根据宿主细胞的不同，另加序列也可包括非编码序列，包括调节序列如转录或翻译的启动子。核酸分子甚至可以包括各种已知在基因中出现的内部非编码序列(内含子)。
通常，此处所用的术语“严格条件”指使结合的核酸分子如寡聚核酸或cDNA分子达到很高同源性的杂交和洗涤条件。
一种适于cDNA探针在55℃-65℃使用的严格洗涤溶液由0.015M氯化钠，0.0015M柠檬酸钠(0.1×SSC，其中1×SSC＝0.15M氯化钠和0.015M柠檬酸钠)以及0.1％SDS组成。另一种严格性略差的洗涤溶液由0.2×SSC和0.1％SDS组成，可在50℃到65℃之间使用。
用寡聚核苷酸探针筛选cDNA或基因组文库时可使用如下的严格洗涤条件。一种方法用6×SSC加0.05％焦磷酸钠，根据寡聚核苷酸探针长度的不同在35℃到62℃之间进行。例如，14碱基对的探针在35℃-40℃洗涤，17碱基对的探针在45℃-50℃洗涤，20碱基对的探针在52℃-57℃洗涤，23碱基对的探针在57℃-63℃洗涤。背景的非特异性结合过高时可将温度升高2℃-6℃。另一种方法利用氯化四甲基铵(TMAC)洗涤寡聚核苷酸探针。一种适当的严格洗涤溶液由3M TMAC，50mM Tris-HCl，pH8.0和0.2％SDS组成。此溶液使用的洗涤温度是探针长度的函数。例如，17碱基对的探针通常在约45-50℃洗涤。
与上述任何DNA分子同源的RNA分子也包括在本发明的范围内。重组表达
本发明的多肽可以通过众所周知的重组技术方法制备，如Sambrook等，分子克隆：实验手册，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港(1989)和/或Ausubel等，编辑，分子生物学流行方法，Green Publishers Inc.andWiley and Sons，New Youk(1994)中所阐述的方法。可通过筛选基因组文库或cDNA文库的方法或经过PCR扩增得到编码多肽或其截短序列的基因或cDNA。替代地，编码多肽的DNA分子可由熟练技术人员所熟知的方法，如Engels等在Angew.Chem.Intl.Ed.，Volume 28，pages716-734(1989)中描述的方法，通过化学合成制备。通常编码多肽的DNA长度为几百个核苷酸。大于约100个核苷酸的核酸可以以几个片段的形式用同样的方法合成，然后连接在一起以形成所需长度的核苷酸序列。
本发明的核酸分子(基因或cDNA)可被插入到适当的表达载体中以通过重组的方法在适当的宿主组织或细胞中表达。选择的载体应是在特定使用的宿主中具有功能的(即载体与宿主细胞的机制相容，从而该基因能进行扩增和/或表达)。多肽、片段和类似物的扩增/表达可以以原核细胞、酵母、昆虫(杆状病毒系统)和/或真核宿主细胞，或转基因的非人类动物为宿主。宿主细胞的选择至少部分依赖于多肽表达产物是否糖基化。如果需要糖基化那么优选酵母，昆虫或哺乳动物宿主细胞，因为酵母细胞能糖基化多肽，而昆虫和哺乳动物宿主细胞能以类似于“天然”糖基化和/或磷酸化的方式糖基化和/或磷酸化多肽。
用于在任何宿主细胞中表达多肽的载体都也可含有5’侧翼序列(也称为“其启动子”)和其它可操作地连接到待表达的核酸分子(DNA)上的表达调控元件，以及增强子、复制元件起点、转录终止元件、含供体和受体剪切位点的内含子全序列、信号肽序列、核糖体结合位点元件、多聚腺苷酸序列、用于插入编码待表达多肽的核酸的多连接位点区域和选择标记元件。这些元件将在下文分别讨论。
供选地，载体还可含有“标记”序列，即位于多肽编码序列的5’或3’端编码多聚组氨酸(如六组氨酸)或另一种小免疫原性序列的寡聚核苷酸序列。这种标记将与蛋白质一起表达，可作为从宿主细胞中纯化多肽的亲和标记。供选地，可利用各种方法从纯化后的多肽除去标记，例如通过使用选择性的肽酶。
5’侧翼序列可以是天然5’侧翼序列，或者可以是同源(即源自与宿主相同的种和/或株)，异源的(即源自另一宿主种或株)，杂合的(即源自一种以上来源的5’侧翼序列的组合)和/或合成的。5’侧翼序列的来源可以是任何单细胞原核或真核有机体，任何脊椎动物或非脊椎动物，或任何植物，前提是该5’侧翼序列在宿主的细胞机制里是有功能的并能被激活。
5’侧翼序列未知时可以从可能含，例如，一个编码序列或甚至是另一个或一些基因的更大的一段DNA中分离含5’侧翼序列的DNA片段。分离可以通过使用一种或多种仔细选择的酶经过限制性内切酶消化以分离恰当的DNA片段来完成。消化后所需的片段可通过琼脂糖凝胶纯化，或以本领域的技术人员已知的其它方法分离。对于本领域的技术人员而言达到此目的所需酶的选择是显而易见的。
复制元件的起点通常是商业途径购买的原核表达载体的一部分，它帮助载体在宿主细胞中的复制。在一些情况下将载体扩增到一定的拷贝数对多肽的最佳表达是很重要的。如果选择的载体不含复制原点，可根据已知序列化学合成并然后连接进该载体中。
转录终止元件通常位于多肽编码序列的3’端，它起终止多肽转录的作用。通常原核细胞中的转录终止元件是一个富含G-C的片段，其后是多聚-T序列。尽管此元件很容易从文库中克隆得到，甚至可作为载体的一部分由商业途径得到，它也可很容易地通过上述的核酸合成方法合成得到。
选择标记基因元件编码对于宿主细胞在选择性培养基中生存和生长必需的蛋白质。通常选择标记基因为(a)编码赋予原核宿主细胞抗抗生素或其它毒素，如氨苄青霉素、四环素、或卡那霉素抗性的蛋白质，(B)营养缺陷型细胞的互补基因，(c)提供复合培养基中没有的重要养分的基因。优选的选择标记为卡那霉素抗性基因，氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。
核糖体结合元件，通常称为Shine-Dalgarno序列(原核生物中)或Kozak序列(真核生物中)，对于mRNA翻译的启动是必需的。该元件通常位于启动子的3’和待合成多肽编码序列的5’端。Shine-Dalgarno序列是变化的，但通常为多嘌呤(即A-G含量高)。已经鉴定了多种Shine-Dalgarno序列，每种都易于用上述的方法合成并被应用于原核载体。
在需要多肽从宿主细胞分泌的情况下可使用一段信号序列将多肽引导出其被合成的宿主细胞。通常信号序列位于核酸序列的编码区，或直接位于编码区的5’端。已有多种信号序列得以鉴定，任何在所选的宿主细胞中具有功能的都可在此使用。这样信号序列可以是与多肽同源或异源的。并且信号序列可用上文所述的方法化学合成。
宿主细胞可以是原核宿主细胞(如E.coli)或真核宿主细胞(如酵母、昆虫或脊椎动物细胞)。在适当的营养条件下培养时，宿主细胞可合成多肽，随后可通过从培养基中分离(如果宿主细胞将其分泌到培养基中)或直接从产生多肽的宿主细胞(如果不分泌)中分离收集多肽。收集后多肽可以通过诸如分子筛层析或亲和层析等等方法纯化。通常，如果多肽在E.coli中表达，在回收形式中它将在其N末端具有一个甲硫氨酸残基(即Met-1)，除非是在宿主能将甲硫氨酸酶切除去的E.coli菌株中表达。
适用的细胞或细胞系也可以是动物细胞，尤其是哺乳动物细胞，如中华仓鼠卵巢细胞(CHO)或3T3细胞。适当哺乳动物宿主细胞的筛选和转化，培养，扩增，筛选以及产品生产和纯化的方法在本领域中是已知的。其它适合的哺乳动物细胞系为猴COS-1和COS-7细胞系，以及CV-1细胞系。进一步的范例哺乳动物宿主细胞系包括灵长类细胞系和啮齿类细胞系，包括转化细胞系。正常的双倍体细胞，源自原代组织体外培养物的细胞株和原代外植体也是适用的。供选的细胞可以是遗传缺陷选择基因或者具有显性作用的选择基因。其它适用的哺乳动物细胞系包括，但不限于，Hela，小鼠L-929细胞，源自Swiss，Balb-c或NIH小鼠，的3T3细胞系，BHK或HaK仓鼠细胞系。
将载体插入(也称为转化或转染)所选的宿主细胞可通过氯化钙、电穿孔、微量注射、脂质体转染或DEAE-dextran方法完成。具体方法的选择将，部分，依赖于所使用的宿主细胞的类型。这些方法和其它适用的方法对于技术熟练的人员而言是已知的。例如，参见Sambrook等，同上。
带有载体的宿主细胞的培养可用本领域的技术人员熟知的标准培养基进行。培养基通常含有对转化细胞的生长和生存必需的全部养分。培养E.Coli细胞的适用培养基为，如，Luria Broth(LB)和/或TerrificBroth(TB)培养基。培养真核细胞的适用培养基为RPMI 1640，MEM，DMEM，所有的这些培养基都补充以血清和/或所培养的特定细胞系所要求的生长因子。适于培养昆虫细胞的培养基为Grace’s培养基补充以yeastolate，乳清蛋白水解物和/或胎牛血清，如果有必要的话。
通常在培养基中添加抗生素或其它用于使转化细胞选择性地生长的化合物。使用的化合物决定于转化宿主细胞的质粒上的选择标记元件。例如，当选择标记元件为卡那霉素抗性时加入到培养基的化合物就为卡那霉素。
在宿主细胞中产生的多肽的量可通过本领域中已知的标准方法测定。这样的方法包括，但不限于，Western免疫印迹法分析，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，非变性胶电泳，HPLC分离，免疫沉淀，和/或活性分析如DNA结合胶漂移实验(DNA binding gel shift assays)。
如果多肽的设计使其分泌出宿主细胞，可能大部分多肽将出现在细胞培养基里。另一方面，如果，多肽不是分泌的，那么它将出现在胞浆里(对真核细胞，革兰氏阳性细菌和昆虫宿主细胞)或在周质腔里(对革兰氏阴性菌宿主细胞)。
对细胞内多肽通常首先用机械的方法或低渗透压破宿主细胞，将胞浆内容物释放到缓冲液中。然后从此溶液中分离多肽。此后可通过多种技术从溶液中纯化多肽。如果合成的多肽在氨基端或羧基端具有如6组氨酸或其它小肽的标记，将上述溶液通过柱填料对标记，或直接对多肽(即单克隆抗体)具有高亲和性的亲和柱可能一步完成上述多肽的纯化。例如，多聚组氨酸特异且高亲和性地结合镍，因此镍亲和柱(如Qiagen镍亲和柱)可用于纯化(例子参见Ausubel等，编辑，分子生物学流行方法，John Wiley&Sons，New York，1994)。
另一方面，当多肽无标记或不能获得抗体时，可使用其它众所周知的方法进行纯化。这样的方法包括，但不限于，离子交换层析、分子筛层析、疏水相互作用层析、反相色谱，天然胶电泳结合胶洗脱，和制备等电聚焦电泳。这些操作可在HPLC系统或低压系统中进行。在一些情况下可联合使用两种或多种技术以提高纯度。
如果预期多肽主要出现在细菌的周质腔或真核细胞的胞浆里，周质腔或胞浆的内容物，包括包涵体(例如革兰氏阴性菌)，如果待处理的多肽形成这样的复合物的话，可用任何本领域的技术人员已知的标准技术从宿主细胞中抽提出来。例如宿主细胞可用Frehch press、匀浆和/或超声裂解以从周质腔中释放内容物。然后匀浆可被离心。
其它DNA表达的方式
除了刚才描述的在异源宿主中重组表达的常规方法外，本发明多肽的表达还可用其它已知的方法进行，这些方法可能使用也可能不使用表达载体。
例如，不使用表达载体的同源重组技术可用于促进本发明的多肽的表达。例如，一个恰当的含调控元件的DNA构建体可通过同源重组的方法被插入到细胞基因组中与编码FGF-16的内源基因片段的邻近并在原位刺激其表达。参见美国专利申请号第5,272,071(Chappel)号。然后收集和纯化表达的多肽产物，其应用可以与在异源宿主中重组表达的多肽相同。
替代地，此处所描述的分离的核酸分子可以直接用于细胞或基因治疗。适合于基因治疗的载体如反转录病毒载体或腺病毒载体是已知的，并可进行修改以掺入编码根据本发明的多肽的核酸从而对病人施用并在体内所需的部位表达。例子参见Verma，Scientific American 58-84页(November，1990)。在这些情况下编码多肽或其片段或其变体的基因组DNA、cDNA和/或合成DNA可以被可操作地连接到一个在所需表达的组织中有活性的组成型或诱导型的启动子上，然后插入一个适当的载体。在一种具体的应用方法中细胞被从病人的身体中取出，用基因治疗载体通过常规转染真核细胞的方法转染，然后测试多肽的表达和分泌。这样的细胞可以是，例如，肝细胞、骨髓细胞、源自脐带的细胞或血液前体细胞。替代地可以用DNA调控元件或片段预处理这些细胞以通过同源重组以上文描述的方式激活编码多肽的内源DNA分子的基因表达。这些表达和分泌多肽的细胞可以被重新导入病人体内从而使它们存活并在原位作为区域性的多肽源。可调节细胞输送使之耐受预定的时间，如几天或几个星期或几个月，在预定时间快结束时接受者将接受另一“剂”(即重新移植分泌多肽的细胞)。
其它方法包括将DNA构建体定向输送到体内的组织或器官以在原位表达治疗上有效的量，如下文详细描述。
多肽衍生物
化学修饰的多肽，其中多肽被连接到一个多聚物上以修饰其特性(此处称为衍生物)，包括在本发明的范围内。多聚物通常为水溶性的，从而使结合到其上的蛋白质不会在水环境下，如生理环境下，沉淀。多聚物可以具有单一的活性基团，如酰化的活性酯或烷基化的醛，以使聚合的程度可控制。一种优选的活性醛为水溶性的聚乙二醇丙醛，或其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(见美国专利申请第5,252,714号)。多聚物可以是分支的或非分支的。优选地对于作为治疗用的终产物的制品，多聚物应是药用上可接受的。例如，水溶性聚合物或，如果需要的话，它们的混合物可选自以下一组：聚乙二醇(PEG)，单甲氧基聚乙二醇，葡聚糖，纤维素，或其它以碳水化合物为基础的多聚物，聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇同型聚合物，氧基/丙氧基共聚物，polyoxyethylated polyols(如甘油)和聚乙烯醇。
药用组合物
为了治疗的目的，本发明的多肽或其片段、类似物或衍生物通常被配制成适当的适于治疗传递的药用组合物，这构成了本发明的另一方面。这样的药用组合物通常单独包含有效量的多肽(或其片段、类似物或衍生物)，或还含有一种或多种载体，赋形剂或其它药用组合物的常规成分。“有效量”指足以对处理的细胞或器官产生可测量的生物效应，如肝细胞的增殖或生长或肝组织的再生(详情见下文)。载体物质可以是注射用的水，优选地补充了其它在哺乳动物施用溶液中常见的其它物质。通常多肽的施用形式为含有纯化的多肽(可以是化学修饰的)和一种或几种生理上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的组合物。合适载体的例子如中性缓冲盐溶液或混合了血清白蛋白的盐溶液。如果需要的话也可含有其它常用的载体、稀释剂和赋形剂。
通过将具有所需纯度的选定组合物与供选的生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Remington’s Pharmaceutical Sciences，18thedition，A.R.Gennaro，ed.，Mack Publishing Company，1990)混合成冻干饼或水溶液的形式可制备储藏形式的药用组合物。可接受的载体、赋形剂或稳定剂对接受者是无毒的，并且优选在所施用的剂量和浓度下是惰性的，包括缓冲液如磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、琥珀酸盐或其它有机酸盐；抗氧化剂如抗坏血酸；低分子量多肽；蛋白如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；疏水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、蔗糖、乳糖或糊精；螯合试剂如EDTA；糖醇如甘露糖醇或山梨糖醇；盐形成的平衡离子如钠离子；和/或非离子表面活性剂如Tween或Pluronics。
本发明的任何预备用于体内施用的组合物都必需是无菌的。除菌可很容易地通过无菌过滤膜的过滤实现。当组合物被冻干时可在冻干和重新溶解之前或之后用此方法进行除菌。用于非肠道施用的组合物通常以冻干的形式或以溶液的形式储存。
优选的稳定剂
通过加入有机的或无机的硫酸盐(例如硫酸钠或硫酸铵)和EDTA可增强本发明的多肽在室温或室温以上或以下的温度缓冲液中的稳定性，并减小任何蛋白聚合的倾向。优选地使用的硫酸盐的量为10mM或更大，EDTA的量为约1μM至约10mM。
用药的剂量和途径
在具体病情和条件下用多肽治疗的有效剂量依赖于多肽和病情或条件的性质，以及接受者的年龄和总体健康状况，有效剂量可通过常规的临床方法确定。如果可能的话在人体实验之前需要先在体外，如在生物测试系统中，测定药用组合物的剂量-反应曲线然后在有用的动物模型系统中体内测试。通常，根据类似物所基于的野生型蛋白质已知的有效治疗剂量知识可得到恰当的体内有效剂量。技术熟练的实践者在考虑了治疗背景、待治疗疾病的类型以及其它可应用的因素后不需要过多的努力就能确定恰当的剂量。对人体的体内用药而言预期大约在30毫克至300毫克每千克体重每天的剂量是足够的。通常，一个实践者将施用多肽组合物直至达到所需的效果。随着时间的过去，或在连续的基础上组合物的施用可以是一剂，两剂或多剂(多肽的量可以相同或不同)。
治疗活性多肽或该多肽的药用组合物的施用途径可以根据任何已知的方法，如口服或静脉(或动脉)注射或灌输，腹膜途径或创伤途径，或通过应用持续释放系统或植入。如果需要的话，组合物可通过灌输、药丸注射(bolus injection)或通过植入装置连续施用。替代地或另加地，本发明的多肽可以以吸附了多肽的膜、海绵或其它恰当的材料的形式植入到治疗区域而局部施用。当使用植入装置时该装置可被植入到任何恰当的组织或器官。
本发明的多肽也可以持续释放配方或制品的形式施用。持续释放制品的合适例子包括具有一定形状的颗粒形式的半渗透多聚物基质，如薄膜或微囊。连续释放基质包括聚酯、水凝胶、多聚乳糖苷(美国专利申请第3,773,919号)，L-谷氨酸和gama-乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等Biopolymers，Volume 22，pages 547-556，1983)，多聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸)(Langer等，J.Biomed，Mater.Res.，Volume 15，pages167-277，1981，和Langer，Chem.Tech.，Volume 12，pages 98-105，1982)，乙烯乙烯基乙酸(ethylene vinyl acetate)(Langer等，上述)或多聚-D(-)-3-羟基丁酸。持续释放组合物也包括脂质体，脂质体可由任何本领域中已知的方法制备；例子参见Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA第82卷，第3688-2692页(1985)，和Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第77卷，第4030-4034页(1980)。
基因和细胞疗法应用
在一些情况下，用所谓的基因或细胞疗法用药也许是合乎需要的。这种形式的输送对于体内刺激肝脏中肝细胞的增殖也许是尤其有效的。在这些情况下编码多肽或其片段或其变体的基因组DNA、cDNA和/或合成DNA可以被可操作地连接到一个在组合物所注射的组织中有活性的组成型或诱导型的启动子上。然后此构建体被插入到适当的载体如腺病毒载体或反转录病毒载体上以构建基因治疗载体。待治疗病人的细胞被从病人的身体中取出，用基因治疗载体通过常规转染真核细胞的方法转染，然后测试多肽的产生和分泌。这些表达和分泌多肽的细胞可以被重新导入病人体内从而使它们存活并在原位作为区域性的多肽源。
替代地，DNA构建体可被直接注射到待治疗的器官的组织，在那里它可被体内吸收，并且，如果DNA可操作地连接到在这样的组织中有活性的启动子上，则在细胞中局部表达。该DNA构建体也可另加地包括源自腺病毒载体、反转录病毒载体和/或肝病毒载体的载体序列以帮助被吸收入细胞。对于在肝脏中体内再生肝细胞，Moloney反转录病毒也许是尤其有效的，参见Boseh等，Journal of Clinical Investigation，第98卷，第12期，第26983-2687页(1966)。该载体/DNA构建体可以与药用上可接受的一种或多种载体混合以进行注射。
抗体形成和诊断应用
根据常规方法本发明的多肽也可用于产生在医学目的上有用的抗体。例如，这样的抗体，优选标记形式的抗体，尤其可用于体内或体外探测组织或液体样品中该多肽的存在的诊断目的。
本领域中已知有多种方法可用于产生识别该多肽表位的多克隆抗体。为了产生抗体可通过注射多肽类似物或其片段或其衍生物免疫各种宿主动物，包括但不限于，兔子，小鼠，大鼠等等。根据宿主动物可用多种佐剂增强免疫应答，包括但不限于，Freund佐剂，矿物胶如氢氧化铝(明矾)，表面活性物质如溶血卵磷脂，多聚醇，聚阴离子，肽，油乳浊液，锁眼盔贝血蓝蛋白，二硝基苯酚，和具有潜在用途的人类佐剂如Bacille Calmette-Guerin和Corynebacterium parvum
为了制备抗该多肽的单克隆抗体可使用任何通过连续细胞系在培养物中产生抗体分子的技术。如最初由Kohler和Milstein创立并在Nature，第156卷，第495-497页(1975)中描述的杂交瘤技术以及三杂交瘤(trioma)技术，由Koznbor等，在Immunology Today，第4卷第72页(1983)中描述的人B细胞杂交瘤技术和由Cole等在“MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy”Alan R.Liss，Inc.，第77-96页(1985)中描述的产生单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术，所有的这些技术都可用于制备单克隆抗体。
此外可通过已知的技术制备针对多肽的一个或一些表位的抗体的分子克隆。特别是重组DNA方法可用于构建编码单克隆抗体或其抗原结合区的核酸序列；例子参见Maniatis等，分子克隆，实验室手册，冷泉港实验室，纽约冷泉港(1982)。
具体实施方案的描述
参照以下的材料、方法和步骤本发明将更详细地得以描述。上述材料、方法和步骤仅仅是示例性的，本发明并不限于此。
I.从大鼠胚胎和成体组织制备RNA
利用可由商业途径获得的RNA提取试剂盒(Parmacia Bioteh，Uppsala，Sweden)从Wistar大鼠(雄性)组织中制备RNA。Poly(A)+RNA的制备用的是oligo(dT)纤维素(类型2，Collaborative BiomedicalProducts，Bedford，Massachusetts)。
II.大鼠FGF家族cDNA的分离和分析
5毫克大鼠脑poly(A)+RNA在20微升含300单位Moloney鼠科白细胞病毒反转录酶(Gibico-BRL，Gaithersburg，Maryland)，15单位人胎盘RNase抑制剂(Wako Pure Chemicals，Osaka，Japan)和0.5微克随机六聚脱氧核苷酸引物的反应混合物里37℃温育60分钟。为了扩增FGF家族cDNA，在25微升反应混合物中进行了30循环PCR，反应混合物中含上述cDNA溶液的等份试样，0.05单位每微升(单位/微升)的Taq DNA聚合酶(Woko Pure Chemicals)和有义和反义简并引物各5皮摩尔每微升(皮摩尔/微升)，该引物代表相应于小鼠FGF-3和FGF-7的共有氨基酸序列，分别为YLAMNK和YNTYAS，的所有可能密码子；参见Moore等，EMBO Journal，第5卷，第919-924页(1986)和Nason等，Mech.Dev.，第45卷，15-30页(1994)。扩增出的预期大小(约110碱基对)的DNA克隆到pGEM-T DNA载体中(Promega，Madison，Wisconsin)。克隆DNA的核苷酸序列用DNA测序仪(Applied BiosystemsFoster，California)测定。为了测定整个编码区域，从大鼠心脏poly(A)+RNA合成的cDNA用cDNA末端快速扩增法(RACE)进行分析；Frohman等，Proceedings of the National Academy of sciences USA，第78卷，第3824-3828页。覆盖了整个编码区的cDNA是通过PCR反应(25循环)扩增的，PCR反应混合物含有大鼠心脏cDNA溶液的等份试样，0.05单位/微升Ex Taq DNA聚合酶(TaKaRa，Kyoto，Japan)和cDNA 5’和3’非编码区的有义和反义引物各0.4pmole/微升，扩增后的产物被克隆到pGEM-T DNA载体中。
III.大鼠FGF-16cDNA在Sf9细胞中的表达
在编码区3’端带有编码E标记(GAPVPYPDPLEPR)(SEQ ID NO：6)和6×His标记(HHHHHH)的DNA片段(75碱基对)的一段FGF-16cDNA被构建到转移载体DNA，pBacPAK9(Clontech，Palo Alto，California)中。通过用重组pBacPAK9和Bsu36 I-消化表达载体(Promega)共转染Sf9细胞得到了含带标记序列的FGF-16 cDNA的重组杆状病毒。Sf9细胞用得到的重组杆状病毒感染以产生带标记的重组FGF-16。
IV.通过Western免疫印迹法分析检测大鼠重组FGF-16
感染了重组杆状病毒的Sf9细胞的培养物上清和细胞裂解液在还原条件下进行十二烷基磺酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶(12.5％)电泳，然后转移到硝酸纤维素膜上(hybond-ECL，Amersham，Buckinghamshire，England)。然后该膜与含0.1％Tween 20，5％脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液(PBS)温育。然后与抗E标记抗体(Pharmacia Biotech)在含0.1％Tween20(PBS-T)的磷酸盐缓冲液(PBS-T)中室温温育1小时。用PBS-T洗涤后膜用交联了辣根过氧化物酶的山羊抗兔免疫球蛋白G(Cappel.Durham，North Carolina)室温处理1小时。膜用PBS-T洗涤4次然后与化学发光的辣根过氧化物酶底物(Amersham)反应。通过将膜用X-光底片(RX Medical，Fuji Photo Film Co.Tokyo，Japan)曝光可看到带有E标记的蛋白。
V.Northern印迹法分析
大鼠组织RNA的等份试样(10微克每份)溶于含甲醛的变性琼脂糖凝胶(1％)中然后在20×SSC(1×SSC：0.15M NaCl/0.015M柠檬酸钠)中转移到硝酸纤维素膜上过夜。然后膜在80℃真空烘烤2小时，接着在杂交溶液中(5×SSC/0.1％SDS/4×Denhardt’s溶液/100微克/ml热变性鱼精DNA/5％葡聚糖磺酸钠)60℃预杂交4小时，随后在含32P标记FGF-16cDNA探针的杂交缓冲液中60℃杂交18小时。FGF-16cDNA探针的标记是用脱氧胞嘧啶5’-〔α32P〕三磷酸(大约110TBq/mmol)(ICNBiomedicals Inc.，Costa Mesa，California)通过随机引物标记试剂盒(TaKaRa)进行的。然后用1×SSC和0.1％SDS在室温洗膜三次，每次20分钟，用0.2×SSC和0.1％SDS在60℃洗膜两次。洗涤后膜用放射成像分析仪(radio-imaging analyzer)(BAS 2000，Fuji Photo FilmCo.)进行分析。
VI.原位杂交
用粉末状干冰冷冻Wistar大鼠胚胎(E19)。利用恒冷切片机以16微米切割矢状切片，然后融化固定(thaw-mounted)到用多聚赖氨酸覆盖的载玻片上并储存于-85℃直至杂交。35S标记的大鼠FGF-16反义和有义cRNA探针分别使用尿嘧啶5’-α〔35S〕硫代三磷酸(约30TBq/mmol)(Amersham)通过SP6RNA聚合酶和T7RNA聚合酶(TaKaRa)转录得到的。切片通过原位杂交用标记的探针进行检测，如Yamasaki等所述。为了测定大鼠FGF mRNA的区域定位，标记的切片用X-光底片进行曝光(Hyperfilm-βmax，Amersham)。切片用苏木精和曙红反染后观察。
VII.编码大鼠FGF-16的cDNA的分离
如上文所述，FGF家族的成员具有保守的核心区域。例如，FGF-3的氨基酸残基96至101(YLAMNK)和126至131(YNTYAS)与FGF-7的相应区域相同；参见上文引用的Moore等和Mason等。因此设计了代表相应于FGF-3和FGF-7共有序列所有可能密码子的简并寡聚核苷酸引物以通过聚合酶链式反应(PCR)分离编码FGF家族新成员的cDNA片段。先前同样用这些引物从大鼠胚胎中经PCR分离了编码FGF家族新成员，FGF-10，的cDNA片段：参见上文引用的Yamasaki等。FGF-10的氨基酸序列与FGF-3和FGF-7的氨基酸序列同源性最高(60％)。
FGF在大脑和胚胎中大量表达；参见上文引用的Baird等和Burgesss等。因此尝试了利用上文描述的共有引物通过PCR从大鼠大脑中分离编码FGF家族新成员的cDNA片段。利用这些引物通过PCR扩增了从大鼠大脑poly(A)+RNA合成的cDNA。克隆了为主要扩增产物的预期大小的(大约110碱基对)DNA。分离了55个克隆并测定了它们的核苷酸序列。47个克隆被发现是FGF相关的cDNA克隆。其中33个克隆具有与大鼠FGF-10cDNA相同的序列而9个克隆具有与FGF-7cDNA相同的序列。4个克隆具有与小鼠FGF-3cDNA高度同源的序列，这意味着它们为FGF-3cDNA。只有一个克隆的序列与编码已知的FGF家族成员的cDNA相似但不相同，这意味着此cDNA编码一个FGF家族的新成员。
用对该mRNA特异的引物经PCR初步检测了编码这种在大鼠成体组织中发现的FGF的mRNA的表达。数据表明该mRNA在心脏中的表达比在大脑中的表达更为丰富。通过cDNA末端快速扩增法(RACE)从心脏中分离出了覆盖该FGF整个编码区的cDNA；参见上文引用的Frohman等。
VIII.大鼠FGF-16的结构
该cDNA编码区的核苷酸序列阐明了一种大鼠FGF多肽207个氨基酸的全长序列(SEQ ID NO：2)，它含有约120个氨基酸的氨基酸保守核心区域(即氨基酸51-149和氨基酸161-189)。这种大鼠FGF的全长序列在图1A和图1B中列出。该cDNA片段最初是利用FGF-3和FGF-7的共有氨基酸序列的引物通过基于同源性的PCR扩增得到的。尽管在该多肽的144-149发现了一个共有序列YNTYAS，另一共有序列YLAMNK并未发现。然而在氨基酸114-119发现了与后一共有序列类似的序列：YLGMNE(参见图1A-1B)。此结果意味着该cDNA片段是用错配的引物通过PCR从大脑cDNA中扩增得到的。
在其它FGF家族成员中非常保守的两个半胱氨酸残基在这种大鼠FGF多肽中也是保守的(具体而言，氨基酸67和氨基酸133)。因为这种多肽是第16个记录在案的FGF家族成员所以暂时命名为“FGF-16”。发现FGF-16的氨基酸序列与FGF-9具有最高同源性(73％)(参见图2)。与FGF-9类似，亲水图分析(Hydropathy plot analysis)确认了FGF-16氨基端区域的弱疏水性，这意味着FGF-16没有典型的信号序列；参见Hopp和Woods，Proceeding of the National Academy of Sciences USA，第78卷，第3824-3828页(1991)。
IX.大鼠FGF-16cDNA在Sf9细胞中的表达
已知在氨基端具有典型信号序列的FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7和FGF-8能被高效地分泌到细胞外；参见上文引用的Tanaka等，Dickson等，Yeshida等，Goldfarb等和Coulier等。与之相反，FGF-1、FGF-2、FGF-9和FHF-1至FHF-4在其氨基端没有典型的信号序列，参见上文引用的Baird等，Burgess等，Miyamoto等和Smallwood等。FGF-1，FGF-2和FHF-1至FHF-4不分泌。与之相反，FGF-9尽管无典型的信号肽序列但仍然高效地分泌。
为了检测FGF-16是否分泌，用含3’端延伸编码E和6×His标记的大鼠FGF-16cDNA的重组杆状病毒感染了Sf9细胞。用抗E标记的抗体通过Western免疫印迹法测试了培养物上清和细胞裂解液，以检测带有羧基端25个氨基酸延伸标记的重组FGF-16。主要在培养物上清中检测到了大约26千道尔顿的主条带(见图3)。观察到的主条带的分子量与计算得到的重组FGF-16的分子量(即26，462道尔顿)一致。用螯合柱(chelating colume)通过亲和层析纯化了26千道尔顿的蛋白并用商业化的蛋白测序仪测定了氨基酸序列。然而，氨基末端的序列不能测定，这意味着氨基端的氨基酸可能被封闭了。
X.大鼠FGF-16mRNA在大鼠成体组织中的表达
通过以下方式研究了FGF16mRNA在大鼠成体组织中的表达。
利用32P标记的FGF-16cDNA探针通过Northern印迹杂交法检测了源自大脑、心脏、肺、肝、肾、褐色脂肪组织和白色脂肪组织的RNA。利用含甲醛的变性琼脂糖凝胶电泳确定了RNA的完整性。标记的探针与心脏中1.8千碱基的mRNA的杂交很强(见图4)。在褐色脂肪组织中也探测到中等强度的标记mRNA。但是在大脑、肺、肝，肾和白色脂肪组织中未检测到这种mRNA。还利用对大鼠FGF-16mRNA特异的引物通过PCR检测了FGF-16mRNA在包括小肠、肌肉、胸腺、胃、胰脏、脾脏和睾丸的其它组织中的表达。与心脏相比FGF-16mRNA在这些组织中的表达低很多。因此FGF-16mRNA主要在心脏和褐色脂肪组织中表达。
XI.大鼠FGF-16mRNA在大鼠胚胎中的表达
为了检测FGF-16mRNA在胚胎(E19)中的表达，利用35S标记的反义或有义FGF-16cDNA探针通过原位杂交和随后的宏观放射性自显影分析了胚胎的矢状切片。用反义探针时在胚胎的心脏和褐色脂肪组织也观察到明显的标记(图5B)。但是用作为对照的有义探针时没有观察到标记(图5C)。这些结果表明胚胎中FGF-16mRNA主要在心脏和褐色脂肪组织表达。
FGF-1和FGF-2在成体组织中广泛地表达；参见上文引用的Baird等，和Burgess等。与之相反，大多数FGF和FHF在成体组织中的表达范围很窄；参见以上引用的参考文献。尽管FGF-16的氨基酸序列与FGF-9的同源性很高，但FGF-16的表达分布与FGF-9的相差很大，同时与FGF家族的其它成员相差也很大。因此FGF-16似乎是一种具有独特生理功能的新FGF。
XII.人FGF-16的克隆
利用从大鼠FGF-16基因得到的序列信息和克隆信息，克隆和表达了人的FGF-16基因，具体如下。
图1中大鼠FGF-16从核苷酸92开始到核苷酸637结束的一部分cDNA序列(SEQ ID NO：7)被用于设计扩增人FGF-16DNA的PCR引物。一些引物序列是部分简并的以提高引物退火的可能性，因为在大鼠和人FGF-16DNA序列的密码子之间可能有所不同。在测序之前PCR产物被克隆到PCRII载体或PCR2.1载体(Invitrogen，Carlsbad，California)。大鼠基因组DNA的PCR扩增确认了FGF-16编码区中最后一个内含子与FGF家族其它成员内含子的位置相对应。
用大鼠FGF-16引物的组合物扩增了从Hela细胞制备得到的人基因组DNA，扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行分析。PCR反应的产物的大小是不可预测的，因为扩增产物可能跨越一个或多个内含子；用预期位于单一外显子的引物对通过嵌套式PCR对上述产物进行了分析。在一对引物具体为与图1核苷酸序列的核苷酸422-447对应的5’-CGG GAA CAG TTT GAA GAA AAC TGG TA-3’(SEQ ID NO：8)和与图1A-1B核酸序列中核苷酸554-575互补的5’GAA AGT GNG TGA AYT TCT GRTG-3’(SEQ ID NO：9)，其中N代表次黄嘌呤，的一次基于大鼠FGF-16全长序列的嵌套式PCR中得到了预期大小的PCR产物(0.15千碱基)。根据IUB(国家生化协会)的惯例，在SEQ ID NO：9的核酸序列中“Y”代表C和T的混合物，“R”代表A和G的混合物。克隆和测序了嵌套PCR产物和亲本的跨越内含子的PCR产物(1.7千碱基对，引物为与图1A-1B中大鼠核酸序列的核苷酸217-237同源的5’-CCG CAC GGG CTT CCA CCTTGA-3’(SEQ ID NO：10)，和5’-GAA AGT GIG TGA AYT TCT GRT G-3’)。预测由此人FGF-16基因组DNA片段外显子序列编码的肽序列与大鼠FGF-16高度同源。利用随机引物衔接子，5’-GGC CGG ATA GGC CTC ACNNNN NNT-3’(SEQ ID NO：11)从人心脏poly(A)+RNA合成了第一条链的cDNA，引物衔接子中的N代表碱基A，C，G，T的随机混合物。利用与图1中大鼠核酸序列的核苷酸155-175相对应的5’-CGC GGC TCG CCC ACAGAC TTC-3’(SEQ ID NO：12)以及与图6A-6B中核酸序列的核苷酸480-502互补的独特的人FGF-16PCR引物，5’CTG TCT CTC TGA GTC CGA ATG TT-3’(SEQ ID NO：13)进行了PCR(35循环)，PCR根据人基因组片段的序列设计。得到的产物为约340碱基对的条带，通过PAGE纯化后克隆到pCRII载体(Invitrogen)进行DNA测序。基于这些序列设计了人FGF-16寡聚核苷酸并用于人胚胎大脑cDNA和人心脏cDNA的3’-RACE和5’-RACE以在两个方向上延伸cDNA序列以得到完整的编码序列。
3’-RACE的步骤如下。第一条链的cDNA是利用寡聚-dT引物衔接子，5’-TTCGCCGGATAGGCCTTTTTTTTTTTTTT-3’(SEQ ID NO：14)和Superscript(Gibico-BRL)反转录酶通过常规方法从人心脏polyA+RNA(ClotechLaboratories，Inc.，Palo Alto，California)制备。在引物为5’-TTCGGCCGGATAGGCCTTTTTTTTTTTTTT-3’和5’CGG GAA CAG TTT GAA GAAAAC TGG TA-3’各100nM的3’-RACE PCR(30个循环，退火温度55℃)中第一条链cDNA被用作模板。为了在不抑制FGF-16基因特异性引物的引导的同时部分抑制寡聚T引物衔接子的引导在此处和以后的3’-RACE PCR中加入了终浓度200nM的非引导类似物，即5’-TTCGGCCGGATAGGCCTTTTTTTTTTTTTTp-3’，其中p代表3’-磷酸基团，作为5’-TTCGGCCGGATAGGCCTTTTTTTTTTT TTT-3’退火和引导的竞争抑制物。为了进一步扩增和富集FGF-16 DNA将0.4微升第一次RACE PCR的产物用含同样引物的新鲜PCR反应混合液稀释至40微升，然后继续进行18个循环的PCR反应。0.4微升此次PCR的产物的等份试样被用作嵌套3’-RACE PCR(25循环)的模板，引物为5’-TTCGGCCGGATAGGCCTTTTTTTTTTTTTT-3’和与图6A-6B中人核酸序列核苷酸451-473对应的人FGF-16新引物，即5’-GTA CAA CAC CTA TGC CTC AACCT-3’(SEQ ID NO：15)，定位于5’-CGG GAA CAG TTT GAA GAA AAC TGG TA-3’的下游。克隆和测序了此次嵌套PCR产物的主条带。此DNA片段序列包括了大鼠FGF-16的明显人类同源物的羧基端编码区和3’-UTR的至少一部分。
为了得到编码人FGF-16氨基末端部分的cDNA序列需要进行先后3个循环的5’RACE和DNA测序。利用一套新的半随机引物衔接子在除去尾巴的第一条链cDNA上进行了5’-RACE。能引导大量不同的cDNA，但在任何单一cDNA内，如FGF-16 cDNA内，只在少数位点引发的6个部分随机引物被用作和FGF-16基因特异下游(3’)引物联用的上游(5’)引物。每个部分随机引物由18个核苷酸的独特衔接子序列，5’-GCAGTCGCTCCTTCCGTG-3’(SEQ ID NO：16)和随后的9核苷酸随机序列NNNNNNNNN(SEQ ID NO：17)以及随后的4或5个核苷酸独特序列如5’-CACA-3’组成。
首先以人心cDNA作模板进行了30循环的PCR，引物为5种部分随机序列引物的混合物，即5’GCAGTCGCTCCTTCCGTGNNNNNNNNNX-3’(SEQ IDNO：18)，其中N代表随机碱基(A，T，C或G)而“X”＝AATG，TCTC，TGG，CACA或AACC，以及与图6中人核酸序列的核苷酸366-386互补的一种FGF-16引物5’-CTC CTC GCT CAT TCA TTC CTA-3’(SEQ ID NO：19)。第一循环PCR与随后的循环不同，以允许半随机引物退火所需的低严格性。具体而言，FGF-16特异引物直到第二循环才加入，第一循环的退火是在Taq和Klenow DNA聚合酶存在下25℃进行的，然后是缓慢(10分钟)升温到Taq的延伸温度72℃。当温度升高到74℃以起始第二循环PCR时，加入FGF-16引物继续进行PCR。此次PCR的产物的一个等份试样在转接引物为5’-GCAGTCGCTCCTTCCGTG-3’和5’-AGT CCA CTCCCC GGA TGC TGA T-3’(SEQ ID NO：20)的PCR中被用作模板。上述PCR(20个循环)中后一引物与图6中人核酸序列的核苷酸332-353互补。克隆和测序了此次PCR产物中最为明显的条带，一个克隆的序列揭示了人FGF-16从核苷酸149开始的序列。几个克隆的序列含有一个表观内含子和核苷酸298之前的3’剪切位点。一个克隆的序列表明以4碱基序列CACA结束的半随机引物在内含子内退火。为了消除这种不合乎需要的引发情况，在下一轮的5’-RACE中半随机引物混合物中省略了这种引物。在此次5’-RACE中，4种剩下的半随机引物的混合物与人心第一条链cDNA在含有Taq聚合酶和核苷三磷酸，但不含下游FGF-16引物，的常规PCR混合缓冲液中温育，分别在25℃，37℃和50℃各保温10-15分钟，然后在72℃保温1分钟以进行链的延伸，然后加入FGF-16引物，5’-AGT CCA CTC CCC GGA TGC TGA T-3’和转接引物5’-GCAGTCGCTCCTTCCGTG-3’进行30循环的PCR。产物的一个等份试样进而用引物为5’-GCAGTCGCTCCTTCCGTG-3’和5’-CTC CAG GAT TCC GAA GCG GCTGTG GTC GTG-3’(SEQ ID NO：21)嵌套式PCR(18循环)扩增，后一种引物与图6中人核苷酸序列278-307互补。此后以10∶1稀释进不含竞争剂的相同PCR混合物中进行另外10个循环的PCR。尽管得到的产物在电泳胶上表现为一个模糊的点(smear)，但他们被克隆到了pCRII载体并得到了含有从核苷酸19开始的人FGF-16序列的克隆。
一种与上文描述的5’-RACE方法类似的PCR技术被用于扩增包含人FGF-16氨基端编码序列的基因组DNA序列。在以100ng热变性的人基因组DNA为模板，Klenow聚合酶催化，25℃进行的DNA合成反应中用了2μM的半随机转接引物5’-NNT ANN ACN CCA CNC AAN NNN NAT G-3’(SEQ ID NO：22)，其中1，2，5，6，9，14和18位的“N”代表次黄嘌呤，19，20，21，22位的“N”代表从A，C，T和G随机选出的碱基。在转接引物5’-GGT AGG ACG CCA CGC AAG-3’(SEQ ID NO：23)和FGF-163’引物5’-TCC GAA GCG GCT GTG GTC GTG-3’(SEQ ID NO：24)，后者代表图1A-1B中核酸序列的核苷酸278-298，引导的并存在同样摩尔量的竞争寡聚核苷酸5’-GGT AGG ACG CCA CGC AAGp-3’的PCR(30循环；40微升)中上述产物的一个4微升的等份试样被用作模板。此次PCR的产物通过引物为5’-GGT AGG ACG CCA CGC AAG-3’和5’-AAG ATC TCC AGGTGG AAG CCG-3’，后一种引物与图6A-6B中人核酸序列的核苷酸229-249互补，并同时存在相等摩尔量的竞争物5’-GGT AGG ACG CCA CGC AAGp-3’的嵌套式PCR(20循环)中进一步扩增。产物被克隆到载体PCR2.1(Invitrogen)中。通过引物为代表图6A-6B中核酸序列的核苷酸61-85的5’-GGA TCT ACA CGG CTT CTC CTC GTC T-3’(SEQ ID NO：25)和代表图1A-1B中核酸序列的核苷酸96-116的5’-CTG GGG AGT CAG CTAAGG GCA-3’(SEQ ID NO：26)的PCR和利用32P标记的寡聚核苷酸5’-GGATCT ACA CGG CTT CTC CTC GTC T-3’进行的菌落杂交筛选了存在FGF-16序列的菌落。这些克隆的序列含有人FGF-16的氨基端序列，从而补全了人FGF-16编码区的序列(图6A-6B，SEQ ID NO：5)。
XIII.大鼠FGF-16的重组表达
为了给生物性质研究提供充分的材料，按如下的方法在细菌细胞里重组表达了大鼠FGF-16多肽。
(A)表达载体的构建在细菌细胞中重组表达的载体的构建如下。1)制备pAMG21rFGF-16上述大鼠FGF-16的全长cDNA(图1A-1B，SEQ ID NO：1)被克隆到pGEM-T质粒载体(Promega，Madison，Wisconsin)中。根据厂商建议的常规分子生物学技术和方法将大鼠FGF-16(rFGF-16)插入片段克隆到质粒载体pAMG21(美国典型培养物保藏中心，Rockville，Maryland，登记号98113)。用于PCR的寡聚核苷酸扩增引物被设计得与pGEM-T rFGF-16中rFGF-16插入片段的rFGF-16序列的3’端和5’端部分同源，并分别含有限制性核酸内切内切酶NdeI和KpnI的特点。PCR用的是以下引物：AAA CAA CAT ATG GCT GAA GTT GGT GGTGTC TTT GCC TCC TTG GA(SEQ ID NO：27)，和AAA CAA GGT ACC TTT ACCTAT AGC GGA AGA GGT(SEQ ID NO：28)(与rFGF-16同源的区域用下划线表示)，并以pGEM-T rFGF-16为模板(AmpliTaq DNA聚合酶，Perkin-Elmer，Foster City，California)。PCR产物纯化(QIAquickTMPCR纯化试剂盒，QIAGEN，Santa Clarita，California)后用限制性核酸内切酶NdeI和KpnI(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Indinia)消化。得到的631碱基对的DNA片段用琼脂糖凝胶抽提纯化(QIAquickTMGel Extraction Kit，QIAGEN)后连接到用类似方法纯化的pAMG21载体6.067千碱基片段(ATCC#98113)上。用此连接反应转化(GenePulser，BioRad，Richmond，California)的E.coli宿主株(GM120，ATCC # 55764)涂布到含40微克/毫升卡那霉素的Luria琼脂平板以选择重组细菌。没有得到菌落。用卡那霉素液体培养选择后涂布到含40微克/毫升卡那霉素的Luria琼脂平板上也没有得到任何可存活的菌落。但是，利用一个针对rFGF-16插入序列3’端的引物和一个位于rFGF-16插入序列5’端的载体引物CGT ACA GGT TTA CGC AAG AAA ATG G(SEQ IDNO：29)对连接反应进行的PCR表明在连接中有正确的质粒构建体。此次PCR产物纯化后(QIAquickTM PCR Purification kit)用限制性核酸内切酶XbaI和KpnI(Boehringer Mannheim)切割。得到的667碱基对的DNA片段通过琼脂糖凝胶抽提(QIAquickTM Gel Extraction Kit)纯化并连接到用类似方法纯化的pGEM21载体6.031千碱基KpnI-PstI DNA片段上。用此连接物(Gene Pulser，BioRad)转化适当的E.coli宿主菌(GM120；ATCC # 55764)得到卡那霉素抗性的菌落。从这些克隆中的一个菌落纯化得到了质粒DNA(QIAGENPlasmid Kit，QIAGEN)并确认了该DNA序列。
2).pAMG21AN34rFGF-16的制备根据制造商建议的常规分子生物学方法和技术，通过将NdeI-PstI寡聚核苷酸连接序列TAT GAA CGA GCGCCT GGG CCA GAT CGA GGG GAA GCT GCA(SEQ ID NO：30)和GCT TCC CCTCGA TCT GGC CCA GGC GCT CGT TCA(SEQ ID NO：31)与经过琼脂糖凝胶提取(QIAquickTM凝胶提取试剂盒，QIA GEN)纯化的上述pAMG21rFGF-16的6.56千碱基PstI-NdeI DNA片段的连接克隆了pAMG21AN34rFGF-16。在连接(T4 DNA连接酶，Boehringer Mannheim)之前将连接于用激酶处理并退火(多核苷酸激酶，Boehringer Mannheim)。pAMG21载体质粒(ATCC#98113)含有卡那霉素抗性基因，因此用此连接反应混合物(Gene Pulser，BioRad)转化适当的大肠杆菌宿主菌株(GM120，ATCC#55764)可在生长培养基中含40微克/毫升卡那霉素的Luria琼脂平板上得到卡那霉素抗性的菌落。从这些菌落中的一个纯化得到了质粒DNA(QIAGEN Plasmid Kit，QIAGEN)并确认了DNA序列。
3).全长大鼠FGF-16在E.coli中的表达全长大鼠FGF-16(图1A-1B，SEQ ID NO：1)在E.coli中的表达用的是pAMG21rFGF-16。细胞在pH7温度30℃的10升发酵罐中生长。溶解氧水平保持在50％或更高。当发酵培养基达到光密度10时用10毫升500纳克/毫升(ng/ml)的N-(beta-ketocaproyl)-dl-homoserine lactone(Sigma ChemicalCompany，St.Louis，Missouri)组成的储存液诱导。诱导12小时后发酵培养基冷却并在水中机械裂解细胞，然后10,000转每分钟(rpm)离心2小时。上清在50mM Tris HCl，pH7.5缓冲液中进行SP Sepharose离子交换柱层析。结合的蛋白用NaCl线性梯度洗脱。在0.3-0.6M NaCl之间洗脱下的级分有很多带，分子量在15,000到28,000之间。电印迹后对这些蛋白带的序列分析表明同时形成了完整的和N末端截短的多肽。其中一条带具有NRE的N末端序列(即，天冬酰胺-精氨酸-谷氨酸)并且在进行广泛的蛋白水解之前似乎是最小的。除了大鼠全长FGF-16(SEQ ID NO：1)外得到的细胞匀浆物还含有在亮氨酸34和天冬酰胺35之间被切开的一种截短产物(“des-N-34”)(SEQ ID NO：32)，以及在丙氨酸9与丝氨酸10之间被切开的一种截短产物(“des-N-9”)(SEQ IDNO：33)。
FGF-16具有与FGF-9同源的序列，在人成熟FGF-9和FGF-16全长多肽之间有73％的氨基酸残基相同。这两种FGF都缺少信号序列，在碱性和酸性FGF中也是这样。但是在转染了hFGF-9cDNA的COS细胞中观察到人FGF-9有效地分泌到条件培养基中。纯化样品的序列分析表明存在完整N末端多肽以及在亮氨酸33和丝氨酸34之间截断的多肽。在体外初步生物分析中发现这种FGF-9的des-N-33与全长FGF-9具有同样的活性。在序列相同性的基础上将FGF-9和FGF-16进行序列对比时发现FGF-9和FGF-16的N末端水解位点几乎在同样的位置。因此，决定评价大鼠FGF-16的des-N-34形式，而不是全长多肽，的生物学活性。
c)大鼠FGF-16Des-N-34在E.coli中的表达在上述的条件下培养转化了含编码大鼠FGF-16des-N-34形式cDNA的pAMG21ΔN34rFGF-16的E.Coli细胞并以100g/L在1M硫酸铵，50mM Tris HCl，pH7.5中机械裂解。裂解悬浮液在4℃ 10,000rpm离心2小时。上清在1M硫酸铵，50mM Tris HCl，pH7.5中成批结合(batch-bound)到苯基-Sepharose上。在玻璃滤器中用同样的缓冲液充分洗涤树脂并转移到柱子中。在柱子中进一步用同样的缓冲液洗涤结合的蛋白然后用从1到0M的线性递减硫酸铵梯度洗脱。级分用SDS-PAGE分析，合并含有大鼠FGF-16des-N-34的级分。
所得的合并液与3.5体积的冷水混合后批量结合到用50mM TrisHCl，pH7.0平衡好的SP-Sepharose上。将SP-Sepharose装到柱子上并用0-1M的NaCl线性梯度洗脱结合的蛋白。根据洗脱物质的SDS-PAGE，合并含有大鼠FGF-16的des-N-34形式的级分，然后用1M硫酸铵，50mM Tris HCl，pH7.0透析。透析后的物质上样到用1M硫酸铵，50mM Tris HCl，pH7.0平衡的苯基-Sepharose上。用同样的缓冲液充分洗涤后，结合上的蛋白用1-0M硫酸铵线性梯度洗脱。合并大鼠FGF-16Des-N-34含量大于90％的级分并用PBS缓冲液透析作为最终产物。在纯化过程中加入0.1-10mM EDTA能提高终产物的回收。这种方法，包括0.1mM EDTA的使用，在应用到转化了全长大鼠FGF-16 cDNA的E.coli细胞裂解液时导致能有效地纯化全长大鼠FGF-16。
XIV.源自E.coli的大鼠FGF-16的体内生物学测试
在正常小鼠中如下测试了源自E.coli的重组大鼠FGF-16des-N-34的体内生物学效应。
A.对小鼠的体内用药以5mg/kg/天的剂量7天里通过腹膜内注射(IP)对5只雌性BDF1小鼠施用重组的大鼠FGF-16 des-N-34(SEQ IDNO：32)。另外，另一组5只雌性BDF1小鼠在同样的条件下接受对照缓冲溶液。在收获、放射显影和处死之前一个小时所有的小鼠都注射了50mg/Kg的溴代脱氧尿嘧啶(BrdU)(Aldrich Chemical Company，Milwaukee，Wisconsin)。测量了体重和所选器官的重量，抽血以进行血液学和血清化学试验，收集器官以进行组织学分析和BrdU标记。
Hitachi 717系统上(Boeringer Mannheim)对血液样品进行临床化学分析，或在Technicon H1E Analyzer(Miles Technicon InstrumentCorp.，Tarrytown，New York)上完成血液计数。BrdU免疫组织化学染色是在4毫米厚的石蜡包埋切片上用自动化的TechMate Immunostainer(BioTek Solutions，Santa Barbara，California)进行的。切片首先用0.1％的蛋白酶(Sigma Chemical，St.Louis，Missori)消化，然后用2N HCl处理。BrdU的检测是通过大鼠抗BrdU单克隆抗体(MAb)(Accurate Chemical，Westbury，New York)和随后的生物素标记抗兔/抗小鼠二抗混合抗体(BioTek)和第三位偶联到碱性磷酸酶上的ABC(Bio Tek)进行的。染色反应利用BioTek红色生色素显色。
BrdU标记的肝细胞的定量是由一个不知道哪一组是治疗组的病理学家在每个肝切片上计数10个随机高倍显微镜(HPF-40×物镜)视野的BrdU标记的肝细胞数并测定每个HPF视野的BrdU阳性肝细胞平均数而进行的。
B.总病理学结果注射了大鼠FGF-16des-N-34的小鼠的肝脏和脾脏明显比注射缓冲液的对照小鼠组大。这些结果总结在表1中。
C.临床病理学结果注射了大鼠FGF-16des-N-34的小鼠血清中甘油三酯、乳酸脱氢酶(LDH)和总蛋白的含量明显提高，而血清碱性磷酸酶的含量明显降低。这些结果也总结于表1中。
D.组织病理学结果检测了5只注射了大鼠FGF-16des-N-34的小鼠和5只注射了对照缓冲液的小鼠的肝脏、脾脏、肺、脑、心、肾脏、前列腺、胃、小肠、胰脏、盲肠、大肠、肠系膜淋巴结、皮肤、乳腺、气管、食道、胸腺、副甲状腺、唾液腺、膀胱、卵巢、骨和骨髓的苏木精和曙红(H & E)和BrdU染色切片。唯一明显的组织学发现是发现与注射了对照缓冲液的小鼠相比注射了大鼠FGF-16 des-N-34的小鼠在每个高倍视野里BrdU阳性肝细胞数明显增加。(参见表1和图7)。
表1FGF-16处理的小鼠中选定器官的重量、血清化学和肝细胞BRDU标记
肝脏重量占体重的百分比     FGF-16处理小鼠(n＝5) 缓冲液注射小鼠对照(n＝5)     p值
    6.06±0.36 SD    5.09±0.14 SD     0.0005
脾脏重量占体重的百分比     0.35±0.04 SD    0.29±0.03 SD     0.02
甘油三酯(mg/dl)     193±43 SD    125±45 SD     0.04
乳酸脱氢酶(IU/l)     250±29 SD    193±32 SD     0.02
总血清蛋白(mg/dl)     5.5±0.04 SD    4.9±0.2 SD     0.02
碱性磷酸酶(IU/l)     56±8 SD    166±27 SD  小于0.0001
BrdU阳性肝细胞数每高倍视野     7.28±4.08 SD    0.27±0.52 SD(n＝3)     0.002
E.结论 注射了大鼠FGF-16des-N-34的小鼠表现出肝细胞BrdU标记增加和中等但明显的肝脏重量、血清甘油三酯、血清LDH和总血清蛋白含量增加，同时血清碱性磷酸酶含量减小。因此FGF16诱导了肝细胞的增殖并促进肝脏产生甘油三酯和血清蛋白，如白蛋白。这些体内效应类似于，但在强度上略低于，FGF-7(KGF)诱导的肝脏效应，参见Housley等，Journal of Clinical Investigation，第94卷，1764-1777页(1994)。此发现意味着在需要增加肝细胞刺激、增殖和/或分化的用途中FGF-16的潜在效力。这样的用途包括增加肝功能以治疗或防止肝硬化、爆发性肝衰竭、由于急性肝炎病毒导致的损伤和/或对肝脏的毒性损伤。
用于此目的的具体治疗方法可包括用包含与编码FGF-16或其类似物的DNA分子可操作连接的调控元件(如，已被描述过的)的载体转染待处理的宿主生物体或受试者的内源性肝细胞以实现原位表达。
现在在所附权利要求书中限定上文描述的发明。
序列表(1)一般资料：(i)申请人：Amgen Inc.(ii)发明名称：A FIBROBLAST GROWTH FACTOR(iii)序列数：33(iv)通讯地址：
(A)收件人：Amgen Inc.
(B)街道：1840 DeHavilland Drive
(C)城市：Thousand Oaks
(D)州：California
(E)国家：USA
(F)邮编：91320-1789(v)计算机可读形式：
(A)媒体类型：软盘
(B)计算机：IBM兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30(vi)当前申请数据：
(A)申请号：
(B)申请日：
(C)分类号：(viii)律师/代理人资料：
(A)姓名：Mazza，Richard J.
(B)注册号：27,657
(C)文件/档案号：A-469(ix)电信资料：
(A)电话：617-428-0200
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(C)电传：(2)序列1资料：SEQ ID NO：1：(i)序列特征：
(A)长度：621 bp
(B)类型：核酸
(C)链型：单
(D)拓扑结构：线形(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：ATGGCGGAGG TCGGGGGCGT CTTTGCCTCC TTGGACTGGG ACCTGCAAGG CTTCTCCTCC   60TCTCTGGGGA ACGTGCCCTT AGCTGACTCC CCGGGTTTCC TGAACGAGCG CCTGGGCCAG  120ATCGAGGGGA AGCTGCAGCG CGGCTCGCCC ACAGACTTCG CCCACCTGAA GGGGATCCTG  180CGGCGCCGCC AGCTCTACTG CCGCACGGGC TTCCACCTTG AAATCTTCCC CAATGGCACG  240GTGCATGGCA CCCGCCACGA CCACAGCCGC TTCGGAATTC TGGAATTTAT CAGCTTGGCT  300GTGGGGCTGA TCAGCATCCG GGGAGTAGAC TCTGGCCTAT ACCTAGGAAT GAATGAGCGA  360GGAGAGCTGT TTGGATCGAA GAAACTCACA CGAGAATGTG TTTTCCGGGA ACAGTTTGAA  420GAAAACTGGT ACAACACCTA TGCATCCACC TTGTACAAAC ACTCGGACTC GGAGAGACAG  480TATTATGTGG CCCTGAATAA AGACGGCTCA CCCCGGGAGG GATACAGGAC TAAACGACAC  540CAGAAATTCA CTCACTTTTT ACCCAGGCCA GTAGATCCTT CTAAGTTGCC CTCCATGTCC  600AGAGACCTCT TCCGCTATAG G                                            621(2)序列2资料：SEQ ID NO：2：(i)序列特征：
(A)长度：207氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单
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(D)其他信息：/注释＝指1，2，5，6，9，14，18，的N指肌苷酸，19-22位N指随机碱基(A，C，T，G) (xi)序列描述：SEQ ID NO：22：NNTANNACNC CACNCAANNN NNATG                                  25(2)序列23资料：SEQ ID NO：23：(i)序列特征：
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(A)描述：、desc＝“寡核苷酸”(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：TATGAACGAG CGCCTGGGCC AGATCGAGGG GAAGCTGCA                   39(2)序列31资料：SEQ ID NO：31：(i)序列特征：
(A)长度：33bp
(B)类型：核酸
(C)链型：单
(D)拓扑结构：线形(ii)分子类型：其他核酸
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(A)长度：173氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单
(D)拓扑结构：线形(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：Asn Glu Arg Leu Gly Gln Ile Glu Gly Lys Leu Gln Arg Gly Ser Pro1               5                   10                  15Thr Asp Phe Ala His Leu Lys Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr
        20                  25                  30Cys Arg Thr Gly Phe His Leu Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Val His
    35                  40                  45Gly Thr Arg His Asp His Ser Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser
50                  55                  60Leu Ala Val Gly Leu Ile Ser Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gly Met Asn Glu Arg Gly Glu Leu Phe Gly Ser Lys Lys Leu Thr
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        100                 105                 110Tyr Ala Ser Thr Leu Tyr Lys His Ser Asp Ser Glu Arg Gln Tyr Tyr
    115                 120                 125Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly Ser Pro Arg Glu Gly Tyr Arg Thr Lys
130                 135                 140Arg His Gln Lys Phe Thr His Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Ser145                 150                 155                 160Lys Leu Pro Ser Met Ser Arg Asp Leu Phe Arg Tyr Arg
            165                 170(2)序列33资料：SEQ ID NO：33：(i)序列特征：
(A)长度：198氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链型：单
(D)拓扑结构：线形 (ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：Ser Leu Asp Trp Asp Leu Gln Gly Phe Ser Ser Ser Leu Gly Asn Val1               5                   10                  15Pro Leu Ala Asp Ser Pro Gly Phe Leu Asn Glu Arg Leu Gly Gln Ile
        20                  25                  30Glu Gly Lys Leu Gln Arg Gly Ser Pro Thr Asp Phe Ala His Leu Lys
    35                  40                  45Gly Ile Leu Arg Arg Arg Gln Leu Tyr Cys Arg Thr Gly Phe His Leu
50                  55                  60Glu Ile Phe Pro Asn Gly Thr Val His Gly Thr Arg His Asp His Ser65                  70                  75                  80Arg Phe Gly Ile Leu Glu Phe Ile Ser Leu Ala Val Gly Leu Ile Ser
            85                  90                  95Ile Arg Gly Val Asp Ser Gly Leu Tyr Leu Gly Met Asn Glu Arg Gly
        100                 105                 110Glu Leu Phe Gly Ser Lys Lys Leu Thr Arg Glu Cys Val Phe Arg Glu
    115                 120                 125Gln Phe Glu Glu Asn Trp Tyr Asn Thr Tyr Ala Ser Thr Leu Tyr Lys
130                 135                 140His Ser Asp Ser Glu Arg Gln Tyr Tyr Val Ala Leu Asn Lys Asp Gly145                 150                 155                 160Ser Pro Arg Glu Gly Tyr Arg Thr Lys Arg His Gln Lys Phe Thr His
            165                 170                 175Phe Leu Pro Arg Pro Val Asp Pro Ser Lys Leu Pro Ser Met Ser Arg
        180                 185                 190Asp Leu Phe Arg Tyr Arg
    195

Claims (39)

1.一种具有肝细胞增殖和生长活性的多肽，包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的氨基酸序列，或其片段、类似物或衍生物。
2.根据权利要求1的一种多肽，其中氨基酸1-34被从N末端区域切除。
3.根据权利要求2的一种多肽，包含氨基酸序列SEQ ID NO：33。
4.根据权利要求2的一种多肽，包含氨基酸序列SEQ ID NO：34。
5.根据权利要求1的一种多肽，它与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5具有80％或更高的同源性且以具有肝细胞增殖和生长活性为特征。
6.根据权利要求1的一种多肽，它是人的，并且具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
7.根据权利要求1的一种多肽，它是通过重组的方法生产的。
8.从根据权利要求1的一种多肽衍生出的一种多肽衍生物，其中多肽与一种多聚物交联。
9.根据权利要求8的一种多肽衍生物，其中多聚物是聚乙二醇。
10.编码根据权利要求1的多肽或其片段、类似物的分离的核酸分子。
11.根据权利要求10的核酸分子，它编码SEQ ID NO：2的多肽或其片段或类似物。
12.根据权利要求10的核酸分子，它具有核苷酸序列SEQ ID NO：1。
13.根据权利要求10的核酸分子，它编码SEQ ID NO：5的多肽或其片段或类似物。
14.根据权利要求13的核酸分子，它具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列。
15.包含与根据权利要求10的核酸分子可操作连接的表达调控元件的表达载体。
16.根据权利要求15的表达载体，其中核酸分子具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
17.根据权利要求15的表达载体，其中核酸分子具有SEQ ID NO：4的核苷酸序列。
18.用根据权利要求10的核酸分子转化或转染的宿主细胞。
19.用根据权利要求15的表达载体转化或转染的宿主细胞。
20.根据权利要求18或19的的或转染宿主细胞，它是原子核或真核细胞。
21.根据权利要求20的转化或转染的宿主细胞，它是动物细胞。
22.根据权利要求20的转化或转染的宿主细胞，它是细菌细胞。
23.根据权利要求22的转化或转染的宿主细胞，它是E.coli细胞。
24.一种药用组合物，它包含根据权利要求1的有效剂量的一种多肽，或其片段、类似物或衍生物以及一种药用上适当的载体。
25.针对根据权利要求1的多肽的抗体。
26.根据权利要求25的抗体，它是多克隆的。
27.根据权利要求25的抗体，它是单克隆的。
28.表达包含具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽或其片段或类似物的方法，包括：
将含有与用于刺激表达的调控元件可操作连接的编码所述多肽或其片段或类似物的DNA分子的宿主细胞在适合该DNA分子表达的条件下培养，并
从宿主细胞培养物中分离表达的多肽、片段或类似物。
29.根据权利要求28的方法，其中DNA分子是基因或cDNA。
30.根据权利要求28的方法，其中宿主细胞已用根据权利要求15的表达载体转化或转染。
31.根据权利要求30的方法，其中宿主细胞为E.coli细胞。
32.根据权利要求28的方法，其中DNA分子是宿主细胞基因组一部分的内源基因。
33.根据权利要求32的方法，其中宿主细胞为动物细胞。
34.一种细胞治疗的方法，包括在机体内用包含与根据权利要求10的是一种DNA分子的核酸分子可操作连接的表达调控元件的载体转化或转染细胞从而使该DNA分子的表达在宿主生物体原位发生。
35.刺激肝细胞增殖的方法，包括使这样的细胞与根据权利要求1的有效量的多肽或其片段、类似物或衍生物接触。
36.根据权利要求35的一种方法，它是在体外进行的。
37.根据权利要求35的一种方法，它是在体内进行的。
38.一种通过基因治疗体内刺激肝细胞生长的方法，它包括用与编码根据权利要求1的多肽或其片段或类似物的核酸分子可操作连接的表达载体转化或转染宿主机体中存在的内源性肝细胞，从而使该核酸分子能在原位表达该多肽、类似物或片段。
39.根据权利要求37或38的一种方法，它是用于治疗宿主机体内的肝病或肝功能紊乱。
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