KR20080085093A

KR20080085093A - 키마아제에 의한 ｓｌｐｉ의 프로세싱

Info

Publication number: KR20080085093A
Application number: KR1020087019787A
Authority: KR
Inventors: 스탠리 벨코우스키; 마이클 알. 드안드레아
Original assignee: 얀센 파마슈티카 엔.브이.
Priority date: 2006-01-12
Filing date: 2007-01-12
Publication date: 2008-09-22
Also published as: US7575888B2; WO2007084397A3; BRPI0706494A2; EP1982186A2; JP2009523423A; US20090275068A1; CN101401001A; US7892779B2; MX2008009105A; CA2636774A1; WO2007084397A2; AU2007207749A1; US20070166779A1

Abstract

본 발명에 이르러 인간 키마아제가 인간 SLPI를 특정 부위에서 절단하며, 이 절단은 키마아제 활성의 지표로서 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 본 발명은 SLPI 프로세싱을 측정함으로써 인간 대상에서 키마아제-관련 질환을 진단하거나 키마아제-관련 질환의 치료 효율을 평가하는 방법과, 기타 관련 방법 및 조성물을 제공한다.

생물학적 샘플, 키마아제, SLPI, 타액, 키트

Description

키마아제에 의한 ＳＬＰＩ의 프로세싱{PROCESSING OF SLPI BY CHYMASE}

관련 출원과의 상호 참조

본 출원은 2006년 1월 12일자로 출원된 미국 특허 출원 제60/758,400호에 대한 우선권을 주장하며, 상기 미국 특허 출원의 전체 내용은 본 명세서에 참고로 포함된다.

본 발명은 키마아제 활성의 분석 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 SLPI(Secretory Leukocyte Protease Inhibitor) 프로세싱의 측정에 의해 인간 대상에서 키마아제-관련 질환을 진단하거나 키마아제-관련 질환의 치료 효율을 평가하는 것에 관한 것이다.

분비 백혈구 프로테아제 저해제(SLPI)는 처음에 엘라스타아제 및 카텝신 G의 11.7 kD의 저해제로서 발견되었다 (문헌[Thompson et al., Proc Natl Acad Sci U S A 1986; 83:6692-6]). SLPI는 비만 세포에 의해 발현되며 (문헌[Westin et al., Biol Chem 1999; 380:489-93]), 상부 기도 점막 (문헌[Fryksmark et al., Ann Otol Rhinol Laryngol 1982; 91:268-71]) 및 객담 (문헌[Kramps et al., J Histochem Cytochem 1981; 29:712-9])에 존재한다. 다량의 SLPI가 비강 (문헌[Lee et al., Am Rev Respir Dis 1993; 147:710-6]), 기관 및 기관지 (문헌[Kramps et al., Am Rev Respir Dis 1984; 129:959-63]; 문헌[Mooren et al., J Histochem Cytochem 1982; 30:1130-4]), 상악동 (프릭스마크(Fryksmark) 등의 상기 문헌) 및 세기관지 상피의 배상 세포(goblet cell) (문헌[Willems et al., Am Rev Respir Dis 1989; 139:1244-50])에서 측정되었다.

SLPI의 결정학적 연구에 의하면, 이 분자는 유장 산성 단백질-유사 패밀리(Whey Acidic protein-like family)의 구성원인 것으로 밝혀졌다 (문헌[Grutter et al., Embo J 1988; 7:345-51]). 이러한 단백질은 4개의 다이설파이드로 결합된 도메인 두 개를 갖는다. 각각의 도메인의 4개의 다이설파이드 결합 및 나선 구조에 의해 SLPI는 매우 안정한 단백질이 된다. 소 (그루터(Grutter)의 상기 문헌) 및 양 (문헌[Pemberton et al., Biochim Biophys Acta 1998; 1379:29-34])의 비만 세포 프로테아제는 SLPI를 Leu72 ―Met73에서 절단하는 것으로 밝혀졌다. 기타의 것들이 SLPI의 보다 작은 분자량의 프로세싱된 생성물을 보여 주었지만, 이 절단에 책임이 있는 효소를 특성화하지는 못하였다 (문헌[Ota et al., Hum Reprod 2002; 17:2517-22]). SLPI는 키마아제의 가장 효과적인 저해제인 것으로 설명되었다 (문헌[Walter et al., Arch Biochem Biophys 1996; 327:81-8]; 및 문헌[Fink et al., Biol Chem Hoppe Seyler 1986; 367:567-71]).

키마아제는 펩티다아제 패밀리 S1에 속하는 키모트립틱 세린 프로테이나아제이다. 이것은 피부 및 폐의 구상 백혈구 및 비만 세포에서 발현되며, 세포외 기질(extracellular matrix)의 분해, 점막하선 분비의 조절 및 혈관 활성 펩티드의 생성 기능을 하는 것으로 생각된다. 이것은 비만 세포가 활성화된 후 세포외 기질 내로의 방출 직후 최대 활성을 갖는다 (문헌[Takai et al., FEBS Lett 467: 141―144, 2000]). 두 가지 형태의 포유류 키마아제, α 및 β가 있으며, 이는 그 종이 상이하고 기능이 상이하다. 인간 및 비비 원숭이에서는 α-키마아제만이 발견되는 반면, 개, 쥐 및 생쥐는 α- 및 β-키마아제 둘 모두를 갖는다 (문헌[Dell'Italia et al., Curr Opin Cardiol 2003 17: 374―379]).

키마아제의 정확한 병태생리학적 역할은 아직 결정되지 않았지만, 키마아제는 미세 혈관에서의 유출(microvascular leakage), 호중구 축적, 점액 분비 촉진, 및 사이토카인의 조정 등에 연루되어 있다. 키마아제-선택성의 강력한 저해제는 비만 세포 매개성 질환, 예를 들어 천식, 폐 염증, 및 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)에서 필요로 할 수도 있다. 키마아제는 심장 및 혈관 벽 안지오텐신 II의 생성에서 그 역할을 할 수 있기 때문에, 키마아제 저해제는 심장 비대뿐만 아니라 혈관벽 손상 및 염증 (죽상 동맥 경화증/재협착)용 혈압 강하 치료제로서의 잠재적인 용도를 가질 수도 있다. 키마아제는 심혈관 질환 치료법의 표적이다 (문헌[Doggrell et al., Can J Physiol Pharmacol. 2005 Feb;83(2):123-30]). 게다가, 키마아제는 류마티스 관절염 (문헌[Kobayashi et al., Jpn J Pharmacol. 2002 Sep; 90(1):7-11]), 당뇨병성 신증 (문헌[Huang et al., J Am Soc Nephrol. 2003 Jul;14(7):1738-47]), 및 염증성 질환 (문헌[Muto et al., Idrugs., 2002, 12, 1141-50])과 같은 질환에서 중대한 역할을 하는 것으로 또한 제안되어 왔다.

따라서, 키마아제의 생물학적 활성을 저해하도록 디자인된 화합물은 많은 질 환 영역에서 치료 효과를 제공할 수도 있다. 선택적 키마아제 저해제가 개발되었으며, 이는 TY-51076, SUN-C8257, BCEAB, NK320, 및 TEI-E548을 포함한다 (도그렐(Doggrell) 등의 상기 문헌 참고). 전도 유망한 결과가 심근 경색, 심근증 및 빈맥 유발성 심부전(tachycardia-induced heart failure)의 동물 모델에서 이들 키마아제 저해제를 이용하여 얻어졌다. 일반적으로 인간에서 키마아제 활성의 연구뿐만 아니라 인간에서 키마아제 저해제의 시험을 용이하게 하기 위하여, 인간에서의 키마아제 활성에 있어서의 바이오마커(biomarker)를 개발할 필요가 있다.

발명의 개요

본 발명에 이르러 인간 키마아제가 인간 SLPI를 특정 부위에서 절단하며, 이 절단은 키마아제 활성의 지표로서 사용될 수 있음이 밝혀졌다. 이러한 절단은, 트립타아제, 카텝신 G, 엘라스타아제 및 프로테이나아제 3을 비롯한, SLPI와 상호작용하는 것으로 공지된 일련의 프로테아제에 대하여 시험될 때 키마아제에 특이적이다.

일반적인 일 태양에서, 본 발명은 a) 생물학적 샘플을 인간 대상으로부터 얻는 단계; b) 생물학적 샘플에서 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을 측정하는 단계; 및 c) 단계 b)로부터의 측정된 수준을, 건강한 인간 대상에서의 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 인간 대상에서 키마아제-관련 질환을 검출하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 대조군에 비하여 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준이 상승한다는 것은 인간 대상이 키마아제-관련 질환에 걸렸거나 키마아제-관련 질환의 위험성이 증가함을 나타낸 다.

다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 a) 생물학적 샘플을 인간 환자로부터 얻는 단계; b) 생물학적 샘플에서 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을 측정하는 단계; 및 c) 단계 b)로부터의 측정된 수준을, 치료 이전의 인간 환자에서의 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 인간 환자에서 키마아제-관련 질환의 치료 유효성을 평가하는 방법을 제공하며, 여기서, 상기 대조군에 비하여 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준이 감소한다는 것은 상기 환자에서 키마아제-관련 질환의 치료가 효과적임을 나타낸다.

또한, 본 발명은 a) 인간 키마아제를 분석 혼합물 중 인간 SLPI와 접촉시키는 단계; b) 인간 키마아제가 인간 SLPI를 절단하는 조건 하에 분석 혼합물을 인큐베이션하는 단계; 및 c) 분석 혼합물에서 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 인간 키마아제의 생물학적 활성을 측정하는 방법을 제공한다.

본 발명은 a) 시험 화합물을 분석 혼합물 중 인간 키마아제 및 인간 SLPI와 접촉시키는 단계; b) 인간 키마아제가 인간 SLPI를 절단하는 조건 하에 분석 혼합물을 인큐베이션하는 단계; c) 분석 혼합물에서 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을 측정하는 단계; 및 d) 단계 c)로부터의 검출된 수준을, 시험 화합물이 분석 혼합물에서 빠진 대조군으로부터 검출된 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 인간 키마아제의 생물학적 활성을 감소시키는 화합물을 확인하는 방법을 추가로 제공한다.

게다가, 본 발명은 본 발명의 방법과 관련된 키트도 제공한다.

본 발명의 다른 태양은 a) 생물학적 샘플을 환자로부터 얻는 단계; b) 생물학적 샘플에서 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을 측정하는 단계; 및 c) 단계 b)로부터의 측정된 수준을, 건강한 인간 대상에서의 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준 대조군과 비교하는 단계를 포함하는, 키마아제 저해제를 포함하는 치료에 대하여 반응할 가능성이 보다 우수한 환자를 분류하는 방법이며, 여기서, 상기 대조군에 비하여 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준이 상승한다는 것은 환자가 키마아제 저해제를 포함하는 치료에 대하여 반응할 가능성이 보다 우수함을 나타낸다.

본 발명의 다른 태양, 특징 및 이점은 본 발명의 상세한 설명 및 본 발명의 바람직한 실시 형태들과 첨부된 청구의 범위를 포함하는 하기 개시 내용으로부터 명백해질 것이다.

도 1은 인간 키마아제에 의한 재조합 인간 SLPI(rSLPI)의 절단을 예시한 도면. 각각의 레인에서의 샘플은 1 ― 단백질 크기 표준물 (베크마크(BechMark), 인비트로젠(Invitrogen)); 2 ― SLPI, 0시간; 3 ― 키마아제 + SLPI, 20분; 4 ― 키마아제 + SLPI, 140분; 5 ― 키마아제 + SLPI, 4시간; 6 ― 키마아제 + SLPI, 21시간; 7 ― SLPI, 21시간; 8 ― 키마아제 21시간; 9 ― 1 ug의 키마아제; 10 ― 단백질 크기 표준물 (마크-12, 인비트로젠)이다.

도 2는 공지된 키마아제 저해제가 키마아제에 의한 rSLPI의 절단을 감소시켰 음을 도시한 도면. 수치 0, 8, 80, 800은 분석 혼합물에 존재하는 키마아제 저해제의 양을 pmole 단위로 나타낸 것이다.

도 3은 키마아제가 인간 타액 샘플에 존재하는 SLPI를 절단할 수 있으며, 키마아제 저해제가 이 절단을 감소시킴을 도시한 도면.

도 4는 정상적인 인간 대상과, 키마아제-관련 질환에 걸린 환자로부터 취한 타액 샘플들의 SLPI 절단 수준을 비교한 도면.

도 5는 cSLPI의 증가가 알러지 증상 증가와 상관관계가 있음을 도시한 도면. 총 SLPI에 대한 cSLPI의 비를 항원 챌린지(antigenic challenge)하기 0.75시간 전 및 0.5시간 전, 그리고 항원 챌린지한지 0.5시간 후 및 7시간 후 개체로부터 얻은 비강 세척액에서 웨스턴(western) 분석에 의해 결정하였다(도 5b). 환자를 동일 시점에서 증상 강도(레벨(Lebel) 스코어)에 대하여 스코어링하였다 (도 5a).

도 6은 천식 객담 샘플이 정상적인 객담 샘플보다 큰 퍼센트의 cSLPI/총 SLPI를 포함하며, 이들 개체로부터의 키마아제 수준과 상관관계가 있음을 도시한 도면. 객담 샘플은 정상 및 천식 대상 둘 모두로부터 얻었다. SLPI에 대한 cSLPI의 비 및 키마아제 수준 둘 모두는 웨스턴 분석으로 결정하였다. 값들을 농도 측정 분석법으로 결정하였다.

본 명세서에 인용된 모든 간행물이 본 명세서에 참고로 포함된다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "함유하는", "포함하는", "갖는" 및 "포괄하는"은 제한이 없는 비제한적 의미로 사용된다.

하기는 본 명세서에서 때때로 사용되는 약어이다:

bp = 염기쌍(base pair)

cDNA = 상보성(complementary) DNA

COPD = 만성 폐쇄성 폐질환

ELISA = 효소 결합 면역흡착 분석법(enzyme-linked immunoabsorbent assay);

kb = 킬로베이스; 1000 염기쌍

PAGE = 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis)

PCR = 폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction)

SDS = 소듐 도데실 설페이트

SLPI = 분비 백혈구 프로테아제 저해제

본 명세서에 사용된 용어 "키마아제의 생물학적 활성"은 표준 기술에 따라 생체 내에서 또는 시험관 내에서 측정될 때 키마아제에 의해 발휘되는 활성을 말한다. 키마아제의 예시적인 생물학적 활성은 안지오텐신 I을 혈관 활성 펩티드 안지오텐신 II로 변환시키는 능력, 큰 엔도텔린 1을 31개 아미노산 길이의 펩티드의 엔도텔린 1로 선택적으로 변환시키는 능력, 세포외 기질을 분해하는 능력, 줄기 세포 인자를 절단하여 생활성 용해성 생성물을 생성하는 능력, 프로콜라게나아제, 염증성 사이토카인 및 기타 생활성 펩티드 - 본 명세서에 개시된 SLPI를 포함함 - 를 프로세싱하는 능력 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 사용된 "생물학적 샘플"은 대상으로부터 단리된 세포 또는 생물학적 유체와 같은 세포 또는 조직 물질을 포함하거나 그로 이루어진 샘플을 말한다. "대상"은 치료, 관찰 또는 실험 대상이 되었던 포유류, 예를 들어 쥐, 생쥐, 원숭이 또는 인간일 수 있다. 생물학적 샘플의 예에는, 예를 들어 객담, 혈액, 혈구 세포 (예를 들어, 백혈구 세포), 양수, 혈장, 정액, 타액, 골수, 조직 또는 미세침 생검 샘플, 소변, 복강액, 늑막액 및 세포 배양물이 포함된다. 생물학적 샘플은 조직학적 목적으로 취해진 동결 절편과 같은 조직의 절편을 또한 포함할 수도 있다. 시험용 생물학적 샘플은 분석, 모니터링 또는 관찰의 대상이 되어 온 생물학적 샘플이다. 대조용 생물학적 샘플은 시험용 생물학적 샘플의 양성 또는 음성 대조 중 어느 하나일 수 있다. 흔히, 대조용 생물학적 샘플은 시험용 생물학적 샘플의 유형과 동일한 유형의 대상 조직, 세포 및/또는 생물학적 유체를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 생물학적 샘플은 "임상 샘플"이며, 상기 임상 샘플은 인간 환자로부터 유래되는 샘플이다.

"세포"는 검출 방법의 민감성에 대하여 적절한 적어도 하나의 세포 또는 복수의 세포를 말한다. 세포는 배양된 세포 배양물 중에 존재할 수 있다. 세포는 그의 자연적 환경, 예를 들어 생물학적 조직 또는 유체 중에 또한 존재할 수 있다. 본 발명에 적합한 세포는 박테리아 세포일 수도 있지만, 바람직하게는 진핵 세포이며, 가장 바람직하게는 포유류 세포이다.

본 명세서에 사용된 "인간 키마아제"는 원래 인간으로부터 단리된 키마아제를 말한다. 키마아제는 펩티다아제 패밀리 S1에 속하는 키모트립틱 세린 프로테이나아제이다. 키마아제의 동의어는 비만 세포 프로테아제 I; 골격근 프로테아제; 피부 키모트립틱 프로테이나아제; 비만 세포 세린 프로테이나아제, 키마아제; 및 골격근(SK) 프로테아제를 포함한다. 키마아제의 우선 절단은 Phe-|-Xaa > Tyr-|-Xaa > Trp-|-Xaa > Leu-|-Xaa이다. 예시적인 "인간 키마아제"는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 가지며, 이는 젠뱅크(GenBank) 단백질 ID: NP_001827에 나타나 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "인간 키마아제"는 서열 번호 1에 나타내어진 인간 키마아제의 구조적 및 기능적 다형체(polymorphism)를 포함한다. "다형체"는 집단 중 개체들 사이에서의 특정 유전자좌에서의 유전적 변이체 세트를 말한다.

본 명세서에 사용된 "키마아제-관련 질환" 또는 "키마아제-관련 질병"은 키마아제의 과활성 또는 과발현과 관련된 질환 또는 질병, 또는 대상에서 키마아제의 생물학적 활성을 감소시킴으로써 또는 키마아제의 양을 감소시킴으로써 치료되거나 개선될 수 있는 질환 또는 질병과, 대상에서 그러한 질환 또는 질병에 수반되는 준임상적 징후 또는 상태를 말한다. 예시적인 "키마아제-관련 질환"은 천식, 알러지성 비염, 섬유증, 고혈압, 심장 비대증, 심부전, 류마티스 관절염, 당뇨병성 신증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 및 염증성 질환을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에 사용된 "인간 SLPI"는 원래 인간으로부터 단리된 분비 백혈구 펩티다아제 저해제를 말한다. SLPI의 동의어는 ALP; MPI; ALK1; BLPI; HUSI; WAP4; WFDC4; 및 HUSI-I를 포함한다. SLPI는 상피 조직을 세린 프로테아제로부터 보호한다. 이것은 정장(seminal plasma), 경부 점액, 및 기관지 분비물을 비롯한 다양한 분비물에서 발견되며, 트립신, 백혈구 엘라스타아제 및 카텝신 G에 대하여 친화성을 갖는다. 그의 저해 효과는 내인성 단백질 분해 효소에 의한 공격으로부터 상피 표면을 보호함으로써 면역 반응(immune response)에 기여하는데, 당해 단백질은 광범위한 스펙트럼의 항생제 활성을 갖는 것으로 또한 생각된다. 예시적인 "인간 SLPI"는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 가지며, 이는 젠뱅크 단백질 ID: NP_003055에 나타나 있는 단백질의 성숙 부분이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "인간 SLPI"는 서열 번호 2에 나타내어진 인간 SLPI의 구조적 및 기능적 다형체를 포함한다.

"인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준"은 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI의 절단 또는 단백질 분해의 정도 또는 양을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준"은 시험용 생물학적 샘플 또는 분석 혼합물에 존재하는 전장 SLPI에 대한 키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편의 비로서 측정될 수 있다.

"키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편"은 키마아제에 의한 SLPI의 단백질 분해 또는 절단으로부터 생성되는 인간 SLPI의 일부분을 말한다. 본 발명에서, 인간 키마아제는 Leu72 ― Met73 사이에서 인간 SLPI를 절단하는 것으로 밝혀졌으며, 여기서, 숫자 72 또는 73은 인간 SLPI의 아미노 말단으로부터 세는 아미노산 잔기의 위치를 말한다. 그와 같이, 예시적인, "키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편"은 서열 번호 2의 Ser1 ― Leu72 또는 Met 73 ― Ala107 단편일 수 있으며, 이는 각각 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어진다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편"은 서열 번호 3 또는 서열 번호 4에 나타내어진 인간 SLPI 단편의 구조적 및 기능적 다형체를 포함한다.

"뉴클레오티드 서열"은 단일- 또는 이중-가닥 형태 중 어느 하나의 중합체 중 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 잔기 중 어느 하나의 배열을 말한다. 핵산 서열은 하기 염기, 즉, 각각 T, A, C, G 및 U로 약칭되는 티미딘, 아데닌, 시토신, 구아닌 및 우라실의 천연 뉴클레오티드 및/또는 상기 천연 뉴클레오티드의 합성 유사체로 구성될 수 있다.

"단리된" 핵산 분자는 핵산의 천연 공급원에 존재하는 적어도 하나의 다른 핵산 분자로부터 실질적으로 분리되거나, 핵산 분자가 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 기타 화학물질 중 적어도 하나가 실질적으로 없는 것이다. 또한, "단리된" 핵산 분자는, 예를 들어 핵산이 유래되는 유기체의 게놈 DNA에서 5' 및 3' 말단에서 원래 핵산 분자의 측면에 위치하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열이 실질적으로 없는 핵산 분자일 수 있다. 핵산 분자는, 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% (건조 중량 기준) 미만의 기타 핵산 분자(들) 또는 기타 화학물질(들) (본 명세서에서, "오염 핵산 분자" 또는 "오염 화학물질"로도 지칭됨)이 존재할 때 핵산 분자 제제에서 다른 핵산 분자(들) 또는 다른 화학물질(들)로부터 "실질적으로 분리"되거나, 상기 다른 핵산 분자(들) 또는 다른 화학물질(들)이 "실질적으로 없다".

단리된 핵산 분자는, 한정됨이 없이, 다른 서열들과 관계없는 별개의 핵산 분자 (예를 들어 PCR 또는 제한 엔도뉴클레아제 처리에 의해 생성되는 cDNA 또는 게놈 DNA 단편)와, 벡터, 자가 복제 플라스미드, 바이러스 (예를 들어, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 또는 헤르페스 바이러스(herpes virus)) 내로, 또는 원핵 생물 또는 진핵 생물의 게놈 DNA 내로 혼입되는 핵산 분자를 포함한다. 게다가, 단리된 핵산 분자는 하이브리드 또는 융합 핵산 분자의 부분인 핵산 분자를 포함할 수 있다. 단리된 핵산 분자는 (i) 시험관 내에서, 예를 들어 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭되거나; (ii) 예를 들어, 화학적 합성에 의해 합성되거나; (iii) 클로닝에 의해 재조합적으로 생성되거나; (iv) 절단 및 전기영동 또는 크로마토그래피 분리에 의한 것과 같이 정제되는 핵산 서열일 수 있다.

용어 "올리고뉴클레오티드" 또는 "올리고"는 상대적으로 짧은 길이, 예를 들어 길이가 100개 미만의 잔기인 단일-가닥 DNA 또는 RNA 서열을 말한다. 다수의 방법에 있어서, 길이가 약 16-25개의 뉴클레오티드인 올리고뉴클레오티드가 유용하지만, 약 25개 초과의 뉴클레오티드의 보다 긴 올리고뉴클레오티드가 때로 이용될 수도 있다. 몇몇 올리고뉴클레오티드는 상보성 핵산 가닥의 합성을 위한 "프라이머"로서 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 프라이머는 DNA 폴리머라아제를 이용한 반응에서 상보성 DNA 가닥의 합성을 프라이밍하기 위하여 상보성 핵산 서열에 혼성화될 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 여러 핵산 검출 방법에서, 예를 들어 노던 블로팅(Northern blotting) 또는 원위치(in situ) 혼성화에서 혼성화에 또한 유용하다.

용어 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 본 명세서에서 펩티드 결합 또는 변형 펩티드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 결합된 아미노산 사슬을 지칭하도록 서로 바꾸어서 사용될 수 있다. 아미노산 사슬은 2개 초과의 아미노산의 임의의 길이의 것일 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 용어 "폴리펩티드", "단백질" 및 "펩티드"는 그의 다양한 변형 형태를 또한 포함한다. 그러한 변형된 형태는 자연적으로 발생되는 변형된 형태 또는 화학적으로 변형된 형태일 수 있다. 변형된 형태의 예에는 글리코실화 형태, 포스포릴화 형태, 미리스토일화 형태, 팔미토일화 형태, 리보실화 형태, 아세틸화 형태, 유비퀴틴화 형태 등을 포함하지만, 이로 한정되는 것은 아니다. 또한, 변형은 분자내 가교결합과, 지질, 플라빈, 비오틴, 폴리에틸렌 글리콜 또는 그 유도체 등과 같은 다양한 부분에의 공유 결합적 부착을 포함한다. 게다가, 변형은 환화, 분지화 및 가교결합을 또한 포함할 수도 있다. 또한, 유전자 코돈에 의해 코딩되는 통상적인 20개 아미노산 이외의 아미노산이 폴리펩티드 내에 또한 포함될 수도 있다.

"단리된 단백질"은 당해 단백질의 천연 공급원에 존재하는 적어도 하나의 다른 단백질로부터 실질적으로 분리되거나, 단백질이 화학적으로 합성될 때 화학적 전구체 또는 기타 화학물질 중 적어도 하나가 실질적으로 없는 것이다. 단백질은, 약 30%, 20%, 10%, 또는 5% (건조 중량 기준) 미만의 기타 단백질(들) 또는 기타 화학물질(들) (본 명세서에서, "오염 단백질" 또는 오염 화학물질"로도 지칭됨)이 존재할 때 단백질 제제에서 다른 단백질(들) 또는 다른 화학물질(들)로부터 "실질적으로 분리"되거나, 상기 다른 단백질(들) 또는 다른 화학물질(들)이 "실질적으로 없다".

단리된 단백질은 여러 상이한 물리적 형태를 가질 수 있다. 단리된 단백질은 전장 미성숙(nascent)또는 미프로세싱(unprocessed) 폴리펩티드로서, 또는 부분적으로 프로세싱된 폴리펩티드로서 또는 프로세싱된 폴리펩티드들의 조합으로서 존재할 수 있다. 전장 미성숙 폴리펩티드는 전장 미성숙 폴리펩티드의 단편들을 형성하는 특이적 단백질 분해 절단 이벤트(event)에 의해 번역후 변형될 수 있다. 단편, 또는 단편들의 물리적 회합체는 전장 폴리펩티드와 관련된 화학적 활성을 가질 수 있지만, 개개의 단편들과 관련된 생물학적 활성의 정도는 다양할 수 있다.

단리된 폴리펩티드는 비-자연 발생 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, "단리된 폴리펩티드"는 "하이브리드 폴리펩티드"일 수 있다. "단리된 폴리펩티드"는 또한 아미노산의 부가 또는 결실 또는 치환에 의해 자연 발생 폴리펩티드로부터 유도되는 폴리펩티드일 수 있다. 또한, 단리된 폴리펩티드는, 본 명세서에서 다른 세포 성분, 다른 폴리펩티드, 바이러스 물질 또는 배양 배지가 실질적으로 없거나, 폴리펩티드가 화학적으로 합성될 때 화학적 합성과 관련된 화학적 전구체 또는 부산물이 실질적으로 없는 실질적으로 균질한 제제 중의 특정 폴리펩티드를 의미하기 위하여 사용되는 "정제된 폴리펩티드"일 수 있다. "정제된 폴리펩티드"는, 당업자에게 명백한 바와 같이, 표준 정제 기술에 의해, 또는 화학적 합성에 의해 천연 또는 재조합 숙주 세포로부터 얻어질 수 있다.

본 명세서에서 용어 "하이브리드 단백질", "하이브리드 폴리펩티드", "하이브리드 펩티드", "융합 단백질", "융합 폴리펩티드" 및 "융합 펩티드"는 사실상 특정 폴리펩티드에 결합하지 않는 하나 이상의 다른 폴리펩티드 분자에 공유 결합된 특정 폴리펩티드 분자를 갖는 비-자연 발생 폴리펩티드 또는 단리 폴리펩티드를 의미하기 위하여 서로 바꾸어서 사용될 수 있다. 그와 같이, "하이브리드 단백질"은 공유 결합에 의해 함께 결합된 2가지의 자연 발생 단백질 또는 그의 단편일 수 있다. 또한, "하이브리드 단백질"은 2개의 인공 폴리펩티드를 함께 공유 결합시킴으로써 형성되는 단백질일 수 있다. 전형적으로, 2개 이상의 폴리펩티드 분자는 펩티드 결합에 의해 함께 결합 또는 "융합"되어 단일한 비-분지형 폴리펩티드 사슬을 형성하지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 본 명세서에 사용된 용어 "단백질 단편"은 단백질의 일부분을 나타내는 폴리펩티드를 의미한다.

"재조합체"는 분자 생물학 기술을 이용하여 자연 상태 이외의 그 무엇인가로 변형시킨 핵산, 핵산에 의해 코딩되는 단백질, 세포 또는 바이러스 입자를 말한다. 예를 들어, 재조합 세포는 천연 (비-재조합) 형태의 세포 내에서는 발견되지 않는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있거나, 다르게는 비정상적으로 과소발현되거나 전혀 발현되지 않는 천연 유전자를 발현할 수 있다. 재조합 세포는 천연 형태의 세포에서 발견되는 유전자도 포함할 수 있으며, 여기서, 이 유전자는 인공적인 수단에 의해 변형되어 세포 내로 재도입된다. 이 용어는 내인성 핵산을 세포로부터 제거하지 않고서 변형시킨 내인성 핵산을 포함하는 세포도 포함하며, 그러한 변형은, 예를 들어 유전자 치환(gene replacement) 및 부위-특이적 돌연변이에 의해 얻어지는 것들을 포함한다.

"재조합 숙주 세포"는 세포 내로 재조합 DNA 서열을 도입한 세포이다. 재조합 DNA 서열은, 예를 들어, 전기천공, 인산칼슘 침전법, 미세 주입법, 형질 전환, 바이오리스틱 방법(biolistics) 및 바이러스 감염을 비롯한 임의의 적합한 방법을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 재조합 DNA는 염색체 DNA 내로 통합되어(공유 결합되어) 세포의 게놈을 형성할 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 예를 들어, 재조합 DNA는 에피좀 요소, 예를 들어 플라스미드 상에 유지될 수 있다. 대안적으로는, 안정하게 형질전환되거나 트랜스펙션된(transfected) 세포와 관련하여, 재조합 DNA가 염색체 복제를 통하여 딸세포에 의해 유전되도록 재조합 DNA는 염색체 내로 통합되었다. 이러한 안정성은, 안정하게 형질전환되거나 트랜스펙션된 세포가 외인성 DNA를 포함하는 딸세포 집단으로 이루어진 세포주 또는 클론을 확립하는 능력에 의해 입증된다. 재조합 숙주 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있으며, 이는 박테리아, 예를 들어 이. 콜라이(E. coli), 진균 세포, 예를 들어 효모, 포유류 세포, 예를 들어 인간, 소, 돼지, 원숭이 및 설치류 기원의 세포주, 및 곤충 세포, 예를 들어 초파리- 및 누에-유래된 세포주를 포함한다. 또한, 용어 "재조합 숙주 세포"는 특정 대상 세포뿐만 아니라 그러한 세포의 자손 또는 잠재적 자손도 말하는 것임이 이해된다. 소정 변형이 돌연변이 또는 환경 영향 중 어느 하나로 인하여 다음 세대에서 발생할 수 있기 때문에, 그러한 자손은 사실상 부모 세포와 동일하지 않을 수도 있지만, 본 명세서에 사용되는 용어의 범주 이내에 여전히 포함된다.

"서열"은 단량체가 중합체 내에서 나타나는 선형 순서, 예를 들어 폴리펩티드 중 아미노산의 순서 또는 폴리뉴클레오티드 중 뉴클레오티드의 순서를 의미한다.

당업계에 공지된 바와 같이, "서열 동일성 또는 유사성"은 서열들의 비교에 의해 결정되는 바와 같이, 2개 이상의 폴리펩티드 서열들 또는 2개 이상의 폴리뉴클레오티드 서열들 사이의 관계이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 2개 이상의 핵산 서열들 또는 2개 이상의 폴리펩티드 서열들 사이의 관계의 맥락에서 "동일성"은 서열들을 최적으로 정렬 및 분석할 때 각각 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 백분율을 말한다. 예를 들어, 서열 번호 2의 아미노산 서열에 대하여 쿼리(queried) 서열을 비교하기 위해서는, 쿼리 서열을 서열 번호 2의 서열과 최적으로 정렬하고, 전장의 서열 번호 2의 서열에 대하여 최상의 국소적 정렬을 얻는다.

분석은 수동으로 또는 서열 비교 알고리즘을 이용하여 수행할 수 있다. 서열 비교에 있어서, 전형적으로 한 서열은 참조 서열로 작용하며, 쿼리 서열을 상기 참조 서열과 비교한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 참조 서열은 컴퓨터로 입력되고, 필요할 경우 하위-서열 코오디네이트(sub-sequence coordinate)가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다.

비교를 위한 서열들의 최적 정렬은, 예를 들어 문헌[Needleman & Wunsch, J Mol. Biol., 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘의 사용에 의해 행해질 수 있다. 니들맨(Needleman) 및 분쉬(Wunsch) 분석을 실시하기 위한 소프트웨어는 인스티투트 파스퇴르(Institut Pasteur) (프랑스 소재)의 생물학적 소프트웨어 웹사이트, http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/ interfaces/needle.html을 통하여 공식적으로 입수가능하다. 니들(NEEDLE) 프로그램에서는 두 서열의 전장을 고려할 때 두 서열의 최적 정렬 (갭 포함)을 찾기 위하여 니들맨-분쉬 범용 정렬 알고리즘이 이용된다. 보고된 정렬 영역 - 당해 길이 내의 임의의 갭을 포함함 - 에 걸친 두 서열들 사이의 동일한 매치의 백분율과 함께 동일성이 계산된다. 유사성 스코어가 또한 제공되며, 여기서 유사성은 보고된 정렬 영역 - 당해 길이 내의 임의의 갭을 포함함 - 에 걸친 두 서열들 사이의 매치 백분율로서 계산된다. 표준 비교에서는 단백질 서열의 경우 EBLOSUM62 매트릭스, 그리고 뉴클레오티드 서열의 경우 EDNAFULL 매트릭스가 이용된다. 갭 오픈 페널티(gap open penalty)는 갭이 생성될 때 감해지는 스코어이며, 갭 오픈 페널티를 사용한 초기 설정치는 10.0이다. 갭 연장에 있어서, 페널티는 갭 중의 각각의 염기 또는 잔기에 대한 표준 갭 페널티에 더해지며, 초기 설정치는 0.5이다.

또한, 두 폴리뉴클레오티드가 서로에 대하여 실질적으로 동일함을 나타내기 위하여 시험법으로서 혼성화가 이용될 수 있다. 고도의 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오티드들은 엄격한 혼성화 조건 하에서 서로에게 혼성화될 것이다. "엄격한 혼성화 조건"은, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1989)]에 기재된 바와 같이, 당업계에 공지된 의미를 갖는다. 예시적인 엄격한 혼성화 조건은, 혼성화 폴리뉴클레오티드들이 상보성을 공유하는 길이에 따라 약 45℃에서 6x 염화나트륨/시트르산나트륨(SSC)에서의 혼성화, 이어서 50 - 65℃에서 0.2x SSC 및 0.1% SDS에서의 1회 이상의 세척을 포함한다.

"벡터"는 이종성 핵산이 삽입될 수 있거나 삽입되는 핵산 분자를 말한다. 몇몇 벡터는 숙주 세포 내로 도입되어 벡터의 복제를 허용하거나 벡터 또는 작제물에 의해 코딩되는 단백질의 발현을 허용할 수 있다. 벡터는 전형적으로 선발가능한 마커, 예를 들어 약물 내성을 허용하는 단백질을 코딩하는 유전자, 복제 원점 서열, 및 이종성 서열의 삽입을 허용하는 다수의 클로닝 부위를 갖는다. 벡터는 전형적으로 플라스미드-기반의 것이며, 소문자 "p", 이어서 문자 및/또는 숫자의 조합으로 표기된다. 본 명세서에 개시된 출발 플라스미드는 구매가능하거나, 무제한적으로 공식적으로 입수가능하거나, 당업계에 공지된 절차의 적용에 의해 입수가능한 플라스미드로부터 작제될 수 있다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다수의 플라스미드 및 기타 클로닝 및 발현 벡터는 잘 알려져 있으며, 당업자라면 쉽게 입수가능하다. 게다가, 당업자라면 본 발명에서 사용하기에 적합한 많은 다른 플라스미드를 쉽게 작제할 수도 있다. 본 발명에서, 그러한 플라스미드와, 기타 벡터의 특성, 작제 및 사용은 본 발명의 개시 내용으로부터 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다.

본 발명의 실행에서, 분자 생물학, 미생물학 및 재조합 DNA에서의 다수의 통상적인 기술이 사용된다. 이들 기술은 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Vols. I, II, and III, F.M. Ausubel, ed. (1997)]; 및 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)]에 설명되어 있다.

본 발명은 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을 측정함으로써 인간 키마아제의 생물학적 활성을 측정하는 일반적인 방법을 제공한다.

일반적인 일 태양에서, 본 발명은 생물학적 샘플에서 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을 측정함으로써 인간 대상에서 키마아제-관련 질환을 검출하는 방법을 제공한다. 키마아제-관련 질환에 걸린 인간 대상은 과활성 키마아제 또는 증가된 수준의 키마아제를 가질 수 있다. 따라서, 그러한 인간 대상으로부터 취해진 생물학적 샘플은 건강한 인간 대상의 SLPI 절단과 비교하여 키마아제에 의한 특정 부위 Leu72-Met73에서의 SLPI의 더 많은 절단을 포함할 수 있다.

임의의 유형의 생물학적 샘플이 본 발명에서 사용될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 생물학적 샘플은 타액, 정액, 비강 분비물, ELF 또는 세척액일 수 있다. 생물학적 샘플은 당업자에게 공지된 방법으로 인간 대상으로부터 얻어질 수 있다. 대조용 생물학적 샘플은 시험용 생물학적 샘플의 유형과 동일한 유형의 대상 조직, 세포 및/또는 생물학적 유체를 포함하며, 키마아제-관련 질환으로 진단되지 않은 건강한 인간들 중 하나 또는 상기 건강한 인간들의 집단으로부터 얻어질 수 있다.

전장 인간 SLPI의 수준 및 키마아제 절단에 의해 생성된 SLPI 단편의 수준 둘 모두는 생물학적 샘플로부터 측정되며, 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준의 정량화를 위하여 사용될 수 있다. 생물학적 샘플에서의 전장 인간 SLPI의 수준 및 키마아제 절단에 의해 생성된 SLPI 단편의 수준은 당업자에게 공지된 임의의 단백질 정량화 수단에 의해 측정될 수 있다.

일 실시 형태에서, SLPI 또는 SLPI 단편은 생물학적 샘플로부터 단리 또는 정제하여 그 양을 측정할 수 있다. SLPI 또는 SLPI 단편은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 크기-기반의 분리 방법, 예를 들어 젤 여과법을 이용하여 나머지 생물학적 샘플로부터 쉽게 분리될 수 있다. 게다가, 샘플의 환원 후 샘플 중 SLPI 또는 SLPI 단편은 젤, 예를 들어 폴리아크릴아미드 젤에서 분리되고, 그 후 당해 단백질 복합체와의 항체 면역반응성(antibody immunoreactive)을 이용하여 면역블로팅될 수 있다.

대안적으로, SLPI 또는 SLPI 단편의 수준은 분리, 단리 또는 정제 없이 생물학적 샘플에서 측정될 수 있다. 이를 위하여, SLPI 또는 SLPI 단편과의 선택적 면역반응성을 갖는 항체를 면역 분석에서 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 면역세포화학적 방법이 사용될 수 있다. 다른 잘 알려진 항체-기반의 기술이 또한 사용될 수 있으며, 이는 예를 들어 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA), 방사선 면역 분석법(radioimmunoassay, RIA), 면역방사 계수 측정법(immunoradiometric assay, IRMA), 형광 면역 분석법(fluorescent immunoassay), 단백질 A 면역 분석법, 및 면역효소 분석법(immunoenzymatic assay, EMA)을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제4,376,110호 및 미국 특허 제4,486,530호를 참고하는데, 상기 미국 특허 둘 모두는 본 명세서에 참고로 포함된다.

이어서, 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준은 시험용 생물학적 샘플 또는 분석 혼합물에 존재하는 전장 SLPI에 대한 키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편의 비로서 계산된다. 대조 샘플에 비하여 시험 샘플에서 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준이 상승한다는 것은 인간 대상이 키마아제-관련 질환에 걸렸거나 키마아제-관련 질환의 발병 위험성이 증가함을 나타낸다.

다른 일반적인 태양에서, 본 발명은 치료 전, 치료 동안 또는 치료 후 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을 측정하는 단계에 의해 인간 환자에서 키마아제-관련 질환에 대한 치료의 유효성을 평가하는 방법을 제공한다. 키마아제-관련 질환에 효과적인 치료는 인간 환자에서 키마아제의 생물학적 활성을 감소시키거나 키마아제의 양을 감소시킨다. 그와 같이, 키마아제에 의한 특정 부위 Leu72-Met73에서의 인간 SLPI의 더 적은 절단이 효과적인 치료 후 그러한 인간 환자로부터 취해진 생물학적 샘플에서 발견된다. 대조로서, 시험용 생물학적 샘플의 유형과 동일한 유형의 대상 조직, 세포 및/또는 생물학적 유체를 포함하는 생물학적 샘플이 치료 이전의 동일 인간 환자로부터 얻어질 수 있다. 대조 샘플에 비하여 시험 샘플에서 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준이 감소한다는 것은 상기 환자에서 키마아제-관련 질환의 치료가 효과적임을 나타낸다.

본 발명의 방법은 키마아제-관련 질환과 관련된 다른 바이오마커, 표현형 또는 생리학적 변화를 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 천식에서, VEGF 수준 및 기도 혈관 투과 지수는 천식 환자에서 메타콜린에 대한 기도의 과다 반응성 및 기도 폐쇄의 정도와 반비례하는 상관 관계가 있다는 것이 최근에 보고되었다. (문헌[Kanazawa et al., Clin Exp Allergy. 2005 Nov; 35(11):1432-6]). 특히, 유도 객담에서의 VEGF 수준 및 기도 혈관 투과 지수는 정상적인 대조 또는 궤양성 대장염(ulcerative colitis, UC) 환자 (Id.)에서보다 궤양성 대장염(UC)이 없는 천식 환자 및 UC가 있는 천식 환자에서 유의하게 더 높았다. 그와 같이, 천식 병을 진단하는 본 발명의 방법 또는 천식 병의 치료 유효성을 평가하는 본 발명의 방법에서, 본 방법은 인간 대상의 유도 객담에서 VEGF의 발현 수준을 분석하는 단계를 추가로 포함한다.

만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 완전히 가역적이지는 않은 진행성 기류 제한과 관련된 염증성 폐질환이다. COPD는 일반적으로 흡연과 관련된 만성 폐쇄성 기관지염 및 폐기종을 포함한다. COPD의 정확한 병인은 공지되어 있지 않지만, 의학 문헌은 몇몇 경우, COPD가 매우 중증인 만성 천식으로부터의 병리학적 진행을 나타낼 수도 있음을 시사하고 있다. 따라서, COPD의 치료에 이용가능한 현재의 치료법은 주로 천식과 관련된 기도 및 폐의 염증을 감소시키도록 디자인된 것들이다. 현재의 치료법은 경구 또는 흡입 코르티코스테로이드 및 기관지 확장제, 예를 들어 β₂-아드레날린 작용제(adrenergic agonist) 및 콜린 길항제(cholinergic antagonist)를 포함한다. 따라서, 천식의 새로운 치료법이 COPD의 가능한 치료법이기도 하다는 것을 예상할 수 있다. COPD에 대한 개관에 있어서는, 문헌[de Boer, W. I. Perspectives for cytokine antagonist therapy in COPD. Drug Discovery Today, 10(2):93, 2005]; 및 문헌[Barnes, P.J. New Treatments for COPD. Nature Reviews- Drug Discovery, 1: 437, 2002]을 참고한다. 천식과 같이, COPD의 염증 측면은 호중구 및 대식 세포와 같은 백혈구 세포의 폐 및 기도 내로의 유입을 포함하는 염증 반응을 그 특징으로 할 수 있다. 이 유입은 천식 및 COPD 둘 모두와 관련된 기도 및 폐 염증의 특질들 중 하나이다. 그와 같이, COPD 병을 진단하는 본 발명의 방법 또는 COPD 병의 치료 유효성을 평가하는 본 발명의 방법에서, 본 방법은 백혈구 세포의 폐 및 기도 내로의 유입을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.

사이토카인은 천식 및 COPD에서 주요 염증 매개체이다. 전염증성 사이토카인은 특히 인터류킨(IL)-1, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor, TNF)-α 및 대식 세포 화학 주성 인자(macrophage chemotactic factor, MCP)-1을 포함한다. 천식 및 COPD의 치료에 효과적인 치료제는 이들 전염증성 사이토카인의 수준을 감소시키는 경향이 있다. 따라서, 천식 또는 COPD 병을 진단하는 본 발명의 방법 또는 천식 또는 COPD 병의 치료 유효성을 평가하는 본 발명의 방법에서, 본 방법은 대상에서 사이토카인의 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 다른 태양은 키마아제 저해제 치료에 대하여 반응할 가능성이 보다 우수한 환자를 분류하는 방법이며, 이는 그러한 환자에서 SLPI 절단 수준을 측정하는 단계를 포함한다. SLPI가 더 많이 절단되는 환자는 과다활성 키마아제를 가질 가능성이 있으며, 따라서 키마아제 저해제 치료법에 대하여 더 큰 반응성을 가질 가능성이 있다. 예를 들어, 천식은 압박-관련 (기관지 확장제의 적용) 및/또는 기도 압박-관련 (점액 과생성) 활성에 의해 생길 수도 있다. 비만 세포 및 그의 방출된 키마아제의 역할이 천식의 상기 비정상적인 병태생리학적 특징들 중 어느 하나 또는 그 둘 모두에 연루되는지를 결정하는 것이 남아있다. 그와 같이, 천식은 키마아제-의존적 및/또는 키마아제-독립적 메커니즘의 결과일 수 있다. 그 때문에, 키마아제에 의한 SLPI의 특이적 절단은 키마아제 저해제의 효능 성능을 강화하기 위하여 키마아제-독립적 천식 집단으로부터 키마아제-의존적 천식 집단을 연합시키거나 확인하거나 계층화하기 위하여 사용될 수 있다.

본 발명은 a) 시험 화합물을 분석 혼합물 중 인간 키마아제 및 인간 SLPI와 접촉시키는 단계; b) 인간 키마아제가 인간 SLPI를 절단하는 조건 하에 분석 혼합물을 인큐베이션하는 단계; c) 분석 혼합물에서 키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편의 수준을 측정하는 단계; 및 d) 단계 c)로부터 검출된 양을, 시험 화합물이 분석 혼합물에서 빠진 대조군으로부터 검출된 양과 비교하는 단계를 포함하는, 인간 키마아제의 생물학적 활성을 감소시키는 화합물을 확인하는 방법을 추가로 제공한다.

화합물 확인 방법은 통상적인 실험실 포맷을 이용하여 또는 많은 처리량을 위해 수정된 분석에서 실시될 수 있다. 용어 "많은 처리량"은 동시에 및/또는 빠르게 연이어서 다수의 샘플의 용이한 스크리닝을 허용하는 분석 디자인을 말하며, 로봇 조작 용량을 포함할 수 있다. 많은 처리량의 분석의 다른 요망되는 특징으로는, 요망되는 분석의 달성을 위하여 시약 사용을 감소시키거나, 조작 횟수를 최소화하도록 최적화된 분석 디자인이 있다. 분석 포맷의 예에는 96웰 또는 384웰 플레이트, 공중 부양 소적(levitating droplet), 및 "랩온어칩(lab on a chip)" 마이크로채널 칩(microchannel chip) - 액체 취급 실험에 사용됨 - 을 포함한다. 플라스틱 금형 및 액체 취급 장치의 소형화가 추진됨에 따라 또는 개선된 분석 장치가 설계됨에 따라, 보다 많은 수의 샘플이 본 발명의 디자인을 이용하여 프로세싱될 수 있음이 당업자에게 잘 알려져 있다.

임의의 시험 화합물이 본 발명의 스크리닝 분석에서 스크리닝되어 본 발명의 단백질 복합체의 조정자를 선발할 수 있다. 화합물을 "확인하는"이라는 용어는, (a) 키마아제의 조정자인 것으로 이전에 공지되지 않은 군으로부터 화합물을 선택하는 것; 및 (b) 키마아제에 결합할 수 있거나, 키마아제의 기능 및 활성을 조정할 수 있는 것으로 공지된 화합물을 시험하는 것 둘 모두를 포함하고자 한다. 둘 모두의 유형의 화합물은 일반적으로 본 명세서에서 "시험 화합물" 또는 "후보 화합물"로 지칭된다. 후보 화합물은 작은 유기 또는 무기 화합물, 천연 또는 합성 분자, 예를 들어 항체, 단백질 또는 그의 단편, 안티센스 뉴클레오티드, 간섭 RNA(interfering RNA, iRNA) 및 라이보자임과, 그의 유도체, 모방체 및 유사체를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 다수의 화학물질 부류를 포함한다. 바람직하게는, 이것은 작은 유기 화합물, 즉, 분자량이 10,000 달톤 이하, 더 바람직하게는 5,000 달톤 미만인 것이다. 바람직하게는, 시험 화합물은 당업계에 공지된 라이브러리 포맷으로, 예를 들어 화학적으로 합성된 라이브러리 (일반적으로, 문헌[Gordan et al. J. Med. Chem., 37:1385-1401 (1994)] 참고), 재조합적으로 발현된 라이브러리 (예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리) 및 시험관 내 번역-기반의 라이브러리 (예를 들어, 리보솜 디스플레이 라이브러리)로 제공된다.

후보 화합물은 폴리펩티드와의 구조적 상호작용에 필요한 작용성 화학 기를 포함하며, 전형적으로 적어도 하나의 아민, 카르보닐, 하이드록실 또는 카르복실 기, 바람직하게는 적어도 2개의 작용성 화학 기, 그리고 더 바람직하게는 적어도 3개의 작용성 화학 기를 포함한다. 후보 화합물은 하나 이상의 상기 작용기로 치환된 사이클릭 탄소 또는 헤테로사이클릭 구조 및/또는 방향족 또는 다환방향족 구조를 포함할 수 있다. 또한, 후보 화합물은 생체 분자, 예를 들어 펩티드, 당류, 지방산, 스테롤, 아이소프레노이드, 퓨린, 피리미딘, 상기의 유도체 또는 구조적 유사체, 또는 이들의 조합 등일 수 있다. 이 화합물이 핵산일 경우, 화합물은 전형적으로 DNA 또는 RNA 분자이지만, 비-천연 결합 또는 서브유닛을 갖는 변형 핵산도 고려된다.

후보 화합물은 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함하는 매우 다양한 공급원으로부터 얻어진다. 예를 들어, 다수의 수단이 매우 다양한 유기 화합물 및 생체 분자의 무작위 및 지향(directed) 합성에 이용가능하며, 이는 무작위 추출 올리고뉴클레오티드, 합성 유기 조합 라이브러리, 무작위 펩티드의 파지 디스플레이 라이브러리 등의 발현을 포함한다. 또한, 후보 화합물은 생물학적 라이브러리; 공간적으로 주소매김가능한(spatially addressable) 평행 고체상 또는 용액상 라이브러리; 디콘볼루션(deconvolution)을 필요로 하는 합성 라이브러리 방법; "1비드 1화합물(one-bead one-compound)" 라이브러리 방법; 및 친화 크로마토그래피 선발법을 이용한 합성 라이브러리 방법 (문헌[Lam (1997) Anticancer Drug Des. 12:145])을 포함하는 당업계에 공지된 조합 라이브러리 방법 내의 임의의 다수의 접근법을 이용하여 얻어질 수 있다. 대안적으로, 박테리아, 진균류, 식물 및 동물 추출물의 형태의 천연 화합물의 라이브러리는 입수가능하거나 쉽게 제조된다. 게다가, 천연 및 합성 제조 라이브러리 및 화합물은 통상적인 화학적, 물리적 및 생화학적 수단에 의해 쉽게 변형될 수 있다.

또한, 공지된 약리학적 약제는 이 약제의 구조적 유사체를 생성하기 위하여 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화 등과 같은 지향 또는 무작위 화학 변형을 받을 수 있다. 후보 화합물은 무작위로 선발될 수 있거나, 키마아제 활성의 기능을 조정하고/하거나 그에 결합하는 기존의 화합물을 기반으로 할 수 있다. 따라서, 후보 약제 공급원은 키마아제 활성을 증가 또는 감소시키는 하나 또는 하나 초과의 공지된 화합물을 기반으로 하는 분자의 하나 또는 하나 초과의 라이브러리이며, 여기서, 당해 화합물의 구조는 다소의 화학적 부분 또는 상이한 화학적 부분을 포함하도록 당해 분자의 하나 이상의 위치에서 변화된다. 유사 활성화제/저해제의 라이브러리를 생성함에 있어서 당해 분자에 행해진 구조적 변화는 지향 치환 및/또는 부가, 무작위 치환 및/또는 부가, 또는 지향 및 무작위 치환 및/또는 부가의 조합일 수 있다. 조합 라이브러리 제조 분야의 숙련자라면 기존의 화합물을 기반으로 하는 그러한 라이브러리를 쉽게 제조할 수 있다.

또한, 다양한 다른 시약이 당해 혼합물에 포함될 수 있다. 이들은 최적의 단백질-단백질 및/또는 단백질-핵산 결합을 촉진하기 위하여 사용될 수 있는 염, 완충제, 중성 단백질 (예를 들어, 알부민), 세제 등과 같은 시약을 포함한다. 그러한 시약은 반응 성분들의 비-특이적 또는 배경 상호작용을 또한 감소시킬 수 있다. 분석 효율을 향상시키는 기타 시약, 예를 들어 뉴클레아제 저해제, 항미생물제 등도 사용될 수 있다.

분자 라이브러리의 합성 방법의 예를 당업계, 예를 들어, 문헌[Zuckermann et al: (1994). J Med. Chem. 37:2678]에서 찾아볼 수 있다. 화합물 라이브러리는 용액 형태로 (예를 들어, 문헌[Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421]), 또는 비드 (문헌[Lam (1991) Nature 354:82-84]), 칩 (문헌[Fodor (1993) Nature 364:555-556]), 박테리아 (미국 특허 제5,223,409호), 포자 (미국 특허 제5,571,698호), 플라스미드 (문헌[Cull et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1865-1869]) 또는 파지 (예를 들어, 문헌[Scott and Smith (1990) Science 249:3 86-390] 참고) 상에서 제시될 수 있다.

선발된 화합물은 특정 부위 Leu72-Met73에서 SLPI를 절단하는 키마아제의 생물학적 활성을 감소시키는 그의 능력에 대하여 시험될 수 있다. 이 시험 동안, 시험 화합물이 SLPI 이전에, SLPI 이후에 또는 SLPI와 동시에 키마아제에 첨가될 수 있는데, SLPI는 SLPI 프로테아제 활성에 있어서 기질로서의 역할을 한다. 일반적으로, 상기 스크리닝 분석이 시험 화합물의 부재 하에 행해지는 대조 분석이 실시된다. 이어서, 이 대조 분석 결과를 시험 화합물의 존재 하에 얻은 결과와 비교한다.

스크리닝 분석에서 키마아제 또는 SLPI는 단리되거나 단리되지 않을 수 있다. 일 실시 형태에서, 실질적으로 정제된 키마아제 또는 SLPI가 스크리닝 분석에서 사용될 수 있다. 임의의 재조합 발현 방법이 SLIP 또는 키마아제의 발현 및 정제를 위하여 본 발명에서 사용될 수도 있음이 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명에서 사용될 수 있는 예시적인 핵산 분자는 인간 키마아제 또는 SLPI를 코딩하는 핵산 분자를 포함한다.

전형적으로, 핵산 - 바람직하게는 DNA 형태 - 이 벡터 내로 혼입되어 발현 벡터를 형성할 수 있으며, 상기 발현 벡터는 일단 숙주 세포 내로 도입되면 상호작용 단백질 구성원(들)의 생성을 유도할 수 있다. 다수의 유형의 벡터가 본 발명에 사용될 수 있다. 본 발명을 위한 발현 벡터의 작제 방법은 본 발명의 개시 내용을 알게 된 당업자에게 명백함에 틀림없다. (일반적으로,문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel, et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13, 1988]; 문헌[Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3, 1986]; 문헌[Bitter, et al., Methods in Enzymology 153:516-544 (1987)]; 문헌[The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I and II, 1982]; 및 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989.] 참고.)

일반적으로, 발현 벡터는 상호작용 단백질 구성원을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 결합된 프로모터를 갖는 발현 카세트를 포함한다. 프로모터는 천연 프로모터, 즉, 자연 발생 세포에서 상호작용 단백질 구성원의 발현에 책임이 있는 상기 세포에서 발견되는 프로모터일 수 있다. 대안적으로, 발현 카세트는 키메라 발현 카세트, 즉, 자연 발생 세포에서 상호작용 단백질 구성원의 발현에 책임이 있는 천연 프로모터가 아닌 이종성 프로모터를 갖는 것일 수 있다. 발현 벡터는 숙주 세포에서의 벡터의 복제를 위한 DNA 복제 원점을 추가로 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 발현 벡터는 예를 들어, 이. 콜라이에서 벡터의 증폭을 위한 복제 원점과, 발현 벡터를 품고 있는 숙주 세포만을 선발 및 유지하기 위한 선발 마커(들)를 또한 포함한다.

그와 같이 작제된 발현 벡터는 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해, 예를 들어 직접적인 DNA의 형질전환, 미세 주입, 전기천공, 바이러스 감염, 리포펙션(lipofection), 유전자 총(gene gun) 등에 의해 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 대상 단백질의 발현은 일시적이거나 안정한 것일 수 있다. 발현 벡터는 숙주 세포에서 염색체외(extrachromosomal) 상태로, 즉, 자가-복제 플라스미드 또는 바이러스로서 유지될 수 있다. 대안적으로, 발현 벡터는 통상적인 기술, 예를 들어 안정한 세포주의 선발 또는 부위-특이적 재조합에 의해 숙주 세포의 염색체 내로 통합될 수 있다. 안정한 세포주에서, 발현 벡터의 적어도 발현 카세트 부분이 숙주 세포의 염색체 내로 통합된다.

벡터 작제물은 박테리아, 효모 세포, 식물 세포, 곤충 세포 및 포유류 및 인간 세포를 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 다양한 숙주 세포에서의 발현에 적합하도록 디자인될 수 있다. 상이한 숙주 세포에서의 발현을 위한 발현 벡터의 제조 방법은 당업자에게 명백함에 틀림없다.

또한, 키마아제 또는 SLPI의 동족체 및 단편은 상기에 설명된 재조합 방법을 이용하여 용이하게 발현시킬 수 있다. 예를 들어, 단백질 단편의 발현을 위해서는, 발현 벡터 내로 혼입되는 DNA 단편은 이것이 단백질 단편만을 코딩하도록 선택될 수 있다. 이와 마찬가지로, 특정 하이브리드 단백질은 이 하이브리드 단백질을 코딩하는 재조합 DNA를 사용하여 발현시킬 수 있다. 이와 유사하게, 상동 단백질은 상동 단백질을 코딩하는 DNA 서열로부터 발현될 수도 있다. 동족체를 코딩하는 DNA 서열은 재조합 DNA 기술을 사용하여 천연 단백질 코딩 서열을 조작함으로써 얻어질 수도 있다. 이러한 목적에 있어서, 무작위 또는 특정 부위(site-directed) 돌연변이 유발이 당업계에 일반적으로 공지된 기술을 이용하여 행해질 수 있다. 단백질 유도체의 제조를 위해서는, 예를 들어 천연 상호작용 단백질 구성원의 아미노산 서열이 특정 부위 DNA 돌연변이 유발에 의해 소정의 방식으로 변화되어 콘센서스(consensus) 서열이 생성되거나 제거될 수 있다.

다른 실시 형태에서, 본 발명에 연루된 키마아제 또는 SLPI가 생물학적 샘플, 예를 들어 타액, 객담, 비강 분비물, ELF, 및 세척액 등에 존재할 수 있다. 또한, 키마아제 또는 SLPI는 세포와 관련되거나 세포 용해물에 존재할 수 있다.

본 발명의 방법은 키마아제 활성의 하나 이상의 다른 분석에서 화합물을 시험하는 단계를 추가로 포함한다. 화합물은 안지오텐신 I을 혈관 활성 펩티드 안지오텐신 II로 변환시키는 능력, 큰 엔도텔린 1을 31개 아미노산 길이의 펩티드의 엔도텔린 1로 선택적으로 변환시키는 능력, 세포외 기질을 분해하는 능력, 줄기 세포 인자를 절단하여 생활성 용해성 생성물을 생성하는 능력, 프로콜라게나아제, 염증성 사이토카인 및 기타 생활성 펩티드를 프로세싱하는 능력 등을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아닌 키마아제의 다른 활성에 대하여 추가로 시험될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 화합물은 키마아제 및 발색 기질을 포함하는 효소 저해 분석에서 추가로 시험될 수 있다 (예를 들어, 문헌[Garavilla et al., The J. Bio. Chem. 2005, 280:18001-18007] 참고).

본 발명의 방법은 키마아제-관련 질환의 동물 모델에서 화합물을 시험하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 기도 염증의 충분히 용인된 모델로는 아스카리스 숨(Ascaris suum) 항원 유도성 천식 양 모델이 있다. 시험 화합물을 상기 양 모델에 투여한 후, 호중구 및 대식 세포의 유입의 감소는 시험 화합물이 천식 및 COPD 둘 모두와 관련된 기도 및 폐의 염증의 치료에 유용하다는 것을 당업자에게 시사하는 것이다. 기도 염증의 다른 모델로는 쥐에서의 리포다당류(lipolysaccharide, LPS) 유도성 기도 호중구 증가증이 있으며, 여기서, LPS의 폐 내로의 도입시, 백혈구 세포가 기관지 폐포 세척액 내로 유입된다. 시험 화합물을 상기 쥐 모델에 투여한 후, 역전된 LPS 유도성 기도 염증과, 기관지 폐포 세척액에서의 호중구 카운트 저하는 시험 화합물이 천식 및 COPD 둘 모두의 치료에 유용함을 당업자에게 시사하는 것이다. 천식 및 COPD의 또 다른 모델로는 쥐에서의 글리코겐 유도성 급성 복막염 모델이 있다. 시험 화합물을 상기 쥐 모델에 투여한 후, 글리코겐 처리된 쥐의 혈장 및 복수액에서의, 특히 IL-1, TNF-α, 및 MCP-1을 포함하는 전염증성 사이토카인의 수준 감소는 시험 화합물이 천식 및 COPD 둘 모두의 치료에 유용함을 보여주는 것이다.

실시예 1

특정 부위에서 인간 키마아제에 의해 절단된 재조합 인간 SLPI

소 (문헌[Grutter et al., Embo J 1988; 7:345-51]) 및 양 (문헌[Pemberton et al., Biochim Biophys Acta 1998; 1379:29-34])의 비만 세포 프로테아제에 의한 인간 SLPI 절단이 연구자들에 의해 보고되었지만, 인간 키마아제에 의한 SLPI 절단에 대한 연구는 보고되지 않았다. 이 실시예에서는 재조합 인간 SLPI(rSLPI)를 절단하는 인간 키마아제의 능력을 조사하였다.

재조합 인간 SLPI 및 염소 항-SLPI 다클론 항체를 알앤디 시스템스(R&D systems) (미국 미네소타주 미니애폴리스 소재)로부터 획득하였다. 토끼 항-SLPI 항체를 아브캄(Abcam) (미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)으로부터 획득하였다. 인간 키마아제 및 트립타아제를 코텍스 바이오켐(Cortex Biochem) (미국 캘리포니아주 샌리앤드로 소재)으로부터 획득하였다. 카텝신 G 및 엘라스타아제를 바이오디자인 인터내셔널(Biodesign International) (미국 메인주 사코 소재)로부터 구매하고, 프로테이나아제 3을 피츠제럴드 인더스트리즈 인터내셔널(Fitzgerald Industries International) (미국 매사추세츠주 콩코드 소재)로부터 구매하였다. 달리 지시되지 않는 한, 유사한 시약을 본 발명에 포함되는 다른 실시예에서 또한 사용하였다.

재조합 인간 SLPI를, 37℃에서 0.1 M 트리스(Tris)-HCl (pH 8.0), 0.5 M NaCl에서 인간 키마아제와 함께 (40:1의 몰비) 인큐베이션하였다. 샘플을 다양한 시점 후 수집하였다. 환원시킨 샘플을 4-12% SDS-PAGE (NuPAGE, 인비트로젠) (웰 당 2 ug의 rSLPI)에서 분리하고, 쿠마시 착색제(Coomassie stain)로 착색시켰다.

도 1은 rSLPI를 인간 키마아제와 함께 약 20분 동안 인큐베이션한 후 재조합 인간 SLPI의 절단을 관찰한 것을 보여준다. 키마아제에 대하여 심지어 10배 과량의 rSLPI에서 대부분의 rSLPI 단백질이 절단되었다 (데이터는 예시되지 않음). 전장 인간 SLPI를 2개의 단편으로 절단하였다. 질량 분광 분석에 의하면, 약 11.7 kD의 전장 인간 SLPI가 대략적으로 7.9 kD 및 3.8 kD의 크기의 2개의 단편으로 절단되었음이 나타났다. 정확한 절단 부위를 결정하기 위하여, N-말단 서열 결정을 전장에서 (도 1, 밴드 A) 그리고 절단된 밴드에서 (도 1, 밴드 B 및 C) 실시하였다. 서열 결정 분석에 의하면, 인간 키마아제에 의한 재조합 인간 SLPI의 절단은 Leu72-Met73에서였음이 나타났다. 이 결과에 의하면, 키마아제의 공지된 저해제인 SLPI (문헌[Fink et al., Biol Chem Hoppe Seyler 1986; 367:567-71])가 키마아제의 기질로서 또한 작용한다는 것이 밝혀졌다. 이는 인간 SLPI의 절단에 대한 소 및 양의 비만 세포 프로테아제의 활성과 일치하는 것이었다 (그루터(Grutter) 등의 상기 문헌; 및 펨버톤(Pemberton) 등의 상기 문헌).

엘라스타아제, 카텝신 G, 트립타아제 및 프로테이나아제 3을 비롯한 프로테아제의 패널을, LC/MS 분석을 이용하여 재조합 인간 SLPI를 절단하는 그의 능력에 대하여 시험하였다. 이들 프로테아제는 SLPI에 의해 저해되는 것으로 공지되었다. 재조합 인간 SLPI (1 ㎍)를 시험 프로테아제 (50 ng)와 함께 5시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 샘플을 50 mM NH₄HCO₃ 완충제에서 약 0.1 ㎍의 단백질/ ㎕로 희석시켰다. 액체 크로마토그래피를 아질런트(Agilent) 1100 LC/MSD를 사용하여 실시하였다. 희석시킨 샘플 (10 ㎕)을 0.2 ㎖/분의 유량으로 조박스(Zorbax) SB300 5u C8, C18 (150 x 2.1 ㎜) 컬럼 상에 주입하였다. 샘플 내의 단백질을 용매 A 중 15% 내지 60%의 용매 B의 30분간의 구배를 이용하여 용출시켰으며, 여기서, 용매 A는 (0.1% 포름산 + 0.02% TFA)/ H₂O이고; 용매 B는 (0.1% 포름산 + 0.02% TFA)/ACN이었다. 절단된 rSLPI는 10.7분의 체류 시간에서 검출된 반면, 완전한(intact) SLPI는 12.2분에서 검출되었다. 아질런트 1100 MSD SL 질량 분광계를, 전기분무 이온화 소스(source)에 의해 1100 HPLC 시스템에 인터페이스 연결시켰다. 켐스테이션(Chemstation) 소프트웨어 버전 10.02를 상기 시스템의 제어 및 데이터 획득에 사용하였다.

LC/MS에 의하면, 천연 rSLPI가 단리되었으며 11708 달톤의 예측되는 크기에서 검출되었다. 키마아제와 함께 인큐베이션한 후, HPLC에 의하면 제2 피크가 분리되었다. 이러한 제2 피크는 추가의 18 질량 단위를 가지며, 이는 닉(nicked) 또는 절단 rSLPI 분자에의 물의 부가와 일치하였다. 그와 같이, 제2 피크의 존재는, SDS-PAGE 분석에서 관찰되는 바와 같이, 키마아제가 실제로 rSLPI를 절단함을 나타내는 것이었다. 패널 상의 다른 프로테아제들과 함께 rSLPI를 인큐베이션하면 제2 피크가 형성되지 않았으며, 이는 시험한 다른 프로테아제들이 rSLPI를 절단하지 않음을 나타낸다. 프로테아제의 존재 하에서의 rSLPI 샘플의 환원은 SLPI 단백질의 절단으로 이어졌으며, 이는 다른 프로테아제들이 환원된 형태의 rSLPI를 절단할 수 있음을 나타낸다.

다른 프로테아제들이 SLPI를 절단하는 능력이 없는 것은 보겔마이어(Vogelmeier) 등의 연구와 일치하는데, 상기 연구에 의하면 엘라스타아제 및 카텝신 G에 의해서는 SLPI가 전혀 절단되지 않음이 밝혀졌다 (문헌[J Clin Invest 1991; 87:482-8]).

실시예 2

키마아제 저해제는 인간 키마아제에 의한 인간 rSLPI 의 절단을 감소시킨다

이 실시예에서는 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI의 절단에 대한 키마아제 저해제의 영향을 조사한다. 하기의 두 키마아제 저해제를 다양한 농도로 시험하였다: 미국 특허 제20030195172호에 개시된 키마아제 저해제 A, [2-(3-{메틸-[1-(나프탈렌-2-카르보닐)-피페리딘-4-일]-카르바모일}-나프탈렌-2-일)-1-나프탈렌-1-일-2-옥소-에틸]-포스폰산; 및 미국 특허 제20050176769호에 개시된 키마아제 저해제 B, {(5-클로로-벤조[b]티오펜-3-일)-[2-(3-클로로-5-플루오로-페닐)-비닐카르바모일]-메틸}-메틸-포스핀산.

재조합 인간 SLPI (80 pmole)를, 1 M 트리스 완충제 (pH 7.5) 또는 PBS 중 어느 하나에서 37℃에서 30분 동안 키마아제 저해제의 존재 또는 부재 하에 인간 키마아제 (80 pmole)와 함께 인큐베이션하였다. 웨스턴 분석을 실시하여 rSLPI의 양 및 SLPI의 보다 큰 절단 생성물 (질량 분광 분석에 의하면 약 7.9 kD)의 양을 정량화하였다. 샘플을, SDS 및 베타-머캅토에탄올을 포함하는 동일 부피의 완충제를 이용하여 변성 및 환원시켰다. 각각의 샘플을 4-20% 구배의 폴리아크릴아미드 젤 또는 15% 폴리아크릴아미드 젤에 적용하였다. 샘플을 전기영동하고, PVDF 막 (피어스 바이오테크놀로지(Pierce Biotechnology), 미국 일리노이주 록포드 소재)으로 옮겼다. 이 블롯을 5% 밀크/PBS-트윈(tween) (PBS/0.4% 트윈-20)에서 실온에서 1시간 동안 차단시켰다. 블롯을 차단 용액에 희석시킨 일차 항체 (1:1000의 염소 항-SLPI 또는 1:2000의 토끼 항-SLPI)에서 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하였다. PBS-트윈의 3회 세척 후, 블롯을, 차단 용액에서 1:2500으로 희석시킨 이차 항체 (염소 항-토끼 HRP 또는 토끼 항-염소 HRP)와 함께 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 블롯을 PBS-트윈으로 6회 세척하고, 웨스터 라이트닝(Wester Lightning) 화학발광 시약(퍼킨 엘머(Perkin Elmer), 미국 매사추세츠주 보스톤 소재)과 함께 실온에서 1분 동안 인큐베이션하고, 암실에서 바이오맥스 라이트 필름(Biomax Light Film) (이스트맨 코닥(Eastman Kodak), 미국 뉴욕주 로체스터 소재)에 현상하였다. 알파 이노테크(Alpha Innotech) (미국 캘리포니아주 샌리앤드로 소재)로부터의 농도계, 플루오르켐(FluorChem)™ 8000, 어드밴스트 플루오르선스, 케미루미네선스 앤드 비즈블 이미징 시스템(Advanced Fluorescence, Chemiluminescence and Visible Imaging System)을 사용하여 현상 필름 상에서의 rSLPI의 양 및 SLPI의 보다 큰 절단 생성물의 양과 상관관계가 있는 농도를 측정하였다.

SLPI 절단 백분율을 하기 식을 이용하여 계산하였다: 100 x (보다 큰 SLPI 절단 생성물의 농도/(rSLPI의 농도 + 보다 큰 SLPI 절단 생성물의 농도)).

도 2는 키마아제에 의한 SLPI 절단에 대한 키마아제 저해제의 영향을 도시한다. 저해의 양은 키마아제 저해제의 첨가량과 직접적으로 관련되었다. 이는, 키마아제 저해제 화합물의 효능을 결정하는데 있어서의 이 분석법의 유용성을 시사하는 것이었다.

실시예 3

인간 키마아제는 임상 샘플에서 인간 SLPI 를 절단한다

이 실시예는 용이하게 얻어질 수 있는 임상 샘플인 인간 타액으로부터 SLPI 절단을 측정하기 위한 생체 외(ex vivo) 분석을 예시한다.

10 ㎕의 인간 타액을, PBS를 이용하여 총 부피를 30 ㎕에 이르게 한 키마아제 (4 ㎍/0.1 U/5 μM) 및/또는 키마아제 저해제 (100 μM)와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 미절단 타액 샘플에 있어서, 10 ㎕의 타액을 20 ㎕의 PBS에서 희석시켰다. 실시예 2에 설명된 바와 같이, 웨스턴 분석을 실시하여 타액 샘플 중의 SLPI의 양 및 보다 큰 SLPI 절단 생성물의 양을 측정하고, SLPI 절단 백분율을 계산하였다.

도 3은 외인성 키마아제가 rSLPI에서 그러한 바와 같이 타액 샘플에서 SLPI를 절단하였음을 보여준다. 도 3은 또한 SLPI를 절단하는 키마아제의 능력에 대한 키마아제 저해제의 영향을 보여준다. 키마아제 저해제, {(5-클로로-벤조[b]티오펜-3-일)-[2-(3,4-다이플루오로-페닐)-비닐카르바모일]-메틸}-메틸-포스핀산이 미국 특허 제20050176769호에 개시되었다. 이 저해제는 키마아제 활성을 감소시키며, 타액 유래의 SLPI의 절단을 저해하였다 (도 3). 이들 결과에 의하면, 키마아제의 활성뿐만 아니라 키마아제 저해제의 효율도 타액 샘플로부터 모니터링할 수 있음이 나타났다.

실시예 1의 결과와 일치되게, 시험한 프로테아제들의 패널 중에서 타액 중 SLPI의 절단은 키마아제에 독특한 것이었다. 타액 샘플을 카텝신 G, 트립타아제 및 프로테이나아제 3과 함께 인큐베이션할 때 보다 큰 SLPI 절단 생성물은 관찰되지 않았다. 타액을 엘라스타아제와 함께 인큐베이션한 후 SLPI의 보다 적은 절단이 관찰되었다. 그러나, 생성된 절단 생성물인 이중의 밴드 (SDS-PAGE 분석 후 ~ 11 kD 및 10.5 kD)는 키마아제 절단에 의해 생성된 절단 생성물과 크기 면에서 상이하였다.

실시예 4

키마아제 -관련 질환에 대한 바이오마커로서의 SLPI 의 프로세싱

정상 대상과, 키마아제의 과다활성과 관련된 질병인 알러지가 있는 환자 유래의 인간 타액 샘플에서 SLPI 절단을 측정하였다.

타액 샘플을 하기의 인간 대상으로부터 획득하였다: 생쥐에의 노출에 의해 유발되는 알러지 상태를 호소하고 있는 한 대상 (알러지), 및 호흡기 질환이 전혀 없는 다른 한 대상 (정상). 샘플을 -80℃에서 동결시켜 보관하였다. 샘플을 얼음 상에서 해동시키고 와동시켰다. 타액 (10 ㎕)을 PBS 15(㎕)로 희석시켰다. 실시예 2에 설명한 바와 같이, 웨스턴 분석을 실시하여 타액 샘플 중 SLPI의 양 및 보다 큰 SLPI 절단 생성물의 양을 측정하고, SLPI 절단 백분율을 계산하였다.

도 4는 정상 대상 및 알러지가 있는 환자 유래의 타액 샘플들 사이의 SLPI의 차별적인 절단 양을 보여준다. 알러지 타액 샘플에서 보다 큰 SLPI 절단 백분율이 관찰되었으며, 이는 SLPI 프로세싱이 키마아제-관련 질환에 대한 바이오마커로서 사용될 수 있음을 나타낸다.

실시예 5

하기 방법을 이용하여, 기준선에서와 알러지성 비염이 있는 대상에서 관련 알러젠(allergen)에 반응하는, 코 내의 상부 기도 염증의 용해성 성분들 (매개체, 사이토카인)을 조사하였다.

그 결과가 도 5에 도시되어 있다. 도 5는 cSLPI의 증가가 알러지 증상 증가와 상관관계가 있음을 예시한다. 총 SLPI에 대한 cSLPI의 비를 항원 챌린지하기 0.75시간 전 및 0.5시간 전, 그리고 항원 챌린지한지 0.5시간 후 및 7시간 후 개체로부터 얻은 비강 세척액에서 웨스턴 분석에 의해 결정하였다 (도 5b). 환자를 동일 시점에서 증상 강도(레벨 스코어)에 대하여 스코어링하였다 (도 5a).

실시예 6

유럽 호흡기 학회(European Respiratory Society, ERS) 권고 사항과, 고장성 또는 등장성 식염액의 흡입으로 이루어진 프로토콜을 이용하여 객담을 대상들로부터 수집하였다. 고장성 식염수를 이용하여 경증 내지는 중간 정도의 천식 환자에서 객담을 유발하였는데, 상기 식염수는 에어로졸화하여 3-4 5분의 기간 동안 흡입하였다. 보다 중증의 천식 환자에서, 변경된 ERS 프로토콜을 이용하였으며, 이는 보통의 식염수를 이용한 흡입에서 시작하여, FEV₁의 유의한 강하가 전혀 없을 경우에만 보다 서서히 고장성 식염수로 이동하면서 진행하였다.

그 결과가 도 6에 도시되어 있다. 도 6은 천식 객담 샘플이 정상적인 객담 샘플보다 큰 퍼센트의 cSLPI/총 SLPI를 포함하며, 이들 개체로부터의 키마아제 수준과 상관관계가 있음을 도시하고 있다. 객담 샘플은 정상 및 천식 대상 둘 모두로부터 얻었다. SLPI에 대한 cSLPI의 비 및 키마아제 수준 둘 모두는 웨스턴 분석으로 결정하였다. 값들을 농도 측정 분석법으로 결정하였다.

SEQUENCE LISTING <110> Johnson and Johnson Pharmaceutical Research & Development, L.L.C. <120> Processing of SLPI by Chymase <130> PRD- <160> 4 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 247 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Leu Leu Pro Leu Pro Leu Leu Leu Phe Leu Leu Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ala Glu Ala Gly Glu Ile Ile Gly Gly Thr Glu Cys Lys Pro His Ser 20 25 30 Arg Pro Tyr Met Ala Tyr Leu Glu Ile Val Thr Ser Asn Gly Pro Ser 35 40 45 Lys Phe Cys Gly Gly Phe Leu Ile Arg Arg Asn Phe Val Leu Thr Ala 50 55 60 Ala His Cys Ala Gly Arg Ser Ile Thr Val Thr Leu Gly Ala His Asn 65 70 75 80 Ile Thr Glu Glu Glu Asp Thr Trp Gln Lys Leu Glu Val Ile Lys Gln 85 90 95 Phe Arg His Pro Lys Tyr Asn Thr Ser Thr Leu His His Asp Ile Met 100 105 110 Leu Leu Lys Leu Lys Glu Lys Ala Ser Leu Thr Leu Ala Val Gly Thr 115 120 125 Leu Pro Phe Pro Ser Gln Phe Asn Phe Val Pro Pro Gly Arg Met Cys 130 135 140 Arg Val Ala Gly Trp Gly Arg Thr Gly Val Leu Lys Pro Gly Ser Asp 145 150 155 160 Thr Leu Gln Glu Val Lys Leu Arg Leu Met Asp Pro Gln Ala Cys Ser 165 170 175 His Phe Arg Asp Phe Asp His Asn Leu Gln Leu Cys Val Gly Asn Pro 180 185 190 Arg Lys Thr Lys Ser Ala Phe Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Leu 195 200 205 Cys Ala Gly Val Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Gly Arg Ser Asp Ala 210 215 220 Lys Pro Pro Ala Val Phe Thr Arg Ile Ser His Tyr Arg Pro Trp Ile 225 230 235 240 Asn Gln Ile Leu Gln Ala Asn 245 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala 1 5 10 15 Gln Cys Leu Arg Tyr Lys Lys Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys 20 25 30 Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu 35 40 45 Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys 50 55 60 Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys 65 70 75 80 Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met 85 90 95 Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro Val Lys Ala 100 105 <210> 3 <211> 72 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ser Gly Lys Ser Phe Lys Ala Gly Val Cys Pro Pro Lys Lys Ser Ala 1 5 10 15 Gln Cys Leu Arg Tyr Lys Lys Pro Glu Cys Gln Ser Asp Trp Gln Cys 20 25 30 Pro Gly Lys Lys Arg Cys Cys Pro Asp Thr Cys Gly Ile Lys Cys Leu 35 40 45 Asp Pro Val Asp Thr Pro Asn Pro Thr Arg Arg Lys Pro Gly Lys Cys 50 55 60 Pro Val Thr Tyr Gly Gln Cys Leu 65 70 <210> 4 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Leu Asn Pro Pro Asn Phe Cys Glu Met Asp Gly Gln Cys Lys Arg 1 5 10 15 Asp Leu Lys Cys Cys Met Gly Met Cys Gly Lys Ser Cys Val Ser Pro 20 25 30 Val Lys Ala 35

Claims

a. 생물학적 샘플을 인간 대상으로부터 얻는 단계;

b. 생물학적 샘플에서 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을 측정하는 단계; 및

c. 단계 b)로부터의 측정 수준을, 건강한 인간 대상에서의 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준 대조군과 비교하는 단계(여기서, 상기 대조군에 비하여 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준이 상승한다는 것은 인간 대상이 키마아제-관련 질환에 걸렸거나 키마아제-관련 질환의 위험성이 증가함을 나타냄)를 포함하는, 인간 대상에서 키마아제-관련 질환의 검출 방법.
제1항에 있어서, 생물학적 샘플은 타액임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 키마아제-관련 질환은 천식, 알러지성 비염, 섬유증, 고혈압, 심장 비대증, 심부전, 류마티스 관절염, 당뇨병성 신증, 낭포성 섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD) 및 염증성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을, 생물학적 샘플에 존재하는 전장 SLPI에 대한 키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편의 비로서 측정함을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편은 본질적으로 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편은 본질적으로 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
제4항에 있어서, 전장 인간 SLPI는 본질적으로 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
a. 생물학적 샘플을 인간 환자로부터 얻는 단계;

b. 생물학적 샘플에서 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을 측정하는 단계; 및

c. 단계 b)로부터의 측정 수준을, 치료 이전의 인간 환자에서의 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준 대조군과 비교하는 단계(여기서, 상기 대조군에 비하여 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준이 감소한다는 것은 상기 환자에서 키마아제-관련 질환의 치료가 효과적임을 나타냄)를 포함하는, 인간 환자에서 키마아제-관련 질환의 치료 유효성의 평가 방법.
제8항에 있어서, 생물학적 샘플은 타액임을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 키마아제-관련 질환은 천식, 알러지성 비염, 섬유증, 고혈압, 심장 비대증, 심부전, 류마티스 관절염, 당뇨병성 신증, 낭포성 섬유증, COPD 및 염증성 질환으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을, 생물학적 샘플에 존재하는 전장 SLPI에 대한 키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편의 비로서 측정함을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편은 본질적으로 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편은 본질적으로 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
제11항에 있어서, 전장 인간 SLPI는 본질적으로 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 인간 환자에서 키마아제-관련 질환의 치료는 키마아제의 생 물학적 활성을 감소시키는 화합물을 포함함을 특징으로 하는 방법.
a. 인간 키마아제를 분석 혼합물 중 인간 SLPI와 접촉시키는 단계;

b. 인간 키마아제가 인간 SLPI를 절단하는 조건 하에 분석 혼합물을 인큐베이션하는 단계; 및

c. 분석 혼합물에서 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 인간 키마아제의 생물학적 활성의 측정 방법.
제16항에 있어서, 인간 키마아제는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 인간 SLPI는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을, 생물학적 샘플에 존재하는 전장 SLPI에 대한 키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편의 비로서 측정함을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편은 본질적으로 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편은 본질적으로 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 인간 SLPI는 단리된 것임을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 인간 SLPI는 생물학적 샘플 내에 있음을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 인간 키마아제는 단리된 것임을 특징으로 하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 인간 키마아제는 생물학적 샘플 내에 있음을 특징으로 하는 방법.
a. 시험 화합물을 분석 혼합물 중 인간 키마아제 및 인간 SLPI와 접촉시키는 단계;

b. 인간 키마아제가 인간 SLPI를 절단하는 조건 하에 분석 혼합물을 인큐베이션하는 단계;

c. 분석 혼합물에서 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을 측정하는 단계; 및

d. 단계 c)로부터의 검출 수준을, 시험 화합물이 분석 혼합물에서 빠진 대조군으로부터 검출된 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 인간 키마아제의 생물학적 활성을 감소시키는 화합물의 확인 방법.
제26항에 있어서, 인간 키마아제는 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제26항에 있어서, 인간 SLPI는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제26항에 있어서, 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을, 생물학적 샘플에 존재하는 전장 SLPI에 대한 키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편의 비로서 측정함을 특징으로 하는 방법.
제29항에 있어서, 키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편은 본질적으로 서열 번호 3의 아미노산 서열로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
제29항에 있어서, 키마아제 절단에 의해 생성된 인간 SLPI 단편은 본질적으로 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어짐을 특징으로 하는 방법.
제26항에 있어서, 인간 SLPI는 단리된 것임을 특징으로 하는 방법.
제26항에 있어서, 인간 SLPI는 생물학적 샘플 내에 있음을 특징으로 하는 방법.
제26항에 있어서, 인간 키마아제는 단리된 것임을 특징으로 하는 방법.
제26항에 있어서, 인간 키마아제는 생물학적 샘플 내에 있음을 특징으로 하는 방법.
a. 본질적으로 서열 번호 3 또는 서열 번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 SLPI 단편에 특이적으로 결합하는 항체; 및

b. 상기 SLPI 단편의 측정된 수준을 인간 키마아제의 생물학적 활성과 상관시키는 것에 대한 설명서를 포함하는 키트.
a. 생물학적 샘플을 환자로부터 얻는 단계;

b. 생물학적 샘플에서 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준을 측정하는 단계; 및

c. 단계 b)로부터의 측정 수준을, 건강한 인간 대상에서의 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준 대조군과 비교하는 단계(여기서, 상기 대조군에 비하여 인간 키마아제에 의한 인간 SLPI 절단 수준이 상승한다는 것은 환자가 키마아제 저해제를 포함하는 치료에 대하여 반응할 가능성이 보다 우수함을 나타냄)를 포함하는, 키마아제 저해제를 포함하는 치료에 대하여 반응할 가능성이 보다 우수한 환자의 분류 방법.