CN105628636B - 一种糜蛋白酶活力检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种糜蛋白酶活力检测方法，涉及酶活检测技术领域，本发明通过在检测过程中使用含有Ca2+的反应体系和预热处理反应体系的方法，使反应体系吸光值随时间的变化呈现更加良好的线性关系，能够在反应时间内稳定糜蛋白酶的活力，检测结果重复性好，提高了糜蛋白酶的活力，降低了检测下限，灵敏度高，稳定性好，成本低，且本发明所用试剂安全无毒，可广泛应用于实验室及临床检验。
Description
技术领域
本发明涉及酶活检测技术领域，具体涉及一种糜蛋白酶活力检测方法。
背景技术
糜蛋白酶是来源于牛胰经提取的蛋白水解酶。由于糜蛋白酶具有能分解蛋白、抗凝结和消炎的特性，它可用于医疗领域。糜蛋白酶能切断蛋白质肽链中酪氨酸和苯丙氨酸的羧端肽链，因而能清创消脓，消化浓汁和坏死组织，助长新生肉芽的生长。
酶活力是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可用在一定条件下，酶催化某一化学反应的速度来表示，酶催化反应速度愈快，酶活力愈高，反之活力愈低。测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
糜蛋白酶分解蛋白质、酰胺和酯中的肽键，这些肽键与芳香族氨基酸，如苯基丙氨酸、酪氨酸或色氨酸所提供的羧基团结合。糜蛋白酶已收录于中国药典，2010年版中国药典中检测糜蛋白酶活力的方法是通过在25℃恒温下水解底物N-乙酰-L-酪氨酸乙酯，生成在237nm紫外光下具有更低吸光值的N-乙酰-L-酪氨酸，依据吸光值的变换率计算酶活力，该方法要求在5分钟内吸光值变化率的恒定时间不得少于3分钟，在测定过程中反应体系需要精确维持25℃恒温，而市场上大多数国产紫外分光光度计没有恒温适配器，进口分光光度计具有这种装置但价格昂贵，因此很难保证恒温，对于一个酶催化反应而言，恒定的反应温度是项十分重要的参数，另外，酶自身的稳定性也是对催化反应起着至关重要的左右，而蛋白酶在水溶液中很易自我水解，因此用该法测定糜蛋白酶活力时，往往吸光值随时间变化的线性关系较差，很难维持3分钟的恒定变化率，从而使测量不精确，重复性差。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术中糜蛋白酶活力检测存在的问题，本发明提供一种灵敏度高、稳定性好的检测糜蛋白酶活力的方法，该方法能够在反应时间内稳定糜蛋白酶的活性并提高其活力，使反应过程中吸光值变化呈现更加良好的线性关系，结果稳定，重复性好，检测下限低，成本降低，且所用试剂安全无毒，可广泛应用于实验室及临床检验。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
一种糜蛋白酶活力检测方法，包括如下步骤：
S1、将底物N-乙酰-L-酪氨酸乙酯溶解于含有Ca2+的碱性缓冲液中，得到底物溶液备用；
S2、供试品制备：称取0.1g糜蛋白酶原料，加0.0012mol/L盐酸溶解定容至100mL，再取出5mL用0.0012mol/L盐酸稀释至100mL，作为供试品液备用4℃保存；
S3、将步骤S2制备的供试品液和步骤S1制备的底物溶液分别置于25℃水浴锅中预热5分钟，再迅速将供试品液和底物溶液混合于比色皿中，置于紫外分光光度计内，在237nm波长下检测吸光值的变化。
优选的，步骤S1所述含有Ca2+的碱性缓冲液中Ca2+浓度为1-20mmol/L。
优选的，步骤S1所述含有Ca2+的碱性缓冲液中Ca2+浓度为10mmol/L。
优选的，步骤S1所述含有Ca2+的碱性缓冲液是Tris-HCl缓冲液，pH值为8.0，浓度为50mmol/L。
(三)有益效果
本发明提供了一种糜蛋白酶活力检测方法，本发明相对于现有技术的有益效果如下：
1、本发明通过水浴预热处理使反应体系中各反应成分处于25℃恒温环境中，有利于在普通紫外分光光度计内反应使用，降低成本；
2、Tris-HCl缓冲液不与Ca2+形成沉淀，保证反应体系溶液均一稳定，利于紫外光检测，在含有Tris-HCl的碱性体系中加入Ca2+起到稳定糜蛋白酶的作用，吸光值变化恒定，同时能提高酶活力，降低检测下限，减少样品成本；
3、本发明糜蛋白酶活力检测方法，检测过程中反应体系吸光值随时间变化的线性关系在中国药典方法基础上大大改善，检测结果重复性好，检测灵敏度高，稳定性好；
4、本发明糜蛋白酶活力检测方法，使用的试剂无毒害，易于操作。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明检测糜蛋白酶活力吸光度时间变化的线性关系图：横坐标为反应时间，单位为s；纵坐标为吸光度值，单位为A。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明糜蛋白酶活力检测方法，包括如下步骤：
S1、将底物N-乙酰-L-酪氨酸乙酯溶解于含有Ca2+的碱性缓冲液中，得到底物溶液备用；
S2、供试品制备：称取0.1g糜蛋白酶原料，加0.0012mol/L盐酸溶解定容至100mL，再取出5mL用0.0012mol/L盐酸稀释至100mL，作为供试品液备用4℃保存；
S3、将步骤S2制备的供试品液和步骤S1制备的底物溶液分别置于25℃水浴锅中预热5分钟，再迅速将供试品液和底物溶液混合于比色皿中，置于紫外分光光度计内，在237nm波长下检测吸光值的变化。
且步骤S1中含有Ca2+的碱性缓冲液是Tris-HCl缓冲液，pH值为8.0，浓度为50mmol/L，其中Ca2+浓度为1-20mmol/L。
本发明使用的Tris-HCl缓冲液不与Ca2+形成沉淀，溶液均一，利于吸光值测定。Tris在pH 8左右有较大缓冲能力，由于反应过程中不断有乙酸生成，能够维持较稳定的pH环境。通过优化发现10mmol/L可以很好的稳定和激活糜蛋白酶，在上述反应过程中，用水浴预热反应体系至25℃，使在紫外分光光度计内比色皿中的反应温度能够在一定时期内维持25℃，而加入的Ca2+可以稳定糜蛋白酶的活性，并使酶活力得到提高。
具体检测过程如下：
1、所用试剂及溶液配制：
糜蛋白酶1200U/mg(北京智慧果公司)，酶活力单位定义：在pH 7.0反应体系中，25℃反应10分钟条件下吸光度每分钟改变0.0075，既相当于1个糜蛋白酶单位；
0.0012mol/L盐酸配制：用5mL移液枪取3mL市售0.1mol/L稀盐酸至250mL容量瓶中，加水定容至250mL；
供试品制备：称取0.1g糜蛋白酶原料，加0.0012mol/L盐酸溶解定容至100mL，再取出5mL用0.0012mol/L盐酸稀释至100mL，作为供试品液备用4℃保存；
Tris缓冲液配制(0.05mol/L，pH 8.0)：称取1.5141g Tris溶解于200mL水中，加入CaCl2，将其配制成在最终3.2mL反应体系中Ca2+浓度为：0mmol/L、1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L，加1mol/L稀盐酸调pH至8.0，加水定容至250mL；
磷酸缓冲液配制(0.067mol/L，pH 7.0)：取0.067mol/L磷酸二氢钾溶液38.9mL与0.067mol/L磷酸二氢钠溶液61.1mL混合；
底物溶液配制：分别称取25.4g N-乙酰-L-酪氨酸乙酯一水合物混于50mL磷酸缓冲液和含不同Ca2+浓度的Tris缓冲液中，温热使其溶解，冷却后再定容至100mL(新鲜配制)。
且所用试剂为分析纯，水为蒸馏水。
2、糜蛋白酶活力测定：
将底物溶液、供试品溶液放入25℃水浴锅中预热，取两个1cm光径石英比色皿，向其中一组加入0.0012mol/L盐酸200μL、底物溶液2.45mL、相应缓冲液550μL作为对照，向另一组比色皿中加入0.0012mol/L盐酸200μL、底物溶液3mL。预热5分钟后用前者在237nm下调零，将后者吸光值调至0.2(必要时可通过加入缓冲液的量调整)。
取预热供试品溶液200μL与底物溶液3mL于比色皿中，混匀后放入紫外分光光度计内立刻计时，每隔30s读取吸光度，共5分钟，吸光度的变化率应恒定，恒定时间不得少于3分钟，若变化率不能保持恒定，则用其它酶浓度另行测定。每30s的吸光度变化率应控制在0.008～0.012间，以吸光度为纵坐标，时间为横坐标作图，如图1所示，取在3分钟内成直线部分的吸光度，按中国药典法公式计算。
表1不同浓度Ca2+对糜蛋白酶酶活力测定的影响
由表1得知，与无Ca2+反应体系相比，当反应体系中Ca2+浓度在0-20mmol/L范围内时糜蛋白酶活力都有所提高提高，其中当Ca2+浓度为10mmol/L，糜蛋白酶活力达到最高，在中国药典法基础上提高了33％，而后随着Ca2+浓度提高，酶活力有所下降。当Ca2+浓度为10mmol/L时，由图1所示吸光度-时间变化关系推算线性回归方程为：y＝-0.0003x+0.2307，相关系数R2＝0.99977，在5分钟反应过程中的前3分钟内，变化率几乎恒定不变。
综上所述，本发明糜蛋白酶活力检测方法是在中国药典法基础上加以改进，能够稳定检测和提高糜蛋白酶活力的方法，通过加入Ca2+的碱性缓冲液溶解底物N-乙酰-L-酪氨酸乙酯，在25℃水浴锅中预热酶液和底物溶液，快速加入到比色皿中，混匀后放入分光光度计内，在237nm下读取吸光值变化并绘制线性关系图计算出酶活力值。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (4)
1.一种糜蛋白酶活力检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将底物N-乙酰-L-酪氨酸乙酯溶解于含有Ca2+的碱性缓冲液中，得到底物溶液备用；
S2、供试品制备，称取0.1g糜蛋白酶原料，加0.0012mol/L盐酸溶解定容至100mL，再取出5mL用0.0012mol/L盐酸稀释至100mL，作为供试品液备用，4℃保存；
S3、将步骤S2制备的供试品液和步骤S1制备的底物溶液分别置于25℃水浴锅中预热5分钟，再迅速将供试品液和底物溶液混合于比色皿中，置于紫外分光光度计内，在237nm波长下检测吸光值的变化。
2.根据权利要求1所述的糜蛋白酶活力检测方法，其特征在于，步骤S1所述含有Ca2+的碱性缓冲液中Ca2+浓度为1-20mmol/L。
3.根据权利要求1所述的糜蛋白酶活力检测方法，其特征在于，步骤S1所述含有Ca2+的碱性缓冲液中Ca2+浓度为10mmol/L。
4.根据权利要求1所述的糜蛋白酶活力检测方法，其特征在于，步骤S1所述碱性缓冲液是Tris-HCl缓冲液，pH值为8.0，浓度为50mmol/L。
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