CN101942498A - 快速检测糖尿病试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测糖尿病试剂盒，包括酶试剂、酚试剂和已知浓度的葡萄糖标准溶液，酶试剂为含有4-氨基安替比林，过氧化物酶，葡萄糖氧化酶的磷酸盐缓冲溶液，酚试剂为含有4-氯间苯二酚和3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠的水溶液。本试剂盒解决了国产葡萄糖氧化酶试剂反应速度慢的问题，使其由原来37℃、近30min完成测定缩短为室温、3～4min完成测定；检测灵敏度提高2倍。
Description
技术领域
本发明涉及一种试剂盒，尤其涉及一种快速检测糖尿病试剂盒。
背景技术
糖尿病是一种严重危害人类健康的重大疾病，快速准确地检测糖尿病对治疗糖尿病具有重要意义。现在检测糖尿病的常用方法为葡萄糖氧化酶法，该法利用酶偶联反应，分两步完成，第一步反应是葡萄糖氧化酶催化被测物质β-D葡萄糖与氧反应生成葡萄糖酸和过氧化氢，第二步反应是过氧化氢(H2O2)在过氧化物酶(如辣根过氧化物酶)、4-氨基安替比林(4-AAP)、苯酚的存在下，生成红色醌亚胺化合物，然后利用分析仪器测定显色溶液的吸光度进而求算葡萄糖含量。该方法特异性好、灵敏度高、准确性高，是国际公认的方法。目前，我国大中城市医院普遍采用国外进口的自动生化分析仪和进口试剂，国产葡萄糖氧化酶试剂难以满足快速分析的要求，只能用于小城市和县级医院的手工操作。进口试剂一般包括酶试剂、酚试剂和葡萄糖标准溶液，酶试剂为含有4-氨基安替比林，过氧化物酶，葡萄糖氧化酶的磷酸盐缓冲溶液，酚试剂一般为苯酚类溶液，葡萄糖标准溶液即为葡萄糖浓度已知的溶液。为了加快反应速率以适应快速分析的要求，还要在酶试剂中加入变旋酶，这样导致成本提高，而且变旋酶容易失活，稳定性不够好。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种不含变旋酶的快速检测糖尿病试剂盒，从而满足既能准确快速的检测糖尿病，又使生产成本降低的要求。
通过研究发现，将酶先用微波处理再配成酶试剂，并选择合适的酚配成酚试剂，可以使整个酶偶联反应的速率大为提高，而且测定准确度也可以得到保证。本发明采取如下技术方案来解决前述技术问题：
一种快速检测糖尿病试剂盒，包括酶试剂、酚试剂和已知浓度的葡萄糖标准溶液，酶试剂为含有4-氨基安替比林，过氧化物酶，葡萄糖氧化酶的磷酸盐缓冲溶液，其特征在于所述酚试剂为含有4-氯间苯二酚和3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠的水溶液。
在本试剂盒中，酶试剂中还可以含有叠氮钠，各组分的浓度范围为：
酶试剂：4-氨基安替比林，浓度范围为0.1g/L～10g/L；过氧化物酶，浓度范围为1625U/L～162500U/L；葡萄糖氧化酶，浓度范围为11760U/L～1176000U/L；磷酸盐缓冲溶液pH范围6～8；叠氮钠的浓度范围为0.1g/L～10g/L；
酚试剂：4-氯间苯二酚，浓度范围为0.58g/L～58g/L；3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠，浓度范围为0.2g/L～20g/L。
以下为优选的方案：
酶试剂：4-氨基安替比林1.0g/L；过氧化物酶16250U/L；葡萄糖氧化酶117600U/L；磷酸盐缓冲液的pH＝7.0±0.05；1.0g/L叠氮钠；
酚试剂：含有4-氯间苯二酚5.8g/L；3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠2.0g/L；
葡萄糖标准溶液的浓度为1.0000g/L。
本试剂盒采用非酶类物质替代变旋酶、并利用微波辐射协同作用显著增加了酶促反应速度，解决了国产葡萄糖氧化酶试剂反应速度慢的问题，使其由原来37℃、近30min完成测定缩短为室温、3～4min完成测定；检测灵敏度提高2倍。采用非酶类物质替代变旋酶，避免了酶容易失活、稳定性不够好、成本高等问题，既有效加快了反应速率，又充分保持了酶法测糖特异性较高、条件温和等优点。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步描述：
实施例一：
1.试剂盒制作流程：
葡萄糖氧化酶→微波辐射(350W)处10s→加过氧化物酶和4-氨基安替比林、叠氮钠、磷酸盐缓冲液→包装
3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠和4-氯间苯二酚→加水溶解→包装
葡萄糖→烘干→准确称重→加水溶解→葡萄糖标准液→用参考方法测定→包装
2.试剂盒的组成：
2.1.酶试剂(10ml×1)
葡萄糖氧化酶 117600U/L
过氧化物酶 16250U/L
4-氨基安替比林 1.0g/L
磷酸缓冲液 pH＝7.0±0.05
叠氮钠 1.0g/L
2.2酚试剂(10ml×1)
4-氯间苯二酚 5.8g/L
3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠 2.0g/L
2.3葡萄糖标准液(1ml×1)
D-无水葡萄糖 1.0000g/L
苯甲酸钠 2.50g/L
3.试剂盒的配制：
对于新购的原料测定后进行试配，小批量合格后再大批量配制。
3.1酶试剂的配制：
3.1.1环境温度：4～15℃
3.1.2操作方法
磷酸盐缓冲液：50克磷酸氢二钠和10克磷酸二氢钾溶于1升水，用磷酸或氢氧化钠调节至所用pH＝7.0±0.05；
1.0g 4-氨基安替比林，1.0g叠氮钠，加500mLpH＝7.0±0.05的磷酸盐缓冲液使其溶解，加经微波处理的葡萄糖氧化酶，使浓度117600U/L，加过氧化物酶使浓度16250U/L，加pH＝7.0±-0.05的磷酸盐缓冲液至总体积1L。4℃贮存。
3.1.3配制后检验合格，然后进行包装(10ml西林瓶×1)。
3.2酚试剂的配制：
3.2.1环境温度：室温
3.2.2操作方法
4-氯间苯二酚5.8g/L，3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠2.0g，加蒸馏水至总体积1L。
3.2.3配制后检验合格，然后进行包装(10ml塑料瓶×1)。
3.3葡萄糖标准液的配制：
准确称取于105～110℃烘干恒重的D-无水葡萄糖1.0000g，溶于0.25％的苯甲酸钠水溶液中，定容至1L；配制时使用双蒸水，按规定的浓度进行配制，配制后要用参考方法进行对比测定，如不能达到1.0000g/L要进行调整、分装(10ml安瓶×1)。
葡萄糖标准液也可以从市面购买。
实施例二：
试剂盒使用方法：
1、仪器要求：各类分光光度计，自动、半自动生化分析仪均可。
2、标本要求：
标本在30分钟内分离血清，否则由于糖酵解使结果降低；标本以草酸钾-氟化钠为抗凝剂，其作用是抑制糖原酵解；标本在2-8℃可稳定24h，-20℃冷冻可稳定一个月。
3、稳定性与保存：
酶工作液2-8℃贮存，稳定一个月，酶试剂2-8℃贮存可稳定一年。试剂混浊或有絮状物视为失效。
4、工作液配制：根据标本量，临用时将酶试剂和酚试剂加蒸馏水各稀释10倍，再按体积比1∶1混匀。
5、操作程序：
波长：500nm 比色杯光径：1.0cm或0.5cm
测定方法：终点法，反应温度：25℃
6、操作表：
混匀，25℃、4分钟，以空白管校零，在500nm波长下比色读取各管吸光度值。
7.结果计算：
(单位换算：mg/dl×0.0555＝mmol/L)
8.正常参考值：
空腹血糖3.89-6.11mmol/L(70-110mg/dL)。
建议各实验室建立自己的正常参考值范围。
9.质量控制：
为确保测试结果准确，每批测试均应分析正常和异常浓度的质控血清。质控值应落在允许范围内(均值±2DS)。
试剂与样品的用量可按其比例放大缩小，计算公式不变。
维生素C，谷胱甘肽，左旋多巴10mg/dl可能引起负偏差。
本法特异性高，溶血标本血红蛋白1.0g/L，NaF＜2g/L，尿素＜46.7mmol/L，胆红素＜340mmol/L，尿酸＜2.95mmol/L，肌酐＜4.42mmol/L，半胱氨酸＜13mmol/L，甘油三脂＜5.65mmol/L，对测定均无影响。
性能特征：
线性范围：可达22mmol/L
准确度：回收率98.5-99.8％
精密度：n＝20批内CV＜1.2％批间CV＜1.8％
实施例三：
采用实施例一中的试剂盒，采用实施例二中的方法，将酶试剂稀释10倍，将酚试剂分别稀释20倍、10倍、7倍、5倍、4倍、3倍后，再按体积比1∶1与经稀释的酶试剂混合分别得A、B、C、D、E、F酶工作液，葡萄糖标准液80μl，各酶工作液3.00ml，其他同实施例二，吸光度随时间变化的结果如下表：
由表中可以看出，用B液(即酚试剂被稀释10倍与酶试剂被稀释10倍混合后所得)测定在3.5分钟时吸光度基本达到最大值并稳定至6.5分钟，说明反应速度快且能稳定足够长时间，满足测定需要。
实施例四：
采用实施例一中的试剂盒和前述方法，准确吸取尿样测定尿糖含量、做回收率：
实施例五：
采用实施例一中的试剂盒与其他同类产品比较
在某医院随机选取患者样品16份，按不同厂家的使用说明书对患者样品进行测定，同时做回收率实验，结果如下表：
血清对比实验结果：
实施例六：
将实施例一中各组分浓度变为十分之一，配制方法和操作程序均相同，酚试剂和酶试剂包装均为100ml每瓶，使用时直接混合，操作方法同前。
或者将实施例一中各组分浓度变为十倍，配制方法和操作程序均相同，酚试剂和酶试剂包装均为1ml每瓶，使用时均稀释至100ml，然后混合，操作方法同前。
前述实施例所用酶试剂中的葡萄糖氧化酶已经过微波处理，如直接使用不经微波处理的葡萄糖氧化酶，实验表明显色时间要推迟2～3分钟，其他指标与前述实施例相同。
Claims (4)
1.一种快速检测糖尿病试剂盒，包括酶试剂、酚试剂和已知浓度的葡萄糖标准溶液，酶试剂为含有4-氨基安替比林，过氧化物酶，葡萄糖氧化酶的磷酸盐缓冲溶液，其特征在于所述酚试剂为含有4-氯间苯二酚和3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠的水溶液。
2.如权利要求1所述的一种快速检测糖尿病试剂盒，其特征在于在酶试液中还含有叠氮钠。
3.如权利要求2所述的一种快速检测糖尿病试剂盒，其特征在于：
酶试剂：4-氨基安替比林，浓度范围为0.1g/L～10g/L；过氧化物酶，浓度范围为1625U/L～162500U/L；葡萄糖氧化酶，浓度范围为11760U/L～1176000U/L；磷酸盐缓冲溶液，pH范围6～8；叠氮钠的浓度范围为0.1g/L～10g/L：
酚试剂：4-氯间苯二酚，浓度范围为0.58g/L～58g/L；3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠，浓度范围为0.2g/L～20g/L。
4.如权利要求3所述的一种快速检测糖尿病试剂盒，其特征在于：
酶试剂：4-氨基安替比林1.0g/L；过氧化物酶16250U/L；葡萄糖氧化酶117600U/L；磷酸盐缓冲液的pH＝7.0±0.05；1.0g/L叠氮钠；
酚试剂：含有4-氯间苯二酚5.8g/L；3，5-二氯-2-羟基苯磺酸钠2.0g/L；
葡萄糖标准溶液的浓度为1.0000g/L。
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