CN112074609B - 生物成分测定试剂盒的灵敏度降低抑制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供生物成分的测定灵敏度降低抑制剂,其特征在于,其为适用于生物成分测定法的测定灵敏度降低抑制剂且含有含铁物质,所述生物成分测定法使用氨基安替比林系化合物作为氧化还原显色试剂的耦合剂。优选特征在于,生物成分测定法为使用满足以下的(a)~(d)的条件的试剂或试剂套装的生物成分测定法,将前述含铁物质添加至满足(d)的条件的试剂中来使用:(a)包含能产生过氧化氢的氧化酶,(b)包含过氧化物酶,(c)包含在过氧化物酶的存在下与过氧化氢发生反应而显色的氧化还原显色试剂,(d)包含氨基安替比林系化合物作为该氧化还原显色试剂的耦合剂。
Description
技术领域
本发明涉及临床诊断中使用的生物成分测定试剂盒的灵敏度降低抑制方法。更详细而言,涉及抑制生物成分测定试剂盒中的灵敏度降低的方法等,所述生物成分测定试剂盒通过如下方式进行测定:使利用氧化还原反应而由生物成分产生的过氧化氢与氧化还原显色试剂(组合了作为耦合剂的氨基安替比林系化合物和供氢体的特林德试剂等)在过氧化物酶的存在下进行氧化缩合,对由此发生的显色进行比色定量而测定。
背景技术
一直以来,在临床诊断中利用酶法进行生物成分的测定,特别是广泛进行了如下方法:通过氧化物酶-过氧化物酶-氧化还原显色试剂(以下也记为显色剂。)系的方法、即使待检体中的测定对象物质进行酶反应而产生过氧化氢,在过氧化物酶的存在下与显色剂反应来进行比色定量的方法(非专利文献1)。
作为该氧化还原显色试剂体系,可列举出例如使用供氢体和耦合剂的方法。作为代表例,可列举出在过氧化物酶的存在下使供氢体与耦合剂通过过氧化氢进行氧化缩合而形成色素的特林德(Trinder)法。作为本方法中使用的耦合剂,已知例如4-氨基安替比林(以下也记为4AA)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:BUNSEKI KAGAKU Vol.45,No.2,pp.111-124(1996)
发明内容
发明要解决的问题
本发明人等具备如下经验:制备使用氨基安替比林系化合物和供氢体的酶-过氧化物酶-显色剂体系的生物成分测定试剂,将其用于测定生物成分时会出现原因不明的测定灵敏度降低。
由于测定灵敏度降低的程度根据为了测定而制备的试剂组合物的批次不同而存在差异,因此本发明人等对测定试剂盒的试剂组成进行了各种研究。其结果,意外地发现,在4-氨基安替比林中存在极微量的4-羟基安替比林(以下也记为4HA。)这样的物质。虽然并不希望受理论约束,但在试剂中存在4-羟基安替比林的情况下,可认为在结构上4-羟基安替比林不与供氢体发生偶联反应,但在过氧化氢的存在下4-羟基安替比林与过氧化物酶发生反应,使过氧化氢被消耗,其结果,可认为使酶与待检体中的测定对象物质反应而产生的过氧化氢被4-羟基安替比林消耗,由原本的4-氨基安替比林-供氢体的反应而显色的显色量减少、灵敏度降低。
因此,为了解决一直以来尚不知晓的上述课题,本发明的目的在于提供抑制起因于4-羟基安替比林的灵敏度降低的手段。
用于解决问题的方案
本发明人等为了实现上述目的而进行了深入研究,结果意外地发现:在制备生物成分测定试剂盒时,通过使用产生铁离子的成分等含铁物质,从而能够抑制起因于4-羟基安替比林的灵敏度降低,以至完成了本发明。即,本发明包括以下的构成。
[项目1]一种生物成分的测定灵敏度降低抑制剂,其特征在于,其为适用于生物成分测定法的测定灵敏度降低抑制剂且含有含铁物质,所述生物成分测定法使用氨基安替比林系化合物作为氧化还原显色试剂的耦合剂。
[项目2]根据项目1所述的生物成分的测定灵敏度降低抑制剂,其特征在于,所述生物成分测定法使用满足以下的(a)~(d)的条件的试剂或试剂套装,将所述生物成分的测定灵敏度降低抑制剂添加至满足(d)的条件的试剂中来使用,
(a)包含能产生过氧化氢的氧化酶,
(b)包含过氧化物酶,
(c)包含在过氧化物酶的存在下与过氧化氢发生反应而显色的氧化还原显色试剂,
(d)包含氨基安替比林系化合物作为该氧化还原显色试剂的耦合剂。
[项目3]根据项目1或2所述的生物成分的测定灵敏度降低抑制剂,其特征在于,抑制起因于4-羟基安替比林的生物成分的测定灵敏度的降低。
[项目4]一种生物成分的测定灵敏度降低的抑制方法,其特征在于,其为适用于生物成分测定法的测定灵敏度降低抑制方法且使用含铁物质,所述生物成分测定法使用氨基安替比林系化合物作为氧化还原显色试剂的耦合剂。
[项目5]一种生物成分的测定灵敏度降低的抑制方法,其特征在于,其为使用满足以下的(a)~(d)的条件的试剂或试剂套装的生物成分测定法中的测定灵敏度降低的抑制方法,在满足(d)的条件的试剂中添加含铁物质,
(a)包含能产生过氧化氢的氧化酶,
(b)包含过氧化物酶,
(c)包含在过氧化物酶的存在下与过氧化氢发生反应而显色的氧化还原显色试剂,
(d)包含氨基安替比林系化合物作为该氧化还原显色试剂的耦合剂。
[项目6]根据项目4或5所述的生物成分的测定灵敏度降低的抑制方法,其特征在于,抑制起因于4-羟基安替比林的生物成分的测定灵敏度的降低。
[项目7]根据项目5或6所述的生物成分的测定灵敏度降低的抑制方法,其特征在于,在所述满足(d)的条件的试剂中共存的含铁物质的浓度为0.001~1mM。
[项目8]根据项目4~7中任一项所述的生物成分的测定灵敏度降低的抑制方法,其特征在于,所述生物成分为肌酸酐或糖化血红蛋白中的任意者。
[项目9]一种生物成分测定试剂盒,其特征在于,其使用氨基安替比林系化合物作为氧化还原显色试剂的耦合剂,所述生物成分测定试剂盒包含项1所述的测定灵敏度降低抑制剂。
[项目10]一种生物成分测定试剂盒,其特征在于,其为满足以下的(a)~(e)的条件的生物成分测定试剂盒,满足(d)和(e)条件的试剂是同时满足2个条件的一种试剂,
(a)包含能产生过氧化氢的氧化酶,
(b)包含过氧化物酶,
(c)包含在过氧化物酶的存在下与过氧化氢发生反应而显色的氧化还原显色试剂,
(d)包含氨基安替比林系化合物作为该氧化还原显色试剂的耦合剂,
(e)包含含铁物质。
[项目11]根据项目10所述的生物成分测定试剂盒,其特征在于,同时满足所述(d)和(e)这2个条件的一种试剂在制造后经过至少1个月。
[项目12]一种生物成分测定方法,其特征在于,使用项目9~11中任一项所述的生物成分测定试剂盒。
[项目13]一种生物成分测定试剂盒的制造方法,其特征在于,其为满足以下的(a)~(e)的条件的、抑制了起因于4-羟基安替比林的灵敏度降低的生物成分测定试剂盒的制造方法,将满足(d)和(e)的条件的试剂制成同时满足2个条件的一种试剂,
(a)包含能产生过氧化氢的氧化酶,
(b)包含过氧化物酶,
(c)包含在过氧化物酶的存在下与过氧化氢发生反应而显色的氧化还原显色试剂,
(d)包含氨基安替比林系化合物作为该氧化还原显色试剂的耦合剂,
(e)包含含铁物质。
[项目14]根据项目13所述的生物成分测定试剂盒的制造方法,其特征在于,对于所述满足(d)和(e)的条件的试剂,同时满足2个条件的一种试剂为在生物成分测定试剂盒的制造工艺中的中间试剂。
发明的效果
根据本发明,在通过基于氧化酶-过氧化物酶-显色剂体系的酶法进行的生物成分测定中,能够抑制起因于4-羟基安替比林的灵敏度降低。因此,根据本发明,能够进行良好的生物成分测定。特别是,在生物成分的含量为极微量等需要高灵敏度的生物成分的测定中能够进行稳定的测定。
附图说明
图1是示出对4-氨基安替比林原料药进行分析的结果的HPLC级分的图。
图2是示出4-羟基安替比林的结构式的图。
图3是示出在4-羟基安替比林的第2试剂中浓度与试样测定灵敏度的关系的图。
具体实施方式
若对本发明的实施方式进行详细地说明,则如下所述,但本发明并不限定于此。需要说明的是,本说明书中使用的术语只要没有特别声明,则应理解为以该领域中通常使用的含义来使用。
另外,本说明书中记载的全部非专利文献和专利文献作为参考援引于本说明书中。本说明书中的“~”是指“以上且以下”,例如若在说明书中记载为“X~Y”,则表示“X以上且Y以下”。另外,本说明书中的“和/或”表示任一者或两者。另外,本说明书中,单数形式的表述只要没有特别说明,则应理解为也包括其复数形式的概念。
(生物成分的测定灵敏度降低抑制剂)
本发明的生物成分的测定灵敏度降低抑制剂的特征在于,其为适用于生物成分测定法的测定灵敏度降低抑制剂且含有含铁物质(例如,产生铁离子的成分等),所述生物成分测定法使用氨基安替比林系化合物作为氧化还原显色试剂的耦合剂。
本发明的生物成分的测定灵敏度降低抑制剂所适用的生物成分测定法优选为使用满足以下的(a)~(d)的条件的试剂或试剂套装的生物成分测定法。
(a)包含能产生过氧化氢的氧化酶,
(b)包含过氧化物酶,
(c)包含在过氧化物酶的存在下与过氧化氢发生反应而显色的氧化还原显色试剂,
(d)包含氨基安替比林系化合物作为该氧化还原显色试剂的耦合剂。
对于本发明的生物成分的测定灵敏度降低抑制剂,优选将含铁物质(例如,产生铁离子的成分等)添加至前述满足(d)的条件的试剂中来使用。
前述满足(d)的条件的试剂中包含的氨基安替比林系的化合物有时作为其制造过程中的副产物而混入极微量的4-羟基安替比林,本发明中,本发明人等发现上述4-羟基安替比林致使生物成分的测定灵敏度降低。进而,本发明人等发现通过在4-羟基安替比林中共存有含铁物质而能够抑制上述灵敏度降低,并完成了本发明。
即,本发明的生物成分的测定灵敏度降低抑制剂优选在前述满足(d)的条件的试剂中添加含铁物质来使用,目的在于抑制起因于4-羟基安替比林的生物成分的测定灵敏度的降低。
此处,试剂或试剂套装可以制备成满足(a)~(d)的条件的一种试剂,或还可以是将试剂分装而由2个或3个以上构成的试剂套装。另外,试剂或试剂套装可以是包装于1个包装容器中的试剂盒等那样的形态,或还可以是分别准备各试剂并在使用时作为套装来使用的形态。
(生物成分的测定灵敏度降低的抑制方法)
在一个实施方式中,本发明的生物成分的测定灵敏度降低的抑制方法的特征在于,其为适用于生物成分测定法的测定灵敏度降低抑制方法且使用含铁物质,所述生物成分测定法使用氨基安替比林系化合物作为氧化还原显色试剂的耦合剂。
在其它实施方式中,本发明的生物成分的测定灵敏度降低抑制方法的特征在于,其为使用满足以下的(a)~(d)的条件的试剂或试剂套装的生物成分测定法中的测定灵敏度降低的抑制方法,在满足(d)的条件的试剂中添加含铁物质。
(a)包含能产生过氧化氢的氧化酶。
(b)包含过氧化物酶。
(c)包含在过氧化物酶的存在下与过氧化氢发生反应而显色的氧化还原显色试剂。
(d)包含氨基安替比林系化合物作为该氧化还原显色试剂的耦合剂。
本发明人等推测出:测定灵敏度降低是由于4-羟基安替比林与过氧化物酶发生反应而使过氧化氢被消耗所导致的,但本发明中,发现:通过共存含铁物质(优选能由含铁物质产生的铁离子)而能够抑制该4-羟基安替比林的反应性,并完成了本发明。
即,本发明的生物成分的测定灵敏度降低抑制方法的特征在于,其通过在前述满足(d)的条件的试剂中添加含铁物质(例如,产生铁离子的成分等),从而混入前述满足(d)的条件的试剂中的4-羟基安替比林与含铁物质共存而两者发生反应,通过抑制4-羟基安替比林的前述反应性,从而抑制起因于4-羟基安替比林的生物成分的测定灵敏度的降低。
在含有混入有4-羟基安替比林的氨基安替比林系化合物的试剂中,使含铁物质(特定的方式中,能由其产生的铁离子)反应的时间只要能发挥本发明的效果就没有特别限定。例如,自在前述满足(d)的条件的试剂中添加含铁物质的时刻起,在前述满足(d)的条件的试剂中共存有含铁物质的状态下、若在1℃~10℃下至少反应2周、在11℃~25℃下至少反应1周、在26℃~40℃下至少反应2天、在41℃~60℃下至少反应5小时、在61℃~80℃下至少反应1小时,则能够得到充分的效果。因此,即使在不严格进行温度控制的情况下,若保管约1个月以上并使含铁物质发生反应,则能够得到本发明的效果。本发明中,优选在上述那样的期间使4-羟基安替比林与含铁物质共存并发生反应后使用前述满足(d)的条件的试剂。需要说明的是,可以在制造后、库存保管、流通阶段的期间进行上述的反应。
对于保管温度,下限温度优选试剂不会冷冻的温度,上限温度优选试剂中的各种成分不会发生变质、变性等品质劣化的温度。
作为本发明的具体的实施方式,例如,在前述满足(d)的条件的试剂为产品试剂(例如,包含酶等蛋白质的试剂)的情况下,在该产品试剂中添加含铁物质后,通过在共存有含铁物质的状态下、以冷藏或在室温附近进行库存保管、流通、使用前保管由此进行前述反应,因此直至使用之前,可以在自向前述满足(d)的条件的试剂中添加含铁物质而制造的生物成分测定试剂盒的制造日起至经过至少2周后供于使用。
作为本发明的其它具体的实施方式,满足(d)的条件的试剂为中间试剂(例如,用缓冲液成分等调节浓度为产品试剂数倍至数10倍浓度的氨基安替比林系化合物而得到的试剂)的情况下,在该中间试剂中添加含铁物质后,例如可以在30℃以上的温度条件下保管数天、在45℃以上的温度条件下保管数小时,并在保管后稀释至规定浓度来制备产品试剂。
需要说明的是,在中间试剂中添加含铁物质时,可以在制备产品试剂的阶段去除在满足(d)的条件的试剂中共存的含铁物质(特定的方式中,能由其产生的铁离子)而制成产品试剂。
本发明人等发现:通过预先在4-羟基安替比林中共存有含铁物质,从而可抑制这样的起因于4-羟基安替比林的测定灵敏度降低。含铁物质抑制由4-羟基安替比林所致的灵敏度降低的机理尚不明确,但本发明人等推测出:含铁物质(例如,能由其产生的铁离子)致使4-羟基安替比林发生某种结构变化、不与过氧化物酶发生反应而不再消耗过氧化氢。
需要说明的是,关于这点,可推测出4-羟基安替比林的结构变化是不可逆的变化,本发明人等推测出:对于起因于被含铁物质抑制的4-羟基安替比林的生物成分的测定灵敏度降低,即使之后从该共存试剂中去除含铁物质(特定的方式中,能由其产生的铁离子),4-羟基安替比林与过氧化物酶的反应也不会恢复。
本发明的生物成分的测定灵敏度降低抑制方法中,前述在满足(d)的条件的试剂中共存的含铁物质的浓度优选为0.001~1mM,若为0.005~1mM则更优选,若为0.01~0.5mM则进一步优选。
含铁物质的浓度低于0.001mM时抑制效果小,含铁物质的浓度大于1mM时,在生物成分测定反应中发生起因于含铁物质的测定灵敏度降低。
需要说明的是,前述在满足(d)的条件的试剂中共存的含铁物质的优选的浓度范围依赖于混入前述满足(d)的条件的试剂中的4-羟基安替比林浓度,若4-羟基安替比林的浓度低,则即使含铁物质的浓度低,也能够抑制生物成分的测定灵敏度降低,若4-羟基安替比林的浓度高,则使用更高浓度的含铁物质是有效的,因此在本发明的生物成分测定灵敏度降低抑制方法中,含铁物质的浓度优选根据所混入的4-羟基安替比林的浓度进行适宜设定。
作为能由含铁物质产生的铁离子浓度的测定方法,可以适宜地采用ICP发射光谱分析法(ICP-AES)、ICP质谱分析法(ICP-MS)等。具体而言,本发明中,铁离子的浓度可以利用ICP-AES(使用AMETEK,Inc.的SPECTROBLUE)进行测定。需要说明的是,在ICP-AES低于检测限时,可以利用ICP-MS(使用Agilent Technologies Co.,Ltd.的Agilent7700sICP-MS)进行测定。
对于本发明的生物成分的测定灵敏度降低抑制方法,在存在于前述满足(d)的条件的试剂中的4-羟基安替比林的浓度以添加含铁物质(例如,产生铁离子的成分等)之前的浓度计为0.1~50μg/ml左右时,特别容易获得效果。
添加前述含铁物质之前的前述满足(d)的条件的试剂中存在的4-羟基安替比林的浓度为0.1μg/ml以下的情况,由4-羟基安替比林所致的生物成分的测定灵敏度降低低于1%,通过共存有含铁物质而抑制测定灵敏度降低的必要性小。
添加前述含铁物质之前的前述满足(d)的条件的试剂中存在的4-羟基安替比林的浓度大于50μg/ml时,为了抑制由4-羟基安替比林所致的生物成分的测定灵敏度降低,而需要高浓度的含铁物质,因此由含铁物质引起的副反应使显色变大,有容易产生测定误差的倾向。
根据本发明人等的研究,证实了在通常的氨基安替比林系化合物(4-氨基安替比林)原料药中混入了0.005~0.30w/w%左右的4-羟基安替比林。因此,本发明在作为一个例子用于如下试剂时是有效的,所述试剂为如下试剂:包含0.01~100g/l左右的氨基安替比林系化合物(4-氨基安替比林)的试剂、优选包含0.01~10g/l左右的氨基安替比林系化合物(4-氨基安替比林)的试剂、更优选包含0.01~5g/l左右的氨基安替比林系化合物(4-氨基安替比林)的试剂。
需要说明的是,在4-羟基安替比林的混入量大的情况下,优选的是:利用后述的去除4-羟基安替比林的方法等预先从氨基安替比林系化合物中去除4-羟基安替比林后供于生物成分测定。
(生物成分)
本发明的生物成分测定试剂盒对于成为测定对象的生物成分没有特别限定,能用于各种生物成分的测定。例如,用于本发明的生物成分测定的生物成分可以列举出:尿酸(UA)、肌酸酐(CRE)、甘油三酯(TG)、胆固醇(CHO)、AST(GOT)、ALT(GPT)、LDH(乳酸脱氢酶)和同工酶、ALP(碱性磷酸酶)和同工酶、CK(肌酸激酶)和同工酶、淀粉酶(Amy)和同工酶、脂肪酶、γ-GTP(γ-谷氨酰转肽酶)、胆碱酯酶(ChE)、钠(Na)、钾(K)、氯(Cl)、钙(Ca)、磷(P)〔无机磷(IP)〕、铁(Fe)、镁(Mg)、总蛋白(TP)、血清蛋白级分(PF)、尿素氮(BUN)、肌酸酐(CRE)、尿酸(UA)、胆红素(Bil)、氨、胆固醇、HDL胆固醇(HDL-C、高密度脂蛋白胆固醇)、LDL胆固醇(LDL-C、低密度脂蛋白胆固醇)、中性脂肪(甘油三酯)(TG)、胆固醇(CHO)、BTR(BTR、总支链氨基酸/酪氨酸比)、酪氨酸测定试剂(TYR)、血糖(BS、GLU)、1,5-酐-D-山梨糖醇(1,5-AG)、糖化白蛋白(GA)、糖化血红蛋白(HbA1c)等,但不限定于这些。
可以通过使任意的氧化酶和根据需要的其它酶(例如,水解酶)类作用于这些生物成分而产生过氧化氢。对于例如尿酸(UA)、肌酸酐(CRE)、甘油三酯(TG)、糖化血红蛋白(HbA1c),以下对生物成分测定的具体的方式进行说明。
在测定尿酸(UA)时,可以利用过氧化物酶-显色剂体系对通过将尿酸(UA)作为底物的尿酸酶(氧化酶)的反应而生成的过氧化氢进行定量。
在测定肌酸酐(CRE)时,由于在将肌酸酐(CRE)作为底物的肌酐酶的反应中不会直接生成过氧化氢,因此通过使在肌酐酶的反应中生成的肌酸与预先添加在试剂中的肌酸酶反应而产生肌氨酸、进而使用预先在试剂中添加了肌氨酸的肌氨酸氧化酶(氧化酶)来产生过氧化氢来设计所谓的共轭反应,从而能够利用过氧化物酶-显色剂体系进行肌酸酐(CRE)浓度的定量。
在测定甘油三酯(TG)时,通过使用将甘油三酯(TG)作为底物的脂蛋白脂肪酶、以及作为共轭酶的磷酸甘油激酶、甘油-3-磷酸氧化酶(氧化酶)而产生过氧化氢,从而能够进行基于过氧化物酶-显色剂体系的甘油三酯(TG)浓度的定量。
在测定糖化血红蛋白(HbA1c)时,可以在过氧化物酶-显色剂体系中对利用将糖化血红蛋白作为底物的糖化血红蛋白氧化酶(例如,果糖基氨基酸氧化酶)的反应而生成的过氧化氢进行定量。
如此,即使没有适合的酶对直接氧化测定对象而产生过氧化氢的反应进行催化,通过组合对能催化使测定对象变为能产生氧化氢的氧化酶底物的反应的酶(可以连接任何阶段的酶反应。)与前述氧化酶来适宜设计共轭反应,从而也能够测定除上述以外的生物成分的浓度或量。在测定其它生物成分的情况下,也可以与上述同样地利用该领域中公知的方法来产生过氧化氢。
上述所列举的生物成分中,肌酸酐(CRE)、糖化血红蛋白(HbA1c)的生物成分的含量极少,因此要求特别高灵敏度的测定。根据本发明,抑制阻碍氧化酶-过氧化物酶-显色剂体系的反应的4-羟基安替比林的影响,能够抑制生物成分测定的灵敏度降低,因此有利于寻求如此高灵敏度的测定的生物成分的测定。因此,本发明适宜用于肌酸酐、糖化血红蛋白的测定,其中,优选用于肌酸酐的测定。
(生物成分测定试剂盒)
在一个实施方式中,本发明的生物成分测定试剂盒包含前述那样的含有含铁物质的测定灵敏度降低抑制剂。
在其它实施方式中,本发明的生物成分测定试剂盒的特征在于,满足以下的(a)~(e)的条件且满足以下的(d)和(e)的条件的试剂为同时满足2个条件的一种试剂。(a)包含能产生过氧化氢的氧化酶;(b)包含过氧化物酶;(c)包含在过氧化物酶的存在下与过氧化氢发生反应而显色的氧化还原显色试剂;(d)包含氨基安替比林系化合物作为氧化还原显色试剂的耦合剂;(e)包含含铁物质。
对于前述满足(d)和(e)的条件的试剂为同时满足2个条件的一种试剂,如前所述,可以通过在满足(d)的条件的试剂中添加含铁物质(例如,产生铁离子的成分等)来制造。
本发明的生物成分测定试剂盒优选:满足(d)和(e)这2个条件的一种试剂在制造后经过至少1个月。
本发明人等推测4-羟基安替比林与过氧化物酶发生反应,其结果使过氧化氢被消耗,但在本发明中发现通过在4-羟基安替比林中添加含铁物质而能够抑制该4-羟基安替比林的反应性。
该抑制反应的反应速度可能会受到反应温度和反应时间的影响,但在该生物成分测定试剂盒的通常的保管条件下、保管期间为数周至1个月以上可产生抑制效果,本发明的生物成分测定试剂盒优选在制造后经过至少1个月。
需要说明的是,通常认为上述测定试剂盒在制造后经过库存/流通的工艺直至使用之前需要1个月至数个月,在此期间抑制反应进行而可发挥本发明的效果。
(生物成分测定方法)
本发明的生物成分测定方法的特征在于,使用前述的生物成分测定试剂盒来测定生物成分。
(生物成分测定试剂盒的制造方法)
本发明的生物成分测定试剂盒的制造方法的特征在于,其为满足以下的(a)~(e)的条件的、抑制了起因于4-羟基安替比林的灵敏度降低的生物成分测定试剂盒的制造方法,将满足(d)和(e)的条件的试剂制成同时满足2个条件的一种试剂。
(a)包含能产生过氧化氢的氧化酶。
(b)包含过氧化物酶。
(c)包含在过氧化物酶的存在下与过氧化氢发生反应而显色的氧化还原显色试剂。
(d)包含氨基安替比林系化合物作为该氧化还原显色试剂的耦合剂。
(e)包含含铁物质。
此处,优选的是,前述满足(d)和(e)的条件的试剂优选制成同时满足2个条件的一种试剂;以及该试剂经过了对于抑制起因于4-羟基安替比林的生物成分的测定灵敏度降低足够的期间(例如,约1个月以上),针对上述情况的理由如上所述。
本发明的生物成分测定试剂盒的制造方法中,对于前述满足(d)和(e)的条件的试剂,同时满足2个条件的一种试剂是在生物成分测定试剂盒的制造工艺中的中间试剂,还可以使用该中间试剂来制备产品试剂。
如上所述,本发明的生物成分测定试剂盒需要在4-羟基安替比林中添加含铁物质来抑制4-羟基安替比林的反应性,该抑制反应还可以通过在混入作为产品试剂的前述满足(d)的条件的试剂中的4-羟基安替比林中共存有含铁物质来进行,但该抑制反应未必一定需要在产品试剂中进行,例如还可以在含有氨基安替比林系化合物的试剂的制备过程中在中间试剂等状态下添加含铁物质,在之后进行抑制反应后,使用中间试剂来制造产品试剂而以生物成分测定试剂盒的形式提供。
上述中含有氨基安替比林系化合物的试剂中间体是指:例如,在制造配混有氨基安替比林系化合物的试剂的工序中利用缓冲液等将氨基安替比林系化合物的原体稀释,将氨基安替比林系化合物浓度调整为产品试剂的数倍至数十倍左右的浓度的中间试剂等。
对于本发明的生物成分的测定试剂盒,在含有氨基安替比林系化合物的中间试剂中添加产生含铁物质的成分来进行抑制反应的情况下,在中间试剂中添加含铁物质后直至产品制造日为止的期间、与从产品制造日起至产品使用日为止的期间的总计优选至少1个月。
可以推测,本发明的含铁物质(例如,产生铁离子的成分等)通过与作为氨基安替比林系化合物的杂质而混入的4-羟基安替比林共存,从而抑制起因于4-羟基安替比林的生物成分的测定灵敏度降低。
关于通过使本发明的含铁物质与4-羟基安替比林共存而可抑制生物成分测定的灵敏度降低的理由,尚未确定,但可以认为:通过使含铁物质(例如,能由其产生的铁离子)直接或间接作用于4-羟基安替比林,从而使4-羟基安替比林发生某种变化,其结果,使由于4-羟基安替比林与过氧化物酶发生反应所导致的过氧化氢的消耗减少,抑制灵敏度降低。此处,预料前述4-羟基安替比林的变化是不可逆的,可推测一旦发生变性则经无害化的4-羟基安替比林在通常的生物成分测定试剂盒的保管条件下不会引起灵敏度降低。
因此,在前述中间试剂中添加含铁物质的情况等时,可认为在之后制造产品试剂的阶段,能够去除含铁物质(特定的方式中,能由其产生的铁离子)来制备产品试剂,使用这样的产品试剂而制造的生物成分的测定试剂盒、其制造方法也在本发明的范围内。
作为本发明中使用的含铁物质,优选产生铁离子的成分,没有特别限定,可以列举出包含铁离子的含铁化合物、铁蛋白质、氧化铁系颜料等。需要说明的是,本说明书中,铁离子是指构成中包含铁的离子,例如,是也包括铁氰化物离子和/或亚铁氰化物离子等的概念。例如,作为产生铁离子的成分,可以列举出FeBr2、FeBr3、Fe3C、FeCl2、FeCl3、FeF2、FeF3、FeH2、FeH3、FeI2、FeI3、FeN、Fe3N、Fe3N2、Fe(N3)2、FeO、Fe2O3、Fe3O4、FeS、FeS2、Fe2S3、Fe3S4、FeSe、Fe2Se3、FeSi2、Fe(C5H5)2、Fe(ClO3)3、Fe(ClO4)2、Fe(ClO4)3、Fe(CN)2、Fe(CN)3、FeCO3、Fe(CO)5、FeC2O4、Fe2(CO3)3、Fe2(CO)9、Fe2(C2O4)3、Fe3(CO)12、Fe2(CrO4)3、Fe2(Cr2O7)3、Fe5(IO6)2、FeMnO4、FeMoO4、Fe(NO3)2、Fe(NO3)3、Fe(OH)2、Fe(OH)3、FeO(OH)、FePO4、Fe3(PO4)2、FeSeO4、FeSO3、FeSO4、Fe2(SO4)3、H2FeO4、BaFeO4、K2FeO4、Fe(IO3)2、Fe(IO3)3、FeWO4、[Fe(C5H5)2]BF4、Fe(CH3COO)2、Fe(CH3COO)3、Fe(HCOO)2、Fe(OCN)2、Fe(SCN)2、Fe(SCN)3、H3[Fe(CN)6]、H4[Fe(CN)6]、(NH4)2Fe(SO4)2等含铁化合物;过氧化物酶、血红蛋白、肌红蛋白、细胞色素(Cytochrome)、血液结合素、转铁蛋白、血铁黄素、铁蛋白等铁蛋白质;三氧化二铁(α-Fe2O3为主要成分)、铁黄(α-FeOOH)、铁黑(Fe3O4(FeOFe2O3))、黄褐色颜料(ZnOFe2O3、MgOFe2O3)、透明氧化铁(α-Fe2O3、α-FeOOH)等氧化铁系颜料等,但不限定于这些。
这些产生铁离子的成分例如可以根据成为测定对象的生物成分、生物体试样等进行适宜选择。从能够期待操作的便利性优异、更进一步发挥高的效果这样的观点出发,优选使用FeCl2、FeCl3氯化亚铁(I)(FeCl2)、氯化铁(II)(FeCl3)、亚铁氰化物(H3[Fe(CN)6])、铁氰化物(H4[Fe(CN)6])、过氧化物酶等。
本发明中使用的含铁物质的用量只要发挥本发明的效果就没有特别限定。
需要说明的是,如前所述,本发明中含铁物质优选作为与氨基安替比林系化合物的中间试剂、氨基安替比林系化合物一起配混的产品试剂而使用,作为一个例子,以前述中间试剂、产品试剂中的含铁物质的浓度为0.001~1mM的方式制备并使用即可,优选以前述试剂中间体、试剂中的含铁物质的浓度为0.005~1mM、更优选0.01~0.5mM的方式制备配混量来使用。通过以这样的量使用含铁物质,从而能够有效地抑制起因于4-羟基安替比林的生物成分测定试剂盒的灵敏度降低。
对于本发明中使用的含铁物质,为了在与氨基安替比林系化合物一起配混后表现出抑制起因于作为氨基安替比林系化合物的杂质而含有的4-羟基安替比林的生物成分测定的灵敏度降低的效果,而优选在配混后经过一定时间。
为了使本发明中使用的含铁物质表现出抑制起因于4-羟基安替比林的生物成分测定的灵敏度降低的效果,保管温度优选:在1℃~10℃下为2周或其以上、在11℃~25℃下为1周或其以上、在26℃~40℃下为2天或其以上、在41℃~60℃下为5小时或其以上、在61℃~80℃下为1小时或其以上,依赖于保管温度,温度越高则时间越短,温度越低则需要时间越长。进行反应的时间的上限没有特别限定,例如可以设为10年以下。
需要说明的是,即使超过经过时间的上限,只要生物成分测定试剂盒中使用的试剂品质不发生劣化,就能够维持本发明中使用的含铁物质抑制起因于4-羟基安替比林的生物成分测定的灵敏度降低的效果。
上述中,在通常的生物成分测定试剂盒的产品生命周期中,在生产工序中经过试剂配混、品质试验、出货、流通、保管、直至使用之前需要约数周或1个月以上,因此包含使本发明的含铁物质与氨基安替比林系化合物共存而得到的试剂的测定试剂盒在被使用的阶段,处于维持了通过本发明中使用的含铁物质表现出灵敏度降低抑制效果的状态,但在产品生命周期变短的情况等,可以通过制造的工艺管理、出货时的产品管理等来制备。
(氧化酶)
本发明中使用的氧化酶只要能由底物产生过氧化氢,就可以根据目标测定对象没有限制地使用。作为具体例,可以使用尿酸酶、肌氨酸氧化酶、甘油-3-磷酸氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶等,但不限定于这些。作为市售品,可适宜地使用UAO-211(东洋纺制)、SAO-351(东洋纺制)、G3O-311(东洋纺制)等。其用量、添加的方式等没有特别限定。
(过氧化物酶)
作为本发明中使用的过氧化物酶,只要是对过氧化氢与氧化还原系显色试剂的反应进行催化的酶,就可以使用任意种类的酶,例如可列举出源自植物、源自细菌、源自担子菌的过氧化物酶。其中,从纯度、获得的容易性、价格等理由的方面考虑,优选源自辣根、稻、大豆的过氧化物酶,更优选源自辣根的过氧化物酶。作为市售品,可适宜地使用PEO-131(东洋纺制)、PEO-301(东洋纺制)、PEO-302(东洋纺制)等。其用量、添加的方式等没有特别限定。
利用以下的方法定义过氧化物酶活性。
依次混合蒸馏水14mL、5%(W/V)邻苯三酚水溶液2mL、0.147M过氧化氢溶液1mL和100mM磷酸缓冲液(pH6.0)2mL后,在20℃下进行5分钟预温度调节,加入样品溶液1mL,开始进行酶反应。
进行20秒反应后加入2N硫酸水溶液1mL,由此停止反应,通过醚15mL将生成的红棓酚提取5次。
合并提取液后,将总量设为100mL,测定波长420nm处的吸光度(ΔODtest)。
另一方面,盲试验(blind test)中,依次混合蒸馏水14mL、5%邻苯三酚水溶液2mL、0.147M过氧化氢溶液1mL和100mM磷酸缓冲液(pH6.0)2mL后,加入2N硫酸水溶液1mL进行混合,接着加入样品溶液1mL来制备。
针对该溶液,与上述同样地进行醚提取并测定吸光度(ΔODblank)。
计算出由ΔODtest与ΔODblank的吸光度之差生成的红棓酚量,计算出过氧化物酶活性。
将在上述条件下在20秒内生成1.0mg的红棓酚的酶量作为1个红棓酚单位(U)。计算式如以下所示。
过氧化物酶活性(U/mL)={ΔOD(ODtest-ODblank)×稀释倍率}/{0.117×1(mL))=ΔOD×8.547×稀释倍率
过氧化物酶活性(U/mg)=过氧化物酶活性(U/mL)×1/C
0.117:1mg%红棓酚醚溶液的420nm处的吸光度
C:溶解时的酶浓度(c mg/mL)
(1个红棓酚单位相当于13.5国际单位(将邻联茴香胺作为底物,在25℃的反应条件下)。)
需要说明的是,在上述测定中,样品溶液优选用预先冰冷的0.1M磷酸缓冲液pH6.0溶解,用相同缓冲液稀释为3.0~6.0红棓酚单位(U)/mL而供于测定。
(氧化还原显色试剂)
作为用于测定本发明的生物成分的氧化还原显色试剂,只要与过氧化氢发生反应而显色就可以使用任意种类的色素,例如可列举出供氢体与耦合剂的组合。其用量、添加的方式等没有特别限定。它们均可以获得市售品等。
使用了供氢体和耦合剂的代表例是:使供氢体与耦合剂在过氧化物酶的存在下通过过氧化氢进行氧化缩合而形成色素的特林德(Trinder)法。
(供氢体)
在本发明的生物成分测定法中,作为特林德法等中使用的供氢体,可使用苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。
例如可列举出,N-乙基-N-磺丙基-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3,5-二甲氧基苯胺、N-磺丙基-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-磺丙基-3-甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-磺丙基苯胺、N-(2-羟基-3-磺丙基)-2,5-二甲基苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-琥珀酰乙二胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’-乙酰乙二胺等。
(耦合剂)
这些供氢体可以与耦合剂组合来使用。
作为耦合剂,可以列举出4-氨基安替比林(4AA)、氨基安替比林衍生物等氨基安替比林系化合物;香兰素二胺磺酸等香兰素二胺磺酸系化合物;甲基苯并噻唑啉酮(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉酮(SMBTH)等甲基苯并噻唑啉酮系化合物等。
本发明中,能够抑制由氨基安替比林系化合物中包含的极微量的4-羟基安替比林引起的生物成分测定试剂盒的灵敏度降低,因此将氨基安替比林系化合物用作耦合剂时是有效的。特别是,本发明中,将4-氨基安替比林用作耦合剂时是有利的。
本发明中使用的耦合剂可以是2种以上的氨基安替比林系化合物,还可以除了氨基安替比林系化合物之外组合使用其它耦合剂,但优选使用1种氨基安替比林系化合物,更优选使用4-氨基安替比林。
本发明中使用的氨基安替比林系化合物的用量只要发挥本发明的效果就没有特别限定。在氨基安替比林系化合物中有时包含极微量的使灵敏度降低的4-羟基安替比林,期望的是降低4-羟基安替比林的量,但根据本发明,通过共存有含铁物质,从而即使包含少许4-羟基安替比林,也能够抑制灵敏度降低。从这样的观点出发,作为一个例子,对于使含铁物质共存之前的含有氨基安替比林系化合物的试剂中混入的4-羟基安替比林的浓度,以优选为0.1~50μg/ml、更优选0.3~20μg/ml、特别优选为1~10μg/ml的方式制备并使用生物成分测定中使用的氨基安替比林系化合物的用量是有效的。
4-羟基安替比林的浓度低于上述范围时,由4-羟基安替比林所致的生物成分的测定灵敏度降低的影响小,通过使含铁物质共存来抑制测定灵敏度降低的必要性小。
4-羟基安替比林的浓度超过上述范围时,为了抑制由4-羟基安替比林所致的生物成分的测定灵敏度降低而需要高浓度的含铁物质,因此有发生由含铁物质所致的测定灵敏度阻碍、生物成分的测定精度容易降低的倾向。
需要说明的是,4-羟基安替比林的混入量较多的情况下,优选:通过后述的4-羟基安替比林的去除方法等,在预先去除混入至氨基安替比林系化合物中的4-羟基安替比林后供于生物成分测定。
若考虑到通常的氨基安替比林系化合物(4-氨基安替比林)中的4-羟基安替比林混入量,本发明中,作为一个例子在用于如下试剂时是有效的,所述试剂为:包含0.01~100g/l左右的氨基安替比林系化合物(4-氨基安替比林)的试剂、优选包含0.01~10g/l左右的氨基安替比林系化合物(4-氨基安替比林)的试剂、更优选包含0.01~5g/l左右的氨基安替比林系化合物(4-氨基安替比林)的试剂。
通过在这样的范围内使用氨基安替比林系化合物,从而能够更进一步有效地发挥本发明的效果。
(4-羟基安替比林的定量方法)
氨基安替比林系化合物中的4-羟基安替比林的含量例如可以通过单独或任意组合进行如下定量方法来测定,所述定量方法为:高效液相色谱法(以下也称为HPLC法)、气相色谱法(以下也称为GC法)、质谱分析法(以下也称为MS法)、核磁共振法(以下也称为NMR法)等。没有特别限制,从操作的简便性、系统/设备等经济性的观点出发,优选使用HPLC法。作为HPLC法的柱,优选反相柱,反相柱若为硅胶基质的多孔柱则更为优选。
以下对HPLC法的具体的实施例进行说明。本说明书中,通过以下的HPLC法的条件对4-羟基安替比林进行定量。
(1)柱Imtakt Cadenza CD-C18 2.0×150mm
(2)流动相A:0.1%甲酸、B:甲醇
(3)梯度条件0分钟(A 95%、B 5%)-(其间线性梯度)-15分钟(A 2%、B98%)-25分钟(A 2%、B 98%)
(4)流速0.2mL/分钟
(5)柱温度40℃
(6)试样注入量5μL
(7)检测波长UV250nm
将浓度已知的4HA(SIGMA Corporation)作为标准品使用,确认与测定试样的HPLC的级分峰的检测位置一致。另外,比较与测定试样的级分峰的面积并进行定量。作为SIGMACorporation的4-羟基安替比林(4HA:4-Hydroxyantipyrine)使用Cas.NO.1672-63-5、产品编号109428-5G、纯度99%的产品。
本发明中,作为4-羟基安替比林的定量方法,优选使用上述的方法。
(4-羟基安替比林)
4-羟基安替比林是4-氨基安替比林的4位的氨基转换为羟基而得到的结构,可认为是在4-氨基安替比林的制造工序中生成而混入的副产物。
通过本发明人等的研究证实了:4-羟基安替比林即使混入量极少,也会在生物成分测定法中的显色反应中对显色反应产生巨大的影响。可推测该现象是由如下情况引起的:与原本预期作为耦合剂进行反应的氨基安替比林系化合物(例如,4-氨基安替比林)相比,4-羟基安替比林的反应速度更快而使过氧化氢消耗。
本发明的生物成分测定试剂盒中,可以直接使用可能包含4-羟基安替比林的氨基安替比林系化合物的原料药,也可以使用从氨基安替比林系化合物的原料药中对4-羟基安替比林含量低的化合物进行定量筛选而得到的化合物,还可以筛选使用从氨基安替比林系化合物的原料药中去除4-羟基安替比林等而使4-羟基安替比林含量得以减少的化合物。
从氨基安替比林系化合物中减少4-羟基安替比林含量的方法没有特别限制。可以使用该领域中公知的任意的手段进行分离/去除,例如:从生物成分测定试剂中使用HPLC等色谱的方法;溶解于水、溶剂中后,使4-羟基安替比林吸附于树脂等吸附材料而去除的方法;等。
作为从氨基安替比林系化合物中去除4-羟基安替比林的手段,使用色谱的情况,其分离的物理化学原理没有特别限定。例如可列举出分配(正相/反相)、吸附、分子排斥、离子交换等各种原理。可以通过使之吸附于结合有配体的树脂、吸附材料的方法等进行分离。
作为前述的4-羟基安替比林去除手段,可以使用通常的反相色谱。反相色谱的载体没有特别限定。例如硅胶是适宜的,但也可以是聚合物系的载体。在将硅胶用作载体时,可以选择经端盖(end capping)处理或未经处理的硅胶。另外,对于色谱装置,作为低压、中压、高压中任意的色谱系统也可以根据目的适当地调整条件来制备。
与色谱载体结合的配体的种类也没有特别限定。对于配体,除了通用的十八烷基(ODS)之外,还可以通过优化条件来选择使用苯基、辛基。配体的结合可以是单体型(Monomeric)的或聚合体型(Polymeric)的。作为任意的填充剂也通过对分离条件进行优化而使用。
色谱的流动相可以使用水、及甲醇或乙腈那样的水溶性的溶剂,为了避免与硅胶的硅烷醇基的离子相互作用,可以依据常规方法将色谱流动相的pH调整为酸性侧、或添加微量的离子对试剂。
流动相的流速通过所使用的系统的能力进行最优化即可。另外,可以代替线性梯度使其阶梯式地洗脱来分离。
(其它成分等)
本发明的生物成分测定试剂盒中优选包含含有缓冲液成分的试剂。另外,在本发明的生物成分测定试剂盒中所包含的试剂中,可以在不影响反应的范围内添加抗坏血酸氧化酶、防腐剂、盐类、酶稳定剂、色素原稳定剂等。
作为可以在本发明的生物成分测定试剂中含有的缓冲液成分,可列举出Tris缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸缓冲液、碳酸缓冲液、GOOD缓冲液等。其用量、设定pH、添加的方式等没有特别限定。这些均可以获得市售品等。
作为GOOD缓冲液,可示例出N-(2-乙酰胺)-2-氨基乙磺酸(ACES)、N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、N-环己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、2-〔4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基〕乙磺酸(HEPES)、2-吗啉基乙磺酸(MES)、哌嗪-1,4-双(2-乙磺酸)(PIPES)、N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基甲磺酸(TES)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、N-环己基-2-羟基-3-氨基丙磺酸(CAPSO)、3-〔N,N-双(2-羟基乙基)氨基〕-2-羟基丙磺酸(DIPSO)、3-〔4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基〕丙磺酸(EPPS)、2-羟基-3-〔4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪基〕丙磺酸(HEPPSO)、3-吗啉基丙磺酸(MOPS)、2-羟基-3-吗啉基丙磺酸(MOPSO)、哌嗪-1,4-双(2-羟基-3-丙磺酸)(POPSO)、N-三(羟基甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、N-(2-乙酰胺)亚氨乙酸(ADA)、N,N-双(2-羟基乙基)甘氨酸(Bicine)、N-〔三(羟基甲基)甲基〕甘氨酸(Tricine)等。
本发明的生物成分测定试剂中,抗坏血酸氧化酶、防腐剂、盐类、酶稳定剂、色素原稳定剂等的用量、添加的方式等没有特别限定。这些均可以获得市售品等。
作为防腐剂,可列举出ProClin 150、ProClin 200、ProClin300、ProClin 950、叠氮化物、螯合剂、抗生素、抗菌剂等。
作为螯合剂,可列举出乙二胺四乙酸及其盐等。
作为抗生素,可列举出庆大霉素、卡那霉素、氯霉素等。
作为抗菌剂,可列举出甲基异噻唑啉酮、咪唑烷基脲等。
作为盐类,可列举出氯化钠、氯化钾、氯化铝等。
作为酶稳定剂,可列举出蔗糖、海藻糖、环糊精、葡萄糖酸盐、氨基酸类等。
作为色素原稳定剂,可列举出乙二胺四乙酸及其盐等螯合剂、环糊精等。
本发明的生物成分测定试剂盒中包含的试剂可以是溶解于任意的溶剂(例如,纯化水、有机溶剂等)中的液态试剂,还可以是在使用前用与上述同样的溶剂溶解而使用的干燥粉末状试剂(例如,冷冻干燥粉末)等。
(使用了生物成分测定试剂盒的测定方法)
使用本发明的生物成分测定试剂盒来测定生物成分时,可以使用通用的自动分析机(例如,日立7180型自动分析机)。本发明的生物成分测定试剂盒可以构成为能适用于这样的自动分析机的试剂盒。其形态没有特别限定,例如,可以示例出如下各种形态:由液态试剂构成的试剂盒、由通过冷冻干燥等手段而制造的干燥试剂与溶解液的组合构成的试剂盒、在适合的载体上担载酶等的形态的被称为所谓的干燥系统等的试剂盒、使用传感器的形态的试剂盒等。
作为本发明的生物成分测定试剂盒的构成,可使用由1种试剂构成的试剂盒,另外将试剂分装而由2种或3种以上构成的试剂盒。在制成将试剂分装而由2种以上的试剂构成的试剂盒时,例如可以分装为如下试剂来构成试剂盒:包含(a)能产生过氧化氢的氧化酶及(c)氧化还原显色试剂中的供氢体的试剂;和包含(b)过氧化物酶及(d)氧化还原显色色素中作为耦合剂的4-氨基安替比林的试剂。
以下以由将试剂分装成2个的液态试剂(以下也记载为2种试剂体系的液态试剂)构成的试剂盒的形态为例进行说明。
使用该形态的试剂并利用自动分析机进行分析的方法中,在试样中首先添加第1种类的试剂(以下也记载为第1试剂或R1。)并使其反应一定时间,接着进一步添加第2种类的试剂(以下也记载为第2试剂或R2)并使其反应,测此期间的吸光度的变化,由此能够对目标成分进行定量。
需要说明的是,考虑到将本发明的生物成分测定试剂如前述那样用于自动分析机而分装为2种以上来供给时,可判定各分包试剂中的含铁物质的浓度、其它成分的浓度是否在前述的各成分的优选的浓度的范围内。
(生物成分测定方法)
本发明成为对象的生物成分测定方法包括以下的(1)~(3)的工序。
(1)使氧化酶作用于生物成分而产生过氧化氢的工序;
(2)对于工序(1)中产生的过氧化氢,通过共存过氧化物酶而使过氧化物酶发挥作用,由此使4-氨基安替比林与氧化还原显色试剂进行氧化缩合而使反应液显色的工序;
(3)对在工序(2)中显色的反应产物进行比色定量的工序。
本发明的生物成分测定方法是基于酶法的生物成分测定方法,特别是基于氧化酶-过氧化物酶-显色剂体系的方法,即原理在于,通过使待检体中的生物成分发生酶反应而产生根据生物成分的量的过氧化氢,对在过氧化物酶的存在下使其与显色剂反应而出现的显色进行比色定量。
利用该原理的生物成分测定方法已经在该技术领域中得到了确立。因此,将该见解用于本发明,而能够测定各种试样中的生物成分的量或浓度,其形态没有特别限制。
本发明人等首次发现:氨基安替比林系化合物(特别是4-氨基安替比林)的原料药中极微量包含的4-羟基安替比林抑制该氧化酶-过氧化物酶-显色剂体系的反应,导致灵敏度降低。4-羟基安替比林抑制上述反应的机理未必明确,但由其结构可推测出:通过过氧化物酶的作用而在过氧化氢的存在下使氧化还原显色试剂与4-羟基安替比林发生缩合反应,从而消耗过氧化氢。此外,本发明人等发现:这样的起因于4-羟基安替比林的反应抑制可通过预先在4-羟基安替比林中共存含铁物质并反应而受到抑制,能够抑制灵敏度降低。含铁物质抑制由4-羟基安替比林所致的灵敏度降低的机理也不明确,可推测出:由于含铁物质(例如,能由其产生的铁离子)使4-羟基安替比林发生某种结构变化,变得不易与过氧化物酶发生反应而不再消耗过氧化氢。
(待检体)
作为含有用于本发明的生物成分测定的生物成分的待检体,例如可列举出血液(特别是血清、血浆等)、尿、腹水、髄液等生物体的体液、饮料、食品等人所摄取的物质等。其中,优选将人的体液(血清、血浆等源自血液的试样、源自尿的试样等)作为测定对象的待检体。
(生物成分测定试剂盒的检测灵敏度)
本发明中,通过使用含铁物质,从而与未使用含铁物质的情况相比,在基于氧化酶-过氧化物酶-显色剂体系的酶法的生物成分测定中,能够抑制起因于4-羟基安替比林的检测灵敏度的降低。
以下以作为生物成分的肌酸酐为例,对生物成分测定试剂盒的检测灵敏度进行说明。
近些年,eGFR(也称为估算肾小球滤过率)的计算要求小数点之后两位的肌酸酐的测定精度,作为最少检测灵敏度,以肌酸酐浓度计要求0.03mg/dL左右。
另一方面,作为自动分析机的测定精度,肌酸酐试剂的空白波动为σ=0.045~0.114mABS左右,通常被认为体外诊断药的最小检测灵敏度的2.6σ(99.5%正态分布)为0.117~0.296mABS左右。
因此,可认为:2.6σ的最大值的0.296mABS、即只要有约0.3mABS以上的吸光度,则能检测为信号,能够进行是否存在肌酸酐的判断、肌酸酐的定量。
根据本发明,通过使用含铁物质,从而抑制起因于4-羟基安替比林的生物成分测定试剂盒的灵敏度降低,能够将检测灵敏度提高至如上述那样水平。
需要说明的是,本发明不限定于以上说明的各构成,可以在权利要求书所示的范围内进行变更,对于可以将分别在不同的实施方式、实施例中公开的技术方案进行适宜组合或变更或置换的实施方式、实施例也包括在本发明的保护范围中。
实施例
以下通过实施例对本发明进行更具体地说明,但本发明不限定于这些。
(实施例1)基于4HA的HPLC的分离
由于发现试剂灵敏度降低程度起因于4AA的批次差异,因此推测出根据批次不同在4AA中极微量包含的杂质的含量有所不同,利用前述的4HA的定量法(HPLC法)进行杂质的检测。需要说明的是,批次差异的研究中使用的4AA的纯度通过JIS-K8048使用98.0%以上的物质。
将分析4AA时的HPLC级分示于图1。在图1中,图横轴的洗脱时间在7~8分钟附近可观察到的较大的峰是4-氨基安替比林的峰。在这次的HPLC级分中,如图1所示,除了4-氨基安替比林以外确认了3种杂质。
(实施例2)4HA的鉴定
对实施例1的图1中观察到的3种杂质(a、b、c)的各批次的含量进行了研究,结果可知,仅杂质b根据批次不同而含量产生较大差异。因此,通过质谱分析(MS光谱法)对这3种物质的分子量和结构进行了解析。
其结果,杂质b被鉴定为4-羟基安替比林(4HA)。图2示出4HA的结构式。
将浓度已知的4HA(SIGMA Corporation)作为标准品使用,在与实施例1相同条件下实施HPLC,结果4HA与杂质b的级分峰一致。
(实施例3)对肌酸酐测定灵敏度产生影响的4HA的混入浓度依赖性
作为生物成分使用肌酸酐,关于起因于在试剂中混入的4HA的测定灵敏度降低,对4HA的混入量依赖性进行了评价。
在下述的肌酸酐测定试剂的第2试剂中以试剂中最终浓度计成为0.13~8.75μg/ml的方式添加4HA,制备了各自的测定试剂。作为生物成分试样,使用5mg/dL肌酸酐水溶液。
[试剂的制备]
分别制备包含下述组成的肌酸酐测定试剂。此处,对于4-氨基安替比林,将市售的4-氨基安替比林原体纯化,制造不包含4-羟基安替比林的4-氨基安替比林来使用。
第1试剂
PIPES-NaOH 50mM pH7.4
抗坏血酸氧化酶(东洋纺制ASO-311)3U/mL
肌氨酸氧化酶(东洋纺制SAO-351)10U/mL
肌酐酶(东洋纺制CRH-229)40U/mL
过氧化氢酶(东洋纺制CAO-509)130U/mL
N-乙基-N-(3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺0.14g/L
第2试剂
PIPES-NaOH 50mM pH7.4
肌酸酐酰胺水解酶(东洋纺制CNH-311)400U/mL
过氧化物酶(东洋纺制PEO-302)10U/mL
4-氨基安替比林0.6g/L
[测定法]
使用日立7180型自动分析机。在试样2.7μL中添加第1试剂120μL,在37℃下孵育5分钟,作为第一反应。之后添加第2试剂40μL并孵育5分钟,作为第二反应。利用获得第一反应和第二反应的吸光度进行了液量校正后的各吸光度之差的两点终点法测定了546nm处的吸光度(主波长)和800nm处的吸光度(副波长)。计算并求出由主波长减去副波长后的吸光度。
需要说明的是,在本测定条件下的4HA的反应中的浓度为0.03~2.14μg/ml。
[表1]
试剂NO. | ① | ② | ③ | ④ | ⑤ | ⑥ | ⑦ | ⑧ | ⑨ | ⑩ |
第2试剂中的4HA浓度(μg/ml) | 0 | 0.13 | 0.25 | 1.25 | 2.50 | 3.75 | 5.00 | 6.25 | 7.50 | 8.75 |
反应液中的4HA浓度(μg/ml) | 0 | 0.03 | 0.06 | 0.31 | 0.61 | 0.92 | 1.23 | 1.53 | 1.84 | 2.14 |
试样测定灵敏度(mABS) | 111.7 | 110.2 | 108.5 | 97.1 | 81.7 | 69.6 | 60.6 | 50.8 | 42.4 | 35.0 |
相对于试剂①的测定灵敏度(%) | 100% | 99% | 97% | 87% | 73% | 62% | 54% | 45% | 38% | 31% |
将结果示于表1和图3。确认了随着第2试剂中的4HA浓度变高,试样测定灵敏度降低。
(实施例4)通过含铁化合物带来的灵敏度降低抑制效果
作为含铁化合物使用三氯化铁,确认了起因于4HA的灵敏度降低的抑制效果。
对于实验条件,就除对照(a)以外的试剂而言,在肌酸酐测定试剂的第2试剂中以试剂中最终浓度计成为10μg/ml的方式添加4HA,作为生物成分试样使用5mg/dL的肌酸酐水溶液,除此以外在与实施例3相同的条件下进行。
在规定的肌酸酐测定试剂的第2试剂中以成为最终浓度的方式添加三氯化铁后,使用在各自加速条件(35℃)的温度条件下保存3天后的第2试剂,调查了测定灵敏度(mABS)。也同时测定各试剂的空白值,计算出由测定灵敏度减去空白值后的值作为STD灵敏度。此外,计算出各试剂的测定灵敏度(mABS)相对于未添加4HA的各4AA浓度的对照(a)的测定灵敏度(mABS)的比率〔vs对照(%)〕。将结果示于表2~4。
[表2]
[表3]
[表4]
由该结果能够确认:通过使铁盐共存而带来的起因于4HA的灵敏度降低的抑制效果依赖于铁离子浓度和4HA浓度这两者,但在将三氯化铁在第2试剂中的浓度调整为0.01mM~0.05mM的情况下,能够特别有效地抑制起因于4HA的灵敏度降低。另外,在将三氯化铁的第2试剂中浓度调整为0.001mM的情况下,与空白相比观察到一定的灵敏度降低抑制效果。此处,35℃下的评价相当于冷藏保存条件的加速试验。因此,可推测出即使作为冷藏条件,但通过长期与各种铁盐进行反应,也能够抑制起因于4-羟基安替比林的灵敏度降低。
(实施例5)通过包含铁蛋白/铁盐的混合物带来的灵敏度降低抑制效果
作为含铁化合物使用铁氰化钾和亚铁氰化钾,作为铁蛋白质使用PEO-302(过氧化物酶),确认了起因于4HA的灵敏度降低的抑制效果。
对于实验条件,就除对照(a)以外的试剂而言,在肌酸酐测定试剂的第2试剂中以试剂中最终浓度计成为10μg/ml的方式添加4HA,作为生物成分试样使用5mg/dL的肌酸酐水溶液,除此以外在与实施例3相同的条件下进行。
在肌酸酐测定试剂的第2试剂中以成为规定的第2试剂中最终浓度的方式添加铁氰化钾、亚铁氰化钾和PEO-302后,使用在各自加速试验(35℃)的温度条件下保存3天后的第2试剂,调查了测定灵敏度(mABS)。也同时测定了各试剂的空白值,计算出由测定灵敏度减去空白值后的值作为STD灵敏度。此外,计算出各试剂的测定灵敏度(mABS)相对于未添加4HA的对照(a)的测定灵敏度(mABS)的比率〔vs对照(%)〕。
将结果示于表5。
[表5]
由该结果确认了:对于铁氰化钾和亚铁氰化钾这两者,能够抑制起因于4HA的灵敏度降低。对于PEO-302,可观察到:由于第2试剂中浓度低而灵敏度降低抑制效果不大,但随着浓度增高、抑制效果增加。
产业上的可利用性
可以用于利用氧化还原反应对生物成分进行测定的测定方法、以及该方法中使用的试剂、组合物。
Claims (14)
1.一种生物成分的测定灵敏度降低抑制剂,其特征在于,其为适用于生物成分测定法的测定灵敏度降低抑制剂且含有含铁物质,所述生物成分测定法使用含有0.1~50μg/ml的4-羟基安替比林的氨基安替比林系化合物作为氧化还原显色试剂的耦合剂。
2.根据权利要求1所述的生物成分的测定灵敏度降低抑制剂,其特征在于,所述生物成分测定法使用满足以下的(a)~(d)的条件的试剂或试剂套装,将所述生物成分的测定灵敏度降低抑制剂添加至满足(d)的条件的试剂中来使用,
(a)包含能产生过氧化氢的氧化酶,
(b)包含过氧化物酶,
(c)包含在过氧化物酶的存在下与过氧化氢发生反应而显色的氧化还原显色试剂,
(d)包含含有0.1~50μg/ml的4-羟基安替比林的氨基安替比林系化合物作为该氧化还原显色试剂的耦合剂。
3.根据权利要求1或2所述的生物成分的测定灵敏度降低抑制剂,其特征在于,抑制起因于4-羟基安替比林的生物成分的测定灵敏度的降低。
4.一种生物成分的测定灵敏度降低的抑制方法,其特征在于,其为适用于生物成分测定法的测定灵敏度降低抑制方法且使用含铁物质,所述生物成分测定法使用含有0.1~50μg/ml的4-羟基安替比林的氨基安替比林系化合物作为氧化还原显色试剂的耦合剂。
5.一种生物成分的测定灵敏度降低的抑制方法,其特征在于,其为使用满足以下的(a)~(d)的条件的试剂或试剂套装的生物成分测定法中的测定灵敏度降低的抑制方法,在满足(d)的条件的试剂中添加含铁物质,
(a)包含能产生过氧化氢的氧化酶,
(b)包含过氧化物酶,
(c)包含在过氧化物酶的存在下与过氧化氢发生反应而显色的氧化还原显色试剂,
(d)包含含有0.1~50μg/ml的4-羟基安替比林的氨基安替比林系化合物作为该氧化还原显色试剂的耦合剂。
6.根据权利要求4或5所述的生物成分的测定灵敏度降低的抑制方法,其特征在于,抑制起因于4-羟基安替比林的生物成分的测定灵敏度的降低。
7.根据权利要求5所述的生物成分的测定灵敏度降低的抑制方法,其特征在于,在所述满足(d)的条件的试剂中共存的含铁物质的浓度为0.001mM~1mM。
8.根据权利要求4~7中任一项所述的生物成分的测定灵敏度降低的抑制方法,其特征在于,所述生物成分为肌酸酐或糖化血红蛋白中的任意者。
9.一种生物成分测定试剂盒,其特征在于,其使用含有0.1~50μg/ml的4-羟基安替比林的氨基安替比林系化合物作为氧化还原显色试剂的耦合剂,所述生物成分测定试剂盒包含权利要求1所述的测定灵敏度降低抑制剂。
10.一种生物成分测定试剂盒,其特征在于,其为满足以下的(a)~(e)的条件的生物成分测定试剂盒,满足(d)和(e)条件的试剂是同时满足2个条件的一种试剂,
(a)包含能产生过氧化氢的氧化酶,
(b)包含过氧化物酶,
(c)包含在过氧化物酶的存在下与过氧化氢发生反应而显色的氧化还原显色试剂,
(d)包含含有0.1~50μg/ml的4-羟基安替比林的氨基安替比林系化合物作为该氧化还原显色试剂的耦合剂,
(e)包含含铁物质。
11.根据权利要求10所述的生物成分测定试剂盒,其特征在于,同时满足所述(d)和(e)这2个条件的一种试剂在制造后经过至少1个月。
12.一种生物成分测定方法,其特征在于,使用权利要求9~11中任一项所述的生物成分测定试剂盒。
13.一种生物成分测定试剂盒的制造方法,其特征在于,其为满足以下的(a)~(e)的条件的、抑制了起因于4-羟基安替比林的灵敏度降低的生物成分测定试剂盒的制造方法,将满足(d)和(e)的条件的试剂制成同时满足2个条件的一种试剂,
(a)包含能产生过氧化氢的氧化酶,
(b)包含过氧化物酶,
(c)包含在过氧化物酶的存在下与过氧化氢发生反应而显色的氧化还原显色试剂,
(d)包含含有0.1~50μg/ml的4-羟基安替比林的氨基安替比林系化合物作为该氧化还原显色试剂的耦合剂,
(e)包含含铁物质。
14.根据权利要求13所述的生物成分测定试剂盒的制造方法,其特征在于,对于所述满足(d)和(e)的条件的试剂,同时满足2个条件的一种试剂为在生物成分测定试剂盒的制造工艺中的中间试剂。
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