CN103571916A - 一种双试剂法测定尿酸含量试剂盒的配方 - Google Patents

Abstract

一种双试剂法测定尿酸试剂盒的配方；将抗坏血酸氧化酶、辣根过氧化物酶及其辅助显色底物配制在pH6.5～7.0的磷酸盐缓冲液中为试剂1，将尿酸酶及过氧化物酶显色底物配制在pH8.0～9.6硼酸-硼砂缓冲液中为试剂2；应用时调节试剂1和试剂2的比例使最终反应体系pH为7.2～7.5以保障显色产物稳定性，据此混合比例再调节试剂1和试剂2中各种酶及其它有效成分的初始浓度，使各种有效成分在最终反应体系的浓度同时达到要求。这种试剂盒配方使得所用尿酸酶、抗坏血酸氧化酶和过氧化物酶的稳定性都提高而降低成本或延长试剂盒的货架寿命，并保障分析性能。

Description

一种双试剂法测定尿酸含量试剂盒的配方

技术领域

本发明涉及酶法分析测定尿酸含量双试剂法试剂盒的配方，及其在体液尿酸含量测定中的应用方式。

发明的技术背景

测定尿酸可用于实验诊断痛风和肾脏疾病。测定血清尿酸主要用尿酸酶偶联过氧化物酶反应测定显色产物吸收。此方法需用尿酸酶催化尿酸完全氧化成尿囊素、过氧化氢和二氧化碳；过氧化物酶催化过氧化氢氧化生色底物形成显色产物；测定显色产物吸收，推定过氧化氢量以确定尿酸量。4-氨基安替比林是过氧化物酶偶联测定常用的生色底物；常用尿酸酶来自真菌或细菌；过氧化物酶常来自辣根。此法需定量测定过氧化氢；样品中抗坏血酸等还原剂对测定造成负干扰；用抗坏血酸氧化酶先清除样品中抗坏血酸并测定吸收，再加入尿酸酶反应测定吸收；以两步吸收之差校正体积因素后定量尿酸，可基本消除抗坏血酸的干扰。应用此类方法的试剂盒需用两种试剂溶液，一种试剂为1，其含缓冲液、过氧化物酶的辅助生色底物及除了尿酸酶以外的其余酶，包括过氧化物酶和抗坏血酸氧化酶；另一种试剂为2，含尿酸酶、N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐和缓冲液；故此类试剂盒配制方法称双试剂法。配制时，试剂1和试剂2的pH允许在一定范围内变化以尽可能保障所用酶的稳定性，但试剂1和试剂2在最终反应体系的混合体积比例取决于各自的pH，以使得最终反应pH处于7.2～7.5之间而获得稳定的显色产物，而试剂1和试剂2中的各种酶的浓度则需要据上述混合比例调整以使得最终反应体系中各种酶的活性保持一致；最终反应体系中加入样品体积占总体积的1～3％。

尿酸酶的最稳定pH偏碱性且催化活性的最适pH也偏碱，但辣根过氧化物酶等最稳定pH接近7.0且催化活性的最适pH在中性，抗坏血酸氧化酶最稳定pH接近6.5而催化活性的最适pH接近中性。双试剂法测定尿酸含量时，当两种试剂混合后的pH在7.2～7.5之间时显色产物最稳定且吸收测量灵敏度最高。此类双试剂法测定尿酸含量试剂盒所需的酶是其成本的决定因素；这些所需酶中，尿酸酶的比活性最低而其用量需要足以将尿酸完全氧化，但现有商品化尿酸酶室温下的最大比活性低于商品化辣根过氧化物酶最大比活性的10％，更低于商品化抗坏血酸氧化酶最大比活性的2％，故此类试剂盒的主要成本在于尿酸酶。双试剂法测定尿酸含量试剂盒的经典配方中，试剂1和试剂2的缓冲液都为相同pH；这样最终混合反应体系的pH就取决于所用试剂1和2的pH。鉴于尿酸酶在碱性条件下稳定性更好且活性更高，常选用pH8.0～8.3作为试剂1和试剂2的共同pH，但这种最终pH下反应显色产物不稳定，使得测定精度受到操作重复性的严重影响，即使用于自动分析，在线样品的数量也影响测量结果。如改用显色产物最稳定的中性pH，为了保障双试剂法试剂盒的货架寿命，生产时试剂2中尿酸酶必须用尽可能高的初始浓度，这造成试剂盒的配制成本较高。

如将双试剂法测定尿酸的试剂盒中，试剂1配制成中性或略偏酸溶液以保证辣根过氧化物酶、抗坏血酸氧化酶的稳定性；将试剂2配制成碱性即其pH>8.0以提高尿酸酶的稳定性，从而可降低试剂2中尿酸酶初始浓度，使得试剂盒所消耗的酶量降低或者显著延长试剂盒的货架寿命；通过调整试剂1和试剂2的比例，仍能使最终反应混合物的pH在7.2～7.5之间，以保障检测可靠性和灵敏度。经过探索，发现用pH约6.5的磷酸盐缓冲液配制试剂1，用pH约9.2的硼砂缓冲液配制试剂2，最后反应混合物中试剂1和试剂2的体积比例约为3.2：1～4.7：1，试剂2就能用尽可能低的初始尿酸酶浓度获得相同的试剂盒货架寿命，同时使得最终反应混合物的pH达到使得显色产物稳定性最好和检测灵敏度最高的要求。

发明内容概述

本发明所要解决的技术问题是提供一种双试剂法测定血清尿酸试剂盒的新配方，克服迄今为止采用的尿酸测定双试剂法试剂盒要么尿酸酶用量大，要么货架寿命短的缺点。本发明的配方能明显提高尿酸酶在试剂2中的稳定性，降低其初始浓度而降低成本，而试剂盒中其他酶的稳定性也有提高，总体可达到较长的货架寿命而成本更低。所制得的试剂盒可用于测定血清尿酸水平。

本发明所述的双试剂法测定尿酸的试剂盒优选两种试剂的配方如下。试剂1：辣根过氧化物酶1.5U／ml，4-氨基安替比林0.25mM，抗坏血酸氧化酶0.67U／ml，防腐剂苯甲酸钠3.5mM，50mM磷酸盐缓冲液pH为6.5～7.0。试剂2：尿酸酶2.0U／ml，N-乙基N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(Toos)2.33mM，防腐剂苯甲酸钠3.5mM，50mM四硼酸钠缓冲液pH为8.0～9.6。

本发明的尿酸试剂盒适合用如下的储备液及其配比进行制备。试剂1配制：1146U／ml辣根过氧化物酶储备液取0.37mL，15mM4-氨基安替吡啉储备液取4.67mL，200U／ml抗坏血酸氧化酶取0.94mL，0.35mol／L苯甲酸钠储备液取2.8mL，用50mM磷酸盐缓冲液即PBS(6.5～7.0)定容至280mL。试剂2配制：60U／ml尿酸酶储备液取2.34mL，70mM TOOS取2.33mL，0.35mol／L苯甲酸钠储备液取0.7mL，用50mM硼砂缓冲液(pH8.5～9.2)定容至70mL。校准的尿酸标准液(297μM)定值溯源至国家标准物质--冰冻人血清中尿酸成份分析标准物质GBW09157。混合反应后，测定显色产物吸收的检测波长546nm，反应温度20～37℃。手工操作的代表性过程及测定时剂代表性用量为：样品管加入样品20μL，空白管加入生理盐水20μL，校准管加入配套标准品20μL；分别加入相同体积的试剂1共800μL；分别混匀，在37℃保温5分钟后用总容量为1.4mL的比色皿测定吸收，再各管加入试剂2共200μL，混匀，在37℃保温2到10分钟，再测定吸收，以空白管校准调零。如用全自动或半自动生化分析仪，则按设定的最后反应体积以相同比例缩减。采用本领域公知的方法计算样品中的尿酸浓度。本发明所设计的双试剂法试剂盒，可采用本领域公认的无菌操作方法制备成液体剂型，于4℃左右避光保存。

在本发明所述试剂2中，pH在8.0～9.6条件下，原核和多数真核尿酸酶稳定性最佳。大部分原核和少部分真核尿酸酶稳定性都存在明显的pH效应，包括球形节杆菌尿酸酶即AG尿酸酶和重组表达的苛求芽孢杆菌尿酸酶即BF尿酸酶；此两种尿酸酶在pH9.2的硼砂缓冲液中储存稳定性明显优于pH7.4，因此试剂盒配方选择pH9.2的硼砂缓冲液配制试剂2。辣根过氧化物酶和抗坏血酸氧化酶稳定性也存在pH效应，比较两种酶在pH6.0、6.5、7.0、7.4PBS保存稳定性，辣根过氧化物酶最适pH接近7.0，抗坏血酸氧化酶最适pH6.5；试剂盒配方中试剂1选择pH6.5的PBS配制试剂1。试剂盒中各种酶都保存在对应较好pH的缓冲液中，与市售尿酸试剂盒相比，尿酸酶稳定性提高，货架寿命更长。测定血清尿酸时，试剂1和试剂2按一定体积比混合，使得最终溶液pH值为7.2～7.5，尿酸酶偶联过氧化物酶充分反应后显色最稳定且显色最深。市售尿酸试剂盒多用中性缓冲液，不是尿酸酶保存的最佳pH值，须加大尿酸酶初始浓度才能达到要求的保质期。双试剂法使用时，最后反应体系尿酸酶最低用量为0.2U／ml时即可满足临床尿酸水平检测要求；本发明采用的新配方中，新鲜试剂1和2混合后尿酸酶浓度为0.4U／ml，能满足测量范围和灵敏度的要求，还可以降低成本。

说明书附图说明

图1：在介质pH7.4和pH9.2条件下，本发明的试剂盒配方中拟用旭化成AG尿酸酶的稳定性。1为本发明所用的AG尿酸酶的硼酸缓冲液制剂(pH为9.2)4℃稳定性，2为AG尿酸酶的硼酸缓冲液制剂(pH为7.4)4℃稳定性，3为AG尿酸酶的硼酸缓冲液制剂(pH为9.2)37℃稳定性，4为AG尿酸酶的硼酸缓冲液制剂(pH为7.4)37℃稳定性。测定方法：1.4mL比色皿中加入一定量pH9.2硼酸-硼砂缓冲液，测定75μM尿酸在(25±0.5)℃293nm的吸收变化初速度，每分钟氧化1μmol尿酸的酶量为一个酶活力国际单位，尿酸的毫摩尔消光系数为11.5(mM)^-1.cm^-1。

图2：在介质pH7.4和pH9.2条件下，本发明的试剂盒配方中拟用重组表达的BF尿酸酶的稳定性。1为BF尿酸酶的硼酸缓冲液制剂(pH为9.2)4℃稳定性，2为BF尿酸酶的硼酸缓冲液制剂(pH为7.4)4℃稳定性，3为BF尿酸酶的硼酸缓冲液制剂(pH为9.2)37℃稳定性，4为BF尿酸酶的硼酸缓冲液制剂(pH为7.4)37℃稳定性。测定方法：用pH9.2硼酸-硼砂缓冲液测定75μM尿酸在(25±0.5)℃293nm的吸收变化初速度。

图3：在介质pH7.4和pH9.2条件下，本发明的试剂盒配方中拟用产朊假丝酵母尿酸酶的稳定性。1为产朊假丝酵母尿酸酶的硼酸缓冲液制剂(pH为8.8)4℃稳定性(体系开始的尿酸酶活力为5.4U／ml)，2为产朊假丝酵母尿酸酶的硼酸缓冲液制剂(pH为7.4)4℃稳定性，3为产朊假丝酵母尿酸酶的硼酸缓冲液制剂(pH为8.8)37℃稳定性，4为产朊假丝酵母尿酸酶的硼酸缓冲液制剂(pH为7.4)37℃稳定性。测定方法：用pH9.2硼酸-硼砂缓冲液测定75μmol／L尿酸在(25±0.5)℃293nm的吸收变化初速度。

图4：在介质pH6.0、pH6.5、pH7.0和pH7.4条件下，本发明的试剂盒配方中拟采用的抗坏血酸氧化酶的稳定性。1为本发明所用的抗坏血酸氧化酶的PBS缓冲液制剂(pH为6.0)37℃稳定性，2为抗坏血酸氧化酶的PBS缓冲液制剂(pH为6.5)37℃稳定性，3为抗坏血酸氧化酶的PBS缓冲液制剂(pH为7.0)37℃稳定性，4为抗坏血酸氧化酶的PBS缓冲液制剂(pH为7.4)37℃稳定性。测定方法：通过在245nm处校准吸光度来校正新鲜配制的抗坏血酸溶液的浓度。对照组和空白组取1.0mL用(pH5.6，8.0mM)磷酸钠缓冲液(含0.5mM的EDTA)配制的0.5mM抗坏血酸新鲜溶液，对照组取0.10mL用含0.05％(w／v)牛血清白蛋白的(8.0mM，pH5.6)磷酸钠缓冲液配制的样品溶液，混合，在25℃下恒温5.0分钟。反应5.0分钟后加入3.0mL的200mM HCl终止反应，将最终混合物在245nm处读取吸光度。添加相同的0.1mL酶液到空白组，混合后在245nm处读取吸光度。每分钟氧化1μmol抗坏血酸的酶量为一个酶活力国际单位，抗坏血酸的毫摩尔消光系数为10.0(mM)^-1.cm^-1。

图5：在介质pH6.0、pH6.5和pH7.0条件下，本发明的试剂盒配方中拟用抗坏血酸氧化酶在PBS缓冲液制剂4℃稳定性。测定方法参见图4。

图6：在介质pH6.0、pH6.5、pH7.0和pH7.4，本发明的试剂盒配方中拟用辣根过氧化物酶的稳定性。1为本发明所用的辣根过氧化物酶的PBS缓冲液制剂(pH为6.0)37℃稳定性，2为辣根过氧化物酶的PBS缓冲液制剂(pH为6.5)37℃稳定性，3为辣根过氧化物酶的PBS缓冲液制剂(pH为7.0)37℃稳定性，4为辣根过氧化物酶的PBS缓冲液制剂(pH为7.4)37℃稳定性。测定方法：取147mM的过氧化氢50μL，0.396mol／L的焦性没食子酸100μL，加入10μL的样品和(pH6.0，50mM)磷酸钠缓冲液至1.0mL，混合。在25℃，420nm处以5秒的间隔读取3分钟反应的吸光度。初速度是在420nm处每20秒吸光度以线性增加的最大速率，辣根过氧化物酶毫摩尔消光系数为3.5mM^-1·cm^-1。

图7：在介质pH6.0、pH6.5和pH7.0条件下，本发明的试剂盒配方中拟用辣根过氧化物酶在PBS缓冲液制剂4℃稳定性的情况。测定方法参见图6。

图8：用本发明的配方双试剂法制备尿酸试剂盒测定血清尿酸中的反应混合物在546nm处的标准曲线。

图9：双试剂法市售试剂盒测定尿酸含量(C₁)和双试剂法本发明所制备剂盒测定尿酸含量(C₂)的方法学比较。选取临床病人血清标本80例，每份标本重复测定3次，取均值。以市售双试剂法测定尿酸含量试剂盒测得血清尿酸浓度(95～850μM)为横坐标，双试剂法测定尿酸含量试剂盒的新配方测得血清尿酸浓度(100～942μM)为纵坐标作图，直线方程C₁=1.05C₂+3.25(R²>0.995，s<0.013)，双试剂法测定尿酸含量试剂盒的新配方与市售双试剂法测定尿酸含量试剂盒两种方法有相关关系。

图10：双试剂法市售试剂盒测定尿酸含量(C₁)和双试剂法本发明所制备剂盒测定尿酸含量(C₂)进行Bland Altman分析。直线方程(C₁-C₂)=-0.027(C₁+C₂)／2-0.009(R²>0.258，p<0.01)。此差异可能提示新配方所用BF尿酸酶对黄嘌呤干扰抗性强、显色产物稳定性好，手工测定时第二步显色时间偏差使得结果偏高。

具体实施方式

1.具体实施方式实例部分所用主要化学试剂来源、所用特殊器械和方法

1.1主要试剂和材料：尿酸购自Alfa Aesar公司，DEAE-纤维素购自Whatman公司，聚乙二醇(PEG)-6000、焦性没食子酸和胆红素均购自上海化学试剂厂，辣根过氧化物酶购自北京鼎国生物技术责任有限公司，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(TOOS)购自北京易莱西诺科技有限公司，4-氨基安替比林、苯甲酸钠和抗坏血酸均购自重庆化学试剂厂，邻苯三酚购自上海化学试剂总厂，来自黄瓜的抗坏血酸氧化酶购自合肥兰旭生物技术有限公司，AG尿酸酶购自日本旭化成有限公司，市售双试剂法测定尿酸含量试剂盒购自北京中生北控生物科技有限公司(China；no.000028080，http:／／www.zhongsheng.com.cn／cn／cpjs／pop.asp?InfoID=11)和四川迈克生物技术有限公司(China；http:／／www.makerbio.com／products／list.asp?cat＝2)。其它试剂为国产分析纯。

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例1：参见图1至图7，据双试剂法测定尿酸含量试剂盒的新配方制备方法及其应用过程。

最后配方：试剂1：辣根过氧化物酶1.5U／ml，4-氨基安替比林0.25mM，抗坏血酸氧化酶0.67U／ml，苯甲酸钠3.5mM，50mM磷酸盐缓冲液pH为6.5～7.0，。试剂2：尿酸酶2.0U／ml，N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐(Toos)2.33mM，苯甲酸钠3.5mM，50mM硼酸-硼砂缓冲液pH为8.0～9.2。

制备方法：试剂1：1146U／ml辣根过氧化物酶储备液取0.37mL，15mM4-氨基安替吡啉储备液取4.67mL，200U／ml抗坏血酸氧化酶取0.94mL，0.35mol／L苯甲酸钠储备液取2.8mL，用50mM PBS(6.5～7.0)定容至280mL。试剂2：60U／ml尿酸酶储备液取2.34mL，70mM TOOS取2.33mL，0.35mol／L苯甲酸钠储备液取0.7mL，用50mM硼砂缓冲液(pH8.0～9.2)定容至70mL。尿酸标准液(297μM)使用中生北控配套标准液。所有试剂配制在严格无菌环境进行。

手工操作的代表性过程及测定时试剂代表性用量为：样品管加入样品20μL，空白管加入生理盐水20μL，校准管加入配套标准品20μL；分别加入相同体积的试剂1共800μL；分别混匀，在37℃保温5分钟后用总容量为1.4mL的比色皿测定吸收，再各管加入试剂2共200μL，混匀，在37℃保温2到10分钟，再测定吸收，以空白管校准调零。

全自动或半自动生化分析仪上的应用：按设定的最后反应体积以相同比例，据手工操作的模式进行成比例缩减。

采用本领域公知的方法计算样品中的尿酸浓度。

Claims (4)

1.一种双试剂法测定尿酸含量试剂盒的配方，其特征在于：

(1)用尿酸酶和偶联过氧化物酶反应测定显色产物吸收确定尿酸量，用抗坏血酸氧化酶消除样品中抗坏血酸即维生素C的干扰；

(2)将抗坏血酸氧化酶、过氧化物酶及辅助显色物质，加防腐剂和其它辅助成分配制在pH6.5～7.0的磷酸盐缓冲液中为试剂1；

(3)将尿酸酶和N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐配制在pH8.0～9.6硼酸-硼砂缓冲液中，加防腐剂为试剂2；

(4)应用时，试剂1和试剂2混合的比例以最终反应体系pH在7.2～7.5之间为原则进行设置；试剂1和试剂2的pH不同时，其所含各种酶的初始浓度相应改变，使最终反应体系各种酶浓度变化小于10％即保持一致；试剂1和试剂2的pH在所述范围内变化时，二者在最终反应体系的混合比例如下表：

(5)应用时，加入样品体积占最终反应混合物总体积的1～3％；

(6)应用时，先将试剂1和样品混合，摄氏20～37度反应3到8分钟测定吸收为起点吸收；再加入满足最终pH要求的试剂2，混合后相同温度再反应5到15分钟；测定吸收并扣除起点吸收，得到尿酸氧化所生成过氧化氢被用于氧化显色底物所得产物吸收；

(7)以已知浓度尿酸为标准品，制备所得吸收对样品中尿酸浓度的响应曲线；据响应曲线和所测定的吸收推算样品中尿酸浓度。

2.据权利要求1所述一种双试剂法测定尿酸含量试剂盒的配方，此双试剂法测定尿酸含量试剂盒的制备特征在于：

(1)所需要的缓冲液都先灭菌，所用容器先灭菌并干燥；

(2)所需酶、显色底物、防腐剂作为主要有效成分，都配制成5倍以上高浓度储备液；酶溶液用0.22μm微孔滤膜过滤除菌；

(3)试剂1的缓冲液pH为6.5时，其所含主要有效成分浓度如下：辣根过氧化物酶>1.5U／ml，4-氨基安替比林0.25mM，抗坏血酸氧化酶>0.67U／ml，苯甲酸钠3.5mM；上述有效成分用50mM且pH为6.5的磷酸盐缓冲液即PBS配制成各自的储备液，再按储备液的浓度和所需最终浓度确定比例混合；

(4)试剂2的缓冲液pH为9.2时，其所含主要有效成分浓度如下：用在pH8.0～9.2间摄氏4度时失活半衰期长于6个月的尿酸酶时其浓度>2.0U／ml，2.33mM的N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-3-甲基苯胺钠盐以下简称为Toos，苯甲酸钠3.5mM；上述有效成分用50mM且pH为9.2的50mM硼酸-硼砂缓冲液配制成各自的储备液，再按储备液的浓度和所需最终浓度确定比例混合；

(5)当试剂1和试剂2的pH在权利要求1所述范围内变化时，二者在最终反应体系的混合比例变化后，调整试剂1和试剂2中酶初始浓度使得最终反应体系各种酶的活性与试剂1的pH为6.5而试剂2的pH为9.2时相比，相差小于10％即保持一致。

3.据权利要求1所述一种双试剂法测定尿酸含量试剂盒的配方，其应用特征在于：

(1)当设置试剂1的pH为6.5且试剂2的pH为9.2时，先取0.800mL试剂1和20μL样品混合，摄氏20～37℃反应5分钟；测定546nm吸收作为起点吸收；加入0.200mL试剂2在相同温度再反应5··20分钟，测定546nm吸收；扣除起点吸收为来自尿酸的显色产物吸收；用标准品测定546nm吸收对样品中尿酸浓度的响应作为标准曲线；通过标准曲线计算每个血清样品的尿酸浓度；

(2)试剂1和试剂2的pH不同于上述数值时，按权利要求1第(4)所述的比例混合试剂1和试剂2；用于自动分析仪时，样品、试剂1和试剂2的体积减少但维持相同的比例；

(3)该双试剂法测定尿酸含量的试剂盒在4℃避光保存。

4.据权利要求1所述一种双试剂法测定尿酸含量试剂盒的新配方，试剂1和试剂2所用缓冲液的pH不同且以保障其所含成本最高工具酶的稳定性最好为原则进行设置，应用时以最终反应混合物的pH达到7.2～7.5设置两种试剂混合的比例，故所用工具酶最佳稳定性所需pH决定试剂1和试剂2中所含各种酶的初始浓度。

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