CN101324571A - 谷氨酸诊断/测定试剂盒及谷氨酸浓度的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的谷氨酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定谷氨酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出谷氨酸的浓度大小。
Description
技术领域
本发明涉及一种谷氨酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定谷氨酸浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
背景技术
中华人民共和国国家标准GB5009-2003味精卫生标准分析方法有：1.旋光计法2.甲醛滴定法3.凯氏定氮法。味精系指以粮食及制品为原料经发酵提纯的谷氨酸钠。
酶法分析是国际上公认的谷氨酸盐的分析方法，已被多个国际权威组织或机构采纳：如IFU(国际果汁生产者协会)，AIJN(欧盟果蔬汁及饮料生产者联盟)，及MEBAK，OICC，VDLUFA等组织广为推崇，并确定为标准检测方法。已被写入澳大利亚，荷兰，德国，瑞士等多个国家的食品法。国内也有数家果汁、酒类加工企业使用酶法试剂盒作为检测标准。
生物体内存在分解骨质的破骨细胞和形成骨骼的成骨细胞，正常情况下两种细胞的作用保持着良好的平衡。如果平衡被打破、破骨细胞过于活跃，就会导致骨质疏松。破骨细胞中含有谷氨酸，而一种名为“谷氨酸转运体”的蛋白可以将谷氨酸排出破骨细胞，被“释放”的谷氨酸会和细胞表面的受体结合，激活细胞内的酶，抑制破骨细胞分解骨质的作用。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定谷氨酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的谷氨酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行谷氨酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明谷氨酸浓度测定方法原理如下：
L-谷氨酸+氧+水谷氨酸氧化酶氨离子+2-酮戊二酸酯
+过氧化氢
过氧化氢+辅酶NAD(P)H氧化酶还原型辅酶+氧
这种方法应用谷氨酸氧化酶(glutamate oxidase；EC 1.4.3.7；EC 1.4.3.11)偶联NAD(P)H氧化酶(NAD(P)H oxidase；EC 1.6.3.1)酶促反应速率比色法/终点法。谷氨酸氧化酶酶解谷氨酸反应产生过氧化氢，再通过偶联NAD(P)H氧化酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算谷氨酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明谷氨酸诊断/测定试剂盒较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
辅酶 3mmol/L
谷氨酸氧化酶 10000U/L
NAD(P)H氧化酶 12000U/L
本发明的谷氨酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶。
辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶。
辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定谷氨酸浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的谷氨酸诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
辅酶 3mmol/L
谷氨酸氧化酶 10000U/L
NAD(P)H氧化酶 12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测谷氨酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出谷氨酸的浓度大小。
实施例二
本实施例的谷氨酸诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
谷氨酸氧化酶 10000U/L
NAD(P)H氧化酶 12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测谷氨酸样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出谷氨酸的浓度大小。
实施例三
本实施例的谷氨酸诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
NAD(P)H氧化酶 12000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
谷氨酸氧化酶 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定谷氨酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测谷氨酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出谷氨酸的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
Claims (6)
1.一种酶比色法及酶联法的谷氨酸的浓度测定方法，其方法原理如下：
L-谷氨酸+氧+水谷氨酸氧化酶氨离子+2-酮戊二酸酯
+过氧化氢
过氧化氢+辅酶NAD(P)H氧化酶还原型辅酶+氧
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出谷氨酸的浓度大小测定结果。
2.一种谷氨酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括：
缓冲液 20-500mmol/L
稳定剂 1-4000mmol/L
辅酶 1-6mmol/L
谷氨酸氧化酶 1000-80000U/L
NAD(P)H氧化酶 1000-80000U/L
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述谷氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述谷氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成。辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述谷氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、NAD(P)H氧化酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、谷氨酸氧化酶组成。辅酶、谷氨酸氧化酶、NAD(P)H氧化酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述谷氨酸诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
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| CNA2007100233957A CN101324571A (zh) | 2007-06-13 | 2007-06-13 | 谷氨酸诊断/测定试剂盒及谷氨酸浓度的测定方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN102298034A (zh) * | 2010-06-25 | 2011-12-28 | 苏州艾杰生物科技有限公司 | 甘氨酸的测定方法与甘氨酸测定试剂盒 |
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- 2007-06-13 CN CNA2007100233957A patent/CN101324571A/zh active Pending
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Open date: 20081217 |