CN101324559A - D-乳酸诊断/测定试剂盒及d-乳酸浓度测定方法 - Google Patents

D-乳酸诊断/测定试剂盒及d-乳酸浓度测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种利用具有D－乳酸特异性的酶比色法及酶联法技术的D－乳酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定D－乳酸浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子、D－乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度下降的程度/速度，从而测算出D－乳酸的浓度大小。

Description

D-乳酸诊断/测定试剂盒及D-乳酸浓度测定方法
技术领域
本发明涉及一种利用具有D-乳酸特异性的D-乳酸诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定D-乳酸浓度的方法，属于医学/食品检验测定技术领域。
背景技术
L-乳酸是近年来人们十分关注并发展较快的有机酸。同时L-乳酸具有在食品、饲料、医药、塑料、饲料、农药、日用化工、造纸及电子工业等多领域应用前景。
L-乳酸是大多数生物体代谢作用的终产物。仅少数微生物(例乳酸菌属、明串珠菌属)能形成D-乳酸。生产酸奶时非常注意检测乳酸盐，以评估微生物是否产生L-乳酸，D-乳酸或二者兼有。若有D-乳酸存在，则可能是微生物造成了污染。
乳酸盐浓度的异常升高与多种疾病如糖尿病、酸毒症等疾病有密切的关系。L(+)-Lactate是人体中乳酸盐代谢的主要中间产物，并且存在于血液中。D(-)-Lactate也存在，但含量很低，只有L(+)-Lactate的1-5％。
血乳酸测试作为一个监护、监测运动员训练能力的手段，把血乳酸值作为衡量运动员有氧耐力水平、无氧训练能力、身体疲劳恢复等方面的一个重要数据，供安排训练时参考。
酶法分析是国际上公认的分析方法，已被多个国际权威组织或机构采纳：如IFU(国际果汁生产者协会)，AIJN(欧盟果蔬汁及饮料生产者联盟)，及MEBAK，OICC，VDLUFA等组织广为推崇，并确定为标准检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用具有D-乳酸特异性的酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定D-乳酸浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的D-乳酸诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行D-乳酸浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明D-乳酸浓度测定方法原理如下：
D-乳酸+2高铁细胞色素cD-乳酸脱氢酶丙酮酸+
                                 2亚铁细胞色素c
丙酮酸+氨离子+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸+
                                    水+辅酶
这种方法应用具有D-乳酸特异性的D-乳酸脱氢酶(D-Lactatedehydrogenase；EC 1.1.2.4；EC 1.1.2.5)偶联丙氨酸脱氢酶(alaninedehydrogenase；EC 1.4.1.1)酶促反应连续监测法/终点比色法。D-乳酸脱氢酶酶解D-乳酸反应产生丙酮酸，再通过(偶)联合丙氨酸脱氢酶的作用，最终将还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)氧化成为辅酶(在340nm处没有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度下降的程度/速度，通过测量340nm处吸光度下降的程度/速度，可以测算D-乳酸的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明D-乳酸诊断/测定试剂盒较为理想：
缓冲液            100mmol/L
稳定剂            500mmol/L
还原型辅酶        0.25mmol/L
2高铁细胞色素c    10mmol/L
氨离子            20mmol/L
D-乳酸脱氢酶      10000U/L
丙氨酸脱氢酶      12000U/L
本发明的D-乳酸诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子。
试剂2
缓冲液、稳定剂、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶。
还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子。
试剂2
缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、D-乳酸脱氢酶。
还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定D-乳酸浓度的方法，其还原型辅酶可以是NADPH、NADH或thio-NADH中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的D-乳酸诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           50mmol/L
还原型辅酶                       0.25mmol/L
2高铁细胞色素c                   10mmol/L
氨离子                           20mmol/L
D-乳酸脱氢酶        10000U/L
丙氨酸脱氢酶        12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测D-乳酸样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出D-乳酸的浓度大小。
实施例二
本实施例的D-乳酸诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液        100mmol/L
稳定剂                               50mmol/L
还原型辅酶                           0.25mmol/L
2高铁细胞色素c                       10mmol/L
氨离子                               20mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液        100mmol/L
稳定剂                               500mmol/L
D-乳酸脱氢酶        10000U/L
丙氨酸脱氢酶        12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测D-乳酸样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出D-乳酸的浓度大小。
实施例三
本实施例的D-乳酸诊断/测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液        100mmol/L
稳定剂                               50mmol/L
还原型辅酶                           0.25mmol/L
2高铁细胞色素c                       10mmol/L
氨离子                               20mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液        100mmol/L
稳定剂                               500mmol/L
丙氨酸脱氢酶                         12000 U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液    100mmol/L
稳定剂                           500mmol/L
D-乳酸脱氢酶                     10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定D-乳酸浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度1.8±0.7，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测D-乳酸样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为负反应(下降反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，从而测算出D-乳酸的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。

Claims (6)

1.一种利用具有D-乳酸特异性的酶比色法及酶联法技术的D-乳酸浓度测定方法，其方法原理如下：
D-乳酸+2高铁细胞色素c D-乳酸脱氢酶丙酮酸+
                                      2亚铁细胞色素c
丙酮酸+氨离子+还原型辅酶丙氨酸脱氢酶L-丙氨酸+
                                       水+辅酶
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度下降的程度/速度，测算出D-乳酸的浓度大小测定结果。
2.一种D-乳酸诊断/测定试剂盒，主要成分包括：
缓冲液            20-500mmol/L
稳定剂            1-4000mmol/L
还原型辅酶        0.1-0.35mmol/L
2高铁细胞色素c    1-50mmol/L
氨离子            1-50mmol/L
D-乳酸脱氢酶      1000-80000U/L
丙氨酸脱氢酶      1000-80000U/L
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。氨离子可以使用氨盐，例如氯化铵。
3.根据权利要求2所述D-乳酸诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述D-乳酸诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶组成。还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述D-乳酸诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、丙氨酸脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、D-乳酸脱氢酶组成。还原型辅酶、2高铁细胞色素c、氨离子、D-乳酸脱氢酶、丙氨酸脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述D-乳酸诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
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