CN101329268A - 蔗糖测定试剂盒及蔗糖的浓度测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用酶比色法及酶联法技术的蔗糖测定试剂盒，同时本发明还涉及测定蔗糖浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于食品检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、辅酶、蔗糖酶、果糖脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出蔗糖的浓度大小。
Description
技术领域
本发明涉及一种蔗糖测定试剂盒，同时本发明还涉及测定蔗糖浓度的方法，属于食品检验测定技术领域。
背景技术
当前，蜂蜜掺假的现象严重，据调查，在基层收购的蜂蜜中，出现的掺假的样品中，蔗糖的含量多在10-28％之间，有的甚至高达50％以上。另外，在中、低档茶叶加工时掺糖，以增加重量谋取不法利益的现象也比较普遍。无糖食品查出含有蔗糖的问题，也时有所闻，对糖尿病患者造成危害。
申请专利号200510099310.4的一种甘蔗汁中蔗糖含量的检测方法，公开一种蔗糖的测定方法，其方法包括蔗糖的水解，还原糖与铁氰化钾的反应，亚铁氰化钾的电位滴定等步骤。
由于用常规的滴定法测定蔗糖含量过程繁琐，准确性差，也有利用高效液相色谱仪对样品进行检测。
中华人民共和国国家标准GB 5009.8-85公布了食品中蔗糖的测定方法，其原理为：样品经除去蛋白质后，其中蔗糖经盐酸水解转化为还原糖，再按还原糖测定。水解前后还原糖的差值为蔗糖含量。本国家标准由全国卫生标准技术委员会食品卫生标准分委员会提出，由卫生部食品卫生监督检验所归口。本国家标准由卫生部食品卫生监督检验所负责起草。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)及酶(偶)联法(Couple Reaction)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定蔗糖浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的蔗糖测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行蔗糖浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明蔗糖浓度测定方法原理如下：
蔗糖蔗糖酶D-葡萄糖+D-果糖
D-果糖+辅酶果糖脱氢酶脱氢果糖+还原型辅酶
这种方法应用蔗糖酶(sucrase；EC 3.2.1.48)偶联果糖脱氢酶(Fructosedehydrogenase；EC 1.1.1.124；EC 1.1.99.11)酶促反应速率比色法/终点法。蔗糖酶酶解蔗糖反应产生果糖，再通过偶联果糖脱氢酶的作用，最终将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算蔗糖的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂还是三剂，如下成分关系的本发明蔗糖测定试剂盒较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
辅酶 3mmol/L
蔗糖酶 10000U/L
果糖脱氢酶 12000U/L
本发明的蔗糖测定试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖酶、果糖脱氢酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、蔗糖酶、果糖脱氢酶。
辅酶、蔗糖酶、果糖脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
还可以将上述单剂试剂配成如下三剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、果糖脱氢酶。
试剂3
缓冲液、稳定剂、蔗糖酶。
辅酶、蔗糖酶、果糖脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂还是三剂，本发明测定蔗糖浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的蔗糖测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
辅酶 3mmol/L
蔗糖酶 10000U/L
果糖脱氢酶 12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测蔗糖样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出蔗糖的浓度大小。
实施例二
本实施例的蔗糖测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
蔗糖酶 10000U/L
果糖脱氢酶 12000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测蔗糖样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出蔗糖的浓度大小。
实施例三
本实施例的蔗糖测定试剂为三试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
果糖脱氢酶 12000U/L
试剂3
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
蔗糖酶 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体三试剂，可以直接使用。
测定蔗糖浓度时，在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测蔗糖样品与试剂1、试剂2、试剂3的体积比例为4/40/5/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出蔗糖的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
Claims (6)
1.一种酶比色法及酶联法的蔗糖的浓度测定方法，其方法原理如下：
蔗糖 蔗糖酶 D-葡萄糖+D-果糖
D-果糖+辅酶 果糖脱氢酶 脱氢果糖+还原型辅酶
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出蔗糖的浓度大小测定结果。
2.一种蔗糖测定试剂盒，主要成分包括：
缓冲液 20-500mmol/L
稳定剂 1-4000mmol/L
辅酶 1-6mmol/L
蔗糖酶 1000-80000U/L
果糖脱氢酶 1000-80000U/L
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述蔗糖测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖酶、果糖脱氢酶组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述蔗糖测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖酶、果糖脱氢酶组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、蔗糖酶、果糖脱氢酶组成。辅酶、蔗糖酶、果糖脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述蔗糖测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、蔗糖酶、果糖脱氢酶组成多剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、果糖脱氢酶组成；试剂3，由缓冲液、稳定剂、蔗糖酶组成。辅酶、蔗糖酶、果糖脱氢酶在试剂1、试剂2或试剂3中的位置可以不限。
6.根据权利要求2所述蔗糖测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(AmmoniaSulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐剂中的至少一种。
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| CN102741694A (zh) * | 2009-12-16 | 2012-10-17 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 借助于受保护的分析物的控释来检测测试元件中酶的分解 |
| CN102741694B (zh) * | 2009-12-16 | 2014-12-24 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 借助于受保护的分析物的控释来检测测试元件中酶的分解 |
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