CN102741694A - 借助于受保护的分析物的控释来检测测试元件中酶的分解 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于测定至少一种分析物的诊断元件以及包含这样的诊断元件的分析测量装置。此外，本发明涉及一种用于测定分析物的方法，一种用于校正由分析物产生的信号的方法，以及一种使用所述诊断元件的分析测量装置来检查检测光学部件的方法。最后，本发明涉及一种用于控释试剂的体系和这样的体系作为开关元件的用途。

Description

借助于受保护的分析物的控释来检测测试元件中酶的分解
本发明涉及用于测定至少一种分析物的诊断元件和包含这样的诊断元件的分析测量装置。本发明另外涉及一种用于测定分析物的方法、一种用于校正由分析物产生的信号的方法和一种用于检查使用所述诊断元件的分析测量装置的检测光学部件的方法。最后，本发明涉及用于控释试剂的体系和这样的体系作为开关元件的用途。
诊断元件是临床上相关的分析方法的重要组分。在此，分析物（例如代谢物或底物）的测量，例如借助于所述分析物的特异性酶直接地或间接地测定所述分析物具有重要意义。在该情况下，借助于酶-辅酶复合物，将分析物转化并随后定量。在该过程中，使待测分析物与合适的酶、辅酶和任选的介质接触，其中所述辅酶通过酶促反应得到物理化学变化，例如被氧化或还原。如果另外使用介质，那么它通常将在分析物的转化过程中释放出的电子从还原型辅酶转移到光学指示剂或电极的传导组分上，这样使得所述过程例如可以通过光度测量方法或电化学测量方法来检测。校准提供了测量值和待测分析物的浓度之间的直接关系。
从现有技术已知的诊断元件的特点在于，时间有限的稳定性和为获得该稳定性对环境的特殊要求，诸如冷却或干燥贮存。在某些应用形式，例如在由末端用户自己进行测试的情况下，例如在血糖自监测的情况下，因此可能由于错误的，未被觉察的测量体系的不正确贮存而产生用户难以识别的错误结果，并可能导致各种疾病的错误治疗。
所述错误结果主要归因于下述事实：在这样的诊断元件中使用的酶、辅酶和介质通常对水分和热反应灵敏，并因此被灭活。因而，例如在温暖潮湿的环境条件下借助于葡萄糖脱氢酶/NAD体系来检测葡萄糖时，葡萄糖脱氢酶的活性以及辅酶NAD的含量随着时间而下降，其中辅酶的减少通常比葡萄糖脱氢酶活性的丧失明显进展更快。
一种已知的用于提高诊断元件的稳定性的措施是，使用稳定的酶，例如使用得自嗜热生物的酶。此外，存在这样的可能性，通过化学修饰（例如交联）或通过诱变来稳定化酶。此外，也可以加入酶稳定剂例如海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和血清白蛋白，或者将酶例如通过光聚合包围在聚合物网络中。
另一种用于提高诊断元件的稳定性的方法是，使用稳定化的辅酶。由于核糖和吡啶单元之间的糖基键的不稳定性，天然的辅酶例如NAD和NADP或它们的还原形式NADH和NADPH在碱性或酸性条件下是相对不稳定的，而近年来已经在文献中描述了不同的NAD/NADH和NADP/NADPH的衍生物，它们通过烟酰胺基团或核糖单元的修饰来显著提高辅酶的稳定性。
最后，诊断元件稳定性的提高也可以通过使用稳定的介质来获得。因而，通过使用具有尽可能低的氧化还原电位的介质来增加试验的特异性并消除反应过程中的干扰。但是，酶/辅酶复合物的氧化还原电位会形成介质的氧化还原电位的下限。如果介质的电位低于该限度，与介质的反应会减慢或甚至中止。
但是，在实践中在诊断元件中使用的化学检测试剂的组分并非全都具有相同的稳定性，而是更确切地说为不同速度的分解过程所决定。因而，例如当使用carbaNAD作为辅酶时，发生下述效应：由于碳环（carbazyklisch）糖单元的存在，甚至在潮湿和升高温度的条件下，经长时间辅酶仍保持非常稳定，而在诊断元件中使用的天然酶的活性持续降低。同样地，例如在使用稳定化的酶和天然辅酶组合的情况中，所述酶的活性可以较长时间地保持，而辅酶的量由于热分解或/和水解分解而或多或少地快速减少。
为了避免测定分析物时的错误结果，因此诊断元件必须能够确定：在诊断元件中使用的检测试剂的各个组分在测量时是否还以功能形式存在，并因此该检测试剂是否适用于分析物的定性或/和定量检测。在这方面，例如酶活性的测定是非常有问题的，因为酶的灭活首先由蛋白构象的变化造成，并因此由于缺乏构造的改变而没有形成光学活性的或电化学活性的成分。
因此，本发明的目的是，提供一种尤其用于测定葡萄糖的稳定的诊断元件，其中至少部分地消除现有技术的缺点。尤其应确保所述诊断元件在检测试剂的各个组分极大地减少或完全缺失功能性能的情况下，避免给出待测定的分析物的误以为正确的测量结果。
根据本发明将通过用于测定至少一种分析物的诊断元件实现该目的，所述诊断元件包括：对分析物特异性的检测试剂和确定量的待测分析物(指示剂分析物)，其中所述指示剂分析物以对于与检测试剂的反应来说不可使用的可释放形式存在。
在根据本发明的诊断元件中使用的检测试剂优选为化学检测试剂，且可以包括适用于测定分析物（例如使用光学或电化学方法）的任意组分。这种组分的实例是本领域技术人员已知的，且尤其包括酶、辅酶、介质、光学指示剂以及助剂或/和添加剂，但不限于这些。
在一个优选的实施方式中，所述检测试剂包括至少一种酶或/和辅酶，它们彼此独立地可以是天然的、半合成的或合成的来源，且可以由本领域技术人员根据诊断元件需要自由地选择。根据本发明，至少一种酶和至少一种辅酶的组合是特别优选的，其中所述酶优选地具有对待测分析物的高特异性，并因此在测定所述分析物的范围内将错误结果减小到最低限度。
如果根据本发明的诊断元件包括酶，所述酶优选是辅酶依赖性的酶。这样的酶的实例尤其包括：脱氢酶、氧化酶（例如葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)或胆固醇氧化酶(EC 1.1.3.6)）、氨基转移酶（例如天冬氨酸氨基转移酶或丙氨酸氨基转移酶）、5'-核苷酸酶、肌酸激酶和黄递酶(EC 1.6.99.2)。在一个更优选的实施方式中，使用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)依赖性的或烟酰胺-腺嘌呤-二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)依赖性的脱氢酶，其中所述酶尤其选自：醇脱氢酶(EC 1.1.1.1; EC 1.1.1.2)、L-氨基酸脱氢酶(EC 1.4.1.5)、葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49)、甘油脱氢酶(EC 1.1.1.6)、3-羟基丁酸脱氢酶(EC 1.1.1.30)、乳酸脱氢酶(EC 1.1.1.27; 1.1.1.28)、苹果酸脱氢酶(EC 1.1.1.37)和山梨醇脱氢酶。所述酶最强烈优选地是葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49)。
如果使用葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)作为酶，则在根据本发明的方法的范围内可以使用例如突变的葡萄糖脱氢酶。在本申请的范围内使用的术语“突变体”是指，天然酶的遗传修饰的变体，所述变体具有与野生型酶相同数目的氨基酸，但是具有改变的氨基酸序列，即它与野生型酶相差至少一个氨基酸。所述一个或多个突变的引入可以使用在本专业领域中已知的重组方法位点专一或非位点专一，但是优选位点专一地进行，其中根据各自的需要和条件在天然酶的氨基酸序列内产生至少一个氨基酸交换。相对于野生型酶，所述突变体特别优选具有提高的热或水解稳定性。这种突变体的实例描述在Baik (Appl. Environ. Microbiol. (2005), 71, 3285)、Vásquez-Figueroa (ChemBioChem. (2007), 8，2295)中以及在WO 2005/045016 A2中，在此明确引用其公开内容。
突变的葡萄糖脱氢酶可以基本上在它的氨基酸序列中的任意位置处包含相对于对应的野生型葡萄糖脱氢酶改变的一个或多个氨基酸。突变的葡萄糖脱氢酶优选地包括，在野生型葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列的位置96、170和252的至少一个位置处的突变，其中具有在位置96和位置170处的突变或在位置170和位置252处的突变的突变体是特别优选的。已经证实，如果突变的葡萄糖脱氢酶不含有除了这些突变以外的其它突变，则是有利的。
在位置96、170和252处的突变基本上可以包括导致稳定化（例如，野生型酶的热或水解稳定性的增加）的任意氨基酸置换。在位置96处的突变优选地包括甘氨酸对谷氨酸的氨基酸置换，而对于位置170，精氨酸或赖氨酸对谷氨酸的氨基酸置换、尤其是赖氨酸对谷氨酸的氨基酸置换是优选的。至于在位置252处的突变，则它优选包括亮氨酸对赖氨酸的氨基酸置换。
通过源自任意生物来源的野生型葡萄糖脱氢酶的突变，可以得到突变的葡萄糖脱氢酶，其中在本发明的意义上，术语“生物来源”既包括原核生物（例如细菌）也包括真核生物（例如哺乳动物和其它动物）。野生型葡萄糖脱氢酶优选地源自细菌，其中特别优选为来自巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）或苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的葡萄糖脱氢酶，尤其是来自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶。
在一个特别优选的实施方式中，突变的葡萄糖脱氢酶是通过突变来自枯草芽孢杆菌的野生型葡萄糖脱氢酶而得到的葡萄糖脱氢酶，所述突变的葡萄糖脱氢酶具有在SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列(GlucDH_E96G_E170K)或在SEQ ID NO:2中所示的氨基酸序列(GlucDH_E170K_K252L)。
在本发明的一个实施方式中，在这一点上所述的诊断元件此外包括辅酶，所述辅酶优选地是稳定化的辅酶。在本发明的意义上，稳定化的辅酶是相对于天然辅酶被化学修饰的辅酶，其在大气压下具有比天然辅酶更高的对湿度、温度（特别是在0℃-50℃的范围内）、酸和碱（特别是在pH 4至pH 10的范围内）或/和亲核试剂（例如醇类或胺类）的稳定性，并因此在相同的环境条件下可以比天然辅酶更久地发挥作用。稳定化的辅酶优选地具有比天然辅酶更高的水解稳定性，其中在试验条件下的完全水解稳定性是特别优选的。与天然辅酶相比，稳定化的辅酶可以具有减小的对酶的结合常数，例如减小1/2或更多的结合常数。
在本发明的意义上，稳定化的辅酶的优选实例是稳定化的NAD(P)/NAD(P)H化合物，即天然的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)的化学衍生物，或式(I)化合物：
Figure 862271DEST_PATH_IMAGE001
   。
如果稳定化的辅酶是稳定化的NAD(P)/NAD(P)H化合物，那么稳定化的NAD(P)/NAD(P)H化合物优选地包括3-吡啶羰基残基或3-吡啶硫代羰基残基，其没有糖苷键地经由线型或环状有机残基（尤其是经由环状有机残基）与含磷残基（例如磷酸酯残基）相连。
所述稳定化的NAD(P)/NAD(P)H化合物特别优选地选自通式(II)的化合物：
Figure 654777DEST_PATH_IMAGE002
其中
A= 腺嘌呤或其类似物，
T= 在每种情况下独立地O、S，
U= 在每种情况下独立地OH、SH、BH3 -、BCNH2 -，
V= 在每种情况下独立地是OH或磷酸基，或形成环状磷酸基的2个基团；
W= COOR、CON(R)2、COR、CSN(R)2，其中R= 在每种情况下独立地H或C1-C2烷基，
X1、X2= 在每种情况下独立地O、CH2、CHCH3，C(CH3)2、NH、NCH3，
Y= NH、S、O、CH2，
Z= 线型的或环状的有机残基，条件是Z和吡啶残基没有通过糖苷键相连，
或其盐或任选的还原形式。
在一个优选的实施方式中，通式(II)的化合物含有腺嘌呤或腺嘌呤类似物例如C8-和N6-取代的腺嘌呤、脱氮变体（诸如7-脱氮）、氮杂变体（诸如8-氮杂）或组合（诸如7-脱氮或8-氮杂）或碳环类似物（诸如间型霉素），其中7-脱氮变体可以在7位上被卤素、C1-6炔基、C1-6烯基或C1-6烷基取代。
在另一个优选的实施方式中，通式(II)的化合物含有腺苷类似物，所述腺苷类似物含有例如2-甲氧基脱氧核糖、2’-氟脱氧核糖、己糖醇、阿卓糖醇或多环类似物（诸如双环糖、LNA糖和三环糖类）替代核糖。
特别地，在通式(II)的化合物中(二)磷酸盐氧也可以被各向同性地（isotronically）替代，例如O- 被S-或BH3 -替代，O被NH、NCH3或CH2替代，和=O被=S替代。在根据本发明的式(II)的化合物中，W优选地是CONH2或COCH3。
在通式(II)的化合物中，Z优选地是具有4-6个C原子、优选具有4个C原子的线型残基，其中1或2个C原子任选地1个或多个选自O、S和N的杂原子替代，或是包含具有5或6个C原子的环状基团和残基CR4 2的残基，所述环状基团任选地含有选自O、S和N的杂原子以及任选的一个或多个取代基，其中CR4 2与所述环状基团和X2相连，其中R4 = 在每种情况下独立地H、F、Cl、CH3。
Z特别优选地是饱和的或不饱和的、碳环的或杂环的5元环，尤其是通式(III)的基团
Figure 434514DEST_PATH_IMAGE003
其中在R5’和R5’’之间可以存在单键或双键，其中
R4= 在每种情况下独立地H、F、Cl、CH3，
R5= CR4 2，
如果在R5’和R5’’之间存在单键，则R5’= O、S、NH、NC1-C2烷基、CR4 2、CHOH、CHOCH3，且R5’’= CR4 2、CHOH、CHOCH3，
如果在R5’和R5’’之间存在双键，则R5’=R5’’=CR4，
且
R6、R6’= 在每种情况下独立地CH或CCH3。
在通式(III)的基团中，R5优选地是CH2。此外优选的是，R5’选自：CH2、CHOH和NH。在一个特别优选的实施方式中，R5’和R5’’在每种情况下是CHOH。在另一个优选的实施方式中，R5’是NH，且R5’’是CH2。最优选这样的式(III)的基团：其中R4 = H，R5 = CH2，R5’= R5’’= CHOH，且R6= R6’= CH。
在最强烈优选的实施方式中，所述稳定化的辅酶是carbaNAD (J. T. Slama, Biochemistry (1988), 27, 183和Biochemistry (1989), 28, 7688)或是carbaNADP。根据本发明可以使用的其它的稳定的辅酶描述在WO 98/33936、WO 01/49247、WO 2007/012494、US 5,801,006、US 11/460,366和出版物Blackburn等人(Chem. Comm. (1996), 2765)中，在此明确地引用其公开内容。
在本发明的另一个优选的实施方式中，所述检测试剂包含至少一种额外的有助于分析物的定性检测和/或定量测定的组分，例如介质或/和光学指示剂。在本申请的范围内使用的术语“介质”是指这样的化学化合物：其能够提高通过与分析物的反应得到的还原型辅酶的反应性，并使电子能够转移至合适的光学指示剂或光学指示剂体系。作为介质，根据本发明尤其适宜的是亚硝基苯胺例如[(4-亚硝基苯基)亚氨基]二甲醇盐酸盐，醌例如菲醌、菲咯啉醌或苯并[h]-喹啉醌，吩嗪例如1-(3-羧基丙氧基)-5-乙基-吩嗪鎓三氟甲烷磺酸盐或/和黄递酶(EC 1.6.99.2)。
在本发明的意义上，菲咯啉醌的优选实例包括：1,10-菲咯啉-5,6-醌类，1,7-菲咯啉-5,6-醌类，4,7-菲咯啉-5,6-醌类以及它们的N-烷基化的或N,N'-二烷基化的盐，其中在N-烷基化的或N,N'-二烷基化的盐的情况下，卤化物、三氟甲烷磺酸根或其它增加溶解度的阴离子作为抗衡离子是优选的。特别适合本发明目的的黄递酶包括，例如，来自猪心、克鲁氏梭状芽孢杆菌（Clostridium kluyverii）和嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）的黄递酶，以及在US 2007/0196899 A1中描述的具有比天然黄递酶提高的催化功能和热稳定性的黄递酶突变体。在此明确地引用上述美国申请的公开内容。
可还原的且当被还原时它的光学性质（例如颜色、荧光、衰减、透射、偏振或/和折射率）发生可检测的变化的任何物质，均可以用作光学指示剂。用裸眼或/和借助于检测装置，使用本领域技术人员认为合适的光学方法（尤其是光度测量方法或荧光测量方法）或电化学方法，可以测定样品中分析物的存在或/和量。
杂多酸、且尤其是2,18-磷钼酸被优选地用作光学指示剂，其被还原为对应的杂多蓝。或者，也可能使用醌例如刃天青、二氯酚靛酚或/和四唑盐作为光学指示剂。适合本发明目的的四唑盐包括，例如，商购可得到的产物WST-3、WST-4和WST-5（都由Dojindo 公司生产），但是不限于这些。
根据本发明，本文所述的诊断元件此外含有确定量的待测分析物（指示剂分析物），其用于产生确定的、光学或电化学可检测的信号。如果通过指示剂分析物与检测试剂的反应产生的信号的大小与预定信号（参照信号）相符，所述预定信号与测定分析物所需的以功能形式存在的检测试剂的各个组分的足够的量相关联（例如与足够量的活性酶相关联），那么诊断元件则释放出样品分析物的实际测量结果。
本文使用的术语“以功能形式”是指，检测试剂的相关组分以化学活性形式存在，且可以实现它在诊断元件中的预期功能。相反，术语“以无功能形式”是指，所述组分以化学上无活性的形式存在，或尽管以化学活性形式（不同于实现希望的功能所需的形式）存在，没有实现它的预期功能。
在本申请的范围内描述的诊断元件可以是包含含有检测试剂的干燥的试剂层的任意测试元件，且可以被含有分析物的样品润湿。根据本发明的测试元件优选地包含载体层和含有检测试剂的检测层。在该情况下，所述载体层可以由这样的任意材料形成：在所述材料上可以使用合适的技术施加检测层，并随后作为用于测定分析物的检测试剂的载体起作用。除了酶、辅酶、介质或/和光学指示剂以外，所述检测试剂可以任选地包括其它试剂，所述其它试剂被本领域技术人员认为适合各自用途的目的或/和通常为生产诊断元件所需要，例如助剂或/和添加剂。
指示剂分析物在诊断元件内的空间定位包括不同的变体，所述变体可以由本领域技术人员根据各自的需要和希望进行选择。在一个优选的实施方式中，根据本发明的测试元件含有在检测层中的指示剂分析物，这样检测试剂和指示剂分析物存在于一个共同的层中。在本发明的另一个优选的实施方式中，所述指示剂分析物相反地布置于与检测层分离的贮存层（Depotschicht）中，尤其是位于载体层和检测层之间的贮存层中，其中所述贮存层可以与所述检测层直接接触，或与所述检测层被一个或多个另外的层隔开。特别优选的是在这样的贮存层和检测层之间布置一个可溶的、尤其是可以光化学地或电化学地溶解的屏障层，其又优选直接接触所述检测层。
为了避免与诊断元件的检测试剂不受控制的反应，并从而避免实际的分析物测量的歪曲，根据本发明的测试元件含有对于与检测试剂的反应来说不可使用的可释放形式的指示剂分析物。在本申请中使用的术语“对于与检测试剂的反应来说不可使用的可释放形式”与术语“以受保护形式”被视为同义，且包括防止指示剂分析物和检测试剂之间的(过早)反应的所有可能性。用于保护指示剂分析物免于不希望的化学反应的措施尤其包括：使用合适的保护基对指示剂分析物进行化学衍生化，将指示剂分析物封装在对检测试剂惰性的可溶性基质中，和使指示剂分析物与含有检测试剂的检测层或/和贮存层在空间上分离。
指示剂分析物在化学衍生化的情况下可以由于借此造成的失活直接接触诊断元件的检测试剂，而在使用没有配备化学保护基的指示剂分析物的情况中，指示剂分析物则必须避免与检测试剂的直接接触。为此目的，可以将所述指示剂分析物例如封装在有机或无机基质中，所述基质对检测试剂是惰性的，其且在给定的条件下是可溶解的，并释放出指示剂分析物。或者，为了避免与检测试剂的过早反应，可将所述指示剂分析物与所述检测层通过至少一个屏障层隔开，所述屏障层可以在下面定义的条件下溶解，由此可以将所述指示剂分析物例如从贮存层释放进检测层中。
为了实现与检测试剂的化学反应，必须将在诊断元件中的指示剂分析物在给定的时间从其对于与检测试剂的反应来说不可使用的形式中释放出来。所述释放可以使用合适的方式，尤其是通过用合适波长的光照射而光化学地，或通过施加电压而电化学地，并且在任意时间，尤其在检测试剂与样品分析物反应之前或之后进行，其中将可能存在的指示剂分析物的保护基团解离，将含有指示剂分析物的基质至少部分地溶解，或/和将布置于贮存层和检测层之间的可溶解的屏障层至少部分破坏。可溶解的基质或屏障层的部分或完全破坏例如可以使用光谱孔烧灼（“烧孔”）方法进行，所述方法可以用于结晶的和无定形固体上，并尤其用于光学信息处理、分子电子学、集成光学和光电子学中(C. Br?uchle, Angewandte Chemie (1992), 104(4), 431-435)。
对于在本发明的范围内的光谱孔烧灼方法的应用而言，在其中含有能量吸收剂的聚合物基质是特别有利的。能量吸收剂吸收适合它们的吸收光谱的能量，并且如果没有提供其它的方式例如荧光辐射用于将能量逐渐降低，则将该能量释放到它们的局部环境中。根据照射的持续时间和强度，周围的聚合物基质会由于加热而膨胀、熔化、开裂，或/和发生化学改变反应。在这方面，可以使用至少一种包含能量吸收剂的聚合物基质用于封装指示剂分析物或/和用作屏障层，该聚合物基质保护指示剂分析物免于与诊断元件的检测试剂进行不希望的反应。
在通过用合适波长（尤其是与分析物测量波长相差至少50 nm的波长）的光照射以在聚合物基质中破坏或产生孔的情况下，可使所述指示剂分析物在给定的条件下和在任意时间点接触检测试剂，其中优选产生光学或电化学可测量的信号。如果分析物的测量例如发生在紫外区(即在低于400 nm的范围内的波长下)，尤其是在约150 nm至约400 nm范围内的波长下进行，那么就用于激发能量吸收剂这点而言，可以用例如具有> 400 nm的波长的光，尤其是具有约450 nm至约800 nm范围的波长的光辐照。
因此，上述的方法通常能提供用于控释试剂的体系，其中所述释放可以独立于在所述体系中的其它反应过程而施行，并从而允许有针对性地控制所述体系中的反应过程。结果，包含下述物质的体系可以例如用作开关元件，尤其是在反应级联的范围内：包含以受保护形式存在且可以在给定的条件下释放的试剂的载体，和与所述载体分离的反应体系，以及用于将所述试剂释放在载体上的措施。在这方面，在与反应体系反应之前对所述试剂的保护尤其可以如在本申请的范围内详细描述的通过将所述试剂封装在可溶性的基质中，通过借助于可溶性的屏障层使所述试剂与所述反应体系在空间上分离，或/和通过使用化学保护基来产生。
在一个优选的实施方式中，根据本发明的测试元件的检测层、屏障层或/和贮存层由于包含含有至少一种能量吸收剂的聚合物基质，由此可以在如上所述用合适波长的光照射诊断元件之前保护所述指示剂分析物免于直接接触所述检测试剂。根据本发明，含有能量吸收剂的聚合物基质尤其可以被嵌入本文所述的诊断元件的检测层中，或是形成以单独层（例如作为屏障层）的形式。根据本发明，这样的屏障层的厚度在0.05 μm至5 μm的范围，优选地在1 μm至3 μm的范围。如果所述聚合物基质不作为屏障层用于例如使不具有化学保护基的指示剂分析物与所述检测层在空间上分离，那么所述聚合物基质除了含有能量吸收剂以外也优选含有指示剂分析物，其中所述指示剂分析物在本发明的一个特别优选的变体中被封装在所述聚合物基质中。
所述聚合物基质优选地由至少一种疏水聚合物组成，所述疏水聚合物防止在诊断元件接触水分的情况下所述指示剂分析物表现出部分溶解的征象。所述聚合物尤其是这样的疏水的有机聚合物：其促进热形成孔（thermische Lochbildung），且在5℃至50℃的温度下是稳定的，即不会表现出任何分解征象。原则上，考虑将不溶于水或不会被水溶解的任何疏水聚合物用作适用于形成在本发明范围内的聚合物基质的聚合物。上述聚合物基质特别优选地由选自下述的疏水聚合物形成：聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚甲基丙烯酸乙酯(PEMA)、聚碳酸酯和它们的化学衍生物，尽管也可以使用本领域技术人员已知的其它疏水聚合物。
根据本发明，所述聚合物基质可以含有不同形式（例如共价结合的形式或/和游离形式）的至少一种能量吸收剂，其中在聚合物基质内的能量吸收剂的共价结合被认为是优选的。如果所述聚合物基质含有共价结合的能量吸收剂，那么所述能量吸收剂优选地是疏水聚合物的直接组分，且特别优选融入所述疏水聚合物的聚合物链中，例如这可以通过聚合能量吸收剂的合适单体来实现。以此方式，能够确保大量能量吸收剂分子存在于得到的聚合物基质中，而不依赖于所选择的能量吸收剂在用于生产聚合物基质的聚合物溶液中的溶解度，这使得高能量吸收成为可能并因而有利于聚合物基质的溶解（为了释放指示剂分析物的目的）。相反，如果所述能量吸收剂要以游离形式或未结合形式存在于聚合物基质中，即如果要制备掺有能量吸收剂的聚合物基质，那么这可以例如如下实现：通过简单地混合合适的聚合物前体和能量吸收剂，并随后聚合所述混合物。
作为包含在聚合的聚合物基质内的能量吸收剂可以根据各自的需要使用任意的能量吸收剂，其至少部分地将通过照射吸收的能量释放到它的局部环境中，并从而导致聚合物基质的变化。为了促进孔形成，所述聚合物基质或/和所述疏水聚合物除了包含至少一种能量吸收剂以外，可以另外包含热不稳定的化合物或热不稳定的官能团，其在相应的热供给时下释放易挥发的化合物例如氮、二氧化碳或其它在室温时为气体的化合物。这种化合物或官能团的实例尤其包括偶氮衍生物、碳酸衍生物和环状烯烃，但不限于这些。
根据本发明使用的能量吸收剂优选地是疏水染料，所述疏水染料优选在所述聚合物基质中具有高溶解性，或/和在激发后不发射或仅发射少量的荧光辐射，并因而具有低量子效率，尤其是零量子效率。在本发明的范围内更强烈优选地使用这样的疏水染料：其在实际分析物测量的波长(例如在λ=375 nm)处不表现出或仅表现出低吸收，但是在正交波长(例如在λ> 500 nm)处具有高消光系数，由此避免在实际测量过程中不希望的指示剂分析物释放的风险。在这方面，花青染料例如隐花青、吲哚三羰花青(C7)、氧杂羰花青(C3)、碘化频哪氰醇、硫杂羰花青(C3)、硫杂二羰花青(C5)或方酸菁染料（诸如方酸菁染料III）已经被证实是特别合适的。
在本发明的另一个变体中，以对于与检测试剂的反应来说不可使用的可释放形式存在的指示剂分析物包含光化学地或/和电化学地可裂解的保护基，所述保护基可以根据需要裂解并在该过程中在确定的条件下释放出指示剂分析物。光化学可裂解的保护基（其可以例如用于衍生化葡萄糖）的实例尤其包括：蒽醌衍生物、苯甲酸衍生物、香豆素衍生物、硝基苯基·苯基甲酮衍生物、噻吨衍生物、噻吨酮衍生物、呫吨衍生物和藜芦基衍生物，但不限于这些。在本发明的范围内可以使用的电化学可裂解的保护基的实例尤其包括蒽酮衍生物。在有机合成中的保护基的全面的综述，可以参见T.W. Greene, “Protecting Groups in Organic Synthesis”, 第2版，John Wiley and sons, New York, 1991。
根据本发明，释放出指示剂分析物的释放优选在检测试剂与样品分析物反应之前或之后进行。在刚用分析物样品润湿诊断元件以后（例如在第一秒内）检测试剂还没有进行与待测分析物反应，且因而可以没有干扰地监测与以确定的量存在的指示剂分析物的反应，而在润湿诊断元件约1秒以后观察到溶解在样品中的样品分析物的转化的开始。就这方面来说，从样品分析物转化开始直至样品分析物几乎完全转化的时刻，诊断元件中的指示剂分析物的释放是不希望的，因为通常不可能区分由样品分析物产生的信号和由指示剂分析物产生的信号。因此，已经证实，如果作为替代在与检测试剂完全转化之后才通过检测试剂释放出指示剂分析物，且在总体系检查的范围内测量产生的信号是有利的。
在本发明的范围内优选使用这样的诊断元件：在所述诊断元件上可以施加水溶液或非水溶液形式的分析物。在本发明的一个特别优选的实施方式中，所述诊断元件是测试带、测试盘、测试垫、测试条、测试条卷筒或是在WO 2005/084530 A2（在此明确参考它）中提及的诊断元件，在此将其引用至本文。这里，在本申请中描述的诊断元件包含各至少一个测试区，所述测试区可以与含有分析物的样品接触，并使用合适的方式实现分析物的定性或/和定量测定。
本文中使用的术语“测试带”是指带形的诊断元件，其通常包含超过1个单独的测试区，优选至少10个单独的测试区，强烈优选至少25个单独的测试区，和最强烈优选至少50个单独的测试区。所述单独的测试区优选各以彼此几毫米至最多几厘米的距离，例如以< 2.5 cm的距离排布，其中所述测试带可以任选地包含在彼此相邻的测试区之间的标志区域，以检测路径或/和用于校准。这样的测试带描述在EP 1 739 432 A1中，在此明确地引用其公开内容。
本文使用的术语“测试盘”是指盘形的诊断元件，其可以包含1个或多个单独的测试区，例如至少10个单独的测试区。在一个实施方式中，所述测试盘被涂覆以测试化学试剂薄层，例如厚度为约20μm的层，所述层上可以施加分析物样品，其中取决于样品的体积，或大或少尺寸的测试盘区域被样品润湿，且可以用于测定所述分析物。由于透过实验化学试剂层的水分的渗出可被部分地或完全沾湿（的测试盘的未润湿区域随后可用于分析物的进一步测定。
根据本发明的测试元件可以用于测定可以光化学地或电化学地检测的任意生物物质或化学物质。所述分析物优选地选自：苹果酸、醇、铵、抗坏血酸、胆固醇、半胱氨酸、葡萄糖、谷胱甘肽、甘油、尿素、3-羟基丁酸盐/酯、乳酸、5'-核苷酸酶、肽、丙酮酸盐/酯、水杨酸盐/酯和甘油三酯，其中葡萄糖是特别优选的。在该情况下，所述分析物可以源自任意来源，但是优选的是体液中的，所述体液包括但不限于：全血、血浆、血清、淋巴液、胆汁、脑脊液、胞外组织液、尿液以及腺体分泌物例如唾液或汗液。优选借助于本文所述的诊断元件测定分析物在全血、血浆、血清或胞外组织液样品中的存在和/或量。
在一个优选的实施方式中，本发明提供，形成用于测定多种分析物的本文所述的诊断元件，其中本文使用的术语“多种”表示> 1、优选2-10、更优选2-5、最优选2或3的所有数字。如果意图借助于根据本发明的测试元件测定多种分析物（它们可以包含于一个或多个不同的样品中），那么所述不同的分析物的测试可以基本上在所述诊断元件的一个相同测试区中或在不同测试区中进行，其中在单个测试区中测定多种分析物被认为是有利的。为此目的，根据本发明的测试元件例如可以包含对于要测定的每种分析物特定的检测试剂和确定量的各自的分析物，且尤其为彼此连续测定各种分析物，被构造成例如通过从不同的层或/和在不同的时间从所述诊断元件中释放出各自的指示剂分析物。
可以以任意的方式进行分析物的定性或/和定量测定。为此基本上能够使用现有技术已知的用于检测产生可测量信号的酶促反应的所有方法，所述信号可以手工地或使用合适的方式进行评价或读出。在本发明的范围内，优选地使用光学检测方法，包括例如测量吸收、荧光、圆二色性(CD)、旋光色散(ORD)、折光测定法等以及电化学技术。分析物的检测特别优选以光度测量或荧光测量，例如间接地借助于荧光测量可检测的辅酶变化来进行。
在另一个方面，本发明涉及一种分析测量装置，所述装置包含根据本发明的诊断元件，且用于分析物的定性或/和定量测定。这样的分析测量装置的实例尤其包括商购可得的产品Accu-Chek?Active、Accu-Check?Compact和Accu-Check?Mobile (都来自Roche 公司)，但不限于这些。
在另一个方面，本发明涉及一种用于测定分析物的方法，所述方法包括下述步骤：
（a）使所述分析物与根据本发明的诊断元件接触，和
（b）确定所述分析物的存在或/和量。
在另一个方面，本发明涉及一种用于校正由分析物产生的信号的方法，所述方法包括下述步骤：
（a）将根据本发明的诊断元件引入分析测量装置中，
（b）通过使所述分析物与所述诊断元件接触，在所述分析测量装置中产生可检测的第一信号，
（c）通过释放出在所述诊断元件中的指示剂分析物，在所述分析测量装置中产生可检测的第二信号，和
（d）使用在步骤（c）中产生的信号，校正在步骤（b）中产生的信号。
在上述方法的范围内，首先将根据本发明的诊断元件引入例如上述的分析测量装置中。随后，使待测的分析物与所述诊断元件接触，其中分析物和该分析物的特异性检测试剂彼此反应，并在所述分析测量装置中产生优选光学或电化学可检测的第一信号。
为了评估第一测量信号正确地代表样品中分析物浓度的程度，在另一个步骤中，使诊断元件中的指示剂分析物从它的对于与检测试剂的反应来说不可使用的形式释放出来，其中优选借助于在根据本发明的诊断元件的说明中提及的方法方法进行所述释放。然后可以使以此方式释放的指示剂分析物与分析物的特异性检测试剂接触，其中在所述分析测量装置中产生优选光学或电化学可检测的第二信号，由于同时检测分析物和所释放的指示剂分析物，所述信号通常比第一测量信号更明显。
使用合适的方式例如校正曲线，能够使第一和第二测量信号（优选借助于合适的分析测量装置的2个不同测量通道进行检测）分别与分析物的某种浓度相关联。如果从第一测量信号计算出的分析物浓度与从第二测量信号计算出的分析物浓度不一致，那么使用第二次测量的结果校正从第一测量信号计算出的分析物浓度，这可以例如使用合适的算法来实现。以此方式，可以使测量值的潜在波动最小化，并因此提高分析物测定的准确度，所述潜在波动可以是由于环境造成的影响(例如温度、空气湿度)、由于生产造成的诊断元件的不规则性或/和干扰物在样品中的存在而产生。
在另一个方面，本发明涉及一种用于检查分析测量装置的检测光学部件的方法，所述方法包括下述步骤：
（a）将根据本发明的诊断元件引入分析测量装置中，
（b）通过释放出在所述诊断元件中的指示剂分析物，在所述分析测量装置中产生可检测的信号，和
（c）使用参照信号，校正在步骤（b）中产生的信号。
所述方法尤其用于检查分析测量装置的检测光学部件的污染。在将根据本发明的诊断元件引入分析测量装置中并借助于在根据本发明的诊断元件的说明中提及的方法释放出在所述诊断元件中的指示剂分析物以后，通过释放的指示剂分析物与所述分析物的特异性检测试剂的反应，在所述分析测量装置中产生给定的、优选光学或电化学可检测的信号，所述信号可以与参照信号相关联。
如果分析测量装置的检测光学部件被污染，则在指示剂分析物与检测试剂反应时检测到比参照信号弱的信号，由此用户可以例如通过光学或声学消息注意到分析测量装置的损坏，从而舍弃测得的值。
在另一个方面，本发明涉及一种用于控释试剂的体系，所述体系包括：
（a）载体，其包含所述试剂和所述试剂的单独的反应体系，其中所述试剂以对于所述反应体系的反应来说的不可使用的可释放形式存在，且可以在给定的条件下释放，和
（b）用于释放在所述载体上的所述试剂的方式。
在另一个方面，本发明涉及根据本发明的释放体系作为开关元件的用途。
通过下述的附图和实施例意在进一步阐述本发明。
附图说明
图1：根据本发明的诊断元件的一个实施方式的横截面，所述诊断元件包括：检测层、光化学地可裂解的屏障层、其中含有指示剂分析物的贮存层和载体层。
图2：根据本发明的诊断元件的一个替代实施方式的横截面，所述诊断元件包括：检测层、其中含有指示剂分析物和能量吸收剂的光化学可裂解的屏障层，和载体层。
图3：根据本发明的诊断元件的保护层的横截面，所述保护层含有封装形式的指示剂分析物(这里是葡萄糖)。
图4：根据本发明的诊断元件的检测层的横截面，所述检测层含有封装形式的指示剂分析物(这里是葡萄糖)。
图5：指示剂分析物或样品分析物通过根据本发明的诊断元件的酶体系反应的动力学。
5A：在样品分析物通过酶体系反应开始之前释放指示剂分析物。
5B：在样品分析物通过酶体系反应结束之后释放指示剂分析物。
图6：通过光化学释放和随后的酶促反应对指示剂分析物进行荧光测量检测：
6A：在与酶（GlucDH）和辅酶（NAD）的溶液接触之前和之后，用合适波长的光照射的诊断元件的荧光，所述诊断元件含有衍生化形式的指示剂分析物。
6B：在有或没有酶（GlucDH）和辅酶（NAD）的溶液存在下，不含指示剂分析物的诊断元件的荧光。
图7：通过热形成孔和随后的酶促反应对指示剂分析物的荧光测量检测。
7A：在用合适波长的光照射20分钟以后，掺杂了染料（隐花青）的聚合物层的数字照片。
7B：在用合适波长的光照射20分钟、随后与酶（GlucDH）和辅酶（NAD）的溶液接触以后，掺杂了染料(隐花青)的聚合物层的数字照片。
7C：没有预先照射的与酶（GlucDH）和辅酶（NAD）的溶液接触以后，掺杂了染料(隐花青)的聚合物层的数字照片。
图8：葡萄糖脱氢酶双突变体GlucDH_E96G_JE170K和GlucDH_E170K_K252L的氨基酸序列。
实施例
实施例1：具有衍生化形式的指示剂分析物的诊断元件的制备和用途
将衍生化形式的葡萄糖（三-藜芦基衍生物）和聚丙烯酰胺（Aldrich公司）一起施加在Pokalon箔（Lonza公司）的载体层上。随后，将以此方式得到的双层测试元件置于发光测量装置（Roche公司自建）上，并用375 nm波长的光照射2分钟。然后，将10 mg葡萄糖脱氢酶（GlucDH, Roche公司）和10 mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD; Roche公司）在10 ml磷酸盐缓冲液pH 7（Merck公司）中的溶液施加于所述诊断元件上，并荧光测量监测NADH的形成（参见图6a），用于检测由测试元件中使用的葡萄糖衍生物释放出的葡萄糖。
作为参照，分别通过荧光法测量空白Pokalon箔或结合以上述GlucDH和NAD溶液的Pokalon箔（参见图6B）。
实施例2：具有游离指示剂分析物和掺杂染料的聚合物基质的诊断元件的制备和用途
为了制备含有掺杂染料的聚合物基质的诊断元件，制备具有下述组成的2种部分溶液1和2。
部分溶液1:
  称入的量(g) 固体含量(%) 固体(g) 在GFS上的%
部分溶液1 100.00      
PAA 1500 (聚丙烯酰胺) 60.00 50 30.00 33.33
葡萄糖 40.00 100 40.00 44.44
部分溶液2:
  称入的量(g) 固体含量(%) 固体(g) 在GFS上的%
部分溶液2 4.41      
PEMA在氯仿中的10% 溶液 4.00 10 0.4 49.57
隐花青 0.11 100 0.107 13.26
偶氮-双(环己基)碳二亚胺 0.30 100 0.30 37.17
在制备两种部分溶液以后，如下从部分溶液1生产含有葡萄糖的层：通过刮刀涂布（30 μm湿层厚度）并随后干燥。然后，将部分溶液2刮涂（60 μm湿层厚度）在干燥的含有指示剂分析物的层上，并干燥。
用手持式激光器（波长650 nm，< 5瓦）照射以此方式得到的掺有染料的聚合物层，其中在约20分钟以后，可以在被照射的层中观察到孔（参见图7A）。随后，将10 mg葡萄糖脱氢酶（GlucDH, Roche公司）和10 mg烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD, Roche公司）在10 ml磷酸盐缓冲液pH 7（Merck公司）中的溶液施加于通过照射产生的孔上，其中由下层释放的葡萄糖通过与酶体系的反应被氧化，并形成发绿蓝色荧光的NADH（参见图7B）。
作为参照，在没有预先照射掺有染料的聚合物层的情况下，将上述葡萄糖脱氢酶（GlucDH）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）在磷酸盐缓冲液pH 7中的溶液施加于后一种层上。在该情况下表明，由于缺少热诱导的孔形成，没有从下层释放的葡萄糖，且没有形成NADH（参见图7C）。
序列表
 
<110>  F. Hoffmann - La Roche AG
       Roche Diagnostics GmbH
 
<120>  借助于受保护的分析物的控释来检测测试元件中酶的分解
 
 
<130>  43826P WO
 
<150>  EP 09 179 500.5
<151>  2009-12-16
 
<160>  2    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  261
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  来自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶的突变体
 
 
<220>
<221>  诱变剂
<222>  (96)..(96)
 
<220>
<221>  诱变剂
<222>  (170)..(170)
 
<400>  1
 
Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala
1               5                   10                  15     
 
 
Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala
            20                  25                  30         
 
 
Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val
        35                  40                  45             
 
 
Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly
    50                  55                  60                 
 
 
Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile
65                  70                  75                  80 
 
 
Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Gly
                85                  90                  95     
 
 
Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val
            100                 105                 110        
 
 
Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile
        115                 120                 125            
 
 
Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser
    130                 135                 140                
 
 
Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala
145                 150                 155                 160
 
 
Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Lys Thr Leu Ala Leu Glu Tyr
                165                 170                 175    
 
 
Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn
            180                 185                 190        
 
 
Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp
        195                 200                 205            
 
 
Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile
    210                 215                 220                
 
 
Ala Ala Val Ala Val Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ser Ser Tyr Val Thr
225                 230                 235                 240
 
 
Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Lys Tyr Pro Ser Phe
                245                 250                 255    
 
 
Gln Ala Gly Arg Gly
            260    
 
 
<210>  2
<211>  261
<212>  PRT
<213>  人工序列
 
<220>
<223>  来自枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶的突变体
 
 
<220>
<221>  诱变剂
<222>  (170)..(170)
 
<220>
<221>  诱变剂
<222>  (252)..(252)
 
<400>  2
 
Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala
1               5                   10                  15     
 
 
Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala
            20                  25                  30         
 
 
Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val
        35                  40                  45             
 
 
Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly
    50                  55                  60                 
 
 
Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile
65                  70                  75                  80 
 
 
Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu
                85                  90                  95     
 
 
Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val
            100                 105                 110        
 
 
Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile
        115                 120                 125            
 
 
Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser
    130                 135                 140                
 
 
Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala
145                 150                 155                 160
 
 
Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Lys Thr Leu Ala Leu Glu Tyr
                165                 170                 175    
 
 
Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn
            180                 185                 190        
 
 
Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp
        195                 200                 205            
 
 
Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile
    210                 215                 220                
 
 
Ala Ala Val Ala Val Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ser Ser Tyr Val Thr
225                 230                 235                 240
 
 
Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe
                245                 250                 255    
 
 
Gln Ala Gly Arg Gly
            260    

Claims (23)

1.用于测定至少一种分析物的诊断元件，所述诊断元件包括：
（a）对分析物特异性的检测试剂，和
（b）给定量的待测分析物(指示剂分析物)，其中所述指示剂分析物以对于与检测试剂的反应来说不可使用的可释放形式存在。
2.根据权利要求1所述的诊断元件，其特征在于，
所述检测试剂包括酶或/和辅酶，尤其是稳定化的辅酶。
3.根据权利要求2所述的诊断元件，其特征在于，
所述酶是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)依赖性的或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)依赖性的脱氢酶，尤其是葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC 1.1.1.49)。
4.根据权利要求2或3所述的诊断元件，其特征在于，
所述稳定化的辅酶是稳定化的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)-化合物或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)-化合物，尤其是carbaNAD或carbaNADP，或式(I)化合物
Figure DEST_PATH_IMAGE001
   。
5.根据权利要求1-4之一所述的诊断元件，其特征在于，
所述检测试剂此外包括介质或/和光学指示剂。
6.根据权利要求1-5之一所述的诊断元件，其特征在于，
所述诊断元件包括载体层以及含有所述检测试剂的检测层。
7.根据权利要求6所述的诊断元件，其特征在于，
所述诊断元件含有在检测层中或在单独的贮存层中的指示剂分析物。
8.根据权利要求7所述的诊断元件，其特征在于，
在所述贮存层和所述检测层之间布置有可溶解的屏障层。
9.根据权利要求6-8之一所述的诊断元件，其特征在于，
所述检测层、所述屏障层或/和所述贮存层包含含有至少一种能量吸收剂的聚合物基质。
10.根据权利要求9所述的诊断元件，其特征在于，
所述聚合物基质由至少一种疏水聚合物、尤其是选自下述的疏水聚合物形成：聚甲基丙烯酸甲酯、聚甲基丙烯酸乙酯、聚碳酸酯和它们的化学衍生物。
11.根据权利要求9或10所述的诊断元件，其特征在于，
所述聚合物基质含有至少一种共价结合的或/和游离形式的能量吸收剂。
12.根据权利要求9-11之一所述的诊断元件，其特征在于，
所述能量吸收剂是选自花青染料的疏水染料，尤其是隐花青、吲哚三羰花青(C7)、氧杂羰花青(C3)，碘化频哪氰醇、硫杂羰花青(C3)、硫杂二羰花青(C5)和方酸菁染料，尤其是方酸菁染料III。
13.根据权利要求9-12之一所述的诊断元件，其特征在于，
所述指示剂分析物被封装在聚合物基质中。
14.根据权利要求1-13之一所述的诊断元件，其特征在于，
所述指示剂分析物包含光化学或/和电化学可裂解的保护基。
15.根据权利要求1-14之一所述的诊断元件，其特征在于，
所述诊断元件被设计成测试带、测试盘、测试垫、测试条或测试条卷盘。
16.根据权利要求1-15之一所述的诊断元件，其特征在于，
它被设计成用于测定几种分析物。
17.分析测量装置，其包含根据权利要求1-16之一所述的诊断元件。
18.用于测定分析物的方法，所述方法包括下述步骤：
（a）使所述分析物与根据权利要求1-16之一所述的诊断元件接触，和
（b）测定所述分析物的存在或/和量。
19.用于校正由分析物产生的信号的方法，所述方法包括下述步骤：
（a）将根据权利要求1-16之一所述的诊断元件引入分析测量装置中，
（b）通过使所述分析物与所述诊断元件接触，在所述分析测量装置中产生第一个可检测的信号，
（c）通过释放出在所述诊断元件中的指示剂分析物，在所述分析测量装置中产生第二个可检测的信号，和
（d）使用在步骤（c）中产生的信号，校正在步骤（b）中产生的信号。
20.用于检查分析测量装置的检测光学部件的方法，所述方法包括下述步骤：
（a）将根据权利要求1-16之一所述的诊断元件引入分析测量装置中，
（b）通过释放出在所述诊断元件中的指示剂分析物，在所述分析测量装置中产生可检测的信号，和
（c）用参照信号校正在步骤（b）中产生的信号。
21.用于控释试剂的体系，所述体系包括：
（a）载体，其包含所述试剂和所述试剂的单独的反应体系，其中所述试剂以对于所述反应体系的反应来说的不可使用的可释放形式存在，且可以在给定的条件下释放，和
（b）用于释放在所述载体上的所述试剂的方式。
22.根据权利要求21所述的体系，其特征在于，
所述试剂被封装在可溶解的基质中，通过可溶解的屏障层与所述反应体系分离，或/和包含化学保护基。
23.根据权利要求21或22所述的体系作为开关元件的用途。
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