CN101329336A - 甘油诊断/测定试剂盒及甘油的浓度测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用酶比色法技术的甘油诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定甘油浓度的方法原理、试剂的组成及成分，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：缓冲液、辅酶、甘油脱氢酶及稳定剂；通过将样品与试剂按一定的体积比混合，使之发生一系列的酶促反应，再将反应物置于紫外/可见光分析仪下，检测主波长340nm处吸光度上升的程度/速度，从而测算出甘油的浓度大小。
Description
技术领域
本发明涉及一种甘油诊断/测定试剂盒，同时本发明还涉及测定甘油浓度的方法，属于医学/食品/环境检验测定技术领域。
背景技术
甘油又名丙三醇，是一种无色、无嗅、味甘的粘稠液体。甘油大量用作化工原料，用于制造合成树脂、塑料、油漆、硝酸甘油、油脂和蜂蜡等，还用于制药、香料、化妆品、卫生用品等工业中，甘油是食品加工业中通常使用的甜味剂和保湿剂，大多出现在运动食品和代乳品中。
欧盟的一个检测游离甘油含量的标准是EN 14106，这个标准首先对生物柴油进行萃取，经过萃取后进行气相色谱分析，到目前为止，已经有几种气相色谱分析方法被报道过。Lozano et al.(1996)用带有脉冲安培检测器的高效液相色谱来检测从甲酯或乙酯中萃取出来的甘油溶液。
其它的检测游离甘油含量的色谱和非色谱测试方法有：Greenhill建议了一种酶法测试的替代方法，甘油经过酶转化后生成的H2O2用作形成醌亚胺色素的转化物，而色素的浓度可以通过光谱法进行检测。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：提出一种利用酶比色法(EnzymaticColorimetric Method)技术，计量/连续监测还原型烟酰胺辅酶(还原型辅酶)在340nm波长处吸光度的变化，得以测定甘油浓度的方法，同时，本发明还将给出用以实现该方法的甘油诊断/测定试剂盒，采用该试剂不仅可以在紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪上进行甘油浓度测定，而且测定速度快、准确度高，因而可以得到切实的推广应用。
本发明甘油浓度测定方法原理如下：
甘油+辅酶甘油脱氢酶甘油酸+还原型辅酶
这种方法应用甘油脱氢酶(glycerol dehydrogenase；EC 1.1.1.6；EC1.1.1.72；EC 1.1.1.156；EC 1.1.99.22)酶促反应速率比色法/终点法。甘油脱氢酶酶解甘油反应将辅酶(在340nm处没有吸收峰)还原成为还原型辅酶(在340nm处有吸收峰)，从而得以测定还原型辅酶在340nm处吸光度上升的程度/速度，通过测量340nm处吸光度上升的程度/速度，可以测算甘油的浓度大小。
实验表明，从测定结果的准确性和配制成本的经济性两方面综合考虑，无论是单剂、双剂，如下成分关系的本发明甘油诊断/测定试剂盒较为理想：
缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
辅酶 3mmol/L
甘油脱氢酶 10000U/L
本发明的甘油诊断/测定试剂盒可以是单剂，包括：
缓冲液、稳定剂、辅酶、甘油脱氢酶。
试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
也可以将上述单剂试剂配成如下双剂试剂：
试剂1
缓冲液、稳定剂、辅酶。
试剂2
缓冲液、稳定剂、甘油脱氢酶。
辅酶、甘油脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
无论是单剂、双剂，本发明测定甘油浓度的方法，其辅酶可以是NADP+、NAD+或thio-NAD+中的一种。
具体实施方式
下面结合实施例子对本发明作进一步的说明。
实施例一
本实施例的甘油诊断/测定试剂为单试剂，包括：
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 500mmol/L
辅酶 3mmol/L
甘油脱氢酶 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入纯净水，复溶后使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甘油样品与试剂的体积比例为1/25，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出甘油的浓度大小。
实施例二
本实施例的甘油诊断/测定试剂为双试剂，包括：
试剂1
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
辅酶 3mmol/L
试剂2
三(羧甲基)氨基甲烷-盐酸缓冲液 100mmol/L
稳定剂 50mmol/L
甘油脱氢酶 10000U/L
试剂全部溶解配好后，分装入瓶，制成液体双试剂，可以直接使用。
在全自动生化分析仪上设定：温度37℃，反应时间10分钟，起始吸光度≤0.1，测试主波长340nm，测试副波长405nm，被测甘油样品与试剂1、试剂2的体积比例为2/20/5，反应方向为正反应(上升反应)，延迟时间大约0分钟左右，检测时间5分钟左右。
加入样品和试剂后，使之混合并发生反应，最终将反应物置于生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，从而测算出甘油的浓度大小。
申请人经过实验验证，采用以上发明内容中记载的其他各种还原型色原体组合均能达到本发明的目的，鉴于测定步骤等情况与以上实施例类同，不另一一例举。
总之，实验证明，采用本发明的测定方法完全可以通过一般生化分析仪器得出所需的测定结果，并且灵敏度高、精确度好，便于推广应用。
Claims (5)
1.一种酶比色法的甘油的浓度测定方法，其方法原理如下：
甘油+辅酶 甘油脱氢酶 甘油酸+还原型辅酶
将最终反应物置于紫外/可见光分析仪或半、全自动生化分析仪下，检测主波长340nm吸光度上升的程度/速度，测算出甘油的浓度大小测定结果。
2.一种甘油诊断/测定试剂盒，主要成分包括：
缓冲液 20-500mmol/L
稳定剂 1-4000mmol/L
辅酶 1-6mmol/L
甘油脱氢酶 1000-80000U/L
其特征在于：试剂盒可以是干粉状态，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液体试剂，直接使用。
3.根据权利要求2所述甘油诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、甘油脱氢酶、组成单剂试剂。
4.根据权利要求2所述甘油诊断/测定试剂盒，其特征在于：
由缓冲液、稳定剂、辅酶、甘油脱氢酶组成双剂试剂；试剂1，由缓冲液、稳定剂、辅酶组成；试剂2，由缓冲液、稳定剂、甘油脱氢酶组成。辅酶、甘油脱氢酶在试剂1或试剂2中的位置可以不限。
5.根据权利要求2所述甘油诊断/测定试剂盒，其特征在于：还包括稳定剂1-4000mmol/L或0.1％-100％体积比。所述稳定剂为：硫酸铵(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐剂中的至少一种。
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| CN107356544A (zh) * | 2017-07-19 | 2017-11-17 | 王贤俊 | 一种脂肪酶检测试剂盒 |
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