ES2305771T3 - Diagnostico y terapeutica de enfermedades asociadas a una aminopeptidasa especifica a leucil insensible a la puromicina (pils). - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de selección in vitro de agentes terapéuticos útil en el tratamiento de una enfermedad comprendida en un grupo de enfermedades constituidas por insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias y aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero que comprende las etapas de (i) determinar la actividad de un polipéptido de PILS a una cierta concentración de un compuesto de ensayo o en la ausencia de dicho compuesto de ensayo, (ii) determinar la actividad de dicho polipéptido a una concentración diferente de dicho compuesto de ensayo.

Description

Diagnóstico y terapéutica de enfermedades asociadas a una aminopeptidasa específica a leucil insensible a la puromicina (PILS).

Campo técnico de la invención

La presente invención está en el campo de la biología molecular, más particularmente, la presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleico y secuencias de aminoácidos de PILS humana y su regulación para el tratamiento de trastornos cardiovasculares, trastornos del sistema endocrino y de hormonas, trastornos metabólicos, enfermedades gastrointestinales y del hígado, enfermedades inflamatorias, enfermedades hematológicas, enfermedades respiratorias, trastornos neurológicos y trastornos urológicos en mamíferos.

Antecedentes de la invención

Las proteasas juegan un papel en los procesos controlados cuidadosamente, tal como la coagulación de sangre, fibrinolisis, activación complementaria, fertilización, y producción de hormonas. Estas enzimas también se usan en una diversidad de contextos diagnósticos, terapéuticos, e industriales. PILS es un miembro del grupo de enzimas proteasas Hattori et al. (1999), Hattori et al. (2000), Saric et al. (2002), York et al. (2002), Akada et al. (2002), documento WO 200164856, WO 200190304, WO 200122920, WO 200073454.

Las proteasas se reconocieron muy temprano en la historia de la bioquímica. En el siglo diecinueve, un primer foco de investigación fue sobre las proteasas digestivas, como pepsina y tripsina. Las proteasas pertenecen sistemáticamente a las C-N Hidrolasas. Más específicamente las proteasas catalizan la escisión hiprolítica de un enlace peptídico y por lo tanto se llaman también peptidasas.

Las proteasas se pueden clasificar de acuerdo con varios criterios, por ejemplo, mediante localización. Las proteasas digestivas se localizan en el tracto gastrointestinal. Estas proteasas son responsables de la digestión de las proteínas de alimentos.

Las peptidasas localizadas extracelularmente en la sangre u otros compartimentos extracelulares del cuerpo juegan a menudo papeles reguladores en los procesos del tipo por ejemplo coagulación de la sangre, fibrinolisis, o activación de constituyentes complementarios.

Las proteasas localizadas intracelularmente muestran una amplia diversidad de aspectos. Se encuentran en compartimentos como el ER, el aparato de Golgi, o los lisosomas. Sus funciones incluyen por ejemplo la activación de hormonas peptídicas, proteolisis mediada por ubiquitina, entre otros.

Las proteasas se clasifican de manera más común de acuerdo con su mecanismo de acción, con sus grupos activos específicos que están presentes en el centro activo. Se pueden distinguir los siguientes grupos:

1. Serina-peptidasas, 2. cisteína-peptidasas, 3. aspartil- o peptidasas ácidas, 4. metalo-peptidasas, o 5. peptidasas con mecanismos de reacción todavía no claras.

Serina peptidasas

Las serina proteasas muestran una serina en el sitio catalítico que forma un intermedio del éster covalente durante la ruta de reacción catalítica mediante un ataque nucleófilo sobre el carbono carboxi del enlace peptídico. En el sitio activo de las serina proteasas se encuentra una triada catalítica constituida por un aspartato, una histidina y la serina anteriormente mencionada. Esta triada funciona en el mecanismo de reacción como un sistema regulador de
carga.

A la gran familia serina proteasa pertenecen, por ejemplo, las enzimas digestivas tripsina y quimotripsina, componentes de la cascada complementaria, las enzimas implicadas en la cascada de coagulación de sangre, así como las enzimas que funcionan en la degradación, reconstrucción y mantenimiento de constituyentes de la matriz extra-
celular.

Una característica de la familia de la serina proteasa es el amplio intervalo de la especificidad del sustrato. Los miembros del subgrupo de triptasa escinden después la arginina o lisina, quimasas después de fenilalanina o leucina, aspasas después de aspartato, metasas después de metionina y serasas después de serina.

Cisteína proteasas

Durante la reacción catalítica las cisteína proteasas un intermedio de tioéster covalente es forma mediante un ataque nucleófilo de la cisteína sobre el carbono carboxi del enlace peptídico. De manera similar a las serina peptidasas una triada catalítica constituida por la cisteína, una histidina y y una asparagina se encuentra que funciona como un sistema regulador de carga para facilitar la formación del intermedio tioéster.

Los miembros de la familia de la Cisteína proteasa tienen papeles en muchos procesos celulares diferentes, por ejemplo, procesamiento de los precursores o degradación intracelular. Los ejemplos de cisteína proteasas incluyen catepsina lisosomales, y calpaínas citosólicas.

Aspartil- o peptidasa ácida

El sitio catalítico de las aspartil proteasas se compone de restos de aspartato. Al pH óptimo de las aspartil proteasas (2 - 3) uno de los grupos carboxi de aspartilo se ioniza y la otro es neutro, que es importante para que se produzca la reacción catalítica. Los ejemplos de las aspartil proteasas son pepsinas A y C gástricas, quimosina, así como la renina mamaria.

Metalo-peptidasas

Las Metalo-peptidasas son proteasas, cuya actividad proteolítica depende de la presencia de cationes divalentes en el centro activo. Los ejemplos de los miembros de esta clase son la carboxipeptidasa A, que representa una enzima digestiva pancreática, las enzimas consersoras de la angiotensina (ACE), que son responsables de de la conversión de la angiotensina I en angiotensina II, o las Metaloprotienasas de Matriz Extracelulares.

En resumen, un número enorme de proteasas juegan un papel central en diversos procesos celulares e intracelulares importantes. Además, el valor como dianas farmacéuticas se ha probado para varias proteasas. Por ejemplo, la proteasa codificada por el genoma de VIH se usa como una diana para los fármacos para el tratamiento de las infecciones de VIH, el complejo de proteasom se ha descubierto como una diana anticáncer, o las Cis-proteasas se han implementado como dianas de fármacos para los trastornos inflamatorios. Los inhibidores selectivos se han desarrollado como agentes terapéuticos para enfermedades tal como VIH. De este modo, la identificación de implicaciones patológicas adicionales de las especies de proteasa y sus variantes de ayuste puede conducir al desarrollo de inhibidores o moduladores específicos, o sugieren nuevas utilidades para los compuestos conocidos que afectan a las proteasas. A su vez se proporcionarán planteamientos farmacológicas para tratar enfermedades y afecciones en las que están implicadas las actividades de las proteasas. Estas enfermedades pueden incluir, pero no se limitan a, infecciones tales como infecciones bacterianas, fúngicas, protozoarias, y víricas, particularmente las provocadas por virus de VIH, cánceres, alergias que incluyen asma, enfermedades cardiovasculares que incluyen insuficiencia cardiaca aguda, hipotensión, hipertensión, angina de pecho, infarto de miocardio, enfermedades hematológicas, enfermedades genito urinarias que incluyen incontinencia urinaria e hiperplasia de próstata benigna, osteoporosis, y trastornos periféricos y del sistema nervioso central incluyendo dolor, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson. Como consideraciones, las enfermedades cardiovasculares, Sierevogel et al (2003) describe las metaloproteinasas de matriz como dianas potenciales para la selección de fármacos, ya que están implicadas en la descomposición del tejido conectivo en la fase de remodelación que conduce a la fibrosis.

Tecnología Taiman/perfil de expresión

TaqMan es una técnica desarrollada recientemente, en la que la liberación de un tinte indicador fluorescente de una sonda de hibridación en tiempo real durante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es proporcional a la acumulación del producto de la PCR. La cuantificación se basa en la parte temprana, lineal de la reacción, y mediante la determinación del ciclo de umbral (CT), en el que el fondo anterior de fluorescencia se detecta primero.

Las tecnologías de expresión génica pueden ser útiles en varias áreas del descubrimiento y desarrollo de fármacos, tales como identificación de diana, optimización de la dirección, e identificación del mecanismo de acción. La tecnología TaqMan se puede usar para comparar las diferencias entre los perfiles de expresión del tejido normal y tejido enfermo. El perfil de expresión se ha usado para identificar genes, que se regulan hacia arriba y hacia abajo en una diversidad de enfermedades. Una aplicación de interés del perfil de expresión es el control temporal de los cambios en la expresión génica durante la progresión de la enfermedad y tratamiento de fármacos o en pacientes frente a individuos sanos. La premisa en este planteamiento es que los cambios en el patrón de la expresión génica en respuesta a los estímulos fisiológicos o ambientales (por ejemplo, fármacos) pueden servir como indicaciones indirectas acerca de los genes que provocan enfermedades o dianas de fármacos. Además, los efectos de los fármacos con la eficacia establecida sobre los patrones de expresión génica global pueden proporcionar un indicador, o una marca genética, contra la que se puede comparar un nuevo candidato de fármaco.

PILS

La secuencia de nucleótidos de PILS es accesible en las bases de datos públicas mediante el número de acceso NM_016442 y se proporciona en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos de PILS se muestra en la SEQ ID NO: 2.

Las aminopeptidasas juegan un papel en el metabolismo de varios péptidos que pueden estar implicados en la presión sanguínea y la patogénesis de al hipertensión esencial. PILS es un miembro de la familia de M1 de las metalopeptidasas de zinc.

Mediante investigación una base de datos EST para las secuencias similares a PILS, Hattori et al. (1999) se obtuvo un ADNc de longitud completa que codifica PILS. La proteína de 941 aminoácidos contiene deducida contiene un péptido de señal N-terminal, sitios de N-glicosilación 5 potencial, un dominio de expansión de membrana potencial, y un motivo de unión a cinc. El análisis de transferencia de Northern reveló la expresión de las transcripciones 3,6- y 5,1- kb en todos los tejidos excepto en el cerebro, donde solamente se expresó el ARNm de 5,1 kb. Se expresó una transcripción de 5,6 kb en bazo y ovario. Hattori et al. (1999) identificaron una variante de ayuste de PILS que codifica una proteína con 948 residuos. El análisis de transferencia de Western mostró la expresión de la proteína citoplásmica de aproximadamente 100-kD, cerca del tamaño predicho. El análisis funcional indicó una preferencia para los sustratos de leucina.

Mediante la expresión de PILS recombinante en células de hámster chino, Hattori et al. (2000) se mostró que PILS es una proteína monómera con una masa molecular de 120 kD que hidroliza una diversidad de péptidos bioactivos, que incluyen la angiotensina II. PILS se expresó en gran medida en tejidos humanos, incluyendo el córtex del riñón, donde se localiza la kalicreína de tejidos. Los autores sugieren que PILS juega un papel en la regulación de la presión sanguínea mediante la inactivación de la angiotensina II y/o generación de de la braquinidina en el riñón.

Saric et al. (2002) y York et al. (2002) determinaron que la PILS corta los péptidos mayores que 10 restos de longitud, pero economiza y potencia la producción de los péptidos de 8 restos generados o bien en el ER o citosol. PILS también se encontró que cortan aproximadamente la mitad de los péptidos de nueve restos, reduciendo por lo tanto el suministro de péptidos antigénicos en la ausencia de la expresión de IFNG, que induce la expresión de PILS y en cambio provoca que los proteasomas producen más precursores antigénicos extendidos N-terminal y péptidos de 9 restos.

Estos resultados de los experimentos de Akada et al. (2002) sugieren que mPILSAP está implicado en la activación de integrinas endoteliales.

La PILS está publicada en los documentos WO 200164856, WO 200190304, WO 200122920 y WO 200073454. La PILS muestra la mayor homología (50%) con la aminopeptidasa como se muestra en el ejemplo 1.

La aminopeptidasa PILS se describe como una proteína de membrana integral de tipo II integral con un motivo catalítico de metaloproteasa de cinc (Cui et al. 2002). Se mostró que la PILS asociada a membrana se une in vivo a TNFR1 (receptor 1 de TNF) y está implicado en vertido de TNFR1 (Cui et al. 2002). Los miembros de la familia de la metaloproteasa están implicados en el cambio de la matriz extracelular. (Tyagi, 1997). Ambos procesos son mecanismos bien conocidos para la función cardiovascular.

Sumario de la invención

La invención se refiere a asociaciones de enfermedades novedosas de polipéptidos y polinucleótidos de PILS. La invención también se refiere a procedimientos novedosos de selección de agentes terapéuticos para el tratamiento de insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias, aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas para el tratamiento de insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias, aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero que comprende un polipéptido de PILS, un polinucleótido de PILS, o, un anticuerpo, una ribozima o un ligonucleótido no codificante que regula la actividad del polipéptido PILS. La invención además comprende procedimientos de diagnosis de aterosclerosis en arteria coronaria o aorta en un mamífero.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 muestra la secuencia de un polinucleótido de PILS (SEQ ID NO: 1).

La Fig. 2 muestra la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de PILS (SEQ ID NO: 2).

La Fig. 3 muestra la secuencia de nucleótidos de un cebador útil para la invención (SEQ ID NO: 3).

La Fig. 4 muestra la secuencia de nucleótidos de un cebador útil para la invención (SEQ ID NO: 4).

La Fig. 5 muestra una secuencia de nucleótidos útil como una sonda para detectar proteínas de la invención (SEQ ID NO: 5).

Descripción detallada de la invención Definición de los términos

Un "oligonucleótido" es un tramo de restos de nucleótidos que tiene un número suficiente de bases a usar como un oligómero, amplímero o sonda en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos se preparan a partir de una secuencia de ADNc o del genoma y se usan para amplificar, revelar, o confirmar la presencia de un ADN o ARN similar en una célula o tejido particular. Los oligonucleótidos u oligómeros comprenden porciones de una secuencia de ADN que tiene al menos aproximadamente 10 nucleótidos y como mucho aproximadamente 35 nucleótidos, preferiblemente aproximadamente 25 nucleótidos.

"Las sondas" se pueden derivar de ácidos de origen natural o recombinantes de una sola o doble cadena o se pueden sintetizar químicamente. Son útiles en la detección de la presencia de secuencias idénticas o similares. Tales sondas se pueden marcar con moléculas indicadoras usando traducción nick, reacción de llenado de Klenow, PCR u otros procedimientos bien conocidos en la técnica. Las sondas de ácido nucleico se pueden usar en hibridaciones Southern, Northern o in situ para determinar si ADN o ARN que codifica una cierta proteína está presente en un tipo, tejido, u órgano celular.

Un "fragmento de un polinucleótido" es un ácido nucleico que comprende toda o cualquier parte de de una molécula de nucleótido dada, teniendo el fragmento menos nucleótidos que aproximadamente 6 kb, preferiblemente menos que aproximadamente 1 kb.

"Las moléculas indicadoras" son radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, o cromogénicos que se asocian a una molécula de nucleótidos o aminoácidos particular, estableciendo por lo tanto la presencia de una cierta secuencia, o permitiendo la cuantificación de una cierta secuencia.

Moléculas "quiméricas" se pueden construir mediante la introducción de toda o parte de la secuencia de nucleótidos usada en esta invención en un vector que contiene la secuencia de ácido nucleico adicional que se pudiera esperar que cambiara cualquiera o varios de las siguientes características de PILS: localización celular, distribución, afinidades de unión a ligandos, afinidades intercadena, tasa de degradación/cambio, señalización, etc.

"Activo", con respecto a un polipéptido de PILS, se refiere a aquellas formas, fragmentos, o dominios de un polipéptido de PILS.

"Polipéptido de un polipéptido de PILS de origen natural" se refiere a un polipéptido producido por las células que no se han modificado por ingeniería genética y específicamente contempla diversos polipéptidos que surgen de modificaciones después de la traducción del polipéptido que incluye pero no se limita a acetilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación.

"Derivado" se refiere a polipéptidos que se han modificado químicamente mediante técnicas tales como ubiquitinación, marcado (véase anteriormente), pegilación (derivación con polietilenglicol), e inserción o sustitución química de aminoácidos tales como ornitina que no se produce normalmente en proteínas humanas.

"Sustituciones de aminoácidos conservadoras" se produce del reemplazo de un aminoácido con otro que tiene similares propiedades estructurales y/o químicas, tales como el reemplazo de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, o una treonina con una serina.

"Inserciones" o "supresiones" están típicamente en el intervalo de 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar de manera experimental mediante la producción del péptido sintéticamente mientras se realizan sistemáticamente inserciones, supresiones, o sustituciones de nucleótidos en la secuencia que usa técnicas de ADN recombinantes.

Una "secuencia señal" o "secuencia guía" se puede usar, cuando se desee, para dirigir el polipéptido a través de una membrana de una célula. Tal secuencia puede estar presente de manera natural sobre los polipéptidos usados en la presente invención o proporcionarse a partir de fuentes heterólogas mediante técnicas de ADN recombinante.

Un "oligopéptido" es un tramo corto de restos de aminoácidos y se puede expresar a partir de un oligonucleótido. Los oligonucleótidos comprenden un tramo de restos de aminoácidos de la menos 3, 5, 10 aminoácidos y la mayoría 10, 15, 25 amino aminoácidos, típicamente al menos 9 a 13 aminoácidos, y de suficiente longitud para mostrar actividad biológica y/o antigénica.

"Inhibidor" es cualquier sustrato que retrasa o previene una reacción o respuesta química o fisiológica. Los inhibidores comunes incluyen pero no se limitan a moléculas no codificantes, anticuerpos, y anticuerpos.

"Expresión estándar" es una medida cualitativa o cuantitativa para comparación. Se basa en un número estadísticamente apropiado de muestras normales y se crea para usar como una base de comparación cuando se realizan ensayos diagnósticos, se ensayan pruebas clínicas, o se siguen perfiles de tratamiento de pacientes.

"Animal" como se usa en el presente documento se puede definir para que incluyan especies humanas, domésticas (por ejemplo, vacas, caballos, ovejas, etc.) o de ensayo (por ejemplo, ratón, rata, conejo, etc.).

Un "polinucleótido de PILS", como se usa en la invención, se entenderá que es una molécula de ácido nucleico seleccionado entre un grupo constituido por

(i)

moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2,

(ii)

moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 1,

(iii)

moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia de SEQ ID NO: 1,

(iv)

moléculas de ácido nucleico cuya hebra complementaria se hibrida en condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico de (i), (ii), o (iii); y

(v)

moléculas de ácido nucleico cuya secuencia se diferencia de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (iii) debido a la generación del código genético;

en el que el polipéptido codificado por dicha molécula de ácido nucleico tiene actividad PILS.

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Un "polipéptido de PILS ", usado en la invención, se entenderá que es un polipéptido seleccionado entre el grupo constituido por

(i)

polipéptidos que tienen la secuencia de SEQ ID NO: 2,

(ii)

polipéptidos que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 2,

(iii)

polipéptidos codificados por los polinucleótidos de PILS; y

(iv)

polipéptidos que muestran al menos 99%, 98%, 95%, 90%, u 80% de homología con el polipéptido de (i), (ii), o (iii);

en el que el polipéptido tiene actividad PILS.

Las secuencias de nucleótidos que codifican una PILS (o su complemento) tienen numerosas aplicaciones en las técnicas conocidas por los expertos en la técnica de la biología molecular. Estas técnicas incluyen el uso como sondas de hibridación, uso en la construcción de oligómeros para PCR, uso para el mapeo de de cromosomas y genes, uso en la producción recombinante de PILS, y uso en la generación de ADN o ARN no codificante, sus análogos y similares. Los usos de nucleótidos que codifican una PILS descrita en el presente documento son ejemplares de las técnicas conocidas y no se pretenden que limiten el uso en cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica. Además, las secuencias de nucleótidos descritos en el presente documento se pueden usar en las técnicas de biología molecular que todavía no se han desarrollado, proporcionaron las nuevas técnicas que dependen de las propiedades de las secuencias de nucleótidos que se conocen actualmente, por ejemplo, el código genético triplete, interacciones del par de bases específicas, etc.

Los expertos en la técnica apreciarán que como resultado de la degeneración del código genético, se puede producir una multitud de secuencias de nucleótidos que codifica PILS. Alguna de estas solamente tendrán una hilología mínima con la secuencia de nucleótidos de PILS conocidas y de origen natural de PILS. La descripción ha contemplado específicamente cada una y toda posible variación de secuencia de nucleótidos que se podrían preparar mediante selección de las combinaciones basándose en las posibles elecciones de codón. Estas combinaciones se realizan de acuerdo con el código genético triplete estándar cuando se aplica a la secuencia de nucleótidos de la PILS de origen natural, y todas estas variaciones se han de considerar como se describen específicamente.

Aunque las secuencias de nucleótidos que codifican una PILS, sus derivados o sus variantes son capaces preferiblemente de hibridación con la secuencia de, sus derivados o sus variantes son capaces preferiblemente de hibridarse a la secuencia de nucleótidos del polinucleótido de PILS de origen natural en condiciones rigurosas, puede ser ventajoso producir secuencias de nucleótidos que codifican el polinucleótido de PILS o sus derivados que poseen un uso de codón sustancialmente diferente. Los codones se pueden seleccionar para incrementar la velocidad a la que se produce la expresión del péptido en un huésped de procariótico o eucariótico particular de acuerdo con la frecuencia con la que se utilizan codones particulares por el huésped. Otras razones para alterar de manera sustancial la secuencia de de nucleótidos que codifica un polipéptido de PILS y/o sus derivados sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada incluyen la producción de transcripciones de ARN que tienen propiedades más deseables, tal como una mayor semivida, que las transcripciones producidas a partir de la secuencia de origen natural.

Las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de PILS se puede unir a una diversidad de otras secuencias de nucleótidos mediante técnicas de ADN recombinante establecidas. Las secuencias de nucleótidos útiles para unirse a los polinucleótidos de PILS incluyen cualquier variedad de vectores de clonación tales como plásmidos, cósmicos, derivados del fago lambda, fagémidos, y similares. Los vectores de interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas, vectores de secuenciación, etc. En general, los vectores de interés pueden contener un origen de replicación funcional en al menos un organismo, sitios sensibles de endonucleasa de restricción convenientes, y marcadores seleccionables para uno o más sistemas de células huésped.

Otro aspecto del objeto presente es proporcionar sondas de hibridación específicas de PILS capaces de hibridarse con las secuencias de nucleótidos de origen natural que codifican PILS. Tales sondas también se pueden usar para la detección de secuencias similares que codifican proteasa y deben preferiblemente mostrar al menos una identidad de nucleótidos de 40% con los polinucleótidos de PILS. Las sondas de hibridación del sujeto se pueden derivar de la secuencia de nucleótidos presentada como la SEQ ID NO: 1 o a partir de las secuencias genómicas que incluyen promotor, potenciadores o intrones del gen nativo. Las sondas de hibridación se pueden marcar mediante una diversidad de moléculas indicadoras usando técnicas bien conocidas en la técnica.

Se reconocerá que muchos análogos de supresión o de mutación de los polinucleótidos de PILS serán sondas de hibridación eficaces para los polinucleótidos de PILS. De acuerdo con lo anterior, la invención se refiere a secuencias de nucleótidos que se hibridan con tales secuencias de ácido nucleico que codifica PILS en condiciones riguro-
sas.

"Condiciones rigurosas" se refieren a condiciones que permiten la hibridación de secuencias de ácidos nucleicos relacionadas sustancialmente. Por ejemplo, tales condiciones en general permitirán la hibridación de secuencia con al menos 85% de identidad de secuencia, preferiblemente con al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia, más preferiblemente con al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia. Las condiciones y sondas de hibridación se pueden ajustar en formas bien caracterizadas para lograr la hibridación selectiva de sondas derivadas humanas. Las condiciones rigurosas, dentro del significado de la invención son 65ºC en un tampón que contiene 1 mM de EDTA, 0,5 M de NaHPO_{4} (pH 7,2), 7% (p/v) de SDS.

Las moléculas de ácido nucleico que se hibridarán a los polinucleótidos de PILS en condiciones rigurosas se pueden identificar de manera funcional. Sin limitación, los ejemplos de los usos de las sondas de hibridación incluyen: usos histoquímicas tales como tejidos de identificación que expresan PILS; medición de los niveles de ARNm, por ejemplo para identificar un tipo de tejido de muestras o para identificar las células que expresan niveles anormales de PILS; y para identificar polimorfismos de PILS.

La PCR proporciona usos adicionales para los oligonucleótidos basándose en las secuencias de nucleótidos que codifica PILS. Tales sondas usadas en PCR pueden ser de origen recombinante, sintetizarse químicamente, o una mezcla de ambos. Los oligómeros pueden comprender secuencias de nucleótidos discretas empleadas en condiciones optimas para la identificación de PILS en los tejidos específicos o uso diagnóstico. Los mismos dos oligómeros, o incluso una combinación degenerada de oligómeros se puede empelar en condiciones menos rigurosas para la identificación de los ADN o ARN estrechamente relacionados.

Las reglas para diseñar los cebadores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se establecen ahora, como se revisa por los protocolos de la PCR. Los cebadores degenerados, es decir, las preparaciones de los cebadores que son heterogéneos en las localizaciones de secuencia proporcionadas, se pueden diseñar para amplificar las secuencias de ácidos nucleicos que son altamente homólogas a, pero no idénticas a PILS. Las estrategias están ahora disponibles y permiten que solamente uno de los cebadores se requiera para hibridarse de manera específica con una secuencia conocida. Por ejemplo, se pueden ligar cebadores de ácido nucleico apropiados al ácido nucleico buscado para que se amplifique y proporcionarla pareja de hibridación para uno de los cebadores. De esta forma uno de los cebadores necesita basarse en la secuencia del ácido nucleico buscado para amplificar.

Los procedimientos de la PCR para amplificar ácido nucleico utilizarán al menos dos cebadores. Uno de estos cebadores será capaz de hibridarse a una primera hebra del ácido nucleico a amplificar y de cebar la síntesis de ácido nucleico dirigida por enzimas en una primera dirección. La otra será capaz de de hibridarse a la secuencia recíproca de la primera hebra (si la secuencia a amplificar es de una sola cadena, esta secuencia inicialmente será hipotética, pero se sintetizará en el primer ciclo de amplificación) y de cebado de la síntesis de ácido nucleico a partir de esa hebra en la dirección opuesta a la primera dirección y hacia el sitio de hibridación para el primer cebador. Las condiciones para llevar a cabo tales amplificaciones, particularmente en condiciones de hibridación rigurosas preferidas, son bien conocidas.

Otros medios de producción de sondas de hibridación específica para PILS incluyen la clonación de secuencias de ácidos nucleicos que codifican PILS o derivados de PILS en vectores para la amplificación de sondas de ARNm. Tales vectores se conocen en la técnica, están comercialmente disponibles y se pueden usar para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de de la ARN polimerasa adecuada como la T7 o SP6 ARN polimerasa y las moléculas indicadoras apropiadas.

Es posible producir una secuencia de ADN, o sus partes, completamente o mediante química sintética. Después de la síntesis, la secuencia de ácido nucleico se puede insertar en cualquiera de los vectores de ADN disponibles y sus respectivas células huésped usando las técnicas que se conocen bien en la técnica. Además, se puede usar química sintética para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos. Como alternativa, una porción de la secuencia en la que una mutación se desea que pueda sintetizar y se recombine con una parte mayor de una secuencia existente genómica o recombinante.

Los polinucleótidos de PILS se pueden usar para producir oligo- o polipéptido usando procedimientos bien conocidos de la tecnología de ADN recombinante. El oligopéptido se puede expresar en una diversidad de células huésped, o bien procarióticas o eucarióticas. Las células huésped pueden ser a partir de las mismas especies a partir de las cuales la secuencia de nucleótidos se derivó o se realizó a partir de una especie diferente. Las ventajas de producción de un oligonucleótido mediante la tecnología de ADN recombinante incluyen la obtención de cantidades adecuadas de la proteína para la purificación y la disponibilidad de los procedimientos de purificación simplificados.

Determinación cuantitativa de ácidos nucleicos

Una etapa importante en el análisis genético molecular de enfermedad humana a menudo es la enumeración de del número de copias de un ácido nucleico o la expresión relativa de un gen en tejidos particulares.

Están disponibles actualmente diferentes planteamientos para realizar las determinaciones cuantitativas de ácidos nucleicos. Las técnicas basadas en cromosomas, tales como hibridación genómica comparativa (CGH) y fluorescente in situ (FISH) facilitan los esfuerzos para localizar de manera citogenética las regiones genómicas que están alteradas en las células tumorales. Las regiones de la alteración genómica se pueden estrechar además usando la pérdida de análisis heterocigótico (LOH), en las que el ADN patológico se analiza y se compara con el ADN normal para la pérdida de un marcador polimórfico heterocigótico. Los primeros experimentos usaban polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) [Johnson, (1989)], o ADN de minisatélites hipervariables [Barnes, 2000]. En los años recientes LOH se ha formado previamente usando la amplificación por PCR de marcadores microsatélite y electroforesis del marcado radiactivamente [Jeffreys, (1985)] o productos de PCR marcados fluorescentemente [Weber, (1990)] y se comparan entre los ADN normales y patológicos

También se ha desarrollado numerosos procedimientos para cuantificar ácidos nucleicos [Gergen, (1992)]. Más recientemente, se han desarrollado los procedimientos de PCR y RT-PCR que son capaces de medir la cantidad de un ácido nucleico en una muestra. Un planteamiento, por ejemplo, mide la cantidad de producto de la PCR en la fase logarítmica de la reacción antes de la formación de las mesetas de los productos de reacción [Thomas, (1980)].

Una secuencia génica contenida en todas las muestras a la cantidad relativamente constante se utiliza de manera típica para normalización eficaz de amplificación de la muestra. Sin embargo este planteamiento, tiene varios inconvenientes. El procedimiento requiere que cada muestra tenga iguales cantidades de entrada del ácido nucleico y que la eficacia de amplificación entre las entre las muestras sea idéntica hasta el tiempo de análisis. Además, es difícil de usar los procedimientos convencionales de la cuantificación de la PCR tal como electroforesis de gel o hibridación de captura de placa para determinar que todas las muestras están de hecho analizadas durante la fase logarítmica de la reacción como se requiere por el procedimiento.

Otro procedimiento llamado (QC)-PCR competitivo cuantitativo, como el nombre implica, depende de la inclusión de un competidor de control interno en cada repetición, [Piatak, (1993), BioTechniques]. La eficacia de cada repetición reacción se normaliza con el competidor interno. Una cantidad conocida del competidor interno se añade típicamente a cada muestra. El producto de la PCR diana desconocido se compara con el producto de la PCR competidor conocido para obtener una cuantificación relativa. Una dificultad con este planteamiento general supone el desarrollo de un control interno que amplifica la misma eficacia que las moléculas diana.

Ensayos de nucleasa fluorogénica 5'

Los ensayos de nucleasa fluorogénica 5' son un procedimiento de cuantificación en tiempo real que usa una sonda para controlar la formación del producto de amplificación. La base de este procedimiento de control de la formación del producto de amplificación es medir la acumulación del producto de la PCR de manera continua usando una sonda de oligonucleótidos fluorogénica marcada de manera dual, un planteamiento mencionado frecuentemente en la bibliografía es tan simple como el "procedimiento TaqMan" [Piatak, (1993), Science; Heid, (1996); Gibson, (1996); Holland. (1991)].

La sonda usada en tales ensayos es típicamente un oligonucleótido corto (aproximadamente 20 - 25 bases) que está marcada con dos tintes diferentes fluorescentes. El extremo 5' de la sonda se une a un tinte indicador y el extremo 3' se une a un tinte inactivador, aunque los tintes se pueden unir a otras localizaciones en la sonda también. La sonda se diseña para que tenga al menos una secuencia sustancial complementaria con el sitio que se une a la sonda. Los cebadores cadena arriba y cadena abajo que se unen a las regiones flanqueantes del locus se añaden a la mezcla de reacción. Cuando la sonda está intacta, se produce la transferencia de energía entre los dos fluoróforos y el inactivador inactiva la emisión del indicador. Durante la fase de extensión de la PCR, la sonda se escinde mediante la actividad de la nucleasa 5' de una polimerasa de ácido nucleico tal como la Taq polimerasa, liberando por lo tanto el indicador del indicador de oligonucleótidos y que da como resultado un incremento de la intensidad de emisión indicadora que se puede medir mediante un detector apropiado.

Un detector que se adapta específicamente para medir las emisiones de fluorescencia tales como las creadas durante un ensayo de fluorescencia es el ABI 7700 o 4700 HT fabricado por Applied Biosystems, Inc. in Foster City, Calif. El ABI 7700 usa fibras ópticas conectadas a cada pocillo de una disposición de tubos de la PCR de 9 6 ó 384 pocillos. El instrumento incluye un láser para excitar las marcas y es capaz de medir la intensidad de los espectros de fluorescencia de cada tubo con el control continuo durante la amplificación de PCR. Cada tubo se vuelve a examinar cada 8,5 segundos.

El software del ordenador proporcionado con el instrumento es capaz de registrar la intensidad de fluorescencia del indicador e inactivador durante el curso de la amplificación. Los valores registrados se usarán después para calcular el incremento en la intensidad de emisión del indicador normalizada en base continua. El incremento en la intensidad de emisión se representa gráficamente contra el tiempo, es decir, el número de ciclos de amplificación, para producir una medida continua de la amplificación. Para cuantificar el locus en cada reacción de amplificación, el gráfico de amplificación se examina en un momento durante la fase logarítmica de la acumulación de producto. Esto se lleva a cabo asignando una intensidad de umbral de fluorescencia por encima del fondo y determinando el punto en el que cada representación de amplificación cruza el umbral (definido como el número de ciclos de umbral o Ct). Las diferencias en el número de ciclos de umbral se usan para cuantificar la cantidad relativa de diana de PCR contenida en cada tubo. Asumiendo que cada reacción funciona al 100% de eficacia de PCR, una diferencia de una Ct representa una diferencia de dos veces en la cantidad de molde de partida. El valor de fluorescencia se puede usar junto con una curva estándar para determinar la cantidad de producto de amplificación presente.

Procedimientos de detección basados en no sonda

Está disponibles una diversidad de opciones para medir los productos de amplificación según se forman. Un procedimiento utiliza marcadores, tales como tintes, que solamente se unen a un y de doble cadena. En este tipo de planteamiento, el producto de amplificación (que es de doble cadena) se une a molécula tinte en solución para formar un complejo. Con lo tintes apropiados, es posible distinguir entre las molécula tinte libres en solución y las moléculas tinte unidas a un producto en solución. Por ejemplo, ciertos tintes fluorescentes solamente cuando se unen al producto de amplificación. Los ejemplos de tintes que se pueden usar en los procedimientos de este tipo general incluyen, pero no se limitan a, Syber Green^{TM} y Pico Green de Molecular Probes, Inc. of Eugene, Oreg., bromuro de etidio, yoduro de propidio, e hromomiicina, naranja de acridina, Hoechst 33258, Toto-1, Yoyo-1, DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol clorhidrato).

Otra técnica de de detección en tiempo real mide la alteración de la energía en la transferencia de energía de fluorescencia entre fluoróforos conjugados con cebadores de PCR [Livak, (1995)].

Procedimientos de detección basados en sonda

Estos procedimientos de detección implican alguna alteración a la estructura o conformación de una sonda hibridaza al locus entre el par de cebador de amplificación. En algunos casos, la alteración está provocada por la extensión dependiente del molde catalizada por una polimerasa del ácido nucleico durante el proceso de amplificación. La alteración genera una señal detectable que es una medida indirecta de la cantidad del producto de amplificación formado.

Por ejemplo, algunos procedimientos implican la degradación o digestión de la sonda durante la reacción de extensión. Estos procedimientos son consecuencia de la actividad de nucleasa 5' - 3' asociada a algunas polimerasas de ácidos nucleicos. Las polimerasas que tienen esta actividad escinde mononucleótidos u oligonucleótidos pequeños de una sonda de oligonucleótidos hibridaza a su secuencia complementaria localizada en el locus.

El extremo 3' del cebador cadena arriba proporciona el sitio de unión inicial para la polimerasa de ácido nucleico. Ya que la polimerasa cataliza la extensión del cebador cadena arriba y encuentra la sonda unida, la polimerasa del ácido nucleico desplaza una porción del extremo 5 de la sonda y mediante su actividad nucleasa escinde los mononucleótidos u oligonucleótidos de la sonda.

El cebador cadena arriba y la sonda se puede diseñar de manera que se hibriden a la hebra complementaria en estrecha proximidad a otra. De hecho, el extremo 3' del cebador cadena y el extremo 5' de la sonda puede confinar otra. En esta situación, la extensión del cebador cadena arriba no es necesaria con el fin de que la polimerasa de ácido nucleico comience a escindir la sonda. En el caso en el que los nucleótidos que intervienen separan el cebador cadena arriba y la sonda, la extensión del cebador es necesaria antes de que la polimerasa del ácido nucleico encuentre el extremo 5' de la sonda. Se produce un contacto y continúa, la actividad de la exonucleasa 5'-3' de la polimerasa de ácido nucleico comienza la escisión de mononucleótidos u oligonucleótidos desde el extremo 5' de la sonda. La digestión de la sonda continúa hasta que la parte remanente de la sonda se disocia de la hebra complementaria.

En solución, las dos secciones extremas se pueden hibridar entre sí para formar un bucle de horquilla. En esta conformación, el tinte indicador e inactivador están en estrecha proximidad de manera suficiente para que la fluorescencia del tinte indicador se inactiva de manera eficaz por el tinte inactivador. Por el contrario, la sonda hibridada da como resultado una conformación lineal en la que la extensión de la inactivación disminuye. De este modo, mediante el control de los cambios de emisión para los dos tintes, es posible controlar de manera indirecta la formación del producto de amplificación.

Sondas

La sonda marcada se selecciona de manera que su secuencia sea sustancialmente complementaria a un segmento del locus de ensayo o un locus de referencia. Como se ha indicado anteriormente, el sitio del ácido nucleico al que se une la sonda se debe localizar entre los sitios de unión del cebador para los cebadores de amplificación cadena arriba y cadena abajo.

Cebadores

Los cebadores usados en la amplificación se seleccionan de manera que sean capaces de hibridarse a las secuencias en las regiones flanqueantes del locus que se está amplificando. Los cebadores se eligen para que tengan al menos complementariedad sustancial con las hebreas diferentes del ácido nucleico que se está amplificando. Cuando se utiliza una sonda para detectar la formación de los productos de amplificación, los cebadores se seleccionan de manera que flanqueen la sonda, es decir se localizan cadena arriba y cadena debajo de la sonda.

El cebador debe tener suficiente longitud de manera que sea capaz de cebar la síntesis de los productos de extensión en la presencia de un agente para polimerización. La longitud y composición del cebador depende de muchos parámetros, incluyendo, por ejemplo, la temperatura a la que se lleva a cabo la reacción de hibridación, proximidad del sitio de unión de la sonda a la del cebador, las concentraciones relativas del cebador y sonda y la composición del ácido nucleico particular de la sonda. Típicamente el cebador incluye 15 - 30 nucleótidos. Sin embargo, la longitud del cebador puede ser más o menos dependiendo de la complejidad de la complejidad del sitio de unión al cebador y los factores listados anteriormente.

Marcas para las sondas y cebadores

Las marcas usadas para marcar las sondas o cebadores de la revelación presente y que pueden proporcionar la señal correspondiente a la cantidad del producto de amplificación puede tener una diversidad de formas. Como se ha indicado anteriormente con relación al procedimiento de la nucleasa fluorogénica 5', una señal fluorescente es una señal que se puede medir. Sin embargo, también se pueden realizar mediciones, por ejemplo, mediante el control de radiactividad, colorimetría, absorción, parámetros magnéticos, o actividad enzimática. De este modo, las marcas que se pueden emplear son, pero no se limitan a, fluoróforos, cromóforos, isótopos radiactivos, reactivos densos en densidad, enzimas, y ligandos que tienen patrones de unión específica, (por ejemplo, biotina-avidina).

El control de los cambios en la fluorescencia es una forma particularmente útil para controlar la acumulación de los productos de amplificación. Un número de marcas útiles para la unión a sondas o cebadores están comercialmente disponibles incluyendo fluoresceína y diversos derivados de fluoresceína tales como FAM, HEX, TET y JOE (todos los cuales están disponibles de Applied Biosystems, Foster City, Calif.); amarillo lucifer, y derivados de cumarina.

Las marcas pueden estar unidas a la sonda o cebador usando una diversidad de técnicas y se pueden unir en el extremo 5', y/o en un nucleótido interno. La marca también se puede unir a los brazos del espaciador de diversos tamaños que se unen a la sonda o cebador. Estos brazos de espaciador son útiles para obtener una distancia deseada entre las marcas múltiples unidas a la sonda o cebador.

En algunos casos, se puede utilizar una sola marca; mientras que en otros casos, tal como los ensayos de nucleasa fluorogénica 5', por ejemplo, dos o más marcas se unen a la sonda. En los casos en los que la sonda incluye marcas múltiples, en general es aconsejable mantener un espacio entre las marcas que es suficiente para permitir la separación de las marcas durante la digestión de la sonda mediante la actividad de la nucleasa 5'-3' de la polimerasa de ácido nucleico.

Pacientes que muestran síntomas de enfermedad

Numerosas enfermedades están asociadas a los cambios en la copia de un cierto gen. Para los pacientes que tienen síntomas de una enfermedad, el procedimiento de la PCR en tiempo real se puede usar para determinar si el paciente tiene numerosas alteraciones de copias que se sabe que se unen a las enfermedades que están asociadas a los síntomas que tiene el paciente.

Expresión de PILS Proteínas de fusión de PILS

Las proteínas de fusión son útiles para generar anticuerpos contra los polipéptidos de PILS y para uso en diversos sistemas de ensayo. Por ejemplo, se pueden usar las proteínas de fusión para identificar las proteínas que interactúan con las partes de los polipéptidos PILS. Los ensayos basados en la cromatografía de afinidad de proteína o basados en genoteca para las interacciones proteína - proteína, tales como los sistemas de dos híbridos de levaduras o de despliegue de fago, se pueden usar para este propósito. Tales procedimientos son bien conocidos por los expertos en la técnica y se pueden usar como filtros de fármacos.

Una proteína de fusión de PILS comprende dos segmentos de polipéptidos condensados conjuntamente mediante un enlace polipéptidico. El primer segmento polipeptídico puede comprender al menos 54, 75, 100, 125, 139, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325 ó 350 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 2 o de una variante biológicamente activa, tales como las descritas anteriormente. El primer segmento polipeptídico también puede comprender PILS de longitud completa.

El segundo segmento polipeptídico puede ser una proteína de longitud completa. Las proteínas usadas de manera común en la construcción de la proteína de fusión incluyen, pero no se limitan \beta-galactosidasa, \beta-glucuronidasa, proteína fluorescente verde (GFP), proteínas autofluorescentes, que incluyen proteína fluorescente azul (BFP), glutatión-S-transferasa (GST), luciferasa, peroxidasa de rábano picante (HRP), y cloramfenicol acetiltransferasa (CAT). De manera adicional, se usan etiquetas de epítopes en las construcciones de la proteína de fusión, que incluyen etiquetas de histidina (His), etiquetas de FLAG, etiquetas de hematoglutinina de influenza (HA), etiquetas de Myc, etiquetas de VSV-G, y etiquetas de tioredoxina (Trx). Otras construcciones de de fusión pueden incluir la proteína de unión a maltosa (MBP), etiqueta de S, dominios de unión a ADN de L ex (DBD), fusiones del dominio de unión a GAL4 DNA, y fusiones de proteínas de virus herpes simplex (HSV) BP16. A Una proteína de fusión también se puede modificar por ingeniería genética para que contenga un sitio de escisión localizado adyacente a la PILS.

Preparación de Polinucleótidos

Un polinucleótido de PILS de origen natural se puede aislar sin los otros componentes celulares tales como componentes de membrana, proteínas, y lípidos. Los polinucleótidos se pueden preparar mediante una célula y aislarse usando técnicas de purificación de ácido nucleico convencionales, o sintetizarse usando una técnica de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o mediante el uso de un sintetizador automático. Los procedimientos para asilar polinucleótidos son rutinarios y se conocen en la técnica. Cualesquiera de tales técnicas para obtener un polinucleótido se puede usar para obtener polinucleótidos de PILS. Por ejemplo, se pueden usar enzimas de restricción y sondas para aislar los fragmentos de polinucleótidos que comprenden secuencias de nucleótidos de PILS. Los polinucleótidos aislados están en las preparaciones que están sin o al menos sin 70, 80, ó 90% sin otras moléculas.

Las moléculas de ADNc de PILS se pueden preparar con las técnicas de biología molecular convencionales, usando ARNm e PILS como molde. Las moléculas de ADNc de PILS se pueden replicar después usando técnicas de biología molecular conocidas en la técnica. Una técnica de amplificación, tal como PCR, se puede usar para obtener copias adicionales de los polinucleótidos usados en la invención, usando o bien ADN o ADNc genómico humano como molde.

Como alternativa, se pueden usar técnicas de química sintética para sintetizar los polinucleótidos de PILS. La degeneración del código genético permite que las secuencias de nucleótidos alternativos a sintetizar que codificarán la PILS tengan, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o una variante biológicamente activa de los mismos.

Polinucleótidos de extensión

Se pueden usar diversos procedimientos basados en la PCR para extender las secuencias de ácido nucleico que codifican PILS humana, por ejemplo para detectar las secuencias cadena arriba del gen PILS tales como promotores y elementos reguladores. Por ejemplo, la PCR de sitio restringido utiliza cebadores para recuperar la secuencia no conocida adyacente a un locus conocido. El ADN genómico se amplifica primero en la presencia de un cebador para una secuencia de engarce y un cebador específico a la región conocida. Las secuencias amplificadas se sometes después a una segunda ronda de PCR con el mismo cebador de engarce y otro cebador específico interno al primero. Los productos de cada ronda de la PCR se transcriben con una ARN polimerasa y se secuencian usando transcriptasa inversa.

La PCR inversa también se puede usar para amplificar o extender secuencias que usan cebadores divergentes basándose en una región conocida. Los cebadores se pueden diseñar usando un software comercialmente disponible, tal como el software OLIGO 4.06 Primer Analysis (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.), que es de 22 - 30 nucleótidos de longitud, que tienen un contenido en GC de 50% o más, y que hibridan a la secuencia diana e las temperaturas aproximadamente 68 - 72ºC. El procedimiento usa varias enzimas de restricción para generar un fragmento adecuado en la región conocida de un gen. Después el fragmento se hace circular mediante ligamiento intramolecular y se usa como un molde de PCR.

Otro procedimiento que se puede usar es la PCR de captura, que implica la amplificación de PCR de los fragmentos de ADN adyacentes a una secuencia conocida en el ADN cromosómico artificial humano y de levadura. En este procedimiento, las digestiones de enzima de restricción y ligaduras también se pueden usar para localizar una secuencia de doble cadena modificada por ingeniería genética en un fragmento no conocido de la molécula de ADN antes de la realización de PCR.

Cuando se seleccionan los ADNc de longitud completa, es preferible usar genotecas que se han seleccionado por tamaño para que incluyan ADNc mayores. Son preferibles las genotecas cebadas al azar, ya que contendrán más secuencias que las que contienen las regiones 5' de los genes. El uso de una genoteca cebada al azar se puede preferir de manera especial para las situaciones en las que una genoteca oligo d(T) no produce un ADNc de longitud completa. Pueden ser útil genotecas genómicas para la extensión de la secuencia en las regiones reguladoras no transcritas en 5'.

Se pueden usar sistemas de electroforesis de capilar comercialmente disponibles para analizar el tamaño o confirmar la secuencia de nucleótidos de PCR o productos de secuenciación. Por ejemplo, la secuenciación capilar puede emplear polímeros sueltos para la separación electroforética, cuatro tintes fluorescentes diferentes (uno para cada nucleótido) que se activan por láser, y detección de las longitudes de onda emitidas mediante una cámara con dispositivo acoplada a carga. La intensidad de salida/luz se puede convertir en señal eléctrica usando un equipo y software apropiado (por ejemplo, GENOTYPER y Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer), y todo el proceso de la carga de muestras para análisis de ordenador y la exposición de los datos electrónicos se pueden controlar por ordenador. La electroforesis capilar es especialmente preferible para la secuenciación de piezas pequeñas de ADN que se pudieran presentar en cantidades limitadas en una muestra particular.

Obtención de polipéptidos

PILS se puede obtener, por ejemplo, mediante la purificación de células humanas, mediante la expresión de polinucleótidos de PILS, o mediante química sintética directa.

Purificación de proteínas

PILS se puede purificar a partir de cualquier célula humana que expresa la enzima, incluyendo las que se han transfectado con las construcciones de expresión que expresa PILS. Una PILS purificada se separa de otros compuestos que normalmente se asocian con PILS en la célula, tales como ciertas proteínas, carbohidratos, o lípidos, usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a, cromatografía de exclusión de tamaño, fraccionamiento de sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, y electroforesis de gel preparativa.

Expresión de polinucleótidos de PILS

Para expresar PILS, los polinucleótidos de PILS se pueden insertar en un vector de expresión que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación insertada. Los procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la técnica se pueden usar para construir los vectores de expresión que contienen las secuencias que codifican PILS y los elementos de control de transcripción y traducción apropiados. Estos procedimientos incluyen las técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, y recombinación genética in vivo.

Se puede utilizar una diversidad de sistemas de vector de expresión/huésped para que contenga y exprese las secuencias que codifican PILS. Éstos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con bacteriófagos recombinantes, plásmido, o vectores de expresión de ADN de cósmicos; levaduras transformadas con los vectores de expresión de levaduras, sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus), sistemas de células de la planta transformados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322), o sistemas de células de animales.

Los elementos de control o secuencias reguladoras son las regiones no traducidas de los potenciadores, promotores de vector, regiones no traducidas 5' y 3' - que interactúan con las proteínas celulares del huésped para llevar a cabo la transcripción y traducción. Tales elementos pueden variar en su intensidad y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y huésped utilizado, se puede usar cualquier número de elementos de transcripción y traducción, que incluyen promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en los sistemas bacterianos, se pueden usar promotores inducibles tal como el promotor lacZ híbrido del fagémido BLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, Calif.) o el plásmido pSPORT1 (Life Technologies) y similares. El promotor de polihedrina de baculovirus se puede usar en células de insecto. Los promotores o potenciadores derivados de los genomas de células de plantas (por ejemplo, choque térmico, RUBISCO, y genes de proteína de almacenamiento) o de virus de plantas (por ejemplo, promotores virales o secuencias guía) se pueden clonar en el vector. En los sistemas de células de mamíferos, los promotores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos son preferibles. Es necesario generar una línea celular que contenga múltiples copias de una secuencia de nucleótidos que codifica PILS, vectores basados en SV40 o EBV se pueden usar con un marcador seleccionable adecuado.

Sistemas de expresión bacterianos y de levaduras

En los sistemas bacterianos, se puede seleccionar un número de vectores de expresión. Por ejemplo, cuando se necesita una gran cantidad de PILS para la inducción de anticuerpos, se pueden usar vectores que dirigen la expresión de alto nivel de las proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores de clonación y expresión de E. coli multifuncionales tales como BLUESCRIPT (Stratagene). En un vector BLUESCRIPT, una secuencia que codifica PILS se puede ligar en el vector en fase con las secuencias para Met amino terminal y los 7 restos posteriores de la \beta-galactosidasa de manera que se produce una proteína híbrida. Los vectores pIN o los vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) también se pueden usar para expresar los polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con la glutatión S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante la adsorción a perlas de glutatión-agarosa seguido de elución en la presencia de del glutatión libre. Las proteínas preparadas en tales sistemas se pueden diseñar para incluir heparina, trombina, o sitios de escisión de la proteasa del factor Xa de manera que el polipéptido clonado de interés se puede liberar a partir del resto GST si se quiere.

Sistemas de expresión de plantas e insectos

Si se usan los vectores de expresión de plantas, la expresión de de las secuencias que codifican PILS se pueden dirigir mediante cualquiera de un número de promotores. Por ejemplo, los promotores virales tales como los promotores 35S y 19S de CaMV se pueden usar solos o en combinación con la secuencia guía omega de TMV. Como alternativa, se pueden usar promotores de plantas talas como la subunidad pequeña de RUBISCO o choque térmico. Estas construcciones se pueden introducir en células de plantas mediante transformación de ADN directa o mediante transfección mediada por patógeno.

Se puede usar un sistema de insectos para expresar PILS. Por ejemplo, en un sistema tal como virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se usa como un vector para expresar genes foráneos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican PILS se pueden clonar en una región no clonal del virus, tal como el gen de polihedrina, y colocarse bajo el control del promotor de polihedrina. La inserción exitosa de PILS w hará que el gen de la polihedrina inactive y produzca virus recombinante que carece de la proteína de recubrimiento. Los virus recombinantes se pueden usar después para infectar células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las que se puede expresar PILS.

Sistemas de expresión de mamíferos

Se puede usar un número de sistemas de expresión basados en virus para expresar PILS en células huésped de mamíferos. Por ejemplo, si se usa un adenovirus como vector de expresión, las secuencias que codifican PILS se pueden ligar en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que comprende el último promotor y secuencia guía tripartita. La inserción en una región no esencial de E1 o E3 del genoma viral se puede usar para obtener un virus viable que es capaz de expresar PILS en células huésped infectadas [Engelhard, 1994)]. Si se desea, los potenciadores de transcripción, tal como el potenciador del virus de sarcoma de Rous (RSV), se puede usar para incrementar la expresión en células huésped de mamíferos.

También se pueden usar cromosomas artificiales humanos (HAC) para administrar fragmentos mayores de y que se pueden contener y expresar en un plásmido. Los HAC de 6M a 10M se construyen y se administran mediante los procedimientos de administración convencional (por ejemplo, liposomas, polímeros amino policatiónicos, o vesículas). También se pueden usar señales de inicio específicas para lograr la traducción más eficaz de las secuencias que codifican PILS. Tales señales incluyen el codón de inicio ATG y las secuencias adyacentes. En los casos en los que las secuencias que codifican PILS, su codón de inicio, y las secuencias cadena arriba se insertan en el vector de expresión apropiado, no puede ser necesaria ninguna señal de control de la transcripción o traducción adicional. Sin embargo, en los casos en los que se inserta solamente la secuencia de codificación, o su fragmento, se deben proporcionar señales de control de traducción exógenas (incluyendo el codón de inicio ATG). El codón de inicio debe estar en la fase de lectura correcta para asegurar la traducción de de la inserción completa. Los elementos de traducción exógenos y codones de inicio pueden ser de diversos orígenes, tanto natural como sintético.

Células huésped

Una cepa de célula huésped se puede elegir por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar la PILS expresada de la manera deseada. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. El procedimiento después de la traducción que escinde una forma "prepro" del polipéptido también se puede usar para facilitar la correcta inserción, plegamiento y/o función. Las diferentes células huésped que tienen maquinaria celular específica y mecanismos característicos para las actividades después de la traducción (por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38), estás disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) y se puede elegir para asegurar la modificación correcta y procesamiento de la proteína foránea.

Se prefiere la expresión estable a largo plazo, la producción de alto rendimiento de proteínas recombinantes. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable PILS se pueden transformar usando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión exógenos y un gen marcador seleccionable sobre el mismo vector o separado. Después de la introducción del vector, se puede permitir que las células se desarrollen durante 1 - 2 días en un medio enriquecido antes de que se desvíen a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el desarrollo y recuperación de las células que expresan de manera exitosa las secuencias de PILS introducidas. Los clones resistentes de las células transformadas de manera estable pueden proliferar usando técnicas de cultivo de tejidos apropiados al tipo de célula. Se puede usar cualquier número de sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Éstos incluyen, pero no se limitan a, a timidina quinasa del virus del herpes simplex [Logan, (1984)] y los genes de adenina fosforribosil transferasa [Wigler, (1977)] que se pueden emplear en las células en tk- o aprt-, respectivamente. También se puede usar resistencia antimetabolitos, antibióticos, o herbicidas en base a la selección. Por ejemplo, dhfr confiere la resistencia a metotrexato [Lowy, (1980)], npt confiere resistencia a los aminoglicósidos, neomicina y G-418 [Wigler, (1980)], y las y pat confieren resistencia a clorsulfuron y fosfinotricin acetiltransferasa, respectivamente [Colbere-Garapin, 1981]. Se han descrito los genes adicionales seleccionables. Por ejemplo, trpB permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina. Se pueden usar marcadores visibles tales como antocianinas, \beta-glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa y su sustrato luciferina, para identificar transformantes y para cuantificar la cantidad de la expresión de proteína transitoria o estable que se puede atribuir.

Detección de la expresión de polipéptidos

Aunque la presencia de la expresión del gen marcador sugiere que un polinucleótido de PILS también está presente, su presencia y expresión puede necesitar ser confirmada. Por ejemplo, Si una secuencia que codifica PILS se inserta dentro en una secuencia del gen marcador, células transformadas que contienen secuencias que codifican PILS se pueden identificar mediante la ausencia de la función del gen marcador. Como alternativa, un gen marcador se puede colocar en tándem con una secuencia que codifica PILS bajo el control de un solo promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección usualmente indica la expresión del polinucleótido de PILS.

Como alternativa, células huésped que contienen un polinucleótido de PILS y que expresa PILS se puede identificar mediante una diversidad de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, hibridaciones ADN - ADN o ADN - ARN y técnicas de bioensayo o inmunoensayo de proteínas que incluyen tecnologías de membrana, solución, o basadas en procesador para la detección y/o cuantificación de ácido nucleico o proteína. Por ejemplo, la presencia de una secuencia de polinucleótidos que codifica PILS se puede detectar mediante hibridación ADN - ADN o ADN - ARN o amplificación usando sondas o fragmentos o fragmentos de polinucleótidos que codifican PILS. Los ensayos basados en la amplificación de ácido nucleico implican el uso de oligonucleótidos seleccionados entre las secuencias que codifican PILS para detectar transformantes que contienen un polinucleótido de PILS.

Se conoce en la técnica una diversidad de protocolos para detectar y medir la expresión de PILS, usando anticuerpos o bien policlonales o monoclonales específicos para el polipéptido. Los ejemplos incluyen ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y aislamiento de células en citofluorímetro (FACS). Se puede usar un inmunoensayo de dos sitios basado en monoclonal que usa anticuerpos monoclonales reactivos con dos epítopes que no interfieren en la PILS, o se puede emplear un ensayo de unión competitiva.

Una amplia diversidad de marcadores y técnicas de conjugación son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden usar en varios ensayos de ácido nucleico y de aminoácidos. Los medios para producir la hibridación marcada de las sondas de la PCR para detectar secuencias relacionadas con los polinucleótidos que codifican PILS incluyen oligomarcado, traducción de nick, marcado en los extremos, o amplificación por la PCR usando un nucleótido marcado. Como alternativa, las secuencias que codifican PILS se pueden clonar en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Tales vectores se conocen en la técnica, están comercialmente disponibles, y se pueden usar para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de nucleótidos marcados y una ARN polimerasa tal como T7, T3, o SP6. Estos procedimientos se pueden llevar a cabo usando una diversidad de kits comercialmente disponibles (Amersham Pharmacia Biotech, Promega, y US Biochemical). Las moléculas o marcadores indicadores adecuados que se pueden usar para facilitar la detección incluyen radionúclidos, enzimas, y agentes fluorescentes, quimioluminiscenets, o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares.

Expresión y purificación de polipéptidos

Se pueden cultivar células huésped transformadas con polinucleótidos de PILS en condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína a partir del cultivo celular. El polipéptido producido mediante una célula transformada se puede secretar o contener de manera intracelular dependiendo de la secuencia y/o el vector usado. Como entenderán los expertos en la técnica, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos de PILS se pueden diseñar para que contengan secuencias de señal que dirigen la secreción de PILS soluble mediante una membrana de células procarióticas o eucarióticas o que dirigen la inserción de membrana de la PILS unida a membrana.

Como se ha descrito anteriormente, se pueden usar otras construcciones para unir una secuencia que codifica PILS a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de polipéptidos que facilitará la purificación de proteínas solubles. Tales dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan, péptidos quelantes de metales tales como módulos histidina - triptófano que permiten la purificación de los metales inmovilizados, dominios de proteína A que permiten la purificación sobre inmunoglobulina inmovilizada, y el dominio utilizado en el sistema de purificación de extensión/afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Wash.). La inclusión de las secuencias de engarce escindibles tales como las específicas para el Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y PILS también se puede usar para facilitar la purificación. Uno de tales vectores de expresión proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene PILS y 6 restos de histidina que preceden a una tioredoxina o un sitio de escisión de enteroquinasa. Los restos de histidina facilitan la purificación mediante IMAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados) Maddox, (1983)], mientras el sitio de escisión de la enteroquinasa proporciona un medio para la purificación de PILS a partir de la proteína de fusión [Porath, (1992)].

Síntesis química

Las secuencias que codifican PILS se pueden sintetizar, en total o en parte, usando procedimientos químicos bien conocidos en la técnica. Como alternativa, la propia PILS se puede producir usando procedimientos químicos para sintetizar su secuencia de aminoácidos, tal como la síntesis directa de péptidos usando técnicas de fase sólida. La síntesis de proteína puede o bien realizarse usando técnica manual o automáticamente. La síntesis automática se puede lograr, por ejemplo, usando el sintetizador de Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Opcionalmente, los fragmentos de PILS se pueden sintetizar de manera separada y combinarse usando procedimientos químicos para producir una molécula de longitud completa.

El péptido sintetizado recientemente se puede purificar sustancialmente mediante cromatografía líquida de alta resolución preparativa. La composición de una PILS sintética se puede confirmar mediante análisis o secuenciación de aminoácidos. De manera adicional, cualquier porción de la secuencia de aminoácidos de PILS se puede alterar durante la síntesis directa y/o combinarse usando procedimientos químicos con secuencias de otras proteínas para producir un polipéptido variante o una proteína de fusión.

Producción de polipéptidos alterados

Como entenderán los expertos en la técnica, puede ser ventajoso producir polinucleótidos de PILS que poseen codones de origen natural. Por ejemplo, los codones preferidos por huésped procariótico o eucariótico particular se puede seleccionar para incrementar la velocidad de la expresión de proteína o para producir una transcripción de ARN que tiene las propiedades deseables, tal como una semivida que es más larga que la de una transcripción generada a partir de la secuencia de origen natural.

Las secuencias de nucleótidos mencionadas en el presente documento se puede modificar por ingeniería genética usando procedimientos en general conocidos en la técnica para alterar polinucleótidos de PILS por una diversidad de razones, que incluyen pero no se limitan a, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento y/o expresión del polipéptido o producto de ARNm. La mezcla de AND mediante fragmentación al azar y reensamblaje de los fragmentos del gen y oligonucleótidos sintéticos se pueden usar para modificar por ingeniería genética las secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, se puede usar la mutagénesis dirigida al sitio para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glicosilación, cambiar la preferencia del codón, producir variantes de ayuste, introducir mutaciones, y así sucesivamente.

Análogos de PILS

Una clase general de análogos de PILS son variantes que tienen una secuencia de aminoácidos que es una mutación de la secuencia de aminoácidos descrita en el presente documento. Otra clase de análogos de PILS se proporciona mediante anticuerpos anti-idiotipos, y sus fragmentos, como se describe a continuación. Además, anticuerpos recombinantes que comprenden dominios variables anti-idiotipo se pueden usar como análogos (véase, por ejemplo, [Monfardini et al., (1996)]). Ya que los dominios variables de los anticuerpos de PILS anti-idiotipo imitan a PILS, estos dominios pueden proporcionar la actividad enzimática de PILS. Los procedimientos de producción de anticuerpos catalíticos anti-idiotipos son conocidos por los expertos en la técnica [Joron et al., (1992), Friboulet et al. (1994), Avalle et al., (1998)].

Otro planteamiento para identificar los análogos de PILS se proporciona mediante el uso de genotecas combinatorias. Se proporcionan los procedimientos para construir y seleccionar el despliegue del fago y otras genotecas combinatorias, por ejemplo, por [Kay et al., Phage Display of Peptides y Proteins (Academic Press 1996), documentos U.S. 5.783.384, U.S. 5.747.334, y U.S. 5.723.323.

Un uso ilustrativo in vitro de PILS y sus análogos es la producción de péptidos marcados a partir de un sustratos de proteína marcado. Las proteasas también se pueden usar en detergentes y soluciones de limpieza. Por ejemplo, se usan serina proteasas en soluciones para limpiar y desinfectar lentes de contacto (véase, por ejemplo, [el documento U.S. 5.985.629]). Otro uso de una serina proteasa en la formulación de vacunas (véase, por ejemplo, [el documento U.S. 5.885.814]). Los expertos en la técnica pueden idear otros usos para las moléculas que tienen actividad de PILS.

Anticuerpos

Cualquier tipo de anticuerpo conocido en la técnica se pueden generar para unirse específicamente a un epítope de PILS.

"Anticuerpo" como se usa en el presente documento incluye moléculas de inmunoglobulina intactas, así como sus fragmentos, tal como Fab, F(ab')2, y Fv, que son capaces de unirse a un epítope de PILS. Típicamente, al menos 6, 8, 10, ó 12 aminoácidos contiguos se requieren para formar un epítope. Sin embargo, los epítopes que implican aminoácidos contiguos pueden requerir más, por ejemplo, al menos 15, 25, ó 50 aminoácidos. Un anticuerpo que específicamente se une a un epítope de PILS se puede usar terapéuticamente, así como en ensayos inmunoquímicos, tales como transferencia de Western, ELISA, radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquímicos, inmunoprecipitaciones, u otros ensayos inmunoquímicos conocidos en la técnica. Se pueden usar diversos inmunoensayos para identificar anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Numerosos protocolos para la unión competitiva o ensayos inmunorradiométricos se conocen bien en la técnica. Tales inmunoensayos típicamente implican la medición de la formación de complejo entre un inmunógeno y un anticuerpo que se une de manera específica al inmunógeno de PILS.

Típicamente, un anticuerpo que se une específicamente a PILS proporciona una señal de detección al menos 5-, 10-, ó 20- veces mayor que una señal de detección proporcionada con otras proteínas cuando se usa en un ensayo inmunoquímico. Preferiblemente, los anticuerpos que se unen de manera específica a PILS no detectan otras proteínas en ensayos inmunoquímicos y pueden inmunoprecipitar PILS en solución.

PILS se puede usar para inmunizar un mamífero, tal como un ratón, rata, conejo, cobaya, ratón, o ser humano para producir anticuerpos policlonales. Si se desea, se puede conjugar PILS a una proteína vehículo, tal como albúmina sérica bovina, tiroglobulina, y hemocianina de lapa californiana. Dependiendo de las especies de huésped, se pueden usar diversos adyuvantes para incrementar al respuesta inmunológico. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a adyuvante de Freund, geles minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio), y sustancias tensioactivas (por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianina de lapa californiana, y dinitrofenol). Entre los adyuvantes usados en seres humanos, BCG (bacilos Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum son especialmente útiles.

Los anticuerpos monoclonales que se unen específicamente a PILS se pueden preparar usando una técnica que proporciona la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares en cultivo continuo. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridoma, la técnica de hibridoma de células B, y la técnica de hibridoma de EBV [Roberge, (1995)].

Además, las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el ayuste de los genes de anticuerpos de ratón a los genes de anticuerpo humanos para obtener una molécula con especificidad de antígeno apropiada y actividad biológica, se puede usar. Los anticuerpos monoclonales y otros también se pueden "humanizar" para prevenir un paciente de montar una respuesta inmune contra el anticuerpo cuando se usa terapéuticamente. Tales anticuerpos pueden ser suficientemente similares en secuencia a los anticuerpos humanos a usar directamente en la terapia o pueden requerir alteración de unos pocos restos. Las diferencias de secuencias entre anticuerpos de roedores y secuencias de seres humanos se pueden minimizar reemplazando los restos que difieren de aquellos en las secuencias de seres humanos mediante la mutagénesis dirigida al sitio de restos individuales o mediante el enrejado de las regiones determinantes de la completa complementariedad. Los anticuerpos que se unen de manera especial a PILS pueden contener sitios de unión a antígenos que están humanizados o bien parcialmente o completamente, como se describe en el documento U.S. 5.565.332.

Como alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena se pueden adaptar usando procedimientos conocidos en la técnica para producir anticuerpos de una sola cadena que se unen específicamente a PILS. Los anticuerpos con especificidad relacionada, pero de distinta composición de idiotipos, se pueden generar mediante mezcla de cadena a partir de genotecas de inmunoglobulina combinatorias al azar. Los anticuerpos de una sola cadena se pueden construir usando un procedimiento de amplificación de ADN, tal como PCR, usando ADNc de hibridoma como molde. Los anticuerpos de una sola cadena pueden ser mono o biespecíficos, y puede ser bivalente o tetravalente. Se enseña la construcción de anticuerpos de una sola cadena tetravalente, biespecíficas. Una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de una sola cadena se puede construir usando la síntesis de nucleótidos manual o automática, clonarse en una construcción de expresión usando procedimientos de ADN recombinante convencionales, e introducirse en una célula para expresar la secuencia de codificación, como se describe a continuación. Como alternativa, los anticuerpos de una sola cadena se pueden producir directamente usando, por ejemplo, tecnología de fago filamentoso.

Los anticuerpos que se unen específicamente a PILS también se pueden producir mediante la inducción de la producción in vivo en la población de linfocitos o mediante la selección de genotecas de inmunoglobulinas o paneles de reactivos de unión altamente específicos. Otros tipos de anticuerpos se pueden construir y usar de manera terapéutica relacionados en la invención. Por ejemplo, se pueden construir anticuerpos quiméricos como se describe en el documento WO 93/03151. También se pueden preparar las proteínas de unión que se derivan de inmunoglobulinas y que son multivalentes o multiespecíficas, tales como los "diacuerpos" descritos en el documento WO 94/13804.

Los anticuerpos usados en la invención se pueden purificar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos e pueden purificar por afinidad mediante pase en una columna a la que está unida la PILS. Los anticuerpos unidos se pueden después eluir de la columna usando un tampón con una alta concentración de sal.

Oligonucleótidos no codificantes

Los oligonucleótidos no codificantes son secuencias de nucleótidos que son complementarais a una secuencia de AND o ARN específica. Una vez introducidos en una célula, los nucleótidos complementarios se combinan con las secuencias naturales producidas por la célula para formar complejos y bloquear o bien la transcripción o traducción. Preferiblemente, un oligonucleótido no codificante es de al menos 11 nucleótidos de longitud, pero puede ser al menos de 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ó 50 o más nucleótidos de longitud. Se pueden usar secuencias más largas. Las moléculas de oligonucleótidos no codificantes se pueden proporcionar en una construcción de ADN e introducirse en una célula como se ha descrito anteriormente para que disminuya el nivel de los productos génicos de PILS en la célula.

Los oligonucleótidos no codificantes pueden ser desoxinucleótidos, ribonucleótidos, o una combinación de ambos. Los oligonucleótidos se pueden sintetizar manualmente o mediante un sintetizador automático, mediante unión covalente del extremo 5' de un nucleótido con el extremo 3' de otro nucleótido con enlaces no fosfodiéster entre los nucleótidos tales como alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos, alquillfosfonotioatos, alquilfosfonatos, fosforamidatos, ésteres fosfatos, carbamatos, acetamidato, carboximetil ésteres, carbonatos, y fosfato triésteres.

Las modificaciones de la expresión génica de PILS se pueden obtener mediante diseño de oligonucleótidos no codificantes formarán complejos dúplex con el control, 5', o regiones reguladoras del gen de PILS. Los oligonucleótidos derivados del sitio de inicio de transcripción, por ejemplo, se prefiere entre las posiciones 10 y +10 desde el punto de inicio. De manera similar la inhibición se puede lograr usando la metodología de apareamiento de bases de "triple hélice". El apareamiento de triple hélice es útil porque provoca la inhibición de la capacidad de la doble hélice para abrir suficientemente la unión de polimerasas, factores de transcripción, o acompañantes. Los avances terapéuticos que usan ADn triples se han descrito en la [Nicholls, (1993)]. También se puede diseñar un oligonucleótido no codificante para bloquear la traducción de ARNm mediante la transcripción de unión a ribosomas.

No se requiere complementariedad precisa para la formación exitosa del complejo entre un oligonucleótido no codificante y la secuencia complementaria de un polinucleótido de PILS. Los oligonucleótidos no codificantes que comprenden, por ejemplo, 2, 3, 4, ó 5 o más tramos de oligonucleótidos contiguos que no son complementarios a los nucleótidos de PILS adyacentes, pueden proporcionar suficiente especificidad de dirección para la ARNm de PILS. Preferiblemente, cada tramo de nucleótidos contiguos complementarios es de al menos 4, 5, 6, 7, u 8 o más nucleótidos de longitud. Las secuencias que intervienen no complementarias son preferiblemente de 1, 2, 3, ó 4 nucleótidos de longitud. Los expertos en la técnica pueden fácilmente usar el punto de fusión calculado de un par no codificante - codificante para determinar el grado de discordancia que se tolerará entre un oligonucleótido no codificante particular y una secuencia de polinucleótidos de PILS particular. Los oligonucleótidos no codificantes se pueden modificar sin que afecte a su capacidad de hibridarse a un polinucleótido de PILS. Estas modificaciones pueden ser internas o en uno o ambos extremos de la molécula no codificante. Por ejemplo, los enlaces de fosfato de internucleósidos entre los grupos amino y la ribosa terminal. Las bases modificadas y/o azúcares, tales como arabinosa en lugar de ribosa, o un oligonucleótido sustituido en 3', 5'- en el que el grupo hidroxilo 3' o el grupo fosfato 5' están sustituidos, también se pueden emplear en un oligonucleótido no codificante modificado. Estos oligonucleótidos modificados se pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos.

Ribozimas

Las ribozimas son moléculas de ARN con actividad catalítica [Uhlmann, (1987)]. Las ribozimas se pueden usar para inhibir la función génica mediante la escisión de una secuencia de ARN, como se conoce en la técnica. El mecanismo de la acción de ribozima implica la hibridación específica de la molécula de ribozima con el ARN diana complementario, después de la escisión de endonucleótidos. Los ejemplos de incluyen moléculas de ribozima de motivo del pez martillo modificadas por ingeniería genética que pueden catalizar de manera específica y eficaz la escisión de endonucleótidos de secuencias de nucleótidos específica. La secuencia de codificación de un polinucleótido de PILS se puede usar para generar ribozimas que se unen de manera específica a un ARNm transcrito de un polinucleótido de PILS. Los procedimientos de diseño y construcción de ribozimas que pueden escindir otras moléculas de ARN en trans de una manera altamente específica de la secuencia se han desarrollado y descrito en la técnica. Por ejemplo, la actividad de escisión de las ribozimas se pueden dirigir a los ARN específicos mediante ingeniería genética de una región de "hibridación" discreta en la ribozima. La región de hibridación contiene una secuencia complementaria con el ARN Diana y de este modo se hibridiza específicamente con el ARN diana.

Los sitios de escisión de ribozima específicos dentro de una diana de ARN de PILS se puede identificar mediante el barrido de la molécula diana para los sitios de escisión de ribozima que incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU, y GUC. Una vez identificadas las secuencias de ARN cortas de entre 15 y 20 ribonucleótidos correspondientes a la región del ARN diana que contiene el sitio de escisión se puede evaluar para determinar las características estructurales secundarias que pueden hacer a la diana inoperable. La idoneidad de las dianas de ARN de PILS candidato también se puede evaluar mediante el ensayo de accesibilidad para la hibridación con los oligonucleótidos complementarios usando ensayos de protección de ribonucleasa. Las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 1 y su complemento proporcionan fuentes de secuencias de región de hibridación adecuadas. Las secuencias complementarias más largas se pueden usar para incrementar la afinidad de la secuencia de hibridación para la diana. Las regiones de hibridación y escisión de la ribozima pueden estar de manera integral relacionadas de manera que tras la hibridación al ARN diana a través de las regiones complementarais, la región catalítica de la ribozima puede escindir la diana.

Se pueden introducir las ribozimas en las células como parte de una construcción de ADN. Se pueden usar procedimientos mecánicos, tales como microinyección, transfección mediada por liposomas, electroporación, o precipitación por fosfato de calcio para introducir una construcción de ADN que contiene ribozima en las células en las que se desea que disminuya la expresión de PILS. Como alternativa, si se desea que las células retengan de manera estable la construcción de ADN, la construcción se puede administrar a un plásmido y mantener como un elemento separado o integrarse en el genoma de las células, como se conoce en la técnica, un potenciador de elemento de UAS, y un terminador de la señal de la transcripción, para controlar la transcripción de ribozimas en las células (documento U.S. 5.641.673). Las ribozimas también se pueden modificar por ingeniería genética para proporcionar un nivel adicional de regulación, de manera que la destrucción del ARNm se produce solamente cuando tanto una ribozima como un gen diana se inducen en las células.

Selección/ensayos de selección Reguladores

Los reguladores, como se usan en el presente documento, se refieren a los compuestos que afectan a la actividad de PILS in vivo y/o in vitro. Los reguladores pueden ser agonistas y antagonistas de polipéptido de PILS y pueden ser compuestos que ejercen su efecto en la actividad de PILS mediante la actividad enzimática, expresión, modificaciones después de la traducción o mediante otros medios. Los agonistas de PILS son moléculas que cuando se unen a PILS, incrementan o prolongan la actividad de PILS. Los agonistas de PILS incluyen proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, moléculas pequeñas, o cualquier otra molécula que activa PILS. Los antagonistas de PILS son moléculas que cuando se unen a PILS, disminuyen la cantidad o la duración de la actividad de PILS. Los antagonistas incluyen proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, anticuerpos, moléculas pequeñas, o cualquier otra molécula que disminuye la actividad de PILS.

El término "modular", como aparece en el presente documento, se refiere a un cambio en la actividad de polipéptidos de PILS. Por ejemplo, la modulación puede provocar un incremento o disminución en la actividad enzimática, las características de unión, o cualesquiera otras propiedades biológicas, o inmunológicas de PILS.

Como se usa en el presente documente, los términos "unión específica" o "unión específicamente" se refiere a la interacción entre una proteína o péptido y un agonista, un anticuerpo, o un antagonista. La interacción depende de la presencia de una estructura particular de la proteína reconocida por la molécula de unión (es decir, el determinante o epítope). Por ejemplo, si un anticuerpo es específico para un epítope "A" la presencia de un n polipéptido que contiene el epítope A, o la presencia de A no marcada libre, en una reacción que contiene la A marcada libre y el anticuerpo reducirá la cantidad de A marcada que se une al anticuerpo.

La invención proporciona procedimientos (también denominados en el presente documento "ensayos de selección") para la identificación de compuestos que se pueden usar para el tratamiento de enfermedades relacionadas con PILS. Los procedimientos suponen la identificación de los compuestos o agentes de de ensayo (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, pequeñas moléculas u otras moléculas) que se unen a PILS y/o tienen un efecto estimulador o inhibidor de la actividad biológica de PILS o su expresión y después determinar cuáles de estos compuestos tienen un efecto sobre los síntomas o enfermedades relacionadas con PILS en un ensayo in vivo.

Los compuestos candidatos o de ensayo que se unen a PILS y/o tienen un efecto estimulador o inhibidor sobre la actividad o la expresión de PILS se identifican o bien en ensayos que emplean células que expresan PILS (ensayos basados en células) o en ensayos con PILS aislada (ensayos sin células). Los diversos ensayos pueden emplear una diversidad de variantes de PILS (por ejemplo, PILS de longitud completa, un fragmento biológicamente activo de PILS, o una proteína de fusión que incluye toda o una parte de una porción de PILS). Además, PILS se puede derivar a partir de cualquier especie de mamífero adecuada (por ejemplo, PILS humana, PILS de rata o PILS de murinos). El ensayo puede ser un ensayo de unión que supone la medición directa o indirecta de la unión de un compuesto de ensayo o un ligando de PILS conocido PILS. El ensayo también puede ser un ensayo de actividad que supone la medición directa o indirecta de la actividad de PILS. El ensayo también puede ser un ensayo de expresión que contempla la medición directa de la expresión de ARNm de PILS o proteína de PILS. Se combinan los diversos ensayos de selección con un ensayo in vivo que consideran la medida del efecto del compuesto de ensayo en los síntomas de la enfermedad relacionada con PILS.

La presente invención incluye ensayos bioquímicos, ensayos sin células que permiten la identificación de inhibidores y un agonista de proteasas adecuadas como estructuras guías para el desarrollo de fármacos farmacológicos. Tales ensayos implican poner en contacto una forma PILS (por ejemplo, PILS de longitud completa, un fragmento biológicamente activo de PILS, o una proteína de fusión que comprende toda o una parte de PILS) con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para que actúe como (preferiblemente) o un agonista del la actividad enzimática de PILS.

La actividad de las moléculas de PILS de la presente invención se puede medir usando una diversidad de ensayos que miden la actividad de PILS. Por ejemplo, la actividad de de la enzima PILS se puede ensayar mediante un ensayo in vitro de serina/metalo/proteasa (véase, por ejemplo, el documento [U.S. 5.057.414]). Los expertos en la técnica son conscientes de una diversidad de sustratos adecuados para los ensayos in vitro, tal como SucAla-Ala-Pro-Phe-pNA, clorhidrato de fluoresceína mono-p-guanidinobenzoato, benciloxicarbonil-L-Arginil-S-benciléster, Nalfa-Benzoil-L-arginina etil éster clorhidrato, y similares. Además, los kits de ensayo de proteasa disponibles de fuentes comerciales, tal como Calbiochem^{TM} (San Diego, Calif.). Para las referencias generales véase Barrett (Ed.), Methods in Enzymology, Proteolytic Enzymes: Serine y Cysteine Peptidases (Academic Press Inc. 1994), y Barrett et al., (Eds.), Handbook of Proteolytic Enzymes (Academic Press Inc. 1998).

Se pueden usar ensayos in vitro en solución para identificar un sustrato o inhibidor de PILS. También se pueden usar sistemas en fase sólida para identificar un sustrato o inhibidor de un polipéptido de PILS. Por ejemplo, un polipéptido de PILS o proteína de fusión de PILS se puede inmovilizar sobre la superficie de un procesador del receptor de un instrumento biosensor comercialmente disponible (BIACORE, Biacore A B; Uppsala, Suecia). El uso de este instrumento se describe por ejemplo, por [Karlsson, (1991), y Cunningham y Wells, (1993)].

En resumen, un polipéptido o proteína de fusión de PILS se une de manera covalente, usando química de amina o sulfidrilo, a las fibras de dextrano que están unidas a película de oro en una celda de flujo. Después se pasa una muestra de ensayo a través de la celda. Si está presente un sustrato o inhibidor de de PILS en la muestra, se unirá al polipéptido o proteína de fusión inmovilizado, provocando un cambio en el índice de refracción del medio, que se detecta como un cambio en la resonancia de plasmón de superficie de la película de oro. El sistema permite la determinación de tasas de conexión y desconexión, a partir de las cuales se puede calcular la afinidad de unión, y determinación de la estequiometría de unión, así como los efectos cinéticos de la mutación de PILS. Este sistema también se puede usar para examinar las interacciones anticuerpo - antígeno, y las interacciones de los otros pares complemento/anticomplemento.

En una realización, la invención proporciona ensayos para seleccionar compuestos candidatos o de ensayo que se unen a o modulan la actividad de PILS. Tales ensayos pueden emplear PILS de longitud completa, un fragmento biológicamente activo de PILS, o una proteína de fusión que incluye toda o una parte de PILS. Como se describe en mayor detalle a continuación, el compuesto de ensayo se puede obtener mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, a partir de genotecas de compuestos convencionales.

La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo de modular la actividad de PILS se puede llevar cabo, por ejemplo, mediante la determinación de la capacidad de PILS de unirse a o interactuar con una molécula diana. La molécula diana puede ser una molécula que a la la que une PILS o interactúa. La molécula diana puede ser un componente de una ruta de transducción de señal que facilita la transducción de una señal extracelular. La molécula de PILS diana puede ser, por ejemplo, una segunda proteína intracelular que tiene actividad catalítica o una proteína que facilita la asociación de las moléculas de se3ñalización cadena abajo con PILS.

La determinación de la capacidad de PILS de unirse a o interactuar con una molécula diana se puede llevar a cabo mediante uno de los procedimientos descritos anteriormente para determinar la unión directa. En una realización la determinación de la capacidad de un polipéptido de la invención de unirse a o interactuar con una molécula diana se puede llevar a cabo mediante la determinación de la actividad de la molécula diana. Por ejemplo, la actividad de la molécula diana se puede determinar mediante la detección de la inducción de un segundo mensajero celular de la diana (por ejemplo, Ca^{2+} intracelular, diacilglicerol, IP3, etc.), detección de la actividad catalítica/enzimática de la diana sobre un sustrato apropiado, detección de la inducción de un gen indicador (por ejemplo, un elemento regulador que es sensible a un polipéptido de la invención unido de manera operativa a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, por ejemplo, luciferasa), o detección de una respuesta
celular.

En diversas realizaciones de los procedimientos de ensayos anteriores de la presente invención, puede ser deseable inmovilizar PILS (o una molécula diana de PILS) para facilitar la separación de las formas complejadas de las no complejadas de una o ambas de las proteínas, así como para acomodar la automatización del ensayo. La unión de un compuesto de ensayo a PILS, o interactuación de PILS con una molécula diana en la presencia y ausencia de un compuesto candidato, se puede llevara a cabo en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga. En una realización, se puede proporcionar una proteína de fusión que agrega un dominio que permite que se una a una matriz. Por ejemplo, las proteínas de fusión de la glutatión-S-transferasa (GST) o las proteínas de fusión de la glutatión-S-transferasa se pueden adsorber sobre perlas de glutatión transferasa (Sigma Chemical; St. Louis, Mo.) o placas de microtitulación derivatizadas de glutatión, que después se combinan con el compuesto de ensayo y o bien la proteína no adsorbida o PILS, y la mezcla se incuba en condiciones conductivas para la formación de complejos (por ejemplo, a las condiciones fisiológicas de sal y pH). Después de la incubación, las perlas o los pocillos de la placa de microtitualción se lavan para retirar cualesquiera componentes no unidos y formación de complejo se mide o bien directa o indirectamente, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, los complejos se pueden disociar a partir de la matriz, y el nivel de unión o actividad de PILS se pueden determinar usando de PILS se puede determinar usando técnicas convencionales.

También se pueden usar otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre las matrices en los ensayos de selección de la invención. Por ejemplo, o bien PILS o su molécula diana se puede inmovilizar utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. El polipéptido biotinilado usado en la invención o moléculas diana se pueden preparar a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) usando técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals; Rockford, III), y se inmovilizan en los pocillos de placas recubiertas de estreptavidina (Pierce Chemical). Como alternativa, los anticuerpos reactivos con PILS o moléculas diana pero que no interfieren con la unión del polipéptido usado en la invención a su molécula diana se puede derivatizar a los pocillos de la placa, y la diana no unida o polipéptido usado en la invención atrapados en los pocillos mediante la conjugación de anticuerpos. Los procedimientos para detectar tales complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados por GST, incluyen la inmunodetección de los complejos usando anticuerpos reactivos con PILS o molécula diana, así como ensayos ligados a enzima que dependen de la detección de una actividad enzimática asociada a PILS o molécula diana.

Otra técnica para la selección de fármacos que se puede usar proporciona selección de alto rendimiento de los compuestos que tienen afinidad de unión adecuada a la proteína de interés como se describe en la solicitud PCT publicada WO84/03564. En este procedimiento, se sintetizan grandes números de diferentes compuestos de ensayo pequeños sobre un sustrato sólido, tales como alfileres de plástico o alguna otra superficie. Los compuestos de ensayo reaccionan con PILS, o sus fragmentos, y se lavan. La PILS unida después se detecta mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. La PILS purificada también se puede recubrir directamente sobre las placas para uso en las técnicas de selección de fármacos anteriormente mencionadas. Como alternativa, se pueden usar anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido.

En otra realización, se puede n usar ensayos de selección de fármacos competitivos en los que los anticuerpos de neutralización capaces de unirse a PILS específicamente compiten con un compuesto de ensayo para la unión de PILS. De esta manera, los anticuerpos se pueden usar para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos con PILS.

El ensayo de selección también puede implicar el control de la expresión de PILS. Por ejemplo, los reguladores de la proteína de expresión o ARNm en la célula se determina. El nivel de expresión de la proteína de PILS o ARNm la presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de expresión de la proteína de PILS o ARNm en la ausencia del compuesto candidato. Después el compuesto candidato se puede identificar como un regulador de expresión de PILS basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de la proteína de PILS o proteína de ARNm es mayor (estadísticamente significativamente mayor) en la presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica se identifica como un estimulador de la proteína de PILS o la expresión de ARNm. Como alternativa, cuando la expresión de la proteína de PILS es menor (estadísticamente significativamente menor) en la presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un inhibidor de la proteína de PILS o la expresión de ARNm. El nivel de la proteína de PILS o la expresión de ARNm en las células se puede determinar mediante los procedimientos descritos a continuación.

Ensayos de unión

Para los ensayos de unión, el compuesto de ensayo es preferiblemente una molécula pequeña que se une a y ocupa el sitio activo del polipéptido de PILS, haciendo por lo tanto que ligando se una al sitio inaccesible al sustrato de manera que la actividad biológica normal se evite. Los ejemplos de tales moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, pequeños péptidos o moléculas de tipo péptido. Los ligandos potenciales que se unen a un polipéptido de la invención incluyen, pero no se limitan a, los ligandos naturales de las proteasas de PILS conocidas y sus análogos o derivados.

En los ensayos de unión, o bien el compuesto de ensayo o el polipéptido de PILS puede comprender una marca detectable, tal como una marca fluorescente, de radioisótopo, quimioluminiscente, o enzimática, tal como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, o luciferasa. La detección de un compuesto de ensayo que se une al polipéptido de PILS se puede después llevar a cabo, por ejemplo, mediante conteo directo de radioemisión, mediante conteo de centelleo, o mediante la determinación de la conversión de un sustrato apropiado a un producto detectable. Como alternativa, la unión de un compuesto de ensayo a un polipéptido de PILS se puede determinar sin marcar ninguno de los interactuantes. Por ejemplo, se puede usar un microfisiómetro para detectar la unión de un compuesto de ensayo con un polipéptido de PILS. Un microfisiómetro (por ejemplo, Cytosensor^{TM}) es un instrumento analítico que mide la velocidad a la que la célula acidifica su ambiente usando un sensor potenciométrico que se puede dirigir por la luz (LAPS). Los cambios en esta velocidad de acidificación se pueden usar como un indicador de la interacción entre un compuesto de ensayo y PILS [Haseloff, (1988)].

La determinación de un compuesto de ensayo de unirse a PILS también se puede llevar a cabo usando una tecnología tal como el Análisis de Interacción Biomolecular (BIA) en tiempo real [McConnell, (1992); Sjolander, (1991)]. BIA es una tecnología para estudiar las interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los interactuantes (por ejemplo, BIAcore^{TM}). Los cambios en la resonancia de plasmón de superficie (SPR) del fenómeno óptico se pueden usar como una indicación de las reacciones en tiempo real entre las moléculas biológicas.

En todavía otro aspecto de la invención, un polipéptido de tipo PILS se puede usar como una "proteína cebo" en un ensayo de dos híbridos o ensayo de tres híbridos [Szabo, (1995); documento U.S. 5.283.317), para identificar otras proteínas que se unen a o interactúan con PILS y modulas su actividad.

El sistema de dos híbridos se basa en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que consta de dominios de unión de ADN y de activación separables. En resumen, el ensayo utiliza dos construcciones diferentes de de ADN. Por ejemplo, en una construcción el polinucleótido que codifica PILS se puede condensar a un polinucleótido que codifica el dominio de unión de ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En la otra construcción una secuencia de ADN que codifica una proteína no identificada ("presa" o "muestra") se puede condensar a un polinucleótido que codifica el dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si las proteínas "cebo" y "presa" son capaces de interactuar in vivo para formar un complejo dependiente de proteína, los dominios de unión de ADN y activación del factor de transcripción se ponen en estrecha proximidad. Esta proximidad permite la transcripción de un gen indicador (por ejemplo, LacZ), que está unido de manera operativa a un sitio regulador de la transcripción sensible al factor de transcripción. La expresión del gen indicador se puede detectar, y las colonias de células que contienen el factor de transcripción funcional se puede aislar y usar para obtener la secuencia de ADN que codifica la proteína que interactúa con PILS.

Puede ser deseable a inmovilizar o bien PILS (o polinucleótido) o el compuesto de ensayo para facilitar la separación de la forma unida a partir de las formas no unidas de uno ambos de los interactuantes, así como para acomodar la automatización del ensayo. De este modo, o bien el polipéptido de tipo PILS (o polinucleótido) o el compuesto de ensayo se puede unir a un soporte sólido. Los soportes sólidos adecuados incluyen pero no se limitan a, portaobjetos de vidrio o de plástico, placas de cultivo de tejido, pocillo de microtitulación, tubos, procesadores de silicona, o partículas tales como perlas (que incluyen, pero no se limitan a, látex, poliestireno, o perlas de vidrio). Cualquier procedimiento conocido en la técnica se puede usar para unir polipéptido de tipo PILS (o polinucleótido) o compuesto de ensayo a un soporte sólido, que incluye el uso de enlaces covalentes y no covalentes, absorción pasiva, o pares de resto de unión unidos respectivamente al polipéptido (o polinucleótido) o compuesto de ensayo y el soporte sólido. Los compuestos de ensayo están preferiblemente unidos al soporte sólido en una disposición, de manera que la localización de los compuestos de ensayo individuales se pueden rastrear. La unión de un compuesto de ensayo a PILS (o un polinucleótido que codifica PILS) se puede llevar a cabo en un recipiente adecuado para que contenga los reactivos. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos de microcentrí-
fuga.

En una realización, PILS es una proteína de fusión que comprende un dominio que permite la unión de PILS a un soporte sólido. Por ejemplo, se pueden adsorber las proteínas de fusión de la glutatión-S-transferasa sobre perlas de glutatión sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) o placas de microtitulación derivatizadas de glutatión, que después se combinan con el compuesto de ensayo o el compuesto de ensayo y la PILS no adsorbida; la mezcla se incuba después en condiciones conductivas para la formación de complejos (por ejemplo, en condiciones fisiológicas de sal y pH). Después de la incubación, las perlas o pocillos de placa de microtitulación se lavan para retirar cualesquiera componentes no unidos. La unión de los interactuantes se puede determinar o bien directamente o indirectamente, como se ha descrito anteriormente.

Como alternativa, los complejos se pueden disociar del soporte sólido antes de que se determine la unión.

Otras técnicas para inmovilizar las proteínas o polinucleótidos sobre un soporte sólido se pueden usar en los ensayos de selección de la invención. Por ejemplo, o bien PILS (o un polinucleótido que codifica PILS) o un compuesto de ensayo se puede inmovilizar utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. PILS biotinilada (o un polinucleótido que codifica PILS biotinilada) o compuestos de ensayo se pueden preparar a partir de biotina-NHS (N-hidroxisuccinimida) usando técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals; Rockford, III), y se inmovilizan en los pocillos de placas recubiertas de estreptavidina (Pierce Chemical). Como alternativa, los anticuerpos que se unen específicamente a PILS, olinucleótido, o un compuesto de ensayo pero que no interfieren con un sitio de unión deseado, tal como el sitio activo de PILS, se puede derivatizar a los pocillos de la placa. La diana o proteína no unida se puede atrapar en los pocillos mediante conjugación de anticuerpos.

Los procedimientos para detector tales complejos, además de los descrito anteriormente para los complejos inmovilizados por GST, incluyen inmunodetección de complejos que usa anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido de PILS o compuesto de ensayo, ensayos ligados a enzimas que dependen de la detección de una actividad del polipéptido de PILS, y electroforesis en gel de SDS en condiciones no reductoras.

La selección de los compuestos de ensayo que se unen a un polipéptido o polinucleótido de GPCR también se pueden llevar a cabo en células intactas. Cualquier célula que comprende un polipéptido o polinucleótido de GPCR se puede usar en un sistema de ensayo basado en células. Un polinucleótido de GPCR puede ser de origen natural en la célula o se puede introducir usando las técnicas tales como las descritas anteriormente. La unión del compuesto de ensayo a un polipéptido o polinucleótido de GPCR se determina como se ha descrito anteriormente

Ensayos funcionales

Los compuestos de ensayo se pueden ensayar por la capacidad de incrementar o disminuir la actividad de PILS de un polipéptido de PILS. La actividad de PILS se puede medir, por ejemplo, usando los procedimientos descritos en los ejemplos específicos, más adelante. La actividad de PILS se puede medir después de poner en contacto o bien una PILS purificada o una célula intacta con un compuesto de ensayo. Un compuesto de ensayo que disminuye la actividad de PILS al menos aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente aproximadamente 75, 90, o 100% se identifica como un agente potencial para disminuir la actividad de PILS. Un compuesto de ensayo que incrementa la actividad de PILS en al menos aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente aproximadamente 75, 90, o 100% se identifica como un agente para incrementar la actividad de PILS.

Expresión génica

En otra realización se identifican los compuestos de ensayo que aumentan o disminuyen la expresión génica de PILS. Como se usa en el presente documento, el término "se correlaciona con la expresión de un polinucleótido" indica que la detección de la presencia de ácidos nucleicos, el mismo o relacionado con una secuencia de ácido nucleico que codifica PILS, mediante análisis de Northern o PCR en tiempo real es indicativo de la presencia de ácidos nucleicos que codifican PILS en una muestra, y por lo tanto se correlaciona con la expresión de de la transcripción del polinucleótido que codifica PILS. El término "microdisposición", como se usa en el presente documento se refiere a una disposición de distintos polinucleótidos u oligonucleótidos dispuestos sobre un sustrato, tal como papel, nylon u otro tipo de membrana, filtro, procesador, portaobjetos de vidrio, o cualquier otro soporte sólido. Un polinucleótido de PILS se pone en contacto con un compuesto de ensayo, y la expresión de un ARN o producto de polipéptido del polinucleótido de PILS se determina. El nivel de expresión de un ARNm o polipéptido apropiado en presencia del compuesto de ensayo se compara con el nivel de expresión de ARNm o polipéptido en ausencia del compuesto de ensayo. El compuesto de ensayo se puede después identificar como un modulador de expresión basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de un ARNm o polipéptido es mayor en la presencia del compuesto de ensayo que en su ausencia, el compuesto de ensayo se identifica como un estimulador o potenciador de la expresión de ARNm o polipéptido. Como alternativa, cuando la expresión del ARNm o polipéptido es menor en la presencia del compuesto de ensayo que en su ausencia, el compuesto de ensayo se identifica como un inhibidor de la expresión de ARNm o polipéptido.

El nivel de la expresión de ARNm o polipéptido de PILS en las células se puede determinar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica para detectar ARNm o polipéptido. Se pueden usar procedimientos o bien cualitativos o cuantitativos. La presencia de productos polipeptídicos de un polinucleótido enzimático de tipo prostatina humana se puede determinar, por ejemplo, usando una diversidad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo procedimientos inmunoquímicos tales como radioinmunensayo, transferencia de Western, e inmunohistoquímica. Como alternativa, la síntesis de polipéptidos se puede determinar in vivo, en un cultivo celular, o en un sistema de traducción in vitro mediante la detección de la incorporación de aminoácidos marcados en PILS.

Tal selección se puede llevar a cabo o bien en un sistema de ensayo sin células o en una célula intacta. Cualquier célula que expresa un polinucleótido de PILS se puede usar en un sistema de ensayo basado en células. El polinucleótido de PILS puede ser de origen natural en la célula o se puede introducir usando técnicas tales como las descritas anteriormente. Se puede usar o bien un cultivo primario o una línea celular estabilizada.

Compuestos de ensayo

Los compuestos de ensayo adecuados para uso en los ensayos de selección se pueden obtener a partir de cualquier fuente adecuada, por ejemplo genotecas de compuestos convencionales. Los compuestos de ensayo también se pueden obtener usando cualesquiera de los numerosos planteamientos en los procedimientos de genotecas combinatorios conocidos en la técnica, incluyendo: genotecas biológicas, genotecas en fase sólida o de fase en solución que se pueden dirigir de manera espacial; procedimientos de genotecas sintéticas que requieren desconvolución; el procedimiento de genoteca de "una perla un compuesto"; y los procedimientos de genotecas sintéticas que usan selección de cromatografía de afinidad. El planteamiento de genoteca biológica se limita a genotecas de péptidos, mientras los otros cuatro planteamientos son aplicables a oligómero de péptido, no péptido o genotecas de moléculas pequeñas de los compuesto [Lam, (1997)]. Los ejemplos de los procedimientos para la síntesis de genotecas moleculares se pueden encontrar en la técnica. Las genotecas de los compuestos se pueden presentar en en solución o en perlas, bacterias, esporas, plásmidos o fago.

Indicaciones y procedimientos terapéuticos

Se ha encontrado por el presente solicitante que PILS se expresa en diversos tejidos humanos.

Trastorno cardiovasculares

Insuficiencia cardíaca se define como un estado patofisiológico en el que una anormalidad de la función cardíaca es responsable del fallo de que el corazón bombee sangre a una velocidad conmensurables con el requerimiento del tejido metabolizante. Incluye todas las formas de fallos de bombeo tales como alto rendimiento y bajo rendimiento, agudo y crónico, del lado derecho o izquierdo, sistólico o diastólico, independiente de la causa que sub-
yace.

El infarto de miocardio (MI) está generalmente provocado por una disminución repentina de en el caudal de flujo coronario que sigue a una oclusión trombótica de una arteria coronaria que se ha estrechado previamente mediante arteriosclerosis. La profilaxis de MI (prevención primaria y secundaria) se incluye así como el tratamiento agudo de MI y la prevención de las complicaciones.

Las enfermedades isquémicas son afecciones en las que el flujo coronario está restringido dando como resultado una perfusión que es inadecuada para que cumpla el requerimiento miocárdico para el oxígeno. Este grupo de enfermedades incluye angina estable, angina inestable e isquemia asintomática.

Las arritmias incluyen todas las formas de arritmias taquicárdicas ventriculares, taquicardia atrial, palpitación atrial, fibrilación ventricular así como, así como formas braquicárdicas de arritmias.

La aterosclerosis es una enfermedad cardiovascular en la que la pared del vaso se remodela, comprendiendo el lúmen del vaso. El proceso de remodelación aterosclerótica, implica la acumulación de las células, tanto células de músculo liso como células inflamatorias de monocitos / y de macrófagos, en la intima de la pared del vaso. Estas células están ocupadas por lípidos, probablemente de la circulación, para formar una lesión aterosclerótica madura. Aunque la formación de de estas lesiones es un proceso crónico, que ha aparecido durante décadas en la vida de un humano adulto, la mayoría de la morbilidad asociada a la aterosclerosis se produce cuando una lesión se rompe, liberando los desechos trombogénicos que rápidamente ocluye la arteria. Cuando se produce tal episodio agudo en la arteria coronaria, el infarto de miocardio puede asegurar, y en el caso peor, puede dar como resultado la
muerte.

La formación de la lesión aterosclerótica se puede considerar que se produzca en cinco fases se superposición tal como migración, acumulación de lípidos, reclutamiento de células inflamatorias, proliferación de células de los músculos lisos vasculares, y deposición de la matriz extracelular. Cada uno de estos procesos se puede mostrar que se produce en modelos de hombres y de animales de aterosclerosis, pero la contribución relativa de cada uno a la patología y significación clínica de la lesión no está clara.

De este modo, existe una necesidad de procedimientos y agentes terapéuticos para tratar patologías cardiovasculares, tales como aterosclerosis y otras afecciones relacionadas con la enfermedad arterial coronaria.

Las enfermedades cardiovasculares incluyen pero no se limitan a trastornos del corazón y el sistema vascular como insuficiencia cardíaca congestiva, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, todos los tipos de arritmias atriales y ventriculares, y aterosclerosis.

El riesgo de desarrollo de aterosclerosis y enfermedad de la arteria coronaria o arteria carótida (y de este modo el riesgo de tener un ataque cardíaco o apoplejía) se incrementa con el aumento de nivel de colesterol total. No obstante, los niveles extremadamente bajos de colesterol no pueden ser sanos. Los ejemplos de trastornos de metabolismo de lípidos son hiperlipidemia (niveles anormalmente altos de grasos (colesterol, triglicéridos, o ambos) en la sangre, se puede provocar mediante la historia familiar de hiperlipidemia), obesidad, una dieta alta en grasas, carencia de ejercicio, consume moderado a alto de alcohol, fumar cigarrillos, diabetes escasamente controlada, y una glándula tiroides infla activa), hiperlipidemias hereditarias (hiperlipoproteína de tipo I (hiperquilomicronemia familiar), hiperlipoproteinemia de tipo II (hipercolesterolemia familiar), hiperlipoproteinemia de tipo III hiperlipoproteinemia de tipo IV hipercolesterolemia familiar o hiperlipoproteinemia de tipo V), hipolipoproteinemia, lipidosis (provocada por anormalidades en las enzimas que metabolizan grasas), enfermedad de Gaucher, enfermedad de Niemann-Pick, enfermedad de Fabry, enfermedad de Wolman, xantomatosis cerebrotendinsa, sitosterolemia, enfermedad de Refsum, o enfermedad de Tay-Sachs.

La PILS humana se expresa en gran medida en los siguientes tejidos relacionados cardiovasculares: corazón, atrio del corazón (izquierdo), células endoteliales aórticas, células endoteliales de las arterias coronarias. La expresión en los tejidos anteriormente mencionados demuestra que la PILS humana o ARNm se puede utilizar para diagnosticar insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias, aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta. De manera adicional la actividad de la PILS humana se puede modular para tratar insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias, aterosclerosis en la artera o aorta o aorta coronaria.

Aplicaciones

La presente invención proporciona procedimientos tanto profilácticos como terapéuticos para insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias, aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta.

El procedimiento regulador de la invención implica poner en contacto una célula con un agente que modula una o más de las actividades de PILS. Un agente que modula la actividad puede ser un agente como se describe e en el presente documento, tal como un ácido nucleico o una proteína, un ligando afín de origen natural del polipéptido, un péptido, un peptidomimético, o cualquier molécula pequeña. En una realización, el agente estimula una o más de las actividades de PILS. Los ejemplos de tales agentes estimuladores incluyen la PILS activa y las moléculas de ácido nucleico que codifican una parte de PILS. En otra realización, el agente inhibe una o más de las actividades biológicas de PILS. Los ejemplos de tales agentes inhibidores incluyen molécula de ácidos nucleicos no codificantes y anticuerpos. Estos procedimientos reguladores se pueden realizar in vitro (por ejemplo, mediante el cultivo de la célula con el agente) o, como alternativa, in vivo (por ejemplo, mediante la administración del agente a un sujeto). Como tal, la presente invención proporciona procedimientos de tratamiento de un individuo aquejado de una enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión no deseada o actividad de PILS o una proteína en la ruta de señalización de PILS. En una realización, el procedimiento implica la administración de un agente como cualquier agente identificado o que se puede identificar mediante un ensayo de selección como se describe en el presente documento, o combinación de tales agentes que modulan supongamos hacia arriba o hacia abajo la expresión o actividad de PILS o de cualquier proteína en la ruta de señalización de PILS. En otra realización, el procedimiento implica la administración de un regulador de PILS como terapia para compensar la baja expresión o actividad reducida o no deseable de PILS o una proteína en la ruta de señalización de PILS.

La expresión de la actividad o expresión de PILS es deseable en las situaciones en las que la actividad o expresión enzimática es anormalmente bajo y en la que el incremento de actividad es probable que tenga un efecto beneficioso. De manera inversa, la inhibición de la actividad o expresión enzimática de PILS es deseable en las situaciones en las que la actividad o expresión de PILS es anormalmente alta y en la que la disminución de su actividad es probable que tenga un efecto beneficioso.

Esta invención además se ilustra mediante los siguientes ejemplos que no se deben considerar como limitantes. El contenido de todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas citadas en la presente solicitud se incorporan por la presente por referencia.

Composiciones farmacéuticas

Esta descripción además pertenece a agentes novedosos identificados por los ensayos de selección descritos anteriormente y sus usos para tratamientos como se describe en el presente documento.

Las moléculas de ácidos nucleicos, polipéptidos y anticuerpos (también denominados en el presente documento como "compuestos activos") usados en la invención se pueden incorporar en las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Tales composiciones típicamente comprenden la molécula de ácido nucleico, o anticuerpo y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Como se usa en el presente documento la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Se contempla el uso de tales medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto en la medida que cualquier medio o agente convencional es compatible con el compuesto activo, su uso en las composiciones. Los compuestos suplementariamente activos también se pueden incorporar en las composiciones.

La invención incluye el uso de un polinucleótido o polipéptido de PILS, o, un anticuerpo, una ribozima o un oligonucleótido no codificante que regula la actividad de un polipéptido de PILS, para la preparación de una composición farmacéutica útil para el tratamiento de insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias, aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta así como procedimientos para preparar tales composiciones mediante la combinación de uno o más de tales reguladores y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Un inhibidor de PILS se puede producir usando los procedimientos que se conocen en general en la técnica. En particular, se puede usar la PILS purificada para producir anticuerpos o para seleccionar genotecas de agentes farmacéuticos para identificar los que se unen de manera específica a PILS. Los anticuerpos de PILS también se pueden generar usando los procedimientos que se conocen bien en la técnica. Tales anticuerpos pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, de una sola cadena, fragmentos Fab, y fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab. Los anticuerpos neutralizantes del tipo a los que inhiben la formación de dímeros se prefieren especialmente para uso terapéutico.

En otra realización de la invención, los polinucleótidos que codifican PILS, o cualquiera se su fragmento o complemento, se puede usar para propósitos terapéuticos. En un aspecto, el complemento del polipéptido que codifica PILS se puede usar en situaciones en las que sería deseable bloquear la transcripción del ARNm. En particular, las células se pueden transformar con secuencias complementarias a los polinucleótidos que codifican PILS. De este modo, las moléculas complementarias o fragmentos se pueden usar para modular la actividad de PILS, o para lograr la regulación de la función génica. Tal tecnología se conoce ahora bien en la técnica, y los oligonucleótidos codificantes o no codificantes o fragmentos mayores se pueden diseñar a partir de diversas localizaciones junto con las regiones codificantes o de control de las secuencias que codifican PILS.

Los vectores de expresión derivados de retrovirus, adenovirus, o virus de herpes o de vaccinia, o de diversos plásmidos bacterianos, se pueden usar para la administración de secuencias de nucleicos complementarias con los polinucleótidos del gen que codifica PILS. Estas técnicas se describen, por ejemplo en [Scott y Smith (1990)].

Cualquiera de los procedimientos anteriores descritos anteriormente se pueden aplicar a cualquier sujeto en necesidad de tal terapia, incluyendo, por ejemplo, mamíferos tales como perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos, y lo más preferiblemente, seres humanos.

Se describe la administración de una composición farmacéutica que contiene PILS junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, para cualquiera de los efectos terapéuticos descritos anteriormente. Tales composiciones farmacéuticas pueden constar de PILS, anticuerpos de PILS, y miméticos, agonistas, o inhibidores de PILS. Las composiciones se pueden administrar solas o en combinación con al menos otro agente, tal como un compuesto estabilizante, que se puede administrar en cualquier vehículo estéril, farmacéuticamente biocompatible que incluye, pero no se limita a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, y agua. Las composiciones se pueden administrar a un paciente solo, o en combinación con otros agentes, fármacos u hormonas.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para que sea compatible con su vía propuesta de administración. Los ejemplos de vías de administración incluyen parenteral, por ejemplo, administración intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica ((tópica), transmucosal, y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica, o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites estables, polietilen glicoles, glicerina, propilen glicol, u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tal como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tal como ácido etilen diamino tetra acético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad tal como cloruro de sodio o dextosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede encerrar en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiple hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática Cremophor EM^{TM} (BASF, Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado de que se pueda administrar fácilmente por jeringa. Deben ser estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe conservar contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, un glicerol de tipo poliol farmacéuticamente aceptable, propilen glicol, polietilen glicol líquido, y sus mezclas adecuadas. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro sódico en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede llevar a cabo mediante la inclusión en la composición de un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación del compuesto activos (por ejemplo, un polipéptido o anticuerpo) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de la esterilización por filtración. En general, se preparan las dispersiones mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos preferidos de preparación de son secado al vacío y secado por congelación que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de su solución estéril por filtración.

Las composiciones orales en general incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Se pueden encerrar en compuestos de gelatina o comprimirse en comprimidos. Para el propósito de la administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usarse en la forma de comprimidos, trociscos, o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar usando un vehículo fluido para uso como un enjuague, en el que el compuesto en el vehículo fluido se aplica por vía oral y se hace crujir y se expectora o se ingiere.

Los agentes de unión farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes se pueden incluir como parte de la composición. Los comprimidos, píldoras, cápsulas, trociscos y similares pueden contener cualesquiera de los siguientes ingredientes, o los compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente disgregante tal como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o esterotas; un deslizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente edulcorante tal como pipermín, salicilato de metilo, o aroma de naranja.

Para la administración mediante inhalación, los compuestos se administran en la forma de una pulverización en aerosol a partir de un recipiente presurizado o dispensador que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica, los penetrantes apropiados a la barrera a pernear se usan en la formulación. Tales penetrantes se conocen en general en la técnica, e incluyen, por ejemplo, la administración transmucosal, detergentes, sales biliares, y derivados del ácido fusídico. La transmucosal se puede llevar a cabo mediante el uso de pulverizadores nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas, ungüentos, ges, o cremas como se conoce en general en la técnica.

Los compuestos también se pueden preparar en la forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para la administración rectal.

En una realización los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de distribución microencapsuladas. Se pueden usar polímeros, biodegradables, biocompatible, tales como vinil acetato de etileno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los procedimientos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. También se pueden obtener los materiales comercialmente a partir de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. También se pueden usar suspensiones de liposomas (que incluyen liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales para los antígenos virales) y también se pueden usar como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstos se pueden preparar de acuerdo con los procedimientos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se describe en el documento U.S. 4.522.811.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en la forma de dosificación unitaria para la fácil administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la invención se dictan mediante y dependiendo directamente de las únicas características del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de combinación tal como un compuesto activo para el tratamiento de individuos.

Las secuencias de polinucleótidos que codifican PILS se pueden usar para la diagnosis de aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta asociada a la expresión de PILS. Las secuencias de polinucleótidos que codifican PILS se pueden usar en análisis de Southern, Northern, o transferencia de puntos, u otras tecnologías basadas en membrana; en las tecnologías de PCR; en ensayos de aforación, alfiler, y de ELISA; y en microensayos que utilizan fluidos o tejidos a partir de biopsias de pacientes para detectar la expresión de PILS alterada. Tales procedimientos cualitativos o cuantitativos se conocen bien en la técnica.

En un aspecto particular, las secuencias de polinucleótidos que codifican PILS pueden ser ensayos útiles para detectar la presencia de trastornos asociados, particularmente los mencionados anteriormente. Las secuencias de nucleótidos que codifican PILS se pueden marcar mediante procedimientos convencionales y se añaden a una muestra de fluido o tejido de un paciente en condiciones adecuadas para la formación de los complejos de hibridación. Después de un período de incubación adecuado, se lava la muestra y se cuantifica la señal y se compara con un valor convencional. Si la cantidad de señal en la muestra del paciente está significativamente alterada de la de una muestra de control comparable, las secuencias de nucleótidos se han hibridizado con la secuencias de nucleótidos en la muestra, y la presencia de niveles alterados de secuencias de nucleótidos que codifican PILS en la muestra indica la presencia del trastorno asociado. Tales ensayos también se pueden usar para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento terapéutico particular en estudios animales, en ensayos clínicos, o en el control del tratamiento de un paciente individual.

Con el fin de proporcionar una base para la diagnosis de aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta saciado a la expresión de PILS, se establece un perfil normal o convencional para la expresión. Esto se puede llevar a cabo mediante la combinación de fluidos o extractos de células que se toman de sujetos normales, o bien un animal o ser humano, con una secuencia, o su fragmento, que codifica PILS, en condiciones adecuadas para la hibridación o amplificación. La hibridación convencional se puede cuantificar comparando los valores obtenidos de sujetos normales con valores de un experimento en los que se usa una cantidad conocida de un polinucleótido sustancialmente purificado. Los valores convencionales obtenidos a partir de muestras normales se puede comparar con los valores obtenidos a partir de muestras de pacientes que tienen los síntomas de un trastorno. La desviación de los valores convencionales se usa para establecer la presencia de un trastorno.

Determinación de una dosis terapéuticamente eficaz

La determinación de una dosis terapéuticamente eficaz se conoce bien dentro de la capacidad de los expertos en la técnica. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de ingrediente activo que aumenta o disminuye la actividad de PILS con relación a la actividad de PILS que se produce en la ausencia de la dosis terapéuticamente eficaz. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente o bien en ensayos de cultivos celulares o en modelos animales, usualmente ratones, conejos, perros, o cerdos. El modelo animal también se puede usar para determinar el intervalo de concentración apropiada y vía de administración en seres humanos.

La eficacia terapéutica y toxicidad, por ejemplo, DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población) y la DL_{50} (la dosis letal para el 50% de la población), se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos celulares o de animales experimentales. La relación de dosis de efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación, DL_{50}, / DE_{50}. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que muestran grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos a partir de ensayos de cultivos de células y estudios animales se usan en la formulación de un intervalo de dosificación para uso humano. La dosificación contenida en tales composiciones es preferible dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE_{50} con o ninguna toxicidad. La dosificación varía en este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada, sensibilidad del paciente, y la vía de administración. La dosificación exacta se determinará por el facultativo, a la luz de los factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. La dosificación y administración se ajustan para proporcionar los niveles suficientes del ingrediente activo o para mantener el efecto deseado. Los factores que se pueden tener en cuanta incluyen la gravedad del estado patológico, salud general del sujeto, edad, peso, y género del sujeto, tiempo y frecuencia de administración, combinación (es) de fármacos, sensibilidades de reacción, y, y tolerancia 7 respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de larga duración se pueden administrar cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la semivida y velocidad de eliminación de las formulaciones particulares.

Las cantidades de dosificación normales pueden variar entre 0,1 microgramos y 100.000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g, dependiendo de la vía de administración. La guía para unas dosificaciones particulares y procedimientos de administración se proporciona en la bibliografía y en general están disponibles para los expertos en la técnica. Los expertos en la técnica emplearán diferentes formulaciones para los nucleótidos para los nucleótidos y para las proteínas o sus inhibidores. De manera similar, la administración de polinucleótidos o polipéptidos será específica de las células particulares, afecciones, localizaciones, etc. Si el reactivo es un anticuerpo de una sola cadena, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo se pueden construir e introducir en una célula o bien ex vivo o in vivo usando técnicas bien establecidas que incluyen, pero no se limitan a, transferencia de ADN mediada por transferían - policatión, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados, fusión celular mediada por liposomas, transporte intracelular de perlas de látex revestidas con ADN, fusión de protoplastos, infección viral, electroporación, "pistola de genes", y transfección mediada por DEAE- o fosfato de calcio.

Si el producto de expresión es ARNm, el reactivo es preferiblemente un oligonucleótido no codificante o una ribozima. Los polinucleótidos que expresan oligonucleótidos no codificantes o ribozimas se pueden introducir en las células mediante una diversidad de procedimientos, como se ha mencionado anteriormente. Preferiblemente, un reactivo reduce la expresión del gen de PILS o la actividad de PILS mediante al menos aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente aproximadamente 75, 90, o 100% con relación a la ausencia del reactivo. La eficacia del mecanismo elegido para que disminuya el nivel de expresión del gen de PILS o la actividad de PILS se puede determinar usando procedimientos bien conocidos en la técnica, tales como hibridación de sonadas de nucleótidos a ARNm específico de PILS, RT-PCR cuantitativa, detección inmunológica de PILS, o medición de la actividad de PILS.

En cualquiera de las realizaciones descritas anteriormente, cualquiera de las composiciones farmacéuticas de la invención se puede administrar en combinación con otros agentes terapéuticos apropiados. La selección de los agentes apropiados para uso en la terapia de combinación se puede realizar por los expertos en la técnica, de acuerdo con los principios farmacéuticos convencionales. La combinación de los agentes terapéuticos puede actuar de manera sinérgica para efectuar el tratamiento o prevención de los diversos trastornos descritos anteriormente. Usando este planteamiento, se puede ser capaz de lograr eficacia terapéutica con dosificaciones menores de cada agente, reduciendo de este modo el potencial de efectos secundarios adversos. Cualquiera de los procedimientos terapéuticos descritos anteriormente se puede aplicar a cualquier sujeto en necesidad de tal terapia, incluyendo, por ejemplo, mamíferos tales como perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos, y lo más preferiblemente, seres humanos.

Las moléculas de ácidos nucleicos usadas en la invención son las moléculas de ácidos nucleicos que están contenidas en un grupo de moléculas de ácido nucleico constituidas por (i) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2, (ii) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 1, (iii) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 1, (iv) moléculas de ácido nucleico la hebra complementaria del cual se hibrida a en condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico de (i), (ii), o (iii); y (v) moléculas de ácido nucleico la secuencia de los cuales difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (iii) debido a la degeneración del código genético, en la que el polipéptido codificado por dicha molécula de ácido nucleico tiene actividad de PILS.

Los polipéptidos usados en la invención son los polipéptidos que están contenidos en un grupo de polipéptidos que constan de (i) polipéptidos que tienen la secuencia de SEQ ID NO: 2, (ii) polipéptidos que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 2, (iii) polipéptidos codificados por las moléculas de ácido nucleico usadas en la invención y (iv) polipéptidos que muestras al menos 99%, 98%, 95%, 90%, u 80% de homología con un polipéptido de (i), (ii), o (iii), en los que dicho polipéptido purificado tiene acción de PILS.

Un objeto de la invención es un procedimiento de selección para agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de una enfermedad comprendida en un grupo de enfermedades constituidas por insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias, aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero que comprende las etapas de (i) poner en contacto un compuesto de ensayo con un polipéptido de PILS, (ii) detectar la unión de dicho compuesto de ensayo a dicho polipéptido de PILS. Por ejemplo, los compuestos que que se unen al polipéptido de PILS son agentes terapéuticos potenciales identificados para tal enfermedad.

Otro objeto de la invención es un procedimiento de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de una enfermedad comprendida en un grupo de enfermedades constituidas por insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias, aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero que comprende las etapas de (i) determinar la actividad de un polipéptido de PILS a una cierta concentración de un compuesto de ensayo o en la ausencia de dicho compuesto de ensayo, (ii) determinar la actividad de dicho polipéptido a una concentración diferente de dicho compuesto de ensayo. Por ejemplo, los compuestos que conducen a una diferencia en la actividad del polipéptido de PILS en (i) y (ii) son agentes terapéuticos potenciales identificados para tal enfermedad.

Otro objeto de la invención es un procedimiento de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de una enfermedad comprendida en un grupo de enfermedades constituidas por insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias, aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero que comprende las etapas de (i) determinar la actividad de un polipéptido de PILS a una cierta concentración de un compuesto de ensayo o en la ausencia de dicho compuesto de ensayo, (ii) determinar la actividad de un polipéptido de PILS en la presencia de un compuesto conocido por ser un regulador de un polipéptido de PILS. Por ejemplo, los compuestos que muestran efectos similares sobre la actividad del polipéptido de PILS en (i) cuando se compara con los compuestos usados en (ii) son agentes terapéuticos potenciales identificados para tal
enfermedad.

Otros objetos de la invención son procedimientos de los anteriores, en los que la etapa de poner en contacto es en el interior o en la superficie de una célula.

Otros objetos de la invención son procedimientos de los anteriores, en los que la célula está in vitro.

Otros objetos de la invención son procedimientos de los anteriores, en los que la la etapa de poner en contacto es en un sistema sin células.

Otros objetos de la invención son procedimientos de los anteriores, en los que el polipéptido está acoplado a una marca detectable.

Otros objetos de la invención son procedimientos de los anteriores, en los que el compuesto está acoplado a una marca detectable.

Otros objetos de la invención son procedimientos de los anteriores, en los que el compuesto de ensayo desplaza a un ligando que se une primero al polipéptido.

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Otros objetos de la invención son procedimientos de los anteriores, en los que el polipéptido está unido a un soporte sólido.

Otros objetos de la invención son procedimientos de los anteriores, en los que el compuesto está unido a un soporte sólido.

Otro objeto de la invención es un procedimiento de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de una enfermedad comprendida en un grupo de enfermedades constituidas por insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias, aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero que comprende las etapas de (i) poner en contacto un compuesto de ensayo con un polipéptido de PILS, (ii) detectar la unión de dicho compuesto de ensayo a dicho polipéptido de PILS. Los compuestos que, por ejemplo, se unen al polinucleótido de PILS son agentes terapéuticos potenciales identificados para tal enfermedad.

Otro objeto de la invención es el procedimiento de los anteriores, en el que la molécula de ácido nucleico es ARN.

Otro objeto de la invención es un procedimiento de los anteriores, en el que la etapa de contacto es dentro de o en la superficie de una célula.

Otro objeto de la invención es un procedimiento de los anteriores, en el que la etapa de contacto es un sistema libre de células.

Otro objeto de la invención es un procedimiento de los anteriores, en el que el polinucleótido está unido a una marca detectable.

Otro objeto de la invención es un procedimiento de los anteriores, en el que el compuesto está acoplado a una marca detectable.

Otro objeto de la invención es un procedimiento de diagnosis de aterosclerosis en arteria coronaria o aorta en un mamífero que comprende las etapas de (i) determinar la cantidad de un polinucleótido de PILS en una muestra tomada de dicho mamífero, (ii) determinar la cantidad de polinucleótido de PILS un mamífero sano y/o enfermo. Una enfermedad se diagnostica, por ejemplo, si existe una similitud sustancial en la cantidad de polinucleótido de PILS en dicho mamífero de ensayo cuando se compara con un mamífero enfermo.

Otro objeto de la invención es una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad comprendida en un grupo de enfermedades constituidas por insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias, aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero que comprende un agente terapéutico que regula la actividad de un polipéptido de PILS, en el que dicho agente terapéutico es (i) un oligonucleótido, (ii) un anticuerpo, o (iii) una ribozima.

Otro objeto de la invención es una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad comprendida en un grupo de enfermedades constituidas por insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias, aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero que comprende un polinucleótido de PILS.

Otro objeto de la invención es una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad comprendida en un grupo de enfermedades constituidas por insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias, aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero que comprende un polipéptido de PILS.

Los ejemplos dados a continuación se proporcionan para ilustrar el objeto de la invención. Estos ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no se incluyen con objeto de limitar la invención.

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Ejemplos

Ejemplo 1

Búsqueda de secuencias homólogas en las bases de datos de las secuencias públicas

El grado se homología se puede calcular fácilmente mediante procedimientos conocidos. Los procedimientos preferidos para determinar la homología se diseñan para proporcionar la coincidencia mayor entre las secuencias ensayadas. Los procedimientos para determinar la homología se codifican en los programas de ordenador disponibles públicamente tales como BestFit, BLASTP, BLASTN, y FASTA. Los programas BLAST están públicamente disponibles de NCBI y otras fuentes en Internet.

Para la PILS se identificaron los siguientes aciertos mediante el uso del algoritmo de BLAST [Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ; Nucleic Acids Res 1 de sep 1 de 1997; 25 (17): 3389 - 402] y el siguiente establecimiento de parámetros: matriz = BLOSUM62 y filtro de complejidad bajo. Se investigaron las siguientes bases de datos: NCBI (base de datos no redundante) y base de datos de patentes DERWENT (Geneseq).

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Se encontraron las siguientes coincidencias:

>gb|AAF20384.1|AF183569_1 aminopeptidasa PILS [Homo sapiens] Longitud = 941 Puntuación = 1904 bits (4932), Expectativa = 0,0 Identidades = 941/941 (100%), Positivos = 941/941 (100%)

>gb|AAF34664.1|AF222340_1 receptor del factor de necrosis tumoral de tipo 1 que pierde el regulador de la aminopeptidasa [Homo sapiens] gb|AAH30775.1| receptor del factor de necrosis tumoral de tipo 1 que pierde el regulador de la aminopeptidasa [Homo sapiens] Longitud = 941 Puntuación = 1896 bits (4912), Expectativa = 0,0 Identidades = 937/941 (99%), Positivos = 939/941 (99%)

>gb|AAF07395.1|AF106037_1 aminopeptidasa de leucina derivada de adipocitos [Homo sapiens] Longitud = 941 Puntuación = 1891 bits (4899), Expectativa = 0,0 Identidades = 935/941 (99%), Positivos = 937/941 (99%)

>gb|AAN98130.1| Secuencia 353 de la patente de Estados unidos nº 6478825 Longitud = 941 Puntuación = 1891 bits (4898), Expectativa = 0,0 Identidades = 935/941 (99%), Positivos = 938/941 (99%)

>dbj|BAA25451.2| proteína KIAA0525 [Homo sapiens] Longitud = 951 Puntuación = 1887 bits (4888), Expectativa = 0,0 Identidades = 933/939 (99%), Positivos = 936/939 (99%)

>ref|NP_057526.2| receptor del factor de necrosis tumoral de tipo 1 que pierde el regulador de la aminopeptidasa; aminopeptidasa de leucina derivada de adipocitos; aminopeptidasa PILS [Homo sapiens] gb|AAK37777.1| isoforma a de la aminopeptidasa 2 de leucina derivada de adipocitos [Homo sapiens] gb|AAK37778.1| isoforma a de la aminopeptidasa 2 de leucina derivada de adipocitos [Homo sapiens] Longitud = 948 Puntuación = 1885 bits (4882), Expectativa = 0,0 Identidades = 932/939 (99%), Positivos = 935/939 (99%)

>sp|Q9NZ08|ART1_HUMAN precursor de la aminopeptidasa de leucina derivada de adipocitos (A-LAP) (ARTS-1) (Aminopeptidasa PILS) (aminopeptidasa específica de leucilo insensible a puromicina) (PILS-AP) (receptor del factor de necrosis tumoral de tipo 1 que pierde el regulador de la aminopeptidasa) Longitud = 929 Puntuación = 1872 bits (4849), Expectativa = 0,0 Identidades = 925/929 (99%), Positivos = 927/929 (99%)

>ref|NP_109636.1| receptor del factor de necrosis tumoral de tipo 1 que pierde el regulador de la aminopeptidasa; aminopeptidasa de leucina derivada de adipocitos [Mus musculus] dbj|BAB11982.1| aminopeptidasa inducida por VEGF [Mus musculus] dbj|BAC26904.1| producto de proteína sin nombre [Mus musculus] gb|AAH46610.1| receptor del factor de necrosis tumoral de tipo 1 que pierde el regulador de la aminopeptidasa [Mus musculus] Longitud = 930 Puntuación = 1623 bits (4202), Expectativa = 0,0 Identidades = 791/928 (85%), Positivos = 862/928 (92%), Huecos = 1/928 (0%)

>sp|Q9EQH2|ART1_MOUSE precursor de aminopeptidasa de leucina derivado de adipocitos (A-LAP) (ARTS-1) (Aminopeptidasa PILS) (aminopeptidasa específica de leucilo insensible a puromicina) (PILS-AP) (aminopeptidasa inducida por VEGF) gb|AAG44260.1|AF227511_1 aminopeptidasa de leucina derivada de adipocitos [Mus musculus] Longitud = 930 Puntuación = 1618 bits (4191), Expectativa = 0.0 Identidades = 789/928 (85%), Positivos = 860/928 (92%), Huecos = 1/928 (0%)

>sp|Q9JJ22|ART1_RAT precursor de aminopaptidasa de leucina derivada de Adipoitos (A-LAP) (ARTS-1) (Aminopeptidasa PILS) (aminoespecífica de leucilo insensible a puromicina) (PILS-AP) gb|AAF73106.1|AF148323_1 aminopeptidasa PILS [Rattus norvegicus] Longitud = 930 Puntuación = 1608 bits (4164), Expectativa = 0,0 Identidades = 784/928 (84%), Positivos = 857/928 (91%), Huecos = 1/928 (0%)

>ref|NP_110463.1| aminopeptidasa PILS específica de leucilo [Rattus norvegicus] gb|AAF73107.1|AF148324_1 aminopeptidasa PILS [Rattus norvegicus] Longitud = 884 Puntuación = 1526 bits (3950), Expectativa = 0,0 Identidades = 744/882 (84%), Positivos = 814/882 (91%), Huecos = 1/882 (0%)

>dbj|BAC30569.1| producto de proteína sin nombre [Mus musculus] Longitud = 694 Puntuación = 1256 bits (3251), Expectativa = 0,0 Identidades = 611/692 (88%), Positivos = 653/692 (94%)

>gb|AAM17820.1| Secuencia 1 de la patente de estados unidos nº 6362324 Longitud = 960 Puntuación = 966 bits (2496), Expectativa = 0,0 Identidades = 476/934 (50%), Positivos = 646/934 (68%), Huecos = 15/934 (1%)

>ref|NP_071745.1| aminopeptidasa [Homo sapiens] gb|AAG28383.|AF191545_1 aminopeptidasa [Homo sapiens] Longitud = 960 Puntuación = 966 bits (2496), Expectativa = 0,0 Identidades = 476/934 (50%), Positivos = 646/934 (68%), Huecos = 15/934 (1%)

>dbj|AC38159.1| producto de proteína sin nombre [Mus musculus] Longitud = 549 Puntuación = 952 bits (2461), Expectativa = 0,0 Identidades = 461/549 (83%), Positivos = 507/549 (91%), Huecos = 1/549 (0%)

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Ejemplo 2

Perfil de expresión

Se aisló ARN celular total a partir de células mediante uno de dos procedimientos convencionales: 1) centrifugación en gradiente de densidad de isotiocianatao de guanidina/cloruro de cesio [Kellogg, (1990)]; o con el protocolo del Tri-Reagent de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Molecular Research Center, Inc., Cincinatti, Ohio). ARN total preparado mediante el protocolo de Tri-reagent se trató con ADNasa I para eliminar la contaminación de AND genómico.

Para la cuantificación relativa de la distribución del ARNm de PILS, ARN total de cada fuente de célula o tejido primero se transcribió de manera inversa, 85 \mug de ARN total se transcribió de manera inversa usando 1 \mumol de cebadores de hexámeros al azar, 0,5 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP (Qiagen, Hilden, Alemania), 3000 U RnaseQut (Invitrogen, Groningen, Holanda) en un volumen final de 680 \mul. El tampón de síntesis de la primera hebra y transcriptasa inversa de Omniscript (2 u/\mul) eran de (Qiagen, Hilden, Alemania). La reacción se incubó a 37ºC durante 90 minutos y se enfrió sobre hielo. El volumen se ajustó hasta 6800 \mul con agua, produciendo una concentración final de 12,5 ng/\mul de ARN de partida.

Para la cuantificación relativa de ARNm de PILS mRNA en las células y tejidos se usó el sistema de detección de secuencias Perkin Elmer ABI Prism RTM. 7700 o Biorad iCycler de acuerdo con las especificaciones y protocolos del fabricante. Se establecieron las reacciones de la PCR para cuantificar PILS y los genes de gobierno HPRT (hipoxantina fosforribosiltransferasa), GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), \beta-actina, y otros. Los cebadores directos e inversos y las sonadas para PILS se diseñaron usando el software Perkin Elmer ABI Primer Express^{TM} y se sintetizaron mediante TibMolBiol (Berlin, Alemania). La secuencia del cebador directo de PILS era: Cebador 1 (SEQ ID NO: 3). La secuencia del cebador inverso de PILS era Cebador 2 (SEQ ID NO: 4). Sonda 1 (SEQ ID NO: 5), marcada con FAM (carboxifluorescein succinimidil éster) como el tinte indicador y TAMRA (carboxitetrametilrrodamina) como el inactivador, se usa como sonda para PILS. Se prepararon los siguientes reactivos en un total de of 25 \mul: 1 x de tampón A TaqMan A, 5,5 mM de MgCl_{2}, 200 nM de dATP, dCTP, dGTP, y dUTP, 0,025 U/\mul AmpliTaq Gold^{TM}, 0,01 U/\mul AmpErase y Sonda 1 (SEQ ID NO: 4), cebadores directo e inverso de PILS cada uno a 200 nM, 200 nM de sonda marcada con FAM/TAMRA de PILS, y 5 \mul de ADNc de molde. Los parámetros de ciclación térmica fueron 2 min a 50ºC, seguido de 10 min a 95ºC, seguido de 40 ciclos de fusión a 95ºC durante 15 sec e hibridación/extensión a 60ºC durante 1 min.

Cálculo de los valores de CT corregidos

El valor de CT (ciclo umbral) se calcula como se ha descrito en la sección "Determinación cuantitativa de ácidos nucleicos". El valor de CF (factor para la corrección del ciclo umbral) se calcula como sigue:

1.

Se establecieron las reacciones de la PCR para cuantificar los genes de gobierno (HKG) para cada muestra de ADNc.

2.

Los valores de CT_{HKG} (ciclo umbral para el gen de gobierno) se calcularon como se ha descrito en la sección "Determinación cuantitativa de ácidos nucleicos".

3.

Se calcularon los valores medios de CT_{HKG} (valor medio de CT todos los HKG ensayados sobre un ADNc) de todos los HKG para cada ADNc

(n = número de HKG):

Valor medio de CT_{HGC-n} = (valor de CT_{HGK1} + valor de CT_{HGK2} + ... valor de CT_{HGC-n}/n

4.

Valor medio de CT panel (valor medio de CT todos los HKG en todos los ADNc ensayados) = (valor medio de CT_{HKG1} + valor medio de CT_{HKG2} +... + valor medio de CT_{HKG-y}) / y (y = número de los ADNc)

5.

CF_{ADNc-n} (factor de corrección para ADNc n) = valor medio de CT panel - valor medio de CT_{HKG-n}

6.

CT_{ADNc-n} (valor de CT del gen ensayado para ADNc n) + CF_{ADNc-n} (factor de corrección para ADNc) = CT_{cor-ADNc}

(valor corregido de CT para un gen sobre ADNc n)

Cálculo de la expresión relativa

Definición: valor mayor de CT_{cor-ADNc-n} \neq 40 se define como CT_{cor-ADNc} [alto]

Expresión relativa = 2^{(CTcor-cDNA[alto] - CTcor-ADNc-n)}

Tejidos

Se investigó la expresión de PILS en los tejidos en la tabla 1.

Perfil de expresión

Los resultados de la cuantificación del ARNm (perfil de expresión) se muestra en la Tabla 1.

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TABLA 1 Expresión relativa de PILS en diversos tejidos humanos

1

3

4

5

6

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Ejemplo 3

Análisis no codificante

El conocimiento de la secuencia correcta, completa de ADNc que codifica PILS permite su uso como una herramienta para la tecnología no codificante en la investigación de la función génica. Los oligonucleótidos ADNc, fragmentos genómicos que comprende la hebra no codificante de un polinucleótido que codifica PILS se usan o bien in vitro o in vivo para inhibir la traducción del ARNm. Tal tecnología se conoce ahora bien en la técnica, y las moléculas no codificantes se pueden diseñar en diversos lugares junto con las secuencias de nucleótidos. Mediante el tratamiento de células o animales de ensayo completes con tales secuencias no codificantes, el gen de interés se desconecta de manera eficaz. Frecuentemente, la función del gen se averigua observando el comportamiento en el nivel intracelular, celular, tejido u organismo (por ejemplo, letalidad, pérdida de función diferenciada, cambios en morfología, etc).

Además de usar las secuencias construidas para interrumpir la transcripción de un marco abierto de lectura, la modificación de la expresión génica se obtiene diseñando secuencias no codificantes a las regiones de intrones, elementos promotores/potenciadores, o incluso para los genes reguladores de tramitación.

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Ejemplo 4

Expresión de PILS

La expresión de PILS se lleva a cabo mediante la subclonación de los ADN en vectores de expresión apropiados y transfectando los vectores en vectores de expresión tales como, por ejemplo, E. coli. En un caso particular, el vector se modifica por ingeniería genética de tal forma contiene un promotor para la \beta-galactosidasa, cadena arriba del sitio de clonación, seguido de la secuencia que contiene la metionina amino terminal y los siete restos posteriores de la \beta-galactosidasa. Inmediatamente después de estos ocho restos es un promotor bacteriófago modificado por ingeniería genética útil para el cebado artificial y transcripción y para proporcionar un número de sitios de restricción de endonucleasa únicos para la clonación.

La inducción de la cepa bacteriana aislada, transfectada con la isopropil \beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) usando procedimientos convencionales produce una proteína de fusión que corresponde a los siete restos primeros de la \beta-galactosidasa, aproximadamente 15 restos de "engarce", y el péptido codificado entro del ADNc. Ya que las inserciones de clones de ADNc se generan esencialmente mediante un procedimiento al azar, existe una probabilidad del 33% de que el ADNc inducido estará en el marco de lectura correcto para la traducción apropiada. Si el ADNc no está en el marco de lectura apropiado, se obtiene mediante la supresión o inserción del número apropiado de bases usando procedimientos bien que incluyen mutagénesis in vitro, digestión con exonucleasa III o o nucleasa de alubia mung, o la inclusión de un engarce de oligonucleótidos de longitud apropiada.

El ADNc de PILS se transfiere en otros vectores conocidos por ser útiles para la expresión de proteínas en huéspedes específicos. Los cebadores de oligonucleótidos que contienen sitios de clonación así como un segmento de ADNc (aproximadamente 25 bases) suficiente para hibridarse a tramos en ambos extremos del ADNc diana se sintetiza químicamente mediante procedimientos convencionales. Estos cebadores se usan después para amplificar el segmento del gen deseado mediante la PCR. El segmento del gen resultante se digiere con enzimas de restricción adecuados en condiciones convencionales y se aíslan mediante electroforesis en gel. Como alternativa, se producen segmentos de genes similares mediante digestión del ADNc con enzimas de restricción adecuadas. Usando los cebadores apropiados, los segmentos de la secuencia de codificación de uno o más genes se ligan conjuntamente y se clonan en vectores apropiados. Es posible optimizar la expersión mediante la construcción de tales secuencias quiméricas.

Los huéspedes de expresión adecuados para tales moléculas quiméricas incluyen, pero no se limitan a, células de mamíferos tales como Células de Ovario de Hámster Chino (CHO) y 293 humanas, células de insecto, tales como células Sf9, células de levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae y y células bacterianas tal como E. coli. Para cada uno de estos sistemas, un vector de expresión útil también incluye un origen de replicación para permitir la propagación en bacterias, y un marcador seleccionable tal como el gen de resistencia a antibiótico \beta-lactamasa para permitir la selección de plásmidos en bacterias. Además, el vector puede incluir un segundo marcador seleccionable tal como el gen neomicin fosfotransferasa para permitir la selección en células huésped eucarióticas transfectadas. Los vectores para uso en huéspedes de expresión eucarióticos requieren elementos de procesamiento de ARN tales como secuencias de 3' poliadenilación si tales no son parte del ADNc de interés.

De manera adicional, el vector contiene promotores o potenciadores que incrementan la expresión génica. Tales promotores son específicos de huésped e incluyen promotores MMTV, SV40, y de metalotionina para las células de CHO; promotores trp, lac, tac y de T7 promotores para huéspedes bacterianos; y promotores del factor alfa, alcohol oxidasa y de PHG para levaduras. Los potenciadores de transcripción, tal como el potenciador del virus de sarcoma rous, se usan en células huésped de mamíferos. Una vez que se han obtenido cultivos homogéneos de células recombinantes mediante procedimientos de cultivo convencionales, grandes cantidades de PILS producido de manera recombinante se recuperan del medio acondicionado y se analizan usando procedimientos cromatográficos conocidos en la técnica. Por ejemplo, PILS se puede clonar en el vector de expresión pcDNA3, como se ejemplifica en en el presente documento. Este producto se puede usar para transformar, por ejemplo, HEK293 o COS mediante metodología convencional en la técnica. De manera específica, por ejemplo, usando transferencia de genes mediada por Lipofectamina (Gibco BRL nº de catálogo. 1 8324-020).

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Ejemplo 5

Aislamiento de PILS recombinante

PILS se expresa como una proteína quimérica con uno o más dominios de polipéptidos adicionales se añaden para facilitar la proteína de purificación. Tales dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos que quelan metales tales como módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación o metales inmovilizados [Appa Rao, 1997] y el dominio utilizado en el sistema de purificación FLAGS extensión/afinidad (Immunex Corp., Seattle, Washington). La inclusión de una secuencia de engarce escindible tal Factor Xa o enteroquinasa (Invitrogen, Groningen, Holanda) entre el dominio de purificación y la secuencia de PILS es útil para la expresión de PILS.

El siguiente ejemplo proporciona un procedimiento de purificación de PILS.

PILS se genera usando el sistema de expresión de baculovirus BAC-TO-BAC (GIBCO BRL) basándose en la infección del virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) células de insecto de Spodoptera frugiperda (células Sf9).

El ADnc que codifica las proteasas se clonan o bien en el plásmido donante pFASTBAC1 o pFASTBAC-HT que contienen un elemento de transposición mini-Tn7. El plásmido recombinante se transforma en células competentes DH10BAC que contienen el bácmido precursor bMON14272 (ADN infeccioso de AcNPV) y un plásmido auxiliar. El elemento mini-Tn7 sobre el donante pFASTBAC se puede trasponer al sitio de unión attTn7 sobre el bácmido introduciendo de esta manera el gen de la proteasa en el genoma viral. Las colonias que contienen bácmidos recombinantes se identifican mediante la interrupción del gen lacZ. La construcción proteasa/bácmido se puede aislar después e infectarse en células de insecto (células Sf9) que dan como resultado la producción de partículas de baculovirus recombinantes infecciosas y la expresión de o bien enzima recombinante (pFastbac1) o proteína de fusión PILS-His (pFastbacHT).

Las células se recogen y se preparan extractos 24, 48 y 72 horas después de la transfección. La expresión de PILS se confirma mediante tinción de coomassie después de electroforesis en gel de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE) y transferencia de Western sobre una membrana PVDF de un SDS-PAGE no teñido. La proteína de fusión proteasa-His se detecta debido a la interacción entre el conjugado Ni-NTA HRP y el His-tag que se condensa a PILS.

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Ejemplo 6

Producción de anticuerpos específicos de PILS

Se utilizan dos planteamientos para inducir anticuerpos de PILS, y cada planteamiento es útil para generar anticuerpos o bien policlonales o monoclonales. En un planteamiento, la proteína desnaturalizada de separación de HPLC de fase inversa se obtiene en cantidades de hasta 75 mg. Esta proteína desnaturalizada se usa para inmunizar ratones o conejos usando protocolos convencionales; aproximadamente 100 \mug son adecuados para la inmunización de un ratón, mientras que hasta 1 mg se podría usar para inmunizar un conejo. Para identificar hibridomas de ratón, la proteína desnaturalizada se radioyoad y se usa para seleccionar hibridomas de células B de tipo murino potenciales para aquellos que producen anticuerpos. Este procedimiento requiere solamente pequeñas cantidades de proteína, de manera que 20 mg es suficiente para marcar y seleccionar varios miles de clones.

En el segundo planteamiento, la secuencia de aminoácidos de un dominio de PILS adecuado, como se deduce de la traducción del ADNc, se analiza para determinar las regiones de alta antigenicidad. Los oligopéptidos que comprenden regiones hidrófilas apropiadas se sintetizan y se usan en protocolos de inmunización adecuados para inducir antibióticos. La secuencia de aminoácidos óptima para la inmunización están usualmente en el en extremo C, el extremo N y los que intervienen, regiones hidrófilas del polipéptido que son probable que se expongan al ambiente externo cuando la proteína está en su conformación natural.

Típicamente, los péptidos seleccionados, aproximadamente de 15 restos de longitud, se sintetizan usando el modelo 431 A de un Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems que usa química fmoc y está acoplado a la hemocianina de lapa califormiana (KLH; Sigma, St. Louis, MO) mediante reacción con M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster, MBS. Si es necesario se introduce una cisteína en el extremo N del péptido para permitir el acoplamiento a KLH. Los conejos se inmunizan con el complejo péptido-KLH en el adyuvante de Freund completo. Los antisueros resultantes se ensayan para evaluar la actividad antipeptídica mediante la unión del péptido al plástico, bloqueando con 1% de albúmina sérica bovina, que reacciona con antisueros, lavando y haciendo reaccionar con IgG anti conejo de cabra específico, purificada por afinidad marcada (radiactiva o fluorescente).

Los hibridomas se preparan y se seleccionan usando técnicas convencionales. Los hibridomas de interés se detectan mediante selección con PILS marcada para identificar las funciones que producen el anticuerpo monoclonal con la especificidad deseada. En un protocolo típico, pocillos o placas (FAST; Becton-Dickinson, Palo Alto, CA) se revisten durante la incubación con anticuerpos anti ratón específicos, purificados por afinidad 1 g) a 10 mg/ml. Los pocillos revestidos se bloquean con 15 de albúmina sérica bovina (BSA), se lava y se incuba con sobrenadantes de hibridomas. Después de lavar los pocillos se incuban con PILs marcada a 1 mg/ml. Los sobrenadantes con anticuerpos específicos se unen más a la PILS marcada que es detectable en el fondo. Después los clones que producen anticuerpos específicos se expanden y se someten a dos ciclos de clonación a dilución limitante. Los hibridomas clonados se inyectan en micela tratada con pristano para producir ascitos, y el anticuerpo monoclonal se purifica en fluido ascítico mediante cromatografía de afinidad sobre la proteína A. Los anticuerpos monoclonales con afinidades de al menos 10^{8} M^{-1}, preferiblemente 10^{9} a 10^{10} M^{-1} o mayos, se preparan típicamente mediante procedimientos convencionales.

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Ejemplo 7

Ensayo de diagnóstico que usa anticuerpos específicos de PILS

Los anticuerpos de PILS particulares son útiles para investigar la traducción de señal y la diagnosis de afecciones infecciosas o hereditarias que se caracterizan por las diferencias en la cantidad o distribución de PILS o productos cadena debajo de una cascada de señalización activa.

Los ensayos diagnósticos para PILS incluyen procedimientos que utilizan anticuerpo y una marca para detectar PILS en fluidos corporales humanos, membranas, células, tejidos o extractos de tales. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención se usan con o sin modificación. Frecuentemente, los polipéptidos y anticuerpos se marcan juntándolos, o bien covalentemente o no covalentemente, con una sustancia que proporciona una señal detectable. Una amplia diversidad de marcas y técnicas de conjugación se conocen y se han reseñado de manera extensiva en la bibliografía tanto científica como de patentes. Las marcas adecuadas incluyen radionúclidos, enzimas, sustratoscofactores, inhibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes, agentes cromogénicos, partículas magnéticas y similares.

Se conocen en la técnica, una diversidad de protocolos para medir la PILS soluble o unida a membrana, usando anticuerpos o bien policlonales o monoclonales específicos de la proteína. Los ejemplos incluyen ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Se prefiere un inmunoensayo basado monoclonal de dos sitios que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos con dos epítopes que no interfieren en la PILS, pero se puede emplear un ensayo de de unión competitiva

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Ejemplo 8

Purificación de PILS Nativa que usan anticuerpos específicos

La PILS nativa o recombinante se purifica mediante cromatografía de inmunoafinidad usando anticuerpos específicos para PILS. En general, se construye una columna de inmunoafinidad mediante acoplamiento covalente del anticuerpo anti-TRH a una resina cromatográfica activada.

Se preparan inmunoglobulinas policlonales a partir de sueros inmunes o bien mediante precipitación con sulfato de amonio o mediante purificación o proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway N.J.). Del mismo modo, se preparan anticuerpos monoclonales a partir de fluidos de ascitos mediante precipitación con sulfato de amonio o cromatografía o Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina purificada parcialmente está unida de manera covalente a una resina cromatográfica tal como Sefarosa activada por CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, se bloquea la resina, y la resina derivada se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se utilizan tales columnas de inmunoafinidad en la purificación de PILS preparando una fracción de las células que contienen PILS en una forma soluble. Esta preparación se deriva mediante la solubilización de células enteras o de una fracción subcelular obtenida mediante centrifugación diferencial (con o sin la adición de detergente) o mediante otros procedimientos bien conocidos en la técnica. Como alternativa, PILS soluble que contiene una secuencia de señal se secreta en cantidad útil en el medio en el que las células se desarrollan.

Una preparación que contiene PILS soluble se pasa sobre la columna de inmunoafinidad, y la columna se lava en condiciones que permiten la absorbancia preferencial de PILS (por ejemplo, tampones de alta resistencia iónica en la presencia de detergente. Después la columna se eluye en condiciones que interrumpen la unión anticuerpo/proteína (por ejemplo, un tampón de pH 2 - 3 o una alta concentración de un chaotropo tal como urea o ion tiocianato), y se recoge PILS.

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Ejemplo 9

Selección de fármacos

Esta invención es particularmente útil para la selección de compuestos terapéuticos mediante el uso de PILS o sus fragmentos en cualquiera de una diversidad de técnicas de selección de fármacos.

El siguiente ejemplo proporciona un sistema para la selección de fármacos que miden la actividad de proteasa.

La proteína de fusión proteasa - His se puede purificar a partir del lisado bruto mediante cromatografía de afinidad de metal usando agarosa de Ni-NTA. Esto permite la retención específica del material recombinante (ya que se condensa a His-tag) mientras las proteínas de insectos endógenas se retiran por lavado. El material recombinante se eluye después mediante competición con imidazol.

La actividad de las moléculas de PILS de la presente invención se puede medir usando una diversidad de ensayos que miden la actividad de PILS. Por ejemplo, la actividad de la enzima de PILS se puede determinar mediante ensayo de serina/metalo/... proteasa in vitro convencional (véase, por ejemplo, [documento U.S. 5.057.414]). Los expertos en la técnica son conscientes de una diversidad de sustratos adecuados para los ensayos in vitro, tales como SucAla-Ala-Pro-Phe-pNA, fluoresceína mono-p-guanidinobenzoato clorhidrato, benciloxicarbonil-L-Arginil-S-benciléster, Nalfa-Benzoil-L-arginina etil éster clorhidrato, y similares. Además, los kits de ensayo de proteasa disponibles de fuentes comerciales, tales como Calbiochem^{TM} (San Diego, Calif). Para las referencias generales, véase Barreto (Ed.), Methods in Enzymology, Proteolytic Enzymes: Serine y Cysteine Peptidases (Academic Press Inc. 1994), y Barrett et al., (Eds.), Handbook of Proteolytic Enzymes (Academic Press Inc. 1998).

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Ejemplo 10

Diseño de fármacos racional

El objetivo del diseño de fármaco racional es producir análogos estructurales de polipéptidos biológicamente activos de interés o de pequeñas moléculas con los que interactúan, agonistas, antagonistas, o inhibidores. Cualesquiera de estos ejemplos se usan para modelar fármacos que son más activos o formas estables del polipéptido o que potencian o interfieren con la función de un polipéptido in vivo.

En un planteamiento, la estructura de tres dimensiones de una proteína de interés, o de un complejo inhibidor de la proteína, se determina mediante cristalografía de rayos X, mediante modelado por ordenador o, más típicamente, mediante una combinación de los dos planteamientos. Tanto la forma como los cambios del polipéptido se debe determinar para elucidar la estructura y para determinar el sitio (s) activo (s) de la molécula. Menos a menudo, la información con relación a la estructura de un polipéptido se obtiene mediante modelado basándose en la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la información estructural relevante se usa para diseñar inhibidores eficaces. Los ejemplos útiles del diseño de fármacos racional incluyen las moléculas que tienen actividad o estabilidad mejorada o que actúan como inhibidores, agonistas, o antagonistas de péptidos nativos.

También es posible aislar un anticuerpo específico de diana, seleccionarse mediante ensayo funcional, como se ha descrito anteriormente, y después disolver su estructura cristalina. Este planteamiento. En principio, produce un farmacore tras el se basa el diseño de fármaco posterior. Es posible desviar la cristalografía de proteína en conjunto mediante la generación de anticuerpos anti idiotípicos (anti-ids) a un anticuerpo funcional, farmacológicamente activo. Como una imagen especular de una imagen especular, el sitio de unión anti-ids se espera que sea un análogo del receptor original. Después el anti-id se usa para identificar y aislar los péptidos de los bancos de péptidos producidos químicamente o biológicamente. Los péptidos aislados después actúan como el farmacore.

En virtud de la presente invención, una cantidad suficiente de polipéptido se hacen disponibles para realizar tales estudios analíticos como cristalografía de rayos X. además, el conocimiento de la secuencia de la secuencia de aminoácidos de PILS proporcionada en el presente documento proporciona la guía para los que emplean técnicas de modelado por ordenador en lugar de o en adición a la cristalografía de rayos X.

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Ejemplo 11

Identificación de otros miembros del complejo de transducción de señal

La PILS marcada se usa como un reactivo para la purificación de las moléculas con los que interactúa. En una realización de purificación por afinidad, PILS se acopla de manera covalente a una columna de cromatografía. El extracto sin células derivado de células sinoviales o células Diana supuestas se pasa sobre la columna, y las moléculas con afinidad apropiada se unen a PILS. Se recupera el complejo de PILS de la columna, y el ligandos unido a PILS se disocia y se somete a la secuenciación de proteína n terminal. Después se usa la información de la secuencia de aminoácidos para identificar la molécula capturada o para diseñar sondas de oligonucleótidos degenerados para clonar el gen relevante de una genoteca de ADNc apropiada.

En un procedimiento alternativo se inducen anticuerpos contra PILS, específicamente anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se seleccionan para identificar los que inhiben la unión de PILS marcada. Los anticuerpos monoclonales se usan después de manera terapéutica.

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Ejemplo 12

Uso y administración de Anticuerpos, inhibidores, o Antagonistas

Anticuerpos, inhibidores o antagonistas de PILS u otros tratamientos y otros tratamientos y compuestos que son limitadores de la transducción de señal (LST), proporcionan diferentes efectos cuando se administran terapéuticamente. Los LST se formulan en un medio vehículo no tóxico, inerte, farmacéuticamente aceptable preferiblemente a un pH de aproximadamente 5 a 8, más preferiblemente de 6 a 8, aunque pH puede variar de acuerdo con la característico del anticuerpo, inhibidor, o antagonista que se está formulando y la afección a tratar. Las características de LST incluyen la solubilidad de la molécula, su vida media y antigenicidad/inmunogenicidad. Estas y otras características ayudan en la definición de un vehículo eficaz. Las proteínas humanas nativas se prefieren como LST, pero las moléculas orgánicas y sintéticas que se producen por selecciones de fármacos son igualmente eficaces en situaciones particulares.

Los LST se administran medio vías conocidas de administración que incluyen pero no se limitan a cremas tópicas y geles; pulverización y aerosol transmucosal; parche y vendas transdérmicos; formulaciones inyectables, intravenosas y de lavado; y líquidos y pastillas administrados por vía oral formulados particularmente para resistir el ácido y las enzimas del estómago. La formulación particular, dosificación exacta, y vía de administración se determina por el médico asistente y varía de acuerdo con cada situación específica.

Tales determinaciones se preparan mediante la consideración de múltiples variables tales como la afición a tratar, el LST a administrar, y el perfil farmacocinética de un LST particular. Los factores adicionales que se tienen encuenta incluyen gravedad del estado patológico, edad del paciente, peso, género, y dieta, tiempo y frecuencia de la administración de LST, combinación posible con otros fármacos, sensibilidades de reacción, y tolerancia/respuesta a la terapia. La formulación de LST de larga duración se puede administrar cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la semivida y tasa de eliminación del LST particular.

Las cantidades de dosificación normal varían entre 0,1 y 10^{5} \mug, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g dependiendo de la vía de administración. La guía para las dosificaciones particulares y los procedimientos de administración se proporciona en la bibliografía; véase las patentes de Estados Unidos números. 4.657.760; 5.206.344; o 5.225.212. Los expertos en la técnica emplean diferentes formulaciones para los diferentes LST. La administración a las células tales como células nerviosas necesita la distribución de una manera diferentes de la de otras células tales como células endoteliales vasculares.

Se contempla que la transducción de señal anormal, trauma, o enfermedades que disparan la actividad de PILS se pueden tratar con LST. Estas afecciones o enfermedades se diagnostican de manera específica mediante los ensayos descritos anteriormente, y tal ensayo se debe realizar en los casos sospechosos de infecciones virales, bacterianas o fúngicas, respuestas alérgicas, lesión mecánica asociada a trauma, enfermedades hereditarias, linfoma o carcinoma, u otras afecciones que activan los genes de tejidos linfoides o neuronales.

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Ejemplo 13

Producción de animales transgénicos no humanos

Los sistemas de modelos animales que elucidan los papeles fisiológicos y de comportamiento de la PILS se producen mediante la creación de animales transgénicos no humanos en los que la actividad de la PILS o bien se incrementa o disminuye, o la secuencia de aminoácidos de la PILS expresada se altera, mediante una diversidad de técnicas. Los ejemplos de estas técnicas incluyen, pero no se limitan a a: 1) inserciones de versiones normales o mutantes de ADN que codifican una PILS, mediante microinyección, electroporación, transfección retroviral u otros medios bien conocidos por los expertos en la técnica, en aproximadamente embriones fertilizados con el fin de producir un animal transgénico o 2) recombinación homóloga de versiones mutantes o normales, humanas o animales de estos genes con el locus del gen nativo en animales transgénicos que alteran la regulación de la expresión o la estructura de estas secuencias de PILS. La técnica de recombinación homóloga se conoce bien en la técnica. Reemplaza el gen nativo con el gen insertado y por lo tanto es útil para la producción de un animal que no puede expresar PILS nativa pero no expresa, por ejemplo, una PILS mutante insertada, que ha reemplazado la PILS nativa en el genoma animal mediante recombinación, dando como resultado la infla expresión del transportador. La microinyección añade genes al genoma, pero no los elimina, y la técnica es útil para producir un animal que se expresa ella misma y se añade PILS, dando como resultado la sobre expresión de la PILS.

Un medio disponible para producir un animal transgénico, con un ratón como un ejemplo, es como sigue: se aparean hembras de ratones, y a los huevos fertilizados resultantes se realiza la vivisección de sus oviductos. Los huevos se almacenan en un medio apropiado tal como medio M2 de cloruro de cesio. El ADN o ADNc que codifica PILS se purifica a partir de un vector mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Se pueden condensar promotores inducibles con la región codificante del ADN para proporcionar un medio experimental para regular la expresión del transgen. Como alternativa o además, los elementos reguladores específicos de tejidos se pueden condensar con la región codificante para permitir la expresión específica de tejidos del transgen. El ADN, en una solución tamponada de manera apropiada, se coloca en una aguja de microinyección (que se puede realizar a partir de un tubo capilar usando un extractor de flauta) y el huevo a inyectar se pone en un portaobjetos de depresión. La aguja se inserta en el pronúcleo del huevo y se inyecta la solución de ADN. El huevo inyectado se transfiere después en el oviducto de un ratón pseudoembarazado que es un ratón estimulado por las hormonas apropiadas con el fin de mantener un embarazo falso, donde procede del útero, implantes, y se desarrolla para que termine. Como se ha indicado anteriormente, la microinyección no es solamente el único procedimiento para insertar ADN en el huevo pero se usa aquí solamente para propósitos ejemplares.

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<130> Le A 36 744

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<160> 5

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<170> PatentIn version 3.1

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<210> 1

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<211> 2826

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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7

8

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 2

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<211> 941

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 2

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9

10

11

12

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<210> 3

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<211> 15

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador directo

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<400> 3

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gctctgacgg cgccc

\hfill

15

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 20

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> cebador inverso

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcggatttgc tggtgatgaa

\hfill

20

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

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<212> ADN

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<213> secuencia artificial

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<220>

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<223> sonda

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acactgggta cctgtggcat gttcca

\hfill

26

Claims (21)

1. Un procedimiento de selección in vitro de agentes terapéuticos útil en el tratamiento de una enfermedad comprendida en un grupo de enfermedades constituidas por insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias y aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero que comprende las etapas de

(i)

determinar la actividad de un polipéptido de PILS a una cierta concentración de un compuesto de ensayo o en la ausencia de dicho compuesto de ensayo,

(ii)

determinar la actividad de dicho polipéptido a una concentración diferente de dicho compuesto de ensayo.

2. Un procedimiento de selección in vitro de agentes terapéuticos útil en el tratamiento de una enfermedad comprendida en un grupo de enfermedades constituidas por insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias y aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero que comprende las etapas de

(i)

determinar la actividad de un polipéptido de PILS a una cierta concentración de un compuesto de ensayo.

(ii)

determinar la actividad de un polipéptido de PILS en la presencia de un compuesto que se conoce que es un regulador de un polipéptido de PILS.

3. Un procedimiento de selección de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2 que procede de un procedimiento de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de una enfermedad comprendida en un grupo de enfermedades constituidas por insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias y aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero que comprende las etapas de

(i)

poner en contacto el compuesto de ensayo con un polipéptido de PILS

(ii)

detectar la unión de dicho compuesto de ensayo a dicho polipéptido de PILS.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa de poner en contacto está en o junto a la superficie de una célula.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula está in vitro.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa de poner en contacto está en un sistema libre de células.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido está acoplado a una marca detectable.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el compuesto está acoplado a una marca detectable.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el compuesto de ensayo desplaza un ligando que está primero unido al polipéptido.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido está unido a un soporte sólido.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el compuesto está unido a un soporte sólido.

12. Un procedimiento de selección in vitro de agentes terapéuticos útil en el tratamiento de una enfermedad comprendida en un grupo de enfermedades constituidas por insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias y aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero que comprende las etapas de

(i)

poner en contacto el compuesto de ensayo con un polipéptido de PILS

(ii)

detectar la unión de dicho compuesto de ensayo a dicho polipéptido de PILS.

13. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que la molécula de ácido nucleico es ARN.

14. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que la etapa de puesta en contacto está en o junto a la superficie de una célula.

15. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que la etapa puesta en de contacto está en un sistema libre de células.

16. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que el polinucleótido está acoplado a una marca detectable.

17. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que el compuesto está acoplado a una marca detectable.

18. Un procedimiento de diagnosis de aterosclerosis en un mamífero que comprende las etapas de

i)

determinar la cantidad de un polinucleótido de PILS en una muestra de arteria coronaria o aorta tomada de dicho mamífero,

ii)

determinar la cantidad de polinucleótido de PILS en mamíferos sanos y/o con enfermedades.

19. Con uso de

i)

un oligonucleótido no codificante,

ii)

un anticuerpo, o

iii)

una ribozima.

que específicamente regula la actividad del polipéptido PILS de acuerdo con la reivindicación 1 - 17 para la preparación de un medicamento útil en cualquier tratamiento de una enfermedad comprendida en un grupo de enfermedades constituidas por insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias y aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero.

20. Uso de un polinucleótido de PILS para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una enfermedad comprendida en un grupo de enfermedades constituidas por insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias y aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero.

21. Uso de un polipéptido de PILS para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de una enfermedad comprendida en un grupo de enfermedades constituidas por insuficiencia cardíaca, infarto de miocardio, enfermedades isquémicas del corazón, arritmias y aterosclerosis en la arteria coronaria o aorta en un mamífero.