ES2313055T3 - Proteina mgat-x1 de tipo acilglicerol aciltranferasa y sus usos. - Google Patents
Proteina mgat-x1 de tipo acilglicerol aciltranferasa y sus usos. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para seleccionar reguladores de la actividad de acilglicerol aciltransferasa de un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2 útil en el tratamiento de cáncer en un mamífero, que comprende las etapas de i) poner en contacto un compuesto de ensayo con un polipéptido de la SEQ ID NO: 2, ii) detectar la unión de dicho compuesto de ensayo a dicho polipéptido, en el que los compuestos de ensayo que se une bajo (ii) se identifican como reguladores potenciales de la actividad de la SEQ ID NO: 2 útil en el tratamiento de cáncer.
Description
Proteína MGAT-X1 de tipo
acilglicerol aciltransferasa y sus usos.
La presente invención es en el campo de la
biología molecular; más particularmente, la presente invención
describe una secuencia de ácidos nucleicos y una secuencia de
aminoácidos para una MGAT-X1 novedosa humana y su
regulación para propósitos terapéuticos.
La Acil-CoA: diacilglicerol
aciltransferasa (DGAT; EC 2.3.1.20) es una enzima microsómica que
juega un papel central en el metabolismo de los lípidos
diacilglicerol celulares. Cataliza la etapa terminal y solamente
ncargada en la síntesis detricilglicerol mediante el uso de
diacilglicerol (DAG) y acil CoA grasa como sustratos. La MGAT usa
mono-acilglicerol (MAG) acil CoA grasa como
sustratos. DGAT se ha considerado necesaria para la formación de
tejido adiposo y esencial para la supervivencia [Cases et al.
(1998)].
Oelkers et al. [Oelkers et al.
(1998)] identificaron 2 ADNc humanos parciales novedosos y distintos
mediante el uso de la secuencia de la acil-CoA:
colesterol aciltransferasa-1 (ACAT1) para
seleccionar las bases de datos de EST: Aislaron dos "productos
génicos relacionados con ACAT" a partir de una genoteca de ADNc
de hepatocitos que denominaron ARGP1 y ARGP2. ARGP1 se encontró que
se expresaba en numerosos tejidos de adultos humanos y líneas
celulares de cultivos de tejidos, mientras que la expresión de ARGP2
era más restringida. El ADNc de ARGP1 codifica una proteína de 488
aminoácidos con 9 dominios de transmembrana predichos, un sitio de
glicosilación potencial unido a N, y un motivo de fosforilación de
tirosina putativo. La comparación con ACAT1 reveló un 22% de
identidad de aminoácidos sobre la molécula entera. El análisis de
transferencia de Northern de ARGP1 indicó la expresión ubicua con
una gran variabilidad a nivel de expresión. Había una alta expresión
en la corteza adrenal, médula adrenal, testículos, e intestino
delgado, con una moderada expresión en tiroides, corazón, músculo
esquelético, e hígado. Una transcripción de 2,0 kb era invariable en
todos los tejidos examinados, mientras que se observó una
transcripción de 2,4 kb en aproximadamente la mitad de los
tejidos.
Más tarde, Cheng et al. [Cheng et
al. (2001)] clonaron DGAT1 a partir de una genoteca de ADNc de
tejido adipose e identificaron una variante de ayuste, que se
denominó DGATsv. Esta DGATsv contiene una inserción de 77
nucleótidos de intrón no empalmada con un codón de parada en fase.
Es una forma truncada de DGAT1 que termina en Arg387. Por lo tanto
101 restos del extremo C están suprimidos, incluyendo el sitio
activo putativo. Por filtración de gel, coinmunoprecipitacón, y
SDS-PAGE de proteínas recombinantes reticuladas, los
autores determinaron que tanto DGAT1 como DGATsv forman dímeros y
tetrámeros. Cuando se coexpresan, las 2 variantes forman
heterocomplejos.
Smith y colaboradores [Smith et al.,
(2000)] demostraron que los ratones deficientes en DGAT que se
generaron mediante rupture dirigida eran viables y todavía
sintetizaban triglicéridos. Además encontraron que estos ratones
eran delgados y resistentes a la obesidad inducida por dieta. La
resistencia a obesidad implicaba un incremento del gasto de energía
e incremento de actividad. La deficiencia en DGATt también alteraba
el metabolismo de triglicéridos en otros tejidos. Esto incluye la
glándula mamaria, donde la lactancia era defectuosa en hembras
DGAT -/. Smith et al. [Smith et al., (2000)]
concluyeron que existen múltiples mecanismos para la síntesis de
triglicéridos y sugirieron que la inhibición selectiva de la
síntesis de triglicéridos mediada por DGAT puede ser útil para
tratar la obesidad.
Buhman et al. [Buhman et al.,
(2002)] analizaron el modelo de ratón deficiente en DGAT1 y
encontraron que DGAT1 no era esencial para la absorción de
triacilglicerol de la dieta cuantitativa, incluso en ratones
alimentados con una dieta alta en grasa, o para la síntesis de
quilomicrones. Sin embargo, los ratones sin DGAT1 tenían una
reducción de quilomicronemia después de la absorción 1 hora después
de una alta exposición a grasa. Cuando se alimentan de manera
crónica con una dieta alta en grasa, acumulan gotitas de lípidos
neutros en el citoplasma de los entericitos, sugiriendo una
reducción en la absorción de triacilglicerol. El análisis de
intestino de ratones sin DGAT1 reveló que la actividad de las
enzimas implicadas en la síntesis de triacilglicerol, DGAT2 y
diacilglicerol transacilasa, pueden ayudar a compensar la ausencia
de DGAT1.
Usando el planteamiento de candidato posicional,
Grisart et al. [Grisart et al. (2002)] mapearon un
locus del carácter cuantitativo con un efecto principal en la
composición de la leche en el ganado lechero al extremo
centromérico del cromosoma 14 de bovinos, donde mapea el gen de
DGAT1. Identificaron una Lys232 no conservadora a la sustitución de
Ala en el gen de DGAT1 que tenía un efecto principal en la
producción y características de la leche, incluyendo el contenido
en grasa.
El documento WO03/053363 describe varias
secuencias de polinucleótidos que codifican los polipéptidos
descritos como "miembros de la familia de la diacilglicerol
aciltransferasa 2", y los datos de expresión de un número
limitado de tejidos de ratones. Una de estas secuencias (m112023,
SEQ ID N0: 13 - 14) es casi idéntica a la de MGAT- X1 (SEQ ID NO: 1
- 2) de la presente solicitud.
Se desvela una nueva secuencia de nucleótidos
que codifica una MGAT-X1 humana novedosa. En lo
siguiente MGAT-X1 designa un polipéptido que tiene
la secuencia de o que es homóloga a la SEQ ID No:2, y que tiene
actividad MGAT-X1 acilglicerol aciltransferasa.
MGAT-X1 además contempla diversos polipéptidos que
surgen de modificaciones después de la transcripción del
polipéptido incluyendo pero sin limitación a acetilación,
carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y
acilación. Se desvelan moléculas de ácido nucleico que codifican
MGAT-X1 y polipéptidos que tienen actividad de la
MGAT-X1, y a su uso en la diagnosis o tratamiento de
enfermedades asociadas a la expresión de la
MGAT-X1.
Un objeto de la invención es proporcionar
reactivos y procedimientos para regular la expresión y actividad de
la MGAT-X1 para el tratamiento de cáncer. Este y
otros objetos de la invención se proporcionan mediante una o más de
las realizaciones descritas más adelante.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
de selección de agentes que pueden regular la actividad de MGATX1.
Un compuesto de ensayo se pone en contacto con un polipéptido que
comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y se
detecta la unión del compuesto de ensayo a MGAT-X1,
en el que un compuesto de ensayo que se une al polipéptido se
identifica como un agente terapéutico potencial para disminuir la
actividad de la MGAT-X1. Otra realización de la
invención es un procedimiento de selección de agentes que pueden
regular la actividad de la MGAT-X1. Un compuesto de
ensayo puesto en contacto con un polipéptido que comprende la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y se detecta la
actividad de la MGAT-X1 del polipéptido, en el que
un compuesto de ensayo que incrementa la actividad de la
MGAT-X1 se identifica como un agente terapéutico
potencial para incrementar la actividad de la
MGAT-X1, y en el que un compuesto de ensayo que
disminuye la actividad de la MGAT-X1 del
polipéptido se identifica como un agente terapéutico potencial para
disminuir la actividad de la MGAT-X1.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
para la selección de agentes que pueden regular la actividad de
MGATX1. Un compuesto de ensayo se pone en contacto con un
polinucleótido que comprende la secuencia de la SEQ ID NO: 1; y se
detecta la unión del compuesto de ensayo al polinucleótido, en el
que un compuesto de ensayo que se une al polinucleótido se
identifica como un agente terapéutico para disminuir la actividad
de MGAT-X1.
Se revela un procedimiento para la selección de
agentes que pueden regular la actividad de la
MGAT-X1. Un compuesto de ensayo se pone en contacto
con un producto codificado por un polinucleótido que comprende la
secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO: 1; y se detecta
la unión del compuesto de ensayo al producto, en el que un
compuesto de ensayo que se une al producto se identifica como un
agente potencial para regular la actividad de la
MGAT-X1.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
de reducción de la actividad de la MGAT-X1. Una
célula se pone en contacto con un reactivo que se une de manera
específica a un polinucleótido que codifica MGAT-X1
o el polipéptido de la MGAT-X1. Por lo tanto la
actividad de la MGAT-X1 se reduce.
Se revela un procedimiento de incremento de la
actividad de MGAT- X1. Una célula se pone en contacto con un
reactivo que específicamente se une a un polinucleótido que
codifica MGAT-X1 o el polipéptido de la
MGAT-X1. Por lo tanto se incrementa la actividad de
la MGAT-X1.
Se revela el ADN no codificante del ADN que
codifica MGAT-X1; clonación de los vectores de
expresión que contienen el ácido nucleico que codifica
MGAT-X1; células huésped u organismos transformados
con los vectores de expresión que contienen ácido nucleico que
codifican MGAT-X1; un procedimiento para la
producción de y recuperación de MGAT-X1 purificada
a partir de células huésped: proteína purificada,
MGAT-X1, que se puede usar para identificar
inhibidores o activadores de la transducción de señal que implica
MGAT-X1; y procedimientos de selección de ligandos
de la MGAT-X1 que usa células transformadas.
La Fig. 1 muestra la secuencia de nucleótidos de
un polinucleótido de la MGAT-X1 (SEQ ID NO: 1).
La Fig. 2 muestra la secuencia de aminoácidos de
un polipolipéptido de MGAT- X1 (SEQ ID NO: 2).
La Fig. 3 muestra la secuencia de nucleótidos of
a primer útil para la invención (SEQ ID NO: 3).
La Fig. 4 muestra la secuencia de nucleótidos of
a primer útil para la invención (SEQ ID NO: 4).
La Fig. 5 muestra la secuencia de nucleótidos of
a primer útil para la invención (SEQ ID NO: 5).
Como se usa en el presente documento y se
designa por la abreviatura en mayúsculas, MGAT-X1,
se refiere a una acilglicerol aciltransferasa en cualquier forma de
origen natural o sintético y sus fragmentos activos que tienen la
secuencia de aminoácidos de la SEQ. ID NO: 2. En una realización, el
polipéptido MGAT-X1 está codificado por los ARNm
transcritos a partir del ADNc, como se ha mencionado por la
abreviatura en letra minúscula, MGAT-X1, de la
SEQ. ID NO: 1. La secuencia de la MGAT-X1 se
ensambló a partir de ESTs: BG674782, W68831, BG742855,
W68738.
Un "oligonucleótido" es un tramo de restos
de nucleótidos que tiene un número suficiente de bases que se usan
como un oligómero, amplímero o sonda en una reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos se preparan a partir de
secuencia genómica o de ADNc y se usan para amplificar, revelar, o
confirmar la presencia de un ADN o ARN similar en una célula o
tejido particular. Los oligonucleótidos u oligómeros comprenden
partes de una secuencia de AND de al menos aproximadamente 10
nucleótidos y como mucho aproximadamente 35 nucleótidos,
preferiblemente aproximadamente 25 nucleótidos.
Se puede derivar "sondas" de ácidos
nucleicos de una sola o doble cadena de origen natural o se pueden
sintetizar de manera química. Son útiles en la detección de la
presencia de secuencias idénticas o similares. Tales sondas se
pueden marcar con moléculas indicadoras usando la traducción de
muesca, la reacción de llenado de Klenow, la PCR u otros
procedimientos bien conocidos en la técnica. Loas sondas de ácido
nucleico se pueden usar en las hibridaciones southern, northern o
in situ para determinar si el ADN o ARN que codifica una
cierta proteína está presente en un tipo de célula, tejido, u
órgano. Un fragmento de un polinucleótido o ácido nucleico que
comprende toda o parte de la secuencia de nucleótidos que tienen
menos nucleótidos que aproximadamente 6 kb, preferiblemente menor
que aproximadamente 1 kb que se puede usar como una sonda.
Moléculas "indicadoras" son radionúclidos,
enzimas, fluorescentes, quimioluminiscentets, o agentes cromogénicos
que están asociados a un nucleótido o secuencia de aminoácidos
particular, estableciendo por lo tanto la presencia de una cierta
secuencia, o permitiendo la cuantificación de una cierta
secuencia.
"Variantes de nucleótido recombinante" que
codifican MGAT-X1 se pueden sintetizar mediante el
uso de "redundancia" en el código genético. Se pueden
introducir diversas sustituciones de codón, tales como cambios
silenciosos que producen sitios de restricción específicos o
mutaciones específicas del uso de codón, se pueden introducir para
optimizar la clonación en un plásmido o vector viral o expresión en
un sistema huésped procariótico o eucariótico particular,
respectivamente.
Moléculas "quiméricas" se pueden construir
mediante la introducción de toda o parte de la secuencia de
nucleótidos de esta invención en un vector que contiene la
secuencia de ácidos nucleicos adicional que se puede esperar que
cambie cualquiera o varias de las siguientes características de la
MGAT-X1: localización celular, distribución,
afinidades de unión a ligando, afinidades intercadena,
degradación/tasa de intercambio, señalización, etc.
"Activo" se refiere a aquellas formas,
fragmentos, o dominios de MGAT- X1 que retienen las actividades y/o
actividades antigénicas de la MGAT-X1.
"MGAT-X1 de origine natural
" se refiere a un polipéptido producido por las células que no se
han modificado por ingeniería genética y de manera específica
contempla diversos polipéptidos que surgen de las modificaciones
después de la traducción del polipéptido que incluye pero no se
limita a acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación,
lipidación y acilación.
"Derivado" se refiere a polipéptidos que se
han modificado de manera química mediante técnicas tales como
ubiquitinación, marcado (véase anteriormente), pegilación
(derivación con polietilen glicol), e inserción o substitución
química de aminoácidos tales como ornitina que no aparecen de manera
natural en las proteínas humanas.
"Variante de polipéptido recombinante" se
refiere a cualquier polipéptido que difiere de la
MGAT-X1 de origen natural mediante inserciones,
supresiones y/o sustituciones de aminoácidos, creadas usando
técnicas de ADN recombinante. La guía en al determinación de qué
restos de aminoácidos se pueden reemplazar, añadir, o suprimir,
sin eliminar las actividades de interés se pueden encontrar
comparando la secuencia del polipéptido de interés con la de los
polipéptidos relacionados y minimizar el número de cambios en la
secuencia de aminoácidos realizados en las regiones altamente
conservadas.
"Sustituciones" de aminoácidos
conservadoras se producen por reemplazo de un aminoácido con otro
que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal
como el reemplazo de de una leucina con una isoleucina o valina, un
aspartato con un glutamato, o treonina con una serina.
"Inserciones" o "supresiones" están
típicamente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La
variación permitida se puede determinar experimentalmente
produciendo el péptido de manera sintética mientas que se producen
de manera sistémica las inserciones, supresiones, o sustituciones de
nucleótidos en la secuencia que usa técnicas de ADN
recombinante.
Una "secuencia de señal o guía" se puede
usar, cuando se desee, para dirigir al polipéptido a través de una
membrana de una célula. Tal secuencia se puede presentar
naturalmente sobre los polipéptidos de la presente invención o
proporcionar a partir de de las fuentes heterólogas mediante
técnicas de ADN recombinantes.
Un "oligopéptido" es un tramo corto de
restos de aminoácidos y se pueden expresar a partir de un
oligonucleótido. Oligopéptidos comprenden un tramo de restos de
aminoácidos de al menos 3, 5, 10 aminoácidos y la mayoría 10, 15,
25 aminoácidos, típicamente de al menos 9 a 13 aminoácidos, y de
suficiente longitud para mostrar la actividad biológica y/o
antigénica.
"Inhibidor" es cualquier sustancia que
retrasa o previene una reacción o respuesta química o fisiológica.
Los inhibidores comunes incluyen pero no se limitan a moléculas no
codificantes, anticuerpos, y antagonistas.
Expresión "estándar" es una medida
cuantitativa o cualitativa para comparación. Se basa en un número
estadísticamente apropiado de muestras normales y se crea para
usar como base de comparación cuando se realizan ensayos de
diagnóstico, desarrollo de ensayos clínicos, o siguiendo los
perfiles de tratamiento de paciente.
"Animal" como se usa en el presente
documento se puede definir para que incluya especies humana,
domésticas (gatos, perros, etc.), agrícolas (vacas, caballos,
ovejas, etc.) o especies de ensayo (ratón, rata, conejo, etc.).
Las secuencias de nucleótidos que codifican
MGAT-X1 (o su complemento) tienen numerosas
aplicaciones en las técnicas conocidas por los expertos en la
técnica e la biología molecular. Estas técnicas incluyen el uso de
sondas de hibridación, uso en la construcción de oligómeros para la
PCR, uso para el mapeado de genes, uso en la producción
recombinante de MGATX1, y uso en la generación de ADN o ARN no
codificante, sus análogos químicos y similares. Usos de nucleótidos
que codifican MGAT-X1 descritos en el presente
documento son ejemplares de las técnicas conocidas y no se pretende
que limiten su uso en cualquier técnica conocida por los expertos
en la técnica. Además, las secuencias de nucleótidos descritas en el
presente documento se pueden usar en las técnicas de biología
molecular que no se han desarrollado todavía, con la condición que
las nuevas técnicas que dependen de las propiedades de las
secuencias de nucleótidos que se conocen actualmente, por ejemplo,
el código genético de tripletes, interacciones de pares de bases
específicas, etc.
Los expertos en la técnica apreciarán que como
resultado de la degeneración del código genético, se pueden
producir una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican la
MGAT-X1. Algunas de éstas solamente tendrán una
homología mínima con la secuencia de nucleótidos de la
MGAT-X1 conocida y de origen natural. La invención
también contempla específicamente cada una toda variación posible de
la secuencia de nucleótidos que se podría preparar mediante la
selección de combinaciones basándose e las elecciones de codones
posibles. Estas combinaciones se preparan de acuerdo con el código
genético de tripletes convencional cuando se aplica a la secuencia
de nucleótidos de la MGAT-X1 de origen natural, y
todas estas variaciones se han de considerar como que se desvelan
de manera específica.
Aunque las secuencias de nucleótidos que
codifican MGAT-X1, sus derivados o sus variantes
son preferiblemente capaces de hibridarse a la secuencia de
nucleótidos de la MGAT-X1 de origen natural en
condiciones rigurosas, puede ser ventajoso para introducir
secuencias de nucleótidos que codifican la MGAT-X1
o sus derivados que poseen un uso de codón sustancialmente
diferentes. Los codones se pueden seleccionar para incrementar la
tasa a la que la expresión del péptido se produce en un huésped de
expresión particular procariótico o eucariótico de acuerdo con la
frecuencia con la que los codones particulares se utilizan por el
huésped. Otras razones para alterar de manera sustancial la
secuencia de nucleótidos que codifican MGAT-X1 y/o
sus derivados sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada
incluyen la producción de las transcripciones de ARN que tienen
propiedades más deseables, tal como una mayor semivida, que las
transcripciones producidas a partir de la secuencia de origen
natural.
Las secuencias de nucleótidos que codifican
MGAT-X1 se pueden acoplar a una diversidad de otras
secuencias de nucleótidos mediante medios de las técnicas de ADN
recombinante establecidas. Las secuencias de nucleótidos útiles
para acoplarse a MGAT-X1 incluyen una colección de
vectores de clonación tales como plásmidos, cósmicos, derivados del
fago lambda, fagémidos, y similares. Los vectores de interés
incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores
de generación de sondas, vectores de secuenciación, etc. En general,
los vectores de interés pueden contener un origen de replicación
funcional en al menos un organismo, sitios sensibles a la
endonucleasa de restricción, y marcadores que se pueden seleccionar
de uno o más sistemas de células huésped.
Se desvelan sondas de hibridación específicas de
la MGAT-X1 capaces de hibridarse con secuencias de
nucleótidos de origen natural que MGAT-X1. Tales
sondas también se pueden usar para la detección de secuencias que
codifican GPCR similares y deben contener preferiblemente al menos
un 40% de identidad de nucleótidos con la secuencia de la
MGAT-X1. Las sondas de hibridación de la invención
sujeto se pueden derivar a partir de la secuencia de nucleótidos
presentada como la SEQ. ID NO: 1 o a partir de secuencias genómicas
incluyen promotor, potenciadotes o intrones del gen nativo. Las
sondas de hibridación se pueden marcar mediante una diversidad de
moléculas indicadoras usando las técnicas bien conocidas en la
técnica.
Se reconocerá que muchos análogos de supresión o
de mutación de secuencias de ácidos nucleicos para
MGAT-X1 serán sondas de hibridación eficaces para
el ácido nucleico de la MGAT-X1. De acuerdo con lo
anterior, la invención describe secuencias de ácidos nucleicos que
se hibridan con tales secuencias de ácidos nucleicos que codifican
MGAT-X1 en condiciones rigurosas.
"Condiciones rigurosas" se refiere a las
condiciones que permiten la hibridación de secuencias de ácido
relacionadas sustancialmente. Por ejemplo, tales condiciones en
general permitirán la hibridación de la secuencia con al menos un
85% de identidad de secuencias, preferiblemente con al menos
aproximadamente 90% de identidad de secuencias, más preferiblemente
con al menos aproximadamente un 90% de identidad de secuencia, más
preferiblemente con al menos aproximadamente un 95% de identidad
de secuencia. Las condiciones y sondas de hibridación se pueden
ajustar de formas bien caracterizadas para lograr la hibridación
selectiva de sondas derivadas humanas.
Las hibridaciones en condiciones rigurosas para
la hibridación de ácidos nucleicos son, por ejemplo, las
hibridaciones realizadas en soluciones acuosas, que contienen 0,2
x SSC (1x de solución salina convencional - citrato = 150 mM NaCl,
15 mM trinatriocitrato), a 68ºC (Sambrook et al., 1989).
Las moléculas de ácido nucleico que se
hibridarán al ácido nucleico que codifica MGAT-X1
en condiciones rigurosas se pueden identificar de manera funcional.
Sin limitación, los ejemplos de los usos para sondas de hibridación
incluyen: usos histoquímicas tales como identificación de tejidos
que expresan MGAT-X1; medición de los niveles de
ARNm, por ejemplo para identificar un tipo de tejido de muestra o
para identificar células que expresan niveles anormales de la
MGAT-X1; y detección de polimorfismos de la
MGAT-X1.
La PCR como se desvela en las patentes de
Estados Unidos números 4.683.195; 4.800.195; y 4.965.188
proporciona usos adicionales de oligonucleótidos basándose en la
secuencia de nucleótidos que codifica MGAT-X1.
Tales sondas usadas en la PCR pueden ser de origen recombinante,
sintetizadas químicamente, o una mezcla de ambos. Los oligómeros
pueden comprender secuencias de nucleótidos discretas empleadas en
condiciones optimizadas para la identificación de la
MGAT-X1 en tejidos específicos o uso de diagnóstico.
Los mismos dos oligómeros, un conjunto jeraquizzado de oligómeros,
o incluso un conjunto degenerado de oligómeros se puede emplear en
condiciones menos rigurosas para la identificación de los ADn o ARN
relacionados estrechamente.
Las reglas para diseñar los cebadores de
reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") se establecen
ahora, como revisión por Protocolos de PCR [Devlin et al].
Cebadores degenerados, es decir, preparaciones de cebadores que son
heterogéneos en localizaciones de secuencias dadas, se pueden
diseñar para amplificar secuencias de ácidos nucleicos que son
altamente homólogas con, pero no idénticas a MGATX1. Las
estrategias están ahora disponibles para permitir que solamente uno
de los cebadores se requiera para hibridizarse se manera específica
con una secuencia conocida. Por ejemplo, cebadores de ácido nucleico
apropiadas se pueden ligar al ácido nucleico pretendido que se va a
amplificar para proporcionar la pareja de hibridación para uno de
los cebadores. De esta forma, solamente uno de los cebadores
necesitan basarse en la secuencia del ácido nucleico previsto
amplificar.
Los procedimientos de la PCR para amplificar
ácido nucleico utilizarán al menos dos cebadores. Uno de estos
cebadores será capaz de de hibridarse a una primera hebra del ácido
nucleico a amplificar y de cebado de la síntesis de ácido nucleico
dirigida por enzimas en una primera dirección. El otro será capaz de
hibridar la secuencia recíproca de la primera hebra (si la
secuencia a amplificar es de una sola cadena, esta secuencia será
inicialmente hipotética, pero se sintetizará en el primer ciclo de
amplificación) y cebado de la síntesis de ácido nucleico a partir
de esa hebra en la dirección opuesta a la primera dirección y hacia
el sitio de hibridación para el primer cebador. Las condiciones
para conducir tales amplificaciones, particularmente en condiciones
de hibridación rigurosas preferidas son bien
conocidas.
conocidas.
Otros medios de producción de sondas de
hibridación específicas para MGAT-X1 incluyen la
clonación de secuencias de ácido nucleico que codifican
MGAT-X1 o derivados de la MGAT-X1 en
los vectores para la producción de sondas de ARNm. Tales vectores
se conocen en la técnica, están comercialmente disponibles y se
pueden usar para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante
la adición de la ARN polimerasa como la ARN polimerasa de T7 o SP6
y las moléculas indicadoras apropiadas.
Es posible producir una secuencia de ADN, o sus
porciones, completamente mediante la química de síntesis. Después
de la síntesis, la secuencia de ácido nucleico se puede insertar en
cualquiera de los muchos vectores de ADN disponibles y las
respectivas células huésped usando técnicas bien conocidas en la
técnica. Además, la química sintética se puede usar para introducir
mutaciones en la secuencia de nucleótidos. Como alternativa, una
parte de la secuencia en la que una mutación se desea se puede
sintetizar y recombinar con una parte más larga de una secuencia
genómica o recombinante existente.
Las secuencias de nucleótidos que codifican
MGAT-X1 se pueden usar para producir un oligo- o
polipéptido purificado usando procedimientos bien conocidos de la
tecnología de ADN recombinante. El oligopéptido se puede expresar
en una diversidad de células huésped, o bien procarióticas o
eucarióticas. Las células huésped pueden ser de la misma especie a
partir de la que se derivó la secuencia de nucleótidos o a partir de
especies diferentes. Las ventajas de producir un oligonucleótido
mediante tecnología de ADN recombinante incluyen la obtención de
cantidades adecuadas de la proteína para la purificación y la
disponibilidad de procedimientos de purificación simplificados.
Una etapa importante en el análisis de genética
molecular de enfermedad humana es a menudo la enumeración del
número de copias de un ácido nucleico o la expresión relativa de un
gen en tejidos particulares.
Estás actualmente disponibles varios
planteamientos diferentes para preparar determinaciones
cuantitativas de ácidos nucleicos. Las técnicas basadas en
cromosomas, tales como hibridación genómica comparativa (CGH) e
hibridación in situ fluorescente (FISH) facilitatan los
esfuerzos para localizar de manera citogenética regiones genómicas
que están alteradas en las células tumorales. Las regiones de
alteración genómica se pueden estrechar además de usar la pérdida
de análisis de heterozigosidad (LOH), en la que el ADN enfermo se
analiza y se compara con el ADN normal para evaluar la pérdida de
un marcador polimórfico heterocigótico. Los primeros experimentos
usados en los polimorfismos en la longitud del fragmento de
restricción (RFLP) [Johnson et al], o ADN de minisatélites
hipervariables [Barnes et al]. En los años recientes LOH se
ha realizado principalmente usando la amplificación por PCR de
marcadores de microsatélites y electroforesis de los productos de la
PCR radiomarcados [Jeffreys et al] o marcados
fluorescentemente [Weber et al] y se comparan con los ADN
normal y enfermo.
También se han desarrollado un número de
procedimientos diferentes para cuantificar los ácidos nucleicos
[Gergen et al, Southern et al, Sharp et al].
Más recientemente, se han desarrollado procedimientos para PCR y
RT-PCR que son capaces de medir la cantidad de un
ácido nucleico en una muestra. Un planteamiento, por ejemplo, mide
la cantidad de un producto de la PCR en la fase logarítmica de la
reacción antes de la formación de las mesetas de productos de
reacción [Thomas et al].
Una secuencia génica contenida en todas las
muestras a cantidad relativamente constante se utiliza típicamente
para la normalización de la eficacia de amplificación de la muestra.
Sin embargo, este planteamiento, sufre varios inconvenientes. El
procedimiento requiere que cada muestra tenga cantidades iguales de
entrada del ácido nucleico y que la eficacia de amplificación entre
muestras sea idéntica hasta el momento del análisis. Además, es
difícil usar los procedimientos convencionales de la cuantificación
de la PCR tal como electroforesis de gel o hibridación de captura
en placa para determinar que todas las muestras se analizan de hecho
durante la fase logarítmica de la reacción como se requiere por el
procedimiento.
Otro procedimiento llamado
(QC)-PCR cuantitativo competitivo, como el nombre
implica, depende de la inclusión de un competidor de control
interno en cada reacción [Maniatis et al,
Becker-Andre et al, Piatak et al in
BioTechniques (1993)]. La eficacia de cada reacción se normaliza al
competidor interno. Se añade típicamente una cantidad conocida de
competidor interno. El producto de la PCR diana desconocido se
compara con el producto de la PCR competidor desconocido para
obtener una cuantificación relativa. Una dificultad a este
planteamiento general depende del desarrollo de un control interno
que se amplifica con la misma eficacia que la molécula diana.
Los ensayos de la nucleasa fluorogénica son un
procedimiento de cuantificación a tiempo real que usa una sonda
para controlar la formación del producto de amplificación. La base
de este procedimiento de control de de la formación del producto de
amplificación. La base de este procedimiento de control de la
formación del producto de amplificación es medir la acumulación de
manera continua del producto de la PCR usando una sonda de
oligonucleótidos fluorogénica marcada doble, un planteamiento
frecuentemente mencionado en la bibliografía simplemente como el
procedimiento "TaqMan " [Piatak et al in
Science_(1993), Heid et al, Gibson et al,
Holland et al] .
La sonda usada en tales ensayos es típicamente
un oligonucleótido corto (de aproximadamente 20 - 25 bases) que
está marcado con dos tintes fluorescentes diferentes. El extremo 5'
de la sonda se une a un tinte indicador y el extreme 3' se une a un
tinte de inactivación, aunque los tintes se pueden unir a otras
localizaciones sobre la sonda también. La sonda se diseña para que
tenga al menos una complementariedad de secuencia sustancial con el
sitio de unión a la sonda. Los cebadores de la PCR cadena arriba y
cadena abajo que se unen a las regiones de flanqueo del locus se
añaden a la mezcla de reacción. Cuando la sonda está intacta, se
produce la transferencia la transferencia de energía entre los dos
fluoróforos y el inactivador inactiva la emisión a partir del
indicador. Durante la fase de extensión de la PCR, la sonda se
escinde mediante la actividad de la nucleasa en 5' de una
polimerasa de ácido nucleico tal como la Taq polimerasa, liberando
por lo tanto el indicador del inactivador de oligonucleótidos y
dando como resultado un incremento de intensidad de emisión del
indicador que se puede medir mediante un detector apropiado.
Un detector que se adapta de manera específica
para medir las emisiones de fluorescencia tales como las creadas
durante un ensayo fluorogénico es el ABI 7700 ó 4700 HT fabricados
por Applied Biosystems, Inc. in Foster City, Calif. El ABI 7700 usa
fibra óptica conectada a cada pocillo en una disposición de tubos de
la PCR de 96 ó 384 pocillos. El instrumento incluye un láser para
excitar las etiquetas y es capaz de medir la intensidad del
espectro fluorescente a partir de cada tubo con el control continuo
durante la amplificación por PCR. Cada tubo se vuelve a examinar
cada 8,5 segundos.
El software del ordenador que tiene el
instrumento es capaz de registrar la intensidad de fluorescencia del
indicador e inactivador durante el curso de la amplificación. Los
valores registrados se usarán después para calcular el incremento
en la intensidad de emisión normalizado en una base continua. El
incremento en intensidad de emisión se representa gráficamente
frente al tiempo, es decir, el número de ciclos de amplificación,
para producir una medición continua de la amplificación. Para
cuantificar el locus en cada reacción de amplificación, el gráfico
de amplificación se examina en un punto durante la fase logarítmica
de la acumulación del producto.. Esto se lleva a cabo mediante la
asignación de una intensidad de umbral de fluorescencia por encima
del fondo y determinando el punto en el que cada gráfico de
amplificación cruza el umbral (definido como el número de ciclos
de umbral o Ct). Las diferencias en el número de ciclos umbral se
usan para cuantificar la cantidad relativa de diana de PCR
contenida dentro de cada tubo. Asumiendo que cada función de
reacción a 100% de eficacia de PCR, una diferencia de un valor de
Ct representa una diferencia de dos veces en la cantidad del molde
de partida. El valor de fluorescencia se puede usar junto con una
curva patrón para determinar la cantidad del producto de
amplificación presente.
Está disponible una diversidad de opciones para
medir los productos de amplificación a medida que se forman. Un
procedimiento utiliza etiquetas, tales como tintes, que solamente se
unen a ADN de cadena doble. En este tipo de planteamiento, el
producto de amplificación (que es de cadena doble) se une a
moléculas de tinte en solución para formar un complejo. Con los
tintes apropiados, es posible distinguir entre las moléculas de
tinte libres en solución y las moléculas de tinte unidas al producto
de amplificación. Por ejemplo, ciertos tintes son fluorescentes
solamente cuando se unen al producto de amplificación. Los ejemplos
de tintes que se pueden usar en procedimientos de este tipo general
incluyen, pro no se limitan a, Syber Green. TM. y Pico Green de
Molecular Probes, Inc. of Eugene, Oreg., bromuro de etidio, yoduro
de propidio, cromomicina, acridina naranja, Hoechst 33258,
Toto-1, Yoyo-1, DAPI
(4',6-diamidino-2-fenilindol
hidroclorotiazida).
Otra técnica de detección de tiempo real mide la
alteración en la transferencia de la energía de fluorescencia
entre fluoróforos conjugada con los cebadores de PCR [Livak et
al.]
Estos procedimientos de detección implican
alguna alteración a la estructura o conformación de una sonda
hibridaza al locus entre el par de cebadores de amplificación. En
algunos casos, la alteración está provocada por la extensión
dependiente del molde catalizada por una polimerasa de ácido
nucleico durante el procedimiento de amplificación. La alteración
genera una señal detectable que es una medida indirecta de la
cantidad de producto de amplificación formado.
Por ejemplo, algunos procedimientos implican la
degradación o digestión de la sonda durante la reacción de
extensión. Estos procedimientos son consecuencia de la actividad de
la nucleasa en 5'-3' asociada a algunas polimerasas
de los ácidos nucleicos. Las polimerasas que tienen esta actividad
escinden los mononucleótidos u oligonucleótidos pequeños a partir
de una sonda de oligonucleótidos hibridaza a su secuencia
complementaria localizada dentro del locus.
El extremo 3' del cebador cadena arriba
proporciona el sitio de unión inicial para la polimerasa de ácido
nucleico. A medida que la polimerasa cataliza la extensión del
cebador cadena arriba y se encuentra con la sonda de unión, la
polimerasa del ácido nucleico desplaza una parte del extremo 5' de
la sonda y a través de su actividad de nucleasa escinde los
mononucleótidos u olgonucleótidos de la sonda.
El cebador cadena arriba de la sonda se pueden
diseñar de manera que se hibriden a la hebra complementaria en
estrecha proximidad entre sí. De hecho, el extremo 3' del cebador
cadena arriba y el extremo 5' de la sonda puede terminar en otra.
En esta situación, la extensión del cebador cadena arriba no es
necesaria con el fin de que la polimerasa de ácido nucleico
comience a escindir la sonda. En el caso en el que en el que los
nucleótidos que intervienen separan el cebador cadena arriba y la
sonda, la extensión del cebador es necesaria antes de que la
polimerasa de ácido nucleico encuentre el extremo 5' de la sonda.
Una vez se produce el contacto y continúa la polimerización, la
actividad de la exonucleasa 5'-3' de la polimerasa
del ácido nucleico comienza a escindir los mononucleótidos u
oligonucleótidos a partir del extremo 5' de la sonda. La digestión
de la sonda continúa hasta que la parte restante de la sonda se
disocia de la hebra complementaria.
En solución, las dos secciones del extreme se
pueden hibridar entre sí para formar un bucle de horquilla. En esta
conformación, el tinte indicador e inactivador están en proximidad
lo suficientemente próxima que es fluorescente a partir del tinte
indicador se inactiva de manera eficaz por el tinte inactivador. La
sonda hibridaza, por el contrato, da como resultado una
conformación linealizada en la que el grado de inactivación
disminuye. De este modo, mediante control de los casos de emisión
para los dos tintes, es posible controlar de manera indirecta la
formación del producto e amplificación.
La sonda marcada se selecciona de manera que su
secuencia sea sustancialmente complementaria a un segmento del
locus de ensayo o un locus de referencia. Como se ha indicado
anteriormente, el sitio del ácido nucleico al que la sonda se une
de debe localizar entre los sitios de unión del cebador para los
cebadores de amplificación cadena arriba y cadena abajo.
Los cebadores usados en la amplificación se
seleccionan de manera que sean capaces de hibridarse a las
secuencias de en las regiones flanqueantes del locus que se están
amplificando. Los cebadores se eligen para que tengan al menos
complementariedad sustancial con las diferentes hebras de los ácidos
nucleicos que se están amplificando. Cuando una sonda se utiliza
para detectar la formación de los productos de amplificación, los
cebadores e seleccionan de tal manera que flanquean la sonda, es
decir, se localizan cadena arriba y cadena debajo de la sonda.
El cebador debe tener una longitud suficiente de
manera que sea capaz de de cebar la síntesis de los productos de
extensión en la presencia de un agente para la polimerización. La
longitud y composición del cebador depende de muchos parámetros,
incluyendo, por ejemplo, la temperatura a la que la reacción de
hibridación se lleva a cabo, proximidad del sitio de unión de la
sonda a la del cebador, concentraciones relativas del cebador y
sonda y la composición del ácido nucleico particular de la sonda.
Típicamente el cebador incluye 15 - 30 nucleótidos. Sin embargo,
la longitud del cebador puede ser más o menos dependiente de la
complejidad del sitio de unión del cebador y los factores listados
anteriormente.
Las marcas usadas para marcar las sondas o
cebadores de la invención actual pueden proporcionar la señal
correspondiente a la cantidad del producto de amplificación pueden
tomar una diversidad de formas. Como se ha indicado anteriormente
con relación a l procedimiento de nucleasa 5' fluorogénica, una
señal fluorescente es una señal que se puede medir. Sin embargo,
también se pueden realizar mediciones, por ejemplo, controlando la
radiactividad, colorimetría, absorción, parámetros magnéticos, o
actividad enzimática. De este modo, las etiquetas que se pueden
emplear incluyen, pero no se limitan a, fluoróforos, cromóferos,
isótopos radiactivos, reactivos de densidad de electrones, enzimas,
y ligandos que tienen parejas de unión específica (por ejemplo,
biotina-avidina).
El control de cambios en la fluorescencia es una
forma particularmente útil para controlar la acumulación de los
productos de amplificación. Un número de etiquetas útiles para la
unión a sondas o cebadores están comercialmente disponibles
incluyendo fluoresceína y diversos derivados de fluoresceína tales
como FAM, HEX, TET y JOE (todos lso cuales están disponibles a
partir de Applied Biosystems, Foster City, Calif.); amarillo de
lucifer, y derivados de cumarina.
Las etiquetas pueden estar unidas a la sonda o
cebador usando una diversidad de técnicas y se puede unir al
extremo 5', y/o el extremo 3' y/o en un nucleótido interno. La
etiqueta también se puede unir a brazos de espaciador de diversos
tamaños que están unidos a la sonda o cebador. Estos brazos
espaciadores son útiles para obtener una distancia deseada entre
múltiples etiquetas unidas a la sonda o cebador.
En algunos casos, se puede utilizar una sola
etiqueta; mientras, en otros casos, tales como con los ensayos de
nucleasa 5' fluorogénica por ejemplo, dos o más etiquetas están
unidas a la sonda. En los casos en los que la sonda incluye
múltiples etiquetas, es en general aconsejable para mantener el
espacio entre las etiquetas que es suficiente para permitir la
separación de las etiquetas durante la digestión de la sonda
mediante la actividad de la nucleasa 5'-3' de la
secuencia de la polimerasa de ácido nucleico.
Un número de enfermedades están asociadas a los
cambios en el número de copias de un cierto gen. Para los pacientes
que tienen síntomas de una enfermedad, el procedimiento de la PCr de
tiempo real se puede usar para determinar si el paciente tiene
alteraciones del número de copia que se sabe que están unidas a
enfermedades que están asociadas a los síntomas que tiene el
paciente.
Las proteínas de fusión son útiles para generar
anticuerpos contra las secuencias de aminoácidos de la
MGAT-X1 y para uso en diversos sistemas de ensayo.
Por ejemplo, proteínas de fusión se pueden usar para identificar
proteínas que interactúan con partes del péptido
MGAT-X1. Los ensayos de cromatografía de proteína o
basados en genotecas para las interacciones proteína - proteína,
tales como los sistemas de dos híbridos de levaduras o de
despliegue en fago, se pueden usar para este propósito. Tales
procedimientos se conocen bien en la técnica y también se pueden
usar como selecciones de fármaco.
Unas proteína de fusión de la
MGAT-X1 comprende dos segmentos de polipéptidos
condensados conjuntamente mediante mediante un enlace de péptido.
El primer segmento de polipéptido puede comprender al menos 54, 75,
100, 125, 139, 150, 175, 200, 225, 250, ó 275 aminoácidos contiguos
de la SEQ ID NO:2 o de una variante biológicamente activa, tales
como los descritos anteriormente. El primer segmento de polipéptido
también comprende MGAT-X1 de longitud
completa.
\newpage
El Segundo segmento de polipéptido puede ser una
proteína de longitud completa o fragmento de proteína. Las
proteínas usadas comúnmente en la construcción de la proteína de
fusión incluyen, pero no se limitan a,
\beta-galactosidasa,
\beta-glucuronidase, proteína fluorescente verde
(GFP), proteínas autofluorescentes, incluyendo la proteína
fluorescente azul (BFP),
glutatión-S-transferasa (GST),
luciferasa, peroxidasa de rábano picante (HRP), y cloramfenicol
acetiltransferasa (CAT). De manera adicional, las etiquetas de
epítopes se usan en las construcciones de proteínas de fusión,
incluyendo etiquetas de histidina (His), etiquetas de FLAG,
etiquetas de hemaglutinina de gripe(HA), etiquetas Myc,
etiquetas VSV-G, y etiquetas tioredoxina (Trx).
Otras construcciones de fusión pueden incluir proteína de unión a
maltosa (MBP), etiqueta S, fusiones de Lex un dominio de unión a
ADN (DBD), fusiones de dominio de unión de ADN GAL4, fusiones de
proteína BP16 de virus herpes simplex (HSV) y fusiones de proteína
G (por ejemplo G (alfa)16, Gs, Gi). También se puede
modificar por ingeniería genética una proteína de fusión para que
contenga un sitio de escisión localizado adyacente a la
MGAT-X1.
Un polinucleótido de la MGAT-X1
de origen natural se puede aislar sin otros componentes celulares
tales como componentes de membrana, proteínas, y lípidos. Los
polinucleótidos se pueden preparar por una célula y aislarse usando
técnicas de purificación de ácido nucleico, o sintetizarse usando
una técnica de amplificación, tal como la reacción en cadena de
la polimerasa (PCR), o mediante el uso de un sintetizador
automático. Los procedimientos para aislar polinucleótidos son
rutinarios y se conocen en la técnica. Cualquier técnica para
obtener un polinucleótido se puede usar para obtener polinucleótidos
de la MGAT-X1. Por ejemplo, se pueden usar enzimas
de restricción y sondas para aislar fragmentos de polinucleótidos
que comprende secuencias de nucleótidos de la
MGAT-X1. Los polinucleótidos aislados están en las
preparaciones que están libres de al menos 70, 80, o 90% de otras
moléculas.
Las moléculas de ADNc de la
MGAT-X1 se pueden preparar con técnicas de biología
molecular convencionales usando ARNm de la MGAT-X1
como molde. Las moléculas de ADNc de la MGAT-X1 se
pueden después replicar usando las técnicas de biología molecular
conocidas en la técnica. Se puede usar una técnica de amplificación,
tal como PCR para obtener copias adicionales de polinucleótidos
de la invención, usando o bien ADN o ADNc genómico humano como
molde.
Como alternativa, se pueden usar técnicas de
química de síntesis para sintetizar polinucleótidos de la
MGAT-X1. La degeneración del código genético
permite secuencias de nucleótidos alternativas para sintetizar que
codificarán MGAT-X1 que tienen, por ejemplo, una
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o su variante
biológicamente activa.
Se pueden usar diversos procedimientos basándose
en PCR para extender las secuencias de ácido nucleico que
codifican MGAT-X1, por ejemplo para detectar
secuencias cadena arriba del gen de la MGAT-X1 tales
como promotores y elementos reguladores. Por ejemplo, la PCR de
sitio de restricción usa cebadores universales para recuperar la
secuencia desconocida adyacente a un locus conocido. El ADN genómico
se amplifica primero en la presencia de un cebador a una secuencia
de engarce y un cebador específico a la región conocida. Las
secuencias amplificadas son el sujeto de una segunda ronda de la
PCR con el mismo cebador de engarce y otro cebador específico
interno al primero. Los productos de cada ronda de la PCR se
transcriben con una ARN polimerasa apropiada y secuenciarse usando
transcriptasa inversa.
La PCR inversa también se puede usar para
amplificar o extender secuencias que usan cebadores divergentes
basándose en una región conocida. Los cebadores se pueden diseñar
usando un software comercialmente disponible, tal como el software
OLIGO 4.06 Primer Analysis (National Biosciences Inc., Plymouth,
Minn.), que es de 22 - 30 nucleótidos de longitud, para que tenga
un contenido de GC de 50% o más, e hibridarse a la secuencia diana
a temperaturas aproximadamente 68 - 72ºC. El procedimiento usa
varias enzimas de restricción para generar un fragmento adecuado en
la región conocida. Después el fragmento se hace circular mediante
ligamiento intramolecular y se usa como un molde de la PCR.
Otro procedimiento que se puede usar es PCR de
captura, que implica la amplificación mediante la PCR de los
fragmentos de ADN adyacentes a una secuencia conocida en el ADN
cromosómico humano y de levadura artificial. En este procedimiento,
se pueden usar las digestiones y ligaduras de enzima de restricción
múltiples para colocar una secuencia de ADN modificada por
ingeniería genética en un fragmento desconocido de la molécula de
ADN antes de realizar la PCR.
Cuando se seleccionan los ADNc de longitud
completa, se prefiere usar genotecas que se hayan seleccionado por
tamaño para que incluyan ADNc mayores. Las genotecas cebadas al azar
pueden ser esencialmente preferibles par alas situaciones en las
que una genoteca de oligo d(T)no produce un ADNc de
longitud completa. Las genotecas genómicas pueden ser útiles para
la extensión de secuencia en las regiones reguladoras no transcritas
de 5'.
Los sistemas de electroforesis de capilar
comercialmente disponibles se pueden usar para analizar el tamaño
o confirmar la secuencia de nucleótidos de la PCR o productos de
secuenciación. Por ejemplo, la secuenciación capilar puede emplear
polímeros de flujo libre para la separación electroforética, cuatro
tintes fluorescentes diferentes (uno para cada nucleótido) que
están activados por láser, y la detección de las longitudes de onda
emitidas por una cámara con dispositivo acoplado a carga. La
intensidad de la salida/luz se puede convertir en señal eléctrica
usando un equipo y software apropiado (por ejemplo, GENOTYPER and
Sequence NAVIGATOR, Perkin Elmer), y el procedimiento entero de
carga de las muestras a análisis de ordenador y muestra de datos
electrónica se puede controlar por ordenador. La electroforesis
capilar se prefiere de manera especial para la secuenciación de
partes pequeñas de ADN que pudieran estar presentes en cantidades
limitadas en una muestra particular.
La MGAT-X1 se puede obtener, por
ejemplo, mediante purificación de células humanas, mediante la
expresión de los polinucleótidos de la MGAT-X1, o
mediante síntesis química directa.
La MGAT-X1 se puede purificar a
partir de cualquier célula que expresa la transferasa, incluyendo
los que se han transferido con las construcciones de expresión que
expresan MGAT-X1. Una MGAT-X1
purificada se separa de otros compuestos que normalmente se asocian
a MGAT-X1 en la célula, tales como ciertas
proteínas, carbohidratos, o lípidos, usando los procedimientos bien
conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen, pero no se
limitan a, cromatografía por exclusión de tamaño, fraccionamiento
por sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico,
cromatografía de afinidad, y electroforesis de gel preparativa.
Para expresar MGAT-X1, el
polinucleótido de la MGAT-X1 se puede insertar en un
vector de expresión que contiene los elementos necesarios para la
transcripción y traducción de la secuencia de codificación
insertada. Los procedimientos que se conocen bien por los expertos
en la técnica se pueden usar para MGAT-X1 y
elementos de control de transcripción y de traducción apropiados.
Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in
vitro, técnicas de síntesis, i recombinación genética in
vivo [Devlin et al., Science, (1990)].
Una variedad de los sistemas de vector/huésped
se puede utilizar para que contenga y exprese las secuencias que
codifican MGATX1. Éstos incluyen, pero no se limitan a,
microorganismos, tales como bacterias transformadas con
bacteriófago recombinante, plásmido, o vectores de expresión de ADN
de cósmico; levadura transformada con vectores de expresión de
levaduras, sistemas de células de insectos infectados con vectores
de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de coliflor,
CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV) o con vectores de expresión
de bacterias (por ejemplo,Ti o plásmidos de pBR322), o sistemas de
células animales.
Los elementos de control o secuencias
reguladoras son las regiones no traducidas de los potenciadores del
vector, promotores, regiones no traducidas 5' y 3' que interactúan
con las proteínas celulares de huésped para sacar la transcripción
y traducción. Tales elementos pueden variar en su longitud y
especificidad. Dependiendo del sistema de vector y huésped
utilizado, se puede usar cualquier número de elementos de
transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores
constitutivos y que se pueden inducir. Por ejemplo, cuando se
clonan en sistemas bacterianos, se pueden usar promotores que se
pueden inducir tales como el promotor lacZ híbrido o el fagémido
BLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, Calif.) o plásmido pSPORT1 (Life
Technologies) y similares. El promotor de de polihedrina de
baculovirus se puede usar en células de insectos. Los promotores o
potenciadotes derivados de los genomas de células de plantas (por
ejemplo, choque térmico, RUBISCO, y genes de proteína de
almacenamiento) o a partir de virus de plantas (por ejemplo,
promotores virales o secuencias guía) se pueden clonar en el
vector. En los sistemas de células de mamíferos, son preferibles
promotores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Si es
necesario generar una línea celular que contiene múltiples copias de
una secuencia de nucleótidos que codifica MGAT-X1,
se pueden usar vectores basados en SV40 o EBV con un marcador que
se puede seleccionar apropiado.
En los sistemas bacterianos, se pueden
seleccionar un número de vectores de expresión. Por ejemplo, cuando
se necesita una gran cantidad de la MGAT-X1 para la
inducción de anticuerpos, se pueden usar vectores que dirigen la
expresión de alto nivel de proteínas de fusión que se purifican de
manera fácil. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a,
vectores de clonación y expresión de E. coli multifuncionales
tales como BLUESCRIPT (Stratagene). En un vector BLUESCRIPT, se
puede ligar una secuencia de la MGAT-X1 en el vector
en fase con las secuencias para la Met terminal y los 7 restos
posteriores de \beta-galactosidasa xde manera que
se produce una proteína híbrida. Los vectores pIN o vectores pGEX
vectors (Promega, Madison, Wis.) también se pueden usar para
expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con la
glutatión S-transferasa (GST). En general, teles
proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a
partir de células lisadas mediante adsorción a perlas de
glutatión-agarosa seguido de elución en la presencia
de glutatión libre. Las proteínas preparadas en tales sistemas
se pueden diseñar para que incluyan heparina, trombina, o sitios de
escisión de la proteasa del factor Xa de manera que el polipéptido
clonado de interés se pueda liberar del resto GST también.
\newpage
Si se usan vectores de expresión de plantas, la
expresión de las secuencias que codifican MGAT-X1
se pueden proporcionar mediante cualquiera de un número de
promotores. Por ejemplo, promotores virales tales como los
promotores 35S y 19S de CaMV se pueden usar solos o en combinación
con la secuencia guía omega de TMV [Scott et al. (1990)].
Como alternativa, promotores de plantas tales como la pequeña unidad
de RUBISCO o se pueden usar promotores de choque térmico [Takamatsu
et al. (1987)]. Estas construcciones se pueden introducir en
células de plantas mediante transformación de ADN directa o mediante
transfección mediada por patógenos.
También se puede usar un sistema de insecto para
expresar MGAT-X1. Por ejemplo, en uno de tales
sistemas se usa el virus de polihedrosis nuclear de Autographa
californica (AcNPV) como un vector para expresar genes foráneos
en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de
Trichoplusia. Las secuencias que codifican
MGAT-X1 se pueden clonar en una región no esencial
del virus, tal como el gen de la polihedrina, y colocarse bajo
control del promotor de la polihedrina. La inserción exitosa de la
MGAT-X1 hará que el gen de la polihedrina sea
inactivo y produzca virus recombinante que carece de proteína de
revestimiento. Los virus recombinantes se pueden después usar para
infectar células de S. frugiperda cells o larvas de
Trichoplusia en las que se puede expresar
MGAT-X1 [Fodor et al., (1993)].
Se puede usar un número de sistemas de expresión
basados en virus para expresar MGAT-X1 en células
huésped de mamífero. Por ejemplo, si se usa un adenovirus como un
vector de expresión, las secuencias que codifican
MGAT-X1 se pueden ligar en un complejo de
transcripción/traducción de adenovirus que comprende el promotor
antiguo y la secuencia guía tripartita. La inserción en una región
E1 o E3 no esencial del genoma viral se puede usar para obtener un
virus viable que es capaz de expresar MGAT-X1 en
células huésped infectadas [Engelhard et al. (1994)]. Si se
desea, se pueden usar potenciadotes de transcripción, tal como
potenciador del virus de sarcoma Rous (RSV), para incrementar
la expresión en células huésped de mamíferos.
También se pueden usar cromosomas artificiales
humanos (HAC) para administrar fragmentos mayores de AND que pueden
estar contenidos y expresados en un plásmido. Los HAC de 6M a 10M se
construyen y se distribuyen a las células mediante procedimientos
de distribución convencionales (por ejemplo, liposomas, polímeros de
amino policatiónicos, o vesículas). También se pueden usar señales
de inicio de específicas para lograr traducción más eficaz de las
secuencias que codifican MGAT-X1. Tales señales
incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. En los
casos en los que las secuencias que codifican
MGAT-X1, su codón de inicio, y las secuencias
cadena arriba se insertan en el vector de expresión adecuado, no se
necesitan señales de control de transcripción o de traducción
adicionales. Sin embargo, en los casos en los que la secuencia de
codificación solamente, o su fragmento, se inserta, se deben
proporcionar señales de control de la traducción exógena (incluyendo
el codón de inicio ATG). El codón de inicio debe estar en el marco
de lectura correcto para asegurar la traducción de la inserción
completa. Los elementos de traducción exógenos y los codones de
inicio pueden ser de diversos orígenes, tanto natural como
sintético.
Se puede elegir una cepa de célula por su
capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o
para procesar la MGAT-X1 expresada de la manera
deseada. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se
limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación,
lipidación, y acilación. El procesamiento después de la traducción
que escinde una "prepro" del polipéptido también se puede usar
para facilitar la inserción, plegamiento y/o función correcta.
Diferentes células huésped que tienen maquinaria celular y
mecanismos característicos para las actividades después de la
traducción (por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38), están
disponibles de la Colección Americana de Cultivos (ATCC; 10801
University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209) y se
pueden elegir para asegurar la correcta modificación y
procesamiento de la proteína foránea.
Se prefiere la expresión estable para la
producción a largo plazo, de alto rendimiento de proteínas
recombinantes. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de
manera estable la MGAT-X1 se pueden transformar
usando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales
de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen
marcador que se puede seleccionar sobre el mismo o sobre un vector
separado. Después de la introducción del vector, las células se
pueden dejar crecer durante 1 - 2 días en un medio enriquecido antes
de que se cambien a un medio selectivo. El propósito del marcador
que se puede seleccionar es conferir resistencia a la selección, y
su presencia permite el crecimiento y recuperación de las células
que expresan de manera exitosa las secuencias de la
MGAT-X1 introducidas. Los clones resistentes de las
células transformadas de manera estable se pueden hacer proliferar
usando técnicas de cultivo de tejidos apropiados al tipo de célula.
Se puede usar cualquiera de un número de los sistemas de selección
para recuperar las líneas celulares transformadas. Éstas incluyen,
pero no se limitan a, los genes de la timidina quinasa de virus
herpes simplex [Logan & Shenck, (1984)] y la adenina
fosforibosiltransferasa [Wigler et al., (1977)] que se pueden
emplear en las células tk- o aprt-, respectivamente. También, se
pueden usar, resistencia a antimetabolito, antibiótico, o herbicida
como la base para la selección. Por ejemplo, dhfr- confiere
resistencia a metotrexato [Lowy et al., (1980)], npt
confiere resistencia a los aminoglicósidos, neomicina y
G-418 [Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
(1980)], y las y pat confiere resistencia a clorsulfuron y
fosfinotricin acetiltransferasa, respectivamente
[Colbere-Garapin et al., (1981)]. Se han
descrito genes que se pueden seleccionar adicionales. Por ejemplo,
trpB permite que las células utilicen indol en lugar de
triptófano, o hisD, que permite que las células utilicen
histinol en lugar de histidina [Murray et al., (1992)]. Se
pueden usar marcadores visibles tales como antocianinas,
b-glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa su
sustrato luciferina, para identificar transformantes y para
cuantificar la cantidad de la expresión de proteína transitoria o
estable atribuible a un sistema de vector específico.
Aunque la presencia de la expresión de un gen
marcador sugiere que un polipéptido de la MGAT-X1
también está presente, su presencia y expresión puede necesitar ser
confirmada. Por ejemplo, si se inserta una secuencia que codifica
MGAT-X1 dentro de una secuencia de gen marcador, las
células transformadas que contienen secuencias que codifican
MGAT-X1 se pueden identificar mediante la ausencia
de la función del gen marcador. Como alternativa, se puede colocar
un gen marcador en tándem con una secuencia que codifica
MGAT-X1 bajo el control de un solo promotor. La
expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección
usualmente indica la expresión del polinucleótido de la
MGAT-X1.
Como alternativa, células huésped que contienen
un polinucleótido de MGAT-X1 y que expresa
MGAT-X1 se puede identificar mediante una
diversidad de procedimientos conocidos por los expertos en la
técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a,
hibridaciones ADN-ADN o ADN-ARN y
bioensayo de proteínas o técnicas de inmunoensayo que incluyen
tecnologías basadas en membrana, solución o en procesador para la
detección y/o cuantificación de ácido nucleico o proteína. Por
ejemplo, la presencia de una secuencia de polinucleótidos que
codifica MGAT-X1 se puede detectar mediante
hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN o
amplificación usando sondas o fragmentos o fragmentos de
polinucleótidos que codifican MGAT-X1. Los ensayos
basados en la amplificación de ácido nucleico implican el uso de
oligonucleótidos seleccionados entre las secuencias que codifican
MGAT-X1 para detectar transformantes que contienen
un polinucleótido de la MGAT-X1.
Se conocen en la técnica una diversidad de
protocolos para detector y medir la expresión de
MGAT-X1, usando o bien anticuerpos policlonales o
monoclonales específicos para el polipéptido. Los ejemplos incluyen
ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo
(RIA), y clasificación de células activada por fluorescencia
(FACS). Se puede usar un inmunoensayo de dos sitios, basado en
monoclonales que usa anticuerpos monoclonales reactivos con dos
epítopes que no interfieren sobre MGAT-X1, o se
puede emplear un ensayo de unión competitiva [Hartman &
Mulligan, (1988), Hampton et al., (1990)].
Los expertos en la técnica conocen una amplia
diversidad de etiquetas y se pueden usar en diversos ensayos de
ácido nucleico y aminoácido. Los medios para producir la hibridación
marcada o sondas de PCR para detector secuencias relacionadas con
los polinucleótidos que codifican MGAT-X1 incluyen
oligomarcado, traducción de muesca, marcado del extremo, o
amplificación de la PCR que usa un nucleótido marcado. Como
alternativa, las secuencias que codifican MGAT-X1
se pueden clonar en un vector para la producción de una sonda de
ARNm. Tales vectores se conocen en la técnica, están
comercialmente disponibles, y se pueden usar para sintetizar sondas
de ARN in vitro mediante la adición de nucleótidos marcados
y una ARN polimerasa apropiada tales como T7, T3, o SP6. Estos
procedimientos se pueden llevar a cabo usando una diversidad de kits
comercialmente disponibles (Amersham Pharmacia Biotech, Promega, y
US Biochemical). Las moléculas indicadoras adecuadas o etiquetas
que se pueden usar para facilitar la detección incluyen
radionúclidos, enzimas y agentes fluorescentes, quimioluminiscentes
o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores,
partículas magnéticas, y similares.
Las células huésped transformadas con secuencias
de nucleotides que codifican MGAT-X1 se pueden
cultivar en condiciones adecuadas para al expresión y recuperación
de la proteína a partir de cultivo de células. El polipéptido
producido por una célula transformada puede estar secretado o
contenido intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el
vector usado. Como entenderán los expertos en la técnica, los
vectores de expresión que contienen polinucleótidos que codifican
MGAT-X1 se pueden diseñar para contener secuencias
de señal que dirigen la secreción de MGAT-X1
soluble mediante una membrana de células procarióticas o
eucarióticas o que dirigen la inserción de membrana de la
MGAT-X1 unida a membrana.
Como se ha descrito anteriormente, se pueden
usar otras construcciones para unir una secuencia que codifica
MGAT-X1 a una secuencia de nucleótidos que codifica
un dominio de polipéptido que facilitará la purificación de
proteínas solubles. Tales dominios que facilitan la purificación
incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metal tales
como los módulos histidina-triptófano que permiten
la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de la
proteína A sobre inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado
en el sistema de extensión FLAGS/purificación por afinidad
(Immunex Corp., Seattle, Wash.). Inclusión de secuencias de engarce
escindibles tales como los específicos para el Factor XA o
enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de
purificación y MGAT-X1 también se pueden usar para
facilitar la purificación. Un vector de expresión tal proporciona
la expresión de una proteína de fusión que contiene
MGAT-X1 y 6 restos de histidina que precede un
sitio de escisión de tioredoxina o de una enteroquinasa. Los restos
de histidina facilitan la purificación por IMAC (cromatografía de
afinidad de ion metálico inmovilizado) Maddox et al.,
(1983)], mientras el sitio de escisión de la enteroquinasa
proporciona un medio para purificar MGAT-X1 a
partir de la proteína de fusión [Porath et al., (1992)].
\newpage
Las secuencias que codifican
MGAT-X1 se pueden sintetizar, completamente o en
parte, usando procedimientos químicos bien conocidos en la técnica
[Kroll et al. (1993), Caruthers et al., (1980)]. Como
alternativa, la propia MGAT-X1 se puede usar usando
procedimientos químicos para sintetizar su secuencia de aminoácidos,
tal como síntesis de péptido directa usando técnicas en fase sólida
[Hom et al., (1980); Merrifield et al., (1963)]. La
síntesis de proteína se puede o bien realizar usando técnicas
manuales o mediante automatización. La síntesis automática se
puede lograr, por ejemplo, usando El sintetizador de péptidos de
Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Opcionalmente, los
fragmentos de la MGAT-X1 se pueden separar de manera
separada y combinarse usando procedimientos químicos para producir
una molécula de longitud completa.
El péptido recientemente sintetizado se puede
purificar sustancialmente mediante cromatografía líquida de alta
resolución preparativa. La composición de una
MGAT-X1 sintética se puede confirmar mediante
análisis o secuenciación de aminoácidos. De manera adicional,
cualquier porción de la secuencia de aminoácidos de la
MGAT-X1 se puede alterar durante la síntesis directa
y/o combinarse usando procedimientos químicos con las secuencias
de otras proteínas para producir un polipéptido variante o una
proteína de fusión.
Como entienden los expertos en la técnica, se
puede producir de manera ventajosa las secuencias de nucleótidos
que codifica MGAT-X1- que poseen codones de origen
no natural. Por ejemplo, los codones preferidos por un huésped
procariótico o eucariótico particular se puede seleccionar para
incrementar la velocidad de la expresión de proteína o para
producir una transcripción de ARN que tiene las propiedades
deseables, tal como una semivida que es más larga que la de una
transcripción generada a partir de la secuencia de origen
natural.
Las secuencias de nucleótidos mencionadas en el
presente documento se pueden modificar por ingeniaría genética
usando procedimientos generalmente conocidos en la técnica para
alterar las secuencias que codifican MGAT-X1 por una
diversidad de razones, que incluyen, pero no se limitan a,
alteraciones que modifican la clonación, procesamiento, y/o
expresión del polipéptido o producto de ARNm. La recomposición de
ADN mediante fragmentación al azar y reensamblaje de los fragmentos
génicos y oligonucleótidos sintéticos se pueden usar para modificar
por ingeniería genética las secuencias de nucleótidos. Por ejemplo,
la mutagénesis dirigida al sitio se puede usar para insertar nuevos
sitios de restricción, alterar patrones de glicosilación, cambiar la
preferencia de codón, producir variantes de ayuste, introducir
mutaciones, y así sucesivamente.
Cualquier tipo de anticuerpo conocido en la
técnica se puede generar para que se usa de manera específica a un
epítope de la MGAT-X1. "Anticuerpo" como se usa
en el presente documento incluye moléculas de inmunoglobulina
intactas, así como sus fragmentos, tales como Fab, F(ab')2, y
Fv, que son capaces de unirse a un epítope de la
MGAT-X1. Típicamente, al menos 6, 8, 10, ó 12
aminoácidos contiguos se requieren para formar un epítope. Sin
embargo, los epítopes que implican aminoácidos no contiguos pueden
requerir más, por ejemplo, al menos 15, 25, ó 50 aminoácido.
Cualquier anticuerpo que se une de manera específica a un epítope de
MGAT-X1 se puede usar de manera terapéutica, así
como en ensayos inmunoquímicos, tales como transferencias de
Western, ELISA, radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquímicos,
inmunoprecipitaciones, u otros ensayos inmunoquímicos conocidos en
la técnica. Se pueden usar diversos inmunoensayos para identificar
anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Se conocen bien en
la técnica numerosos protocolos para ensayos competitivos o
inmunorradiométricos. Tales inmunoensayos típicamente implican la
medida de formación de complejo entre un inmunógeno y un anticuerpo
que se une de manera específica al inmunógeno.
Típicamente, un anticuerpo que se une de manera
específica a MGAT- X1 proporciona una señal de detección al menos
5-, 10-, ó 20- veces mayor que una señal de detección proporcionada
con otras proteínas cuando se usan en un ensayo inmunoquímico.
Preferiblemente, los anticuerpos que se unen de manera específica a
MGAT-X1 no detectan otras proteínas en los ensayos
inmunoquímicos y pueden inmunoprecipitar MGAT-X1 en
solución.
La MGAT-X1 se puede usar para
inmunizar a un mamífero, tal como un ratón, rata, conejo, cobaya,
ratón, o ser humano, para producir anticuerpos policlonales. Si se
desea, MGAT-X1 se puede conjugar a una proteína
vehículo, tal como albúmina sérica bovina, tiroglobulina, y
hemocianina de lapa californiana. Dependiendo de la especie
huésped, se pueden usar diversos adyuvantes para incrementar la
respuesta inmunológica. Tales adyuvantes incluyen, pero no se
limitan a, adyuvante de Freund, geles minerales (por ejemplo,
hidróxido de aluminio), y sustancias tensioactivas (por ejemplo,
lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones
oleosas, lemociania de lapa californiana, y dinitrofenol). Entre
otros adyuvantes usados en los seres humanos, BCG (Bacilos
Calmette-Guerin) y Corynebacterium
parvum son especialmente útiles.
Los anticuerpos monoclonales que se usan
específicamente a MGAT-X1 se pueden preparar usando
cualquier técnica que proporciona la producción de moléculas de
anticuerpos mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas
técnicas incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridoma,
la técnica de hibridoma de células B humanas, y la técnica de
hibridoma EBV [Roberge et al., (1995); Kohler et al.,
(1985); Kozbor et al., (1985); Cote et al.,
(1983)].
Además, se pueden usar las técnicas
desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos,"
el ayuste de genes de anticuerpos de ratón a genes de anticuerpos
humanos para obtener una molécula con especificidad de antígeno y
actividad biológica apropiada [Cole et al. (1984); Morrison
et al. (1984); Neuberger et al. (1984)]. También se
pueden usar anticuerpos monoclonales y otros "humanizados" para
evitar que un paciente monte una respuesta inmune frente al
anticuerpo cuando se usa de manera terapéutica.. Tales anticuerpos
pueden ser suficientemente similares a los anticuerpos humanos a
usar directamente en terapia o pueden requerir alteración de unos
pocos restos clave. Las diferencias de secuencias entre anticuerpos
de roedores y secuencias humanas se pueden minimizar reemplazando
restos que difieren de aquellos en las secuencias humanas mediante
mutagénesis dirigida al sitio de restos individuales o mediante
injerto de regiones determinantes complementarias enteras. Los
anticuerpos que se unen específicamente a MGAT-X1
pueden contener sitios de unión a antígeno que están o bien
parcialmente o totalmente humanizados, como se desvela en el
documento de Estados Unidos 5.565.332.
Como alternativa, las técnicas descritas para la
producción de anticuerpos de una sola cadena se pueden adaptar
usando procedimientos conocidos en la técnica para producir
anticuerpos de una sola cadena que se unen específicamente a
MGAT-X1. Los anticuerpos con especificidad
relacionada, pero composición idiotípica distinta, se pueden
generar mediante recomposición de cadena a partir de genotecas de
imunoglobulina de combinación al azar [Takeda et al.,
(1985)]. Los anticuerpos de una sola cadena también se pueden
construir usando un procedimiento de amplificación de ADN, tal como
PCR, usando ADNc de hibridoma como molde. Los anticuerpos de una
sola cadena pueden ser mono o bi específicos, y pueden ser
bivalentes o tetravalentes. Se enseña la construcción de
anticuerpos de una sola cadena tetravalentes biespecíficos. Una
secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de una sola
cadena se puede construir usando la síntesis de nucleótidos manual o
automática., clonarse en una construcción de expresión que usa
procedimientos de ADN recombinante, e introducirse en una célula
para expresar la secuencia codificante, como Se desvela más
adelante. Como alternativa, los anticuerpos de una sola cadena se
pueden producir directamente usando, por ejemplo, tecnología de fago
filamentoso [Burton et al. (1991); Verhaar et al.
(1995)].
Los anticuerpos que se unen específicamente a
MGAT-X1 también se pueden producir mediante la
inducción in vivo de la producción en la población de
linfocitos o mediante selección de genotecas de inmunoglobulina o
paneles de reactivos de unión altamente específicos. Se pueden
construir otros tipos de anticuerpos y usarse de manera terapéutica
en los procedimientos de la invención. Por ejemplo, se pueden
construir anticuerpos quiméricos como Se desvela en el documento WO
93/03151. También se pueden preparar las proteínas de unión que se
derivan de las inmunoglobulinas y que son multivalentes y
multiespecíficas, tales como los "dicuerpos" descritos en el
documento WO 94/13804.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención se
pueden purificar mediante procedimientos bien conocidos en la
técnica. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden purificar por
actividad mediante paso en una columna a las que
MGAT-X1 está unidad. Los anticuerpos unidos se
pueden después eluir de la columna usando un tampón con una alta
concentración en sal.
Los oligonucleótidos no codificantes son
secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia
de ADN o ARN. Una vez se ha introducido en una célula, los
nucleótidos complementarios se combinan con secuencias naturales
producidas por la célula para formar complejos y bloquear o bien la
transcripción o la traducción. Preferiblemente, un oligonucleótido
no codificante es de al menos 11 nucleótidos de longitud, pero puede
ser de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ó 50 o más
nucleótidos de longitud. Se pueden usar secuencias más largas. Las
moléculas de oligonucleótidos no codificantes se pueden proporcionar
en una construcción de ADN e introducirse en una célula como se ha
descrito anteriormente para disminuir el nivel del producto génico
de MGAT-X1 en la célula.
Los oligonucleótidos no codificantes pueden ser
desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, o una combinación de
ambos. Los oligonucleótidos se pueden sintetizar manualmente o
mediante un sintetizador automático, mediante unión covalente del
extremo 5' de un nucleótido con el extremo 3' de otro nucleótido
con enlaces de internucleótido no fosfodiéster tales como
alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos,
alquilfosforotioatos, alquilfosfonatos, fosforamidatos, ésteres
fosfatos,, carbamatos, acetamida, carboximetil estrés, carbonatos, y
fosfato triésteres.
Las modificaciones de la expresión génica de la
MGAT-X1 se pueden obtener mediante diseño de
oligonucleótidos no codificantes que formarán complejos dobles con
el control, 5', o regiones reguladoras del gen de la MGAT- X1. Se
prefieren los oligonucleótidos derivados del sitio de inicio de
transcripción, por ejemplo, entre las posiciones -10 y +10 del
sitio de partida. De manera similar, la inhibición se puede lograr
usando la metodología de apareamiento de bases de "triple
hélice". El emparejamiento de triple hélice es útil debido a que
provoca la inhibición de que la capacidad de la doble hélice se
abra suficientemente para la unión de las polimerasas, factores de
transcripción, o chaperones. Los avances terapéuticos que usan ADN
triple se han descrito en la bibliografía [Nicholls et al.
(1993)]. Un oligonucleótido no codificante se puede usar se puede
diseñar para bloquear la traducción de ARNm mediante la prevención
de la transcripción de la unión a ribosomas.
No se requiere una complementariedad precisa
para la formación del complejo exitoso entre un oligonucleótido no
codificante y la secuencia complementaria de un polinucleótido de la
MGAT-X1. Los oligonucleótidos no codificantes que
comprenden, por ejemplo, 2, 3, 4, ó 5 o más tramos de nucleótidos
contiguos que son complementarios de manera precisa a un
polinucleótido de la MGAT-X1, cada uno separado por
un tramo de de nucleótidos contiguos que no son complementarios a
los nucleótidos MGATX1 adyacentes, pueden proporcionar una
especificidad de dirección suficiente para el ARNm de la
MGAT-X1. Preferiblemente, cada tramos de nucleótidos
contiguos complementarios es de al menos 4, 5, 6, 7, u 8 o más
nucleótidos de longitud. Las secuencias que intervienen no
complementarias son preferiblemente de 1, 2, 3, ó 4 nucleótidos de
longitud. Los expertos en la técnica pueden fácilmente usar el
punto de fusión calculado de un par no codificante - codificante
para determinar el grado de discordancia que se tolerará entre un
oligonucleótido no codificante particular y una secuencia de
polinucleótidos de la MGAT-X1 particular. Los
oligonucleótidos no codificantes se pueden modificar sin que afecte
a su capacidad para hibridarse a un polinucleótido de
MGAT-X1. Estas modificaciones pueden ser internas o
en uno o ambos extremos de la molécula no codificante. Por ejemplo,
los enlaces de fosfato internucleósido se pueden modificar mediante
la adición de restos colesterilo o diamina con números variables
de restos de carbono entre los grupos amino y la ribosa terminal.
También se pueden emplear bases modificadas y/o azúcares, tal como
arabinosa en lugar de ribosa, o un oligonucleótido sustituido en
3', 5' en el que el grupo hidroxilo 3' o el grupo fosfato 5' están
sustituidos, también se puede emplear en un oligonucleótido no
codificante modificado. Estos oligonucleótidos modificados se
pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica
[Gee et al. (1994); Agrawal et al. (1992); Uhlmann
et al. (1990)].
Las ribozimas son moléculas de ARN con actividad
catalítica Uhlmann et al. (1987); Cech et al. (1987),
(1990), (1992)]. Las ribozimas se pueden usar para inhibir la
función génica mediante escisión de una secuencia de ARN, como se
conoce en la técnica (Patente de Estados unidos Nº 5.641.673). El
mecanismo de la acción de ribozima implica la hibridación
específica de la secuencia de la molécula de ribozima a ARN diana
complementario, seguido de la escisión endonucleolítica. Los
ejemplos incluyen moléculas de ribozima de pez martillo modificadas
por ingeniería genética que pueden de manera específica y eficaz
catalizar la escisión endonucleolítica de las secuencias de
nucleótidos específicas. La secuencia codificante de un
polinucleótido de la MGAT-X1 se puede usar para
generar ribozimas que se unirán específicamente a ARNm transcrito a
partir de un polinucleótido de la MGAT-X1. Los
procedimientos de diseño y construcción de ribozimas que pueden
escindir otras moléculas de ARNm en trans de una manera altamente
específica de secuencia se han desarrollado y descrito en la técnica
[Couture & Stinchcomb (1996)]. Por ejemplo, la acividad de
escisión de las ribozimas se pueden dirigir a ARN específicos
mediante modificación por ingeniería genética de una región discreta
de "hibridización" en la ribozima. La región de hibridización
contiene una secuencia complementaria al ARN diana y de esta manera
se híbrida de manera específica con él.
Los sitios de escisión específica de la ribozima
dentro de una diana de ARN de MGAT-X1 se puede
identificar mediante exploración de la molécula diana para los
sitios de escisión de ribozima que incluyen las siguientes
secuencias: GUA, GUU, y GUC. Una vez identificadas, las secuencias
de ARN cortas de entre 15 y 20 ribonucleótidos correspondiente a
la región del ARN diana que contiene el sitio de escisión se puede
evaluar por las características estructurales secundarias que
pueden hacer que la diana no se pueda trabajar. La idoneidad de las
diaans de ARN de MGAT-X1 adecuadas también se
pueden evaluar mediante el ensayo de la accesibilidad a la
hibridación con oligonucleótidos complementarios usando los ensayos
de protección de ribonucleasa. Las secuencias de nucleótidos
mostradas en la SEQ ID NO: 1 y su complemento proporcionan fuentes
de secuencias de la región de hibridación adecuadas. Se pueden
usar secuencias de hibridación más largas para incrementar la
afinidad de la secuencia de hibridación para la diana. Las
regiones de hibridación y escisión de la ribozima se pueden
relacionar de manera íntegra de manera que tras la hibridación del
ARN diana a través de las regiones complementarias, la región
catalítica de la ribozima puede escindir la diana.
Las ribozimas se pueden introducir en las
células como parte de una construcción de ADN. Se pueden usar
procedimientos mecánicos, tales como microinyección, transfección
mediada por liposomas, electroporación, o precipitación por fosfato
de calcio, para introducir una construcción de ADN que contiene
ribozima en las células en las que se desea disminuir la expresión
de MGAT-X1. Como alternativa, si se desea que las
células retengan de manera estable la construcción de ADN, la
construcción se puede suministrar sobre un plásmido y mantener como
un elemento separado o integrarse en el genoma de las células, como
se conoce en la técnica. Una construcción de ADN que codifica
ribozima puede incluir elementos reguladores de la transcripción,
tal como un elemento promotor, un potenciador o elemento UAS, y una
señal de terminador de la transcripción, para controlar la
transcripción de ribozimas en las células (patente de Estados
Unidos nº 5.641.673). También se pueden modificar por ingeniería
genética las ribozimas para proporcionar un nivel adicional de
regulación, de manera que la destrucción de ARNm se produzca
solamente cuando se inducen en la célula tanto una ribozima como un
gen diana.
Los reguladores como se usan en el presente
documento, se refiere a agonistas de la MGAT-X1 y
antagonistas de la MGAT-X1. Los agonistas de MGAT-
X1 son moléculas que, cuando se unen a MGAT-X1,
incrementan o prolongan la actividad de la MGAT-X1.
Los agonistas de la MGAT-X1 incluyen proteínas,
ácidos nucleicos, carbohidratos, pequeñas moléculas, o cualquier
otra molécula que activa MGAT-X1. Los antagonistas
de la MGAT-X1 son moléculas que, cuando se unen a
MGAT-X1, disminuyen la cantidad de o la duración de
la actividad de la MGAT-X1. Los antagonistas
incluyen proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, anticuerpos,
pequeñas moléculas, o cualquier otra molécula que disminuye la
actividad de la MGAT-X1.
\newpage
El término "modular," como aparece en el
presente documento, se refiere a un cambio en la actividad de la
MGAT-X1. Por ejemplo, modulación puede provocar un
incremento o una disminución en la actividad de proteína,
características de unión, o cualesquiera otras propiedades
biológica, funcional, o inmunológica de la
MGAT-X1.
Como se usa en el presente documento, las frases
"unión específica" o "que se une de manera específica" se
refiere a la interacción entre una proteína o péptido y un agonista,
un anticuerpo o un antagonista. La interacción depende de la
presencia de una estructura particular de la proteína reconocida por
la molécula de unión (es decir, el determinante antigénico o
epítope). Por ejemplo, si un anticuerpo es específico para el
epítope "A," la presencia de de un polipéptido que contiene
el epítope A, o la presencia de de A no marcado libre, en la
reacción que contiene A marcado libre y el anticuerpo reducirá la
cantidad de A marcado que se une al anticuerpo.
La invención proporciona procedimientos (también
denominados en el presente documento como "ensayos de
selección") para identificar compuestos que se pueden usar para
el tratamiento de cáncer. Los procedimientos suponen la
identificación de compuestos o agentes candidatos o de ensayo (por
ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, pequeñas moléculas u otras
moléculas) que se unen a MGAT-X1 y/o tienen un
efecto estimulador o inhibidor sobre la actividad biológica de la
MGAT-X1 o su expresión y después determinar cuales
de estos compuestos tienen un efecto sobre los síntomas o
enfermedades relacionadas con cáncer, en un ensayo in
vivo.
Los compuestos candidatos o de ensayo o agentes
que se unen a la MGAT-X1 y/o tienen un efecto
estimulador o inhibidor sobre la actividad de la expresión de la
MGAT-X1 se identifican o bien n ensayos que emplean
células que expresan la MGAT-X1 sobre la superficie
de la célula (ensayos basados en célula) o en ensayos que con la
MGAT-X1 aislada (ensayos sin células). Los diversos
ensayos pueden emplear una diversidad de variantes de la
MGAT-X1 (por ejemplo, MGAT-X1 de
longitud completa, un fragmento biológicamente activo de la
MGAT-X1, o una proteína de fusión que incluye toda o
parte de la MGAT-X1). Además,
MGAT-X1 se puede derivar de cualquier especie de
mamífero adecuado (por ejemplo, MGAT-X1 humana,
MGAT-X1 de rata o MGAT-X1 murina).
El ensayo puede ser un ensayo de unión que supone la medición
directa o indirecta de la unión de un compuesto de ensayo o un
ligando de la MGAT-X1 conocido a
MGAT-X1. El ensayo también puede ser un ensayo de
actividad que supone la medición directa o indirecta de la
actividad de la MGAT-X1. El ensayo también puede
ser un ensayo de expresión que supone la medición directa o
indirecta del ARNm de la MGAT-X1 o proteína de la
MGAT-X1. Se combinan los diversos ensayos de
selección con un ensayo in vivo que supone la medición de
los efectos del compuesto de ensayo sobre los síntomas de
cáncer.
En una realización, la invención proporciona
ensayos para seleccionar compuestos candidatos o de ensayo que se
unen a o modulan la actividad de una forma unida a membrana
(expresado en la superficie de la célula) de la
MGAT-X1. Tales ensayos pueden emplear la
MGAT-X1 de longitud completa, un fragmento
biológicamente activo de la MGAT-X1, o una proteína
de fusión que incluye toda o parte de MGATX1. Como Se desvela en
más detalle más adelante, se puede obtener el compuesto de ensayo
mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, a partir de
genotecas de compuestos convencionales. La determinación de la
capacidad del compuesto de ensayo a unir a una forma unida a
membrana de MGATX1 se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante
acoplamiento del compuesto de ensayo con un radiosiótopo o marca
enzimática de manera que la unión de del compuesto de ensayo a la
célula que expresa la MGAT-X1 se puede medir
detectando el compuesto marcado en un complejo. Por ejemplo, el
compuesto de ensayo se puede marcar con .. ^{125}I, .. ^{35}S,
.. ^{14}C, o .. ^{3}H, bien directa o indirectamente, y
detectar el radioisótopo mediante conteo directo de la radioemisión
o mediante conteo de centelleo. Como alternativa, el compuesto de
ensayo se se puede marcar de manera enzimática con, por ejemplo,
peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, o luciferasa, y
detectar la marca enzimática mediante la determinación de la
conversión de un sustrato apropiado en el producto.
En un formato de unión competitiva, el ensayo
comprende poner en contacto la célula que expresa
MGAT-X1 con un compuesto conocido que se une a
MGAT-X1 para formar una mezcla de ensayo, poner en
contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y
determinar la capacidad del compuesto de ensayo que interactúa con
la célula que expresa MGAT-X1, en el que la
determinación de la capacidad del compuesto de ensayo que interactúa
con la célula que expresa MGAT-X1 comprende la
determinación de de la capacidad del compuesto de ensayo para
unirse de manera preferencial a la célula que expresa
MGAT-X1 cuando se compara con el compuesto de
ensayo.
En otra realización, el ensayo es un ensayo
basado en células que comprende poner en contacto una célula que
expresa una forma unida a membrana MGAT-X1 (por
ejemplo, la MGAT-X1 de longitud completa, un
fragmento biológicamente activo de la MGAT-X1, o
una proteína de fusión que incluye toda o parte de la
MGAT-X1) que se expresa sobre la superficie celular
con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto
de ensayo para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la
actividad de la forma unida a membrana de la
MGAT-X1. La determinación del compuesto de ensayo
para modular la actividad de la forma unida a membrana de la
MGAT-X1 se puede llevar a cabo mediante cualquier
procedimiento adecuado para medir la actividad de la
MGAT-X1. la actividad de un transportador se puede
medir de numerosas formas, no todas las cuales son adecuadas para
cualquier transferasa dada.
La determinación de la capacidad del compuesto
de ensayo para modular la actividad de la MGAT-X1
se puede llevar a cabo, por ejemplo, determinando la capacidad de
la MGAT-X1 de unirse o interactuar con una molécula
diana. La molécula diana puede ser una molécula con la que se une o
interactúa con la MGAT-X1 en la naturaleza, por
ejemplo, una molécula sobre la superficie de una célula que expresa
MGAT-X1, una molécula sobre la superficie de una
segunda célula, una molécula en el medio extracelular, una molécula
asociada a la superficie interna de una membrana celular o molécula
citoplásmica. La molécula diana puede ser un componente de una ruta
de transducción de señal que facilita la transducción de una señal
extracelular (por ejemplo, una señal generada mediante la unión de
un ligando de la MGAT-X1, a través de la membrana
celular y en la célula. La molécula diana, puede ser, por ejemplo,
una segunda proteína intracelular que tiene actividad catalítica o
una proteína que facilita la asociación de las moléculas de señal
cadena abajo con la MGAT-X1.
La determinación de la capacidad de la
MGAT-X1 de unirse o interactuar con una molécula
diana se puede llevar a cabo mediante uno de los procedimientos
descritos anteriormente para la determinación de la unión directa.
En una realización, la determinación de la capacidad de un
polipéptido de la invención de unirse o interactuar con una
molécula diana se puede llevar a cabo mediante la determinación de
la actividad de la molécula diana. Por ejemplo, la actividad de la
molécula diana se puede determinar mediante la detección de la
inducción de un segundo mensajero celular de la diana (por ejemplo,
Ca^{2+} intracelular, diacilglicerol, IP3, etc.), detección de la
actividad catalítica/enzimática de la diana sobre un sustrato
apropiado, detección de la inducción de un gen indicador (por
ejemplo, un elemento regulador que es sensible a un polipéptido de
la invención unido de manera operativa a un ácido nucleico que
codifica un marcador detectable, por ejemplo, luciferasa), o
detección de una respuesta celular.
La presente invención también incluye ensayos
sin células. Tales ensayos implican poner en contacto una forma de
la MGAT-X1 (por ejemplo, MGAT-X1 de
longitud completa, un fragmento biológicamente activo de MGAT- X1, o
una proteína de fusión que comprende toda o parte de
MGAT-X1) con un compuesto de ensayo y determinar la
capacidad del compuesto de ensayo para unirse a
MGAT-X1. La unión del compuesto de ensayo a
MGAT-X1 se puede determinar o bien directa o
indirectamente como se ha descrito anteriormente. En una
realización, el ensayo incluye poner en contacto la
MGAT-X1 con un compuesto que se une a
MGAT-X1 para formar una mezcla de ensayo, poner en
contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y
determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interactuar con
la MGAT-X1, en la que la determinación de la
capacidad del compuesto de ensayo para interactuar con la
MGAT-X1 comprende la determinación de la capacidad
del compuesto de ensayo de unirse preferentemente a
MGAT-X1 cuando se compara con el compuesto
conocido.
Los ensayos sin células de la presente invención
son susceptibles de usarse o bien una forma unida a membrana de la
MGATX1 o su fragmento soluble. En el caso de los ensayos sin células
que comprenden la forma unida a membrana del polipéptido, puede ser
deseable utilizar un agente solubilizante de manera que la forma
unida a membrana del polipéptido se mantiene en solución. Los
ejemplos de tales agentes solubilizantes incluyen pero no se
limitan a detergentes no iónicos tales como
n-octilglucósido,
n-dodecil-glucósido,
n-dodecilmaltósido,
octanoil-N-metilglucamida,
decanoil-N-metilglucamida, Triton
X-100, Triton X-114, Thesit,
Isotridecipoli (etilen glicol éter)n, sulfonato de 3-[(3-
colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano,
(CHAPS), sulfonato de
3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propano
(CHAPSO), o sulfonato de
N-dodecil=N,N-dimetil-3-ammonio-1-propano.
En diversas realizaciones de los procedimientos
de ensayo anteriores, puede ser deseable inmovilizar
MGAT-X1 (o una molécula diana de la
MGAT-X1) para facilitar la separación de las formas
que forman complejo de las no forman complejo de una o ambas de las
proteínas, así como para acomodar la automatización del ensayo. La
unión de un compuesto de ensayo a la MGAT-X1, o
interacción de la MGAT-X1 con una molécula diana en
la presencia y ausencia de un compuesto candidato, se puede llevar
a cabo en cualquier recipiente adecuado para contener los
reactivos. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de
microvaloración, tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga. En
una realización, se puede proporcionar una proteína de fusión que
añada un dominio que permita que una o ambas de las proteínas se
unan a una matriz. Por ejemplo, proteínas de fusión de
glutatión-S-transferasa (GST) o
proteínas de fusión de
glutatión-S-transferasa se pueden
adsorber sobre perlas de glutatión sefarosa (Sigma Chemical; St.
Louis, Mo.) o placas de microvaloración derivadas de glutatión, que
después se combinan con el compuesto de ensayo o el compuesto de
ensayo y o bien la proteína diana no adsorbida o
MGAT-X1, y la mezcla se incuba en condiciones que
conducen a la formación de complejo (por ejemplo, en condiciones
fisiológicas de sal y pH). Después de la incubación, las perlas o
pocillos de la placa de microvaloración se lavan para retirar
cualesquiera componentes no unidos y se mide la formación de
complejo o bien directa o indirectamente, por ejemplo, como se he
descrito anteriormente. Como alternativa, los complejos se pueden
disociar de la matriz, y el nivel de unión o actividad de la
MGAT-X1 se pueden determinar usando técnicas
convencionales.
Otras técnicas para la inmovilización de
proteínas o matrices también se pueden usar en los ensayos de
selección de la invención. Por ejemplo, o bien
MGAT-X1 o su molécula Diana se puede inmovilizar
utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. Se puede
preparar polipéptido biotinilado de la invención o moléculas diana a
partir de biotina-NHS
(N-hidroxi-succinimida) usando
técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de
biotinilación, Pierce Chemicals; Rockford, Ill.), y se inmovilizan
en los pocillos de las placas recubiertas con estreptavidina
(Pierce Chemical). Como alternativa, los anticuerpos reactivos con
la MGAT-X1 o moléculas diana pero que no
interfieren con la unión del polipéptido de la invención a su
molécula diana se puede derivatizar a los pocillos de la placa, y
diana o polipéptido no unido de la invención atrapados en los
pocillos mediante conjugación de anticuerpos. Los procedimientos
para detectar tales complejas, además de los descritos anteriormente
para los complejos GST-inmovilizados, incluyen
inmunodetección de complejos que usan anticuerpos reactivos con la
MGAT-X1 o molécula diana, así como ensayos ligados a
enzima que depende de la detección de una actividad enzimática
asociada a la MGAT-X1 o molécula diana.
El ensayo de selección también puede implicar el
control de la expresión de la MGAT-X1. Por ejemplo,
se pueden identificar reguladores de la expresión de la
MGAT-X1 en un procedimiento en el que una célula se
pone en contacto con un compuesto candidato y se determina la
expresión de la proteína MGAT-X1 o ARNm en la
célula. El nivel de expresión de la proteína de la
MGAT-X1 o la expresión de ARNm en la ausencia del
compuesto candidato. El compuesto candidato se después identificar
como un regulador de expresión de la proteína
MGAT-X1 o ARNm en la ausencia del compuesto
candidato. Después el compuesto candidate se puede identificar como
un regulador de expresión de la MGAT-X1 basándose
en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de la proteína
de la MGAT-X1 o proteína de ARNm es mayor (mayor
estadísticamente significativa) en la presencia del compuesto
candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica
como un estimulador de la proteína MGAT-X1 o
expresión de ARNm. Como alternativa, cuando la expresión de la
proteína de la MGAT-X1 o ARNm es menor (menor
estadísticamente significativa) en la presencia del compuesto
candidato en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como
un estimulador de la proteína de la MGAT-X1 o
expresión de ARNm. El nivel de la proteína de
MGAT-X1 o expresión de ARNm en las células se puede
determinar mediante procedimientos descritos a continuación.
Para los ensayos de unión, el compuesto de
ensayo es preferiblemente una molécula pequeña que se une a y ocupa
el sitio activo del polipéptido de transferasa de la
MGAT-X1, haciendo por lo tanto el sitio de unión de
ligando inaccesible al sustrato de manera que se evite la actividad
biológica normal. Los ejemplos de tales moléculas pequeñas
incluyen, pero no se limitan a, péptidos pequeños o moléculas de
tipo péptido Los ligandos potenciales que se unen a un polipéptido
de la invención incluyen, pero no se limitan a, los ligandos
naturales de la transferasa de la MGAT-X1 y
análogos conocidos o derivados de los mismos.
En los ensayos de unión, o bien el compuesto de
ensayo o el polipéptido de la transferasa de la
MGAT-X1 pueden comprender una etiqueta detectable,
tal como etiqueta fluorescente, radioisotópica, quimilouminiscente,
o enzimática, tal como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa
alcalina, o luciferasa., quimioluminiscente, o etiqueta enzimática,
tal como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, o
luciferasa. La detección de un compuesto de ensayo que se une a un
polipéptido de la transferasa de la MGAT-X1, se
puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante conteo de la
radioemisión, mediante conteo de centelleo, o determinando la
conversión de un sustrato apropiado para un producto detectable.
Como alternativa, la unión de un compuesto de ensayo a un
polipéptido de transferasa de MGATX1 se puede determinar sin marcar
cualquiera de los interactuantes. Por ejemplo, se puede usar un
microfisiómetro para detectar la unión de un compuesto de ensayo
con un polipéptido de transferasa de MGATX1. Un microfisiómetro
(por ejemplo, Cytosensor^{TM}) es un instrumento que mide la la
velocidad a la que una célula acidifica su entorno usando un sensor
potnciométrico dirigible (LAPS). Los cambios en esta velocidad de
acidificación se pueden usar como un indicador de la interacción
entre un compuesto de ensayo y MGAT-X1 [Haseloff
et al. (1988)].
La determinación de la capacidad de un compuesto
de ensayo de unirse a MGAT-X1 también se puede
llevar a cabo una tecnología tal como Ensayos de Interacción
Biomolecular a tiempo real (BIA) [McConnell et al. (1992),
Sjolander & Urbaniczky (1991)]. BIA es una tecnología para
estudiar las interacciones bioespecíficas a tiempo real, sin marcar
ninguno de los inetractuantes (por ejemplo, BIAcore^{TM}). Los
cambios en la resonancia de plasmón de superficie (SPR) del
fenómeno óptico se puede usar como una indicación de las reacciones
de tiempo real entre moléculas biológicas.
Un polipéptido de tipo MGAT-X1
se puede usar como una "proteína cebo" en un ensayo de dos
híbridos o ensayo de tres híbridos [Szabo et al., (1995);
Zervos et al. (1993); Madura et al. (1993); Bartel
et al. (1993)]; documento de ESTADOS UNIDOS Nº 5.283.317),
para identificar otras proteínas que se unen o interactúan con
MGAT-X1 y modular su actividad.
El sistema de dos híbridos se basa en la
naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción,
que consta de dominios de unión a ADN y de activación. En resumen,
el ensayo utiliza dos construcciones deferentes de ADN. Por
ejemplo, en una construcción, el polinucleótido que codifica
MGAT-X1 se puede fusionar a un polinucleótido que
codifica el dominio de unión a ADN de un factor de transcripción
conocido (por ejemplo, GAL-4). En la otra
construcción una secuencia de ADN que codifica una proteína no
identificada ("presa" o "muestra") se puede fusionar a un
polinucleótido que codifica el dominio de activación del factor de
transcripción conocido. Si el "cebo" y las proteínas
"presa" son capaces de interactuar in vivo para formar
un complejo dependiente de proteína, los dominios de unión a ADN y
de activación del factor de transcripción se llevan a una
proximidad estrecha. Esta proximidad permite la transcripción de un
gen indicador (por ejemplo, LacZ), que está ligado de manera
operativa a un sitio regulador de la transcripción sensible al
factor de transcripción. La expresión del gen indicador se puede
detectar, y las colonias de células que contienen el factor de
transcripción funcional se puede aislar y usar para obtener la
secuencia de ADN que codifica la proteína que interactúa con
MGAT-X1.
Puede ser deseable inmovilizar o bien la
MGAT-X1 (o polinucleótido) o el compuesto de ensayo
para facilitar la separación de la forma unida de la forma no unida
de uno o ambos interactuantes, así como para acomodar la
automatización del ensayo. De este modo, o bien el polipéptido de
tipo MGAT-X1 (o polinucleótido) o el compuesto de
ensayo se puede unir a un soporte sólido. Los soportes sólidos
adecuados incluyen, pero no se limitan a, portaobtejos de vidrio o
plástico, placas de cultivo de tejidos, pocillos de microvaloración,
tubos, procesadores de silicio, o partículas tales como perlas,
(que incluyen pero no se limitan a, látex, poliestireno, o perlas
de vidrio). Cualquier procedimiento conocido en la técnica se puede
usar para unir el polipéptido de tipo MGAT-X1 (o
polinucleótido) o compuesto de ensayo a un soporte sólido que
incluye el uso de enlaces covalentes y no covalentes, absorción
pasiva, o pares de restos de unión unidos respectivamente al
polipéptido (o polinucleótido) o compuesto de ensayo y el soporte
sólido. Los compuesto de ensayo se unen preferiblemente al soporte
sólido en una disposición, de manera que la localización de los
compuestos de ensayo individuales se puedan rastrear. La unión de
un compuesto de ensayo a la MGAT-X1 (o un
polinucleótido que codifica MGAT-X1) se puede
llevar a cabo en cualquier recipiente adecuado para contener los
reactivos. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de
microvaloración, tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga.
En una realización, la MGAT-X1
es una proteína de fusión que comprende un dominio que permite la
unión de la MGAT-X1 a un soporte sólido. Por
ejemplo, las proteínas de fusión de
glutatión-S-transferasa se puede
adsorber en perlas de glutatión sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis,
Mo.) o placas de microvaloración derivatizadas de glutatión, que
después se combinan con el compuesto de ensayo o el compuesto de
ensayo y la MGAT-X1 no adsorbida; la mezcla después
se incuba en condiciones conductivas para la formación del complejo
(por ejemplo, en condiciones fisiológicas de sal y pH). Después de
la incubación, las perlas o pocillos de placas de microvaloración
se lavan para retirar cualesquiera componentes. La unión de los
interactuantes se puede determinar o bien directa o indirectamente,
como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, los complejos
se pueden disociar del soporte sólido antes que se determine la
unión.
Otras técnicas para inmovilizar proteínas o
polinucleótidos sobre dicho soporte sólido se puede usar en los
ensayos de selección de la invención. Por ejemplo, o bien la
MGAT-X1 (o a polinucleótido que codifica la
MGAT-X1) o un compuesto de ensayo se puede
inmovilizar utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina.
La MGAT-X1 biotinilada (o un polinucleótido que
codifica la MGAT-X1 biotinilada) o compuestos de
ensayo se puede preparar a partir de biotina-NHS
(N-hidroxisuccinimida) usando las técnicas bien
conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilation, Pierce
Chemicals, Rockford, Ill.) e inmovilizarse en los pocillos de las
placas recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical). Como
alternativa, los anticuerpos que se unen de manera específica a
MGAT-X1, polinucleótido, o un compuesto de ensayo,
pero que no interfieren con un sitio de unión deseado, tal como el
sitio activo de MGAT-X1, se puede derivatizar a
los pocillos de la placa. La diana o proteína no unida puede estar
atrapada en los pocillos mediante conjugación de anticuerpos.
Los procedimientos para detector tales
complejos, además de los descritos anteriormente, además de los
descritos anteriormente para los complejos inmovilizados de GST,
incluyen inmunodetección de complejos que usan anticuerpos que se
unen específicamente al polipéptido de la transferasa de la
MGAT-X1 o compuesto de ensayo, los ensayos ligados
a enzima que dependen de la detección de una actividad sobre el
polipéptido de la transferasa de la MGAT-X1, y
electroforesis de gel SDS en condiciones no reductoras.
La selección de los compuestos de ensayo que se
unen a un polipéptido de la transferasa de polipéptido de la
transferasa de la MGAT-X1 o polinucleótido también
se puede llevar a cabo en una célula intacta. Cualquier célula que
comprende un polipéptido de la transferasa de la
MGAT-X1 o polinucleótido se puede usar en sistema
de ensayo basado en célula. Un polipéptido de la transferasa de la
MGAT-X1 puede ser de origen natural en la célula o
se pueden introducir usando las técnicas tales como las descritas
anteriormente. La unión del compuesto de ensayo a
MGAT-X1 o un polinucleótido que codifica
MGAT-X1 se determina como se ha descrito
anteriormente.
Los compuestos de ensayo se pueden ensayar para
determinar la capacidad de aumentar o disminuir
MGAT-X1 de un polipéptido de la transferasa de la
MGAT-X1. La actividad de la MGAT-X1
se puede medir, por ejemplo, usando procedimientos descritos en los
ejemplos específicos, más adelante. La actividad de la
MGAT-X1 se puede medir después de poner en contacto
o bien MGAT-X1 purificada, una preparación de
membrana celular, o una célula intacta con un compuesto de ensayo.
Un compuesto de ensayo que disminuye la actividad de la
MGAT-X1 en al menos aproximadamente 10,
preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente
aproximadamente 75, 90, ó 100% se identifica como un agente
potencial para disminuir la actividad de la MGAT-X1.
Un compuesto de ensayo que incrementa la actividad de la
MGAT-X1 en al menos aproximadamente 10,
preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente
aproximadamente 75, 90, ó 100% se identifica para como un agente
potencial para incrementar la actividad de la
MGAT-X1.
Uno de tales procedimientos de selección implica
el uso de melanóforos que se transfectan para expresar la
MGAT-X1. Tal técnica de selección Se desvela en el
documento PCT WO 92/01810 publicado el 6 de febrero de 1992. De
este modo, por ejemplo, tal ensayo se puede emplear para seleccionar
un compuesto que inhibe la activación del polipéptido de la
transferasa de la presente invención poniendo en contacto las
células de melanóforos que codifican la transferasa con tanto el
ligando de transferasa y un compuesto a seleccionar. La inhibición
de la señal generada por el ligando indica que un compuesto es un
antagonista potencial para la transferasa, es decir inhibe la
activación de la transferasa. La selección se puede emplear para
identificar un compuesto que activa la transferasa poniendo en
contacto tales células con compuestos a seleccionar y determinar si
cada compuesto genera una señal, es decir, activa la
transferasa.
Otras técnicas de selección incluyen el uso de
células que expresan MGAT-X1 (por ejemplo,
células CHO transfectadas) en un sistema que mide los cambios de pH
extracelular provocados por la activación de transferasa
[Iwabuchi et al. (1993)]. Por ejemplo, los compuestos se
pueden poner en contacto con una célula que expresa el polipéptido
de la transferasa de la presente invención y una segunda respuesta
de mensajero por ejemplo, transducción de la señal o cambios de
pH, se pueden medir para determinar si el compuesto potencial activa
o inhibe la transferasa. Otra de tales técnicas de selección
implica la introducción de ARN que codifica MGAT-X1
en oocitos de Xenopus para expresar de manera transitoris la
transferasa. Los oocitos de transferasa se pueden poner en
contacto con un ligando de transferasa y un compuesto a seleccionar,
seguido de la detección de la inhibición o activación de una señal
de calcio en el caso de seleccionar compuestos que se cree que
inhiben la activación de la transferasa.
En otra realización, los compuestos de ensayo
que incrementan o disminuyen la expresión génica de la
MGAT-X1 se identifican. Como se usa en el presente
documento, la frase "se correlaciona" con la expresión de un
"polinucleótido" indica que la detección de la presencia de
ácidos nucleicos, los mismos o relacionados con una secuencia de
ácido nucleico que codifica MGAT-X1, mediante
análisis de northern o PCR de tiempo real es indicativo de la
presencia de de ácidos nucleicos que codifican la
MGAT-X1 en una muestra, y por lo tanto se
correlaciona con la expresión de la transcripción a partir del
polinucleótido que codifica MGAT-X1. El término
"microdisposición," como se usa en el presente documento, se
refiere a una disposición de polinucleótidos u oligonucleótidos
distintos dispuestos sobre un sustrato, tal como papel, nylon o
cualquier otro tipo de membrana, filtro, procesador, portaobjetos
de vidrio, o cualquier otro soporte sólido adecuado. Un
polinucleótido de la MGAT-X1 se pone en contacto
con un compuesto de ensayo, y se determina la expresión de un ARN o
producto de polipéptido del polinucleótido de la
MGAT-X1. El nivel de expresión de ARNm o
polipéptido apropiado en la presencia del compuesto de ensayo se
compara con el nivel de expresión de ARNm o polipéptido en la
ausencia del compuesto de ensayo. El compuesto de ensayo se puede
después identificar como un regulador de la expresión basándose en
esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de ARNm o
polipéptido es mayor en la presencia del compuesto de ensayo que en
su ausencia, el compuesto de ensayo se identifica con un estimulador
o potenciador del ARNm o polipéptido es menor en la presencia del
compuesto de ensayo que en su ausencia, el compuesto de ensayo se
identifica como un inhibidor de la expresión del ARNm o
polipéptido.
El nivel de la expresión de ARNm or polipéptido
de la MGAT-X1 en las células se puede determinar
mediante procedimientos bien conocidos en la técnica para detectar
ARNm o polipéptido. Se pueden usar cualesquiera procedimientos
cualitativo o cuantitativo. La presencia de productos de
polipéptidos del polinucleótido de la transferasa de la
MGAT-X1 se puede determinar, por ejemplo, usando una
diversidad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo
procedimientos inmunoquímicos tal como radioinmunoensayo,
transferencia de Western, e inmunoquímica. Como alternativa, la
síntesis de polipéptidos se puede determinar in vivo, en un
cultivo celular, o en un sistema de traducción in vitro
mediante la detección de la incorporación de aminoácidos marcado en
MGAT-X1.
Tal selección se puede llevar a cabo o bien en
un sistema sin células o en una célula intacta. Cualquier célula
que expresa el polinucleótido de MGAT-X1 se puede
usar en un sistema de ensayo basado en célula. El polinucleótido
de la MGAT-X1 puede ser de origen natural en la
célula o se puede introducir usando las técnicas tales como los
descritos anteriormente. Se puede usar un cultivo primario o una
línea celular establecida.
Los compuestos de ensayo adecuados para uso en
los ensayos de selección se pueden obtener a partir de cualquier
fuente adecuada, por ejemplo, genotecas de compuestos
convencionales. Los compuestos de ensayo también se pueden obtener
usando cualquiera de los numerosos planteamientos los procedimientos
de genoteca combinatoria conocidos en la técnica, incluyendo:
genotecas biológicas; genotecas de fase sólida paralelas dirigidas
especialmente o en fase de solución; procedimientos de genoteca
sintéticos que requieren desconvolución; el procedimiento de
genoteca "una perla un compuesto"; y procedimientos de genoteca
sintética que usan selección por cromatografía de afinidad. El
planteamiento de genoteca biológica se limita a genotecas de
péptidos, mientras que los otros cuatro planteamientos son
apli-
cables a genotecas de péptido, oligómero no péptido o de moléculas pequeñas de compuestos [Lam et al. (1997)].
cables a genotecas de péptido, oligómero no péptido o de moléculas pequeñas de compuestos [Lam et al. (1997)].
Los ejemplos de procedimientos para la síntesis
de genotecas moleculares se pueden encontrar en la técnica [Lam
et al. (1997); DeWitt et al. (1993); Erb et al.
(1994); Zuckermann et al. (1994); Cho et al. (1993);
Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059].
Lis genotecas de los compuestos se pueden presentar en solución
[Carrell et al. (1994), Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2061;
Gallop et al. (1994)] o sobre perlas [Houghten et al.
(1992)], chips [Cull et al. (1992)], bacteria (documento de
ESTADOS UNIDOS Nº 5.223.409), esporas (documento de ESTADOS UNIDOS
Nº 5.571.698; 5.403.484; y 5.223.409), plásmidos [Coruzzi et
al. (1984)] o fago [Nagarenko et al. (1997); Felici
et al. [1991]; Cwirla et al. (1990); Devlin et
al. (1990); Sambrook et al. (1989)].
El presente solicitante encontró que la
MGAT-X1 se expresa en diferentes tejidos
humanos.
La MGAT-X1 humana se expresa en
gran cantidad en los siguientes tejidos: tumor de colon, tumor de
íleo, tumor de hígado, tumor de útero, tumor de mama, tumor de
próstata. la expresión en los tejidos anteriormente mencionados y
en particular la expresión diferencial entre el tumor de colon de
tejido enfermo y colon de tejido sano, entre tumor de íleo de
tejido enfermo y tejido sano, entre tumor de hígado de tejido
enfermo e hígado de tejido sano, entre tumor de útero de tejido
enfermo y útero de tejido sano, entre tumor de mama de tejido
enfermo y mama de tejido sano, entre tumor de próstata de tejido
enfermo y próstata de tejido sano demuestra que
MGAT-X1 humana o ARNm se puede utilizar para
diagnosticar cáncer. De manera adicional la actividad de la
MGAT-X1 se puede modular para tratar cáncer.
Los trastornos de cáncer dentro del ámbito de la
invención comprenden cualquier enfermedad de un órgano o tejido en
mamíferos caracterizados por una multiplicación escasamente
controlada o no controlada de células normales o anormales en ese
tejido y su efecto sobre el cuerpo como conjunto.
Las enfermedades de cáncer dentro del ámbito la
invención comprenden neoplasmas benignos, displasias, hiperplasias
así como neoplasmas que muestran desarrollo metastático o cualquier
otras transformaciones similares por ejemplo leucoplaquias que a
menudo preceden al brote de cáncer. Las células y tejidos son
cancerosos cuando se desarrollan más rápidamente que las células
normales, que desplazan o se extienden en el tejido sano circundante
o cualesquiera otros tejidos del cuerpo descritos como crecimiento
metastático, asumen las formas y tamaños anormales, muestran
cambios en su relación nucleocitoplasmático, policromasia nuclear,
finalmente pueden cesar. Las células y tejidos cancerosos pueden
afectar al cuerpo como conjunto cuando provocan síndromes
paraneoplásicos o si se produce cáncer dentro de un órgano o tejido
vital, función normal se alterará o se detendrá, con resultados
fatales posibles. La última implicación de un órgano vital por
cáncer, o bien primario o metastático, puede conducir a la muerte
del mamífero afectado. El cáncer tiende a extenderse, y la extensión
de su extensión se refiere usualmente a una posibilidad del
individuo de sobrevivir a la enfermedad. Los cánceres en general se
dice que están en una de las tres fases de crecimiento: temprana, o
localizada, cuando un tumor todavía está confinada al tejido de
origen, o sitio primario, extensión directa, cuando las células
cancerosas del tumor han invadido el tejido adyacente o se han
extendido solamente a los ganglios linfáticos regionales: o
metástasis, en el que las células cancerosas han migrado a partes
distantes del cuerpo desde el sitio primario, mediante la sangre o
sistemas linfáticos, y tienen sitios secundarios establecidos de
infección. El cáncer se dice que es maligno debido a su tendencia a
provocar la muerte si no se trata. Los tumores benignos usualmente
no provocan muerte, aunque pueden si interfieren con una función de
cuerpo normal en virtud de su localización, tamaño, o efectos
laterales paraneoplásicos. Por lo tanto los tumores benignos caen
dentro de la definición de cáncer dentro del ámbito de la invención
también. En general, las células cancerosas se dividen a una
velocidad mayor que las células normales, pero la distinción entre
el crecimiento de tejidos cancerosos y normales no es tanto la
rapidez de división celular en el pasado como es la pérdida parcial
o completa de restricción de crecimiento en las células cancerosas
y su incapacidad para diferenciarse en un tejido útil, limitado del
tipo que caracteriza el equilibrio funcional de crecimiento de
tejido normal. Los tejidos cancerosos pueden expresar ciertos
receptores moleculares y probablemente están influenciados por la
susceptibilidad e inmunidad del huésped y se sabe que ciertos
cánceres de la mama y próstata, por ejemplo, se consideran
dependientes de hormonas específicas para su existencia. El término
"cáncer" dentro del ámbito de la invención no se limita a la
neoplasia benigna simple pero comprende cualquier otro tipo de
neoplasia benigna y maligna 1) Carcinoma, 2) Sarcoma, 3)
Carcinosarcoma, 4) Cánceres de los tejidos formadores de sangre, 5)
tumores de tejidos nerviosos incluyendo el cerebro, 6) cáncer de
células de piel. Cáncer de acuerdo con 1) se produce en tejidos
epiteliales que cubren el exterior de cuerpo (la piel) y las
membranas mucosas de recubrimiento y las estructuras cavitarias
internas de los órganos por ejemplo tal como lamaza, el pulmón, los
tractos respiratorio y gastrointestinal, las glándulas endocrinas,
y el sistema genitourinario. Los elementos de conducto o glandulares
pueden persistir en tumores epiteliales, como en tipos de
adenocarcinomas, por ejemplo adenocarcinoma de tiroides,
adenocarcinoma gástrico, adenocarcinoma uterino. Los cánceres de
del epitelio de las células con escarificación previa y de ciertas
membranas mucosas, tal como por ejemplo, cánceres de la lengua,
labio, laringe, vejiga urinaria, cuello uterino o pene, se pueden
calificar como carcinomas de de la epidermis o de células escamosas
de los tejidos respectivos y están dentro del ámbito de la
definición de cáncer también. El cáncer de cuerdo con 2) se
desarrolla en tejidos conectivos, incluyendo tejidos fibrosos,
tejidos adiposos (grasa), músculo, vasos sanguíneos, hueso, y de
cartílago como por ejemplo sarcoma osteogénica; liposarcoma,
fibrosarcoma, carcomo sinovial. El cáncer de acuerdo a 3) es
cáncer que se desarrolla en tejido tanto epitelial como conectivo.
La enfermedad de cáncer dentro del ámbito de esta definición puede
ser primario o secundario, en el que primario indica que el cáncer
originado en el tejido donde se encuentra en lugar que se establezca
como un sitio secundario mediante metástasis a partir de otra
lesión. Los cánceres y enfermedades tumorales dentro del ámbito de
esta definición pueden ser benignos o malignos y pueden afectar a
todas las estructuras anatómicas del cuerpo de un mamífero. Por
ejemplo pero sin limitación comprenden cánceres y enfermedades
tumorales de I) la médula ósea y células derivadas de médula ósea
(leucemia), II) las glándulas endocrinas y exocrinas como por
ejemplo, tiroides, paratiroides, pituitaria, glándulas adrenales,
glándulas salivares, páncreas III) la mama, por ejemplo tumores
benignos o malignos en las glándulas mamarias de o bien un macho o
hembra, los conductos mamarios, adenocarcinoma, carcinoma medular,
carcinoma comedo, enfermedad de Pager del pezón, carcinoma
inflamatoria de la mujer joven, IV) el pulmón, V) el estómago, VI)
el hígado y el bazo, VII) el intestino delgado, VIII) el colon,
IX) el hueso y sus tejidos de soporte y conectivo como tumor de
hueso maligno o benigno, por ejemplo sarcoma osteogénico maligno,
osteoma benigno, tumores de cartílago; como condrosarcoma maligno o
condroma benigno; tumores de médula ósea como mieloma maligno o
granuloma eosinófilo benigno, así como tumores metastáticos de
tejidos óseos en otros lugares del cuerpo; X) la boca, garganta,
laringe, y el esófago XI) la vejida urinaria y los órganos y
estructuras internos y externos del sistema urogenital de macho y
hembra como ovarios, útero, cuello del útero, testículos, y
glándula de la próstata, XII) la próstata, XIII) el páncreas, como
carcinoma de los conductos del páncreas; XIV) el tejido linfático
como linfomas y otros tumores de origen linfoide, XV) la piel, XVI)
cánceres y enfermedades tumorales de las estructuras anatómicas que
pertenecen a la respiración y los sistemas respiratorios que
incluyen músculos y revestimientos torácicos, XVII) cáncer
primario y secundario de los ganglios linfáticos XVIII) la lengua y
las estructuras óseas del paladar duro o sinusitis, XVIV) la boca,
mejillas, cuello y glándulas salivares, XX) los vasos sanguíneos que
incluyen el corazón y los revestimientos, XXI) los músculos lisos o
esqueléticos y los ligamientos y los revestimientos, XXII) el
sistema nervioso periférico, autónomo, central que incluye
cerebelo, XXIII) el tejido adiposo.
La presente invención proporciona procedimientos
tanto profilácticos como terapéuticos para el cáncer.
El procedimiento regulador de la invención
implica poner en contacto una célula con un agente que modula una o
más de las actividades de la MGAT-X1. Un agente que
modula la actividad puede ser un agente como se ha descrito en el
presente documento, tal como un ácido nucleico o una proteína, un
ligando afín de origen natural del polipéptido, un péptido, un
peptidomimético, o cualquier molécula pequeña. En una realización,
el agente estimula una o más de las actividades biológicas de la
MGAT-X1. Los ejemplos tales agentes estimuladores
incluyen las moléculas de MGAT-X1 y de ácido
nucleico activas que codifican una parte de la
MGAT-X1. En otra realización, el agente una o más
de las actividades biológicas de la MGAT-X1. Los
ejemplos de tales agentes inhibidores incluyen moléculas de ácido
nucleico no codificantes y anticuerpos. Estos procedimientos
reguladores de se pueden realizar in vitro (por ejemplo,
mediante cultivo de la célula con el agente) o, como alternativa,
in vivo (por ejemplo, mediante la administración del agente
a un sujeto). Como tal, la presente invención proporciona
procedimientos de tratamiento de un individuo aquejado con una
enfermedad o trastorno caracterizado por la expresión no deseada de
la actividad de la MGAT-X1 o una proteína en la ruta
de señalización de la MGAT-X1. En una realización,
el procedimiento implica la administración de un agente como
cualquier agente identificado o que es identificable mediante un
ensayo de selección como Se desvela en el presente documento, o
combinación de tales agentes que se dice que modulan hacia arriba o
hacia abajo la expresión o actividad de MGAT-X1 o
de cualquier proteína en la ruta de señalización de la
MGAT-X1. En otra realización, el procedimiento
implica la administración de un regulador de la
MGAT-X1 como terapia para compensar la expresión o
actividad reducida o no deseable de la MGAT-X1 o
una proteína en la ruta de señalización de
MGAT-X1.
La estimulación o expresión de la
MGAT-X1 es deseable en las situaciones en las que la
actividad o expresión es anormalmente baja y en la que la actividad
incrementada es probablemente que tenga un efecto beneficioso. De
manera inversa, la inhibición de la actividad o expresión de la
MGAT-X1 es deseable en las situaciones en las que
la actividad o expresión de la MGAT-X1 es
anormalmente alta y en la que la disminución de su actividad es
probable que tenga un efecto beneficioso.
Esta invención además se ilustra por los
siguientes ejemplos que no se deben construir considerar como
limitantes.
Esta invención además pertenece a agentes
novedosos identificados por los ensayos de selección anteriormente
descritos y usos de de los mismos para los tratamientos como se ha
descrito en el presente documento.
Las moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, y
anticuerpos (también denominadas en el presente documento como
"compuestos activos") de la invención se pueden incorporar en
las composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración.
Tales composiciones típicamente comprenden la molécula de ácido
nucleico, proteína, o anticuerpo y vehículo farmacéuticamente
aceptable. Como se usa en el presente documento la frase "vehículo
farmacéuticamente aceptable" pretende incluir cualquiera y todos
los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes
antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y que retrasan la
absorción, y similares, compatibles con la administración
farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para las sustancias
farmacéuticamente activas se conocen bien en la técnica. Excepto en
la medida en la que cualquier medio o agente convencional es
incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo
en las composiciones.
La invención incluye el uso de un
oligonucleótido no codificante, un anticuerpo, o una ribozima, que
específicamente regula hacia abajo la actividad de la SEQ ID NO: 2
para la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de
cáncer en un mamífero, así como procedimientos para preparar tales
composiciones combinando uno o más de tales reguladores y un
vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un antagonista de la MGAT-X1 se
puede producir usando procedimientos que en general se conocen en la
técnica. En particular, la MGAT-X1 purificada se
puede usar para producir anticuerpos o para seleccionar genotecas
de agentes farmacéuticos para identificar los que se unen
específicamente a MGAT-X1. Los anticuerpos para la
MGAT-X1 también se pueden generar usando
procedimientos que se conocen bien en la técnica. Tales anticuerpos
pueden incluir, pero no se limitan a, anticuerpos policlonales,
monoclonales, quiméricos, de una sola cadena, fragmentos Fab, y
fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab. Los
anticuerpos neutralizantes como aquellos que inhiben la formación
de dímeros se prefieren de manera especial para uso
terapéutico.
En otra realización de la invención, los
polinucleótidos que codifican la MGAT-X1, o
cualquier fragmento o complemento de los mismos, se puede usar para
propósitos terapéuticos. En un aspecto, el complemento del
polinucleótido que codifica la MGAT-X1 se puede
usar en las situaciones en las que deben ser deseables que bloqueen
la transcripción del ARNm. En particular, las células se pueden
transformar con secuencias complementarias a los polinucleótidos
que codifican MGAT-X1. De este modo, se pueden usar
moléculas o fragmentos complementarios para modular la actividad de
la MGAT-X1, o para lograr la regulación de la
función génica. Tal tecnología se conoce ahora bien en la técnica,
y los oligonucleótidos codificantes y no codificantes o fragmentos
mayores se pueden diseñar a partir de diversas localizaciones junto
con las regiones codificantes o de control de las secuencias que
codifican MGAT-X1.
Los vectores de expresión derivados de
retrovirus, adenovirus, o virus herpes o vaccinia, o a partir de
diversos plásmidos bacterianos, se pueden usar para la
administración de secuencias de nucleótidos al órgano, tejido, o
población de células dianas. Los procedimientos que se conocen bien
por los expertos en la técnica se pueden usar para construir
vectores que expresarán la secuencia de ácido nucleico
complementaria con los polinucleótidos del gen que codifica
MGAT-X1. checklit: Estas técnicas se desvelan, por
ejemplo, en [Scott y Smith (1990) Science 249: 386 - 390].
Cualquiera de los procedimientos terapéuticos
descritos anteriormente se pueden aplicar a cualquier sujeto en
necesidad de tal terapia, incluyendo, por ejemplo, mamíferos tales
como perros, gatos, vacas, caballos, conejos, monos, y lo más
preferiblemente, seres humanos.
Una realización adicional de la invención se
refiere a la administración de una composición farmacéutica que
contiene MGAT-junto con un vehículo
farmacéuticamente aceptable, para cualquiera de los efectos
terapéuticos descritos anteriormente. Tales composiciones
farmacéuticas pueden constar de la MGAT-X1, y
anticuerpos para la MGAT-X1. Las composiciones se
pueden administrar solas o en combinación con al menos otro agente,
tal como un compuesto estabilizante, que se pueden administrar en
cualquier vehículo farmacéutico estéril, biocompatible que incluye,
pero no se limita a, solución salina, solución salina tamponada,
dextrosa, y agua. Las composiciones se pueden administrar a un
paciente solos, o en combinación con otros agentes, fármacos u
hormonas.
Una composición farmacéutica de la invención se
formula para que sea compatible con su vía propuesta de
administración. Los ejemplos de las vías de administración incluyen
parenteral, por ejemplo, la administración intravenosa,
intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación),
transdérmica (tópica), transmucosal, y rectal. Las soluciones o
suspensiones usadas para la aplicación parenteral, intradérmica, o
subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente
estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites
estables, polietilen glicoles, glicerina, propilen glicol, u otros
disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tal como alcohol
bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido
ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido
etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o
fosfatos y agentes para el ajuste de tonicidad tal como cloruro de
sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tales
como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parental
se puede encerrar en ampollas, jeringas desechables o viales de
dosis múltiples hechas de vidrio o plástico.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para
uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (soluble en
agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación
extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles.
Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen
solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor
EL.TM. (BASF; Parsippany, N.J.) o solución salina tamponada con
fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril
y debe ser fluido hasta el grado de que sea fácilmente administrado
por jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y
almacenamiento y se debe preservar contra la acción contaminante de
microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser
un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo,
agua, etanol, un poliol farmacéuticamente aceptable como glicerol,
propilen glicol, polietilen glicol líquido, y sus mezclas adecuadas.
Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el
uso del uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el
mantenimiento de del tamaño de partícula deseado en el caso de
dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la
acción de microorganismos se puede lograr mediante diversos
agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos,
clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En
muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por
ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol,
cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las
composiciones inyectables se puede llevar a cabo aproximadamente
mediante la inclusión en la composición de un agente que retrasa la
absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Las
soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando
el compuesto activo (por ejemplo, a polipéptido o anticuerpo) en la
cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una
combinación de ingredientes enumerados anteriormente, como se
requiere, seguido de la esterilización por filtración. En general,
la dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto
activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión
básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados
anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la
preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos
preferidos de preparación son secado al vacío y secado por
congelación que produce un polvo del ingrediente activo más
cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución
filtrada estéril del mismo.
Las composiciones orales en general incluyen un
diluyente inerte o vehículo comestible. Pueden estar encerrados en
cápsulas de gelatina o en comprimidos. Para el propósito de la
administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede
incorporar con excipientes y usarse en la forma de comprimidos,
trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden
preparar usando un vehículo fluido para uso como un enjuague de
boca, en el que el compuesto en el vehículo fluido se aplica por
vía oral y se hace crujir y se expectora o se ingiere.
Los agentes de unión farmacéuticamente
compatibles, y/o materiales adyuvantes se pueden incluir como parte
de la composición. Los comprimidos, pastillas, cápsulas, trociscos y
similares pueden contener cualquiera de los siguiente ingredientes,
o compuestos de una naturaleza similar; un aglutinante tal como
celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un
excipiente tal como almidón o lactosa, in agente disgregante tal
como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tal
como estearato de magnesio o esteroles; un deslizante tal como
dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa
o sacarina; o un agente aromatizante tal como pipermín, salicilato
de metilo, o aromatizante de naranja.
Para la administración mediante inhalación, los
compuestos se administran en la forma de una pulverización por
aerosol a partir de un recipiente presurizado o dispensador que
contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como
dióxido de carbono, o un nebulizador.
La administración sistémica también puede ser
mediante medios transmucosales o transdérmicos. Para la
administración transmucosal o transdérmica, se usan en la
formulación penetrantes apropiados para que penetre la barrera.
Tales penetrantes se conocen en general en la técnica, e incluyen,
por ejemplo, para la administración transmucosal, detergentes,
sales biliares, y derivados del ácido fusídico. La administración
transmucosal se puede llevar a cabo mediante el uso de
pulverizaciones nasales o supositorios. Para la administración
transdérmica, los compuestos activos se formulan en pomadas,
ungüentos, geles, o cremas como en general se conocen en la
técnica.
Los compuestos también se preparan en la forma
de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorios
convencionales tales como manteca de cacao y otro glicéridos) o
enemas de retención para la administración rectal. Los compuestos
activos se preparan con vehículos que protegerán el el compuesto
contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación
de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de
administración microencapsuladas. Se pueden usar polímeros
biodegradables, biocompatibles, tales como etilen vinil acetato,
polianhidruros, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y
ácido poliláctico. Los procedimientos para la preparación de tales
formulaciones serán evidentes para los expertos en la técnica. Los
materiales también se pueden obtener comercialmente a partir de
Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones de
liposomas (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con
anticuerpos monoclonales para antígenos virales) también se pueden
usar como vehículos farmacéuticamente aceptables. Éstos se pueden
preparar de acuerdo con los procedimientos conocidos por los
expertos en la técnica, por ejemplo, como se desvela en el documento
de Estados Unidos Nº 4.522.811.
Es especialmente ventajoso formular las
composiciones orales o parenterales en una forma de dosificación
unitaria para la administración fácil y uniformidad de
dosificación. La forma de dosificación unitaria como se usa en el
presente documento se refiere a las unidades físicamente discretas
adecuadas para las dosificaciones adecuadas para el sujeto a
tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de de
compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico
deseado junto con el vehículo farmacéutico requerido. La
especificación par alas formas de dosificación unitaria de la
invención se disponen y dependen directamente de las características
únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular a
lograr, y las limitaciones inherentes en la técnica de combinación
tal como un compuesto activo para el tratamiento de individuos.
En otra realización de la invención, los
polinucleótidos que codifican MGAT-X1 se pueden usar
para propósitos de diagnóstico. Los polinucleótidos que se pueden
usar incluyen secuencias de oligonucleótidos, moléculas de ARN y
ADN complementarias, y PNA. Los polinucleótidos se pueden usar para
detectar la expresión génica cuantitativa en tejidos de biopsia en
los que la expresión de MGAT-X1 puede estar
correlacionada con la enfermedad. El ensayo de diagnóstico. El
ensayo de diagnóstico se puede usar para distinguir entre ausencia,
presencia, y exceso de la expresión de la MGAT-X1,
y para controlar la regulación de los niveles de la
MGAT-X1 durante la intervención terapéutica.
Las secuencias de polinucleótidos que codifican
la MGAT-X1 se pueden usar para la diagnosis de un
cáncer, asociado a la expresión de la MGAT-X1. Las
secuencias de polinucleótidos que codifica la
MGAT-X1 se puede usar en análisis de Southern-,
Northern-, o de transferencia por puntos, u otras tecnologías
basadas en membrana; en las tecnologías de PCR; en ensayos de
varilla aforadora, alfiler, y ELISA; y en microdisposiciones que
utilizan fluidos o tejidos de biopsias de pacientes para detectar la
expresión de la MGAT-X1 alterada. Tales
procedimientos cualitativos o cuantitativos se conocen bien en la
técnica.
En un aspecto particular, las secuencias de
nucleótidos que codifican la MGAT-X1 pueden ser
útiles en los ensayos que detectan la presencia de trastornos
asociados, particularmente los mencionados anteriormente. Las
secuencias de nucleótidos que codifican la MGAT-X1
se pueden marcar mediante procedimientos convencionales y añadirse
a una muestra de fluido o tejido de un paciente en las condiciones
adecuadas para la formación de complejos de hibridación. Después de
un período de incubación adecuado, la muestra se lava y la señal se
cuantifica y se compara con un valor patrón. Si la cantidad de
señal en la muestra del paciente está alterada de manera
significativa de la muestra de control comparable, las secuencias de
nucleótidos se han hibridado con las secuencias de nucleótidos en
la muestra, y la presencia de niveles alterados de secuencias de
nucleótidos que codifican MGAT-X1 en la muestra
indica la presencia del trastorno asociado. Tales ensayos también se
pueden usar para evaluar la eficacia de un régimen de tratamiento
terapéutico en los estudios animales, en ensayos clínicos, o en el
control del tratamiento de un paciente individual.
Con el fin de proporcionar una base para la
diagnosis de cáncer, asociado a la expresión de la
MGAT-X1, se establece un perfil normal o patrón
para la expresión. Esto se puede llevar a cabo combinando fluidos
corporales o extractos de células tomados de los sujetos normales,
o bien animales o humanos, con una secuencia, o un fragmento de los
mismos, que codifican la MGAT-X1, en las
condiciones adecuadas para la hibridación o amplificación. La
hibridación convencional se puede cuantificar comparando los valores
obtenidos de sujetos normales con valores de un experimento en el
que se usa una cantidad conocida de un polinucleótido
sustancialmente purificado. Los valores convencionales obtenidos de
muestras normales se pueden comparar con los valores obtenidos de
las muestras de pacientes que son sintomáticos de un trastorno. La
desviación de los valores convencionales se usa para establecer la
presencia de un trastorno.
Otra técnica para la selección de fármacos que
se puede usar proporciona un alto rendimiento de selección de los
compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada a la proteína
de interés como se desvela en la solicitud PCT publicada
WO84/03564. En este procedimiento, se sintetizan un gran número de
compuestos de ensayo pequeños diferentes sobre un sustrato sólido,
tal como alfileres de plástico o alguna otra superficie. Los
compuestos de ensayo se hacen reaccionar con la
MGAT-X1, o sus fragmentos, y se lavan. La MGATX1
unida después se detecta mediante procedimientos bien conocidos en
la técnica. La MGAT-X1 purificada también se puede
recubrir directamente sobre placas para uso en las técnicas de
selección de fármaco anteriormente mencionadas. Como alternativa,
se pueden usar anticuerpos no neutralizantes para capturar el
péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido.
Se pueden usar ensayos de selección competitivos
en los que los anticuerpos neutralizantes capaces de unirse a la
MGATX1 compiten de manera específica con un compuesto de ensayo para
unirse a la MGAT-X1. De esta manera, los
anticuerpos se pueden usar para detectar la presencia de cualquier
péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos con la
MGAT-X1.
Las transferasas son ubicuas en el huésped
mamífero y son responsables de muchas funciones biológicas,
incluyendo muchas patologías: de acuerdo con lo anterior, es
deseable encontrar compuestos y fármacos que estimulan la actividad
de las transferasas por una parte y que pueden inhibir la función de
una transferasa por otra parte.
La determinación de una dosis terapéuticamente
eficaz está también dentro de la capacidad de los expertos en la
técnica. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la
cantidad de ingrediente activo que incrementa o disminuye la
actividad de la MGAT-X1 con relación a la actividad
de la MGAT-X1 que se produce en la ausencia de la
dosis terapéuticamente eficaz. Para cualquier compuesto, la dosis
terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente o bien en los
ensayos de cultivo o en modelos animales, usualmente ratones,
conejos, perros, o cerdos. El modelo animal también se puede usar
para determinar el intervalo de concentración apropiado y la vía de
administración. Después tal información se puede usar para
determinar las dosis útiles y vías de administración en seres
humanos.
La eficacia y toxicidad terapéutica, por
ejemplo, DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz al 50% de la
población) y DL_{50} (la dosis letal al 50% de la población), se
puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos
convencionales en cultivos de células o animales experimentales. La
relación de dosis de efectos tóxicos a terapéuticos es el índice
terapéutico, y se puede expresar como la relación
DL_{50}/DE_{50}. Se prefieren las composiciones farmacéuticas
que muestran grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos de
los ensayos de cultivos de células y estudios animales se usa en la
formulación de un intervalo de dosificación para uso humano. La
dosificación contenida en tales composiciones está preferiblemente
dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen
la DE_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varía
dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación
empleada, sensibilidad del paciente, y la vía de administración. La
dosificación exacta se determinará por el facultativo, a la luz de
los factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento.
La dosificación y administración se ajustan para proporcionar los
niveles suficientes del ingrediente activo o APRA mantener el efecto
deseado Los factores que se pueden tener en cuenta incluyen la
gravedad del estado patológico, salud general del sujeto, edad,
peso, y género del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de
administración, combinación (es) de fármaco, sensibilidades a la
reacción, y tolerancia 7 respuesta a la terapia. Las composiciones
farmacéuticas de larga duración se pueden administrar cada 3 o 4
días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la
semivida y velocidad de eliminación de la formulación
particular.
Las cantidades de dosificación normales pueden
variar entre 0,1 microgramos y 100.000 microgramos, hasta una dosis
total de aproximadamente de 1 g, dependiendo de la vía de
administración. La guía para las dosificaciones y procedimientos
particulares de distribución se proporciona en la bibliografía y en
general disponibles para los facultativos. Los expertos en la
técnica emplean diferentes formulaciones para los nucleótidos que
para las proteínas o sus inhibidores. De manera similar, la
distribución de polinucleótidos o polipéptidos será específica
para las células, condiciones, localizaciones, etc. Si el reactivo
es un anticuerpo de una sola cadena, los polinucleótidos que
codifican el anticuerpo se pueden construir e introducir en una
célula o bien in vivo usando las técnicas bien conocidas
incluyendo, pero sin limitación, transferencia de ADN mediada por
transferina - policatión, transfección con ácidos nucleicos desnudos
o encapsulados, fusión celular mediada por liposomas, transporte
intracelular de perlas de látex cubiertas por ADN, fusión de
protoplastos, infección viral, electroporación, "pistola
génica," y transfección mediada por DEAE- o fosfato de
calcio.
Si el producto de expresión es ARNm, el reactivo
es preferiblemente un oligonucleótido no codificante o una
ribozima. Los polinucleótidos que expresan oligonucleótidos no
codificante o ribozimas se pueden introducir en las células
mediante procedimientos, como se ha descrito anteriormente.
Preferiblemente, un reactivo reduce la expresión del gen de la
MGAT-X1 o la actividad de la
MGAT-X1 en al menos aproximadamente 10,
preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente
aproximadamente 75, 90, o 100% con relación a la ausencia del
reactivo. La eficacia del mecanismo elegido para disminuir el
nivel de expresión del gen de la MGAT-X1 o la
actividad de la MGAT-X1 se puede establecer usando
los procedimientos bien conocidos en la técnica, tal como
hibridación de sondas de nucleótidos para el ARNm específico de
MGATX1, RT-PCR cuantitativa, detección inmunológica
de la MGAT-X1, o medición de la actividad de la
MGAT-X1.
\newpage
En cualquiera de las realizaciones descritas
anteriormente, cualquiera de las composiciones farmacéuticas de la
invención se puede administrar en combinación con otros agentes
terapéuticos apropiados. La selección de los agentes apropiados
para uso en la terapia de combinación se puede realizar por los
expertos en la técnica, de acuerdo con los principios farmacéuticos
convencionales. La combinación de agentes terapéuticos puede actuar
de manera sinérgica para efectuar el tratamiento o prevención de los
diversos trastornos descritos anteriormente. Usando este
planteamiento, se puede ser capaz de lograr la eficacia terapéutica
con dosificaciones inferiores de cada agente, reduciendo de esta
manera el potencial de efectos secundarios adversos. Cualquiera de
los procedimientos terapéuticos descritos anteriormente se pueden
aplicar a cualquier sujeto en necesidad de tal terapia, incluyendo,
por ejemplo, mamíferos tales como perros, gatos, vacas, caballos,
conejos, monos, y lo más preferiblemente, seres humanos.
Las moléculas de ácido nucleico usadas en la
invención son las moléculas de ácido nucleico que están contenidas
en un grupo de moléculas de ácido nucleico que constan de (i)
moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que
comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, (ii)
moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de SEQ ID
NO: 1, (iii) moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia de
SEQ ID NO: 1, (iv) moléculas de ácido nucleico cuya hebra
complementaria se hibrida en condiciones rigurosas a una molécula
de ácido nucleico de (i), (ii), o (iii); y (v) moléculas de ácido
nucleico cuya secuencia difiere de de la secuencia de una molécula
de ácido nucleico de (iii) debido a la degeneración del código
genético, en el que el polipéptido codificado por dicha molécula de
ácido nucleico tiene la actividad de la MGAT-X1.
Los polipéptidos usados en la invención son los
polipéptidos que están contenidos en un grupo de polipéptidos que
constan de (i) polipéptidos que tienen la secuencia de SEQ ID NO: 2,
(ii) polipéptidos que comprenden la secuencia de de la SEQ ID NO:
2, (iii) polipéptidos codificados por moléculas de ácido nucleico de
la invención y (iv) polipéptidos que muestran al menos 99%, 98%,
95%, 90%, ó 80% de homología con un polipéptido de (i), (ii), o
(iii), en el que dicho polipéptido purificado tiene la actividad de
la MGAT-X1.
Se desvela un vector que comprende la molécula
de ácido nucleico de la invención.
Se desvela una célula huésped que contiene un
vector de la invención. Se desvela un procedimiento de producción de
una MGAT-X1 que comprende las etapas de (i) cultivar
una célula huésped de la invención en las condiciones adecuadas y
(ii) recuperar la MGAT-X1 del medio de cultivo.
Se desvela un procedimiento para la detección de
un polinucleótido que codifica una MGAT-X1 en una
muestra que comprende las etapas de (i) hibridar un polinucleótido
de la invención al material de ácido nucleico de la muestra,
formando por lo tanto un complejo de hibridación; y (ii) detectar
dicho complejo de hibridación.
Se desvela un procedimiento para la detección de
un polinucleótido que codifica una MGAT-X1 en una
muestra que comprende las etapas de (i) hibridar un polinucleótido
de la invención a material de ácido nucleico de la muestra,
formando por lo tanto un complejo de hibridación; y (ii) detectar
dicho complejo de hibridación, en el que antes de la hibridación,
el material de ácido nucleico de la muestra se amplifica.
Se desvela un procedimiento para la detección de
un polinucleótido de la invención o un polipéptido de la invención
que comprende las etapas de (i) poner en contacto una muestra con un
reactivo que específicamente interactúa con un polinucleótido de
la invención o un polipéptido de la invención, y (ii) detectar dicha
interacción.
Los reguladores de una proteína dada, dentro del
significado de la invención, se entienden por ser compuestos que
alteran o bien directa o indirectamente la actividad de una proteína
dada o bien in vivo o in vitro. La alteración de la
actividad puede ser, por ejemplo, pero sin limitación a, mediante
efectos alostéricos o mediante afectación de la expresión de la
proteína dada.
Otros objetos la invención son los
procedimientos para seleccionar reguladores de la actividad de la
acilglicerol aciltransferasa de una MGAT-X1 que
comprende las etapas de (i) poner en contacto un compuesto de ensayo
con un polipéptido de la invención, (ii) detectar la unión de dicho
compuesto de ensayo a dicho polipéptido of la invención, en el que
el compuesto de ensayos que se unen en (ii) se identifican como
reguladores potenciales de la actividad de la
MGAT-X1.
Otros objetos de la invención son procedimientos
de lo anterior, en los que la etapa de contacto está en o en la
superficie de una célula.
Otros objetos de la invención son procedimientos
de lo anterior, en los que la etapa de contacto está en o en la
superficie de una célula en el que la célula está in
vitro.
Otros objetos de la invención son procedimientos
de lo anterior, en los que la etapa de contacto está en un sistema
libre de células.
Otros objetos de la invención son procedimientos
de lo anterior, en los que el polipéptido de la invención está
acoplado a una marca detectable.
\newpage
Otros objetos de la invención son procedimientos
de lo anterior, en los que el compuesto está acoplado a una marca
detectable.
Se desvelan procedimientos de lo anterior, en
los que el compuesto de ensayo desplaza un ligando que primero se
une al polipéptido.
Otros objetos de la invención son procedimientos
de lo anterior, en los que el polipéptido de la invención está
unido a un soporte sólido.
Otros objetos de la invención son procedimientos
de lo anterior, en los que el compuesto está unido a un soporte
sólido.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
de selección de reguladores de la actividad de una
MGAT-X1 que comprende las etapas de
- \quad
- (i) medir la actividad de un polipéptido de la invención a una cierta concentración de un compuesto de ensayo o en la ausencia de dicho compuesto de ensayo, (ii) medir la actividad de dicho polipéptido a una concentración diferente de dicho compuesto de ensayo, en el que dicho compuesto de ensayo se identifica como un regulador de la actividad de una MGAT-X1 cuando existe una diferencia significativa entre las actividades medidas en (i) y (ii).
Se desvela un procedimiento de selección de
reguladores de la actividad de una MGAT-X1 que
comprende las etapas de (i) medir la actividad de un polipéptido
de la invención a una cierta concentración de un compuesto de
ensayo, (ii) medir la actividad de un polipéptido de la invención
en la presencia de un compuesto conocido que es regulador de la
MGAT-X1. Otro objeto de la invención es un
procedimiento de selección de reguladores de la actividad de una
MGAT-X1 que comprende los procedimientos
anteriormente mencionados, en los que se miden las actividades en
una célula. Otro objeto de la invención es un procedimiento de
selección de reguladores de la actividad de una
MGAT-X1 que comprende los procedimientos
anteriormente mencionados, en el que la célula está in
vitro.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
de selección de reguladores de la actividad de a
MGAT-X1 que comprende los procedimientos
anteriormente mencionados, en los que las actividades se miden en un
sistema sin células.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
de selección de reguladores de la MGAT-X1 que
comprende las etapas de (i).
Poner en contacto un compuesto de ensayo con una
molécula de ácido nucleico de la invención, (ii) detectar la unión
de dicho compuesto de ensayo a dicha molécula de ácido nucleico, en
el que dicho compuesto de ensayo se identifica como un regulador
potencial de la MGAT-X1 cuando se une a dicha
molécula de ácido nucleico.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
de selección de reguladores de la MGAT-X1 que
comprende las etapas de (i) poner en contacto un compuesto de
ensayo con una molécula de ácido nucleico de la invención, en el
que la molécula de ácido nucleico ies un ARN (ii) detectar la unión
de dicho compuesto de ensayo a dicha molécula de ARN, en el que
dicho compuesto de ensayo se identifica como un regulador potencial
de MGAT-X1 cuando se une a dicha molécula de
ARN.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
de selección de reguladores de la MGAT-X1 que
comprende las etapas de poner en contacto un compuesto de ensayo
con una molécula de ácido nucleico de la invención, detecta la
unión de dicho compuesto de ensayo a dicha molécula de ácido
nucleico, en el que dicho compuesto de ensayo se identifica como un
regulador potencial de la MGAT-X1 cuando se une a
dicha molécula de ácido nucleico, en el que la etapa de contacto es
(i) en o en la superficie de una célula o (ii) en un sistema sin
células o en el que (iii) el polipéptido o molécula de ácido
nucleico está acoplado a una marca detectable o en el que (iv) el
compuesto de ensayo está acoplado a una marca detectable.
Otro objeto de la invención es a procedimiento
de regular la actividad de MGAT-X1 en el que
MGAT-X1 se pone en contacto con un regulador de la
MGAT-X1.
Otro objeto de la invención es un procedimiento
de diagnosis de cáncer en un mamífero enfermo que comprende las
etapas de (i) medir la cantidad de una molécula de ácido nucleico
de la invención en una muestra tomada de dicho mamífero enfermo,
(ii) comparar los resultados de (i) a la cantidad de dicha molécula
de ácido nucleico en uno o varios mamíferos sanos, en el que cáncer
se diagnostica en el mamífero enfermo cuando la cantidad de dicha
molécula de ácido nucleico en el mamífero enfermo es
significativamente diferentes de la cantidad de molécula de ácido
nucleico en el mamífero/mamíferos sano (s).
Se desvelan composiciones farmacéuticas que
comprenden (i) una molécula de ácido nucleico de la invención, (ii)
un vector de la invención, o (iii) un polipéptido de la
invención.
Se desvelan composiciones farmacéuticas que
comprenden un regulador identificado por procedimientos de la
invención para el tratamiento de cáncer, en un mamífero.
Otro objeto de la invención se refiere al uso de
un oligonucleótido no codificante, un anticuerpo, o una ribozima,
que específicamente regula hacia abajo la actividad de la SEQ ID NO:
2 y el uso de un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO: 1 o un
polipéptido que comprende un polipéptido que comprende la SEQ ID NO:
2 para la preparación de las composiciones farmacéuticas útiles
para el tratamiento de cáncer, en un mamífero.
Se desvelan procedimientos para la preparación
de las composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento de
cáncer, en un mamífero que comprende las etapas de (i) identificar
un regulador de la MGAT-X1 mediante cualquiera de
los procedimientos anteriormente mencionados, (ii) determinar si
dicho regulador mejora los síntomas de cáncer, en un mamífero,
(iii)) combinar dicho regulador con un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Un oligonucleótido antisentido, un anticuerpo, o
una ribozima, que regulan a la baja específicamente la actividad de
SEQ ID NO: 2 y el uso de un polinucleótido que comprende SEQ ID NO:
1 o un polipéptido que comprende un polipéptido que comprende SEQ
ID NO: 2.
Los ejemplos más adelante se proporcionan para
ilustrar la invención sujeto. Estos ejemplos se proporcionan a modo
de ilustración y no se incluyen con el propósito de limitar la
invención.
El grado de homología se puede calcular
fácilmente mediante procedimientos conocidos. Los procedimientos
preferidos para determinar la homología se diseñan para
proporcionar la concordancia mayor entre las secuencias ensayadas.
Los procedimientos para determinar la homología están recopilados en
los programas de ordenador disponibles públicamente tales como
BestFit, BLASTP, BLASTN, y FASTA. Los programas BLAST están
disponibles públicamente a partir de NCBI I otras fuentes en
Internet.
Para MGAT-X1 se identificaron
los siguientes aciertos para las secuencias conocidas mediante el
uso del algoritmo BLAST [Altschul et al. (1997)] y el
siguiente conjunto de parámetros: matriz = BLOSUM62 y el filtro de
complejidad baja. Se investigaron las siguientes bases de datos:
NCBI (base de datos no redundante) y base de datos de patente
DERWENT (Geneseq). Se encontraron los siguientes aciertos:
>gb|AC128661.3| Mus
musculus cromosoma 7 clon
RP24-567N23,
longitud de secuencia completa =
421625747, Puntuación = 1602 bits (833), Previsión = 0,0,
Identidades = 833/833
(100%)
\vskip1.000000\baselineskip
>gb|BC039181.1| Homo
sapiens, Similar a diacilglicerol
O-aciltransferasa 2, clon IMAGE: 4746146,
ARNm
Longitud = 1152, Puntuación = 1594
bits (829), Previsión = 0,0, Identidades = 831/832
(99%)
\vskip1.000000\baselineskip
>NA2002: AAD46546 y 46546
diacilglicerol aciltransferasa Humana (DGAT) homólogo 2 alfa, DC3
ADNc.
1/2003
Longitud = 1240, Puntuación = 1075
bits (559), Previsión = 0,0, Identidades = 559/559
(100%)
\vskip1.000000\baselineskip
>ref|XM_228568.1| Rattus
norvegicus similar a bA351K23.5 (proteína novedosa)
[Homosapiens] (LOC302423),
ARNm
Longitud = 966, Puntuación = 990 bits (515),
Previsión = 0,0, Identidades = 779/911 (85%)
\vskip1.000000\baselineskip
>ref|XM__141972.1| Mus
musculus similar a diacilglicerol
O-aciltransferasa homólogo 2; GS1999full [Homo
sapiens] (LOC245533),
ARNm
Longitud = 972, Puntuación = 913
bits (475), Previsión = 0,0, Identidades = 695/805
(86%)
\vskip1.000000\baselineskip
>emb|AL357752.19| Secuencia
de ADN humano del clon RP13-26D14 sobre el cromosoma
Xq13.2-21.1, secuencia
completa
Longitud = 178868, Puntuación =
498 bits (259), Previsión = e-138, Identidades =
259/259
(100%)
\vskip1.000000\baselineskip
>NA2002: AAD46545 Aad46545
diacilglicerol aciltransferasa de ratón (DGAT) homólogo 2 alfa, DC3
ADNc.
1/2003
Longitud = 435, Puntuación = 448
bits (233), Previsión = e-123, Identidades = 364/430
(84%)
\vskip1.000000\baselineskip
>NA2000: AAZ60386 Aaz60386 A
diacilglicerol acil transferasa etiqueta de la secuencia expresada
relacionada.
5/2000
Longitud = 375, Puntuación = 335
bits (174), Previsión = 3e-89, Identidades = 305/371
(82%)
\vskip1.000000\baselineskip
>dbj|BD218492.1| proteínas
de la Diacilglicerol acil
transferasa
Longitud = 375, Puntuación = 335
bits (174), Previsión = 3e-89, Identidades = 305/371
(82%)
\vskip1.000000\baselineskip
>emb|AL671299.18| Secuencia
de ADN de ratón del clon RP23-281K21 sobre el
cromosoma X, secuencia
completa
Longitud = 214997, Puntuación =
304 bits (158), Previsión = 6e-80, Identidades =
192/209
(91%)
\vskip1.000000\baselineskip
>gb|AC091784.8| Secuencia
genómica para Mus musculus, clon RP23- 213D23, secuencia
completa
Longitud = 215410, Puntuación =
304 bits (158), Previsión = 6e-80, Identidades =
192/209
(91%)
\vskip1.000000\baselineskip
>ref|XM__228583.1| Rattus
norvegicus similar a bA351K23.5 (proteína novedosa)
[Homosapiens] (LOC302425),
ARNm
Longitud = 903, Puntuación = 123
bits (64), Previsión = 2e-25, Identidades = 122/151
(80%)
\vskip1.000000\baselineskip
>NA2002:_AAD46547 Aad46547
diacilglicerol aciltransferasa humana (DGAT) homólogo 2 alfa, DC4
ADNc.
1/2003
Longitud = 1872, Puntuación = 116
bits (60), Previsión = 3e-23, Identidades = 114/141
(80%)
\vskip1.000000\baselineskip
>NA2001A:_ABA18912 Aba18912
polinucleótido relacionado con el sistema nervioso humano SEQ ID NO
11243.
1/2002
Longitud = 3527, Puntuación = 116
bits (60), Expect - 3e-23, Identidades = 114/141
(80%).
\vskip1.000000\baselineskip
Se aisló ARN total celular a partir células
mediante uno de dos procedimientos convencionales: 1) centrifugación
en gradiente de densidad de isotiocianato de guanidina/cloruro de
cesio [Kellogg et al. (1990)]; o con el protocolo de
Tri-Reagent de acuerdo con las especificaciones del
fabricante (Molecular Research Center, Inc., Cincinatti, Ohio). El
ARN total preparado por el protocolo de Tri-reagent
se trató con ADNasa I para retirar la contaminación de ADN
genómica.
Para la cuantificación relativa de la
distribución de ARNm de la MGAT-X1 humana, el ARN
total de cada fuente celular o de tejido primero se transcribió de
manera inversa. 85 \mug de ARN total se transcribió de manera
inversa usando 1 \mumol de cebadores de hexámeros al azar, 0,5 mM
de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP (Qiagen, Hilden, Alemania),
3000 U RnaseQut (Invitrogen, Groningen, Holanda) en un volumen final
de 680 \mul. El tampón de síntesis de la primera hebra y
transcriptaza inversa Omniscript (2 u/\mul) eran de (Qiagen,
Hilden, Alemania). La reacción se incubó a 37ºC durante 90 minutos y
se enfrió sobre hielo. El volumen se ajustó hasta 6800 \mul con
agua, produciendo una concentración final de 12.5 ng/\mul de ARN
de de partida.
Para la cuantificación relativa de la
distribución del ARNm de la MGAT-X1 humano en las
células y tejidos se usó el Sistema de Detección de Secuencias de
Applied Biosystems 7900HT de acuerdo con las especificaciones y
protocolos del fabricante. Las reacciones de PCR se establecieron
para cuantificar la MGAT-X1 humana y los genes
controladores positivos de expresión HPRT (hipoxantina
fosforibosiltransferasa), GAPDH
(gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa), \beta-actina, y otros. Los
cebadores directos e inversos y sondas para la
MGAT-X1 humana se diseñaron usando el software
Perkin Elmer ABI Primer Express^{TM} y se sintetizaron mediante
TibMolBiol (Berlin, Alemania). La secuencia del cebador directo de
la MGAT-X1 humana era: Cebador 1 (SE Q ID NO: 3).
La secuencia del cebador inverso de la MGAT-X1
humana era Cebador 2 (SEQ ID NO: 5). Sonda 1 (SEQ ID NO: 4),
marcada con FAM (carboxifluoresceína succinimidil éster) como el
tinte indicador y TAMRA (carboxitetrametilrodamina) como el
inactivador, se usa como una sonda para la proteína de tipo UST3 1.
Se prepararon los siguientes reactivos en un total de 25 \mul:
tampón A 1x TaqMan, 5,5 mM MgCl_{2}, 200 nM de dATP, dCTP, dGTP, y
dUTP, 0,025 U/\mul AmpliTaq Gold^{TM}, 0,01 U/\mul AmpErase y
Sonda 1 (SEQ ID NO: 4), cebadores directo e inverso de la
MGAT-X1 humana cada uno a 200 nM, 200 nM,
MGAT-X1 humana sonda marcada con FAM/TAMRA-, y 5
\mul de ADNc de molde. Los parámetros de ciclación térmica eran 2
min a 50ºC, seguido de 10 min a 95ºC, seguido de 40 ciclos de
fusión a 95ºC durante 15 segundos e hibridación/extensión a 60ºC
durante 1 min.
\vskip1.000000\baselineskip
El valor de CT (ciclo de umbral) se calcula como
se desvela en la sección de "Determinación cuantitativa de
ácidos nucleicos". El valor de CF - (factor para la corrección
del ciclo umbral) se calcula como sigue:
- 1.
- Se establecieron las reacciones de la PCR para cuantificar los genes controladores positivos de la expresión (HKG) para cada muestra de ADNc.
- 2.
- Los valores de CT_{HKG} - (ciclo umbral del gen controlador positivos de la expresión) se calcularon como se ha descrito en la sección " Determinación cuantitativa de ácidos nucleicos".
- 3.
- Se calculan los valores medios de CT (valor medio de CT de los HKG ensayados sobre uno de los ADNc) de todos los HKG para cada ADNc
- \quad
- (n = número de HKG):
- \quad
- Valor medio de CT_{HKG-n} = (valor de CT_{HKG1} + valor de CT_{HKG2} + ... valor de CT_{HKG-n})/n
- 4.
- Valor medio de CT_{panel} (valor medio de CT de todos los HKG en todos los ADNc ensayados) (valor medio de CT_{HKG1} + valor medio de CT_{HKC2} + ... + valor medio de CT_{HKG-y})/y (y = número de ADNc)
- 5.
- CF_{ADNc-n} (factor de corrección para ADNc n) = valor medio de CT_{pannel} - valor medio de CT_{HKG-n}
- 6.
- CT_{ADNc-n} (valor medio de CT del gen ensayado para el ADNc n) + CF_{ADNc-n} (factor de corrección para ADNc n) = CT_{cor-ADNc-n}
- \quad
- valor de CT corregido para un gen de ADNc n).
\vskip1.000000\baselineskip
Definición: el valor mayor de
CT_{cor-ADNc-n} \neq 40 se
define como CT_{cor-ADNc} [alto]
Expresión relativa =
2(CT_{cor-ADNc}[alto] –
CT_{cor-ADNc-n}).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Los resultados de la cuantificación de ARNm
(perfil de expresión) se muestra en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
El conocimiento de la secuencia de ADNc,
correcta, completa que codifica MGAT-X1 permite
su uso como una herramienta para la tecnología no codificante en
la investigación de la función génica. Los oligonucleótidos, ADNc o
fragmentos genómicos que comprenden la hebra no codificante de un
polinucleótido que codifica MGAT-X1 se usan o bien
in vitro o in vivo para inhibir la traducción del
ARNm. Tal tecnología se conoce bien en la técnica, y moléculas no
codificantes se pueden diseñar en diversas localizaciones junto con
las secuencias de nucleótidos. Mediante tratamiento de células o
animales de ensayo enteros con tales secuencias no codificantes, el
gen de interés se cierra de manera eficaz. Frecuentemente, la
función del gen se determina mediante la observación del
comportamiento a nivel intracelular, celular, de tejido o de
organismo (por ejemplo, letalidad, pérdida de función
diferenciada, cambios en la morfología, etc.).
\newpage
Además de usar las secuencias construidas para
interrumpir la transcripción de un marco abierto de lectura
particular, se obtienen modificaciones de la expresión génica
diseñando las secuencias no codificantes a las regiones de intrón,
elementos promotor/potenciador, o incluso para tramitar los genes
reguladores.
Ejemplo
4
La expresión de la MGAT-X1 se
lleva a cabo mediante la subclonación de los ADNc en los vectores
de expresión apropiados y transfectando los vectores en los
huéspedes de expersión tales como, por ejemplo, E. coli. En
un caso particular, el vector de modifica de manera genética de
manera que contenga un promotor de la
\beta-galactosidasa, cadena arriba del sitio de
clonación, seguido de la secuencia que contiene la metionina amino
terminal y los posteriores siete restos de
\beta-galactosidasa. Inmediatamente después de de
estos ocho restos es un promotor bacteriófago modificado por
ingeniería genética útil para el cebado artificial y transcripción
y para proporcionar un número de sitios de restricción de
endonucleasa para clonación.
La inducción de la cepa bacteriana aislada
transfecetada con Isopropil-
\beta-D-tiogalactopiranósido
(IPTG) usando procedimientos convencionales produce una proteína de
fusión que corresponde a los primeros siete restos de la
\beta-galactosidasa, aproximadamente 15 restos de
"engarce", y el péptido codificado dentro del ADNc. Ya que las
inserciones del clon de ADNc se generan mediante un procedimiento
esencialmente al azar, existe una probabilidad del 33% de que el
ADNc incluido se ubique en el marco de lectura correcto para la
traducción apropiada. Si el ADNc no es el marco de lectura
apropiado, se obtiene mediante supresión o inserción del número
apropiado de bases que usan los procedimientos bien conocidos que
incluyen mutagénesis in vitro, digestión con la endonucleasa
III o nucleasa de judía mung, o la inclusión de un engarce de
oligonucleótido de una longitud apropiada.
El ADNc de la MGAT-X1 se
transfiere en otros vectores que se conoce que son útiles para la
expresión de proteínas en huéspedes específicos. Los cebadores de
oligonucleótido que contienen sitios de clonación así como un
segmento de ADN (aproximadamente 25 bases) suficiente para
hibridarse a tramos en ambos extremos del ADNC diana se sintetiza
de manera química mediante procedimientos convencionales. Estos
procedimientos después se usan para amplificar el segmento del gen
deseado mediante la PCR. El segmento del gen resultante se digiere
con enzimas de restricción apropiadas en condiciones convencionales
y aislarse mediante electroforesis en gel. De manera alternativa,
los segmentos de genes similares se producen mediante digestión del
ADNc con enzimas de restricción apropiadas. Usando los cebadores
apropiados, los segmentos de la secuencia de codificación de más de
un gen se ligan conjuntamente y se clonan en vectores apropiados.
Es posible optimizar la expresión mediante la construcción de tales
secuencias quiméricas.
Los huéspedes de expresión adecuados para tales
moléculas quiméricas incluyen, pero no se limitan a, células de
mamíferos tales como células de Ovario de Hámster Chino (CHO) y
células 293 humanas, células células de insecto tales como células
Sf9, células de levadura tales como Saccharomyces cerevisiae
y células huésped tales como E. coli. Para cada uno de estos
sistemas de células, un vector de expresión útil también incluye un
origen de replicación para permitir la propagación en bacterias, y
un marcador que se puede seleccionar tal como el gen de resistencia
al antibiótico \beta-lactamasa que permite la
selección de plásmido en bacterias. Además, el vector puede incluir
un segundo marcador que se puede seleccionar tal como el gen de
neomicina fosfotransferasa que permite la selección en las células
huésped eucarióticas transfectadas. Los vectores para uso en
huésped de expresión eucariótico requieren los elementos de
procesamiento de ARN tal como las secuencias de
3'-poliadenilación si tales no son parte del ADNc
de interés.
De manera adicional, el vector contiene
promotores o potenciadores que incrementan la expersión génica.
Tales promotores son huéspedes específicos e incluyen MMTV,
SV40, y promotores de metalotionina para las células de CHO;
promotores de trp, lac, tac y T7 para huéspedes bacterianoss; y
factor alfa, alcohol oxidasa y promotores de PGH para levadura. Los
potenciadotes de transcripción, tales como el potenciador del virus
de sarcoma rous, se usan en células huésped de mamífero. Una vez se
obtienen los cultivos homogéneos de las células recombinantes
mediante procedimientos de cultivo convencionales, se recuperan
grandes cantidades de la MGAT-X1 producida de
manera recombinante a partir del medio acondicionado y se analiza
usando los procedimientos cromatográficos conocidos en la técnica.
Por ejemplo, MGAT-X1 se puede clonar en el vector de
expresión pADNc3, como se ejemplifica en el presente documento.
Este producto se usar para transformar, por ejemplo, HEK293 o COS
mediante procedimiento convencional en la técnica. Específicamente,
por ejemplo, usando la transferencia de gen mediada por
Lipofectamine (Gibco BRL nº de catálogo
18324-020).
MGAT-X1 se expresa como una
proteína quimérica con uno o más dominios de polipéptido adicional
añadidos para facilitar la purificación de proteína. Tales dominios
que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a,
péptidos quelantes de metal tales como los módulos de
histidina-triptófano que permiten la purificación
sobre metales inmovilizados [Appa Rao (1997)] y el dominio utilizado
en el sistema de extensión/purificación por afinidad FLAGS
(Immunex Corp., Seattle, Washington). La inclusión de una secuencia
engarce de escisión tal como el Factor Xa o enteroquiinasa
(Invitrogen, Groningen, Holanda) entre el dominio de purificación
y la secuencia de la MGAT-X1 es útil para facilitar
la expresión de la MGAT-X1.
Se utilizan dos planteamientos para inducir
anticuerpos para MGAT-X1, y cada planteamiento es
útil para generar anticuerpos o bien policlonales o monoclonales.
en un planteamiento, la proteína desnaturalizada de la separación
de HPLC de fase inversa se obtiene en cantidades de hasta 75 mg.
Esta proteína desnaturalizada se usa para inducir anticuerpos para
inmunizar ratones o conejos que usan protocolos convencionales;
aproximadamente 100 \mug son adecuados para la inmunización de un
ratón, mientras hasta 1 mg se podría usar para inmunizar un
conejo. Para identificar hibridomas de ratón, la proteína
desnaturalizada se radioyoda y se usa para seleccionar los
hibridomas de células B inmunes potenciales para los que producen
anticuerpo. Este procedimiento requiere solamente cantidades
pequeñas de proteína, tal como 20 mg es suficiente para marcar y
seleccionar varios miles de clones.
En el Segundo planteamiento, la secuencia de
aminoácidos de un dominio de la MGAT-X1 apropiado,
como se deduce de la traducción del ADN, se analiza para determinar
las regiones de alta antigenicidad. Los oligopéptidos que
comprenden regiones hidrófilas se sintetizan y se usan en
protocolos de inmunización adecuados para inducir anticuerpos. Las
secuencias de aminoácidos óptimas para la inmunización están
usualmente en el extremo C, el extremo N y los que intervienen,
regiones hidrófilas del polipéptido que probablemente se exponen al
ambiente externo cuando la proteína está en su conformación
natural.
Típicamente, los péptidos seleccionados,
aproximadamente de 15 restos de longitud, se sintetizan usando un
Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems Modelo 431A usando
la química de fmoc y se acoplaron a la hemocianica de lapa
californiana (KLH; Sigma, St. Louis, MO) mediante reacción con
M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida
éster, MBS. Si es necesario, se introduce una cisteína en el
extremo N del péptido que permite el acoplamiento a KLH. Se
inmunizan los conejos con el complejo péptido KLH en adyuvante de
Freund' completo. Los antisueros resultantes se ensayan para
determinar la actividad de antipéptido mediante la unión del
péptido a plástico, bloqueando con 1% de albúmina sérica bovina,
haciendo reaccionar con antisuero, lavando y haciendo reaccionar
con IgG marcado (radioactivo o fluorescente), purificado por
afinidad, anticonejo de cabra específico.
Los hibridomas se preparan y se seleccionan
usando técnicas convencionales Los hibridomas de interés se detectan
mediante selección con la MGAT-X1 marcada para
identificar las fusiones que producen el anticuerpo monoclonal
con la actividad deseada. En un protocolo típico, los pocillos de
las placas (FAST; Becton-Dickinson, Palo Alto, CA)
se recubren durante la incubación con anticuerpos purificados por
afinidad, anti-conejo de conejo específico (o
antiespecies adecuados 1 g) a 10 mg/ml. Los pocillos recubiertos se
bloquean con albúmina sérica bovina (BSA) al 1, se lavan y se
incuban con los sobrenadantes de hibridomas. Después de lavar los
pocillos se incuban con MGAT-X1 marcada a 1
mg/ml. Los sobrenadantes con anticuerpos se unen a la
MGAT-X1 más marcada que es detectable en el
trasfondo. Después los clones que producen anticuerpos específicos
se expanden y se someten a dos ciclos de clonación en la dilución
limitante. Los hibridomas clonados se inyectan en ratones tratados
con pristano para producir ascitos, y se purifica el anticuerpo
monoclonal del fluido de ascitos de ratones mediante cromatografía
por afinidad sobre Proteína A. Los anticuerpos monoclonales con
afinidades de al menos 10^{8} M^{-1}, preferiblemente 10^{9}
a 10^{10} M^{-1} o mayor, se preparan típicamente mediante
procedimientos convencionales.
Los anticuerpos particulares de la
MGAT-X1 son útiles para investigar la transducción
de la señal y la diagnosis de afecciones infecciosas o
hereditarias que se caracterizan por diferencias en la cantidad o
distribución de MGAT-X1 o productos cadena debajo
de una cascada< de señalización activa.
Los ensayos de diagnóstico para
MGAT-X1 incluyen procedimientos que utilizan
anticuerpo y una marca para detectar MGAT-X1 en
fluidos corporales humanos, membranas, células, tejidos o extractos
de ellos. Los polipéptidos y anticuerpos de la presente invención
se usan con o sin modificación. Frecuentemente, los polipéptidos y
anticuerpos se marcan juntándolos, o bien de manera covalente o no
covalente, con una sustancia que proporciona una señal detectable.
Se conocen una amplia diversidad de de marcas y técnicas de
conjugación y se han reseñado de manera extensa tanto en la
bibliografía científica como de patentes. Las marcas adecuadas
incluyen radionúclidos, enzimas, substratos, cofactores,
inhibidores, agentes fluorescentes, agentes quimioluminiscentes,
agentes cromogénicos, partículas magnéticas, y similares.
Una diversidad de protocolos para medir la
MGAT-X1 soluble o unida a membranas, usando
anticuerpos o bien policlonales o monoclonales específicos para la
proteína, se conocen en la técnica. Los ejemplos incluyen ensayo
inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA)
y clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Se
prefiere un inmunoensayo a base de monoclonales de dos sitios que
utiliza anticuerpos monoclonales reactivos a dos epítopes que no
interfieren sobre MGAT-X1, pero se puede emplear un
ensayo de unión competitiva.
Se purifica MGAT-X1 nativa o
recombinante mediante cromatografía de de inmunoafinidad usando los
anticuerpos específicos para MGAT-X1. En general,
se construye una columna de inmunoafinidad mediante acoplamiento
covalente del anticuerpo anti-TRH a una resina
cromatográfica activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a
partir de suero immune o bien mediante precipitación con sulfato
de amonio o mediante purificación sobre Proteína A inmovilizada
(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway N.J.). De manera similar,
los anticuerpos se preparan a partir de fluidos de ascitos de ratón
mediante precipitación con sulfato de amonio o cromatografía sobre
Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina purificada parcialmente
se une de manera covalente a una resina cromatográfica tal como
Sefarosa activada por CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El
anticuerpo se acopla a la resina, se bloquea la resina, y la resina
derivada se lava de acuerdo con las instrucciones del
fabricante.
Tales columnas de afinidad se utilizan en la
purificación de la MGAT-X1 mediante la preparación
de una fracción de células que contienen MGAT-X1 en
una forma soluble. Esta preparación se deriva mediante la
solubilización de células enteras o de una fracción subcelular
obtenida mediante centrifugación diferencial (con o sin la adición
de detergente) o mediante otros procedimientos bien conocidos en la
técnica. Como alternativa, MGAT-X1 soluble que
contiene una secuencia de señal se secreta en cantidad útil en el
medio en el que las células se desarrollan.
Una preparación que contiene la
MGAT-X1 soluble se pasa sobre la columna
inmunológica, y la columna se lava en condiciones que permiten la
absorbencia preferencial de la MGAT-X1 (por ejemplo,
tampones de alta resistencia iónica en la presencia de detergente).
Después, la columna se eluye en condiciones que interrumpen la unión
de anticuerpo/proteína (por ejemplo, un tampón de pH 2 - 3 o una
alta concentración de un chaotropo tal como ion urea o tiocianato),
y se recoge la MGAT-X1.
Los compuestos de ensayo se pueden seleccionar
para determinar la capacidad diacilglicerol aciltransferasa
polipéptidos o polinucleótidos o para afectar a la actividad de la
diacilglicerol aciltransferasa o la expresión del gen de
diacilglicerol aciltransferasa usando selección de alto rendimiento.
Usando la selección de alto rendimiento, se pueden ensayar muchos
compuestos discretos en paralelo al gran número de compuestos de
ensayo se puede seleccionar rápidamente. Las técnicas establecidas
más ampliamente utilizan plaacs de 96 pocillos. Los pocillos de las
placas de mirotitulación típicamente requieren volúmenes de ensayo
que varían entre 50 y 500 microlitros. Además de las placas, muchos
instrumentos, materiales, pipetas, robótica, lavadores de placas, y
lectores de placas están comercialmente disponibles para fijar el
formato de 96 pocillos.
De manera alternativa "los ensayos de formato
libre", o ensayos que no tienen barrera física entre las muestras
se pueden usar. Por ejemplo, un ensayo que usa células de pigmento
(melanocitos) en un ensayo homogéneo sencillo para las genotecas de
péptidos combinatorias se desvela por Jayawickreme et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 19, 1614 - 18 (1994). Las células se
colocan bajo azarosa en placas petri, después las perlas que llevan
compuestos combinatorios se colocan sobre la superficie de azarosa.
Los compuestos combinatorios son parcialmente liberados los
compuestos de las perlas. Los compuestos activos se pueden
visualizar como áreas de pigmentos oscuros porque, como los
compuestos se difunden localmente en la matriz del gel, los
compuestos activos provocan que las células cambien los
colores.
Otro ejemplo del formato libre se desvela por
Chelsky, "Strategies for Screening Combinatorial Libraries:
Novel and Traditional Approaches," reseñado en la Primera
Conferencia Anual de la Sociedad para la Selección Biomolecular en
Filadelfia, Pa. (Nov. 7 - 10, 1995). Chelsky colocó un ensayo de
enzima homogéneo sencillo para carbónico anhidrasa dentro de un gel
de azarosa de manera que la enzima en el gel provocaría un cambio
de color a lo largo del gel. Después de esto, las perlas que llevan
compuestos combinatorios mediante un fotoengarce se colocaron
dentro del gel y los compuestos se liberaron parcialmente mediante
luz ultravioleta. Los compuestos que inhibían la enzima se
observaron como zonas locales de inhibición que tienen menos cambio
de color.
Todavía otro ejemplo se desvela por Salmon et
al., Molecular Diversity 2, 57-63 (1996). En
este ejemplo, las genotecas combinatorias se seleccionaron para los
compuestos que tenían efectos citotóxicos sobre células de cáncer
que se desarrollan en agar.
Otro procedimiento de selección de alto
rendimiento se desvela por Beutel et al., patente de Estados
Unidos nº 5.976.813. En este procedimiento, las muestras de ensayo
se colocan en una matriz porosa. Uno o más componentes de ensayo se
colocan después dentro, sobre la parte superior, o en el fondo de
una matriz tal como un gel, una hoja de plástico, un filtro, u otra
forma de soporte sólido que se manipula fácilmente. Cuando las
muestras se introducen a la matriz porosa se difunden
suficientemente lento, de manera que los ensayos se pueden realizar
sin que las muestras de ensayo se desarrollen conjuntamente.
El objetivo de diseño de fármaco racional es
producir análogos estructurales polipéptidos biológicamente activos
de interés o de moléculas pequeñas con las que interactúan,
agonistas, antagonistas, o inhibidores. Cualquiera de estos
ejemplos se usan para modelar fármacos que son más activos o formas
estables del polipéptido o que potencian o interfieren con la
función de un polipéptido in vivo.
En un planteamiento, la estructura de tres
dimensiones proteína de interés, o de un complejo inhibidor de
proteína, se determina mediante cristalografía de rayos X, mediante
modelado por ordenador o, más típicamente, mediante una combinación
de los dos planteamientos. Tanto la forma como cargas del
polipéptido se debe determinar para elucidar la estructura y para
determinar el (los) sitio (s) activo (s) de la molécula. Menos a
menudo, la información útil con relación a la estructura de un
polipéptido se gana mediante modelado basándose en la estructura de
proteínas homólogas. En ambos casos, la información estructural
relevante se usa para diseñar inhibidores eficaces. Los ejemplos
útiles del diseño de fármaco racional incluyen moléculas que tienen
una actividad o estabilidad mejorada o que actúan como inhibidores,
agonistas, o antagonistas de los péptidos nativos.
También es posible aislar un anticuerpo
específico de Diana, seleccionado mediante ensayo funcional, como
se ha descrito anteriormente, y después resolver su estructura
cristalina. Este planteamiento, en principio, produce un
farmanúcleo en el que se basa el diseño del fármaco. Es posible
desviar la cristalografía de proteína en conjunto mediante la
generación de anticuerpos antiidiotípicos (anti-ids)
a un anticuerpo funcional, farmacológicamente activo. Como una
imagen especular de una imagen en el espejo, el sitio de unión de
los anti-ids se espera que sea un análogo de la
transferasa original. Los anti-ids después se usan
para identificar t aislar péptidos de bancos de péptidos producidos
de forma química o biológica. Los péptidos aislados después actúan
como el farmanúcleo.
En virtud de la presente invención, se prepara
cantidad suficiente de polipéptido disponible para realizar tales
estudios analíticos como cristalografía de rayos X. Además, el
conocimiento de la secuencia de aminoácidos de
MGAT-X1 proporcionada en el presente documento
proporciona la guía de aquellas que emplean técnicas de modelación
por ordenador.
\vskip1.000000\baselineskip
Anticuerpos, inhibidores, o antagonistas de la
MGAT-X1 u otros tratamientos y compuestos que son
limitadores de la transducción de la señal (LST), proporcionan
efectos diferentes cuando se administran de manera terapéutica. LST
se formulan en un medio vehículo acuoso no tóxico, inerte,
farmacéuticamente aceptable, preferiblemente a un pH de
aproximadamente 5 a 8, más preferiblemente 6 a 8, aunque el pH puede
variar de acuerdo con las características del anticuerpo,
inhibidor, o antagonista que se formula y la afección a tratar. Las
características de los LST incluyen la solubilidad de la molécula,
se semivida y antigenicidad/inmunogenicidad. Estas y otras
características ayudan en la definición de un vehículo eficaz. Las
proteínas humanas nativas se prefieren como LST, pero las moléculas
orgánicas o sintéticas que se producen a partir de selecciones de
fármacos son igualmente eficaces en situaciones particulares.
Los LST se administran mediante vías de
administración que incluyen pero no se limitan a cremas y geles
tópicos; pulverización y aerosol transmucosal; parche transdérmico
y venda; formulaciones inyectables, intravenosas y de lavado; y
líquidos y pastillas administrados por vía oral particularmente
formuladas para resistir las enzimas ácidas del estómago. La
formulación particular, dosis exacta, y vía de administración se
determina por el médico asistente y varía de acuerdo con cada
situación específica.
Tales determinaciones se realizan mediante la
consideración de múltiples variables tales como la afección a
tratar, el LST a administrar, y el perfil farmacocinética de un
LST particular. Los factores adicionales que se tienen en cuenta
incluyen gravedad de estado patológico, la edad del paciente, peso,
género y dieta, tiempo y frecuencia de la administración de LST,
posible combinación con tros fármacos, sensibilidades de reacción,
y tolerancia/respuesta a la terapia. Las formulaciones de LST de
larga duración se puede administrar cada 3 a 4 días, cada semana,
o una vez cada dos semanas dependiendo de la semivida y velocidad de
eliminación del LST particular.
Las cantidades de dosificación normal varía
entre 0,1 y 10^{5} \mug, hasta una dosis total de
aproximadamente 1 g, dependiendo de la vía de administración. La
guía para las dosificaciones y procedimientos particulares de la
distribución se proporciona en la bibliografía; véanse las patentes
de Estados Unidos números 4.657.760; 5.206.344; ó 5.225.212.
Los expertos en la técnica emplean diferentes formulaciones para los
LST. La administración a las células tales como células nerviosas
necesita la administración de una manera diferente de de la de
otras células tales como células endoteliales vasculares.
Se contempla que la transducción de señal
anormal, trauma o enfermedades que disparan la actividad de
MGAT-X1 se pueden tratar con los LST. Estas
afecciones o enfermedades se diagnostican de manera específica
mediante los ensayos descritos anteriormente, y tal ensayo se debe
realizar en los casos sospechosos de infecciones virales,
bacterianas o fúngicas, respuestas alérgicas, lesión mecánica
asociada a trauma, enfermedades hereditarias, linfoma o carcinoma, u
otras afecciones que activan los genes de tejidos linfoides o
neuronales.
Los sistemas de modelos animales que elucidan
los papeles fisisológicos y de comportamiento de la
MGAT-X1 transferasa se producen creando animales
transgénicos no humanos en los que la actividad de la
MGAT-X1 transferasa o bien se incrementa o
disminuye, o la secuencia de aminoácidos de la
MGAT-X1 transferasa expresada se altera, mediante
una diversidad de técnicas. Los ejemplos de estas técnicas incluyen,
pero no se limitan a: 1) Inserción de versiones normales o mutantes
de ADN que codifican una MGAT-X1 transferasa,
mediante microinyección, electroporación, transfección retroviral u
otros medios bien conocidos por los expertos en la técnica, en
embriones fertilizados de manera apropiada con el fin de producir
un animal transgénico o 2) recombinación homóloga de versiones
mutantes o normales, humanas o animales de estos genes con el locus
del gen nativo en animales transgénicos para alterar la regulación
de la expresión do la estructura de estas secuencias de la
MGAT-X1 transferasa. La técnica de la recombinación
homóloga se conoce bien en la técnica. Reeemplaza el gen nativo con
el gen insertado y por lo tanto es útil para producir un animal que
no puede expresar las MGAT-X1 transferasas nativas
pero no expresan, por ejemplo, una MGAT-X1
transferasa mutante insertada, que tiene reemplazada la
MGAT-X1 transferasa nativa en el genoma de animales
mediante recombinación, dando como resultado la no expresión de la
transferasa. La microinyección añade genes al genoma, pero no los
elimina, y la técnica es útil para producir un animal que se
expresa y expresa la MGAT-X1 transferasa, dando
como resultado la sobreexpresión de la MGAT-X1
transferasa.
Un medio disponible para producir un animal
transgénico, con un ratón como ejemplo, es como sigue: se aparean
ratones hembra, y los huevos fertilizados resultantes se diseccionan
fuera de sus oviductos. Los huevos se almacenan en un medio
apropiado tal como medio M2 de cloruro de cesio. ADN o ADNc que
codifica MGAT-X1 se purifica a partir de un vector
mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la
técnica. Los promotores que se pueden inducir pueden condensarse a
la región codificante del AND que proporciona un medio experimental
para regular la expresión del transgen. De manera alternativa o
además, los elementos reguladores específicos se pueden condensar
con la región codificante para permitir la expresión específica de
tejido del transgen. El ADN, en una solución tamponada con fosfato
de manera apropiada, se colocan en una aguja de microinyecciójn
(que se puede preparar a partir de tubos capilares que usan un
extractor de tuberías) y el huevo a inyectar se pone en un
portaobjetos por depresión. La aguja se inserta en el pronúcleo del
huevo, y se inyecta la solución de ADN. El huevo inyectado se
transfiere después en el oviducto de un ratón pseudopreñado que es
un ratón estimulado por las hormonas apropiadas con el fin de
mantener el falso embarazo, cuando procede del útero, los
implantes, se desarrolla hasta el final. Como se ha indicado
anteriormente, la microinyección no es solamente el procedimiento
para insertar ADN en el huevo pero se sa aquí solamente para
propósitos ejemplares.
Para los ensayos de unión, el compuesto de
ensayo es preferiblemente una pequeña molécula que se une a un
polipéptido de la acilglicerol aciltransferasa, reduciendo por lo
tanto la actividad biológica del polipéptido de la acilglicerol
aciltransferasa. Los ejemplos de tales moléculas pequeñas incluyen,
pero no se limitan a, moléculas de péptidos o de tipo péptidos
pequeñas. En los ensayos de unión, o bien el compuesto de ensayo o
el polipéptido de la acilglicerol aciltransferasa polipéptido puede
comprender una marca detectable,tal como una marca fluorescente,
radioisotóica, quimioluminiscente, o enzimática, tal como peroxidasa
de rábano picante, fosfatasa alcalina, o luciferasa. Se puede
después llevar a cabo la detección de un compuesto de ensayo que
se une al polipéptido de la acilglicerol aciltransferasa, por
ejemplo, mediante conteo directo de la radioemisión, mediante
centelleo, o mediante determinación de la conversión de un sustrato
apropiado para un producto detectable.
Como alternativa, la unión de un compuesto de
ensayo a un polipéptido de acilglicerol aciltransferasa se puede
determinar sin marcar cualquiera de los interactuantes por ejemplo,
se puede usar un microfisiómetro para detectar la unión de un
compuesto de ensayo con un polipéptido de la acilglicerol
aciltransferasa. Un microfisiómetro (por ejemplo,
Cytosensor^{TM}) es un instrumento analítico que mide la velocidad
a la que una célula acidifica su ambiente usando un sensor
potenciométrio dirigible por la luz (LAPS). Los cambios en esta
velocidad de acificación se pueden usar como un indicador de la
interacción entre un compuesto de ensayo y un polipéptido de la
acilglicerol aciltransferasa (McConnell et al., Science 257,
1906 - 1912, 1992).
La determinación de la capacidad de un compuesto
de ensayo de unirse a un polipéptido de la acilglicerol
aciltransferasa también se puede llevar a cabo usando una tecnología
tal como Análisis de Interacción Biomolecular de tiempo real
(BIA) (Sjolander & Urbaniczky, Anal. Chem. 63, 2338 - 2345,
1991, y Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699 -
705, 1995). BIA es una tecnología para estudiar las interacciones
bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los
interactuantes (por ejemplo,BIAcore^{TM}). Los cambios en la
resonancia de plasmón de superficie (SPR) de fenómeno óptico se
pueden usar como una indicación de las reacciones de tiempo real
entre moléculas de
tiempo.
tiempo.
Todavía en otro aspecto de la invención, un
polipéptido de la acilglicerol aciltransferasa se puede usar como
una " proteína cebo" en un ensayo de tres híbridos (véase, por
ejemplo, la Patente de Estados Unidos nº 5.283.317; Zervos et
al., Cell 72, 223 - 232, 1993; Madura et al., J. Biol.
Chem. 268, 12046 - 12054, 1993; Bartel et al., Biotechniques 14,
920 - 924, 1993; Iwabuchi et al, Oncogene 8, 1693 - 1696,
1993; y Brent W094/10300), para identificar otras proteínas que se
unen a o interactúan con el polipéptido de la acilglicerol
aciltransferasa y modulan su actividad.
El sistema de dos híbridos basado en la
naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción
que constan de unión de ADN separables y dominios de activación. En
resumen, el ensayo utiliza dos construcciones deferentes de ADN.
Por ejemplo, en una construcción, el polinucleótido que codifica un
polipéptido de la acilglicerol aciltransferasa se puede condensar a
un polipéptido que codifica el dominio de unión de ADN de un factor
de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En
la otra construcción una secuencia de que codifica una proteína no
identificada ("presa" o "muestra") se puede condensar a
un polinucleótido que codifica el domino de activación del factor
de transcripción conocido. Si las proteínas "cebo" y
"presa" son capaces de interactuar in vivo para formar
un complejo dependiente de proteína, los dominios de unión de ADN y
de activación del factor e transcripción están en proximidad
estrecha. Esta proximidad permite la transcripción de un gen
indicador (por ejemplo, acZ), que se une de manera operativa a un
sitio de transcripción regulador sensible al factor de
transcripción. Se puede detectar la expresión de gen indicador, y
las colonias de células que contienen el factor de transcripción
funcional se puede aislar y usar para obtener la secuencia de ADN
que codifica la proteína que interactúa con el polipéptido de la
acilglicerol aciltransferasa.
Puede ser deseable inmovilizar o bien el
polipéptido de la acilglicerol aciltransferasa (o polinucleótido) o
el compuesto de ensayo para facilitar la separación de las formas
unidas de las no unidas de uno o ambos de los interactuantes, sí
como para acomodar la automatización del ensayo. De este modo, el
polipéptido de la acilglicerol aciltransferasa (o polinucleótido) o
el compuesto de ensayo se puede unir a un soporte sólido. Los
soportes sólidos adecuados incluyen, pero no se limitan a,
portaobjetos de vidrio o de plástico, placas de cultivo de tejidos,
pocillos de microvaloración, tubos, procesadores de silicio, o
partículas tales como perlas, (que incluyen pero no se limitan a,
látex, poliestireno, o perlas de vidrio). Cualquier procedimiento
conocido en la técnica se puede usar para unir el polipéptido de la
acilglicerol aciltransferasa (o un polinucleótido) o compuesto de
ensayo a un soporte sólido, que incluye el uso de al polipéptido de
la acilglicerol aciltransferasa (o polinucleótido) o compuesto de
ensayo a un soporte sólido, incluyendo el uso de enlaces covalentes
y no covalentes, absorción positiva, o pares de restos de unión
unidos respectivamente al polipéptido (o polinucleótido) o
compuesto de ensayo y el soporte sólido. Los compuestos de ensayo se
unen preferiblemente al soporte sólido en una disposición, de
manera que la localización de los compuestos de ensayo individuales
se puede rastrear. La unión de un compuesto de ensayo a un
polipéptido de la acilglicerol aciltransferasa o (polinucleótido)
se puede llevar a cabo en cualquier vehículo adecuado para recubrir
los reactivos. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de
microvaloración, tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga.
En una realización, el polipéptido de la
acilglicerol aciltransferasa es una proteína de fusión que
comprende un dominio que comprende un dominio que permite que el
polipéptido de la acilglicerol aciltransferasa se una a un soporte
sólido. Por ejemplo, proteínas de fusión de la
glutatión-S-transferasa se pueden
adsorber sobre las perlas de glutatión sefarosa (Sigma Chemical,
St. Louis, Mo.) o placas de microvaloración derivatizadas de
glutatión que después se combinan con el compuesto de ensayo o el
compuesto de ensayo y polipéptido de la acilglicerol
aciltransferasa no adsorbido; la mezcla después se incuba en
condiciones para la formación de complejos (por ejemplo, en
condiciones fisiológicas para sal y pH). Después de la incubación,
las perlas o pocillos de las placas de microvaloración se lavan
para retirar los componentes no unidos. La unión de los
interactuantes se puede determinar o bien directa o indirectamente,
como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, los complejos
se pueden disociar del soporte sólido antes de que se determine la
unión.
Se pueden usar otras técnicas para la
inmovilización de proteínas o polinucleótidos sobre un soporte
sólido en los ensayos de de selección de la invención. Por ejemplo,
o bien un polipéptido de la acilglicerol aciltransferasa (o
polinucleótido) o un compuesto de ensayos puede inmoilizar
utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. Los
polipéptidos de la acilglicerol aciltransferasa biotinilados (o
polinucleótidos) o compuestos de ensayo se pueden preparar a partir
de
biotin-NHS(N-hidroxisuccinimida)
usando las técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, kit
de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, III.) y se inmovilizan
en los pocillos de las placas de 96 pocillos revestidas con
estreptavidina (Pierce Chemical). Como alternativa, los
anticuerpos que se unen de manera específica a un polipéptido de
la acilglicerol aciltransferasa, polinucleótido, o un compuesto de
ensayo, pero que no interfieren con un sitio de unión deseado, tal
como el sitio activo del polipéptido de la acilglicerol
aciltransferasa, se pueden derivatizar a los pocillos de la placa.
La diana o proteína no unida se puede atrapar en los pocillos
mediante conjugación de anticuerpos.
Los procedimientos para detectar tales
complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos
inmovilizados por GST, incluyen la inmunodetección de complejos que
usan anticuerpos que usan anticuerpos que específicamente se unen
al polipéptido de la acilglicerol aciltransferasa o compuesto de
ensayo, ensayos ligados a enzima que dependen de la detección de
una actividad del polipéptido de la acilglicerol aciltransferasa,
y electroforesis en gel de SDS en condiciones no reductoras.
La selección de los compuestos de ensayo que se
unen al polipéptido de la acilglicerol aciltransferasa o
polinucleótido también se puede llevar a cabo En una célula intacta.
Cualquier célula que comprende un polipéptido de la acilglicerol
aciltransferasa o polinucleótido se puede usar en un sistema de
ensayo basado en células. Un polinucleótido de la acilglicerol
aciltransferasa puede ser de origen natural en la célula o se puede
introducir usando las técnicas tales como las descritas
anteriormente. La unión del compuesto de ensayo a un polipéptido de
la acilglicerol aciltransferasa o polinucleótido se determina como
se ha descrito anteriormente.
El polipéptido purificado de la acilglicerol
aciltransferasas que comprende una proteína de la
glutatión-S-transferasa y absorbida
sobre pocillos derivatizados de glutatión de placas de
microvaloración de 96 pocillos se ponen en contacto con los
compuestos de ensayo de una genoteca de pequeñas moléculas a pH 7,0
en una solución tampón fisiológica, los polipéptidos de la
acilglicerol aciltransferasas comprenden una secuencia de
aminoácidos mostrada en una cualquiera o más de SEQ ID NO: 6 a 10.
Los compuestos de ensayo comprenden una etiqueta fluorescente. Las
muestras se incuban durante 5 minutos a una hora. Las muestras de
control se incuban en la ausencia de un compuesto de ensayo.
La solución de tampón que contiene los
compuestos de ensayo se lava de los pocillos. La unión de un
compuesto de ensayo a un polipéptido de la acilglicerol
aciltransferasa se detecta mediante mediciones de fluorescencia del
contenido de los pocillos. Un compuesto te ensayo que incrementa la
fluorescencia en un pocillo en al menos 15% con relación a la
fluorescencia de un pocillo en el que un compuesto de ensayo no
incubado se identifica como un compuesto que se une a un
polipéptido relacionado con el factor de
ADO-ribosilación.
Los ensayos funcionales se pueden llevar a cabo
como se ha descrito en los ejemplos específico, después de poner en
contacto o bien un polipéptido de la acilglicerol aciltransferasa o
en una célula intacta de un compuesto de ensayo. Un compuesto de
ensayo que disminuye una actividad funcional de un polipéptido de
la acilglicerol aciltransferasa humano en al menos aproximadamente
10, preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente
aproximadamente 75, 90, ó 100% se identifica como un agente
potencial para disminuir la actividad de la proteína de la
acilglicerol aciltransferasa. Un compuesto de ensayo que incrementa
la actividad funcional en al menos 10, preferiblemente
aproximadamente 50, más preferiblemente aproximadamente 75, 90, ó
100% se identifica como un agente potencial para incrementar la
actividad de la proteína de la acilglicerol aciltransferasa.
El transporte de sustrato marcado con ^{3}H
en la presencia o ausencia de de un compuesto de ensayo se puede
medir como se ha descrito en Hsiang et al. (1999,
supra). En resumen, las células 293c18 se transfectan con
las construcciones de tipo human OATP2- humanas usando
LipofectAMINE Plus (Life Technologies, Inc.) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. Se retira el medio, y se lavan las
células una vez en DMEM sin suero. El sustrato marcado con ^{3}H,
o bien solo o en la presencia de un compuesto de ensayo, se añade
en el mismo medio y se incuba a temperatura ambiente durante 5 - 10
minutos. Las células se lavan rápidamente una vez con DMEM enfriado
con hielo que contiene 5% de albúmina sérica bovina, después se
lava tres veces con DMEM enfriado con hielo. Se lisan las células
en 0,1 N NaOH. La incorporación radiomarcada se determina mediante
conteo por centelleo líquido.
Las referencias que describen al menos la
purificación parcial de la acilglicerol aciltransferasa de fuentes
de origen natural incluyen: Kamisaka et al., "Purification
and Characterization of Diacilglicerol Aciltransferasa from the
Lipid Body Fraction of Oleaginous Fungus," J. Biochem (Tokyo)
1997 (6) 1107 - 1114 [Kamisaki et al., (1997)]; Little et
al., "Solubilization and Characterization of Diacilglicerol
Aciltransferasa from Microspore-_Derived Cultures
of Oilseed Rape," Biochem J. (Dec. 15, 1994) 304 (Pt 3): 951 -
958 [Little et al., (1994)]; Andersson et al.,
"Purification of Diacylgycerol: acyltransferase from Rat Liver to
Near Homogeneity," J. Lipid Res. (March 1994) 35: 535 - 545
[Anderson et al., (1994)]; Polokoff & Bell,
"Solubilization, Partial Purification and Characterization of Rat
Liver Microsomal Diacylgycerol: acyltransferase", Biochim.
Biophys. Acta (1980) 618: 129-142 [Polokoff et
al., (1980)].
Ensayo de la acilglicerol aciltransferasa [Bhat
et al., (1998)]. MGAT se purificó parcialmente a partir de
hígados de ratas Sprague-Dawley de 8 día de edad
obtenidas a partir de hembras embarazadas
(Zivic-Miller) (7). Después de la etapa de
cromatografía por hidroxilapatita, la preparación de enzima
solubilizada y altamente purificada está libre de fosfolípidos. Se
almacenaron alícuotas a - 70 C. MGAT se ensayó en micelas
mezcladas. En resumen, se solubilizaron lípidos secos en 0,2% de
Triton X-100 y se añadieron a la mezcla de reacción.
Las concentraciones de cada lípido y el sustrato hidrófobo de MGAT
2-monoC18: 1- sn-glicerol se
expresan como un porciento de moles, calculado por la ecuación: 100
x {[lípido añadido]/([lípido total] + [Triton X- 100])}. Se ensayó
la actividad de la MGAT en un volumen de 200 l que contenía 100 mM
Tris-HCl (pH 7,0), 0,5 mg/ml BSA, 0,22% Triton
X-100 (3 mM concentración de micela), 150 M
2-MO, 25 M [3H]palmitoil-CoA
(115 Ci/mol), 0,25-0,5 g de proteína purificada por
hidroxilapatita, y las concentraciones indicadas de lípidos
especificada. Las concentraciones de palmitoil-CoA,
que es soluble en agua, se reseñan como concentraciones molares,
debido a que los inventores no pueden estar seguros sobre la
cantidad que se reparte en las micelas, particularmente en la
presencia de BSA. Las concentraciones de
palmitoil-CoA mayores que 60 M no se usaron debido
a que no se observó inhibición. Después de 5 minutos de incubación
a 23ºC, los productos se extrajeron y se analizaron. Cuando es
necesario, una parte del extracto de heptano se cromatografió con
los lípidos vehículo sobre placas G de gel de sílice de 10 cm en
heptano/isopropil éter/ácido acético (60:40:4; v/v), y las áreas de
triacilglicerol y diradilglicerol se rasparon y se contaron. Todos
los ensayos contenían las cantidades óptimas de sustratos y se
midieron en sus cantidades iniciales. Se desvela otro ensayo para la
acilglicerol aciltransferasa en el documento de Estados Unidos
6.607.893.
Documento de Estados Unidos Nº 4.522.811
Documento de Estados Unidos Nº 4.683.195
Documento de Estados Unidos Nº 4.800.195
Documento de Estados Unidos Nº 4.965.188
Documento de Estados Unidos Nº 5.223.409
Documento de Estados Unidos Nº 5.283.317
Documento de Estados Unidos Nº 5.403.484
Documento de Estados Unidos Nº 5.565.332
Documento de Estados Unidos Nº 5.571.698
Documento de Estados Unidos Nº 5.641.673
Documento de Estados Unidos Nº 6.607.893
Documento WO 84/03564
Documento WO 92/01810
Documento WO 93/03151
Documento WO 94/13804
Documento WO 01/04283
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tipo acilglicerol aciltransferasa y sus usos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Le A 36 894
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1131
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 328
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador directo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccaggcctat tgtcactgtg
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador inverso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctggcttggc ttttcaattt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> sonda
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipttggggagcc tctgccactg c
\hfill21
Claims (21)
1. Un procedimiento para seleccionar reguladores
de la actividad de acilglicerol aciltransferasa de un polipéptido
que comprende la SEQ ID NO: 2 útil en el tratamiento de cáncer en un
mamífero, que comprende las etapas de
- i)
- poner en contacto un compuesto de ensayo con un polipéptido de la SEQ ID NO: 2,
- ii)
- detectar la unión de dicho compuesto de ensayo a dicho polipéptido,
en el que los compuestos de ensayo
que se une bajo (ii) se identifican como reguladores potenciales de
la actividad de la SEQ ID NO: 2 útil en el tratamiento de
cáncer.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la etapa de contacto está en o junto a la superficie de una
célula.
3. El procedimiento de la reivindicación 1 en
el que la célula está in vitro.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que la etapa de contacto es en un sistema sin células.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el polipéptido está acoplado a una marca detectable.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el compuesto está acoplado a una marca detectable.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el polipéptido está unido a un soporte sólido.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el compuesto está unido a un soporte sólido.
9. Un procedimiento de selección de reguladores
de la actividad de la acilglicerol aciltransferasa de un
polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2 útil en el tratamiento de
cáncer en un mamífero, que comprende las etapas de:
- i)
- medir la actividad de un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2 a una cierta concentración de un compuesto de ensayo o en la ausencia de dicho compuesto de ensayo,
- ii)
- medir la actividad de dicho polipéptido a una concentración diferente de dicho compuesto de ensayo,
en el que dicho compuesto de ensayo
se identifica como un regulador de la actividad de un polipéptido
que comprende la SEQ ID NO: 2 cuando existe una diferencia
significativa entre las actividades medidas en (i) y
(ii).
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que las actividades se miden en una célula.
11. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que la célula está in vitro.
12. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que las actividades se miden en un sistema sin células.
13. Un procedimiento para seleccionar
reguladores de la actividad de acilglicerol aciltransferasa de la
SEQ ID NO: 2 útil en el tratamiento de cáncer en un mamífero, que
comprende las etapas de
- i)
- poner en contacto un compuesto de ensayo con una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1,
- ii)
- detectar la unión de dicho compuesto de ensayo a dicha molécula de ácido nucleico,
en el que dicho compuesto de ensayo
se identifica como un regulador potencial de la actividad de la
acilglicerol aciltransferasa de la SEQ ID NO: 2 cuando se une a
dicha molécula de ácido
nucleico.
14. El procedimiento de la reivindicación 13 en
el que la molécula de ácido nucleico es ARN.
15. El procedimiento de la reivindicación 13 en
el que la etapa de contacto es en o junto a la superficie de una
célula.
16. El procedimiento de la reivindicación 13 en
el que la etapa de contacto es en un sistema sin células.
17. El procedimiento de la reivindicación 13 en
el que la molécula de polipéptido o de ácido nucleico está acoplada
a una marca detectable.
18. El procedimiento de la reivindicación 13 en
el que el compuesto de ensayo está acoplado a una marca
detectable.
19. Un procedimiento de diagnosis de cáncer en
un mamífero que comprende las etapas de
- i)
- medir la cantidad de una SEQ ID NO: molécula de ácido nucleico en una muestra tomada dicho mamífero enfermo,
- ii)
- comparar el resultado de (i) con la cantidad de dicha molécula de ácido nucleico en uno o varios mamíferos sanos,
en el que cáncer se diagnostica en
el mamífero enfermo cuando la cantidad de dicha molécula de ácido
nucleico en el mamífero enfermo es significativamente diferente de
la cantidad de dicha molécula de ácido nucleico en el (los)
mamífero (s)
sano(s).
20. Uso de
- i)
- un oligonucleótido no codificante,
- ii)
- un anticuerpo, o
- iii)
- una ribozima,
que regula específicamente hacia
abajo la actividad de la acilglicerol aciltransferasa de la SEQ ID
NO: 2 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 18 para
la preparación de un medicamento útil en el tratamiento de cáncer
en un
mamífero.
21. Uso de
- i)
- un polinucleótido que comprende la SEQ ID NO: 1 o
- ii)
- un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 2
para la preparación de un
medicamento útil en el tratamiento de cáncer en un
mamífero.
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