ES2314383T3 - Diagnostico y tratamiento terapeuticos para enfermedades asociadas al receptor 5a del componente del complemento (c5ar). - Google Patents

Diagnostico y tratamiento terapeuticos para enfermedades asociadas al receptor 5a del componente del complemento (c5ar). Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de insuficiencia cardíaca en un mamífero que comprende las etapas de i) determinar la actividad de un polipéptido de C5AR a una cierta concentración de un compuesto de ensayo en ausencia de dicho compuesto de ensayo, ii) determinar la actividad de dicho polipéptido a una concentración diferente de dicho compuesto de ensayo.

Description

Diagnóstico y tratamientos terapéuticos para enfermedades asociadas al receptor 5A del componente del complemento (C5AR).
Campo técnico de la invención
La presente invención pertenece al campo de la biología molecular, más particularmente, la presente invención se refiere a secuencias de ácido nucleicos de un C5AR humano y su regulación para el tratamiento de trastornos cardiovasculares, enfermedades inflamatorias, enfermedad gastrointestinal y enfermedades del hígado, trastornos de cáncer, trastornos hematológicos, enfermedades respiratorias y trastornos urológicos en mamíferos.
Antecedentes de la invención Receptores acoplados a la proteína G
El C5AR es un receptor acoplado a proteínas G de siete dominios transmembrana (GPCR) [Bao et al. (1992), Hopken et al. (1996), 15 Karp et al. (2000), Gavett et al. (1995), Ober et al. (1998), Wjst et al. (1999), Arumugam et al. (2003), Abe et al. (2001), US 5861272]. Muchos procedimientos biológicos médicamente significativos están medicados mediante rutas de transducción de señal que implican las proteínas G [Lefkowitz, (1991)]. La familia de los receptores acoplados a la proteína G (GPCR) incluye los receptores de hormonas, neurotransmisores, factores de crecimiento, y virus. Los ejemplos específicos de GPCRs incluyen receptores para tales agentes diversos tales como dopamina, calcitonina, hormonas adrenérgicas, endotelina, cAMP, adenosina, acetilcolina, serotonina, histamina, trombina, quinina, hormona estimuladora de folículos, opsinas, gen-1 de diferenciación endotelial, rodopsinas, odorantes, citomegalovirus, las propias proteínas G, proteínas efectoras tales como fosfolipasa C, adenil ciclasa, y fosfodiesterasa, y proteínas actuadoras tal como la proteína quinasa A y proteína quinasa C.
Los GPCR poseen siete dominios transmembrana conservados que conectan al menos ocho bucles hidrófilos divergentes. Los GPCR, también conocidos como siete dominios transmembrana, 7TM, receptores, se han caracterizado porque incluyen estos siete tramos hidrófobos conservados de aproximadamente 20 a 30 aminoácidos, que conectan al menos ocho bucles hidrófilos divergentes. La mayoría de los GPCR tienen restos de cisteína individuales conservados en cada uno de los dos primeros bucles extracelulares, que forman enlaces disulfuros que se cree que estabilizan la estructura funcional de la proteína. Las regiones de siete dominios transmembrana se denominan TM1, TM2, TM3, TM4, TM5, TM6, y TM7. TM3 está implicado con la transducción de señal. La fosforilación y lipidación (palmitilación o farnesilación) de restos de cisteína pueden influenciar la transducción de señal de algunos GPCR. La mayoría de los GPCR contienen sitios de fosforilación potenciales dentro del tercer bucle citoplásmico y/o el extremo carboxi. Para varios GPCR, tal como el receptor beta-adrenérgico, fosforilación por la proteína quinasa A y/o quinasas del receptor específico media la desensibilización del receptor.
Para algunos receptores, los sitios de unión a ligandos de los GPCR se cree que comprenden alvéolos hidrófilos formados por varios dominios transmembrana GPCR. Los alvéolos hidrófilos están rodeados de restos hidrófobos de los GPCR. El lado hidrofílico de cada hélice transmembrana GPCR se postula en frente del interior y forma un sitio de unión al ligando polar. TM3 está implicado en varios GPCR por tener un sitio de unión a ligando, tal como el resto aspartato TM3. TM5 serinas, una TM6 asparagina, y TM6 o TM7 fenilalaninas o tirosina también están implicados en la unión de ligandos.
Los GPCR están acoplados en el interior de la célula mediante proteínas G a varias enzimas intracelulares, canales de iones, y transportadores. Las subunidades alfa de la proteína G diferentes estimulan de manera preferencial los efectores particulares para modular diversas funciones biológicas en una célula. La fosforilación de los restos citoplásmicos de los GPCR es un mecanismo importante para la regulación de de algunos GPCR. Por ejemplo, en una forma de la transducción de señal, el efecto de la unión de hormona es la activación de la enzima, y adenilato ciclasa, dentro de la célula. La activación de enzima por las hormonas depende de la presencia del nucleótido GTP. GTP también influye en la unión a hormona. Una proteína G conecta el receptor de hormona con la adenilato ciclasa. La proteína G cambia la GTP por la GDP unida cuando se activa mediante un receptor de hormona. La forma que lleva GTP después se une a la adenilato ciclasa activada. La hidrólisis de GTP a GDP, catalizada por la misma proteína G, hace volver al la Proteína G a su forma inactiva basal. De este modo, la Proteína G tiene un papel doble, como un intermedio que vuelve a transmitir la señal del receptor al efector, y como un reloj que controla la duración de la
señal.
Durante los últimos 15 años, aproximadamente 350 agentes terapéuticos que dirigen los receptores 7TM se han introducido de manera exitosa en el mercado. Esto indica que estos receptores tienen una historia establecida, probada como dianas terapéuticas. Evidentemente, existe una necesidad para la identificación y caracterización de receptores adicionales que pueden jugar un papel en la prevención, mejora, o corrección de las disfunciones o enfermedades que incluyen pero no se limitan a, infecciones tales como infecciones bacterianas, fúngicas, por protozoos, y virales, particularmente las provocadas por virus VIH, cánceres, alergias que incluyen asma, enfermedades cardiovasculares que incluyen insuficiencia cardíaca aguda, hipotensión, hipertensión, angina de pecho, infarto de miocardio, enfermedades hematológicas, enfermedades genitourinarias que incluyen incontinencia urinaria e hiperplasia de próstata benigna, osteoporosis, y trastornos del sistema nervioso periférico y central incluyendo dolor, enfermedad de Alzheimer y enfermedad de Parkinson. La presente invención identificó C5AR como una Diana para seleccionar agentes terapéuticos para el tratamiento de insuficiencia cardíaca.
Tecnología TaqMan/perfil de expresión
TaqMan es una técnica desarrollada recientemente, en la que la liberación de un tinte indicador fluorescente de una sonda de hibridación a tiempo real durante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es proporcional a la acumulación del producto de la PCR. La cuantificación se basa en la parte temprana lineal de la reacción, y mediante la determinación del ciclo umbral (CT), en el que se detecta la fluorescencia por encima del fondo.
Las tecnologías de expresión génicas pueden ser útiles en varios áreas del descubrimiento y desarrollo de fármacos, tal como identificación diana, optimización de plomo, e identificación de los mecanismos de acción. La tecnología TaqMan se puede usar para comparar las diferencias entre los perfiles de expresión de tejido normal y tejido enfermo. El perfil de expresión se ha usado en la identificación de genes, que regulan hacia arriba o hacia abajo una diversidad de enfermedades. Una aplicación interesante del perfil de expresión es el control temporal de los cambios en la expresión génica durante la progresión de la enfermedad y tratamiento por fármacos o en pacientes frente a los individuos sanos. La premisa en este planteamiento es que cambia en el patrón de la expresión génica en respuesta a los estímulos fisiológicos o ambientales (por ejemplo, fármacos) pueden servir como indicios indirectos sobre los genes que provocan enfermedades o dianas de fármacos. Además, los efectos de los fármacos con eficacia establecida sobre los patrones de expresión génica global puede proporcionar un indicador de o una firma genética, contra la que se puede comparar un nuevo candidato de fármaco.
C5AR
La secuencia de nucleótidos de C5AR está accesible en las bases de datos de públicas mediante el número de acceso NM_001736 y se proporciona en la SEO ID NO: 1. las secuencia de aminoácidos de C5AR se muestra en la SEO ID NO:2.
Usando un panel de híbridos de células somáticas, Bao et al. (1992) mapearon el receptor para el ligando del receptor quimiotáctico C5a al cromosoma 19. Este receptor, como aquellos para los péptidos formilo e interleuquina-8, está relacionado de manera estructural con la rodopsina (RHO) y transluce las señales por medio de las proteínas de unión a GTP intracelulares. De manera adicional, este receptor es similar al receptor de tipo 1 de quimioquina.
Hopken et al. (1996) suprimieron el receptor C5a murino (C5ar) mediante recombinación homóloga. Reseñaron que los ratones deficientes en C5ar no mostraron defectos de desarrollo o biológico en las células en las que se expresa C5a (por ejemplo, linajes de células mieloides, hepatocitos, y células epiteliales) además de la capacidad de unirse y señalar C5a exógeno. Hopken et al. (1996) reseñaron que los ratones deficientes en C5ar alimentados de manera normal y que no mostraban defectos ordinarios cuando se mantenían en condiciones límite. Cuando los ratones se expusieron con Pseudomonas aeruginosa intratraqual, los ratones deficientes en C5ar, por el contrario a sus compañeros de carnada, eran incapaces de eliminar las bacterias y sucumbieron a la neumonía. En base a estos estudios, Hopken et al. (1996) concluyeron que C5ar tiene una función no redundante y se requiere para la defensa de células huésped mucosales en el pulmón.
Usando los análisis de microensayos de la expresión génica pulmonar y determinación de genotipo basado en polimorfismo de nucleótidos individuales (SNP), Karp et al. (2000) identificaron C5 en el cromosoma 2 de ratones como una susceptibilidad del locus a la hipersensibilidad de las vías respiratorias inducida por alérgeno en un modelo de ratón de asma. El análisis de retrocruzamiento y SNP mostró que una supresión de 2 pares de bases en el gen C5 de ratones AIJ y AKRIJ condujeron a deficiencia en C5, que se relaciona con la hipersensibilidad de las vías respiratorias, mientras que las cepas suficientes en C5 no desarrollaron asma. Los estudios previos habían mostrado que la administración de IL12 a ratones susceptibles les hace resistentes a la inducción de asma (Gavett et al., 1995). El bloqueo de C5R1 en monocitos humanos provocado por la inhibición marcada, dependiente de la dosis de la producción de IL12, así como la inhibición de la secreción de TNFA y supresión mediada por IFNG de la producción de IL10, aunque no existía efecto global sobre la producción de IL10. Estos resultados sugirieron que la deficiencia en C5 conduce e un fenotipo antiinflamatorio. Karp et al. (2000) indicaron que las selecciones por amplitud del genoma previas habían encontrado evidencia de unión de la susceptibilidad de asma a las regiones cromosómicas de C5 (Ober et al., 1998; Wjst et al., 1999) y C5R1 (Collaborative Study on the Genetics of Asthma, 1997; Ober et al.,
1998).
El tratamiento preisquémico con el antagonista del receptor C5a (C5aR) (1 mg/kg IV o 10 mg/kg PO) inhibió o previno sustancialmente la hematuria inducida por I/R, derrame vascular, niveles de tejido de TNF-alpha y MPO, y niveles en suero de AST y creatinina. El examen histológico de riñones de animales I/R previamente tratados con antagonista mostraron una reducción notable en el tejido dañado comparado con las ratas I/R sin fármaco. Sin embargo el antagonista, no inhibió la tisis mediada por complemento de los glóbulos rojos, lo que sugiere la formación intacta del complejo de ataque a membrana (MAC) [Arumugam et al. (2003)].
En los riñones normales, Abe et al. (2001) detectaron la proteína C5aR en las células epiteliales tubulares, mientras que el ARNm de C5aR se detectó en unas pocas células glomerulares, células epiteliales tubulares, y células endoteliales vasculares y del músculo liso. En MCNS, la distribución de la proteína y ARNm de C5aR era similar a la de los riñones normales. En MN y mesGN, la proteína y ARNm de C5aR se detectaron en las células mesangiales, células epiteliales y endoteliales glomerulares, células de la cápsula de Bowman, células tubulares, células infiltrantes, y células endoteliales vasculares y del músculo liso. La expresión glomerular de la proteína y ARNm de C5aR está correlacionado de manera positiva con el grado de hipercelularidad mesangial y expansión de la matriz mesangial en mesGN.
En el tubulointerstitium, la expresión intersticial del ARNm de C5aR estaba correlacionada positivamente con el grado de atrofia tubular y ensanchamiento intersticial en mesGN. Además, la expresión intersticial de ARNm de C5aR estaba correlacionada positivamente con el nivel de creatinina en suero. Los resultados indican que las células renales producen C5aR y que la inactivación de la ruta C5a1C5aR en las células renales puede estar implicada en la lesión de tejidos en mesGN [Abe et al. (2001)].
El receptor C5AR se publica en el documento US 5861272. C5AR muestra la mayor homología (38%) al receptor humano C5L2 como se muestra en el ejemplo 1.
Otras dianas para la selección de agentes terapéuticos para el tratamiento de insuficiencia cardíaca se describen en el documento WO 0309 4856.
Sumario de la invención
La invención se refiere a asociaciones patológicas novedosas de polipéptidos y polinucleótidos de C5AR. La invención también se refiere a procedimientos novedosos de selección de agentes terapéuticos para el tratamiento de insuficiencia cardíaca.
Breve descripción de los dibujos
La Fig.1 muestra la secuencia de nucleótidos de un polinucleótido del receptor de C5R1 (SEO ID NO: 1).
La Fig. 2 muestra la secuencia de aminoácidos del polipéptido del receptor C5R1 (SEO ID NO:2).
La Fig. 3 muestra la secuencia de nucleótidos de un cebador útil para la invención (SEO ID NO:3).
La Fig. 4 muestra la secuencia de nucleótidos de un cebador útil para la invención (SEO ID NO:4).
La Fig. 5 muestra una secuencia de nucleótidos útil como una sonda para detectar proteínas de la invención (SEO ID NO:5).
Descripción detallada de la invención Definición de términos
Un "oligonucleótido" es un tramo de restos de nucleótidos que tiene un número suficiente de bases a usar como un oligómero, amplímero o sonda en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los oligonucleótidos se preparan a partir de secuencias de ADNc genómico y se usan para amplificar, revelar, o confirmar la presencia de un ADN o ARN similar en una célula o tejido particular. Los oligonucleótidos u oligómeros comprenden partes de una secuencia de ADN que tiene al menos aproximadamente 10 nucleótidos y como mucho aproximadamente 35 nucleótidos, preferiblemente aproximadamente 25 nucleótidos.
"Sondas" se pueden derivar de ácidos nucleicos de una sola cadena o de cadena doble recombinante o se puede sintetizar químicamente. Son útiles en la detección de la presencia de secuencias idénticas o similares. Tales sondas se pueden marcar con moléculas indicadoras usando desplazamiento de mella, reacción de relleno de Klenow, PCR u otros procedimientos bien conocidos en la técnica. Las sondas de ácido nucleico se pueden usar en hibridaciones southern, northern o in situ para determinar si ADN o ARN que codifica una cierta proteína está presente en un tipo de célula, tejido, u órgano.
Un "fragmento de un polinucleótido" es un ácido nucleico que comprende toda o cualquier parte de una molécula de nucleótido dado, teniendo el fragmento menos nucleótidos que aproximadamente 6 kb, preferiblemente menos de aproximadamente 1 kb.
"Moléculas indicadoras" son radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes, o cromogénicas que se asocian a una secuencia de nucleótidos o aminoácidos particular, estableciendo por lo tanto la presencia de una cierta secuencia, o permitiendo la cuantificación de una cierta secuencia.
Moléculas "quiméricas" se pueden construir mediante la introducción de toda o parte de la secuencia de nucleótidos de esta invención en un vector que contiene la secuencia de ácidos nucleicos adicional que se puede esperar que cambie cualquiera o varias de las siguientes características de C5AR: localización celular, distribución, afinidades de unión a ligando, afinidades intercadena, tasa de degradación/intercambio, señalización, etc.
"Activo" con respecto a un polipéptido de C5AR se refiere a aquellas formas, fragmentos, o dominios de un polipéptido de C5AR que retienen la actividad biológica y/o antigénica de un polipéptido de C5AR.
"Polipéptido de C5AR de origen natural" se refiere a un polipéptido producido por las células que no se han modificado por ingeniería genética y de manera específica contempla diversos polipéptidos que surgen de las modificaciones después de la traducción del polipéptido que incluye pero no se limita a acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación y acilación.
"Derivado" se refiere a polipéptidos que se han modificado de manera química mediante técnicas tales como ubiquitinación, marcado (véase anteriormente), pegilación (derivación con polietilen glicol), e inserción o substitución química de aminoácidos tales como ornitina que no aparecen de manera natural en las proteínas humanas.
"Las sustituciones" de aminoácidos conservadoras se producen por reemplazo de un aminoácido con otro que tiene propiedades estructurales y/o químicas similares, tal como el reemplazo de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, o treonina con una serina.
"Inserciones" o "supresiones" están típicamente en el intervalo de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida se puede determinar experimentalmente produciendo el péptido de manera sintética mientas que se producen de manera sistémica las inserciones, supresiones, o sustituciones de nucleótidos en la secuencia que usa técnicas de ADN recombinante.
Una "secuencia de señal" o "secuencia guía" se puede usar, cuando se desee, para dirigir al polipéptido a través de una membrana de una célula. Tal secuencia se puede presentar naturalmente sobre los polipéptidos de la presente invención o proporcionar a partir de las fuentes heterólogas mediante técnicas de ADN recombinantes.
Un "oligopéptido" es un tramo corto de restos de aminoácidos y se pueden expresar a partir de un oligonucleótido. Oligopéptidos comprenden un tramo de restos de aminoácidos de al menos 3, 5, 10 aminoácidos y la mayoría 10, 15, 25 aminoácidos, típicamente de al menos 9 a 13 aminoácidos, y de suficiente longitud para mostrar la actividad biológica y/o antigénica.
"Inhibidor" es cualquier sustancia que retrasa o previene una reacción o respuesta química o fisiológica. Los inhibidores comunes incluyen pero no se limitan a moléculas no codificantes, anticuerpos, y antagonistas.
"Expresión estándar" es una medida cuantitativa o cualitativa para comparación. Se basa en un número estadísticamente apropiado de muestras normales y se crea para usar como base de comparación cuando se realizan ensayos de diagnóstico, desarrollo de ensayos clínicos, o siguiendo los perfiles de tratamiento del paciente.
"Animal" como se usa en el presente documento se puede definir para que incluya especies humana, domésticas (gatos, perros, etc.), agrícolas (vacas, caballos, ovejas, etc.) o especies de ensayo (ratón, rata, conejo, etc.).
"Un polipéptido de C5AR", usado en la invención, se deberá entender como que es una molécula de ácido nucleico seleccionada entre un grupo constituido por
(i)
moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprenden la secuencia de aminoácidos de la SEO ID NO: 2,
(ii)
moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de SEO ID NO: 1,
(iii)
moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia de SEO ID NO: 1,
(iv)
moléculas de ácido nucleico la hebra complementaria de la que se hibrida en condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico de (i), (ii), o (iii); y
(v)
moléculas de ácido nucleico la secuencia de la cual difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico (iii) debido a la degeneración del código genético;
en el que el polipéptido codificado por dicha molécula de ácido nucleico tiene actividad de C5AR.
Un "polipéptido de C5AR", usado en la invención, se deberá entender como que es un polipéptido seleccionado entre un grupo constituido por
(i)
polipéptidos que tienen la secuencia de SEO ID NO: 2,
(ii)
polipéptidos que comprende la secuencia de SEO ID NO: 2,
(iii)
polipéptidos codificada por los polinucleótidos de C5AR; y
(iv)
polipéptidos que muestran al menos 99%, 98%, 95%, 90%, u 80% de homología con un polipéptido de (i), (ii), o (iii);
en el que dicho polipéptido tiene actividad C5AR.
Las secuencias de nucleótidos que codifican C5AR (o su complemento) tienen numerosas aplicaciones en las técnicas conocidas por los expertos en la técnica e la biología molecular. Estas técnicas incluyen el uso de sondas de hibridación, uso en la construcción de oligómeros para la PCR, uso para el mapeado de cromosomas y genes, uso en la producción recombinante de C5AR, y uso en la generación de ADN o ARN no codificante, sus análogos químicos y similares. Usos de nucleótidos que codifican C5AR descritos en el presente documento son ejemplares de las técnicas conocidas y no se pretende que limiten su uso en cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica. Además, las secuencias de nucleótidos descritas en el presente documento se pueden usar en las técnicas de biología molecular que no se han desarrollado todavía, con la condición que las nuevas técnicas que dependen de las propiedades de las secuencias de nucleótidos que se conocen actualmente, por ejemplo, el código genético de tripletes, interacciones de pares de bases específicas, etc.
Los expertos en la técnica apreciarán que como resultado de la degeneración del código genético, se pueden producir una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican C5AR. Algunas de éstas solamente tendrán una homología mínima con la secuencia de nucleótidos de C5AR conocida y de origen natural. La descripción ha contemplado específicamente cada una y toda variación posible de la secuencia de nucleótidos que se podría preparar mediante la selección de combinaciones basándose e las elecciones de codones posibles. Estas combinaciones se preparan de acuerdo con el código genético de tripletes convencional cuando se aplica a la secuencia de nucleótidos de C5AR de origen natural, y todas estas variaciones se han de considerar como que se describen de manera específica.
Aunque las secuencias de nucleótidos que codifican C5AR, sus derivados o sus variantes son preferiblemente capaces de hibridarse a la secuencia de nucleótidos del C5AR de origen natural en condiciones rigurosas, puede ser ventajoso para producir secuencias de nucleótidos que codifican C5AR o sus derivados que poseen un uso de codón sustancialmente diferente.
Los codones se pueden seleccionar para incrementar la tasa a la que la expresión del péptido se produce en un huésped de expresión particular procariótico o eucariótico de acuerdo con la frecuencia con la que los codones particulares se utilizan por el huésped. Otras razones para alterar de manera sustancial la secuencia de nucleótidos que codifican C5AR y/o sus derivados sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada incluyen la producción de las transcripciones de ARN que tienen propiedades más deseables, tal como una mayor semivida, que las transcripciones producidas a partir de la secuencia de origen natural.
Las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de C5AR se pueden acoplar a una diversidad de otras secuencias de nucleótidos mediante medios de las técnicas de ADN recombinante establecidas. Las secuencias de nucleótidos útiles para acoplarse a C5AR incluyen una colección de vectores de clonación tales como plásmidos, cósmidos, derivados del fago lambda, fagémidos, y similares. Los vectores de interés incluyen vectores de expresión, vectores de replicación, vectores de generación de sondas, vectores de secuenciación, etc. En general, los vectores de interés pueden contener un origen de replicación funcional en al menos un organismo, sitios sensibles a la endonucleasa de restricción, y marcadores que se pueden seleccionar de uno o más sistemas de células huésped.
Otro aspecto de la invención sujeto es proporcionar sondas de hibridación específicas de C5AR capaces de hibridarse con secuencias de nucleótidos de origen natural que C5AR. Tales sondas también se pueden usar para la detección de secuencias que codifican GPCR similares y deben contener preferiblemente al menos un 40% de identidad de nucleótidos con el polipéptido de C5AR. Las sondas de hibridación de la invención sujeto se pueden derivar a partir de la secuencia de nucleótidos presentada como la SEQ. ID NO: 1 o a partir de secuencias genómicas que incluyen promotor, potenciadores o intrones del gen nativo. Las sondas de hibridación se pueden marcar mediante una diversidad de moléculas indicadoras usando las técnicas bien conocidas en la técnica.
Se reconocerá que muchos análogos de supresión o de mutación de secuencias de polinucleótidos de C5AR serán sondas de hibridación eficaces para los polinucleótidos de C5AR. De acuerdo con lo anterior, la descripción se refiere a secuencias de ácidos nucleicos que se hibridan con tales secuencias de ácidos nucleicos que codifican C5AR en condiciones rigurosas.
"Condiciones rigurosas" se refiere a las condiciones que permiten la hibridación de secuencias de ácido nucleico relacionadas sustancialmente. Por ejemplo, tales condiciones en general permitirán la hibridación de la secuencia con al menos un 85% de identidad de secuencias, preferiblemente con al menos aproximadamente 90% de identidad de secuencias, más preferiblemente con al menos aproximadamente un 95% de identidad de secuencia. Las condiciones y sondas de hibridación se pueden ajustar de formas bien caracterizadas para lograr la hibridación selectiva de sondas derivadas humanas. Las condiciones rigurosas dentro del significado de la invención son 65°C en un tampón que contiene 1 mM EOTA, 0,5 M NaHPO_{}4 (pH 7,2), 7% (p/v) SDS.
Las moléculas de ácido nucleico que se hibridarán a los polinucleótidos de C5AR en condiciones rigurosas se pueden identificar de manera funcional. Sin limitación, los ejemplos de los usos para sondas de hibridación incluyen: usos histoquímicos tales como identificación de tejidos que expresan C5AR; medición de los niveles de ARNm, por ejemplo para identificar un tipo de tejido de muestra o para identificar células que expresan niveles anormales de C5AR; y detección de polimorfismos de C5AR.
La PCR proporciona usos adicionales para los oligonucleótidos basándose en la secuencia de nucleótidos que codifica C5AR. Tales sondas usadas en la PCR pueden ser de origen recombinante, sintetizadas químicamente, o una mezcla de ambos. Los oligómeros pueden comprender secuencias de nucleótidos discretas empleadas en condiciones optimizadas para la identificación del C5AR en tejidos específicos o uso de diagnóstico. Los mismos dos oligómeros, un conjunto jerarquizado de oligómeros, o incluso un conjunto degenerado de oligómeros se puede emplear en condiciones menos rigurosas para la identificación de los ADN o ARN relacionados estrechamente.
Las reglas para diseñar los cebadores de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se establecen ahora, como revisión por Protocolos de PCR. Cebadores degenerados, es decir, preparaciones de cebadores que son heterogéneos en localizaciones de secuencias dadas, se pueden diseñar para amplificar secuencias de ácidos nucleicos que son altamente homólogas con, pero no idénticas a C5AR. Las estrategias están ahora disponibles para permitir que solamente uno de los cebadores se requiera para hibridarse de manera específica con una secuencia conocida. Por ejemplo, cebadores de ácido nucleico apropiadas se pueden ligar al ácido nucleico pretendido que se va a amplificar para proporcionar la pareja de hibridación para uno de los cebadores. De esta forma, solamente uno de los cebadores necesitan basarse en la secuencia del ácido nucleico previsto amplificar.
Los procedimientos de la PCR para amplificar ácido nucleico utilizarán al menos dos cebadores. Uno de estos cebadores será capaz de hibridarse a una primera hebra del ácido nucleico a amplificar y de cebado de la síntesis de ácido nucleico dirigida por enzimas en una primera dirección. El otro será capaz de hibridar la secuencia recíproca de la primera hebra (si la secuencia a amplificar es de una sola cadena, esta secuencia será inicialmente hipotética, pero se sintetizará en el primer ciclo de amplificación) y cebado de la síntesis de ácido nucleico a partir de esa hebra en la dirección opuesta a la primera dirección y hacia el sitio de hibridación para el primer cebador. Las condiciones para conducir tales amplificaciones, particularmente en condiciones de hibridación rigurosas preferidas son bien conocidas.
Otros medios de producción de sondas de hibridación específicas para C5AR incluyen la clonación de secuencias de ácido nucleico que codifican C5AR o derivados de C5AR en los vectores para la producción de sondas de ARNm. Tales vectores se conocen en la técnica, están comercialmente disponibles y se pueden usar para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de la ARN polimerasa como la ARN polimerasa de T7 o SP6 y las moléculas indicadoras apropiadas.
Es posible producir una secuencia de ADN, o sus porciones, completamente mediante la química de síntesis. Después de la síntesis, la secuencia de ácido nucleico se puede insertar en cualquiera de los muchos vectores de ADN disponibles y las respectivas células huésped usando técnicas bien conocidas en la técnica. Además, la química sintética se puede usar para introducir mutaciones en la secuencia de nucleótidos. Como alternativa, una parte de la secuencia en la que una mutación se desea se puede sintetizar y recombinar con una parte más larga de una secuencia genómica o recombinante existente.
Los polinucleótidos de C5AR se pueden usar para producir un oligo- o polipéptido purificado usando procedimientos bien conocidos de la tecnología de ADN recombinante. El oligopéptido se puede expresar en una diversidad de células huésped, o bien procarióticas o eucarióticas. Las células huésped pueden ser de la misma especie a partir de la que se derivó la secuencia de nucleótidos o a partir de especies diferentes. Las ventajas de producir un oligonucleótido mediante tecnología de ADN recombinante incluyen la obtención de cantidades adecuadas de la proteína para la purificación y la disponibilidad de procedimientos de purificación simplificados.
Determinación cuantitativa de ácidos nucleicos
Una etapa importante en el análisis de genética molecular de enfermedad humana es a menudo la enumeración del número de copias de un ácido nucleico o la expresión relativa de un gen en tejidos particulares.
Están actualmente disponibles varios planteamientos diferentes para preparar determinaciones cuantitativas de ácidos nucleicos. Las técnicas basadas en cromosomas, tales como hibridación genómica comparativa (CGH) e hibridación in situ fluorescente (FISH) facilitan los esfuerzos para localizar de manera citogenética regiones genómicas que están alteradas en las células tumorales. Las regiones de alteración genómica se pueden estrechar además de usar la pérdida de análisis de heterocigosidad (LOH), en la que el ADN enfermo se analiza y se compara con el ADN normal para evaluar la pérdida de un marcador polimórfico heterocigótico. Los primeros experimentos usados en los polimorfismos en la longitud del fragmento de restricción (RFLP) [Johnson et al], o ADN de minisatélites hipervariables [Barnes et al]. En los años recientes LOH se ha realizado principalmente usando la amplificación por PCR de marcadores de microsatélites y electroforesis de los productos de la PCR radiomarcados [Jeffreys et al] o marcados fluorescentemente [Weber et al] y se comparan con los ADN normal y enfermo.
También se han desarrollado un número de procedimientos diferentes para cuantificar los ácidos nucleicos [Gergen et al, (1992)]. Más recientemente, se han desarrollado procedimientos para PCR y RT-PCR que son capaces de medir la cantidad de un ácido nucleico en una muestra. Un planteamiento, por ejemplo, mide la cantidad de un producto de la PCR en la fase logarítmica de la reacción antes de la formación de las mesetas de productos de reacción [Thomas et al, (1950)].
Una secuencia génica contenida en todas las muestras a cantidad relativamente constante se utiliza típicamente para la normalización de la eficacia de amplificación de la muestra. Sin embargo, este planteamiento, sufre varios inconvenientes. El procedimiento requiere que cada muestra tenga cantidades iguales de entrada del ácido nucleico y que la eficacia de amplificación entre muestras sea idéntica hasta el momento del análisis. Además, es difícil usar los procedimientos convencionales de la cuantificación de la PCR tal como electroforesis de gel o hibridación de captura en placa para determinar que todas las muestras se analizan de hecho durante la fase logarítmica de la reacción como se requiere por el procedimiento.
Otro procedimiento llamado (QC)-PCR cuantitativo competitivo, como el nombre implica, depende de la inclusión de un competidor de control interno en cada reacción [Maniatis et al, Becker-Andre et al, Piatak et al in BioTechniques (1993)]. La eficacia de cada reacción se normaliza al competidor interno. Se añade típicamente una cantidad conocida de competidor interno. El producto de la PCR diana desconocido se compara con el producto de la PCR competidor desconocido para obtener una cuantificación relativa. Una dificultad a este planteamiento general depende del desarrollo de un control interno que se amplifica con la misma eficacia que la molécula diana.
Ensayos de la nucleasa 5' Fluorogénica
Los ensayos de la nucleasa fluorogénica son un procedimiento de cuantificación a tiempo real que usa una sonda para controlar la formación del producto de amplificación. La base de este procedimiento de control de la formación del producto de amplificación. La base de este procedimiento de control de la formación del producto de amplificación es medir la acumulación de manera continua del producto de la PCR usando una sonda de oligonucleótidos fluorogénica marcada doble, un planteamiento frecuentemente mencionado en la bibliografía simplemente como el "Procedimiento TaqMan" [Piatak (1993), Science, Heid, (1996); Gibson, (1996); Holland (1991)].
La sonda usada en tales ensayos es típicamente un oligonucleótido corto (de aproximadamente 20 - 25 bases) que está marcado con dos tintes fluorescentes diferentes. El extremo 5' de la sonda se une a un tinte indicador y el extreme 3' se une a un tinte de inactivación, aunque los tintes se pueden unir a otras localizaciones sobre la sonda también. La sonda se diseña para que tenga al menos una complementariedad de secuencia sustancial con el sitio de unión a la sonda. Los cebadores de la PCR cadena arriba y cadena abajo que se unen a las regiones de flanqueo del locus se añaden a la mezcla de reacción. Cuando la sonda está intacta, se produce la transferencia la transferencia de energía entre los dos fluoróforos y el inactivador inactiva la emisión a partir del indicador. Durante la fase de extensión de la PCR, la sonda se escinde mediante la actividad de la nucleasa en 5' de una polimerasa de ácido nucleico tal como la Taq polimerasa, liberando por lo tanto el indicador del inactivador de oligonucleótidos y dando como resultado un incremento de intensidad de emisión del indicador que se puede medir mediante un detector
apropiado.
Un detector que se adapta de manera específica para medir las emisiones de fluorescencia tales como las creadas durante un ensayo fluorogénico es el ABI 7700 ó 4700 HT fabricados por Applied Biosystems, Inc. in Foster City, Calif. El ABI 7700 usa fibra óptica conectada a cada pocillo en una disposición de tubos de la PCR de 96 ó 384 pocillos. El instrumento incluye un láser para excitar las etiquetas y es capaz de medir la intensidad del espectro fluorescente a partir de cada tubo con el control continuo durante la amplificación por PCR. Cada tubo se vuelve a examinar cada 8,5 segundos.
El software de ordenador proporcionado con el instrumento es capaz de registrar la intensidad de fluorescencia del indicador e inactivador durante el curso de la amplificación. Los valores registrados se usarán después para calcular el incremento en la intensidad de emisión normalizado en una base continua. El incremento en intensidad de emisión se representa gráficamente frente al tiempo, es decir, el número de ciclos de amplificación, para producir una medición continua de la amplificación. Para cuantificar el locus en cada reacción de amplificación, el gráfico de amplificación se examina en un punto durante la fase logarítmica de la acumulación del producto. Esto se lleva a cabo mediante la asignación de una intensidad de umbral de fluorescencia por encima del fondo y determinando el punto en el que cada gráfico de amplificación cruza el umbral (definido como el número de ciclos de umbral o Ct). Las diferencias en el número de ciclos umbral se usan para cuantificar la cantidad relativa de diana de PCR contenida dentro de cada tubo. Asumiendo que cada función de reacción a 100% de eficacia de PCR, una diferencia de un valor de Ct representa una diferencia de dos veces en la cantidad del molde de partida. El valor de fluorescencia se puede usar junto con una curva patrón para determinar la cantidad del producto de amplificación presente.
Procedimientos de detección basados en no sonda
Está disponible una diversidad de opciones para medir los productos de amplificación a medida que se forman. Un procedimiento utiliza etiquetas, tales como tintes, que solamente se unen a ADN de cadena doble. En este tipo de planteamiento, el producto de amplificación (que es de cadena doble) se une a moléculas de tinte en solución para formar un complejo. Con los tintes apropiados, es posible distinguir entre las moléculas de tinte libres en solución y las moléculas de tinte unidas al producto de amplificación. Por ejemplo, ciertos tintes son fluorescentes solamente cuando se unen al producto de amplificación. Los ejemplos de tintes que se pueden usar en procedimientos de este tipo general incluyen, pro no se limitan a, Syber Green.TM. y Pico Green de Molecular Probes, Inc. of Eugene, Oreg., bromuro de etidio, yoduro de propidio, cromomicina, acridina naranja, Hoechst 33258, Toto-1, Yoyo-1, DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol clorhidrato).
Otra técnica de detección de tiempo real mide la alteración en la transferencia de la energía de fluorescencia entre fluoróforos conjugada con los cebadores de PCR [Livak et al. (1995)].
Procedimientos de detección basados en sonda
Estos procedimientos de detección implican alguna alteración a la estructura o conformación de una sonda hibridaza al locus entre el par de cebadores de amplificación. En algunos casos, la alteración está provocada por la extensión dependiente del molde catalizada por una polimerasa de ácido nucleico durante el procedimiento de amplificación. La alteración genera una señal detectable que es una medida indirecta de la cantidad de producto de amplificación formado.
Por ejemplo, algunos procedimientos implican la degradación o digestión de la sonda durante la reacción de extensión. Estos procedimientos son consecuencia de la actividad de la nucleasa en 5'-3' asociada a algunas polimerasas de los ácidos nucleicos. Las polimerasas que tienen esta actividad escinden los mononucleótidos u oligonucleótidos pequeños a partir de una sonda de oligonucleótidos hibridaza a su secuencia complementaria localizada dentro del locus.
El extremo 3' del cebador cadena arriba proporciona el sitio de unión inicial para la polimerasa de ácido nucleico. A medida que la polimerasa cataliza la extensión del cebador cadena arriba y se encuentra con la sonda de unión, la polimerasa del ácido nucleico desplaza una parte del extremo 5' de la sonda y a través de su actividad de nucleasa escinde los mononucleótidos u olgonucleótidos de la sonda.
El cebador cadena arriba de la sonda se pueden diseñar de manera que se hibriden a la hebra complementaria en estrecha proximidad entre sí. De hecho, el extremo 3' del cebador cadena arriba y el extremo 5' de la sonda puede terminar en otra. En esta situación, la extensión del cebador cadena arriba no es necesaria con el fin de que la polimerasa de ácido nucleico comience a escindir la sonda. En el caso en el que en el que los nucleótidos que intervienen separan el cebador cadena arriba y la sonda, la extensión del cebador es necesaria antes de que la polimerasa de ácido nucleico encuentre el extremo 5' de la sonda. Una vez se produce el contacto y continúa la polimerización, la actividad de la exonucleasa 5'-3' de la polimerasa del ácido nucleico comienza a escindir los mononucleótidos u oligonucleótidos a partir del extremo 5' de la sonda. La digestión de la sonda continúa hasta que la parte restante de la sonda se disocia de la hebra complementaria.
En solución, las dos secciones del extreme se pueden hibridar entre sí para formar un bucle de horquilla. En esta conformación, el tinte indicador e inactivador están en proximidad lo suficientemente próxima que es fluorescente a partir del tinte indicador se inactiva de manera eficaz por el tinte inactivador. La sonda hibridaza, por el contrato, da como resultado una conformación linealizada en la que el grado de inactivación disminuye. De este modo, mediante control de los casos de emisión para los dos tintes, es posible controlar de manera indirecta la formación del producto de amplificación.
Sondas
La sonda marcada se selecciona de manera que su secuencia sea sustancialmente complementaria a un segmento del locus de ensayo o un locus de referencia. Como se ha indicado anteriormente, el sitio del ácido nucleico al que la sonda se une de debe localizar entre los sitios de unión del cebador para los cebadores de amplificación cadena arriba y cadena abajo.
Cebadores
Los cebadores usados en la amplificación se seleccionan de manera que sean capaces de hibridarse a las secuencias de en las regiones flanqueantes del locus que se están amplificando. Los cebadores se eligen para que tengan al menos complementariedad sustancial con las diferentes hebras de los ácidos nucleicos que se están amplificando. Cuando una sonda se utiliza para detectar la formación de los productos de amplificación, los cebadores e seleccionan de tal manera que flanquean la sonda, es decir, se localizan cadena arriba y cadena debajo de la sonda.
El cebador debe tener una longitud suficiente de manera que sea capaz de de cebar la síntesis de los productos de extensión en la presencia de un agente para la polimerización. La longitud y composición del cebador depende de muchos parámetros, incluyendo, por ejemplo, la temperatura a la que la reacción de hibridación se lleva a cabo, proximidad del sitio de unión de la sonda a la del cebador, concentraciones relativas del cebador y sonda y la composición del ácido nucleico particular de la sonda. Típicamente el cebador incluye 15 - 30 nucleótidos. Sin embargo, la longitud del cebador puede ser más o menos dependiente de la complejidad del sitio de unión del cebador y los factores listados anteriormente.
Etiquetas para sondas y cebadores
Las marcas usadas para marcar las sondas o cebadores de la invención actual pueden proporcionar la señal correspondiente a la cantidad del producto de amplificación pueden tomar una diversidad de formas. Como se ha indicado anteriormente con relación a I procedimiento de nucleasa 5' fluorogénica, una señal fluorescente es una señal que se puede medir. Sin embargo, también se pueden realizar mediciones, por ejemplo, controlando la radiactividad, colorimetría, absorción, parámetros magnéticos, o actividad enzimática. De este modo, las etiquetas que se pueden emplear incluyen, pero no se limitan a, fluoróforos, cromóforos, isótopos radiactivos, reactivos de densidad de electrones, enzimas, y ligandos que tienen parejas de unión específica (por ejemplo, biotina-avidina).
El control de cambios en la fluorescencia es una forma particularmente útil para controlar la acumulación de los productos de amplificación. Un número de etiquetas útiles para la unión a sondas o cebadores están comercialmente disponibles incluyendo fluoresceína y diversos derivados de fluoresceína tales como FAM, HEX, TET y JOE (todos los cuales están disponibles a partir de Applied Biosystems, Foster City, California); amarillo de lucifer, y derivados de cumarina.
Las marcas pueden estar unidas a la sonda o cebador usando una diversidad de técnicas y se puede unir al extremo 5', y/o el extremo 3' y/o en un nucleótido interno. La etiqueta también se puede unir a brazos de espaciador de diversos tamaños que están unidos a la sonda o cebador. Estos brazos espaciadores son útiles para obtener una distancia deseada entre múltiples etiquetas unidas a la sonda o cebador.
En algunos casos, se puede utilizar una sola etiqueta; mientras, en otros casos, tales como con los ensayos de nucleasa 5' fluorogénica por ejemplo, dos o más etiquetas están unidas a la sonda. En los casos en los que la sonda incluye múltiples etiquetas, es en general aconsejable para mantener el espacio entre las etiquetas que es suficiente para permitir la separación de las etiquetas durante la digestión de la sonda mediante la actividad de la nucleasa 5'-3' de la secuencia de la polimerasa de ácido nucleico.
Pacientes que muestran síntomas de Enfermedad
Un número de enfermedades están asociadas a los cambios en el número de copias de un cierto gen. Para los pacientes que tienen síntomas de una enfermedad, el procedimiento de la PCr de tiempo real se puede usar para determinar si el paciente tiene alteraciones del número de copia que se sabe que están unidas a enfermedades que están asociadas a los síntomas que tiene el paciente.
Expresión de C5AR Proteínas de fusión C5AR
Las proteínas de fusión son útiles para generar anticuerpos contra las secuencias de aminoácidos de C5AR y para uso en diversos sistemas de ensayo. Por ejemplo, proteínas de fusión se pueden usar para identificar proteínas que interactúan con partes del péptido C5AR. Los ensayos de cromatografía de proteína o basados en genotecas para las interacciones proteína - proteína, tales como los sistemas de dos híbridos de levaduras o de despliegue en fago, se pueden usar para este propósito. Tales procedimientos se conocen bien en la técnica y también se pueden usar como selecciones de fármaco.
Una proteína de fusión de C5AR comprende dos segmentos de polipéptidos condensados conjuntamente mediante un enlace de péptido. El primer segmento de polipéptido puede comprender al menos 54, 75, 100, 125, 139, 150, 175, 200, 225, 250, ó 275 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:2 o de una variante biológicamente activa, tales como los descritos anteriormente. El primer segmento de polipéptido también comprende C5AR de longitud
completa.
El segundo segmento de polipéptido puede ser una proteína de longitud completa o fragmento de proteína. Las proteínas usadas comúnmente en la construcción de la proteína de fusión incluyen, pero no se limitan a, \beta-galactosidasa, \beta-glucuronidasa, proteína fluorescente verde (GFP), proteínas autofluorescentes, incluyendo la proteína fluorescente azul (BFP), glutatión-S-transferasa (GST), luciferasa, peroxidasa de rábano picante (HRP), y cloramfenicol acetiltransferasa (CAT). De manera adicional, las etiquetas de epítopes se usan en las construcciones de proteínas de fusión, incluyendo etiquetas de histidina (His), etiquetas de FLAG, etiquetas de hemaglutinina de gripe(HA), etiquetas Myc, etiquetas VSV-G, y etiquetas tioredoxina (Trx). Otras construcciones de fusión pueden incluir proteína de unión a maltosa (MBP), etiqueta S, fusiones de Lex un dominio de unión a ADN (DBD), fusiones de dominio de unión de ADN GAL4, fusiones de proteína BP16 de virus herpes simplex (HSV) y fusiones de proteína G (por ejemplo G (alfa)16, Gs, Gi). También se puede modificar por ingeniería genética una proteína de fusión para que contenga un sitio de escisión localizado adyacente a la C5AR.
Preparación de Polinucleótidos
Un polinucleótido de C5AR de origen natural se puede aislar sin otros componentes celulares tales como componentes de membrana, proteínas, y lípidos. Los polinucleótidos se pueden preparar por una célula y aislarse usando técnicas de purificación de ácido nucleico, o sintetizarse usando una técnica de amplificación, tal como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o mediante el uso de un sintetizador automático. Los procedimientos para aislar polinucleótidos son rutinarios y se conocen en la técnica. Cualquier técnica para obtener un polinucleótido se puede usar para obtener polinucleótidos de C5AR. Por ejemplo, se pueden usar enzimas de restricción y sondas para aislar fragmentos de polinucleótidos que comprende secuencias de nucleótidos de C5AR. Los polinucleótidos aislados están en las preparaciones que están libres de al menos 70, 80, o 90% de otras moléculas.
Las moléculas de ADNc de C5AR se pueden preparar con técnicas de biología molecular convencionales usando ARNm de C5AR como molde. Las moléculas de ADNc de C5AR se pueden después replicar usando las técnicas de biología molecular conocidas en la técnica. Se puede usar una técnica de amplificación, tal como PCR para obtener copias adicionales de polinucleótidos de la invención, usando o bien ADN o ADNc genómico humano como molde.
Como alternativa, se pueden usar técnicas de química de síntesis para sintetizar polinucleótidos de C5AR. La degeneración del código genético permite secuencias de nucleótidos alternativas para sintetizar que codificarán C5AR que tienen, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO: 2 o su variante biológicamente activa.
Extensión de Polinucleótidos
Se pueden usar diversos procedimientos basándose en PCR para extender las secuencias de ácido nucleico que codifican C5AR, por ejemplo para detectar secuencias cadena arriba del gen de C5AR tales como promotores y elementos reguladores. Por ejemplo, la PCR de sitio de restricción usa cebadores universales para recuperar la secuencia desconocida adyacente a un locus conocido. El ADN genómico se amplifica primero en la presencia de un cebador a una secuencia de engarce y un cebador específico a la región conocida. Las secuencias amplificadas son el sujeto de una segunda ronda de la PCR con el mismo cebador de engarce y otro cebador específico interno al primero. Los productos de cada ronda de la PCR se transcriben con una ARN polimerasa apropiada y secuenciarse usando transcriptasa inversa.
La PCR inversa también se puede usar para amplificar o extender secuencias que usan cebadores divergentes basándose en una región conocida. Los cebadores se pueden diseñar usando un software comercialmente disponible, tal como el software OLIGO 4.06 Primer Analysis (National Biosciences Inc., Plymouth, Minn.), que es de 22 - 30 nucleótidos de longitud, para que tenga un contenido de GC de 50% o más, e hibridarse a la secuencia diana a temperaturas aproximadamente 68 - 72°C. El procedimiento usa varias enzimas de restricción para generar un fragmento adecuado en la región conocida. Después el fragmento se hace circular mediante ligamiento intramolecular y se usa como un molde de la PCR.
Otro procedimiento que se puede usar es PCR de captura, que implica la amplificación mediante la PCR de los fragmentos de ADN adyacentes a una secuencia conocida en el ADN cromosómico humano y de levadura artificial. En este procedimiento, se pueden usar las digestiones y ligaduras de enzima de restricción múltiples para colocar una secuencia de ADN modificada por ingeniería genética en un fragmento desconocido de la molécula de ADN antes de realizar la PCR.
Cuando se seleccionan los ADNc de longitud completa, se prefiere usar genotecas que se hayan seleccionado por tamaño para que incluyan ADNc mayores. Las genotecas cebadas al azar pueden ser especialmente preferibles par alas situaciones en las que una genoteca de oligo d(T)no produce un ADNc de longitud completa. Las genotecas genómicas pueden ser útiles para la extensión de secuencia en las regiones reguladoras no transcritas de 5'.
Los sistemas de electroforesis de capilar comercialmente disponibles se pueden usar para analizar el tamaño o confirmar la secuencia de nucleótidos de la PCR o productos de secuenciación. Por ejemplo, la secuenciación capilar puede emplear polímeros de flujo libre para la separación electroforética, cuatro tintes fluorescentes diferentes (uno para cada nucleótido) que están activados por láser, y la detección de las longitudes de onda emitidas por una cámara con dispositivo acoplado a carga. La intensidad de la salida/luz se puede convertir en señal eléctrica usando un equipo y software apropiado (por ejemplo, GENOTYPER y Secuencia NAVIGATOR, Perkin Elmer), y el procedimiento entero de carga de las muestras a análisis de ordenador y muestra de datos electrónica se puede controlar por ordenador. La electroforesis capilar se prefiere de manera especial para la secuenciación de partes pequeñas de ADN que pudieran estar presentes en cantidades limitadas en una muestra particular.
Obtención de Polipéptidos
El C5AR se puede obtener, por ejemplo, mediante purificación de células humanas, mediante la expresión de los polinucleótidos de C5AR, O mediante síntesis química directa.
Purificación de proteínas
El C5AR se puede purificar a partir de cualquier célula que expresa el receptor, incluyendo los que se han transferido con las construcciones de expresión que expresan C5AR. Una C5AR purificada se separa de otros compuestos que normalmente se asocian a C5AR en la célula, tales como ciertas proteínas, carbohidratos, o lípidos, usando los procedimientos bien conocidos en la técnica. Tales procedimientos incluyen, pero no se limitan a, cromatografía por exclusión de tamaño, fraccionamiento por sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, y electroforesis de gel preparativa.
Expresión de Polinucleótidos de C5AR
Para expresar C5AR, los polinucleótidos de C5AR se pueden insertar en un vector de expresión que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia de codificación insertada. Los procedimientos que se conocen bien por los expertos en la técnica se pueden usar para C5AR y elementos de control de transcripción y de traducción apropiados. Estos procedimientos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntesis, y recombinación genética in vivo.
Una variedad de los sistemas de vector/huésped se puede utilizar para que contenga y exprese las secuencias que codifican C5AR. Éstos incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con bacteriófago recombinante, plásmido, o vectores de expresión de ADN de cósmico; levadura transformada con vectores de expresión de levaduras, sistemas de células de insectos infectados con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de coliflor, CaMV; virus de mosaico de tabaco, TMV) o con vectores de expresión de bacterias (por ejemplo, Ti o plásmidos de pBR322), o sistemas de células animales.
Los elementos de control o secuencias reguladoras son las regiones no traducidas de los potenciadores del vector, promotores, regiones no traducidas 5' y 3' que interactúan con las proteínas celulares de huésped para sacar la transcripción y traducción. Tales elementos pueden variar en su longitud y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y huésped utilizado, se puede usar cualquier número de elementos de transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos y que se pueden inducir. Por ejemplo, cuando se clonan en sistemas bacterianos, se pueden usar promotores que se pueden inducir tales como el promotor lacZ híbrido o el fagémido BLUESCRIPT (Stratagene, LaJolla, Calif.) o plásmido pSPORT1 (Life Technologies) y similares. El promotor de polihedrina de baculovirus se puede usar en células de insectos. Los promotores o potenciadores derivados de los genomas de células de plantas (por ejemplo, choque térmico, RUBISCO, y genes de proteína de almacenamiento) o a partir de virus de plantas (por ejemplo, promotores virales o secuencias guía) se pueden clonar en el vector. En los sistemas de células de mamíferos, son preferibles promotores de genes de mamíferos o de virus de mamíferos. Si es necesario generar una línea celular que contiene múltiples copias de una secuencia de nucleótidos que codifica C5AR, se pueden usar vectores basados en SV40 o EBV con un marcador que se puede seleccionar apropiado.
Sistemas de expresión de bacterias y de levaduras
En los sistemas bacterianos, se pueden seleccionar un número de vectores de expresión. Por ejemplo, cuando se necesita una gran cantidad de C5AR para la inducción de anticuerpos, se pueden usar vectores que dirigen la expresión de alto nivel de proteínas de fusión que se purifican de manera fácil. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, vectores de clonación y expresión de E. coli multifuncionales tales como BLUESCRIPT (Stratagene). En un vector BLUESCRIPT, se puede ligar una secuencia de C5AR en el vector en fase con las secuencias para la Met terminal y los 7 restos posteriores de \beta-galactosidasa de manera que se produce una proteína híbrida. Los vectores pIN o vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) también se pueden usar para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con la glutatión S-transferasa (GST). En general, teles proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción a perlas de glutatión-agarosa seguido de elución en la presencia de glutatión libre. Las proteínas preparadas en tales sistemas se pueden diseñar para que incluyan heparina, trombina, o sitios de escisión de la proteasa del factor Xa de manera que el polipéptido clonado de interés se pueda liberar del resto GST también.
Sistemas de expresión de plantas y de insectos
Si se usan vectores de expresión de plantas, la expresión de las secuencias que codifican C5AR se puede proporcionar mediante cualquiera de un número de promotores. Por ejemplo, promotores virales tales como los promotores 35S y 19S de CaMV se pueden usar solos o en combinación con la secuencia guía omega de TMV. Como alternativa, promotores de plantas tales como la pequeña unidad de RUBISCO o se pueden usar promotores de choque térmico. Estas construcciones se pueden introducir en células de plantas mediante transformación de ADN directa o mediante transfección mediada por patógenos.
También se puede usar un sistema de insecto para expresar C5AR. Por ejemplo, en uno de tales sistemas se usa el virus de polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes foráneos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican C5AR se pueden clonar en una región no esencial del virus, tal como el gen de la polihedrina, y colocarse bajo control del promotor de la polihedrina. La inserción exitosa de C5AR hará que el gen de la polihedrina sea inactivo y produzca virus recombinante que carece de proteína de revestimiento. Los virus recombinantes se pueden después usar para infectar células de S. frugiperda cells o larvas de Trichoplusia en las que se puede expresar C5AR.
Sistemas de expresión de mamíferos
Se puede usar un número de sistemas de expresión basados en virus para expresar C5AR en células huésped de mamífero. Por ejemplo, si se usa un adenovirus como un vector de expresión, las secuencias que codifican C5AR se pueden ligar en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que comprende el promotor antiguo y la secuencia guía tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral se puede usar para obtener un virus viable que es capaz de expresar C5AR en células huésped infectadas [Engelhard et al. (1994)]. Si se desea, se pueden usar potenciadores de transcripción, tal como potenciador del virus de sarcoma Rous (RSV), para incrementar la expresión en células huésped de mamíferos.
También se pueden usar cromosomas artificiales humanos (HAC) para administrar fragmentos mayores de AND que pueden estar contenidos y expresados en un plásmido. Los HAC de 6M a 10M se construyen y se distribuyen a las células mediante procedimientos de distribución convencionales (por ejemplo, liposomas, polímeros de amino policatiónicos, o vesículas). También se pueden usar señales de inicio de específicas para lograr traducción más eficaz de las secuencias que codifican C5AR. Tales señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. En los casos en los que las secuencias que codifican C5AR, su codón de inicio, y las secuencias cadena arriba se insertan en el vector de expresión adecuado, no se necesitan señales de control de transcripción o de traducción adicionales. Sin embargo, en los casos en los que la secuencia de codificación solamente, o su fragmento, se inserta, se deben proporcionar señales de control de la traducción exógena (incluyendo el codón de inicio ATG). El codón de inicio debe estar en el marco de lectura correcto para asegurar la traducción de la inserción completa. Los elementos de traducción exógenos y los codones de inicio pueden ser de diversos orígenes, tanto natural como sintético.
Células huésped
Se puede elegir una cepa de célula por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o para procesar el C5AR expresada de la manera deseada. Tales modificaciones del polipéptido incluyen, pero no se limitan a, acetilación, carboxilación, glicosilación, fosforilación, lipidación, y acilación. El procesamiento después de la traducción que escinde una "prepro" del polipéptido también se puede usar para facilitar la inserción, plegamiento y/o función correcta. Diferentes células huésped que tienen maquinaria celular y mecanismos característicos para las actividades después de la traducción (por ejemplo, CHO, HeLa, MDCK, HEK293, y WI38), están disponibles de la Colección Americana de Cultivos (ATCC; 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110 - 2209) y se pueden elegir para asegurar la correcta modificación y procesamiento de la proteína foránea.
Se prefiere la expresión estable para la producción a largo plazo, de alto rendimiento de proteínas recombinantes. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan de manera estable el C5AR se pueden transformar usando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador que se puede seleccionar sobre el mismo o sobre un vector separado. Después de la introducción del vector, las células se pueden dejar crecer durante 1 - 2 días en un medio enriquecido antes de que se cambien a un medio selectivo. El propósito del marcador que se puede seleccionar es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y recuperación de las células que expresan de manera exitosa las secuencias de C5AR introducidas. Los clones resistentes de las células transformadas de manera estable se pueden hacer proliferar usando técnicas de cultivo de tejidos apropiados al tipo de célula. Se puede usar cualquiera de un número de los sistemas de selección para recuperar las líneas celulares transformadas. Éstas incluyen, pero no se limitan a, los genes de la timidina quinasa de virus herpes simplex [Logan, (1984)] y la adenina fosforibosiltransferasa [Wigler, (1977)] que se pueden emplear en las células tk- o aprt-, respectivamente. También, se pueden usar, resistencia a antimetabolito, antibiótico, o herbicida como la base para la selección. Por ejemplo, dhfr- confiere resistencia a metotrexato [Lowy, (1980)], npt confiere resistencia a los aminoglicósidos, neomicina y G-418 [Wigler, (1980)], y las y pat confiere resistencia a clorsulfuron y fosfinotricin acetiltransferasa, respectivamente [Colbere-Garapin et al., (1981)]. Se han descrito genes que se pueden seleccionar adicionales. Por ejemplo, trpB permite que las células utilicen indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite que las células utilicen histinol en lugar de histidina. Se pueden usar marcadores visibles tales como antocianinas, b-glucuronidasa y su sustrato GUS, y luciferasa su sustrato luciferina, para identificar transformantes y para cuantificar la cantidad de la expresión de proteína transitoria o estable atribuible a un sistema de vector específico.
Detección de la expresión de Polipéptido
Aunque la presencia de la expresión de un gen marcador sugiere que un polipéptido de C5AR también está presente, su presencia y expresión puede necesitar ser confirmada. Por ejemplo, si se inserta una secuencia que codifica C5AR dentro de una secuencia de gen marcador, las células transformadas que contienen secuencias que codifican C5AR se pueden identificar mediante la ausencia de la función del gen marcador. Como alternativa, se puede colocar un gen marcador en tándem con una secuencia que codifica C5AR bajo el control de un solo promotor. La expresión del gen marcador en respuesta a la inducción o selección usualmente indica la expresión del polinucleótido de C5AR.
Como alternativa, células huésped que contienen un polinucleótido de C5AR y que expresa C5AR se puede identificar mediante una diversidad de procedimientos conocidos por los expertos en la técnica. Estos procedimientos incluyen, pero no se limitan a, hibridaciones ADN-ADN o ADN- ARN y bioensayo de proteínas o técnicas de inmunoensayo que incluyen tecnologías basadas en membrana, solución o en procesador para la detección y/o cuantificación de ácido nucleico o proteína. Por ejemplo, la presencia de una secuencia de polinucleótidos que codifica C5AR se puede detectar mediante hibridación de ADN-ADN o ADN-ARN o amplificación usando sondas o fragmentos o fragmentos de polinucleótidos que codifican C5AR. Los ensayos basados en la amplificación de ácido nucleico implican el uso de oligonucleótidos seleccionados entre las secuencias que codifican C5AR para detectar transformantes que contienen un polinucleótido de C5AR.
Se conocen en la técnica una diversidad de protocolos para detector y medir la expresión de C5AR, usando o bien anticuerpos policlonales o monoclonales específicos para el polipéptido. Los ejemplos incluyen ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), y clasificación de células activada por fluorescencia (FACS). Se puede usar un inmunoensayo de dos sitios, basado en monoclonales que usa anticuerpos monoclonales reactivos con dos epítopes que no interfieren sobre C5AR, o se puede emplear un ensayo de unión competitiva.
Los expertos en la técnica conocen una amplia diversidad de etiquetas y se pueden usar en diversos ensayos de ácido nucleico y aminoácido. Los medios para producir la hibridación marcada o sondas de PCR para detector secuencias relacionadas con los polinucleótidos que codifican C5AR incluyen oligomarcado, traducción de muesca, marcado del extremo, o amplificación de la PCR que usa un nucleótido marcado. Como alternativa, las secuencias que codifican C5AR se pueden clonar en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Tales vectores se conocen en la técnica, están comercialmente disponibles, y se pueden usar para sintetizar sondas de ARN in vitro mediante la adición de nucleótidos marcados y una ARN polimerasa apropiada tales como T7, T3, o SP6. Estos procedimientos se pueden llevar a cabo usando una diversidad de kits comercialmente disponibles (Amersham Pharmacia Biotech, Promega, y US Biochemical). Las moléculas indicadoras adecuadas o etiquetas que se pueden usar para facilitar la detección incluyen radionúclidos, enzimas y agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos, así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares.
Expresión y Purificación de Polipéptidos
Las células huésped transformadas con secuencias de nucleótidos que codifican C5AR se pueden cultivar en condiciones adecuadas para al expresión y recuperación de la proteína a partir de cultivo de células. El polipéptido producido por una célula transformada puede estar secretado o contenido intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o el vector usado. Como entenderán los expertos en la técnica, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos que codifican C5AR se pueden diseñar para contener secuencias de señal que dirigen la secreción de C5AR soluble mediante una membrana de células procarióticas o eucarióticas o que dirigen la inserción de membrana de C5AR unida a membrana.
Como se ha descrito anteriormente, se pueden usar otras construcciones para unir una secuencia que codifica C5AR a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de polipéptido que facilitará la purificación de proteínas solubles. Tales dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metal tales como los módulos histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados, dominios de la proteína A sobre inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado en el sistema de extensión FLAGS/purificación por afinidad (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Inclusión de secuencias de engarce escindibles tales como los específicos para el Factor XA o enteroquinasa (Invitrogen, San Diego, CA) entre el dominio de purificación y C5AR también se pueden usar para facilitar la purificación. Un vector de expresión tal proporciona la expresión de una proteína de fusión que contiene C5AR y 6 restos de histidina que precede un sitio de escisión de tioredoxina o de una enteroquinasa. Los restos de histidina facilitan la purificación por IMAC (cromatografíade afinidad de ion metálico inmovilizado) Maddox et al., (1983)], mientras el sitio de escisión de la enteroquinasa proporciona un medio para purificar C5AR a partir de la proteína de fusión [Porath (1992)].
Síntesis química
Las secuencias que codifican C5AR se pueden sintetizar, completamente o en parte, usando procedimientos químicos bien conocidos en la técnica. Como alternativa, la propia C5AR se puede usar usando procedimientos químicos para sintetizar su secuencia de aminoácidos, tal como síntesis de péptido directa usando técnicas en fase sólida. La síntesis de proteína se puede o bien realizar usando técnicas manuales o mediante automatización. La síntesis automática se puede lograr, por ejemplo, usando El sintetizador de péptidos de Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Opcionalmente, los fragmentos de C5AR se pueden separar de manera separada y combinarse usando procedimientos químicos para producir una molécula de longitud completa.
El péptido recientemente sintetizado se puede purificar sustancialmente mediante cromatografía líquida de alta resolución preparativa. La composición de una C5AR sintética se puede confirmar mediante análisis o secuenciación de aminoácidos. De manera adicional, cualquier porción de la secuencia de aminoácidos de C5AR se puede alterar durante la síntesis directa y/o combinarse usando procedimientos químicos con las secuencias de otras proteínas para producir un polipéptido variante o una proteína de fusión.
Producción de polipéptidos alterados
Como entienden los expertos en la técnica, se puede producir de manera ventajosa las secuencias de nucleótidos que codifica C5AR- que poseen codones de origen no natural. Por ejemplo, los codones preferidos por un huésped procariótico o eucariótico particular se puede seleccionar para incrementar la velocidad de la expresión de proteína o para producir una transcripción de ARN que tiene las propiedades deseables, tal como una semivida que es más larga que la de una transcripción generada a partir de la secuencia de origen natural.
Las secuencias de nucleótidos mencionadas en el presente documento se pueden modificar por ingeniaría genética usando procedimientos generalmente conocidos en la técnica para alterar las secuencias que codifican C5AR por una diversidad de razones, que incluyen, pero no se limitan a, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento, y/o expresión del polipéptido o producto de ARNm. La recomposición de ADN mediante fragmentación al azar y reensamblaje de los fragmentos génicos y oligonucleótidos sintéticos se pueden usar para modificar por ingeniería genética las secuencias de nucleótidos. Por ejemplo, la mutagénesis dirigida al sitio se puede usar para insertar nuevos sitios de restricción, alterar patrones de glicosilación, cambiar la preferencia de codón, producir variantes de ayuste, introducir mutaciones, y así sucesivamente.
Anticuerpos
Cualquier tipo de anticuerpo conocido en la técnica se puede generar para que se una de manera específica a un epítope de C5AR.
"Anticuerpo" como se usa en el presente documento incluye moléculas de inmunoglobulina intactas, así como sus fragmentos, tales como Fab, F(ab')2, y Fv, que son capaces de unirse a un epítope de C5AR. Típicamente, al menos 6, 8, 10, ó 12 aminoácidos contiguos se requieren para formar un epítope. Sin embargo, los epítopes que implican aminoácidos no contiguos pueden requerir más, por ejemplo, al menos 15, 25, ó 50 aminoácido. Cualquier anticuerpo que se une de manera específica a un epítope de C5AR se puede usar de manera terapéutica, así como en ensayos inmunoquímicos, tales como transferencias de Western, ELISA, radioinmunoensayos, ensayos inmunohistoquímicos, inmunoprecipitaciones, u otros ensayos inmunoquímicos conocidos en la técnica. Se pueden usar diversos inmunoensayos para identificar anticuerpos que tienen la especificidad deseada. Se conocen bien en la técnica numerosos protocolos para ensayos competitivos o inmunorradiométricos. Tales inmunoensayos típicamente implican la medida de formación de complejo entre un inmunógeno y un anticuerpo que se une de manera específica al
inmunógeno.
Típicamente, un anticuerpo que se une de manera específica a C5AR proporciona una señal de detección al menos 5-, 10-, ó 20- veces mayor que una señal de detección proporcionada con otras proteínas cuando se usan en un ensayo inmunoquímico. Preferiblemente, los anticuerpos que se unen de manera específica a C5AR no detectan otras proteínas en los ensayos inmunoquímicos y pueden inmunoprecipitar C5AR en solución.
El C5AR se puede usar para inmunizar a un mamífero, tal como un ratón, rata, conejo, cobaya, ratón, o ser humano, para producir anticuerpos policlonales. Si se desea, C5AR se puede conjugar a una proteína vehículo, tal como albúmina sérica bovina, tiroglobulina, y hemocianina de lapa californiana. Dependiendo de la especie huésped, se pueden usar diversos adyuvantes para incrementar la respuesta inmunológica. Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a, adyuvante de Freund, geles minerales (por ejemplo, hidróxido de aluminio), y sustancias tensioactivas (por ejemplo, lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, lemociania de lapa californiana, y dinitrofenol). Entre otros adyuvantes usados en los seres humanos, BCG (Bacilos Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum son especialmente útiles.
Los anticuerpos monoclonales que se usan específicamente a C5AR se pueden preparar usando cualquier técnica que proporciona la producción de moléculas de anticuerpos mediante líneas celulares continuas en cultivo. Estas técnicas incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridoma, la técnica de hibridoma de células B humanas, y la técnica de hibridoma EBV [Roberge (1995)].
Además, se pueden usar las técnicas desarrolladas para la producción de "anticuerpos quiméricos", el ayuste de genes de anticuerpos de ratón a genes de anticuerpos humanos para obtener una molécula con especificidad de antígeno y actividad biológica apropiada [Cole et al. (1984); Morrison et al. (1984); Neuberger et al. (1984)]. También se pueden usar anticuerpos monoclonales y otros "humanizados" para evitar que un paciente monte una respuesta inmune frente al anticuerpo cuando se usa de manera terapéutica. Tales anticuerpos pueden ser suficientemente similares a los anticuerpos humanos a usar directamente en terapia o pueden requerir alteración de unos pocos restos clave. Las diferencias de secuencias entre anticuerpos de roedores y secuencias humanas se pueden minimizar reemplazando restos que difieren de aquellos en las secuencias humanas mediante mutagénesis dirigida al sitio de restos individuales o mediante injerto de regiones determinantes complementarias enteras. Los anticuerpos que se unen específicamente a C5AR pueden contener sitios de unión a antígeno que están o bien parcialmente o totalmente humanizados, como se describe en el documento de Estados Unidos 5.565.332.
Como alternativa, las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena se pueden adaptar usando procedimientos conocidos en la técnica para producir anticuerpos de una sola cadena que se unen específicamente a C5AR. Los anticuerpos con especificidad relacionada, pero composición idiotípica distinta, se pueden generar mediante recomposición de cadena a partir de genotecas de imunoglobulina de combinación al azar. Los anticuerpos de una sola cadena también se pueden construir usando un procedimiento de amplificación de ADN, tal como PCR, usando ADNc de hibridoma como molde. Los anticuerpos de una sola cadena pueden ser mono o bi específicos, y pueden ser bivalentes o tetravalentes. Se enseña la construcción de anticuerpos de una sola cadena tetravalentes biespecíficos. Una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo de una sola cadena se puede construir usando la síntesis de nucleótidos manual o automática, clonarse en una construcción de expresión que usa procedimientos de ADN recombinante, e introducirse en una célula para expresar la secuencia codificante, como se describe más adelante. Como alternativa, los anticuerpos de una sola cadena se pueden producir directamente usando, por ejemplo, tecnología de fago filamentoso.
Los anticuerpos que se unen específicamente a C5AR también se pueden producir mediante la inducción in vivo de la producción en la población de linfocitos o mediante selección de genotecas de inmunoglobulina o paneles de reactivos de unión altamente específicos. Se pueden construir otros tipos de anticuerpos y usarse de manera terapéutica en los procedimientos de la invención. Por ejemplo, se pueden construir anticuerpos quiméricos como se describe en el documento WO 93/03151. También se pueden preparar las proteínas de unión que se derivan de las inmunoglobulinas y que son multivalentes y multiespecíficas, tales como los "dicuerpos" descritos en el documento WO 94/13804.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden purificar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los anticuerpos se pueden purificar por actividad mediante paso en una columna a las que C5AR está unidad. Los anticuerpos unidos se pueden después eluir de la columna usando un tampón con una alta concentración en sal.
Oligonucleótidos no codificantes
Los oligonucleótidos no codificantes son secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de ADN o ARN. Una vez se ha introducido en una célula, los nucleótidos complementarios se combinan con secuencias naturales producidas por la célula para formar complejos y bloquear o bien la transcripción o la traducción. Preferiblemente, un oligonucleótido no codificante es de al menos 11 nucleótidos de longitud, pero puede ser de al menos 12, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ó 50 o más nucleótidos de longitud. Se pueden usar secuencias más largas. Las moléculas de oligonucleótidos no codificantes se pueden proporcionar en una construcción de ADN e introducirse en una célula como se ha descrito anteriormente para disminuir el nivel del producto génico de C5AR en la célula.
Los oligonucleótidos no codificantes pueden ser desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos, o una combinación de ambos. Los oligonucleótidos se pueden sintetizar manualmente o mediante un sintetizador automático, mediante unión covalente del extremo 5' de un nucleótido con el extremo 3' de otro nucleótido con enlaces de internucleótido no fosfodiéster tales como alquilfosfonatos, fosforotioatos, fosforoditioatos, alquilfosforotioatos, alquilfosfonatos, fosforamidatos, ésteres fosfatos, carbamatos, acetamida, carboximetil estrés, carbonatos, y fosfato triésteres.
Las modificaciones de la expresión génica de C5AR se pueden obtener mediante diseño de oligonucleótidos no codificantes que formarán complejos dobles con el control, 5', o regiones reguladoras del gen de C5AR. Se prefieren los oligonucleótidos derivados del sitio de inicio de transcripción, por ejemplo, entre las posiciones -10 y +10 del sitio de partida. De manera similar, la inhibición se puede lograr usando la metodología de apareamiento de bases de "triple hélice". El emparejamiento de triple hélice es útil debido a que provoca la inhibición de que la capacidad de la doble hélice se abra suficientemente para la unión de las polimerasas, factores de transcripción, o chaperones.
Los avances terapéuticos que usan ADN triple se han descrito en la bibliografía [Nicholls, (1993)]. Un oligonucleótido no codificante se puede usar se puede diseñar para bloquear la traducción de ARNm mediante la prevención de la transcripción de la unión a ribosomas.
No se requiere una complementariedad precisa para la formación del complejo exitoso entre un oligonucleótido no codificante y la secuencia complementaria de un polinucleótido de C5AR. Los oligonucleótidos no codificantes que comprenden, por ejemplo, 2, 3, 4, ó 5 o más tramos de nucleótidos contiguos que son complementarios de manera precisa a un polinucleótido de C5AR, cada uno separado por un tramo de nucleótidos contiguos que no son complementarios a los nucleótidos C5AR adyacentes, pueden proporcionar una especificidad de dirección suficiente para el ARNm de C5AR. Preferiblemente, cada tramos de nucleótidos contiguos complementarios es de al menos 4, 5, 6, 7, u 8 o más nucleótidos de longitud. Las secuencias que intervienen no complementarias son preferiblemente de 1, 2, 3, ó 4 nucleótidos de longitud. Los expertos en la técnica pueden fácilmente usar el punto de fusión calculado de un par no codificante - codificante para determinar el grado de discordancia que se tolerará entre un oligonucleótido no codificante particular y una secuencia de polinucleótidos de C5AR particular. Los oligonucleótidos no codificantes se pueden modificar sin que afecte a su capacidad para hibridarse a un polinucleótido de C5AR. Estas modificaciones pueden ser internas o en uno o ambos extremos de la molécula no codificante. Por ejemplo, los enlaces de fosfato internucleósido se pueden modificar mediante la adición de restos colesterilo o diamina con números variables de restos de carbono entre los grupos amino y la ribosa terminal. También se pueden emplear bases modificadas y/o azúcares, tal como arabinosa en lugar de ribosa, o un oligonucleótido sustituido en 3', 5' en el que el grupo hidroxilo 3' o el grupo fosfato 5' están sustituidos, también se puede emplear en un oligonucleótido no codificante modificado. Estos oligonucleótidos modificados se pueden preparar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica.
Ribozimas
Las ribozimas son moléculas de ARN con actividad catalítica [Uhlmann (1987)]. Las ribozimas se pueden usar para inhibir la función génica mediante escisión de una secuencia de ARN, como se conoce en la técnica. El mecanismo de la acción de ribozima implica la hibridación específica de la secuencia de la molécula de ribozima a ARN diana complementario, seguido de la escisión endonucleolítica. Los ejemplos incluyen moléculas de ribozima de pez martillo modificadas por ingeniería genética que pueden de manera específica y eficaz catalizar la escisión endonucleolítica de las secuencias de nucleótidos específicas. La secuencia codificante de un polinucleótido de C5AR se puede usar para generar ribozimas que se unirán específicamente a ARNm trascrito a partir de un polinucleótido de C5AR. Los procedimientos de diseño y construcción de ribozimas que pueden escindir otras moléculas de ARNm en trans de una manera altamente específica de secuencia se han desarrollado y descrito en la técnica. Por ejemplo, la actividad de escisión de las ribozimas se pueden dirigir a ARN específicos mediante modificación por ingeniería genética de una región discreta de "hibridización" en la ribozima. La región de hibridización contiene una secuencia complementaria al ARN diana y de esta manera se hibrida de manera específica con el ARN diana.
Los sitios de escisión específica de la ribozima dentro de una diana de ARN de C5AR se puede identificar mediante exploración de la molécula diana para los sitios de escisión de ribozima que incluyen las siguientes secuencias: GUA, GUU, y GUC. Una vez identificadas, las secuencias de ARN cortas de entre 15 y 20 ribonucleótidos correspondiente a la región del ARN diana que contiene el sitio de escisión se puede evaluar por las características estructurales secundarias que pueden hacer que la diana no se pueda trabajar. La idoneidad de las dianas de ARN de C5AR adecuadas también se puede evaluar mediante el ensayo de la accesibilidad a la hibridación con oligonucleótidos complementarios usando los ensayos de protección de ribonucleasa. Las secuencias de nucleótidos mostradas en la SEQ ID NO: 1 y su complemento proporcionan fuentes de secuencias de la región de hibridación adecuadas. Se pueden usar secuencias de hibridación más largas para incrementar la afinidad de la secuencia de hibridación para la diana. Las regiones de hibridación y escisión de la ribozima se pueden relacionar de manera íntegra de manera que tras la hibridación del ARN diana a través de las regiones complementarias, la región catalítica de la ribozima puede escindir la diana.
Las ribozimas se pueden introducir en las células como parte de una construcción de ADN. Se pueden usar procedimientos mecánicos, tales como microinyección, transfección mediada por liposomas, electroporación, o precipitación por fosfato de calcio, para introducir una construcción de ADN que contiene ribozima en las células en las que se desea disminuir la expresión de C5AR. Como alternativa, si se desea que las células retengan de manera estable la construcción de ADN, la construcción se puede suministrar sobre un plásmido y mantener como un elemento separado o integrarse en el genoma de las células, como se conoce en la técnica. Una construcción de ADN que codifica ribozima puede incluir elementos reguladores de la transcripción, tal como un elemento promotor, un potenciador o elemento UAS, y una señal de terminador de la transcripción, para controlar la transcripción de ribozimas en las células (documento de Estados Unidos n° 5.641.673). También se pueden modificar por ingeniería genética las ribozimas para proporcionar un nivel adicional de regulación, de manera que la destrucción de ARNm se produzca solamente cuando se inducen en la célula tanto una ribozima como un gen diana.
Selección/Ensayos de selección Reguladores
Los reguladores como se usan en el presente documento, se refieren a agonistas de C5AR y antagonistas de C5AR. Los agonistas de C5AR son moléculas que, cuando se unen a C5AR, incrementan o prolongan la actividad de C5AR. Los agonistas de C5AR incluyen proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, pequeñas moléculas, o cualquier otra molécula que activa C5AR. Los antagonistas de C5AR son moléculas que, cuando se unen a C5AR, disminuyen la cantidad de o la duración de la actividad de C5AR. Los antagonistas incluyen proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos, anticuerpos, pequeñas moléculas, o cualquier otra molécula que disminuye la actividad de C5AR.
El término "modular", como aparece en el presente documento, se refiere a un cambio en la actividad de C5AR. Por ejemplo, modulación puede provocar un incremento o una disminución en la actividad de proteína, características de unión, o cualesquiera otras propiedades biológica, funcional, o inmunológica de C5AR.
Como se usa en el presente documento, las frases "unión específica" o "que se une de manera específica" se refiere a la interacción entre una proteína o péptido y un agonista, un anticuerpo o un antagonista. La interacción depende de la presencia de una estructura particular de la proteína reconocida por la molécula de unión (es decir, el determinante antigénico o epítope). Por ejemplo, si un anticuerpo es específico para el epítope "A", la presencia de un polipéptido que contiene el epítope A, o la presencia de de A no marcado libre, en la reacción que contiene A marcado libre y el anticuerpo reducirá la cantidad de A marcado que se une al anticuerpo.
La invención proporciona procedimientos (también denominados en el presente documento como "ensayos de selección") para identificar compuestos que se pueden usar para el tratamiento de cáncer. Los procedimientos suponen la identificación de compuestos o agentes candidatos o de ensayo (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, pequeñas moléculas u otras moléculas) que se unen a C5AR y/o tienen un efecto estimulador o inhibidor sobre la actividad biológica de C5AR o su expresión y después determinar cuales de estos compuestos tienen un efecto sobre los síntomas o enfermedades relacionadas con cáncer, en un ensayo in vivo.
Los compuestos candidatos o de ensayo o agentes que se unen a C5AR y/o tienen un efecto estimulador o inhibidor sobre la actividad de la expresión del C5AR se identifican o bien n ensayos que emplean células que expresan el C5AR sobre la superficie de la célula (ensayos basados en célula) o en ensayos que con El C5AR aislada (ensayos sin células). Los diversos ensayos pueden emplear una diversidad de variantes de C5AR (por ejemplo, C5AR de longitud completa, un fragmento biológicamente activo de C5AR, o una proteína de fusión que incluye toda o parte de C5AR). Además, C5AR se puede derivar de cualquier especie de mamífero adecuado (por ejemplo, C5AR humano, C5AR de rata o C5AR murino). El ensayo puede ser un ensayo de unión que supone la medición directa o indirecta de la unión de un compuesto de ensayo o un ligando del C5AR conocido a C5AR. El ensayo también puede ser un ensayo de actividad que supone la medición directa o indirecta de la actividad de la C5AR. El ensayo también puede ser un ensayo de expresión que supone la medición directa o indirecta del ARNm de C5AR o proteína de C5AR. Se combinan los diversos ensayos de selección con un ensayo in vivo que supone la medición del efecto del compuesto de ensayo sobre los síntomas de cáncer enfermedades cardiovasculares, trastornos del sistema nervioso central, COPD, asma, trastornos genitourinarios y enfermedades inflamatorias.
En una realización, la invención proporciona ensayos para seleccionar compuestos candidatos o de ensayo que se unen a o modulan la actividad de una forma unida a membrana (expresado en la superficie de la célula) de C5AR. Tales ensayos pueden emplear el C5AR de longitud completa, un fragmento biológicamente activo de C5AR, o una proteína de fusión que incluye toda o parte de C5AR. Como se describe en más detalle más adelante, se puede obtener el compuesto de ensayo mediante cualquier medio adecuado, por ejemplo, a partir de genotecas de compuestos convencionales. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo a unir a una forma unida a membrana de C5AR se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante acoplamiento del compuesto de ensayo con un radiosiótopo o marca enzimática de manera que la unión de del compuesto de ensayo a la célula que expresa el C5AR se puede medir detectando el compuesto marcado en un complejo. Por ejemplo, el compuesto de ensayo se puede marcar con ^{125}I, ^{35}S, ^{14}C, o ^{3}H, bien directa o indirectamente, y detectar el radioisótopo mediante conteo directo de la radioemisión o mediante conteo de centelleo. Como alternativa, el compuesto de ensayo se se puede marcar de manera enzimática con, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, o luciferasa, y detectar la marca enzimática mediante la determinación de la conversión de un sustrato apropiado en el producto.
En un formato de unión competitiva, el ensayo comprende poner en contacto la célula que expresa C5AR con un compuesto conocido que se une a C5AR para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo que interactúa con la célula que expresa C5AR, en el que la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo que interactúa con la célula que expresa C5AR comprende la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para unirse de manera preferencial a la célula que expresa C5AR cuando se compara con el compuesto conocido.
En otra realización, el ensayo es un ensayo basado en células que comprende poner en contacto una célula que expresa una forma unida a membrana C5AR (por ejemplo, el C5AR de longitud completa, un fragmento biológicamente activo de C5AR, o una proteína de fusión que incluye toda o parte de C5AR) que se expresa sobre la superficie celular con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de la forma unida a membrana de C5AR. La determinación del compuesto de ensayo para modular la actividad de la forma unida a membrana de C5AR se puede llevar a cabo mediante cualquier procedimiento adecuado para medir la actividad de C5AR, por ejemplo, cualquier procedimiento adecuado para medir la actividad de un receptor acoplado a la proteína G u otro receptor de siete dominios transmembrana (descrito en mayor detalle más adelante). La actividad de un receptor de siete dominios transmembrana se pueden medir de numerosas formas, no todas las cuales son adecuadas para cualquier receptor dado. Entre las medidas de actividad están: alteración de la concentración intracelular de Ca^{2+}, activación de la fosfolipasa C, alteración de la concentración de trifosfato de inositol intracelular (IP_{3}), alteración de la concentración intracelular de diacilglicerol (DAG), y alteración de la concentración de 3',5'-monofosfato de adenosina cíclica (AMPc).
La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de C5AR se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante la determinación de la capacidad de C5AR de unirse o interactuar con una molécula diana. La molécula diana puede ser una molécula con la que se une o interactúa con el C5AR en la naturaleza, por ejemplo, una molécula sobre la superficie de una célula que expresa C5AR, una molécula sobre la superficie de una segunda célula, una molécula en el medio extracelular, una molécula asociada a la superficie interna de una membrana celular o molécula citoplásmica. La molécula diana puede ser un componente de una ruta de transducción de señal que facilita la transducción de una señal extracelular (por ejemplo, una señal generada mediante la unión de un ligando de C5AR, a través de la membrana celular y en la célula. La molécula diana de C5AR, puede ser, por ejemplo, una segunda proteína intracelular que tiene actividad catalítica o una proteína que facilita la asociación de las moléculas de señal cadena abajo con C5AR.
La determinación de la capacidad de C5AR de unirse o interactuar con una molécula diana se puede llevar a cabo mediante uno de los procedimientos descritos anteriormente para la determinación de la unión directa. En una realización, la determinación de la capacidad de un polipéptido de la descripción de unirse o interactuar con una molécula diana se puede llevar a cabo mediante la determinación de la actividad de la molécula diana. Por ejemplo, la actividad de la molécula diana se puede determinar mediante la detección de la inducción de un segundo mensajero celular de la diana (por ejemplo, Ca^{2+} intracelular, diacilglicerol, IP_{3}, etc.), detección de la actividad catalítica/enzimática de la diana sobre un sustrato apropiado, detección de la inducción de un gen indicador (por ejemplo, un elemento regulador que es sensible a un polipéptido de la invención unido de manera operativa a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, por ejemplo, luciferasa), o detección de una respuesta celular.
La presente invención también incluye ensayos sin células. Tales ensayos implican poner en contacto una forma de C5AR (por ejemplo, C5AR de longitud completa, un fragmento biológicamente activo de C5AR, o una proteína de fusión que comprende toda o parte de C5AR) con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse a C5AR. La unión del compuesto de ensayo a C5AR se puede determinar o bien directa o indirectamente como se ha descrito anteriormente. En una realización, el ensayo incluye poner en contacto el C5AR con un compuesto que se une a C5AR para formar una mezcla de ensayo, poner en contacto la mezcla de ensayo con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interactuar con el C5AR, en la que la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interactuar con el C5AR comprende la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo de unirse preferentemente a C5AR cuando se compara con el compuesto conocido.
Los ensayos sin células de la presente invención son susceptibles de usarse o bien una forma unida a membrana de la C5AR o su fragmento soluble. En el caso de los ensayos sin células que comprenden la forma unida a membrana del polipéptido, puede ser deseable utilizar un agente solubilizante de manera que la forma unida a membrana del polipéptido se mantiene en solución. Los ejemplos de tales agentes solubilizantes incluyen pero no se limitan a detergentes no iónicos tales como n-octilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Triton X-100, Triton X-114, Thesit, Isotridecipoli (etilen glicol éter)n, sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-1-propano, (CHAPS), sulfonato de 3-[(3-colamidopropil)dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propano (CHAPSO), o sulfonato de N-dodecil=N,N-dimetil-3-ammonio-1-propano.
En diversas realizaciones de los procedimientos de ensayo anteriores, puede ser deseable inmovilizar C5AR (o una molécula diana de C5AR) para facilitar la separación de las formas que forman complejo de las no forman complejo de una o ambas de las proteínas, así como para acomodar la automatización del ensayo. La unión de un compuesto de ensayo al C5AR, o interacción del C5AR con una molécula diana en la presencia y ausencia de un compuesto candidato, se puede llevar a cabo en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microvaloración, tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga. En una realización, se puede proporcionar una proteína de fusión que añada un dominio que permita que una o ambas de las proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa (GST) o proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa se pueden adsorber sobre perlas de glutatión sefarosa (Sigma Chemical; St. Louis, Mo.) o placas de microvaloración derivadas de glutatión, que después se combinan con el compuesto de ensayo o el compuesto de ensayo y o bien la proteína diana no adsorbida o C5AR, y la mezcla se incuba en condiciones que conducen a la formación de complejo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas de sal y pH). Después de la incubación, las perlas o pocillos de la placa de microvaloración se lavan para retirar cualesquiera componentes no unidos y se mide la formación de complejo o bien directa o indirectamente, por ejemplo, como se he descrito anteriormente. Como alternativa, los complejos se pueden disociar de la matriz, y el nivel de unión o actividad de C5AR se pueden determinar usando técnicas convencionales.
Otras técnicas para la inmovilización de proteínas o matrices también se pueden usar en los ensayos de selección de la invención. Por ejemplo, o bien C5AR o su molécula Diana se puede inmovilizar utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. Se puede preparar polipéptido biotinilado de la invención o moléculas diana a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) usando técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, III.), y se inmovilizan en los pocillos de las placas recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical). Como alternativa, los anticuerpos reactivos con el C5AR o moléculas diana pero que no interfieren con la unión del polipéptido de la invención a su molécula diana se puede derivatizar a los pocillos de la placa, y diana o polipéptido no unido de la invención atrapados en los pocillos mediante conjugación de anticuerpos. Los procedimientos para detectar tales complejas, además de los descritos anteriormente para los complejos GST-inmovilizados, incluyen inmunodetección de complejos que usan anticuerpos reactivos con el C5AR o molécula diana, así como ensayos ligados a enzima que depende de la detección de una actividad enzimática asociada al C5AR o molécula diana.
El ensayo de selección también puede implicar el control de la expresión de C5AR. Por ejemplo, se pueden identificar reguladores de la expresión de C5AR en un procedimiento en el que una célula se pone en contacto con un compuesto candidato y se determina la expresión de la proteína C5AR o ARNm en la célula. El nivel de expresión de la proteína de C5AR o la expresión de ARNm en la ausencia del compuesto candidato. El compuesto candidato se después identificar como un regulador de expresión de la proteína C5AR o ARNm en la ausencia del compuesto candidato. Después el compuesto candidato se puede identificar como un regulador de expresión del C5AR basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de la proteína de C5AR o proteína de ARNm es mayor (mayor estadísticamente significativa) en la presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador de la proteína C5AR o expresión de ARNm. Como alternativa, cuando la expresión de la proteína de C5AR o ARNm es menor (menor estadísticamente significativa) en la presencia del compuesto candidato en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como un estimulador de la proteína de C5AR o expresión de ARNm. El nivel de la proteína de C5AR o expresión de ARNm en las células se puede determinar mediante procedimientos descritos a continuación.
Ensayos de unión
Para los ensayos de unión, el compuesto de ensayo es preferiblemente una molécula pequeña que se une a y ocupa el sitio activo del polipéptido de C5AR, haciendo por lo tanto el sitio de unión de ligando inaccesible al sustrato de manera que se evite la actividad biológica normal. Los ejemplos de tales moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, péptidos pequeños o moléculas de tipo péptido Los ligandos potenciales que se unen a un polipéptido de la invención incluyen, pero no se limitan a, los ligandos naturales de C5AR y análogos conocidos o derivados de los mismos.
En los ensayos de unión, o bien el compuesto de ensayo o el polipéptido de C5AR pueden comprender una etiqueta detectable, tal como etiqueta fluorescente, radioisotópica, quimilouminiscente, o enzimática, tal como peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, o luciferasa. La detección de un compuesto de ensayo que se une a un polipéptido de C5AR, se puede después llevar a cabo, por ejemplo, mediante conteo de la radioemisión, mediante conteo de centelleo, o determinando la conversión de un sustrato apropiado para un producto detectable. Como alternativa, la unión de un compuesto de ensayo a un polipéptido de C5AR se puede determinar sin marcar ninguno de los interactuantes. Por ejemplo, se puede usar un microfisiómetro para detectar la unión de un compuesto de ensayo con un polipéptido de C5AR. Un microfisiómetro (por ejemplo, Cytosensor^{TM}) es un instrumento analítico que mide la velocidad a la que una célula acidifica su entorno usando un sensor potenciométrico dirigible (LAPS). Los cambios en esta velocidad de acidificación se pueden usar como un indicador de la interacción entre un compuesto de ensayo y C5AR [Haseloff, (1988)].
La determinación de la capacidad de un compuesto de ensayo de unirse a C5AR también se puede llevar a cabo usando una tecnología tal como Ensayos de Interacción Biomolecular a tiempo real (BIA) [McConnell, (1992), Sjolander, (1991)]. BIA es una tecnología para estudiar las interacciones bioespecíficas a tiempo real, sin marcar ninguno de los inetractuantes (por ejemplo, BIAcore^{TM}). Los cambios en la resonancia de plasmón de superficie (SPR) del fenómeno óptico se pueden usar como una indicación de las reacciones de tiempo real entre moléculas biológicas.
En todavía otro aspecto de la invención, un polipéptido de tipo C5AR se puede usar como una "proteína cebo" en un ensayo de dos híbridos o ensayo de tres híbridos [Szabo, (1995); documento de Estados Unidos N° 5.283.317), para identificar otras proteínas que se unen o interactúan con C5AR y modular su actividad.
El sistema de dos híbridos se basa en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que consta de dominios de unión a ADN y de activación. En resumen, el ensayo utiliza dos construcciones deferentes de ADN. Por ejemplo, en una construcción, el polinucleótido que codifica C5AR se puede fusionar a un polinucleótido que codifica el dominio de unión a ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En la otra construcción una secuencia de ADN que codifica una proteína no identificada ("presa" o "muestra") se puede fusionar a un polinucleótido que codifica el dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si el "cebo" y las proteínas "presa" son capaces de interactuar in vivo para formar un complejo dependiente de proteína, los dominios de unión a ADN y de activación del factor de transcripción se llevan a una proximidad estrecha. Esta proximidad permite la transcripción de un gen indicador (por ejemplo, LacZ), que está ligado de manera operativa a un sitio regulador de la transcripción sensible al factor de transcripción. La expresión del gen indicador se puede detectar, y las colonias de células que contienen el factor de transcripción funcional se puede aislar y usar para obtener la secuencia de ADN que codifica la proteína que interactúa con C5AR.
Puede ser deseable inmovilizar o bien el C5AR (o polinucleótido) o el compuesto de ensayo para facilitar la separación de la forma unida de la forma no unida de uno o ambos interactuantes, así como para acomodar la automatización del ensayo. De este modo, o bien el polipéptido de tipo C5AR (o polinucleótido) o el compuesto de ensayo se puede unir a un soporte sólido. Los soportes sólidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, portaobtejos de vidrio o plástico, placas de cultivo de tejidos, pocillos de microvaloración, tubos, procesadores de silicio, o partículas tales como perlas, (que incluyen pero no se limitan a, látex, poliestireno, o perlas de vidrio). Cualquier procedimiento conocido en la técnica se puede usar para unir el polipéptido de tipo C5AR (o polinucleótido) o compuesto de ensayo a un soporte sólido que incluye el uso de enlaces covalentes y no covalentes, absorción pasiva, o pares de restos de unión unidos respectivamente al polipéptido (o polinucleótido) o compuesto de ensayo y el soporte sólido. Los compuestos de ensayo se unen preferiblemente al soporte sólido en una disposición, de manera que la localización de los compuestos de ensayo individuales se pueda rastrear. La unión de un compuesto de ensayo al C5AR (o un polinucleótido que codifica C5AR) se puede llevar a cabo en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microvaloración, tubos de ensayo, y tubos de microcentrífuga.
En una realización, el C5AR es una proteína de fusión que comprende un dominio que permite la unión del C5AR a un soporte sólido. Por ejemplo, las proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa se puede adsorber en perlas de glutatión sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, Mo.) o placas de microvaloración derivatizadas de glutatión, que después se combinan con el compuesto de ensayo o el compuesto de ensayo y el C5AR no adsorbida; la mezcla después se incuba en condiciones conductivas para la formación del complejo (por ejemplo, en condiciones fisiológicas de sal y pH). Después de la incubación, las perlas o pocillos de placas de microvaloración se lavan para retirar cualesquiera componentes. La unión de los interactuantes se puede determinar o bien directa o indirectamente, como se ha descrito anteriormente. Como alternativa, los complejos se pueden disociar del soporte sólido antes que se determine la unión.
Otras técnicas para inmovilizar proteínas o polinucleótidos sobre dicho soporte sólido se pueden usar en los ensayos de selección de la invención. Por ejemplo, o bien el C5AR (o a polinucleótido que codifica el C5AR) o un compuesto de ensayo se puede inmovilizar utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. El C5AR biotinilada (o un polinucleótido que codifica el C5AR biotinilada) o compuestos de ensayo se puede preparar a partir de biotina-NHS (N-hidroxisuccinimida) usando las técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilation, Pierce Chemicals, Rockford, III.) e inmovilizarse en los pocillos de las placas recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical). Como alternativa, los anticuerpos que se unen de manera específica a C5AR, polinucleótido, o un compuesto de ensayo, pero que no interfieren con un sitio de unión deseado, tal como el sitio activo de C5AR, se puede derivatizar a los pocillos de la placa. La diana o proteína no unida puede estar atrapada en los pocillos mediante conjugación de anticuerpos.
Los procedimientos para detectar tales complejos, además de los descritos anteriormente, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados de GST, incluyen inmunodetección de complejos que usan anticuerpos que se unen específicamente al polipéptido de C5AR o compuesto de ensayo, los ensayos ligados a enzima que dependen de la detección de una actividad sobre el polipéptido de la C5AR, y electroforesis de gel SDS en condiciones no reductoras.
La selección de los compuestos de ensayo que se unen a un polipéptido o polinucleótido de C5AR también se puede llevar a cabo en una célula intacta. Cualquier célula que comprende un polipéptido o polinucleótido de C5AR se puede usar en sistema de ensayo basado en célula. Un polinucleótido C5AR puede ser de origen natural en la célula o se puede introducir usando las técnicas tales como las descritas anteriormente. La unión del compuesto de ensayo a C5AR o un polinucleótido que codifica C5AR se determina como se ha descrito anteriormente.
Ensayos funcionales
Los compuestos de ensayo se pueden ensayar para determinar la capacidad de aumentar o disminuir C5AR de un polipéptido de C5AR. La actividad de C5AR se puede medir, por ejemplo, usando procedimientos descritos en los ejemplos específicos, más adelante. La actividad de C5AR se puede medir después de poner en contacto o bien C5AR purificado, una preparación de membrana celular, o una célula intacta con un compuesto de ensayo. Un compuesto de ensayo que disminuye la actividad de C5AR en al menos aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente aproximadamente 75, 90, ó 100% se identifica como un agente potencial para disminuir la actividad de C5AR. Un compuesto de ensayo que incrementa la actividad de C5AR en al menos aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente aproximadamente 75, 90, ó 100% se identifica para como un agente potencial para incrementar la actividad de C5AR.
Uno de tales procedimientos de selección implica el uso de melanóforos que se transfectan para expresar el C5AR. Tal técnica de selección se describe en el documento PCT WO 92/01810 publicado el 6 de febrero de 1992. De este modo, por ejemplo, tal ensayo se puede emplear para seleccionar un compuesto que inhibe la activación del polipéptido receptor usado en la presente invención poniendo en contacto las células de melanóforos que codifican el receptor con tanto el ligando receptor como un compuesto a seleccionar.
La inhibición de la señal generada por el ligando indica que un compuesto es un antagonista potencial para el receptor, es decir inhibe la activación de el receptor. La selección se puede emplear para Identificar un compuesto que activa el receptor poniendo en contacto tales células con compuestos a seleccionar y determinar si cada compuesto genera una señal, es decir, activa el receptor.
Otras técnicas de selección incluyen el uso de células que expresan C5AR (por ejemplo, células CHO transfectadas) en un sistema que mide los cambios de pH extracelular provocados por la activación de receptor [Iwabuchi (1993)]. Por ejemplo, los compuestos se pueden poner en contacto con una célula que expresa el polipéptido de la presente invención y una segunda respuesta de mensajero por ejemplo, transducción de la señal o cambios de pH, se pueden medir para determinar si el compuesto potencial activa o inhibe el receptor. Otra de tales técnicas de selección implica la introducción de ARN que codifica C5AR en oocitos de Xenopus para expresar de manera transitoria el receptor. Después los oocitos del receptor se pueden poner en contacto con un ligando de receptor y un compuesto a seleccionar, seguido de la detección de la inhibición o activación de una señal de calcio en el caso de seleccionar compuestos que se cree que inhiben la activación de el receptor.
Otra técnica de selección implica la expresión de C5AR en las células en las que el receptor está ligado a una fosfolipasa C o D. Tales células incluyen células endoteliales, células del músculo liso, células de riñón embrionarias, etc. La selección se puede llevar a cabo como se ha descrito anteriormente mediante la cuantificación del grado de activación del receptor a partir de los cambios en la actividad de la fosfolipasa.
Expresión génica
En otra realización, se identifican los compuestos de ensayo que incrementan o disminuyen la expresión génica de C5AR. Como se usa en el presente documento, la frase "se correlaciona con la expresión de un polinucleótido" indica que la detección de la presencia de ácidos nucleicos, la misma secuencia o relacionada de un ácido nucleico que codifica C5AR, mediante análisis de northern o PCR de tiempo real es indicativo de la presencia de ácidos nucleicos que codifican el C5AR en una muestra, y por lo tanto se correlaciona con la expresión de la transcripción del polinucleótido que codifica C5AR. El término "microdisposición", como se usa en el presente documento, se refiere a una disposición de polinucleótidos u oligonucleótidos distintos dispuestos sobre un sustrato, tal como papel, nylon o cualquier otro tipo de membrana, filtro, procesador, portaobjetos de vidrio, o cualquier otro soporte sólido adecuado. Un polinucleótido de C5AR se pone en contacto con un compuesto de ensayo, y se determina la expresión de un ARN o producto de polipéptido del polinucleótido de C5AR. El nivel de expresión de ARNm o polipéptido apropiado en la presencia del compuesto de ensayo se compara con el nivel de expresión de ARNm o polipéptido en la ausencia del compuesto de ensayo. El compuesto de ensayo se puede después identificar como un regulador de la expresión basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión de ARNm o polipéptido es mayor en la presencia del compuesto de ensayo que en su ausencia, el compuesto de ensayo se identifica con un estimulador o potenciador del ARNm o polipéptido es menor en la presencia del compuesto de ensayo que en su ausencia, el compuesto de ensayo se identifica como un inhibidor de la expresión del ARNm o
polipéptido.
El nivel de la expresión de ARNm o polipéptido de C5AR en las células se puede determinar mediante procedimientos bien conocidos en la técnica para detectar ARNm o polipéptido. Se pueden usar o bien procedimientos cualitativos o cuantitativos. La presencia de productos de polipéptidos del polinucleótido de C5AR se puede determinar, por ejemplo, usando una diversidad de técnicas conocidas en la técnica, incluyendo procedimientos inmunoquímicos tal como radioinmunoensayo, transferencia de Western, e inmunoquímica. Como alternativa, la síntesis de polipéptidos se puede determinar in vivo, en un cultivo celular, o en un sistema de traducción in vitro mediante la detección de la incorporación de aminoácidos marcado en C5AR.
Tal selección se puede llevar a cabo o bien en un sistema sin células o en una célula intacta. Cualquier célula que expresa el polinucleótido de C5AR se puede usar en un sistema de ensayo basado en célula. El polinucleótido de C5AR puede ser de origen natural en la célula o se puede introducir usando las técnicas tales como los descritos anteriormente. Se puede usar un cultivo primario o una línea celular establecida.
Compuestos de ensayo
Los compuestos de ensayo adecuados para uso en los ensayos de selección se pueden obtener a partir de cualquier fuente adecuada, por ejemplo, genotecas de compuestos convencionales. Los compuestos de ensayo también se pueden obtener usando cualquiera de los numerosos planteamientos los procedimientos de genoteca combinatoria conocidos en la técnica, incluyendo: genotecas biológicas; genotecas de fase sólida paralelas dirigidas espacialmente o en fase de solución; procedimientos de genoteca sintéticos que requieren desconvolución; el procedimiento de genoteca "una perla un compuesto"; y procedimientos de genoteca sintética que usan selección por cromatografía de afinidad. El planteamiento de genoteca biológica se limita a genotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro planteamientos son aplicables a genotecas de péptido, oligómero no péptido o de moléculas pequeñas de compuestos [Lam, (1997)]. Los ejemplos de procedimientos para la síntesis de genotecas moleculares se pueden encontrar en la técnica. Las genotecas de los compuestos se pueden presentar en solución o sobre perlas, bacterias, esporas, plásmidos o
fago.
Indicaciones y Procedimientos terapéuticos
El presente solicitante encontró que el C5AR se expresa en diferentes tejidos humanos.
Trastornos cardiovasculares
La insuficiencia cardíaca se define como un estado patofisiológico en el que una anormalidad de la función cardíaca es responsable del fallo del corazón para bombear sangre a una velocidad proporcional con el requerimiento del tejido de metabolización. Se incluyen todas las formas de fallos de bombeo tal como alto rendimiento y bajo rendimiento, agudo y crónico, del lado derecho o del lado izquierdo, sistólico o diastólico, independiente de la causa
subyacente.
El receptor quimiotáctico de anapfilatoxina c5a humano se expresa en gran medida en los siguientes tejidos relacionados cardiovasculares: atrio del corazón (izquierdo), ventrículo del corazón (izquierdo), aorta, arteria, vena. La expresión en los tejidos anteriormente mencionados demuestra que el receptor quimiotáctico de la anafilatoxina c5a humano o ARNm se puede utilizar para diagnosticar las enfermedades cardiovasculares. De manera adicional la actividad del receptor quimiotáctico de la anafilatoxina c5a humano se puede modular para tratar enfermedades cardiovasculares.
Otra técnica para la selección de fármaco que se puede usar proporciona una selección de alto rendimiento de los compuestos que tienen una afinidad de unión adecuada a la proteína de interés como se ha descrito en la solicitud publicada WO84/03564. En este procedimiento se sintetizan numerosos compuestos de ensayo pequeños diferentes sobre un soporte sólido, tal como alfileres de plástico o alguna otra superficie. Los compuestos de ensayo se hacen reaccionar con C5AR, o sus fragmentos, y se lavan. El C5AR unido se detecta después mediante los procedimientos bien conocidos en la técnica. El C5AR purificado también se puede revestir directamente sobre placas para uso en las técnicas de selección de fármaco anteriormente mencionadas. Como alternativa, se pueden usar anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido.
En otra realización, se pueden usar ensayos de selección de fármacos competitivos en los que los anticuerpos de neutralización capaces de unirse C5AR compiten de manera específica con un compuesto de ensayo para unirse a C5AR. De esta manera, los anticuerpos se pueden usar para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos con C5AR.
Determinación de una dosis terapéuticamente eficaz
La determinación de una dosis terapéuticamente eficaz está también dentro de la capacidad de los expertos en la técnica. Una dosis terapéuticamente eficaz se refiere a la cantidad de ingrediente activo que incrementa o disminuye la actividad de C5AR con relación a la actividad de C5AR que se produce en la ausencia de la dosis terapéuticamente eficaz. Para cualquier compuesto, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente o bien en los ensayos de cultivo o en modelos animales, usualmente ratones, conejos, perros, o cerdos. El modelo animal también se puede usar para determinar el intervalo de concentración apropiado y la vía de administración. Después tal información se puede usar para determinar las dosis útiles y vías de administración en seres huma-
nos.
La eficacia y toxicidad terapéutica, por ejemplo, DE_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz al 50% de la población) y DL_{50} (la dosis letal al 50% de la población), se puede determinar mediante procedimientos farmacéuticos convencionales en cultivos de células o animales experimentales. La relación de dosis de efectos tóxicos a terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación DL_{50}/DE_{50}. Se prefieren las composiciones farmacéuticas que muestran grandes índices terapéuticos. Los datos obtenidos a partir de los ensayos de cultivos de células y estudios animales se usan en la formulación de un intervalo de dosificación para uso humano.
La dosificación contenida en tales composiciones está preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE_{50} con poca o ninguna toxicidad. La dosificación varía dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada, sensibilidad del paciente, y la vía de administración. La dosificación exacta se determinará por el facultativo, a la luz de los factores relacionados con el sujeto que requiere tratamiento. La dosificación y administración se ajustan para proporcionar los niveles suficientes del ingrediente activo o para mantener el efecto deseado Los factores que se pueden tener en cuenta incluyen la gravedad del estado patológico, salud general del sujeto, edad, peso, y género del sujeto, dieta, tiempo y frecuencia de administración, combinación(es) de fármaco, sensibilidades a la reacción, y tolerancia/respuesta a la terapia. Las composiciones farmacéuticas de larga duración se pueden administrar cada 3 o 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la semivida y velocidad de eliminación de la formulación particular.
Las cantidades de dosificación normales pueden variar entre 0,1 microgramos y 100.000 microgramos, hasta una dosis total de aproximadamente de 1 g, dependiendo de la vía de administración. La guía para las dosificaciones y procedimientos particulares de distribución se proporciona en la bibliografía y en general disponibles para los facultativos. Los expertos en la técnica emplean diferentes formulaciones para los nucleótidos que para las proteínas o sus inhibidores. De manera similar, la distribución de polinucleótidos o polipéptidos será específica para las células, condiciones, localizaciones, etc. Si el reactivo es un anticuerpo de una sola cadena, los polinucleótidos que codifican el anticuerpo se pueden construir e introducir en una célula o bien ex vivo o in vivo usando las técnicas bien conocidas que incluyen, pero no se limitan a, transferencia de ADN mediada por transferina - policatión, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados, fusión celular mediada por liposomas, transporte intracelular de perlas de látex cubiertas por ADN, fusión de protoplastos, infección viral, electroporación, "pistola génica", y transfección mediada por DEAE- o fosfato de calcio.
Si el producto de expresión es ARNm, el reactivo es preferiblemente un oligonucleótido no codificante o una ribozima. Los polinucleótidos que expresan oligonucleótidos no codificante o ribozimas se pueden introducir en las células mediante procedimientos, como se ha descrito anteriormente. Preferiblemente, un reactivo reduce la expresión del gen de C5AR o la actividad del C5AR en al menos aproximadamente 10, preferiblemente aproximadamente 50, más preferiblemente aproximadamente 75, 90, o 100% con relación a la ausencia del reactivo. La eficacia del mecanismo elegido para disminuir el nivel de expresión del gen de C5AR o la actividad de C5AR se puede establecer usando los procedimientos bien conocidos en la técnica, tal como hibridación de sondas de nucleótidos para el ARNm específico de C5AR, RT-PCR cuantitativa, detección inmunológica de C5AR, o medición de la actividad de
C5AR.
Las moléculas de ácido nucleico usadas en la invención son las moléculas de ácido nucleico que están contenidas en un grupo de moléculas de ácido nucleico que constan de (i) moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, (ii) moléculas de ácido nucleico que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 1, (iii) moléculas de ácido nucleico que tienen la secuencia de SEQ ID NO: 1, (iv) moléculas de ácido nucleico cuya hebra complementaria se hibrida en condiciones rigurosas a una molécula de ácido nucleico de (i), (ii), o (iii); y (v) moléculas de ácido nucleico cuya secuencia difiere de la secuencia de una molécula de ácido nucleico de (iii) debido a la degeneración del código genético, en el que el polipéptido codificado por dicha molécula de ácido nucleico tiene la actividad de C5AR.
Los polipéptidos usados en la invención son los polipéptidos que están contenidos en un grupo de polipéptidos que constan de (i) polipéptidos que tienen la secuencia de SEQ ID NO: 2, (ii) polipéptidos que comprenden la secuencia de la SEQ ID NO: 2, (iii) polipéptidos codificados por moléculas de ácido nucleico de la invención y (iv) polipéptidos que muestran al menos 99%, 98%, 95%, 90%, ó 80% de homología con un polipéptido de (i), (ii), o (iii), en el que dicho polipéptido purificado tiene la actividad de C5AR.
Un objeto de la invención es un procedimiento de selección de los agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de insuficiencia cardíaca en un mamífero que comprende las etapas de (i) poner en contacto un compuesto de ensayo con un polipéptido de C5AR, (ii) detectar la unión de dicho compuesto de ensayo de dicho polipéptido de C5AR. Por ejemplo, los compuestos que se unen al polipéptido de C5AR se identifican como agentes terapéuticos potenciales para tal enfermedad.
Otro objeto de la invención es un procedimiento de selección de los agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de insuficiencia cardíaca en un mamífero que comprende las etapas de (i) determinar la actividad de un polipéptido de C5AR a una cierta concentración de un compuesto de ensayo o en la ausencia de dicho compuesto de ensayo, (ii) determinar la actividad de dicho polipéptido a una concentración diferente de dicho compuesto de ensayo. Por ejemplo, los compuestos que conducen a una diferencia en la actividad del polipéptido de C5AR en (i) y (ii) se identifican como agentes potenciales identificados para tal enfermedad.
Otro objeto de la invención es un procedimiento de selección de los agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de insuficiencia cardíaca en un mamífero que comprende las etapas de (i) determinar la actividad de un polipéptido de C5AR a una cierta concentración de un compuesto de ensayo, ii) determinar la actividad de un polipéptido de C5AR en la presencia de un compuesto conocido para que sea un regulador de un polipéptido de C5AR. Por ejemplo, los compuestos que muestran efectos similares sobre la actividad del polipéptido de C5AR en (i) cuando se compara con los compuestos usados en (ii) se identifican como agentes potenciales identificados para tal enfermedad.
Otros objetos de la invención son procedimientos de lo anterior, en los que la etapa de contacto está en o en la superficie de una célula.
Otros objetos de la invención son procedimientos de lo anterior, en los que la célula está in vitro.
Otros objetos de la invención son procedimientos de lo anterior, en los que la etapa de contacto está en un sistema sin células.
Otros objetos de la invención son procedimientos de lo anterior, en los que el polipéptido está acoplado a una marca detectable.
Otros objetos de la invención son procedimientos de lo anterior, en los que el compuesto está acoplado a una marca detectable.
Otros objetos de la invención son procedimientos de lo anterior, en los que el compuesto de ensayo desplaza un ligando que primero se une al polipéptido.
Otros objetos de la invención son procedimientos de lo anterior, en los que el polipéptido de la invención está unido a un soporte sólido.
Otros objetos de la invención son procedimientos de lo anterior, en los que el compuesto está unido a un soporte sólido.
Otro objeto de la invención es un procedimiento de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de insuficiencia cardíaca en un mamífero que comprende las etapas de (i) poner en contacto un compuesto de ensayo con un polinucleótido de C5AR, (ii) detectar la unión de dicho compuesto de ensayo a dicho polinucleótido de C5AR. Los compuestos que, por ejemplo, se unen al polinucleótido de C5AR son agentes terapéuticos potenciales para el tratamiento de tales enfermedades.
Otro objeto de la invención es el procedimiento de lo anterior, en el que la molécula de ácido nucleico es ARN.
Otro objeto de la invención es un procedimiento de lo anterior, en el que la etapa de poner en contacto está dentro en o en la superficie de una célula.
Otro objeto de la invención es un procedimiento de lo anterior, en el que la etapa de poner en contacto está dentro de un sistema sin células.
Otro objeto de la invención es un procedimiento de lo anterior, en el que el polinucleótido está acoplado a una marca detectable.
Otro objeto de la invención es un procedimiento de lo anterior, en el que el compuesto de ensayo está acoplado a una marca detectable.
Los ejemplos dados más adelante se proporcionan para ilustrar la invención presente. Estos ejemplos se proporcionan a modo de ilustración y no se incluyen con el propósito de limitar la invención.
Ejemplos
Ejemplo 1
Investigación de las secuencias homólogas en las bases de datos de secuencias públicas
El grado de homología se puede calcular fácilmente mediante procedimientos conocidos. Los procedimientos preferidos para determinar la homología se diseñan para proporcionar la concordancia mayor entre las secuencias ensayadas. Los procedimientos para determinar la homología están recopilados en los programas de ordenador disponibles públicamente tales como BestFit, BLASTP, BLASTN, y FASTA. Los programas BLAST están disponibles públicamente a partir de NCBI y otras fuentes en Internet.
Para el C5AR se identificaron los siguientes aciertos para las secuencias conocidas mediante el uso del algoritmo BLAST [Altschul SF, Madden TL, Schaffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ; Nucleic Acids Res 1997 sep 1; 25 (17): 3389 - 402] y el siguiente conjunto de parámetros: matriz = BLOSUM62 y el filtro de complejidad baja. Se investigaron las siguientes bases de datos: NCBI (base de datos no redundante) y base de datos de patente DERWENT (geneses).
Se encontraron los siguientes aciertos:
>gbIAAE02556.1I Secuencia 9 de la patente de Estados Unidos 5861272 Longitud = 350 Puntuación = 702 bits (1811), Previsión = 0,0 Identidades = 350/350 (100%), Positivos = 350/350 (100%).
>refINP_001727.1I receptor 1 del componente 5 de complemento 1 (ligando C5a); receptor 2 del componente 5 de complemento (Ligando C5a) [Homo sapiens] spIP21730IC5AR_HUMAN receptor C5a de receptor quimiotáctico de anafilatoxina (C5a-R) (antígeno C088) pirIIA37963 receptor C5a de complemento de anafilotoxina - humano emb1CAA40530.1I receptor C5A [Homo sapiens] gb1AAA62831.1I receptor C5a de anafilotoxina emb1CAB37830.11 receptor C5a de anafilotoxina [Homo sapiens] gb1AAH08982.1IAAH08982 receptor 1 del componente 5 de complemento (Ligando C5a) [Homo sapiens] Longitud = 350 Puntuación = 702 bits (1811), Previsión = 0,0 Identidades = 350/350 (100%), Positivos = 350/350 (100%).
>prf111705295A receptor C5a del receptor quimiotáctico de anafilotoxina Longitud = 350 Puntuación = 698 bits (1801), Previsión = 0,0 Identidades = 349/350 (99%), Positivos = 349/350 (99%).
>spl P79175IC5AR_GORGO receptor C5a del receptor quimiotáctico de anafilotoxina (C5a-R) emb1CAA66317.
11 receptor C5a [Gorilla gorilla] Longitud = 340 Puntuación = 676 bits (1745), Previsión = 0,0 Identidades = 337/340 (99%), Positivos = 338/340 (99%).
>spl P79240IC5AR_PANTR receptor C5a del receptor quimiotáctico de anafilotoxina (C5a-R) emb1CAA66314.
11 receptor C5a [Pan troglodytes] Longitud = 340 Puntuación = 676 bits (1743), Previsión = 0,0 Identidades = 337/340 (99%), Positivos = 338/340 (99%).
>spl P791881C5AR_<MACMU receptor C5a del receptor quimiotáctico de anafilotoxina (C5a-R) emb1
CAA66315.11 receptor C5a [Macaca mulatta] Longitud = 340 Puntuación = 660 bits (1702), Previsión = 0,0 Identidades = 326/340 (95%), Positivos = 333/340 (97%).
>spIP79234IC5AR_PONPY receptor C5a del receptor quimiotáctico de anafilotoxina (C5a-R) emb1CAA66316.
11 receptor C5a [Pongo pygmaeus] Longitud = 340 Puntuación = 659 bits (1701), Previsión = 0,0 Identidades = 327/340 (96%), Positivos = 332/340 (97%).
>gbIAAB11 098.11 Secuencia 35 de la patente de Estados Unidos US 5508384 Longitud = 304 Puntuación = 586 bits (1511), Previsión = e-166 45 Identidades = 300/315 (95%), Positivos = 302/315 (95%), Huecos=12/315 (3%).
>spIQ9TUE1IC5AR_RABIT receptor C5a del receptor quimiotáctico de anafilotoxina (C5a-R) gb1AAF13030. 11AF068680_1 receptor C5a de anafilotoxina [Oryctolagus cuniculus] Longitud = 350 Puntuación = 522 bits (1344), Previsión = e-147 Identidades = 261/345 (75%), Positivos = 292/345 (83%), Huecos = 1/345 (0%).
>spIP30992IC5AR_CANFA receptor C5a del receptor quimiotáctico de anafilotoxina (C5a-R) pirIIS27357 receptor C5a de anafilotoxina de complemento - perro emb1CAA46690.11 receptor C5a de complemento [Canis familiaris] Longitud = 352 Puntuación = 471 bits (1212), Previsión = e-132 Identidades = 243/353 (68%), Positivos = 282/353 (79%), Huecos = 4/353 (1%).
>refINP_446071.1I componente 5 de complemento, receptor 1 [Rattus norvegicus] spIP97520IC5AR_RAT receptor C5a del receptor quimiotáctico de anafilotoxina (C5a-R) emb1CAA70825.11 receptor C5a [Rattus norvegicus] dbj1BAA20263.11 receptor C5a [Rattus norvegicus] Longitud = 352 Puntuación = 470 bits (1209), Previsión = e-131 Identidades = 227/315 (72%), Positivos = 273/315 (86%), Huecos = 1/315 (0%).
>refINP_031603.1 componente 5 de complemento, receptor 1; Ligando C5a [Mus musculus] pirIIA46525 receptor C5a de complemento de anafilotoxina - ratón gbIAAB97774.1 receptor C5a de anafilotoxina; C5aR [Mus musculus] Longitud = 351 Puntuación = 459 bits (1182), Previsión = e-128 Identidades = 227/340 (66%), Positivos = 276/340 (80%), Huecos = 2/340 (0%).
>spIP30993IC5AR_RATÓN receptor C5a del receptor quimiotáctico de anafilotoxina (C5a-R) Longitud = 347 Puntuación = 459 bits (1181), Previsión = e-128 Identidades = 227/340 (66%), Positivos = 276/340 (80%), Huecos = 2/340 (0%).
>spI070129IC5AR_CAVPO receptor C5a del receptor quimiotáctico de anafilotoxina (C5a-R) gb1AAC40074.11 receptor C5a de anafilotoxina [Cavia porcellus] Longitud = 345 Puntuación = 447 bits (1149), Previsión = e-124 Identidades = 226/337 (67%), Positivos = 263/337 (77%).
>gbIAAG12474.1IAF284498_1 receptor C5a de anafilotoxina [Sus scrofa] Longitud = 227 Puntuación = 345 bits (885), Previsión = 6e-94 Identidades = 167/224 (74%), Positivos = 190/224 (84%), Huecos = 1/224 (0%).
>gbIAAG12475.1IAF284499_1 receptor C5a de anafilotoxina [Ovis aries] Longitud = 227 Puntuación = 338 bits (868), Previsión = 5e-92 Identidades = 164/224 (73%), Positivos = 190/224 (84%), Huecos = 1/224 (0%).
>gbIAAG24260.1IAF090996_1 receptor acoplado a la Proteína G putativo [Rattus norvegicus] Longitud = 220 Puntuación = 322 bits (824), Previsión = 7e-87 identidades = 152/220 (69%), Positivos = 186/220 (84%), Huecos = 11220 (0%).
>embICAC51134.1 producto de proteína no nombrado [Homo sapiens] Longitud = 337 Puntuación = 234 bits (598), Previsión = 1e60 Identidades = 129/333 (38%), Positivos = 183/333 (54%), Huecos = 17/333 (5%).
>refINP_060955.1 receptor C5L2 acoplado a proteína G [Homo sapiens] spI09P296IC5L2_HUMAN receptor C5a del receptor quimiotáctico de anafilotoxina C5L2 dbj1BAA95414.11 receptor de proteína acoplado a la proteína G C5L2 [Homo sapiens] gbIAAK12640.1IAF317655_1 receptor acoplado a proteína G [Homo sapiens] Longitud = 337 Puntuación = 234 bits (598), Previsión = 1e-60 Identidades = 129/333 (38%), Positivos = 183/333 (54%), Huecos = 17/333 (5%).
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Ejemplo 2
Perfil de expresión
Se aisló ARN total celular a partir células mediante uno de dos procedimientos convencionales: 1) centrifugación en gradiente de densidad de isotiocianato de guanidina/cloruro de cesio [Kellogg, (1990)]; o con el protocolo de Tri-Reagent de acuerdo con las especificaciones del fabricante (Molecular Research Center, Inc., Cincinatti, Ohio). El ARN total preparado por el protocolo de Tri-reagent se trató con ADNasa I para retirar la contaminación de ADN genómica.
Para la cuantificación relativa de la distribución de ARNm de C5AR, el ARN total de cada fuente celular o de tejido primero se transcribió de manera inversa 85 \mug de ARN total se transcribió de manera inversa usando 1 \mumol de cebadores de hexámeros al azar, 0,5 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP (Qiagen, Hilden, Alemania), 3000 U RnaseQut (Invitrogen, Groningen, Holanda) en un volumen final de 680 \mul. El tampón de síntesis de la primera hebra y transcriptasa inversa Omniscript (2 u/\mul) eran de (Qiagen, Hilden, Alemania). La reacción se incubó a 37°C durante 90 minutos y se enfrió sobre hielo. El volumen se ajustó hasta 6800 \mul con agua, produciendo una concentración final de 12,5 ng/\mul de ARN de partida.
Para la cuantificación relativa de la distribución del ARNm de C5AR en las células y tejidos se usó el Sistema de Detección de Secuencias de Applied Biosystems 7900 HT o Biorad iCycler de acuerdo con las especificaciones y protocolos del fabricante. Las reacciones de la PCR se establecieron para cuantificar C5AR y los genes controladores positivos de expresión HPRT (hipoxantina fosforibosiltransferasa), GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenase), \beta-actina, y otros. Los cebadores directos e inversos y sondas para C5AR se diseñaron usando el software Perkin Elmer ABI Primer Express^{TM} y se sintetizaron mediante TibMolBiol (Berlin, Alemania). La secuencia del cebador directo de C5AR era: Cebador 1 (SE Q ID NO: 3). La secuencia del cebador inverso de C5AR era Cebador 2 (SEQ ID NO: 5). Sonda 1 (SEQ ID NO: 4), marcada con FAM (carboxifluoresceína succinimidil éster) como el tinte indicador y TAMRA (carboxitetrametilrodamina) como el inactivador, se usa como una sonda para la proteína de tipo UST3 1. Se prepararon los siguientes reactivos en un total de 25 \mul: tampón A 1x TaqMan, 5,5 mM MgCl_{2}, 200 nM de dATP, dCTP, dGTP, y dUTP, 0,025 U/\mul AmpliTaq Gold^{TM}, 0,01 U/\mul AmpErase y Sonda 1 (SEQ ID NO: 4), cebadores directo e inverso de C5AR cada uno a 200 nM, 200 nM, C5AR humana sonda marcada con FAM/TAMRA-, y 5 \mul de ADNc de molde. Los parámetros de ciclación térmica eran 2 min a 50°C, seguido de 10 min a 95°C, seguido de 40 ciclos de fusión a 95°C durante 15 segundos e hibridación/extensión a 60°C durante 1
min.
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Cálculo de los valores corregidos de CT
El valor de CT (ciclo de umbral) se calcula como se describe en la sección de "Determinación cuantitativa de ácidos nucleicos". El valor de CF - (factor para la corrección del ciclo umbral) se calcula como sigue:
1. Se establecieron las reacciones de la PCR para cuantificar los genes controladores positivos de la expresión (HKG) para cada muestra de ADNc.
2. Los valores de CT_{HKG} - (ciclo umbral del gen controlador positivos de la expresión) se calcularon como se ha descrito en la sección "Determinación cuantitativa de ácidos nucleicos".
3. Se calculan los valores medios de CT (valor medio de CT de los HKG ensayados sobre uno de los ADNc) de todos los HKG para cada ADNc (n = número de HKG):
Valor\ medio\ de\ CT_{HKG-n} = (valor\ de\ CT_{HKG1} + valor\ de\ CT_{HKG2} + ...\ valor\ de\ CT_{HKG-n})/n
4. Valor medio de CT_{panel} (valor medio de CT de todos los HKG en todos los ADNc ensayados) =
(Valor\ medio\ de\ CT_{HKG1} + valor\ medio\ de\ CT_{HKC2} + ... + valor\ medio\ de\ CT_{HKG-y})/y (y = número\ de\ ADNc)
\newpage
5. CF_{ADNc-n} (factor de corrección para ADNc n) = valor medio de CT_{pannel} - valor medio de CT_{HKG-n}.
6. CT_{ADNc-n} (valor medio de CT del gen ensayado para el ADNc n) + CF_{ADNc-n} (factor de corrección para ADNc n) = CT_{cor-ADNc-n}
(valor de CT corregido para un gen de ADNc n).
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Cálculo de expresión relativa
Definición: el valor mayor de CT_{cor-ADNc-n} \neq 40 se define como CT_{cor-ADNc} [alto]
Expresión\ relativa = 2^{(CTcor-ADNc[alto] - CTcor-ADNc-n)}
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Tejidos
La expresión de C5AR se investigó en los tejidos enumerados en la tabla 1.
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Perfil de expresión
Los resultados de la cuantificación de ARNm (perfil de expresión) se muestra en la Tabla 1.
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TABLA 1 Expresión relativa de C5AR en diversos tejidos humanos 
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1
2
3
4 
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Ejemplo 3
Análisis no codificante
El conocimiento de la secuencia de ADNc, correcta, completa que codifica C5AR permite su uso como una herramienta para la tecnología no codificante en la investigación de la función génica. Los oligonucleótidos, ADNc o fragmentos genómicos que comprenden la hebra no codificante de un polinucleótido que codifica C5AR se usan o bien in vitro o in vivo para inhibir la traducción del ARNm. Tal tecnología se conoce bien en la técnica, y moléculas no codificantes se pueden diseñar en diversas localizaciones junto con las secuencias de nucleótidos. Mediante tratamiento de células o animales de ensayo enteros con tales secuencias no codificantes, el gen de interés se cierra de manera eficaz. Frecuentemente, la función del gen se determina mediante la observación del comportamiento a nivel intracelular, celular, de tejido o de organismo (por ejemplo, letalidad, pérdida de función diferenciada, cambios en la morfología, etc.).
Además de usar las secuencias construidas para interrumpir la transcripción de un marco abierto de lectura particular, se obtienen modificaciones de la expresión génica diseñando las secuencias no codificantes a las regiones de intrón, elementos promotor/potenciador, o incluso para tramitar los genes reguladores.
\newpage
Ejemplo 4
Expresión de C5AR
La expresión de C5AR se lleva a cabo mediante la subclonación de los ADNc en los vectores de expresión apropiados y transfectando los vectores en los huéspedes de expresión tales como, por ejemplo, E. coli. En un caso particular, el vector se modifica de manera genética de manera que contenga un promotor de la \beta-galactosidasa, cadena arriba del sitio de clonación, seguido de la secuencia que contiene la metionina amino terminal y los posteriores siete restos de \beta-galactosidasa. Inmediatamente después de de estos ocho restos es un promotor bacteriófago modificado por ingeniería genética útil para el cebado artificial y transcripción y para proporcionar un número de sitios de restricción de endonucleasa para clonación.
La inducción de la cepa bacteriana aislada transfectada con Isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) usando procedimientos convencionales produce una proteína de fusión que corresponde a los primeros siete restos de la \beta-galactosidasa, aproximadamente 15 restos de "engarce", y el péptido codificado dentro del ADNc. Ya que las inserciones del clon de ADNc se generan mediante un procedimiento esencialmente al azar, existe una probabilidad del 33% de que el ADNc incluido se ubique en el marco de lectura correcto para la traducción apropiada. Si el ADNc no es el marco de lectura apropiado, se obtiene mediante supresión o inserción del número apropiado de bases que usan los procedimientos bien conocidos que incluyen mutagénesis in vitro, digestión con la endonucleasa III o nucleasa de judía mung, o la inclusión de un engarce de oligonucleótido de una longitud apropiada.
El ADNc de C5AR se transfiere en otros vectores que se conoce que son útiles para la expresión de proteínas en huéspedes específicos. Los cebadores de oligonucleótido que contienen sitios de clonación así como un segmento de ADN (aproximadamente 25 bases) suficiente para hibridarse a tramos en ambos extremos del ADNC diana se sintetiza de manera química mediante procedimientos convencionales. Estos procedimientos después se usan para amplificar el segmento del gen deseado mediante la PCR. El segmento del gen resultante se digiere con enzimas de restricción apropiadas en condiciones convencionales y aislarse mediante electroforesis en gel. De manera alternativa, los segmentos de genes similares se producen mediante digestión del ADNc con enzimas de restricción apropiadas. Usando los cebadores apropiados, los segmentos de la secuencia de codificación de más de un gen se ligan conjuntamente y se clonan en vectores apropiados. Es posible optimizar la expresión mediante la construcción de tales secuencias quiméricas.
Los huéspedes de expresión adecuados para tales moléculas quiméricas incluyen, pero no se limitan a, células de mamíferos tales como células de Ovario de Hámster Chino (CHO) y células 293 humanas, células células de insecto tales como células Sf9, células de levadura tales como Saccharomyces cerevisiae y células huésped tales como E. coli. Para cada uno de estos sistemas de células, un vector de expresión útil también incluye un origen de replicación para permitir la propagación en bacterias, y un marcador que se puede seleccionar tal como el gen de resistencia al antibiótico \beta-lactamasa que permite la selección de plásmido en bacterias. Además, el vector puede incluir un segundo marcador que se puede seleccionar tal como el gen de neomicina fosfotransferasa que permite la selección en las células huésped eucarióticas transfectadas. Los vectores para uso en huésped de expresión eucariótico requieren los elementos de procesamiento de ARN tal como las secuencias de 3'-poliadenilación si tales no son parte del ADNc de interés.
De manera adicional, el vector contiene promotores o potenciadores que incrementan la expresión génica. Tales promotores son huéspedes específicos e incluyen MMTV, SV40, y promotores de metalotionina para las células de CHO; promotores de trp, lac, tac y T7 para huéspedes bacterianos; y factor alfa, alcohol oxidasa y promotores de PGH para levadura. Los potenciadores de transcripción, tales como el potenciador del virus de sarcoma rous, se usan en células huésped de mamífero. Una vez se obtienen los cultivos homogéneos de las células recombinantes mediante procedimientos de cultivo convencionales, se recuperan grandes cantidades de C5AR producida de manera recombinante a partir del medio acondicionado y se analiza usando los procedimientos cromatográficos conocidos en la técnica. Por ejemplo, C5AR se puede clonar en el vector de expresión pADNc3, como se ejemplifica en el presente documento. Este producto se usar para transformar, por ejemplo, HEK293 o COS mediante procedimiento convencional en la técnica. Específicamente, por ejemplo, usando la transferencia de gen mediada por Lipofectamine (Gibco BRL n° de catálogo 18324-020).
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Ejemplo 5
Aislamiento de C5AR recombinante
El C5AR se expresa como una proteína quimérica con uno o más dominios de polipéptido adicional añadidos para facilitar la purificación de proteína. Tales dominios que facilitan la purificación incluyen, pero no se limitan a, péptidos quelantes de metal tales como los módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación sobre metales inmovilizados [Appa Rao (1997)] y el dominio utilizado en el sistema de extensión/purificación por afinidad FLAGS (Immunex Corp., Seattle, Washington). La inclusión de una secuencia engarce de escisión tal como el Factor Xa o enteroquiinasa (Invitrogen, Groningen, Holanda) entre el dominio de purificación y la secuencia de C5AR es útil para facilitar la expresión de C5AR.
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Ejemplo 6
Ensayo de GPCR
Los GPCR quiméricos funcionales se construyen mediante combinación de las secuencias receptoras extracelulares de una nueva isoforma con los segmentos transmembrana e intracelulares de una isoforma conocida para los propósitos de ensayo. Este concepto fue demostrado por Kobilka et al. (1988), Science 240: 1310 - 1316) que crearon una serie de receptores adrenérgicos (AR) \alpha2-\beta2 quiméricos mediante la inserción de manera progresiva de mayores cantidades de la secuencia transmembrana \alpha2-AR en \beta2-AR. La actividad de unión de agonistas conocidos cambió a medida que la molécula desplazada que tiene más conformación \alpha2 que \beta2, y las construcciones intermedias demostraron especificidad mixta. Sin embargo, la especificidad para los antagonistas de unión, están correlacionadas con la fuente del dominio VII. La importancia del dominio VII de T7G para el reconocimiento de ligandos también se encontró en quimeras que utilizan dos receptores del factor \alpha de levaduras y es significativo debido a que los receptores de levaduras se clasifican como receptores varios. De este modo, el papel funcional de los dominios específicos parece que está conservado mediante la familia de GPCR independientemente de la
categoría.
De una manera paralela, los segmentos internos o dominios GPCR conocidos y se usaron para identificar los determinantes estructurales responsables del acoplamiento de los receptores de las proteínas G quiméricas. Un receptor quimérico en los que los dominios V, VI, y el bucle de conexión intracelular de \beta2-AR se sustituyeron en \alpha2-AR se mostró que se une a los ligandos con especificidad \alpha2-AR, pero estimulan la adenilato ciclasa en la forma de \beta2-AR. Esto demuestra que para los receptores de tipo adrenérgico, el reconocimiento de la proteína G está presente en los dominios V y VI y su bucle de conexión. La situación opuesta se predijo y se observó para un una quimera en la que el bucle V -> VI de un \alpha1-AR reemplazó el dominio correspondiente sobre \beta2-AR y los ligandos unidos al receptor con especificidad de \beta2-AR y recambio de fosfatidilinositol mediado por la proteína G activado de la manera \alpha1-AR. Finalmente las quimeras construidas a partir de los receptores muscarínicos también demostraron que el bucle V->VI es el determinante principal para la especificidad de la actividad de la proteína G.
Los GPCR que contienen sustituciones modificadas o quiméricas en las regiones extracelulares y transmembrana han mostrado que estas porciones del receptor determinan la especificidad de unión a ligando. Por ejemplo, dos restos de serina conservados en el dominio V de todos los GPCR adrenérgicos y de D catecolamina son necesarios para la actividad agonista potente. Estas serinas se cree que forman enlaces de hidrógeno con el resto catecol de los agonistas dentro del sitio de unión de GPCR. De manera similar, un resto Asp presente el dominio III de todos los GPCR que se unen a aminas biogénicas se cree que forman un par de iones con el grupo de amina del ligando en el sitio de unión de GPCR.
Los GPCR funcionales, clonados se expresan en sistemas de expresión heterólogas y se establece su actividad biológica. Un sistema heterólogo introduce genes para un GPCR de mamífero y una proteína G de mamífero en células de levadura. El GPCR se muestra que tiene especificidad de ligandos apropiada y afinidad y desencadenamiento adecuado de la activación biológica (detención del crecimiento y cambios morfológicos) de las células de levadura.
Un procedimiento alternativo para ensayar los receptores quiméricos se basa en el procedimiento que utiliza el receptor purinérgico (P_{2}u). La función se ensaya fácilmente en células de leucemia K562 cultivadas debido a que estas células carecen de los receptores P_{2}u. Las células K562 se transfectan con vectores de expresión que contienen P_{2}u normal o quimérico y se cargan con fura-a, sonda fluorescente para Ca^{++}. Activación de los receptores de P_{2}u ensamblados apropiadamente y funcionales con UTP o ATP extracelular moviliza el Ca^{++} intracelular que reacciona con fura-a y se mide de manera espectrofluorométrica.
Como los GPCR anteriores, los genes quiméricos crean mediante combinación de secuencias de secuencias para los segmentos receptores extracelulares de cualquier nuevo polipéptido de GPCR con los nucleótidos para los segmentos de transmembrana e intracelulares de la P_{2}u conocida. El baño de las células K562 transfectadas en micropocillos que contienen los ligandos apropiados desencadena la actividad de unión y fluorescente que definen los efectores de la molécula de GPCR. Una vez que se establece un ligando y función, el sistema de P2u es útil para definir los antagonistas o inhibidores que bloquean la unión y evitan tales reacciones fluorescentes.
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Ejemplo 7
Producción de anticuerpos específicos de C5AR
Se utilizan dos planteamientos para inducir anticuerpos para C5AR, y cada planteamiento es útil para generar anticuerpos o bien policlonales o monoclonales. En un planteamiento, la proteína desnaturalizada de la separación de HPLC de fase inversa se obtiene en cantidades de hasta 75 mg. Esta proteína desnaturalizada se usa para inducir anticuerpos para inmunizar ratones o conejos que usan protocolos convencionales; aproximadamente 100 \mug son adecuados para la inmunización de un ratón, mientras hasta 1 mg se podría usar para inmunizar un conejo. Para identificar hibridomas de ratón, la proteína desnaturalizada se radioyoda y se usa para seleccionar los hibridomas de células B inmunes potenciales para los que producen anticuerpo. Este procedimiento requiere solamente cantidades pequeñas de proteína, tal como 20 mg es suficiente para marcar y seleccionar varios miles de clones.
En el segundo planteamiento, la secuencia de aminoácidos de un dominio de C5AR apropiado, como se deduce de la traducción del ADN, se analiza para determinar las regiones de alta antigenicidad. Los oligopéptidos que comprenden regiones hidrófilas se sintetizan y se usan en protocolos de inmunización adecuados para inducir anticuerpos. Las secuencias de aminoácidos óptimas para la inmunización están usualmente en el extremo C, el extremo N y los que intervienen, regiones hidrófilas del polipéptido que probablemente se exponen al ambiente externo cuando la proteína está en su conformación natural.
Típicamente, los péptidos seleccionados, de aproximadamente 15 restos de longitud, se sintetizan usando un Sintetizador de Péptidos de Applied Biosystems Modelo 431A usando la química de fmoc y se acoplaron a la hemocianica de lapa californiana (KLH; Sigma, St. Louis, MO) mediante reacción con M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida éster, MBS. Si es necesario, se introduce una cisteína en el extremo N del péptido que permite el acoplamiento a KLH. Se inmunizan los conejos con el complejo péptido KLH en adyuvante de Freund' completo. Los antisueros resultantes se ensayan para determinar la actividad de antipéptido mediante la unión del péptido a plástico, bloqueando con 1% de albúmina sérica bovina, haciendo reaccionar con antisuero, lavando y haciendo reaccionar con IgG marcado (radioactivo o fluorescente), purificado por afinidad, anticonejo de cabra específico.
Los hibridomas se preparan y se seleccionan usando técnicas convencionales Los hibridomas de interés se detectan mediante selección con C5AR marcado para identificar las fusiones que producen el anticuerpo monoclonal con la actividad deseada. En un protocolo típico, los pocillos de las placas (FAST; Becton-Dickinson, Palo Alto, CA) se recubren durante la incubación con anticuerpos purificados por afinidad, anti-conejo de conejo específico (o antiespecies adecuados 1 g) a 10 mg/ml. Los pocillos recubiertos se bloquean con albúmina sérica bovina (BSA) al 1, se lavan y se incuban con los sobrenadantes de hibridomas. Después de lavar los pocillos se incuban con C5AR marcado a 1 mg/ml. Los sobrenadantes con anticuerpos se unen a C5AR más marcado que es detectable en el trasfondo. Después los clones que producen anticuerpos específicos se expanden y se someten a dos ciclos de clonación en la dilución limitante. Los hibridomas clonados se inyectan en ratones tratados con pristano para producir ascitos, y se purifica el anticuerpo monoclonal del fluido de ascitos de ratones mediante cromatografía por afinidad sobre Proteína A. Los anticuerpos monoclonales con afinidades de al menos 10^{8} M^{-1}, preferiblemente 10^{9} a 10^{10} M^{-1} o mayor, se preparan típicamente mediante procedimientos convencionales.
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Ejemplo 8
Purificación de C5AR nativo usando anticuerpos específicos
Se purifica C5AR nativo o recombinante mediante cromatografía de inmunoafinidad usando los anticuerpos específicos para C5AR. En general, se construye una columna de inmunoafinidad mediante acoplamiento covalente del anticuerpo anti-TRH a una resina cromatográfica activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a partir de suero inmune o bien mediante precipitación con sulfato de amonio o mediante purificación sobre Proteína A inmovilizada (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway N.J.). De manera similar, los anticuerpos se preparan a partir de fluidos de ascitos de ratón mediante precipitación con sulfato de amonio o cromatografía sobre Proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina purificada parcialmente se une de manera covalente a una resina cromatográfica tal como Sefarosa activada por CnBr (Pharmacia LKB Biotechnology). El anticuerpo se acopla a la resina, se bloquea la resina, y la resina derivada se lava de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Tales columnas de afinidad se utilizan en la purificación de C5AR mediante la preparación de una fracción de células que contienen C5AR en una forma soluble. Esta preparación se deriva mediante la solubilización de células enteras o de una fracción subcelular obtenida mediante centrifugación diferencial (con o sin la adición de detergente) o mediante otros procedimientos bien conocidos en la técnica. Como alternativa, C5AR soluble que contiene una secuencia de señal se secreta en cantidad útil en el medio en el que se desarrollan las células.
Una preparación que contiene C5AR soluble se pasa sobre la columna inmunológica, y la columna se lava en condiciones que permiten la absorbancia preferencial de C5AR (por ejemplo, tampones de alta resistencia iónica en la presencia de detergente). Después, la columna se eluye en condiciones que interrumpen la unión de anticuerpo/proteína (por ejemplo, un tampón de pH 2 - 3 o una alta concentración de un chaotropo tal como ion urea o tiocianato), y se recoge C5AR.
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Ejemplo 9
Selección de fármacos
Esta invención es particularmente útil para la selección de compuestos terapéuticos mediante el uso de C5AR o sus fragmentos de unión en cualquiera de una diversidad de técnicas de selección de fármacos. Ya que C5AR es un receptor acoplado a la proteína G cualquiera de los procedimientos usados de manera común en la técnica se pueden usar potencialmente para identificar los ligandos a de C5AR. Por ejemplo, la actividad de un receptor acoplado a la proteína G se puede medir usando cualquiera de una diversidad de ensayos funcionales en los que la activación del receptor da como resultado un cambio observable en el nivel de algún segundo sistema de mensajero, tal como movilización por adenilato ciclasa, guanililciclasa, calcio, o hidrólisis de inositol fosfolípido. Como alternativa, el polipéptido o fragmento empleado en tal ensayo está o bien libre en solución, fijado a un soporte sólido, nacido sobre una superficie celular o localizado de manera intracelular. Un procedimiento de selección de fármacos utiliza células huésped eucarióticas o procarióticas que se transforman de manera estable con ácidos nucleicos que expresan el polipéptido o fragmento. Los fármacos se seleccionan contra tales células transformadas en ensayos de unión competitivos. Tales células, o bien en forma viable o fijada, se usan para los ensayos de unión convencionales.
Se mide, por ejemplo, la formación de los complejos entre C5AR y el agente que se está ensayando. Como alternativa, se examina la disminución de la formación del complejo entre C5AR y un ligando provocada por el agente que se está ensayando.
De este modo, la presente invención proporciona procedimientos para seleccionar candidatos de fármacos, fármacos, o cualesquiera otros agentes que afectan a la transducción de señal. Estos procedimientos, bien conocidos en la técnica, comprenden poner en contacto tal agente con el polipéptido de C5AR o su fragmento y ensayar (i) para determinar la presencia de un complejo entre el agente y polipéptido o fragmento de C5AR, o (ii) para determinar la presencia de un complejo entre el polipéptido de C5AR o fragmento y la célula. En tales ensayos de unión competitiva, el polipéptido de C5AR o fragmento está marcado de manera típica. Después de la incubación adecuada, el polipéptido libre de C5AR o fragmento se separa de la presente en la forma unida, y la cantidad de la marca libre o que no forma complejo es una medición de la capacidad del agente particular a unirse a C5AR o que interfiera con el complejo C5AR - agente.
Otra técnica para la selección de fármacos proporciona la selección de alto rendimiento de los compuestos que tienen afinidad de unión adecuada a los polipéptidos de C5AR. En resumen se establece, grandes números de cantidades pequeñas de diferentes compuestos de ensayo se sintetizan sobre un sustrato sólido, tal como alfileres de plástico o alguna otra superficie. Los compuestos de ensayo de péptido se hacen reaccionar con polipéptido de C5AR y se lavan. El polipéptido de C5AR unido se detecta después mediante los procedimientos bien conocidos en la técnica. El C5AR purificado también se reviste directamente sobre placas para uso en las técnicas de selección de fármaco anteriormente mencionadas. Además, se pueden usar anticuerpos no neutralizantes para capturar el péptido e inmovilizarlo sobre un soporte sólido.
Esta invención también contempla el uso de ensayos de selección de fármacos competitivos en los que los anticuerpos de neutralización capaces de unirse a C5AR compiten de manera específica con un compuesto de ensayo para unirse a polipéptidos de C5AR o sus fragmentos. De esta manera, los anticuerpos se usan para detectar la presencia de cualquier péptido que comparte uno o más determinantes antigénicos con C5AR.
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Ejemplo 10
Diseñó de fármaco racional
El objetivo de diseño de fármaco racional es producir análogos estructurales polipéptidos biológicamente activos de interés o de moléculas pequeñas con las que interactúan, agonistas, antagonistas, o inhibidores. Cualquiera de estos ejemplos se usa para modelar fármacos que son más activos o formas estables del polipéptido o que potencian o interfieren con la función de un polipéptido in vivo.
En un planteamiento, la estructura de tres dimensiones proteína de interés, o de un complejo inhibidor de proteína, se determina mediante cristalografía de rayos X, mediante modelado por ordenador o, más típicamente, mediante una combinación de los dos planteamientos. Tanto la forma como cargas del polipéptido se debe determinar para elucidar la estructura y para determinar el (los) sitio(s) activo(s) de la molécula. Menos a menudo, la información útil con relación a la estructura de un polipéptido se gana mediante modelado basándose en la estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la información estructural relevante se usa para diseñar inhibidores eficaces. Los ejemplos útiles del diseño de fármaco racional incluyen moléculas que tienen una actividad o estabilidad mejorada o que actúan como inhibidores, agonistas, o antagonistas de los péptidos nativos.
También es posible aislar un anticuerpo específico diana, seleccionado mediante ensayo funcional, como se ha descrito anteriormente, y después resolver su estructura cristalina. Este planteamiento, en principio, produce un farmanúcleo en el que se basa el diseño del fármaco. Es posible desviar la cristalografía de proteína en conjunto mediante la generación de anticuerpos antiidiotípicos (anti-ids) a un anticuerpo funcional, farmacológicamente activo. Como una imagen especular de una imagen en el espejo, el sitio de unión de los anti-ids se espera que sea un análogo de la transferasa original. Los anti-ids después se usan para identificar t aislar péptidos de bancos de péptidos producidos de forma química o biológica. Los péptidos aislados después actúan como el farmanúcleo.
En virtud de la presente invención, se prepara cantidad suficiente de polipéptido disponible para realizar tales estudios analíticos como cristalografía de rayos X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos de C5AR proporcionada en el presente documento proporciona la guía de aquellas que emplean técnicas de modelación por ordenador.
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Ejemplo 11
Identificación de otros miembros del complejo de la transducción de señal
El C5AR purificado de la invención es una herramienta de investigación, caracterización y purificación de interacción de G u otras proteínas de la ruta de transducción de señal. Las marcas radiactivas se incorporan en un dominio de C5AR seleccionado mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica y se usan in vitro para capturar las moléculas de interacción. Un procedimiento preferido implica el marcado de los grupos amino primarios en C5AR con reactivo ^{125}I Bolton-Hunter. Este reactivo se ha usado para marcar diversas moléculas sin la pérdida concomitante de la actividad biológica.
El C5AR marcado es útil como un reactivo para la purificación de las moléculas con el que interactúa. En una realización de la purificación de afinidad, el C5AR unido a membrana está acoplado de manera covalente a una columna de cromatografía. El extracto sin células derivado de células sinoviales o células diana supuestas se pasa sobre la columna, y las moléculas con la afinidad apropiada se unen a C5AR. El complejo C5AR se recupera de la columna, y se disocia el ligandos de unión a C5AR y se somete a la secuenciación de la proteína N-terminal. La información de la secuencia de aminoácidos se usa después para identificar la molécula capturada o para diseñar las sondas de oligonucleótidos degenerados para clonar el gen relevante de de una genoteca de ADNc
apropiada.
En un procedimiento alternativo, los anticuerpos se inducen contra C5AR, específicamente anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se seleccionan para identificar los que inhiben la unión de C5AR marcado. Estos anticuerpos monoclonales se usan después de manera terapéutica.
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Ejemplo 12
Uso y Administración de Anticuerpos, Inhibidores, o Antagonistas
Los Anticuerpos, inhibidores, o antagonistas de C5AR u otros tratamientos y compuestos que son limitadores de la transducción de la señal (LST), proporcionan efectos diferentes cuando se administran de manera terapéutica. LST se formulan en un medio vehículo acuoso no tóxico, inerte, farmacéuticamente aceptable, preferiblemente a un pH de aproximadamente 5 a 8, más preferiblemente 6 a 8, aunque el pH puede variar de acuerdo con las características del anticuerpo, inhibidor, o antagonista que se formula y la afección a tratar. Las características de los LST incluyen la solubilidad de la molécula, se semivida y antigenicidad/inmunogenicidad. Estas y otras características ayudan en la definición de un vehículo eficaz. Las proteínas humanas nativas se prefieren como LST, pero las moléculas orgánicas o sintéticas que se producen a partir de selecciones de fármacos son igualmente eficaces en situaciones
particulares.
Los LST se administran mediante vías de administración que incluyen pero no se limitan a cremas y geles tópicos; pulverización y aerosol transmucosal; parche transdérmico y venda; formulaciones inyectables, intravenosas y de lavado; y líquidos y pastillas administrados por vía oral particularmente formuladas para resistir las enzimas ácidas del estómago. La formulación particular, dosis exacta, y vía de administración se determina por el médico asistente y varía de acuerdo con cada situación específica.
Tales determinaciones se realizan mediante la consideración de múltiples variables tales como la afección a tratar, el LST a administrar, y el perfil farmacocinética de un LST particular. Los factores adicionales que se tienen en cuenta incluyen gravedad des estado patológico, la edad del paciente, peso, género y dieta, tiempo y frecuencia de la administración de LST, posible combinación con tros fármacos, sensibilidades de reacción, y tolerancia/respuesta a la terapia. Las formulaciones de LST de larga duración se puede administrar cada 3 a 4 días, cada semana, o una vez cada dos semanas dependiendo de la semivida y velocidad de eliminación del LST particular.
Las cantidades de dosificación normal varía entre 0,1 y 10^{5} \mug, hasta una dosis total de aproximadamente 1 g, dependiendo de la vía de administración. La guía para las dosificaciones y procedimientos particulares de la distribución se proporciona en la bibliografía; véanse las patentes de Estados Unidos números 4.657.760; 5.206.344; ó 5.225.212. Los expertos en la técnica emplean diferentes formulaciones para los LST. La administración a las células tales como células nerviosas necesita la administración de una manera diferente de la de otras células tales como células endoteliales vasculares.
Se contempla que la transducción de señal anormal, trauma o enfermedades que disparan la actividad de C5AR se pueden tratar con los LST. Estas afecciones o enfermedades se diagnostican de manera específica mediante los ensayos descritos anteriormente, y tal ensayo se debe realizar en los casos sospechosos de infecciones virales, bacterianas o fúngicas, respuestas alérgicas, lesión mecánica asociada a trauma, enfermedades hereditarias, linfoma o carcinoma, u otras afecciones que activan los genes de tejidos linfoides o neuronales.
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Ejemplo 13
Producción de animales No-humanos transgénicos
Los sistemas de modelos animales que elucidan los papeles fisiológicos y de comportamiento del C5AR se producen creando animales transgénicos no humanos en los que la actividad del C5AR o bien se incrementa o disminuye, o está alterada la secuencia de aminoácidos del C5AR expresada, mediante una diversidad de técnicas. Los ejemplos de estas técnicas incluyen, pero no se limitan a: 1) Inserción de versiones normales o mutantes de ADN que codifican un C5AR, mediante microinyección, electroporación, transfección retroviral u otros medios bien conocidos por los expertos en la técnica, en embriones fertilizados de manera apropiada con el fin de producir un animal transgénico o 2) recombinación homóloga de versiones mutantes o normales, humanas o animales de estos genes con el locus del gen nativo en animales transgénicos para alterar la regulación de la expresión do la estructura de estas secuencias de C5AR. La técnica de la recombinación homóloga se conoce bien en la técnica, reemplaza el gen nativo con el gen insertado y por lo tanto es útil para producir un animal que no puede expresar los C5ARs nativos pero no expresan, por ejemplo, un C5AR mutante insertado, que tiene reemplazado el C5AR nativo en el genoma de animales mediante recombinación, dando como resultado la no expresión del transportador. La microinyección añade genes al genoma, pero no los elimina, y la técnica es útil para producir un animal que se expresa y expresa él mismo y añade C5AR, dando como resultado la sobreexpresión de
C5AR.
Un medio disponible para producir un animal transgénico, con un ratón como ejemplo, es como sigue: se aparean ratones hembra, y los huevos fertilizados resultantes se diseccionan fuera de sus oviductos. Los huevos se almacenan en un medio apropiado tal como medio M2 de cloruro de cesio. ADN o ADNc que codifica C5AR se purifica a partir de un vector mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la técnica. Los promotores que se pueden inducir pueden condensarse a la región codificante del ADN que proporciona un medio experimental para regular la expresión del transgen. De manera alternativa o además, los elementos reguladores específicos de tejido se pueden condensar con la región codificante para permitir la expresión específica de tejido del transgen. El ADN, en una solución tamponada de manera apropiada, se coloca en una aguja de microinyección (que se puede preparar a partir de tubos capilares que usan un extractor de tuberías) y el huevo a inyectar se pone en un portaobjetos por depresión. La aguja se inserta en el pronúcleo del huevo, y se inyecta la solución de ADN. El huevo inyectado se transfiere después en el oviducto de un ratón preñado de manera falsa que es un ratón estimulado por las hormonas apropiadas con el fin de mantener la falsa preñez, cuando procede del útero, los implantes, y se desarrolla hasta el final. Como se ha indicado anteriormente, la microinyección no es solamente el procedimiento para insertar ADN en el huevo sino que se usa aquí solamente para propósitos ejemplares.
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<110> Bayer AG, BHC
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<120> DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTOS TERAPÉUTICOS PARA ENFERMEDADES ASOCIADAS AL RECEPTOR 5A DEL COMPONENTE DEL COMPLEMENTO (C5AR)
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<130> Le A 36637
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<160> 5
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<170> PatentIn version 3.1
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<210> 1
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<211> 2328
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<212> ADN
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
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\hskip0,7cm
5 
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<210> 2
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<211> 350
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 2
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\hskip0,7cm
6 
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<210> 3
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<211> 18
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> cebador directo
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<400> 3
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7 
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<210> 4
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<211> 24
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> secuencia artificial
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<400> 4
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8 
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<210> 5
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<212> ADN
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<213> secuencia artificial
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<220>
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<223> sonda
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<400> 5
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\hskip0,7cm
9

Claims (17)

1. Un procedimiento de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de insuficiencia cardíaca en un mamífero que comprende las etapas de
i) determinar la actividad de un polipéptido de C5AR a una cierta concentración de un compuesto de ensayo en ausencia de dicho compuesto de ensayo,
ii) determinar la actividad de dicho polipéptido a una concentración diferente de dicho compuesto de ensayo.
2. Un procedimiento de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de insuficiencia cardíaca en un mamífero que comprende las etapas de
i) determinar la actividad de un polipéptido de C5AR a una cierta concentración de un compuesto de ensayo,
ii) determinar la actividad de un polipéptido de C5AR en presencia de un compuesto que se sabe que es un regulador de un polipéptido de C5AR.
3. Un procedimiento de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de insuficiencia cardíaca en un mamífero que precede a los procedimientos de la reivindicación 1 y 2 y que comprende las etapas de
i) poner en contacto un compuesto de ensayo con un polipéptido de C5AR,
ii) detectar la unión de dicho compuesto de ensayo a dicho polipéptido de C5AR.
4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa de poner en contacto es en o junto a la superficie de una célula.
5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula está in vitro.
6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa de poner en contacto es en un sistema sin células.
7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido está acoplado a una marca detectable.
8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el compuesto está acoplado a una marca detectable.
9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el compuesto de ensayo desplaza un ligando que está primero unido al polipéptido.
10. procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el polipéptido está unido a un soporte sólido.
11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el compuesto está unido a un soporte sólido.
12. Un procedimiento de selección de agentes terapéuticos útiles en el tratamiento de insuficiencia cardíaca en un mamífero que comprende las etapas de
i) poner en contacto un compuesto de ensayo con un polinucleótido de C5AR,
ii) detectar la unión de dicho compuesto de ensayo a dicho polinucleótido de C5AR.
13. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que la molécula de ácido nucleico es ARN.
14. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que la etapa de contacto es en o junto a la superficie de una célula.
15. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que la etapa de contacto es en un sistema sin células.
16. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que el polinucleótido está acoplado a una marca detectable.
17. El procedimiento de la reivindicación 12 en el que el compuesto de ensayo está acoplado a una marca detectable.
ES04717062T 2003-03-17 2004-03-04 Diagnostico y tratamiento terapeuticos para enfermedades asociadas al receptor 5a del componente del complemento (c5ar). Expired - Lifetime ES2314383T3 (es)

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