JPH11502104A - ゴナドトロピン放出ホルモン受容体活性の抑制および調節 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子およびタンパク質に関する。本明細書に開示するＤＮＡ配列は、ＧｎＲＨ−Ｒの産生のために設計された発現系に、および／またはＧｎＲＨ−Ｒを発現し、そして好ましくはＧｎＲＨ誘導シグナル伝達に応答する細胞系に、遺伝子操作され得る。そのような細胞系は、ＧｎＲＨアゴニストおよびアンタゴニストをスクリーニングし、同定するために有利に用いることができる。本発明の別の側面によれば、ＧｎＲＨ ＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド配列、ＧｎＲＨ発現産物、およびそのような産物に対する抗体を、ＧｎＲＨ−Ｒの異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現、または機能不全な変異型受容体の発現）に関連する生殖疾患の診断および療法に用いることができる。ＧｎＲＨ−Ｒトランスジーンを有するトランスジェニック動物は、ＧｎＲＨ類似体のin vivo評価のための動物モデルとして用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】 ゴナドトロピン放出ホルモン受容体活性の抑制および調節 １．序論 本発明はゴナドトロピン放出ホルモン受容体（ＧｎＲＨ−Ｒ）のクローニング 、およびＧｎＲＨ−Ｒを発現する遺伝子工学的に作製された宿主細胞に関する。 そのような工学的に作製された細胞は、ＧｎＲＨ−Ｒの活性化、調節および脱共 役に関与する薬物およびＧｎＲＨ類似体を評価し、スクリーニングするのに用い ることができる。 ２．発明の背景 ＧｎＲＨ−Ｒは神経系および内分泌系の統合における重要なメディエーターで ある。正常な生殖は、特異的な高親和性下垂体受容体に結合してゴナドトロピン である黄体形成ホルモン（ＬＨ）および濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）の分泌を開 始させる、生理的濃度のＧｎＲＨの拍動性(pulsatile)放出に依存している。生 理的濃度のＧｎＲＨは調和を保ちながら正常な生殖を統合するが、高レベルのア ゴニストは反対の応答、すなわちゴナドトロピン分泌の抑制を引き起こす。視床 下部−下垂体−性腺軸を活性化および抑制するＧｎＲＨ類似体の能力は、不妊か ら前立腺癌にいたる種々の疾患の治療において広く臨床的有用性を見いだされて きた。 性腺刺激物質ＧｎＲＨ−Ｒの応答性および能力は、アゴニスト、濃度および暴 露パターンによって影響される（Clayton，1989，J．Endocrinol 120:11-19）。 in vivoおよびin vitro両方の研究が、低濃度の拍動性のＧｎＲＨは受容体の活 動を刺激し、そして高濃度のアゴニストは受容体のダウンレギュレーションおよ び脱感作を誘導することを立証した。ＧｎＲＨのその受容体への結合は、ホスホ リパーゼＣを刺激し、イノシトール-1,4,5-トリホスフェートおよびジアシルグ リセロールを生成する(Huckle およびConn，1988，Endocrine Reviews 9: 387-3 95）。次に、これらの第２メッセンジャーは細胞内貯蔵物からカルシウムを放出 し、プロテインキナーゼＣを活性化する。受容体のアップレギュレーションは、 プロテインキナーゼＣとカルシウムの両方を必要とするように思われる(Huckle およびConn，1988，Endocrine Reviews 9: 387-395; Huckleら，1988，Journal of Biological Chemistry 263: 3296-3302; Youngら，1985，Journal of Endocr inology 107: 49-56)。どのエフェクターがダウンレギュレーションの基礎をな しているのかは不明である。 ＧｎＲＨ−Ｒの調節および脱感作の基礎となる作用機構の理解においては受容 体結合の研究により大きな進歩があったが、ＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子の転写物および 生合成の直接測定はこれまで不可能であった。ＧｎＲＨ−Ｒ ｃＤＮＡのクロー ニングは、ＧｎＲＨ−Ｒの活性化、調節および脱共役の評価を進展させるであろ う。この受容体の一次配列の決定は、改善された類似体の方向づけられた設計を 容易にするであろう。しかし、強い興味にもかかわらず、今日までＧｎＲＨ−Ｒ 遺伝子は如何なる種においてもクローニングして発現させられていない。 ３．発明の概略 本発明はＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子およびタンパク質に関する。本明細書に開示する ＤＮＡ配列は、ＧｎＲＨ−Ｒの産生のために設計された発現系に、および／また はＧｎＲＨ−Ｒを発現し、そして好ましくはＧｎＲＨ誘導シグナル伝達に応答す る細胞系に、遺伝子操作され得る。そのような細胞系は、ＧｎＲＨアゴニストお よびアンタゴニストをスクリーニングし同定するために有利に用いることができ る。本発明の別の側面によれば、ＧｎＲＨ ＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレ オチド配列、ＧｎＲＨ発現産物、およびそのような産物に対する抗体を、ＧｎＲ Ｈ−Ｒの異常な発現（例えば、過剰発現、過少発現、または機能不全な変異型受 容体の発現）に関連する生殖疾患の診断および療法に用いることができる。Ｇｎ ＲＨ−Ｒトランスジーンを有するトランスジェニック動物は、ＧｎＲＨ−Ｒ類似 体のin vivo評価のための動物モデルとして用いることができる。 本明細書に記載するＧｎＲＨ−Ｒ配列の解明は、生殖内分泌学における大きな 進歩を反映しており、そして、ＧｎＲＨ−Ｒのシグナル伝達および調節の複雑な 性質を明らかにする。大抵のホルモンシグナルと異なり、ＧｎＲＨは極めて重要 な情報を伝える脈拍の振動数および振幅を有する拍動性の様式で放出される(Wei ssら，1990，Mol．Endocrinol．4:557-564; Hasenlederら，1991，Endocrinolog y 128: 509-517)。ＧｎＲＨ−Ｒ結合能それ自体が、暴露期間および濃度に依存 してアゴニストによってアップまたはダウンレギュレーションされる(Loumayeお よびCatt，1982，Science 215: 983-985)。前立腺肥大、前立腺癌、子宮内膜症 および性的早熟を含む種々のヒト疾患のコントロールを助けるＧｎＲＨアゴニス トの臨床的有用性は、下垂体脱感作の誘導に依存している。ＧｎＲＨ−Ｒのクロ ーニングは、視床下部、下垂体および性腺の各ホルモンの複雑な相互作用のより 大きい理解をもたらすであろう。 ４．図の説明 図１。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるセロトニン（５ＨＴ）受容体お よびＧｎＲＨ−Ｒ発現のハイブリッド阻害。100 nM ５ＨＴまたは200 nM ＧｎＲ Ｈを横線の位置で浴に導入した。Ａ：ラット脳ＲＮＡ（５ＨＴ応答用）、αＴ３ −１ ＲＮＡ（ＧｎＲＨ応答用）およびアンチセンス５ＨＴ_IC受容体オリゴヌク レオチドの混合物を前もって注射しておいた卵母細胞における５ＨＴおよびＧｎ ＲＨへの応答。16個の細胞が同じ応答を示した。Ｂ：ラット脳ＲＮＡ、αＴ３− １ ＲＮＡおよびアンチセンスＷＺ７オリゴヌクレオチドの混合物を前もって注 射しておいた卵母細胞におけるＧｎＲＨおよび５ＨＴへの応答。24個の細胞が同 じ応答を示した。 図２。卵母細胞中に発現されたクローンＷＺ２５の特徴付け。ＧｎＲＨアンタ ゴニストの不在下（左）および存在下（右）にＷＺ２５転写物を注射した卵母細 胞のＧｎＲＨへの電気生理学的応答。図示した３つのトレーシング(tracing)は 異なる細胞に由来する。実線および点線は、それぞれＧｎＲＨおよびＧｎＲＨア ンタゴニストの投与を示す。注射をしなかった卵母細胞はＧｎＲＨに全く応答し なかった(n=12)。Ｂ：ＷＺ２５由来の転写物を注射した卵母細胞の膜におけるＧ ｎＲＨ−ＡおよびＧｎＲＨによる¹²⁵Ｉ−ＧｎＲＨ−Ａの置換。注射をしなかっ た卵母細胞由来の膜と組み合わせたαＴ３−１細胞膜を用いた匹敵する置換曲線 も示した（●）。誤差線はＳＥＭを示す。 図３。クローンＷＺ２５のヌクレオチド配列（配列番号１）および推定される アミノ酸配列（配列番号２）。番号付けは981 塩基対オープンリーディングフレ ームの最初のメチオニンから始まる。推定されるアミノ酸配列をヌクレオチド配 列の下に示す。推定上の膜貫通領域 I〜VII に下線を付してある。アミノ酸配列 の下に付した記号は、潜在的Ｎグリコシル化部位（▲）、およびプロテインキナ ーゼＡ（◆）、カゼインキナーゼ２（●）およびプロテインキナーゼＣ（＊）の リン酸化部位を示す(Hubbard およびIvatt，1981，Ann．Rev．Biochem．50:555- 583; KempおよびPearson，1990，Trends Biochem．Sci．15:342-346; Pearson およびKemp，1991，Meth．Enzymol．200: 62-81; Kennelly およびKrebs，1991 ，J．Biol．Chem．266:15555-15558)。 図４。ＧｎＲＨ−Ｒの疎水性プロット、ならびにＧｎＲＨ（マウスゴナドトロ ピン放出ホルモン受容体）、ＩＬＲ（ヒトインターロイキン−８受容体）(Murph y およびTiffany，1991，Science 253: 1280-1283)、ＳＰＲ（ラットサブスタン スＰ受容体）（HersheyおよびKrause，1990，Science 247: 958-962）、β１Ｒ （ヒトβ１−アドレナリン性受容体）(Frielleら，1987，Proc．Natl．Acad．Sc i．USA 84:7920-7924)、およびＲＨＯ（ヒトロドプシン）(NathansおよびHognes s，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81: 4851-4855)のアミノ酸配列のアライ メント。Ｉ〜VII は推定上の領域を示す。枠で囲んだ部分は同一のアミノ酸残基 を示す。 図５。ＧｎＲＨ−Ｒ ｍＲＮＡの分布。Ａのオートラジオグラム：２μg のマ ウス全下垂体、ＧＴ−１、ＧＨ３およびＡｔＴ２０ ＲＮＡ、および65 ngのα Ｔ３−１全ＲＮＡを用いた溶液ハイブリダイゼーションアッセイ。Ｂ：３μg の ポリ（Ａ）⁺αＴ３−１ ＲＮＡを用いたノーザンブロット分析。Ｃ〜Ｆ：ラッ ト下垂体前葉 in situハイブリダイゼーション。Ｃ：アンチセンスプローブＸ線 フィルムオートラジオグラフィー。Ｄ：センスプローブ対照(検量線= 450 μm) 。Ｅ、Ｆ：エマルジョンに浸漬した下垂体前葉切片の暗視野(検量線= 50μm)、 明視野(検量線= 100 μm)光学顕微鏡写真。分子量マーカーはHind IIIで消化し たλ ＤＮＡであった。 図６。アフリカツメガエル卵母細胞におけるヒトＧｎＲＨ−Ｒ ｃＤＮＡの発 現。 図７。pSV2A-ヒトＧｎＲＨ−Ｒ構築物を用いてトランスフェクトしたＣＯＳ− １細胞から調製した膜に結合している〔¹²⁵Ｉ〕ＧｎＲＨアゴニストの置換。 図８。pSV2A-ヒトＧｎＲＨ−Ｒを用いてトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞 におけるイノシトールホスフェート産生に及ぼすＧｎＲＨおよびＧｎＲＨアンタ ゴニストの効果。 図９。ヒトＧｎＲＨ−Ｒのヌクレオチド配列および推定されるアミノ酸配列。 図10。ヒトＧｎＲＨ−Ｒ ｃＤＮＡを用いたノーザンブロット分析。レーン１ （Ｔ）：ヒト精巣ポリ（Ａ）ＲＮＡ；レーン２（Ｐ）：ヒト下垂体ポリ（Ａ）Ｒ ＮＡ；レーン３（Ａ）：ヒトβ−アクチンｃＤＮＡ；レーン４（Ｒ）：ヒトＧｎ ＲＨ−Ｒ ｃＤＮＡ． 図11。ヒトＧｎＲＨ−Ｒの構造図。 ５．発明の詳細な説明 本発明はマウスおよびヒトのＧｎＲＨ−Ｒのクローニングおよび発現に関する 。生殖系において中心的な役割を果たすＧｎＲＨ−Ｒは、Ｇタンパク質結合受容 体に特徴的な７つの膜貫通ドメインによって特徴付けられるが、典型的な細胞内 Ｃ末端を欠いている。ＧｎＲＨ−Ｒのこの変わった構造および調節ドメインは、 この受容体に媒介されるシグナル伝達および調節の独特な側面に関与している。 本発明により生産されるＧｎＲＨ−Ｒは、受容体の活性化、調節および脱共役に 関与する薬物およびＧｎＲＨ類似体を評価しスクリーニングするのに用いること ができる。または、ＧｎＲＨ−Ｒ ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドおよび／または アンチセンス配列、またはＧｎＲＨ−Ｒ、そのペプチド断片、またはそれらに対 する抗体を生殖疾患の診断および／または治療に用いることができる。 説明を明確にするため、以下の分節では例としてマウスおよびヒトのＧｎＲＨ −Ｒを取り上げて本発明を説明する。しかし、原則を同様に適用して他の種のＧ ｎＲＨ−Ｒをクローニングし発現させること、およびこの独特なＧｎＲＨ−Ｒフ ァミリーに属する他の受容体（すなわち、細胞内Ｃ末端を欠き、かつＧｎＲＨま たはその類似体に結合するＧタンパク質型受容体）をクローニングし発現させる ことが可能である。 ５．１．ＧｎＲＨ−Ｒコード配列 マウスＧｎＲＨ−Ｒのヌクレオチドコード配列（配列番号１）および推定され るアミノ酸配列（配列番号２）を図３に示す。ヒトＧｎＲＨ−Ｒのヌクレオチド コード配列および推定されるアミノ酸配列を図９に示す。 本発明は以下のものを含む遺伝子を包含する。すなわち、（ａ）本明細書に開 示するＤＮＡ配列（図３および９に示す）の少なくとも１つ；（ｂ）本明細書に 開示するＤＮＡ配列（図２および９に示す）によってコードされるアミノ酸配列 をコードする任意のＤＮＡ配列；（ｃ）高ストリンジェント条件下で〔例えば、 0.5 M NaHPO₄、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、１mM ETDA 中で65℃でフィル ター結合ＤＮＡとハイブリダズさせ、そして 0.1xSSC/0.1% SDS を用いて68℃で 洗浄する（Ausubel F.M.ら(編)，1989，Current Protocols in Molecular Biolo gy，Vol．I，Green Publishing Associates Inc．およびJohn Wiley & Sons，In c.，New York，p．2.10.3）〕本明細書に開示するコード配列（図２および９に 示す）の相補体にハイブリダイズし、かつ上記（ａ）の遺伝子によってコードさ れる遺伝子産物に機能的に等価な遺伝子産物をコードする、任意のＤＮＡ配列； および／または（ｄ）中程度のストリンジェント条件等の比較的低いストリンジ ェント条件下で〔例えば、0.2xSSC/0.1% SDS を用いて42℃で洗浄する（Ausubel ら，1989，前出）〕本明細書に開示するコード配列（図２および９に示す）の相 補体にハイブリダイズし、なおかつ上記（ａ）の遺伝子によってコードされる遺 伝子産物に機能的に等価な遺伝子産物をコードする、任意のＤＮＡ配列である。 本発明はまた、上のパラグラフの（ａ）から（ｄ）に記載のＤＮＡ配列にハイ ブリダイズし、それゆえそれらの相補体である核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子 をも含む。そのようなハイブリダイゼーション条件は、上に記述するように、高 ストリンジェント条件であるか、またはそれより低いストリンジェント条件であ ってよい。核酸分子がデオキシオリゴヌクレオチド（「オリゴ」）である場合、 高ストリンジェント条件とは、例えば、6xSSC/0.05% ピロリン酸ナトリウムを用 いて37℃(14塩基オリゴの場合)、48℃(17塩基オリゴの場合)、55℃(20塩基オリ ゴの場合)および60℃(23 塩基オリゴの場合)で洗浄することをいう。これらの核 酸分子は、例えば、標的遺伝子の調節に有用な標的遺伝子アンチセンス分子とし て、および／または標的、フィンガープリントおよび／または経路遺伝子核酸配 列の増幅反応におけるアンチセンスプライマーとして、働きうる。さらに、その ような配列は標的遺伝子の調節に有用なリボザイムおよび／または三重らせん配 列の一部として用いることができる。さらに、そのような分子は、ＧｎＲＨ−Ｒ 関連疾患の存在、またはそれにかかりやすい素質を検出する診断方法の構成要素 として用いることができる。 本発明はさらに（ａ）上記コード配列および／またはそれらの相補体（すなわ ちアンチセンス配列）の任意のものを含むＤＮＡベクター；（ｂ）コード領域の 発現を引き出す調節エレメントと機能しうる形で連結された上記コード配列の任 意のものを含むＤＮＡ発現ベクター；および（ｃ）宿主細胞中でコード領域の発 現を引き出す調節エレメントと機能しうる形で連結された上記コード配列の任意 のものを含む遺伝子工学的に作製された宿主細胞を包含する。本明細書に用いる 調節エレメントという用語は、以下のものを含むがそれらだけに限定されない。 すなわち、誘導性および非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーターおよ び発現を引き出し、調節する当業者に公知の他のエレメントである。本発明は本 明細書に開示するＤＮＡ配列の任意のものの断片を包含する。 最長オープンリーディングフレームは、分子量が約37,000の327アミノ酸タン パク質をコードする。３個の共通なＮ結合グリコシル化部位が存在し、２個はＮ 末端に、そして１個は第１の細胞外ループに存在する（図３）。推定されるタン パク質の疎水性分析は、他のＧタンパク質受容体と20〜30% の配列類似性を有し 、そしてインターロイキン−８受容体に最も高い相同性を有する、７つの高度に 疎水性のアミノ酸ドメインを明らかにしている（図４）。 ＧｎＲＨ−ＲはＧタンパク質受容体スーパーファミリーのほとんど最小のメン バーであるが、ＧｎＲＨ−Ｒの第１の細胞質ループはＧタンパク質受容体のどれ よりも長く、そして他のＧタンパク質受容体とは異なり、ＧｎＲＨ−Ｒは極性の 細胞質Ｃ末端を欠いている。ＧｎＲＨ−Ｒには高度に保存された残基、例えば多 くの受容体を安定化させる最初の２つの細胞外ループのそれぞれにあるシステイ ン残基等が存在する一方、ＧｎＲＨ−Ｒの幾つかの特徴は他と異なっている。例 えば、多くのＧタンパク質受容体の機能にとって必須であることが見いだされた 高度に保存された膜貫通ドメインIIのアスパラギン酸／グルタミン酸は、アスパ ラギンに置換されている。他のＧタンパク質受容体からの別の逸脱は、膜貫通ド メインIII の近隣に位置する保存されたチロシンがセリンに代わっていることで ある。これは、他のＧタンパク質受容体のシグナル伝達にとって重要なドメイン において、ＧｎＲＨ−Ｒに独特の潜在的なリン酸化部位を作り出している。他の 潜在的な調節リン酸化部位もまた存在する（図３参照）。 本発明はまた、ヒトを含む他の種から単離されたＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子に関する 。³²Pで標識したマウスＧｎＲＨ受容体の挿入配列を用いて、ランダムヘキサマ ープライミングによりλgt10ヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリーを釣り上げること により、ヒトＧｎＲＨ受容体をクローニングした。単離したクローンが機能性ヒ トＧｎＲＨ−Ｒをコードすることを確認するため、合成ＲＮＡ転写物を卵母細胞 に注射した。ＲＮＡを注射した卵母細胞はすべて、ＧｎＲＨに暴露すると大きな 減極性電流を発生し、クローニングされたＤＮＡ断片が機能性受容体をコードし ていることを示した。 ヒトＧｎＲＨ−Ｒのヌクレオチドコード配列（配列番号３）および推定される アミノ酸配列（配列番号４）を図９に示す。ヒトクローンの配列決定は、984 bp オープンリーディングフレームを含む2160 bpの挿入配列を同定した。上記オー プンリーディングフレームは、マウス受容体の推定される配列に90% 同一な328 アミノ酸タンパク質をコードする。 疎水性分析は、Ｇタンパク質結合受容体に特徴的な７つの疎水性ドメインを同 定した。マウス受容体の推定される構造に関して見いだされたように、ヒトＧｎ ＲＨ−Ｒは本質的にいかなるＣ末端細胞内ドメインをも欠いている。２個の潜在 的Ｎ結合グリコシル化部位が存在し、それらは最初の細胞外ドメインのそれぞれ に１個づつ存在する。数個の細胞質セリンおよびトレオニン残基が細胞内ドメイ ンに見いだされ、これらは調節リン酸化部位として働くのかもしれない（図11） 。 放射性標識したヒトＧｎＲＨ−Ｒをプローブとして用いたノーザンブロット分 析は、ヒト下垂体ポリ（Ａ）ＲＮＡ中に約4.7 kbの転写物を同定した（図10）。 ヒト精巣から精製したポリ（Ａ）ＲＮＡ中には、またはヒトβアクチンｃＤＮＡ 対照を用いた場合には、いかなるシグナルも検出されなかった。 上記ＲＮＡの５’末端および３’末端非翻訳ドメインの範囲を決定するため、 一次ライブラリースクリーニング由来のファージ単離物のＰＣＲ分析を実施した 。ＧｎＲＨ−Ｒ ｃＤＮＡ挿入配列の５’末端に近い配列に相当するアンチセン スオリゴヌクレオチドプライマー、または上記挿入配列の３’末端付近に相当す るセンスプライマーを、近隣のＧＴＩクローニング部位に対して設計されたプラ イマーと組み合わせて用いて、未精製クローンをマップした。同定された最長Ｐ ＣＲ産物は、-1.3 kb の付加的５’末端配列および-0.3 kbの付加的３’末端配 列を有していた。これらのデータは、ＧｎＲＨ−Ｒ ｍＲＮＡが少なくとも 1.3 kbの５’末端非翻訳配列および 1.5 kb の３’末端非翻訳配列を有することを 示唆する。ノーザンブロットデータに基づくならば、これは付加的非翻訳配列( 〈1kb)が単離されたクローンのいずれにも含まれていないことを示唆する。 本発明はまた、ＧｎＲＨ−Ｒ活性が存在する他の種より単離したＧｎＲＨ−Ｒ 遺伝子に関する。ＧｎＲＨ−Ｒファミリーのメンバーは、本明細書では、ＧｎＲ Ｈに結合する受容体と定義される。このような受容体は、ヌクレオチドレベルで 約80%の相同性を、そして膜貫通ドメインの外の領域に位置する実質的な配列に おけるアミノ酸レベルでは90%もの相同性を示しうる。 ＧｎＲＨ−Ｒファミリーの他の受容体のクローニングは、多数の異なる方法で 実施することができる。例えば、マウスおよびヒト配列を用いて、ＰＣＲプロー ブとして使用可能な縮重または完全縮重オリゴヌクレオチドプローブを設計する ことがでる。もしくは、ＧｎＲＨ−Ｒを発現する適切な細胞由来のｃＤＮＡライ ブラリー、またはゲノムライブラリーをスクリーニングすることができる。図３ および11にそれぞれ示すマウスおよびヒト配列のＮ末端および細胞質ループ（細 胞内および細胞外の両方）を有利に用いて、このようなオリゴヌクレオチドプロ ーブを設計することができる。なぜなら、これらの領域はＧｎＲＨ−Ｒファミリ ー内で比較的保存されているに相違ないからである。 または、バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーを、低減したストリンジェ ンシー条件のもとで、ヒトまたはマウスＧｎＲＨ−Ｒクローンの放射性標識化断 片を用いてスクリーニングし、ＧｎＲＨ−Ｒ関連タンパク質を単離することがで きる。使用できるクローニング戦略の総論としては、例えば、Maniatisら、1989 ,Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Springs Harbor Press，N.Y. ；およびAusubel ら、1989，Current Protocols in Molecular Biology，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.を参照されたい。 本発明によれば、ＧｎＲＨ−Ｒ、その断片、融合タンパク質または機能的等価 物をコードするヌクレオチド配列を、適切な宿主細胞においてＧｎＲＨ−Ｒもし くはその機能的に活性なペプチド、融合タンパク質または機能的等価物の発現を 引き出す組換えＤＮＡ分子の作製に使用することができる。または、ＧｎＲＨ− Ｒ配列の部分とハイブリダイズするヌクレオチド配列を、核酸ハイブリダイゼー ションアッセイ、サザンおよびノーザンブロット分析、等に使用することもでき る。 遺伝子暗号の縮重により、実質的にＧｎＲＨ−Ｒアミノ酸配列、例えば図３に 示すマウス配列（配列番号２）または図９に示すヒト配列（配列番号４）、また はその機能的等価物をコードする他のＤＮＡ配列を、本発明の実施においてＧｎ ＲＨ−Ｒのクローニングおよび発現に使用することができる。このようなＤＮＡ 配列には、ストリンジェントな条件下でマウスまたはヒトＧｎＲＨ−Ｒ配列とハ イブリダイズ可能なＤＮＡ配列、または遺伝子の縮重がないならばストリンジェ ントな条件下でハイブリダイズ可能なＤＮＡ配列が含まれる。ストリンジェント な条件は種々の方法で調節することができる。たとえば、ポリメラーゼ連鎖反応 （ＰＣＲ）を実施する場合は、プライマーの鋳型へのアニーリングが起こる温度 、または反応緩衝液中のMgCl₂の濃度を調節することができる。放射性標識化Ｄ ＮＡ断片またはオリゴヌクレオチドを用いてフィルターを精査する場合は、スト リンジェンシーは洗浄液のイオン強度を変えることにより、またはフィルター洗 浄を実施する温度を注意深くコントロールすることにより調節することができる 。 本発明にしたがって使用することができる変更されたＤＮＡ配列は、同一の、 または機能的に等価な遺伝子産物をコードする配列をもたらす、様々なヌクレオ チド残基の欠失、付加または置換を含む。遺伝子産物それ自体が、表に現れない 、したがって機能的に等価なＧｎＲＨ−Ｒを産生するサイレント変化をもたらす 、 ＧｎＲＨ−Ｒ配列内のアミノ酸残基の欠失、付加または置換を含有してもよい。 このようなアミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水 性および／または両親媒性の類似性に基づいてなされる。例えば、負に荷電した アミノ酸にはアスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれ；正に荷電したアミノ 酸にはリシンおよびアルギニンが含まれ；類似した親水性値をもつ非荷電の極性 ヘッド基(head group)を有するアミノ酸には以下のものが含まれる：すなわち、 ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン；アスパラギン、グルタ ミン；セリン、トレオニン；フェニルアラニン、チロシンである。本明細書では 、機能的に等価なＧｎＲＨ−Ｒとは、ＧｎＲＨに結合するが、その天然の対応物 であるＧｎＲＨ−Ｒと必ずしも同一の結合親和性を有するわけではない受容体、 をいう。 本発明のＤＮＡ配列は、遺伝子産物のプロセシングと発現を改変する変更を含 むがそれらだけに限定されない種々の目的に合わせて、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列 を変更するために遺伝子工学的に作製することができる。例えば、当分野で周知 の技法（例えば、部位特異的突然変異誘発法）を使用して突然変異を導入し、新 しい制限部位を挿入する、グリコシル化パターン、リン酸化等を変える、などが 可能である。例えば、酵母等の特定の発現系において、宿主細胞が遺伝子産物を 過度にグリコシル化することがある。そのような発現系を使用するときは、Ｇｎ ＲＨ−Ｒコード配列を変更してＮ−結合グリコシル化部位を除去することが好ま しい。例えば、マウス配列においては、図３に示すグリコシル化部位の１個以上 を変更することによりこれが達成できる。本発明の別な態様においては、ＧｎＲ Ｈ−Ｒ配列または改変されたＧｎＲＨ−Ｒ配列を異種配列に連結して、融合タン パク質をコードさせることができる。融合タンパク質は、ＧｎＲＨ−Ｒを異種部 分から切り離せるように、ＧｎＲＨ−Ｒ配列と異種タンパク質配列との間に位置 する開裂部位を含むように遺伝子工学的に作製することも可能である。 本発明のまた別な態様においては、当分野で周知の化学的方法を用いて、Ｇｎ ＲＨ−Ｒのコード配列を全部または部分的に合成することが可能であろう。例え ば、Caruthers ら、1980，Nuc．Acids Res．Symp．Ser．7:215-233; Creaおよび Horn，180，Nuc．Acids Res．9(10):2331; Matteucci および Caruthers，1980, Tetrahedron Letters 21:719; ならびに Chow および Kempe，1981，Nuc．Acids Res．9(12):2807-2817 参照。または、ＧｎＲＨ−Ｒアミノ酸配列を全部または 部分的に合成する化学的方法を用いて、タンパク質自体を作製することも可能で あろう。例えば、ペプチドは固相法により合成し、樹脂から切り離し、分取高速 液体クロマトグラフィーにより精製することができる（例えば、Creighton，198 3，Proteins Structures And Molecular Principles，W.H．Freeman and Co.，N ．Y.，pp．50-60参照）。合成ペプチドの組成は、アミノ酸分析または配列決定 により確認できる（例えば、エドマン分解法; Creighton，1983，Proteins Stru ctures and Molecular Principles，W.H．Freeman and Co.，N.Y.，pp．34-49参 照）。 ５．２．ＧｎＲＨ−Ｒの発現 生物学的に活性なＧｎＲＨ−Ｒを発現するため、ＧｎＲＨ−Ｒまたは上記第５ .１節に記述したその機能的等価物をコードするヌクレオチド配列を適切な発現 ベクター、すなわち、挿入されたコード配列の転写および翻訳に必要なエレメン トを含むベクターに挿入する。ＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子産物、および組換えＧｎＲＨ −Ｒ発現ベクターによってトランスフェクトまたは形質転換された宿主細胞また は細胞系は、種々の目的に使用できる。これらの目的には、以下のものが含まれ るがそれだけに限定されない。すなわち、ＧｎＲＨの結合を競合的に阻害しＧｎ ＲＨの活性を「中和する」抗体を含む、この受容体に結合する抗体（つまりモノ クローナルおよびポリクローナル抗体）の作製；ＧｎＲＨ−Ｒを介して作用する ＧｎＲＨ類似体または薬物のスクリーニングおよび選択；等である。 ５．２．１．発現系 当業者に周知の方法を用いて、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列および適切な転写／翻 訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法には 、in vitro組換えＤＮＡ技法、合成技法およびin vivo組換え／遺伝子組換えが 含まれる。例えば、Maniatisら，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manu al,Cold Springs Harbor Laboratory，N.Y.およびAusubelら、1989，Current Pr oto cols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and Wiley Inters cience，N.Y．に記述されている技法を参照されたい。 種々の宿主−発現ベクター系がＧｎＲＨ−Ｒコード配列を発現するのに使用で きる。これらは以下のものを含むがそれだけに限定されない。すなわち、ＧｎＲ Ｈ−Ｒコード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡま たはコスミドＤＮＡ発現ベクターを用いて形質転換した細菌等の微生物；ＧｎＲ Ｈ−Ｒコード配列を含む組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換した酵母；Ｇ ｎＲＨ−Ｒコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウ イルス）に感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリ フラワーモザイクウイルスＣａＭＶ；タバコモザイクウイルスＴＭＶ）に感染さ せた、またはＧｎＲＨ−Ｒコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例 えば、Ｔｉプラスミド）を用いて形質転換した植物細胞系；または、安定に増幅 された（例：ＣＨＯ／ｄｈｆｒ）またはＤＭ染色体中で不安定に増幅された（例 ：マウス細胞系）ＧｎＲＨ−Ｒ ＤＮＡの多重コピーを含むように遺伝子操作し た細胞系を含む、組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、ワク シニアウイルス）に感染させた動物細胞系である。 これらの系の発現エレメントは、その強度と特異性において異なる。使用する 宿主／ベクター系により、構成プロモーターおよび誘導プロモーターを含む多数 の適切な転写および翻訳エレメントの任意のものを発現ベクターに使用できる。 例えば、細菌系でクローニングを行うときは、バクテリオファージλのpL、plac 、ptrp、ptac（ptrp-lacハイブリッドプロモーター）等の誘導プロモーターが使 用できる；昆虫細胞系でクローニングを行うときは、バキュロウイルスのポリヒ ドリンプロモーター等が使用できる；植物細胞系でクローニングを行うときは、 植物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、熱ショックプロモーター；RUBI SCO の小サブユニットのプロモーター；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプ ロモーター）または植物ウイルス由来のプロモーター（例えば、ＣａＭＶの３５ Ｓ ＲＮＡプロモーター；ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）が使用でき る；哺乳動物細胞系でクローニングを行うときは、哺乳動物細胞のゲノム由来の プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）、または哺乳動物ウイ ルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニ アウイルス7.5Kプロモーター）が使用できる；ＧｎＲＨ−Ｒ ＤＮＡの多重コピ ーを含む細胞系を作製するときは、ＳＶ４０、ＢＰＶ、およびＥＢＶをベースと するベクターを適切な選択マーカーと共に使用できる。 細菌系においては、発現されるＧｎＲＨ−Ｒの意図された用途によって、多数 の発現ベクターが有利に選択できる。例えば、抗体の作製のために大量のＧｎＲ Ｈ−Ｒを生産しなければならないときは、容易に精製できる融合タンパク質産物 の高レベル発現を引き出すベクターが望ましいだろう。このようなベクターには 以下のものが含まれるが、それらだけに限定されない。すなわち、大腸菌発現ベ クターpUR278（Rutherら、1983，EMBO J．2:1791）（ここでＧｎＲＨ−Ｒコード 配列は、ハイブリッド AS-lac Z タンパク質が産生されるように lac Zコード領 域のフレームに合わせてベクターに連結することができる）；pIN ベクター(Ino uye およびInouye，1985，Nucleic Acids Res．13:3101-3109; Van Heekeおよび Schuster，1989，J．Biol．Chem．264:5503-5509); 等である。pGEXベクターも また、外来ポリペプチドをグルタチオンS-トランスフェラーゼ(GST)を有する融 合タンパク質として発現するのに使用できる。一般に、このような融合タンパク 質は可溶性で、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、次いで遊離グルタ チオンの存在下で溶出させることにより、溶解した細胞から容易に精製できる。 これらpGEXベクターは、クローニングされた興味のあるポリペプチドをＧＳＴ部 分から引き離せるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を 含むように設計されている。 酵母においては、構成または誘導プロモーターを含む多くのベクターが使用で きる。総説については、Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2，198 8，Ausubelら（編）、Greene Publish．Assoc．& Wiley Interscience,第13章； Grantら、1987，Expression and Secretion Vectors for Yeast，in Methods in Enzymology，Wuおよび Grossman（編），1987，Acad．Press，N.Y.，Vol.153,p p．516-544; Glover，1986，DNA Cloning，Vol．II，IRL Press，Wash.，D.C.第 ３章；およびBitter，1987，Heterologous Gene Expression in Yeast，Methods in Enzymology，BergerおよびKimmel（編）、Acad．Press，N.Y.，Vol.152，p p．673-684;および The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，1982 ，Strathernら（編）、Cold Spring Harbor Press，Vols．ＩおよびIIを参照さ れたい。 植物発現ベクターを使用する場合には、多数のプロモーターのうち任意のもの によってＧｎＲＨ−Ｒコード配列の発現を推進させることができる。例えば、Ｃ ａＭＶの35S ＲＮＡおよび19S ＲＮＡプロモーター（Brissonら、1984，Nature 310:511-514）、またはＴＭＶの外被タンパク質プロモーター(Takamatsuら、198 7，EMBO J．6:307-311)等のウイルスプロモーターが使用できる。または、RUBIS CO の小サブユニット(Coruzziら、1984，EMBO J．3:1671-1680; Broglieら、198 4，Science 224:838-843)等の植物プロモーター；もしくは、大豆 hspl7.5-Eま たは hsp17.3-B（Gurleyら、1986，Mol．Cell．Biol．6:559-565）等の熱ショッ クプロモーターが使用できる。これらの構築物は、Tiプラスミド、Riプラスミド 、植物ウイルスベクター、直接ＤＮＡ形質転換、マイクロインジェクション、エ レクトロポレーション、等を用いて植物細胞に導入することができる。これらの 技法の総論については、例えば、Weissbach およびWeissback，1988，Methods f or Plant Molecular Biology，Academic Press，NY，第VIII節，pp．421-463;な らびに、GriersonおよびCorey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed.，Blac kie，London 第7-9章を参照されたい。 ＧｎＲＨ−Ｒを発現するのに使用できる別の発現系は、昆虫系である。このよ うな系の１つにおいては、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa calif ornica ）核多角体病ウイルス(AcNPV)が外来遺伝子を発現するベクターとして使 用される。このウイルスは、スポドプテラ・フルジペルダ（Spodoptera frugipe rda )細胞中で増殖する。ＧｎＲＨ−Ｒコード配列は、このウイルスの非必須領域 （例えばポリヒドリン遺伝子）にクローニングし、AcNPV プロモーター（例えば ポリヒドリンプロモーター）の制御下に置くことができる。ＧｎＲＨ−Ｒコード 配列の挿入がうまくゆくと、ポリヒドリン遺伝子の不活性化と閉鎖されていない (non-occluded)組換えウイルス（すなわち、ポリヒドリン遺伝子によってコード されるタンパク質のコートを欠くウイルス）の産生をもたらすであろう。次に、 これらの組換えウイルスを用いて、挿入遺伝子を発現させるスポドプテラ・フル ジペルダ細胞を感染させる（例えば、Smithら、1983，J．Viol．46:584; Smith ，米国特許第4,215,051参照）。 哺乳動物細胞においては、ウイルスベースの多数の発現系が使用できる。アデ ノウイルスを発現ベクターとして使用する場合は、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列をア デノウイルスの転写/ 翻訳制御複合体、例えば後期プロモーターおよび３部分リ ーダー配列に連結することができる。次に、このキメラ遺伝子をin vitroまたは in vivo 組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイル スゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１またはＥ３領域）への挿入は、感染した宿 主中で生存可能であり、かつＧｎＲＨ−Ｒを発現することができる組換えウイル スをもたらす(LoganおよびShenk，1984，Proc．Natl．Acad．Sci．(USA)，81:36 55-3659)。または、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーターを使用することも できる。（例えば、Mackettら、1982，Proc．Natl．Acad．Sci．（USA）79:7415 -7419; Mackettら、1984，J．Virol．49:857-864; Panicaliら、1982，Proc．Na tl．Acad．Sci．79:4927-4931参照）。 挿入されたＧｎＲＨ−Ｒコード配列の効率的な翻訳のためには、特異的開始シ グナルもまた必要とされる場合がある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コド ンおよび隣接配列が含まれる。それ自身の開始コドンおよび隣接配列を含む完全 なＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子を適切な発現ベクターに挿入する場合は、付加的翻訳制御 シグナルはなんら必要とされない。しかし、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列の一部のみ を挿入する場合は、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルを供給しな ければならない。さらに、その開始コドンは、挿入配列全体の翻訳を確実にする ために、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列のリーディングフレームと一致していなければ ならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合 成の多様な起源のものでありうる。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメ ント、転写ターミネーター、等を包含させることにより増強できる（Bitterら、 1987，Methods in Enzymol．153:516-544 参照）。 さらに、挿入配列の発現を調節する、または所望の特異的様式で遺伝子産物を 修飾しプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。このようなタンパ ク質産物の修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、開裂） は、そのタンパク質の機能にとって重要でありうる。異なる宿主細胞は、タンパ ク質の翻訳後プロセシングおよび修飾のための、特徴的で特異的な作用機構をも つ。適切な細胞系または宿主系を選択して、発現された外来タンパク質の適正な 修飾およびプロセシングを確実にすることができる。この目的のため、一次転写 物の適切なプロセシング、すなわち遺伝子産物のグリコシル化およびリン酸化の ための細胞機構をもつ真核宿主細胞が使用できる。このような哺乳動物宿主細胞 には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ ３８等が含まれるが、これらだけに限定されない。 組換えタンパク質の長期間にわたる高収率産生のためには、安定した発現が望 ましい。例えば、ＧｎＲＨ−Ｒを安定的に発現する細胞系を遺伝子操作すること が可能である。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するよりも、むし ろ適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー配列、転写 ターミネーター、ポリアデニル化部位、等）によって制御されるＧｎＲＨ−Ｒ ＤＮＡおよび選択マーカーを用いて宿主細胞を形質転換することができる。外来 ＤＮＡの導入に続いて、遺伝子操作した細胞を１〜２日間富化培地中で増殖させ 、そして次に選択培地に替えてもよい。組換えプラスミド中の選択マーカーは、 選択に対する耐性を付与し、細胞がプラスミドをその染色体中に安定に組み込み 、そしてフォーカスを形成するまで増殖することを可能とする。次にこのフォー カスをクローニングし、細胞系へと拡大させることができる。この方法は、Ｇｎ ＲＨ−Ｒを細胞表面に発現し、かつＧｎＲＨが仲介するシグナル伝達に応答する 細胞系を遺伝子操作に有利に使用することができる。このように遺伝子操作され た細胞系は、ＧｎＲＨ類似体をスクリーニングするのに特に有用である。 多数の選択系を使用することができる。これらの選択系には 以下のものが含 まれるが、それらだけに限定されない。すなわち、単純ヘルペスウイルスチミジ ンキナーゼ遺伝子(Wiglerら、1977，Cell 11:223)、ヒポキサンチン−グアニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子(SzybalskaおよびSzybalski，1962，P roc．Natl．Acad．Sci．USA 48:2026)、およびアデニンホスホリボシルトランス フェラーゼ遺伝子(Lowyら、1980，Cell 22:817)を、それぞれｔｋ^-、ｈｇｐｒｔ^- またはａｐｒｔ^-細胞に採用することができる。また、代謝拮抗物質耐性を、 メトトレキセートへの耐性を付与するｄｈｆｒ遺伝子（Wiglerら、1980，Natl． Acad．Sci．USA 77:3567; O'Hareら、1981，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 78:15 27）；マイコフェノール酸への耐性を付与するｇｐｔ遺伝子（MulliganおよびBe rg，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．78:2072）；アミノグリコシドＧ− ４１８への耐性を付与するｎｅｏ遺伝子（Colberre-Garapinら、1981，J．Mol． Biol．150:1）；およびハイグロマイシンへの耐性を付与するｈｙｇｒｏ遺伝子( Santerreら、1984，Gene 30:147)の選択の基礎として使用できる。最近、さらな る選択遺伝子が報告された。それらは、細胞がトリプトファンの代わりにインド ールを利用できるようにするｔｒｐＢ；細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノー ルを利用できるようにするｈｉｓＤ（Hartman およびMulligan，1988，Proc．Na tl．Acad．Sci．U.S.A．85:8047)；およびオルニチンデカルボキシラーゼインヒ ビターである２−（ジフルオロメチル）−ＤＬ−オルニチン（ＤＦＭＯ）への耐 性を付与するＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）[McConlogue L.，1987， In: Current Communications in Molecular Biology，Cold Spring Harbor labo ratory（編）]である。 本明細書に記載の特定の実施態様において、SV40初期プロモーターを含む発現 ベクターpSV2A 中にヒトＧｎＲＨ−ＲのｃＤＮＡをサブクローニングした。pSV2 A-ヒトＧｎＲＨ−Ｒ構築物を用いて、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクシ ョン法(Keown，W.A.ら，1990，in Methods of Enzymology，Vl．185(Goeddel,D. V.編),pp．527-537，Academic Press，New York)によりＣＯＳ−１細胞を一過性 にトランスフェクトした。トランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞由来の膜を用 いた実験は、異種発現された受容体はＧｎＲＨと結合可能であることを示した。 また、リガンド結合がイノシトールリン酸代謝と結びついていることが見いださ れ、これはさらにトランスフェクトされたＣＯＳ−１細胞が機能性ヒトＧｎＲＨ −Ｒを発現したことを示していた。 ５．２．２．ＧｎＲＨ−Ｒを発現するトランスフェクタント(transfectant) または形質転換体の同定 コード配列を含み、そして生物的に活性な遺伝子産物を発現する宿主細胞を少 なくとも４種類の一般的アプローチにより同定することができる。すなわち、（ ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション；（ｂ）「マ ーカー」遺伝子機能の有無；（ｃ）宿主細胞におけるＧｎＲＨ−Ｒ ｍＲＮＡ転 写物の発現によって測定される転写レベルの評価；および（ｄ）イムノアッセイ または生物活性によって測定される遺伝子産物の検出である。 第１のアプローチでは、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列、その一部または誘導体にそ れぞれ相同なヌクレオチド配列を含むプローブを用いて、発現ベクターに挿入さ れたＧｎＲＨ−Ｒコード配列の存在をＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイ ブリダイゼーションによって検出することができる。 第２のアプローチでは、特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキ ナーゼ活性、抗生物質耐性、メトトレキセートへの耐性、形質転換表現型、バキ ュロウイルスにおける閉鎖体(occlusion body)の形成、等）の有無に基づいて組 換え発現ベクター／宿主系を同定し、選択することができる。例えば、ＧｎＲＨ −Ｒコード配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入されている場合は、マ ーカー遺伝子機能の不在によってＧｎＲＨ−Ｒコード配列を含む組換え体を同定 することができる。または、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列の発現を制御するために用 いられたものと同一の、または異なるプロモーターの制御下に、マーカー遺伝子 をＧｎＲＨ−Ｒ配列とタンデムに配置することができる。誘導または選択に応答 してのマーカーの発現は、ＧｎＲＨ−Ｒコード配列の発現を示す。 第３のアプローチでは、ＧｎＲＨ−Ｒコード領域の転写活性をハイブリダイゼ ーションアッセイによって評価することができる。例えば、ＲＮＡを単離し、そ してＧｎＲＨ−Ｒコード配列またはその特定部分に相同なプローブを用いてノー ザンブロットにより分析することができる。または、宿主細胞の全核酸を抽出し 、そのようなプローブへのハイブリダイゼーションをアッセイすることができる 。 第４のアプローチでは、ＧｎＲＨ−Ｒタンパク質産物の発現を、例えばウエス タンブロット、イムノアッセイ（ラジオイムノ沈降法、酵素結合イムノアッセイ 、等）によって免疫学的に評価することができる。しかし、発現系が成功したこ とについての最終的試験は、生物的に活性なＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子産物の検出を必 要とする。受容体活性を検出するためには多数のアッセイが使用できる。これら の アッセイにはＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体結合アッセイ；および試験基質とし た遺伝子操作した細胞系を用いるＧｎＲＨ生物学的アッセイが含まれるが、それ らだけに限定されない。 本明細書に記述する特定の実施態様において、ヒトＧｎＲＨ−Ｒ ｃＤＮＡを 含む組換え発現ベクターを用いてトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞から細胞 膜を調製した。¹²⁵Ｉ標識ＧｎＲＨ類似体を用いて、ヒトＧｎＲＨ−Ｒの発現を 検出した。さらに、第7.1.5 節に記述するようにＧｎＲＨ刺激イノシトールリン 酸（ＩＰ）産生レベルを測定することにより、生物的に活性なＧｎＲＨ−Ｒの発 現を検出することができた。 ５．２．３．ＧｎＲＨ−Ｒの回収 生物的に活性なＧｎＲＨ−Ｒを高レベルで産生するクローンが一旦同定された ならば、そのクローンを増やし、大量の受容体を産生するのに用いることができ る。産生された受容体は、以下のものを含むがそれらだけに限定されない、当分 野で周知の技法を用いて精製することができる。すなわち、イムノアフィニティ ー精製；高速液体クロマトグラフィー、ビーズに結合したＧｎＲＨまたはＧｎＲ Ｈ類似体等の固定化リガンドを用いるアフィニティークロマトグラフィーを含む クロマトグラフ法；抗体を用いるイムノアフィニティー精製；等である。 ＧｎＲＨ−Ｒコード配列が開裂可能な融合タンパク質をコードするように遺伝 子操作されている場合、アフィニティー精製技法を用いて容易に精製を行なうこ とができる。例えば、コラゲナーゼ開裂認識共通配列をＧｎＲＨ−Ｒのカルボキ シ末端とプロテインＡの間で遺伝子操作することが可能である。生じる融合タン パク質は、プロテインＡ部分に結合するＩｇＧカラムを用いて容易に精製するこ とができる。コラゲナーゼを用いて処理することにより、融合していないＧｎＲ Ｈ−Ｒを容易にカラムから放出させることができる。別の例は、外来のポリペプ チドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質 として発現するpGEXベクターの使用であろう。融合タンパク質は、クローニング した遺伝子とＧＳＴ部分の間にトロンビンまたは第Ｘａ因子開裂部位を持つよう に遺伝子操作することができる。この融合タンパク質は、グルタチオンアガロー スビーズに吸着させ、次にグルタチオンの存在下で溶出することにより、細胞抽 出物から容易に精製することができる。本発明のこの側面において、任意の開裂 部位または酵素開裂基質を、ＧｎＲＨ−Ｒ配列と精製に用いうる結合パートナー を有する第２ペプチドまたはタンパク質（例えば、それに対してイムノアフィニ ティーカラムを調製することができる任意の抗原）の間で遺伝子操作することが できる。 ５．３．ＧｎＲＨ−Ｒを規定する抗体の創成 遺伝子組換えで産生されたＧｎＲＨ−Ｒのエピトープに対する抗体を作製する ために、当分野で公知の種々の方法を用いることができる。中和性抗体、すなわ ち受容体のＧｎＲＨ結合部位で競合する抗体は、診断および治療剤にとって特に 好ましい。ウイルスの血清マーカーを規定する抗体は、診断用途に好ましいであ ろう。そのような抗体は、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、一本鎖抗 体、Ｆａｂ断片およびＦａｂ発現ライブラリーにより作製された断片を含むが、 これらだけに限定されない。 抗体の産生のため、ウサギ、マウス、ラット等を含むがこれらだけに限定され ない種々の宿主動物を、ＧｎＲＨ−Ｒを用いた注射により免疫感作することがで きる。宿主の種によって、免疫応答を増大させるため、種々のアジュバントを用 いることができる。これらのアジュバントには以下のものが含まれるが、それら だけに限定されない。すなわち、フロイントアジュバント（完全および不完全） 、水酸化アルミニウム等のミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオー ル等の界面活性剤、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホール リンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット− ゲラン(Calmette-Guerin)杆菌）およびコリネバクテリウム・パルバム（Coryneb acterium parvum）等の潜在的に有用なヒトアジュバントである。 ＧｎＲＨ−Ｒに対するモノクローナル抗体は、培養中での連続的継代細胞系に よる抗体分子の産生を提供する任意の技法を用いて調製することができる。これ らの技法は以下のものを含むがそれらだけに限定されない。すなわち、Kohlerお よびMilsteinによって最初に記述されたハイブリドーマ技法（Nature，1975，25 6:495-497)、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法(Kosborら，1983，Immunology Toda y，4:72; Coteら，1983，Proc．Natl．Acad．Sci.，80:2026-2030)およびＥＢＶ −ハイブリドーマ技法(Coleら，1985，Monoclonal Antibodies and Cancer Ther apy，Alan R．Liss，Inc.，pp．77-96)である。さらに、適切な抗原特異性を有 するマウス抗体分子由来の遺伝子を適切な生物活性を有するヒト抗体分子由来の 遺伝子と共にスプライシングすることにより「キメラ」抗体(Morrison ら，1984 ，Proc．Natl．Acad．Sci.，81:6851-6855; Neuberger ら，1984，Nature，312: 604-608; Takeda ら，1985，Nature，314:452-454)を産生するために開発された 技法を用いることができる。または、一本鎖抗体（米国特許第4,946,778 号）を 産生するために記述された技法を、ＧｎＲＨ−Ｒ特異的一本鎖抗体の産生のため に適合させることもできる。 ＧｎＲＨ−Ｒの特異的結合部位を有する抗体断片は公知の技法によりつくり出 すことができる。例えば、そのような断片は抗体分子のペプシン消化により生成 されるF(ab')₂断片、およびF(ab')₂断片のジスルフィド架橋を還元することによ り生成されるFab 断片を含むが、これらだけに限定されない。またはFab 発現ラ イブラリーを構築して(Huseら，1989，Science，246:1275-1281)、ＧｎＲＨ−Ｒ に対する所望の特異性を有するモノクローナルFab 断片の迅速で容易な同定を可 能とすることができる。 ５．４．ＧｎＲＨ−Ｒ、ＤＮＡおよび遺伝子操作した細胞系の用途 上記のＧｎＲＨ−Ｒ ＤＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＧｎＲＨ− Ｒ発現産物、抗体、および工学的に作製された細胞系は、生殖疾患の診断および 治療のため、ならびにドラッグデザインおよび薬物の発見において、多数の用途 を有する。 例えば、ＧｎＲＨ−Ｒ ＤＮＡ配列はＧｎＲＨ−Ｒ発現の異常を診断するため に生検のハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、in situ ハイブリダイゼー ションアッセイを含むサザンまたはノーザン分析）に用いることができる。治療 剤への応用としては、ＧｎＲＨ−Ｒ ＤＮＡ配列に基づいて設計したアンチセン ス分子またはリボザイム分子を利用して、ＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子産物の輸送および 発現をブロックすることができる。これについては、翻訳開始部位（例えば、Ｇ ｎＲＨ−Ｒヌクレオチド配列の-10から+10の間の領域）由来のオリゴヌクレオチ ドが好ましい。または、ＧｎＲＨ−Ｒ ＤＮＡを遺伝子治療アプローチに用いて 、ＧｎＲＨ−Ｒおよびその機能を再構成するため、正常な組換え遺伝子を患者の 欠陥細胞に導入する、つまり内因性突然変異を正すことが可能であろう。 本発明の別な実施態様においては、生検組織における受容体発現パターンを決 定するため、またはin vivo診断イメージングのためにＧｎＲＨ−Ｒに特異的な 抗体を用いることができる。このような使用においては、「中和」抗体が好まし い。例えば、イメージング化合物と結合させた抗体を患者に投与して、ＧｎＲＨ −Ｒの位置および分布をin vivoで「マップ」することができる。 本発明の別な実施態様においては、ＧｎＲＨ−Ｒ自体、またはそのＧｎＲＨ結 合部位を含む断片をin vivoで投与することができるであろう。遊離のＧｎＲＨ −Ｒまたはそのペプチド断片は、ＧｎＲＨと競合的に結合し、そしてＧｎＲＨと 天然の受容体との相互作用をin vivoで抑制できるであろう。 本発明の別な実施態様においては、ＧｎＲＨ−Ｒに特異的な抗体応答の刺激を 避妊の手段として用いることができる。例えば、ＧｎＲＨ−ＲまたはＧｎＲＨ− Ｒ融合タンパク質を用いた注射により種々の宿主動物を免疫感作して、それら動 物の免疫系を刺激し、循環性抗ＧｎＲＨ−Ｒ抗体の産生をもたらすことができる 。 ＧｎＲＨ−Ｒおよび／またはＧｎＲＨ−Ｒを発現する細胞系は、ＧｎＲＨ−Ｒ 活性のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗体、ペプチド、有機分 子または他のリガンドをスクリーニングするのに用いることができる。例えば、 ＧｎＲＨの活性を中和することができる抗ＧｎＲＨ−Ｒ抗体は、ＧｎＲＨ−Ｒ機 能を抑制するために使用できる。さらに、ＧｎＲＨ活性が低下している生殖疾患 に用いるため、ＧｎＲＨ活性を模倣する抗ＧｎＲＨ−Ｒ抗体を選択することがで きる。あるいは、遺伝子組換えで発現させた可溶性タンパク質またはタンパク質 を発現する細胞系を用いたペプチドライブラリーまたは有機化合物のスクリーニ ングは、ＧｎＲＨの生物活性を抑制することによって機能する治療剤分子の同定 に有用でありうる。 本発明の１実施態様において、ＧｎＲＨ−Ｒの全コード領域またはそのリガン ド結合ドメインを発現する工学的に作製された細胞系は、ＧｎＲＨアンタゴニス トおよびアゴニストをスクリーニングし、同定するために使用できる。合成化合 物、天然物、および潜在的に生物的に活性な物質の他の供給源を多数の方法でス クリーニングすることができる。ＧｎＲＨまたはその類似体のＧｎＲＨ−Ｒへの 結合を抑制する試験化合物の能力は、第7.1.4 節に記述するような標準的受容体 結合技法を用いて測定することができる。 発現細胞におけるシグナル伝達応答に及ぼすＧｎＲＨ結合の効果を阻止または 模倣する作用物質の能力を測定することが可能である。例えば、第２メッセンジ ャー生成の調節または細胞代謝の変化、等の応答（すなわち、細胞内カルシウム 貯蔵物の放出またはプロテインキナーゼＣの活性化）をモニターすることができ る。本明細書に記述する特定の実施態様においては、ＧｎＲＨ刺激イノシトール リン酸（ＩＰ）産生をＧｎＲＨ−Ｒ媒介シグナル伝達のインジケーターとして利 用した。ＧｎＲＨ媒介シグナル伝達の測定のためのアッセイは、これらの目的の ために開発された任意の常用技法を用いて実施することができる。 ＧｎＲＨ−ＧｎＲＨ−Ｒ系を介してシグナル伝達を調節する試験化合物の能力 もまた動物モデル系を用いてin vivoで測定することができる。たとえば、トラ ンスジーンとしてＧｎＲＨ−Ｒ ＤＮＡを含むトランスジェニック動物を遺伝子 操作して、そのようなアゴニストまたはアンタゴニストの効果をin vivoで試験 することができる。発現細胞におけるシグナル伝達応答に及ぼすＧｎＲＨ結合の 効果を阻止する作用物質の能力を測定することが可能である。例えば、ホルモン の産生、生殖機能の抑制または活性化、またはホルモン応答性腫瘍の大きさの退 縮、等の応答をモニターすることができる。 ５．４．１．GnRH-Rタンパク質または遺伝子操作された細胞系を用いるペプチド ライブラリーのスクリーニング 固相支持体に結合したアミノ酸のすべてのありうる組み合わせからなるランダ ムペプチドライブラリーを使用して、GnRH-Rのリガンド結合部位に結合しうるペ プチドを同定することができる。ペプチドライブラリーのスクリーニングは、受 容体との相互作用によってGnRH-Rの生物活性を阻害するかまたは活性化するよう に作用をする薬剤の発見について治療的価値を有しうる。 GnRH-Rに結合しうる分子の同定は、ペプチドライブラリーを組換え可溶性GnRH -Rタンパク質を用いてスクリーニングすることにより達成できる。GnRH-Rの発現 および精製方法は上記５．２．１．節に記載されており、そして組換え完全長Gn RH-Rまたは興味ある機能性ドメインに応じGnRH-Rの断片を発現させるのに使用で きる。例えば、GnRH-Rの細胞内および細胞外リガンド結合ドメインは別々に発現 させてペプチドライブラリーのスクリーニングに使用することができる。 GnRH-Rと相互作用し複合体を形成するペプチド／固相支持体を同定および単離 するために、GnRH-R分子を標識または「タグ付け」することができる。GnRH-Rタ ンパク質はアルカリホスファターゼ若しくはセイヨウワサビペルオキシダーゼ等 の酵素へ、またはフルオレセインイソチオシアナート（FITC）、フィコエリトリ ン（PE）またはローダミンを包含しうる蛍光標識等の他の試薬へのコンジュゲー ションにより標識できる。任意の既知の標識のGnRH-Rへのコンジュゲーションは 当該技術分野でよく知られた技術を用いて実施できる。 あるいはまた、GnRH-R発現ベクターを、商業的に入手しうる抗体が存在するエ ピトープを含有するキメラGnRH-Rタンパク質を発現するように遺伝子操作するこ ともできる。エピトープ特異的抗体は、酵素、蛍光色素または着色若しくは磁気 ビーズを用いる標識化を含む当該技術分野でよく知られた方法を用いてタグ付け することができる。 GnRH-Rに結合しうるペプチドを同定するには、この「タグ付けされた」GnRH-R コンジュゲートをランダムペプチドライブラリーと22℃で30分から１時間インキ ュベートして、GnRH-Rとライブラリー内のペプチド種との間に複合体を形成させ る。次にこのライブラリーを洗浄してすべての未結合GnRH-Rタンパク質を除去す る。GnRH-Rがアルカリホスファターゼまたはセイヨウワサビペルオキシダーゼと コンジュゲートしている場合には、ライブラリー全体をアルカリホスファターゼ またはペルオキシダーゼのいずれかの基質、例えば、それぞれ５−ブロモ−４− クロロ−３−インドイルホスフェート（BCIP）または3,3',4,4'-ジアミノベンジ ジン(DAB)を含有するペトリ皿に注ぐ。数分間インキュベートした後、ペプチド ／固相−GnRH-R複合体の色が変わり、そして容易に同定されマイクロマニピュレ ーターを用いて解剖顕微鏡の下に物理的に単離されうる。もし蛍光タグ付きGnRH -R分子を用いる場合には、複合体は蛍光活性化ソーティングにより単離されうる 。異種構造のエピトープを発現するキメラGnRH-Rタンパク質を使用する場合には 、ペプチド／GnRH-R複合体の検出は標識されたエピトープ特異的抗体を用いるこ とにより達成されうる。ひとたび単離されると、固相支持体に結合したペプチド の同定はペプチド配列決定により決定されうる。 可溶性GnRH-R分子を用いることに加え、別の態様ではGnRH-Rを発現する無傷の 細胞を用いてGnRH-Rに結合するペプチドを検出することが可能である。無傷の細 胞の使用は、マルチサブユニットであるか、若しくは不安定である受容体と一緒 に、または細胞膜の脂質ドメインが機能することを必要とする受容体と一緒に使 用することが好ましい。GnRH-Rを発現する細胞系を作製する方法は、５．２．１ ．節および５．２．２．節に記載されている。この技術で使用される細胞は生き た細胞であるかまたは固定された細胞のいずれでもよい。細胞はランダムペプチ ドライブラリーとインキュベートされ、そしてライブラリー中のあるペプチドに 結合して標的細胞と関連固相支持体／ペプチドとの間に「ロゼット」を形成する であろう。このロゼットは次に示差遠心分離により単離されるか、または解剖顕 微鏡の下に物理的に除かれうる。 全細胞アッセイの代替として、GnRH-R分子は、標識されるかまたは「タグ付け 」されていてもよいリポソームに再構成でき、そして前記したようにしてペプチ ドライブラリーのスクリーニングに使用できる。 ５．４．２．GnRH-Rタンパク質または遺伝子操作された細胞系を用いる化合物の スクリーニング GnRH-Rを発現する細胞系を使用して、GnRH-R活性を変調するかまたはGnRH-R介 在シグナル伝達を変調する分子をスクリーニングすることができる。かかる分子 には小さい有機若しくは無機化合物、またはGnRH-R活性を変調するか若しくはGn RH-R／GnRH複合体の形成を促進若しくは抑制する他の分子が包含されうる。合成 化合物、天然産物、および潜在的に生物学的に活性な物質の他の供給源を多数の 方法でスクリーニングできる。 試験分子がGnRH-GnRH-R 結合および／またはGnRH-Rシグナル伝達を妨害する能 力は標準的な生化学的技術を使用して測定できる。触媒活性の活性化若しくは抑 制、他のタンパク質の燐酸化若しくは脱燐酸化、第２メッセンジャー産生の活性 化若しくは変調、細胞性イオンレベルの変化、シグナリング分子の会合、解離若 しくは転座、または特異的な遺伝子の転写若しくは翻訳のような応答も監視でき る。これらのアッセイはスクリーニングの過程でこれらの目的のために開発され た慣用の技術を用いて実施できる。 リガンドのその細胞性受容体への結合は、シグナル伝達経路を介して、種々の 細胞過程に影響しうる。GnRH-R／GnRHシグナリング経路の制御の下にある細胞過 程には、それらに限定されるわけではないが、非調節細胞増殖、分化の阻止また は細胞死のような異常なまたは潜在的に有害な過程に加え、ホルモン産生のよう な正常な細胞機能、および細胞の増殖および／または分化が包含されうる。当該 技術分野で知られた技術による記載された細胞過程のいかなる定性的または定量 的観察および測定もが、スクリーニング経路におけるシグナル伝達のスコアリン グ手段として有利に使用されうる。 GnRH-Rと相互作用する化合物のスクリーニング、同定および評価のための種々 の態様が以下に記載されており、これら化合物はGnRH受容体シグナリング経路の 制御の下に種々の細胞過程に影響を及ぼしうる。 本発明は下記のことを包含するGnRH-R活性を変調しうる化合物の同定方法を包 含する、すなわち、 (a) 純粋なまたは半純粋形態の、膜調製物中の、または全生存細胞もしくは固定 細胞中のGnRH-Rまたはその機能性誘導体に上記化合物を接触させ； (b) 工程(a)の混合物を、GnRHまたはGnRH類似体の存在下で上記化合物がシグナ ル伝達を促進または抑制するのに十分な期間でインキュベートし； (c) シグナル伝達を測定し； (d) 上記シグナル伝達活性を、上記化合物の不存在でインキュベートしたGnRH-R のシグナル伝達と比較して、それにより上記化合物がシグナル伝達を促進するか または抑制するか決定する。 GnRH-R、またはシグナル伝達を変調しうる化合物の同定に有用なその機能性誘 導体は、それらが有意なシグナル伝達能を保持する限り、例えばアミノ酸欠失お よび／または挿入および／または置換をしてもよい。GnRH-Rの機能性誘導体は、 天然に存在するかまたは組換えにより発現されたGnRH-Rから、タンパク質分解に よる開裂に続く当業者に知られた慣用の精製操作により調製できる。あるいはま た、機能性誘導体は組換えＤＮＡ技術により、機能性ドメインを包含するGnRH-R の一部分を好適な細胞中で発現させることにより生産できる。機能性誘導体はま た化学的に合成することもできる。GnRH-Rを発現する細胞は粗製または精製され てGnRH-Rの供給源として使用されうるし、またはこれらアッセイにおける試験用 に膜調製物中で使用されうる。あるいはまた、全生存細胞または固定細胞を直接 これらのアッセイに使用することもできる。 GnRH-Rシグナル伝達活性は標準的な生化学的技術によるかまたはそのシグナル により制御される細胞過程を監視することにより測定できる。例えば、GnRH-R活 性の変調を評価するために、GnRH-Rを含有する反応混合物に試験分子を添加した 後にホスホリパーゼＣの活性化またはイノシトール−1,4,5 −トリホスフェート 若しくはジアシルグリセロールの生成をアッセイすることができる。あるいはま た、プロテインキナーゼＣの活性化または細胞内貯蔵所からのカルシウムイオン の放出をアッセイすることもできる。 本発明はさらに、GnRH-Rと相互作用するとGnRH-RへのGnRHの結合作用を模倣す るシグナルを引き起こすかまたはその引き金を引く化合物をスクリーニングする 方法を提供する。シグナル伝達は、シグナリング経路の制御の下にある細胞過程 がリガンド結合により惹起される場合と同様の様式で影響される場合に模倣され る。かかる化合物はGnRH-Rを活性化する天然に存在するかまたは合成的に生産さ れた分子であってもよい。 また、本発明は化学的または生物学的調製物中のGnRH-Rに結合可能な分子を同 定する方法であって、 (a) GnRH-Rまたはその機能性断片を固相マトリックスに固定し； (b) 上記化学的または生物学的調製物を、上記化合物を結合させるのに十分な期 間、工程(a)で作製した固相マトリックスに接触させ； (c) 固相マトリックスからすべての未結合物質を洗い落とし； (d) 固相に結合された上記化合物の存在を検出し； それにより上記化合物を同定する、 ことを含んでなる該方法をも包含する。 前記方法はさらに下記工程をも包含しうる、すなわち、 (e) 結合した化合物を固相マトリックスから溶出させ、それにより該化合物を単 離する。 「GnRH-Rに結合可能な化合物」なる用語は、GnRH-Rと相互作用する天然に存在 するかまたは合成的に生産された任意の分子を指す。かかる化合物には、GnRH-R シグナル伝達を直接的または間接的に変調できるとともに細胞内部でGnRH-Rの細 胞内ドメインと天然に会合している分子が包含されうる。かかる化合物の例とし ては、(i)GnRH-Rの天然の基質；(ii)シグナリング複合体の一部分である天然に 存在する分子；および／または他の細胞型により生産された天然に存在するシグ ナリング分子がある。 ５．５．増殖性疾患の治療におけるGnRH-R類似体の使用 本発明の態様においては、アゴニストまたはアンタゴニスト活性のいずれかに よりGnRH-R変調に関与する薬物は癌のような増殖性疾患の治療に有用でありうる 。例えば、GnRH-Rの活性を変調する薬物は、細胞表面上にGnRH-Rを発現するGnRH 応答性癌細胞の増殖を調節するのに使用できる。 GnRH-R活性が介在するホルモンレベルの調節はまたホルモン応答性腫瘍の治療 にも有用でありうる。本発明の別の態様においては、アゴニストまたはアンタゴ ニストGnRH-R活性のいずれかを示す薬物はホルモン応答性腫瘍の異常増殖を間接 的に変調するのに使用できる。エストロゲンおよびテストステロンのようなホル モンの生産はGnRH-R活性の変調によって調節されうる。例えば、GnRH-R活性の変 調剤は、血清テストステロンレベルを低下させるという所望される効果を得るた めに男性前立腺癌患者に投与されうる。加えて、GnRH-R変調剤はエストロゲン活 性のレベルを低下させるために女性の乳癌患者に投与されうる。 ５．６．薬理学的調製物 GnRH-R受容体シグナル伝達を変調する特定のペプチド、タンパク質、有機化合 物または抗体は、それ自体でまたは適当な担体若しくは賦形剤と混合し医薬組成 物として患者に投与できる。 治療されるべき特有の状態に応じて、これらの薬剤は製剤化されそして全身的 ににまたは局所的に投与されうる。製剤化および投与の技術は「Remington's Ph armaceutical Sciences」，Mack Publishing Co.，Easton，PA,最新版、に見出 されうる。好適な経路には、例えば、経口、直腸、経粘膜、または経腸投与；筋 肉内、皮下、骨髄内注射、ならびに髄腔内、直接心室内、静脈内、腹腔内、鼻内 、または眼内注射を含む非経口送達が包含され、固形腫瘍の場合にはその固形腫 瘍に直接注射されうる。注射用には、本発明の薬剤は水溶液、好ましくはハンク ス溶液、リンゲル液、または生理食塩水緩衝液のような生理学的に適合する緩衝 液中で製剤化されうる。経粘膜投与には、透過すべき障壁に対して適切な浸透剤 が製剤中に使用される。かかる浸透剤は当該技術分野で一般的に知られている。 本発明化合物は当該技術分野でよく知られた製剤学上受容されうる担体を用い て経口投与に適する剤形に容易に製剤化できる。かかる担体は、治療すべき患者 に経口摂取させるために本発明化合物を錠剤、丸剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤 、シロップ剤、スラリー、懸濁液、等として製剤化することを可能にする。 本発明で使用するのに好適な医薬組成物には、その意図する目的が達成できる ような有効量で活性成分を含有する組成物が包含される。有効量の判定は特に本 明細書中に提示される詳細な開示に照らして充分に当業者の能力の範囲内にある 。 活性成分に加え、これらの医薬組成物は活性化合物の医薬上使用できる製剤へ の加工を容易にする賦形剤および補助剤を包含する適当な製剤学上受容されうる 担体を含有しうる。経口投与用に処方された製剤は錠剤、糖衣錠、カプセル剤ま たは液剤の形態であってもよい。 本発明の医薬組成物は、例えば慣用の混合、溶解、顆粒形成、糖衣形成、研和 、乳化、カプセル化、捕捉(entrapping)または凍結乾燥工程等のそれ自体知られ た 方法で製造できる。 非経口投与のための医薬製剤には水溶性形態における活性化合物の水溶液が包 含される。加えて、活性化合物の懸濁液を適当な油性の注射懸濁液として調製で きる。好適な親油性溶媒若しくはビヒクルにはゴマ油のような脂肪油、またはオ レイン酸エチル若しくはトリグリセライドのような合成脂肪酸エステル、または リポソームが包含される。水性注射懸濁液はカルボキシメチルセルロースナトリ ウム、ソルビトールまたはデキストランのような懸濁液の粘度を高める物質を含 有しうる。場合によっては、懸濁液は高濃度溶液の調製を可能にするために化合 物の溶解度を増大させる好適な安定剤または薬剤を含有してもよい。 経口使用用の医薬製剤は、活性化合物を固形賦形剤と混合し、得られる混合物 を必要により粉砕し、所望の場合は好適な補助剤を添加後に顆粒の混合物を加工 して錠剤または糖衣錠コアとすることにより得ることができる。好適な賦形剤は 、特に、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖な どの充填剤；例えばとうもろこし澱粉、小麦澱粉、米澱粉、馬鈴薯澱粉、ゼラチ ン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロー ス、カルボキシメチルセルロースナトリウム、／および／またはポリビニルピロ リドン(PVP)のようなセルロース調製物である。所望の場合は、架橋ポリビニル ピロリドン、アガー、またはアルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウムのような その塩などの崩壊剤を添加できる。 糖衣錠コアには適当なコーティングが付与される。この目的には濃厚な糖溶液 を使用でき、これは場合によりアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、 カルボポル(carbopol)ゲル、ポリエチレングリコール、および／または二酸化チ タン、ラッカー溶液、および適当な有機溶媒または溶媒混合物を含有しうる。同 定のためまたは異なる活性化合物量の組み合わせを特徴づけるために錠剤または 糖衣錠コーティングに染料または顔料を添加できる。 経口使用できる医薬製剤にはゼラチン製のプッシュフィットカプセル、ならび にゼラチンと可塑剤（例えばグリセロールまたはソルビトール）とから作られる 軟質シールカプセルが包含される。プッシュフィットカプセルは活性成分を、ラ クトースのような充填剤、澱粉のような結合剤および／またはタルク若しくはス テアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および場合により安定剤と混合して含 有できる。軟質カプセルにおいては、活性化合物を脂肪油、流動パラフィン、ま たは液状ポリエチレングリコールのような適当な液体中に溶解または懸濁するこ とができる。加えて、安定剤を添加できる。 適合性の医薬担体中に製剤化された本発明の化合物を包含する組成物は調製さ れ、適当な容器に入れられ、そして指示された状態の治療のためにラベルを付け ることができる。ラベルに指示された適当な状態には生殖性疾患および癌のよう な増殖性疾患の治療が包含されうる。加えて、本発明の化合物は避妊法として使 用できる。 本発明の疎水性化合物にとって好ましい製剤上の担体は、ベンジルアルコール 、無極性界面活性剤、水混和性有機ポリマー、および水相を包含する共溶媒系で ある。好ましい共溶媒系はＶＰＤ共溶媒系である。ＶＰＤは３％W/V のベンジル アルコール、８％W/V の無極性界面活性剤ポリソルベート80、および65W/V のポ リエチレングリコール300 を無水エタノール中で容量となした溶液である。ＶＰ Ｄ共溶媒系(VPD:5W)は水溶液中の5%デキストロースを用いて１：１希釈したＶＰ Ｄからなる。この共溶媒系は疎水性化合物をよく溶解させ、そしてそれ自体全身 投与に際して低い毒性しか生じない。当然、共溶媒系の割合はその溶解性および 毒性特性を破壊することなくかなり変動させることができる。さらに、共溶媒成 分の同一性も変動させることができる。例えば、他の低毒性無極性界面活性剤を ポリソルベート80の代わりに使用でき、ポリエチレングリコールのフラクション サイズを変動させることができ、他の生物適合性ポリマー（例えばポリビニルピ ロリドン）がポリエチレングリコールに代わることができ、そして他の糖または 多糖類がデキストロースに代わることができる。 あるいはまた、疎水性医薬化合物のための他の送達系も使用することができる 。リポソームおよび乳剤は疎水性薬物のための送達ビヒクルまたは担体の良く知 られた例である。通常はより毒性が大きいという犠牲はあるが、DMSOのようなあ る種の有機溶媒も使用できる。 医薬組成物はまた好適な固形またはゲル相担体または賦形剤をも包含しうる。 かかる担体または賦形剤の例には炭酸カルシウム、燐酸カルシウム、種々の糖、 澱粉、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー（例えばポリエチレングリ コール）が包含されるがそれらに限定されるわけではない。 本発明のGnRH-R変調化合物の多くは製剤学上適合するカウンターイオンとの塩 として提供されうる。製剤上適合する塩は塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リ ンゴ酸、コハク酸、等を包含するがそれらに限定されない多くの酸を用いて形成 できる。塩は水性のまたは対応する遊離塩基形態である他のプロトン性溶媒中に より溶解しうる傾向がある。 本発明の方法において用いられる何れの化合物でも、治療上有効な投与量は、 最初に、細胞培養アッセイから予想される。例えば、投与量は、動物モデルで処 方して、細胞培養で決定されるようなＩＣ50（すなわち、GnRH-R活性の最大の半 分の抑制を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環濃度範囲を達成することが 可能である。かかる情報を用いて、ヒトにおいて有用な投与量をさらに正確に決 定することが可能である。 治療上有効な投与量とは、患者の症状の改善または延命をもたらすような化合 物の量を言う。かかる化合物の毒性および治療上の効能は、例えば、ＬＤ50（母 集団の５０％に対する致死投与量）およびＥＤ50（母集団の５０％に治療上有効 な投与量）を決定するために、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的 操作により決定することが可能である。毒性と治療上の効果との投与比率は治療 指数であり、それは、ＬＤ50／ＥＤ50の比率として表される。大きな治療指数を 示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られる データは、ヒトで使用するための投薬量の範囲を処方するのに用いることが可能 である。かかる化合物の投薬量は、好ましくは、循環濃度の範囲内にあり、毒性 がほとんどない、あるいは毒性が全くないＥＤ50を含む。投薬量は、採用される 投薬形態および用いられる投与経路に応じて、この範囲内で変化させてもよい。 正確な配合処方、投与経路および投薬量は、患者の状態をみながら、各医師によ り選択することが可能である。（例えば、Finglら、1975，”The Pharmacologic al Basis of Therapeutics”，Ch.1 p.1を参照）。 投薬の量および間隔を、それぞれ調節して、GnRH-R受容体阻害効果を維持する のに十分な活性部分の血漿レベルを達成してもよい。全身投与のための通常の患 者の投薬量は、１〜２０００mg／日の範囲であり、通常は１〜２５０mg／日であ り、典型的には１０〜１５０mg／日である。患者の体重について言えば、通常の 投薬量範囲は0.02〜２５mg/kg/日であり、通常は0.02〜３mg/kg/日であり、典型 的には0.2〜1.5mg/kg/日である。患者の体表面積について言えば、通常の投薬量 範囲は0.5〜１２００mg/m²/日であり、通常は0.5〜１５０mg/m²/日であり、典型 的には５〜１００mg/m²/日である。 投薬の量および間隔をそれぞれ調節して、GnRH-R受容体抑制効果を維持するの に十分な活性部分の血漿レベルを達成してもよい。通常の平均的な血漿レベルは 、５０〜５０００μg/ml内でなければらなず、通常は５０〜１０００μg/mlであ り、典型的には１００〜５００μg/mlである。 あるいはまた、上記化合物は、全身的ではなく局所的に投与してもよく、例え ば、該化合物をしばしばデポー製剤または持続型放出製剤として直接的に腫瘍に 注入することにより投与されてもよい。 さらに、薬剤を、標的薬剤運搬系(targeted drug delivery system)で投与し てもよく、例えば、腫瘍特異的抗体で被覆されたリポソームとして投与される。 このリポソームは、腫瘍によって標的にされ、選択的に摂取される。 局所投与または選択的摂取の場合、薬剤の有効な局所濃度は、血漿濃度には関 係しない。 ６．実施例：機能的マウスGnRH-Rのクローニング 以下のサブセクションは、マウスGnRH-Rを表す相補的ＤＮＡのクローニングを 説明し、ツメガエル(Xenopus)卵母細胞発現を用いてその同一性を確認する。セ ンスＲＮＡ転写物の注入より、機能的な高親和性のGnRH-Rの発現が起こる。しか し、性腺細胞系ＲＮＡを用いたGnRH-Rの発現は、アンチセンス・オリゴヌクレオ チドにより遮断される。ラット下垂体前葉におけるin situハイブリダイゼーシ ョンによって、特徴的なGnRH-Rの分布が明かになる。このヌクレオチド配列は、 ３２７個のアミノ酸の蛋白質をコードし、これは、Ｇ蛋白質が結合している受容 体に特徴的な７個の推定の膜貫通ドメインを有するが、典型的な細胞内Ｃ末端が 欠如している。このGnRH-Rの変わった構造および新規な潜在的調節ドメインは、 そのシグナル形質導入および調節の独特な面を説明する。 6.1．材料および方法 薬剤は、以下の供給元から得た。：GnRH-Rアンタゴニスト[D-Phe^2.6,Pro³]-Gn RH(Bechem，Torrance，CA)、ブセレリン(buserelin)（D-Ser(But)⁶,Pro⁹-N-エチ ルアミドGnRH）Hoerchst-Roussel Pharmaceuticals(Somerville，NJ)。他の全て の薬品は、Sigma Chemical Co．(St．Louis，MO)からであった。全ての動物の 管理は、NIH Guide for the CareおよびUse of Laboratory Animalsに従った。 6.1.1.卵母細胞のマイクロインジェクションおよび記録 成体雌性アフリカツメガエル(Xenopus laevis)(Nasco，Ft．Atkinson，WI)を １８〜２０℃および１５ｈ／９ｈの昼／夜サイクルに保持した。卵母細胞を注入 のために調製し、応答を先述のようにして記録した(Sealfonら、1990，Mol．End ocrinol 4; 119-124)。細胞を0.5ml容の浴に入れ、標準的な二電極技術(Dascal ，1987，CRC Crit．Rev．Biochem．417: 47-61)を用いて電圧を−７０mVにクラ ンプした(clamped)。ペプチド・リガンドは、潅流緩衝液に希釈し、上記浴に導 入した。クランプ電流(clamp current)は、チャート記録計を用いて記録した。 反転電位(reversal potentials)は、アゴニストを用いて、あるいは用いずに、I BM PC/AT装置で、TL-1インターフェースおよびpCLAMPソフトウエア[Axon Instru ments(Burlingame，CA)]を用いて、２秒間にわたる−７０〜＋１０mVの連続ラン ピング(continuous ramping)により決定した。 6.1.2.ＰＣＲクローニングおよびハイブリッド阻害スクリーニング ＲＮＡの調製およびｃＤＮＡの合成は先述のようにして行った(Sealfonら、19 90，Mol．Endocrinol 4: 119-124; Snyderら、1991，Neurosci Lett 122: 37-40 )。ハイブリッド阻害スクリーニング(hybrid arrest screening)のためのサブク ローンは、ＧＰＲスーパーファミリーの保存された膜貫通ドメインに対応する種 々の縮重オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲを用いて単離した。このオリゴヌク レオチドは、WZ7を含むサブクローンの群を単離するのに用い、公表されたオリ ゴマーの配列から改変し(Zhouら、1990，Nature 347: 76-80)、これは膜貫通III [5'-GAGTCGACCTGTG(CT)G(CT)(GC)AT(CT)(AG)CNNT(GT)GAC(AC)G(CG)TAC-3']およ び膜貫通VI[5'-CAGAATTCAG(AT)AGGGCANCCAGCAGAN(CG)(AG)(CT)GAA-3']に対応す る。ＰＣＲは、低いストリンジェント条件で行った。反応の一部は、高いストリ ンジェント条件で再増幅し、制限酵素で消化し、pBluescript II KS+(Stratagen e)にサブクローニングし、配列決定した。ハイブリッド阻害アッセイでは、5HTI C受容体の膜貫通IIに対応するアンチセンス・オリゴヌクレオチド(5'-ATCAGC AATGGCTAG-3')(Juliusら、1988，Science 241: 558-564)およびWZ7に対応するオ リゴヌクレオチド(5'-AGCATGATGAGGAGG-3')を合成した。αT3-1（１mg/ml）とラ ット脳全ＲＮＡ（１mg/ml）との混合物を、アンチセンス・オリゴヌクレオチド （１００μg/ml）を用いて、１０分間にわたって、３７℃で、２００mMのNaClお よび５mMのTrisを含有する緩衝液（pH 7.4，３μl容）中でプレインキュベート した。ツメガエルの卵母細胞に５０nlの上記混合物を注入し、４８時間にわたっ てインキュベートした後で、記録した。 6.1.3.ライブラリー・スクリーニングおよび配列決定 UniZap(Stratagene)αT3-1 ｃＤＮＡライブラリーの１０⁶個のプラークを、 ランダム・ヘキサマー・プライマーによって³²Ｐ標識化されているWZ7の挿入物 を用いてスクリーニングした。４０個の陽性のプラークを同定し、２回目および ３回目のスクリーニングで７個を精製した。WZ25を、ヘルパー・ファージ切り出 しによってpBluescript II SK+にサブクローニングし、両ストランドを、ジデオ キシ連鎖末端法によって、シーケナーゼＴ７ＤＮＡポリメラーゼ(USB)を用いて 配列決定した。配列は、taqポリメラーゼ標識化およびApplied Biosystems自動 シーケンサーを用いて両ストランドを再度配列決定することによって、さらに確 認した。予想される細胞質Ｃ末端がWZ25内での突然変異により末端切断される可 能性を除外するために、３´配列を２種のさらなる独立したクローン内で確認し た。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、VAXコンピュータのWisconsin GCGパッ ケージおよびマイクロプロセッサのMacVector(IBI)を用いて分析した。 6.1.4.WZ25 ＲＮＡ転写物の特徴決定 pBluescript II SK+(Stratagene)中のWZ25を直鎖状にし、Ｔ３ＲＮＡポリメラ ーゼ(Stratagene)を用いて、キャップ化されたＲＮＡ転写体を合成した。卵母細 胞に1.25 ngの得られた転写体を注入し、４８時間にわたってインキュベートし た後で、記録した。卵母細胞は、緩衝液またはGnRHアンタゴニスト（アンタゴニ スト６：[Ac-D-Nal(2)¹，D,α-Me-pCl-Phe²，D-Trp³，D-Arg⁶，D-Ala¹⁰]GnRH； アンタゴニスト２７：[Ac-D-Nal(2)¹，D-α-Me-pCl-Phe²，D-Trp³，N-ε-lpr-Ly s⁵，D-Tyr⁶，D-Ala¹⁰]GnRH；(Cander Spuyら、1987，Vickery BH and Nestor JJ （eds）LHRH and its Analogs: Cotraceptive and therapeutic Applications． NTP Press，Lancaster，Englandを参照）)のいずれかを用いて、３分間にわたっ て予備処理した後で、GnRH投与を行った。受容体の発現を確認するために、卵母 細胞は、アンタゴニストを３分間にわたって洗い出した後で、GnRHに再度さらし た。 6.1.5.ラジオリガンド結合アッセイ 膜を調製するために、５００個の卵母細胞にそれぞれ2.5 ngの合成WZ25ＲＮＡ を注入した。４８時間後、卵母細胞の膜を記載(Kobilkaら、1987，J．Biol．Che m．262: 15796-15802)のようにして調製し、１０mMのHEPES、1mMのEDTAおよび0. 1%のウシ血清アルブミンを含有する結合緩衝液に再懸濁して、２０個の卵母細胞 ／mlの最終濃度を得た。¹²⁵I-[D-Ala⁶，NaMe-Leu⁷，Pro⁹-NHEt]GnRH(GnRH-A)を 用いた受容体結合アッセイは、ラットおよびヒツジの下垂体膜について先述した もの(Millarら、1989，J．Bio．Chem．264: 21007-21013)に基づいた。１０^-6M のGnRHアナログの存在下での結合は、非特異的な結合であると考えた。平均のBo （最大結合）および非特異的結合の値は、それぞれ1429および662cpmであった。 GnRH-AおよびGnRHについての解離定数(Kd)は、Enzfitter(Elsevier-BIOSOFT)を 用いて決定した。 6.1.6.溶液ハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析および in situ ハイブリダイゼーション ３９９ヌクレオチドの³²Ｐ標識化したGnRH-Rおよび1１７ヌクレオチドの1B15 （シクロフィリン内部ストランド）アンチセンスｃＲＮＡプローブを合成し、記 載の方法(Autelitanoら、1989，Mo Cell．Endo．67: 101-105)を用いてＲＮＡ に溶液でハイブリダイズした。ポリ(A)⁺αT3-1 ＲＮＡを用いたノーザンブロッ ト分析は、記載(Sambrookら、1989，Molecular Cloning: A Laborabory Manual ．Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)のようにし て行った。³⁵Ｓ−ＵＴＰ標識したｃＲＮＡを用いたin situハイブリダイゼー ションは、自由に浮遊している下垂体の切片の上で、公表された方法(Gall & Is ackson，1989，Science 245: 758-761)にしたがって行った。切片を載せ、Amers ham Beta-max フィルムに３日間にわたってさらすか、あるいは放射活性エマル ジョンに浸漬し、１７日後に現像させた。 6.2.結果 6.2.1.機能的マウスGnRH-RのｃＤＮＡクローニング マウス性腺刺激細胞系であるαT3-1[5]からのＲＮＡは、ツメガエル卵母細胞 における機能的GnRH-Rの発現を支配するものであるが(Sealfonら、1990，Mol．E ndocrinol 4: 119-124)、これを用いて、Ｇ蛋白質結合受容体(GPR: Probstら、1 992，DNAand Cell Bio 11:1-20 を参照)の保存されたモチーフに対応する縮重 オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲのためのｃＤＮＡを合成した。ＰＣＲ生成物 をサブクローニングし、配列決定して、アンチセンス・オリゴマーをハイブリッ ド阻害アッセイのために合成した(Kawashi，1985，Nuc．Acids Res．13: 4991-5 004)。クローンWZ7に対応するオリゴヌクレオチドは、α-T3-1およびラット脳Ｒ ＮＡと共に同時注入した場合、卵母細胞におけるGnRH-Rの発現を完全に消滅させ たが、脳5HTI_IC受容体の発現には影響しなかった（図１）。第２のアンチセンス ・オリゴヌクレオチドは、WZ7の別のセグメントを示すが、これもまた、テスト した全ての卵母細胞（ｎ＝１６）においてGnRH-R発現を完全に、かつ特異的に失 わせた。クローンWZ7は、αT3-1バクテリオファージｃＤＮＡライブラリーをス クリーニングするためのプローブとして用い、７個の陽性のプラークを精製した 。 1.3kbの最大の挿入物(すなわち、WZ25)を有するクローンが機能的GnRH-Rをコ ードするか否かを試験するために、それをＲＮＡ合成および卵母細胞発現のため にサブクローニングした。全ての合成ＲＮＡ注入卵母細胞（ｎ＞５０）は、GnRH にさらした場合、GnRH-R発現の大きな減極性応答特性(depolarizing response c haracteristic)を示した（図２）。WZ25 ＲＮＡ転写体によって卵母細胞におい て誘発されるGnRHに対する応答の反転電位(V^r)およびカルシウム依存性は、α T3-1 ＲＮＡを用いて予め得られたものと同様であった(Sealfonら、1990，Mol ．Endocrinol 4: 119-124)。GnRHによってもたらされる電流のVrは、−２７±0. 79mV（ｎ＝７）であり、卵母細胞における塩素イオンのものと一致した(Barish ，1983，J．Physiol．342: 309-325)。GnRHによってもたらされる応答は、記録 する１時間前に卵母細胞を５mMのEGTAで予備処理することによって完全に失われ た（ｎ＝４）が、潅流液中おけるCa²⁺の不存在によってそれ程影響を受けなかっ た（ｎ＝７）。したがって、クローンWZ25から発現された受容体は、ホスファチ ジルイノシトール加水分解を起こす受容体（Dascal，1987，CRC Crit．Rev．Bio chem．417:47-61を参照）に特徴的な、卵母細胞のカルシウムに依存するクロラ イドの流れによって媒介される応答を示した。得られた応答の薬理学は、哺乳動 物のGnRH-Rの発現と一致した。GnRHアゴニスト[D-Ser(t-Bu)⁶，Pro⁹-NHEt]GnRH （１００nM ブセレリン、ｎ＝６）は、ＲＮＡ注入卵母細胞において減極性の電 流をもたらした。等モルの弱いGnRHアンタゴニスト[D-Phe^2.6，Pro³]GnRHの存在 下では、GnRH単独に対する応答と比較して、GnRHへの応答が６０％低下した（そ れぞれ、1880±551 nA，ｎ＝５、および4756±1082 nA,ｎ＝４）。２種の潜在的 なGnRHアンタゴニストは、GnRHによってもたらされる電流を完全になくした（図 ２Ａ）。 このｃＤＮＡクローンによってコードされる受容体をさらに特徴決定するため に、WZ25 ＲＮＡ転写体を注入した卵母細胞から精製した膜の上でのラジオリガ ンド結合アッセイを行った。GnRHアゴニスト[D-Ala⁶，NαMe-Leu⁷，Pro⁹-NHEt]G nRH(GnRH-A)は、合成ＲＮＡが注入された卵母細胞の膜と高い親和性で結合した （図２Ｂ）。¹²⁵I-GnRH-AをGnRH-Aで置換することにより、WZ25 ＲＮＡ注入卵 母細胞膜およびαT3-1細胞膜において、それぞれ4.5および2.9nMという同様のKd であることが明らかになった。クローン化した受容体に結合したGnRH-AのGnRHに よる置換は、以前にαT3-1膜について報告されているように(Hornら、1991，Mol ．Endocrinol．5: 347-355)、それ程有効ではない桁数であった。したがって、 ハイブリッド阻害および発現のデータにより、クローンWZ25がマウスGnRH-Rを示 すことが確認される。 6.2.2.マウスGnRH-Rのコード配列の特徴決定 クローンWZ25のヌクレオチド（配列番号１）および対応する予想されるアミノ 酸配列（配列番号２）を図３に示す。最長のオープン・リーディング・フレーム は３２７個のアミノ酸の蛋白質（相対的分子質量、Mr＝37,683）をコードする。 可溶化したラットGnRH-Rの結合サブユニットについては、さらに長い大きさのも の（Mr 50,000-60,000）が報告されており(Hazumら、1986，J．Bio．Chem．261: 13043-13048; Iwashitaら、1988，J.Mol．Endocrinol．1: 187-196)、これは受 容体のグリコシル化による。３つのコンセンサスＮ連結グリコシル化部位が存在 し、２つはＮ末端にあり、１つは推定される第１の細胞外ループにある。第１の ATGは翻訳開始部位を示すと考えられる。その理由は、それがKozakコンセンサス 配列(Kozak，1987，Nuc．Acids Res．15: 8125-8148)と非常に類似しており、か つ、さらなる５’配列を有する第２のｃＤＮＡクローンが、このリーディング・ フレーム内に−５４および−５７の位置で、２つの非センス・コドンを含むから である。したがって、あらゆる上流スタート部位での翻訳開始は、正しいオープ ン・リーディング・フレームに到達する前に終了するであろう。ポリアデニル化 シグナルは全くなく、明らかなポリ(A)末端が、ライブラリー構築の際の３’非 翻訳領域におけるオリゴ(dT)プライミングを最も表すと思われる。しょ糖勾配(S ealfonら，1990，Mol．Endocrinol 4: 119-124)およびノーザンブロット分析に より決定したところ、単離された機能的GnRH-R ｃＤＮＡは1.3kbであるが、こ の配列を含むｍＲＮＡは約4.6kbである（図５Ｂ）。一次ライブラリー・スクリ ーニングにより同定される４０個の陽性のプラークのＰＣＲ分析から、GnRH-R ｍＲＮＡがさらなる５’非翻訳配列と３’非翻訳配列との双方を含有することが 示唆される。 導き出された蛋白質の疎水性分析から、インターロイキン−８受容体と高度の 相同性を有する他のＧＰＲに類似する２０〜３０％の配列を有する高い疎水性の アミノ酸の７つのストレッチ(stretches)が証明される（図４）。GnRH-R中の幾 つかの高度に保存された残基（例えば、多くの受容体を安定化する最初の２つの 細胞外ループの各々に存在するシステイン等）が注目されるが、GnRH-Rの幾つか の特徴は珍しいものである。例えば、高度に保存された細胞貫通IIアスパルテー ト／グルタメートは、多くのＧＰＲの機能にとって重要であることがわかってい るが、これはアスパラギンで置き換えられる。GnRH-Rは、ＧＰＲのスーパーファ ミリーの中でほとんど最短のものであり、あらゆる他のＧＰＲとは異なって、極 性細胞質Ｃ末端が欠如している。推定される第１の細胞質ループは、他の如何な るＧＰＲよりも長い。ＧＰＲの中でも独特なことに、GnRH-Rは二量重合により活 性化する(Connら，1982，Nature 296: 653-655; Gregory & Taylor，1982，Natu re 300: 269-271)。その珍しい構造は、この提案された活性化のメカニズムに役 立つであろう。 他のＧＰＲとののもう１つの相違(deviation)は、セリンの、細胞貫通IIIに隣 接して位置する保存されたチロシンへの置換である。これにより、他のＧＰＲの シグナル形質導入にとって重要なドメインに潜在的なリン酸化部位がつくられ、 これはGnRH-Rに独自ものである。Ｃ末端のリン酸化は、GnRH-Rでは見られないこ とであるが、これは、幾つかのＧＰＲの減感作に寄与する（Probstら，1992，DN A and Cell Biology 11: 1-20を参照）。GnRH-Rの新規なリン酸化部位が受容体 の減感作に介在するか否かを決定することは興味深いことである。他の潜在的な 調節リン酸化部位も存在する（図３）。 種々の神経内分泌細胞系におけるGnRH-R ｍＲＮＡの存在は、溶液ハイブリダ イゼーション／ヌクレアーゼ保護アッセイによって調べた（図５Ａ）。GnRH-Rｍ ＲＮＡはαT3-1細胞およびマウス下垂体において検出されたが、神経由来のGnRH （GT-1）、コルチコトロピン(corticotroph)（AtT20）またはソマトラクトトロ ピン(somatolactotroph)（GH3）細胞系では該アッセイの検出限界で検出されな かった。GT-1およびAtT-20細胞系において検出可能なGnRH-R ｍＲＮＡが存在し ないことは、溶液ハイブリダイゼーション／ヌクレアーゼ保護アッセイにおいて 高濃度のＲＮＡを用いて確認されている（Dr．Andrea C．gore,非公開のデータ ）。図５Ｃは、ラット下垂体前葉におけるGnRH-R ｍＲＮＡの分布を示す。標識 は、腺全体に不均一に分布し、GnRH-Rオートラジオグラフィによってパターンが 予め観察された(Badr & Pelletier，1988，Neuropeptides 11:7-11)。明視野(br ight-field)および暗視野(dark-field)顕微鏡法により、GnRH-R ｍＲＮＡを発 現する細胞の密集化が明らかになった（図５Ｅ，Ｆ）。 ７．実施例：ヒトGnRH-Rのクローニングおよび特徴決定 以下のサブセクションは、ヒトGnRH-Rを表す相補的ＤＮＡのクローニングを説 明し、かつツメガエル卵母細胞発現を用いてその同一性を確認する。さらに、こ のヒトGnRH-Rは、COS-1細胞内で発現して、機能的に活性であることが示された 。 7.1.材料および方法 7.1.1.ヒトGnRH-Rのクローニング GT10ヒト下垂体ｃＤＮＡライブラリー(Clontech)の120万個のプラークを、高 いストリンジェント条件で、マウスGnRH-R挿入物(Tsutsumiら，1992，Mol．Endo crinol．6: 1163-1169）（ランダム・ヘキサマー・プライミングにより³²Ｐ標識 されている）でプローブした(Sambrookら，1989，Molecular Cloning: A Labora tory Mnual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y .)。３２個の陽性のプラークを二連のフィルターで同定した。すなわち、１０個 はさらに特徴決定するために選別し、６個は次のスクリーニングによってうまく 精製した。最も大きな挿入物を有するクローンを、pBluescript II SK+（構築物 LC27-4）のEcoRI部位にサブクローンし、両ストランドを、Applied Biosystems 自動シーケンサー(Foster City，CA，USA)で、合成オリゴヌクレオチド・プライ マーを用いて、繰り返し配列決定した。配列は、VAXコンピューターのWisconsin GCGパッケージを用いて分析した。 7.1.2.ツメガエル卵母細胞での発現 構築物LC27-4を直鎖状にし、キャップ化ＲＮＡ転写体をＴ３ＲＮＡポリメラー ゼを用いて合成した。卵母細胞の調製および電気生理学は先述(Sralfonら，1990 ,Mol．Endocrinol．4: 119-124)のようにして行った。細胞に１〜１０ngの合成 転写物を注入し、電気生理学を二電極電圧クランプにより４８時間後に記録した 。全てのアゴニストおよびアンタゴニストを0.2μMの濃度でかけた。アンタゴニ ストは、GnRHにさらす前に浴に３分間導入した。 以下のGnRHアナログを用いた。：GnRH-A：[D-Ala⁶，N-Me-Leu⁷，Pro⁹-NHEt]G nRH；アンタゴニスト５：[D-pGlu¹，D-Phe²，D-Trp^3.6]GnRH；アンタゴニスト６ ：[Ac-D-NaI(2)¹，D-α-Me-pCl-Phe²，D-Trp³，D-Arg⁶，D-Ala¹⁰]GnRH；アンタ ゴニスト１３：[Ac-D-NaI¹，D-α-4-ClPhe²，D-Pal³，D-Arg⁶，D-Ala¹⁰]GnRH； アンタゴニスト２７：[Ac-D-NaI(2)¹，D-α-Me-pCl]-Phe²，D-Trp³，N-ε-ipr-L ys⁵，D-Tyr⁶，D-Ala¹⁰]GnRH[Van der Spuyら，1987，”LHRH and its Analogs": Contraceptive and Therapeutic Applications（Vickery，B.H．およびNestor ，J.J．eds）NTP Press，Lancaster]。ブセレリン(buserelin)[D-Ser(But)⁶,Pro⁹ ]GnRH)は、Hoerchst-Roussel Pharmaceuticals(Somerville，NJ，USA)の寛大な 贈与であった。 7.1.3.COS-1 細胞のトランスフェクション ヒトGnRH-R ｃＤＮＡを、SV40初期プロモーターを含有する発現ベクターpSV2 Aにサブクローニングした。COS-1細胞は、pSV2A-ヒトGnRH-R構築体により、DEAE −デキストラン法(Keownら，1990，”Methods in Enzymology”VI．185（Goedde l，D.V.，ed.）pp．527-537，Academic Press，New York)を用いて瞬間的にトラ ンスフェクトした。GnRH結合の検討では、３ｘ１０⁶細胞／１０cm皿を１５μgの ＤＮＡでトランスフェクトした。イノシトールリン酸産生に関する検討では、1. 8ｘ１０⁵細胞／ウエル（１２ウエルのプレート）を1.5μgのＤＮＡでトランスフ ェクトした。細胞は、トランスフェクションの４８時間後にアッセイした。 7.1.4.受容体結合 細胞の膜は、トランスフェクトした細胞から、ラット下垂体について記載した ような単一の遠心分離工程(Millarら，1989，J．Biol．Chem．264: 21007-21013 )を用いて調製した。受容体結合アッセイは、先述(Tsutsumiら，1992，Mol．End ocrinol．6: 1163-1169)のようにして、¹²⁵I-GnRH-Aを用いて行った。１０^-7Mの GnRH-Aを用いて、非特異的な結合を推定した。 7.1.5.イノシトールリン酸産生の刺激 GnRHで刺激されるイノシトールリン酸（IP）産生は、記載(Davidsonら，1990, Endocrinology 126: 80-87)のようにして決定した。LiClの存在下での[³H]IPの 蓄積は、リン酸イノシトールのターンオーバーの指標として用いた。簡単に言う と、トランスフェクトされた細胞は、一夜にわたって[³H]イノシトールで標識化 し、LiClの存在下で1.0μMのGnRHで刺激した。反応は、過塩素酸およびフィチン 酸の添加により停止した。KOHで中和した後、イノシトールリン酸をDowexイオン 交換カラムで分離し、カウントした。 7.1.6.ノーザンブロットおよびＰＣＲ分析 ＲＮＡは、６つのヒト下垂体（５つは男性、１つは女性のもの、年齢３０〜４ ５才）およびヒト精巣（年齢８０才）から、グアニジニウム・チオシアネートで 抽出することにより調製し、続いて塩化セシウム中で遠心分離した(Sambrookら ，1989，"Molecular Cloning"：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab oratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。Promega PolyA Tract mRNA単離装置 を用いて調製した下垂体（1.6μg）および精巣（0.9μg）のポリ（Ａ）ＲＮＡを 、１％アガロース、2.2Mホルムアルデヒド・ゲルで電気泳動し、２０ｘＳＳＣ中 のニトロセルロース膜(HYbond-C extra，Amersham)に移し、減圧下で８０℃で固 定した。構築体LC27-4からの挿入物を、7.2ｘ１０⁸cpm/μgの比活性までAmersha m Megaprime Labelling Kitを用いて標識化した。ブロットをプレハイブリダイ ズし（２時間）、２ｘPipes、50% ホルムアルデヒド、0.5%ＳＤＳ、100μg/mlの ニシンの精子ＤＮＡ中で４２℃でハイブリダイズし（一夜）、続いて洗浄した（ 最終洗浄 0.2ｘＳＳＣ、0.1%ＳＤＳ、６０℃、１０分間）。ヒトＲＮＡにおけ る過剰の５’および３’非翻訳配列を明らかにする(delineate)ために、クロー ンを、一次ライブラリー・スクリーニングにおける二連のフィルタで同定し、精 製されなかったものは、GT10クローニング部位および公知のヒトGnRH-R挿入物に 向かう対になったプライマーを有するＰＣＲ鋳型として用いた。得られるＰＣＲ 反応の生成物は、１％アガロースゲル上で、ＰＣＲ鋳型としてクローンLC27-4を 用いて得られるものと比較した。 7.2.結果 7.2.1.ヒトGnRH-Rのクローニングおよび特徴決定 クローンLC27-4の配列決定は、2160bpの挿入物であることが同定された（図９ ）。最大のオープン・リーディング・フレーム(1008bp)は、該クローンの５’末 端に伸びる。翻訳開始部位は、Kozakコンセンサス配列(Kozak，1987，Nucleic A cids Res．15: 8125-8148)の存在により、一部分は第１のATGとされる。特徴決 定されるクローンはその完全な５’範囲内のリーディング・フレームに残ってい るという理由から、さらなる上流開始部位の存在は除外できない。しかし、さら なる５’コード領域の存在はありそうにないと考えられる。その理由は、翻訳開 始部位が大きな確実性をもって指定される(assigned)ことが可能な、マウス受容 体との高い相同性のためである(Tsutsumiら，1992)。したがって、ヒト受容体ｃ ＤＮＡは、328 個のアミノ酸の蛋白質をコードする984bpのリーディング・フレ ームを、マウス受容体の予想される配列と９０％の同一性で含む。長い３´非翻 訳領域は、ポリアデニル化シグナルを全く含まない。 ノーザンブロット分析を用いて、全長ヒトGnRH ＲＮＡの大きさを決定した。 このプローブは、ヒト下垂体ポリ（Ａ）ＲＮＡにおける約4.7 kbの単一のバンド であることが明らかになった（図１０）。ヒト精巣から精製されたポリ（Ａ）Ｒ ＮＡまたはヒトβ−アクチンｃＤＮＡコントロールを用いて精製したポリ（Ａ） ＲＮＡでは、シグナルは全く検出されなかった。ＲＮＡの５’および３’非翻訳 ドメインの範囲を決定するために、一次ライブラリー・スクリーニングからのフ ァージ単離物のＰＣＲ分析を行った。LC27-4挿入物の５’末端付近の配列を表す アンチセンス・オリゴヌクレオチド・プライマー、または同じ配列の３’末端付 近のセンス・プライマーを、隣接するGT1クローニング部位に対して設計された プライマーとの連結(conjunction)に用いて、精製されていないクローンのマッ ピングを行った。同定した最長のＰＣＲ生成物は、約1.3kbのさらなる５’配列 および0.3kbのさらなる３’配列を有していた（図示せず）。これらのデータは 、GnRH-R ｍＲＮＡが少なくとも1.3kbの５’非翻訳配列と1.5kbの３’非翻訳配 列とを含むことを示唆する。ノーザンブロットのデータに基づくと、このことは 、さらなる非翻訳配列（＜１kb）が単離されたクローンの何れにも含まれていな いことを示唆する。 疎水性分析(Kyte-Dolittle)により、Ｇ蛋白質結合受容体の特徴である７つの 疎水性ドメインを同定した（図９参照）。マウス受容体の予想される構造からわ かるように、ヒトGnRH-Rは、本質的に、あらゆるＣ末端細胞内ドメインが欠如し ている。２つの潜在的なＮ連結グリコシル化部位が存在し、最初の２つの細胞外 ドメインの各々にある。幾つかの細胞質セリンおよびトレオニン残基が、細胞内 ドメインに見いだされ、調節リン酸化部位としての役割を果たす。 7.2.2.ツメガエル卵母細胞の注入 単離された最大のクローンであるLC27-4は、約2.2kbの挿入物を含有していた 。このクローンが機能的ヒトGnRH-Rをコードするか否かを試験するために、合成 ＲＮＡ転写体をツメガエル卵母細胞に注入した。全てのＲＮＡ注入卵母細胞は、 ２ｘ１０^-7M のGnRH（ｎ＝１７）または２ｘ１０ M のブセレリン（Ｎ＝６；図 １）にさらした際に、大きな減極性電流を生じ、これは、組織または細胞系ＲＮ Ａを用いた卵母細胞における哺乳動物のGnRH-Rの発現に従って得られる応答(Sea lfonら，1990，Mol．Endocrinol．4: 119-124)とは区別できなかった。これらの 応答は、等モル濃度の２種の潜在的なGnRH受容体アンタゴニストによって完全に 遮断された（それぞれｎ＝５；図６）。 7.2.3.ヒトGnRH-RのCOS-1細胞における発現 クローン化されたヒトGnRH-Rをさらに特徴決定するために、受容体をCOS-1細 胞内で発現した。ヒトGnRH-R構築体でトランスフェクトされたCOS-1細胞からの 膜を用いた結合のデータを図７に示す。GnRH-AのGnRH-A、GnRHおよびアンタゴニ スト５による置き換えは、解離定数がそれぞれ0.97nM、2.8nMおよび8.4nMであり 、ヒト下垂体膜を用いて予め得たもの(Wormaldら，1985，J．Clin．Endocrinol ．Metab．61: 1190-1198)と類似する値であった。 COS-1細胞内で発現された受容体は機能的であり、イノシトールリン酸代謝に 関連することがわかった。最大の受容体の刺激で、リン酸イノシトール(phospho inositol)代謝において約８倍の増加が達成され、GnRHのＥＣ₅₀は約３nMであっ た。（１０^-8）MのGnRHにより誘発されるＰＩターンオーバーの刺激は、GnRHア ンタゴニストにより濃度依存的に抑制された（図８）。GnRHで刺激される（１０^-8 M）イノシトールリン酸産生は、アンタゴニスト１３（ＩＣ₅₀が6.7ｘ１０^-9M ）およびアンタゴニスト５（ＩＣ₅₀が1.05ｘ１０^-7M）によって抑制され（図示 せず）、Kdの値がそれぞれ2.1 ｘ１０^-10Mおよび3.6 ｘ１０^-9Mであった(Leslie ，F.M.，1987，Pharmacol．Rev．39: 197-247)。 本発明は、例示した実施例によって範囲が限定されるものではなく、それらの 実施例は、本発明の単一の形態を説明するものとして意図され、機能的に等価で あるあらゆるクローン、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は本発明の範疇内である。ま さに、本発明の種々の改変は、上記の記載および添付の図面から、当業者であれ ば可能である。そのような改変は添付の請求の範囲の範疇内であると意図される 。 さらに、ヌクレオチドについて与えられる全ての塩基対の大きさはおよその値 であり、説明の目的で用いられる、と理解すべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/577 Ｂ 33/577 Ａ６１Ｋ 31/70 // Ａ６１Ｋ 31/70 39/395 Ｐ 39/395 Ｃ０７Ｋ 14/72 Ｃ０７Ｋ 14/72 Ａ６１Ｋ 37/02

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＧｎＲＨ−Ｒのヌクレオチド配列の一部に相補的なアンチセンス配列をコー ドし、かつ細胞におけるＧｎＲＨ−Ｒ遺伝子の翻訳を阻害するオリゴヌクレオチ ド。 ２．ＧｎＲＨ−Ｒのアミノ末端領域をコードするヌクレオチド配列に相補的な、 請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。 ３．ＧｎＲＨ−Ｒのエピトープに免疫特異的に結合するモノクローナル抗体。 ４．ＧｎＲＨのＧｎＲＨ−Ｒへの結合を競合的に阻害する、請求項３に記載のモ ノクローナル抗体。 ５．ヒトＧｎＲＨ−Ｒに結合する、請求項３または４に記載のモノクローナル抗 体。 ６．ＧｎＲＨ−Ｒを用いて宿主種を免疫感作することを含んでなる避妊法。 ７．ＧｎＲＨ−Ｒ融合タンパク質を用いて宿主種を免疫感作することを含んでな る避妊法。 ８．ＧｎＲＨ−Ｒシグナル伝達を変調することのできる化合物を同定する方法で あって、 （ａ）純粋または半純粋形態の、膜調製物中の、または全生存細胞もしくは 固定細胞中のＧｎＲＨ−Ｒまたはその機能性誘導体に前記化合物を接触させ； （ｂ）工程（ａ）の混合物を、ＧｎＲＨまたはＧｎＲＨ類似体の存在下で、 前記化合物がシグナル伝達を促進または抑制するのに十分な期間インキュベート し； （ｃ）シグナル伝達を測定し； （ｄ）上記シグナル伝達活性を前記化合物の不在下でインキュベートしたＧ ｎＲＨ−Ｒのシグナル伝達活性と比較し、それによって前記化合物がシグナル伝 達を刺激するか又は抑制するかを決定する、 ことを含んでなる該方法。 ９．化学的または生物学的調製物中の、ＧｎＲＨ−Ｒに結合可能な分子を同定す る方法であって、 （ａ）ＧｎＲＨ−Ｒまたはその機能性断片を固相マトリックスに固定し； （ｂ）前記化合物を結合させるのに十分な期間、上記化学的または生物学的 調 製物を工程（ａ）で作成した固相マトリックスに接触させ； （ｃ）固相マトリックスから未結合の物質をすべて洗い落とし； （ｄ）固相に結合した前記化合物の存在を検出する、 ことを含んでなる該方法。 10．化学的または生物学的調製物中の、ＧｎＲＨ−Ｒに結合可能な分子を同定す る方法であって、 （ａ）ＧｎＲＨ−Ｒまたはその機能性断片を固相マトリックスに固定し； （ｂ）前記化合物を結合させるのに十分な期間、上記化学的または生物学的 調製物を工程（ａ）で作成した固相マトリックスに接触させ； （ｃ）固相マトリックスから未結合の物質をすべて洗い流し； （ｄ）固相に結合した前記化合物の存在を検出し； （ｅ）固相マトリックスから結合した化合物を溶出させ、それにより該化合 物を単離する、 ことを含んでなる該方法。 11．ＧｎＲＨ−Ｒに結合可能なペプチドを同定する方法であって、 （ａ）固相支持体に結合させた、アミノ酸の全ての可能な組合せからなるラ ンダムペプチドライブラリーを、前記ペプチドを結合させるのに十分な期間Ｇｎ ＲＨ−Ｒタンパク質またはその機能性断片に接触させ； （ｂ）未結合ペプチドをすべて洗い流し； （ｃ）ＧｎＲＨ−Ｒに結合した前記ペプチドの存在を検出する、 ことを含んでなる該方法。 12．請求項８、９、10または11に記載の方法によって同定または単離された化合 物を含んでなる、ＧｎＲＨ−Ｒの生物活性を抑制する医薬組成物。 13．請求項８、９、10または11に記載の方法によって同定または単離された化合 物を含んでなる、ＧｎＲＨ−Ｒの生物活性を活性化する医薬組成物。 14．請求項８、９、10または11に記載の方法によって同定または単離された化合 物を含んでなる、動物の腫瘍を治療するための医薬組成物。 15．請求項８、９、10または11に記載の方法によって同定または単離された化合 物を含んでなる、避妊のための医薬組成物。