KR20060059257A - 도파민 수용체를 사용한 근육 질량 또는 기능의 조절을위한 화합물의 동정 방법 - Google Patents

도파민 수용체를 사용한 근육 질량 또는 기능의 조절을위한 화합물의 동정 방법 Download PDF

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러셀 제임스 쉘던
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더 프록터 앤드 갬블 캄파니
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Abstract

본 발명은 생체내에서 개별적으로 또는 조합된 D1 또는 D5 도파민 수용체에 결합하거나 이를 활성화시키거나 생체내에서 골격근의 질량 또는 기능을 조절하거나 잠재적으로 조절하는 화합물을 동정하기 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또한 D1 또는 D5 도파민 수용체 또는 D1 또는 D5 도파민 수용체 신호 전송 경로의 활성화를 연장 또는 증대시키며 D1 또는 D5 도파민 수용체 발현을 증가시키는 화합물을 동정하기 위한 스크리닝 방법이 개시되어 있다. D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제, D1 또는 D5 도파민 수용체에 대한 항체를 함유하는 제약 조성물 및 D1 또는 D5 도파민 수용체를 개입 표적으로 사용하여 골격근의 질량 또는 기능을 증가시키거나 골격근 위축을 치료하는 방법과 근이영양증의 치료 방법이 개시되어 있다.
골격근, 도파민 수용체, 후보 화합물, 아미노산 서열, 제약 조성물

Description

도파민 수용체를 사용한 근육 질량 또는 기능의 조절을 위한 화합물의 동정 방법{METHODS FOR IDENTIFYING COMPOUNDS FOR REGULATING MUSCLE MASS OR FUNCTION USING DOPAMINE RECEPTORS}
본 발명은 골격근의 질량 또는 기능을 조절하거나 도파민 수용체(도파민 수용체)의 활성 또는 발현을 조절하기 위한 후보 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 개입 표적으로서 D1 또는 D5 도파민 수용체를 사용하여 골격근 위축을 치료하는 방법 또는 골격근 비대를 유도하기 위한 방법과, 표적으로서 D1 또는 D5 도파민 수용체를 사용하여 근이영양증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
도파민 수용체
도파민은 중추 및 말초 활성을 포함하는 다수의 생리학적 효과를 갖는다. 뇌에서, 도파민은 운동기 활성, 인식력, 감정, 정적 강화, 음식 섭취 및 내분비 조절을 포함하는 다수의 기능을 제어한다. 말초에서, 도파민은 심혈관 활성(심장 기능 및 혈관 기능 둘다), 카테콜아민 방출, 호르몬 분비, 신장 기능 및 위장관 유동성의 조절제로서 작용한다 (1998년 미샬 (Missale) 등에 의해 검토됨).
도파민은 적어도 5개의 공지된 도파민 수용체(D1-D5)를 통해 이의 작용을 매 개한다. 이들 5개의 수용체는 이의 분자 구조, 약리학적 활성 및 생리학적 기능을 기준으로 2개의 총괄 군, D1/D5 군 (D1형) 및 D2/3/4 군 (D2형)으로서 세분될 수 있다 (문헌참조: Civelli et al., 1993; Gingrich et al., 1993; Jackson et al., 1994; Missale et al., 1998; O'Dowd, 1993). 수용체의 D1/D5 아부류는 주로 Gαs에 결합하여 아데닐릴 사이클라제를 활성화시키고 cAMP를 형성함으로써 신호를 전달한다 (문헌참조: Gingrich et al., 1993; Missale et al., 1998). 2차 메신저로서 cAMP는 단백질 키나제 A의 활성화, 포스포리파제 C 활성화, 세포내 칼슘 및 나트륨 농도의 증가, 세포내 pH의 변화, 미토겐 활성화된 단백질 키나제 유도 등을 포함하는 다양한 효과를 갖는다 (문헌참조: Missale et al., 1998). 수용체 D2/3/4 아부류는 주로 Gαi 와 결합하여 아데닐릴 사이클라제의 활성을 억제하는 신호를 전달한다 (문헌참조: Gingrich et al., Missale et al., 1998). D1/D5 수용체 아부류는 또한 Gαo, Gαi, 및 Gαq와 결합하는 것으로 관찰되었고 이것은 G1/5 아부류에 의해 활성화되는 신호 전송 경로가 매우 복잡할 수 있음을 시사한다 (문헌참조: Kimura et al., 1995a; Sidhu et al., 1991; Wang et al., 1995). 도파민 수용체는 인간을 포함하는 많은 종으로부터 클로닝되었다 (Missale et al., 1998). 도파민 수용체의 발현 분석은 D1 수용체가 선조, 측중결핵, 후각 결절, 변연계, 전두 피질, 시상, 연수(medulla), 편도체, 중간뇌, 비중격, 전두/후두 기저핵 및 시상하부를 포함하여 쥐 뇌에서 광범위하게 발현되지만 D5 수용체는 쥐 해마, 외측유두체핵, 시상의 다발결핵, 뇌 피질, 외측 시상, 흑색질, 중간 시상 및 해마에서 발현되고; 영장류 뇌에서는 D1 및 D5 수용체가 전두엽의 피라미드성 뉴런, 전운동 영역, 대상이랑 및 내후각뇌피질, 해마, 치아이랑, 후각망울, 편모체, 미상핵 및 흑색질(유일하게 D1)에서 발현되고; 말초에서는 수용체의 D1/D5 아부류가 혈관, 부신 및 신장에서 발현됨을 입증하였다 (문헌참조: Jackson et al., 1994; Missale et al., 1998).
D1/D5 수용체 아부류의 작용 활성을 선택적으로 활성화시키는 작용제 및 D1/D5 수용체 아부류의 작용 활성을 선택적으로 차단하는 길항제는 문헌 (참조: Missale et al., 1998; Seeman et al., 1994; Sokoloff et al. 1995)에 보고되었다. 이들 작용제 및 길항제는 상이한 도파민 수용체를 기능적으로 구별할 수 있고 생물학적 활성과 특정 도파민 수용체 부류를 결합시키는 데에 유용하다.
골격근은 성형성(plastic) 조직인데, 이는 일에 대한 생리학적인 요구 사항 또는 대사적 필요성에 있어서의 변화에 손쉽게 적응한다. 비대는 골격근 질량의 증가를 나타내는 반면, 골격근 위축은 골격근 질량의 감소를 나타낸다. 급성 골격근 위축은 수술, 침상 안정 또는 골절로 인한 불용, 척수 상해, 자가면역 질환 또는 감염성 질환으로 인한 탈신경/신경 손상; 관련되지 않은 병에 있어서의 글루코코르티코이드 사용; 감염 또는 기타 원인으로 인한 패혈증; 질병 또는 기아로 인한 영양소 제한 및 우주 여행을 포함하지만 그에 한정되지 않는 다양한 원인인 것으로 추적될 수 있다. 골격근 위축은 정상적인 생물학적 과정을 통하여 발생하지만, 어 떤 의학적 상황에서는 이러한 정상적인 생물학적 과정이 쇠약 수준의 근육 위축으로 이어진다. 예를 들어, 급성 골격근 위축은, 그에 한정되는 것은 아니지만, 정형외과적 처치를 수반하는 것을 포함한, 고정(immobilization)으로부터의 환자의 재활에 있어서 상당한 제한성을 나타낸다. 이러한 경우, 골격근 위축의 반전에 요구되는 재활 기간은 종종 원래의 상해의 회복에 요구되는 기간보다 훨씬 더 길다. 이러한 급성 불용 위축은 근육 기능 및 질량에 있어서의 상당한 연령관련 부족으로 이미 고통받을 수도 있는 중장년층에서 특히 문제가 되는데, 이는 이러한 위축이 영구적인 장애 및 조기 사망으로 이어질 수 있기 때문이다.
골격근 위축은 암악액질, 만성 염증, 에이즈(AIDS) 악액질, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 울혈성 심부전, 유전 질환, 예를 들어 근이영양증(muscular dystrophies), 퇴행성 신경 질환(neurodegenerative disease) 및 사르코페니아(sarcopenia)(연령 관련 근육 손실)와 같은 만성 병으로부터도 생길 수 있다. 이러한 만성 병에 있어서, 골격근 위축은 이동성의 조기 손실로 이어짐으로써 질환-관련 이환률에 부가될 수 있다.
골격근의 위축 또는 비대를 제어하는 분자적 과정에 관해서는 거의 알려져 있지 않다. 골격근 위축의 유발 개시는 다양한 위축 개시 사건에 있어서 서로 다르지만, 단백질 합성 감소 및 단백질 분해 증가와 느린 섬유(고도의 산화 대사/느린 수축성의 단백질 이소형)에서 빠른 섬유(고도의 해당 대사/빠른 수축성의 단백질 이소형)로의 전환을 특징으로 하는 수축성 및 대사성 효소 단백질 동질효소들 모두에서의 변화를 포함한 몇몇의 공통적인 생화학적 변화가 감염된 골격근 섬유에 서 발생한다. 발생하는 골격근에서의 추가의 변화는 혈관계의 손실 및 세포외 매트릭스의 재구성을 포함한다. 신속하고 느린 인력근은 적당한 조건하에서 위축을 입증하고 상대적인 근 손실은 특정 위축 자극 또는 조건에 따라 다양하다. 중요한 것은, 이러한 모든 변화가 대등하게 조절되며 생리학적 및 대사적 필요성에 따른 변화에 따라 온(on) 또는 오프(off)로 전환된다는 것이다.
위축 및 비대가 발생하는 과정은 포유류 종들에 걸쳐 보존되어 있다. 다수의 연구에 의하면 설치류와 인간 둘 모두에 있어서 위축 동안 동일한 기본적 분자, 세포, 및 생리학적 과정이 발생한다는 것이 증명되었다. 이와 같이, 골격근 위축의 설치류 모델은 인간 위축 응답의 이해 및 예측에 성공적으로 이용되었다. 예를 들어 설치류 및 인간 둘 모두에 있어서 다양한 방법으로 유도된 위축은 근육 해부체, 단면적 기능, 섬유 유형 전환, 수축성 단백질 발현, 및 조직적 특성에서의 유사한 변화로 이어진다. 또한, 여러 약제가 설치류 및 인간 둘 모두에 있어서 골격근 위축을 조절하는 것으로 증명되었다. 이들 제제는 동화 작용성 스테로이드, 성장 호르몬, 인슐린형 성장 인자 I 및 β-아드레날린 작용제를 포함한다. 이와 함께, 상기 데이터에 의하면 골격근 위축이 설치류 및 인간 둘 모두에서 공통 메커니즘으로부터 생긴다는 것이 증명된다.
몇몇 약제가 골격근 위축을 조절하는 것으로 밝혀졌으며 인간에 있어서 상기 징후에 사용하는 것이 승인되었다고는 하지만, 상기 약제는 심근 비대, 신생물, 조모증, 여성의 남성화, 이환률 및 사망률의 증가, 간 손상, 저혈당증, 근골격통, 조직 터거(turgor) 증가, 빈맥 및 부종 등의 바람직하지 못한 부작용을 가진다. 현 재로는 급성 또는 만성 골격근 위축에 대한 고도로 유효한 선택적 치료법은 없다. 따라서, 골격근 위축을 조절하는 기타 치료학적 제제를 동정할 필요가 있다.
근이영양증
근이영양증은 골격근 무력증의 선택적인 분포에 의해 임상적으로 구별되는 유전성의 진행성 근육 장애군을 포함한다. 가장 일반적인 근이영양증의 두가지 유형은 듀센(Duchenne)형 및 베커(Becker)형 근이영양증인데, 이들 각각은 Xp21 유전자 좌에 위치하는 디스트로핀 유전자의 돌연변이의 유전에 의해 생긴다. 다른 근이영양증은, 그에 한정되는 것은 아니지만, p94 칼파인(calpain), 아드할린(adhalin), γ-사르코글리칸(sarcoglycan), 및 β-사르코글리칸 유전자 좌를 비롯한 다수의 유전자 좌의 돌연변이로 인해 생기는 지대형 근이영양증; 안면견갑상완형(란도즈-디제린(Landouzy-Dejerine)형) 근이영양증, 근긴장성 근이영양증, 및 에머리-드레이푸스(Emery-Dreifuss)형 근이영양증을 포함한다. 거의 남성에게서만 발생하는 듀센형 근이영양증의 증상은 동요성 보행, 발가락으로 걷기, 척주 전만, 빈번한 넘어짐, 및 직립 및 계단 오르기의 어려움을 포함한다. 증상은 약 3-7세에 시작되며 대부분의 환자는 10-12세까지 휠체어에 갇혀지내게 되고 다수는 호흡기 합병증으로 인하여 약 20세에 사망한다. 현재의 듀센형 근이영양증 치료법은 프레드니손(prednisone)(코르티코스테로이드계 약물)의 투여를 포함하는데, 프레드니손은 치유적인 것은 아니지만 근육 강도 감퇴를 늦추고 장애를 지연시킨다. 프레드니손과 같은 코르티코스테로이드는 상기 질환으로부터 생기는 근육 섬유 손상에 의해 촉진되는 면역 세포 활성화 및 침윤을 차단함으로써 작용하는 것으로 생각된다. 불행하게도, 코르티코스테로이드 치료법도 골격근 위축으로 이어지는데 이는 상기 환자에 있어서의 면역 응답 차단의 잠재적인 이득의 일부를 무효로 하게 된다. 따라서, 근섬유 손상을 지연시키고 근이영양증을 앓는 환자가 불구가 되는 시점을 지연시키지만 현 치료요법 보다 골격근 위축을 덜 일으키는 치료제를 동정할 필요가 있다.
골격근 위축 또는 근이영양증의 치료에 사용하기 위한 화합물의 동정과 관련된 문제점 중 하나는 당해 화합물을 동정하기 위한 우수한 스크리닝 방법이 없다는 것이다. 본 발명자는 현재 D1 및 D5 도파민 수용체가 골격근의 질량 또는 기능의 조절에 관여하고 D1 및 D5 도파민 수용체의 작용제가 골격근 위축을 차단할 수 있고/있거나 골격근의 비대를 유도할 수 있음을 밝혔다. 본 발명은 근육 위축의 치료에 유용한 후보 화합물을 동정하는 데에 사용될 수 있는 D1 및 D5 도파민 수용체를 사용하는 스크리닝 방법을 제공함에 의해 근육 위축 치료용 화합물을 동정하는 데에 있어서의 문제점을 해결하였다. 본 발명은 또한 D1 또는 D5 도파민 수용체 둘 다를 활성화시키는 후보 화합물을 동정하는 스크리닝 방법을 제공함에 의해 근이영양증 치료용 화합물을 모색하는 데에 있어서의 문제점을 해결하였다.
인용된 모든 문헌은 본 명세서에 관련 부분에서 참고로서 포함되며, 어떠한 문 헌의 인용도 본 발명과 관련된 종래 기술로서의 인정으로서 해석되어서는 안 된다.
발명의 개요
본 발명은 골격근 위축의 치료에 잠재적으로 유용한 후보 화합물을 동정하거나 골격근 비대를 유도하기 위한 D1 또는 D5 도파민 수용체의 용도에 관한 것이다. D1 및 D5 수용체는 개별적으로 또는 서로 조합되어 후보 화합물을 동정하는 데에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명은 시험 화합물을 D1 또는 D5 도파민 수용체를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계 또는 시험 화합물을 단리된 D1 또는 D5 도파민 수용체와 접촉시키는 단계, 및 시험 화합물이 D1 또는 D5 도파민 수용체에 결합하거나 이를 활성화시키는 지를 측정하는 단계를 포함하는, 골격근의 질량 또는 기능을 조절하는 화합물을 동정하기 위한 시험관내 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 실시 형태는 후보 화합물을 비-인간 동물에 투여하는 단계 및 후보 화합물이 처리된 동물에서 골격근 질량 또는 근육 기능을 조절하는 지를 측정하는 단계를 포함하는, D1 또는 D5 도파민 수용체에 결합하거나 이를 활성화시키는 것으로 이전에 결정된 하나 이상의 후보 화합물 군으로부터 후보 치료 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 실시 형태는 임의의 순서로, (i) 시험 화합물을 기능성 D1 또는 D5 도파민 수용체를 발현하는 세포와 접촉시키고 시험 화합물로부터 비롯된 D1 또는 D5 도파민 수용체의 활성화 수준을 측정하는 단계; (ii) 시험 화합물을 기능성 D1 또는 D5 도파민 수용체를 발현하는 세포와 접촉시키고 시험 화합물로부터 비 롯된 D1 또는 D5 도파민 수용체의 활성화 수준을 측정하는 단계, 이어서 (iii) D1 또는 D5 도파민 수용체 활성화 수준과 활성화 수준을 비교하는 단계, 및 (iv) D1 또는 D5 도파민 수용체에 대하여 유사한 활성을 나타내고/나타내거나 D1 또는 D5 도파민 수용체에 대하여 선택성을 나타내는 시험 화합물을 골격근의 질량 또는 기능을 조절하는 후보 화합물로서 동정하는 단계를 포함하는, 골격근의 질량 또는 기능을 조절하는 후보 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, D1 또는 D5 도파민 수용체 또는 D1 또는 D5 도파민 수용체 신호 전송 경로의 작용제-유도성 활성화를 연장 또는 증대시키는 후보 화합물을 동정하기 위한 방법을 제공한다. 이들 방법은 임의의 순서로 또는 동시에, (i) 시험 화합물을 기능성 D1 또는 D5 도파민 수용체를 발현 하는세포와 접촉시키는 단계; (ii) 이 세포를 대조 세포에서 D1 또는 D5 도파민 수용체의 탈감작을 야기하기에 충분한 농도로 그리고 그렇게 하기에 충분한 시간 동안 D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제로 처리하는 단계, 이어서 (iii) D1 또는 D5 도파민 수용체의 활성화 수준을 측정하고 도파민 수용체 또는 도파민 수용체 신호 전송 경로의 활성화를 연장 또는 증대시키는 시험 화합물을 골격근의 질량 또는 기능을 조절하기 위한 후보 화합물로서 동정하는 단계를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 본 발명은 후보 화합물을 D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제와 함께 비-인간 동물에게 투여하는 단계 및 후보 화 합물이 처리된 동물에서 골격근의 질량 또는 기능을 조절하는 지를 측정하는 단계를 포함하는 D1 또는 D5 도파민 수용체의 활성화 또는 D1 또는 D5 도파민 수용체 신호 전송 경로의 활성화를 연장 또는 증대시키는 것으로 결정된 하나 이상의 후보 화합물 군으로부터 후보 치료 화합물을 동정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 추가로, 시험 화합물을, 도파민 수용체 유전자 조절 요소와 작동가능하게 결합된 리포터 유전자를 함유하는 세포 또는 세포 용해물과 접촉시키고 리포터 유전자의 발현을 검출하는 단계를 포함하는 D1 또는 D5 도파민 수용체 발현을 증가시키는 후보 화합물을 동정하기 위한 방법을 제공한다. 리포터 유전자의 발현을 증가시키는 시험 화합물은 D1 또는 D5 도파민 수용체 발현을 증가시키는 후보 화합물로서 동정된다. 특정 실시 형태에서, 본 발명은 D1 또는 D5 도파민 수용체 발현을 증가시키는 후보 화합물이, 비-인간 동물에의 투여에 의해 생체내에서 골격근의 질량 또는 기능을 조절하는 데에 사용될 수 있는 지를 측정하고 후보 화합물이 처리된 동물에서 골격근의 질량 또는 기능을 조절하는 지를 측정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제, 기능성 D1 또는 D5 도파민 수용체를 코딩하는 발현 벡터, 구성적 활성 D1 또는 D5 도파민 수용체를 코딩하는 발현 벡터 또는 D1 또는 D5 도파민 수용체의 발현을 증가시켜 골격근 위축을 치료하는 화합물의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 안전하고 유효한 양의 D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제, 기능성 D1 또는 D5 도파민 수용체를 코딩하는 발현 벡터, 구성적 활성 D1 또는 D5 도파민 수용체를 코딩하는 발현 벡터, 도파민 수용체 또는 도파민 수용체 유사체를 코딩하는 발현 벡터 또는 D1 또는 D5 도파민 수용체의 발현을 증가시키는 화합물을 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 당해 치료를 필요로 하는 대상에서 골격근 위축을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시 형태에서, 본 발명은 안전하고 유효한 양의 D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제를 D1 또는 D5 도파민 수용체 또는 D1 또는 D5 도파민 수용체 신호 전송 경로의 작용제-유도성 활성화를 연장 또는 증대시키는 안전하고 유효한 양의 화합물과 함께 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 골격근 위축 치료를 필요로 하는 대상에서 골격근 위축을 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 대상에서 골격근의 질량 또는 기능을 증가시키기 위한 D1 또는 D5 도파민 수용체의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 근육 질량 또는 기능의 증가가 요구되는 대상을 확인하고 이 대상에게 안전하고 유효한 양의 도파민 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 골격근의 질량 또는 기능을 증가시킬 필요가 있는 대상에서 골격근의 질량 또는 기능을 증가시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, 안전하고 유효한 양의 D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제 및 제약적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시 형태에서, 당해 제약 조성물은 D1 및 D5 도파민 수용체에 특이적인 키메라 항체 또는 인간 항체를 포함한다.
본 발명은 또한 D1 및 D5 도파민 수용체에 대한 항체 및 특히 D1 및 D5 도파민 수용체의 작용제인 키메라 또는 인간 항체를 제공한다.
서열 목록 설명
상응하는 젠뱅크 또는 더웬트 등록 번호 및 이것이 클로닝된 동물 종과 함께, 서열 목록에 포함된 도파민 수용체 뉴클레오티드 및 단백질 서열 또는 도파민 수용체 유사체 단백질 서열 각각은 표 I에 나타낸다. 또한 서열목록에 나타낸 서열과 동일하거나 거의 동일하거나 아미노산 서열을 코딩하는 관련 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
Figure 112006003563636-PCT00001
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도 1A 및 도 1B는 생쥐 좌골 신경 탈신경 위축 모델에서 전경골근(도 1A) 및 중간 비복근(도 1B)에 대한 D1 및 D5 도파민 수용체 작용제인, SKF 81297 (피하 투여됨, 하루 2회)의 항 위축효과를 입증한다. 도 1A 및 도 1B는 또한 탈신경화되지 않은(정상적인) 전경골근(도 1A) 및 중간 비복근(도 1B)에 대한 SKF 81297의 비대 유도 효과를 입증한다.
도 2는 전경골근의 깁스 유도 위축에 대한 D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제인 SKF81297(피하 투여됨, 하루 2회)의 항위축 효과 및 깁스하지 않은(정상적인) 전경골근에 대한 SKF 81297의 비대 유도 효과를 입증한다.
도 3은 중간 비복근의 깁스 유도된 위축에 대한 D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제인 페놀도팜(피하 투여됨, 하루 2회)의 항위축 효과를 입증한다.
I. 용어 및 정의:
이하는 본 명세서에서 사용되는 용어 정의의 목록이다.
"작용제"는 수용체를 활성화시키는 항체를 포함하지만 그에 한정되지 않는 임의의 화합물을 의미한다. 예를 들어, 도파민 수용체 작용제는 도파민 및 도파민 유사체, 예를 들어, SKF81297 및 페놀도팜을 포함하지만 그에 한정되지 않는다.
"대립형질 변이체"는 소정의 유전자 또는 유전자 생성물의 변이 형태를 의미한다. 당업자는 다수의 유전자가 하나의 집단으로 2개 이상의 대립형질 형태로 존재하고 몇몇 유전자가 다수의 대립형질을 갖고 있음을 인지하고 있다.
"결합 친화성"은 리간드가 수용체와 상호작용하는 성향을 의미하고 특정 도파민 수용체 리간드-도파민 수용체 상호작용에 대한 해리 상수와는 반대 개념이다. 해리 상수는 표준 포화법, 경쟁법 또는 동역학적 결합 기술을 통하여 직접적으로, 또는 기능 분석 및 종점(endpoint)을 수반하는 약리학적 기술을 통하여 간접적으로 측정될 수 있다.
"키메라 항체"는 2개 이상의 상이한 항체 분자, 즉 상이한 동물 종으로부터 유래되는 구조적 요소들을 함유하는 항체를 의미한다. 키메라 항체는, 상보성 결정 영역 이식으로서 공지된 기술에 의해 생성된 키메라 항체를 포함하지만 그에 한정되지 않는 "인간화된 항체"로서 공지된 항체를 포함하지만 그에 한정되지 않는다.
"도파민 수용체 작용제"는 D1 또는 D5 도파민 수용체 또는 이들 둘다를 활성화시키는 능력을 갖는 화합물 또는 분자를 의미한다. 도파민 수용체의 활성화는 이후에 기재되는 바와 같이, SKF 81297 및 페놀도팜 D1/D5 선택적 수용체 작용제와 같은 선택적 작용제를 사용하여 측정될 수 있다.
"도파민 수용체"는 임의의 생물학적 종으로부터 유래되는 D1 또는 D5 도파민 수용체를 의미한다.
용어 "도파민 수용체"는 또한 리간드 결합 또는 신호 전송에 필요하지 않은 수용체 분자의 영역이 결실되거나 변형된, 절단되고/되거나 돌연변이된 단백질을 포함한다. 예를 들어, 당업자는 1차 아미노산 서열에서 하나 이상의 보존성 변화를 갖는 도파민 수용체가 본 발명에 유용할 것임을 인지할 것이다. 특정 아미노산을 유사한 구조 또는 성질을 갖는 상이한 아미노산으로 치환하는 것(보존성 치환)이 사일런트(silent) 변화, 즉 기능을 상당히 변화시키지 않는 변화를 유도할 수 있다는 것은 당업계에 공지되어 있다. 보존성 치환은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, GPCR은 지질 방향으로 배향되어 있는 막관통(transmembrane) 알파 헬릭스에서 아미노산 잔기가 또 다른 소수성 아미노산으로 치환되는 것에 내성을 가질 수 있고 기능이 유지된다는 것은 공지되어 있다. 보존성 아미노산 치환과 같은 절단 및/또는 돌연변이에 의한 천연에 존재하는 서열과는 상이한 D1 및 D5 도파민 수용체는 또한 도파민 수용체 정의내에 포함된다.
당업자는 또한 상기 열거된 것들 이외의 종, 특히 포유동물 종으로부터 유래되는 도파민 수용체가 본 발명에 유용할 것임을 인지할 것이다. 당업자는, 공지된 도파민 수용체 종의 서열로부터의 프로브를 사용함으로써, 공지된 서열에 상동성인 cDNA 또는 게놈 서열이 공지된 클로닝 방법에 의해 동일하거나 또 다른 종으로부터 수득될 수 있음을 인지할 것이다. 또한 이러한 것은 D1 및 D5 도파민 수용체의 정의에 포함되고, 이러한 D1 및 D5 도파민 수용체가 또한 D1 및 D5 도파민 수용체의 정의에 포함된다.
추가로, 당업자는 도파민 수용체의 기능성 대립형질 변이체 또는 기능성 스플라이스 변이체가 특정 종에 존재하고 이들 변이체가 본 발명에 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 이러한 변이체는 또한 D1 및 D5 도파민 수용체의 정의내에 포함되고, 이러한 D1 및 D5 도파민 수용체 변이체가 또한 D1 및 D5 도파민 수용체의 정의내에 포함된다.
D1 및 D5 도파민 수용체 폴리펩티드 또는 D1 및 D5 도파민 수용체 폴리펩티드 단편의 비-도파민 수용체 폴리펩티드로의 융합은 도파민 수용체 융합 단백질로서 언급된다. 공지된 방법을 사용하여, 당업자는 본래의 것 및 D1 및 D5 도파민 수용체와는 상이하지만 본 발명에 여전히 유용한 D1 및 D5 도파민 수용체의 융합 단백질을 제조할 수 있을 것이다. 예를 들어, 비-도파민 수용체 폴리펩티드는 번역과 동시에 또는 번역 후 단백질을 이의 합성 부위로부터 또 다른 부위로 전달시키는 신호(또는 리더(leader)) 폴리펩티드 서열(예를 들어, 효모 α-인자 리더)일 수도 있다. 또는 비-도파민 수용체 폴리펩티드(예를 들어, 폴리-His 또는 플래그 펩티드)가 도파민 수용체의 정제 또는 동정을 촉진하기 위해 첨가될 수 있다. D1 및 D5 도파민 수용체 융합 단백질은 또한 D1 및 D5 도파민 수용체의 정의내에 포함된다.
"D1 및 D5 도파민 수용체 신호 전송 경로"는 임의의 신호 전송 경로(예를 들어, cAMP, MAP 키나제) 또는 내인성 또는 외인성 리간드가 D1 및 D5 도파민 수용체에 결합함에 의해 조절되는 조합된 신호 전송 경로를 의미한다.
"페놀도팜"은 6-클로로-2,3,4, 5-테트라하이드로 -1-(4-하이드록시페닐)-[1H]-3-벤즈아제핀-7,8-디올이고 또한 코를로팜(등록상표)로서 공지되어 있다.
"기능성 도파민 수용체"는 생체내 또는 시험관내에서 도파민 수용체 작용제와 결합하여 리간드 결합의 결과로서 활성화되는 도파민 수용체를 언급한다.
"융합 유전자"는 하나의 하이브리드 단백질을 코딩하기 위해 작동가능하게 결합된 2개 이상의 DNA 암호화 서열을 의미한다. "융합 단백질"은 융합 유전자의 단백질 생성물이다.
"억제한다"는 특정 과정 또는 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단함을 의미한다. 예를 들어, 화합물이 근육 위축을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 경우 당해 화합물은 골격근 위축을 억제한다.
"작동가능하게 결합된"이란 2개의 DNA 서열간의 연결 특성이 (1) 프레임 전환 돌연변이를 유발하지 않거나 (2) 코딩 서열의 전사를 지시하는 프로모터 영역의 능력을 방해하지 않거나 (3) 상응하는 RNA 전사체가 단백질로 번역되는 능력을 방해하지 않는 2개의 DNA 서열을 언급한다. 예를 들어, 코딩 서열 및 조절 서열은, 코딩 서열의 전사가 조절 서열의 영향 또는 제어 하에 있는 것과 같은 방식으로 이들이 공유 결합적으로 결합되어 있을 경우 작동가능하게 결합되어 있는 것이다. 따라서, 프로모터 영역은 이것이 당해 DNA 서열의 전사를 수행하여 수득한 전사체가 목적하는 단백질 또는 폴리펩티드로 번역될 수 있도록 하는 경우 코딩 서열과 작동가능하게 결합되어 있는 것이다.
"% 상동성"은 2개의 서열이 하기와 같이 계산된, 공유하는 뉴클레오티드 또는 아미노산의 %를 의미한다. 특정 서열(미지의 서열)에 대한 % 상동성을 계산하기 위해, 미지의 서열의 관련 부분은 최적합 비교 컴퓨터 프로그램, 즉 제네틱스 컴퓨터 그룹, 인크.(Genetics Computer Group, Inc)로부터 구입한 위스콘신 패키지 버전 10.1을 사용하여 표준 서열과 비교한다. 당해 프로그램은 문헌[Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics, Issue 2: 482-489 (1981)]의 알고리즘을 사용한다. % 상동성은 최적합 프로그램을 위해 하기의 디폴트 계수를 사용하여 계산하고 스코어 매트릭스는 blosum62.cmp이고, 갭 발생 페날티는 8이고 갭 연장 페날티는 2이다. 하나의 서열을 표준 서열과 비교하는 경우, 미지 서열의 관련 부분은 도파민 수용체 서열로부터 유래하는 것이다. 예를 들어, 미지의 물질이 도파민 수용체/정제 태그 융합 단백질인 경우, 단지 서열의 도파민 수용체 폴리펩티드 부분만이 % 상동성 스코어를 계산하기 위해 정렬된다.
"폴리펩티드"는 길이 또는 번역후 변형(예를 들어, 인산화 또는 당화)과 상관없이 임의의 쇄의 아미노산을 의미한다.
"프로모터"는 유전자 또는 코딩 영역으로부터 전사의 개시 및 전사 속도를 제어하는 DNA 서열을 의미한다.
"예방적 치료"는 현재 골격근 위축을 나타내지 않는 환자를 예방적으로 치료하여 골격근 위축의 발생을 부분적으로 또는 완전히 차단함을 의미한다. 당업자는 특정 개인이 본원의 배경 분야에서 논의된 바와 같이 골격근 위축의 위험에 처해있는지를 인지할 것이다. 추가로, 당업자는 골격근 위축을 유도하는 생화학적 변화가 적당히 조절되는 경우, 위축의 발병이 위험에 처한 개인에서 예방되거나 감소된다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어, 코르티코스테로이드를 사용한 치료를 개시하는 근육 위축 환자는 골격근 위축이 발병될 위험에 처해있고 이는 당해 환자의 예방적 치료가 적절한 것임을 시사한다.
모든 문법적 형태에서 "조절하다"는 골격근의 질량 또는 기능을 증가, 감소 또는 유지, 예를 들어, 조절하는 것은 골격근의 질량 또는 기능의 수준을 증가시키거나 감소시키거나 유지시키는 것을 의미한다.
"골격근의 질량 또는 기능의 조절"은 골격근 질량, 골격근 기능 또는 둘다의 조절을 포함한다.
"조절 요소"는 작동가능하게 결합된 DNA 서열로부터 전사 수준을 제어할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 조절 요소의 정의내에 포함되는 것은 프로모터 및 인핸서(enhancer)이다. 예를 들어, 도파민 수용체 유전자 조절 요소는 도파민 수용체 유전자로부터 전사 수준을 제어할 수 있는 DNA 서열이다.
"리포터 유전자"는 바람직하게는 정량적으로 이의 생성물이 검출될 수 있는 코딩 서열을 의미하는데, 여기서 리포터 유전자는 측정되어야만 하는 신호에 응답하는 이종성 프로모터 또는 인핸서 요소와 작동가능하게 결합되어 있다. 해당 부분에서 프로모터 또는 인핸서 요소는 본원에서 "반응성 요소"로서 언급된다.
"SKF 81297"은 매사추세츠주 내틱 소재의 RBI/Sigma로부터 시판되는, 6-클로로-7,8-디하이드록실-1-페닐-2,3,4,5-테트라하이드로-1H-3-벤즈아제핀이다.
"선택적 작용제"는 작용제가 기타 수용체와 비교하여 특정 수용체를 선호하여 상당히 큰 활성을 갖지만 기타 수용체에 대해서도 완전히 불활성이 아닌 것을 의미한다. 예를 들어, D1 및 D5 도파민 수용체 선택적 작용제는 SKF 81297 및 페놀도팜에 한정되지 않는다.
"SKF"는 스미쓰클라인 프렌치(SmithKline French)를 의미한다.
"골격근 비대"는 골격근 질량 또는 골격근 기능 또는 둘다의 증가를 의미한다.
"골격근 위축"은 "근육 파괴"와 동일한 의미이고 골격근의 질량 또는 기능 또는 둘다의 감소를 의미한다.
"스플라이스 변이체"는 대안적인 엑손(exon) 사용에 따른 mRNA 또는 단백질을 의미한다. 당업자는 세포 유형에 따라 또는 심지어 단일 세포 유형내에서도 mRNA가 스플라이스 변이체로서 상이한 형태로 발현될 수 있고 따라서 번역된 단백질이 발현된 mRNA에 따라 상이함을 인식한다.
물질의 "치료적 유효량"은 처리된 환자에서 의학적으로 목적하는 결과를 발생시킬 수 있는 양이고 예를 들어, 허용가능한 이익 위험 비율로 인간 또는 비-인간 포유동물에서 골격근 위축을 감소시키거나 골격근 질량을 증가시키거나 골격근 기능을 증가시킨다.
"치료적 치료"는 근육 질량 또는 근육 기능의 증가가 필요한 대상의 치료를 의미한다. 예를 들어, 발생된 골격근 위축을 부분적으로 또는 완전히 역전시키기 위해 또는 추가의 골격근 위축의 발생을 부분적으로 또는 완전히 차단하기 위해 현재 골격근 위축의 징후를 나타내는 대상의 치료가 당해 대상의 치료적 치료일 것이다. 용어 "치료적 치료"는 또한 예를 들어, 골격근 비대를 유도하기 위해 골격근 위축의 징후를 나타내지 않는 대상의 치료, 예를 들어, 근육 질량을 증가시키기 위한 가축 동물의 치료를 포함한다.
용어 "치료"는 예방학적 또는 치료학적 처리를 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 단백질 화학, 약리학 또는 분자 생물학 분야의 숙련자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 명세서에 기술된 방법, 재료 및 실시예는 한정하려는 것이 아니다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 다른 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있다.
II. 골격근 질량의 조절에서 도파민 수용체의 역할
당업자는 하기의 선행 기술 분야 및 교시에 주어진 정보를 본 발명에 사용할 수 있음을 인지할 것이다. 본원에 기재된 당해 결과는 D1 및 D5 도파민 수용체 둘다를 활성화시키지만 D2/3/4 도파민 수용체를 활성화시키지 않는 도파민 수용체 작용제(선택적 도파민 수용체 작용제)의 투여가 골격근 위축을 차단하고/하거나 억제하여 골격근 위축 모델에서 탈신경 및 불용 치료 효과를 유도한다는 것을 입증한다. 추가로, 당해 결과는 선택적 도파민 수용체 작용제의 투여가 비대 유도 효과를 나타냄을 입증한다. 이들 모두의 데이터는 골격근 위축의 과정에서 D1 및 D5 도파민 수용체의 조절 역할을 입증한다. 생체내 도파민 수용체의 특정 역할은 이후에 기재되는 다양한 골격근 위축의 모델에서 D1 및 D5 도파민 수용체에 대한 선택적 작용제인 약리학적 제제 SKF81297(매사추세츠주 내틱 소재의 RBI/Sigma) 및 페놀도팜 (코를로팜(등록상표))를 사용하여 조사되었다. 이들 제제의 특성은 잘 분석되었고 과학 문헌에 보고되어 있다. 도 2는 D1 및 D5 도파민 수용체 전경골근의 깁스 유도 위축에 대한 D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제인 SKF81297(피하 투여됨, 하루 2회)의 항위축 효과 및 깁스하지 않은(정상적인) 전경골근에 대한 SKF 81297의 비대 유도 효과를 입증한다. 도 3은 중간 비복근의 깁스 유도된 위축에 대한 D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제인 페놀도팜(피하 투여됨, 하루 2회)의 항위축 효과를 입증한다.
구체적으로, 도 1은 생쥐 좌골 신경 탈신경 위축 모델에서 SKF 81297이 전경골근(도 1A) 중간 비복근(도 1B)의 탈신경 유도된 위축을 억제함을 보여준다. 추가로, 도 1은 SKF 81297이 정상적인(탈신경화되지 않음) 전경골근(도 1A) 및 중간 비복근(도 1B)에서 비대를 유도함을 입증한다. 범례: A - 생리학적 식염수(대조); B - SKF 81297 (0.3 ㎎/㎏) + 테오필린; C - SKF 81297 (1.0 ㎎/㎏) + 테오필린; D - SKF 81297 (3.0 ㎎/㎏) + 테오필린. * 식염수와 비교하여 p ≤ 0.05. 우측 좌골 신경의 탈신경화 후 수컷 생쥐의 중간 견갑골 영역의 피하내로 매일 2회로 9일동안 상기 지적된 바와 같은 용량으로 SKF 81297 또는 비히클 대조(생리학적 식염수)를 주사하였다. SKF 81297은 하루에 2회 복강내 투여로 포스포디에스테라제 억제제인 테오필린 (30 ㎎/㎏)과 동시 투여하였다. 9일째에, 전경골근 및 중간 비복근을 제거하고 칭량하여 위축 정도를 측정하였다.
도 2는 SKF 81297이 전경골근의 깁스 유도된 위축을 억제함을 입증한다. 추가로, 전략적으로 상당한 깁스되지 않은 다리의 전경골근을 또한 SKF 81297 처리로 관찰하였다. 범례: A - 생리학적 식염수 (대조); B - SKF 81297 (0.3 ㎎/㎏) + 테오필린; C - SKF 81297 (1.0 ㎎/㎏) + 테오필린; D - SKF 81297 (3.0 ㎎/㎏) + 테오필린; * 식염수와 비교하여 p ≤ 0.05. 우측 뒷다리의 깁스 후, 수컷 생쥐의 중간 견갑골 영역의 피하내로 하루 2회 10일동안 지시된 하루 전달되는 용량으로 SKF 81297 또는 비히클 대조(생리학적 식염수)를 주사하였다. SKF 81297을 포스포디에스테라제 억제제 테오필린(30 ㎎/㎏)의 하루 2회 복강내 투여로 동시 투여하였다. 10일째에 전경골근을 제거하고 칭량하여 위축의 정도를 측정하였다.
도 3은 페놀도팜이 중간 비복근의 깁스 유도된 위축을 억제함을 입증한다. 범례: A - 생리학적 식염수 (대조); B - 페놀도팜 (0.3 ㎎/㎏); C - 페놀도팜 (1.0 ㎎/㎏); D - 페놀도팜 (3.0 ㎎/㎏); * 식염수와 비교하여 p ≤ 0.05. 우측 뒷다리의 깁스 후, 수컷 생쥐의 중간 견갑골 영역의 피하내로 하루 2회 10일동안 지시된 하루 전달되는 용량에서 페놀도팜 또는 비히클 대조(생리학적 식염수)를 주사하였다. 10일째에 전경골근을 제거하고 칭량하여 위축의 정도를 측정하였다.
III. 도파민 수용체들, 도파민 수용체 또는 도파민 수용체 유사체 또는 도파민 수용체 발현 세포주의 제조
D1 및 D5 도파민 수용체는 항체의 제조, 본 발명의 스크리닝 분석에서 시약으로서의 용도 및 골격근 위축의 치료를 위한 제약적 시약으로서의 용도를 포함하지만 그에 한정되지 않는 다양한 용도를 위해 제조될 수 있다. 본 발명의 특정 실시 형태를 위해, 정제된 폴리펩티드가 가장 유용할 것이지만 기타 실시 형태를 위해서는 폴리펩티드를 발현하는 세포주가 가장 유용하다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 도파민 수용체의 구조적 및 기능적 특성을 보유하는 것이 중요한 상황에서 예를 들어, 도파민 수용체를 활성화시키는 후보 화합물을 동정하기 위한 스크리닝 방법에서 기능성 도파민 수용체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
도파민 수용체의 공급원이 폴리펩티드 발현 세포주인 경우, 당해 세포는 예를 들어, 내생적으로 도파민 수용체를 발현할 수 있고 자극되어 내인성 도파민 수용체 발현이 증가되거나 유전적으로 조작되어 도파민 수용체를 발현할 수 있다. 세포주가 목적하는 폴리펩티드를 발현하는지의 여부를 측정하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있고 예를 들어, 적합한 항체를 사용한 폴리펩티드의 검출, DNA 프로브를 사용한 mRNA가 코딩하는 단백질의 검출 방법(노던 블롯 또는 PCR 기술) 또는 목적하는 폴리펩티드에 대하여 선택성을 갖는 제제(예를 들어, 방사선 표지된 선택적 작용제)의 결합을 측정하는 방법이 있다.
D1 및 D5 도파민 수용체 또는 이들 폴리펩티드 발현 세포주의 제조에서 재조합 DNA 기술의 사용이 특히 고려되고 있다. 이러한 재조합 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 재조합 D1 및 D5 도파민 수용체를 발현하기 위해, 하나 이상의 조절 요소들의 제어하에 목적하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 제조한다. 몇몇 종으로부터 D1 및 D5 도파민 수용체를 코딩하는 게놈 또는 cDNA 서열은 보고되었고 본원의 서열 목록에서뿐만 아니라 진뱅크(GenBank) 데이터베이스(<http://www.ncbi.nlm.nih.gov/>에서 입수가능함) 또는 더웬트(Derwent) 데이터베이스(<http://www.derwent.co.uk/geneseq/index.html>에서 입수가능함)로부터 쉽게 입수할 수 있다. D1 및 D5 도파민 수용체 서열의 등록 번호 및 상응하는 서열 번호는 표 I에 나타낸다. 공중에게 유용한 서열 정보를 사용한 D1 및 D5 도파민 수용체를 코딩하는 핵산 분자를 분리하는 하나의 수단은 당업계에 널리 공지된 방법, 예를 들어, 적당한 라이브러리로부터 서열의 PCR 증폭에 의해 천연 또는 인공적으로 합성된 DNA 프로브로 게놈 DNA 또는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것이다. 또 다른 방법은 목적하는 수용체에 대해 특이적인 올리고뉴클레오티드를 사용하여 PCR로 특정 조직(예를 들어, 골격근)으로부터 단리된 mRNA로부터 직접 cDNA를 증폭시키는 것이다. 당해 단리된 mRNA는 시판되고 있다. 당업자는 또한 공지된 도파민 수용체 서열의 일부에 해당하는 핵산 프로브를 사용함에 의해, 기타 종으로부터 유래되는 상동성 cDNA 또는 게놈 서열을 공지된 방법을 사용하여 수득할 수 있음을 인지할 것이다. 특히, 인간, 생쥐, 쥐, 돼지, 원숭이, 침팬지, 명주원숭이, 개, 소, 양, 고양이, 닭 및 칠면조를 포함하지만 그에 한정되지 않는 종으로부터 유래되는 도파민 수용체가 본 발명에 유용하다. 당업계에 널리 공지된 방법에 의해, 목적하는 도파민 수용체를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 적합한 발현 벡터에 라이게이션시킨다. 따라서 제조된 발현 벡터를 숙주 세포에서 발현시키고 수용체 발현 숙주 세포를 스크리닝 분석에 직접 사용하거나 수용체를 수용체 발현 숙주 세포로부터 단리하고 분리된 수용체를 스크리닝 분석에 사용한다.
본 발명의 용도에 사용될 수 있는 숙주-발현 벡터 시스템은, 그에 한정되는 것은 아니지만, 도파민 수용체 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균(예를 들어, 이. 콜라이(E. coli), 비. 서브틸리스(B. subtilis)) 또는 도파민 수용체 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모(예를 들어, 사카로마이세스(Saccharomyces), 피치아(Pichia))와 같은 미생물; 도파민 수용체 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 벡터(예를들어, 바쿨로바이러스)로 형질감염된 곤충 세포계; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, 담배 모자이크 바이러스)로 감염되거나 도파민 수용체 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포계 또는 포유동물 세포 게놈으로부터 유래되는 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스(예를들어, 레트로바이러스 LTR) 로부터 유래되는 프로모터 및 또한 도파민 수용체 뉴클레오티드 서열을 함유하는 재조합 발현 작제물을 갖는 포유동물 세포계(예를 들어, COS, CHO, HEK293, NIH3T3)를 포함한다.
당해 숙주 세포를 사용하여 목적하는 폴리펩티드를 생산한다. 도파민 수용체는 막 결합 분자이기 때문에 이것은 숙주 세포 막으로부터 정제되거나 도파민 수용체는 세포 막에 결합된 상태로 사용되고 즉, 전세포 또는 세포의 막 분획이 사용된다. 당해 발현 시스템으로부터 도파민 수용체의 정제 또는 풍부화는 당업자에게 널리 공지된 방법에 의해 적당한 세제 및 지질 마이셀을 사용하여 성취된다.
세균 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 발현되는 유전자 생성물을 위해 의도된 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 대량의 당해 단백질이 도파민 수용체에 대한 항체의 제조를 위해 생산하는 경우, 고수준의 단백질 생성물의 발현을 지시하는 벡터가 바람직할 수 있다. 당업자라면 이러한 벡터 제작물을 생성하고 융합 단백질 선택성 컬럼 및 항체 컬럼과 같은 선택적 정제 기술, 및 비-선택적 정제 기술을 비롯한 다양한 방법으로 단백질을 정제할 수 있다.
곤충 단백질 발현 시스템에 있어서, 바큘로바이러스 에이. 칼리포니카(A. californica) 핵 다각체 바이러스(nuclear polyhedrosis virus)(AcNPV)를 벡터로 사용하여 에스. 프루기페르다(S. frugiperda) 세포에서 외래 유전자를 발현시킨다. 이 경우에, 도파민 수용체 뉴클레오티드 서열은 바이러스의 비필수 영역으로 클로닝되고 AcNPV 프로모터의 제어하에 있게된다. 이어서 재조합 바이러스를 사용하여 삽입된 유전자가 발현되는 세포를 감염시키고 당업자에게 공지된 다수의 기술 중 하나로 단백질을 정제한다.
포유류 숙주 세포에 있어서, 다수의 바이러스-기반 발현 시스템이 이용될 수 있다. 이러한 발현 시스템의 이용에는 삽입된 뉴클레오티드 서열의 효율적인 번역을 위하여 벡터에 특정의 개시 신호를 생성할 것이 종종 요구된다. 이것은 특히 내인성 개시 신호를 포함하지 않는 도파민 수용체 유전자의 일부가 사용되는 경우에 있어서 중요하다. 이러한 개시 신호를 삽입된 뉴클레오티드 서열의 코딩 영역과 프레임이 맞게(in frame) 배치하는 것과, 전사 및 번역 증강 요소의 부가 및 재조합 단백질의 정제는 당업자에게 공지된 다수의 방법 중 하나로 성취된다. 포유류 숙주 세포에서 또한 중요한 것은 필요한 재조합 단백질의 번역 후 변형이 가능한 적절한 세포형의 선택이다. 당해 변형, 예를 들어, 절단, 인산화, 당화등을 위해서는 그러한 변형 효소를 함유하는 적당한 숙주 세포를 선별해야만 한다. 이러한 숙주 세포는, 그에 한정되는 것은 아니지만, CHO, HEK293, NIH3T3, COS 등을 포함하며 당업자에게 공지되어 있다.
재조합 단백질의 장기간의 높은 발현을 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 안정하게 도파민 수용체를 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 당업자는 전기천공, 인산칼슘 트랜스펙션법 또는 리포좀 매개 트랜스펙션법과 같은 공지된 방법에 따라 도파민 수용체를 안정하게 발현하는 세포주를 생성시킬 수 있다. 이는 일반적으로 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터 서열, 인핸서 서열, 전사 종결 서열, 폴리아데닐화 부위, 번역 개시 부위 등), 선발 마커(selectable marker), 및 목적 유전자를 포함하는 발현 벡터를 사용하여 세포를 트랜스펙션시킴으로써 성취된다. 선발 마커는 목적하는 유전자와 동일한 벡터내에 또는 도파민 수용체 서열 함유 벡터와 동시에 트랜스펙션된 별도의 벡터상에 포함될 수 있다. 발현 벡터 내의 선발 마커는 선발에 대한 내성을 부여할 수 있으며 세포가 벡터를 그의 염색체 내로 안정하게 통합하게 하고 생장하여 중심체(focus)를 형성하게 하는데 이 중심체는 다시 클로닝하여 세포주로 확장시킬 수 있다. 이와는 달리, 발현 벡터는 마커의 물리적 속성을 이용하여 선발 마커를 발현하는 세포가 선발될 수 있게 하는데, 즉, 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)의 발현은 형광 활성화 세포 분리(fluorescence activated cell sorting, FACS) 분석법을 사용한 마커 발현 세포의 선발을 가능하게 한다.
당업자는 목적하는 유전자가 성공적으로 통합된 세포의 선발을 위해 트랜스펙션을 위해 적절한 세포 유형을 선발할 수 있다. 예를 들어, 선발 마커가 단순포진 바이러스 타이미딘 키나제, 하이포잔틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 또는 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제일 경우, 적절한 세포형은 각각 tk-, hgprt- 또는 aprt-세포이다. 또는, 선발 마커가 각각 메토트렉세이트, 마이코페놀산, G-418 또는 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 dhfr, gpt, neo 또는 hygro일 경우 정상 세포가 사용될 수 있다. 당해 재조합 세포주는 도파민 수용체 활성에 영향을 주는 후보 화합물의 동정을 위해 유용하다.
IV. 도파민 수용체 항체의 제조
도파민 수용체의 하나 이상의 에피토프를 선택적으로 인지하는 항체는 또한 본 발명에 포함된다. 당해 항체는 예를 들어, 다중클론 항체, 단일클론 항체, 키메라 항체, 인간 항체, 단일쇄 항체, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab 발현 라이브러리를 사용하여 제조된 분자, 유전자전이된 생쥐에서 제조된 인간 항체(다중클론 또는 단일클론) 및 상기된 것중 에피토프 결합 단편을 포함한다. 치료학적 용도를 위해, 키메라 또는 인간 항체가 바람직하고 인간 항체가 가장 바람직하다.
당해 항체는 시험 화합물을 평가하기 위해 본원에 기재된 화합물 스크리닝 방법과 함께 사용될 수 있는데, 예를 들어, 도파민 수용체 폴리펩티드의 고정화를 위해 사용될 수 있거나 당해 항체는 유전자 요법 기술과 함께 사용하여 예를 들어, 당해 유전자가 도입된 세포 또는 환자 조직에서 직접 도파민 수용체의 발현을 평가할 수 있다. 추가로, 본 발명의 항체는 골격근 위축의 치료에 유용하다. 도파민 수용체에 특이적인 항체는 도파민 수용체 작용제인 항체 서브세트를 동정하기 위한 본 발명의 방법에 의해 스크리닝될 수 있다. 추가로, 도파민 수용체에 특이적인 항체에 대해 생성된 항-유전자형(idiotype) 항체는 도파민 수용체 작용제로서 유용할 수 있고 항-도파민 수용체 항체와 마찬가지로 본 발명의 방법에 의해 도파민 수용체를 활성화시키는 이들의 능력에 대해 스크리닝될 수 있다.
항체의 생산을 위해, 다양한 숙주 동물은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 도파민 수용체, 항-도파민 수용체 항체, 또는 이의 면역원성 단편을 주사하여 면역화시킬 수 있다. 항-유전자형 항체의 제조를 위해, 면역원은 항-도파민 수용체 항체이다. 항-유전자형 항체의 생산은 예를 들어, 본원에 참조로서 인용되는 미국 특허 제4,699,880호에 기재되어 있다. 적합한 숙주 동물은 토끼, 생쥐, 염소, 양 및 말을 포함하지만 그에 한정되지 않는다. 면역화 기술은 당 업계에 잘 알려져 있다. 다중클론 항체는 면역화 동물의 혈청으로부터 정제될 수 있으며, 단일클론 항체는 당 업계에 잘 알려진 방법에 의해 생성될 수 있다. 이러한 기술은, 그에 한정되는 것은 아니지만, 잘 알려진 쾰러(Kohler)와 밀스타인(Milstein)의 하이브리도마(hybridoma) 기술, 인간 B-세포 하이브리도마 기술, 및 EBV 하이브리도마 기술을 포함한다. 단일클론 항체는 카파 또는 람다 경쇄를 포함하는 IgG, IgE, IgM, IgA 및 IgD를 비롯한 임의의 면역글로불린류일 수 있다.
인간에서 비-인간 항체의 면역원성 때문에, 키메라 항체는 인간 환자의 치료학적 처리를 위해 사용되는 경우 비-인간 항체에 바람직하다. 키메라 항체를 제조하고 사용하는 기술은 예를 들어, 미국 특허 제5,807,715호; 제4,816,397호; 제4,816,567호; 제5,530,101호; 제5,585,089호; 제5,693,761호; 제5,693,762호; 제6,180,370호 및 제5,824,307호에 공지되어 있고 이들 모두는 본원에 참조로서 인용된다.
완전한 인간 항체는 특히 비-인간 항체 또는 키메라 항체보다 면역원성이 덜하기 때문에 인간 환자의 치료적 치료를 위해 바람직할 수 있다. 당해 항체는 실질적으로 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 없지만 인간 중쇄 및 경쇄 유전자를 발현할 수 있는 유전자전이된 생쥐를 사용하여 제조될 수 있다. 유전자전이된 생쥐는 선택된 항원, 예를 들어, D1 및 D5 도파민 수용체 전부 또는 일부를 사용하여 정상적인 양상으로 면역화된다. 항원에 대해 지시된 단일클론 항체는 이들 면역화된 유전자전이 생쥐로부터 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 수득된다. 본 기술은 미국 특허 제5,874,299호; 제5,877,397호; 제5,569,825호; 제5,661,016호; 제5,770,429호 및 제6,075,181호에 상세하게 보고되어 있고 이들 모두는 본원에 참조로서 인용된다. 하이브리도마 세포 배양물로부터 직접 인간 면역글로불린을 수득하기 위한 또 다른 방법으로서, 하이브리도마 세포는 후속 발현 또는 유전자 조작을 위해 재배열된 중쇄 및 경쇄 유전자좌의 공급원으로서 사용될 수 있다. 당해 항체 생산 세포로부터의 유전자의 분리는 고수준의 적합한 mRNA가 이용가능하기 때문에 간단하다. 회수된 재배열된 유전자좌는 목적하는 바대로 조작될 수 있다. 예를 들어, 불변 영역은 제거되거나 상이한 이소형의 불변영역으로 대체되거나 단일쇄 FV 영역을 암호화하는 가변 영역이 연결될 수 있다. 당해 기술은 본원에 참조로서 인용되는 WO 96/33735호 및 WO 96/34096호에 기재되어 있다.
V. 시험 화합물의 선발
본 발명의 분석에 따라 스크리닝될 수 있는 화합물은 예를 들어, 식물 또는 동물 추출물과 같은 천연 생성물, 합성 화학물질, 무작위 펩티드 라이브러리의 구성원을 포함하지만 그에 한정되지 않는 단백질, 가용성 펩티드와 같은 펩티드를 포함하는 생물학적 활성 물질 및 D- 또는 L- 배위 아미노산, 포스포펩티드(무작위 또는 부분적인 축퇴성 지시된 포스포펩티드 라이브러리를 포함하지만 그에 한정되지 않음)로 이루어진 조합적 화학물질로부터 유래된 분자 라이브러리, 항체(다중클론, 단일클론, 키메라, 인간, 항유전자형 또는 단일쇄 항체 및 Fab, F(ab')2 및 Fab 발현 라이브러리 단편 및 에피토프 결합 단편을 포함하지만 그에 한정되지 않음), 유기 및 무기 분자를 포함하는, 공지된 화합물의 라이브러리를 포함하지만 그에 한정되지 않는다.
시험 화합물의 보다 통상적인 공급원 뿐만 아니라 컴퓨터 모델링 및 검색 기술을 사용하여 도파민 수용체의 리간드 결합 부위 또는 이미 동정된 도파민 수용체의 작용제로부터 구조적 정보를 통해 시험 화합물을 이상적으로 선택할 수 있다. 시험 화합물의 당해 이상적인 선발은 치료학적 후보 화합물을 동정하기 위해 스크리닝되어야만 하는 시험 화합물의 수를 감소시킬 수 있다. 도파민 수용체는 GPCR이고 따라서 도파민 수용체 단백질 서열에 대한 정보 지식을 통해 잠재적인 리간드를 스크리닝하는 데 사용될 수 있는 결합 부위의 모델을 합성할 수 있다. 이러한 과정은 당업계에 널리 공지된 여러 방식으로 성취될 수 있다. 간략하게는 가장 막강한 방법은 도파민 수용체 서열을 주형(세균 로돕신 또는 로돕신 결정 구조 또는 기타 GPCR 모델로부터 유래됨)과 서열 정렬시키고 아미노산 구조를 전환시키고 분자의 조작 및 가시적 조사에 의해 모델을 개량함을 포함한다. 강한 서열 정렬이 수행될 수 없는 경우, 모델은 또한 소수성 헬릭스의 결합 모델에 의해 작성될 수 있다. 이들은 이어서 공지된 로돕신 구조의 일반적인 배치로부터 시작하는 또 다른 것과 상대적으로 각각의 헬릭스를 회전시키고 해독하여 함께 조정된다. 잔기-잔기 접촉을 지적하는 돌연변이 데이터를 또한 사용하여 헬릭스 서로간의 위치를 밝혀 이들이 접촉되어 있음을 확인한다. 이러한 과정 동안에, 헬릭스내에 공지된 리간드의 결합 부위로의 결합을 또한 사용함으로써 리간드의 결합을 안정화시키는 상호작용이 이루어지도록 하여 헬릭스의 위치를 밝히는 것을 도와줄 수 있다. 당해 모델은 분자 조작 및 표준 상동성 모델링 기술을 사용하는 세포내 및 세포외 루프의 루프 형성을 사용하는 정련에 의해 완성될 수 있다. GPCR 구조 및 모델링을 사용하는 일반적인 정보는 문헌[참조: Schoneberg, T. et. al., Molecular and Cellular Endocrinology, 151:181-193 (1999), Flower, D., Biochimica et Biophysica Acta, 1422:207-234 (1999), and Sexton, P.M., Current Opinion in Drug Discovery and Development, 2(5):440-448 (1999)]에 기재되어 있다.
일단 모델이 완료되면, 이는 여러 기존의 컴퓨터 프로그램 중 하나와 함께 사용되어 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 스크리닝될 화합물의 수를 줄일 수 있다. 이들중 가장 일반적인 것은 DOCK 프로그램 (UCSF Molecular Design Institute, 533 Parnassus Ave, U-64, Box 0446, San Francisco, California 94143-0446)이다. 이의 여러 변이체에서, 결합 부위에 대한 입체적 조정 및 대략적인 정전기적 상보성에 대한 시판되고/되거나 독점적인 화합물에 대한 데이터베이스를 스크리닝할 수 있다. 흔히, DOCK내에서 우수하게 스코어되는 분자가 리간드가 될 가능성이 높은 것으로 밝혀졌다. 사용될 수 있는 또 다른 프로그램은 FLEXX (Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Missouri, 63144-2913 (www.tripos.com))이다. 당해 프로그램은 상당히 느리기 때문에 일반적으로 소형 화합물에 대한 데이터베이스를 조사하는 것으로 제한된다. FLEXX내 스코어링이 보다 상세하게 기재되어 있고 일반적으로 DOCK 의 결합 능력 평가 보다 우수하다. FLEXX는 DOCK 제안을 확고히 하거나 공지된 리간드 또는 주형으로부터 조합적으로 제조된 화합물을 조사하는데 가장 적합하게 사용된다.
VI. 골격근의 질량 또는 기능의 조절을 위한 후보 화합물의 동정을 위한 스크리닝 분석
D1 및 D5 도파민 수용체가 골격근 위축 비대의 조절에서 그 역할을 한다는 발견에 의해 골격근 위축의 예방적 또는 치료적 치료에 궁극적으로 사용될 수도 있는 후보 화합물의 동정을 위하여 하나 이상의 시험 화합물을 스크리닝하는 여러 방법이 가능해진다. 본 발명은 시험 화합물을 D1 및 D5 도파민 수용체에 결합하거나, D1 및 D5 도파민 수용체를 활성화시키거나, D1 및 D5 도파민 수용체 또는 D1 및 D5 도파민 수용체 신호 전송 경로의 작용제-유도성 활성화를 연장 또는 증대시키거나 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자의 발현을 증가시키는 그의 능력에 대하여 스크리닝하는 방법을 제공한다.
인간에 있어서 D1 또는 D5 도파민 수용체를 통하여 골격근의 질량 또는 기능을 조절하는 데에 궁극적으로 사용되는 화합물의 스크리닝에 있어서 아미노산 서열의 서열 번호 2의 서열에 대한 동일성이 70%보다 큰, 더 바람직하게는 아미노산 서열의 서열 번호 2의 서열에 대한 동일성이 80%보다 큰, 가장 바람직하게는 아미노산 서열의 서열 번호 2의 서열에 대한 동일성이 90%보다 큰 D1 도파민 수용체를 이용하여 초기 시험관내 스크린을 실시하는 것이 바람직하다. 아미노산 서열의 서열 번호 8의 서열에 대한 동일성이 70%보다 큰, 더 바람직하게는 아미노산 서열의 서열 번호 8의 서열에 대한 동일성이 80%보다 큰, 가장 바람직하게는 아미노산 서열의 서열 번호 8의 서열에 대한 동일성이 90%보다 큰 D5 도파민 수용체를 이용하여 초기 시험관내 스크린을 실시하는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 시험 화합물을 인간, 생쥐 또는 쥐 도파민 수용체에 대하여 스크리닝하는데, 가장 바람직한 것은 인간이다. 비-인간 종에서 D1 및 D5 도파민 수용체를 통하여 골격근의 질량 또는 기능을 조절하는 데에 궁극적으로 사용되는 화합물의 스크리닝에 있어서 치료가 고려되는 종으로부터 유래되는 D1 및 D5 도파민 수용체를 이용하는 것이 바람직하다.
만약 있다면, 후보 화합물이 D1 및 D5 도파민 수용체에 대하여 어떠한 선택성을 나타내는지에 대하여 시험 또는 후보 화합물이 갖는 활성 수준의 측정을 위한 스크리닝에 있어서 초기 스크린은 아미노산 서열의 서열 번호 2의 서열에 대한 동일성이 70%보다 큰, 더 바람직하게는 아미노산 서열의 서열 번호 2의 서열에 대한 동일성이 80%보다 큰, 가장 바람직하게는 아미노산 서열의 서열 번호 2의 서열에 대한 동일성이 90%보다 큰 D1 도파민 수용체를 이용하여 실시하는 것이 바람직하다. 또한 그 다음의 초기 스크린은 아미노산 서열의 서열 번호 8의 서열에 대한 동일성이 70%보다 큰, 더 바람직하게는 아미노산 서열의 서열 번호 8의 서열에 대한 동일성이 80%보다 큰, 가장 바람직하게는 아미노산 서열의 서열 번호 8의 서열에 대한 동일성이 90%보다 큰 D5 도파민 수용체를 이용하여 실시하는 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 시험 화합물은 인간, 생쥐 또는 쥐에 대하여 스크리닝하는데, 가장 바람직한 것은 인간이다. 비-인간 종에서 골격근의 질량 또는 기능의 조절에 궁극적으로 사용되는 화합물의 스크리닝에 있어서 치료가 고려되는 종으로부터 유래되는 수용체, 예를 들어 서열 번호 16 내지 서열 번호 30의 서열로서 표 I에 열거되어 있는 것을 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법은 높은 처리량에 이용될 수 있지만 본 방법에 있어서 하나만큼 적은 시험 화합물의 사용이 " 스크리닝"이라는 용어에 포함된다. 본 발명의 방법으로 결정되는 바와 같이 D1 또는 D5 도파민 수용체에 결합하거나, D1 또는 D5 도파민 수용체를 활성화시키거나, D1 또는 D5 도파민 수용체 또는 D1 또는 D5 도파민 수용체 신호 전송 경로의 작용제-유도성 활성화를 연장 또는 증대시키거나, D1 또는 D5 도파민 수용체의 발현을 증가시키는 시험 화합물은 본 명세서에서 "후보 화합물"로 칭해진다. 이러한 후보 화합물을 사용하여 골격근의 질량 또는 기능을 조절할 수 있다. 그러나 더 전형적으로는 시험관내 스크린의 이 첫번째 수준은 보다 좁은 범위의 화합물, 즉, 후보 화합물을 선발하는 수단을 제공하는데, 이는 추가의 스크리닝 수준에 있어서 추가의 조사를 받을 만하다. 숙련자라면 본 발명의 유용성이 하나 이상의 시험 화합물의 군으로부터 추가의 조사를 받을 만한 화합물의 서브세트(subset)를 동정하는 것임을 인지할 것이다. 또한 당업자라면 본 발명의 분석법이 다른 후보 화합물에 비하여 특정 후보 화합물의 가능한 실용성의 등급화에 유용하다는 것을 인지할 것이다. 예를 들어 1000 nM에서 (10 nM에서는 아님) D1 또는 D5 도파민 수용체를 활성화시키는 후보 화합물은 10 nM에서 D1 또는 D5 도파민 수용체를 활성화시키는 것보다 덜 흥미롭다. 숙련자는 그러한 정보를 이용하여 첫번째 수준의 스크리닝에서 동정된 후보 화합물의 서브세트를 추가의 조사를 위하여 선발할 수도 있다. 또한 숙련자라면 시험 화합물 군이 어떻게 선발되는지에 따라, 그리고 양성체가 어떻게 선발되는지에 따라, 단지 소정의 비율의 시험 화합물이 후보 화합물로 동정될 것이며, 이 비율은 매우 작을 수도 있음을 인지할 것이다.
이하에 기술되는 분석 시스템은 다양한 용기, 예를 들어 바이알, 튜브, 마이크로타이터 웰 플레이트, 병 등에 포장될 수 있는 D1 또는 D5 도파민 수용체 또는 D1 또는 D5 도파민 수용체를 발현하는 세포를 포함하는 키트 내로 제형화될 수도 있다. 다른 시약, 예를 들어 양성 대조 샘플, 음성 대조 샘플, 완충제 및 세포 배양 배지가 별개의 용기에 포함되어 키트에 제공될 수 있다.
일 실시 형태에 있어서 본 발명은 D1 또는 D5 도파민 수용체 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두에 결합되는 후보 화합물의 동정을 위한 하나 이상의 시험 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 수용체에의 화합물의 결합을 측정하는 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 전형적으로는 이 분석법은 시험 화합물의 존재 또는 부재 하에 D1 및 D5 도파민 수용체 공급원을 이 수용체에 결합하는 것으로 공지된 표지된 화합물과 함께 인큐베이션하는 단계 및 결합된 표지 화합물의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 본 명세서에 기술되어 있는 바와 같이 D1 및 D5 도파민 수용체의 공급원은 D1 및 D5 도파민 수용체를 발현하는 세포 또는 몇몇 형태의 단리된 D1 및 D5 도파민 수용체 중 어느 하나일 수도 있다. 표지된 화합물은 측정될 수 있도록, 바람직하게는 정량적으로 측정될 수 있도록 표지된(예를 들어 125I-표지, 3H-표지, 14C-표지, 유러퓸 표지, 플루오레세인 표지) 도파민 또는 임의의 도파민 유사체(바람직하게는 SCH 23390을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 D1 및 D5 도파민 수용체 리간드)일 수 있다. 그러한 표지 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 도파민 수용체에 결합되는 시험 화합물은 이 수용체에 결합되는 표지된 리간드의 양의 감소를 야기하며, 그럼으로써 대조 샘플 (시험 화합물의 부재)로부터의 신호 수준에 비하여 신호 수준이 감소된다. G-단백질 비커플링제의 존재 및 부재 하에서의 수용체 결합(예를 들어 구아니딘 뉴클레오티드 유사체, 즉, GpppNHp의 부재 및 존재 하에서의 결합)이 작용제와 길항제를 구별할 수 있는 이 기술의 변형 기술이 설명되어 있다. 문헌[Keen, M., Radioligand Binding Methods for Membrane Preparations and Intact cells in Receptor Signal Transduction Protocols, R.A.J. Challis, (ed), Humana Press Inc., Totoway N.J. (1997)]을 참고한다.
비교시 D1 및 D5 도파민 수용체에 특이적으로 결합되는 화합물들을 구별하는 것이 바람직하기 때문에 상기에 설명된 분석은 단지 D1 및 D5 도파민 수용체를 발현하는 세포 또는 세포로부터 유래되는 막을 사용하여 행하여야 하거나 이 분석은 D1 및 D5 도파민 수용체의 재조합 공급원을 이용하여 행할 수 있다. 둘 모두의 형태의 도파민 수용체를 발현하는 세포는 도파민 수용체 유전자들 중 하나를 불활성화하거나 그렇지 않을 경우 무능하게 하기 위하여 상동 재조합을 이용하여 변경할 수도 있다. 대안적으로는 도파민 수용체 공급원이 하나보다 많은 도파민 수용체 유형을 포함한다면 목적으로 하는 것이 아닌, 이 수용체에 의해 생성되는 배경 신호는 이 분석에서 수득되는 신호로부터 빼야 한다. 배경 응답은 안티센스, 항체 또는 선택성 길항제의 사용에 의해 목적으로 하는 것이 아닌 도파민 수용체로부터의 신호의 제거를 포함하는 다수의 방법으로 측정할 수 있다. 도파민 수용체의 공지된 길항제는 SCH23390(D1 및 D5 도파민 수용체 선택성), 및 스피페론(Spiperone)(D2/3/4 도파민 수용체 선택성)을 포함한다.
다른 실시 형태에 있어서, 본 발명은 D1 및 D5 도파민 수용체를 활성화시키는 후보 화합물의 동정을 위한 시험 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 이는 본 명세서에서 상기에 설명되어 있는 결합 분석과 함께 사용될 수 있다. 전형적으로는 이 분석은 세포를 기반으로 하는 것이지만, 상기에 설명되어 있는 바와 같이 작용제와 길항제를 구별지을 수 있는 무세포 분석법이 공지되어 있다. 세포 기반의 분석법은 D1 및 D5 도파민 수용체를 발현하는 세포를 시험 화합물 또는 대조와 접촉시키는 단계 및 도파민 수용체 신호 전송 경로의 구성 요소(component)의 발현 또는 활성을 측정함으로써 도파민 수용체의 활성화를 측정하는 단계를 포함한다.
상기의 배경기술 섹션에 설명되어 있는 바와 같이 도파민 수용체는 세포 유형에 따라 Gαq 또는 Gαi를 포함하는 여러 상이한 경로들을 통하여 커플링하는 것으로 나타났다. 필요한 경로의 구성 요소가 특정 세포 유형에 존재한다면, 도파민 수용체의 작용제에 의한 활성화에 의해 이 수용체는 이 경로들 중 임의의 경로를 통하여 신호화한다고 생각된다. 따라서 도파민 수용체 활성화의 스크리닝을 위하여 분석에서는 심지어 생체내에서의 처리에 있어서 관련 세포 유형이 상이한 경로를 통하여 도파민 수용체를 골격근 위축에 커플링시키는 경우에도 임의의 신호 전송 경로가 해독 정보로 이용될 수 있다. 당업자라면 스크리닝 분석법이 수용체 활성화가 측정되는 경로와는 관계없이 유용한 도파민 수용체 작용제의 동정에 유효함을 인지할 것이다. 이러한 신호 전송 경로의 활성화를 측정하는 분석법은 당 업계에 공지되어 있다.
예를 들어 시험 화합물과의 접촉 후 세포 용해물이 제조되고 cAMP 유도에 대하여 분석될 수 있다. cAMP는 Gαs 활성화에 응답하여 유도된다. Gαs는 도파민 수용체 이외의 수용체에 의해 활성화되기 때문에, 그리고 시험 화합물은 도파민 수용체를 통하여 또는 다른 기전에 의해 그의 효과를 발휘할 수 있기 때문에 시험 화합물이 도파민 수용체의 활성화를 통하여 cAMP의 수준을 증가시키는 지를 결정하는 데에 있어서 두가지의 대조 비교가 관련된다. 하나의 대조에서는 시험 화합물과 접촉시킨 세포의 cAMP 수준 및 대조 화합물(즉, 시험 화합물이 용해되는 비히클)과 접촉시킨 세포의 cAMP 수준이 비교된다. 시험 화합물이 대조 화합물에 비하여 cAMP 수준을 증가시키면 이는 시험 화합물이 몇몇 기전에 의해 cAMP를 증가시키고 있음을 나타낸다. 다른 대조에서는 도파민 수용체 발현 세포주 및 도파민 수용체를 발현하지 않는 것을 제외하고는 본질적으로 동일한 세포주의 cAMP 수준이 비교되는데, 여기에서 두 세포주 모두는 시험 화합물로 처리되었다. 시험 화합물이 도파민 수용체를 발현하지 않는 세포주에 비하여 도파민 수용체 발현 세포주에서 cAMP 수준을 상승시킨다면 이는 도파민 수용체의 활성화를 통하여 시험 화합물이 cAMP를 상승시킴을 나타내는 것이다.
본 발명의 특정 실시 형태에 있어서 cAMP 유도는 도파민 수용체를 발현하는 세포 내로 도입될 수 있는 임의의 다양한 리포터 유전자에 결합된 cAMP 응답성 요소를 포함하는 DNA 제작물을 사용하여 측정한다. 이러한 리포터 유전자는, 그에 한정되는 것은 아니지만, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase, CAT), 루시퍼라제, 글루큐로나이드 신테타제, 성장 호르몬, 형광 단백질(예를 들어 녹색 형광 단백질), 또는 알칼라인 포스파타제를 포함한다. 시험 화합물에 세포를 노출시킨 후, 리포터 유전자의 발현 수준을 중량화하여 cAMP 수준을 증가시키는 시험 화합물의 능력을 측정하며 따라서 도파민 수용체를 활성화시키는 시험 화합물의 능력을 측정할 수 있다.
이 분석법에서 유용한 세포는 활성화 분석법에서 이용되는 세포가 도파민 또는 하나 이상의 도파민 유사체에 대하여 통계학적으로 유의한 응답을 주는 기능성 수용체를 발현하는 것이 바람직하다는 것을 제외하고는, 상기에 설명된 도파민 수용체 결합 분석법에서의 것과 동일하다. 전장 도파민 수용체를 발현하는 세포를 사용하는 것 외에도, 리포터 요소에 커플링되거나, 리포터 요소를 포함하거나 신호화 단백질과 상호 작용하도록 물리적으로 변경된 수용체의 리간드 결합 도메인을 포함하는 도파민 수용체를 발현하는 세포가 조작될 수 있다. 예를 들어 야생형의 도파민 수용체 또는 도파민 수용체 단편을 G-단백질에 융합시켜 융합 단백질의 도파민 수용체 부분에의 작용제 결합시 융합된 G-단백질을 활성화시킬 수 있다 (문헌[Siefert, R. et al., Trends Pharmacol. Sci. 20: 383-389 (1999)]). 또한 세포는 바람직하게는 해독 정보에 따라 도파민 수용체 또는 도파민 수용체 유사체, 예를 들어 CRE 리포터 유전자의 강력한 유도를 탐지하기 위한 도파민 수용체 또는 도파민 수용체 유사체에 의한 유도성 응답을 최대화하기 위하여 다수의 특성을 보유하여야 하는데, (a) 낮은 천연 수준의 cAMP; (b) 도파민 수용체와 상호 작용할 수 있는 G 단백질; (c) 높은 수준의 아데닐릴 사이클라제; (d) 높은 수준의 단백질 키나제 A; (e) 낮은 수준의 포스포다이에스테라제; 및 (f) 높은 수준의 cAMP 응답 요소 결합 단백질이 유리하다. 도파민 또는 도파민 유사체에의 응답의 증가를 위하여 숙주 세포는 보다 많은 양의 유리한 인자 또는 보다 적은 양의 불리한 인자를 발현하도록 조작될 수 있다. 또한, CRE 리포터의 다른 유도 경로를 제거하여 기초 수준을 감소시킬 수 있다.
몇몇 예에 있어서 작용제에의 노출 연장 후 G 단백질-커플링 수용체 응답은 감퇴되거나 탈감작되게 된다. 본 발명의 다른 실시 형태는 D1 및 D5 도파민 수용체 작용제에 응답하여 D1 및 D5 도파민 수용체, 또는 D1 및 D5 도파민 수용체 신호 전송 경로의 작용제-유도성 활성화를 연장 또는 증대시키는 화합물의 동정 방법을 제공한다. 그러한 화합물은 예를 들어 골격근 위축 치료용의 D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제와 함께 사용될 수도 있다. 전형적으로는 본 방법에서는 임의의 순서로, 또는 동시에 (i) 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계; (ii) 기능성 D1 및 D5 도파민 수용체를 발현하는 세포를, 수용체가 탈감작되게 하기에 충분한 작용제의 농도에서, 그리고 그렇게 하기에 충분한 작용제-수용체 노출 기간 동안 D1 및 D5 도파민 수용체 작용제로 처리하는 단계; 이어서 (iii) D1 및 D5 도파민 수용체의 활성화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 세포 기반의 분석법이 이용된다. 당업자라면 여러 기전이 수용체 인산화, 수용체 내부화(internalization) 또는 분해 및 도파민 수용체 신호 전송 경로 하향-조정을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 수용체 탈감작에 기여함을 인지할 것이다. 당업자라면 어떠한 탈감작 기전을 표적으로 하는지에 따라 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 적절한 시간(즉, 작용제 처리 전, 이 처리 동안 또는 이 처리 후)을 결정할 수 있다. 예를 들어 작용제 처리 이후세포를 시험 화합물과 접촉시키면 수용체의 인산화의 결과로 일어나는 수용체의 탈감작을 차단하는 시험 화합물을 검출할 수 있다.
다른 실시 형태에 있어서 본 발명은 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자로부터의 전사를 조절하거나 D1 및 D5 도파민 수용체 발현을 조절하는 후보 화합물의 동정을 위한 하나 이상의 시험 화합물의 스크리닝 방법을 제공한다. 도파민 수용체 유전자의 전사 활성을 조절하는 후보 화합물은 D1 및 D5 도파민 수용체 조절 영역과 작동가능하게 결합된 리포터 유전자(리포터 유전자 제작물)을 이용하여 동정할 수도 있다. 그러한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 하나의 그러한 방법에 있어서 리포터 유전자 제작물은 세포 인자 공급원의 존재 하에 시험 화합물과 접촉시키며 리포터 유전자 발현 수준을 측정한다. 대조 샘플에 비하여 발현 수준의 증가를 야기하는 시험 화합물은 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자의 전사를 증가시키는 후보 화합물임을 나타내는 것이다. 시험관내 또는 생체내 전사에 필요한 세포 인자의 제공을 위하여 적절한 세포 또는 세포 추출물이 D1 및 D5 도파민 수용체를 정상적으로 발현하는 임의의 세포 유형으로부터 제조된다.
D1 및 D5 도파민 수용체 발현을 조절하는 후보 화합물은 또한 세포를 시험 화합물과 접촉시키며 도파민 수용체의 발현을 측정하는 방법에서 동정될 수 있다. 시험 화합물의 존재 하에서의 D1 및 D5 도파민 수용체의 발현 수준은 시험 화합물의 부재 하에서의 발현 수준과 비교된다. D1 및 D5 도파민 수용체의 발현을 증가시키는 시험 화합물은 근육 질량 또는 근육 기능을 증가시키기 위한 후보 화합물로 동정된다. 그러한 방법에서는 D1 및 D5 도파민 수용체의 전사 또는 번역을 증가시키거나 mRNA 또는 D1 및 D5 도파민 수용체 단백질의 안정성을 증가시키는 후보 화합물이 검출된다.
VII. 골격근 위축 모델을 이용한 후보 화합물의 스크리닝
상기에 설명한 바와 같이 시험관내 분석에 의해 하나 이상의 시험 화합물로부터 선택된 후보 화합물을 골격근 위축 및/또는 비대의 모델 시스템에서 골격근의 질량 또는 기능을 조절하는 그의 능력에 대하여 더 시험할 수 있다. 그러한 골격근 위축 또는 비대 모델은 골격근 위축의 시험관내 세포 배양 모델 및 생체내 동물 모델 둘 모두를 포함한다. 그러한 추가 수준의 스크리닝은 추가의 조사, 예를 들어 임상 시험을 받을 만한 후보 화합물의 범위를 더 좁히는 데에 유용하다.
근육 위축의 세포 배양 모델
골격근 위축의 시험관내 모델은 당 업계에 공지되어 있다. 그러한 모델은 예를 들어 문헌[Vandenburgh, H.H., In Vitro 24:609-619 (1988)], 문헌[Vandenburgh, H.H. et al., J of Biomechanics, 24 Suppl 1:91-99 (1991)], 문헌[Vandenburgh, H.H et al., In Vitro Cell. Dev. Biol., 24(3):166-174 (1988)], 문헌[Chromiak, J.A., et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim., 34(9):694-703 (1998)], 문헌[Shansky, J., et al., In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim., 33(9):659-661 (1997)], 문헌[Perrone, C.E. et al., J. Biol. Chem. 270(5):2099-2106 (1995)], 문헌[Chromiac, J.A. and Vandenburgh, H.H., J. Cell. Physiol. 159(3):407-414 (1994)], 및 문헌[Vandenburgh, H.H. and Karlisch, P., In Vitro Cell. Dev. Biol. 25(7):607-616 (1989)]에 설명되어 있다. 그러한 모델은 동물 모델에서 시험을 받을 만한 후보 화합물의 범위를 더 좁히기 위하여 상기에 설명한 시험관내 스크리닝 이후에 유용하지만 이것이 필요한 것은 아니다. 세포 배양 모델은 후보 화합물로 처리하며 이 처리에 대한 모델의 응답은 근육 단백질 합성 또는 분해, 골격근의 질량 또는 수축 기능의 변화와 같은 근육 마커의 변화를 평가함으로써 측정한다. 전형적으로 근육 마커에 있어서 유의한 변화를 유도하는 화합물이 골격근 위축의 동물 모델에서 더 스크리닝된다.
골격근 위축의 동물 모델
후보 화합물을 비-인간 동물에게 투여하며 동물의 응답은 예를 들어 위축 또는 비대의 마커, 예를 들어 골격근 질량, 골격근 기능, 근육 또는 근섬유 단면적, 수축성 단백질 함량, 비수축성 단백질 함량 또는 골격근의 질량 또는 기능의 변화와 상관 관계가 있는 생화학적 또는 유전적 마커의 변화를 평가함으로써 모니터링한다. 골격근 비대를 유도하거나 임의의 양상의 골격근 위축을 방지하는 후보 화합물은 인간 골격근 위축을 치료하기 위한 유망한 치료 후보체로 간주되어야 하며 본 발명에서 후보 치료 화합물로 칭해진다. 후보 화합물이 골격근 위축을 조절하는 능력의 평가 외에도 독성과 같은 바람직하지 못한 부작용이 그러한 스크린에서 또한 탐지될 수도 있다. 용납하기 어려울 정도로 높은 수준의 부작용이 없다는 것은 후보 치료 화합물의 선발에 있어서 추가의 기준으로 이용될 수도 있다.
하기의 참고 문헌에 기술되어 있는 것과 같은 다양한 골격근 위축의 동물 모델이 당 업계에 공지되어 있다: 문헌[Herbison, G.J., et al. Arch. Phys. Med. Rehabil. 60:401-404 (1979), Appell, H-J. Sports Medicine 10:42-58 (1990)], 문헌[Hasselgren, P-O. and Fischer, J.E. World J. Surg. 22:203-208 (1998)], 문헌[Agbenyega, E.T. and Wareham, A.C. Comp. Biochem. Physiol. 102A:141-145 (1992)], 문헌[Thomason, D.B. and Booth, F.W. J. Appl. Physiol. 68:1-12 (1990)], 문헌[Fitts, R.H., et al. J. Appl. Physiol. 60:1946-1953 (1986)], 문헌[Bramanti, P., et al. Int. J. Anat. Embryol. 103:45-64 (1998)], 문헌[Cartee, G.D. J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 50:137-141 (1995)], 문헌[Cork, L.C., et al. Prog. Clin. Biol. Res. 229:241-269 (1987)], 문헌[Booth, F.W. and Gollnick, P.D. Med. Sci. Sports Exerc. 15:415-420 (1983)], 문헌[Bloomfield, S.A. Med. Sci. Sports Exerc. 29:197-206 (1997)]. 이러한 모델에 있어서의 바람직한 동물은 생쥐 및 쥐이다. 상기 모델은 예를 들어 깁스(casting) 또는 그렇지 않을 경우 사지의 고정, 뒷다리 현수, 완전한 동물 고정화, 및 무게 감소 상태와 같은 불용 유도성 위축 모델을 포함한다. 신경 손상 유도성 위축 모델은 예를 들어 신경 압박(crush), 특정 근육에 분포하는 신경 절편의 제거, 신경에 대한 독소 적용과, 바이러스, 박테리아 또는 진핵생물 감염 제제(agent)에 의한 신경 감염을 포함한다. 글루코코르티코이드 유도성 위축 모델은, 예를 들어 시상하부-뇌하수체-부신(HPA) 축을 활성화하는 호르몬의 적용에 의한 내인성 코르티코스테로이드 생성의 촉진과, 위축 유도 투여량의 외인성 글루코코르티코이드의 동물에의 적용을 포함한다. 패혈증 유도성 위축 모델은 예를 들어 박테리아와 같은 패혈증 유도 유기체를 이용한 접종, 박테리아 세포벽 추출물 또는 내독소와 같은 면역 활성화 화합물을 이용한 동물의 처치, 및 장 벽의 천자(puncture)를 포함한다. 악액질 유도성 위축 모델은 예를 들어 악액질 형성 잠재력을 가지는 종양 형성성(tumorigenic) 세포의 동물에의 접종, 악액질로 이어지는 감염성 제제(예를 들어 에이즈를 야기하는 바이러스)의 동물에의 접종 및 악액질을 유도하는 호르몬 또는 사이토카인, 예를 들어 CNTF, TNF, IL-6, IL-1 등을 이용한 동물의 처치를 포함한다. 심부전 유도성 위축 모델은 심부전이 골격근 위축과 동시에 발병하도록 동물을 조작하는 것을 포함한다. 퇴행성 신경 질환 유도성 위축 모델은 동물을 뉴런 구성 요소로 면역화하는 것으로부터 생기는 것과 같은 자가면역 동물 모델을 포함한다. 근이영양증 유도성 위축 모델은 Mdx 생쥐에서 나타나는 디스트로핀 유전자의 돌연변이와 같은 유전적으로 유도된 근이영양증의 천연 또는 인공 모델을 포함한다.
골격근 비대의 동물 모델은 예를 들어 반대되는 사지의 불활성화로 인한 사지 근육 사용 증가 모델, 불용 위축 유도 사건에 이은 리웨이팅(reweighting) 모델, 일시적 신경 손상 때문에 위축된 근육의 재이용 모델, 주동근(synergistic muscle)의 불활성화로 인한 선택적 근육 사용의 증가 모델(예를 들어 보상성 비대), 근육에 가해지는 하중 증가로 인한 근육 이용 증가 모델 및 글루코코르티코이드 유도성 위축 후 글루코코르티코이드의 제거에 의해 생기는 비대 모델을 포함한다. 바람직한 동물 위축 모델은 이하에서 더욱 상세하게 기술되는 좌골 신경 탈신경 위축 모델, 글루코코르티코이드 유도성 위축 모델, 및 다리 깁스에 의한 불용 위축 모델을 포함한다.
좌골 신경 탈신경 위축 모델은 동물을 마취시키고 이어서 우측 또는 좌측 좌골 신경의 짧은 절편을 수술로 제거하는 것을 포함하는데, 예를 들어 생쥐에 있어서 좌골 신경은 대략 대퇴부의 중앙에서 단리하며 3-5 ㎜ 절편을 제거한다. 이는 뒷다리 하부의 근육 조직의 신경을 제거하여 상기 근육에서 위축을 일으킨다. 일반적으로, 대퇴이두근으로의 신경 분포는 온전하게 남아 있어 사실상 정상적인 보행을 위한 만족스러운 무릎 운동을 제공한다. 일반적으로, 미처리 동물에 있어서는 탈신경화 근육의 근육 질량이 탈신경화한지 10일 후에 30-50% 감소한다. 탈신경화 후, 시험 화합물을 예를 들어 삼투 미니펌프(예를 들어, 알제트(Alzet), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)의 이식을 통하여 예를 들어 연속 주입으로 또는 주사에 의해 투여하여 시험 화합물의 탈신경화 유도성 골격근 위축에 대한 영향을 측정한다. 탈신경화 이후의 다양한 시간대에서 동물을 안락사시키고 하부 다리 근육을 탈신경화 및 비탈신경화 다리 둘 모두로부터 신속하게 절개하고, 힘줄과 결합 조직을 제거한 근육의 중량을 잰다. 영향을 받은 근육에서의 위축 정도를 예를 들어 근육 질량, 근육 단면적, 근육섬유 단면적 또는 수축성 단백질 함량의 측정에 의해 분석한다.
글루코코르티코이드 유도성 위축 모델은 글루코코르티코이드, 예를 들어 일일 1.2 ㎎/㎏의 음용수 중 덱사메타손을 시험 동물에 투여하는 것을 포함한다. 일반적으로, 미처리 동물에 있어서, 골격근 질량은 덱사메타손 투여 10일 후에 30-50% 감소된다. 글루코코르티코이드 투여와 동시에, 또는 글루코코르티코이드 투여 이후, 시험 화합물을 예를 들어 주사 또는 연속 주입에 의해 투여하여 그의 글루코코르티코이드 유도성 골격근 위축에 대한 영향을 측정한다. 글루코코르티코이드 투여 이후의 다양한 시간대에서 영향을 받은 근육에서의 위축 정도를 상기 탈신경 모델에 대하여 기술한 바와 같이 분석한다.
다리 깁스에 의한 불용 위축 모델은 무릎에서 아래로 발까지 동물의 뒷다리 하나를 깁스하는 것을 포함한다. 일반적으로 근육 질량은 깁스 10일 후에 20-40% 감소한다. 깁스 후, 시험 화합물을 삼투 미니펌프(예를 들어, 알제트, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)의 이식을 통하여 연속 주입으로 또는 주사에 의해 투여하여 시험 펩티드의 다리 깁스 유도성 골격근 위축에 대한 영향을 측정한다. 다리 깁스 이후의 다양한 시간대에서 영향을 받은 근육에서의 위축 정도를 상기 탈신경 모델에 대하여 기술한 바와 같이 분석한다.
당업자라면 인간 용도의 화합물의 스크리닝에 있어서 인간 D1 및 D5 도파민 수용체와 다른 동물 종으로부터 유래되는 D1 및 D5 도파민 수용체 사이에는 상이한 점이 존재하기 때문에 스크린이 비-인간 D1 및 D5 도파민 수용체를 사용하여 수행될 때에 발생하는 몇몇 허위 양성 또는 음성 결과가 존재할 수도 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서 인간 D1 및 D5 도파민 수용체를 이용하여 초기 시험관내 스크린을 행하는 것이 바람직하다. 소정의 경우에 있어서 동정된 후보 화합물은 단지 인간 수용체에 대해서 활성을 가지며 비-인간 수용체에 대해서는 활성을 가지지 않을 수도 있다. 그러한 경우에 있어서 두번째 수준의 스크리닝에서 이 후보 화합물들이 골격근의 질량 또는 기능을 조절할 수 있는 지를 결정하는 것이 여전히 바람직할 수 있다. 이 후보들은 비-인간 D1 및 D5 도파민 수용체를 활성화하지 않기 때문에 비-인간 동물을 이용한 표준 생체내 스크린은 권고되지 않는다. 그러한 경우에 있어서 이 후보들에 대한 두번째 수준의 스크리닝은 인간 도파민 수용체를 발현하는 트랜스제닉 동물에서 수행될 수도 있다.
생쥐, 쥐, 토끼, 기니아 피그, 돼지, 염소, 개 및 비-인간 영장류를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 임의의 종의 동물, 특히 포유류를 사용하여 도파민 수용체 트랜스제닉 동물을 생성할 수도 있다. 생쥐 및 쥐가 바람직하며 생쥐가 가장 바람직하다. 다양한 기술이 당업계에 공지되어 있으며 이를 사용하여 인간 도파민 수용체 트랜스진을 동물 내로 도입하여 트랜스제닉 동물의 원조 주(founder line)를 제조할 수도 있다. 그러한 기술은 전핵 미세주입법, 레트로바이러스에 의해 매개되는 세균(germ line) 내로의 유전자 전달법, 배아 줄기 세포에 있어서의 유전자 표적화, 배아의 전기 천공법 및 정자 매개성 유전자 전달법을 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다.
VIII. 골격근 위축의 치료를 위한 유전자 요법 방법
D1 및 D5 도파민 수용체의 전체 활성은 (D1 및 D5 도파민 수용체의 발현의 증가를 위하여) D1 및 D5 도파민 수용체의 유전자 또는 적절한 조직에 있어서 구성적 활성(consititutively active) D1 및 D5 도파민 수용체의 유전자의 과다 발현에 의해 증가시킬 수 있다. 도파민 수용체의 수준은 마찬가지로 도파민 수용체 유전자의 과다 발현에 의해 생체내에서 증가시킬 수 있다. 이 유전자들의 과다 발현은 전체 세포 D1 및 D5 도파민 수용체 활성을 증가시킬 것이며 따라서 골격근 위축을 조절한다. 목적 유전자(들)는 대상에서의 발현에 적합한 벡터 내로 삽입된다. 이들 벡터는 목적 유전자를 포함하는 DNA 발현 벡터의 인간 조직(예를 들어 근육) 내로의 직접적인 주입에 의해 또는 세포 내로 DNA를 도입하는 다른 입자(예를 들어 리포좀, 금 입자 등) 외에도 아데노바이러스 벡터, 아데노바이러스 관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 헤르페스 바이러스 벡터를 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다.
IX. 제약 제형 및 사용 방법
본 명세서에 설명되어 있는 스크리닝 방법으로 동정되는 후보 화합물 또는 후보 치료 화합물을 개체에 투여하여 골격근 위축을 치료하거나 골격근 비대를 유도할 수 있다. 이 때문에 본 발명은 수술, 침상 안정, 골절로 인한 불용에 의해 유도되는 골격근 위축; 척수 상해로 인한 신경 손상/탈신경; 자가면역 질환; 감염성 질환; 관련성 없는 병에서의 글루코코르티코이드의 사용; 감염 또는 기타 원인으로 인한 패혈증; 질병 또는 기아로 인한 영양소 제한; 암 악액질; 만성 염증; 에이즈(AIDS) 악액질; COPD; 울혈성 심부전; 근육 감소증 및 유전성 질환; 예를 들어 근이영양증, 신경 퇴행성 질환을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 골격근 위축의 조정을 위한 방법 및 조성물을 포함한다. D1 및 D5 도파민 수용체의 작용제를 사용하여 골격근 위축을 억제할 수 있다. 효과적인 화합물이 도파민 수용체에 대하여 절대적인 특이성을 보일 필요는 없다. 영향을 받은 다른 수용체의 특이적 길항제가, 유효하지만 비특이적인 작용제와 함께 공동 투여될 수 있다고 생각된다. 이와는 달리 이러한 특이성의 결여는 용량만의 조정, 또는 투여 섭생법의 조정에 의해 대처될 수도 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에 의해 동정되는 후보 화합물 또는 후보 치료 화합물은 D1 및 D5 도파민 수용체 또는 D1 및 D5 도파민 수용체 신호 전송 경로의 활성화를 연장 또는 증대시키는 화합물과 함께 투여될 수도 있다. 이들은 공지된 화합물, 예를 들어 테오필린일 수 있거나 이 화합물들은 본 발명의 스크리닝 방법으로 동정되어 D1 및 D5 도파민 수용체 또는 D1 및 D5 도파민 수용체 신호 전송 경로의 활성화를 연장 또는 증대시킬 수도 있다.
용량 결정
도파민 수용체를 작용시키는 화합물의 안전성 및 치료 효능은 시험관내 또는 생체내 기술을 이용하여 표준 절차로 결정할 수 있다. 부작용의 수준이 허용가능하다면 치료 지수가 보다 낮은 화합물이 유용하지만, 큰 치료 지수를 나타내는 화합물이 바람직하다. 시험관내 및 생체내 독물학적 및 약리학적 기술로부터 수득되는 데이터를 이용하여 유용할 수 있는 인간의 용량 범위를 제형화할 수 있다. 바람직한 용량은 화합물의 혈중 농도(circulating concentration)가 허용가능한 안전성에서 치료적으로 최대치인 범위에 있다. 화합물의 혈중 농도는 투여 형태, 투여 후 시간, 투여 경로 등에 따라 달라질 수도 있다. 이 범위 밖의 용량도 부작용이 허용가능하다면 유용하다. 환자의 연령 및 체중 등과 같은 것을 이용하여 통상적인 방식으로 그러한 것을 결정할 수 있다. 약물 유전학적 접근이 임상 집단에 있어서의 화합물 선택, 용량 및 투여 섭생법의 최적화에 유용할 수도 있다.
제형 및 용도
본 발명에 따라 골격근 위축의 조정에 사용하기 위한 제약 조성물은 제약적으로 허용가능한 담체 및 부형제를 사용하여 통상적인 방법을 이용하여 제형화할 수도 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 단위 투여 형태(unit dosage form)로 제공된다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단위 투여 형태"는 양호한 의료 관행에 따라 동물, 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 인간 대상에게 단일 용량으로 투여하기에 적합한 양의 D1 및 D5 도파민 수용체 작용제를 함유하는 본 발명의 조성물이다. 제약 조성물은 예를 들어 비강내 투여, 경피 투여, 흡입 투여, 비경구 투여, 피부 투여, 경구 투여 또는 직장 투여에 의한 전달용으로 제형화될 수도 있다. 경구 투여에 있어서 제약 조성물은 약리학적 활성 화합물과 완충제, 충전제, 윤활제, 붕해제 또는 습윤제를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 첨가제를 함유하는 정제 또는 캡슐의 형태를 취할 수도 있다. 정제는 코팅될 수도 있다. 경구 투여용 액체 제제는 약리학적 활성 화합물과 현탁제, 유화제, 비-수성 비히클, 방부제, 완충제 염, 착향제, 착색제, 감미제 등을 포함하지만 그에 한정되지는 않는 첨가제를 함유하는 시럽, 현탁액 또는 사용 전에 액체 비히클로 재구성되는 건조 제품을 포함하지만 그에 한정되지는 않는다. 경구 투여용 제약 조성물은 입, 위 또는 장관(intestinal tract) 중 어느 하나에서의 약리학적 활성 화합물의 방출 조절을 위하여 제형화될 수도 있다.
흡입 투여에 있어서, 본 발명에 따른 사용을 위한 화합물은 제한됨이 없이 하기 형태에 의해 전달될 수도 있다: 액체, 분말, 겔 또는 사전 측정(premeasured) 또는 비-사전 측정 용량 중 어느 하나의 가압 또는 비가압 추진제 중 어느 하나를 이용한 에어로졸 스프레이의 형태. 약리학적 활성 화합물은 적절한 충전제, 비히클, 방부제, 완충제 등과 함께 제형화될 수도 있다. 비경구 투여에 있어서, 약리학적 활성 화합물은 허용가능한 생리적 담체, 방부제 등과 함께 제형화되며 현탁액, 용액, 에멀젼, 볼루스(bolus) 주사 또는 주입용 즉석 구성형(ready for constitution) 분말 등으로 제조될 수도 있다. 이 화합물의 용량은 피하용 주사 바늘, 고압 장치 등을 포함하는 다양한 기술로 투여될 수도 있다. 직장 투여에 있어서 약리학적 활성 화합물은 좌약제, 관장제 등으로 전달하기 위하여 허용가능한 생리학적 담체, 방부제 등과 함께 제형화될 수도 있다. 피부 투여에 있어서 약리학적 활성 화합물은 로션, 연화제 등을 포함하는 허용가능한 생리학적 담체와 함께 제형화되거나 패치형 장치 내로 혼입될 수도 있다. 장기간 투여에 있어서 약리학적 활성 화합물 및 적절한 첨가제, 예를 들어 제한됨이 없이 중합체, 소수성 재료, 수지 등은 근육내 및 피하 위치를 포함하지만 그에 한정되지는 않는 다수의 부위에서의 주사 또는 이식을 위한 저장 제제(depot preparation)로 제형화될 수도 있다. 또한 약리학적 활성 화합물은 분배 장치로 투여될 수도 있다.
임상 시험 동안의 효과의 모니터링
D1 및 D5 도파민 수용체의 발현 또는 활성에 대한 화합물(예를 들어 약물)의 영향의 모니터링은 기본적인 약물 스크리닝에서뿐만 아니라 임상 시험에서도 이용될 수 있다. 예를 들어 스크리닝 분석에 의해 측정되는 D1 및 D5 도파민 수용체 활성 또는 D1 및 D5 도파민 수용체 발현을 증가시키는 화합물의 유효성은 골격근 위축을 앓고 있거나 골격근 위축의 위험성이 있는 환자의 임상 시험에서 평가될 수 있다. 시험 화합물 또는 위약의 투여 후의 다양한 시간대에서 환자에 대한 화합물의 영향은 예를 들어 골격근 질량, 골격근 기능, 근육 분해의 생화학적 마커 또는 삶의 질 상의 척도의 변화를 관찰함으로써 결정할 수 있다. 인간 대상에서의 골격근 질량의 측정 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 사지의 둘레의 측정; 예를 들어 컴퓨터 단층 촬영, MRI 또는 수퍼소닉스(supersonics)를 이용한 근육 두께의 측정; 또는 형태학적 및 생화학적 파라미터(예를 들어 섬유의 단면적, 섬유의 직경 또는 효소 활성)의 조사를 위한 근육의 생검을 포함한다. 또한 골격근 질량은 골격근 기능과 상관 관계가 있기 때문에 근육의 기능이 질량의 대리 마커로 사용될 수 있으며 근육 질량의 변화는 기능 측정법, 예를 들어 주동근 군의 힘, 강도, 또는 근전도 기록에서 발견되는 수축 특성을 이용하여 평가할 수 있다. 또한 근육 위축의 결과로서의 근육 단백질 손실은 대상의 소변 또는 혈액 중의 아미노산 또는 아미노산 유도체, 즉, 3-메틸 히스티딘의 수준을 정량화함으로써 측정할 수 있다. 그러한 방법의 개관을 위해서는 문헌[Appell, Sports Med.10:42-58 (1990)]을 참고한다. 삶의 질의 척도는 의자에서 떠날 때의 용이성, 피곤해지기 전에 걷는 걸음 수 또는 계단을 오르는 능력을 포함하지만 그에 한정되지는 않는다.
실시예 1. 인간 D 1 및 D 5 도파민 수용체 발현용 벡터의 제작
인간 D1 및 D5 도파민 수용체(hD1 및 hD5 도파민 수용체) DNA 서열인 서열 등록 번호 X58987 및 X58454를 검색하고 개시 코돈에서 시작되며 이 유전자의 5' 말단을 포함하는 것(5' 올리고뉴클레오티드)과 종결 코돈을 포함하며 이 유전자의 3' 말단을 포함하는 것(3' 올리고뉴클레오티드)을 포함하는 2개의 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 5' 올리고뉴클레오티드 중의 하나의 특유한 부위 및 3' 올리고뉴클레오티드 중의 다른 특유한 제한 엔도뉴클레아제 부위를 가지며 D1 또는 D5 도파민 수용체 유전자에는 존재하지 않는 제한 엔도뉴클레아제 부위들을 포함하도록 고안된다. 또한 3' 올리고뉴클레오티드는 폴리아데닐화 부가 신호 서열을 포함한다. 인간 골격근으로부터 유래되는 이중 가닥 cDNA는 유니버셜 퀵-클론 cDNA 콜렉션(Universal QUICK-Clone cDNA collection)(클론테크 인크(Clonetech Inc.), 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)으로부터 구매한다. 상기 5' 및 3' 올리고뉴클레오티드를 사용하여, D1 및 D5 도파민 수용체 cDNA를 AdvanTaq PCR 키트(클론테크 인크, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 사용하여 인간 골격근 cDNA의 PCR로 증폭시킨다. D1 및 D5 도파민 수용체 유전자 PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동으로 PCR 인공물로부터 정제하며 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자 DNA 단편은 뉴클레오트랩( NucleoTrap)(클론테크 인크, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)과 같은 정제 제품을 사용하여 아가로스 겔로부터 정제한다.
D1 및 D5 도파민 수용체 PCR 산물의 pIRESneo 벡터(클론테크 인크, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재) 내로의 클로닝은 먼저 D1 및 D5 도파민 수용체 PCR 산물 및 pIRESneo 벡터를 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 5' 및 3' 제한 엔도뉴클레아제 부위가 즉시 라이게이션가능하게 함으로써 달성한다. 제조자의 권고 사항에 따라 어드밴티지(AdvantAge)™PCR 클로닝 키트(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로부터의 DNA 리가제를 사용하여 D1 및 D5 도파민 수용체 PCR 산물인 DNA에 pIRESneo 벡터 DNA를 라이게이션시킨다. 이어서 라이게이션된 벡터 및 인서트 제작물(pIRESneo/ D1 및 D5 도파민 수용체)을 사용하여 TOP10F' 컴피턴트(competent) 이. 콜라이 세포(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 형질전환시킨다. 형질전환된 세포를 LB/X-gal/IPTG + 암피실린 함유 한천에 도말한다. 백색 콜로니(양성 클론)를 선발하고 LB 배지에서 개별적으로 배양한다. 플라스미드 DNA를 뉴클레오본드 DNA 정제 시스템(NucleoBond DNA Purification System)(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)을 사용하여 단리한다. 하나 이상의 클론으로부터 유래되는 인서트를 서열 결정하여 D1 및 D5 도파민 수용체의 서열이 정확하다는 것을 보장한다. 안정하게 통합된 머큐리(Mercury) CRE-LUC 플라스미드(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소 재)를 포함하는 HEK293 세포에 올바른 서열의 인서트를 갖는 정제된 pIRESneo/ D1 및 D5 도파민 수용체 DNA를 CalPhos™ 포유류 트랜스펙션 키트(Mammalian Transfection Kit)(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 이용하여 트랜스펙션시킨다. IRESneo/ D1 및 D5 도파민 수용체 DNA로 안정하게 트랜스펙션된 세포는 이 세포를 G418에서 배양함으로써 선발한다. 안정하게 트랜스펙션된 세포(HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/ D1 및 D5 도파민 수용체 세포)를 10% 소 태아 혈청(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재), 페니실린/스트렙토마이신 용액(라이프 테크놀로지즈(Life Technologies), 미국 매릴랜드주 로크빌 소재), L-글루타민(라이프 테크놀로지즈, 미국 매릴랜드주 로크빌 소재), 및 비-필수 아미노산(라이프 테크놀로지즈, 미국 매릴랜드주 로크빌 소재)을 함유하는 DMEM(라이프 테크놀로지즈, 미국 매릴랜드주 로크빌 소재)에서 37℃에서 5% 이산화탄소/95% 공기 분위기에서 증식시킨다. 클론은 실시예 2 및 실시예 3에 설명되어 있는 바와 같이 도파민 수용체에의 노출 후의 CRE-LUC 활성화 및 도파민 수용체 결합 둘 모두에 대하여 특성화한다. 이어서 CRE-LUC 리포터 시스템에 적절하게 커플링된 적절한 수준의 D1 및 D5 도파민 수용체를 발현하는 세포를 추가의 분석에 이용한다.
실시예 2. 수용체 결합 분석
화합물의 수용체 결합 분석은 96웰의 폴리라이신 코팅 플레이트에 실시예 1로부터의 HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/ D1 또는 D5 도파민 수용체 세포를 도말함으로써 전세포(whole cell)에서 수행한다. 세포는 37℃에서 5% 이산화탄소/95% 공기 분위기에서 10% 소 태아 혈청, 페니실린/스트렙토마이신 용액, L-글루타민, 및 비-필수 아미노산을 함유하는 DMEM 배지에 접종하고 하룻밤 배양한다. 배양 배지를 제거하고 적절한 양의 MEM 중 3H-SCH23390(라이프 테크놀로지즈, 미국 매릴랜드주 로크빌 소재) + 10% 씨블록(Seablock)(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)을 첨가한다. 세포를 3H-SCH23390과 함께 실온에서 90분 동안 인큐베이션하고 이어서 마그네슘 및 칼슘이 결여된 인산염 완충 염수(라이프 테크놀로지즈, 미국 매릴랜드주 로크빌 소재)로 4회 세척한다. 최종 세척 후 사이토신트(CytoScint) ES 신틸레이션 유체를 첨가하고(아이씨엔 바이오메디칼, 인크.(ICN Biomedical, Inc.), 미국 캘리포니아주 코스타 메사 소재) 플레이트를 탑카운트(TopCount) NXT 마이크로플레이트 신틸레이션 카운터(Microplate Scintillation Counter)(패커드 인스트루먼트 컴퍼니(Packard Instrument Company), 미국 코네티컷주 메리덴 소재) 상에서 판독한다. 포화 결합 분석에 있어서 10(-12) 내지 10(-3) M 범위의 로그 용량을 세포에 첨가하고 비특이적 결합의 평가를 위하여 포화 농도의 SCH23390의 부재 및 존재 하에서 결합력을 분석한다. 경쟁 결합에 있어서, 다양한 농도의 목적 화합물 외에도, 결합 관점에서 최고치의 절반인 농도의 SCH23390을 첨가한다.
실시예 3. 수용체 활성화 분석
수용체 활성화 분석은 실시예 1의 HEK293/CRE-LUC/pIRESneo/ D1 또는 D5 도파민 수용체 세포를 패커드 뷰 플레이트(Packard View Plate)-96(패커드 인크.(Packard Inc.), 미국 캘리포니아 소재) 내로 접종함으로써 수행한다. 세포를 37℃에서 5% 이산화탄소/95% 공기 분위기에서 10% 소 태아 혈청, 페니실린/스트렙토마이신 용액, L-글루타민 및 비-필수 아미노산을 함유하는 DMEM에 접종하고 하룻밤 배양한다. 이어서 배지를 제거하고 목적 화합물을 함유하는 0.01% 소 알부민 분획 V(시그마(SIGMA), 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 함유 DMEM(라이프 테크놀로지즈, 미국 매릴랜드주 로크빌 소재)으로 대체한다. 이어서 세포를 37℃에서 5% 이산화탄소/95% 공기 분위기에서 4시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 세포를 행스 균형 염 용액(Hanks Balanced Salt Solution)(라이프 테크놀로지즈, 미국 매릴랜드주 로크빌 소재)으로 2회 세척한다. 이어서 용해 시약(프로메가 인크.(Promega Inc.), 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 세척된 세포에 첨가하고 세포를 37℃에서 5% 이산화탄소/95% 공기 분위기에서 20분 동안 인큐베이션한다. 이어서 세포를 -80℃에서 20분 동안 두고 이어서 37℃에서 5% 이산화탄소/95% 공기 분위기에서 20분 동안 인큐베이션한다. 이 인큐베이션 후 루시퍼라제 분석용 완충제(Luciferase Assay Buffer) 및 루시퍼라제 분석용 기질(Luciferase Assay Substrate)(프로메가 인크., 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 세포 용해물에 첨가하고 화학 발광 측정기(luminometer)를 사용하여 루시퍼라제 활성을 정량화한다. 화합물의 상대적인 활성은 화합물에의 노출 후의 증가치를 화합물에의 노출 후의 D1 및 D5 도파민 수용체를 포함하지 않는 CRE-LUC 제작물을 포함하는 HEK 세포에서의 루시퍼라제의 수준과 비교함으로써 평가한다. 응답 특이성은 또한 10배 과량의 D1 및 D5 도파민 수용체 길항제의 존재 및 부재 하에서 화합물에 대한 D1 및 D5 도파민 수용체/CRE-LUC HEK 세포의 루시퍼라제 응답을 평가함으로써 체크한다.
실시예 4. D 1 또는 D 5 도파민 수용체 및/또는 D 1 및 D 5 도파민 수용체 신호 전송 경로의 활성화를 연장 또는 증대시키는 후보 화합물의 동정을 위한 스크린.
D1 또는 D5 도파민 수용체 또는 D1 및 D5 도파민 수용체 신호 전송 경로의 작용제-유도성 활성화를 연장 또는 증대시키는 화합물의 동정은 실시예 3에 설명되어 있는 수용체 활성화 분석법의 변형법을 포함한다. 구체적으로는 이 분석은 HEK293/ CRE-LUC/pIRESneo/D1 및 D5 도파민 수용체 세포를 패커드 뷰 플레이트-96(패커드 인크., 미국 캘리포니아 소재) 내로 접종함으로써 수행한다. 세포는 37℃에서 5% 이산화탄소/95% 공기 분위기에서 10% 소 태아 혈청, 페니실린/스트렙토마이신 용액, L-글루타민, 비-필수 아미노산, 및 포화량의 도파민 수용체를 함유하는 DMEM에 접종하고 48시간 동안 배양한다. 이어서 배지를 제거하고 목적 화합물 외에도 0.01% 소 알부민 분획 V(시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 및 SKF81297를 함유하는 DMEM (라이프 테크놀로지즈, 미국 매릴랜드주 로크빌 소재)으로 대체한다. 이어서 세포를 37℃에서 5% 이산화탄소/95% 공기 분위기에서 4시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 세포를 행스 균형 염 용액(라이프 테크놀로지즈, 미국 매릴랜드주 로크빌 소재)으로 2회 세척한다. 이어서 용해 시약(프로메가 인크., 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 세척된 세포에 첨가하고 세포를 37℃에서 5% 이산화탄소/95% 공기 분위기에서 20분 동안 인큐베이션한다. 이어서 세포를 -80℃ 에서 20분 동안 두고 이어서 37℃에서 5% 이산화탄소/95% 공기 분위기에서 20분 동안 인큐베이션한다. 이 인큐베이션 후 루시퍼라제 분석용 완충제 및 루시퍼라제 분석용 기질(프로메가 인크., 미국 위스콘신주 매디슨 소재)을 세포 용해물에 첨가하고 화학 발광 측정기를 사용하여 루시퍼라제 활성을 정량화한다. 세포 밀도에서의 변이에 대한 보정 후 미처리 대조 세포의 수준보다 유의하게 높게 형광성을 촉진하는 시험 화합물은 골격근의 질량 또는 기능의 조절을 위한 후보 화합물로 간주한다. 가장 흥미로운 화합물은 비교적 높은 수준의 형광성을 유도하는 것이다.
실시예 5. D 1 또는 D 5 도파민 수용체 발현을 증가시키는 후보 화합물의 동정을 위한 스크린
적절한 조직에 있어서 D1 또는 D5 도파민 수용체 유전자의 생리학적 발현에 필요한 모든 조절 요소를 포함하도록 전사 개시 부위의 충분히 먼 상류에서 시작되는 D1 또는 D5 도파민 수용체 유전자의 프로모터 영역을 포함하는 서열을 인간 게놈 데이터베이스로부터 검색한다. 프로모터 영역의 5' 말단을 포함하는 것(5' 올리고뉴클레오티드)과 전사 시작 부위를 포함하는 프로모터 영역의 3' 말단을 포함하는 것(3' 올리고뉴클레오티드)의 2개의 올리고뉴클레오티드를 합성한다. 이들 올리고뉴클레오티드는 또한 5' 올리고뉴클레오티드 중의 하나의 특유한 부위 및 3' 올리고뉴클레오티드 중의 상이한 특유의 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 D1 또는 D5 도파민 수용체 유전자 조절 영역에는 존재하지 않는 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함한다. 5' 및 3' 올리고뉴클레오티드를 PCR 키트, 어드밴티지(Advantage)(등록상표) 게노믹(Genomic) PCR 키트(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 사용하여 인간 DNA(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로부터 유래되는 D1 또는 D5 도파민 수용체 유전자 조절 영역의 PCR 증폭에 사용한다. D1 및 D5 도파민 수용체유전자 조절 영역 PCR 산물은 아가로스 겔 전기영동으로 PCR 인공물로부터 정제하고 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자 조절 영역 DNA 단편은 뉴클레오트랩(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)과 같은 정제 제품을 사용하여 아가로스 겔로부터 정제한다. D1 및 D5 도파민 수용체 유전자 조절 영역 PCR 산물의 pECFP-1 벡터(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재) 내로의 클로닝은 먼저 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자 조절 영역 PCR 산물 및 pECFP-1 벡터를 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 5' 및 3' 제한 엔도뉴클레아제 부위가 즉시 라이게이션가능하도록 함으로써 달성한다. pECFP-1 벡터 DNA를 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자 조절 영역 PCR 산물 DNA에 라이게이션하는 것은 제조자의 권고 사항에 따라 어드밴티지™PCR 클로닝 키트 (클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로부터의 DNA 리가제를 사용하여 달성한다. 이어서 라이게이션된 벡터 및 인서트 제작물을 사용하여 TOP10F' 컴피턴트 이. 콜라이 세포(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 형질전환시킨다. 세포를 LB + 카나마이신 함유 한천 상에 도말하고 카나마이신 내성 콜로니를 추가의 분석을 위하여 선 발한다. 카나마이신 내성 클론을 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 배양하고 플라스미드 DNA를 뉴클레오본드(NucleoBond) DNA 정제 시스템(Purification System)(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)을 사용하여 단리하고 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자 조절 영역을 포함하는 제작물을 DNA 서열 결정으로 분석하여 제작물의 정확성 및 온전성을 보장한다. 이어서 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자 조절 영역을 포함하는 정제된 제작물 플라스미드 DNA를 칼포스(CalPhos)™ 포유류 트랜스펙션 키트(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 이용하여 인산칼슘 - 매개된 트랜스펙션법을 이용하여 HEK293 세포 내로 트랜스펙션시킨다. 트랜스펙션된 세포 클론을 G418을 사용하여 선발하고, 단리하고 10% 소 태아 혈청(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재), 페니실린/스트렙토마이신 용액(라이프 테크놀로지즈, 미국 매릴랜드주 로크빌 소재), L-글루타민(라이프 테크놀로지즈, 미국 매릴랜드주 로크빌 소재), 비-필수 아미노산(라이프 테크놀로지즈, 미국 매릴랜드주 로크빌 소재) 및 G418(라이프 테크놀로지즈, 미국 매릴랜드주 로크빌 소재)을 함유하는 DMEM(라이프 테크놀로지즈, 미국 매릴랜드주 로크빌 소재) 에서 37℃에서 5% 이산화탄소/95% 공기 분위기에서 증식시킨다. G418 내성 클론은 서던(Southern) 블로팅으로 특성화하여 이들이 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자 프로모터 서열을 포함한다는 것을 보장하며, 또한 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자 조절 영역의 활성화는 적절한 자극제를 사용하여 분석한다. 이어서 하기와 같이 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자 조절 영역-ECFP를 적절한 수준으로 발현하는 세포를 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자 조절 영역의 활성을 조정할 수 있는 화합물의 평가를 위하여 고안된 분석에 사용한다. 조절 영역 활성화 분석은 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자 조절 영역-ECFP 함유 HEK293 세포를 기저부가 투명한 블랙 96 웰 마이크로타이터 플레이트 내로 적절한 밀도로 접종함으로써 수행하고 하룻밤 배양한다. 다음날 배지를 제거하고 시험 화합물을 신선한 성장 배지에 첨가한다. 세포를 37℃에서 5% 이산화탄소/95% 공기 분위기에서 16시간 동안 배양하고 이어서 형광계(바이오루민(biolumin)™ 960, 몰레큘러 다이내믹스(Molecular Dynamics)/애머샴 파마시아 바이오테크(Amersham Pharmacia Biotech), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 사용하여 470 (501) ㎚에서의 방출량을 검출함으로써 형광성을 측정한다(433 (453) ㎚에서의 여기). 세포 밀도에서의 변이에 대한 보정 후 미처리 대조 세포의 수준보다 유의하게 높게 형광성을 촉진하는 시험 화합물은 골격근의 질량 또는 기능의 조절을 위한 후보 화합물로 간주한다. 가장 흥미로운 화합물은 비교적 높은 수준의 형광성을 유도하는 것이다.
실시예 6. D 1 및 D 5 도파민 수용체를 활성화시키는 인간 항체의 제조 방법.
D1 및 D5 도파민 수용체를 활성화시키는 완전한 인간 단일클론 항체는 하기와 같이 먼저 재조합 D1 및 D5 도파민 수용체 단백질을 생성함으로써 제조한다. 실시예 1의 절차에 따라 D1 및 D5 도파민 수용체 PCR 산물을 수득한다. 이어서 이 D1 및 D5 도파민 수용체 PCR 산물을, 먼저 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자 PCR 산물 및 pHAT20 벡터를 적절한 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 5' 및 3' 제한 엔도뉴클레아제 부위가 즉시 라이게이션가능해지도록 함으로써 pHAT20 벡터(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재) 내로 클로닝한다. pHAT20 벡터 DNA를 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자 PCR 산물 DNA에 라이게이션하는 것은 제조자의 권고 사항에 따라 어드밴티지™PCR 클로닝 키트(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)로부터의 DNA 리가제를 사용하여 달성한다. 이어서 라이게이션된 벡터/인서트 제작물을 사용하여 TOP10F' 컴피턴트 이. 콜라이 세포(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 형질전환시킨다. 형질전환된 세포를 LB + 암피실린 함유 한천에 도말하고 암피실린 내성 콜로니를 추가의 분석을 위하여 선발한다. 양성 클론을 암피실린을 함유하는 LB 배지에서 배양하고 플라스미드 DNA를 뉴클레오본드 DNA 정제 시스템(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)을 사용하여 단리하고 D1 및 D5 도파민 수용체 유전자를 포함하는 제작물을 DNA 서열 결정으로 분석하여 제작물의 정확성 및 온전성을 보장한다. 이어서 HAT 서열의 시작 부분(beginning)을 포함하는 5' 올리고뉴클레오티드와 D1 및 D5 도파민 수용체-pHAT20 제작물에 존재하지 않는 특유한 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 이전에 이용된 3' D1 및 D5 도파민 수용체 올리고뉴클레오티드의 이용에 의한 추가의 PCR 클로닝에 D1 및 D5 도파민 수용체-pHAT20 벡터 DNA를 사용한다. 올리고뉴클레오티 드 프라이머들을 사용하여 D1 및 D5 도파민 수용체-pHAT20 제작물로부터 HAT- D1 및 D5 도파민 수용체 융합 유전자를 PCR 증폭시키고 PCR 산물을 상기한 바와 같이 정제한다. 이어서 HAT-D1 및 D5 도파민 수용체 융합 유전자 PCR 산물을, 클론테크로부터의 BacPAK 바큘로바이러스(Baculovirus) 발현 시스템(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)을 사용한 pBacPAK8 벡터 내로의 클로닝에 이용한다. HAT-- D1 및 D5 도파민 수용체 융합 유전자의 pBacPAK8 벡터 내로의 라이게이션은 본질적으로 상기한 바와 같다. 이어서 D1 및 D5 도파민 수용체/HAT-pBacPAK8 제작물을 TOP10'F 컴피턴트 이. 콜라이 세포 내로 트랜스펙션시키고, 암피실린 내성 세포를 선발하고 플라스미드 DNA를 단리하며 상기와 같이 제작물의 온전성에 대하여 체크한다. 이어서 칼포스™ 포유류 트랜스펙션 키트(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 이용하여 이 제작물을 선형화 BacPAK6 DNA와 함께 Sf21 곤충 숙주 세포 내로 공동 트랜스펙션시킨다. 이어서 곤충 세포를 2-3일 동안 배양하고 이어서 개개의 투명 플라크로부터 바이러스를 수확한다. 이어서 바이러스를 Sf21 세포에서 증폭시키고, 수확한 바이러스의 역가를 측정하고, 역가를 측정한 바이러스를 BacPAK 곤충 세포 배지를 이용한 Sf21 세포의 대규모 감염에 사용하는데, 이 모두는 제조자의 권고 사항에 따른 것이다(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재). 이어서 재조합 HAT-D1 및 D5 도파민 수용체 융합 단백질을, 제조자가 권고하는 조건을 사용하여 클론테크로부터의 탈론(TALON)(등록상표) 셀쓰 루(CellThru) 정제 키트(클론테크 인크., 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)를 사용하여 정제한다. 간략하게는 감염된 Sf21 세포를 감염시킨지 48시간 후에 수확하고 추출/적하 완충제에서 초음파 처리한다. 이어서 세포 용해물을 탈론(등록상표) 셀쓰루 컬럼에 통과시킨다. 컬럼을 추출/적하 완충제로 2회 세척하고 결합된 HAT- D1 및 D5 도파민 수용체 단백질을 용출 완충제로 용출시킨다. 용출된 단백질을 SDS-PAGE로 온전성에 대하여 분석하고 단백질 농도를 제조자의 권고 사항에 따라 바이오-라드(Bio-Rad) SDS-PAGE 시스템 및 단백질 정량화 시스템(바이오-라드 래브러토리즈(Bio-Rad Laboratories), 미국 캘리포니아주 헤라클레스 소재)을 사용하여 정량화한다. 이어서 하기와 같이 정제된 HAT- D1 및 D5 도파민 수용체 융합 단백질을 인간 단일클론 항체 제조를 위한 제노생쥐(XenoMouse) 동물(압게닉스 인크.(Abgenix Inc.), 미국 캘리포니아주 프레몬트 소재)의 면역화에 사용한다. 25 ㎍의 아쥬반트(adjuvant) 모노포스포릴 지질 A(시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)와 조합된 10 ㎍의 정제된 재조합 HAT- D1 및 D5 도파민 수용체 융합 단백질을 사용하여 10마리의 제노생쥐 동물에게 8주의 기간에 걸쳐 다수회 백신 접종을 하였다. 혈청을 백신 접종 동물로부터 수득하고 정제된 HAT- D1 및 D5 도파민 수용체 융합 단백질을 이용하는 항원 포획 ELISA에서 이용하여, 폴리스티렌 ELISA 플레이트(코닝 글래스 웍스(Corning Glass Works), 미국 뉴욕주 코닝 소재)를 HAT-D1 및 D5 도파민 수용체 융합 단백질로 코팅하고, PBS-1% BSA로 차단하고, 세척하고 37℃ 에서 1시간 동안 1:50으로 희석시킨 혈청 샘플과 함께 인큐베이션함으로써 HAT- D1 및 D5 도파민 수용체 단백질에 대한 항체를 검출한다. PBS로 5회 세척한 후 플레이트를 인간 면역글로불린 G에 대한 알칼리 포스파타제-콘쥬게이션된 염소 항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다. 이어서 플레이트를 PBS로 5회 세척하고 항체를 완충제 중 p-니트로페닐 포스페이트 기질(시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재)로 검출한다. 405 ㎚에서의 흡광도를 플레이트 판독기를 사용하여 측정하고 신호를 정량화한다. 높은 항체 생성이 입증된 생쥐를 하이브리도마 형성에 사용한다. 하이브리도마는 30% 폴리에틸렌 글리콜 PEG1450의 존재 하에 NSA-bcl2 세포데하여 4:1의 비의 비장 세포를 사용하여 제노생쥐 동물로부터 유래되는 비장 세포를 비분비 골수종 세포주 NSA-bcl 2와 융합시킴으로써 생성한다. 융합된 세포는 96웰 플레이트 내로의 희석의 제한에 의해 개별적으로 클로닝하고 10% 소 태아 혈청, 비필수 아미노산, 피루브산나트륨, L-글루타민, 100 u/ml의 페니실린/스트렙토마이신 및 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘을 함유하는 RPMI-1640 배지(모두 라이프 테크놀로지즈제, 미국 매릴랜드주 로크빌 소재)에서 배양한다. 하이포잔틴-아미노프테린-티미딘 선발 하이브리도마로부터 유래되는 상청액에 있어서 인간 항체 생성을 전술한 바와 같이 ELISA로 스크리닝하였다. HAT- D1 및 D5 도파민 수용체 융합 단백질에 대한 인간 항체를 생성하는 하이브리도마를 대규모 항체 생성에 대하여 선발한다. 단일클론 항체를 단백질 G-세파로스(Protein G-Sepharose) 크로마토그래피로 정제한다. 간략하게는 적하 완충제 중 배양된 하이브리도마 클론으로부터 유래되는 상청액을 단백질 G-세파로스 컬럼(시그마, 미국 미주리주 세인트 루이스 소재) 상으로 적하하고, 3회 세척하고 IgG를 용출 완충제로 용출시킨다. 이어서 이 항체를 스크리닝에 사용하여 D1 및 D5 도파민 수용체 활성화(작용 효과(agonism)) 잠재력을 평가한다. 이는 실시예 3에 약술되어 있는 방법을 사용하여 달성한다. D1 및 D5 도파민 수용체에 대하여 작용제 활성을 보여주는 인간 단일클론 항체는 후보 화합물로 나타낸다.
실시예 7. 근육의 절대 힘 측정치의 측정.
장지신근(extensor digitorum longus, EDL) 및 가자미근(soleus muscle)을 힘줄에서 힘줄까지 깁스한 생쥐 다리로부터 제거한다. 단리된 근육의 각각의 힘줄에 견봉합사를 묶고 25℃에서 유지되는 95% 산소/5% 이산화탄소로 끊임없이 버블링되는 링거액(Ringer solution)(137 mM의 염화나트륨, 24 mM의 중탄산나트륨, 11 mM의 글루코스, 5 mM의 염화칼륨, 1 mM의 황산마그네슘, 1 mM의 인산나트륨, 0.025 mM의 투보쿠라린, 모두 pH 7.4이며 95% 산소/5% 이산화탄소로 산소 처리함)으로 충전된 플렉시글래스(plexiglass) 챔버 내에 둔다. 근육을 서보모터 레버 암(servomotor lever arm)(미국 매사추세츠주 워터타운 소재의 캠브리지 테크놀로지 인크.(Cambridge Technology Inc.)의 모델 305B-LR)과 힘 변환기(미국 뉴저지주 레오니아 소재의 쿨라이트 세미컨덕터 프로덕츠 인크.(Kulite Semiconductor Products Inc.)의 모델 BG-50)의 스테인레스 강 후크 사이에 수평으로 정렬하고 근육의 어느 한 측면에 종방향으로 위치된 2개의 백금 전극들 사이로 전달되는 펄스 에 의해 전계 자극(field stimulated)된다. 랩뷰(Labview) 보드(미국 텍사스주 오스틴 소재의 랩뷰 인크.(Labview Inc.)의 모델 PCI-MIO 16E-4)를 갖는 퍼스널 컴퓨터에 의해 생성되는 구형파 펄스(0.2 ms의 지속 시간)를 증폭시켜(미국 뉴욕주 돕스 페리 소재, 아쿠루스(Acurus) 전력 증폭기 모델 A25) 거대 수축을 증가시킨다. 자극 전압 및 근육 길이(Lo)를 조정하여 최대 등척성 연축력(isometric twitch force)을 얻는다. 최대의 거대 힘 생성(Po)은 주파수-힘 관계의 평탄역(plateau)으로부터 결정한다.
실시예 8. D 1 및 D 5 도파민 수용체의 작용제인 인간 항체를 사용한 골격근 위축의 치료적 치료.
체중이 50 ㎏이며 침상 안정의 연장으로 인하여 팔 및 다리에 상당한 근육 위축이 있는 인간 남성 대상을 골격근 위축이 반대가 되게 하기 위하여 치료한다. 3개월의 기간 동안 매주 1회, D1 및 D5 도파민 수용체의 활성화 항체를 함유하는 pH 6의 수성 용액 15 ㎖를 정맥내 주사를 통하여 대상에게 투여한다. 이 용액은 하기를 함유한다:
성분 농도(㎎/㎖)
도파민 수용체 활성화 항체 20
L-히스티딘 HCl 0.47
L-히스티딘 0.3
α, α-트레할로스 이수화물 20
폴리소르베이트20 0.1
정균성 살균수 1 ㎖가 되게 하는 적당량
치료 기간의 마지막에 환자는 팔 및 다리의 근육 질량, 강도 및 이동성의 측정가능한 증가를 나타낸다.
실시예 9. D 1 및 D 5 도파민 수용체의 작용제인 인간 항체를 사용한 골격근 위축의 예방적 치료.
체중이 55 ㎏인 인간 여성 대상을 1개월 후에 고관절 대체 수술을 할 예정이다. 이 대상을, 수술 이전 및 수술 후의 골격근 질량을 향상시켜 수술 후 회복 동안의 근육 불용으로 인한 골격근 위축의 수준을 궁극적으로 감소시키기 위하여 치료한다. 구체적으로는 수술 이전 1개월의 기간 동안, 그리고 수술 후 2개월 동안 매주 1회, D1 및 D5 도파민 수용체의 활성화 항체를 함유하는 pH 6.0의 수성 용액 18 ㎖를 정맥내 주사를 통하여 대상에게 투여한다. 이 용액은 하기를 함유한다:
성분 농도(㎎/㎖)
도파민 수용체 활성화 항체 20
L-히스티딘 HCl 0.47
L-히스티딘 0.3
α, α-트레할로스 이수화물 20
폴리소르베이트 20 0.1
정균성 살균수 1 ㎖가 되게 하는 적당량
치료 기간의 마지막에 대상은 항체 요법이 없을 경우의 대상의 기대되는 상태에 비하여 팔 및 다리의 근육 질량, 강도 및 이동성의 측정가능한 보존을 나타낸다.
실시예 10. D 1 및 D 5 도파민 수용체의 작용제인 인간 항체를 사용한 골격근 위축의 예방적 치료.
체중이 45 ㎏인 인간 여성 대상에게 낙상 후 상완골의 단순 골절의 치료를 위하여 깁스 절차를 받게 한다. 대상을 골절 치유 동안의 제한된 사용 및 불용으로 인한 영향을 받은 팔 및 어깨의 골격근의 위축을 예방하기 위하여 치료한다. 구체적으로는 깁스일로부터 시작하여 매주 1회, 항-D1 및 D5 도파민 수용체 활성화 항체를 함유하는 pH 6.0의 용액 13 ㎖을 정맥내 주사를 통하여 대상에게 투여한다. 이 용액은 하기를 함유한다:
성분 농도(㎎/㎖)
도파민 수용체 활성화 항체 20
L-히스티딘 HCl 0.47
L-히스티딘 0.3
α, α-트레할로스 이수화물 20
폴리소르베이트 20 0.1
정균성 살균수 1 ㎖가 되게 하는 적당량
치료 기간의 마지막에 대상은 항체 요법이 없는 경우의 대상의 기대되는 상태 및 후속 치료에 비하여 물리 치료(physical therapy) 코스의 감소 및 영향을 받은 팔과 어깨의 근육 질량, 강도 및 이동성의 측정가능한 보존을 나타낸다.
실시예 11. 페놀도팜(Fenoldopam)을 사용한 골격근 위축의 예방적 치료
체중이 60 ㎏인 인간 여성 대상이 혼수 상태로 병원에 들어온다. 대상을 이 방법으로 치료하여 혼수 상태에서의 불용으로 인한 전신의 골격근의 위축을 예방한다. 구체적으로는 혼수 상태 동안 매일 1회, 대상에게 5 ㎖의 하기 원액을 500 ㎖의 살균 염수에 첨가함으로써 제조하는 대략 500 ㎖의 수성 용액을 느린 정맥내 주입을 통하여 투여한다:
성분 농도(㎎/㎖)
페놀도팜 12
인산나트륨 완충제, Ph 7.4 140
치료의 결과로서 약물 치료를 하지 않은 대상의 상태에 비하여 대상은 골격근의 질량 및 기능의 측정가능한 보존, 및 혼수 상태 동안, 그리고 의식을 회복한 후의 물리 치료의 필요성 감소를 나타낸다.
실시예 12. 페놀도팜을 사용한 듀센형(Duchenne) 근이영양증을 앓고 있는 환자의 치료적 치료
듀센형 근이영양증인 것으로 기존에 진단된 체중 40 ㎏의 남성 대상을, 이 질환의 진행에 걸쳐 근육 강도 및 기능의 개선 또는 유지를 위하여 서방형의 저장 제형의 페놀도팜형으로 치료한다. 구체적으로는 매월 1회, 대상에게 하기를 함유하는 pH 6.0의 수성 용액 3 ㎖를 근육내 주사를 통하여 투여한다:
성분 농도(㎎/㎖)
페놀도팜 4
D,L 락트산 및 글리콜산 공중합체 5
치료의 결과로서, 대상은 이 질환의 자연적인 진행 동안 나타나는 것에 비하여 시한-기능 평가에 있어서 근육 강도 또는 근육 기능의 저하의 개선 또는 감쇠를 경험하게 된다.
본 발명은 본 발명의 개별적인 태양을 단지 예시하려는 기술된 특정 실시 형태에 의하여 그 범주가 제한되는 것은 아니며, 기능적으로 동등한 방법 및 구성 요소는 본 발명의 범주 이내이다. 이는 시험 동물의 종, 도파민 수용체 작용제의 성질 및 유형, 동물의 성별, 위축 모델, 유전적 방법을 포함하는 도파민 수용체의 활성화 방법 등을 포함하지만 그에 한정되는 것은 아니다. 전술한 상세한 설명 및 첨부된 도면을 읽어보면 본 명세서에 예시되고 기술되어 있는 것 외에도 본 발명의 다양한 변경이 당업자에게 자명해질 것이다. 그러한 변경은 첨부된 청구의 범위의 범주 이내이다.
<110> The Procter & Gamble Company Isfort, Robert Sheldon, Russell <120> Methods for Identifying Compounds for Regulationg Muscle Mass or Function Using Dopamine Receptors <130> 8448M <140> Not Yet assigned <141> 2002-11-18 <150> 60/349,620 <151> 2002-07-01 <160> 32 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 2342 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (277)..(1614) <400> 1 gaattcaggg gctttctggt gcccaagaca gtgacctgca gcaagggagt cagaagacag 60 atgtagaaat caagagtgac catccacggg attgacttgg attgccactc aagcggtcct 120 ctcatggaat gttggtgagg ccctctgcca gggaagcaat ctggctgtgc aaagtgctgc 180 ctggtgggga ggactcctgg aaatctgact gacccctatt ccctgcttag gaacttgagg 240 ggtgtcagag cccctgatgt gctttctctt aggaag atg agg act ctg aac 291 Met Arg Thr Leu Asn 1 5 acc tct gcc atg gac ggg act ggg ctg gtg gtg gag agg gac ttc tct 339 Thr Ser Ala Met Asp Gly Thr Gly Leu Val Val Glu Arg Asp Phe Ser 10 15 20 gtt cgt atc ctc act gcc tgt ttc ctg tcg ctg ctc atc ctg tcc acg 387 Val Arg Ile Leu Thr Ala Cys Phe Leu Ser Leu Leu Ile Leu Ser Thr 25 30 35 ctc ctg ggg aac acg ctg gtc tgt gct gcc gtt atc agg ttc cga cac 435 Leu Leu Gly Asn Thr Leu Val Cys Ala Ala Val Ile Arg Phe Arg His 40 45 50 ctg cgg tcc aag gtg acc aac ttc ttt gtc atc tcc ttg gct gtg tca 483 Leu Arg Ser Lys Val Thr Asn Phe Phe Val Ile Ser Leu Ala Val Ser 55 60 65 gat ctc ttg gtg gcc gtc ctg gtc atg ccc tgg aag gca gtg gct gag 531 Asp Leu Leu Val Ala Val Leu Val Met Pro Trp Lys Ala Val Ala Glu 70 75 80 85 att gct ggc ttc tgg ccc ttt ggg tcc ttc tgt aac atc tgg gtg gcc 579 Ile Ala Gly Phe Trp Pro Phe Gly Ser Phe Cys Asn Ile Trp Val Ala 90 95 100 ttt gac atc atg tgc tcc act gca tcc atc ctc aac ctc tgt gtg atc 627 Phe Asp Ile Met Cys Ser Thr Ala Ser Ile Leu Asn Leu Cys Val Ile 105 110 115 agc gtg gac agg tat tgg gct atc tcc agc cct ttc cgg tat gag aga 675 Ser Val Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Ser Ser Pro Phe Arg Tyr Glu Arg 120 125 130 aag atg acc ccc aag gca gcc ttc atc ctg atc agt gtg gca tgg acc 723 Lys Met Thr Pro Lys Ala Ala Phe Ile Leu 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Val Glu Cys Ser Gln Pro Glu Ser Ser Phe Lys 250 255 260 atg tcc ttc aaa aga gaa act aaa gtc ctg aag act ctg tcg gtg atc 1107 Met Ser Phe Lys Arg Glu Thr Lys Val Leu Lys Thr Leu Ser Val Ile 265 270 275 atg ggt gtg ttt gtg tgc tgt tgg cta cct ttc ttc atc ttg aac tgc 1155 Met Gly Val Phe Val Cys Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Leu Asn Cys 280 285 290 att ttg ccc ttc tgt ggg tct ggg gag acg cag ccc ttc tgc att gat 1203 Ile Leu Pro Phe Cys Gly Ser Gly Glu Thr Gln Pro Phe Cys Ile Asp 295 300 305 tcc aac acc ttt gac gtg ttt gtg tgg ttt ggg tgg gct aat tca tcc 1251 Ser Asn Thr Phe Asp Val Phe Val Trp Phe Gly Trp Ala Asn Ser Ser 310 315 320 325 ttg aac ccc atc att tat gcc ttt aat gct gat ttt cgg aag gca ttt 1299 Leu Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Asp Phe Arg Lys Ala Phe 330 335 340 tca acc ctc tta gga tgc tac aga ctt tgc cct gcg acg aat aat gcc 1347 Ser Thr Leu Leu Gly Cys Tyr Arg Leu Cys Pro Ala Thr Asn Asn Ala 345 350 355 ata gag acg gtg agt atc aat aac aat ggg gcc gcg atg ttt tcc agc 1395 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ggggagccat aagggacatg tctttggctt cagaattgtt tttagaaatt 1880 tattcttatc ttaggattta ccaaataggg caaagaatca acagtgaaca gcttcactta 1940 aaatcaaatt tttctgggaa gaaaatgaga tgggttgagt ttgctgtata caaacaggtg 2000 ctaacactgt tcccagcaaa gttttcagat tgtaaaggta ggtgcatgcc ttcataaatt 2060 atttctaaaa cattaattga ggcttacagt aggagtgaga aatttttttc cagaattgag 2120 agatgttttg ttgatattgg ttctatttat ttattgtata tatggatatt tttaatttat 2180 gatataataa atatatattt atcatattta ataggataaa ttaatgagtt ttatccaaga 2240 ccttacaacc acatttctgg ccatttaact agcactttat aagccaatga agcaaacaca 2300 cagactctgt gagattctaa atgttcatgt gtaacttcta ga 2342 <210> 2 <211> 446 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Thr Leu Asn Thr Ser Ala Met Asp Gly Thr Gly Leu Val Val 1 5 10 15 Glu Arg Asp Phe Ser Val Arg Ile Leu Thr Ala Cys Phe Leu Ser Leu 20 25 30 Leu Ile Leu Ser Thr Leu Leu Gly Asn Thr Leu Val Cys Ala Ala Val 35 40 45 Ile Arg Phe Arg His Leu Arg Ser Lys Val Thr Asn Phe Phe Val Ile 50 55 60 Ser Leu Ala Val Ser Asp Leu Leu Val Ala Val 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atc tcc agc cct ttc cgg tat gag aga 672 Ser Val Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Ser Ser Pro Phe Arg Tyr Glu Arg 120 125 130 aag atg acc ccc aag gca gcc ttc atc ctg atc agt gtg gca tgg acc 720 Lys Met Thr Pro Lys Ala Ala Phe Ile Leu Ile Ser Val Ala Trp Thr 135 140 145 ttg tct gta ctc atc tcc ttc atc cca gtg cag ctc agc tgg cac aag 768 Leu Ser Val Leu Ile Ser Phe Ile Pro Val Gln Leu Ser Trp His Lys 150 155 160 165 gca aaa ccc aca agc ccc tct gat gga aat gcc act tcc ctg gct gag 816 Ala Lys Pro Thr Ser Pro Ser Asp Gly Asn Ala Thr Ser Leu Ala Glu 170 175 180 acc ata gac aac tgt gac tcc agc ctc agc agg aca tat gcc atc tca 864 Thr Ile Asp Asn Cys Asp Ser Ser Leu Ser Arg Thr Tyr Ala Ile Ser 185 190 195 tcc tct gta ata agc ttt tac atc cct gtg gcc atc atg att gtc acc 912 Ser Ser Val Ile Ser Phe Tyr Ile Pro Val Ala Ile Met Ile Val Thr 200 205 210 tac acc agg atc tac agg att gct cag aaa caa ata cgg cgc att gcg 960 Tyr Thr Arg Ile Tyr Arg Ile Ala Gln Lys Gln Ile Arg Arg Ile Ala 215 220 225 gcc ttg gag agg gca gca gtc cac gcc aag aat tgc cag acc acc aca 1008 Ala Leu Glu Arg Ala Ala Val His Ala Lys Asn Cys Gln Thr Thr Thr 230 235 240 245 ggt aat gga aag cct gtc gaa tgt tct caa ccg gaa agt tct ttt aag 1056 Gly Asn Gly Lys Pro Val Glu Cys Ser Gln Pro Glu Ser Ser Phe Lys 250 255 260 atg tcc ttc aaa aga gaa act aaa gtc ctg aag act ctg tcg gtg atc 1104 Met Ser Phe Lys Arg Glu Thr Lys Val Leu Lys Thr Leu Ser Val Ile 265 270 275 atg ggt gtg ttt gtg tgc tgt tgg cta cct ttc ttc atc ttg aac tgc 1152 Met Gly Val Phe Val Cys Cys Trp Leu Pro Phe Phe Ile Leu Asn Cys 280 285 290 att ttg ccc ttc tgt ggg tct ggg gag acg cag ccc ttc tgc att gat 1200 Ile Leu Pro Phe Cys Gly Ser Gly Glu Thr Gln Pro Phe Cys Ile Asp 295 300 305 tcc aac acc ttt gac gtg ttt gtg tgg ttt ggg tgg gct aat tca tcc 1248 Ser Asn Thr Phe Asp Val Phe Val Trp Phe Gly Trp Ala Asn Ser Ser 310 315 320 325 ttg aac ccc atc att tat gcc ttt aat gct gat ttt cgg aag gca ttt 1296 Leu Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Asp Phe Arg Lys Ala Phe 330 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Val Phe His Lys Glu Ile Ala Ala Ala Tyr Ile His Met Met Pro Asn 405 410 415 gcc gtt acc ccc ggc aac cgg gag gtg gac aac gac gag gag gag ggt 1296 Ala Val Thr Pro Gly Asn Arg Glu Val Asp Asn Asp Glu Glu Glu Gly 420 425 430 cct ttc gat cgc atg ttc cag atc tat cag acg tcc cca gat ggt gac 1344 Pro Phe Asp Arg Met Phe Gln Ile Tyr Gln Thr Ser Pro Asp Gly Asp 435 440 445 cct gtt gct gag tct gtc tgg gag ctg gac tgc gag ggg gag att tct 1392 Pro Val Ala Glu Ser Val Trp Glu Leu Asp Cys Glu Gly Glu Ile Ser 450 455 460 tta gac aaa ata aca cct ttc acc ccg aat gga ttc cat taa 1434 Leu Asp Lys Ile Thr Pro Phe Thr Pro Asn Gly Phe His 465 470 475 <210> 8 <211> 477 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Leu Pro Pro Gly Ser Asn Gly Thr Ala Tyr Pro Gly Gln Phe Ala 1 5 10 15 Leu Tyr Gln Gln Leu Ala Gln Gly Asn Ala Val Gly Gly Ser Ala Gly 20 25 30 Ala Pro Pro Leu Gly Pro Ser Gln Val Val Thr Ala Cys Leu Leu Thr 35 40 45 Leu Leu Ile Ile Trp Thr Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Cys Ala Ala 50 55 60 Ile Val Arg Ser 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tcaagaccct gtcggtgatc atgggggtct tcgtgtgttg ctggctgccc ttcttcatcc 1090 ttaactgcat ggtccctttc tgcagtggac accctgaagg ccctccggcc ggcttcccct 1150 gcgtcagtga gaccaccttc gacgtcttcg tctggttcgg ctgggctaac tcctcactca 1210 accccgtcat ctatgccttc aacgccgact ttcagaaggt gtttgcccag ctgctggggt 1270 cgagccactt ctgctcccgc acgccggtgg agacggtgaa catcagcaat gagctcatct 1330 cctacaacca agacatcgtc ttccacaagg aaatcgcagc tgcctacatc cacatgatgc 1390 ccaacgccgt tacccccggc aaccgggagg tggacaacga cgaggaggag ggtcctttcg 1450 atcgcatgtt ccagatctat cagacgtccc cagatggtga ccctgttgct gagtctgtct 1510 gggagctgga ctgcgagggg gagatttctt tagacaaaat aacacctttc accccgaatg 1570 gattccatta aactgcatta agaaaccccc tcatggatct gcataaccgc acagacactg 1630 acaagcacgc acacacacgc aaatacatgc ctttccagta ctg 1673 <210> 12 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Met Leu Pro Pro Gly Ser Asn Gly Thr Ala Tyr Pro Gly Gln Phe Ala 1 5 10 15 Leu Tyr Gln Gln Leu Ala Gln Gly Asn Ala Val Gly Gly Ser Ala Gly 20 25 30 Ala Pro Pro Leu Gly Pro Ser Gln Val Val Thr Ala Cys Leu Leu Thr 35 40 45 Leu Leu Ile Ile Trp Thr Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Cys Ala Ala 50 55 60 Ile Val Arg Ser Arg His Leu Arg Ala Asn Met Thr Asn Val Phe Ile 65 70 75 80 Val Ser Leu Ala Val Ser Asp Leu Phe Val Ala Leu Leu Val Met Pro 85 90 95 Trp Lys Ala Val Ala Glu Val Ala Gly Tyr Trp Pro Phe Gly Ala Phe 100 105 110 Cys Asp Val Trp Val Ala Phe Asp Ile Met Cys Ser Thr Ala Ser Ile 115 120 125 Leu Asn Leu Cys Val 130 <210> 13 <211> 1439 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(462) <400> 13 atg ctg ccg cca agg agc aac ggc acc gcg tac ccg ggg cag tta gcg 48 Met Leu Pro Pro Arg Ser Asn Gly Thr Ala Tyr Pro Gly Gln Leu Ala 1 5 10 15 ctg tac cag cag ctg gcg cag ggg aat gcc gtg ggg ggc tcg gcg ggg 96 Leu Tyr Gln Gln Leu Ala Gln Gly Asn Ala Val Gly Gly Ser Ala Gly 20 25 30 gca ccg cca ctg ggg ccc gtg cag gtg gtc acc gcc tgc ctg ctg acc 144 Ala Pro Pro Leu Gly Pro Val Gln Val Val Thr Ala Cys Leu Leu Thr 35 40 45 cta ctc atc atc tgg acc ttg ctg ggc aac gtg ctg gtg tcc gca gcc 192 Leu Leu Ile Ile Trp Thr Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Ser Ala Ala 50 55 60 atc gtg cgg agc cgc cac ctg cgc gcc aag atg acc aac gtc ttc atc 240 Ile Val Arg Ser Arg His Leu Arg Ala Lys Met Thr Asn Val Phe Ile 65 70 75 80 gtg tct cta cct gtg tca gac ctc ttc gtg gcg ctg ctg gtc atg tcc 288 Val Ser Leu Pro Val Ser Asp Leu Phe Val Ala Leu Leu Val Met Ser 85 90 95 tgg aag gca gtc gcc gag gtg gcc ggt tac tgg ccc ttt gaa gcg ttc 336 Trp Lys Ala Val Ala Glu Val Ala Gly Tyr Trp Pro Phe Glu Ala Phe 100 105 110 tgc gac gtc tgg gtg gcc ttc gac atc atg tgc tcc acc gcc tcc atc 384 Cys Asp Val Trp Val Ala Phe Asp Ile Met Cys Ser Thr Ala Ser Ile 115 120 125 ctg aac ctg tgc gtc agc agg tca tca gcg tgg ccc gct act ggg cca 432 Leu Asn Leu Cys Val Ser Arg Ser Ser Ala Trp Pro Ala Thr Gly Pro 130 135 140 tct cca ggc cct tcc gct acg agc gca aga tgacccag cgcatggcct 480 Ser Pro Gly Pro Ser Ala Thr Ser Ala Arg 145 150 tggtcatggt ccgcccggcc tggaccttgt ccagcctcat ctccttcatt ccggtccagc 540 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tggacacccc aaaggccctc cggccggctt 990 cccctgcgtc agtgagacca cattcgatgt cttcgtctgg ttctgctggg ccaactcctc 1050 actcaaccca gtcactatgc cttcaacgcc gacttccgga aggtgtttgc ccagctgctg 1110 gggtgcagcc acgtctgctc ccgcacgccg gtggagacgg tgaacatcag caatgagctc 1170 atctcctaca accaagacac cgtcttccac aaggaaatcg cagctgccta catccacatg 1230 atgcccaacg ccattcccac cggcgaccgg gaggtggaca acgatgagga ggagagtcct 1290 ttcgatcgca tgtcccagat ctatcagatg tccccatatg gtgaccctgt tgcagagtct 1350 gtctgagagc tggactgcga gggggagatt tctttagaca aaataacacc tttcaccccg 1410 aatggatttc 1420 <210> 18 <211> 103 <212> PRT <213> Gorilla gorilla <400> 18 Leu Pro Pro Arg Asp Gly Thr Ala Tyr Pro Gly Gln Leu Ala Leu Tyr 1 5 10 15 Gln Gln Leu Ala Gln Gly Asn Ala Val Gly Gly Ser Ala Gly Ala Pro 20 25 30 Pro Leu Gly Pro Ala Gln Val Val Thr Ala Cys Leu Leu Thr Leu Leu 35 40 45 Ile Ile Trp Thr Leu Leu Gly Asn Val Leu Leu Cys Ala Ala Ile Val 50 55 60 Arg Thr Arg His Leu Arg Ala Lys Met Thr Asn Val Phe Ile Val Ser 65 70 75 80 Leu Ala Val Ser Asp 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gcatctgtgt caatcatctg 720 actagtacac ccttttccga gatctgattt ctgctggcta attaggagag cttcttaggc 780 tatttagaga aaattcgagc attcagtgcg gtgtatggtt cgcatggaaa caaaactact 840 attttatttt ttattttaaa aactggtcct ggaagaaatt tctggccacc aagggctgac 900 tgagtccata tctggtgccc gagtcttaaa taaatatctc atttaattct tcttaagaag 960 ttcttatcag taagcacggg agtccaggca aagaggttca caagttccat cctcaagctc 1020 ttttcacagg gatgggaaga aggtgttgtg tctatgctct aaacgttccc gaggccacac 1080 attcctgtct ctactttacc cccgtggtaa ctgtttagat ggcgggctcc gttctagaca 1140 tggtcgtaca agcgacagtc agacagacag gtcaccatcc tcattagcta ctgtgttagc 1200 gttgagtaga tttttctgag catcattttc cactcagaga agtagagccg tgcaagcctg 1260 taaggaaggg ttttgcaaga tgtcgaaggt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt 1320 gtgtgtgtat gcgcgtgcgt gcgcgcttcg gggacacaga gcctgctgag tttatgccag 1380 gtctctgttc acttgcacag taagttgacc tgttgtcccc actgctgctc cagccttggc 1440 acacagggga cacaaaagga aaatcctggc ttaacgaata aaatgctagc caaagggact 1500 tcctactctt atgagttttt agaagtattt caagcgaggg agctcagaga 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ctc tgc gtg atc agc 3622 Asp Ile Met Cys Ser Thr Ala Ser Ile Leu Asn Leu Cys Val Ile Ser 105 110 115 gtg gac agg tac tgg gct atc tcc agc cct ttc cag tat gag agg aag 3670 Val Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Ser Ser Pro Phe Gln Tyr Glu Arg Lys 120 125 130 atg acc ccc aaa gca gcc ttc atc ctg att agc gta gca tgg act ctg 3718 Met Thr Pro Lys Ala Ala Phe Ile Leu Ile Ser Val Ala Trp Thr Leu 135 140 145 tct gtc ctt ata tcc ttc atc cca gta cag cta agc tgg cac aag gca 3766 Ser Val Leu Ile Ser Phe Ile Pro Val Gln Leu Ser Trp His Lys Ala 150 155 160 165 aag ccc aca tgg ccc ttg gat ggc aat ttt acc tcc ctg gag gac acc 3814 Lys Pro Thr Trp Pro Leu Asp Gly Asn Phe Thr Ser Leu Glu Asp Thr 170 175 180 gag gat gac aac tgt gac aca agg ttg agc agg acg tat gcc att tca 3862 Glu Asp Asp Asn Cys Asp Thr Arg Leu Ser Arg Thr Tyr Ala Ile Ser 185 190 195 tcg tcc ctc atc agc ttt tac atc ccc gta gcc att atg atc gtc acc 3910 Ser Ser Leu Ile Ser Phe Tyr Ile Pro Val Ala Ile Met Ile Val Thr 200 205 210 tac acc agt atc tac agg 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ctg aac ccc att att tat gct ttt aat gct gac ttc cag aag gcg ttc 4294 Leu Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe Asn Ala Asp Phe Gln Lys Ala Phe 330 335 340 tca acc ctc tta gga tgc tac aga ctc tgc cct act acg aat aat gcc 4342 Ser Thr Leu Leu Gly Cys Tyr Arg Leu Cys Pro Thr Thr Asn Asn Ala 345 350 355 ata gag acg gtg agc att aac aac aat ggg gct gtg gtg ttt tcc agc 4390 Ile Glu Thr Val Ser Ile Asn Asn Asn Gly Ala Val Val Phe Ser Ser 360 365 370 cac cat gag ccc cga ggc tcc atc tcc aag gac tgt aat ctg gtt tac 4438 His His Glu Pro Arg Gly Ser Ile Ser Lys Asp Cys Asn Leu Val Tyr 375 380 385 ctg atc cct cat gcc gtg ggc tcc tct gag gac ctg aag aag gaa gag 4486 Leu Ile Pro His Ala Val Gly Ser Ser Glu Asp Leu Lys Lys Glu Glu 390 395 400 405 gct ggt gga ata gct aag cca ctg gag aag ctg tcc cca gcc tta tcg 4534 Ala Gly Gly Ile Ala Lys Pro Leu Glu Lys Leu Ser Pro Ala Leu Ser 410 415 420 gtc ata ttg gac tat gac acc gat gtc tct cta gaa aag atc caa cct 4582 Val Ile Leu Asp Tyr Asp Thr Asp Val Ser Leu Glu Lys Ile Gln Pro 425 430 435 gtc aca cac agt gga cag cat tcc act t gaatattggg tcctcatctc 4630 Val Thr His Ser Gly Gln His Ser Thr 440 445 tgaggccacg agttcccttg ggcttgctgt taaggaatta acaggagatc cctctgctgc 4690 ttttggacaa ttacgaagct tctcaaactc actgattcca gtgtattctc tagcttcaag 4750 ggaaatgact tcggctctga aatcagtttg ggagtattat cttaggacat tataaaacaa 4810 caacaaacaa acaaacaaac aaacaaatag gccaagagtc aactgtaaac agcttcactt 4870 aaaaatcgaa ctttccagaa aggaagggta ggagttgagt ttgctgtcca aacaggtgct 4930 aaaactgtcc gagcagtttt cagattggaa aggtaggtgc atgcctttgt taattaactt 4990 ctccaataat aattgagcct tacagcagga gtgggattcc tttttctcag aattgacaga 5050 tgcattgttg atgacggttt tatttattta tttattgtac tatatgaata ttttaaattt 5110 atcatagtga atctatattt aacatattta acagagcaaa ccaatgtgtt atctgagact 5170 gacctctcca tttgtactag cactttatga gccaatgaaa catacgcgta gactctgaga 5230 ttctgaattg tgagttactt ctgggaacac agcaaagact gatgtggtgg ctccttaact 5290 cgacaaggac acaaagaaac gcaagaggag aagtgactaa tgccaccaat gctcccccta 5350 aaaagatttt gaaaagatta gttttttttt ttttttaaaa gaagctacta ttgtgttctg 5410 agtgttttaa atggcagagg ctttccccgg ggcgaatttg cacttctgta aatatctatg 5470 taagaaccag ctcaagagga atacaacttt atatttccgc ttttggatgg cgaggaagag 5530 catatgccac tttgtattta tgtaaactaa ttggccctcc ttgtcatttc tcatttcatg 5590 cttgaaatag ctttctgaaa caaacaaatg actgtccagg ctggagatct gcagggtgga 5650 gaatgagttg taaattcaca ggtcacagca gcccctccga tagctgggct catcattggt 5710 cctttatctg cccaggtcta accaagtcgg ctgcttaagg ggctactttt gtagtgcttt 5770 aatccgaatt tagtatcctc tcttttaaaa aaaaaagctc tttaatgtta gtggtaaact 5830 agctaatgaa cggtacctca tcgctgcata atacacttct gttggtgggg gcgtagacga 5890 gcccttcccg gtgcgagcac cacaaagcca tctgcatagc tagtcacaaa tgctgttttt 5950 ctttctctgt gggtttgaat ctagtttcct tgttatcata gcctggactg caaaaagatc 6010 catccagtcc cctcttgtgg gggcattgca acagtgtttc tttttgtttt tgttttgttt 6070 ttgaaatgtt tacaaggtgt tctttggaag cagttgcaac acgtggatgg aactgaagaa 6130 aaggctgact ggcttgctaa cggtatctcc tgcagggggt ttgtactgcg gactttgaat 6190 gttttctcag 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Ser Glu Asp 385 390 395 400 ctg aag aag gaa gag gct ggt gga ata gct aag cca ctg gag aag ctg 1307 Leu Lys Lys Glu Glu Ala Gly Gly Ile Ala Lys Pro Leu Glu Lys Leu 405 410 415 tcc cca gcc tta tcg gtc ata ttg gac tat gac acc gat gtc tct cta 1355 Ser Pro Ala Leu Ser Val Ile Leu Asp Tyr Asp Thr Asp Val Ser Leu 420 425 430 gaa aag atc caa cct gtc aca cac agt gga cag cat tcc act tga 1400 Glu Lys Ile Gln Pro Val Thr His Ser Gly Gln His Ser Thr 435 440 445 atattgggtc ctcatctctg aggccacgag ttcccttggg cttgctgtta aggaattaac 1460 aggagatccc tctgctgctt ttggacaatt acgaagcttc tcaaactcac tgattccagt 1520 gtattctcta gcttcaaggg aaatgacttc ggctctgaaa tcagtttggg agtattatct 1580 taggacatta taaaacaaca acaaacaaac aaacaaacaa acaaataggc caagagtcaa 1640 ctgtaaacag cttcacttaa aaatcgaact ttccagaaag gaagggtagg agttgagttt 1700 gctgtccaaa caggtgctaa aactgtccga gcagttttca gattggaaag gtaggtgcat 1760 gcctttgtta attaacttct ccaataataa ttgagcctta cagcaggagt gggattcctt 1820 tttctcagaa ttgacagatg cattgttgat gacggtttta 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ctttctgtag tctgctgcat agaaacaaac 2270 gattcttagc tgagaaatga cgaggctgtt ggataact 2308 <210> 24 <211> 475 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 24 Met Leu Pro Pro Gly Arg Asn Arg Thr Ala Gln Pro Ala Arg Leu Gly 1 5 10 15 Leu Gln Arg Gln Leu Ala Gln Val Asp Ala Pro Ala Gly Ser Ala Thr 20 25 30 Pro Leu Gly Pro Ala Gln Val Val Thr Ala Gly Leu Leu Thr Leu Leu 35 40 45 Ile Val Trp Thr Leu Leu Gly Asn Val Leu Val Cys Ala Ala Ile Val 50 55 60 Arg Ser Arg His Leu Arg Ala Lys Met Thr Asn Ile Phe Ile Val Ser 65 70 75 80 Leu Ala Val Ser Asp Leu Phe Val Ala Leu Leu Val Met Pro Trp Lys 85 90 95 Ala Val Ala Glu Val Ala Gly Tyr Trp Pro Phe Gly Thr Phe Cys Asp 100 105 110 Ile Trp Val Ala Phe Asp Ile Met Cys Ser Thr Ala Ser Ile Leu Asn 115 120 125 Leu Cys Ile Ile Ser Val Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Ser Arg Pro Phe 130 135 140 Arg Tyr Glu Arg Lys Met Thr Gln Arg Val Ala Leu Val Met Val Gly 145 150 155 160 Leu Ala Trp Thr Leu Ser Ile Leu Ile Ser Phe Ile Pro Val Gln Leu 165 170 175 Asn Trp His Arg Asp Lys Ala 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Phe Arg His Leu Arg Ser Lys Val Thr Asn Phe Phe Val Ile Ser 50 55 60 ttg gct gtg tca gac ctc ttg gtg gcg gtt ttg gtc atg cct tgg aaa 240 Leu Ala Val Ser Asp Leu Leu Val Ala Val Leu Val Met Pro Trp Lys 65 70 75 80 gct gtg tct gag atc gct ggt ttc tgg cct ttt ggt tca ttt tgc aac 288 Ala Val Ser Glu Ile Ala Gly Phe Trp Pro Phe Gly Ser Phe Cys Asn 85 90 95 atc tgg gtg gcc ttt gat att atg tgc tca aca gcc tcc atc tta aat 336 Ile Trp Val Ala Phe Asp Ile Met Cys Ser Thr Ala Ser Ile Leu Asn 100 105 110 ctc tgt gtc att agt gtg gac aga tac tgg gcc atc tcc agc cca ttc 384 Leu Cys Val Ile Ser Val Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Ser Ser Pro Phe 115 120 125 agg tac gag agg aaa atg acc ccc aag gca gcc ttc atc atg atc agt 432 Arg Tyr Glu Arg Lys Met Thr Pro Lys Ala Ala Phe Ile Met Ile Ser 130 135 140 gtg gcg tgg act ttg tct gtg ttg att tcc ttc atc ccc gtg cag ctg 480 Val Ala Trp Thr Leu Ser Val Leu Ile Ser Phe Ile Pro Val Gln Leu 145 150 155 160 aac tgg cac aag gct aca acc acg agc ttt ttg gac ctg aat gcc agt 528 Asn Trp His Lys Ala Thr Thr Thr Ser Phe Leu Asp Leu Asn Ala Ser 165 170 175 tta caa ggt ata agc atg gac aac tgt gat tct agc cta aac agg atg 576 Leu Gln Gly Ile Ser Met Asp Asn Cys Asp Ser Ser Leu Asn Arg Met 180 185 190 tat gcc atc tcc tct tct cta att agc ttc tat ata cct gtg gcc atc 624 Tyr Ala Ile Ser Ser Ser Leu Ile Ser Phe Tyr Ile Pro Val Ala Ile 195 200 205 atg ata gta acc tac aca agg ata tac cgg att gct cag aag caa ata 672 Met Ile Val Thr Tyr Thr Arg Ile Tyr Arg Ile Ala Gln Lys Gln Ile 210 215 220 cga cga att tca gct ttg gag aga gca gca gtg cat gcc aag aac tgc 720 Arg Arg Ile Ser Ala Leu Glu Arg Ala Ala Val His Ala Lys Asn Cys 225 230 235 240 cag aac aca agt ggc aac aga agc agc atg gac tgc cag caa ccc gag 768 Gln Asn Thr Ser Gly Asn Arg Ser Ser Met Asp Cys Gln Gln Pro Glu 245 250 255 agc aac ttc aaa atg tcc ttc aag agg gaa aca aag gtt cta aag act 816 Ser Asn Phe Lys Met Ser Phe Lys Arg Glu Thr Lys Val Leu Lys Thr 260 265 270 ttg tca gtg atc atg ggg gtg ttt gtg tgc tgc tgg ttg 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aac ccc acc acg cag aat gga cag cac aag tta tg aagtgctgta 1520 Lys Ile Asn Pro Thr Thr Gln Asn Gly Gln His Lys Leu 435 440 445 agggagggaa atggcgtcat gttacagaag aacacctcac cacatagagc tttgcgtcga 1580 tccgtgctta cataccacag cgtaagagga aatagatcca caatgcgact cggacgtgtg 1640 gggtgg 1646 <210> 28 <211> 445 <212> PRT <213> Anguilla anguilla <400> 28 Met Asp Leu Asn Leu Ser Thr Val Leu Asp Gly Asp Leu Pro Glu Lys 1 5 10 15 Asp Ser Ser Ala Arg Val Leu Thr Gly Cys Phe Leu Ser Leu Leu Ile 20 25 30 Leu Thr Thr Leu Leu Gly Asn Thr Leu Val Cys Ala Ala Val Thr Arg 35 40 45 Phe Arg His Leu Arg Ser Lys Val Thr Asn Phe Phe Val Ile Ser Leu 50 55 60 Ala Ile Ser Asp Leu Leu Val Ala Ile Leu Val Met Pro Trp Lys Ala 65 70 75 80 Ala Thr Glu Ile Val Gly Phe Trp Pro Phe Gly Ser Phe Cys Asn Val 85 90 95 Trp Val Ala Phe Asp Ile Met Cys Ser Thr Ala Ser Ile Leu Asn Leu 100 105 110 Cys Val Ile Ser Val Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Ser Ser Pro Phe Arg 115 120 125 Tyr Glu Arg Lys Met Thr Pro Lys Val Ala Phe Val Met Ile Ser Val 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Met Asp Arg Arg Gly Leu Val Val Glu 1 5 10 15 agg gac ttc tcc ttc cgc atc ctt act gcc tgc ttc ctt tca cta ttg 390 Arg Asp Phe Ser Phe Arg Ile Leu Thr Ala Cys Phe Leu Ser Leu Leu 20 25 30 atc ttg tct aca ctt ttg gga aat act ttg gtg tgt gca gct gtc atc 438 Ile Leu Ser Thr Leu Leu Gly Asn Thr Leu Val Cys Ala Ala Val Ile 35 40 45 agg ttc cgc cac cta agg tcc aag gtg act aat ttc ttt gtc atc tcg 486 Arg Phe Arg His Leu Arg Ser Lys Val Thr Asn Phe Phe Val Ile Ser 50 55 60 ttg gct gtt tct gac ctc tta gta gct gtc ttg gtc atg ccc tgg aaa 534 Leu Ala Val Ser Asp Leu Leu Val Ala Val Leu Val Met Pro Trp Lys 65 70 75 80 gct gtt gca gag att gcg ggt ttc tgg ccc ttt ggc tcc ttc tgc aat 582 Ala Val Ala Glu Ile Ala Gly Phe Trp Pro Phe Gly Ser Phe Cys Asn 85 90 95 atc tgg gtg gca ttt gat atc atg tgt tct acg gcc tcc att cta aac 630 Ile Trp Val Ala Phe Asp Ile Met Cys Ser Thr Ala Ser Ile Leu Asn 100 105 110 tta tgt gtc atc agt gtt gat aga tat tgg gct att tcc agt ccc ttt 678 Leu Cys Val Ile Ser Val Asp Arg Tyr Trp Ala Ile Ser Ser Pro Phe 115 120 125 cgc tat gag aga aaa atg acc ccc aag gca gcc ttc att ttg atc agt 726 Arg Tyr Glu Arg Lys Met Thr Pro Lys Ala Ala Phe Ile Leu Ile Ser 130 135 140 gtt gct tgg act ttg tct gtg ttg att tcc ttc att cca gta cag ttg 774 Val Ala Trp Thr Leu Ser Val Leu Ile Ser Phe Ile Pro Val Gln Leu 145 150 155 160 aat tgg cac aag gcc aga ccc ctg agc tca cca gat ggg aat gtt agt 822 Asn Trp His Lys Ala Arg Pro Leu Ser Ser Pro Asp Gly Asn Val Ser 165 170 175 tcc caa gat gag aca atg gac aac tgt gac tct agc ctg agc agg aca 870 Ser Gln Asp Glu Thr Met Asp Asn Cys Asp Ser Ser Leu Ser Arg Thr 180 185 190 tat gcc atc tct tct tct ctt att agc ttt tac att cca gtg gct atc 918 Tyr Ala Ile Ser Ser Ser Leu Ile Ser Phe Tyr Ile Pro Val Ala Ile 195 200 205 atg ata gtc aca tac acg agg atc tac agg att gca cag aag caa ata 966 Met Ile Val Thr Tyr Thr Arg Ile Tyr Arg Ile Ala Gln Lys Gln Ile 210 215 220 aga cga atc tca gct ttg gag aga gct gcc gtt cat gcc aag aac tgc 1014 Arg Arg Ile Ser Ala Leu Glu Arg Ala Ala Val His Ala Lys Asn Cys 225 230 235 240 cag aac act act ggg aat ggg gca aat gtg gag tgt tcc cag cca gaa 1062 Gln Asn Thr Thr Gly Asn Gly Ala Asn Val Glu Cys Ser Gln Pro Glu 245 250 255 agt tcc ttc aag atg tcc ttc aag aga gaa acc aaa gtt tta aag act 1110 Ser Ser Phe Lys Met Ser Phe Lys Arg Glu Thr Lys Val Leu Lys Thr 260 265 270 ctg tca gtg atc atg gga gtg ttt gta tgc tgc tgg cta cct ttt ttc 1158 Leu Ser Val Ile Met Gly Val Phe Val Cys Cys Trp Leu Pro Phe Phe 275 280 285 ata ttg aac tgc atg gta ccc ttc tgt gaa tct gat ttg cct tct ggg 1206 Ile Leu Asn Cys Met Val Pro Phe Cys Glu Ser Asp Leu Pro Ser Gly 290 295 300 gaa aca aaa ccc ttc tgt att gat tct att acc ttt gat gtt ttc gtg 1254 Glu Thr Lys Pro Phe Cys Ile Asp Ser Ile Thr Phe Asp Val Phe Val 305 310 315 320 tgg ttt gga tgg gca aat tcc tca ctg aac cct atc att tat gcc ttt 1302 Trp Phe Gly Trp Ala Asn Ser Ser Leu Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe 325 330 335 aat gct gac ttc cga aag gca ttt tct act ctc tta gga tgc tac agg 1350 Asn Ala Asp Phe Arg Lys Ala Phe Ser Thr Leu Leu Gly Cys Tyr Arg 340 345 350 ctc tgt ccc act gcc aac aat gca ata gag aca gtt agc atc aac aat 1398 Leu Cys Pro Thr Ala Asn Asn Ala Ile Glu Thr Val Ser Ile Asn Asn 355 360 365 aat ggg gct gtg ttt tca agc cat cat gag ccc aga ggg tcc att tct 1446 Asn Gly Ala Val Phe Ser Ser His His Glu Pro Arg Gly Ser Ile Ser 370 375 380 aag gac tgt aat ctg gtt tac ctg att cca caa gct gtc acc tcc cga 1494 Lys Asp Cys Asn Leu Val Tyr Leu Ile Pro Gln Ala Val Thr Ser Arg 385 390 395 400 gac cca aag aag gaa gaa ggt gga gga tcc aag cca ttg gag aaa acc 1542 Asp Pro Lys Lys Glu Glu Gly Gly Gly Ser Lys Pro Leu Glu Lys Thr 405 410 415 tct cca gct tta tct gtc att ttg gat tat gaa gtt gat cta tct ttg 1590 Ser Pro Ala Leu Ser Val Ile Leu Asp Tyr Glu Val Asp Leu Ser Leu 420 425 430 gaa aag att aac ccc atc aca cag aat gga caa cac aag acc tgaaccgt 1640 Glu Lys Ile Asn Pro Ile Thr Gln Asn Gly Gln His Lys Thr 435 440 445 aagatgaatc ctgtaaaaat atgctagtga aaacaaaaaa 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Ser Ser Ser Leu Ile Ser Phe Tyr Ile Pro Val Ala Ile 195 200 205 Met Ile Val Thr Tyr Thr Arg Ile Tyr Arg Ile Ala Gln Lys Gln Ile 210 215 220 Arg Arg Ile Ser Ala Leu Glu Arg Ala Ala Val His Ala Lys Asn Cys 225 230 235 240 Gln Asn Thr Thr Gly Asn Gly Ala Asn Val Glu Cys Ser Gln Pro Glu 245 250 255 Ser Ser Phe Lys Met Ser Phe Lys Arg Glu Thr Lys Val Leu Lys Thr 260 265 270 Leu Ser Val Ile Met Gly Val Phe Val Cys Cys Trp Leu Pro Phe Phe 275 280 285 Ile Leu Asn Cys Met Val Pro Phe Cys Glu Ser Asp Leu Pro Ser Gly 290 295 300 Glu Thr Lys Pro Phe Cys Ile Asp Ser Ile Thr Phe Asp Val Phe Val 305 310 315 320 Trp Phe Gly Trp Ala Asn Ser Ser Leu Asn Pro Ile Ile Tyr Ala Phe 325 330 335 Asn Ala Asp Phe Arg Lys Ala Phe Ser Thr Leu Leu Gly Cys Tyr Arg 340 345 350 Leu Cys Pro Thr Ala Asn Asn Ala Ile Glu Thr Val Ser Ile Asn Asn 355 360 365 Asn Gly Ala Val Phe Ser Ser His His Glu Pro Arg Gly Ser Ile Ser 370 375 380 Lys Asp Cys Asn Leu Val Tyr Leu Ile Pro Gln Ala Val Thr Ser Arg 385 390 395 400 Asp Pro Lys 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Leu 405 410 415 Ser Pro Ala Leu Ser Val Ile Leu Asp Tyr Asp Thr Asp Val Ser Leu 420 425 430 Glu Lys Ile Gln Pro Ile Thr Gln Asn Gly Gln His Pro Thr 435 440 445

Claims (14)

  1. 골격근의 질량 또는 기능을 조절하기 위한 후보 화합물의 동정 방법으로서,
    a. 시험 화합물을 D1 또는 D5 도파민 수용체와 접촉시키는 단계;
    b. 시험 화합물이 D1 또는 D5 도파민 수용체에 결합하는 지를 결정하는 단계; 및
    c. D1 또는 D5 도파민 수용체에 결합하는 시험 화합물을 골격근의 질량 또는 기능을 조절하기 위한 후보 화합물로 동정하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 골격근의 질량 또는 기능을 조절하기 위한 후보 화합물의 동정 방법으로서,
    a. 시험 화합물을 기능성 D1 또는 D5 도파민 수용체를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계;
    b. 시험 화합물이 D1 또는 D5 도파민 수용체를 활성화시키는 지를 결정하는 단계; 및
    c. D1 또는 D5 도파민 수용체 중 어느 하나를 활성화시키는 시험 화합물을 골격근의 질량 또는 기능을 조절하기 위한 후보 화합물로 동정하는 단계를 포함하는 방법.
  3. D1 또는 D5 도파민 수용체의 작용제-유도성 활성화 또는 D1 또는 D5 도파민 수용체 신호 전송 경로의 활성화를 연장 또는 증대시키는 후보 화합물의 동정 방법으로서, 임의의 순서로 또는 동시에
    a. 시험 화합물을 기능성 D1 또는 D5 도파민 수용체를 발현하는 세포와 접촉시키는 단계;
    b. 이 세포를 세포에서 D1 또는 D5 도파민 수용체의 탈감작을 야기하기에 충분한 농도로, 그리고 그렇게 하기에 충분한 시간 동안 D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제로 처리하는 단계; 이어서
    c. D1 또는 D5 도파민 수용체의 상기 탈감작까지의 활성화의 수준 및 지속 기간을 측정하는 단계; 및
    d. D1 또는 D5 도파민 수용체 또는 D1 또는 D5 도파민 수용체 신호 전송 경로의 활성화를 연장 또는 증대시키는 시험 화합물을 골격근의 질량 또는 기능을 조절하기 위한 후보 화합물로 동정하는 단계를 포함하는 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, D1 도파민 수용체의 아미노산 서열의, 서열 번호 2의 서열에 대한 동일성이 90% 초과인 후보 화합물의 동정 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, D5 도파민 수용체의 아미노산 서열의, 서열 번호 8의 서열에 대한 동일성이 90% 초과인 후보 화합물의 동정 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, D1 및 D5 도파민 수용체의 아미노산 서열이 서열 번호 2, 서열 번호 4, 서열 번호 6, 서열 번호 8, 서열 번호 10, 서열 번호 12 또는 서열 번호 14의 아미노산 서열에 해당하는 후보 화합물의 동정 방법.
  7. D1 또는 D5 도파민 수용체에 결합하거나, 이 수용체를 활성화시키거나, 이 수용체의 활성화를 연장시키는 것으로 이전에 결정된 하나 이상의 후보 화합물 군으로부터 후보 치료 화합물을 동정하는 방법으로서,
    a. 후보 화합물을 비-인간 동물에게 투여하는 단계; 및
    b. 후보 화합물이 치료되는 비-인간 동물에서 골격근의 질량 또는 기능을 조절하는 지를 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  8. 골격근의 질량 또는 기능의 증가가 바람직한 대상에서의 골격근의 질량 또는 기능을 증가시키는 방법으로서,
    a. 근육의 질량 또는 기능의 증가가 바람직한 대상을 확인하는 단계; 및
    b. 이 대상에게 안전하고 유효한 양의 D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  9. 골격근 위축의 치료가 필요한 대상에 대한 골격근 위축의 치료 방법으로서,
    a. 골격근 위축의 치료를 필요로 하는 대상을 확인하는 단계; 및
    b. 이 대상에게 D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제, 기능성 D1 또는 D5 도파민 수용체를 코딩하는 발현 벡터, 구성적 활성(constitutively active) D1 또는 D5 도파민 수용체를 코딩하는 발현 벡터, 도파민 수용체를 코딩하는 발현 벡터 및 D1 또는 D5 도파민 수용체의 발현을 증가시키는 화합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 안전하고 유효한 양의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 화합물이 D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제인 치료 방법.
  11. 제 8 항 또는 제 10 항에 있어서, D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제가 D2, D3 또는 D4 도파민 수용체에 비하여 D1 또는 D5 도파민 수용체에 대하여 100배 초과의 선택성을 나타내는 방법.
  12. 제 8 항 또는 제 11 항에 있어서, D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제가 키메라 또는 인간 항체인 방법.
  13. a. 안전하고 유효한 양의 D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제; 및
    b. 제약적으로 허용가능한 담체를 함유하는 제약 조성물.
  14. 제 13 항에 있어서, D1 또는 D5 도파민 수용체 작용제가 페놀도팜(fenoldopam)인 제약 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113720823A (zh) * 2021-05-17 2021-11-30 丹望医疗科技(上海)有限公司 检测类器官最大截面积的方法及其应用

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