JP2003532416A - 内皮分化遺伝子６様ｇタンパク質共役受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 内皮分化遺伝子６（ＥＤＧ６）様Ｇタンパク質共役受容体の新規核酸配列およびアミノ酸配列を開示する。ＥＤＧ６様受容体遺伝子産物に結合する物質を、炎症過程に関連する異常、例えば、アレルギー、喘息、自己免疫疾患および免疫系の過剰な活性化または長期にわたる活性化によって組織にダメージが与えられる他の慢性炎症性疾患を処置するのに用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は新規Ｇタンパク質共役受容体の核酸配列およびアミノ酸配列に関する
。より詳細には、内皮分化遺伝子６（ＥＤＧ６）様Ｇタンパク質共役受容体、そ
の核酸配列およびその調節の分野に関する。

【０００２】 （背景技術） Ｇタンパク質共役受容体 多くの医学的に重要な生体プロセスは、Ｇタンパク質を含むシグナル伝達経路
により媒介されている（Lefkowitz, Nature 351, 353-354, 1991）。Ｇタンパク
質共役受容体（ＧＰＣＲ）のファミリーには、ホルモン、神経伝達物質、成長因
子、およびウイルスに対する受容体が含まれる。ＧＰＣＲの具体的例としては、
ドーパミン、カルシトニン、アドレナリン作動性ホルモン、エンドセリン、ｃＡ
ＭＰ、アデノシン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キ
ニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子（endothelial differenti
ation gene）−１、ロドプシン、臭気物質、サイトメガロウイルス、Ｇタンパク
質自身、エフェクタータンパク質（例えばホスホリパーゼＣ、アデニル酸シクラ
ーゼおよびホスホジエステラーゼ）、およびアクチュエータータンパク質（例え
ばプロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣ）などの多彩な物質につい
ての受容体が挙げられる。

【０００３】 ＧＰＣＲは、少なくとも８つの異なる親水性ループを連結する７つの保存性の
（保存的）膜貫通ドメインを有する。ＧＰＣＲ（７ＴＭ受容体としても知られる
）は、少なくとも８つの異なる親水性ループを連結する、７つのアミノ酸約２０
〜３０個より成る保存的疎水性区間を含むことで特徴付けられている。たいてい
のＧＰＣＲは、最初の二つの細胞外ループのそれぞれに、機能性タンパク質構造
を安定化させると考えられているジスルフィド結合を形成する単一の保存的シス
テイン残基を有している。この７つの膜貫通領域はＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、Ｔ
Ｍ４、ＴＭ５、ＴＭ６およびＴＭ７と称される。ＴＭ３がシグナル伝達に関与し
ている。

【０００４】 システイン残基のリン酸化および脂質化（パルミチル化またはファルネシル化
）は、幾つかのＧＰＣＲのシグナル伝達に影響を及ぼし得る。たいていのＧＰＣ
Ｒは、第三の細胞質ループ内部に潜在的なリン酸化部位、および／またはカルボ
キシ末端を含んでいる。幾つかのＧＰＣＲ、例えばβ−アドレナリン作動性受容
体は、プロテインキナーゼＡおよび／または他の特異的受容体キナーゼによるリ
ン酸化によって受容体の脱感作が媒介される。

【０００５】 幾つかの受容体については、ＧＰＣＲのリガンド結合部位に、数個のＧＰＣＲ
膜貫通ドメインにより形成される親水性ソケットが含まれると考えられている。
この親水性ソケットは、ＧＰＣＲの疎水性残基に取り囲まれている。各ＧＰＣＲ
膜貫通ヘリックスの親水性側は内側を向き、極性リガンド結合部位を形成すると
推定されている。ＴＭ３はリガンド結合部位、例えばＴＭ３のアスパラギン酸残
基を有するように、幾つかのＧＰＣＲと関わりがある。ＴＭ５のセリン、ＴＭ６
のアスパラギン、およびＴＭ６またはＴＭ７のフェニルアラニンまたはチロシン
もまたリガンド結合に関与している。

【０００６】 ＧＰＣＲは細胞内部でヘテロ三量体Ｇタンパク質を介して、種々の細胞内酵素
、イオンチャンネルおよび輸送体と共役している（Johndonら、Endoc.Rev. 10,
317-331, 1989を参照のこと）。種々のＧタンパク質αサブユニットは特定のエ
フェクター（効果器）を優先的に刺激し、細胞の様々な生体機能を調整する。Ｇ
ＰＣＲの細胞質残基のリン酸化は、幾つかのＧＰＣＲの調節に重要なメカニズム
である。例えば、シグナル伝達の一つの形態におけるホルモン結合は、細胞内部
での酵素、アデニル酸シクラーゼの活性化に影響する。ホルモンによる酵素の活
性化はヌクレオチド ＧＴＰの存在に依存する。また、ＧＴＰはホルモン結合に
も影響を及ぼす。Ｇタンパク質はホルモン受容体をアデニル酸シクラーゼに関係
させる。Ｇタンパク質はホルモン受容体によって活性化された場合に、結合して
いるＧＤＰをＧＴＰに交換する。その後、このＧＴＰ運搬型が、活性化されるア
デニル酸シクラーゼに結合する。Ｇタンパク質自身により触媒されるＧＴＰから
ＧＤＰへの加水分解によって、Ｇタンパク質はその基本的な不活性型へと戻る。
このようにＧタンパク質は、シグナルを受容体からエフェクターへ中継する仲介
物質としての役割と、シグナルの長さを制御する時計としての役割の二つを担っ
ている。

【０００７】 過去１５年間にわたり、７ＴＭ受容体を標的とする３５０近くの治療薬が市場
に出され、成功している。このことは、これらの受容体が治療薬として確立され
、折り紙付きの歴史を有することを示すものである。細菌感染症、真菌感染症、
原虫感染症およびウイルス感染症などの感染症、特にＨＩＶウイルスによって引
き起こされる感染症、疼痛、癌、摂食障害、過食症、喘息、パーキンソン病、急
性心不全、低血圧症、高血圧症、尿閉、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘
息、アレルギー、良性前立腺肥大、並びに不安症(anxiety)、統合失調症、躁鬱
病、譫妄、痴呆、様々な精神遅延およびジスキネジア（例えばハンチントン舞踏
病とテゥレット(Tourett)症候群）を含む精神異常および神経疾患、を包含する
機能障害または疾患（これらに制限されない）を予防、改善または是正する役割
を果たすことのできる、さらなる受容体の同定および特徴づけに対する必要性が
あることは明らかである。

【０００８】 ＥＤＧ６ Ｇタンパク質共役受容体ＥＤＧ６はスフィンゴシン１−ホスフェートに対する
受容体であると考えられており、そして他の同類のリゾスフィンゴ脂質（例えば
スフィンゴシルホスホリルコリン）またはリゾリン脂質（例えばリゾホスファチ
ジン酸）とも結合できる（Yamazakiら、Biochem Biophys Res Commun., 2000 Fe
b 16;268(2):583-9）。このスフィンゴシン１−ホスフェートに対する受容体と
しての役割が、炎症応答を媒介するのに重要である。スフィンゴシン１−ホスフ
ェートは、Ｆａｓ、ＴＮＦ−β、およびＮＦ−ΚＢやＥｒｋの活性化を介したセ
ラミド誘導アポトーシス、から白血球を保護することが示されている（Cuvillie
r Oら、Nature. 1996 Jun 27;381(6585):800-3, Cuvillier Oら、J Biol Chem.
1998 Jan 30;273(5):2910-6）。

【０００９】 多くの炎症媒介病態は、白血球の過剰な活性化または長期にわたる活性化が、
周辺（bystander）組織にダメージを与えることが原因であろうと考えられてい
る。過剰な活性化または必要以上に長く持続された活性化を防ぐため、免疫応答
は自己制御型、すなわち白血球の長期にわたる活性化によってプログラムされた
細胞死プロセスが引き起こされ、そのような白血球が排除されることになる免疫
応答が典型的である。一方、免疫応答の早過ぎる停止は有害な場合があるため、
免疫応答を持続させる機構が存在する。スフィンゴシン１−ホスフェートは後者
のタイプの応答、すなわち、プログラムされた細胞死を防ぎ、免疫応答を継続さ
せる役割を果たし得る。

【００１０】 その活性を調節して治療効果、特に炎症応答に関与する疾患および異常につい
て、治療効果を与えることができるＥＤＧ６受容体ファミリーのさらなるメンバ
ーを同定する必要性が当分野にはある。

【００１１】 （発明の概要） 本発明の一態様は、 配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも約２５％一致するアミノ酸配列；
および、 配列番号１に示すアミノ酸配列、 より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドで
ある。

【００１２】 本発明のさらに別の態様は、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性を低下させる物質をス
クリーニングする方法である。被験化合物を、 配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも約２５％一致するアミノ酸配列；
および、 配列番号１に示すアミノ酸配列、 より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドと
接触させる。

【００１３】 被験化合物とＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドとの間の結合を検出する。それ
により、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドに結合する被験化合物を、ＥＤＧ６様
ＧＰＣＲの活性を低下させる可能性のある物質と同定する。

【００１４】 本発明のその他の態様は、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性を低下させる物質をスク
リーニングする方法である。被験化合物を、 配列番号２に示すヌクレオチド配列と少なくとも約２５％一致するヌクレオチ
ド配列；および、 配列番号２に示すヌクレオチド配列、 より成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含むＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチ
ドをコードするポリヌクレオチドと接触させる。

【００１５】 ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する。ポリヌクレオチドに
結合する被験化合物を、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性を低下させる可能性のある物
質と同定する。この物質はＥＤＧ６様ＧＰＣＲ ｍＲＮＡとの相互作用を通じて
ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ量を減少させることによって作用させることができる。

【００１６】 本発明の別の態様は、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性を調節する物質をスクリーニ
ングする方法である。被験化合物を、 配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも約２５％一致するアミノ酸配列；
および、 配列番号１に示すアミノ酸配列、 より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含む、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド
と接触させる。

【００１７】 上記ポリペプチドのＥＤＧ６様ＧＰＣＲ活性を検出する。それにより、被験化
合物の不存在時におけるＥＤＧ６様ＧＰＣＲ活性と比べて該ポリペプチドのＥＤ
Ｇ６様ＧＰＣＲ活性を増大させる被験化合物を、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性を増
大させる可能性のある物質と同定する。それにより、被験化合物の不存在時にお
けるＥＤＧ６様ＧＰＣＲ活性と比べて該ポリペプチドのＥＤＧ６様ＧＰＣＲ活性
を低下させる被験化合物を、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性を低下させる可能性のあ
る物質と同定する。

【００１８】 本発明のさらに別の態様は、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性を低下させる物質をス
クリーニングする方法である。被験化合物を、 配列番号２に示すヌクレオチド配列と少なくとも約２５％一致するヌクレオチ
ド配列；および、 配列番号２に示すヌクレオチド配列、 より成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドのＥＤＧ６様
ＧＰＣＲ産物と接触させる。

【００１９】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ産物に対する被験化合物の結合を検出する。それにより、
ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ産物と結合する被験化合物を、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性を
低下させる可能性のある物質と同定する。

【００２０】 本発明のさらに他の態様は、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性を減少させる方法であ
る。細胞を、 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または、 配列番号２に示すヌクレオチド配列と少なくとも約２５％一致するヌクレオチ
ド配列；および、配列番号２に示すヌクレオチド配列より成る群から選ばれるヌ
クレオチド配列を含むポリヌクレオチドによってコードされている産物、 と特異的に結合する物質と接触させる。

【００２１】 それにより、細胞のＥＤＧ６様ＧＰＣＲ活性を低下させる。

【００２２】 このように本発明は、炎症過程に関連する異常を調節して処置できるＥＤＧ６
様Ｇタンパク質共役受容体を提供する。

【００２３】 （発明の詳細な説明） 本発明は、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている単離されたポリ
ヌクレオチドであって、 ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも約２５％一致するアミノ酸配
列；および、 配列番号１に示すアミノ酸配列 より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドを
コードしているポリヌクレオチド； ｂ）配列番号２に記載の配列を含むポリヌクレオチド； ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記したポリヌクレオチドとストリンジェントな条
件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド； ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）〜（ｃ）に明記するポリヌク
レオチド配列から逸脱している配列のポリヌクレオチド；および、 ｅ）（ａ）〜（ｄ）に明記したポリヌクレオチド配列の断片、誘導体またはア
レル変異体を表すポリヌクレオチド、 より成る群から選ばれるポリヌクレオチドに関する。

【００２４】 本明細書中にて用いる全ての技術用語は、本発明に属する分野の当業者が通常
用いるのと同じ意味を有する。

【００２５】 本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡ形態またはＤＮＡ形態であってよく、ＤＮ
ＡにはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡおよび合成ＤＮＡが含まれる。ＤＮＡは二本鎖ま
たは一本鎖のいずれであってもよい。成熟ポリペプチドをコードするコード配列
は、配列番号：２に示すコード配列と同一であるか、または配列番号：２に記載
のＤＮＡと同じ成熟ポリペプチドをコードするコード配列と、遺伝コードの重複
または縮重により異なっていてもよい。

【００２６】 配列番号：１に記載の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドには、 （１）成熟ポリペプチドのコード配列のみ、 （２）成熟ポリペプチドのコード配列、およびリーダー配列または分泌配列ま
たはプロタンパク質配列などの付加的なコード配列、 （３）成熟ポリペプチドのコード配列（および場合によっては付加的なコード
配列）、および非コード配列（例えば、イントロン、または成熟ポリペプチドコ
ード配列の非コード配列５'および／若しくは３'）、 が含まれ得る。

【００２７】 このように、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」には、ポリ
ペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、並びに付加的なコード配列
および／または非コード配列を含むポリヌクレオチドが包含される。

【００２８】 本明細書中で用いる「核酸配列」は、オリゴヌクレオチド配列、ヌクレオチド
配列またはポリヌクレオチド配列、それらの断片若しくは一部を、並びにゲノム
起源または合成起源のＤＮＡ若しくはＲＮＡを意味し、それらは二本鎖または一
本鎖であっても、センス鎖またはアンチセンス鎖を表していてもよい。本発明の
核酸配列には、配列番号：１から推定されるアミノ酸配列を有するポリペプチド
の断片、類似体（アナログ）、誘導体および変異体をコードするポリヌクレオチ
ドが含まれる。本ポリヌクレオチドの変異体は、配列番号：２に記載のポリヌク
レオチドの天然アレル変異体または非天然変異体であってもよい。

【００２９】 「ストリンジェントな条件下」は、６×ＳＳＣ、１％ 硫酸ナトリウムラウリ
ル、１００μｇ／ｍｌ サケ精子ＤＮＡおよび５×デンハルト溶液を含む溶液中
にて１０〜２０時間、６５℃の条件（これに制限されない）を含むことを意味す
る。

【００３０】 同様に、本明細書中にて用いる「アミノ酸配列および／または残基配列」は、
ペプチド配列またはタンパク質配列、あるいはそれらの一部を意味する。「配列
番号：１中の１つ乃至幾つかのアミノ酸残基（群）に置換、欠失、付加または転
移が生じたアミノ酸配列」には、１つ乃至幾つかのアミノ酸「置換」によって異
なる配列番号：１に示す修飾アミノ酸配列が含まれる。また、これには配列番号
：１から１つ乃至幾つかのアミノ酸が欠失したものや、付加されたもの、あるは
その両方の修飾アミノ酸配列が含まれる。修飾アミノ酸配列には、置換アミノ酸
が類似の構造または化学的性質を有する「保存的」変化が含まれ、例えばロイシ
ンとイソロイシンとの置換がある。より希な修飾アミノ酸配列には、「非保存的
」変化があり、例えばグリシンとトリプトファンとの置換がある。修飾アミノ酸
配列には、元来のヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲの生物学的活性または免疫学的活性を
破壊しない置換、欠失または付加が含まれ得る。

【００３１】 本発明のポリペプチドには、配列番号：１に記載のポリペプチド（詳細には成
熟ポリペプチド）が含まれ、同様に、配列番号：１に記載のポリペプチドと少な
くとも２５％一致するポリペプチド、およびより好ましくは配列番号：１に記載
のポリペプチドと少なくとも４０％一致するポリペプチド、さらにより好ましく
は配列番号：１に記載のポリペプチドと少なくとも５０％一致するポリペプチド
が含まれ、並びに、一般に少なくとも３０アミノ酸、より好ましくは少なくとも
５０アミノ酸を含む該ポリペプチドの一部もまた含まれる。当分野で周知のよう
に、２つのポリペプチド間の「類似性」はそのアミノ酸配列と、１つのポリペプ
チドから二番目のポリペプチドの配列への保存的アミノ酸置換とを比較すること
によって決定される。そのような保存的置換には、Dayhoff著のThe Atlas of Pr otein Sequence and Structure 5 (1978) およびArgos著のEMBO J., 8:779-785
(1989)に記載のものが挙げられる。例えば、以下の群： ala, pro, gly, gln, asn, ser, thr; cys, ser, tyr, thr; val, ile, leu, met, ala, phe; lys, arg, his; phe, tyr, trp, his; および asp, glu、 の１つに属するアミノ酸は、保存的変化を示す。

【００３２】 本発明のポリペプチドの断片または一部を用いて、ペプチド合成により相当す
る完全長のポリペプチドを産生することができる。したがって、断片を中間体と
して用いて、完全長のポリペプチドを産生することができる。本発明のポリヌク
レオチドの断片またはその一部を使用して、本発明の完全長のポリヌクレオチド
を合成することができる。

【００３３】 「相同性（ホモロジー）」、「一致性」または「類似性」とは、２つまたはそ
れ以上のペプチド間、或いは２つまたはそれ以上の核酸分子間の配列の類似度を
意味し、通常パーセンテージで表される。相同性は、比較のためにアライメント
することができる各々の配列の或る部位を比較することによって決定することが
できる。比較される配列の或る部位が、同じ塩基またはアミノ酸によって占めら
れている場合、その分子はその部位で相同的である。配列間の相同性の程度は、
配列によって分けられる一致部位または相同部位数の関数である。

【００３４】 １．ヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲのアミノ酸配列 Ｇ−タンパク質共役受容体ＥＤＧ６（Graler MHら., Genomics. 1998 Oct 15;
53(2):164-9., Graler MHら., Curr Top Microbiol Immunol. 1999;246:131-6）
の相同体（核酸配列はアクセッション番号 ＡＬ０３３３７９、アミノ酸配列は
アクセッション番号 ＣＡＢ５５８７１）は、日本のＤＮＡデータバンク（ＤＤ
ＢＪ）の高処理ゲノム配列装置(High Throughput Genome Sequence division)の
ホモロジー検索を通じて見つけられる。この相同体（クエリー配列）をＥＤＧ６
（サブジェクト配列）と比較することで、この相同体が図１に示すように８１残
基中２６残基が同一であり、かつ８１残基中４１残基が同一または類似である８
１アミノ酸領域にわたってＥＤＧ６と似ていることが示される。

【００３５】 ２．ＥＤＧ６の機能 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲは、ＥＤＧ６に対するその相同性のために、ＥＤＧ６と同
じリガンドと結合し、それにより白血球を活性化するか、またはプログラムされ
た細胞死を予防する役割を果たすと仮説が立てられている。それは免疫媒介疾患
、例えば、アレルギー、喘息、自己免疫疾患および他の慢性炎症性疾患（免疫系
の過剰な活性化または長期化した活性化による正常組織へのダメージが不意に生
じる場合がある）に重要な役割を果たし得る。したがって、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ
を標的として用いて、その機能に選択的に作用する阻害物質（インヒビター）ま
たは活性物質（アクチベーター）を開発することができ、そして、そのインヒビ
ターまたはアクチベーターを炎症性疾患の処置に用いることができる。

【００３６】 本発明は、ＥＤＧ６様Ｇ−タンパク質共役受容体（ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ）を調
節することで、炎症過程に関連する異常を処置することができ、その受容体のア
ゴニストおよびアンタゴニストを同定することができるという発見に基づく。

【００３７】ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド 本発明に係るＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドには、配列番号：１に示すアミ
ノ酸配列、その配列の一部、または下記定義による生理学的に活性なそのアミノ
酸配列の変異体が含まれる。したがって、本発明のＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプ
チドは、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲタンパク質の一部、完全長のＥＤＧ６様ＧＰＣＲ、
またはＥＤＧ６様ＧＰＣＲの全部または一部を含む融合タンパク質であり得る。
配列番号：１に示すＥＤＧ６様ＧＰＣＲは、特徴的な「ＮＰＸＸＹ」モチーフ（
配列番号：１においては、ＮＰＬＩＹ、アミノ酸３８１−３８５）を有しており
、このことは、この受容体が内部移行（インターナリゼーション）を受けること
を意味している。

【００３８】生理学的に活性な変異体 生理学活性がある、即ちＥＤＧ６関連リガンドと結合し、生物学的効果（例え
ばサイクリックＡＭＰ形成、細胞内カルシウムの流動化、またはホスホイノシチ
ド代謝）を産する能力を保持しているＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド変異体も
また、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドである。天然または非天然ＥＤＧ６様Ｇ
ＰＣＲ変異体は配列番号：１に示すアミノ酸配列と少なくとも約５０、好ましく
は約７５、９０、９６若しくは９８％一致するアミノ酸配列を有することが好ま
しい。推定されるＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドと配列番号：１のアミノ酸配
列との一致パーセントは、Ｂｌａｓｔ２整列（アラインメント）プログラムを用
いて決定される。

【００３９】 一致パーセントの変異は例えばアミノ酸置換、挿入または欠失に起因し得る。
アミノ酸置換は１対１のアミノ酸の置き換えとして定義される。置換されたアミ
ノ酸が類似の構造的および／または化学的性質を有する場合、置換は保存的であ
る。保存的置換の例は、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの置換、グル
タミン酸塩によるアスパラギン酸塩の置換、またはセリンによるスレオニンの置
換である。

【００４０】 アミノ酸挿入または欠失はアミノ酸配列への、またはその内部での変化である
。これらは典型的には約１から５アミノ酸の範囲で起こる。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ
ポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を破壊することなく、どのアミノ酸
残基が置換、挿入または欠失できるかを決定する際の指針は、当分野で周知のコ
ンピュータープログラム、例えばDNASTARソフトウェアを用いて見出すことがで
きる。あるアミノ酸変化が生物学的に活性なＥＤＧ６受容体様ポリペプチドを生
成するか否かは、例えば以下の具体的実施例に記載のように、ＥＤＧ６様ＧＰＣ
Ｒポリペプチド活性を検定することにより容易に決定できる。

【００４１】融合タンパク質 融合タンパク質は、配列番号１に示すアミノ酸配列の少なくとも５、６、８、
１０、２５、もしくは５０、またはそれ以上の連続アミノ酸を含むことができる
。融合タンパク質は、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドアミノ酸配列に対する抗
体の作製に、そして様々な検定系での使用に有用である。例えば、融合タンパク
質は、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドの一部と相互作用するタンパク質の同定
に使用できる。タンパク質親和クロマトグラフィーまたはタンパク質−タンパク
質相互作用のためのライブラリーに基づく検定、例えば酵母２−ハイブリッドま
たはファージディスプレイ系をこの目的のために使用できる。このような方法は
当分野で周知であり、薬物スクリーニングとしても使用できる。

【００４２】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド融合タンパク質は、ペプチド結合により融合
した二つのポリペプチドセグメントを含んでいる。第一のポリペプチドセグメン
トは配列番号１、または上記のようなそれらの配列の生物学的に活性な変異体の
少なくとも５、６、８、１０、２５、もしくは５０、またはそれ以上の連続アミ
ノ酸を含む。第一のポリペプチドセグメントはまた、完全長ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ
タンパク質を含むことができる。

【００４３】 第二のポリペプチドセグメントは完全長タンパク質またはタンパク質断片であ
ってよい。融合タンパク質の構築に一般的に使用するタンパク質は、β−ガラク
トシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、自己蛍光
タンパク質（青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を包含する）、グルタチオン−Ｓ−
トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ
（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ
）を包含する。さらに、融合タンパク質の構築には、ヒスチジン（His）標識、
ＦＬＡＧ標識、インフルエンザへマグルチニン（ＨＡ）標識、Ｍｙｃ標識、ＶＳ
Ｖ−Ｇ標識、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ）標識を包含するエピトープ標識を
使用する。その他の融合構築は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−標
識、Lex a ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイ
ン融合物、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を
包含する。融合タンパク質はさらに、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドコード配
列と非相同タンパク質配列の間に位置する開裂部位を含むよう構築することがで
き、その結果、このＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドは、開裂させ、非相同部分
を無くすように精製できる。

【００４４】 融合タンパク質は当分野で周知のように化学合成できる。好ましくは、融合タ
ンパク質は二つのポリペプチドセグメントを共有結合で連結することにより、ま
たは分子生物学分野で標準的な方法により調製する。例えば、当分野で知られて
いるように、第二のポリペプチドセグメントをコードしているヌクレオチドを有
する適切なリーディングフレームに配列番号２より選ばれるコード配列を含むＤ
ＮＡ構築物を作製し、このＤＮＡ構築物を宿主細胞で発現させることによる組換
えＤＮＡ法を用いて、融合タンパク質を調製できる。融合タンパク質構築用の多
くのキットが、Promega Corporation(Madison, WI)、Stratagene(La Jolla, CA)
、CLONTECH(Mountain View, CA)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA)
、MBL international Corporation(MIC; Watertown, MA)、およびQuantum Biote
chnologies(Montreal, Canada; 1-888-DNA-KITS)といった企業から入手できる。

【００４５】種相同体の同定 ヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドのポリヌクレオチド（下記）を使用して
、他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーを
スクリーニングするために好適なプローブまたはプライマーを作製し、ＥＤＧ６
様ＧＰＣＲポリペプチドの相同体をコードしているｃＤＮＡを同定し、そして当
分野で周知のようにこのｃＤＮＡを発現させて、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチ
ドの種相同体を得ることができる。

【００４６】ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチド ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってよく、Ｅ
ＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドのコード配列またはこのコード配列の相補体を含
んでいる。ヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドのコード配列を配列番号２に示
す。

【００４７】 ヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている縮重ヌクレオチド配列
、および、配列番号２に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５０、好ましくは
約７５、９０、９６または９８％一致するホモローガスなヌクレオチド配列もま
た、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドである。二つのポリヌクレオチド配列
間の配列一致パーセントは、ALIGNのようなコンピュータープログラムを用いて
決定するが、これは、ギャップオープンペナルティー−１２およびギャップエク
ステンションペナルティー−２によるアフィンギャップ検索を用いるFASTAアル
ゴリズムを使用するものである。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体およ
び生物学的に活性なＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているＥＤＧ６
様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの変異体もやはりＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオ
チドである。

【００４８】ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチド変異体および相同体の同定 上記のＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチド変異体および相同体もまたＥＤＧ
６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドである。典型的には、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌ
クレオチド配列は、当分野で周知のように、ストリンジェントな条件下で候補ポ
リヌクレオチドを既知のＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドにハイブリダイズ
することにより同定できる。例えば、以下の洗浄条件 -- ２Ｘ ＳＳＣ（０.３M
ＮａＣｌ、０.０３Mクエン酸ナトリウム、pH７.０）、０.１％ＳＤＳ、室温 ２
回、各々３０分間；次いで２× ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、５０℃ １回、３０分
間；次いで２× ＳＳＣ、室温 ２回、各々１０分間 -- を使用して、最大約２５
−３０％の塩基対ミスマッチを含む相同配列を同定できる。より好ましくは、相
同核酸鎖は１５−２５％の塩基対ミスマッチを、さらに好ましくは５−１５％の
塩基対ミスマッチを含む。

【００４９】 本明細書に開示するＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの種相同体はさらに
、適当なプローブまたはプライマーを作製し、他の種、例えばマウス、サル、ま
たは酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによって同
定できる。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドのヒト変異体は、例えばヒトｃ
ＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。二本鎖Ｄ
ＮＡのＴ_mは相同性が１％低下する毎に１−１.５℃低下することがよく知られて
いる（Bonnerら、J.Mol.Biol. 81,123(1973)）。故にヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲポ
リヌクレオチドの変異体または他の種のＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは
、推定の相同ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを、配列番号２に記載のヌク
レオチド配列を有するポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズさせ
て被験ハイブリッドを作製することによって同定できる。被験ハイブリッドの融
解温度を完全に相補的なヌクレオチド配列を有するトランスホルミラーゼポリヌ
クレオチドを含むハイブリッドの融解温度と比較し、被験ハイブリッドの中の塩
基対ミスマッチのパーセント数を算出する。

【００５０】 ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に従いト
ランスホルミラーゼポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズするヌ
クレオチド配列もまたＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドである。ストリンジ
ェントな洗浄条件は当分野で周知且つ理解されており、例えばSambrookら、MOLE
CULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed., 1989, 9.50-9.51頁に開示され
ている。

【００５１】 典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のためには、温
度と塩濃度の組み合わせを、検討中のハイブリッドの理論的Ｔ_mよりおよそ１２
−２０℃低くなるよう選択すべきである。配列番号２に示すヌクレオチド配列を
有するＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドまたはその相同体と、それらのヌク
レオチド配列のいずれか１つと少なくとも約５０、好ましくは約７５、９０、９
６、または９８％一致するポリヌクレオチド配列とのハイブリッドのＴ_mは、例
えばBoltonおよびMcCarthy, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 48,1390(1962)の式： Ｔ_m＝８１.５℃−１６.６(log₁₀[Ｎａ⁺])＋０.４１(％Ｇ＋Ｃ)−０.６３(％ホ
ルムアミド)−６００／ｌ）、 [式中、ｌ＝塩基対で表したハイブリッドの長さ] を用いて算出できる。

【００５２】 ストリンジェントな洗浄条件としては例えば、４× ＳＳＣ（６５℃）、また
は５０％ホルムアミド、４× ＳＳＣ（４２℃）、または０.５× ＳＳＣ、０.１
％ＳＤＳ（６５℃）が挙げられる。高度ストリンジェントな洗浄条件は、例えば
０.２× ＳＳＣ（６５℃）などである。

【００５３】ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの調製 天然に存在するＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは、膜構成成分、タンパ
ク質および脂質といった他の細胞成分を含まないよう単離できる。ポリヌクレオ
チドは細胞から調製でき、標準的核酸精製技術を用いて単離、またはポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を用いて合成、もしくは自動合成機を用
いることによって調製できる。ポリヌクレオチドを単離する方法は機械的であり
、当分野で知られている。ポリヌクレオチドを取得するためこのような任意の技
術を用いて、単離されたＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを得ることができ
る。例えば、制限酵素およびプローブを用いてＥＤＧ６様ＧＰＣＲヌクレオチド
配列を含むポリヌクレオチド断片を単離できる。単離したポリヌクレオチドは含
まないか、あるいは他の分子を少なくとも７０、８０、または９０％含まない調
製物である。

【００５４】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ ｃＤＮＡ分子は、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ ｍＲＮＡを鋳型に
用いて標準的分子生物学技術にて調製できる。その後ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ ｃＤ
ＮＡ分子は、当分野で周知でありSambrookら.(1989)のようなマニュアルに開示
される分子生物学技術を用いて複製できる。ヒトゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを
鋳型に使用して本発明に係るポリヌクレオチドのさらなるコピーを得るため、Ｐ
ＣＲのような増幅技術を用いることができる。

【００５５】 別法として、合成化学技術を用いてＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを合
成することもできる。遺伝コードの縮重は、例えば配列番号１に示すアミノ酸配
列を有するＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドまたはその生物学的に活性な変異体
をコードしている別のヌクレオチド配列の合成を可能にする。

【００５６】ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの伸長 ＰＣＲに基づく様々な方法を用いて開示されたヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペ
プチドの一部をコードする核酸配列を伸長させ、プロモーターおよび調節要素と
いった上流配列を検出することができる。例えば制限部位ＰＣＲは、既知の座に
隣接する未知配列を検索するため、ユニバーサルプライマーを使用する（Sarkar
, PCR Methods Applic. 2,318-322,1993）。まず、ゲノムＤＮＡを、リンカー配
列に対するプライマーと既知領域に特異的なプライマーの存在下で増幅する。次
に、増幅させた配列を、同じリンカープライマーと最初のものの内部にある別の
特異的プライマーを用いて、第二回目のＰＣＲを行なう。各回のＰＣＲ産物を適
当なＲＮＡポリメラーゼで転写し、逆転写を行ない配列決定する。

【００５７】 既知領域に基づく異なるプライマーを用いて配列を増幅または伸長するために
、逆ＰＣＲを使用することもできる（Trigliaら、Nucleic Acids Res. 16,8186,
1988）。OLIGO 4.06 Primer Analysisソフトウェア（National Biosciences Inc
., Plymouth, Minn）のような市販ソフトウェアを用いて、長さ２２−３０ヌク
レオチド長、５０％またはそれ以上のＧＣ含有量を持ち、約６８−７２℃の温度
で標的配列とアニーリングするプライマーを設計できる。この方法は、幾つかの
制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域に適当な断片を作り出せる。次いでこの断
片を分子内ライゲーションにより環化し、ＰＣＲ鋳型として使用する。

【００５８】 使用できるもう一つの方法は、ヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡ中の既知配列
に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む、捕捉ＰＣＲである（Lagerstromら、
PCR Methods Applic. 1,111-119,1991）。この方法では、作製した二本鎖配列を
、ＰＣＲの実施前に当該ＤＮＡ分子の未知断片中に入れるため、さらに複数の制
限酵素消化とライゲーションを行うことができる。

【００５９】 未知配列を回収するために使用できるもう一つの方法はParkerら、Nucleic Ac
ids Res. 19,3055-3060,1991の方法である。さらに、ＰＣＲ、ネスティド(neste
d)プライマー、およびPROMOTERFINDERライブラリー（CLONTECH, Palo Alto, Cal
if.）を用いてゲノムＤＮＡ歩行を行なうことができる（CLONTECH, Palo Alto,
Calif.）。このプロセスはライブラリーをスクリーニングする必要性を排除し、
イントロン／エクソン接合点の発見に有用である。

【００６０】 スクリーニングで完全長ｃＤＮＡを求める場合、より大きなｃＤＮＡを含むよ
うサイズ選択したライブラリーを使用するのが望ましい。遺伝子の５'領域を含
む配列をより多く含んでいるという点で、無作為プライミングしたライブラリー
が好ましい。無作為プライミングしたライブラリーの使用は、オリゴｄ(Ｔ)ライ
ブラリーが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況で特に好ましいであろう。ゲノムラ
イブラリーは、配列を５'非転写調節領域へと伸長させるのに有用な場合がある
。

【００６１】 市販品が入手可能な毛細管電気泳動系を用いて、ＰＣＲまたは配列決定産物の
サイズを分析、またはヌクレオチド配列を確認することができる。例えば、毛細
管配列決定は、電気泳動分離用の流動性ポリマー、レーザー励起する４種の異な
る蛍光色素（各ヌクレオチドにつき１種ずつ）、および電荷結合素子カメラによ
る放射された波長の検出を利用することができる。出力／光強度は適当なソフト
ウェア（例えばGENOTYPERおよびSequence NAVIGATOR、Perkin Elmer）を用いて
電気信号に変換でき、試料のロードからコンピューター分析および電子的データ
表示に至る全プロセスをコンピューター管理することができる。毛細管電気泳動
は、特定の試料中に限られた量で存在するかも知れないＤＮＡの小片を配列決定
するのに特に好ましい。

【００６２】ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドの取得 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドは、例えばヒト細胞からの精製によって、Ｅ
ＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの発現によって、または直接的化学合成によ
って取得できる。

【００６３】タンパク質精製 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドは、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドで
トランスフェクト宿主細胞を包含する、受容体を発現する任意のヒト細胞から精
製できる。脳、網膜、肺、神経内分泌肺カルチノイド、胎盤、正常な睾丸、Ｂ−
細胞、胎児の肺、リンパ組織および正常な胚中心Ｂ−細胞がＥＤＧ６様ＧＰＣＲ
ポリペプチドの特に有用な原料である。精製ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドは
、細胞内のＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドに通常付随するその他の化合物、例
えばある種のタンパク質、炭水化物または脂質から、当分野で周知の方法を用い
て分離する。このような方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニ
ウム分画、イオン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、および調
製用ゲル電気泳動を包含するが、これらに限定されない。

【００６４】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドは、下記の具体的な実施例に記載のように、
関連Ｇタンパク質との複合体として簡便に分離することができる。精製ＥＤＧ６
様ＧＰＣＲポリペプチドの調製物は少なくとも８０％純粋であり、好ましくは該
調製物は９０％、９５％、または９９％純粋である。調製物の純度はＳＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動のような当分野で既知の任意の手段によって評価
できる。

【００６５】ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの発現 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドを発現させるため、挿入されたコード配列の
転写と発現に必要な要素を含む発現ベクター中にＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレ
オチドを挿入することができる。当業者に周知の方法を利用して、ＥＤＧ６様Ｇ
ＰＣＲポリペプチドをコードしている配列および適当な転写および翻訳調節要素
を含む発現ベクターを構築できる。これらの方法には、インビトロ組換えＤＮＡ
技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えがある。このような技術は、例え
ばSambrookら、(1989)およびAusubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOL
OGY, John Wiley ＆ Sons, New York., 1989に記載されている。

【００６６】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列を含み、そして発現す
る様々な発現ベクター／宿主系が利用できる。これらには、微生物、例えば組換
えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターにより
形質転換された細菌；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母、ウイルス発
現ベクター（例えばバキュロウイルス）により感染を受けた昆虫細胞系、ウイル
ス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザ
イクウイルス、ＴＭＶ）、もしくは細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢＲ
３２２プラスミド）により形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が包含
されるがこれらに限定される訳ではない。

【００６７】 調節要素または調節配列は、宿主細胞タンパク質と相互作用して転写と翻訳を
実行するベクターの非翻訳領域−エンハンサー、プロモーター、５'および３'非
翻訳領域−である。かかる要素はその強さと特異性において異なっている。利用
するベクター系および宿主に応じて、構成的および誘導的プロモーターを包含す
る、多数の好適な転写および翻訳要素を使用できる。例えば、細菌系でクローニ
ングを行う場合、BLUESCRIPTファージミド（Stratagene, LaJolla，Calif.）ま
たはpSPORT１プラスミド（Life Technologies）等のハイブリッドlacZプロモー
ターのような誘導的プロモーターを使用できる。バキュロウイルスのポリヘドリ
ンプロモーターは昆虫細胞に使用できる。植物細胞のゲノムから誘導したプロモ
ーターまたはエンハンサー（例えば熱ショック、RUBISCO、および貯蔵タンパク
質遺伝子）、または植物ウイルスから誘導したプロモーターまたはエンハンサー
（例えば、ウイルスプロモーターまたはリーダー配列）を該ベクター中にクロー
ニングすることができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来の、または
哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプ
チドをコードしているヌクレオチド配列を複数コピー含む細胞系を作製する必要
がある場合は、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベクターを適当な選択マーカーと
共に使用することができる。

【００６８】細菌および酵母発現系 細菌系では、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドに対して意図する用途に応じて
幾つかの発現ベクターを選択できる。例えば、抗体の誘導のため大量のＥＤＧ６
様ＧＰＣＲポリペプチドが必要である場合は、容易に精製できる融合タンパク質
の高レベル発現を指令するベクターが使用できる。このようなベクターは、BLUE
SCRIPT(Stratagene)のような多機能E.coliクローニングおよび発現ベクターを包
含するが、これに限定される訳ではない。BLUESCRIPTベクターにおいては、ＥＤ
Ｇ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列を、β−ガラクトシダーゼの
アミノ末端Ｍｅｔとこれに続く７残基の配列と共にフレーム内で該ベクター中に
ライゲーションすることができ、その結果ハイブリッドタンパク質が産生される
。ｐＩＮベクター（Van Heeke ＆ Schuster, J.Biol.Chem. 264,5503-5509,1989
）またはｐＧＥＸベクター（Promega, Madison, Wis.）もまた、グルタチオンＳ
−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を伴う融合タンパク質として外来ポリペプチド
を発現させるのに使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であ
り、グルタチオン−アガロースビーズに吸着させ、その後遊離グルタチオンの存
在下で溶離することにより、溶菌させた細胞から容易に精製できる。このような
系で調製したタンパク質は、ヘパリン、トロンビン、または第Ｘａ因子プロテア
ーゼ開裂部位を含むよう設計でき、その結果、目的とするクローンポリペプチド
をＧＳＴ部分から随意に解放することができる。

【００６９】 酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいては、α因子、アルコールオキシダーゼ
、およびＰＧＨのような構成的または誘導的プロモーターを含む幾つかのベクタ
ーが使用できる。総説としてAusubelら、(1989)およびGrantら、Methods Enzymo
l. 153,516-544,1987を参照されたい。

【００７０】植物および昆虫発現系 植物発現ベクターを使用する場合、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコード
している配列の発現は、幾つかのプロモーターのうち任意のものにより駆動でき
る。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターのようなウイルスプロ
モーターを、単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使
用できる（Takamatsu, EMBO J. 6,307-311,1987）。別法として、RUBISCOの小サ
ブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用する
こともできる（Coruzziら、EMBO J. 3,1671-1680,1984；Broglieら、Science 22
4,838-843,1984；Winterら、Results Probl.Cell Differ. 17,85-105,1991）。
これらの構築物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクション
により植物細胞中に導入できる。このような技術は幾つかの一般に入手可能な総
説に記載されている（例えば、HobbsまたはMurray、MCGRAW HILL YEARBOOK OF S
CIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, New York, N.Y., pp191-196,1992）。

【００７１】 昆虫系もまたＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドの発現に使用できる。例えば、
かかる系の１つAutographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は、
Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusiaの幼虫で外来遺伝子を発現させ
るベクターとして使用する。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている
配列を、ポリヘドリン遺伝子のような該ウイルスの非必須領域中にクローニング
し、ポリヘドリンプロモーターの調節下に置くことができる。ＥＤＧ６様ＧＰＣ
Ｒポリペプチドをうまく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子は不活性化し、コート
タンパク質を欠く組換えウイルスが生成する。次いでこの組換えウイルスをS.fr
ugiperda細胞またはTrichoplusiaの幼虫への感染に使用し、そこでＥＤＧ６様Ｇ
ＰＣＲポリペプチドを発現させることができる（Engelhardら、Proc.Nat.Acad.S
ci. 91,3224-3227,1994）。

【００７２】哺乳動物発現系 ウイルスに基づく多くの発現系を用いて哺乳動物宿主細胞でＥＤＧ６様ＧＰＣ
Ｒポリペプチドを発現させることができる。例えば、発現ベクターとしてアデノ
ウイルスを使用する場合、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配
列は、後期プロモーターおよび３部に分かれたリーダー配列を含むアデノウイル
ス転写／翻訳複合体中にライゲーションできる。該ウイルスゲノムの非必須Ｅ１
またはＥ３領域における挿入を用いて、感染宿主細胞においてＥＤＧ６様ＧＰＣ
Ｒポリペプチドを発現できる生存ウイルスを取得できる（Logan ＆ Shenk, Proc
.Natl.Acad.Sci. 81,3655-3659,1984）。所望によりラウス肉腫ウイルス（ＲＳ
Ｖ）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて哺乳動物宿主細胞での発現
を増大させることができる。

【００７３】 ヒト人工染色体（ＨＡＣ）もまた、プラスミドが内包し発現するＤＮＡ断片よ
りも大きなＤＮＡ断片の運搬に使用できる。６Ｍから１０ＭのＨＡＣを構築し、
常套的送達法により細胞に到達させる（例えば、リポソーム、ポリカチオンアミ
ノポリマー、または小胞）。

【００７４】 さらに、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列のより効率的
な翻訳を達成するために、特異的開始シグナルを使用できる。かかるシグナルは
ＡＴＧ開始コドンおよび連続配列を包含する。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド
をコードしている配列、その開始コドン、および上流配列を適当な発現ベクター
中に挿入した場合、さらなる転写または翻訳調節シグナルは必要ないであろう。
しかしながら、コード配列またはその断片のみを挿入した場合は、外因性の翻訳
調節シグナル（ＡＴＧ開始コドンを包含する）を供給すべきである。開始コドン
は挿入物全体を確実に翻訳させるために、正しいリーディングフレームになけれ
ばならない。外因性翻訳要素および開始コドンは天然および合成両者の様々な起
源であってよい。発現の効率は、使用する特定の細胞系に対し適切なエンハンサ
ーを存在させることにより増強できる（Scharfら、Results Probl.Cell Differ.
20,125-162,1994）。

【００７５】宿主細胞 宿主細胞菌株は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現されたＥＤＧ
６様ＧＰＣＲポリペプチドを所望の方法で処理できる能力を目的として選択でき
る。該ポリペプチドのこのような修飾には、アセチル化、カルボキシ化、グリコ
シル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化が包含されるがこれらに限定されな
い。該ポリペプチドの「プレプロ」型を開裂する翻訳後プロセシングもまた、正
しい挿入、折り畳み、および／または機能を促進するために使用できる。翻訳後
活性のための特異的な細胞機構および特徴的メカニズムを持つ異なる宿主細胞（
例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、Ｂ−リンパ腫細胞およびＷ
Ｉ３８）が、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ；10801 University
Boulevard, Manassas, VA 20110-2209）から入手でき、外来タンパク質の正し
い修飾およびプロセシングを確実とするために選択できる。

【００７６】 組換えタンパク質の、長期高収量産生のために、安定な発現が好ましい。例え
ば、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドを安定に発現する細胞系を、ウイルス複製
起点および／または内因性発現要素、および同じまたは別のベクター上にある選
択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質転換することができる。該ベ
クターの導入に続いて、細胞を強化培地で１−２日間生育させた後、培地を選択
培地に交換することができる。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を付与
することであり、その存在が、導入されたＥＤＧ６様ＧＰＣＲ配列をうまく発現
する細胞の生育と回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性クローン
は、その細胞型にとって適当な組織培養技術を用いて増殖させることができる。
例えば、ANIMAL CELL CULTURE, R.I.Freshney,ed.,1986を参照されたい。

【００７７】 幾つかの選択系を用いて、形質転換された細胞系を回収できる。これらには、
それぞれtk^-またはaprt^-細胞で使用できる単純ヘルペスウイルスチミジンキナー
ゼ（Wiglerら、Cell 11,223-32,1977）およびアデニンホスホリボシルトランス
フェラーゼ（Lowyら、Cell 22,817-23,1980）遺伝子が包含されるがこれらに限
定される訳ではない。さらに、代謝拮抗物質、抗生物質、または除草剤耐性を選
択の基準に用いることができる。例えば、dhfrはメソトレキサートに対する耐性
を付与し（Wiglerら、Proc.Natl.Acad.Sci. 77,3567-70,1980）nptはアミノグリ
コシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与し（Colbere-Garapi
nら、J.Mol. Biol. 150,1014,1981）、そしてalsおよびpatはそれぞれクロルス
ルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性を
付与する（Murray, 1992,上記）。さらなる選択遺伝子が記載されている。例え
ば、trpBは細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用するようにさせ、
hisDは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用するようにさせる（Hart
man ＆ Mulligan, Proc.Natl.Acad.Sci. 85,8047-51,1988）。アントシアニンの
ような可視マーカー、β−グルクロニダーゼとその基質ＧＵＳ、およびルシフェ
ラーゼとその基質ルシフェリンは、形質転換体を同定し、特異的ベクター系に帰
すことのできる一過性または安定なタンパク質発現の量を定量するために使用で
きる（Rhodesら、Methods Mol.Biol. 55,121-131,1995）。

【００７８】ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドの発現の検出 マーカー遺伝子発現の存在はＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドが存在する
ことも示唆しているが、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの存在と発現は確
認する必要がある。例えば、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている
配列がマーカー遺伝子配列内部に挿入されている場合、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリ
ペプチドをコードしている配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機
能の不在によって同定できる。これとは別に、単一のプロモーターの調節下にＥ
ＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列と、マーカー遺伝子が直列
（タンデム）に位置する場合がある。誘導または選択に応答してこのマーカー遺
伝子は発現し、通常、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの発現を示す。

【００７９】 これとは別に、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを含み、ＥＤＧ６様ＧＰ
ＣＲポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に知られる様々な方法によって
同定できる。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリ
ダイゼーションおよびタンパク質生検またはイムノアッセイ技術（核酸またはタ
ンパク質の検出および／または定量のための膜、溶液、またはチップに基づく技
術を包含する）が包含されるがこれらに限定されない。例えば、ＥＤＧ６様ＧＰ
ＣＲポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の存在は、プローブま
たは断片またはＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているポリヌクレオ
チドの断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーシ
ョンまたは増幅によって検出できる。核酸増幅に基づく検定は、ＥＤＧ６様ＧＰ
ＣＲポリヌクレオチドを含む形質転換体を検出するための、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ
ポリペプチドをコードしている配列から選択されるオリゴヌクレオチドの使用を
含む。

【００８０】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドに対し特異的なポリクローナルまたはモノク
ローナル抗体のいずれかを使用して該ポリペプチドの発現を検出および測定する
ための様々なプロトコルが当分野で知られている。例として、酵素結合免疫吸着
測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化セ
ルソーティング（ＦＡＣＳ）がある。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド上の２個
の非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる、２部位のモノク
ローナルに基づくイムノアッセイが使用でき、または、競合的結合検定を使用す
ることができる。これらのおよびその他の検定はHamptomら、SEROLOGICAL METHO
DS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, St.Paul, Minn., 1990およびMaddoxら、
J.Exp.Med. 158,1211-1216,1983に記載されている。

【００８１】 多岐にわたる標識およびコンジュゲーション技術が当業者に知られており、様
々な核酸およびアミノ酸検定に使用できる。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドを
コードしているポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハイブ
リダイゼーションまたはＰＣＲプローブを調製する手段は、標識したヌクレオチ
ドを使用する、オリゴ標識化、ニック翻訳、末端標識化、またはＰＣＲ増幅を包
含する。これとは別に、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列
を、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクター中にクローニングすることもでき
る。このようなベクターは当分野で既知であり、市販品が入手でき、標識化ヌク
レオチドおよび適当なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６を
添加することによりインビトロでのＲＮＡプローブの合成に使用することができ
る。これらの方法は、市販の様々なキットを用いて実施できる（Amersham Pharm
acia Biotech、 Promega、およびUS Biochemical）。検出を容易にするために使
用できる適当なリポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、および蛍光
、化学ルミネセント、または色素生成物質、ならびに基質、補助因子、インヒビ
ター、磁性粒子などが包含される。

【００８２】ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドの発現および精製 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列で形質転
換させた宿主細胞は、発現と、細胞培養からのタンパク質の回収に適した条件下
で培養できる。形質転換細胞により産生されたポリペプチドは、その配列および
／または使用したベクターに応じて分泌されまたは細胞内に貯留され得る。当業
者には理解できるであろうが、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしてい
るポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通った可溶
性ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドの分泌を指令する、または膜結合ＥＤＧ６様
ＧＰＣＲポリペプチドの、膜挿入を指令する、シグナル配列を含むよう設計でき
る。

【００８３】 上に論じたように、他の構築物を用いて、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドを
コードしている配列を、可溶性タンパク質の精製を促進するポリペプチドドメイ
ンをコードしているヌクレオチド配列と結合させることができる。このような精
製促進ドメインは、金属キレート化ペプチド、例えば固定化金属上での精製を可
能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上での
精製を可能にするタンパク質Ａドメイン、およびFLAGS伸長／親和精製系で利用
するドメインが包含されるが、これらに限定されない（Immunex Corp., Seattle
, Wash.）。精製ドメインとＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドとの間に開裂可能
リンカー配列、例えば第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼに特異的なリンカー配
列を入れること（Invitrogen, San Diego, CA）もまた、精製を促進するために
利用できる。このような発現ベクターの１つは、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチ
ドと、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ開裂部位に先立つ６個のヒスチジ
ン残基とを含む融合タンパク質の発現を提供する。このヒスチジン残基はＩＭＡ
Ｃ（Porathら、Prot.Exp.Purif. 3,263-281,1992に記載の固定化金属イオン親和
クロマトグラフィー）による精製を促進し、一方エンテロキナーゼ開裂部位は融
合タンパク質からのＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドの精製手段を提供する。融
合タンパク質を含むベクターはKrollら、DNA Cell Biol. 12,441-453,1993に開
示されている。

【００８４】化学合成 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列は、その全体または一
部を、当分野で周知の化学的方法を用いて合成できる（Caruthersら、Nucl.Acid
s Res.Symp.Ser. 215-223,1980；Hornら、Nucl.Acids Res.Symp.Ser. 225-232,1
980）。これとは別に、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド自身を、そのアミノ酸
配列を合成するための化学的方法、例えば固相技術を用いる直接ペプチド合成を
用いて調製できる（Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85,2149-2154,1963；Roberge
ら、Science 269,202-204,1995）。タンパク質合成は手動技術またはオートメー
ションを用いて実施できる。自動化合成は、例えばApplied Biosystems 431Aペ
プチド合成機（Perkin Elmer）を用いて達成できる。所望により、ＥＤＧ６様Ｇ
ＰＣＲポリペプチドの断片を別々に合成し、化学的方法を用いて合して完全長の
分子を調製することもできる。

【００８５】 新たに合成したペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフイー（例えばCrei
ghton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and Co.
, New York, N.Y., 1983）により実質的に精製できる。合成ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ
ポリペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定により確認できる（例えばエ
ドマン分解法；Creighton、上記を参照されたい）。さらに、直接合成中にＥＤ
Ｇ６様ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を改変させ、そして／
または化学的方法を用いて他のタンパク質由来の配列と合して、変異体ポリペプ
チドまたは融合タンパク質を調製することができる。

【００８６】改変ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドの調製 当業者には理解できるであろうが、天然に存在しないコドンを有するＥＤＧ６
様ＧＰＣＲポリペプチドコード化ヌクレオチドを調製することは有利であり得る
。例えば、特定の原核または真核宿主が好むコドンを選択して、タンパク質発現
の速度を増大させ、または所望の性質、例えば天然に存在する配列から産み出さ
れる転写物の半減期より長い半減期を持つＲＮＡ転写物を調製することができる
。

【００８７】 本明細書に開示するヌクレオチド配列は、当分野で一般的に知られる方法を用
いて、該ポリペプチドまたはｍＲＮＡ産物のクローニング、プロセシング、およ
び／または発現を修飾する改変を包含する（但しこれらに限定される訳ではない
）様々な理由で、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドコード配列を改変させるよう
に設計できる。無作為断片化によるＤＮＡシャフリングと遺伝子断片および合成
オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再集合を用いてヌクレオチド配列を設計できる。例
えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新たな制限部位を挿入し、グリコシル化
パターンを変え、コドンの優先性を変え、スプライス変異体を調製し、突然変異
を導入する等を実施できる。

【００８８】抗体 当分野で知られているいかなる型の抗体も、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド
のエピトープと特異的に結合するよう作製できる。本明細書で使用する「抗体」
とは、無処理の免疫グロブリン分子、およびその断片、例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ'
)₂、およびＦｖを包含し、これらはＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドのエピトー
プに結合できる。典型的には、エピトープを形成するためには少なくとも６、８
、１０、または１２の連続するアミノ酸が必要である。しかしながら、非連続ア
ミノ酸を含むエピトープはより多くの、例えば少なくとも１５、２５、または５
０のアミノ酸を必要とするかも知れない。

【００８９】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドのエピトープと特異的に結合する抗体は治療
に使用でき、そして免疫化学検定、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ラ
ジオイムノアッセイ、免疫組織化学検定、免疫沈降、またはその他の当分野で既
知の免疫化学的検定に使用できる。所望の特異性を有する抗体の同定のため、様
々なイムノアッセイが使用できる。競合的結合または免疫放射検定のための多数
のプロトコルが当分野でよく知られている。このようなイムノアッセイは典型的
には、免疫原と、その免疫原に特異結合する抗体との間の複合体形成の測定を含
んでいる。

【００９０】 典型的には、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドと特異的に結合する抗体は、免
疫化学検定に使用する時、他のタンパク質が提供する検出シグナルより少なくと
も５、１０、または２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、ＥＤＧ６
様ＧＰＣＲポリペプチドに特異結合する抗体は、免疫化学検定で他のタンパク質
を検出せず、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドを溶液から免疫沈降させることが
できる。

【００９１】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドは、哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサ
ギ、モルモット、サル、またはヒトを免疫してポリクローナル抗体を産生させる
のに使用できる。所望により、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドは、担体タンパ
ク質、例えば牛血清アルブミン、チログロブリン、およびスカシガイヘモシアニ
ンとコンジュゲートさせることができる。宿主の種に応じて、免疫学的反応を増
大させるために種々のアジュバントを使用できる。このようなアジュバントは、
フロイントアジュバント、鉱物性ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、および界
面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペ
プチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノー
ル）を包含するがこれらに限定されない。ヒトに使用するアジュバントの中では
ＢＣＧ（bacilli Calmette-Guerin）およびCorynebacterium parvumが特に有用
である。

【００９２】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドと特異的に結合するモノクローナル抗体は、
培養中の連続的細胞系により抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて調製
できる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技
術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術があるがこれらに限定されない（Kohler
ら、Nature 256,495-497,1985; Kozborら、J.Immunol.Methods 81,31-42,1985;
Coteら、Proc.Natl.Acad.Sci. 80,2026-2030,1983; Coleら、Mol.Cell Biol. 62
,109-120,1984）。

【００９３】 さらに、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングして適当な抗原
特異性と生物活性を持つ分子を得る、「キメラ抗体」の産生のために開発された
技術が利用できる（Morrisonら、Proc.Natl.Acad.Sci. 81,6851-6855,1984; Neu
bergerら、Nature 312,604-608,1984; Takedaら、Nature 314,452-454,1985）。
モノクローナルおよびその他の抗体はまた、これを治療に使用した場合に患者が
該抗体に対する免疫反応を起こすのを防ぐため、「ヒト化」することができる。
このような抗体は、治療に直接使用できるほど配列が充分ヒトに類似しているか
も知れず、または幾つかの重要残基の変更を必要とするかも知れない。齧歯類の
抗体とヒト配列の間の配列相違は、個々の残基の位置指定突然変異誘発により、
または相補性決定領域全体の格子により、ヒト配列内の残基と相違する残基を置
き換えることによって最小化することができる。別法として、ヒト化抗体はGB21
88638Bに記載のように組換え法を用いて調製できる。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペ
プチドと特異的に結合する抗体は、U.S.5565332に開示のように、部分的または
完全にヒト化した抗原結合部位を含むことができる。

【００９４】 これに代わり、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の調製のために記載
した技術を適合させ、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドに特異結合する一本鎖抗
体を調製することができる。関連する特異性を持つが別個のイディオタイプ組成
を有する抗体を、無作為組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから鎖シャフリ
ングによって調製することができる（Burton, Proc.Natl.Acad.Sci. 88,11120-2
3,1991）。

【００９５】 一本鎖抗体はまた、ハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲのような
ＤＮＡ増幅法を用いて構築することができる（Thirionら、1996, Eur.J.Cancer
Prev. 5,507-11）。一本鎖抗体は単一または二重特異性であり得、また、二価ま
たは四価であり得る。四価二重特異性一本鎖抗体の構築は例えばColoma ＆ Morr
ison, 1997, Nat.Biotechnol. 15,159-63に教示されている。二価二重特異性一
本鎖抗体の構築はMallender ＆ Voss, 1994, J.Biol.Chem. 269,199-206に教示
されている。

【００９６】 下記のように、一本鎖抗体をコードしているヌクレオチド配列を手動または自
動ヌクレオチド合成を用いて構築し、標準的組換えＤＮＡ法を用いて発現構築物
中にクローニングし、そして細胞中に導入してコード配列を発現させることがで
きる。別法として、一本鎖抗体を、例えば繊維ファージ技術を用いて直接調製す
ることもできる（Verhaarら、1995, Int.J.Cancer 61,497-501; Nichollaら、19
93, J.Immunol.Meth. 165,81-91）。

【００９７】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドに特異結合する抗体はまた、リンパ球集団に
おいてインビボ産生を誘導することによって、または、文献に開示されている極
めて特異的な結合試薬のパネルまたは免疫グロブリンライブラリーをスクリーニ
ングすることによって調製することもできる（Orlandiら、Proc.Natl.Acad.Sci.
86,3833-3837,1989; Winterら、Nature 349,293-299,1991）。

【００９８】 その他の型の抗体を、本発明方法において構築し、治療に使用することができ
る。例えば、WO93/03151に開示のように、キメラ抗体を構築することができる。
免疫グロブリンから誘導され多価且つ多重特異的である結合タンパク質、例えば
WO94/13804に記載の「ジアボディイ(diabody)」もまた調製できる。

【００９９】 本発明に係る抗体は当分野で周知の方法により精製できる。例えば、抗体は、
ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドが結合しているカラムを通過させることにより
親和精製できる。次いで、結合した抗体を、高い塩濃度の緩衝液を用いてカラム
から溶出することができる。

【０１００】アンチセンスオリゴヌクレオチド アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対し相
補的なヌクレオチド配列である。いったん細胞中に導入されるとこの相補的ヌク
レオチドは、該細胞が産生した天然配列と結合して複合体を形成し、転写または
翻訳のいずれかを遮断する。好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは少な
くとも１１ヌクレオチド長であるが、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０
、３５、４０、４５、もしくは５０またはそれ以上のヌクレオチド長であっても
よい。より長い配列もまた使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子を
ＤＮＡ構築物に提供し、上記のように細胞中に導入して、その細胞におけるＥＤ
Ｇ６様ＧＰＣＲ遺伝子産物のレベルを低下させることができる。

【０１０１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレ
オチド、またはこの両者の組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドは、１
つのヌクレオチドの５'末端を、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、
ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、
ホスホロアミデート、燐酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボ
キシメチルエステル、カルボネート、および燐酸トリエステルといった非ホスホ
ジエステルヌクレオチド間結合を有する別のヌクレオチドの３'末端と共有結合
させることにより、手動で、または自動合成機によって合成できる。Brown, Met
h.Mol. Biol. 20,1-8,1994; Sonveaux, Meth.Mol.Biol. 26,1-72,1994; Uhlmann
ら、Chem.Rev. 90,543-583,1990を参照されたい。

【０１０２】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ遺伝子の制御、５'、または調節領域と二本鎖を形成する
アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することにより、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ遺
伝子発現の修飾が得られる。転写開始部位、例えば開始部位から−１０および＋
１０位の間から誘導されるオリゴヌクレオチドが好ましい。同様に、「三重らせ
ん」塩基対合法を用いて阻害を達成できる。三重らせん対合は、ポリメラーゼ、
転写因子またはシャペロンが結合するのに十分なほど開く二重らせんの能力の阻
害を引き起こすため、有用である。三本鎖ＤＮＡを用いる治療上の進歩が文献に
記載されている（例えばGeeら、Huber ＆ Carr, MOLECULAR AND IMMUNOLOGIC AP
PROACHES, Futura Publishing Co., Mt.Kisco, N.Y., 1994）。転写物がリボソ
ームに結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するアンチセンスオリ
ゴヌクレオチドもまた設計できる。

【０１０３】 アンチセンスオリゴヌクレオチドとＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの相
補配列との間に好結果の複合体を形成させるためには、正確な相補性は必要ない
。例えばＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドに対し正確に相補的である２、３
、４、もしくは５またはそれ以上の長さの連続するヌクレオチドであって、その
各々が、隣接するＥＤＧ６様ＧＰＣＲヌクレオチドとは相補的ではない連続する
ある長さのヌクレオチドによって隔てられているものを含有するアンチセンスオ
リゴヌクレオチドは、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ ｍＲＮＡに対する充分な標的化特異
性を提供できる。好ましくは、相補的な連続ヌクレオチドの長さはそれぞれ少な
くとも４、５、６、７もしくは８またはそれ以上のヌクレオチド長である。非相
補的な介在配列は、好ましくは１、２、３、または４ヌクレオチド長である。当
業者は、アンチセンス−センスの対の算出融点を容易に使用して、特定のアンチ
センスオリゴヌクレオチドと特定のＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチド配列間
で寛容されるミスマッチの程度を決定できるであろう。

【０１０４】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドと
ハイブリダイズする能力に影響を及ぼすことなく修飾できる。これらの修飾は該
アンチセンス分子の内部、または一端もしくは両端である。例えば、ヌクレオシ
ド間の燐酸結合は、アミノ基と末端リボースの間にいろいろな数の炭素残基を有
するコレステリルまたはジアミン部分を加えることによって修飾できる。修飾さ
れた塩基および／または糖、例えばリボースの代わりのアラビノース、または３
'ヒドロキシ基または５'燐酸基が置換されている３',５'−置換オリゴヌクレオ
チドもまた修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに使用できる。これらの修飾オ
リゴヌクレオチドは当分野で周知の方法により調製できる。例えば、Agrawalら
、Trends Biotechnol. 10,152-158,1992; Uhlmannら、Chem.Rev. 90,543-584,19
90; Uhlmannら、Tetrahedron.Lett. 215,3539-3542,1987を参照されたい。

【０１０５】リボザイム リボザイムは触媒活性を有するＲＮＡ分子である。例えば、Cech, Science 23
6,1532-1539; 1987; Cech, Ann.Rev.Biochem. 59,543-568; 1990, Cech, Curr.O
pin.Struct.Biol. 2,605-609; 1992, Couture ＆ Stinchcomb, Trends Genet. 1
2,510-515, 1996を参照されたい。当分野で知られるように、リボザイムは、Ｒ
ＮＡ配列を開裂することにより遺伝子機能を阻害するのに使用できる（例えば、
Haseloffら、米国特許5641673）。リボザイムの作用機構は、相補的標的ＲＮＡ
に対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後の内ヌ
クレオチド鎖分解性の(endonucleolytic)開裂を含む。例には、特異的ヌクレオ
チド配列の内ヌクレオチド鎖分解性の開裂を特異的且つ効果的に触媒できる、設
計されたハンマーヘッドモチーフリボザイム分子がある。

【０１０６】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドのコード配列、例えば配列番号２に示し
たヌクレオチド配列を用いて、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドから転写さ
れたｍＲＮＡに特異結合するリボザイムを作製できる。他のトランスのＲＮＡ分
子を極めて配列特異的に開裂できるリボザイムを設計し構築する方法が開発され
、当分野で記載されている（Haseloffら、Nature 334,585-591,1988）。例えば
、リボザイムの開裂活性は、別個の「ハイブリダイゼーション」領域を該リボザ
イム中に組み入れることによって、特定のＲＮＡを標的とさせることができる。
このハイブリダイゼーション領域は標的ＲＮＡに対し相補的な配列を含んでおり
、したがってその標的と特異的にハイブリダイズする（例えばGerlachら、EP321
201を参照されたい）。

【０１０７】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ ＲＮＡ標的内部の特異的リボザイム開裂部位は、この標
的分子を、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを包含するリボザイム開
裂部位についてスキャンすることにより同定できる。同定できたならば、該開裂
部位を含む標的ＲＮＡの領域に対応する、１５および２０の間のリボヌクレオチ
ドを有する短いＲＮＡ配列を、標的を非機能的にし得る二次構造の特徴について
評価できる。さらに、候補のＥＤＧ６様ＧＰＣＲ ＲＮＡ標的の適合性を、リボ
ヌクレアーゼ防護検定を用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼー
ションに対する利用可能性を試験することによって評価できる。配列番号２に示
すヌクレオチド配列およびこれらの相補物は、適当なハイブリダイゼーション領
域配列の供給源を提供する。より長い相補配列を用いて、標的に対するハイブリ
ダイゼーション配列の親和性を増大させることができる。リボザイムのハイブリ
ダイズおよび開裂する領域は、相補領域を介して標的ＲＮＡにハイブリダイズす
る時、リボザイムの触媒領域が標的を開裂し得るといったように、完全に相関し
ている。

【０１０８】 リボザイムはＤＮＡ構築物の一部として細胞内に導入できる。マイクロ注入、
リポソーム媒介トランスフェクション、電気穿孔、または燐酸カルシウム沈殿と
いった機械的方法を用いて、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ発現の低下が望まれる細胞中に
リボザイム含有ＤＮＡ構築物を導入することができる。これとは別に、細胞がＤ
ＮＡ構築物を安定的に保持することが望まれる場合は、該構築物をプラスミド上
で供給し、当分野で知られるように、別個の要素として維持するか、または細胞
のゲノム中に組み込むことができる。リボザイムコード化ＤＮＡ構築物は、細胞
中のリボザイムの転写を調節するために、プロモーター要素、エンハンサーまた
はＵＡＳ要素、および転写ターミネーターシグナルといった転写調節要素を含み
得る。

【０１０９】 Haseloffら、米国特許5641673に教示のように、リボザイムは、標的遺伝子の
発現を誘導する因子に応答してリボザイムの発現が起こるように設計することが
できる。リボザイムはまた、追加レベルの調節を提供するよう設計でき、その結
果、ｍＲＮＡの破壊はリボザイムと標的遺伝子の両者が細胞に誘導された時にの
み起こる。

【０１１０】スクリーニング方法 本発明は、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドまたはＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌ
クレオチドに結合する、またはその活性を調節する、被験化合物をスクリーニン
グするための検定を提供する。好ましくは、被験化合物はＥＤＧ６様ＧＰＣＲポ
リペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する。より好ましくは、被験化合物は
、ヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲを介して媒介されるＥＤＧ６またはＥＤＧ６アナログ
の効果を、被験化合物の不在時に比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０
、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下または増大させる。

【０１１１】被験化合物 被験化合物は当分野で既知の薬理学的物質であってよく、または薬理活性を持
っていることが前もって分かっていない化合物であってよい。この化合物は天然
に存在する、または実験室で設計されたものであってよい。これらは、微生物、
動物、または植物から単離されたものであってよく、そして組換え的に調製され
、または当分野で既知の化学的方法により合成されたものであってよい。所望に
より被験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的アドレス特定可能な並行固相
または液相ライブラリー、デコンボルーションを要する合成ライブラリー法、「
一ビーズ一化合物」ライブラリー法、および親和クロマトグラフィー選択を用い
る合成ライブラリー法を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）当分野
で既知の数多くの組み合わせライブラリー法のいずれかを用いて取得できる。生
物学的ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されているが
、他の４種のアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物
の小分子ライブラリーに適用できる。Lam, Anticancer Drug Des. 12,145,1997
を参照されたい。

【０１１２】 分子ライブラリーの合成法は当分野でよく知られている（例えば、DeWittら、
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90,6909,1993; Erbら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
91,11422,1994; Zuckermannら、J.Med.Chem. 37,2678,1994; Choら、Science 2
61,1303,1993; Carellら、Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33,2059,1994; Carellら、
Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33,2061; Gallopら、J.Med.Chem. 37,1233,1994を参
照されたい）。化合物のライブラリーは溶液で（例えば、Houghten, Biotechniq
ues 13,412-421,1992）、またはビーズ(Lam, Nature 354,82-84,1991)、チップ
（Fodor, Nature 364,555-556,1993）、細菌または胞子（Ladner、米国特許5223
409）プラスミド（Cullら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 89,1865-1869,1992）、
またはファージ（Scott ＆ Smith, Science 249,386-390, 1990; Devlin, Scien
ce 249,404-406,1990）;Cwirlaら、Proc.Natl.Acad.Sci.97,6378-6382,1990; Fe
lici, J.Mol.Biol. 222,301-310,1991; およびLadner、米国特許5223409）上に
提供できる。

【０１１３】ハイスループットスクリーニング 被験化合物は、高（ハイ）スループットスクリーニングを用いて、ＥＤＧ６様
ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する能力、またはＥＤＧ６
様ＧＰＣＲ活性もしくはＥＤＧ６様ＧＰＣＲ遺伝子発現に影響を及ぼす能力につ
いてスクリーニングできる。ハイスループットスクリーニングを使用して、多く
の個別的化合物を並行して試験でき、その結果多数の被験化合物を迅速にスクリ
ーニングできる。最も広範に確立されている技術は９６ウェル微量定量プレート
を利用するものである。この微量定量プレートのウェルは、典型的には５０から
５００μｌの範囲の検定容量を必要とする。このプレートに加えて、９６ウェル
フォーマットに適合させた多くの機器、材料、ピペット、ロボット、プレート洗
浄機、およびプレート読み取り機が市販されている。

【０１１４】 別法として、「自由フォーマット検定」、または試料間に物理的障壁を持たな
い検定が使用できる。例えば、組み合わせペプチドライブラリーのための、単純
な均質検定で色素細胞（メラノサイト）を用いる検定が、Jayawickremeら、Proc
.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 19,1614-18(1994)に記載されている。ペトリ皿中のアガ
ロースの下にこの細胞を入れ、次いで組み合わせ化合物を伴っているビーズをア
ガロースの表面に載せる。組み合わせ化合物はこのビーズから化合物を部分的に
放出する。化合物がゲルマトリックス中へと局所的に拡散するにつれて活性化合
物が細胞の色の変化を惹起するため、活性化合物を暗色色素領域として視覚化す
ることができる。

【０１１５】 自由フォーマット検定のもう一つの例は、生体分子スクリーニング学会第１回
年次総会（Philadelphia,Pa.、1995年11月7-10日）で報告されたChelsky、「組
み合わせライブラリーのスクリーニングのための戦略：新規な、そして伝統的な
アプローチ」により記載されている。Chelskyは、カルボニックアンヒドラーゼ
のための単純な均質酵素検定をアガロースゲルの内部に入れ、その結果ゲル中の
酵素がゲル全体に色の変化を惹起するようにさせた。その後、光リンカーを介し
て組み合わせ化合物を持つビーズをゲル内部に入れ、すると該化合物はＵＶ光に
より部分的に放出された。酵素を阻害する化合物は、色の変化がより少ない局所
阻害領域として観察された。

【０１１６】 さらに別の例がSalmonら、Molecular Diversity 2,57-63(1996)に記載されて
いる。この例では、組み合わせライブラリーを、寒天中で生育する癌細胞への細
胞毒性効果を有する化合物についてスクリーニングした。

【０１１７】 もう一つのハイスループットスクリーニング法がBeutelら、米国特許5976813
に記載されている。この方法では、被験試料を多孔性マトリックスに入れる。次
に１またはそれ以上の検定成分を、マトリックス、例えばゲル、プラスチックシ
ート、フィルター、またはその他の形の容易に操作できる固体担体の内部、上、
または底に入れる。試料がこの多孔性マトリックスに導入されるとこれらは充分
ゆっくりと拡散し、その結果、被験試料が混ざらずに検定が遂行できる。

【０１１８】結合検定 結合検定について、被験化合物は好ましくは、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチ
ドの活性部位に結合してこれを占有し、それにより基質をリガンド結合部位に接
近できなくさせる結果、正常な生物活性が妨げられるような小分子である。この
ような小分子の例は小ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、これらに限
定される訳ではない。本発明のポリペプチドに結合する可能性のあるリガンドに
は、既知のＥＤＧ６様ＧＰＣＲの天然リガンドおよびそれらのアナログまたは変
異体が含まれるが、これらに制限されない。

【０１１９】 結合検定では、被験化合物またはＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドのいずれか
が検出可能な標識、例えば蛍光、放射性同位元素、化学ルミネセント、または酵
素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、または
ルシフェラーゼ）を含むことができる。そこで、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチ
ドに結合している被験化合物の検出は、例えば放射能の放出を直接計数すること
により、またはシンチレーション計数により、または検出可能産物への適当な基
質の変換を測定することにより、達成できる。

【０１２０】 別法として、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドへの被験化合物の結合を、反応
体のいずれをも標識せずに測定することができる。例えば、マイクロフィジオメ
ーターを用いて、被験化合物とＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドとの結合を検出
できる。マイクロフィジオメーター（例えばサイトセンサー^TM）とは、細胞がそ
の環境を酸性化する速度を光アドレッサブル電位差センサー（ＬＡＰＳ）を用い
て測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、被験化合物とＥＤＧ６様
ＧＰＣＲポリペプチドの相互作用の指標として使用できる（McConnellら、Scien
ce 257,1906-1912,1992）。

【０１２１】 被験化合物がＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドに結合する能力の測定はまた、
実時間Bimolecular Interaction Analysis（ＢＩＡ）のような技術を用いて達成
できる（Sjolander ＆ Urbaniczky, Anal.Chem. 63,2338-2345,1991、およびSza
boら、Curr.Opin.Struct.Biol. 5,699-705,1995）。ＢＩＡは、いかなる反応体
をも標識せずに、生体特異的相互作用を実時間で研究するための技術である（例
えばBIAcore(登録商標)）。光学的現象表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の変化を
、生体分子間の実時間反応の指標に使用できる。

【０１２２】 本発明のさらに別の態様では、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドを二ハイブリ
ッド検定または三ハイブリッド検定（例えば、米国特許5283317; Zervosら、Cel
l 72,223-232,1993; Maduraら、J.Biol.Chem. 268,12046-12054,1993; Bartelら
、Biotechniques 14,920-924,1993; Iwabuchiら、Oncogene 8,1693-1696,1993;
およびBrent WO94/10300）における「おとりタンパク質」として使用し、ＥＤＧ
６様ＧＰＣＲポリペプチドに結合またはこれと相互作用してその活性を調節する
他のタンパク質を同定することができる。

【０１２３】 二ハイブリッド系はたいていの転写因子のモジュール的性格に基づくものであ
り、それは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインから成っている。簡潔
に述べると、この検定は二種の異なるＤＮＡ構築物を利用する。例えば、一方の
構築物においては、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているポリヌク
レオチドが、既知の転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードしているポリヌクレ
オチドに融合できる（例えばＧＡＬ−４）。別の構築物においては、未同定タン
パク質（「餌」または「試料」）をコードしているＤＮＡ配列が、既知の転写因
子の活性化ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合できる。もし「お
とり」および「餌」タンパク質がインビボで相互作用してタンパク質依存複合体
を形成できたならば、該転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは極めて近
位に招来される。この近位性が、転写因子に応答する転写調節部位と機能的に結
合しているリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。リポータ
ー遺伝子の発現が検出でき、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、ＥＤ
Ｇ６様ＧＰＣＲポリペプチドと相互作用するタンパク質をコードしているＤＮＡ
配列取得に使用することができる。

【０１２４】 反応体の一方または両方の非結合型からの結合型の分離を促進するため、そし
て検定の自動化の便宜を図るため、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポ
リヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固定化することが望ましいかも
知れない。したがって、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオ
チド）または被験化合物のいずれかを固体支持体に結合させることができる。好
適な固体支持体は、ガラスまたはプラスチックスライド、組織培養プレート、微
量定量ウェル、管、シリコンチップ、またはビーズ（ラテックス、ポリスチレン
、またはガラスビーズを包含するがこれらに限定されない）のような粒子を包含
するがこれらに限定されない。共有および非共有結合、受動吸収、またはそれぞ
れポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物に付着させた結合
部分と固体支持体の対、の使用を包含する、当分野で既知の任意の方法を用いて
ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物
を固体支持体に付着させることができる。被験化合物は好ましくは整列して固体
支持体に結合させ、その結果個々の被験化合物の位置を追跡することができる。
ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）への被験化合物の
結合は、反応体を入れるのに適した任意の容器で達成できる。かかる容器の例に
は微量定量プレート、試験管、および微量遠沈管がある。

【０１２５】 一つの態様において、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドは、ＥＤＧ６様ＧＰＣ
Ｒポリペプチドを固体支持体に結合させるドメインを含む融合タンパク質である
。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質をグルタチオ
ンセファロースビーズ（Sigma Chemical, St.Louis, Mo.）上またはグルタチオ
ン誘導体化微量定量プレート上に吸着させ、次いでこれを被験化合物または被験
化合物および非吸着ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドに合し；次にこの混合物を
複合体形成が行われる条件下でインキュベートする（例えば、塩およびpHに関し
て生理的条件）。インキュベーションの後、ビーズまたは微量定量プレートのウ
ェルを洗浄して未結合成分を除去する。反応体の結合は上記のように直接的また
は間接的に測定できる。別法として、複合体を固体支持体から解離させた後に結
合を測定することもできる。

【０１２６】 本発明に係るスクリーニング検定には、タンパク質またはポリヌクレオチドを
固体支持体上に固定化するためのその他の技術を使用することもできる。例えば
、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合
物のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用し
て固定化できる。当分野で周知の技術（例えばビオチニル化キット、Pierce Che
micals, Rockford,Ill.）を用いて、ビオチニル化したＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリ
ペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物をビオチン−ＮＨＳ（Ｎ
-ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン被覆した９６ウ
ェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定化できる。別法として、ＥＤ
Ｇ６様ＧＰＣＲポリペプチド、ポリヌクレオチド、または被験化合物と特異的に
結合するが、所望の結合部位、例えばＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドの活性部
位に干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができる。未結合の
標的またはタンパク質が抗体コンジュゲーションによりウェル中に捕捉できる。

【０１２７】 ＧＳＴ−固定化複合体について上に記載した方法に加え、このような複合体を
検出する方法には、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドまたは被験化合物に特異結
合する抗体を用いる、複合体の免疫検出、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドの活
性検出へと引き継がれる酵素結合検定、および非還元条件下でのＳＤＳゲル電気
泳動がある。

【０１２８】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する被験化合
物を求めるスクリーニングは、無傷の細胞で実施することもできる。ＥＤＧ６様
ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む任意の細胞が、細胞に基づ
く検定系で使用できる。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは細胞中に天然に
存在し、または上記のような技術を用いて導入できる。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリ
ペプチドまたはポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合は、上記のように測
定する。

【０１２９】機能検定 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドの生物学的効果を増大または低下させる能力
について被験化合物を試験できる。かかる生物学的効果は、下記の具体的実施例
に記載の機能検定を用いて測定できる。機能検定は、精製したＥＤＧ６様ＧＰＣ
Ｒポリペプチド、細胞膜調製物、または無傷の細胞を被験化合物と接触させた後
に実施できる。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲの機能的活性を少なくとも約１０、好ましく
は約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる被験化合物
を、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ活性を低下させる可能性のある物質として同定する。Ｅ
ＤＧ６様ＧＰＣＲ活性を少なくとも約１０、好ましくは約５０、より好ましくは
約７５、９０、または１００％増大させる被験化合物を、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ活
性を増大させる可能性のある物質として同定する。

【０１３０】 そのようなスクリーニング方法の１つは、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドを
発現するようトランスフェクトしたメラノフォア（メラニン細胞）の使用を含む
。そのようなスクリーニング技術は１９９２年２月６日に公開されたＷＯ９２/
０１８１０に記載されている。したがって、例えば、この受容体を含むメラニン
細胞を、その受容体リガンド（例えば、ＥＤＧ６またはＥＤＧ６アナログ）とス
クリーニングされる被験化合物の両方と接触させる検定を用いて、この受容体ポ
リペプチドの活性を阻害する化合物をスクリーニングすることができる。このリ
ガンドによって発せられるシグナルを阻害することは、被験化合物がこの受容体
のアンタゴニスト、即ちこの受容体の活性を阻害することを示している。前記細
胞を、スクリーニングされる化合物と接触させるスクリーニングを行なうことで
、この受容体を活性化する被験化合物を同定し、各々の被験化合物がシグナルを
発するか否か、即ちこの受容体を活性化するか否かを決定することができる。

【０１３１】 その他のスクリーニング技術には、受容体の活性化によって引き起こされる細
胞外ｐＨ変化を測定する系におけるヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドを発現
する細胞（例えば、トランスフェクトＣＨＯ細胞）の使用が含まれる（例えば、
Science 246, 181-296, 1989を参照のこと）。例えば被験化合物を、ヒトＥＤＧ
６様ＧＰＣＲポリペプチドを発現する細胞と接触させ、そして二次メッセンジャ
ー応答、例えばシグナル伝達またはｐＨ変化を測定して、被験化合物が受容体を
活性化するか、または阻害するかを決定することができる。

【０１３２】 別のこのようなスクリーニング技術には、その受容体を一過的に発現させるべ
くヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードするＲＮＡをゼノパス(Xenopus
)卵母細胞中に導入することが含まれる。その後、このトランスフェクトした卵
母細胞をその受容体リガンドおよびスクリーニングされる被験化合物と接触させ
、次いでカルシウムシグナルの阻害または活性化を検出し、その場合に、受容体
の活性を阻害すると考えられる被験化合物をスクリーニングすることができる。

【０１３３】 別のスクリーニング技術には、本受容体がホスホリパーゼＣまたはＤと関連し
ている細胞において、ヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドを発現させることが
含まれる。そのような細胞には、内皮細胞、平滑筋細胞、胚の腎細胞などが含ま
れる。ホスホリパーゼ活性の変化から受容体の活性化の程度を定量化して、この
スクリーニングを上記のように行なうことができる。

【０１３４】 上に記載のような機能検定の詳細は、下記の具体的実施例に提供する。

【０１３５】ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ遺伝子発現 別の態様では、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ遺伝子の発現を増大または減少させる被験
化合物を同定する。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを被験化合物と接触さ
せ、ＲＮＡまたはＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドのポリペプチド産物の発
現を測定する。被験化合物存在下での適当なｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現
レベルを、該被験化合物不在下でのｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現レベルと
比較する。すると被験化合物が、この比較に基づく発現のモジュレーターとして
同定できる。例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在
時よりも存在時により大きい場合は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリ
ペプチド発現の刺激物質または増強物質と同定する。そうではなく、ｍＲＮＡま
たはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時により小さい場合
は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のインヒビターと同
定する。

【０１３６】 細胞におけるＥＤＧ６様ＧＰＣＲ ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現のレベル
は、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを検出するための当分野で周知の方法により決
定できる。定性または定量的方法のいずれかが使用できる。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ
ポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存在は、例えばラジオイムノアッセイの
ような免疫化学的方法、ウエスタンブロッティング、および免疫組織化学を包含
する、当分野で周知の様々な技術を用いて決定できる。別法として、ポリペプチ
ド合成は、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド内への標識アミノ酸の取り込みを検
出することにより、インビボで、細胞培養で、またはインビトロ翻訳系で決定で
きる。

【０１３７】 このようなスクリーニングは、無細胞検定系または無傷の細胞のいずれかで実
施できる。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを発現するいかなる細胞も細胞
に基づく検定系で使用できる。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは細胞内に
天然に存在するか、または上記のような技術を用いて導入することができる。一
次培養または確立された細胞系、例えばＣＨＯまたはヒト胚性腎２９３細胞のい
ずれかを使用できる。

【０１３８】医薬組成物 本発明はさらに、治療効果を達成するために患者に投与できる医薬組成物を提
供する。本発明に係る医薬組成物は、例えばＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド、
ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチド、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドと特異
的に結合する抗体、または類似体、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＥＤＧ
６様ＧＰＣＲポリペプチド活性のインヒビターを含み得る。この組成物は単独で
、または少なくとも１種類の他の物質、例えば安定化化合物と組み合わせて投与
でき、これは、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、および水を包含する（
但しこれらに限定されない）任意の無菌で生物学的適合性のある製薬的担体中で
投与できる。この組成物は単独で、または他の物質、薬物またはホルモンと組み
合わせて患者に投与できる。

【０１３９】 活性成分に加えてこれらの医薬組成物は、賦形剤および補助物質を含む適当な
製薬的に許容し得る担体を含有でき、これらは、製薬的に使用できる調製物への
活性化合物の処理を促進する。本発明に係る医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉
内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局
所、舌下、または直腸手段を包含する（但しこれらに限定されない）多くの経路
により投与できる。経口投与用医薬組成物は、当分野で既知の製薬的に許容し得
る担体を用いて経口投与に適した用量に調合できる。このような担体により、該
医薬組成物を、患者が内服するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液体、
ゲル、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などに調合できる。

【０１４０】 経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を、固体賦形剤と合し、得られた混
合物を所望により粉砕し、そしてこの顆粒混合物を、所望ならば適当な補助物質
を加えた後に処理して錠剤または糖衣剤核を得る。好適な賦形剤は炭水化物また
はタンパク質増量剤、例えば乳糖、シュクロース、マンニトール、またはソルビ
トールを包含する糖；トウモロコシ、小麦、米、馬鈴薯、またはその他の植物由
来の澱粉；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセ
ルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム；アラビアゴムおよび
トラガカントゴムを包含するゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのような
タンパク質である。所望により崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピ
ロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添
加できる。

【０１４１】 糖衣剤核は、濃縮糖溶液のような適当な被覆剤と共に使用でき、これはさらに
、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポル(carbopol)ゲル、
ポリエチレングリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および
適当な有機溶媒または溶媒混合物を含むことができる。製品の同定のためまたは
活性化合物の量、即ち用量をあらわすために染料または色素を錠剤または糖衣被
覆剤に添加できる。

【０１４２】 経口的に使用できる医薬調合物は、ゼラチン製の押してはめ込むカプセル剤、
ならびに、ゼラチンおよび被覆剤、例えばグリセロールまたはソルビトールでで
きた軟封入カプセル剤を包含する。押してはめ込むカプセル剤は、活性成分を、
乳糖または澱粉のような増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネ
シウムのような潤滑剤、および所望により安定剤と混合して含有できる。軟カプ
セル剤では、活性化合物を、安定剤を加えた、または加えない適当な液体、例え
ば脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁できる。

【０１４３】 非経口投与に好適な医薬製剤は、水溶液、好ましくは生理学的適合性の緩衝液
、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的に緩衝化した食塩水中で
調合できる。水性注射用懸濁剤は、該懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカ
ルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含
有できる。さらに、活性化合物の懸濁剤は適当な油性注射用懸濁剤として調製で
きる。好適な親油性溶媒または媒質は、胡麻油のような脂肪油、またはオレイン
酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソーム
を包含する。非脂質ポリカチオンアミノポリマーもまた送達に使用できる。所望
により懸濁剤は、化合物の溶解性を増し高濃縮溶液の調製を可能にするような適
当な安定剤または物質を含むことができる。局所または鼻腔投与のためには、透
過すべき特定の障壁に対し適当な浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は
当分野で一般に知られている。

【０１４４】 本発明に係る医薬組成物は当分野で既知の方法で、例えば常套的混合、溶解、
顆粒化、糖衣剤製造、すりつぶし、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥プ
ロセスによって製造できる。この医薬組成物は塩として提供でき、塩酸、硫酸、
酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、琥珀酸などを包含する（但しこれらに限定さ
れない）多くの酸を用いて調製できる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒に
おいて、対応する遊離塩基型よりもより可溶性の傾向がある。別の場合には、好
ましい調製物は、pH範囲４.５から５.５において以下のもの：１−５０mMヒスチ
ジン、０.１％−２％シュクロース、および２−７％マンニトール、の全てまた
は任意のものを含有できる凍結乾燥粉末であってよく、これを使用前に緩衝液と
合する。

【０１４５】 調合と投与のための技術のさらなる詳細は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCI
ENCES（Maack Publishing Co., Easton, Pa）の最新版に見出すことができる。
医薬組成物を製造した後、これらを適当な容器に入れ、適応状態の治療のために
ラベルを貼る。このようなラベル表示は、投与の量、頻度、および投与方法を包
含する。

【０１４６】治療上の適応および方法 ＧＰＣＲは哺乳類の宿主に広範囲に分布し、多くの病理を包含するたくさんの
生体機能を担っている。したがって、一方ではＧＰＣＲを刺激し、他方ではＧＰ
ＣＲの機能を阻害する化合物および薬物を発見することが望まれる。例えば、Ｇ
ＰＣＲを活性化する化合物を治療目的、例えば喘息、パーキンソン病、急性心不
全、尿閉および骨粗鬆症を処置するために用いることができる。詳細には、ＧＰ
ＣＲを活性化する化合物は、様々な心血管の病気、肺血流欠乏または高血圧症に
よって引き起こされる病気を処置するのに有用である。加えて、これらの化合物
を用いて、体液および電解液ホメオスタシスの異常な制御に関連する様々な生理
的疾患、並びに異常なアンジオテンシン誘導性アルドステロン分泌に関係する疾
患を処置することができる。

【０１４７】 一般に、ＧＰＣＲの活性化を阻害する化合物を様々な治療目的、例えば、低血
圧症および／または高血圧症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良
性前立腺肥大症、並びに統合失調症、躁病性興奮、うつ病、譫妄、痴呆または様
々な精神遅滞を含む精神病および神経病、ジスキネジア（例えば、ハンチントン
病若しくはテューレット症候群）、その他のものを処置するために用いることが
できる。また、ＧＰＣＲを阻害する化合物も内在的摂食障害を回復させるのに、
過食症を制御するのに、および例えば過剰な肺の血流または高血圧によって引き
起こされる種々の心血管の病気を処置するのに有用である。

【０１４８】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲの調節は炎症過程に伴う皮膚病を処置するのに特に有用で
ある。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ調節を用いて、内部器官の疾患（急性または慢性炎症
コンポーネントを記載する、例えば間接疾患（関節炎）；気道の疾患（喘息、鼻
炎、アレルギーおよび慢性閉塞性肺疾患）；炎症性腸疾患（大腸炎）；および、
一時的な血管の病的閉塞によってもたらされる再灌流ダメージ（心臓、腸または
腎臓に対する））を処置することができる。加えて、複数の硬化症およびショッ
クを処置することができ、同様に炎症過程の他の疾患、および白血球などの細胞
の形成や発育が病的に増加する疾患、あるいは動脈硬化症を処置することができ
る。

【０１４９】 本発明はさらに、上記のスクリーニング検定により同定する新規物質の使用に
関するものである。したがって、本明細書に記載のように定義する被験化合物を
適当な動物モデルに使用することが、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書
記載のように特定する物質（例えば、調節物質、アンチセンス核酸分子、特異抗
体、リボザイム、またはＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド結合分子）を動物モデ
ルに使用して、かかる物質による治療の有効性、毒性、または副作用を決定する
ことができる。これとは別に、本明細書に記載のように定義する物質は、かかる
物質の作用機構を決定するための動物モデルに使用できる。さらに、本発明は、
本明細書記載の治療のための上記スクリーニング検定により同定する新規物質の
用途・使用に関するものである。

【０１５０】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ活性に影響を及ぼす試薬をインビトロまたはインビボでヒ
ト細胞に投与し、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ様活性を低下させることができる。この試
薬は好ましくはヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲ遺伝子の発現産物に結合する。発現産物
がタンパク質である場合、この試薬は好ましくは抗体である。ヒト細胞をex viv
oで治療するために、身体から取り出した幹細胞の調製物に抗体を添加できる。
次いでこの細胞を、当分野で既知のクローン増幅を行って、または行わずに、同
じまたは別のヒトの身体に戻すことができる。

【０１５１】 一つの態様では、この試薬はリポソームを用いて送達する。好ましくはリポソ
ームは、投与される動物中で少なくとも約３０分間、より好ましくは少なくとも
約１時間、さらに好ましくは少なくとも約２４時間安定である。リポソームは、
試薬、とりわけポリヌクレオチドを動物、例えば人間の特定部位に標的化できる
脂質組成物を含んでいる。好ましくはリポソームのこの脂質組成物は、動物の特
定の臓器、例えば肺、肝臓、脾臓、心臓、脳、リンパ節、および皮膚を標的とす
ることができる。

【０１５２】 本発明において有用なリポソームは、標的細胞の細胞質膜と融合してその内容
物を細胞へと運搬できる脂質組成物を含んでいる。好ましくは、リポソームのト
ランスフェクション効率は、約１０⁶細胞に送達されるリポソーム１６nmoleあた
りＤＮＡ約０.５μg、より好ましくは約１０⁶細胞に送達されるリポソーム１６n
moleあたりＤＮＡ約１.０μg、さらに好ましくは約１０⁶細胞に送達されるリポ
ソーム１６nmoleあたりＤＮＡ約２.０μgである。好ましくは、リポソームは直
径が約１００および５００nmの間、より好ましくは約１５０および４５０nmの間
、そしてさらに好ましくは約２００および４００nmの間である。

【０１５３】 本発明での使用にとって好適なリポソームには、例えば当業者に知られる遺伝
子送達法で標準的に用いるリポソームが包含される。より好ましいリポソームは
、ポリカチオン脂質組成物を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリ
コールとコンジュゲートしたコレステロールバックボーンを有するリポソームを
包含する。所望により、リポソームはこのリポソームを腫瘍細胞、例えばリポソ
ームの外表面に暴露している腫瘍細胞リガンドへと標的化できる化合物を含む。

【０１５４】 リポソームと、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムのような試
薬との複合体形成が、当分野において標準的な方法を用いて達成できる（例えば
米国特許5705151）。好ましくは約０.１μgから約１０μgのポリヌクレオチドを
約８nmolのリポソームと、より好ましくは約０.５μgから約５μgのポリヌクレ
オチドを約８nmolのリポソームと、そしてさらに好ましくは約１.０μgのポリヌ
クレオチドを約８nmolのリポソームと合する。

【０１５５】 別の態様では、受容体媒介標的化送達を用いて抗体を特異的組織にインビボ送
達できる。受容体媒介ＤＮＡ送達技術は、例えばFindeisら、Trends in Biotech
nol. 11,202-05(1993); Chiouら、GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIO
NS OF DIRECT GENE TRANSFER（J.A.Wolff編）(1994); Wu ＆ Wu, J.Biol.Chem.
263,621-24(1988); Wuら、J.Biol.Chem. 269,542-46(1994); Zenkeら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A. 87,3655-59(1990); Wuら、J.Biol.Chem. 266,338-42(1991)
に教示されている。

【０１５６】治療的有効量の決定 治療的有効量の決定は、充分当業者の能力の範囲内にある。治療的有効量とは
、治療的有効量の不在下で起こるＥＤＧ６様ＧＰＣＲ活性に比較してＥＤＧ６様
ＧＰＣＲ活性を増大させ、または低下させる活性成分の量を指す。

【０１５７】 いかなる化合物に関しても、治療的有効量は最初に細胞培養検定で、または動
物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタで見積もることができる。動
物モデルは適当な濃度範囲および投与経路の決定にも使用できる。次にこのよう
な情報を用いて人間での有用な用量と投与経路を決定できる。

【０１５８】 治療的有効性および毒性、例えばＥＤ₅₀（集団の５０％で治療的に有効な用量
）およびＬＤ₅₀（集団の５０％で致死的な用量）は、細胞培養または実験動物に
おける標準的薬学的方法により決定できる。治療効果に対する毒性効果の用量比
が治療指数であり、比ＬＤ₅₀／ＥＤ₅₀で表すことができる。

【０１５９】 大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養検定および動物研究か
ら得られるデータを、人間への使用のための用量範囲を処方する際に使用する。
かかる組成物に含まれる用量は、好ましくは殆どまたは全く毒性を持たないＥＤ₅₀ を包含する循環濃度の範囲内である。この用量は、使用する用量型、患者の感
受性、および投与経路に応じてこの範囲内で変わる。

【０１６０】 正確な用量は、治療を必要とする対象に関連する因子に照らして医師が決定す
る。用量および投与は、充分なレベルの活性成分を提供するよう、または所望の
効果を保持するよう、調節する。考慮できる因子は、疾病状態の重篤度、対象の
全身健康状態、年齢、体重、および対象の性別、食餌、投与の時間および頻度、
薬物の組み合わせ、反応の感受性、および療法に対する寛容／応答を包含する。
長時間作用性医薬組成物は、その製剤の半減期およびクリアランス率に応じて３
から４日毎、毎週、または２週間に１回投与することができる。

【０１６１】 標準的な用量は投与経路に応じて０.１から１００,０００マイクログラムまで
変えることができ、約１gまでの総用量とすることができる。特定の用量および
送達方法についての指針は文献に提供されており、一般に当分野の医師が入手で
きる。当業者は、ヌクレオチド用にはタンパク質またはそれらのインヒビター用
のものとは異なる製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドの送達は特定の細胞、状態、場所などに特異的である。

【０１６２】 この試薬が一本鎖抗体である場合、この抗体をコードしているポリヌクレオチ
ドを構築し、トランスフェリン−ポリカチオン−媒介ＤＮＡ転移、裸のまたはカ
プセル内核酸を用いるトランスフェクション、リポソームの媒介する細胞融合、
ＤＮＡ被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染
、電気穿孔、「遺伝子銃」、およびＤＥＡＥ−または燐酸カルシウム−媒介トラ
ンスフェクションを包含する（但しこれらに限定される訳ではない）充分確立し
た技術を用いて、ex vivoまたはインビボで細胞内に導入できる。

【０１６３】 抗体の有効なインビボ用量は、約５μgから約５０μg/kg、約５０μgから約５
mg/kg、約１００μgから約５００μg/kg（患者の体重）、および約２００から約
２５０μg/kg（患者の体重）の範囲である。一本鎖抗体をコードしているポリヌ
クレオチドの投与のためには、有効なインビボ用量は、約１００ngから約２００
ng、５００ngから約５０mg、約１μgから約２mg、約５μgから約５００μg、お
よび約２０μgから約１００μgのＤＮＡの範囲である。

【０１６４】 発現産物がｍＲＮＡである場合、試薬は好ましくはアンチセンスオリゴヌクレ
オチドまたはリボザイムである。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザ
イムを発現するポリヌクレオチドは、上記のように多岐にわたる方法によって細
胞中に導入できる。

【０１６５】 好ましくは、試薬は、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ遺伝子の発現またはＥＤＧ６様ＧＰ
ＣＲポリペプチドの活性を、該試薬の不在時と比較して少なくとも約１０、好ま
しくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下させる。ＥＤ
Ｇ６様ＧＰＣＲ遺伝子の発現レベルまたはＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドの活
性を低下させるよう選択した機構の有効性は、当分野で周知の方法、例えばＥＤ
Ｇ６様ＧＰＣＲ特異的ｍＲＮＡへのヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーシ
ョン、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドの免疫学的検出、
またはＥＤＧ６様ＧＰＣＲ活性の測定を用いて評価できる。

【０１６６】 上記のいずれの態様においても、本発明に係る任意の医薬組成物は他の適当な
治療薬と組み合わせて投与できる。併用療法に使用するための適当な物質の選択
は、常套的製薬原理に従い、当業者により実施することができる。治療薬の組み
合わせは、相乗的に働いて、上記の様々な疾患の治療または予防を奏効させる。
このアプローチを用いて、より低い各物質の用量で治療効果を達成することがで
き、したがって有害な副作用の可能性を低減することができる。

【０１６７】 上記の治療方法のいずれも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、
および最も好ましくはヒトといった哺乳動物を包含する、このような治療を必要
とする任意の対象に適用することができる。

【０１６８】診断方法 ＧＰＣＲはさらに、ＧＰＣＲをコードしている核酸配列における突然変異の存
在に関連する疾病および異常、または疾病および異常に対する感受性を検出する
診断検定に使用できる。このような疾患は、実例として、例えば、腫瘍および癌
などの細胞の形質転換体、および低血圧症および高血圧症を含む様々な心血管疾
患、並びに異常な血流、異常なアンジオテンシン誘導性アルドステロン分泌、お
よびその他の体液および電解液ホメオスタシスの異常な制御から生じる疾患に関
する。

【０１６９】 疾病に罹患している個体と正常な個体とにおけるＧＰＣＲをコードしているｃ
ＤＮＡまたはゲノム配列の間の相違を決定できる。もし罹患している個体の幾つ
かまたは全てに突然変異が観察され、正常な個体には観察されないならば、この
突然変異がその疾病の原因であると思われる。

【０１７０】 レファレンス遺伝子および突然変異を有する遺伝子の間の配列相違は、直接Ｄ
ＮＡ配列決定法によって明らかにできる。加えて、クローニングしたＤＮＡセグ
メントを、特定のＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして使用できる
。この方法の感受性はＰＣＲと組み合わせる時極めて増強される。例えば、二本
鎖ＰＣＲ産物または修飾ＰＣＲにより調製された一本鎖鋳型分子と共に、配列決
定プライマーを使用することができる。配列決定は、放射標識したヌクレオチド
を用いる常套的方法によって、または蛍光標識を使用する自動配列決定法によっ
て実施する。

【０１７１】 ＤＮＡ配列相違に基づく遺伝子試験は、変性させる物質を含むまたは含まない
ゲル中のＤＮＡ断片の電気泳動移動度の変化を検出することにより実施できる。
小配列の欠失および挿入は、例えば高分解能ゲル電気泳動によって視覚化できる
。異なる配列のＤＮＡ断片は変性させるホルムアミド勾配ゲル上で識別でき、こ
こでは、異なるＤＮＡ断片の移動度が、それらの特異的融解温度または部分的融
解温度に従って、ゲル中の異なる位置で遅延する（例えば、Myersら、Science 2
30,1242,1985を参照されたい）。特定の位置での配列改変もまたヌクレアーゼ保
護検定、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂法によって明らかに
することができる（例えば、Cottonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,4397-4401,
1985）。即ち特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、ＲＮアーゼ
保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定といった方法によって、または制限酵素
とゲノムＤＮＡのサザンブロッティングを使用することによって実施できる。ゲ
ル電気泳動およびＤＮＡ配列決定のような直接法に加えて、突然変異はin situ
分析により検出することもできる。

【０１７２】 ＧＰＣＲレベルの変化もまた種々の組織で検出できる。血液または組織生検の
ように、宿主から誘導した身体試料中の受容体ポリペプチドのレベルを検出する
ために用いる検定は、当業者に周知であり、ラジオイムノアッセイ、競合的結合
検定、ウェスタンブロット分析、およびELISA検定を包含する。

【０１７３】 本明細書に引用する全ての特許および特許出願は、引用により特に本明細書の
一部とする。上記の内容は本発明を一般的に記載するものである。より完全な理
解は以下の具体的実施例を参照することによって得られ、それらの実施例は例示
のみの目的で提供するものであり、本発明の範囲を限定する意図は無い。

【０１７４】実施例１ ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ活性の検出 配列番号：２に記載のポリヌクレオチドを発現ベクターｐＣＥＶ４に挿入し、
得られた発現ベクターｐＣＥＶ４−ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをヒト胚の
腎臓２９３細胞にトランスフェクトする。その細胞を培養フラスコから掻き出し
、トリスＨＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７.５、５ｍｌ中にとり超音波処理して
溶解させる。細胞の溶解物を１０００ｒｐｍの遠心分離を４℃で５分間行なう。
その上清を３０,０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離する。そのペレットを、
５０ｍＭ トリスＨＣｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、ｐＨ７.５を含み、０.１％ ＢＳＡ、２μｇ/ｍｌ アプロチニン、０.５
ｍｇ/ｍｌ ロイペプチンおよび１０μｇ/ｍｌ ホスホラミドンを補助添加した結
合バッファー中に懸濁する。添加する放射リガンド、即ち¹²⁵Ｉ−標識化ＥＤＧ
６の１０％未満と結合するのに必要とされるタンパク質濃度で規定される最適な
膜懸濁物の希釈物を、リガンド、非標識化ペプチド、および結合バッファーを含
む９６ウェルポリプロピレン微量定量プレートに添加し、最終量を２５０μｌと
する。

【０１７５】 平衡飽和結合検定において、膜調製物を¹²⁵Ｉリガンドの増大濃度（０.１ｎＭ
〜４ｎＭ）の存在下でインキュベートする。

【０１７６】 結合反応混合物を３０℃で１時間インキュベートする。この反応を、０.５％
ポリエチレンイミンを用いて処理したＧＦ/Ｂフィルターに通じてろ過し、反応
を停止させ、細胞を回収する。放射活性をシンチレーション計数して計測し、デ
ータをコンピューターによる非線形回帰プログラムによって分析する。非特異的
結合は、非標識化ペプチド１００ｎＭの存在下にて、膜タンパク質をインキュベ
ートした後に残存する放射活性の量として規定される。タンパク質濃度を、標準
的としてウシ血清アルブミンと共にBio-Rad Reagentを用いるBradford法により
測定する。配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドのＥＤＧ６様
ＧＰＣＲ活性を実証する。

【０１７７】実施例２ 放射リガンド結合検定 ヒトＥＤＧ６様ＣＰＣＲを発現するポリヌクレオチドを用いてトランスフェク
トしたヒト胚の腎臓２９３細胞を培養フラスコから掻き出し、トリスＨＣｌ、５
ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７.５、５ｍｌ中にとり超音波処理して溶解させる。細胞の
溶解物を１０００ｒｐｍの遠心分離を４℃で５分間行なう。その上清を３０,０
００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離する。そのペレットを、５０ｍＭ トリスＨ
Ｃｌ、５ｍＭ ＭｇＳＯ₄、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.５
を含み、０.１％ ＢＳＡ、２μｇ/ｍｌ アプロチニン、０.５ｍｇ/ｍｌ ロイペ
プチンおよび１０μｇ/ｍｌ ホスホラミドンを補助添加した結合バッファー中に
懸濁する。添加する放射リガンド、即ちＥＤＧ６の１０％未満と結合するのに必
要とされるタンパク質濃度で規定される最適な膜懸濁物の希釈物を、¹²⁵Ｉ−標
識化リガンドまたは被験化合物、非標識化ペプチド、および結合バッファーを含
む９６ウェルポリプロピレン微量定量に添加し、最終量を２５０μｌとする。

【０１７８】 平衡飽和結合検定において、膜調製物を、¹²⁵Ｉ標識化リガンドの増大濃度（
０.１ｎＭ〜４ｎＭ）または被験化合物（特異的活性 ２２００Ｃｉ/ｍｍｏｌ）
の存在下でインキュベートする。種々の被験化合物の結合親和度を、各々１２種
の異なる濃度の被験化合物の存在下にて０.１ｎＭ ¹²⁵Ｉ−ペプチドを用いる平
衡競合結合検定にて決定する。

【０１７９】 結合反応混合物を３０℃で１時間インキュベートする。この反応を、０.５％
ポリエチレンイミンを用いて処理したＧＦ/Ｂフィルターに通じてろ過し、反応
を停止させ、細胞を回収する。放射活性をシンチレーション計数により計測し、
データをコンピューターによる非線形回帰プログラムによって分析する。

【０１８０】 非特異的な結合は、非標識化ペプチド１００ｎＭの存在下にて、膜タンパク質
をインキュベートした後に残存する放射活性の量として規定される。タンパク質
濃度を、標準的として、ウシ血清アルブミンと共にBio-Rad Reagentを用いるBra
dford法により測定する。膜タンパク質の放射活性を、被験化合物を用いてイン
キュベートしなかった膜タンパク質の放射活性と比較して、少なくとも１５％ま
で増大させる被験化合物を、ヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドに結合する化
合物と同定する。

【０１８１】実施例３ ヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲ媒介サイクリックＡＭＰ形成における被験化合物の効果 受容体媒介ｃＡＭＰ形成の阻害は、ヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲを発現する宿主細
胞において検定することができる。細胞を、９６ウェルプレートに蒔き、１０ｍ
Ｍ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ テオフィリン、２μｇ/ｍｌ アプロチニン、０.５ｍｇ/
ｍｌ ロイペプチンおよび１０μｇ/ｍｌ ホスホラミドンを補助添付したダルベ
ッコリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）において、５％ＣＯ₂下にて３７℃、２０分間
インキュベートする。その培地を吸引し、１００ｍＭ ＨＣｌを添加して、その
反応を停止させる。そのプレートを４℃で１５分間保存する。この反応を停止さ
せた溶液中のｃＡＭＰ含有量を放射免疫測定によって測定する。

【０１８２】 放射活性を、データ換算ソフトウェアーを備えたガンマ計測器を用いて定量化
する。被験化合物の非存在下でウェル中の内容物の放射活性と比較して、ウェル
中の内容物の放射活性を減少させる被験化合物を、ｃＡＭＰの形成を阻害する可
能性のあるインヒビターとして同定する。被験化合物の非存在下でウェル中の内
容物の放射活性と比較して、ウェル中の内容物の放射活性を増大させる被験化合
物を、ｃＡＭＰの形成を増大させる可能性のあるエンハンサーとして同定する。

【０１８３】実施例４ 細胞内カルシウム流動化における被験化合物の効果 細胞内の遊離カルシウム濃度は、蛍光指標染色Ｆｕｒａ−２/ＡＭ（Bushら、J
Neurochem. 57,56274,1991）を用いた顕微分光蛍光光度計によって測定するこ
とができる。安定なトランスフェクト細胞を、ガラスのカバースリップ挿入を含
む３５ｍｍ培養皿にシードする。細胞をＨＢＳで洗浄し、被験化合物と共にイン
キュベートし、そしてＦｕｒａ−２/ＡＭ（１０μＭ）１００μｌを２０〜４０
分間充填する。ＨＢＳを用いて洗浄してＦｕｒａ−２/ＡＭ溶液を取り除き、細
胞をＨＢＳ中にて１０〜２０分間平衡化する。その後、細胞をＬｅｉｔｚ Ｆｌ
ｕｏｖｅｒｔ ＦＳマイクロスコープの４０×対物レンズの下で可視化する。

【０１８４】 ３４０ｎＭ〜３８０ｎＭの間で変更する励起波長を用いて、５１０ｎＭの蛍光
発光を決定する。生の蛍光データを基準カルシウム濃度およびソフトウェアー解
析技術を用いて、カルシウム濃度に変換する。被験化合物の非存在下における蛍
光と比較して、少なくとも１５％蛍光を増大させる被験化合物を、細胞内カルシ
ウムを流動化させる化合物として規定する。

【０１８５】実施例５ ホスホイノシチド代謝における被験化合物の効果 ヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲｃＤＮＡを安定に発現する細胞を、９６ウェルプレー
トにプレーティングし、増殖させて密集させる。検定を行なう前日に、培養培地
を、１％の血清と０.５μＣｉ³Ｈ−ミノシトール(myinositol)を含む培地１００
μｌに交換する。そのプレートをＣＯ₂インキュベーター（３７℃で、５％ ＣＯ₂ ）において一晩中、インキュベートする。検定の直前に、その培地を取り除き
、１０ｍＭ ＬｉＣｌを含むＰＢＳ２００μｌに置き換え、その細胞を新しい培
地で２０分間、平衡化する。この期間間にもまた、細胞をアンタゴニストを用い
て、ＰＢＳ中にて２０倍濃縮溶液の一部１０μｌとして加えて平衡化する。

【０１８６】 イノシトールリン脂質代謝由来の³Ｈ−イノシトールリン酸蓄積は、被験化合
物を含む溶液１０μｌを添加することで開始される。最初のウェルに１０μｌを
添加し、基礎蓄積を測定する。被験化合物の１１種の異なる濃度を、以下の１１
ウェルの各々のプレート列にて検定する。全ての検定は、２つの平行プレート列
に同じ添加を繰り返すことによって二度行なう。

【０１８７】 そのプレートをＣＯ₂インキュベーターにて１時間、インキュベートする。こ
の反応を、５０％ ｖ/ｖ トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）１５μｌを添加し、４℃で
４０分間、インキュベートして停止させる。１Ｍ トリス４０μｌを用いてＴＣ
Ａを中和した後、ウェルの内容物を、Dowex ＡＧ１−Ｘ８（２００−４００網目
、ホルマート型）を含むマルチスクリーンＨＶフィルタープレート（ミリポア）
に移す。このフィルタープレートは、各々のウェルにＤｏｗｅｘ ＡＧ１−Ｘ８
懸濁液（５０％ ｖ/ｖ、水：樹脂）２００μｌを加えることによって調製される
。このフィルタープレートをバキュームマニホールドに置き、残基ベッドを洗浄
または溶出する。それぞれのウェルを水２００μｌを用いて二度洗浄した後、５
ｍＭ テトラホウ酸ナトリウム／６０ｍＭ ギ酸アンモニウム ２００μｌで二回
洗浄する。

【０１８８】 ³Ｈ−ＩＰを１.２Ｍ ホウ酸アンモニウム／０.１ギ酸 ２００μｌを用いて、
空の９６ウェルプレート中に溶離させる。そのウェルの内容物をシンチレーショ
ンカクテル３ｍｌ中に加え、放射活性を液体シンチレーション計数によって決定
する。

【０１８９】実施例６ 受容体の結合方法 標準的な結合検定。結合検定は５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７.４、０.５％
ＢＳＡ、および５ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む結合バッファー中にて行なう。ＥＤＧ６
様ＧＰＣＲポリペプチドを含む膜断片に結合する放射リガンドについての標準的
な検定は、以下のように９６ウェル微量定量プレート（例えば、Dynatech Immul
on II Removawellプレート）にて行なう。放射リガンドを、ＰＭＳＦ／Ｂａｃｉ
を含む結合バッファー中にて希釈し、５０μｌ当たり所望のｃｐｍにした後、５
０μｌ部分をウェルに加える。非特異的結合試料については、４０μＭ 冷リガ
ンド５μｌもまたウェルに加える。結合は、ＰＭＳＦ／Ｂａｃｉを含む結合バッ
ファー中にて所望の濃度（１０〜３０μｇ膜タンパク質／ウェル）に希釈した膜
をウェル当たり１５０μｌ添加することで開始される。その後、プレートをLinb
roマイラープレートシーラー（Ｆｌｏｗ Ｌａｂ）を用いて覆い、Dynatechマイ
クロシェイカーIIに設置する。結合は、室温にて１〜２時間行なわせることがで
き、そのプレートを２,０００×ｇで１５分間遠心分離して止めることができる
。その上清をデカントし、膜ペレットを冷結合バッファー２００μｌを加えて一
度洗浄し、短時間攪拌し、再び遠心分離にかける。個々のウェルを１２×７５ｍ
ｍチューブに設置し、ＬＫＢ Gammamaster計測器（効率７５％）にて計測する。
この方法による特異的結合は、遊離リガンドを素早く（３〜５秒）ろ過し、ポリ
エチレンイミンコーティングガラス繊維フィルターで洗浄することによって取り
除いた場合に測定したものと一致する。

【０１９０】 標準結合検定の３つの変法もまた用いられる １．冷リガンド対、¹²⁵Ｉ標識化リガンドの濃度範囲を用いる競合放射リガンド
結合検定を、改良して上記のように行なう。検定されるリガンドの全希釈物を４
０×ＰＭＳＦ／Ｂａｃｉ中にて、この検定の最終濃度の４０倍の濃度にする。そ
の後、ペプチド試料（それぞれ５μｌ）を微量定量ウェルごとに加える。膜と放
射リガンドを、プロテアーゼインヒビターを含まない結合バッファー中に希釈す
る。放射リガンドを加え、冷リガンドを混合し、その後結合を膜を加えることに
よって開始させる。

【０１９１】 ２．受容体を用いる放射リガンドの化学交差連結を、標準検定と同一の結合工程
の後に行なう。しかしながら、洗浄工程はＢＳＡを用いた放射リガンドの非特異
的な交差連結を減少させるべく、ＢＳＡを引いた結合バッファーを用いて行う。
交差連結は下記のごとく行なわれる。

【０１９２】 ３．受容体とリガンドの複合体の可溶化における研究、および受容体精製のため
の膜ペレットを得るための大規模な結合検定もまた行なわれる。これらは、（ａ
）結合を１〜２５０ｍｌ量のポリプロピレンチューブにて行なうこと、（ｂ）膜
タンパク質濃度が常に０.５ｍｇ/ｍｌであること、および（ｃ）受容体精製のた
めに、結合バッファー中のＢＳＡ濃度を０.２５％にまで減らし、洗浄工程を精
製した受容体のＢＳＡ汚染を減少させるために、ＢＳＡを含まない結合バッファ
ーを用いて行なうこと、を除いて標準的な検定と同一である。

【０１９３】実施例７ 受容体に対する放射リガンドの化学交差連結 上記の放射リガンド結合工程の後に、膜ペレットを微量定量プレートウェル当
たりＢＳＡを含まない冷結合バッファー２００μｌ中に再懸濁する。その後、Ｄ
ＭＳＯ中、４ｍＭ Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミ
ド（ANBNOS、Pierce）をウェル当たり５μｌ添加し、混合する。試料を氷上にて
維持し、５〜１０ｃｍの距離でミネラライト(Mineralight)Ｒ−５２Ｇランプ（U
VP Inc., San Gabriel, Calif.）を用いて１０分間、ＵＶ照射を行なう。その後
、その試料をエッペンドルフマイクロチューブに移し、遠心分離により膜をペレ
ット化し、上清を取り除き、そしてポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ
）用のLaemmili ＳＤＳサンプルバッファー中に膜を可溶化させる。下記のごと
くＰＡＧＥを行なう。放射標識化タンパク質を、コダックＸＡＲフィルムとDupo
ntイメージ増強スクリーンを用いて、乾燥ゲルをオートラジオグラフィーにより
可視化する。

【０１９４】実施例８ 膜の可溶化 膜の可溶化は、２５ｍＭ トリス、ｐＨ ８、１０％ グリセロール（ｗ/ｖ）お
よび０.２ｍＭ ＣａＣｌ₂を含むバッファー（可溶化バッファー）中にて行なう
。トリトンＸ−１００、デオキシコレート、デオキシコレート：リゾレシチン、
ＣＨＡＰＳおよびzwittergentを含む高可溶性界面活性剤を、可溶化バッファー
中において１０％濃度作製し、凍結標本として保存する。リゾレシチンは凍結融
解の際に不溶化するため、新しく作製し、ジギトニンはその可溶性がより制限さ
れるために低濃度で新たに作製する。

【０１９５】 膜を可溶化するために、結合工程後の洗浄ペレットを、粒子が見えなくなるま
でピペッティングや可溶化バッファー中で１００,０００×ｇのボルテックスを
３０分間行なって再懸濁する。この上清を取り出して氷上で維持し、ペレットを
除去する。

【０１９６】実施例９ 可溶化受容体の検定 ¹²⁵Ｉリガンドを結合させ、界面活性剤を用いて膜を可溶化させた後に、無処
理のＲ：Ｌ複合体を４つの異なる方法によって検定することができる。全ての検
定は氷上、または４〜１０℃の低温室で行う。

【０１９７】 １．カラムクロマトグラフィー（Knuhtsenら、Biochem. J. 254, 641-647, 1988
）。Sephadex Ｇ−５０カラム（８×２５０ｍｍ）を、膜を可溶化するのに用い
た濃度の界面活性剤と１ｍｇ/ｍｌ ウシ血清アルブミンを含む可溶化バッファー
を用いて平衡化する。可溶化膜試料（０.２〜０.５ｍｌ）をカラムに充填し、約
０.７ｍｌ/分の流速にて溶出する。試料（０.１８ｍｌ）を回収する。放射活性
をガンマ計測器にて決定する。カラム空隙容量をブルーデキストランの溶出量に
より決定する。空隙容量中に溶出する放射活性をタンパク質に対する結合と考え
る。溶出後の放射活性は、遊離¹²⁵Ｉリガンドと同量の、非結合と考えられる。

【０１９８】 ２．ポリエチレングリコール沈降（Cuatrecasas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
69, 318-322, 1972）。１２×７５ｍｍポリプロピレンチューブ中に可溶化した
膜試料１００μｌに０.１Ｍ リン酸ナトリウムバッファー中の１％（ｗ/ｖ）ウ
シガンマグロブリン（シグマ）０.５ｍｌを加えた後、２５％（ｗ/ｖ）ポリエチ
レングリコール（シグマ）０.５ｍｌを加えて、混合する。その混合物を氷上に
１５分間維持する。その後、０.１Ｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ ７.４を試料当た
り３ｍｌ加える。試料を素早く（１〜３秒）Whatman ＧＦ／Ｂガラス繊維フィル
ターでろ過し、リン酸バッファー４ｍｌで洗浄する。ＰＥＧ沈殿受容体：¹²⁵Ｉ
−リガンド複合体を、そのフィルターをガンマ計数することによって決定する。

【０１９９】 ３．ＧＦＢ／ＰＥＩフィルター結合（Brunsら、Analytical Biochme．132, 74-8
1, 1983）。Whatman ＧＦ／Ｂガラス繊維フィルターを０.３％ ポリエチレンイ
ミン（ＰＥＩ、シグマ）に３時間浸す。可溶化膜試料（２５〜１００μｌ）を１
２×７５ｍｍポリプロピレンチューブに移しかえる。その後、界面活性剤を含ま
ない可溶化バッファーを試料当たり４ｍｌ加え、その試料を素早く（１〜３秒）
ＧＦＢ／ＰＥＩフィルターを通じてろ過し、可溶化バッファー４ｍｌで洗浄する
。フィルターに吸着した受容体：¹²⁵Ｉ−リガンド複合体のＣＰＭをガンマ計数
することで決定する。

【０２００】 ４．木炭（チャコール）／デキストラン（PaulおよびSaid, Peptides ７[Suppl.
1], 147-149, 1986）。デキストランＴ７０（０.５ｇ、ファルマシア）を水１
リットル中に溶解させ、その後、活性炭（Norit A, アルカリン；Fisher Scient
ific）５ｇを加える。その懸濁液を室温で１０分間攪拌した後、使用するまで４
℃で保存する。Ｒ：Ｌ複合体を測定するために、木炭／デキストラン懸濁液容量
４部を、可溶化膜容量１部に加える。試料を混合し、氷上に２分間維持した後、
ベックマン微量遠心管にて１１,０００×ｇで遠心分離を２分間行なう。遊離放
射リガンドは木炭／デキストランに吸着されており、ペレットと共に廃棄する。
受容体：¹²⁴Ｉ−リガンド複合体は上清中に残存しており、それをガンマ計数に
より決定する。

【０２０１】実施例１０ 受容体の精製 ビオチニル−受容体のＧＨ₄Ｃｌ膜に対する結合は、上記のごとく行なう。室
温で１時間、インキュベートする。標準的な精製手段における結合インキュベー
トには１０ｎＭ Ｂｉｏ−Ｓ２９が含まれる。¹²⁵Ｉ リガンドをトレーサーとし
て、膜タンパク質ｍｇ当たり５,０００〜１００,０００ｃｐｍレベルで加える。
コントロールインキュベートには、ビオチン化していないリガンドを用いて受容
体を飽和させるための１０μＭ 冷リガンドが含まれる。

【０２０２】 また、受容体：リガンド複合体の可溶化は０.２ｍＭ ＭｇＣｌ₂を含む可溶化
バッファー中の０.１５％ デオキシコール酸：リゾレシチンを用いて上記のよう
に行ない、可溶化Ｒ：Ｌ複合体を含む１００,０００×ｇ上清を得る。

【０２０３】 固定化ストレプトアビジン（６％ ビーズ状アガロースに対する交差連結スト
レプトアビジン、Pierce Chemical Co.;「ＳＡ−アガロース」）を可溶化バッフ
ァー中にて洗浄し、可溶化膜に最終容量の１／３０となるように添加する。この
混合物を４〜１０℃で４〜５時間、反転ローテーションにより定期的に攪拌しな
がらインキュベートする。その後、この混合物をカラムに充填し、非結合物質を
洗い流す。ＳＡ−アガロースに対する放射リガンドの結合を、１００,０００×
ｇ上清中のｃｐｍをＳＡ−アガロースに対する吸着後のカラム廃液のｃｐｍと比
較することによって決定する。最終的に、カラムを０.１５％ デオキシコレート
を含む可溶化バッファー：１／５００（vol/vol）１００×４パセ（pase）を含
むリゾレシチンの１２〜１５カラム容量を用いて洗浄する。

【０２０４】 そのストレプトアビジンカラムを、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、０.１ｍＭ ＥＧＴＡ
、０.１ｍＭ ＧＴＰ−ガンマ−Ｓ（シグマ）、０.１５％（wt/vol）デオキシコ
レートを含む可溶化バッファー：１／１０００（vol/vol）１００倍の４ｐａｓ
ｅを含むリゾレシチンを用いて溶出する。初めに、溶出バッファー１カラム容量
をこのカラムに通じ、流出を２０〜３０分間止める。その後、溶出バッファー３
〜４カラム容量を通じる。全ての溶出物をプールする。

【０２０５】 ストレプトアビジンカラム由来の溶出物を、固定化したコムギ胚芽凝集素（Ｗ
ＧＡアガロース、Vector Labs）と共に一晩中（１２〜１５時間）インキュベー
トし、共有結合炭水化物の相互作用を介してＷＧＡレクチンと受容体を吸着させ
る。ストレプトアビジンカラム溶出物に対するＷＧＡ−アガロースの割合（vol
：vol）は一般に１：４００である。また、１：１０００〜１：２００範囲を用
いてもよい。結合工程後に、樹脂を遠心分離してペレット化し、上清を取り出し
て保存し、その樹脂を５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ８、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、およ
び０.１５％ デオキシコレート：リゾレシチンを含むバッファー中にて３回（約
２分ごと）洗浄する。ＷＧＡ−結合受容体を溶出するために、その樹脂を、この
樹脂の洗浄するのに用いたのと同じＨＥＰＥＳバッファーを中の１０ｍＭ Ｎ−
Ｎ'−Ｎ''−トリアセチルシトトリロースを、毎回３樹脂カラムを用いて氷上で
１５〜３０分間かけて繰り返し混合（低速でのボルテックスミキサー）して３回
抽出する。各々の溶出工程後に、樹脂を遠心沈降させ、その上清を慎重に取り除
き、ＷＧＡ−アガロースペレットを除去する。この３つのプールした溶出物には
、最終的な精製受容体が含まれる。ＷＧＡに結合していない物質には、ストレプ
トアビジンカラムから特異的に溶出したＧタンパク質サブユニットと同様に、非
特異的な汚染物質が含まれる。これら全てのフラクションを−９０℃で凍結保存
する。

【０２０６】実施例１１ ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドに結合する被験化合物の同定 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタンパク質を含むＥＤＧ６様ＧＰＣＲ
ポリペプチドを精製し、９６ウェル微量定量プレートのグルタチオン誘導化ウェ
ルに吸着させたものを、生理バッファー溶液中、ｐＨ ７.０の低分子ライブラリ
ー由来の被験化合物と接触させる。ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドには、配列
番号：１に示されるアミノ酸配列が含まれる。被験化合物には蛍光タグが含まれ
る。この試料を５分〜１時間インキュベートする。コントロール試料は被験化合
物の非存在化にてインキュベートする。

【０２０７】 被験化合物を含むバッファー溶液をウェルから洗い出す。被験化合物のＥＤＧ
６様ＧＰＣＲポリペプチドに対する結合を、ウェル内容物の蛍光測定によって検
出する。被験化合物をインキュベートしなかったウェルの蛍光と比較して、少な
くとも１５％までウェルの蛍光を増大させる被験化合物を、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ
ポリペプチドに結合する化合物として規定する。

【０２０８】実施例１２ ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ遺伝子発現を減少させる被験化合物の同定 被験化合物をヒトの胃細胞の培養物に投与し、３７℃で１０〜４５分間インキ
ュベートする。被験化合物を用いず、同時にインキュベートした同型の細胞の培
養物をネガティブコントロールとする。

【０２０９】 ＲＮＡをChirgwinら、Biochem. 18, 5294−99, 1979に記載のように２つの培
養物から単離する。全ＲＮＡ２０〜３０μｇを用いて、ノーザンブロットを調製
し、³²Ｐ−標識化ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ特異的プローブを用いて、Ｅｘｐｒｅｓｓ
−ｈｙｂ（クローンテック）にて６５℃でハイブリダイズさせる。このプローブ
には、配列番号：２の構成成分から選ばれる少なくとも１１個の連続するヌクレ
オチドが含まれる。被験化合物の不存在下にて得られるシグナルと比較して、Ｅ
ＤＧ６様ＧＰＣＲに特異的なシグナルを減少させる被験化合物を、ＥＤＧ６様Ｇ
ＰＣＲ遺伝子発現のインヒビターとして規定する。

【０２１０】実施例１３ ヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲの機能を増大させることによる炎症の処置 ヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲを発現するポリヌクレオチドを、炎症を患っている患
者に投与する。患者の炎症の重症度を減少させる。

【０２１１】実施例１４ ＥＤＧ６様ＧＰＣＲの定量発現プロファイリング 発現プロファイリングは定量ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）分析、または動
的(キネティクス)分析とも称される分析（最初にHiguchiら,1992、およびHiguch
iら,1993によって記載された）に基づく。重要なことは、ＰＣＲ対数期の任意の
サイクルにおいて、産生物量が最初の鋳型のコピー数に比例していることである
。この技術を用いることで、染色体からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）とし
て転写される特定の遺伝子の発現レベルを、最初にＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を
ｍＲＮＡから作製した後に、そのｃＤＮＡについて定量ＰＣＲを行なう、定量逆
転写ポリメラーゼ連鎖反応（定量ＲＴ−ＰＣＲ）と称される方法で測定する。

【０２１２】 種々のヒト組織由来のＲＮＡの定量ＲＴ−ＰＣＲ分析を行い、ＥＤＧ６様ＧＰ
ＣＲ ｍＲＮＡの組織分布を調査する。種々の組織由来の全ＲＮＡ（ヒト全ＲＮ
ＡパネルＩ〜Ｖ、Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA）２５μｇを鋳
型として用いて、第一ストランドｃＤＮＡをＲＴ−ＰＣＲ用のSUPERSCRIPT^TM 第
一ストランドＡ合成系（Life Technologies, Rockville, MD, USA）を用いて合
成する。第一ストランドｃＤＮＡ合成は工業手順に従い、ｍＲＮＡの３'ポリＡ
テイルとハイブリダイズするオリゴ（ｄＴ）を用い、合成反応を開始させて行な
う。その後、第一ストランドｃＤＮＡ１０ｎｇをポリメラーゼ連鎖反応における
鋳型として用いる。ポリメラーゼ連鎖反応で２本鎖ＤＮＡの合成が上手くいった
場合にのみ形成されるＤＮＡ２重螺旋の副溝に結合する、ＤＮＡ結合蛍光染色サ
イバーグリーンＩ（SYBR Green I）の存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応をライト
サイクラー(LightCycler）（ロッシュモレキュラーバイオケミカルズ(Roche Mol
ecular Biochemicals), アメリカ合衆国インディアナ州インディアナポリス）に
て行なう（Morrisonら、1998）。２本鎖ＤＮＡと結合する際に、サイバーグリー
ンＩはライトサイクラー器によって定量的に測定され得る光を発する。このポリ
メラーゼ連鎖反応はオリゴヌクレオチドプライマーＥＤＧ６Ｈ−Ｌ５（ＣＣＴＣ
ＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＴＡＧＣＴＴＴＴＧＣ）とＥＤＧ６Ｈ−Ｒ３（ＡＴＣＴＧ
ＣＡＧＧＴＣＧＧＧＧＴＴＴＣＣＴＡＣＧ）を用いて行い、反応が温度８１℃に
達する反応サイクルごとに発せられる光の強度を測定する。発せられた光の強度
を、同時に反応させた既知濃度のストランドを比較することによって、鋳型ｃＤ
ＮＡｎｇ当たりの遺伝子転写物のコピー数に変換した。

【０２１３】 種々の組織型における細胞当たりのｍＲＮＡ転写物レベルの差異を補正すべく
、標準化法は、種々の組織の５種のハウスキーピング遺伝子：グリセルアルデヒ
ド−３−ホスファターゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、ヒポキサチン グアニン フォフォリボ
シル(phophoribosyl) トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、β−アクチン、ポルフ
ォビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、およびβ−２−ミクログロブリンに
おいて同様に計算した発現レベルを用いて行なう。このハウスキーピング遺伝子
発現レベルは、全ての組織で比較的一定していると考えられており（Adamsら、1
993, Adamsら、1995, Liewら、1994）、それ故ｃＤＮＡの合成工程に用いられる
全ＲＮＡｍｕ.ｇ当たりの、細胞の適当な相対数に対するゲージとして用いるこ
とができる。わずかに異なる組みのハウスキーピング遺伝子を用いること、およ
び発現レベルを測定するのにライトサイクラー系を用いることを除けば、標準化
法はＲＮＡ Master Blot User Mamual, Apendix C（1997, Clontech Laboratori
es, Palo Alto, CA, USA）に記載のものと実質的に同一である。簡潔に述べると
、全ての組織試料における５つのハウスキーピング遺伝子の発現レベルを、ライ
トサイクラーと一定量の出発ＲＮＡ（２５μｇ）を用いて遺伝子当たり、独立し
た３回の反応で測定した。同時に反応させた既知濃度ストランドと比較して得ら
れた各々の遺伝子について計算したコピー数を記録し、全組織試料の遺伝子コピ
ー数の和パーセンテージに変換した。その後、それぞれの組織試料について、そ
れぞれの遺伝子のパーセンテージ値の和を計算し、標準として任意に選び出した
１つの組織のパーセンテージ値の合計で、それぞれの組織のパーセンテージ値の
合計を割ることによって、標準化因子を計算する。組織試料中の特定の遺伝子発
現について実験的に得られた値を標準化するために、得られた値を試験した組織
についての標準化因子で掛けた。

【０２１４】 結果を図３に示し、その左には実験的に得られた第一ストランドｃＤＮＡ１０
ｎｇ当たりのｍＲＮＡのコピー数を示し、右にはその標準値を示す。ｃＤＮＡ合
成に用いたＲＮＡを、その供給元およびカタログナンバーにそって、図４に示す
。

【０２１５】引用文献 Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S. およびGriffith, R. (1992) 特定
のＤＮＡ配列の同時増幅および検出. BioTechnology 10: 413-417。 Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G. およびWatson, R. (1993) 動的ＰＣ
Ｒ分析: ＤＮＡ増幅反応の実時間モニタリング. BioTechnology 11: 1026-1030
。 T. B. Morrison, J. J. Weis ＆ C. T. Wittwer. (1998) 増幅時の連続サイバー
グリーンＩモニタリングによる低コピー転写物の定量．Biotechniques 24: 954-
962。 Adams, M. D., Kerlavage, A. R., Fields, C. ＆ Venter, C. (1993) ３,４０
０の新規発現配列タグによるヒト脳における転写物の多様性の同定. Nature Gen
et. 4: 256-265。 Adams, M. Dら. (1995) ｃＤＮＡ配列の８３００万ヌクレオチドに基づくヒト遺
伝子の多様性および発現パターンの初期評価. Nature 377 supp : 3-174。 Liew, C. C., Hwang, D. M., Fung, Y. W., Laurenson, C., Cukerman, E., Tsu
i, S. ＆ Lee, C. Y. (1994) 発現遺伝子タグによって同定される循環系におけ
る遺伝子カタログ. Proc. Natl. Acad Sci. USA 91: 10145-10649。

【図面の簡単な説明】

【図１】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列。

【図２】 図１に示すＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列。

【図３】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリヌクレオチドのＴａｑｍａｎ発現プロフ
ァイリングの結果。

【図４】 発現プロファイリングに用いられる組織パネル。

【図５】 本発明のＥＤＧ６様ＧＰＣＲとＥＤＧ６間の比較。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 48/00 ４Ｃ０８４ Ａ６１Ｐ 11/06 ４Ｃ０８５ 45/00 29/00 ４Ｃ０８６ 48/00 37/06 ４Ｃ０８７ Ａ６１Ｐ 11/06 37/08 ４Ｈ０４５ 29/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 37/06 19/00 37/08 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/705 1/19 19/00 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/02 1/21 1/68 Ａ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｐ 21/02 33/50 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/53 Ｄ 1/68 Ｍ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/566 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ Ａ６１Ｋ 37/02 33/566 37/48 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA34 AA35 BB05 BB10 BB41 BB46 BB50 BB51 CB01 DA13 DA36 FA20 FB02 FB07 FB08 FB12 GC15 JA01 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA06 DA02 DA05 DA06 DA11 DA12 EA04 GA11 HA12 4B063 QA19 QA20 QQ08 QQ43 QR08 QR42 QR56 QS25 QS34 QX02 QX07 4B064 AG01 CA02 CA05 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AA01X AA57X AA72X AA90X AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA13 AA17 DC50 NA14 ZA591 ZB081 ZB111 ZB131 4C085 AA13 CC02 CC03 CC04 DD86 EE06 FF02 FF03 FF17 4C086 AA01 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA59 ZB08 ZB11 ZB13 4C087 BC83 CA12 NA14 ZA59 ZB08 ZB11 ZB13 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 EA20 EA50 FA74

Claims (79)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている単離され
   たポリヌクレオチドであって、 ａ）配列番号１に示すアミノ酸配列と少なくとも約２５％一致するアミノ酸配
   列；および、 配列番号１に示すアミノ酸配列 より成る群から選ばれるアミノ酸配列を包含するＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチ
   ドをコードしているポリヌクレオチド； ｂ）配列番号２に記載の配列を含むポリヌクレオチド； ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記したポリヌクレオチドとストリンジェントな条
   件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド； ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）から（ｃ）に明記するポリヌ
   クレオチド配列から逸脱している配列のポリヌクレオチド；および、 ｅ）（ａ）から（ｄ）に明記したポリヌクレオチド配列の断片、誘導体または
   アレル変異体を表すポリヌクレオチド、 より成る群から選ばれるポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを含む発現ベクタ
   ー。
3. 【請求項３】 請求項２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
4. 【請求項４】 請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされている
   、実質上精製されたＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチド。
5. 【請求項５】 ａ）請求項３に記載の宿主細胞を、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリ
   ペプチドの発現に好適な条件下で培養し；そして、 ｂ）ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドを該宿主細胞培養から回収する工程、 を含む、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドを調製する方法。
6. 【請求項６】 ａ）請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを生体試料の
   核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形
   成させ；そして、 ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体を検出する工程、 を含む、生体試料中のＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているポリヌ
   クレオチドを検出する方法。
7. 【請求項７】 ハイブリダイゼーションの前に、生体試料の核酸材料を増幅
   させる、請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 生体試料を、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求
   項４に記載のＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドと特異的に相互作用する試薬と接
   触させる工程を含む、該ポリヌクレオチドまたは該ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプ
   チドを検出する方法。
9. 【請求項９】 請求項６〜８のいずれかに記載の方法を実施するための診断
   キット。
10. 【請求項１０】 被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチド
    によりコードされる任意のＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドと接触させ； 該ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程
    、 を含むＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性を低下させる物質をスクリーニングする方法で
    あって、該ポリペプチドに結合する被験化合物を、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性を
    低下させる可能性のある治療物質として同定する方法。
11. 【請求項１１】 被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチド
    によりコードされるＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドと接触させ；そして、 該ポリペプチドのＥＤＧ６様ＧＰＣＲ活性を検出する工程、 を含むＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性を調節する物質をスクリーニングする方法であ
    って、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ活性を増大させる被験化合物を、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ
    の活性を増大させる可能性のある治療物質として同定し、かつ該ポリペプチドの
    ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ活性を低下させる被験化合物を、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性
    を低下させる可能性のある治療物質として同定する方法。
12. 【請求項１２】 被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチド
    と接触させ；そして、 該ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、 を含むＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性を低下させる物質をスクリーニングする方法で
    あって、該ポリヌクレオチドに結合する被験化合物を、ＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活
    性を低下させる可能性のある治療物質として同定する方法。
13. 【請求項１３】 細胞を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドまたは
    請求項４に記載の任意のＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドと特異的に結合する試
    薬と接触させ、それによりＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性を低下させる工程、を含む
    ＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性を低下させる方法。
14. 【請求項１４】 請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法によって同定さ
    れる、該ＥＤＧ６様ＧＰＣＲポリペプチドまたは該ポリヌクレオチドの活性を調
    整する試薬。
15. 【請求項１５】 請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の
    試薬および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
16. 【請求項１６】 疾患においてＥＤＧ６様ＧＰＣＲの活性を調整するための
    、請求項１５に記載の医薬組成物の使用。
17. 【請求項１７】 該疾患が慢性炎症性疾患、アレルギー性疾患、喘息または
    自己免疫疾患である、請求項１６に記載の使用。
18. 【請求項１８】 配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
    ドしているｃＤＮＡ。
19. 【請求項１９】 配列番号２を含む請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
20. 【請求項２０】 配列番号２より成る請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
21. 【請求項２１】 配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
    ドしているポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
22. 【請求項２２】 該ポリヌクレオチドが配列番号２より成る、請求項２１に
    記載の発現ベクター。
23. 【請求項２３】 配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
    ドしている発現ベクターを含む宿主細胞。
24. 【請求項２４】 該ポリヌクレオチドが配列番号２より成る、請求項２３に
    記載の宿主細胞。
25. 【請求項２５】 配列番号１に示すアミノ酸配列を含む精製されたポリペプ
    チド。
26. 【請求項２６】 配列番号１に示すアミノ酸配列より成る、請求項２５に記
    載の精製されたポリペプチド。
27. 【請求項２７】 配列番号１に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含
    む融合タンパク質。
28. 【請求項２８】 配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
    ドしている発現ベクターを含む宿主細胞を、該ポリペプチドが発現される条件下
    で培養し；それにより、該ポリペプチドを単離する工程、を含む該ポリペプチド
    を調製する方法。
29. 【請求項２９】 該発現ベクターが配列番号２を含む、請求項２８に記載の
    方法。
30. 【請求項３０】 配列番号２に記載の１１個の連続ヌクレオチドを含むポリ
    ヌクレオチドを、生体試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブ
    リダイゼーション複合体を形成させ；そして、該ハイブリダイゼーション複合体
    を検出する工程、を含む配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコ
    ード配列を検出する方法。
31. 【請求項３１】 ハイブリダイズさせる工程の前に、核酸材料を増幅する工
    程をさらに含む、請求項３０に記載の方法。
32. 【請求項３２】 配列番号２に記載の１１個の連続ヌクレオチドを含むポリ
    ヌクレオチド；および、請求項３０に記載の方法のための使用説明書を含む、配
    列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード配列を検出するための
    キット。
33. 【請求項３３】 生体試料を、配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペ
    プチドと特異的に結合する試薬と接触させて、試薬−ポリペプチド複合体を形成
    させ；そして、該試薬−ポリペプチド複合体を検出する工程、を含む該ポリペプ
    チドを検出する方法。
34. 【請求項３４】 該試薬が抗体である、請求項３３に記載の方法。
35. 【請求項３５】 配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異
    的に結合する抗体；および、請求項３３に記載の方法のための使用説明書、を含
    む該ポリペプチドを検出するためのキット。
36. 【請求項３６】 被験化合物を、（１）配列番号１に示すアミノ酸配列と少
    なくとも約２５％一致するアミノ酸配列、および（２）配列番号１に示すアミノ
    酸配列、より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させ；
    そして、 該ポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、 を含むＥＤＧ６様ＧＰＣＲタンパク質の活性を調節できる物質をスクリーニング
    する方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物をＥＤＧ６様ＧＰＣＲ
    タンパク質の活性を調節する可能性のある物質と同定する方法。
37. 【請求項３７】 接触させる工程が細胞においてである、請求項３６に記載
    の方法。
38. 【請求項３８】 インビトロにおける細胞である、請求項３６に記載の方法
    。
39. 【請求項３９】 接触させる工程が無細胞系においてである、請求項３６に
    記載の方法。
40. 【請求項４０】 該ポリペプチドが検出可能な標識を含む、請求項３６に記
    載の方法。
41. 【請求項４１】 被験化合物が検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の
    方法。
42. 【請求項４２】 被験化合物が該ポリペプチドと結合している標識リガンド
    に取って代わる、請求項３６に記載の方法。
43. 【請求項４３】 該ポリペプチドが固体支持体と結合している、請求項３６
    に記載の方法。
44. 【請求項４４】 被験化合物が固体支持体と結合している、請求項３６に記
    載の方法。
45. 【請求項４５】 被験化合物を、（１）配列番号１に示すアミノ酸配列と少
    なくとも約２５％一致するアミノ酸配列、および（２）配列番号１に示すアミノ
    酸配列、より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させ；
    そして、 該ポリペプチドの活性を検出する工程、 を含むヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲタンパク質の活性を調節する物質をスクリーニン
    グする方法であって、該ポリペプチドの活性を増大させる被験化合物を、ヒトＥ
    ＤＧ６様ＧＰＣＲタンパク質の活性を増大させる可能性のある物質として同定し
    、かつ該ポリペプチドの活性を低下させる被験化合物を、ヒトＥＤＧ６様ＧＰＣ
    Ｒタンパク質の活性を低下させる可能性のある物質として同定する方法。
46. 【請求項４６】 接触させる工程が細胞においてである、請求項４５に記載
    の方法。
47. 【請求項４７】 インビトロにおける細胞である、請求項４５に記載の方法
    。
48. 【請求項４８】 接触させる工程が無細胞系においてである、請求項４５に
    記載の方法。
49. 【請求項４９】 該活性がサイクリックＡＭＰ形成である、請求項４５に記
    載の方法。
50. 【請求項５０】 該活性が細胞内カルシウム流動である、請求項４５に記載
    の方法。
51. 【請求項５１】 該活性がホスホイノシチド代謝である、請求項４５に記載
    の方法。
52. 【請求項５２】 被験化合物を、配列番号２に示すヌクレオチド配列を含む
    ポリヌクレオチドによりコードされている産物と接触させ；そして、 該産物に対する被験化合物の結合を検出する工程、 を含むヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲタンパク質の活性を調節する物質をスクリーニン
    グする方法であって、該産物と結合する被験化合物をヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲタ
    ンパク質の活性を調節する可能性のある物質として同定する方法。
53. 【請求項５３】 該産物がポリペプチドである、請求項５２に記載の方法。
54. 【請求項５４】 該産物がＲＮＡである、請求項５２に記載の方法。
55. 【請求項５５】 細胞を、配列番号２に示すヌクレオチド配列を含むポリヌ
    クレオチドによりコードされている産物と特異的に結合する試薬と接触させ、そ
    れによりヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲタンパク質の活性を低下させる工程、を含むヒ
    トＥＤＧ６様ＧＰＣＲタンパク質の活性を低下させる方法。
56. 【請求項５６】 該産物がポリペプチドである、請求項５５に記載の方法。
57. 【請求項５７】 該試薬が抗体である、請求項５６に記載の方法。
58. 【請求項５８】 該産物がＲＮＡである、請求項５５に記載の方法。
59. 【請求項５９】 該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項
    ５８に記載の方法。
60. 【請求項６０】 該試薬がリボザイムである、請求項５８に記載の方法。
61. 【請求項６１】 インビトロにおける細胞である、請求項５５に記載の方法
    。
62. 【請求項６２】 インビボにおける細胞である、請求項５５に記載の方法。
63. 【請求項６３】 配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異
    的に結合する試薬；および、製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
64. 【請求項６４】 該試薬が抗体である、請求項６３に記載の医薬組成物。
65. 【請求項６５】 配列番号２に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
    ド産物と特異的に結合する試薬；および、製薬的に許容し得る担体、を含む医薬
    組成物。
66. 【請求項６６】 該試薬がリボザイムである、請求項６５に記載の医薬組成
    物。
67. 【請求項６７】 該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項
    ６５に記載の医薬組成物。
68. 【請求項６８】 該試薬が抗体である、請求項６５に記載の医薬組成物。
69. 【請求項６９】 配列番号１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
    ドしている発現ベクター；および、製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物
    。
70. 【請求項７０】 該発現ベクターが配列番号２を含む、請求項６９に記載の
    医薬組成物。
71. 【請求項７１】 ヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲタンパク質の機能を阻害する試薬
    の治療的有効量をそれを必要とする患者に投与し、それによりＥＤＧ６様ＧＰＣ
    Ｒ疾患の症状を改善する工程、を含むＥＤＧ６様ＧＰＣＲ疾患を処置する方法。
72. 【請求項７２】 該試薬が請求項３６に記載の方法によって同定される、請
    求項７１に記載の方法。
73. 【請求項７３】 該試薬が請求項４５に記載の方法によって同定される、請
    求項７１に記載の方法。
74. 【請求項７４】 該試薬が請求項５２に記載の方法によって同定される、請
    求項７１に記載の方法。
75. 【請求項７５】 ヒトＥＤＧ６様ＧＰＣＲタンパク質の機能を阻害する試薬
    の治療的有効量をそれを必要とする患者に投与し、それによりＥＤＧ６様ＧＰＣ
    Ｒ疾患の症状を改善する工程、を含むＥＤＧ６様ＧＰＣＲ疾患を処置する方法。
76. 【請求項７６】 該試薬が請求項３６に記載の方法によって同定される、請
    求項７５に記載の方法。
77. 【請求項７７】 該試薬が請求項４５に記載の方法によって同定される、請
    求項７５に記載の方法。
78. 【請求項７８】 該試薬が請求項５２に記載の方法によって同定される、請
    求項７５に記載の方法。
79. 【請求項７９】 該ＥＤＧ６様ＧＰＣＲ疾患が慢性炎症性疾患、アレルギー
    性疾患、喘息または自己免疫疾患である、請求項７５に記載の方法。