JP2003530121A - ヒトｃｙｓｌｔ２様ｇｐｃｒ蛋白の調節 - Google Patents

ヒトｃｙｓｌｔ２様ｇｐｃｒ蛋白の調節

Info

Publication number
JP2003530121A
JP2003530121A JP2001575619A JP2001575619A JP2003530121A JP 2003530121 A JP2003530121 A JP 2003530121A JP 2001575619 A JP2001575619 A JP 2001575619A JP 2001575619 A JP2001575619 A JP 2001575619A JP 2003530121 A JP2003530121 A JP 2003530121A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cyslt2
gpcr
polypeptide
seq
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
JP2001575619A
Other languages
English (en)
Inventor
ヨンホン・シャオ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bayer AG filed Critical Bayer AG
Publication of JP2003530121A publication Critical patent/JP2003530121A/ja
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/22—Anxiolytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Abstract

(57)【要約】 ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白を調節する試薬、およびヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ遺伝子産物に結合する試薬は、末梢および中枢神経系疾患、喘息ならびに心血管疾患を包含する（但しこれらに限定されない）機能不全または疾患の防止、改善、または是正において役割を果たすことができる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明はＧ蛋白共役レセプターの分野に関するものである。より詳細には、本
発明はＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白およびそれらの調節の分野に関するものであ
る。
【０００２】 （背景技術）Ｇ蛋白共役レセプター 多くの医学的に重要な生体プロセスは、Ｇ蛋白を含むシグナル伝達経路により
仲介されている（Lefkowitz, Nature 351, 353-354, 1991）。Ｇ蛋白共役レセプ
ター（ＧＰＣＲ）のファミリーは、ホルモン、神経伝達物質、成長因子、および
ウイルスに対するレセプターを包含している。ＧＰＣＲの具体的例には、ドーパ
ミン、カルシトニン、アドレナリン作動性ホルモン、エンドセリン、ｃＡＭＰ、
アデノシン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、
卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子１、ロドプシン、臭気物質、サイ
トメガロウイルス、Ｇ蛋白自身、エフェクター蛋白、例えばホスホリパーゼＣ、
アデニルシクラーゼ、およびホスホジエステラーゼ、ならびにアクチュエーター
蛋白、例えばプロテインキナーゼＡおよびプロテインキナーゼＣといったような
多彩な物質のレセプターが包含される。
【０００３】 ＧＰＣＲは、少なくとも８個の異なる親水性ループを連結する、膜を貫通する
７個の保存されたドメインを持っている。ＧＰＣＲ（７ＴＭレセプターとしても
知られる）は、少なくとも８個の異なる親水性ループを連結する、約２０ないし
３０のアミノ酸より成るこれら７個の保存された疎水性区間を含むものとして特
徴付けられている。殆どのＧＰＣＲは、最初の二つの細胞外ループの各々に単一
の保存されたシステイン残基を持っており、これがジスルフィド結合を形成し、
機能的蛋白構造を安定化させると考えられている。この７個の膜貫通領域はＴＭ
１、ＴＭ２、ＴＭ３、ＴＭ４、ＴＭ５、ＴＭ６、およびＴＭ７と呼ばれる。ＴＭ
３はシグナル伝達に関わっている。
【０００４】 システイン残基の燐酸化および脂質化（パルミチル化またはファルネシル化）
は、幾つかのＧＰＣＲのシグナル伝達に影響を及ぼし得る。殆どのＧＰＣＲは、
第三細胞質ループおよび／またはカルボキシ末端内部に燐酸化の可能性ある部位
を含んでいる。幾つかのＧＰＣＲ、例えばβ−アドレナリン作動性レセプターで
は、プロテインキナーゼＡおよび／または特異的レセプターキナーゼによる燐酸
化によってレセプターの脱感作が仲介される。
【０００５】 幾つかのレセプターについては、ＧＰＣＲのリガンド結合部位が、数個のＧＰ
ＣＲ膜貫通ドメインにより形成された親水性ソケットを含むと考えられる。この
親水性ソケットは、ＧＰＣＲの疎水性残基に取り囲まれている。各ＧＰＣＲ膜貫
通ヘリックスの親水性側は、内側を向き、極性リガンド結合部位を形成している
と仮定されている。ＴＭ３は、リガンド結合部位、例えばＴＭ３アスパラギン酸
残基を持っている幾つかのＧＰＣＲと関連している。ＴＭ５のセリン、ＴＭ６の
アスパラギン、およびＴＭ６またはＴＭ７のフェニルアラニンまたはチロシンも
またリガンド結合に関連している。
【０００６】 ＧＰＣＲは細胞内部でヘテロ三量体Ｇ蛋白により、種々の細胞内酵素、イオン
チャンネルおよび輸送体と共役している（Johndon et al., Endoc.Rev. 10, 317
-331, 1989を参照されたい）。種々のＧ蛋白αサブユニットは優先的に特定のエ
フェクターを刺激し、細胞の様々な生体機能を調整する。ＧＰＣＲの細胞質残基
の燐酸化は、幾つかのＧＰＣＲの調節にとって重要な機構である。例えば、或る
形のシグナル伝達においては、ホルモン結合の効果は、細胞内部での酵素アデニ
ルシクラーゼの活性化である。ホルモンによる酵素の活性化はヌクレオチドＧＴ
Ｐの存在に依存する。ＧＴＰはホルモン結合にも影響を及ぼす。Ｇ蛋白はホルモ
ンレセプターをアデニルシクラーゼに結合させる。Ｇ蛋白はホルモンレセプター
によって活性化されると、ＧＴＰを、結合したＧＤＰに交換する。すると、ＧＴ
Ｐを有する型が、活性化アデニルシクラーゼに結合する。Ｇ蛋白自身により触媒
されるＧＴＰからＧＤＰへの加水分解が、Ｇ蛋白をその基本的な不活性型へと戻
す。したがってＧ蛋白は、レセプターからエフェクターへとシグナルを中継する
仲介物質としての、そしてシグナルの持続を制御する時計としての、二重の役割
を果たしている。
【０００７】 過去１５年間にわたり、ＧＰＣＲレセプターを標的とする３５０近くの治療薬
が成功裏に上市されてきた。この事は、これらのレセプターが治療薬として確立
された折り紙付きの歴史を持っていることを示すものである。明らかに、細菌、
真菌、原虫といった感染症、およびウイルス感染症、とりわけＨＩＶウイルスに
よる感染症、癌、食欲不振、過食症、喘息、急性心不全、低血圧症、高血圧症、
尿停留、骨粗鬆症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、多発性硬化症
、良性前立腺肥大、を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）機能不全
または疾病の予防、改善または是正において役割を果たし得る、さらなるＧＰＣ
Ｒの同定および特性決定に対する継続した需要があり、また、ＧＰＣＲは中枢お
よび末梢神経系の両方に対して極めて重要性があり、それ故に、新規なＧＰＣＲ
は神経系疾患、例えば脳損傷後の原発性および二次的異常、気分障害、不安障害
、思考および意志の障害、睡眠および覚醒の障害、神経原性およびミオパシー障
害のような運動単位の障害、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような神
経変性疾患、末梢および慢性疼痛をもたらす疾患の治療のための新しい有望な標
的である。ＣｙｓＬＴ２レセプターは炎症の際に役割を果たすことから、Ｃｙｓ
ＬＴ２様ＧＰＣＲは、炎症性疼痛、関節炎、多発性硬化症などのような神経系の
炎症性疾患において特に重要である。
【０００８】 多様な生物学的効果を有するＧＣＰＲが広範囲に分布しているため、その活性
を調節して治療効果をもたらすようなＧＣＰＲファミリーのさらなる成員を同定
することが当分野で必要とされている。
【０００９】 （発明の概要） ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白を調節する試薬および方法を提供することが、本
発明の１つの目的である。本発明のこのおよびその他の目的は、下に記載する１
またはそれ以上の態様によって提供する。
【００１０】 本発明の一つの態様は、 配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約３９％一致するアミノ酸配列；
および、 配列番号２に示すアミノ酸配列、 より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチ
ドである。
【００１１】 本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックスの分解を減少させる物質を（
求めて）スクリーニングする方法である。被験化合物を、 配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約３９％一致するアミノ酸配列；
および、 配列番号２に示すアミノ酸配列、 より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチ
ドと接触させる。 被験化合物とＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドとの結合を検出する。それ
により、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドに結合する被験化合物を、細胞外
マトリックス分解を減少させる可能性のある物質として同定する。
【００１２】 本発明の別の態様は、細胞外マトリックス分解を減少させる物質をスクリーニ
ングする方法である。被験化合物を、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコ
ードしているポリヌクレオチド［ここでこのポリヌクレオチドは、 配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約３９％一致するヌクレオチ
ド配列； 配列番号１に示すヌクレオチド配列； 配列番号３に示すヌクレオチド配列と少なくとも約３９％一致するヌクレオチ
ド配列；および、 配列番号３に示すヌクレオチド配列； より成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含む］と接触させる。
【００１３】 被験化合物と当該ポリヌクレオチドとの結合を検出する。当該ポリヌクレオチ
ドに結合する被験化合物を、細胞外マトリックス分解を減少させる可能性のある
物質として同定する。この物質は、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲｍＲＮＡと相互作用
することを介してＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの量を減少させることにより作用でき
る。
【００１４】 本発明の別の態様は、細胞外マトリックス分解を調節する物質をスクリーニン
グする方法である。被験化合物を、 配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約３９％一致するアミノ酸配列；
および、 配列番号２に示すアミノ酸配列、 より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチ
ドと接触させる。
【００１５】 このポリペプチドのＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ活性を検出する。それにより、被
験化合物不在時のＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ活性に比して、該ポリペプチドのＣｙ
ｓＬＴ２様ＧＰＣＲ活性を増大させる被験化合物を、細胞外マトリックス分解を
増大させる可能性のある物質として同定する。被験化合物不在時のＣｙｓＬＴ２
様ＧＰＣＲ活性に比して、該ポリペプチドのＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ活性を減少
させる被験化合物を、細胞外マトリックス分解を減少させる可能性のある物質と
して同定する。
【００１６】 本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックス分解を減少させる物質をスク
リーニングする方法である。被験化合物を、 配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約３９％一致するヌクレオチ
ド配列； 配列番号１に示すヌクレオチド配列； 配列番号３に示すヌクレオチド配列と少なくとも約３９％一致するヌクレオチ
ド配列；および、 配列番号３に示すヌクレオチド配列； より成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドの、ＣｙｓＬ
Ｔ２様ＧＰＣＲ産物と接触させる。
【００１７】 被験化合物とＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ産物との結合を検出する。それにより、
ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ産物に結合する被験化合物を、細胞外マトリックス分解
を減少させる可能性のある物質として同定する。
【００１８】 本発明のさらに別の態様は、細胞外マトリックス分解を低下させる方法である
。細胞を、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているポリヌクレオ
チドまたは当該ポリヌクレオチドによりコードされている産物［ここで当該ポリ
ヌクレオチドは、 配列番号１に示すヌクレオチド配列と少なくとも約３９％一致するヌクレオチ
ド配列； 配列番号１に示すヌクレオチド配列； 配列番号３に示すヌクレオチド配列と少なくとも約３９％一致するヌクレオチ
ド配列；および、 配列番号３に示すヌクレオチド配列； より成る群から選ばれるヌクレオチド配列を含む］ と特異的に結合する試薬と接触させる。 それにより細胞のＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ活性は減少する。
【００１９】 このように本発明は、アゴニストおよびアンタゴニスト、部分的アゴニスト、
逆アゴニスト、コアクティベーターといったヒトＧＰＣＲモジュレーターとして
被験化合物を同定するために使用できるＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲを提供する。Ｃ
ｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白およびその断片はさらに、レセプターをブロックでき
、リガンド結合を効果的に防止できる、特異抗体の作製に有用である。
【００２０】 （発明の詳細な説明） 本発明はＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている、そして ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約３９％一致するアミノ酸配列
；および、 配列番号２に示すアミノ酸配列、 より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチ
ドをコードしているポリヌクレオチド； ｂ）配列番号１または３で示される配列を含むポリヌクレオチド； ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記したポリヌクレオチドとストリンジェントな（緊
縮）条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド； ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）ないし（ｃ）に明記したポリヌ
クレオチド配列から逸脱しているポリヌクレオチド配列；および、 ｅ）（ａ）ないし（ｄ）に明記したポリヌクレオチド配列の断片、誘導体または
アレレ変異を表すポリヌクレオチド、 より成る群から選ばれる、単離されたポリヌクレオチドに関するものである。
【００２１】 さらに、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白、特にヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白
が、細菌、真菌、原虫、およびウイルス感染症、とりわけＨＩＶウイルスによる
感染症、癌、食欲不振、過食症、ＣＯＰＤ、心血管疾患、例えば急性心不全、狭
心症、心筋梗塞、低血圧症および高血圧症、尿停留、骨粗鬆症、潰瘍、喘息、ア
レルギー、良性前立腺肥大といったような疾患を処置する治療法に使用できるこ
と、そして、ＧＰＣＲが中枢および末梢神経系の両方に対して極めて重要性があ
ること、また、それ故に、新規なＧＰＣＲは神経系疾患、例えば脳損傷後の原発
性および二次的異常、気分障害、不安障害、思考および意志の障害、睡眠および
覚醒の障害、神経原性およびミオパシー障害のような運動単位の障害、アルツハ
イマー病およびパーキンソン病のような神経変性疾患、末梢および慢性疼痛をも
たらす疾患の治療のための新しい有望な標的であることが、本出願人により発見
された。ＣｙｓＬＴ２レセプターは炎症の際に役割を果たすことから、ＣｙｓＬ
Ｔ２様ＧＰＣＲは、炎症性疼痛、関節炎、多発性硬化症などのような神経系の炎
症性疾患において特に重要である。
【００２２】 ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲはさらに、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲアゴニストお
よびアンタゴニスト、部分的アゴニスト、逆アゴニスト、コアクティベーターを
求めるスクリーニングに使用できる。
【００２３】 ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲは、swiss|Q13304|GPRH_HUMAN（図１）に対し３
１７アミノ酸にわたり３５％一致し、trembl|AF119711|AF119711_1（図３）に対
し２９８アミノ酸にわたり３８％一致し、そしてtrembl|Y12546|HSP2YLG_1に対
し３２２アミノ酸にわたり３４％一致する。ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲはシス
テイニルロイコトリエン（ｃｙｃＬＴ１ ＬＴＤ４）レセプターおよびＰ２Ｙレ
セプターに対しホモローガスである。
【００２４】ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチド 本発明に係るＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドは配列番号２に示すアミノ
酸配列、その配列の一部、または下記定義によるその生物学的に活性な変異体を
含む。故に本発明に係るＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドは、ＣｙｓＬＴ２
様ＧＰＣＲ蛋白の一部、完全長ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白、またはＣｙｓＬＴ
２様ＧＰＣＲ蛋白の全てまたは一部を含む融合蛋白であり得る。配列番号２に示
すアミノ酸配列はアミノ酸９３−１１０由来の、およびアミノ酸１１５−１３９
由来の膜貫通ヘリックスを含んでいる。配列番号２のためのヌクレオチドコード
化配列を含む相補対は配列番号１にて示される。
【００２５】生物学的に活性な変異体 生物学的に活性な、即ちリガンドに結合してサイクリックＡＭＰ形成、細胞内
カルシウムの動員、またはホスホイノシチド代謝といった生物学的効果を産む能
力を保持しているＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチド変異体もまた、ＣｙｓＬ
Ｔ２様ＧＰＣＲポリペプチドである。好ましくは、天然または非天然に存在する
ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチド変異体は、配列番号２に示すアミノ酸配列
またはその断片と少なくとも約３９、４０、４５、５０、好ましくは約７５、９
０、９６、または９８％一致するアミノ酸配列を有する。推定されるＣｙｓＬＴ
２様ＧＰＣＲポリペプチド変異体と配列番号２のアミノ酸配列との一致パーセン
トはBlast２整列（アラインメント）プログラムを用いて決定する。
【００２６】 一致パーセントの変異は例えばアミノ酸置換、挿入または欠失に起因し得る。
アミノ酸置換は１対１のアミノ酸の置き換えとして定義される。置換されたアミ
ノ酸が類似の構造的および／または化学的性質を有する場合、置換は保存的であ
る。保存的置換の例は、イソロイシンまたはバリンによるロイシンの置換、グル
タミン酸塩によるアスパラギン酸塩の置換、またはセリンによるスレオニンの置
換である。
【００２７】 アミノ酸挿入または欠失はアミノ酸配列への、またはその内部での変化である
。これらは典型的には約１ないし５アミノ酸の範囲で起こる。ＣｙｓＬＴ２様Ｇ
ＰＣＲポリペプチドの生物学的または免疫学的活性を廃絶することなく、どのア
ミノ酸残基が置換、挿入または欠失できるかを決定する際の指針は、当分野で周
知のコンピュータープログラム、例えばDNASTARソフトウェアを用いて見出すこ
とができる。或るアミノ酸変化が生物学的に活性なＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリ
ペプチドを生成するか否かは、例えば以下の具体的実施例に記載のように、リガ
ンドとの結合を検定することにより、または機能検定を実施することにより、容
易に決定できる。
【００２８】融合蛋白 融合蛋白は、配列番号２に示すアミノ酸配列の少なくとも５、６、８、１０、
２５、もしくは５０、またはそれ以上の連続アミノ酸を含むことができる。融合
蛋白は、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドアミノ酸配列に対する抗体の作製
に、そして様々な検定系での使用に有用である。例えば、融合蛋白は、ＣｙｓＬ
Ｔ２様ＧＰＣＲポリペプチドの一部と相互作用する蛋白の同定に使用できる。蛋
白親和クロマトグラフィーまたは蛋白−蛋白相互作用のためのライブラリーに基
づく検定、例えば酵母２−ハイブリッドまたはファージディスプレイ系をこの目
的のために使用できる。このような方法は当分野で周知であり、薬物スクリーニ
ングとしても使用できる。
【００２９】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチド融合蛋白は、ペプチド結合により融合し
た二つのポリペプチドセグメントを含んでいる。第一のポリペプチドセグメント
は配列番号２の少なくとも５、６、８、１０、２５、もしくは５０、またはそれ
以上の連続アミノ酸を含む。融合蛋白での使用のための連続アミノ酸は配列番号
２に示すアミノ酸配列から、または上記のようなそれらの配列の生物学的に活性
な変異体から選択できる。第一のポリペプチドセグメントはまた、完全長Ｃｙｓ
ＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白を含むことができる。
【００３０】 第二のポリペプチドセグメントは完全長蛋白または蛋白断片であってよい。融
合蛋白の組み立てに一般的に使用する蛋白は、β−ガラクトシダーゼ、β−グル
クロニダーゼ、緑色蛍光蛋白（ＧＦＰ）、自己蛍光蛋白（青色蛍光蛋白（ＢＦＰ
）を包含する）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ルシフェ
ラーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、およびクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）を包含する。さらに、融合蛋白の組み立
てには、ヒスチジン（His）標識、ＦＬＡＧ標識、インフルエンザへマグルチニ
ン（ＨＡ）標識、Ｍｙｃ標識、ＶＳＶ−Ｇ標識、およびチオレドキシン（Ｔｒｘ
）標識を包含するエピトープ標識を使用する。その他の融合組み立て物は、マル
トース結合蛋白（ＭＢＰ）、Ｓ−標識、Lex a ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融
合物、ＧＡＬ４ ＤＮＡ結合ドメイン融合物、および単純ヘルペスウイルス（Ｈ
ＳＶ）ＢＰ１６蛋白融合物を包含する。
【００３１】 融合蛋白はさらに、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドコード化配列とヘテ
ロローガス蛋白配列の間に位置する開裂部位を含むよう組み立てることができ、
その結果、このＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドは、開裂してヘテロローガ
ス部分が無くなるように精製できる。
【００３２】 融合蛋白は当分野で周知のように化学合成できる。好ましくは、融合蛋白は二
つのポリペプチドセグメントを共有結合で連結することにより、または分子生物
学分野で標準的な方法により調製する。例えば、当分野で知られているように、
第二のポリペプチドセグメントをコードしているヌクレオチドを有する適切なリ
ーディングフレームに配列番号１の相補物から選ばれるコード化配列を含む、Ｄ
ＮＡ組み立て物を作製し、このＤＮＡ組み立て物を宿主細胞で発現させる事によ
る組換えＤＮＡ法を用いて、融合蛋白を調製できる。融合蛋白を組み立てるため
の多くのキットが、Promega Corporation(Madison, WI)、Stratagene(La Jolla,
CA)、CLONTECH(Mountain View, CA)、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz,
CA)、MBL international Corporation(MIC; Watertown, MA)、およびQuantum Bi
otechnologies(Montreal, Canada; 1-888-DNA-KITS)といった企業から入手でき
る。
【００３３】種相同体の同定 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドのポリヌクレオチド（下記）を使用して
他の種、例えばマウス、サル、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをス
クリーニングするために好適なプローブまたはプライマーを作製し、ＣｙｓＬＴ
２様ＧＰＣＲポリペプチドの相同体をコードしているｃＤＮＡを同定し、そして
当分野で周知のようにこのｃＤＮＡを発現させて、ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ
ポリペプチドの種相同体を得ることができる。
【００３４】ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチド ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは一本鎖または二本鎖であってよく
、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドのコード化配列またはこのコード化配列
の相補体を含んでいる。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲのコード化配列は配列番号１に
示し、このコード化配列は配列番号３に示したより長い配列の中に位置している
。
【００３５】 ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている縮重ヌクレオチド
配列、および、配列番号１もしくは３に示すヌクレオチド配列と少なくとも約５
０、好ましくは約７５、９０、９６、もしくは９８％一致するホモローガスなヌ
クレオチド配列またはこれらの相補物もまた、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌク
レオチドである。二つのポリヌクレオチド配列間の配列一致パーセントは、ALIG
Nのようなコンピュータープログラムを用いて決定するが、これは、ギャップオ
ープンペナルティー−１２およびギャップエクステンションペナルティー−２に
よるアフィンギャップ検索を用いるFASTAアルゴリズムを使用するものである。
相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）分子、種相同体および生物学的に活性なＣｙｓＬＴ２
様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオ
チドの変異体もやはりＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドであり、配列番
号１の少なくとも６、７、８、９、１０、１２、１５、１８、２０、または２５
の連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたはその相補物もまた同様で
ある。このようなポリヌクレオチドは例えばハイブリダイゼーションプローブま
たはアンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用できる。
【００３６】変異体および相同体の同定 上記のＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの変異体および相同体もまた
ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドである。典型的には、ＣｙｓＬＴ２様
ＧＰＣＲポリヌクレオチド配列は、当分野で周知のように、ストリンジェントな
条件下で候補ポリヌクレオチドを既知のＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチ
ドにハイブリダイズすることにより同定できる。例えば、以下の洗浄条件 -- ２
Ｘ ＳＳＣ（０.３M ＮａＣｌ、０.０３Mクエン酸ナトリウム、pH７.０）、０.１
％ＳＤＳ、室温 ２回、各々３０分間；次いで２Ｘ ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、５
０μC １回、３０分間；次いで２Ｘ ＳＳＣ、室温 ２回、各々１０分間 -- を使
用して、最大約２５−３０％の塩基対ミスマッチを含むホモローガス配列を同定
できる。より好ましくは、ホモローガス核酸鎖は１５−２５％の塩基対ミスマッ
チを、さらに好ましくは５−１５％の塩基対ミスマッチを含む。
【００３７】 本明細書に開示するＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの種相同体はさ
らに、適当なプローブまたはプライマーを作製し、他の種、例えばマウス、サル
、または酵母由来のｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることによっ
て同定できる。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドのヒト変異体は、例え
ばヒトｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。
二本鎖ＤＮＡのＴｍは相同性が１％低下する毎に１−１.５℃低下することがよ
く知られている（Bonner et al., J.Mol.Biol. 81,123(1973)）。故にヒトＣｙ
ｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの変異体または他の種のＣｙｓＬＴ２様Ｇ
ＰＣＲポリヌクレオチドは、推定のホモローガスＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌ
クレオチドを、配列番号１のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドまたは
その相補物とハイブリダイズさせて被験ハイブリッドを作製することによって同
定できる。被験ハイブリッドの融解温度を完全に相補的なヌクレオチド配列を有
するトランスホルミラーゼポリヌクレオチドを含むハイブリッドの融解温度と比
較し、被験ハイブリッドの中の塩基対ミスマッチのパーセント数を算出する。
【００３８】 ストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件に従いト
ランスホルミラーゼポリヌクレオチドまたはその相補物とハイブリダイズするヌ
クレオチド配列もまたＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドである。ストリ
ンジェントな洗浄条件は当分野で周知且つ理解されており、例えばSambrook et
al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2d ed., 1989, 9.50-9.51頁に
開示されている。
【００３９】 典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のためには、温
度と塩濃度の組み合わせを、検討中のハイブリッドの理論的Ｔｍよりおよそ１２
−２０℃低くなるよう選択すべきである。配列番号１に示すヌクレオチド配列を
有するＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドまたはその相同体と、それらの
ヌクレオチド配列のいずれか１つと少なくとも約５０、好ましくは約７５、９０
、９６、または９８％一致するポリヌクレオチド配列とのハイブリッドのＴｍは
、例えばBolton and McCarthy, Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 48,1390(1962)の
式： Ｔｍ＝８１.５℃−１６.６(log１０[Ｎａ＋])＋０.４１(％Ｇ＋Ｃ)−０.６３(
％ホルムアミド)−６００／ｌ）、 [式中、ｌ＝塩基対で表したハイブリッドの長さ] を用いて算出できる。
【００４０】 ストリンジェントな洗浄条件としては例えば、４Ｘ ＳＳＣ（６５℃）、また
は５０％ホルムアミド、４Ｘ ＳＳＣ（４２℃）、または０.５Ｘ ＳＳＣ、０.１
％ＳＤＳ（６５℃）が挙げられる。高度ストリンジェントな洗浄条件は、例えば
０.２Ｘ ＳＳＣ（６５℃）などである。
【００４１】ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの調製 天然に存在するＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは、膜構成成分、蛋
白および脂質といった他の細胞成分を含まないよう単離できる。ポリヌクレオチ
ドは細胞から調製でき、標準的核酸精製技術を用いて単離、またはポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）のような増幅技術を用いて合成、もしくは自動合成機を用い
ることによって調製できる。ポリヌクレオチドを単離する方法は常套的であり、
当分野で知られている。ポリヌクレオチドを取得するためこのような任意の技術
を用いて、単離されたＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを得ることがで
きる。例えば、制限酵素およびプローブを用いてＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲヌクレ
オチド配列を含むポリヌクレオチド断片を単離できる。単離したポリヌクレオチ
ドは、他の分子を少なくとも７０、８０、または９０％含まない調製物である。
【００４２】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ ｃＤＮＡ分子は、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ ｍＲＮＡ
を鋳型に用いて標準的分子生物学技術にて調製できる。その後ＣｙｓＬＴ２様Ｇ
ＰＣＲ ｃＤＮＡ分子は、当分野で周知でありSambrook et al.(1989)のようなマ
ニュアルに開示される分子生物学技術を用いて複製できる。ヒトゲノムＤＮＡま
たはｃＤＮＡを鋳型に使用して本発明に係るポリヌクレオチドのさらなるコピー
を得るため、ＰＣＲのような増幅技術を用いることができる。
【００４３】 別法として、合成化学技術を用いてＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチド
を合成することもできる。遺伝コードの縮重は、例えば配列番号２に示すアミノ
酸配列を有するＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドまたはその生物学的に活性
な変異体をコードしている別のヌクレオチド配列の合成を可能にする。
【００４４】ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの伸長 ＰＣＲに基づく様々な方法を用いて本明細書に開示の核酸配列を伸長させ、プ
ロモーターおよび調節要素といった上流配列を検出することができる。例えば制
限部位ＰＣＲは、既知の座に隣接する未知配列を回収するため、普遍的プライマ
ーを使用する（Sarkar, PCR Methods Applic. 2,318-322,1993）。まず、ゲノム
ＤＮＡを、リンカー配列に対するプライマーおよび既知領域に対し特異的なプラ
イマーの存在下で増幅する。次に、増幅させた配列を、同じリンカープライマー
および最初のものの内部にある別の特異的プライマーを用いる第二回目のＰＣＲ
に付す。各回のＰＣＲの産物を適当なＲＮＡポリメラーゼで転写し、逆転写酵素
を用いて配列決定する。
【００４５】 既知領域に基づく異なるプライマーを用いて配列を増幅または伸長するために
、逆ＰＣＲを使用することもできる（Triglia et al., Nucleic Acids Res. 16,
8186,1988）。OLIGO 4.06 Primer Analysisソフトウェア（National Bioscience
s Inc., Plymouth, Minn.）のような市販ソフトウェアを用いて、長さ２２−３
０ヌクレオチド長、５０％またはそれ以上のＧＣ含有量を持ち、約６８−７２℃
の温度で標的配列とアニーリングするプライマーを設計できる。この方法は、遺
伝子の既知領域に適当な断片を作り出す幾つかの制限酵素を使用する。次いでこ
の断片を分子内ライゲーションにより環化し、ＰＣＲ鋳型として使用する。
【００４６】 使用できるもう一つの方法は、ヒトおよび酵母人工染色体ＤＮＡ中の既知配列
に隣接するＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅を含む、捕捉ＰＣＲである（Lagerstrom et
al., PCR Methods Applic. 1,111-119,1991）。この方法では、作製した二本鎖
配列を、ＰＣＲの実施前に当該ＤＮＡ分子の未知断片中に入れるため、さらに複
数の制限酵素消化とライゲーションを行うことができる。
【００４７】 未知配列を回収するために使用できるもう一つの方法はParker et al., Nucle
ic Acids Res. 19,3055-3060,1991の方法である。加えて、ＰＣＲ、入れ子式(ne
sted)プライマー、およびPROMOTERFINDERライブラリー（CLONTECH, Palo Alto,
Calif.）を用いてゲノムＤＮＡを移動させることができる（CLONTECH, Palo Alt
o, Calif.）。このプロセスはライブラリーをスクリーニングする必要性を排除
し、イントロン／エクソン接合点の発見に有用である。
【００４８】 スクリーニングで完全長ｃＤＮＡを求める場合、より大きなｃＤＮＡを含むよ
うサイズ選択したライブラリーを使用するのが望ましい。遺伝子の５'領域を含
む配列をより多く含んでいるという点で、無作為プライミングしたライブラリー
が好ましい。無作為プライミングしたライブラリーの使用は、オリゴｄ(Ｔ)ライ
ブラリーが完全長ｃＤＮＡを産生しない状況で特に好ましいであろう。ゲノムラ
イブラリーは、配列を５'非転写調節領域へと伸長させるのに有用であり得る。
【００４９】 市販品が入手可能な毛細管電気泳動系を用いて、ＰＣＲまたは配列決定産物の
サイズを分析、またはヌクレオチド配列を確認することができる。例えば、毛細
管配列決定は、電気泳動分離用の流動性ポリマー、レーザー励起する４種の異な
る蛍光色素（各ヌクレオチドにつき１種ずつ）、および電荷結合素子カメラによ
る放射された波長の検出を利用することができる。出力／光強度は適当なソフト
ウェア（例えばGENOTYPERおよびSequence NAVIGATOR、Perkin Elmer）を用いて
電気信号に変換でき、試料のロードからコンピューター分析および電子的データ
表示に至る全プロセスをコンピューター管理することができる。毛細管電気泳動
は、特定の試料中に限られた量で存在するかも知れないＤＮＡの小片を配列決定
するのに特に好ましい。
【００５０】ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドの取得 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドは、例えばヒト細胞からの精製によって
、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの発現によって、または直接的化学
合成によって取得できる。
【００５１】蛋白精製 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドは、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレ
オチドでトランスフェクトした宿主細胞を包含する、該レセプターを発現する任
意のヒト細胞から精製できる。精製ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドは、細
胞内のＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドに通常付随するその他の化合物、例
えば或る種の蛋白、炭水化物、または脂質から、当分野で周知の方法を用いて分
離する。このような方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム
分画、イオン交換クロマトグラフィー、親和クロマトグラフィー、および調製用
ゲル電気泳動を包含するが、これらに限定されない。
【００５２】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドは、下記の具体的実施例に記載のように
、付随するＧ蛋白との複合体として簡便に単離できる。精製ＣｙｓＬＴ２様ＧＰ
ＣＲポリペプチドの調製物は少なくとも８０％純粋であり、好ましくは該調製物
は９０％、９５％、または９９％純粋である。調製物の純度はＳＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動のような当分野で既知の任意の手段によって評価できる
。
【００５３】ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの発現 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドを発現させるため、挿入されたコード化
配列の転写と発現に必要な要素を含む発現ベクター中にＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ
ポリヌクレオチドを挿入することができる。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチ
ドをコードしている配列および適当な転写および翻訳調節要素を含む発現ベクタ
ーを組み立てるため、当業者に周知の方法が利用できる。これらの方法には、イ
ンビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えがある。こ
のような技術は、例えばSambrook et al.(1989)およびAusubel et al., CURRENT
PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York., 1989に記
載されている。
【００５４】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列を含みそして発現
する様々な発現ベクター／宿主系が利用できる。これらには、微生物、例えば組
換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターによ
り形質転換された細菌；酵母発現ベクターにより形質転換された酵母、ウイルス
発現ベクター（例えばバキュロウイルス）により感染を受けた昆虫細胞系、ウイ
ルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモ
ザイクウイルス、ＴＭＶ）、もしくは細菌発現ベクター（例えばＴｉまたはｐＢ
Ｒ３２２プラスミド）により形質転換された植物細胞系、または動物細胞系が包
含されるがこれらに限定される訳ではない。
【００５５】 調節要素または調節配列は、宿主細胞蛋白と相互作用して転写と翻訳を実行す
る、ベクターの非翻訳領域 エンハンサー、プロモーター、５'および３'非翻訳
領域 である。係る要素はその強さと特異性において異なっている。利用するベ
クター系および宿主に応じて、構成的および誘導的プロモーターを包含する、多
数の好適な転写および翻訳要素を使用できる。例えば、細菌系でクローニングを
行う場合、BLUESCRIPTファージミド（Stratagene, LaJolla，Calif.）またはpSP
ORT１プラスミド（Life Technologies）等のハイブリッドlacZプロモーターのよ
うな誘導的プロモーターを使用できる。バキュロウイルスのポリヘドリンプロモ
ーターは昆虫細胞に使用できる。植物細胞のゲノムから（例えば熱ショック、RU
BISCO、および貯蔵蛋白遺伝子）、または植物ウイルスから（例えば、ウイルス
プロモーターまたはリーダー配列）誘導したプロモーターまたはエンハンサーを
該ベクター中にクローニングすることができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物
遺伝子由来の、または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが好ましい。Ｃｙｓ
ＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列を複数コピー
含むセルラインを作製する必要がある場合は、ＳＶ４０またはＥＢＶに基づくベ
クターを適当な選択マーカーと共に使用することができる。
【００５６】細菌および酵母発現系 細菌系では、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドに対して意図する用途に応
じて幾つかの発現ベクターを選択できる。例えば、抗体の誘導のため大量のＣｙ
ｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドが必要である場合は、容易に精製できる融合蛋
白の高レベル発現を指令するベクターが使用できる。このようなベクターは、BL
UESCRIPT(Stratagene)のような多機能E.coliクローニングおよび発現ベクターを
包含するが、これに限定される訳ではない。BLUESCRIPTベクターにおいては、Ｃ
ｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列を、β−ガラクトシダ
ーゼのアミノ末端Ｍｅｔとこれに続く７残基の配列と共にフレーム内で該ベクタ
ー中にライゲーションすることができ、その結果ハイブリッド蛋白が産生される
。ｐＩＮベクター（Van Heeke & Schuster, J.Biol.Chem. 264,5503-5509,1989
）またはｐＧＥＸベクター（Promega, Madison, Wis.）もまた、グルタチオンＳ
−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を伴う融合蛋白として外来ポリペプチドを発現
させるのに使用できる。一般に、このような融合蛋白は可溶性であり、グルタチ
オン−アガロースビーズに吸着させ、その後遊離グルタチオンの存在下で溶離す
ることにより、溶菌させた細胞から容易に精製できる。このような系で調製した
蛋白は、ヘパリン、トロンビン、または第Ｘａ因子プロテアーゼ開裂部位を含む
よう設計でき、その結果、目的とするクローンポリペプチドをＧＳＴ部分から随
意に解放することができる。
【００５７】 酵母Saccharomyces cerevisiaeにおいては、α因子、アルコールオキシダーゼ
、およびＰＧＨのような構成的または誘導的プロモーターを含む幾つかのベクタ
ーが使用できる。総説としてAusubel et al.(1989)およびGrant et al., Method
s Enzymol. 153,516-544,1987を参照されたい。
【００５８】植物および昆虫発現系 植物発現ベクターを使用する場合、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコ
ードしている配列の発現は、幾つかのプロモーターのうち任意のものにより駆動
できる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーターのようなウイルス
プロモーターを、単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせ
て使用できる（Takamatsu, EMBO J. 6,307-311,1987）。別法として、RUBISCOの
小サブユニットのような植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用
することもできる（Coruzzi et al., EMBO J. 3,1671-1680,1984；Broglie et a
l., Science 224,838-843,1984；Winter et al., Results Probl.Cell Differ.
17,85-105,1991）。これらの組み立て物は、直接ＤＮＡ形質転換または病原体仲
介トランスフェクションにより植物細胞中に導入できる。このような技術は幾つ
かの一般に入手可能な総説に記載されている（例えば、HobbsまたはMurray、MCG
RAW HILL YEARBOOK OF SCIENCE AND TECHNOLOGY, McGraw Hill, New York, N.Y.
, pp191-196,1992）。
【００５９】 昆虫系もまたＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドの発現に使用できる。例え
ば、係る系の１つAutographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）は
、Spodoptera frugiperda細胞またはTrichoplusiaの幼虫で外来遺伝子を発現さ
せるベクターとして使用する。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードし
ている配列を、ポリヘドリン遺伝子のような該ウイルスの非必須領域中にクロー
ニングし、ポリヘドリンプロモーターの調節下に置くことができる。ＣｙｓＬＴ
２様ＧＰＣＲポリペプチドをうまく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子は不活性化
し、コート蛋白を欠く組換えウイルスが生成する。次いでこの組換えウイルスを
S.frugiperda細胞またはTrichoplusiaの幼虫への感染に使用し、そこでＣｙｓＬ
Ｔ２様ＧＰＣＲポリペプチドを発現させることができる（Engelhard et al., Pr
oc.Nat.Acad.Sci. 91,3224-3227,1994）。
【００６０】哺乳動物発現系 ウイルスに基づく多くの発現系を用いて哺乳動物宿主細胞でＣｙｓＬＴ２様Ｇ
ＰＣＲポリペプチドを発現させることができる。例えば、発現ベクターとしてア
デノウイルスを使用する場合、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードし
ている配列は、後期プロモーターおよび３部に分かれたリーダー配列を含むアデ
ノウイルス転写／翻訳複合体中にライゲーションできる。該ウイルスゲノムの非
必須Ｅ１またはＥ３領域における挿入を用いて、感染宿主細胞においてＣｙｓＬ
Ｔ２様ＧＰＣＲポリペプチドを発現できる生存ウイルスを取得できる（Logan &
Shenk, Proc.Natl.Acad.Sci. 81,3655-3659,1984）。所望によりラウス肉腫ウイ
ルス（ＲＳＶ）エンハンサーのような転写エンハンサーを用いて哺乳動物宿主細
胞での発現を増大させることができる。
【００６１】 ヒト人工染色体（ＨＡＣ）もまた、プラスミドが内包し発現するＤＮＡ断片よ
りも大きなＤＮＡ断片の運搬に使用できる。６Ｍないし１０ＭのＨＡＣを組み立
て、常套的デリバリー法により細胞に到達させる（例えば、リポソーム、ポリカ
チオンアミノポリマー、または小胞）。
【００６２】 さらに、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列の、より
効率的な翻訳を達成するために、特異的開始シグナルを使用できる。係るシグナ
ルはＡＴＧ開始コドンおよび連続配列を包含する（Kozak配列）。ＣｙｓＬＴ２
様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列、その開始コドン、および上流配
列を適当な発現ベクター中に挿入した場合、さらなる転写または翻訳調節シグナ
ルは必要ないであろう。しかしながら、コード化配列またはその断片のみを挿入
した場合は、外因性の翻訳調節シグナル（ＡＴＧ開始コドンを包含する）を供給
すべきである。開始コドンは挿入物全体を確実に翻訳させるために、正しいリー
ディングフレームになければならない。外因性翻訳要素および開始コドンは天然
および合成両者の様々な起源であってよい。発現の効率は、使用する特定の細胞
系に対し適切なエンハンサーを存在させることにより増強できる（Scharf et al
., Results Probl.Cell Differ. 20,125-162,1994）。
【００６３】宿主細胞 宿主細胞菌株は、挿入した配列の発現を調節する能力または発現されたＣｙｓ
ＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドを所望の方法で処理できる能力を目的として選択
できる。該ポリペプチドのこのような修飾には、アセチル化、カルボキシ化、グ
リコシル化、燐酸化、脂質化、およびアシル化が包含されるがこれらに限定され
ない。該ポリペプチドの「プレプロ」型を開裂する翻訳後プロセシングもまた、
正しい挿入、折り畳み、および／または機能を促進するために使用できる。翻訳
後活性のための特異的な細胞機構および特徴的メカニズムを持つ異なる宿主細胞
（例えばＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、１３２１Ｎ１およびＷＩ
３８）が、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ；10801 University B
oulevard, Manassas, VA 20110-2209）から入手でき、外来蛋白の正しい修飾お
よびプロセシングを確実とするために選択できる。
【００６４】 組換え蛋白の、長期高収量産生のために、安定な発現が好ましい。例えば、セ
ルラインは、クローニングされたＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ ｃＤＮＡまたはゲノ
ムＤＮＡ、ウイルス複製起点および／または内因性発現要素、および同じまたは
別のベクター上にある選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを使用して、常套
的トランスフェクション法、例えばリポソーム、ポリカチオンアミノポリマー、
小胞、電気穿孔、燐酸カルシウム等によって安定にトランスフェクトされ得る。
該ベクターの導入に続いて、細胞を強化培地で１−２日間生育させた後、培地を
選択培地に交換することができる。選択マーカーの目的は選択に対する抵抗性を
付与することであり、その存在が、導入されたＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ配列をう
まく発現する細胞の生育と回収を可能にする。安定に形質転換された細胞の耐性
クローンは、その細胞型にとって適当な組織培養技術を用いて増殖させることが
できる。例えば、ANIMAL CELL CULTURE, R.I.Freshney,ed.,1986を参照されたい
。
【００６５】 幾つかの選択系を用いて、形質転換されたセルラインを回収できる。これらに
は、それぞれtk−またはaprt−細胞で使用できる単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ（Wigler et al., Cell 11,223-32,1977）およびアデニンホスホリボシ
ルトランスフェラーゼ（Lowy et al., Cell 22,817-23,1980）遺伝子が包含され
るがこれらに限定される訳ではない。さらに、代謝拮抗物質、抗生物質、または
除草剤耐性を選択の基準に用いることができる。例えば、dhfrはメソトレキサー
トに対する耐性を付与し（Wigler et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 77,3567-70,19
80）nptはアミノグリコシド、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付
与し（Colbere-Garapin et al., J.Mol. Biol. 150,1014,1981）、そしてalsお
よびpatはそれぞれクロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトラン
スフェラーゼに対する耐性を付与する（Murray, 1992,上記）。さらなる選択遺
伝子が記載されている。例えば、trpBは細胞がトリプトファンの代わりにインド
ールを利用するようにさせ、hisDは細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノールを
利用するようにさせる（Hartman & Mulligan, Proc.Natl.Acad.Sci. 85,8047-51
,1988）。アントシアニンのような可視マーカー、β−グルクロニダーゼとその
基質ＧＵＳ、およびルシフェラーゼとその基質ルシフェリンは、形質転換体を同
定し、特異的ベクター系に帰すことのできる一過性または安定な蛋白発現の量を
定量するために使用できる（Rhodes et al., Methods Mol.Biol. 55,121-131,19
95）。
【００６６】ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドの発現の検出 マーカー遺伝子発現の存在はＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドもまた
存在することを示唆しているが、その存在と発現は確認する必要がある。例えば
、もしＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列がマーカー遺
伝子配列内部に挿入されるならば、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコー
ドしている配列を含む形質転換された細胞は、マーカー遺伝子機能の不在によっ
て同定できる。これに代わり、マーカー遺伝子は、単一のプロモーターの調節下
にＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列とタンデムに並べ
て位置させることもできる。誘導または選択に応答したマーカー遺伝子の発現は
、通常、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドの発現を示す。
【００６７】 これとは別に、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを含みＣｙｓＬＴ２
様ＧＰＣＲポリペプチドを発現する宿主細胞は、当業者に知られる様々な方法に
よって同定できる。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハ
イブリダイゼーションおよび蛋白生検またはイムノアッセイ技術（核酸または蛋
白の検出および／または定量のための膜、溶液、またはチップに基づく技術を包
含する）が包含されるがこれらに限定されない。例えば、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣ
Ｒポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の存在は、プローブまた
は断片またはＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているポリヌクレ
オチドの断片を使用するＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼー
ションまたは増幅によって検出できる。核酸増幅に基づく検定は、ＣｙｓＬＴ２
様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを含む形質転換体を検出するための、ＣｙｓＬＴ２
様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列から選択されるオリゴヌクレオチ
ドの使用を含む。
【００６８】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドに対し特異的なポリクローナルまたはモ
ノクローナル抗体のいずれかを使用して該ポリペプチドの発現を検出および測定
するための様々なプロトコルが当分野で知られている。例として、酵素結合イム
ノソルベント検定（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍
光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）がある。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペ
プチド上の２個の非干渉性エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いる、
２部位のモノクローナルに基づくイムノアッセイが使用でき、または、競合的結
合検定を使用することができる。これらのそしてその他の検定はHamptom et al.
, SEROLOGICAL METHODS: A LABORATORY MANUAL, APS Press, St.Paul, Minn., 1
990およびMaddox et al., J.Exp.Med. 158,1211-1216,1983）に記載されている
。
【００６９】 多岐にわたる標識およびコンジュゲーション技術が当業者に知られており、様
々な核酸およびアミノ酸検定に使用できる。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチ
ドをコードしているポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識化ハ
イブリダイゼーションまたはＰＣＲプローブを調製する手段は、標識したヌクレ
オチドを使用する、オリゴ標識化、ニック翻訳、末端標識化、またはＰＣＲ増幅
を包含する。これとは別に、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードして
いる配列を、ｍＲＮＡプローブの産生のためのベクター中にクローニングするこ
ともできる。このようなベクターは当分野で既知であり、市販品が入手でき、標
識化ヌクレオチドおよび適当なＲＮＡポリメラーゼ、例えばＴ７、Ｔ３、または
ＳＰ６を添加することによりインビトロでのＲＮＡプローブの合成に使用するこ
とができる。これらの方法は、市販の様々なキットを用いて実施できる（Amersh
am Pharmacia Biotech、 Promega、およびUS Biochemical）。検出を容易にする
ために使用できる適当なリポーター分子または標識には、放射性核種、酵素、お
よび蛍光、化学ルミネセント、または色素生成物質、ならびに基質、補助因子、
インヒビター、磁性粒子などが包含される。
【００７０】ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドの発現および精製 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列で形
質転換させた宿主細胞は、発現と、細胞培養からの蛋白の回収に適した条件下で
培養できる。形質転換細胞により産生されたポリペプチドは、その配列および／
または使用したベクターに応じて分泌されまたは細胞内に貯留され得る。当業者
には理解できるであろうが、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードして
いるポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核または真核細胞膜を通った可
溶性ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドの分泌を指令する、または膜結合Ｃｙ
ｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドの、膜挿入を指令する、シグナル配列を含むよ
う設計できる。
【００７１】 上に論じたように、他の組み立て物を用いて、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペ
プチドをコードしている配列を、可溶性蛋白の精製を促進するポリペプチドドメ
インをコードしているヌクレオチド配列と結合させることができる。このような
精製促進ドメインは、金属キレート化ペプチド、例えば固定化金属上での精製を
可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定化免疫グロブリン上で
の精製を可能にする蛋白Ａドメイン、およびFLAGS伸長／親和精製系で利用する
ドメインが包含されるが、これらに限定されない（Immunex Corp., Seattle, Wa
sh.）。精製ドメインとＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドとの間に開裂可能
リンカー配列、例えば第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼに特異的なリンカー配
列を入れること（Invitrogen, San Diego, CA）もまた、精製を促進するために
利用できる。このような発現ベクターの１つは、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペ
プチドと、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ開裂部位に先立つ６個のヒス
チジン残基とを含む融合蛋白の発現を提供する。このヒスチジン残基はＩＭＡＣ
（Porath et al., Prot.Exp.Purif. 3,263-281,1992に記載の固定化金属イオン
親和クロマトグラフィー）による精製を促進し、一方エンテロキナーゼ開裂部位
は融合蛋白からのＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドの精製手段を提供する。
融合蛋白を含むベクターはKroll et al., DNA Cell Biol. 12,441-453,1993に開
示されている。
【００７２】化学合成 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている配列は、その全体また
は一部を、当分野で周知の化学的方法を用いて合成できる（Caruthers et al.,
Nucl.Acids Res.Symp.Ser. 215-223,1980；Horn et al., Nucl.Acids Res.Symp.
Ser. 225-232,1980）。これとは別に、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチド自
身を、そのアミノ酸配列を合成するための化学的方法、例えば固相技術を用いる
直接ペプチド合成を用いて調製できる（Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85,2149-2
154,1963；Roberge et al., Science 269,202-204,1995）。蛋白合成は手動技術
またはオートメーションを用いて実施できる。自動化合成は、例えばApplied Bi
osystems 431Aペプチド合成機（Perkin Elmer）を用いて達成できる。所望によ
り、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドの断片を別々に合成し、化学的方法を
用いて合して完全長の分子を調製することもできる。
【００７３】 新たに合成したペプチドは、調製用高速液体クロマトグラフイー（例えばCrei
ghton, PROTEINS: STRUCTURES AND MOLECULAR PRINCIPLES, WH Freeman and Co.
, New York, N.Y., 1983）により実質的に精製できる。合成ＣｙｓＬＴ２様ＧＰ
ＣＲポリペプチドの組成はアミノ酸分析または配列決定により確認できる（例え
ばエドマン分解法；Creighton、上記を参照されたい）。さらに、直接合成中に
ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドのアミノ酸配列の任意の部分を改変させ、
そして／または化学的方法を用いて他の蛋白由来の配列と合して、変異体ポリペ
プチドまたは融合蛋白を調製することができる。
【００７４】改変ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドの調製 当業者には理解できるであろうが、天然に存在しないコドンを有するＣｙｓＬ
Ｔ２様ＧＰＣＲポリペプチドコード化ヌクレオチドを調製することは有利であり
得る。例えば、特定の原核または真核宿主が好むコドンを選択して、蛋白発現の
速度を増大させ、または所望の性質、例えば天然に存在する配列から産み出され
る転写物の半減期より長い半減期を持つＲＮＡ転写物を調製することができる。
【００７５】 本明細書に開示するヌクレオチド配列は、当分野で一般的に知られる方法を用
いて、該ポリペプチドまたはｍＲＮＡ産物のクローニング、プロセシング、およ
び／または発現を修飾する改変を包含する（但しこれらに限定される訳ではない
）様々な理由で、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドコード化配列を改変させ
るように設計できる。無作為断片化によるＤＮＡシャフリングと遺伝子断片およ
び合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再集合を用いてヌクレオチド配列を設計でき
る。例えば、位置指定突然変異誘発を用いて、新たな制限部位を挿入し、グリコ
シル化パターンを変え、コドンの優先性を変え、スプライス変異体を調製し、突
然変異を導入する等を実施できる。
【００７６】抗体 当分野で知られているいかなる型の抗体も、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプ
チドのエピトープに特異的に結合するよう作製できる。本明細書で使用する「抗
体」とは、無傷の免疫グロブリン分子、およびその断片、例えばＦａｂ、Ｆ(ａ
ｂ')２、およびＦｖを包含し、これらはＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドの
エピトープに結合できる。典型的には、エピトープを形成するためには少なくと
も６、８、１０、または１２の連続するアミノ酸が必要である。しかしながら、
非連続アミノ酸を含むエピトープはより多くの、例えば少なくとも１５、２５、
または５０のアミノ酸を必要とするかも知れない。
【００７７】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドのエピトープに特異的に結合する抗体は
治療に使用でき、そして免疫化学検定、例えばウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ
、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学検定、免疫沈降、またはその他の当分野
で既知の免疫化学的検定に使用できる。所望の特異性を有する抗体の同定のため
、様々なイムノアッセイが使用できる。競合的結合または免疫放射検定のための
多数のプロトコルが当分野でよく知られている。このようなイムノアッセイは典
型的には、免疫原と、その免疫原に特異結合する抗体との間の複合体形成の測定
を含んでいる。
【００７８】 典型的には、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドに特異的に結合する抗体は
、免疫化学検定に使用する時、他の蛋白が提供する検出シグナルより少なくとも
５、１０、または２０倍高い検出シグナルを提供する。好ましくは、ＣｙｓＬＴ
２様ＧＰＣＲポリペプチドに特異結合する抗体は、免疫化学検定で他の蛋白を検
出せず、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドを溶液から免疫沈降させることが
できる。
【００７９】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドは、哺乳動物、例えばマウス、ラット、
ウサギ、モルモット、サル、またはヒトを免疫してポリクローナル抗体を産生さ
せるのに使用できる。所望により、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドは、担
体蛋白、例えば牛血清アルブミン、チログロブリン、およびスカシガイヘモシア
ニンとコンジュゲートさせることができる。宿主の種に応じて、免疫学的反応を
増大させるために種々のアジュバントを使用できる。このようなアジュバントは
、フロイントアジュバント、鉱物性ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、および
界面活性物質（例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、
ペプチド、油性エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノ
ール）を包含するがこれらに限定されない。ヒトに使用するアジュバントの中で
はＢＣＧ（bacilli Calmette-Guerin）およびCorynebacterium parvumが特に有
用である。
【００８０】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体
は、培養中の連続的セルラインにより抗体分子の産生を提供する任意の技術を用
いて調製できる。これらの技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリ
ドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術があるがこれらに限定されない
（Kohler et al., Nature 256,495-497,1985; Kozbor et al., J.Immunol.Metho
ds 81,31-42,1985; Cote et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 80,2026-2030,1983; Co
le et al., Mol.Cell Biol. 62,109-120,1984）。
【００８１】 さらに、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子にスプライシングして適当な抗原
特異性と生物活性を持つ分子を得る、「キメラ抗体」の産生のために開発された
技術が利用できる（Morrison et al., Proc.Natl.Acad.Sci. 81,6851-6855,1984
; Neuberger et al., Nature 312,604-608,1984; Takeda et al., Nature 314,4
52-454,1985）。モノクローナルおよびその他の抗体はまた、これを治療に使用
した場合に患者が該抗体に対する免疫反応を起こすのを防ぐため、「ヒト化」す
ることができる。このような抗体は、治療に直接使用できるほど配列が充分ヒト
に類似しているかも知れず、または幾つかの重要残基の変更を必要とするかも知
れない。齧歯類の抗体とヒト配列の間の配列相違は、個々の残基の位置指定突然
変異誘発により、または相補性決定領域全体のgratingにより、ヒト配列内の残
基と相違する残基を置き換えることによって最小化することができる。別法とし
て、ヒト化抗体はGB2188638Bに記載のように組換え法を用いて調製できる。Ｃｙ
ｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドに特異的に結合する抗体は、U.S.5565332に開
示のように、部分的または完全にヒト化した抗原結合部位を含むことができる。
【００８２】 これに代わり、当分野で既知の方法を用いて、一本鎖抗体の調製のために記載
した技術を適合させ、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドに特異結合する一本
鎖抗体を調製することができる。関連する特異性を持つが別個のイディオタイプ
組成を有する抗体を、無作為組み合わせ免疫グロブリンライブラリーから鎖シャ
フリングによって調製することができる（Burton, Proc.Natl.Acad.Sci. 88,111
20-23,1991）。
【００８３】 一本鎖抗体はまた、ハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型に用いて、ＰＣＲのような
ＤＮＡ増幅法を用いて組み立てることができる（Thirion et al., 1996, Eur.J.
Cancer Prev. 5,507-11）。一本鎖抗体は単一または二重特異性であり得、また、
二価または四価であり得る。四価二重特異性一本鎖抗体の組み立ては例えばColo
ma & Morrison, 1997, Nat.Biotechnol. 15,159-63に教示されている。二価二重
特異性一本鎖抗体の組み立てはMallender & Voss, 1994, J.Biol.Chem. 269,199
-206に教示されている。
【００８４】 下記のように、一本鎖抗体をコードしているヌクレオチド配列を手動または自
動ヌクレオチド合成を用いて組み立て、標準的組換えＤＮＡ法を用いて発現組み
立て物中にクローニングし、そして細胞中に導入してコード化配列を発現させる
ことができる。別法として、一本鎖抗体を、例えば糸状ファージ技術を用いて直
接調製することもできる（Verhaar et al., 1995, Int.J.Cancer 61,497-501; N
icholla et al., 1993, J.Immunol.Meth. 165,81-91）。
【００８５】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドに特異結合する抗体はまた、リンパ球集
団においてインビボ産生を誘導することによって、または、文献に開示されてい
る極めて特異的な結合試薬のパネルまたは免疫グロブリンライブラリーをスクリ
ーニングすることによって調製することもできる（Orlandi et al., Proc.Natl.
Acad.Sci. 86,3833-3837,1989; Winter et al., Nature 349,293-299,1991）。
【００８６】 その他の型の抗体を、本発明方法において組み立て、治療に使用することがで
きる。例えば、WO93/03151に開示のように、キメラ抗体を組み立てることができ
る。免疫グロブリンから誘導され多価且つ多重特異的である結合蛋白、例えばWO
94/13804に記載の「diabodies」もまた調製できる。
【００８７】 本発明に係る抗体は当分野で周知の方法により精製できる。例えば、抗体は、
ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドが結合しているカラムを通過させることに
より親和精製できる。次いで、結合した抗体を、高い塩濃度の緩衝液を用いてカ
ラムから溶出することができる。
【００８８】アンチセンスオリゴヌクレオチド アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対し相
補的なヌクレオチド配列である。いったん細胞中に導入されるとこの相補的ヌク
レオチドは、該細胞が産生した天然配列と結合して複合体を形成し、転写または
翻訳のいずれかを遮断する。好ましくはアンチセンスオリゴヌクレオチドは少な
くとも１１ヌクレオチド長であるが、少なくとも１２、１５、２０、２５、３０
、３５、４０、４５、もしくは５０またはそれ以上のヌクレオチド長であっても
よい。より長い配列もまた使用できる。アンチセンスオリゴヌクレオチド分子を
ＤＮＡ組み立て物に提供し、上記のように細胞中に導入して、その細胞における
ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白遺伝子産物のレベルを低下させることができる。
【００８９】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレ
オチド、またはこの両者の組み合わせであってよい。オリゴヌクレオチドは、１
つのヌクレオチドの５'末端を、アルキルホスホネート、ホスホロチオエート、
ホスホロジチオエート、アルキルホスホノチオエート、アルキルホスホネート、
ホスホロアミデート、燐酸エステル、カルバメート、アセトアミデート、カルボ
キシメチルエステル、カルボネート、および燐酸トリエステルといった非ホスホ
ジエステルヌクレオチド間結合を有する別のヌクレオチドの３'末端と共有結合
させることにより、手動で、または自動合成機によって合成できる。Brown, Met
h.Mol. Biol. 20,1-8,1994; Sonveaux, Meth.Mol.Biol. 26,1-72,1994; Uhlmann
et al., Chem.Rev. 90,543-583,1990を参照されたい。
【００９０】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白遺伝子の制御、５'、または調節領域と二本鎖を
形成するアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計することにより、ＣｙｓＬＴ２
様ＧＰＣＲ蛋白遺伝子発現の修飾が得られる。転写開始部位、例えば開始部位か
ら−１０および＋１０位の間から誘導されるオリゴヌクレオチドが好ましい。同
様に、「三重らせん」塩基対合法を用いて阻害を達成できる。三重らせん対合は
、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子またはシャペロンの結合に足るほど開く
能力の阻害を惹起するため、有用である。三本鎖ＤＮＡを用いる治療上の進歩が
文献に記載されている（例えばGee et al., Huber & Carr, MOLECULAR AND IMMU
NOLOGIC APPROACHES, Futura Publishing Co., Mt.Kisco, N.Y., 1994）。転写
物がリボソームに結合するのを防ぐことによりｍＲＮＡの翻訳を遮断するアンチ
センスオリゴヌクレオチドもまた設計できる。
【００９１】 アンチセンスオリゴヌクレオチドとＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチド
の相補配列との間に好結果の複合体を形成させるためには、正確な相補性は必要
ない。例えばＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドに対し正確に相補的であ
る２、３、４、もしくは５またはそれ以上の長さの連続するヌクレオチドであっ
て、その各々が、隣接するＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白ヌクレオチドとは相補的
ではない連続するある長さのヌクレオチドによって隔てられているものを含有す
るアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白ｍＲＮＡに
対する充分な標的化特異性を提供できる。好ましくは、相補的な連続ヌクレオチ
ドの長さはそれぞれ少なくとも４、５、６、７もしくは８またはそれ以上のヌク
レオチド長である。非相補的な介在配列は、好ましくは１、２、３、または４ヌ
クレオチド長である。当業者は、アンチセンス−センスの対の算出融点を容易に
使用して、特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドと特定のＣｙｓＬＴ２様ＧＰ
ＣＲポリヌクレオチド配列間で寛容されるミスマッチの程度を決定できるであろ
う。
【００９２】 アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチ
ドとハイブリダイズする能力に影響を及ぼすことなく修飾できる。これらの修飾
は該アンチセンス分子の内部、または一端もしくは両端である。例えば、ヌクレ
オシド間の燐酸結合は、アミノ基と末端リボースの間にいろいろな数の炭素残基
を有するコレステリルまたはジアミン部分を加えることによって修飾できる。修
飾された塩基および／または糖、例えばリボースの代わりのアラビノース、また
は３'ヒドロキシ基または５'燐酸基が置換されている３',５'−置換オリゴヌク
レオチドもまた修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドに使用できる。これらの修
飾オリゴヌクレオチドは当分野で周知の方法により調製できる。例えば、Agrawa
l et al., Trends Biotechnol. 10,152-158,1992; Uhlmann et al., Chem.Rev.
90,543-584,1990; Uhlmann et al., Tetrahedron.Lett. 215,3539-3542,1987を
参照されたい。
【００９３】リボザイム リボザイムは触媒活性を有するＲＮＡ分子である。例えば、Cech, Science 23
6,1532-1539; 1987; Cech, Ann.Rev.Biochem. 59,543-568; 1990, Cech, Curr.O
pin.Struct.Biol. 2,605-609; 1992, Couture & Stinchcomb, Trends Genet. 12
,510-515, 1996を参照されたい。当分野で知られるように、リボザイムは、ＲＮ
Ａ配列を開裂することにより遺伝子機能を阻害するのに使用できる（例えば、Ha
seloff et al., 米国特許5641673）。リボザイムの作用機構は、相補的標的ＲＮ
Ａに対するリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、その後のen
donucleolyticな開裂を含む。例には、特異的ヌクレオチド配列のendonucleolyt
icな開裂を特異的且つ効果的に触媒できる、設計されたハンマーヘッドモチーフ
リボザイム分子がある。
【００９４】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドのコード化配列、例えば配列番号１
に示したものの相補物を用いて、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドから
転写されたｍＲＮＡに特異結合するリボザイムを作製できる。他のトランスのＲ
ＮＡ分子を極めて配列特異的に開裂できるリボザイムを設計し組み立てる方法が
開発され、当分野で記載されている（Haseloff et al. Nature 334,585-591,198
8）。例えば、リボザイムの開裂活性は、別個の「ハイブリダイゼーション」領
域を該リボザイム中に組み入れることによって、特定のＲＮＡを標的とさせるこ
とができる。このハイブリダイゼーション領域は標的ＲＮＡに対し相補的な配列
を含んでおり、したがってその標的と特異的にハイブリダイズする（例えばGerl
ach et al., EP321201を参照されたい）。
【００９５】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白ＲＮＡ標的内部の特異的リボザイム開裂部位は、
この標的分子を、以下の配列：ＧＵＡ、ＧＵＵ、およびＧＵＣを包含するリボザ
イム開裂部位についてスキャンすることにより同定できる。同定できたならば、
該開裂部位を含む標的ＲＮＡの領域に対応する、１５および２０の間のリボヌク
レオチドを有する短いＲＮＡ配列を、標的を非機能的にし得る二次構造の特徴に
ついて評価できる。さらに、候補のＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白ＲＮＡ標的の適
合性を、リボヌクレアーゼ防護検定を用いて相補的オリゴヌクレオチドとのハイ
ブリダイゼーションに対する利用可能性を試験することによって評価できる。配
列番号１、３に示すヌクレオチド配列およびこれらの相補物は、適当なハイブリ
ダイゼーション領域配列の供給源を提供する。より長い相補配列を用いて、標的
に対するハイブリダイゼーション配列の親和性を増大させることができる。リボ
ザイムのハイブリダイズおよび開裂する領域は、相補領域を介して標的ＲＮＡに
ハイブリダイズする時、リボザイムの触媒領域が標的を開裂し得るといったよう
に、完全に相関している。
【００９６】 リボザイムはＤＮＡ組み立て物の一部として細胞内に導入できる。マイクロ注
入、リポソーム仲介トランスフェクション、電気穿孔、または燐酸カルシウム沈
殿といった機械的方法を用いて、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白発現の低下が望ま
れる細胞中にリボザイム含有ＤＮＡ組み立て物を導入することができる。これと
は別に、細胞がＤＮＡ組み立て物を安定的に保持することが望まれる場合は、該
組み立て物をプラスミド上で供給し、当分野で知られるように、別個の要素とし
て維持するか、または細胞のゲノム中に組み込むことができる。リボザイムコー
ド化ＤＮＡ組み立て物は、細胞中のリボザイムの転写を調節するために、プロモ
ーター要素、エンハンサーまたはＵＡＳ要素、および転写ターミネーターシグナ
ルといった転写調節要素を含み得る。
【００９７】 Haseloff et al.,米国特許5641673に教示のように、リボザイムは、標的遺伝
子の発現を誘導する因子に応答してリボザイムの発現が起こるように設計するこ
とができる。リボザイムはまた、追加レベルの調節を提供するよう設計でき、そ
の結果、ｍＲＮＡの破壊はリボザイムと標的遺伝子の両者が細胞に誘導された時
にのみ起こる。
【００９８】区別的に発現される遺伝子 遺伝子産物がヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドと相互作用する遺伝子
の同定方法をここに記載する。このような遺伝子は、ＣＮＳ疾患、心血管疾患、
骨粗鬆症、喘息、アレルギー、およびＣＯＰＤを包含する（但しこれらに限定さ
れない）疾患において区別して（区別的に）発現される遺伝子を表し得る。さら
に、係る遺伝子は、このような疾患の進行または治療に関連する操作に応答して
区別的に調節される遺伝子を表し得る。加えて、このような遺伝子は、組織また
は生物の発生の異なる段階で増大または低下する、一時的に調節される発現を示
すことができる。区別的に発現される遺伝子はまた、その発現を、対照対実験条
件の下で調節させることができる。さらに、ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペ
プチド遺伝子または遺伝子産物は、これ自体区別的発現について試験できる。
【００９９】 発現が正常対疾病状態で相違する程度は、標準的特性決定技術、例えば区別的
ディスプレイ技術によって視覚化されるに充分大きいというだけでよい。発現の
相違を視覚化することのできる、その他のこのような標準的特性決定技術は、定
量的ＲＴ（逆転写酵素）、ＰＣＲ、およびノーザン分析を包含するが、これらに
限定されない。
【０１００】 区別的に発現される遺伝子の同定 区別的に発現される遺伝子を同定するためには、目的とする組織から全ＲＮＡ
、または好ましくはｍＲＮＡを単離する。例えば、ＲＮＡ試料は、実験対象の組
織から、そして対照となる対象の対応組織から取得する。ｍＲＮＡの単離に対し
て不利に選択しない任意のＲＮＡ単離技術を、係るＲＮＡ試料の精製に利用でき
る。例えば、Ausubel et al., ed., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,
John Wiley & Sons, Inc. New York, 1987-1993を参照されたい。当業者に周知
の技術、例えばChomczynski、米国特許4843155の一段階ＲＮＡ単離プロセスを用
いて多数の組織試料を容易に処理することができる。
【０１０１】 区別的に発現される遺伝子が産生したＲＮＡを表す、集められたＲＮＡ試料内
部の転写物は、当業者に周知の方法により同定する。これらには、例えば、ディ
ファレンシャルスクリーニング（Tedder et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 8
5,208-12,1988）、差引きハイブリダイゼーション（Hedrick et al., Nature 30
8,149-53; Lee et al., Proc Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88,2825,1984）、および好
ましくはディファレンシャルディスプレイ（Liang & Pardee, Science 257,967-
71,1992; 米国特許5262311）が包含される。
【０１０２】 区別的発現の情報はこれ自体、ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドの関
与する疾病の治療のための関連法を示唆している。例えば、治療は、区別的に発
現される遺伝子および／またはヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコー
ドしている遺伝子の発現の調節を包含し得る。区別的発現の情報は、区別的に発
現される遺伝子もしくは遺伝子産物またはヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプ
チド遺伝子もしくは遺伝子産物の活性または発現が、アップレギュレーションで
あるかダウンレギュレーションであるかを示すことができる。
【０１０３】スクリーニング方法 本発明は、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドまたはＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣ
Ｒポリヌクレオチドに結合する、またはその活性を調節する、被験化合物をスク
リーニングするための検定を提供する。被験化合物は好ましくはＣｙｓＬＴ２様
ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する。より好ましくは、被
験化合物は、ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白を介して仲介される生物学的効果
を、被験化合物の不在時に比較して少なくとも約１０、好ましくは約５０、より
好ましくは約７５、９０、または１００％低下または増大させる。
【０１０４】被験化合物 被験化合物は当分野で既知の薬理学的物質であってよく、または薬理活性を持
っていることが前もって分かっていない化合物であってよい。この化合物は天然
に存在する、または実験室で設計されたものであってよい。これらは、微生物、
動物、または植物から単離されたものであってよく、そして組換え的に調製され
、または当分野で既知の化学的方法により合成されたものであってよい。所望に
より被験化合物は、生物学的ライブラリー、空間的アドレス特定可能な並行固相
または液相ライブラリー、デコンボルーションを要する合成ライブラリー法、「
一ビーズ一化合物」ライブラリー法、および親和クロマトグラフィー選択を用い
る合成ライブラリー法を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）当分野
で既知の数多くの組み合わせライブラリー法のいずれかを用いて取得できる。生
物学的ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されているが
、他の４種のアプローチはポリペプチド、非ペプチドオリゴマー、または化合物
の小分子ライブラリーに適用できる。Lam, Anticancer Drug Des. 12,145,1997
を参照されたい。
【０１０５】 分子ライブラリーの合成法は当分野でよく知られている（例えば、DeWitt et
al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 90,6909,1993; Erb et al., Proc.Natl.Acad.
Sci.U.S.A. 91,11422,1994; Zuckermann et al., J.Med.Chem. 37,2678,1994; C
ho et al., Science 261,1303,1993; Carell et al., Angew.Chem.Int.Ed.Engl.
33,2059,1994; Carell et al., Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 33,2061; Gallop et
al., J.Med.Chem. 37,1233,1994を参照されたい）。化合物のライブラリーは溶
液で（例えば、Houghten, Biotechniques 13,412-421,1992）、またはビーズ(La
m, Nature 354,82-84,1991)、チップ（Fodor, Nature 364,555-556,1993）、細
菌または胞子（Ladner、米国特許5223409）プラスミド（Cull et al., Proc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A. 89,1865-1869,1992）、またはファージ（Scott & Smith, Sc
ience 249,386-390, 1990; Devlin, Science 249,404-406,1990）;Cwirla et al
., Proc.Natl.Acad.Sci.97,6378-6382,1990; Felici, J.Mol.Biol. 222,301-310
,1991; およびLadner、米国特許5223409）上に提供できる。
【０１０６】ハイスループットスクリーニング 被験化合物は、高（ハイ）スループットスクリーニングを用いて、ＣｙｓＬＴ
２様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する能力、またはＣｙ
ｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白活性もしくはＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白遺伝子発現に
影響を及ぼす能力についてスクリーニングできる。ハイスループットスクリーニ
ングを使用して、多くの個別的化合物を並行して試験でき、その結果多数の被験
化合物を迅速にスクリーニングできる。最も広範に確立されている技術は９６ウ
ェル微量定量プレートを利用するものである。この微量定量プレートのウェルは
、典型的には５０ないし５００μlの範囲の検定容量を必要とする。このプレー
トに加えて、９６ウェルフォーマットに適合させた多くの機器、材料、ピペット
、ロボット、プレート洗浄機、およびプレート読み取り機が市販されている。
【０１０７】 別法として、「自由フォーマット検定」、または試料間に物理的障壁を持たな
い検定が使用できる。例えば、組み合わせペプチドライブラリーのための、単純
な均質検定で色素細胞（メラノサイト）を用いる検定が、Jayawickreme et al.,
Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 19,1614-18(1994)に記載されている。ペトリ皿中
のアガロースの下にこの細胞を入れ、次いで組み合わせ化合物を伴っているビー
ズをアガロースの表面に載せる。組み合わせ化合物はこのビーズから化合物を部
分的に放出する。化合物がゲルマトリックス中へと局所的に拡散するにつれて活
性化合物が細胞の色の変化を惹起するため、活性化合物を暗色色素領域として視
覚化することができる。
【０１０８】 自由フォーマット検定のもう一つの例は、生体分子スクリーニング学会第１回
年次総会（Philadelphia,Pa.、1995年11月7-10日）で報告されたChelsky、「組
み合わせライブラリーのスクリーニングのための戦略：新規な、そして伝統的な
アプローチ」により記載されている。Chelskyは、カルボニックアンヒドラーゼ
のための単純な均質酵素検定をアガロースゲルの内部に入れ、その結果ゲル中の
酵素がゲル全体に色の変化を惹起するようにさせた。その後、光リンカーを介し
て組み合わせ化合物を持つビーズをゲル内部に入れ、すると該化合物はＵＶ光に
より部分的に放出された。酵素を阻害する化合物は、色の変化がより少ない局所
阻害領域として観察された。
【０１０９】 さらに別の例がSalmon et al., Molecular Diversity 2,57-63(1996)に記載さ
れている。この例では、組み合わせライブラリーを、寒天中で生育する癌細胞へ
の細胞毒性効果を有する化合物についてスクリーニングした。
【０１１０】 もう一つのハイスループットスクリーニング法がBeutel et al.、米国特許597
6813に記載されている。この方法では、被験試料を多孔性マトリックスに入れる
。次に１またはそれ以上の検定成分を、マトリックス、例えばゲル、プラスチッ
クシート、フィルター、またはその他の形の容易に操作できる固体担体の内部、
上、または底に入れる。試料がこの多孔性マトリックスに導入されるとこれらは
充分ゆっくりと拡散し、その結果、被験試料が混ざらずに検定が遂行できる。
【０１１１】結合検定 結合検定については、被験化合物は好ましくは、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリ
ペプチドの活性部位に結合してこれを占有し、それにより基質がリガンド結合部
位に接近できなくさせ、その結果正常な生物活性が妨げられるような小分子であ
る。このような小分子の例は小ペプチドまたはペプチド様分子を包含するが、こ
れらに限定される訳ではない。本発明に係るポリペプチドに結合する可能性ある
リガンドは、既知のＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白の天然リガンドおよびその類似
体または誘導体を包含するが、これらに限定されない。ＧＰＣＲの天然リガンド
には、アドレノメデュリン、アミリン、カルシトニン遺伝子関連蛋白（ＣＧＲＰ
）、カルシトニン、アナンダミド、セロトニン、ヒスタミン、アドレナリン、ノ
ルアドレナリン、血小板活性化因子、トロンビン、Ｃ５ａ、ブラジキニン、およ
びケモカインがある。
【０１１２】 結合検定では、被験化合物またはＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドのいず
れかが検出可能な標識、例えば蛍光、放射性同位元素、化学ルミネセント、また
は酵素標識（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ま
たはルシフェラーゼ）を含むことができる。そこで、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポ
リペプチドに結合している被験化合物の検出は、例えば放射能の放出を直接計数
することにより、またはシンチレーション計数により、または検出可能産物への
適当な基質の変換を測定することにより、達成できる。
【０１１３】 別法として、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドへの被験化合物の結合を、
反応体のいずれをも標識せずに測定することができる。例えば、マイクロフィジ
オメーターを用いて、被験化合物とＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドとの結
合を検出できる。マイクロフィジオメーター（例えばサイトセンサー）とは、細
胞がその環境を酸性化する速度を光アドレッサブル電位差センサー（ＬＡＰＳ）
を用いて測定する分析機器である。この酸性化速度の変化は、被験化合物とＣｙ
ｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドの相互作用の指標として使用できる（McConnel
l et al., Science 257,1906-1912,1992）。
【０１１４】 被験化合物がＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドに結合する能力の測定はま
た、実時間Bimolecular Interaction Analysis（ＢＩＡ）のような技術を用いて
達成できる（Sjolander & Urbaniczky, Anal.Chem. 63,2338-2345,1991、および
Szabo et al., Curr.Opin.Struct.Biol. 5,699-705,1995）。ＢＩＡは、いかな
る反応体をも標識せずに、生体特異的相互作用を実時間で研究するための技術で
ある（例えばBIAcore(登録商標)）。光学的現象表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
の変化を、生体分子間の実時間反応の指標に使用できる。
【０１１５】 本発明のさらに別の態様では、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドを二ハイ
ブリッド検定または三ハイブリッド検定（例えば、米国特許5283317; Zervos et
al., Cell 72,223-232,1993; Madura et al., J.Biol.Chem. 268,12046-12054,
1993; Bartel et al., Biotechniques 14,920-924,1993; Iwabuchi et al., Onc
ogene 8,1693-1696,1993; およびBrent WO94/10300）における「おとり蛋白」と
して使用し、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドに結合またはこれと相互作用
してその活性を調節する他の蛋白を同定することができる。
【０１１６】 二ハイブリッド系は殆どの転写因子のモジュール的性格に基づくものであり、
それは、分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインから成っている。簡潔に述
べると、この検定は二種の異なるＤＮＡ組み立て物を利用する。例えば、一方の
組み立て物においては、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている
ポリヌクレオチドが、既知の転写因子のＤＮＡ結合ドメインをコードしているポ
リヌクレオチドに融合できる（例えばＧＡＬ−４）。別の組み立て物においては
、未同定蛋白（「餌」または「試料」）をコードしているＤＮＡ配列が、既知の
転写因子の活性化ドメインをコードしているポリヌクレオチドに融合できる。も
し「おとり」および「餌」蛋白がインビボで相互作用して蛋白依存複合体を形成
できたならば、該転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインは極めて近位に招
来される。この近位性が、転写因子に応答する転写調節部位と機能的に結合して
いるリポーター遺伝子（例えばＬａｃＺ）の転写を可能にする。リポーター遺伝
子の発現が検出でき、機能的転写因子を含む細胞コロニーを単離し、ＣｙｓＬＴ
２様ＧＰＣＲポリペプチドと相互作用する蛋白をコードしているＤＮＡ配列取得
に使用することができる。
【０１１７】 反応体の一方または両方の非結合型からの結合型の分離を促進するため、そし
て検定の自動化の便宜を図るため、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチド（また
はポリヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固定化することが望ましい
かも知れない。したがって、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリ
ヌクレオチド）または被験化合物のいずれかを固体支持体に結合させることがで
きる。好適な固体支持体は、ガラスまたはプラスチックスライド、組織培養プレ
ート、微量定量ウェル、管、シリコンチップ、またはビーズ（ラテックス、ポリ
スチレン、またはガラスビーズを包含するがこれらに限定されない）のような粒
子を包含するがこれらに限定されない。共有および非共有結合、受動吸収、また
はそれぞれポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物に付着さ
せた結合部分と固体支持体の対、の使用を包含する、当分野で既知の任意の方法
を用いてＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）また
は被験化合物を固体支持体に付着させることができる。被験化合物は好ましくは
整列して固体支持体に結合させ、その結果個々の被験化合物の位置を追跡するこ
とができる。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）
への被験化合物の結合は、反応体を入れるのに適した任意の容器で達成できる。
係る容器の例には微量定量プレート、試験管、および微量遠沈管がある。
【０１１８】 一つの態様において、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドは、ＣｙｓＬＴ２
様ＧＰＣＲポリペプチドを固体支持体に結合させるドメインを含む融合蛋白であ
る。例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合蛋白をグルタチオンセ
ファロースビーズ（Sigma Chemical, St.Louis, Mo.）上またはグルタチオン誘
導体化微量定量プレート上に吸着させ、次いでこれを被験化合物または被験化合
物および非吸着ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドに合し；次にこの混合物を
複合体形成が行われる条件下でインキュベートする（例えば、塩およびpHに関し
て生理的条件）。インキュベーションの後、ビーズまたは微量定量プレートのウ
ェルを洗浄して未結合成分を除去する。反応体の結合は上記のように直接的また
は間接的に測定できる。別法として、複合体を固体支持体から解離させた後に結
合を測定することもできる。
【０１１９】 本発明に係るスクリーニング検定には、蛋白またはポリヌクレオチドを固体支
持体上に固定化するためのその他の技術を使用することもできる。例えば、Ｃｙ
ｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物
のいずれかを、ビオチンとストレプトアビジンのコンジュゲーションを利用して
固定化できる。当分野で周知の技術（例えばビオチニル化キット、Pierce Chemi
cals, Rockford,Ill.）を用いて、ビオチニル化したＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポ
リペプチド（またはポリヌクレオチド）または被験化合物をビオチン−ＮＨＳ（
Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド）から調製し、ストレプトアビジン被覆した９６
ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定化できる。別法として、Ｃ
ｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチド、ポリヌクレオチド、または被験化合物に特
異的に結合するが、所望の結合部位、例えばＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチ
ドの活性部位に干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化することができる
。未結合の標的または蛋白が抗体コンジュゲーションによりウェル中に捕捉でき
る。
【０１２０】 ＧＳＴ−固定化複合体について上に記載した方法に加え、このような複合体を
検出する方法には、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドまたは被験化合物に特
異結合する抗体を用いる、複合体の免疫検出、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプ
チドの活性検出へと引き継がれる酵素結合検定、および非還元条件下でのＳＤＳ
ゲル電気泳動がある。
【０１２１】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドに結合する被験
化合物を求めるスクリーニングは、無傷の細胞で実施することもできる。Ｃｙｓ
ＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含む任意の細胞が、細
胞に基づく検定系で使用できる。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは細
胞中に天然に存在し、または上記のような技術を用いて導入できる。ＣｙｓＬＴ
２様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合は
、上記のように測定する。
【０１２２】機能検定 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドの生物学的効果を増大または低下させる
能力について被験化合物を試験できる。係る生物学的効果は、下記の具体的実施
例に記載の機能検定を用いて測定できる。機能検定は、精製したＣｙｓＬＴ２様
ＧＰＣＲポリペプチド、細胞膜調製物、または無傷の細胞を被験化合物と接触さ
せた後に実施できる。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白の機能的活性を少なくとも約
１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下さ
せる被験化合物を、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白活性を低下させる可能性ある物
質として同定する。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白の活性を少なくとも約１０、好
ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％増大させる被験
化合物を、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白活性を増大させる可能性ある物質として
同定する。
【０１２３】 このようなスクリーニング方法の１つは、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチ
ドを発現するようトランスフェクトしたメラニン保有細胞の使用を含む。係るス
クリーニング技術は１９９２年２月６日公開のWO92/01810に記載されている。し
たがって、例えばこのような検定を使用して、該レセプターを含むメラニン保有
細胞を、レセプターリガンドと、スクリーニングされる被験化合物の両者に接触
させることにより、レセプターポリペプチドの活性化を阻害する化合物を求める
スクリーニングができる。リガンドが生成するシグナルの阻害は、被験化合物が
そのレセプターについての可能性あるアンタゴニストであること、即ち該レセプ
ターの活性化を阻害することを示す。このスクリーニングは、係る細胞をスクリ
ーニングすべき化合物と接触させることにより、レセプターを活性化する被験化
合物を同定するために、そして各被験化合物がシグナルを生成するかどうか、即
ちレセプターを活性化するかどうかを決定するために使用できる。
【０１２４】 その他のスクリーニング技術は、レセプター活性化により惹起される細胞外pH
変化を測定する系においてヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドを発現する
細胞（例えば、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞）を使用することを包含する
（例えばScience 246,181-296,1989を参照されたい）。例えば、被験化合物をヒ
トＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドを発現する細胞に接触させ、二次メッセ
ンジャー反応、例えばシグナル伝達またはpH変化を測定して、被験化合物が該レ
セプターを活性化するか阻害するかを決定できる。
【０１２５】 別のこのようなスクリーニング技術は、ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプ
チドをコードしているＲＮＡをXenopus卵母細胞内に導入し、該レセプターを一
過性発現させることを含む。次いでトランスフェクトさせた卵母細胞をレセプタ
ーリガンドおよびスクリーニングすべき被験化合物に接触させ、その後、該レセ
プターの活性化を阻害すると思われる被験化合物についてスクリーニングする場
合は、カルシウムシグナルの活性化または阻害の検出を行う。
【０１２６】 別のスクリーニング技術は、レセプターがホスホリパーゼＣまたはＤに結合し
ている細胞でヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドを発現させることを含む
。このような細胞には、内皮細胞、平滑筋細胞、胚性腎細胞などがある。スクリ
ーニングは上記のように、ホスホリパーゼ活性の変化から該レセプターの活性化
程度を定量することにより達成できる。
【０１２７】 上に記載のような機能検定の詳細は、下記の具体的実施例に提供する。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ遺伝子発現 別の態様では、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白遺伝子の発現を増大または減少さ
せる被験化合物を同定する。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを被験化
合物と接触させ、ＲＮＡまたはＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドのポリ
ペプチド産物の発現を測定する。被験化合物存在下での適当なｍＲＮＡまたはポ
リペプチドの発現レベルを、該被験化合物不在下でのｍＲＮＡまたはポリペプチ
ドの発現レベルと比較する。すると被験化合物が、この比較に基づく発現のモジ
ュレーターとして同定できる。例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、
被験化合物の不在時よりも存在時により大きい場合は、この被験化合物を、該ｍ
ＲＮＡまたはポリペプチド発現の刺激物質または増強物質と同定する。そうでは
なく、ｍＲＮＡまたはポリペプチドの発現が、被験化合物の不在時よりも存在時
により小さい場合は、この被験化合物を、該ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の
インヒビターと同定する。
【０１２８】 細胞におけるＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白ｍＲＮＡまたはポリペプチド発現の
レベルは、ｍＲＮＡまたはポリペプチドを検出するための当分野で周知の方法に
より決定できる。定性または定量的方法のいずれかが使用できる。ＣｙｓＬＴ２
様ＧＰＣＲポリヌクレオチドのポリペプチド産物の存在は、例えばラジオイムノ
アッセイのような免疫化学的方法、ウエスタンブロッティング、および免疫組織
化学を包含する、当分野で周知の様々な技術を用いて決定できる。別法として、
ポリペプチド合成は、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチド内への標識アミノ酸
の取り込みを検出することにより、インビボで、細胞培養で、またはインビトロ
翻訳系で決定できる。
【０１２９】 このようなスクリーニングは、無細胞検定系または無傷の細胞のいずれかで実
施できる。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドを発現するいかなる細胞も
細胞に基づく検定系で使用できる。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチドは
細胞内に天然に存在するか、または上記のような技術を用いて導入することがで
きる。一次培養または確立されたセルライン、例えばＣＨＯまたはヒト胚性腎２
９３細胞のいずれかを使用できる。
【０１３０】医薬組成物 本発明はさらに、治療効果を達成するために患者に投与できる医薬組成物を提
供する。本発明に係る医薬組成物は、例えばＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチ
ド、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリヌクレオチド、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペ
プチドに特異的に結合する抗体、または類似体、アゴニスト、アンタゴニスト、
またはＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチド活性のインヒビターを含み得る。こ
の組成物は単独で、または少なくとも１種類の他の物質、例えば安定化化合物と
組み合わせて投与でき、これは、食塩水、緩衝化食塩水、デキストロース、およ
び水を包含する（但しこれらに限定されない）任意の無菌で生物学的適合性のあ
る製薬的担体中で投与できる。この組成物は単独で、または他の物質、薬物また
はホルモンと組み合わせて患者に投与できる。
【０１３１】 活性成分に加えてこれらの医薬組成物は、賦形剤および補助物質を含む適当な
製薬的に許容し得る担体を含有でき、これらは、製薬的に使用できる調製物への
活性化合物の処理を促進する。本発明に係る医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉
内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、非経口、局
所、舌下、または直腸手段を包含する（但しこれらに限定されない）多くの経路
により投与できる。経口投与用医薬組成物は、当分野で既知の製薬的に許容し得
る担体を用いて経口投与に適した用量に調合できる。このような担体により、該
医薬組成物を、患者が内服するための錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル剤、液体、
ゲル、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤などに調合できる。
【０１３２】 経口使用のための医薬製剤は、活性化合物を、固体賦形剤と合し、得られた混
合物を所望により粉砕し、そしてこの顆粒混合物を、所望ならば適当な補助物質
を加えた後に処理して錠剤または糖衣剤核を得る。好適な賦形剤は炭水化物また
は蛋白増量剤、例えば乳糖、シュクロース、マンニトール、またはソルビトール
を包含する糖；トウモロコシ、小麦、米、馬鈴薯、またはその他の植物由来の澱
粉；セルロース、例えばメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロー
ス、またはカルボキシメチルセルロースナトリウム；アラビアゴムおよびトラガ
カントゴムを包含するゴム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンのような蛋白で
ある。所望により崩壊剤または可溶化剤、例えば架橋ポリビニルピロリドン、寒
天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムを添加できる。
【０１３３】 糖衣剤核は、濃縮糖溶液のような適当な被覆剤と共に使用でき、これはさらに
、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、carbopolゲル、ポリエチレン
グリコール、および／または二酸化チタン、ラッカー溶液、および適当な有機溶
媒または溶媒混合物を含むことができる。製品の同定のためまたは活性化合物の
量、即ち用量をあらわすために染料または色素を錠剤または糖衣被覆剤に添加で
きる。
【０１３４】 経口的に使用できる医薬調合物は、ゼラチン製の押してはめ込むカプセル剤、
ならびに、ゼラチンおよび被覆剤、例えばグリセロールまたはソルビトールでで
きた軟封入カプセル剤を包含する。押してはめ込むカプセル剤は、活性成分を、
乳糖または澱粉のような増量剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネ
シウムのような潤滑剤、および所望により安定剤と混合して含有できる。軟カプ
セル剤では、活性化合物を、安定剤を加えたまたは加えない適当な液体、例えば
脂肪油、液体、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁できる。
【０１３５】 非経口投与に好適な医薬製剤は、水溶液、好ましくは生理学的適合性の緩衝液
、例えばハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的に緩衝化した食塩水中で
調合できる。水性注射用懸濁剤は、該懸濁液の粘度を増加させる物質、例えばカ
ルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含
有できる。さらに、活性化合物の懸濁剤は適当な油性注射用懸濁剤として調製で
きる。好適な親油性溶媒または媒質は、胡麻油のような脂肪油、またはオレイン
酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソーム
を包含する。非脂質ポリカチオンアミノポリマーもまたデリバリーに使用できる
。所望により懸濁剤は、化合物の溶解性を増し高濃縮溶液の調製を可能にするよ
うな適当な安定剤または物質を含むことができる。局所または鼻腔投与のために
は、透過すべき特定の障壁に対し適当な浸透剤を製剤に使用する。このような浸
透剤は当分野で一般に知られている。
【０１３６】 本発明に係る医薬組成物は当分野で既知の方法で、例えば常套的混合、溶解、
顆粒化、糖衣剤製造、すりつぶし、乳化、カプセル化、捕捉、または凍結乾燥プ
ロセスによって製造できる。この医薬組成物は塩として提供でき、塩酸、硫酸、
酢酸、乳酸、クエン酸、リンゴ酸、琥珀酸などを包含する（但しこれらに限定さ
れない）多くの酸を用いて調製できる。塩は、水性または他のプロトン性溶媒に
おいて、対応する遊離塩基型よりもより可溶性の傾向がある。別の場合には、好
ましい調製物は、pH範囲４.５ないし５.５において以下のもの：１−５０mMヒス
チジン、０.１％−２％シュクロース、および２−７％マンニトール、の全てま
たは任意のものを含有できる凍結乾燥粉末であってよく、これを使用前に緩衝液
と合する。
【０１３７】 調合と投与のための技術のさらなる詳細は、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCI
ENCES（Maack Publishing Co., Easton, Pa）の最新版に見出すことができる。
医薬組成物を製造した後、これらを適当な容器に入れ、適応状態の治療のために
ラベルを貼る。このようなラベル表示は、投与の量、頻度、および投与方法を包
含する。
【０１３８】治療上の適応および方法 ＧＰＣＲは哺乳動物宿主に遍在し、多くの病理を包含するたくさんの生体機能
を担っている。したがって、一方ではＧＰＣＲを刺激し、他方ではＧＰＣＲの機
能を阻害する化合物および薬物を発見することが望ましい。例えば、ＧＰＣＲを
活性化する化合物は、喘息、パーキンソン病、急性心不全、尿停留、および骨粗
鬆症の治療といったような治療目的に使用できる。特に、ＧＰＣＲを活性化する
化合物は例えば肺血流の欠如または高血圧により惹起される様々な心血管疾患の
治療に有用である。加えて、これらの化合物は体液および電解質のホメオスタシ
スの調節異常に関連する様々な生理的異常の治療に、そして異常なアンギオテン
シンにより誘発されるアルドステロン分泌に伴う疾病にも使用できる。
【０１３９】 一般に、ＧＰＣＲの活性化を阻害する化合物は、様々な治療目的、例えば低血
圧症および／または高血圧症、狭心症、心筋梗塞、潰瘍、喘息、アレルギー、良
性前立腺肥大、ならびに、統合失調症、躁病性興奮、鬱病、せん妄、痴呆または
重篤な精神遅滞、ジスキネジア、中でも例えばハンチントン病またはトゥレット
症候群を包含する精神病的および神経学的異常の治療に使用できる。ＧＰＣＲを
阻害する化合物はさらに、内因性食欲不振の逆転および過食症の制御に有用であ
る。
【０１４０】 とりわけＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドを調節して、ＣＮＳ疾患、心血
管疾患、骨粗鬆症、喘息、アレルギー、およびＣＯＰＤを治療することができる
。
【０１４１】 神経系の疾患： ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲを調節して神経系の疾患を治療でき
る。治療できる神経系の疾患は、脳損傷、脳血管疾患およびその結果、パーキン
ソン病、皮質基底部変性、運動神経疾患、ＡＬＳを包含する痴呆、多発性硬化症
、外傷性脳損傷、卒中、卒中後、外傷後脳損傷、および小血管脳血管疾患を包含
する。痴呆、例えばアルツハイマー病、血管性痴呆、レーヴィ体を伴う痴呆、前
頭側頭痴呆および第17染色体に連鎖したパーキンソン病、ピック病を包含する前
頭側頭痴呆、進行性核麻痺、基質基底部変性、ハンチントン病、視床変性、クロ
イツフェルト−ヤコブ痴呆、ＨＩＶ痴呆、痴呆を伴う統合失調症、ならびにコル
サコフ精神病もまた治療できる。同様に、認知関連疾患、例えば軽度の認知障害
、加齢に伴う記憶障害、加齢に関連する認知低下、血管性認知障害、注意欠陥障
害、注意欠陥多動性障害、学習障害を伴う小児の記憶障害をＣｙｓＬＴ２様ＧＰ
ＣＲの活性を調節することにより治療することが可能である。
【０１４２】 神経系疾患に付随する疼痛もまた、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの活性を調節する
ことにより治療できる。治療できる疼痛は、多発性硬化症、脊髄損傷、坐骨神経
痛、背部手術失敗症候群、外傷性脳損傷、てんかん、パーキンソン病、卒中後、
ならびに脳および脊髄の血管病変（例えば、梗塞、出血、血管奇形）といった中
枢神経系疾患に随伴する疼痛を包含する。非中枢性神経障害性疼痛には、乳房切
除後疼痛、反射性交感神経性ジストロフィー（ＲＳＤ）、三叉神経痛、radiocul
opathy、手術後疼痛、ＨＩＶ／ＡＩＤＳ関連疼痛、癌の疼痛、代謝性神経障害（
例えば糖尿病性神経障害）、脈管炎神経障害（例えば、結合組織疾患に続発性の
）、腫瘍随伴性多発神経障害（例えば肺の癌腫、または白血病、またはリンパ腫
、または前立腺、大腸もしくは胃の癌腫に随伴）、ならびにヘルペス後神経痛お
よび慢性炎症性疼痛がある。癌および癌治療に随伴する疼痛もまた治療可能であ
り、頭痛（例えば、アウラを伴う片頭痛、アウラを伴わない片頭痛、およびその
他の片頭痛疾患）、エピソード的および慢性緊張性頭痛、緊張性様頭痛、群発頭
痛、および慢性発作性片頭痛もまた治療できる。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの調節
により、さらに、内臓痛、例えば膵炎、腸管性膀胱炎、月経困難症、過敏性腸症
候群、クローン病、胆石疝痛、尿管疝痛、心筋梗塞および骨盤腔の疼痛症候群、
例えばヴァルボディニア、精巣痛、尿道神経症およびprotatodyniaを治療するこ
とができる。
【０１４３】 心血管疾患： 心血管疾患は以下のような心臓および血管系の疾患を包含する
：鬱血性心不全、心筋梗塞、虚血性心疾患、あらゆる種類の心房性および心室性
不整脈、高血圧性血管疾患、および末梢血管疾患。
【０１４４】 心不全とは、心機能の異常が、代謝している組織の要求に相応じた速度で心臓
が血液を送り出せないことに起因する、病態生理学的状態として定義される。こ
れは、基礎原因に関わりなく、例えば高拍出量および低拍出量、急性および慢性
、右側および左側、収縮期および拡張期といったような全ての型のポンプ不全を
包含する。
【０１４５】 心筋梗塞（ＭＩ）は一般に、冠血流の突然の低下と、これに続き既に動脈硬化
によって狭隘化していた冠動脈が血栓により閉塞することにより惹起される。Ｍ
Ｉ予防（一次および二次的防止）、ならびにＭＩの急性期治療および合併症の防
止が包含される。
【０１４６】 虚血性疾患は、冠血流が制限され、その結果、心筋の酸素要求を満たすに充分
でない灌流となる状態である。この群の疾患には、安定アンギナ、不安定アンギ
ナ、および無症候性虚血がある。
【０１４７】 不整脈とは全ての形の心房性および心室性頻脈（心房性頻脈、心房性粗動、心
房性細動、心房−心室リエントリー頻脈、早期興奮症候群、心室性頻脈、心室性
粗動、および心室性細動）、および徐脈型の不整脈を包含する。
【０１４８】 血管疾患は、原発性および全ての種の二次性動脈性高血圧症（腎性、内分泌性
、神経性、その他）を包含する。ここに開示する遺伝子およびその産物は、高血
圧症の治療および全合併症の防止のための薬物標的として使用できる。末梢血管
疾患とは、動脈および／または静脈血流が減少し、その結果、血液供給と組織の
酸素要求の間に不均衡が生じている血管疾患として定義する。これには、慢性末
梢動脈閉塞疾患（ＰＡＯＤ）、急性動脈血栓症および塞栓症、炎症性血管疾患、
レイノー現象、および静脈疾患が包含される。
【０１４９】 骨粗鬆症： 骨粗鬆症とは、低い骨量と骨組織の微構築的悪化を特徴とし、こ
れが骨の脆弱性の増大と、結果としての骨折リスクの増大を導く疾患である。こ
れは人間の最も一般的な代謝性骨疾患である。確立した骨粗鬆症は骨折の存在を
包含する。骨のターンオーバーは、骨内の二つの主たるエフェクター細胞型の作
用によって起こる：骨再吸収を担う破骨細胞と、骨マトリックスを合成および鉱
化する骨芽細胞である。破骨細胞および骨芽細胞の作用は高度に協調している。
破骨細胞の前駆体はターンオーバーの部位に動員され、これらは分化し融合して
成熟破骨細胞を形成し、次いで骨を再吸収する。骨表面に付着すると破骨細胞は
、特化した破骨細胞境界膜と骨マトリックスとの間の厳密に定められた接合点に
酸性の微小環境を作り出し、そのようにして骨マトリックスの限局的可溶化を可
能にする。次いでこれが脱塩された骨コラーゲンの蛋白分解を促進する。マトリ
ックス分解はマトリックス関連成長因子およびサイトカインを放出すると考えら
れており、これが一時的且つ空間的に調節されたやり方で骨芽細胞を動員する。
骨芽細胞は新たな骨マトリックス蛋白を合成および分泌し、その後この新しいマ
トリックスを鉱化する。正常な骨格では、これは正味の骨量変化をもたらさない
生理的プロセスである。病的状態、例えば骨粗鬆症では、再吸収と形成の均衡が
、骨喪失が起こるように変化する。WO99/45923を参照されたい。
【０１５０】 破骨細胞自身が、恐らくは弗化物という例外を除いて、現在利用可能な全ての
骨粗鬆症薬物の直接的または間接的標的である。抗再吸収療法は、治療した個体
におけるさらなる骨喪失を防止する。骨芽細胞は骨髄に存在する多能性幹細胞か
ら誘導され、脂肪細胞、軟骨細胞、線維芽細胞および筋細胞からも生ずる。骨芽
細胞活性の選択的増強は、これがさらなる骨喪失の防止ではなく骨量の増大を導
くことから、骨粗鬆症治療の極めて望ましい到達点である。現在利用可能な治療
よりも著しく大きな骨折リスクの減少を導く有効な同化療法が期待される。
【０１５１】 この新たに発見されたポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニスト
は、破骨細胞の分化、破骨細胞の骨マトリックスへの付着、または破骨細胞が骨
マトリックスを分解する機能を直接変化させることにより、抗再吸収物質として
作用し得る。このアゴニストまたはアンタゴニストは、破骨細胞の分化または機
能のエフェクター分子、例えばサイトカイン、ペプチドもしくはステロイドホル
モン、プロテアーゼなどの合成および／または修飾を妨害することにより、破骨
細胞の機能を間接的に変える。
【０１５２】 この新たに発見されたポリペプチドに対するアゴニストまたはアンタゴニスト
は、骨芽細胞の分化および／またはその骨マトリックス形成機能を直接増強する
ことにより、同化物質として作用し得る。このアゴニストまたはアンタゴニスト
はさらに、成長因子、ペプチドまたはステロイドホルモンの合成を増強すること
により、または阻害分子の合成を低下させることにより、破骨細胞の機能を間接
的に変化させることができる。
【０１５３】 このアゴニストおよびアンタゴニストは、骨粗鬆症、パジェット病、骨インプ
ラント、特に歯科インプラントの分解の治療に有用となり得る新たに発見された
ポリペプチドの作用を擬似、増大または阻害するために使用できる。
【０１５４】 喘息およびアレルギー： アレルギーは、環境にある抗原が臨床上有害な反応
を引き起こす複雑なプロセスである。アレルゲンと呼ばれるこの誘発抗原は、典
型的には特異的ＩｇＥ反応を引き起こし、大抵の場合アレルゲン自体は殆どまた
は全く固有毒性を持たないけれども、これらはＩｇＥ反応がＩｇＥ依存性または
Ｔ細胞依存性過敏性反応を引き起こす時、病態を誘発する。過敏性反応は局所的
または全身的となり得、典型的には、かつて或るアレルゲンに感作されたことの
ある個体がアレルゲンに暴露されると数分以内に起こる。アレルゲンが、肥満細
胞、好塩基球または好酸球といったエフェクター細胞の表面にある特異的レセプ
ターに結合したＩｇＥ抗体に認識され、それが該エフェクター細胞の活性化と、
反応の急性徴候および症状を引き起こす仲介物質の放出を惹起すると、アレルギ
ーの過敏性反応が発現する。アレルギー性疾患には、喘息、アレルギー性鼻炎（
枯草熱）、アトピー性皮膚炎、およびアナフィラキシーがある。
【０１５５】 喘息は複数の遺伝的因子と環境的因子の間の相互作用の結果生ずると考えられ
、３つの主たる特徴：１）気管支収縮、粘液産生増加、および気道狭窄を導く気
道壁の肥厚により惹起される間欠的且つ可逆的な気道閉塞、２）気道口径の調節
低下により惹起される気道の過度反応性、および３）気道の炎症、がある。或る
種の細胞が喘息の炎症反応に対し重要であり、それらはＴ細胞および抗原提示細
胞、ＩｇＥを産生するＢ細胞、および肥満細胞、好塩基球、好酸球、およびＩｇ
Ｅに結合するその他の細胞を包含する。これらのエフェクター細胞は気道のアレ
ルギー反応の部位に蓄積し、急性病態、そしてついには該疾患に関連する組織破
壊に寄与する毒性産物を放出する。その他の常在細胞、例えば平滑筋細胞、肺上
皮細胞、粘液産生細胞、および神経細胞もまた、喘息を持つ個体では異常である
ことがあり、それらがこの病理に寄与し得る。臨床的には間欠的ぜん鳴と息切れ
として現れる喘息の気道閉塞が、一般に即時治療を要するこの疾病の最も緊急的
症状であるが、この疾病に随伴する炎症と組織破壊は不可逆的変化を導き、つい
には喘息を、長期管理の必要な慢性の障害疾患とする。
【０１５６】 喘息の病態生理学に関する理解において近年重要な進歩があったとは言え、こ
の疾患は流行と重篤度を増しているように思われる（Gergen and Weiss, Am.Rev
.Respir.Dis. 146,823-24,1992）。人口の３０−４０％がアトピー性アレルギー
に罹患し、小児の１５％および成人の５％が喘息に罹患している（Gergen and W
eiss, 1992）。したがって我々の保健財源に膨大な負荷が課せられている。しか
しながら、喘息の診断と治療は共に困難である。肺組織炎症の重篤度は測定が容
易ではなく、この疾病の症状は、呼吸器感染、慢性呼吸器炎症性疾患、アレルギ
ー性鼻炎、またはその他の呼吸器疾患としばしば識別不能である。原因となって
いるアレルゲンがしばしば判定できず、原因環境物質の除去を困難にしている。
現行の薬理学的治療はそれら自身の不利益を被っている。β−アゴニストのよう
な一般に用いられる治療薬は、肺機能を一時的に改善する症状軽減剤として作用
するが、基礎となっている炎症に作用することはない。抗炎症ステロイドのよう
な、基礎となっている炎症を低下させ得る物質は、免疫抑制から骨喪失にまで及
ぶ重大な欠点を有し得る（Goodman and Gilman's THE PHARMACOLOGIC BASIS OF
THERAPEUTICS, 第7版、MacMillan Publishing Company, NY, USA, 1985）。さら
に、コルチコステロイド吸入のような現在の治療の多くは、短時間持続性であり
、使用に不便であり、しばしば定期的に、幾つかの場合には生涯使用せねばなら
ず、患者がこの治療を遵守できないことが大きな問題となり、それにより治療と
しての有効性が低下している。
【０１５７】 常套的療法に伴う問題の故に、代替治療戦略が評価されている。グリコホリン
Ａ（Chu and Sharom, Cell.Immunol. 145,223-39,1992）、シクロスポリン（Alex
ander et al., Lancet 339,324-28,1992）、およびＩＬ−２のノナペプチド断片
（Zav'yalov et al., Immunol.Lett. 31,285-88,1992）は全てインターロイキン
−２依存性Ｔリンパ球増殖を阻害する。ところがこれらは他の多くの効果を有す
ることが分かっている。例えば、シクロスポリンは臓器移植後の免疫抑制に使用
する。これらの物質は、喘息治療でステロイドの代替薬となり得る一方で、イン
ターロイキン−２依存性Ｔリンパ球増殖を阻害し、ホメオスタシスに関連する重
要な免疫機能を阻害する可能性がある。気管支収縮の仲介物質の放出または活性
を遮断するその他の治療、例えばクロモンまたは抗ロイコトリエンが近年軽度喘
息の治療に導入されているが、これらは高価で全ての患者に有効という訳ではな
く、またこれらが喘息の炎症に伴う慢性変化に何らかの効果を有するかどうかは
不明である。当分野で必要とされるのは、喘息の発現にとって重要な経路で作用
することができ、該疾患のエピソード的発作を遮断して、患者を免疫無防備状態
とすることなく専ら活動過多なアレルギー免疫反応を低下させ得る治療の同定で
ある。
【０１５８】 気道平滑筋の収縮と炎症細胞の化学的誘引に関与する仲介物質の多くは、ＧＰ
ＣＲ結合を介してそれらの効果を発揮する。平滑筋収縮の仲介物質には、ロイコ
トリエン、血小板活性化因子、エンドセリン−１、アデノシン、およびトロンボ
キサンＡ２がある。これら仲介物質の幾つかによるＧＰＣＲの活性化を遮断する
レセプターアンタゴニストが喘息の治療薬として成功裏に使用されてきた。炎症
細胞の化学的誘引物質には、ケモカイン、例えばエオタキシン、ＭＣＰ−４、RA
NTES、およびＩＬ−８がある。同様にケモカインレセプターアンタゴニストが喘
息の治療薬として開発されている。Sarau et al., Mol.Pharmacol. 56,657-63,1
999; Kitaura et al., J.Biol.Chem. 271,7725-30,1996; Ligget et al., Am.J.
Respir.Crit.Care Med. 152,394-402,1995; Panettieri et al., J.Immunol. 15
4,2358-65,1995; Noveral et al., Am.J.Physiol. 263,L317-24,1992; Honda et
al., Nature 349,342-46,1991。
【０１５９】 幾つかのＧＰＣＲの活性化は逆に喘息において有益な効果を持っている。例え
ば、β１−およびβ２−アドレナリン作動性ＧＰＣＲを活性化するレセプターア
ゴニストは、喘息発作の治療の際、収縮した気道平滑筋を弛緩させるために治療
的に使用される。このように、正または負のやり方でのＧＰＣＲの調節が、喘息
治療において重要な役割を果たし得る。
【０１６０】 ＣＯＰＤ： 慢性閉塞性肺（または気道）疾患（ＣＯＰＤ）は、生理学的には
、慢性気管支炎に起因する末梢気道の閉塞と気腫の混在から一般的に引き起こさ
れる気流の閉塞と定義される状態である（Senior & Shapiro, Pulmonary Diseas
es and Disorders, 第3版、New York, McGraw-Hill, 1998,pp.659-681,1998; Ba
rnes, Chest 117,10S-14S,2000）。気腫は、肺の気腔の異常拡大を招く肺胞壁の
破壊を特徴とする。慢性気管支炎とは、臨床的には、連続２年間でそれぞれ年に
３ヶ月間の慢性湿性咳嗽の存在と定義する。ＣＯＰＤでは気流の閉塞は通常進行
性であり、部分的に可逆的であるに過ぎない。非喫煙者にもＣＯＰＤは起こるも
のの、この疾病の発現にとってずば抜けて最重要な危険因子は喫煙である。
【０１６１】 気道の慢性炎症がＣＯＰＤの重要な病理学的特徴である（Senior & Shapiro,
1998）。炎症細胞集団は、増大した数のマクロファージ、好中球、およびＣＤ８＋ リンパ球を含んでいる。吸入された刺激物質、例えば煙草の煙が気道および上
皮細胞に存在するマクロファージを活性化しケモカイン（例えばインターロイキ
ン−８）およびその他の走化性因子の放出を導く。これらの走化性因子が血液か
ら肺組織および気道への好中球／単球の輸送を増加させるよう働く。気道へと動
員された好中球と単球は蛋白分解酵素および活性酸素種といった様々な有害であ
る可能性のある仲介物質を放出し得る。マトリックス分解および気腫、ならびに
気道壁肥厚、界面活性物質の機能不全、および粘液分泌過多、これら全てが気流
と気体交換の減損を導くこの炎症反応の、可能性ある続発症である。
【０１６２】 本発明はさらに、上記のスクリーニング検定により同定する新規物質の使用に
関するものである。したがって、本明細書に記載のように定義する被験化合物を
適当な動物モデルに使用することが、本発明の範囲内にある。例えば、本明細書
記載のように特定する物質（例えば、調節物質、アンチセンス核酸分子、特異抗
体、リボザイム、またはＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチド結合分子）を動物
モデルに使用して、係る物質による治療の有効性、毒性、または副作用を決定す
ることができる。これとは別に、本明細書に記載のように定義する物質は、係る
物質の作用機構を決定するための動物モデルに使用できる。さらに、本発明は、
本明細書記載の治療のための上記スクリーニング検定により同定する新規物質の
用途・使用に関するものである。
【０１６３】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白活性に影響を及ぼす試薬をインビトロまたはイン
ビボでヒト細胞に投与し、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白活性を低下させることが
できる。この試薬は好ましくはヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白遺伝子の発現産
物に結合する。発現産物が蛋白である場合、この試薬は好ましくは抗体である。
ヒト細胞をex vivoで治療するために、身体から取り出した幹細胞の調製物に抗
体を添加できる。次いでこの細胞を、当分野で既知のクローン増幅を行ってまた
は行わずに、同じまたは別の人の身体に戻すことができる。
【０１６４】 一つの態様では、この試薬はリポソームを用いてデリバリーする。好ましくは
リポソームは、投与される動物中で少なくとも約３０分間、より好ましくは少な
くとも約１時間、さらに好ましくは少なくとも約２４時間安定である。リポソー
ムは、試薬、とりわけポリヌクレオチドを動物、例えば人間の特定部位に標的化
できる脂質組成物を含んでいる。好ましくはリポソームのこの脂質組成物は、動
物の特定の臓器、例えば肺、肝臓、脾臓、心臓、脳、リンパ節、および皮膚を標
的とすることができる。
【０１６５】 本発明において有用なリポソームは、標的細胞の細胞質膜と融合してその内容
物を細胞へと運搬できる脂質組成物を含んでいる。好ましくは、リポソームのト
ランスフェクション効率は、約１０６細胞にデリバリーされるリポソーム１６nm
oleあたりＤＮＡ約０.５μg、より好ましくは約１０６細胞にデリバリーされる
リポソーム１６nmoleあたりＤＮＡ約１.０μg、さらに好ましくは約１０６細胞
にデリバリーされるリポソーム１６nmoleあたりＤＮＡ約２.０μgである。好ま
しくは、リポソームは直径が約１００および５００nmの間、より好ましくは約１
５０および４５０nmの間、そしてさらに好ましくは約２００および４００nmの間
である。
【０１６６】 本発明での使用にとって好適なリポソームは例えば当業者に知られる遺伝子デ
リバリー法で標準的に用いるリポソームを包含する。より好ましいリポソームは
、ポリカチオン脂質組成物を有するリポソームおよび／またはポリエチレングリ
コールとコンジュゲートしたコレステロールバックボーンを有するリポソームを
包含する。所望により、リポソームはこのリポソームを腫瘍細胞、例えばリポソ
ームの外表面に暴露している腫瘍細胞リガンドへと標的化できる化合物を含む。
【０１６７】 リポソームと、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムのような試
薬との複合体形成が、当分野において標準的な方法を用いて達成できる（例えば
米国特許5705151）。好ましくは約０.１μgないし約１０μgのポリヌクレオチド
を約８nmolのリポソームと、より好ましくは約０.５μgないし約５μgのポリヌ
クレオチドを約８nmolのリポソームと、そしてさらに好ましくは約１.０μgのポ
リヌクレオチドを約８nmolのリポソームと合する。
【０１６８】 別の態様では、レセプター仲介された標的化デリバリーを用いて抗体を特異的
組織にインビボでデリバリーできる。レセプター仲介されたＤＮＡデリバリー技
術は、例えばFindeis et al. Trends in Biotechnol. 11,202-05(1993); Chiou
et al., GENE THERAPEUTICS: METHODS AND APPLICATIONS OF DIRECT GENE TRANS
FER（J.A.Wolff編）(1994); Wu & Wu, J.Biol.Chem. 263,621-24(1988); Wu et
al., J.Biol.Chem. 269,542-46(1994); Zenke et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S
.A. 87,3655-59(1990); Wu et al., J.Biol.Chem. 266,338-42(1991)に教示され
ている。
【０１６９】治療的有効量の決定 治療的有効量の決定は、充分当業者の能力の範囲内にある。治療的有効量とは
、治療的有効量の不在下で起こるＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白の活性に比較して
ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白の活性を増大させまたは低下させる活性成分の量を
指す。
【０１７０】 いかなる化合物に関しても、治療的有効量は最初に細胞培養検定で、または動
物モデル、通常マウス、ウサギ、イヌ、またはブタで見積もることができる。動
物モデルは適当な濃度範囲および投与経路の決定にも使用できる。次にこのよう
な情報を用いて人間での有用な用量と投与経路を決定できる。
【０１７１】 治療的有効性および毒性、例えばＥＤ５０（集団の５０％で治療的に有効な用
量）およびＬＤ５０（集団の５０％で致死的な用量）は、細胞培養または実験動
物における標準的薬学的方法により決定できる。治療効果に対する毒性効果の用
量比が治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０で表すことができる。
【０１７２】 大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。細胞培養検定および動物研究か
ら得られるデータを、人間への使用のための用量範囲を処方する際に使用する。
係る組成物に含まれる用量は、好ましくは殆どまたは全く毒性を持たないＥＤ５ ０ を包含する循環濃度の範囲内である。この用量は、使用する用量型、患者の感
受性、および投与経路に応じてこの範囲内で変わる。
【０１７３】 正確な用量は、治療を必要とする対象に関連する因子に照らして医師が決定す
る。用量および投与は、充分なレベルの活性成分を提供するよう、または所望の
効果を維持するよう、調節する。考慮できる因子は、疾病状態の重篤度、対象の
全身健康状態、年齢、体重、および対象の性別、食餌、投与の時間および頻度、
薬物の組み合わせ、反応の感受性、および療法に対する寛容／応答を包含する。
長時間作用性医薬組成物は、その製剤の半減期およびクリアランス率に応じて３
ないし４日毎、毎週、または２週間に１回投与することができる。
【０１７４】 標準的な用量は投与経路に応じて０.１から１０００００マイクログラムまで
変えることができ、約１gまでの総用量とすることができる。特定の用量および
デリバリー方法についての指針は文献に提供されており、一般に当分野の医師が
入手できる。当業者は、ヌクレオチド用には蛋白またはそれらのインヒビター用
のものとは異なる製剤を使用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポ
リペプチドのデリバリーは特定の細胞、状態、場所などに特異的である。
【０１７５】 この試薬が一本鎖抗体である場合、この抗体をコードしているポリヌクレオチ
ドを組み立て、トランスフェリン−ポリカチオン−仲介ＤＮＡ転移、裸のまたは
カプセル内核酸を用いるトランスフェクション、リポソームの仲介する細胞融合
、ＤＮＡ被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感
染、電気穿孔、「遺伝子銃」、およびＤＥＡＥ−または燐酸カルシウム−仲介ト
ランスフェクションを包含する（但しこれらに限定される訳ではない）充分確立
した技術を用いて、ex vivoまたはインビボで細胞内に導入できる。
【０１７６】 抗体の有効なインビボ用量は、約５μgないし約５０μg/kg、約５０μgないし
約５mg/kg、約１００μgないし約５００μg/kg（患者の体重）、および約２００
ないし約２５０μg/kg（患者の体重）の範囲である。一本鎖抗体をコードしてい
るポリヌクレオチドの投与のためには、有効なインビボ用量は、約１００ngない
し約２００ng、５００ngないし約５０mg、約１μgないし約２mg、約５μgないし
約５００μg、および約２０μgないし約１００μgのＤＮＡの範囲である。
【０１７７】 発現産物がｍＲＮＡである場合、試薬は好ましくはアンチセンスオリゴヌクレ
オチドまたはリボザイムである。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザ
イムを発現するポリヌクレオチドは、上記のように多岐にわたる方法によって細
胞中に導入できる。
【０１７８】 好ましくは、試薬は、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白遺伝子の発現またはＣｙｓ
ＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドの活性を、該試薬の不在時と比較して少なくとも
約１０、好ましくは約５０、より好ましくは約７５、９０、または１００％低下
させる。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白遺伝子の発現レベルまたはＣｙｓＬＴ２様
ＧＰＣＲポリペプチドの活性を低下させるよう選択した機構の有効性は、当分野
で周知の方法、例えばＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白特異的ｍＲＮＡへのヌクレオ
チドプローブのハイブリダイゼーション、定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ＣｙｓＬＴ２様
ＧＰＣＲポリペプチドの免疫学的検出、またはＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白活性
の測定を用いて評価できる。
【０１７９】 上記のいずれの態様においても、本発明に係る任意の医薬組成物は他の適当な
治療薬と組み合わせて投与できる。併用療法に使用するための適当な物質の選択
は、常套的製薬原理に従い、当業者により実施することができる。治療薬の組み
合わせは、相乗的に働いて、上記の様々な疾患の治療または予防を奏効させる。
このアプローチを用いて、より低い各物質の用量で治療効果を達成することがで
き、したがって有害な副作用の可能性を低減することができる。
【０１８０】 上記の治療方法のいずれも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、
および最も好ましくはヒトといった哺乳動物を包含する、このような治療を必要
とする任意の対象に適用することができる。
【０１８１】診断方法 ＧＰＣＲはさらに、ＧＰＣＲをコードしている核酸配列における突然変異の存
在に関連する疾病および異常または疾病および異常に対する感受性を検出する診
断検定に使用できる。このような疾病は、例えば細胞の形質転換、例えば腫瘍お
よび癌、ならびに高血圧症および低血圧症を包含する様々な心血管疾患、ならび
に血流異常、アンギオテンシンの誘発するアルドステロン分泌の異常、およびそ
の他の体液および電解質ホメオスタシスの調節異常から生ずる疾病に関連してい
る。
【０１８２】 疾病に罹患している個体と正常な個体とにおけるＧＰＣＲをコードしているｃ
ＤＮＡまたはゲノム配列の間の相違を決定できる。もし罹患している個体の幾つ
かまたは全てに突然変異が観察され、正常な個体には観察されないならば、この
突然変異がその疾病の原因であると思われる。
【０１８３】 レファレンス遺伝子および突然変異を有する遺伝子の間の配列相違は、直接Ｄ
ＮＡ配列決定法によって明らかにできる。加えて、クローニングしたＤＮＡセグ
メントを、特定のＤＮＡセグメントを検出するためのプローブとして使用できる
。この方法の感受性はＰＣＲと組み合わせる時極めて増強される。例えば、二本
鎖ＰＣＲ産物または修飾ＰＣＲにより調製された一本鎖テンプレート分子と共に
、配列決定プライマーを使用することができる。配列決定は、放射標識したヌク
レオチドを用いる常套的方法によって、または蛍光標識を使用する自動配列決定
法によって実施する。
【０１８４】 ＤＮＡ配列相違に基づく遺伝子試験は、変性させる物質を含むまたは含まない
ゲル中のＤＮＡ断片の電気泳動移動度の変化を検出することにより実施できる。
小配列の欠失および挿入は、例えば高分解能ゲル電気泳動によって視覚化できる
。異なる配列のＤＮＡ断片は変性させるホルムアミド勾配ゲル上で識別でき、こ
こでは、異なるＤＮＡ断片の移動度が、それらの特異的融解温度または部分的融
解温度に従って、ゲル中の異なる位置で遅延する（例えば、Myers et al., Scie
nce 230,1242,1985を参照されたい）。特定の位置での配列改変もまたヌクレア
ーゼ保護検定、例えばＲＮアーゼおよびＳ１保護または化学的開裂法によって明
らかにすることができる（例えば、Cotton et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85
,4397-4401,1985）。即ち特異的ＤＮＡ配列の検出は、ハイブリダイゼーション、
ＲＮアーゼ保護、化学的開裂、直接ＤＮＡ配列決定といった方法によって、また
は制限酵素とゲノムＤＮＡのサザンブロッティングを使用することによって実施
できる。ゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定のような直接法に加えて、突然変異
はin situ分析により検出することもできる。
【０１８５】 ＧＰＣＲレベルの変化もまた種々の組織で検出できる。血液または組織生検の
ように、宿主から誘導した身体試料中のレセプターポリペプチドのレベルを検出
するために用いる検定は、当業者に周知であり、ラジオイムノアッセイ、競合的
結合検定、ウェスタンブロット分析、およびELISA検定を包含する。
【０１８６】 本明細書に引用する全ての特許および特許出願は、引用により特に本明細書の
一部とする。上記の内容は本発明を一般的に記載するものである。より完全な理
解は以下の具体的実施例を参照することによって得られ、それらの実施例は例示
のみの目的で提供するものであり、本発明の範囲を限定する意図は無い。
【０１８７】実施例１ ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ活性の検出 配列番号１のポリヌクレオチドを発現ベクターｐＣＥＶ４内部に挿入し、得ら
れた発現ベクターｐＣＥＶ４−ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをヒト胚性
腎２９３細胞にトランスフェクトする。この細胞を培養フラスコから削り取って
５mlのTris ＨＣｌ、５mM ＥＤＴＡ、pH７.５に入れ、超音波により溶解する。
細胞溶解液を１０００rpm、４℃で５分間遠心分離する。上清を３００００ｘｇ
、４℃で２０分間遠心分離する。０.１％ＢＳＡ、２μg/mlアプロチニン、０.５
mg/mlロイペプチン、および１０μg/mlホスホルアミドンを添加した５０mM Tris
ＨＣｌ、５mM ＭｇＳＯ４、１mM ＥＤＴＡ、１００mM ＮａＣｌ、pH７.５を含
有する結合緩衝液にペレットを懸濁する。添加した放射性リガンド、即ち１２５ Ｉ−標識ＣｙｓＬＴ２の１０％未満と結合するのに要する蛋白濃度として定義し
た最適膜懸濁液希釈液を、リガンド、非標識ペプチド、および最終容量２５０μ
lとするのに要する結合緩衝液を入れた９６ウェルポリプロピレン微量定量プレ
ートに加える。
【０１８８】 平衡飽和結合検定では、漸増濃度（０.１nMないし４nM）の１２５Ｉリガンド
存在下で膜調製物をインキュベートする。
【０１８９】 結合反応混合物を３０℃で１時間インキュベートする。細胞収穫器を使用し、
０.５％ポリエチレンイミンで処理したＧＦ／Ｂフィルターで濾過することによ
り反応を停止させる。シンチレーション計数により放射能を測定し、コンピュー
ター処理した非線形回帰プログラムによりデータを解析する。非特異結合は、非
標識ペプチド１００nMの存在下で膜蛋白をインキュベートした後に残留する放射
能の量として定義する。蛋白濃度を、牛血清アルブミンを標準とするBio-Rad試
薬を用いるBradford法により測定する。配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペ
プチドのＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ活性が証明される。
【０１９０】実施例２ 放射性リガンド結合検定 ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白を発現するポリヌクレオチドでトランスフェ
クトしたヒト胚性腎２９３細胞を培養フラスコから削り取って、５mlのTris Ｈ
Ｃｌ、５mM ＥＤＴＡ、pH７.５に入れ、超音波処理によって溶解させる。細胞溶
解液を１０００rpm、４℃で５分間遠心分離する。上清を３００００ｘｇ、４℃
で２０分間遠心分離する。０.１％ＢＳＡ、２μg/mlアプロチニン、０.５ｍg/ml
ロイペプチン、および１０μg/mlホスホルアミドンを添加した５０mM Tris ＨＣ
ｌ、５mM ＭｇＳＯ４、１mM ＥＤＴＡ、１００mM ＮａＣｌ、pH７.５を含有する
結合緩衝液にペレットを懸濁する。添加した放射性リガンド、即ちＣｙｓＬＴ２
の１０％未満と結合するのに要する蛋白濃度として定義した最適膜懸濁液希釈液
を、１２５Ｉ−標識リガンドまたは被験化合物、非標識ペプチド、および最終容
量２５０μｌとするのに要する結合緩衝液を入れた９６ウェルポリプロピレン微
量定量プレートに加える。
【０１９１】 平衡飽和結合検定では、漸増濃度（０.１nMないし４nM）の１２５Ｉ−標識リ
ガンドまたは被験化合物（比活性２２００Ci/mmol）の存在下で膜調製物をイン
キュベートする。異なる被験化合物の結合親和性を、１２の異なる濃度の各被験
化合物の存在下で、０.１nM１２５Ｉ−ペプチドを用いる平衡競合結合検定で決
定する。
【０１９２】 結合反応混合物を３０℃で１時間インキュベートする。細胞収穫器を使用し、
０.５％ポリエチレンイミンで処理したＧＦ／Ｂフィルターで濾過することによ
り反応を停止させる。シンチレーション計数により放射能を測定し、コンピュー
ター処理した非線形回帰プログラムによりデータを解析する。
【０１９３】 非特異結合は、非標識ペプチド１００nMの存在下で膜蛋白をインキュベートし
た後に残留する放射能の量として定義する。蛋白濃度を、牛血清アルブミンを標
準とするBio-Rad試薬を用いるBradford法により測定する。被験化合物と共にイ
ンキュベートしなかった膜蛋白の放射能に比して、膜蛋白の放射能を少なくとも
１５％増大させる被験化合物を、ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドに結
合する化合物として同定する。
【０１９４】実施例３ ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白の仲介するサイクリックＡＭＰ形成に及ぼす被
験化合物の効果 レセプターの仲介するｃＡＭＰ形成の阻害が、ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋
白を発現する宿主細胞で検定できる。細胞を９６ウェルプレートに蒔き、１０mM
HEPES、５mMテオフィリン、２μg/mlアプロチニン、０.５ｍg/mlロイペプチン
、および１０μg/mlホスホロアミドンを添加したダルベッコ燐酸緩衝化食塩水（
ＰＢＳ）中、３７℃、５％ＣＯ２中で２０分間インキュベートする。被験化合物
を加え、３７℃でさらに１０分間インキュベートする。培地を吸引し、１００mM
ＨＣｌの添加により反応を停止させる。このプレートを４℃で１５分間保存す
る。停止用溶液中のｃＡＭＰ含有量をラジオイムノアッセイにより測定する。
【０１９５】 データ処理ソフトウェアを備えたガンマカウンターを用いて放射能を定量する
。被験化合物の無いウェル内容物の放射能に比してウェル内容物の放射能を低下
させる被験化合物を、ｃＡＭＰ形成の可能性あるインヒビターと同定する。被験
化合物の無いウェル内容物の放射能に比してウェル内容物の放射能を増大させる
被験化合物を、ｃＡＭＰ形成の可能性あるエンハンサーと同定する。
【０１９６】実施例４ 細胞内カルシウムの動員に及ぼす被験化合物の効果 細胞内の遊離カルシウム濃度は、蛍光インディケーター色素Fura-2/AMを用い
る顕微分光蛍光分析によって測定できる（Bush et al., J.Neurochem. 57,562-7
4,1991）。安定にトランスフェクトされた細胞を、ガラス製カバーグラス挿入物
を入れた３５mm培養皿に蒔く。細胞をＨＢＳで洗浄し、被験化合物と共にインキ
ュベートし、１００μlのFura-2/AM（１０μＭ）を用いて２０−４０分間ロード
する。ＨＢＳで洗浄してFura-2/AM溶液を除去した後、細胞をＨＢＳ中で１０−
２０分間平衡化する。次いでLeitz Fluovert FS顕微鏡の４０Ｘ対物レンズの下
で細胞を視覚化する。
【０１９７】 蛍光の放出を、３４０nMおよび３８０nMの間を交代する励起波長を用いて５１
０nMで測定する。標準カルシウム濃度曲線とソフトウェア解析技術を用いて生の
蛍光データをカルシウム濃度に変換する。被験化合物不在時の蛍光に比して蛍光
を少なくとも１５％増大させる被験化合物を、細胞内カルシウムを動員する化合
物と同定する。
【０１９８】実施例５ ホスホイノシチド代謝に及ぼす被験化合物の効果 ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白ｃＤＮＡを安定に発現する細胞を９６ウェル
プレートに蒔き、密集するまで増殖させる。検定の前日、成長培地を１％血清お
よび０.５μCi ３Ｈ−myinositolを含有する培地１００μlに交換する。このプ
レートをＣＯ２インキュベーター（５％ＣＯ２、３７℃）中で一夜インキュベー
トする。検定の直前、培地を除去し、１０mM ＬｉＣｌを含有するＰＢＳ ２００
μlに置き換え、細胞を新しい培地で２０分間平衡化する。この間に細胞は、Ｐ
ＢＳ中の２０倍濃縮溶液１０μlアリコートとして加えたアンタゴニストにも平
衡化する。
【０１９９】 被験化合物を含有する溶液１０μlを添加することにより、イノシトール燐脂
質代謝からの燐酸３Ｈ−イノシトールの蓄積を開始させる。最初のウェルに１０
μlを加えて基礎蓄積を測定する。１１の異なる濃度の被験化合物を、各プレー
ト列の、以下の１１ウェルで検定する。全ての検定は、二つの連続するプレート
列に同じ添加を反復することにより、二重に実施する。
【０２００】 このプレートをＣＯ２インキュベーター中で１時間インキュベートする。５０
％v/vトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）１５μlの添加により反応を停止させ、その後４
℃で４０分間インキュベートする。１M Tris ４０μlでＴＣＡを中和した後、ウ
ェルの内容物を、Dowex AG1-X8（２００−４００メッシュ、蟻酸塩（エステル）
型）を含有するMultiscreen HVフィルタープレート（Millipore）に移す。この
フィルタープレートは、各ウェルにDowex AG1-X8懸濁液２００μl（５０％v/v、
水：樹脂）を添加することにより調製する。フィルタープレートを真空マニホル
ド上に据え、樹脂床を洗浄または溶出する。各ウェルを水２００μlで２回、続
いて５mM四硼酸ナトリウム／６０mM蟻酸アンモニウム２ｘ２００μlで洗浄する
。
【０２０１】 ３Ｈ−ＩＰを１.２M蟻酸アンモニウム／０.１蟻酸２００μlで、空の９６ウェ
ルプレートに溶出する。ウェル内容物をシンチレーション混合液３mlに加え、液
体シンチレーション計数により放射能を測定する。
【０２０２】実施例６ レセプター結合法 標準結合検定。５０mM HEPES、pH７.４、０.５％ＢＳＡ、および５mM ＭｇＣ
ｌ２を含有する結合緩衝液中で結合検定を実施する。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポ
リペプチドを含む膜断片に対する放射性リガンド（例えば１２５Ｉ−被験化合物
）の結合のための標準検定は、９６ウェル微量定量プレート（例えば、Dynatech
Immulon II Removawellプレート）中で以下のように実施する。放射性リガンド
を、結合緩衝液＋ＰＭＳＦ／Ｂａｃｉ中で５０μｌあたり所望のcpmとなるよう
希釈し、次いで５０μlアリコートをウェルに加える。非特異結合試料のため、
ウェルあたり４０μMのコールドリガンド５μlもまた加える。結合緩衝液＋ＰＭ
ＳＦ／Ｂａｃｉ中、所望濃度（１０−３０μg膜蛋白／ウェル）に希釈した、ウ
ェルあたり１５０μlの膜を添加することにより、結合を開始させる。次いでプ
レートをLinbro mylarプレートシーラー（Flow Labs）で被蓋し、Dynatech Micr
oshaker II上に据える。結合を室温で１−２時間進行させ、プレートを２０００
ｘｇで１５分間遠心分離することにより結合を停止させる。上清をデカンテーシ
ョンし、氷冷結合緩衝液２００μlの添加、短時間の振盪、および再遠心分離に
より、膜ペレットを１回洗浄する。個々のウェルを１２ｘ７５mmの管に入れ、LK
B Gammamasterカウンターで計数する（７８％効率）。この方法による特異結合
は、迅速濾過（３−５秒間）と、ポリエチレンイミン被覆したグラスファイバー
フィルター上での洗浄により遊離リガンドを除去して測定したものと同一である
。
【０２０３】 標準結合検定の３種の変形もまた使用する。 １．或る濃度範囲のコールドリガンド対１２５Ｉ−標識リガンドを用いる競合的
放射性リガンド結合検定を、１つの修飾を施す他は上記のように実施する。検定
するリガンドの全希釈液を４０Ｘ ＰＭＳＦ／Ｂａｃｉ中で検定の最終濃度の４
０Ｘ濃度に作製する。次にペプチドの試料（各々５μl）を微量定量ウェル毎に
加える。膜と放射性リガンドを、プロテアーゼインヒビター無しの結合緩衝液で
希釈する。放射性リガンドを加え、コールドリガンドと混合し、次いで膜の添加
により結合を開始させる。
【０２０４】 ２．放射性リガンドとレセプターの化学的架橋は、標準検定と同一の結合工程の
後に行う。しかしながら、洗浄工程は、放射性リガンドとＢＳＡとの非特異的架
橋の可能性を減少させるため、ＢＳＡを除いた結合緩衝液で行う。架橋工程は下
記のように実施する。
【０２０５】 ３．レセプター：リガンド複合体の可溶化に関する研究のための、およびレセプ
ター精製のためのの、膜ペレットを取得するために、大スケール結合検定もまた
実施する。これらは、（ａ）結合をポリプロピレン管内で１−２５０mlの容量で
実施し、（ｂ）膜蛋白の濃度を常に０.５mg/mlとし、そして（ｃ）レセプター精
製については、結合緩衝液中のＢＳＡ濃度を０.２５％に減らし、洗浄工程をＢ
ＳＡ無しの結合緩衝液で行い、これにより、精製されたレセプターのＢＳＡ混入
を減らす、という事を除いては標準検定と同一である。
【０２０６】実施例７ 放射性リガンドとレセプターの化学的架橋 上記の放射性リガンド結合工程の後、膜ペレットを、微量定量プレートのウェ
ルあたり２００μlの、ＢＳＡを含まない氷冷結合緩衝液に再懸濁する。次に、
ウェルあたり５μlの、ＤＭＳＯ中の４mM Ｎ−５−アジド−２−ニトロベンゾイ
ルオキシスクシンイミド（ＡＮＢ−ＮＯＳ、Pierce）を加え、混合する。この試
料を氷上に保持し、Mineralight R-52Gランプ（UVP Inc., San Gabriel, Calif.
）を用いて１０分間ＵＶ照射する。次いで試料をエッペンドルフ微量遠心管に移
し、遠心分離により膜をペレット化し、上清を除き、膜をポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＰＡＧＥ）用のLaemmli ＳＤＳ試料緩衝液中に可溶化する。ＰＡＧ
Ｅは下記のように実施する。放射標識した蛋白を、Kodak XARフィルムおよびDup
ont画像増感紙を用いる乾燥ゲルのオートラジオグラフィーにより視覚化する。
【０２０７】実施例８ 膜の可溶化 膜の可溶化は、２５mM Tris、pH８、１０％グリセロール（w/v）および０.２m
M ＣａＣｌ２を含有する緩衝液（可溶化緩衝液）中で実施する。Triton X-100、
デオキシコール酸、デオキシコール酸：リソレシチン、ＣＨＡＰＳ、および両性
洗浄剤を含有する極めて可溶性の洗浄剤を可溶化緩衝液中１０％濃度で作製し、
凍結アリコートとして保存する。リソレシチンは凍結−融解時の不溶性の故に新
しく作製し、ジギトニンは、より限られた溶解性の故に低濃度で新たに作製する
。
【０２０８】 膜を可溶化するため、結合工程後の洗浄したペレットをピペット操作により目
視できる粒子が無いよう再懸濁し、可溶化緩衝液中１０００００ｘｇで３０分間
攪拌する。上清を除去し、氷上に保持し、ペレットを廃棄する。
【０２０９】実施例９ 可溶化したレセプターの検定 １２５Ｉリガンドの結合と、洗浄剤による膜の可溶化の後、無傷のＲ：Ｌ複合
体は４つの異なる方法で検定できる。全て氷上または４−１０℃の冷室で実施す
る。
【０２１０】 １．カラムクロマトグラフィー（Knuhtsen et al., Biochem.J. 254,641-647,19
88）。Sephadex G-50カラム（８ｘ２５０mm）を、膜の可溶化に用いた濃度の洗
浄剤と１mg/mlの牛血清アルブミンを含有する可溶化緩衝液で平衡化する。可溶
化した膜の試料（０.２−０.５ml）をこのカラムに適用し、約０.７ml/分の流速
で溶出する。試料（０.１８ml）を集める。放射能をガンマカウンターで測定す
る。カラムの空隙容量をブルーデキストランの溶出容量により決定する。空隙容
量に溶出する放射能は蛋白に結合していると考えられる。遊離の１２５Ｉリガン
ドと同容量で後に溶出する放射能は非結合であると考えられる。
【０２１１】 ２．ポリエチレングリコール沈殿（Cuatrecasas, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69,3
18-322,1972）。１２ｘ７５mmポリプロピレン管中の可溶化した膜の試料１００
μlに対し、０.１M燐酸ナトリウム緩衝液中の１％（w/v）牛ガンマグロブリン（
Sigma）０.５ml、続いて２５％（w/v）ポリエチレングリコール（Sigma）０.５m
lを加え、混合する。混合物を１５分間氷上に保持する。次に試料毎に０.１M燐
酸ナトリウム（pH７.４）３mlを加える。試料をWhatman GF/Bグラスファイバー
フィルターで速やかに（１−３秒間）濾過し、燐酸緩衝液４mlで洗浄する。ＰＥ
Ｇ沈殿したレセプター：１２５Ｉ−リガンド複合体をフィルターのガンマ計数に
よって測定する。
【０２１２】 ３．ＧＦＢ／ＰＥＩフィルター結合（Bruns et al., Analytical Biochem. 132,
74-81,1983）。Whatman GF/Bグラスファイバーフィルターを０.３％ポリエチレン
イミン（ＰＥＩ、Sigma）に３時間浸漬する。可溶化した膜の試料（２５−１０
０μｌ）を１２ｘ７５mmポリエチレン管に戻す。次いで、洗浄剤を含まない可溶
化緩衝液４mlを試料毎に加え、この試料を直ちにＧＦＢ／ＰＥＩフィルターで濾
過し（１−３秒間）、可溶化緩衝液４mlで洗浄する。吸着されたレセプター：１ ２５ Ｉ−リガンド複合体のＣＰＭをガンマ計数により決定する。
【０２１３】 ４．木炭／デキストラン（PaulおよびSaid, Peptides 7[Suppl. 1], 147-149,19
86）。デキストランＴ７０（０.５g、Pharmacia）を水１リットルに溶解し、次
に活性炭（Norit A、アルカリ性；Fisher Scientific）５gを加える。この懸濁
液を室温で１０分間攪拌し、次いで使用時まで４℃で保存する。Ｒ：Ｌ複合体を
測定するため、木炭／デキストラン懸濁液４部（容量）を、可溶化した膜１部（
容量）に加える。試料を混合し、氷上に２分間保持し、次いでBeckman遠心分離
器中１１０００ｘｇで２分間遠心分離する。遊離の放射性リガンドが木炭／デキ
ストランに吸着され、これをペレットと共に廃棄する。レセプター：１２５Ｉ−
リガンド複合体は上清に残存し、これをガンマ計数によって測定する。
【０２１４】実施例１０ レセプターの精製 ＧＨ４Ｃｌ膜へのビオチニル−レセプターの結合は上記のように実施する。イ
ンキュベーションは室温で１時間とする。標準的精製プロトコルでは、結合イン
キュベーションは１０nM Bio-S29を含有する。トレーサーとして１２５Ｉリガン
ドを、膜蛋白ｍｇあたり５０００−１０００００cpmのレベルで加える。対照イ
ンキュベーションには、レセプターを非ビオチニル化リガンドで飽和させるため
１０μMのコールドリガンドを含有させる。
【０２１５】 レセプター：リガンド複合体の可溶化はさらに、０.２mM ＭｇＣｌ２を含有す
る可溶化緩衝液中の０.１５％デオキシコール酸：リソレシチンを用いて上記の
ように実施して、可溶化したＲ：Ｌ複合体を含有する１０００００ｘｇ上清を得
る。
【０２１６】 固定化したストレプトアビジン（６％ビーズ化アガロースに架橋させたストレ
プトアビジン、Pierce Chemical Co.; 「ＳＡ−アガロース」）を可溶化緩衝液
中で洗浄し、可溶化した膜に１／３０の最終容量で加える。この混合物をぐるぐ
ると回転させることにより４−１０℃で４−５時間絶えず攪拌しつつインキュベ
ーションする。次に混合物をカラムに適用し、非結合物質を洗い流す。１０００
００ｘｇ上清のcpmをＳＡ−アガロースへの吸着後のカラム溶出液のcpmと比較す
ることにより、ＳＡ−アガロースへの放射性リガンドの結合を決定する。最後に
、１２−１５カラム容量の可溶化緩衝液＋０.１５％デオキシコール酸：リソレ
シチン＋１／５００（容量／容量）１００ｘ４paseでカラムを洗浄する。
【０２１７】 ストレプトアビジンカラムを可溶化緩衝液＋０.１mM ＥＤＴＡ＋０.１mM ＥＧ
ＴＡ＋０.１mM ＧＴＰ−ガンマ−Ｓ（Sigma）+０.１５％（重量／容量）デオキ
シコール酸：リソレシチン＋１／１０００（容量／容量）１００倍４paseで溶出
する。まず、１カラム容量の溶離緩衝液をカラムに流し、流れを２０−３０分間
停止させる。次に、さらに３−４カラム容量の溶離緩衝液を流す。溶出液を全て
プールする。
【０２１８】 ストレプトアビジンカラムからの溶出液を固定化した小麦胚芽アグルチニン（
ＷＧＡアガロース、Vector Labs）と共に一夜（１２−１５時間）インキュベー
トし、共有結合した炭水化物とＷＧＡレクチンとの相互作用を介してレセプター
を吸着させる。ストレプトアビジンカラム溶出液に対するＷＧＡ−アガロースの
比（容量／容量）は一般に１：４００である。１：１０００ないし１：２００の
範囲もまた使用できる。結合工程の後、樹脂を遠心分離によってペレット化し、
上清を除去して取り置き、樹脂を５０mM HEPES、pH８、５mM ＭｇＣｌ２、およ
び０.１５％デオキシコール酸：リソレシチンを含有する緩衝液で３回（それぞ
れ約２分間）洗浄する。ＷＧＡ結合レセプターを溶離するため、樹脂の洗浄に用
いたものと同じHEPES緩衝液に入れた１０mM Ｎ−Ｎ'−Ｎ"−トリアセチルチトト
リオースを毎回３樹脂カラム容量用いて氷上１５−３０分間反復混合（低速のボ
ルテクスミキサー）することにより、３回抽出する。各溶離工程の後、樹脂を遠
心沈降させ、ＷＧＡ−アガロースペレットを含まないよう上清を注意深く取り除
く。３つのプールした溶出液は、最終的な精製レセプターを含有する。ＷＧＡに
結合しない物質は、ストレプトアビジンカラムから特異的に溶離されたＧ蛋白サ
ブユニット、および非特異的混入物質を含有する。これらの画分は全て−９０℃
で冷凍保存する。
【０２１９】実施例１１ ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドに結合する被験化合物の同定 グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ蛋白を含み９６ウェル微量定量プレー
トのグルタチオン誘導体化したウェル上に吸収させた精製ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣ
Ｒポリペプチドを、小分子ライブラリー由来の被験化合物と、生理的緩衝溶液中
pH７.０で接触させる。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドは配列番号２に示
すアミノ酸配列を含む。この被験化合物は蛍光標識を含む。試料を５分間ないし
１時間インキュベートする。対照試料は被験化合物の不在下にインキュベートす
る。
【０２２０】 被験化合物を含有する緩衝溶液をウェルから洗浄する。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣ
Ｒポリペプチドへの被験化合物の結合を、ウェル内容物の蛍光測定によって検出
する。ウェル内の蛍光を、被験化合物をその中でインキュベートしなかったウェ
ルの蛍光に比して、少なくとも１５％増大させる被験化合物を、ＣｙｓＬＴ２様
ＧＰＣＲポリペプチドに結合する化合物として同定する。
【０２２１】実施例１２ ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白遺伝子発現を減少させる被験化合物の同定 被験化合物をヒト胃細胞の培養に投与し、３７℃で１０ないし４５分間インキ
ュベートする。被験化合物無しで同時間インキュベートした同じ型の細胞培養を
負の対照とする。
【０２２２】 二つの培養から、Chirgwin et al., Biochem. 18,5294-99,1979に記載のよう
にＲＮＡを単離する。総ＲＮＡ２０ないし３０μgを用いてノーザンブロットを
調製し、Express-hyb（CLONTECH）中６５℃で３２Ｐ標識ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣ
Ｒ蛋白特異的プローブとハイブリダイズさせる。このプローブは配列番号１から
選択した少なくとも１１の連続するヌクレオチドを含んでいる。被験化合物不在
時に得られるシグナルに比してＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白特異的シグナルを減
少させる被験化合物を、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白遺伝子発現のインヒビター
と同定する。
【０２２３】実施例１３ ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白遺伝子産物に特異結合する試薬による喘息の治療 配列番号１から選択した少なくとも１１の連続するヌクレオチドを含んでいる
アンチセンスＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲオリゴヌクレオチドの合成を、ホスホロア
ミダイト法を用いてPharmacia Gene Assembler連続合成機上で実施する（Uhlman
n et al., Chem.Rev. 90,534-83,1990）。組み立てと脱保護の後、オリゴヌクレ
オチドを２回エタノール沈殿させ、乾燥し、燐酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）に所望
濃度で懸濁させる。これらのオリゴヌクレオチドの純度を毛管ゲル電気泳動とイ
オン交換ＨＰＬＣにより試験する。このオリゴヌクレオチド調製物のエンドトキ
シンレベルをLuminous Amebocyte Assay（Bang, Biol.Bull.(Woods Hole, Mass.
)105,361-362,1953）を用いて測定する。
【０２２４】 このアンチセンスオリゴヌクレオチドを喘息の患者に気管支内投与する。患者
の喘息の重篤度は軽減する。
【０２２５】実施例１４ ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの組織特異的発現 ＣＯＰＤの病因におけるＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの役割を確立する第一段階と
して、ＣＯＰＤに関連するヒト呼吸器組織および炎症細胞由来のＲＮＡ試料を用
いた実時間定量的ＰＣＲを使用する、該遺伝子の発現プロファイリングを行った
。パネルは、総ＲＮＡ試料の肺（成人および胎児）、気管、新たに単離した胚胞
II型細胞、ヒト気管支上皮培養細胞、小気道上皮培養細胞、気管支平滑筋培養細
胞、Ｈ４４１培養細胞（クラーラ様）、新たに単離した好中球および単球、なら
びに培養単球（マクロファージ様）で構成されていた。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ
の発現はさらに、Clontech Laboratories,UK,Ltd.から取得した総ＲＮＡパネル
を用いた一連のヒト組織においても評価した。この組織は、副腎、骨髄、脳、大
腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、乳腺、膵臓、前立腺、唾液腺、骨格筋、小腸、脾臓
、胃、精巣、胸腺、気管、甲状腺、および子宮であった。ＰＣＲの速度論的分析
の進展はHiguchi et al., BioTechnology 10,413-17,1992、およびHiguchi et a
l., BioTechnology 11,1026-30,1993に最初に記載された。その原理とは、対数
期のＰＣＲのいかなるサイクルにおいても、産物の量は鋳型コピーの初期数に比
例するということである。
【０２２６】 標的配列に対し相補的であり、且つ蛍光リポーター色素および消光剤色素で標
識したオリゴヌクレオチドプローブ（TaqManプローブ）の存在下でＰＣＲ増幅を
実施する。ＰＣＲの伸長期の間にこのプローブはTaq DNAポリメラーゼの５'−３
'エンドヌクレアーゼ活性により開裂し、消光剤色素の作用から発蛍光団を解放
する（Holland et al., Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 88,7276-80,1991）。蛍光
の放出は特異的増幅産物の量に直接比例して増大するため、ＰＣＲ産物の指数増
殖期が検出でき、これを用いて最初の鋳型濃度を決定できる（Heid et al., Gen
ome Res. 6,986-94,1996、およびGibson et al., Genome Res. 6,995-1001,1996
）。
【０２２７】 ABI Prism7700配列検出機を用いて実時間定量的ＰＣＲを実施した。各反応に
ついて作製したＣＴ値を使用して、広域標準曲線からの内挿により、最初の鋳型
濃度（コピー数）を決定した。各々の試料中の標的遺伝子の発現レベルを、該遺
伝子を最も低く発現する試料に比較して算出した。
【０２２８】 ＲＮＡ抽出およびｃＤＮＡ調製。上に列挙した呼吸組織と炎症細胞型の各々か
らの総ＲＮＡを、製造者のプロトコルに従いQiagenのRNeasy系を用いて単離した
（Crawley, West Sussex, UK）。精製ＲＮＡの濃度をRiboGreen ＲＮＡ定量キッ
トを用いて決定した（Molecular Probes Europe, The Netherlands）。ｃＤＮＡ
の調製のためには、製造者のプロトコルに従い、２００ＵのSUPERSCRIPT(登録商
標)ＲＮアーゼ Ｈ−逆転写酵素（Life Technologies, Paisley, UK）、１０mMジ
チオトレイトール、０.５mMの各ｄＮＴＰおよび５μMのランダムヘキサマー（Ap
plied Biosystems, Warrington, Cheshire, UK）を使用して、総ＲＮＡ １μgを
最終容量２０μlで逆転写した。
【０２２９】 TaqMan定量分析。PE Applied Biosystemsの推奨に従い特異的プライマーおよ
びプローブを設計した；ＦＡＭ(６−カルボキシ−フルオレセイン)−標識プロー
ブを使用した。各試料から逆転写したＲＮＡ ５ngで定量的ＰＣＲを実施した。
各測定は二重に実施した。
【０２３０】 検定反応混合物は以下の通りとした：１Ｘ最終TaqMan Universal PCR Master
Mix(２Ｘ保存液より)(PE Applied Biosystems, CA)；９００nM前進プライマー；
９００nM逆プライマー；２００nMプローブ；５ng ｃＤＮＡ；水を加えて２５μl
とする。
【０２３１】 以下の工程をそれぞれ１回実施した：プレＰＣＲ、５０Ｃで２分間、および９
５Ｃで１０分間。以下の工程は４０回実施する：変性、９５Ｃで１５秒間、アニ
ーリング／伸長、６０Ｃで１分間。
【０２３２】 実験は全てABI Prism 7700配列検出機（PE Applied Biosystems, CA）を用い
て実施した。実施の最後に、ＰＣＲ中に得られた蛍光データをABI Prism 7700使
用者マニュアルに記載されているように処理し、より良いバックグラウンドの削
減と、出発標的量とのシグナル直線性を達成した。
【０２３３】 第１表および第２表は、表示の細胞および組織試料を用いたＣｙｓＬＴ２様Ｇ
ＰＣＲの発現プロファイリングの結果を示している。第１表に関し、細胞は以下
のように定義する：ＨＢＥＣ、ヒト気管支上皮培養細胞；Ｈ４４１、クラーラ様
セルライン；ＳＡＥ、小気道上皮培養細胞；ＳＭＣ、気道平滑筋培養細胞；ＡＩ
Ｉ、新たに単離したヒト胚胞II型細胞；Ｎｅｕｔ、新たに単離した循環好中球；
Ｍｏｎｏ、新たに単離した単球；およびＣＭ、培養単球。その他の文字はドナー
を示している。結果は図５および６にグラフで示す。心臓、肺、大腸、小腸およ
び胎盤と比較して相対的に低い発現が、胎児と成人の脳で検出されている。ＣＮ
Ｓでの発現は低いものの、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの特異的発現が、神経系の様
々な疾患を治療する可能性を示している。特異的神経系組織でのＣｙｓＬＴ２様
ＧＰＣＲの発現は低いが、脳と脊髄全体に遍在している。最も高い発現は、後根
神経節の末梢神経系で検出された。中枢および末梢神経系組織でのこのＣｙｓＬ
Ｔ２様ＧＰＣＲの発現は、神経系の様々な疾患を治療する可能性を示している。
【０２３４】実施例１５ 組換えヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの発現 Pichia pastoris発現ベクターｐＰＩＣＺＢ（Invitrogen, San Diego, CA）を
使用して、大量の組換えヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドを酵母で産生
させる。ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲコード化ＤＮＡ配列は配列番号１から誘導する
。ベクターｐＰＩＣＺＢ中に挿入する前に、このＤＮＡ配列を、周知の方法によ
り、５'末端に開始コドンを、そして３'末端にエンテロキナーゼ開裂部位、Ｈｉ
ｓ６リポーター標識および終止コドンを含むように修飾する。さらに、両方の末
端に制限エンドヌクレアーゼのための認識配列を付加し、ｐＰＩＣＺ Ｂの複数
のクローニング部位を対応する制限酵素で消化した後に、この修飾したＤＮＡ配
列をｐＰＩＣＺＢ中にライゲーションする。この発現ベクターは、酵母プロモー
ターにより駆動する、Pichia pastorisでの誘導的発現のために設計する。得ら
れたｐＰＩＣＺ／ｍｄ−Ｈｉｓ６ベクターを用いて酵母を形質転換する。
【０２３５】 この酵母を５リットル振盪フラスコ中、通常条件下に培養し、組換え産生され
た蛋白を８Ｍ尿素の存在下で親和クロマトグラフィー（Ｎｉ−ＮＴＡ−樹脂）に
よって培養から単離する。結合したポリペプチドを緩衝液（pH３.５）で溶出し
、中和する。Ｈｉｓ６リポーター標識からの該ポリペプチドの分離を、製造者の
指示に従いエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego, CA）を用いる位置特異
的蛋白分解により達成する。精製されたヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチ
ドが得られる。
【０２３６】実施例１６ ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの定量的発現のプロファイリング 発現プロファイリングは反応速度分析とも呼ばれる定量的ポリメラーゼ連鎖反
応（ＰＣＲ）分析に基づくものであり、Higuchi et al., 1992およびHiguchi et
al., 1993で最初に記載された。その原理は、対数期のＰＣＲのいかなるサイク
ルにおいても、産物の量は最初の鋳型コピーの数に比例するということである。
この技術を用いて、染色体からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として転写さ
れる特定遺伝子の発現レベルが、まず該ｍＲＮＡのＤＮＡコピー（ｃＤＮＡ）を
作製し、次にこのｃＤＮＡで定量的ＰＣＲを実施することによる、定量的逆転写
ポリメラーゼ連鎖反応（定量的ＲＴ−ＰＣＲ）と呼ばれる方法によって測定され
る。
【０２３７】 異なるヒト組織由来のＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を実施してＣｙｓＬＴ
２様ＧＰＣＲ ｍＲＮＡの組織分布を検討した。種々の組織由来の総ＲＮＡ ２５
.mu.g（ヒト総ＲＮＡパネルＩ−Ｖ、Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, U
SA）を鋳型に使用し、ＲＴ−ＰＣＲのためのSUPERSCRIPT(登録商標) 第一鎖合成
系（Life Technologies, Rockville, MD, USA）を用いて第一鎖ｃＤＮＡを合成
した。製造者のプロトコルに従い、ｍＲＮＡの３'ポリＡ尾にハイブリダイズし
合成反応を開始させるためのオリゴ(ｄＴ)を使用して、第一鎖ｃＤＮＡ合成を実
施した。次に第一鎖ｃＤＮＡ １０ngをポリメラーゼ連鎖反応の鋳型に使用した
。このポリメラーゼ連鎖反応は、ＤＮＡ結合蛍光色素SYBR Green Iの存在下にLi
ghtCycler（Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA）中で実施
し、この色素は当該反応で二本鎖ＤＮＡがうまく合成できた時にのみ調製するＤ
ＮＡ二重らせんの小溝に結合する（Morrison et al., 1998）。二本鎖ＤＮＡに
結合すると、SYBR Green IはLightCycler機により定量的に測定できる光を放射
する。このポリメラーゼ連鎖反応はオリゴクヌレオチドプライマーＡＡ２５４６
６４−Ｌ２（ＴＧＣＧＴＴＴＣＣＴＧＧＣＡＡＴＧＧＴＴＣＡ）およびＡＡ２５
４６６４−Ｒ２（ＧＣＡＧＣＣＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＡＡＴＡ）を用いて実
施し、放射された光の強度測定は、反応の各サイクルの後、反応が摂氏８０度に
到達した時に行った。放射光の強度は、同時に反応させた既知濃度の標準との比
較により、鋳型ｃＤＮＡナノグラムあたりの遺伝子転写物のコピー数に変換した
。
【０２３８】 様々な組織型の細胞あたりのｍＲＮＡ転写レベルにおける相違を補正するため
、同様に算出した様々な組織における５種類の異なるハウスキーピング遺伝子：
グリセルアルデヒド−３−ホスファターゼ（Ｇ３ＰＤＨ）、ヒポキサンチングア
ニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）、β−アクチン、ポルホビ
リノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、およびβ−２−ミクログロブリン、の発
現レベルを用いて正規化操作を行った。ハウスキーピング遺伝子の発現レベルは
全ての組織について比較的一定であると考えられ（Adams et al., 1993、Adams
et al., 1995、Liew et al., 1994）、故に、ｃＤＮＡ合成工程で使用する総Ｒ
ＮＡの.mu.gあたりの概算相対的細胞数の尺度として使用できる。僅かに相違す
るハウスキーピング遺伝子の組を使用したこと、そして発現レベルの測定にLigh
tCycler系を使用したことを除いて、正規化操作はＲＮＡ Master Blot User Man
ual、追補Ｃ（1997, Clontech Laboratories, Palo Alto, CA, USA）に記載のも
のと本質的に同一であった。簡潔に述べると、全ての組織試料における５種類の
ハウスキーピング遺伝子の発現レベルを、LightCyclerおよび一定量（２５.mu.g
）の出発ＲＮＡを使用して、遺伝子あたり３回の独立した反応で測定した。同時
に反応させた既知濃度の標準との比較から導いた各遺伝子についての算出コピー
数を記録し、全組織試料中の遺伝子のコピー数の合計からのパーセンテージに変
換した。次に、各組織試料について、各遺伝子についてのパーセント値の合計を
算出し、各組織の合計パーセント値を、標準として任意に選択した或る１つの組
織の合計パーセント値で除することにより、正規化因子を算出した。或る組織試
料における特定遺伝子の発現について実験的に得られた値を正規化するために、
得られた値に、試験した組織についての正規化因子を掛けた。
【０２３９】 結果を図１１に示すが、ここでは、第一鎖ｃＤＮＡ １０ngあたりのｍＲＮＡ
の実験的に得られたコピー数を左側に、そして正規化した値を右側に示している
。ｃＤＮＡ合成に使用したＲＮＡならびにその供給者およびカタログ番号を第１
表に示す。
【０２４０】
【表１】 全身体スクリーニング組織 組織 供給者 パネル名およびカタログ番号 １．脳 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルＩ、Ｋ４０００−１ ２．心臓 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルＩ、Ｋ４０００−１ ３．腎臓 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルＩ、Ｋ４０００−１ ４．肝臓 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルＩ、Ｋ４０００−１ ５．肺 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルＩ、Ｋ４０００−１ ６．気管 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルＩ、Ｋ４０００−１ ７．骨髄 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルII、Ｋ４００１−１ ８．大腸 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルII、Ｋ４００１−１ ９．小腸 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルII、Ｋ４００１−１ １０．脾臓 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルII、Ｋ４００１−１ １１．胃 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルII、Ｋ４００１−１ １２．胸腺 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルII、Ｋ４００１−１ １３．乳腺 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルIII、Ｋ４００２−１ １４．骨格筋 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルIII、Ｋ４００２−１ １５．前立腺 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルIII、Ｋ４００２−１ １６．精巣 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルIII、Ｋ４００２−１ １７．子宮 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルIII、Ｋ４００２−１ １８．小脳 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルIV、Ｋ４００３−１ １９．胎児脳 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルIV、Ｋ４００３−１ ２０．胎児肝臓 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルIV、Ｋ４００３−１ ２１．脊髄 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルIV、Ｋ４００３−１ ２２．胎盤 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルIV、Ｋ４００３−１ ２３．副腎 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルＶ、Ｋ４００４−１ ２４．膵臓 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルＶ、Ｋ４００４−１ ２５．唾液腺 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルＶ、Ｋ４００４−１ ２６．甲状腺 Clontech ヒト総ＲＮＡパネルＶ、Ｋ４００４−１
【０２４１】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲは、発現が殆ど検出不能である肝臓、骨格筋、および
骨髄という顕著な例外はあるが、まずまず広範に発現される。ＣｙｓＬＴ２様Ｇ
ＰＣＲは肺と免疫系の両方で発現されるという事実の故に、その調節は喘息およ
び関連疾患の経過に大きな影響を及ぼし得る。
【０２４２】 関連するＣｙｓＬＴ１レセプターの発現（下に示す）に比して、ＣｙｓＬＴ２
様ＧＰＣＲは、試験された組織において概してはるかに低いレベルで発現され（
細胞あたりほぼ十分の一の量）、胎盤では相対的により明白な発現を示す。
【０２４３】 参考文献 Higuchi,R., Dollinger,G., Walsh,P.S.およびGriffith,R. (1992) Simultane
ous amplification and detection of specific DNA sequences. BioTechnology
10:413-417。 Higuchi,R., Fockler,C., Dollinger,G.およびWatson,R. (1993) Kinetic PCR
analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. BioTechn
ology 11:1026-1030。 T.B.Morrison, J.J.Weis & C.T.Wittwer (1998) Quantification of low-copy
transcripts by continuous SYBR Green I monitoring during amplification.
Biotechniques 24:954-962。
【０２４４】 Adams,M.D., Kerlavage,A.R., Fields,C. & Venter,C. (1993) 3,400 new exp
ressed sequence tags identify diversity of transcripts in human brain. N
ature Genet. 4:256-265。
【０２４５】 Adams,M.D., et al. (1995) Initial assessment of human gene diversity a
nd expression patterns based upon 83 million nucleotides of cDNA sequenc
e. Nature 377 supp:3-174。
【０２４６】 Liew,C.C., Hwang,D.M., Fung,Y.W., Laurenson,C., Cukerman,E., Tsui,S. &
Lee,C.Y. (1994) A catalog of genes in the cardiovascular system as iden
tified by expressed sequence tags. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:10145-10649
。
【０２４７】実施例１７ ヒト組織におけるＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの相対的発現の定量分析 Higuchi et al., 1992およびHiguchi et al., 1993により最初に記載された「
反応速度分析」と呼ばれる定量的ＰＣＲ分析の型によって定量的発現プロファイ
リングを実施した。その原理は、対数期のＰＣＲのいかなるサイクルにおいても
、産物の量は最初の鋳型コピーの数に比例するということである。
【０２４８】 標的配列に対し相補的な内部消光した蛍光オリゴヌクレオチド（TaqManプロー
ブ）の存在下に増幅を行うと、このプローブはTaq DNAポリメラーゼの５'−３'
エンドヌクレアーゼ活性により開裂し、蛍光色素が媒質中に放出される（Hollan
d et al.）。蛍光の放射は特異的増幅産物の量に直接比例して増加するため、Ｐ
ＣＲ産物の対数期が検出でき、最初の鋳型濃度の決定に使用できる（Heid et al
., 1996、およびGibson et al., 1996）。
【０２４９】 内因性調節の増幅を実施して、反応に添加する試料ＲＮＡの量を標準化するこ
とができる。この種の実験では、好まれる対照は１８ＳリボソームＲＮＡである
。異なる放射スペクトルのリポーター色素が入手できることから、標的および内
因性対照は、異なる色素で標識したプローブを使用するならば、同じ管内で個別
に定量することができる。
【０２５０】 蛍光の「実時間ＰＣＲ」測定は全てABI Prism 7700配列検出機系（PE Applied
Biosystems, Foster City, CA）で行う。
【０２５１】 参考文献 ・Higuchi,R., Dollinger,G., Walsh,P.S. and Griffith,R. 1992. Simultaneou
s amplification and detection of specific DNA sequences. BioTechnology 1
0:413-417。 ・Higuchi,R., Fockler,C., Dollinger,G. and Watson,R. 1993. Kinetic PCR a
nalysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. BioTechnol
ogy 11:1026-1030。 ・Holland,P.M., Abramson,R.D., Watson,R. and Gelfand,D.H. 1991. Detectio
n of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3' e
xonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc.Natl.Acad.
Sci. 88:7276-7280。 ・Heid,C., Stevens,J., Livak,K. and Williams,P.M. 1996. Real time quanti
tative PCR. Geneme Res. 6:986-994。 ・Gibson,U.E., Heid,C.A. and Williams,P.M. 1996. A novel method for real
time quantitative RT-PCR. Genome Res. 6:995-1001。
【０２５２】 ｃＤＮＡの調製 発現の定量に使用した総ＲＮＡを、それらの購入者と共に第２表に列挙する。 各ＲＮＡ５０□gを、以下の反応混合物中、ＤＮアーゼＩにより３７℃で１時
間処理した：
【０２５３】 ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼＩ ０.２U/μL (Roche Diagnostics,ドイツ) ＲＮアーゼインヒビター（PE Applied Biosystems,CA） ０.４U/μL Tris-ＨＣｌ pH７.９ １０mM ＭｇＣｌ２ １０mM ＮａＣｌ ５０mM ＤＴＴ １mM
【０２５４】 インキュベーション後、ＲＮＡを、１容量のフェノール：クロロホルム：イソ
アミルアルコール（２４：２４：１）で１回、そしてクロロホルムで１回抽出し
、１／１０容量の酢酸ナトリウム（３M、pH５.２）および２容量のエタノールで
沈殿させた。
【０２５５】 分光光度的定量の後、購入者のプロトコルに従い各試料をTaqMan逆転写試薬（
PE Applied Biosystem, CA）で逆転写した。反応混合物のＲＮＡ最終濃度は２０
０ng/μLであった。逆転写は２.５μMのランダムヘキサマーで行った。
【０２５６】 TaqMan定量分析 特異的プライマーとプローブをPE Applied Biosystemsの推奨に従って設計し
たが、それを下に列挙する： 前進プライマー：５'−ＴＴＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＡＧＴＧＴＴ−３' 逆プライマー：５'−ＧＴＧＡＣＡＴＧＣＡＧＡＡＧＣＣＧＡＡＡＧ−３' プローブ：５'−(ＦＡＭ)ＴＧＣＧＴＴＴＣＣＴＧＧＣＡＡＴＧＧＴＴＣＡＣ
Ｃ(ＴＡＭＲＡ)−３' ［式中、ＦＡＭ＝６−カルボキシ−フルオレセインであり、ＴＡＭＲＡ＝６−
カルボキシ−テトラメチル−ローダミンである］ このＰＣＲ産物の予想長さは６８bpであった。
【０２５７】 各試料由来の逆転写されたＲＮＡ ５０ngについて定量実験を実施した。それ
ぞれの測定は三重に行った。 ｃＤＮＡの合計含有量を、Pre-Developed TaqMan検定試薬（ＰＤＡＲ）Contro
l Kit（PE Applied Biosystems,CA）を使用して、１８ＳリボソームＲＮＡの同
時定量（複合ＰＣＲ）により正規化した。
【０２５８】 検定反応混合物は以下の通りとした： 最終 TaqMan Universal PCR Master Mix（２ｘ） １ｘ （PE Applied Biosystems,CA） ＰＤＡＲ対照 − １８Ｓ ＲＮＡ（２０ｘ １ｘ 前進プライマー ３００nM 逆プライマー ９００nM プローブ ２００nM ｃＤＮＡ １０nM 水を加えて２５μLとする
【０２５９】 ＰＣＲ条件は、 以下の工程で１回： プレＰＣＲ ５０℃で２分間 ９５℃で１０分間 以下の工程で４０回： 変性 ９５℃で１５秒間 アニーリング／伸長 ６０℃で１分間 とした。
【０２６０】 実験はABI Prism 7700配列検出機（PE Applied Biosystems,CA）で実施した。
操作の最後に、より良いバックグラウンド削減および出発標的の量とのシグナル
直線性を達成するため、ＰＣＲ中に得られた蛍光データを、ABI Prism 7700使用
者マニュアルに記載のように処理した。 得られた結果を図１２、１３および１４に示す。
【０２６１】
【表２】 ＲＮＡ 購入者およびカタログ番号 ヒト胎児脳 Clontech(CA)640191 ヒト脳 OriGene(MD)HT1001 ヒト筋肉 OriGene(MD)HT1008 ヒト心臓 OriGene(MD)HT1002 ヒト肺 OriGene(MD)HT1009 ヒト腎臓 OriGene(MD)HT1003 ヒト肝臓 OriGene(MD)HT1005 ヒト胸腺 Clontech(CA)640281 ヒト精巣 OriGene(MD)HT1011 ヒト大腸 OriGene(MD)HT1015 ヒト胎盤 OriGene(MD)HT1013 ヒト気管 Clontech 640911 ヒト膵臓 Clontech 640311 ヒト胃粘膜 剖検より ヒト胎児肝臓 Clontech(CA)640181 ヒト膀胱 Invitrogen(CA)D602001 ヒト前立腺 Clontech(CA)640381 ヒト副腎 Clontech(CA)640161 ヒト脾臓 OriGene(MD)HT1004 ヒト肥大性前立腺 剖検より ヒト前立腺 剖検より ヒト小脳 Clontech(CA)640351 ヒト脳 剖検より ヒト視床下部 剖検より ヒト皮質 剖検より ヒト扁桃 剖検より ヒト扁桃 剖検より ヒト小脳 剖検より ヒト海馬 剖検より ヒト脈絡叢 剖検より ヒト視床 剖検より ヒト脊髄 Clontech(CA)K40031 ヒトＤＲＧ 剖検より
【０２６２】実施例１８ 細胞のカルシウム動員に及ぼすＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲアンタゴニストの効果 材料および方法 プラスミド、トランスフェクションおよび細胞培養 ヒトＣｙｓＬＴ１レセプター（ＣｙｓＬＴ１Ｒ）およびヒトＣｙｓＬＴ２レセ
プター（ＣｙｓＬＴ２Ｒ）をコードしているｃＤＮＡのクローニングを実施した
。ＣｙｓＬＴ１Ｒの翻訳オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含むHindII
I-NotI断片（１.２kb）およびＣｙｓＬＴ２ＲのＯＲＦを含むEcoRI断片（１.４k
b）をそれぞれ哺乳動物エピソーム性発現プラスミドｐＥＡＫ１０（Edge Biosys
tems）中にサブクローニングした。この発現プラスミドをLipofectamin Plus（G
ibco）を使用し製造者の指示に従ってＰＥＡＫ−安定細胞（Edge Biosystems）
中にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、１０％ＦＣＳ、ペ
ニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミンおよび漸増濃度のピューロマイ
シン（０.５−２μg/ml）を添加したＤ−ＭＥＭで３週間培養し、安定にトラン
スフェクトされた細胞を選択した。得られたピューロマイシン耐性細胞を２μg/
mlピューロマイシンを含有する培地で培養し続けた。マウスプレＢセルラインＬ
１.２は１０％ＦＣＳおよびペニシリン／ストレプトマイシン／Ｌ−グルタミン
を添加したＲＰＭＩ１６４０で培養した。
【０２６３】 カルシウム動員検定 トランスフェクトされた細胞は培養フラスコに緩やかに付着していた。そこで培
地を２９３−ＳＦＭ II（Gibco）に交換しフラスコを叩くことによってこれを懸
濁させた。この細胞懸濁液を洗浄溶液（２０mM Hepesおよび０.１％ＢＳＡを添
加したハンクス均衡塩溶液）で１回洗浄し、１mMプロベネシド（Sigma）を含有
する洗浄溶液中２□M Fluo-3 AM（Molecular Probes）によって周囲温度で１時
間ロードした。１mMプロベネシドを含有する洗浄溶液で１回洗浄した後、この細
胞を、ウェルあたり５０００細胞の密度で透明底の黒色３８４ウェルプレート（
Nunc）のウェルに蒔いた。アンタゴニストの評価のため、アンタゴニストの希釈
系列を刺激の５分前にウェルに加えた。細胞内カルシウム動員をFDSS-6000(Hama
matsu-Photonics)により監視した。蛍光の変化として得られたカルシウム動員デ
ータを、刺激無しの初期蛍光計数値の比として算出した。
【０２６４】 その他の試薬 montelukast、pranlukastおよびBay y8943は合成した。Bay y9773はBiomolか
ら購入した。ロイコトリエンＤ４（ＬＴＤ４）およびプロテアーゼ活性化された
レセプター−１（ＰＡＲ−１）活性化ペプチド（H-Ser-Phe-Lue-Lue-Arg-Asn-NH
2）はそれぞれSigmaおよびBachemから購入した。
【０２６５】 得られた結果を図１５、１６および１７に示す。 図１５は、レセプタートランスフェクトされた細胞における、ｃｙｓＬＴＲ依
存性カルシウム動員の速度論的研究を示す。ＣｙｓＬＴ２Ｒ（Ａ）、ＣｙｓＬＴ
１Ｒ（Ｂ）および空のベクター（Ｃ）の発現プラスミドで安定にトランスフェク
トされたＰＥＡＫ安定性細胞を、示された濃度のＬＴＤ４で刺激した。ＬＴＤ４
は測定開始の１０秒後に加えた。内因性ｃｙｓＬＴ１Ｒを発現するマウスプレＢ
セルラインＬ１.２もまた試験した（Ｄ）。 図中のＬＴＤ−６、ＬＴＤ−７、ＬＴＤ−８ ・・・・・・ は、１０−６Ｍ、１０− ７ Ｍ、１０−８Ｍ ・・・・・・ のＬＴＤ４を意味する。
【０２６６】 図１６は、レセプタートランスフェクト細胞におけるＬＴＤ４により誘発され
たカルシウム動員に及ぼすＣｙｓＬＴＲアンタゴニストの効果を示す。moteluka
stおよびpranlukastをＣｙｓＬＴ２Ｒ（上）またはＣｙｓＬＴ１Ｒ（下）依存カ
ルシウム動員について試験した。ＬＴＤ４添加による蛍光変化の５０秒間の積分
を、ＬＴＤ４濃度（Ｘ軸）に対してプロットした（Ｚ軸）。各々のデータは１回
の実験における６個の検定点の平均である。
【０２６７】 図１７は、レセプタートランスフェクト細胞における、ＬＴＤ４により誘発さ
れたカルシウム動員に及ぼすＣｙｓＬＴＲアンタゴニストの効果を示す。図１５
の結果をアンタゴニストの濃度（横座標）対阻害％（縦座標）に変換した。アン
タゴニストの効果は、それぞれＣｙｓＬＴ２ＲおよびＣｙｓＬＴ１Ｒトランスフ
ェクト細胞について２nMおよび０.２nM ＬＴＤ４に対して評価した。プロテアー
ゼ活性化レセプター−１（ＰＡＲ−１）は、ＰＥＡＫ−安定細胞の内因性Ｇｐ−
結合レセプターである。１０μMのＰＡＲ−１活性化ペプチドを使用して、空の
ベクターで安定にトランスフェクトされた細胞上の該レセプターを刺激した。選
択したアゴニスト濃度は各レセプターによって最大反応の５０−７０％を与えた
。
【０２６８】実施例１９ ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲに対する特異的分子の結合および結合阻害 ＣｙｓＬＴ２レセプター結合検定のための膜の調製 ＣｙｓＬＴ２発現ベクターで形質転換したピーク安定細胞を、１０％ＦＣＳお
よび２μg/mlのピューロマイシンを添加したＤ−ＭＥＭに維持した。細胞を集め
、膜を調製するまで−８０℃に維持した。凍結細胞を、冷却した膜調製緩衝液（
５０mM Tris-HCl pH７.５、プロテアーゼインヒビター混合物（#1873580、Roche
））に懸濁し、Polytron（カタログ番号PT10-35、Kinematica AG, スイス）で破
壊した。破壊した細胞を４℃、５００ｘｇで５分間遠心分離して核画分を除去し
、上清を高速遠心分離（４５０００ｘｇ、１５分間、４℃）にかけて膜画分を沈
殿させた。上清を除去した後、膜調製緩衝液をこのペレットに加え、氷上で穏や
かにホモジナイズした。この膜懸濁液に、安定剤としてグリセロール（最終濃度
；１０％）および牛血清アルブミン（最終濃度；０.５％、カタログ番号Ａ−３
０５９、Sigma）を添加した。次に、膜懸濁液を小バイアルに分注し、液体窒素
中で凍結させた。１時間の凍結後、使用時までバイアルを−８０℃で保存した。
【０２６９】 飽和結合 ロイコトリエンＤ４（ＬＴＤ４）および［３Ｈ］−標識ＬＴＤ４を購入した（
それぞれカタログ番号２０３１０、Cayman Chemical、カタログ番号ＮＥＴ−１
０１９、NEN）。飽和結合のため、［３Ｈ］−標識ＬＴＤ４を非標識ＬＴＤ４と
混合して比放射能を低下させた。総結合の測定のため、２倍連続希釈した［３Ｈ
］−標識ＬＴＤ４と上記のように調製した膜（最終濃度；５０□g/ml）とを、９
６ウェルポリプロピレンプレート（カタログ番号３７９４、Costar）を使用して
、結合緩衝液（５０mM Tris-HCl pH７.４、４０mM ＭｇＣｌ２、５mM Ｌ−セリ
ン、５mM硼酸、５mM Ｌ−システイン、１００μM Ｓ−ヘキシルグルタチオン、
０.１％ ＢＳＡ）１２０□l中、室温で２時間インキュベートした。この結合反
応の終了時に、反応混合物１００μlを９６ウェル濾過プレート（カタログ番号
ＭＡＦＢ−Ｎ０Ｂ、Millipore）に移し、冷結合緩衝液２００μl/ウェルで３回
洗浄した。２μlのＬＴＤ４の存在下での並行インキュベートにより非特異結合
を測定した。特異結合（総結合−非特異結合）は液体シンチレーションカウンタ
ー（TopCount(登録商標)、Packard）によって測定した。次いでこの特異結合を
スキャッチャードプロットに変換してＫｄ値を算出した。スキャッチャードプロ
ットの図において、ＣｙｓＬＴ２に対する［３Ｈ］ＬＴＤ４のＫｄは７.５nMと
算出された。
【０２７０】 ＣｙｓＬＴ２に対する［３Ｈ］ＬＴＤ４−特異的結合の競合 ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）、ＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４を購入
した（それぞれカタログ番号２０１１０、カタログ番号２０２１０、カタログ番
号２０３１０、カタログ番号２０４１０、Cayman Chemical）。３倍連続希釈し
たそれぞれの非標識ロイコトリエン、膜（最終濃度；５０□g/ml）、および［３ Ｈ］−標識ＬＴＤ４（０.４nM）を、９６ウェルポリプロピレンプレートを使用
し、結合緩衝液１２０μl中、室温で２時間インキュベートした。この結合反応
の終了時に、反応混合物１００μlを９６ウェル濾過プレート（カタログ番号MAF
B-N0B、Millipore）に移し、冷結合緩衝液２００μl/ウェルで３回洗浄した。２
μMのＬＴＤ４の存在下での並行インキュベートにより非特異結合を測定した。
特異結合（総結合−非特異結合）を液体シンチレーションカウンター（TopCount
(登録商標)、Packard）によって測定し、図に相対結合（％）として表した。Ｌ
ＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４のＩＣ５０値はそれぞれ６nM、８nM、および２
００nMと算出された。しかしながら１０−６Ｍまでの濃度のＬＴＢ４は、Ｃｙｓ
ＬＴ２に対する［３Ｈ］ＬＴＤ４の結合を阻害しなかった。
【０２７１】 幾つかのアンタゴニストを用いる阻害検定 ３倍連続希釈したBay y9773、montelukast、またはpranlukast、膜（最終濃度
；５０μg/ml）、および［３Ｈ］−標識ＬＴＤ４（０.４nM）を、９６ウェルポ
リプロピレンプレートを使用して、結合緩衝液１２０μl中、室温で２時間イン
キュベートした。［３Ｈ］ＬＴＤ４の特異結合を上記の方法によって測定し、図
に相対阻害（％）として表した。Bay y9773、Bay y8934、montelukast、およびp
ranlukastのＩＣ５０値はそれぞれ２μM、１μM、３０μMおよび８μMと算出され
た。
【０２７２】 得られた結果を図１８、１９および２０に示す。 図１８は、ＣｙｓＬＴ２を発現する安定なトランスフェクト体（Ａ）の膜に対
する［３Ｈ］ＬＴＤ４の飽和結合、および、Ａの示す飽和結合のスキャッチャー
ド分析を示す。ＣｙｓＬＴ２に対する［３Ｈ］ＬＴＤ４のＫｄは７,５nMと算出
された。
【０２７３】 図１９は、ＣｙｓＬＴ２に対する［３Ｈ］ＬＴＤ４−特異的結合についての競
合を示す。ＬＴＣ４、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４は、ＣｙｓＬＴ２を発現する安定
なトランスフェクト体の膜に対する［３Ｈ］ＬＴＤ４の結合を阻害する。ＬＴＣ４ 、ＬＴＤ４およびＬＴＥ４のＩＣ５０値はそれぞれ６nM、８nM、および２００
０nMである。しかしながら１０−６Mまでの濃度のＬＴＢ４は、［３Ｈ］ＬＴＤ
４の結合を阻害しなかった。
【０２７４】 図２０は、［３Ｈ］ＬＴＤ４／ＣｙｓＬＴ２結合に関する幾つかのアンタゴニ
ストを用いた阻害検定を示す。Bay y9773、montelukast、およびpranlukastは ＣｙｓＬＴ２を発現する安定な形質転換体由来の膜に対する［３Ｈ］ＬＴＤ４の
結合を阻害した。Bay y9773、montelukast、およびpranlukastのＩＣ５０値はそ
れぞれ２μM、３０μM、および８μMである。
【０２７５】
【図面の簡単な説明】
【図１】 ＳＷＩＳＳ│Ｑ１３３０４│ＧＰＲＨ＿ＨＵＭＡＮ（配列番号３
）に対する３８＿ＴＲ１（配列番号２）のＢＬＡＳＴＰ（アラインメント）整列
。
【図２】 BLOCKS検索結果。
【図３】 ｔｒｅｍｂｌ│ＡＦ１１９７１１│ＡＦ１１９７１１＿１に対す
る配列番号２のBLASTPアラインメント。
【図４】 ｔｒｅｍｂｌ│Ｙ１２５４６│ＨＳＰ２ＹＬＧ＿１に対する配列
番号２のBLASTPアラインメント。
【図５】 呼吸細胞および組織におけるヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの相対
発現。
【図６】 種々のヒト組織および好中球様セルラインＨＬ６０におけるヒト
ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの相対発現。
【図７】 ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの膜貫通ドメインおよびアミノ酸配
列。
【図８】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているＤＮＡ配
列。
【図９】 図８のＤＮＡ配列から推定したアミノ酸配列。
【図１０】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしているＤＮＡ
配列。
【図１１】 ＣｙｓＬＴ１ ＧＰＣＲ（Ｂ）と比較したヒトＣｙｓＬＴ２様
ＧＰＣＲ（Ａ）の定量的発現。
【図１２】 特異的組織および臓器におけるヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの
定量的発現。
【図１３】 特異的組織および臓器におけるヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの
定量的発現。
【図１４】 特異的組織および臓器におけるヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの
定量的発現。
【図１５】 細胞のカルシウム動員に及ぼすＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲアンタ
ゴニストの効果。
【図１６】 細胞のカルシウム動員に及ぼすＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲアンタ
ゴニストの効果。
【図１７】 細胞のカルシウム動員に及ぼすＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲアンタ
ゴニストの効果。
【図１８】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲに対する特異的分子の結合および結合
阻害。
【図１９】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲに対する特異的分子の結合および結合
阻害。
【図２０】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲに対する特異的分子の結合および結合
阻害。
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】平成１５年３月１４日（２００３．３．１４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｐ 1/04 ４Ｃ０８４ 48/00 1/14 ４Ｃ０８５ Ａ６１Ｐ 1/04 7/10 ４Ｃ０８６ 1/14 9/00 ４Ｈ０４５ 7/10 9/04 9/00 9/10 9/04 9/12 9/10 11/06 9/12 13/08 11/06 19/02 13/08 19/08 19/02 25/00 19/08 25/04 25/00 25/16 25/04 25/18 25/16 25/20 25/18 25/22 25/20 25/28 25/22 29/02 25/28 31/00 29/02 35/00 31/00 37/08 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 37/08 19/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｎ 1/15 19/00 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｍ 33/50 33/566 33/53 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/00 Ａ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 DA36 FB02 FB03 4B024 AA01 AA11 BA63 CA04 CA11 HA01 HA14 4B063 QA01 QA18 QA19 QQ43 QR32 QR35 QR77 QR82 QS34 4B064 AG20 CA19 CC24 DA01 DA13 4B065 AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA06 AA07 AA13 AA17 BA01 BA08 BA22 BA23 CA17 MA01 NA14 ZA012 ZA022 ZA052 ZA082 ZA152 ZA162 ZA182 ZA222 ZA372 ZA402 ZA422 ZA432 ZA592 ZA662 ZA682 ZA692 ZA702 ZA812 ZA832 ZA962 ZA972 ZB112 ZB132 ZB262 ZB322 4C085 AA13 AA14 CC32 DD62 EE01 GG01 4C086 AA01 AA02 AA03 AA04 EA16 MA01 MA04 NA14 ZA01 ZA02 ZA05 ZA08 ZA15 ZA16 ZA18 ZA22 ZA37 ZA40 ZA42 ZA43 ZA59 ZA66 ZA68 ZA69 ZA70 ZA81 ZA83 ZA96 ZA97 ZB11 ZB13 ZB26 ZB32 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA50 EA21 EA22 EA23 FA74

Claims (79)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている単離
    されたポリヌクレオチドであって、 ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも約３９％一致するアミノ酸配
    列；および、 配列番号２に示すアミノ酸配列、 より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチ
    ドをコードしているポリヌクレオチド； ｂ）配列番号１または３で示される配列を含むポリヌクレオチド； ｃ）（ａ）および（ｂ）に明記したポリヌクレオチドとストリンジェントな条
    件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド； ｄ）遺伝コードの縮重のため、その配列が（ａ）から（ｃ）に明記するポリヌ
    クレオチド配列から逸脱している配列のポリヌクレオチド；および、 ｅ）（ａ）から（ｄ）に明記したポリヌクレオチド配列の断片、誘導体または
    アレル変異を表すポリヌクレオチド、 より成る群から選ばれるポリヌクレオチド。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを含む発現ベクタ
    ー。
  3. 【請求項３】 請求項２に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
  4. 【請求項４】 請求項１に記載のポリヌクレオチドによりコードされている
    、実質上精製されたＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチド。
  5. 【請求項５】 以下の工程： ａ）請求項３に記載の宿主細胞を、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドの発
    現に好適な条件下で培養し；そして、 ｂ）ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドを宿主細胞培養から回収する、 を含む、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドを調製する方法。
  6. 【請求項６】 以下の工程： ａ）請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドを生体試料の核酸材料とハイブ
    リダイズさせ、それによりハイブリダイゼーション複合体を形成し；そして、 ｂ）該ハイブリダイゼーション複合体を検出する、 を含む、生体試料中の、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドをコードしている
    ポリヌクレオチドを検出するための方法。
  7. 【請求項７】 ハイブリダイゼーションの前に、生体試料の核酸材料を増幅
    させる、請求項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】 生体試料を、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求
    項４に記載のＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドと特異的に相互作用する試薬
    と接触させる工程、 を含む、請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項４に記載のＣｙｓＬＴ
    ２様ＧＰＣＲポリペプチドを検出するための方法。
  9. 【請求項９】 請求項６から８までのいずれかに記載の方法を実施するため
    の診断キット。
  10. 【請求項１０】 被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチド
    によりコードされる任意のＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドと接触させ； ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工
    程、 を含む、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの活性を低下させる物質をスクリーニングする
    方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物を、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣ
    Ｒの活性を低下させる可能性ある治療物質として同定する方法。
  11. 【請求項１１】 被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチド
    によりコードされるＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドと接触させ；そして、 該ポリペプチドのＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ活性を検出する工程、 を含む、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの活性を調節する物質をスクリーニングする方
    法であって、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ活性を増大させる被験化合物を、ＣｙｓＬ
    Ｔ２様ＧＰＣＲの活性を増大させる可能性ある治療物質として同定し、そして該
    ポリペプチドのＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ活性を低下させる被験化合物を、Ｃｙｓ
    ＬＴ２様ＧＰＣＲの活性を低下させる可能性ある治療物質として同定する方法。
  12. 【請求項１２】 被験化合物を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチド
    と接触させ；そして、 該ポリヌクレオチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、 を含む、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの活性を低下させる物質をスクリーニングする
    方法であって、該ポリヌクレオチドに結合する被験化合物を、ＣｙｓＬＴ２様Ｇ
    ＰＣＲの活性を低下させる可能性ある治療物質として同定する方法。
  13. 【請求項１３】 細胞を、請求項１に記載の任意のポリヌクレオチドまたは
    請求項４に記載の任意のＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドに特異的に結合す
    る試薬と接触させ、それによりＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの活性を減少させる工程
    、 を含む、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの活性を減少させる方法。
  14. 【請求項１４】 請求項１０から１２のいずれかに記載の方法によって同定
    される、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲポリペプチドまたはポリヌクレオチドの活性を
    調整する試薬。
  15. 【請求項１５】 請求項２に記載の発現ベクターまたは請求項１４に記載の
    試薬および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
  16. 【請求項１６】 疾病においてＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲの活性を調整するた
    めの、請求項１５に記載の医薬組成物の使用。
  17. 【請求項１７】 該疾病が中枢もしくは末梢神経系疾患、喘息または心血管
    疾患である、請求項１６に記載の使用。
  18. 【請求項１８】 配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
    ドしているｃＤＮＡ。
  19. 【請求項１９】 配列番号１を含む請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
  20. 【請求項２０】 配列番号１より成る請求項１８に記載のｃＤＮＡ。
  21. 【請求項２１】 配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
    ドしているポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
  22. 【請求項２２】 該ポリヌクレオチドが配列番号１より成る、請求項２１に
    記載の発現ベクター。
  23. 【請求項２３】 配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
    ドしている発現ベクターを含む宿主細胞。
  24. 【請求項２４】 該ポリヌクレオチドが配列番号１より成る、請求項２３に
    記載の宿主細胞。
  25. 【請求項２５】 配列番号２に示すアミノ酸配列を含む精製されたポリペプ
    チド。
  26. 【請求項２６】 配列番号２に示すアミノ酸配列より成る請求項２５に記載
    の精製されたポリペプチド。
  27. 【請求項２７】 配列番号２に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドを含
    む融合蛋白。
  28. 【請求項２８】 配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを調製
    する方法であって、該ポリペプチドをコードしている発現ベクターを含む宿主細
    胞を、該ポリペプチドが発現される条件下で培養し；そして該ポリペプチドを単
    離する工程を含む方法。
  29. 【請求項２９】 発現ベクターが配列番号１を含む、請求項２８に記載の方
    法。
  30. 【請求項３０】 配列番号１に記載の１１個の連続ヌクレオチドを含むポリ
    ヌクレオチドを生体試料の核酸材料とハイブリダイズさせ、それによりハイブリ
    ダイゼーション複合体を形成し；そして、 該ハイブリダイゼーション複合体を検出する、 工程を含む、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード化配列
    を検出する方法。
  31. 【請求項３１】 ハイブリダイズする工程の前に核酸材料を増幅する工程を
    さらに含む、請求項３０に記載の方法。
  32. 【請求項３２】 配列番号１に記載の１１個の連続ヌクレオチドを含むポリ
    ヌクレオチド；および、請求項３０に記載の方法のための使用説明書、 を含む、配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドのコード化配列を検
    出するためのキット。
  33. 【請求項３３】 配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出
    する方法であって、生体試料を該ポリペプチドに特異的に結合する試薬と接触さ
    せて試薬−ポリペプチド複合体を形成し；そして、この試薬−ポリペプチド複合
    体を検出する工程を含む方法。
  34. 【請求項３４】 該試薬が抗体である、請求項３３に記載の方法。
  35. 【請求項３５】 配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを検出
    するためのキットであって、該ポリペプチドに特異的に結合する抗体；および、
    請求項３３に記載の方法のための使用説明書、を含むキット。
  36. 【請求項３６】 被験化合物を、（１）配列番号２に示すアミノ酸配列と少
    なくとも約３９％一致するアミノ酸配列、および（２）配列番号２に示すアミノ
    酸配列、より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させ；
    そして、 該ポリペプチドに対する被験化合物の結合を検出する工程、 を含む、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白の活性を調節できる物質をスクリーニング
    する方法であって、該ポリペプチドに結合する被験化合物をＣｙｓＬＴ２様ＧＰ
    ＣＲ蛋白の活性を調節する可能性ある物質と同定する方法。
  37. 【請求項３７】 接触させる工程が細胞内においてである、請求項３６に記
    載の方法。
  38. 【請求項３８】 細胞がインビトロである、請求項３６に記載の方法。
  39. 【請求項３９】 接触させる工程が無細胞系においてである、請求項３６に
    記載の方法。
  40. 【請求項４０】 該ポリペプチドが検出可能な標識を含む、請求項３６に記
    載の方法。
  41. 【請求項４１】 被験化合物が検出可能な標識を含む、請求項３６に記載の
    方法。
  42. 【請求項４２】 被験化合物が該ポリペプチドに結合している標識リガンド
    に取って代わる、請求項３６に記載の方法。
  43. 【請求項４３】 該ポリペプチドが固体支持体に結合している、請求項３６
    に記載の方法。
  44. 【請求項４４】 被験化合物が固体支持体に結合している、請求項３６に記
    載の方法。
  45. 【請求項４５】 被験化合物を、（１）配列番号２に示すアミノ酸配列と少
    なくとも約３９％一致するアミノ酸配列、および（２）配列番号２に示すアミノ
    酸配列、より成る群から選ばれるアミノ酸配列を含むポリペプチドと接触させ；
    そして、 該ポリペプチドの活性を検出する工程、 を含む、ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白の活性を調節する物質をスクリーニン
    グする方法であって、該ポリペプチドの活性を増大させる被験化合物を、ヒトＣ
    ｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白の活性を増大させる可能性ある物質として同定し、そ
    して該ポリペプチドの活性を低下させる被験化合物を、ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰ
    ＣＲ蛋白の活性を低下させる可能性ある物質として同定する方法。
  46. 【請求項４６】 接触させる工程が細胞においてである、請求項４５に記載
    の方法。
  47. 【請求項４７】 細胞がインビトロである、請求項４５に記載の方法。
  48. 【請求項４８】 接触させる工程が無細胞系においてである、請求項４５に
    記載の方法。
  49. 【請求項４９】 該活性がサイクリックＡＭＰ形成である、請求項４５に記
    載の方法。
  50. 【請求項５０】 該活性が細胞内カルシウム動員である、請求項４５に記載
    の方法。
  51. 【請求項５１】 該活性がホスホイノシチド代謝である、請求項４５に記載
    の方法。
  52. 【請求項５２】 被験化合物を、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含む
    ポリヌクレオチドによりコードされている産物と接触させ；そして、 該産物に対する被験化合物の結合を検出する工程、 を含む、ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白の活性を調節する物質をスクリーニン
    グする方法であって、該産物に結合する被験化合物をヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣ
    Ｒ蛋白の活性を調節する可能性ある物質として同定する方法。
  53. 【請求項５３】 該産物がポリペプチドである、請求項５２に記載の方法。
  54. 【請求項５４】 該産物がＲＮＡである、請求項５２に記載の方法。
  55. 【請求項５５】 細胞を、配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌ
    クレオチドによりコードされている産物に特異的に結合する試薬と接触させ、そ
    れによりヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白の活性を減少させる工程、 を含む、ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白の活性を減少させる方法。
  56. 【請求項５６】 該産物がポリペプチドである、請求項５５に記載の方法。
  57. 【請求項５７】 該試薬が抗体である、請求項５６に記載の方法。
  58. 【請求項５８】 該産物がＲＮＡである、請求項５５に記載の方法。
  59. 【請求項５９】 該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項
    ５８に記載の方法。
  60. 【請求項６０】 該試薬がリボザイムである、請求項５８に記載の方法。
  61. 【請求項６１】 細胞がインビトロである、請求項５５に記載の方法。
  62. 【請求項６２】 細胞がインビボである、請求項５５に記載の方法。
  63. 【請求項６３】 配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異
    的に結合する試薬；および、製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
  64. 【請求項６４】 該試薬が抗体である、請求項６３に記載の医薬組成物。
  65. 【請求項６５】 配列番号１に示すヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチ
    ドの産物に特異的に結合する試薬；および、製薬的に許容し得る担体、を含む医
    薬組成物。
  66. 【請求項６６】 該試薬がリボザイムである、請求項６５に記載の医薬組成
    物。
  67. 【請求項６７】 該試薬がアンチセンスオリゴヌクレオチドである、請求項
    ６５に記載の医薬組成物。
  68. 【請求項６８】 該試薬が抗体である、請求項６５に記載の医薬組成物。
  69. 【請求項６９】 配列番号２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコー
    ドしている発現ベクター；および製薬的に許容し得る担体、を含む医薬組成物。
  70. 【請求項７０】 発現ベクターが配列番号１を含む、請求項６９に記載の医
    薬組成物。
  71. 【請求項７１】 ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白の機能を阻害する試薬の
    治療的有効量をそれを必要とする患者に投与し、それによりＣｙｓＬＴ２様ＧＰ
    ＣＲの症状を改善する工程を含む、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲを処置する方法。
  72. 【請求項７２】 該試薬が請求項３６に記載の方法によって同定される、請
    求項７１に記載の方法。
  73. 【請求項７３】 該試薬が請求項４５に記載の方法によって同定される、請
    求項７１に記載の方法。
  74. 【請求項７４】 該試薬が請求項５２に記載の方法によって同定される、請
    求項７１に記載の方法。
  75. 【請求項７５】 ヒトＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ蛋白の機能を阻害する試薬の
    治療的有効量をそれを必要とする患者に投与し、それによりＣｙｓＬＴ２様ＧＰ
    ＣＲ疾患の症状を改善する工程を含む、ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ疾患を処置する
    方法。
  76. 【請求項７６】 該試薬が請求項３６に記載の方法によって同定される、請
    求項７５に記載の方法。
  77. 【請求項７７】 該試薬が請求項４５に記載の方法によって同定される、請
    求項７５に記載の方法。
  78. 【請求項７８】 該試薬が請求項５２に記載の方法によって同定される、請
    求項７５に記載の方法。
  79. 【請求項７９】 ＣｙｓＬＴ２様ＧＰＣＲ疾患が末梢もしくは中枢神経系疾
    患、喘息または心血管疾患である、請求項７５に記載の方法。
JP2001575619A 2000-04-07 2001-04-06 ヒトｃｙｓｌｔ２様ｇｐｃｒ蛋白の調節 Withdrawn JP2003530121A (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19519600P 2000-04-07 2000-04-07
US60/195,196 2000-04-07
US25487600P 2000-12-13 2000-12-13
US60/254,876 2000-12-13
PCT/EP2001/003981 WO2001077149A2 (en) 2000-04-07 2001-04-06 Regulation of human cyslt2-like gpcr protein

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2003530121A true JP2003530121A (ja) 2003-10-14

Family

ID=26890779

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001575619A Withdrawn JP2003530121A (ja) 2000-04-07 2001-04-06 ヒトｃｙｓｌｔ２様ｇｐｃｒ蛋白の調節

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20020155528A1 (ja)
EP (1) EP1274841A2 (ja)
JP (1) JP2003530121A (ja)
AU (1) AU2001254790A1 (ja)
WO (1) WO2001077149A2 (ja)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004500864A (ja) * 2000-06-06 2004-01-15 メルク　パテント　ゲゼルシャフト　ミット　ベシュレンクテル　ハフトング 新規ｇ−タンパク質共役型受容体
US7531310B2 (en) 2000-11-17 2009-05-12 Bristol-Myers Squibb Company Methods of diagnosing Crohn's disease by measuring expression level of RNA encoding human G-protein coupled receptor, HGPRBMY11
CN1894419A (zh) * 2003-06-27 2007-01-10 纽约州立大学研究基金会 测定mtp活性的荧光分析方法
US20090047700A1 (en) * 2004-06-25 2009-02-19 Hussain M Mahmood Flourescence Assay for MTP Activity
US7977359B2 (en) 2005-11-04 2011-07-12 Amira Pharmaceuticals, Inc. 5-lipdxygenase-activating protein (FLAP) inhibitors
GB2431927B (en) 2005-11-04 2010-03-17 Amira Pharmaceuticals Inc 5-Lipoxygenase-activating protein (FLAP) inhibitors

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1213353B1 (en) * 1999-09-14 2005-11-16 Astellas Pharma Inc. Peptide leukotriene receptor
EP1242448A2 (en) * 1999-11-17 2002-09-25 Arena Pharmaceuticals, Inc. Endogenous and non-endogenous versions of human g protein-coupled receptors
AU2001239756A1 (en) * 2000-02-08 2001-08-20 Curagen Corporation Novel proteins and nucleic acids encoding same
GB0003079D0 (en) * 2000-02-10 2000-03-29 Glaxo Group Ltd Novel protein

Also Published As

Publication number Publication date
EP1274841A2 (en) 2003-01-15
AU2001254790A1 (en) 2001-10-23
WO2001077149A3 (en) 2002-02-21
WO2001077149A2 (en) 2001-10-18
US20020155528A1 (en) 2002-10-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1287133A2 (en) Regulation of human dopamine-like g protein-coupled receptor
US20060052329A1 (en) Regulation of human P2Y1-like G protein-coupled receptor
EP1266005B1 (en) Regulation of human lipoxin a4 receptor-like protein
JP2003530121A (ja) ヒトｃｙｓｌｔ２様ｇｐｃｒ蛋白の調節
JP2008188011A (ja) ヒトケモカイン様レセプターの調節
WO2001070814A2 (en) Regulation of human rta-like g protein-coupled receptor
US20030109673A1 (en) Regulation of human hm74-like g protein coupled receptor
US20030166600A1 (en) Regulation of human isotocin-like g protein-coupled receptor
US20040136981A1 (en) Regulation of human histamine h2-like g protein-coupled receptor
WO2001068842A2 (en) Regulation of human p2y-like gpcr protein
US20010041355A1 (en) Regulation of human nerve growth factor-related G protein-coupled receptor
US20030049787A1 (en) Regulation of human mas oncogene-related g protein-coupled receptor
EP1276867B1 (en) Use of human latrophilin-like G protein-coupled receptor in screening methods
JP2003532416A (ja) 内皮分化遺伝子６様ｇタンパク質共役受容体
EP1290163A2 (en) Regulation of human serotonin-like g protein-coupled receptor
JP2006500056A (ja) ヒトｐ２ｙ１５ｇタンパク質共役型受容体の調節
US20030157541A1 (en) Regulation of human CycLT2-like GPCR protein
US20030114643A1 (en) Regulation of human serotonin-like g protein-coupled receptor
WO2001085764A2 (en) Regulation of human p2y-like g protein-coupled receptor
EP1688496A2 (en) Regulation of human P2Y1-like G protein-coupled receptor
US20040039170A1 (en) Regulation of human g protein-coupled receptor
US20030166142A1 (en) Regulation of human P2Y - like G protein-coupled receptor
US20050266482A1 (en) Regulation of human CYSLT2-like GPCR protein
US20030109482A1 (en) Regulation of human p2y8-like g protein-coupled receptor
US20030153498A1 (en) Regulation of human rta-like g protein-coupled receptor

Legal Events

Date Code Title Description
A761 Written withdrawal of application

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A761

Effective date: 20070119