ES2319386T3

ES2319386T3 - Proteina 2 del canal del calcio de tipo trp (tlcc-2) humana.

Info

Publication number: ES2319386T3
Application number: ES01926743T
Authority: ES
Inventors: Rory A. J. Curtis; Inmaculada Silos-Santiago
Original assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2009-05-07
Anticipated expiration: 2021-04-06
Also published as: EP1294872B1; WO2001077331A9; US20020035056A1; DE60137222D1; AU2001253258A1; ATE419350T1; US20020197680A1; EP1294872A1; WO2001077331A1

Abstract

Un método para identificar un compuesto que se une a un polipéptido o modula la capacidad de un polipéptido para transportar calcio a través de una membrana, donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en: (i) un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, donde el fragmento comprende al menos 250 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:2; (ii) un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 99% a un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3; (iii) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en 90% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; y ( iv) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, que comprende: (a) poner en contacto el polipéptido, o una célula que expresa el polipéptido con un compuesto de ensayo; y (b) determinar si el compuesto se une al polipéptido o modula la capacidad del polipéptido para transportar calcio a través de una membrana, identificando de ese modo un compuesto que se une al polipéptido o modula la capacidad del polipéptido para transportar calcio a través de una membrana.

Description

Proteína 2 del canal del calcio de tipo TRP (TLCC-2) humana.

Solicitudes relacionadas

La presente solicitud es una continuación de parte de la Solicitud de Patente de los Estados Unidos Núm. de Serie 09/544.797 titulada "54420, A NOVEL HUMAN CALCIUM CHANNEL", presentada el 7 de Abril de 2000.

Antecedentes de la invención

La señalización del calcio ha sido implicada en la regulación de varias respuestas celulares, tales como el crecimiento y la diferenciación. Existen dos métodos generales por los cuales pueden aumentar las concentraciones intracelulares de iones calcio: los iones calcio pueden entrar en la célula desde el medio externo por medio del uso de canales específicos en la membrana celular, o los iones calcio pueden ser liberados de almacenes intracelulares, siendo transportados otra vez por canales específicos de la membrana al orgánulo de almacenamiento. En la situación en la que los almacenes intracelulares de calcio han sido agotados, se activa un tipo específico de canal de calcio, denominado "canal de calcio capacitativo" o se activa el "canal de calcio operado por reservorio" (SOC), en la membrana plasmática para importar iones calcio desde el entorno extracelular al citosol (para una revisión, véase Putney y McKay (1999) BioEssays 21:38-46).

Los miembros de la familia del canal de calcio capacitativo incluyen la corriente de calcio activada por la liberación de calcio (CRAC) (Hoth y Penner (1992) Nature 355: 353-355), la corriente de cationes no selectiva activada por la liberación de calcio (CRANC) (Krause et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 32523-32528), y las proteínas receptoras de potencial transitorio (TRP). No existe un único perfil electrofisiológico característico de la familia; en lugar de eso, se han observado una amplia disposición de conductancias de un único canal, selectividad de cationes, y propiedades de corriente para diferentes canales específicos. Adicionalmente, en diversos casos se ha demostrado que se puede producir una homo- o heteropolimerización de la molécula del canal, que cambia adicionalmente las propiedades del canal, de aquellas para la molécula única. En general, sin embargo, estos canales funcionan de una manera similar, ya que son canales catiónicos permeables a iones calcio que se activan tras la estimulación de la fosfolipasa C_{\beta} por un receptor acoplado a proteínas G. El agotamiento de los almacenes de calcio intracelular activa estos canales mediante un mecanismo que todavía no está definido, pero que se ha demostrado que implica un factor difusible utilizando estudios en los que los almacenes de calcio eran agotados artificialmente (p. ej., mediante la introducción de quelantes en la célula, mediante la activación de la fosfolipasa C_{\gamma}, o mediante la inhibición de aquellas enzimas responsables del bombeo de iones calcio a los almacenes o de aquellas enzimas responsables del mantenimiento de las concentraciones de iones calcio intracelulares en reposo) (Putney, J.W., (1986) Cell Calcium 7: 1-12; Putney, J.W. (1990) Cell Calcium 11:611-624).

La familia del canal TRP es uno de los miembros mejor caracterizados del grupo del canal del calcio capacitativo. Estos canales incluyen la proteína receptora de potencial transitorio y los homólogos de la misma (hasta la fecha, se han identificado siete homólogos y variantes de empalme en una variedad de organismos), los receptores vainilloides (también conocidos como receptores de capsaicina), el canal catiónico no selectivo inhibible por tramos (SIC), el canal mecanosensitivo, olfatorio, el canal de calcio regulado por el factor de crecimiento de tipo insulina I, y el canal de calcio epitelial, apical sensible a la vitamina D(ECaC), melastatina, y la familia de proteínas de la enfermedad poliquística del riñón (véase, p. ej. Montell y Rubin (1989) Neuron 2:1313-1323; Caterina et al. (1997) Nature 389: 816-824; Suzuki et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 6330-6335; Kiselyov et al. (1998) Nature 396: 478-482; Hoenderop et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 8375-8378; y Chen et al. (1999) Nature 401(6751): 383-6). Cada una de esta moléculas tiene 700 aminoácidos de longitud o más (TRP y los homólogos de TRP tienen 1300 restos aminoácido o más), y comparte ciertos rasgos estructurales conservados. Son predominantes entre estos rasgos estructurales seis dominios transmembrana, con un bucle hidrófobo adicional presente entre el quinto y el sexto dominios transmembrana. Se cree que este bucle es esencial para la actividad del poro del canal formado tras la inserción en la membrana (Hardie y Minke (1993) Trends Neurosci 16:371-376). Las proteínas del canal TRP también incluyen uno o más dominios anquirina y presentan frecuentemente una región rica en prolina en el extremo N. Aunque se encuentran en tejidos y organismos dispares, los miembros de la familia de proteínas del canal TRP sirven todos para transducir señales por medio de la entrada de calcio en las células, concretamente señales de dolor (véase, p. ej. McClesky y Gold (1999) Annu. Rev. Physiol. 61: 835-856), señales luminosas (Hardie y Minke, supra), o señales olfatorias (Colbert et al. (1997) J. Neurosci 17(21): 8259-8269). De este modo, esta familia de moléculas puede jugar papeles importantes en la transducción de la señal sensorial en general.

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Los receptores vainilloides (VR) son canales catiónicos no selectivos que están estructuralmente relacionados con los miembros de la familia TRP de canales iónicos. Se ha propuesto que estos receptores median la entrada de calcio extracelular en las células en respuesta al agotamiento de los almacenes de calcio intracelular. Los VR son expresados en las neuronas nociceptivas, así como en otros tipos de células, y son activados por una variedad de estímulos incluyendo calor y protones nocivos. La capsaicina, que es un agonista bien conocido de los VR, induce un comportamiento de dolor en seres humanos y roedores. El VR-1, un receptor vainilloide, fue identificado en ganglios sensoriales de rata (Caterina M. J. et al., (1997) Nature 389:816-824). Se ha demostrado que los ratones con el gen VR-1 inactivado se encuentran dañados en su detección del calor doloroso, muestran un comportamiento de dolor no evocado por vainilloides, y muestran poca hipersensibilidad térmica después de la inflamación (Szallasi y Blumberg (1999) Pharmacol. Rev. 51:159-211; Tominaga, et al. (1998) Neuron 21:531; Caterina et al. (2000)
Science 288:306).

Compendio de la invención

La presente descripción se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de miembros de la familia del receptor de potencial trasitorio novedoso (TRP) (p. ej. un canal del calcio y/o un receptor vainilloide), referidos en la presente memoria como moléculas de ácido nucleico y proteína del canal del calcio de tipo TRP o TLCC-2 (por TRP-like calcium channel). Las moléculas de TLCC-2 de la presente invención son útiles como dianas para desarrollar agentes moduladores para regular una variedad de procedimientos celulares, incluyendo la excitabilidad de la membrana, el sobrecrecimiento de las neuritas y la sinaptogénesis, la transducción de la señal, la proliferación, el crecimiento, la diferenciación, y la migración celular, y la nocicepción. En un aspecto la invención proporciona un método para identificar un compuesto que se une a un polipéptido o modula la capacidad de un polipéptido para transportar calcio a través de la membrana, donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en:

(i): un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, donde el fragmento comprende al menos 250 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:2;

(ii): un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en 99% a un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3;

(iii): un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en 90% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; y

(iv): un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, que comprende:

(a): poner en contacto el polipéptido, o una célula que expresa el polipéptido con un compuesto de ensayo; y

(b): determinar si el compuesto se une al polipéptido o modula la capacidad del polipéptido para transportar calcio a través de una membrana, identificando de ese modo un compuesto que se une al polipéptido o modula la capacidad del polipéptido para transportar calcio a través de una membrana.

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En un aspecto adicional la invención proporciona un método de identificación de una molécula de ácido nucleico asociada con un trastorno con dolor que comprende:

(a): poner en contacto una muestra que comprende moléculas de ácido nucleico con una sonda de hibridación que comprende al menos 25 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1; y

(b): detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en dicha muestra que hibrida con dicha sonda, identificando de ese modo una molécula de ácido nucleico asociada con un trastorno con dolor.

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En un aspecto adicional la invención proporciona un método de identificación de un ácido nucleico asociado con un trastorno con dolor que comprende:

(a): poner en contacto una muestra que comprende moléculas de ácido nucleico con un primer y un segundo cebador de amplificación, comprendiendo dicho primer cebador al menos 25 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO:1 y comprendiendo dicho segundo cebador al menos 25 nucleótidos contiguos del complemento de la SEQ ID NO:1;

(b): incubar dicha muestra en condiciones que permiten la amplificación del ácido nucleico; y

(c): detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico en dicha muestra que es amplificada, identificando de ese modo una molécula de ácido nucleico asociada con un trastorno con dolor.

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En un aspecto adicional la invención proporciona un método de identificación de un polipéptido asociado con un trastorno con dolor que comprende:

(a): poner en contacto una muestra que comprende los polipéptidos con un anticuerpo que se une selectivamente a un polipéptido de la SEQ ID NO:2; y

(b): detectar la presencia de un polipéptido en dicha muestra que se une a dicho anticuerpo, identificando de ese modo un polipéptido asociado con un trastorno con dolor. Preferiblemente dicho anticuerpo esta marcado detectablemente.

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En un aspecto adicional la invención proporciona un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno con dolor que comprende analizar la capacidad del compuesto o agente para modular la expresión de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

(a): una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucléotidos mostrada en la SEQ ID NO:1;

(b): una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:3;

(c): una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en 99% a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3;

(d): una molécula de ácido nucleico que comprende un fragmento de al menos 1850 nucleótidos de un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3;

(e): una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2;

(f): una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos aproximadamente en 90% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2;

(g): una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido que comprende al menos 250 restos aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; y

(h): una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de una cualquiera de las subpartes (a) a (g),

identificando de ese modo un compuesto capaz de tratar un trastorno con dolor.

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En un aspecto adicional la invención proporciona un método para identificar un compuesto capaz de tratar un trastorno con dolor que comprende analizar la capacidad del compuesto o agente para modular la actividad del canal del calcio de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(a): un fragmento de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, donde el fragmento comprende al menos 250 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO:2;

(b): un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en 99% a un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3;

(c): un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica al menos en 90% a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2; y

(d): un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, identificando de ese modo un compuesto capaz de tratar un trastorno con dolor.

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Preferiblemente dicho compuesto inhibe la expresión de la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 o 3. Alternativamente, dicho compuesto inhibe la actividad de un polipéptido de la SEQ ID NO:2.

En un aspecto adicional la invención proporciona un método para identificar un compuesto capaz de modular la nocicepción que comprende:

(a): poner en contacto una célula con un compuesto de ensayo; y

(b): analizar la capacidad del compuesto de ensayo para modular la expresión de un ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste en:

(c): una molécula de ácido nucleico que comprende un secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en 99% a la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO 3;

(h): una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las subpartes (a) a (g),

identificando de ese modo un compuesto capaz de modular la nocicepción.

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(a): poner en contacto una célula con un compuesto de ensayo; y

(b): analizar la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

(iv): un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, identificando de ese modo un compuesto capaz de modular la nocicepción.

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En una realización, una molécula de ácido nucleico de TLCC-2 de la descripción es idéntica en al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a la secuencia de nucleótidos (p. ej., a la longitud completa de la secuencia de nucleótidos) mostrada en el SEQ ID NO:1 o 3.

En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada incluye la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1 o 3, o un complemento de la misma. En otra realización, la molécula de ácido nucleico incluye la SEQ ID NO:3 y los nucleótidos 1-140 de la SEQ ID NO:1. En otra realización más, la molécula de ácido nucleico incluye la SEQ ID NO:3 y los nucleótidos 1884-2095 de la SEQ ID NO:1. En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico consiste en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o 3. En otra realización preferida, la molécula de ácido nucleico incluye un fragmento de al menos 706 nucleótidos (p. ej., 706 nucleótidos contiguos) de la secuencia de nucleótidos de al SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3, o un complemento del mismo.

En otra realización, una molécula de ácido nucleico de TLCC-2 incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos suficientemente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2. En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico de TLCC-2 incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a la longitud completa de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2.

En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada codifica la secuencia de aminoácidos de la TLCC-2 humana. En otra realización preferida más, la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2. En otra realización preferida más, la molécula de ácido nucleico tiene al menos 706 nucleótidos de longitud. En una realización preferida adicional, la molécula de ácido nucleico tiene al menos 706 nucleótidos de longitud y codifica una proteína que tiene una actividad TLCC-2 (como se describe en la presente memoria).

Otra realización de la descripción ofrece moléculas de ácido nucleico, preferiblemente moléculas de ácido nucleico de TLCC-2, que detectan específicamente moléculas de ácido nucleico de TLCC-2 relativas a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas distintas de TLCC-2. Por ejemplo, en una realización, semejante molécula de ácido nucleico tiene al menos 706, 706-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1050, 1050-1070, 1070-1100, 1100-1150, 1150-1200, 1200-1250, 1250-1300, 1300-1350, 1350-1400, 1400-1450, 1450-1500, 1500-1550, 1550-1600, 1600-1650, 1650-1700, 1700-1750, 1750-1800, 1800-1850, 1850-1900, 1900-1950, 1950-2000, 2000-2050, 2050-2100 o más nucleótidos de longitud e hibrida en condiciones restrictivas con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1, o un complemento de la misma.

En las realizaciones preferidas, las moléculas de ácido nucleico tienen al menos 15 nucleótidos (p. ej., 15 contiguos) de longitud e hibridan en condiciones restrictivas con los nucleótidos 1-27 de la SEQ ID NO:1.

En otras realizaciones preferidas, la molécula de ácido nucleico codifica una variante alélica de origen natural de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, donde la molécula de ácido nucleico hibrida con una molécula de ácido nucleico que comprende la SEQ ID NO:1 o 3 en condiciones restrictivas.

Otra realización de la descripción proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que es antisentido con respecto a una molécula de ácido nucleico de TLCC-2, p. ej., la hebra codificante de una molécula de ácido nucleico de TLCC-2.

Otro aspecto de esta descripción ofrece proteínas y polipéptidos TLCC-2 aislados o recombinantes. En una realización, una proteína TLCC-2 aislada tiene uno o más de los siguientes dominios: un dominio transmembrana, un dominio poro, y un dominio rico en prolina. En una realización preferida, una proteína TLCC-2 incluye al menos uno o más de los siguientes dominios: un dominio transmembrana, un dominio poro, y un dominio rico en prolina, y tiene una secuencia de aminoácidos idéntica al menos aproximadamente en un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a la SEQ ID NO:2. En otra realización preferida, una proteína TLCC-2 incluye al menos un dominio transmembrana y tiene una actividad TLCC-2 (como se describe en la presente memoria).

En otra realización preferida más, una proteína TLCC-2 incluye uno o más de los siguientes dominios: un dominio transmembrana, un dominio poro, y un dominio rico en prolina, y está codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de hibridación restrictivas con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o 3.

En otra realización, la descripción ofrece fragmentos de la proteína que tienen la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2, en donde el fragmento comprende al menos 18 o más aminoácidos (p. ej., aminoácidos contiguos) de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2. En otra realización, una proteína TLCC-2 tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2.

En otra realización, la descripción ofrece una proteína TLCC-2 que está codificada por una molécula de ácido nucleico que consiste en una secuencia de nucleótidos idéntica al menos aproximadamente en un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% a una secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o 3, o un complemento de la misma. Esta invención ofrece una proteína TCCL-2, que está codificada por una molécula de ácido nucleico que consiste en una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de hibridación restrictivas con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o 3, o un complemento de la misma.

La descripción ofrece adicionalmente anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales o policlonales, que se unen específicamente a las proteínas de la invención, preferiblemente proteínas TLCC-2. Además, las proteínas TLCC-2 o las porciones biológicamente activas de las mismas pueden ser incorporadas a composiciones farmacéuticas, que incluyen opcionalmente portadores farmacéuticamente aceptables.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico, una proteína, o un polipéptido de TLCC-2 en una muestra biológica poniendo en contacto la muestra biológica con un agente capaz de detectar una molécula de ácido nucleico, una proteína, o un polipéptido de TLCC-2, de manera que se detecta la presencia de la molécula de ácido nucleico, proteína o polipéptido de TLCC-2 en la muestra biológica.

En otro aspecto, la presente descripción proporciona un método para detectar la presencia de actividad TLCC-2 en una muestra biológica poniendo en contacto la muestra biológica con un agente capaz de detectar un indicador de la actividad TLCC-2 de manera que la presencia de actividad TLCC-2 sea detectada en la muestra biológica.

En otra realización, el trastorno caracterizado por la actividad TLCC-2 aberrante o no deseada es un trastorno con dolor, o un trastorno caracterizado por mecanismos de la señalización del dolor mal regulados.

En otro aspecto la invención proporciona método para identificar un compuesto que se une a o modula la actividad de una proteína TLCC-2, proporcionando una composición indicadora que comprende una proteína TLCC-2 que tiene actividad TLCC-2, poniendo en contacto la composición indicadora con un compuesto de ensayo, y determinando el efecto del compuesto de ensayo sobre la actividad TLCC-2 en la composición indicadora para identificar un compuesto que modula la actividad de una proteína TLCC-2.

Otros rasgos y ventajas de la invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y de las reivindicaciones.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1A-B representa la secuencia de ADNc y la secuencia de aminoácidos pronosticada de la TLCC-2 humana. La secuencia de nucleótidos corresponde a los ácidos nucleicos 1 a 2095 de la SEQ ID NO:1. La secuencia de aminoácidos corresponde a los aminoácidos 1 a 580 de la SEQ ID NO:2. La región codificadora sin la región 3' no traducida del gen TLCC-2 humano se muestra en la SEQ ID NO:3.

La Figura 2 representa un análisis estructural, de hidrofobicidad, y antigenicidad de la proteína TLCC-2 humana.

La Figura 3 representa los resultados de una búsqueda que se realizó frente a la base de datos MEMSAT y que dio como resultado la identificación de seis "dominios transmembrana" en la proteína TLCC-2 humana (SEQ ID NO:2).

La Figura 4 representa los resultados de una búsqueda que se realizó frente a la base de datos HMM y que dio como resultado la identificación de un "dominio de Fibronectina de tipo III" en la proteína TLCC-2 humana (SEQ ID NO:2).

La Figura 5 representa los resultados de una búsqueda que se realizó frente a la base de datos ProDom y que dio como resultado la identificación de un "dominio de la proteína RNA-4 de 31 K" en la proteína TLCC-2 humana (SEQ ID NO:2).

La Figura 6 representa un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de TLCC-2 humana (SEQ ID NO:2) con las secuencias de aminoácidos del receptor vainilloide 1 humano y el receptor vainilloide 2 humano (Números de Acceso AAD26363 y AAD41724, mostradas como SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5, respectivamente), utilizando el programa de alineamiento CLUSTAL W(1.74).

La Figura 7A-B representa el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de TLCC-2 humana (SEQ ID NO:2) con la secuencia de aminoácidos de la proteína 2 de la enfermedad poliquística del riñón de Mus musculus (Número de Acceso NP_032887, mostrada como SEQ ID NO:6), utilizando el programa de alineamiento CLUSTAL W(1.74).

La Figura 8A-B representa un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de TLCC-2 humana (SEQ ID NO:2) con la secuencia de aminoácidos de la melastatina humana (Número de Acceso AAC8000, mostrada como SEQ ID NO:7), utilizando el programa de alineamiento CLUSTAL W(1.74).

La Figura 9 representa los resultados de una búsqueda realizada frente a la base de datos Prosite y que dio como resultado la identificación de cuatro sitios de N-glicosilación en la secuencia de aminoácidos de TLCC-2 humana (SEQ ID NO:2).

La Figura 10 es una representación gráfica de los niveles relativos de la expresión del ARNm de TLCC-2 humano en un panel de tejidos normales humanos, como se determina utilizando un análisis Taqman®.

La Figura 11 es una representación gráfica de los niveles relativos de la expresión del ARNm de TLCC-2 humano en un panel de tejidos normales humanos, como de determina utilizando un análisis Taqman®.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de moléculas novedosas, referidas en la presente memoria como moléculas de ácido nucleico y proteína "canal de calcio de tipo TRP (TRP-like calcium channel)" o "TLCC-2", que son miembros novedosos de la familia de canales iónicos, p. ej., canal de calcio y/o receptor vainilloide. Estas moléculas novedosas son capaces, por ejemplo, de modular una actividad mediada por un canal iónico (p. ej., una actividad mediada por el canal de calcio y/o mediada por un receptor vainilloide) en una célula, p. ej., una célula neuronal, de la piel, del músculo (p. ej., músculo cardíaco), o del hígado.

La presente invención también está basada en parte, en el descubrimiento de que las moléculas de TLCC-2 novedosas de la presente invención son expresadas en el cerebro a niveles elevados, y también son expresadas en la piel, la médula espinal y los ganglios de la raíz dorsal (DRG). Por otra parte, las moléculas de TLCC-2 novedosas de la invención están reguladas al alza en modelos animales de dolor. Las moléculas de TLCC-2 de la invención están implicadas en la nocicepción (p. ej., nocicepción química, mecánica, o térmica) y de ese modo modulan la inducción del dolor. Por consiguiente, las moléculas de TLCC-2 de la presente invención actúan como dianas para desarrollar dianas de diagnóstico novedosas y agentes terapéuticos para controlar el dolor y los trastornos con dolor.

Como se emplea en esta memoria, un "canal iónico" incluye una proteína o polipéptido que está implicado en la recepción, la conducción, y la transmisión de señales en una célula eléctricamente excitable, p. ej., una célula neuronal o muscular. Los canales iónicos incluyen receptores vainilloides, canales de calcio, canales de potasio, y canales de sodio. Como se emplea en esta memoria, un "canal de calcio" incluye una proteína o polipéptido que está implicado en la recepción, conducción, y transmisión de señales basadas en iones calcio en una célula eléctricamente excitable. Los canales de calcio son selectivos para el ión calcio, y pueden determinar la excitabilidad de la membrana (la capacidad para que, por ejemplo, una célula neuronal responda a un estímulo y lo convierta en un impulso sensorial). Los canales de calcio también pueden influir en el potencial en reposo de las membranas, las formas y las frecuencias de las ondas de los potenciales de acción, y los umbrales de excitación. Los canales de calcio son expresados típicamente en células eléctricamente excitables, p. ej., células neuronales, y pueden formar estructuras heteromultiméricas (p. ej., compuestas por más de un tipo de subunidad). Los canales de calcio también se pueden encontrar en células no excitables (p. ej., células adiposas o células del hígado), donde pueden jugar un papel, p. ej., en la transducción de la señal. Los ejemplos de los canales de calcio incluyen los canales regulados por un voltaje bajo y los canales regulados por un voltaje elevado. Los canales de calcio son descritos, por ejemplo, por Davila et al. (1999) Annals New York Academy of Sciences 868:102-17 y McEnery, M. W. et al. (1998) J. Bioenergetics and Biomembranes 30(4): 409-418, cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria como referencia.

Como se emplea en esta memoria, un "receptor vainilloide" incluye un canal catiónico no selectivo que está relacionado estructuralmente con la familia TRP de canales iónicos. Los receptores vainilloides también son conocidos como receptores de capsaicina. Los receptores vainilloides comparten numerosas características físicas incluyendo un dominio citoplásmico N-terminal que contiene tres repeticiones de anquirina, seis dominios transmembrana, una región poro-bucle localizada entre los dominios transmembrana 5 y 6, y varias secuencias consenso quinasa. Los miembros de la familia de los receptores vainilloides (VR) han sido propuestos para mediar la entrada de calcio extracelular a las células, p. ej., en respuesta al agotamiento de los almacenes de calcio intracelular. Los VR son expresados típicamente en neuronas nociceptivas entre otros tipos de células y son activados directamente por el calor nocivo, los protones extracelulares, y los compuestos vainilloides. Los VR también pueden ser expresados en tejidos no sensoriales y pueden mediar el dolor inflamatorio en lugar del térmico agudo. Los receptores vainilloides son descritos, por ejemplo, por Caterina, M.J. (1997) Nature 389:816-824 y Caterina, M.J. (2000) Science 288:306-313).

Como las moléculas de TLCC-2 de la presente invención pueden modular las actividades mediadas por los canales iónicos (p. ej., actividades mediadas por el canal de calcio y/o por receptores vainilloides), pueden ser útiles para desarrollar agentes de diagnóstico y terapéuticos novedosos para los trastornos asociados con canales iónicos (p. ej., trastornos asociados con el canal de calcio y/o receptores vainilloides).

Como se emplea en esta memoria, un "trastorno asociado con un canal iónico" incluye un trastorno, enfermedad o condición que se caracteriza por una regulación errónea de una actividad mediada por el canal iónico (p. ej., el canal de calcio) y/o un receptor vainilloide). Por ejemplo, un "trastorno asociado con el canal de calcio" incluye un trastorno, enfermedad o condición que se caracteriza por la regulación errónea de la actividad mediada por el canal de calcio. Un "trastorno asociado con un receptor vainilloide" incluye un trastorno, enfermedad o condición que se caracteriza por una regulación errónea de una actividad mediada por un receptor vainilloide. Los trastornos asociados con canales iónicos, p. ej., trastornos del canal de calcio y/o trastornos asociados con receptores vainilloides, también incluyen trastornos con dolor. Como se emplea en esta memoria, el término "trastorno con dolor" incluye un trastorno que afecta a los mecanismos de señalización del dolor. Los trastornos con dolor incluyen trastornos caracterizados por un dolor aberrante (p. ej., excesivo o amplificado). Los ejemplos de los trastornos con dolor incluyen neuralgia post-terapéutica, neuropatía diabética, síndrome de dolor post-mastectomía, muñón doloroso, distrofia simpática refleja, neuralgia del trigémino, dolor neuropático, dolor neuropático orofacial, osteoartritis, artritis reumatoide, síndrome de fibromialgia, mialgia por tensión, síndrome de Guillian-Barre, Meralgia parestética, síndrome de la boca ardiente, fibrocitis, síndrome del dolor miofascial, trastorno de dolor idiopático, síndrome de la articulación temporomandibular, odontalgia atípica, dolor lumbar, síndrome de hematuria, dolor de pecho no cardíaco, dolor en la parte inferior de la espalda, dolor no específico crónico, dolor psicogénico, trastorno con dolor músculo-esquelético, dolor pélvico crónico, dolor de cabeza crónico no orgánico, dolor de cabeza de tipo tensión, dolor de cabeza en racimos, migraña, síndrome de dolor regional complejo, vaginismo, dolor del tronco nervioso, trastorno del dolor somatomorfo, mastalgia cíclica, síndrome de fatiga crónica, síndrome de somatización múltiple, trastornos dolorosos crónicos, trastornos de somatización, Síndrome X, dolor facial, trastorno de dolor idiopático, trastorno de modulación del dolor reumático post-traumático (síndrome de fibrositis), hiperalgesia, y enfermedad de Tangier.

Como se emplea en esta memoria, el término "mecanismos de señalización del dolor" incluye los mecanismos celulares implicados en el desarrollo y la regulación del dolor, p. ej., dolor provocado por estímulos químicos, mecánicos, o térmicos nocivos, en un sujeto, p. ej., un mamífero tal como un ser humano. En los mamíferos, la detección inicial de los estímulos químicos, mecánicos, o térmicos nocivos, un proceso conocido como "nocicepción", se produce predominantemente en los terminales periféricos de neuronas sensoriales de pequeño diámetro, especializadas. Estas neuronas sensoriales transmiten la información al sistema nervioso central, evocando una percepción de dolor o incomodidad e iniciando reflejos protectores apropiados. Las moléculas de TLCC-2 de la presente invención pueden estar presentes en estas neuronas sensoriales y, de este modo, pueden estar implicadas en la detección de estos estímulos químicos, mecánicos, o térmicos nocivos y transducir esta información en eventos de despolarización de la membrana. De este modo, las moléculas de TLCC-2, al participar en los mecanismos de señalización del dolor, pueden modular la obtención de dolor y actuar como dianas para desarrollar dianas de diagnóstico novedosas y agentes terapéuticos para el control del dolor.

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Se pretende que el término "familia" cuando hace referencia a las moléculas de proteína y de ácido nucleico de la invención represente dos o más proteínas o moléculas de ácido nucleico que tienen un dominio estructural o motivo común y que tienen suficiente homología de secuencia de aminoácidos o nucleótidos como se define en la presente memoria. Semejantes miembros de la familia pueden ser de origen natural o no natural y pueden ser de la misma o de diferente especie. Por ejemplo, una familia puede contener una primera proteína de origen humano, así como otras, proteínas distintas de origen humano o alternativamente, pueden contener homólogos de origen no humano, p. ej., proteínas de mono. Los miembros de una familia también pueden tener características funcionales comunes.

Por ejemplo, la familia de proteínas TLCC-2 comprende al menos un "dominio transmembrana" y preferiblemente seis dominios transmembrana. Como se emplea en esta memoria, el término "dominio transmembrana" incluye una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 20-45 restos aminoácido de longitud que abarca la membrana plasmática. Más preferiblemente, un dominio transmembrana incluye aproximadamente al menos 20, 25, 30, 35, 40, o 45 restos aminoácido y abarca la membrana plasmática. Los dominios transmembrana son ricos en restos hidrófobos, y tienen típicamente una estructura helicoidal alfa. En una realización preferida, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de los aminoácidos de un dominio transmembrana son hidrófobos, p. ej., leucinas, isoleucinas, tirosinas, o triptófanos. Los dominios transmembrana son descritos, por ejemplo, por Zagotta W.N. et al, (1996) Annual Rev. Neurosci. 19: 235-263, cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria como referencia. Los restos aminoácido 70-86, 299-317, 354-371, 385-416, 428-447, y 497-521 de la proteína TLCC-2 comprenden dominios transmembrana (véanse las Figuras 2 y 3). Por consiguiente, las proteínas TLCC-2 que tienen una homología de al menos 50-60%, preferiblemente aproximadamente 60-70%, más preferiblemente una homología de aproximadamente 70-80%, o aproximadamente 80-90% con un dominio transmembrana de la TLCC-2 humana están dentro del alcance de la invención.

En otra realización, se identifica una molécula de TLCC-2 de la presente invención basándose en la presencia de al menos un dominio poro entre el quinto y el sexto dominios transmembrana. Como se emplea en esta memoria, el término "dominio poro" incluye una secuencia de aminoácidos hidrófoba global que está localizada entre dos dominios transmembrana de una proteína del canal de calcio, preferiblemente los dominios transmembrana 5 y 6, y que se cree que es un determinante principal de la selectividad de iones y de la actividad del canal en los canales de calcio. Los dominios poro son descritos, por ejemplo por Vannier et al. (1998) J. Biol. Chem. 273: 8675-8679 y Phillips, A. M. et al. (1992) Neuron 8:631-642.

Las moléculas de TLCC-2 que tienen al menos un dominio poro están dentro del alcance de la invención. Se puede encontrar un dominio poro en la secuencia de TLCC-2 humana (SEQ ID NO:2) aproximadamente en los restos 459-470 (Figura 2).

En otra realización, se identifica una molécula de TLCC-2 de la presente invención basándose en la presencia de al menos un sitio de N-glicosilación. Como se emplea en esta memoria, el término "sitio de N-glicosilación" incluye una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 4 restos aminoácido de longitud que sirve como sitio de glicosilación. Más preferiblemente, un sitio de N-glicosilación tiene la secuencia consenso Asn-Xaa-Ser/Thr (donde Xaa puede ser cualquier aminoácido) (SEQ ID NO:4). Los sitios de N-glicosilación se describen, por ejemplo, en Prosite PDOC00001 (http://www.expasy.ch/cgi-bin/get-prodoc-entry?PDOC00001), cuyos contenidos se incorporan en la presente memoria como referencia. Los restos aminoácido 159-162, 179-182, 220-223, y 230-233 de la proteína TLCC-2 comprenden sitios de N-glicosilación (véase la Figura 9). Por consiguiente, las proteínas TLCC-2 que tienen al menos un sitio de N-glicosilación están dentro del alcance de la invención.

En otra realización, una molécula de TLCC-2 de la presente invención es identificada basándose en la presencia de un "dominio rico en prolina" en la proteína o la correspondiente molécula de ácido nucleico. Como se emplea en esta memoria, el término "dominio rico en prolina" incluye una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 4-6 restos aminoácido de longitud que tiene la secuencia general X-Pro-X-X-Pro-X (donde X puede ser cualquier aminoácido). Los dominios ricos en prolina se localizan normalmente en una estructura helicoidal y se unen a través de interacciones hidrófobas a los dominios SH3. Los dominios SH3 reconocen los dominios ricos en prolina en las orientaciones tanto directa como inversa. Los dominios ricos en prolina son descritos, por ejemplo, por Sattler, M. et al. (1998) Leukemia 12: 637-644. Los restos 1-37 de la secuencia de aminoácidos de la TLCC-2 humana (SEQ ID NO:2) contienen dominios ricos en prolina.

En una realización preferida, las moléculas de TLCC-2 de la invención incluyen al menos un dominio transmembrana, al menos un sitio de glicosilación, al menos un dominio poro, y al menos un dominio rico en prolina.

Las proteínas aisladas de la presente invención, preferiblemente las proteínas TLCC-2, tienen una secuencia de aminoácidos suficientemente idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2 o están codificadas por una secuencia de nucleótidos suficientemente idéntica a la SEQ ID NO:1 o 3. Como se emplea en esta memoria, el término "suficientemente idéntica" hace referencia a una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos que contiene un número suficiente o mínimo de restos aminoácido o nucleótidos idénticos o equivalentes (p. ej., un resto aminoácido que tiene una cadena lateral similar) a una secuencia de aminoácidos o nucleótidos de manera que la primera y la segunda secuencias de aminoácidos o nucleótidos comparten dominios estructurales o motivos comunes y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos o nucleótidos que comparten dominios estructurales comunes tienen al menos una homología de 30%, 40%, o 50%, preferiblemente una homología de 60%, más preferiblemente 70%-80%, e incluso más preferiblemente una homología de 90-95% a través de las secuencias de aminoácidos de los dominios y contienen al menos uno y preferiblemente dos dominios estructurales o motivos, se definen en la presente memoria como suficientemente idénticas. Además, las secuencias de aminoácidos o nucleótidos que comparten una homología del al menos 30%, 40%, o 50%, preferiblemente 60%, más preferiblemente 70-80%, o 90-95% y comparten una actividad funcional común se definen en la presente memoria como suficientemente idénticas.

Como se utiliza indistintamente en la presente memoria, una "actividad TLCC-2", "una actividad biológica de TLCC-2 " o "una actividad funcional de TLCC-2", hace referencia a una actividad ejercida por una proteína, un polipéptido o una molécula de ácido nucleico de TLCC-2 sobre una célula o tejido sensible a TLCC-2, o sobre un sustrato de la proteína TLCC-2, determinado in vivo, o in vitro, de acuerdo con las técnicas convencionales. En una realización, una actividad TLCC-2 es una actividad directa, tal como una asociación con una molécula diana de TLCC-2. Como se emplea en esta memoria, una "molécula diana" o "un compañero de unión" es una molécula con la cual se une una proteína TLCC-2 o interacciona en la naturaleza, de manera que se logra la función mediada por TLCC-2. Una molécula diana de TLCC-2 puede ser una molécula distinta de TLCC-2 o una proteína TLCC-2 o un polipéptido de la presente invención. En una realización ilustrativa, una molécula diana de TLCC-2 es un ligando de TLCC-2, p. ej., un ligando del canal de calcio. Alternativamente, una actividad TLCC-2 es una actividad indirecta, tal como una actividad de señalización celular mediada por la interacción de la proteína TLCC-2 con un ligando de TLCC-2. Las actividades biológicas de TLCC-2 se describen en la presente memoria. Por ejemplo, las proteínas TLCC-2 de la presente invención pueden tener una o más de las siguientes actividades: (1) modulan la excitabilidad de la membrana, (2) influyen en el potencial en reposo de las membranas, (3) modulan las formas y las frecuencias de las ondas de los potenciales de acción, (4) modulan los umbrales de excitación, (5) modulan el sobrecrecimiento de las neuritas y la sinaptogénesis, (6) modulan la transducción de la señal, y (7) participan en la nocicepción.

Por consiguiente, otra realización de la invención ofrece proteínas TLCC-2 aisladas y polipéptidos que tienen actividad TLCC-2. Las proteínas preferidas son proteínas TLCC-2 que tienen al menos uno o más de los siguientes dominios: un dominio transmembrana, un sitio de N-glicosilación, un dominio poro, y un dominio rico en prolina, y, preferiblemente, una actividad TLCC-2.

Las proteínas adicionales preferidas tienen uno o más de los siguientes dominios: un dominio transmembrana, un sitio de N-glicosilación, un dominio poro, y un dominio rico en prolina, y están codificadas, preferiblemente, por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones de hibridación restrictivas con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o 3.

La secuencia de nucleótidos del ADNc de TLCC-2 humana aislada y la secuencia de aminoácidos pronosticada del polipéptido TLCC-2 humano se muestran en la Figura 1 y en las SEQ ID NO: 1 y 2, respectivamente. El gen TLCC-2 humano, que tiene aproximadamente 2095 nucleótidos de longitud, codifica una proteína que tiene un peso molecular de aproximadamente 65,7 kD y que tiene aproximadamente 580 restos aminoácido de longitud.

En las siguientes subsecciones se describen diversos aspectos de la invención con más detalle:

I. Moléculas de ácido nucleico aisladas

Un aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican proteínas TLCC-2 o porciones biológicamente activas de las mismas, así como fragmentos de ácido nucleico suficientes para su uso como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico que codifican TLCC-2 (p. ej., ARNm de TLCC-2) y fragmentos para su uso como cebadores de la PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico de TLCC-2. Como se emplea en esta memoria, se pretende que el término "molécula de ácido nucleico" incluya moléculas de ADN (p. ej., ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (p. ej., ARNm) y análogos del ADN o ARN generados utilizando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de hebra sencilla o de doble hebra, pero preferiblemente es ADN de doble hebra.

El término "molécula de ácido nucleico aislada" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, con respecto al ADN genómico, el término "aislado" incluye moléculas de ácido nucleico que están separadas del cromosoma con el cual está asociada naturalmente el ADN genómico. Preferiblemente, un ácido nucleico "aislado" está libre de secuencias que flanquean naturalmente el ácido nucleico (esto es, secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del ácido nucleico) en el ADN genómico del organismo del cual deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas realizaciones, la molécula de ácido nucleico de TLCC-2 aislada puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb o 0,1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula de la cual deriva el ácido nucleico. Por otra parte, una molécula de ácido nucleico "aislada", tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando es producido mediante técnicas recombinantes, o esencialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos cuando es sintetizado químicamente.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, p. ej., una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o 3, o una porción de la misma, puede ser aislada utilizando técnicas de biología molecular convencionales y la información de la secuencia proporcionada en la presente memoria. Utilizando toda o una parte de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 o 3, como sonda de hibridación, se pueden aislar moléculas de ácido nucleico de TLCC-2 usando técnicas de hibridación y clonación convencionales (p. ej., como describen Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

Por otra parte, se puede aislar una molécula de ácido nucleico que abarca toda o una porción de la SEQ ID NO:1 o 3, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores oligonucleotídicos sintéticos diseñados basándose en la secuencia de la SEQ ID NO:1 o 3.

Un ácido nucleico de la invención puede ser amplificado usando ADNc, ARNm o alternativamente, ADN genómico, como molde y cebadores oligonucleotídicos apropiados de acuerdo con técnicas de amplificación por PCR convencionales. El ácido nucleico así amplificado puede ser clonado en un vector apropiado y caracterizado mediante análisis de la secuencia de ADN. Además, se pueden preparar oligonucleótidos correspondientes a las secuencias de nucleótifos de TLCC-2 mediante técnicas sintéticas normalizadas, p. ej., utilizando un sintetizador de ADN automatizado.

En una realización preferida, la molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1. La secuencia de la SEQ ID NO:1 corresponde al ADNc de la TLCC-2 humana. Este ADNc comprende secuencias que codifican la proteína TLCC-2 humana (esto es, "la región codificadora", de los nucleótidos 141-1883), así como las secuencias 5' no traducidas (nucleótidos 1-140) y las secuencias 3' no traducidas (nucleótidos 1884-2095). Alternativamente, la molécula de ácido nucleico puede comprender solamente la región codificadora de la SEQ ID NO:1 (p. ej., los nucleótidos 141-1883, correspondientes a la SEQ ID NO:3).

En otra realización preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1 o 3, o una porción de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1 o 3, es aquella que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1 o 3, de manera que puede hibridar con la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1 o 3, formando de ese modo un dúplex estable.

En otra realización preferida más, una molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos aproximadamente en un 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a la longitud completa de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1 o 3, o una porción de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos.

Por otra parte, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender solamente una porción de la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 o 3, por ejemplo, un fragmento que se puede usar como sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción de una proteína TLCC-2, p. ej., una porción biológicamente activa de una proteína TLCC-2. La secuencia de nucleótidos determinada a partir de la clonación del gen TLCC-2 permite la generación de sondas y cebadores diseñados para su uso en la identificación y/o clonación de otros miembros de la familia de TLCC-2, así como homólogos de TLCC-2 de otras especies. La sonda/cebador comprende típicamente un oligonucleótido sustancialmente purificado. El oligonucleótido comprende típicamente una región de la secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones restrictivas con al menos aproximadamente 12 o 15, preferiblemente aproximadamente 20 o 25, más preferiblemente aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, o 100 o más nucleótidos consecutivos de una secuencia efectora del SEQ ID NO:1 o 3, de una secuencia antisentido de la SEQ ID NO:1 o 3, o de una variante alélica de origen natural o mutante de la SEQ ID NO:1 o 3. En una realización, una molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que tiene más de 706, 706-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1050, 1050-1070, 1070-1100, 1100-1150, 1150-1200, 1200-1250, 1250-1300, 1300-1350, 1350-1400, 1400-1450, 1450-1500, 1500-1550, 1550-1600, 1600-1650, 1650-1700, 1700-1750, 1750-1800, 1800-1850, 1850-1900, 1900-1950, 1950-2000, 2000-2050, 2050-2100 o más nucleótidos de longitud e hibrida en condiciones de hibridación restrictivas con una molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 o 3.

Se pueden utilizar sondas basadas en las secuencias de nucleótidos de TLCC-2 para detectar transcritos o secuencias genómicas que codifican las mismas proteínas o proteínas homólogas. En las realizaciones preferidas, la sonda puede comprender adicionalmente un grupo marcador unido él, p. ej., el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor enzimático. Tales sondas se pueden utilizar como parte de un kit de ensayo para diagnóstico para identificar células o tejidos que expresan erróneamente una proteína TLCC-2, por ejemplo midiendo un nivel de un ácido nucleico que codifica la TLCC-2 en una muestra de células de un sujeto p. ej., detectando los niveles de ARNm de TLCC-2 o determinando si un gen TLCC-2 genómico ha sido mutado o suprimido.

Se puede preparar un fragmento de ácido nucleico que codifica una "porción biológicamente activa de una proteína TLCC-2" aislando una porción de la secuencia de nucleótidos del SEQ ID NO:1 o 3, que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica de TLCC-2 (las actividades biológicas de las proteínas TLCC-2 se describen en la presente memoria), expresando la porción codificada de la proteína TLCC-2 (p. ej., mediante expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la porción codificada de la proteína TLCC-2.

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La invención abarca adicionalmente moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1 o 3, debido a la degeneración del código genético y de este modo codifican las mismas proteínas TLCC-2 que las codificadas por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NO:1 o 3. En otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención tiene una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2.

Por consiguiente, en otra realización, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención tiene al menos 15, 20, 25, 30 o más nucleótidos de longitud e hibrida en condiciones restrictivas con la molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o 3. En otra realización, el ácido nucleico tiene al menos 706, 706-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900-950, 950-1000, 1000-1050, 1050-1070, 1070-1100, 1100-1150, 1150-1200, 1200-1250, 1250-1300, 1300-1350, 1350-1400, 1400-1450, 1450-1500, 1500-1550, 1550-1600, 1600-1650, 1650-1700, 1700-1750, 1750-1800, 1800-1850, 1850-1900, 1900-1950, 1950-2000, 2000-2050, 2050-2100 o más nucleótidos de longitud.

Como se emplea en esta memoria, se pretende que el término "hibrida en condiciones restrictivas" describa las condiciones para la hibridación y el lavado en las cuales las secuencias de nucleótidos que son significativamente idénticas u homólogas entre sí permanecen hibridadas entre sí. Preferiblemente, las condiciones son tales que las secuencias que son idénticas al menos aproximadamente en 70%, más preferiblemente al menos aproximadamente 80%, incluso más preferiblemente al menos aproximadamente 85% o 90% entre sí permanecen hibridadas entre sí. Tales condiciones restrictivas son conocidas por los expertos en la técnica y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc. (1995), secciones 2, 4 y 6. Se pueden encontrar condiciones restrictivas adicionales en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), capítulos 7, 9 y 11. Un ejemplo preferido, no limitante de las condiciones de hibridación restrictivas incluye la hibridación en 4X cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC), a aproximadamente 65-70ºC (o hibridación en 4X SSC más formamida al 50% a aproximadamente 42-50ºC) seguido de uno o más lavados en 1X SSC, a aproximadamente 65-70ºC. Un ejemplo preferido, no limitante de condiciones de hibridación altamente restrictivas incluye hibridación en 1X SSC, a aproximadamente 65-70ºC (o hibridación en 1X SSC más formamida al 50% a aproximadamente 42-50ºC) seguido de uno o más lavados en 0,3X SSC, a aproximadamente 65-70ºC. Un ejemplo preferido, no limitante de condiciones de hibridación poco restrictivas incluye la hibridación en 4X SSC, a aproximadamente 50-60ºC (o alternativamente hibridación en 6X SSC más formamida al 50% a aproximadamente 40-45ºC) seguido de uno o más lavados en 2X SSC, a aproximadamente 50-60ºC. También se pretende que los intervalos intermedios con respecto a los valores citados antes, p. ej., a 65-70ºC o a 42-50ºC estén incluidos en la presente invención. Se puede sustituir el SSPE (1xSSPE es NaCl 0,15 M, NaH_{2}PO_{4} 10 mM, EDTA 1,25 mM, pH 7,4) por SSC (1xSSC es NaCl 0,15 mM y citrato de sodio 15 mM) en los tampones de hibridación y lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos cada uno una vez que se ha completado la hibridación. La temperatura de hibridación para los híbridos que se prevé que tengan menos de 50 pares de bases de longitud debe ser 5-10ºC menor que la temperatura de fusión (T_{m}) del híbrido, donde la T_{m} se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para los híbridos de menos de 18 pares de bases de longitud, T_{m}(ºC) = 2 (núm. de bases A + T) + 4 (núm. de bases G + C). Para los híbridos de entre 18 y 49 pares de bases de longitud, T_{m}(ºC) = 81,5 + 16,6(log_{10}[Na^{+}]) + 0,41(%G+C) - (600/N), donde N es el número de bases del híbrido, y [Na^{+}] es la concentración de iones sodio en el tampón de hibridación ([Na^{+}] para 1xSSC = 0,165 M). Un experto en la técnica también reconocerá que se puede añadir reactivos adicionales a los tampones de hibridación y/o lavado para disminuir la hibridación no específica de las moléculas de ácido nucleico a membranas, por ejemplo, membranas de nitrocelulosa o nailon, incluyendo pero no limitados a agentes de bloqueo (p. ej., BSA o ADN portador de esperma de salmón o arenque), detergentes (p. ej., SDS), agentes quelantes (p. ej., EDTA), Ficoll, PVP y similares. Cuando se utilizan membranas de nailon, en particular, un ejemplo no limitante, preferido adicional de condiciones de hibridación restrictivas es la hibridación en NaH_{2}PO_{4} 0,25-0,5 M, SDS al 7% a aproximadamente 65ºC, seguido de uno o más lavados en NaH_{2}PO_{4} 0,02 M, SDS al 1% a 65ºC, véase p. ej., Church y Gilbert (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:1991-1995, (o alternativamente 0,2X SSC, SDS al 1%).

Preferiblemente, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención que hibrida en condiciones restrictivas con la secuencia de la SEQ ID NO:1 o 3 corresponde a una molécula de ácido nucleico de origen natural. Como se emplea en esta memoria, una molécula de ácido nucleico "de origen natural" hace referencia a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que existe en la naturaleza (p. ej., codifica una proteína natural).

Por consiguiente, otro aspecto de la invención hace referencia a moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas TLCC-2 que contienen cambios en los restos aminoácido que no son esenciales para la actividad. Tales proteínas TLCC-2 difieren en la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO:2, conservando todavía la actividad biológica. En una realización, la molécula de ácido nucleico aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, donde la proteína comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos en aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a la SEQ ID NO:2.

Se puede crear una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una proteína TLCC-2 idéntica a la proteína de la SEQ ID NO:2, introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o 3, de manera que una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos son introducidas en la proteína codificada. Se pueden introducir mutaciones en la SEQ ID NO:1 o 3, mediante técnicas convencionales, tales como la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR. En una realización preferida, se puede analizar una proteína TLCC-2 mutante en busca de la capacidad para: (1) modular la excitabilidad de la membrana, (2) influir en el potencial en reposo de las membranas, (3) modular las formas y frecuencias de ondas de los potenciales de acción, (4) modular los umbrales de excitación, (5) modular el sobrecrecimiento de las neuritas y la sinaptogénesis, (6) modular la transducción de la señal, (7) participar en la nocicepción, y (8) modular los mecanismos de señalización del dolor.

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican las proteínas TLCC-2 descritas anteriormente, otro aspecto de la invención hace referencia a las moléculas de ácido nucleico aisladas que son antisentido para estas. Un ácido nucleico "antisentido" comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico "efector" que codifica una proteína, p. ej., complementaria a la hebra codificante de una molécula de ADNc de doble hebra o complementaria a una secuencia de ARNm. Por consiguiente, un ácido nucleico antisentido puede establecer enlaces de hidrógeno con un ácido nucleico efector. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a una hebra codificante de TLCC-2 completa, o solamente a una porción de la misma. En una realización, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido con respecto a una "región codificante" de la hebra codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica TLCC-2. El término "región codificante" hace referencia a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que son traducidos a restos aminoácido (p. ej., la región codificante de la TLCC-2 humana corresponde a la SEQ ID NO:3). En otra realización, la molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido con respecto a la "región no codificante" de la hebra codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica TLCC-2. El término "región no codificante" hace referencia a las secuencias 5' y 3' que flanquean la región codificante que no son traducidas a aminoácidos (esto es, también referidas como regiones 5' y 3' no traducidas).

Dadas las secuencias de la hebra codificante que codifican la TLCC-2 descritas en la presente memoria (p. ej., SEQ ID NO:3), se pueden diseñar ácidos nucleicos antisentido de la invención de acuerdo con las reglas del emparejamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región codificante completa del ARNm de TLCC-2, pero más preferiblemente es un oligonucleótido que es antisentido solamente para la porción de la región codificante o no codificante del ARNm de TLCC-2. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región circundante del sitio de inicio de la traducción del ARNm de TLCC-2. Un oligonucleótido antisentido puede tener, por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 nucleótidos de longitud. Se puede construir un ácido nucleico antisentido de la invención utilizando la síntesis química y reacciones de ligación enzimática utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede sintetizar químicamente un ácido nucleico antisentido (p. ej., un oligonucleótido antisentido) usando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados de forma diversa diseñados para incrementar la estabilidad biológica de las moléculas o para incrementar la estabilidad física del dúplex formado entre los ácidos nucleicos antisentido y efector, p. ej., se pueden utilizar derivados fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Alternativamente, el ácido nucleico antisentido puede ser producido biológicamente usando un vector de expresión en el cual se ha subclonado un ácido nucleico en una orientación antisentido (esto es, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido con respecto a un ácido nucleico diana de interés, descrito adicionalmente en la siguiente subsección).

Alternativamente, la expresión del gen TLCC-2 puede ser inhibida dirigiendo secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora de TLCC-2 (p. ej., el promotor y/o los potenciadores de TLCC-2; p. ej.,nucleótidos 1-137 de la SEQ ID NO:1) para formar estructuras helicoidales triples que evitan la transcripción del gen TLCC-2 en las células diana. Véase, en general, Helene, C. (1991) Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. et al. (1992) Ann. N. Y. Acad. Sci. 660:27-36; y Maher, L.J. (1992) Bioassays 14(12):807-15.

En otra realización más, las moléculas de ácido nucleico de TLCC-2 de la presente invención pueden ser modificadas en el radical de la base, el radical del azúcar o el esqueleto de fosfato para mejorar, p. ej., la estabilidad, la hibridación, o la solubilidad de la molécula. Por ejemplo, el esqueleto de desoxirribosa fosfato de las moléculas de ácido nucleico puede ser modificado para generar ácidos nucleicos peptídicos (véase Hyrup B. et al. (1996) Bioorganic and Medicinal Chemistry 4 (1): 5-23). Como se emplea en esta memoria, los términos "ácidos nucleicos peptídicos" o "PNA" hacen referencia a miméticos de ácidos nucleicos, p. ej., miméticos de ADN, en los que el esqueleto de la desoxirribosa fosfato es remplazado por un esqueleto pseudopeptídico y solamente se conservan cuatro nucleobases naturales. Se ha demostrado que el esqueleto neutro de los PNA permite una hibridación específica al ADN y al ARN en condiciones de fuerza iónica baja. La síntesis de oligómeros de PNA se puede realizar utilizando protocolos de síntesis de péptidos en fase sólida convencionales como los descritos por Hyrup B. et al. (1996) supra; Perry-O'Keefe et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 14670-675.

II. Proteínas TLCC-2 aisladas y Anticuerpos anti-TLCC-2

Un aspecto de la invención hace referencia a proteínas TLCC-2 aisladas, y porciones biológicamente activas de las mismas, así como fragmentos polipeptídicos adecuados para su uso como inmunógenos para originar anticuerpos anti-TLCC-2. En una realización, se pueden aislar proteínas TLCC-2 nativas de fuentes de células o tejidos mediante un esquema de purificación apropiado utilizando técnicas de purificación de proteínas convencionales. En otra realización, se producen proteínas TLCC-2 mediante técnicas de ADN recombinante. Como alternativa a la expresión recombinante, se puede sintetizar químicamente una proteína o polipéptido TLCC-2 utilizando técnicas convencionales de síntesis peptídica.

Una proteína "aislada" o "purificada" o una porción biológicamente activa de la misma está esencialmente libre de material celular o de otras proteínas contaminantes de la fuente de células o tejidos de la cual deriva la proteína TLCC-2, o esencialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos cuando es sintetizada químicamente. La expresión "esencialmente libre de material celular" incluye preparaciones de proteína TLCC-2 en las cuales la proteína es separada de los componentes celulares de las células a partir de las cuales se aísla o se produce recombinantemente. En una realización, la expresión "esencialmente libre de material celular" incluye preparaciones de la proteína TLCC-2 que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de proteína distinta de TLCC-2 (también referida en la presente memoria como "proteína contaminante"), más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de proteína distinta de TLCC-2, aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de proteína distinta de TLCC-2, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 5% de proteína distinta de TLCC-2. Cuando la proteína TLCC-2 o la porción biológicamente activa de la misma es producida recombinantemente, también está preferiblemente esencialmente libre de medio de cultivo, esto es, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente 20%, más preferiblemente menos de aproximadamente 10%, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína.

La expresión "esencialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos" incluye preparaciones de proteína TLCC-2 en las cuales la proteína es separada de precursores químicos u otros compuestos químicos que están implicados en la síntesis de la proteína. En una realización, la expresión "esencialmente libre de precursores químicos u otros compuestos químicos" incluye preparaciones de la proteína TLCC-2 que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o productos químico distintos de TLCC-2, más preferiblemente menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o productos químicos distintos de TLCC-2, aún más preferiblemente menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o productos químicos distintos de TLCC-2, y lo más preferiblemente menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o productos químicos distintos de TLCC-2.

Como se emplea en esta memoria, una "porción biológicamente activa" de una proteína TLCC-2 incluye un fragmento de una proteína TLCC-2 que participa en una interacción entre una molécula de TLCC-2 y una molécula distinta de TLCC-2. Las porciones biológicamente activas de una proteína TLCC-2 incluyen péptidos que comprende secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a, o derivadas de, la secuencia de aminoácidos de la proteína TLCC-2, p. ej., la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2, que incluye menos aminoácidos que las proteínas TLCC-2 completas, y muestran al menos una actividad de la proteína TLCC-2. Típicamente, las porciones biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad de la proteína TLCC-2, p. ej., modulación de los mecanismos de excitación de la membrana. Una porción biológicamente activa de una proteína TLCC-2 puede ser un polipéptido que tiene, por ejemplo, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 274, 500, 525, 550, 575, 580, o más aminoácidos de longitud. Las porciones biológicamente activas de una proteína TLCC-2 se pueden utilizar como dianas para desarrollar agentes que modulan una actividad mediada por TLCC-2, p. ej., un mecanismo de excitación de la membrana.

En una realización, una porción biológicamente activa de una proteína TLCC-2 comprende al menos un dominio transmembrana. Se debe entender que una porción biológicamente activa preferida de una proteína TLCC-2 de la presente invención comprende al menos uno o más de los siguientes dominios: un dominio transmembrana, un sitio de N-glicosilación, un dominio poro, y un dominio rico en prolina. Por otra parte, se pueden preparar otras porciones biológicamente activas, en las cuales están suprimidas otras regiones de la proteína, mediante técnicas recombinantes y se pueden evaluar en busca de una o más de las actividades funcionales de una proteína TLCC-2 nativa.

En una realización preferida, la proteína TLCC-2 tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2. En otras realizaciones, la proteína TLCC-2 es esencialmente idéntica a la SEQ ID NO:2, y conserva la actividad funcional de la proteína de la SEQ ID NO:2, sin embargo difiere de la secuencia de aminoácidos debido a una variación alélica o mutagénesis, como se describe con detalle en la subsección I anterior. Por consiguiente, en otra realización, la proteína TLCC-2 es una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos idéntica al menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más a la SEQ ID NO:2.

Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico, se alinean las secuencias para una comparación óptima (p. ej., se pueden introducir espacios en una o en ambas de una primera y una segunda secuencias de aminoácidos o de ácidos nucleicos para un alineamiento óptimo y se pueden pasar por alto las secuencias no idénticas con fines comparativos). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada con fines comparativos es al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, incluso más preferiblemente al menos 60%, e incluso más preferiblemente al menos 70%, 80%, o 90% de la longitud de la secuencia de referencia (p. ej., cuando se alinea una segunda secuencia con la secuencia de aminoácidos de TLCC-2 de la SEQ ID NO:2 que tiene 580 restos aminoácido, se alinean al menos 50, preferiblemente al menos 100, más preferiblemente al menos 200, incluso más preferiblemente al menos 300, e incluso más preferiblemente al menos 400 o 500 o más restos aminoácido). Después se comparan los restos aminoácido o los nucleótidos de las correspondientes posiciones de aminoácidos o posiciones de nucleótidos. Cuando una posición de la primera secuencia está ocupada por el mismo resto aminoácido o nucleótido que la correspondiente posición en la segunda secuencia, las moléculas son idénticas en esa posición (como se emplea en esta memoria "identidad" de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a "homología" de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en consideración el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que se necesita introducir para un alineamiento óptimo de las dos secuencias.

La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede completar utilizando un algoritmo matemático. En una realización preferida, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. (48):444-453 (1970)) que ha sido incorporado al programa GAP en el paquete de soporte lógico GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz Blosum 62 o una matriz PAM250, y un peso del espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6, o 4 y una longitud del espacio de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En otra realización preferida más, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina utilizando el programa GAP del paquete de soporte lógico GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso del espacio de 40, 50, 60, 70, o 80 y una longitud del espacio de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. En otra realización, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos se determina utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que ha sido incorporado al programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de restos por peso PAM 120, una penalización de la longitud del espacio de 12 y una penalización del espacio de 4.

Las secuencias de ácido nucleico y de proteínas de la presente invención pueden ser utilizadas adicionalmente como "secuencia problema" para realizar una búsqueda frente a bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Tales búsquedas se pueden realizar utilizando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de la palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de ácido nucleico TLCC-2 de la invención. Las búsquedas de proteínas BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación = 100, longitud de la palabra = 3, y una matriz Blosum62 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las moléculas de proteína TLCC-2 de la invención. Para obtener alineamientos con espacios con fines comparativos, se puede utilizar Gapped BLAST como describen Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden emplear los parámetros por defecto de los respectivos programas (p. ej., XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

En una realización, se pueden explotar los análisis basados en células para analizar una colección de TLCC-2 variegada. Por ejemplo, se puede transfectar una colección de vectores de expresión en una línea celular, p. ej., una línea celular endotelial, que normalmente responde a TLCC-2 de una manera dependiente del sustrato de TLCC-2 concreto. Las células transfectadas se ponen en contacto después con TLCC-2 y se puede detectar el efecto de la expresión del mutante sobre la señalización por el sustrato de TLCC-2, p. ej., controlando el calcio intracelular, el IP3, o la concentración de diacilglicerol, el perfil de fosforilación de las proteínas intracelulares, o la actividad de un factor de transcripción regulado por TLCC-2. Después el ADN plasmídico puede ser recuperado de las células que puntúan para la inhibición, o alternativamente, la potenciación de la señalización por el sustrato de TLCC-2, y los clones individuales pueden ser caracterizados adicionalmente.

Se puede utilizar una proteína TLCC-2 aislada, o una porción o fragmento de la misma, como inmunógeno para generar anticuerpos que se unen a TLCC-2 utilizando técnicas convencionales para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Se puede utilizar una proteína TLCC-2 completa o, alternativamente, la invención proporciona fragmentos peptídicos antigénicos de TLCC-2 para su uso como inmunógenos. El péptido antigénico de TLCC-2 comprende al menos 8 restos aminoácido de la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID NO:2 y abarca un epítopo de TLCC-2 de manera que un anticuerpo originado contra el péptido forma un complejo inmunitario específico con TLCC-2. Preferiblemente, el péptido antigénico comprende al menos 10 restos aminoácido, más preferiblemente al menos 15 restos aminoácido, incluso más preferiblemente al menos 20 restos aminoácido, y lo más preferiblemente al menos 30 restos aminoácido.

Los epítopos preferidos abarcados por el péptido antigénico son regiones de TLCC-2 que están localizadas en la superficie de la proteína, p. ej., regiones hidrófilas, así como regiones con una elevada antigenicidad (véase, por ejemplo, la Figura 2).

Típicamente se utiliza un inmunógeno de TLCC-2 para preparar anticuerpos inmunizando un sujeto adecuado, (p. ej., conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con el inmunógeno. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, la proteína TLCC-2 expresada recombinantemente o un polipéptido de TLCC-2 sintetizado químicamente. La preparación puede incluir adicionalmente un coadyuvante, tal como coadyuvante completo o incompleto de Freund, o un agente inmunoestimulador similar. La inmunización de un sujeto adecuado con una preparación de TLCC-2 inmunogénica induce una respuesta de anticuerpos anti-TLCC-2 policlonales.

Por consiguiente, otro aspecto de la invención hace referencia a anticuerpos anti-TLCC-2. El término "anticuerpo" como se emplea en esta memoria hace referencia a molécula de inmunoglobulina y a porciones imunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina, esto es, moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que se une específicamente (inmunoreacciona con) un antígeno, tal como TLCC-2. Los ejemplos de las porciones inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2 que pueden ser generados tratando el anticuerpo con una enzima tal como pepsina. La invención proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen a TLCC-2. El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se emplea en esta memoria, hace referencia a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solamente una especie de un sitio de unión al antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo concreto de TLCC-2. Una composición de anticuerpo monoclonal presenta de este modo típicamente una única afinidad de unión por una proteína TLCC-2 concreta con la cual inmunorreacciona.

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Los anticuerpos anti-TLCC-2 policlonales se pueden preparar como se ha descrito anteriormente inmunizado un sujeto adecuado con un inmunógeno de TLCC-2. El título de anticuerpo anti-TLCC-2 en el sujeto inmunizado puede ser controlado a lo largo del tiempo mediante técnicas convencionales, tales como un análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA) utilizando TLCC-2 inmovilizada. Si se desea, se pueden aislar las moléculas de anticuerpo dirigidas contra TLCC-2 del mamífero (p. ej., de la sangre) y adicionalmente purificarlas mediante mecanismos bien conocidos, tales como cromatografía con proteína A para obtener la fracción de IgG. En un momento apropiado después de la inmunización, p. ej., cuando los títulos de anticuerpo anti-TLCC-2 son más elevados, se pueden obtener células productoras de anticuerpos a partir del sujeto y utilizarlas para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales, tales como la técnica del hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975) Nature 256:495-497) (véase también, Brown et al. (1981) J. Immunol. 127:539-46. Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83. Yeh et al. (1976) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:2927-31; y Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75), la técnica del hibridoma de las células B humanas más reciente (Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4:72), la técnica del hibridoma de EBV (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96) o las técnicas de los triomas. La tecnología para producir hibridomas de anticuerpos monoclonales es bien conocida (véase en general R. H. Kenneth, en Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lerner (1981) Yale J. Biol. Med., 54:387-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231-36). En resumen, se fusiona una línea celular inmortal (típicamente un mieloma) con linfocitos (típicamente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno de TLCC-2 como se ha descrito anteriormente, y los sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma resultantes se escrutan para identificar un hibridoma productor de un anticuerpo monoclonal que se une a TLCC-2.

Se puede aplicar cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos utilizados para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortalizadas con el fin de generar un anticuerpo monoclonal anti-TLCC-2 (véase, p. ej., G. Galfre et al. (1977) Nature 26655052: Gefter et al. Somatic Cell Genet., cited supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., citado antes; Kenneth, Monoclonal Antibodies, citado arriba). Por otra parte, el experto normal en la técnica apreciará que existen muchas variaciones de tales métodos que también serían útiles. Típicamente, la línea celular inmortal (p. ej., una línea celular de mieloma) deriva de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, se pueden elaborar hibridomas murinos fusionando linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente invención con una línea celular de ratón inmortalizada. Las líneas celulares inmortalizadas preferidas son las líneas celulares de mieloma de ratón que son sensibles al medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Se puede utilizar cualquiera de las numerosas líneas celulares de mieloma como compañero de fusión de acuerdo con las técnicas convencionales, p. ej., las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma se encuentran disponibles en la ATCC. Típicamente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan con esplenocitos de ratón utilizando polietilenglicol ("PEG"). Las células de hibridoma resultantes de la fusión se seleccionan después utilizando medio HAT, que destruye las células de mieloma no fusionadas y fusionadas de manera no productiva (los esplenocitos no fusionados mueren después de varios días debido a que no están transformados). Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan escrutando los sobrenadantes del cultivo de hibridoma en busca de anticuerpos que se unen a TLCC-2, p. ej., utilizando un análisis ELISA convencional.

Como alternativa a la preparación de hibridomas secretores de anticuerpos monoclonales, se puede identificar y aislar un anticuerpo monoclonal anti-TLCC-2 escrutando una colección de inmunoglobulinas combinatorias recombinantes (p. ej., una colección de presentación de anticuerpos en fagos) con TLCC-2 para aislar de ese modo los miembros de la colección de inmunoglobulinas que se unen a TLCC-2. Se encuentran disponibles en el mercado kits para generar y escrutar colecciones de presentación en fagos (p. ej., Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Núm. de Catálogo 27-9400-01; y Stratagene SurfZAP^{TM} Phage Display Kit, Núm. de Catálogo 240612). Adicionalmente, se pueden encontrar ejemplos de los métodos y reactivos particularmente susceptibles de uso en la generación y escrutinio de colecciones de presentación de anticuerpos, por ejemplo, Ladner et al. Patente de los Estados Unidos Núm. 5.223.409; Kang et al. Solicitud de Patente Internacional WO 92/18619; Dower et al. Solicitud de Patente Internacional WO 91/17271; Winter et al. Solicitud de Patente Internacional WO 92/20791; Markland et al. Solicitud de Patente Internacional WO 92/15679; Breitling et al. Solicitud de Patente Internacional WO 93/01288; McCafferty et al. Solicitud de Patente Internacional WO 92/01047; Garrard et al. Solicitud de Patente Internacional WO 92/09690; Ladner et al. Solicitud de Patente Internacional WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281. Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734. Hawkins et al. (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896. Clarkson et al. (1991) Nature 352:624-628. Gram et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) BioTechnology 9:1373-1377. Hoogenboom et al. (1991) Nuc. Acid Res. 19:4133-4137; Barbas et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982; y McCafferty et al. Nature (1990) 348:552-554.

Adicionalmente, los anticuerpos anti-TLCC-2 recombinantes, tales como los anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden porciones tanto humanas como no humanas, que se pueden elaborar utilizando técnicas de ADN recombinante convencionales, están dentro del alcance de la invención. Tales anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden ser producidos mediante mecanismos de ADN recombinante conocidos en la técnica, por ejemplo utilizando los métodos descritos por Robinson et al. Solicitud Internacional Núm. PCT/US86/02269; Akira, et al. solicitud de patente Europea 184.187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente Europea 171.696; Morrison et al. Solicitud de Patente Europea 173.494; Neuberger et al. Solicitud de Patente Internacional WO 86/01533; Cabilly et al. Patente de los Estados Unidos Núm. 4.816.567; Cabilly et al. Solicitud de Patente Europea 125.023; Better et al. (1988) Science 240:1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314:446-449; y Shaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229:1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4:214; Patente de los Estados Unidos 5.225.539 de Winter; Jones et al. (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239:1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141:4053-4060.

Se puede utilizar un anticuerpo monoclonal anti-TLCC-2 (p. ej., un anticuerpo monoclonal) para aislar TLCC-2 mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Un anticuerpo anti-TLCC-2 puede facilitar la purificación de TLCC-2 natural de las células y de TLCC-2 producida recombinantemente expresada en células anfitrionas. Por otra parte puede utilizar un anticuerpo anti-TLCC-2 para detectar la proteína TLCC-2 (p. ej., en un producto lisado celular o sobrenadante celular) con el fin de evaluar la abundancia y el patrón de expresión de la proteína TLCC-2. Se pueden utilizar anticuerpos anti-TLCC-2 diagnósticamente para controlar los niveles de proteína en los tejidos como parte de un procedimiento de ensayo clínico, p. ej., para determinar, por ejemplo, la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección puede ser facilitada acoplando (esto es, uniendo físicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de las sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminescentes, materiales bioluminiscentes, y materiales radiactivos. Los ejemplos de las enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de los complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de los materiales fluorescente adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamin-fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material bioluminiscente incluye luminol; los ejemplos de los materiales bioluminescentes incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina, y los ejemplos del material radioactivo adecuado incluyen I^{125}, I^{131}, S^{35} o H^{3}.

V. Usos y métodos de la invención

Las moléculas de ácido nucleico, proteínas, homólogos de proteína, y anticuerpos descritos en la presente memoria pueden ser utilizados en uno o más de los siguientes métodos: a) análisis de escrutinio; b) medicina predictiva (p. ej., análisis diagnósticos, análisis pronósticos, control de pruebas clínicas, y fármacogenética); y c) métodos de tratamiento (p. ej., terapéutico y profiláctico). Como se describe en la presente memoria, una proteína TLCC-2 de la invención tiene una o más de las siguientes actividades: (1) modula la excitabilidad de la membrana, (2) influye en el potencial en reposo de las membranas, (3) modula las formas y frecuencias de ondas de los potenciales de acción, (4) modula los umbrales de excitación, (5) modula el sobrecrecimiento de las neuritas y la sinaptogénesis, (6) modula la transducción de la señal, y (7) participa en la nocicepción.

Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención se pueden utilizar, por ejemplo, para expresar la proteína TLCC-2 (p. ej., por medio de un vector de expresión recombinante en una célula anfitriona en aplicaciones para la terapia génica), para detectar ARNm de TLCC-2 (p. ej., en una muestra biológica) o una alteración genética en un gen TLCC-2, y para modular la actividad de TLCC-2, como se describe adicionalmente más abajo. Las proteínas TLCC-2 se pueden utilizar para tratar trastornos caracterizados por una producción insuficiente o excesiva de un sustrato de TLCC-2 o una producción de inhibidores de TLCC-2. Además, las proteínas TLCC-2 se pueden utilizar para escrutar sustratos de TLCC-2 de origen natural, para escrutar fármacos o compuestos que modulan la actividad de TLCC-2, así como para tratar trastornos caracterizados por una producción insuficiente o excesiva de proteína TLCC-2 o una producción de formas de la proteína TLCC-2 que han disminuido, son aberrantes o tienen una actividad no deseada en comparación con la proteína TLCC-2 de tipo salvaje (p. ej., trastornos del SNC (tales como trastornos neurodegenerativos), trastornos con dolor, o trastornos del crecimiento, diferenciación, o migración celular. Por otra parte, los anticuerpos anti-TLCC-2 de la invención pueden ser utilizados para detectar y aislar proteínas TLCC-2, para regular la biodisponibilidad de proteínas TLCC-2, y modular la actividad TLCC-2.

A. Análisis de escrutinio

La invención proporciona un método (también referido en la presente memoria como "análisis de escrutinio") para identificar moduladores, esto es, compuestos o agentes candidato o de ensayo (p. ej., péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas u otros fármacos) que se unen a proteínas TLCC-2, tienen un efecto estimulador o inhibidor, por ejemplo, de la expresión de TLCC-2 o la actividad de TLCC-2, o tienen un efecto estimulador o inhibidor, por ejemplo, de la expresión o la actividad del sustrato de TLCC-2.

En una realización, la invención proporciona análisis para escrutar compuestos candidato o de ensayo que son sustratos de una proteína o un polipéptido TLCC-2 o una porción biológicamente activa del mismo. En otra realización, la invención proporciona análisis para escrutar compuestos candidato o de ensayo que se unen a o modulan la actividad de una proteína o un polipéptido TLCC-2 o una porción biológicamente activa del mismo. Los compuestos de ensayo de la presente invención pueden ser obtenidos utilizando cualquiera de los numerosos planteamientos de los métodos de colecciones combinatorias conocidos en la técnica, incluyendo: colecciones biológicas; colecciones en fase sólida o en fase de disolución paralelas aplicables espacialmente; métodos de colecciones sintéticas que requieren desconvolución; método de la colección "una cuenta-un compuesto"; y los métodos de colecciones sintéticas en los que se utiliza una selección por cromatografía de afinidad. El planteamiento de la colección biológica está limitado a colecciones peptídicas, mientras los otros cuatro planteamientos son aplicables a colecciones de compuestos peptídicos, de oligómeros no peptídicos o de molécula pequeña (Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).

Los Ejemplos de los métodos para la síntesis de colecciones moleculares se pueden encontrar en la técnica, por ejemplo, en: DeWitt et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909; Erb et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422; Zuckermann et al. 1994. J. Med. Chem. 372678: Cho et al. (1993) Science 261:1303; Carrell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell et al. (1994) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; y en Gallop et al. 1994 J. Med. Chem. 37:1233.

Las colecciones de compuestos se pueden presentar en disolución (p. ej., Houghten (1992) Biotechniques 13:412-421), o sobre cuentas (Lam(1991) Nature 354:82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364:555-556), bacterias (Ladner USP 5,223,409), esporas (Ladner USP '409), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89:1865-1869) o sobre fagos (Scott y Smith (1990) Science 249:386-390); (Devlin (1990) Science 249:404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6378-6382); (Felici (1991) J. Mol. Biol. 222:301-310); (Ladner supra.).

En una realización, el análisis es un análisis basado en células en el que una célula que expresa una proteína TLCC-2 o una porción biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de ensayo y se determina la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad TLCC-2. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad TLCC-2 se puede lograr controlando, por ejemplo, el calcio intracelular, el IP3, o la concentración de diacilglicerol, el perfil de fosforilación de las proteínas intracelulares, o la actividad de un factor de transcripción regulado por TLCC-2. La célula, por ejemplo, puede ser de mamífero, p. ej., una célula neuronal, o una célula de hígado.

También se puede determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular la unión de TLCC-2 a un sustrato o para unirse a TLCC-2. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la unión de TLCC-2 a un sustrato se puede lograr, por ejemplo, acoplando el sustrato de TLCC-2 a un radioisótopo o marca enzimática de manera que se pueda determinar la unión del sustrato de TLCC-2 a la TLCC-2 detectando el sustrato de TLCC-2 marcado en un complejo. Alternativamente, se podría acoplar la TLCC-2 a un radioisótopo o marca enzimática para controlar la capacidad de un compuesto de ensayo para modular la unión de TLCC-2 a un sustrato de TLCC-2 en un complejo. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para unirse a TLCC-2 se puede lograr, por ejemplo, acoplando el sustrato a un radioisótopo o marca enzimática de manera que se pueda determinar la unión del compuesto a TLCC-2 detectando el compuesto de TLCC-2 marcado en un complejo. Por ejemplo, se pueden marcar los compuestos (p. ej., sustratos de TLCC-2) con I^{125}, S^{35}, C^{14}, o H^{3}, directamente o indirectamente, y el radioisótopo se puede detectar mediante recuento directo de radioemisión o mediante recuento del centelleo. Alternativamente, los compuestos se pueden marcar enzimáticamente, por ejemplo, con peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, o luciferasa, y la marca enzimática se puede detectar mediante determinación de la conversión de un sustrato apropiado en producto.

También está dentro del alcance de esta invención la determinación de la capacidad de un compuesto (p. ej., un sustrato de TLCC-2) para interaccionar con TLCC-2 sin el marcaje de ninguno de los interaccionantes. Por ejemplo, se puede utilizar un microfisómetro para detectar la interacción de un compuesto con TLCC-2 sin el marcaje del compuesto o de la TLCC-2. McConnell, H. M. et al. (1992) Science 257:1906-1912. Como se emplea en esta memoria, un "microfisiómetro" (p. ej., Cytosensor) es un aparato analítico que mide la velocidad a la cual una célula acidula su entorno utilizando un sensor potenciométrico dirigido por luz (LAPS). Se pueden utilizar los cambios de esta velocidad de acidulación como indicador de la interacción entre un compuesto y la TLCC-2.

En otra realización, el análisis es un análisis basado en células que comprende poner en contacto una célula que expresa un molécula diana de TLCC-2 (p. ej., un sustrato de TLCC-2) con un compuesto de ensayo y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para modular (p. ej., estimular o inhibir) la actividad de la molécula diana de TLCC-2. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de una molécula diana de TLCC-2 se puede completar, por ejemplo, determinando la capacidad de la proteína TLCC-2 para unirse a o interaccionar con la molécula diana de TLCC-2.

La determinación de la capacidad de la proteína TLCC-2, o un fragmento biológicamente activo de la misma, para unirse a, o interaccionar con, una molécula diana de TLCC-2 se puede completar mediante uno de los métodos descritos anteriormente para determinar la unión directa. En una realización preferida, la determinación de la capacidad de la proteína TLCC-2 para unirse a, o interaccionar con, una molécula diana de TLCC-2 se puede completar determinando la actividad de la molécula diana. Por ejemplo, la actividad de la molécula diana puede ser determinada detectando la inducción de un segundo mensajero celular de la diana (esto es, Ca^{2+} intracelular, diacilglicerol, IP_{3}, y similares), detectando la actividad catalítica/enzimática de la diana utilizando un sustrato apropiado, detectando la inducción de un gen informador (que comprende un elemento regulador sensible a la diana conectado operablemente a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, p. ej., luciferasa), o detectando una respuesta celular regulada por la diana.

En otra realización más, el análisis de la presente invención es un análisis sin células en el que una proteína TLCC-2 o una porción biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de ensayo y se determina la capacidad del compuesto de ensayo para unirse a la proteína TLCC-2 o a la porción biológicamente activa de la misma. Las porciones biológicamente activas preferidas de las proteínas TLCC-2 que se van a utilizar en los análisis de la presente invención incluyen fragmentos que participan en interacciones con moléculas distintas de TLCC-2, p. ej., fragmentos con elevadas puntuaciones de probabilidad en superficie (véase, por ejemplo, la Figura 2). La unión del compuesto de ensayo a la proteína TLCC-2 se puede determinar directamente o indirectamente como se ha descrito anteriormente. En una realización preferida, el análisis incluye poner en contacto la proteína TLCC-2 o una porción biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une a TLCC-2 para formar una mezcla de análisis, poner en contacto la mezcla de análisis con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína TLCC-2, donde la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con una proteína TLCC-2 comprende determinar la capacidad del compuesto de ensayo para unirse preferentemente a TLCC-2 o a un porción biológicamente activa de la misma en comparación con el compuesto conocido.

En otra realización, el análisis es un análisis sin células en el que una proteína TLCC-2 o una porción biológicamente activa de la misma se pone en contacto con un compuesto de ensayo y se determina la capacidad del compuesto de ensayo para modular (p. ej., estimular o inhibir) la actividad de la proteína TLCC-2 o a la porción biológicamente activa de la misma. La determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de una proteína TLCC-2 se puede completar, por ejemplo, determinando la capacidad de la proteína TLCC-2 para unirse a una molécula diana de TLCC-2 mediante uno de los métodos descritos anteriormente para determinar la unión directa. La determinación de la capacidad de la proteína TLCC-2 para unirse a una molécula diana de TLCC-2 también se puede completar utilizando una tecnología tal como el Análisis de Interacción Biomolecular en tiempo real (BIA). Sjolander, S. y Urbaniczky, C. (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345 y Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705. Como se emplea en esta memoria, el "BIA" es una tecnología para estudiar interacciones bioespecíficas en tiempo real, sin marcar ninguno de los interaccionantes (p. ej., BIAcore). Los cambios en el fenómeno óptico de la resonancia de plasmón superficial (SPR) se pueden utilizar como una indicación de las reacciones en tiempo real entre moléculas biológicas.

En una realización alternativa, la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de una proteína TLCC-2 se puede completar determinando la capacidad de la proteína TLCC-2 para modular adicionalmente la actividad de un efector aguas abajo de una molécula diana de TLCC-2. Por ejemplo, se puede determinar la actividad de la molécula efectora sobre una diana apropiada o se puede determinar la unión del efector a una diana apropiada como se ha descrito previamente.

En otra realización más, el análisis sin células implica poner en contacto una proteína TLCC-2 o una porción biológicamente activa de la misma con un compuesto conocido que se une a la proteína TLCC-2 para formar una mezcla de análisis, poner en contacto la mezcla de análisis con un compuesto de ensayo, y determinar la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con la proteína TLCC-2, donde la determinación de la capacidad del compuesto de ensayo para interaccionar con la proteína TLCC-2 comprende determinar la capacidad de la proteína TLCC-2 para unirse preferentemente a o modular la actividad de una molécula diana de TLCC-2.

En más de una realización de los métodos de análisis anteriores de la presente invención, puede ser deseable inmovilizar TLCC-2 o su molécula diana para facilitar la separación de las formas complejadas de las no complejadas de una o ambas proteínas, así como adaptar la automatización del análisis. La unión de un compuesto de ensayo a una proteína TLCC-2, o la interacción de una proteína TLCC-2 con una molécula diana en presencia y ausencia de un compuesto candidato, se pueden completar en cualquier recipiente adecuado para contener los reaccionantes. Los ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo, y tubos de micro-centrífuga. En una realización, se puede proporcionar una proteína de fusión que añade un dominio que permite que una o ambas proteínas se unan a una matriz. Por ejemplo, se pueden adsorber proteínas de unión de glutationa-S-transferasa/TLCC-2 o proteínas de fusión de glutationa-S-transferasa/diana sobre cuentas de sefarosa con glutationa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación tratadas con glutationa, que después se combinan con el compuesto de ensayo o el compuesto de ensayo y la proteína diana no adsorbida o la proteína TLCC-2, y la mezcla se incuba en condiciones que conducen a la formación del complejo (p. ej., en condiciones fisiológicas de sal y pH). Tras la incubación, las cuentas o los pocillos de la placa de microtitulación se lavan para separar cualquier componente no unido, la matriz de inmoviliza en el caso de las cuentas, se determina el complejo directamente o indirectamente, por ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Alternativamente, los complejos se pueden disociar de la matriz, y se puede determinar el nivel de unión o actividad de TLCC-2 utilizando técnicas convencionales.

También se pueden utilizar otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices en los análisis de escrutinio de la invención. Por ejemplo, se puede inmovilizar una proteína TLCC-2 o una molécula diana de TLCC-2 utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. Se puede preparar la proteína TLCC-2 o moléculas diana biotiniladas a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) usando mecanismos conocidos en la técnica (p. ej., kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL), e inmovilizarla en los pocillos de placas de 96 pocillos recubiertas de estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, se pueden obtener anticuerpos reactivos con la proteína TLCC-2 o las moléculas diana pero que no interfieren en la unión de la proteína TLCC-2 a su molécula diana en los pocillos de la placa, y la diana o la proteína TLCC-2 no unida puede ser atrapada en los pocillos por conjugación con el anticuerpo. Los métodos para detectar tales complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados con GST, incluyen la inmunodetección de los complejos utilizando anticuerpos reactivos con la proteína TLCC-2 o la molécula diana, así como análisis con enzima ligada que cuentan con la detección de una actividad enzimática asociada con la proteína TLCC-2 o la molécula diana.

En otra realización, se identifican los moduladores de la expresión de TLCC-2 en un método en el que se pone en contacto una célula con un compuesto candidato y se determina la expresión del ARNm o la proteína TLCC-2 en la célula. El nivel de expresión de ARNm o proteína TLCC-2 en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de expresión de ARNm o proteína TLCC-2 en ausencia del compuesto candidato. El compuesto candidato se puede identificar después como modulador de la expresión de TLCC-2 basándose en esta comparación. Por ejemplo, cuando la expresión del ARNm o la proteína TLCC-2 es mayor (significativamente mayor estadísticamente) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto candidato se identifica como estimulador de la expresión del ARNm o la proteína TLCC-2. Alternativamente, cuando la expresión del ARNm o la proteína TLCC-2 es menor (significativamente menor estadísticamente) en presencia del compuesto candidato que en su ausencia, el compuesto cadidato se identifica como inhibidor de la expresión del ARNm o la proteína TLCC-2. El nivel de expresión de ARNm o proteína TLCC-2 en las células puede ser determinado mediante métodos descritos en la presente memoria para detectar ARNm o proteína TLCC-2.

En otro aspecto más de la invención, se pueden utilizar las proteínas TLCC-2 como "proteínas cebo" en un análisis de dos híbridos o un análisis de tres híbridos (véase, p. ej., la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.283.317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054. Bartel et al. (1993) BioTechniques 14:920-924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696; y Solicitud de Patente Internacional WO 94/10300 de Brent), para identificar otras proteínas, que se unen a, o interaccionan con, TLCC-2 ("proteínas de unión a TLCC-2" o "TLCC-2-bp") y están implicadas en la actividad de TLCC-2. También es probable que tales proteínas de unión a TLCC-2 estén implicadas en la propagación de señales por las proteínas TLCC-2 o las dianas de TLCC-2 como, por ejemplo, los elementos aguas abajo de una ruta de señalización mediada por TLCC-2. Alternativamente, es probable que tales proteínas de unión a TLCC-2 sean inhibidores de TLCC-2.

El sistema de dos híbridos se basa en la naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que consisten en dominios de unión a ADN y de activación separables. En resumen, el análisis utiliza dos constructos de ADN diferentes. En un constructo, el gen que codifica la proteína TLCC-2 está fusionado con un gen que codifica el dominio de unión a ADN de un factor de transcripción conocido (p. ej., GAL-4). En el otro constructo, una secuencia de ADN, de una colección de secuencias de ADN, que codifica una proteína no identificada ("presa" o "muestra") se fusiona con un gen que codifica el dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si las proteínas "cebo" y "presa" son capaces de interaccionar, in vivo, formando un complejo dependiente de TLCC-2, los dominios de unión al ADN y de activación del factor de transcripción se sitúan en íntima proximidad. Esta proximidad permite la transcripción de un gen informador (p. ej., LacZ) que está conectado operablemente a un sitio regulador transcripcional sensible al factor de transcripción. La expresión del gen informador se puede detectar y las colonias de células que contienen el factor de la transcripción funcional se pueden aislar y utilizar para obtener el gen clonado que codifica la proteína que interacciona con la proteína TLCC-2.

En otro aspecto, la invención hace referencia a una combinación de dos o más de los análisis descritos en la presente memoria. Por ejemplo, se puede identificar un agente modulador utilizando un análisis basado en células o sin células, y se puede confirmar la capacidad del agente para modular la actividad de una proteína TLCC-2 in vivo, p. ej., en un animal tal como un modelo animal para dolor celular.

Esta invención se refiere adicionalmente a agentes novedosos identificados por los análisis de escrutinio descritos anteriormente. Por consiguiente, está dentro del alcance de esta invención el uso adicional de un agente identificado como se describe en la presente memoria en un modelo animal apropiado. Por ejemplo, se puede utilizar un agente identificado como se describe en la presente memoria (p. ej., un agente modulador de TLCC-2, una molécula de ácido nucleico TLCC-2 antisentido, un anticuerpo específico de TLCC-2, o un compañero de unión a TLCC-2) en un modelo animal para determinar la eficacia, toxicidad, o efectos secundarios del tratamiento con semejante agente. Alternativamente, se puede utilizar un agente como se describe en la presente memoria en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de semejante agente. Además, esta invención hace referencia a los usos de agentes novedosos identificados por medio de los análisis de escrutinio descritos anteriormente para los tratamientos descritos en la presente memoria.

Los modelos para estudiar el dolor in vivo incluyen modelos de rata de dolor neuropático causado por métodos tales como la administración intraperitoneal de Taxol (Authier et al. (2000) Brain Res. 887:239-249), la lesión por constricción crónica (CCI), la transección parcial del nervio ciático (Linenlaub y Sommer (2000) Pain 89:97-106), la transección de los nervios tibial y sural (Lee et al. (2000) Neurosci. Lett. 291:29-32), el modelo de la lesión selectiva del nervio (Decosterd y Woolf (2000) Pain 87:149-158), la colocación de un manguito en el nervio ciático (Pitcher y Henry (2000) Eur. J. Neurosci. 12:2006-2020), la ligadura rígida unilateral (Esser y Sawynok (2000) Eur. J. Pharmacol. 399:131-139), la ligadura del nervio espinal L5 (Honroe et al. (2000) Neurosci. 98:585-598), y la lesión isquémica del nervio inducida fotoquímicamente (Hao et al. (2000) Exp. Neurol. 163:231-238); modelos de rata de dolor nociceptivo causado por métodos tales como el Método de Chung, el Método de Bennett, y la administración intraperitoneal de coadyuvante completo de Freund (CFA) (Abdi et al. (2000) Anesth. Analg. 91:955-959); modelos de rata de dolor post-incisional causado por incisión en la piel y fascia de la almohadilla posterior (Olivera y Prado (2000) Braz. J. Med. Biol. Res. 33:957-960); modelos de rata de dolor por cáncer causado por métodos tales como inyección de células de sarcoma osteolítico en el fémur (Honroe et al. (2000) Neurosci. 98:585-598); y modelos de rata de dolor visceral causado por métodos tales como administración intraperitoneal de
ciclofosfamida.

Se conocen en la técnica diversos métodos de determinación de respuestas de animales al dolor. Los ejemplos de tales métodos incluyen, pero no están limitados a una breve exposición intensa a una fuente de calor concentrada, la administración de un agente químico nocivo subcutáneamente, el ensayo de la retirada de la cola, el test de la placa caliente, el test de la formalina, el umbral de Von Frey, y el ensayo de la analgesia inducida por estrés (et al., por restricción, choque eléctrico en la pata, y/o natación en agua fría) (Crawley (2000) What's Wrong With My Mouse? Wiley-Liss págs. 72-75).

B. Análisis de detección

Las porciones o los fragmentos de las secuencias de ADNc identificadas en la presente memoria (y las correspondientes secuencias génicas completas) pueden ser utilizadas de diversas maneras como reactivos polinucleotídicos. Por ejemplo, estas secuencias se pueden utilizar para: (i) mapear sus respectivos genes en un cromosoma; y, de este modo, localizar regiones de genes asociados con enfermedades genéticas; (ii) identificar a un individuo a partir de una muestra biológica diminuta (tipaje de tejidos); y (iii) ayudar a la identificación forense de una muestra biológica. Estas aplicaciones se describen en las subsecciones de más abajo.

C. Medicina predictiva

La presente invención también hace referencia al campo de la medicina predictiva en la que se utilizan análisis diagnósticos, análisis pronósticos, y pruebas clínicas de control para fines pronósticos (predictivos) para tratar de ese modo a un individuo profilácticamente. Por consiguiente, un aspecto de la presente invención hace referencia a análisis diagnósticos para la determinación de la expresión de la proteína y/o el ácido nucleico de TLCC-2 así como de la actividad TLCC-2, en el contexto de una muestra biológica (p. ej., sangre, suero, células, tejido) para determinar de ese modo si un individuo está aquejado de una enfermedad o trastorno, o está en riesgo de desarrollar un trastorno, asociado con la expresión o actividad de TLCC-2 aberrante o no deseada. La invención también proporciona análisis pronósticos (o predictivos) para determinar si un individuo está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la expresión o actividad de la proteína o el ácido nucleico de TLCC-2. Por ejemplo, se pueden analizar mutaciones en un gen TLCC-2 en una muestra biológica. Tales análisis se pueden utilizar con fines pronósticos o predictivos para tratar de ese modo profilácticamente a un individuo antes del comienzo de un trastorno caracterizado por o asociado con la expresión o actividad de la proteína o el ácido nucleico de TLCC-2.

Otro aspecto de la invención hace referencia al control de la influencia de agentes (p. ej., fármacos, compuestos) sobre la expresión o la actividad de TLCC-2 en pruebas clínicas.

Estos y otros agentes se describen con mayor detalle en las siguientes secciones.

1. Análisis diagnósticos

Un método ilustrativo para detectar la presencia o ausencia de proteína o ácido nucleico de TLCC-2 en una muestra biológica implica obtener una muestra biológica de un sujeto de ensayo y poner en contacto la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar una proteína o ácido nucleico de TLCC-2 (p. ej., ARNm, o ADN genómico) que codifica una proteína TLCC-2 de manera que se detecta la presencia de proteína o ácido nucleico de TLCC-2 en la muestra biológica. Un agente preferido para detectar ARNm o ADN genómico de TLCC-2 es una sonda de ácido nucleico marcada capaz de hibridar con ARNm o ADN genómico de TLCC-2. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, el ácido nucleico de TLCC-2 mostrado en la SEQ ID NO:1 o 3, o una porción del mismo, tal como un oligonucleótido de al menos 15, 30, 50, 100, 250 o 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente en condiciones restrictivas con ARNm o ADN genómico de TLCC-2. Otras sondas adecuadas para su uso en los análisis diagnósticos de la invención se describen en la presente memoria.

Un agente preferido para detectar la proteína TLCC-2 es un anticuerpo capaz de unirse a la proteína TLCC-2, preferiblemente un anticuerpo con una marca detectable. Los anticuerpos pueden ser policlonales, o más preferiblemente, monoclonales. Se puede utilizar un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (p. ej., Fab o F(ab')2). Se pretende que el término "marcado", con respecto a la sonda o el anticuerpo, abarque el marcaje directo de la sonda o anticuerpo acoplando (esto es, uniendo físicamente) una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como el marcaje indirecto de la sonda o anticuerpo mediante reactividad con otro reactivo que está marcado directamente. Los ejemplos de marcaje indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente y el marcaje de un extremo de una sonda de ADN con biotina de manera que puede ser detectada con estreptavidina marcada fluorescentemente. Se pretende que el término "muestra biológica" incluya tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes en un sujeto. Esto es, el método de detección de la invención se puede utilizar para detectar ARNm, proteína, o ADN genómico de TLCC-2 en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para la detección de ARNm de TLCC-2 incluyen hibridaciones Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de proteína TLCC-2 incluyen análisis de inmunoabsorción con enzima ligada (ELISA), las transferencias Western, las inmunoprecipitaciones y la inmunifluorescencia. Las técnicas in vitro para la detección de ADN genómico de TLCC-2 incluyen las hibridaciones Southern. Además, las técnicas in vivo para la detección de proteína TLCC-2 incluyen la introducción en un sujeto de un anticuerpo anti-TLCC-2 marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser marcado con un marcador radiactivo cuya presencia y localización en un sujeto puede ser detectada mediante técnicas de formación de imágenes convencionales.

En una realización, la muestra biológica contiene moléculas de proteína del sujeto de ensayo. Alternativamente, la muestra biológica puede contener moléculas de ARNm del sujeto de ensayo o moléculas de ADN genómico del sujeto de ensayo. Una muestra biológica preferida es una muestra de suero aislada de un sujeto mediante medios convencionales.

En otra realización, los métodos implican adicionalmente obtener una muestra biológica de control de un sujeto de control, poner en contacto la muestra de control con un compuesto o agente capaz de detectar la proteína, el ARNm, o el ADN genómico de TLCC-2, de manera que se detecta la presencia de proteína, ARNm o ADN genómico de TLCC-2 en la muestra biológica, y comparar la presencia de proteína, ARNm o ADN genómico de TLCC-2 de la muestra de control con la presencia de proteína, ARNm o ADN genómico de TLCC-2 en la muestra de ensayo.

La invención también abarca kits para detectar la presencia de TLCC-2 en una muestra biológica. Por ejemplo, el kit puede comprender un compuesto o agente marcado capaz de detectar la proteína o el ARNm de TLCC-2 en una muestra biológica; los medios para determinar la cantidad de TLCC-2 en la muestra; y los medios para comparar la cantidad de TLCC-2 en la muestra con un patrón. El compuesto o agente puede estar empaquetado en un contenedor adecuado. El kit puede comprender adicionalmente las instrucciones para utilizar el kit para detectar la proteína o ácido nucleico de TLCC-2.

2. Análisis pronósticos

Los métodos diagnósticos descritos en la presente memoria se pueden utilizar además para identificar sujetos que tienen o están en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante o no deseada de TLCC-2. Como se emplea en esta memoria, el término "aberrante" incluye una expresión o actividad de TLCC-2 que se aparta de la expresión o actividad de TLCC-2 de tipo salvaje. La expresión o actividad aberrante incluye un aumento o disminución de la expresión o actividad, así como una expresión o actividad que no sigue el patrón de expresión evolutivo o el patrón de expresión subcelular de tipo salvaje. Por ejemplo, se pretende que la expresión o actividad aberrante de TLCC-2 incluya los casos en los que una mutación en el gen TLCC-2 hace que el gen TLCC-2 presente una reducción de la expresión o un aumento de la expresión y las situaciones en las que tales mutaciones dan como resultado una proteína TLCC-2 no funcional o una proteína que no funciona de la manera salvaje, p. ej., una proteína que no interacciona con un sustrato de TLCC-2, p. ej., una subunidad o ligando no de canal de calcio y/o una subunidad o ligando no de receptor vainilloide, o una que interacciona con un sustrato que no es de TLCC-2, p. ej. una subunidad o ligando no del canal de calcio y/o una subunidad o ligando no del receptor vainilloide. Como se emplea en esta memoria, el término "no deseado" incluye un fenómeno no deseado implicado en una respuesta biológica, tal como la proliferación celular. Por ejemplo, el término no deseado incluye una expresión o actividad de TLCC-2 que no es deseable en un sujeto.

Los análisis descritos en la presente memoria, tales como los análisis diagnósticos precedentes o los siguientes análisis, se pueden utilizar para identificar un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con una regulación errónea de la actividad de la proteína TLCC-2 o de la expresión del ácido nucleico, tal como un trastorno del SNC (p. ej., un trastorno neurodegenerativo, un trastorno con dolor, o un trastorno de la proliferación, crecimiento, diferenciación, o migración celular). Alternativamente, los análisis pronósticos se pueden utilizar para identificar un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con una regulación errónea de la actividad de la proteína TLCC-2 o de la expresión del ácido nucleico, tal como un trastorno del SNC, un trastorno con dolor, o un trastorno de la proliferación, crecimiento, diferenciación, migración celular. De este modo, la presente invención proporciona un método para identificar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante o no deseada de TLCC-2 en la cual se obtiene una muestra de ensayo de un sujeto y se detecta proteína o ácido nucleico de TLCC-2 (p. ej., ARNm o ADN genómico), donde la presencia de proteína o ácido nucleico de TLCC-2 es un diagnóstico para un sujeto que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con una expresión o actividad aberrante o no deseada de TLCC-2. Como se emplea en esta memoria, una "muestra de ensayo" hace referencia a una muestra biológica obtenida de un sujeto de interés. Por ejemplo, una muestra de ensayo puede ser un fluido biológico (p. ej., suero), una muestra de células, p. ej., células neuronales, o tejido.

Además, los análisis pronósticos descritos en la presente memoria se pueden utilizar para determinar si se puede administrar a un sujeto un agente (p. ej., un agonista, antagonista, peptidomimético, proteína, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña, u otro fármaco candidato) para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante o no deseada de TLCC-2. Por ejemplo, tales métodos se pueden utilizar para determinar si un sujeto puede ser tratado eficazmente con un agente para un trastorno del SNC, un trastorno con dolor, o un trastorno de la proliferación, crecimiento, diferenciación, o migración celular. De este modo, la presente invención proporciona métodos para determinar si un sujeto puede ser tratado eficazmente con un agente para un trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante o no deseada de TLCC-2 en los cuales se obtiene una muestra de ensayo y se detecta la expresión o actividad de la proteína o el ácido nucleico de TLCC-2 (p. ej., donde la abundancia de la expresión o actividad de la proteína o ácido nucleico de TLCC-2 es diagnóstica para un sujeto al que se puede administrar el agente para tratar un trastorno asociado con una expresión o actividad aberrante o no deseada de TLCC-2).

Los métodos de la invención también se pueden utilizar para detectar alteraciones genéticas en un gen TLCC-2, determinando de ese modo si un sujeto con el gen alterado está en riesgo de un trastorno caracterizado por una regulación errónea de la actividad de la proteína TLCC-2 o la expresión de un ácido nucleico, tal como un trastorno del SNC, un trastorno con dolor, o un trastorno del crecimiento, diferenciación, o migración celular. En las realizaciones preferidas, los métodos incluyen la detección, en una muestra de células del sujeto, de la presencia o ausencia de una alteración genética caracterizada por al menos uno de una alteración que afecta la integridad de un gen que codifica una proteína TLCC-2, o la expresión errónea del gen TLCC-2. Por ejemplo, tales alteraciones genéticas pueden ser detectadas averiguando la existencia de al menos uno de 1) una deleción de uno o más nucleótidos de un gen TLCC-2; 2) una adición de uno o más nucleótidos a un gen TLCC-2; 3) una sustitución de uno o más nucleótidos de un gen TLCC-2, 4) una transposición cromosómica de un gen TLCC-2; 5) una alteración del nivel del transcrito del ARN mensajero de un gen TLCC-2, 6) una modificación aberrante de un gen TLCC-2, tal como el patrón de metilación del ADN genómico, 7) la presencia de un patrón de empalme de tipo no salvaje de un transcrito de ARN mensajero de un gen TLCC-2, 8) un nivel de proteína TLCC-2 de tipo no salvaje, 9) una pérdida alélica de un gen TLCC-2, y 10) una modificación post-traduccional inapropiada de una proteína TLCC-2. Como se describe en la presente memoria, existen un gran número de análisis conocidos en la técnica que se pueden utilizar para detectar alteraciones en un gen TLCC-2. Una muestra biológica preferida es una muestra de tejido o suero aislada mediante métodos convencionales de un sujeto.

En ciertas realizaciones, la detección de la alteración implica el uso de una sonda/cebador en una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (véase, p. ej., las patentes de los Estados Unidos Núms. 4.683.195 y 4.683.202), tales como la PCR de anclaje o PCR RACE, o, alternativamente, en una reacción en cadena de la ligasa (LCR) (véase, p. ej., Landegran et al. (1988) Science 241:1077-1080; y Nakazawa et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:360-364), el último de los cuales puede resultar particularmente útil para detectar mutaciones puntuales en el gen TLCC-2 (véase Abravaya et al. (1995) Nucleic Acids Res.23:675-682). Este método puede incluir las etapas de recoger una muestra de células de un sujeto, aislar el ácido nucleico (p. ej., genómico, ARNm o ambos) de las células de la muestra, poner en contacto la muestra de ácido nucleico con uno o más cebadores que hibridan específicamente con un gen TLCC-2 en condiciones tales que se produzca la hibridación y la amplificación del gen TLCC-2 (si está presente), y detectar la presencia o ausencia de un producto de amplificación, o detectar el tamaño del producto de amplificación y comparar la longitud con una muestra de control. Se prevé que pueda ser deseable utilizar la PCR y/o la LCR como etapa de amplificación preliminar junto con cualquiera de las técnicas utilizadas para detectar mutaciones descritas en la presente memoria.

Los métodos de amplificación alternativos incluyen: replicación de secuencias auto-sostenida (Guatelli, J.C. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), sistema de amplificación transcripcional (Kwoh, D.Y. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Replicasa Q-Beta (Lizardi, P.M. et al. (1988) Bio-Technology 6:1197), o cualquier otro método de amplificación de ácido nucleico, seguido de la detección de las moléculas amplificadas utilizando mecanismos bien conocidos por los expertos en la técnica. Estos esquemas de detección son especialmente útiles para la detección de moléculas de ácido nucleico si tales moléculas están presentes en números muy bajos.

En una realización alternativa, se pueden identificar mutaciones en el gen TLCC-2 a partir de una célula de muestra mediante alteraciones en los patrones de escisión de las enzimas de restricción. Por ejemplo, se aísla el ADN de la muestra y de control, se amplifica (opcionalmente), se digiere con una o más endonucleasas de restricción, y se determinan las longitudes de los fragmentos mediante electroforesis en gel y se comparan. Las diferencias en las longitudes de los fragmentos entre el ADN de la muestra de y de control indican las mutaciones en el ADN de la muestra. Por otra parte, se puede emplear la utilización de ribozimas específicas de la secuencia (véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.498.531) para puntuar la presencia de mutaciones específicas mediante el desarrollo o la pérdida de un sitio para la escisión por ribozima.

En otras realizaciones, se pueden identificar las mutaciones genéticas en TLCC-2 hibridando una muestra y los ácidos nucleicos de control, p. ej., ADN o ARN, con matrices de elevada densidad que contienen cientos o miles de sondas oligonucleotídicas (Cronin, M.T. et al. (1996) Human Mutation 7: 244-255; Kozal, M.J. et al. (1996) Nature Medicine 2: 753-759). Por ejemplo, se pueden identificar mutaciones genéticas en TLCC-2 en matrices bidimensionales que contienen sondas de ADN generadas con luz como describen Cronin, M.T. et al. supra. En resumen, se puede utilizar una primera matriz de hibridación de sondas para barrer tramos largos de ADN en una muestra y un control para identificar cambios de bases entre las secuencias realizando matrices lineales de sondas solapantes sucesivas. Esta etapa permite la identificación de mutaciones puntuales. Esta etapa está seguida de una segunda matriz de hibridación que permite la caracterización de mutaciones específicas utilizando matrices de sondas especializadas, más pequeñas, complementarias a todas las variantes o mutaciones detectadas. Cada matriz de mutaciones está compuesta por grupos de sondas paralelas, una complementaria al gen de tipo salvaje y la otra complementaria al gen mutante.

En otra realización más, se puede utilizar cualquiera de una variedad de reacciones de secuenciación conocidas en la técnica para secuenciar directamente el gen TLCC-2 y detectar las mutaciones comparando la secuencia de la TLCC-2 de la muestra con la correspondiente secuencia de tipo salvaje (control). Los ejemplos de las reacciones de secuenciación incluyen aquellas basadas en técnicas desarrolladas por Maxam y Gilbert ((1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:560) o Sanger ((1977) Proc. Natl. Acad Sci. USA 74:5463). Asimismo se contempla que se pueda utilizar cualquiera de una variedad de procedimientos de secuenciación automatizados cuando se realizan los análisis diagnósticos ((1995) Biotechniques 19:448), incluyendo la secuenciación mediante espectrometría de masas (véase, p. ej., Solicitud de Patente Internacional Núm. 94/16101; Cohen et al. (1996) Adv. Chromatogr. 36:127-162; y Griffin et al. (1993) Appl. Biochem. Biotechnol. 38:147-159).

Otros métodos para detectar mutaciones en el gen TLCC-2 incluyen los métodos en los que se utiliza la protección frente a agentes de escisión para detectar bases emparejadas erróneamente en heterodúplex de ARN/ARN o ARN/ADN (Myers et al. (1985) Science 230:1242). En general, el mecanismo de la técnica de "escisión de emparejamientos erróneos" comienza proporcionando heterodúplex formados hibridando ARN o ADN (marcado) que contienen la secuencia de TLCC-2 de tipo salvaje con ARN o ADN potencialmente mutante obtenido a partir de una muestra de tejido. Los dúplex de doble hebra se tratan con un agente que escinde regiones de hebra sencilla del dúplex tales como los que existirán debido a emparejamientos erróneos entre las hebras de control y de la muestra. Por ejemplo, los dúplex de ARN/ADN se pueden tratar con ARNasa e híbridos de ADN/ADN tratados con nucleasa S1 para digerir enzimáticamente las regiones emparejadas erróneamente. En otras realizaciones, se pueden tratar los dúplex de ADN/ADN o ARN/ADN con hidroxilamina o tetróxido de osmio y con piperidina con el fin de digerir regiones emparejadas erróneamente. Tras la digestión de las regiones emparejadas erróneamente, el material resultante se separa después por tamaños en geles de poliacrilamida desnaturalizantes para determinar el sitio de la mutación. Véase, por ejemplo, Cotton et al. (1988) Proc. Natl Acad Sci USA 85:4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymol. 217:286-295. En una realización preferida, se puede marcar el ADN o ARN de control para su detección.

En otra realización más, la reacción de escisión de emparejamientos erróneos emplea una o más proteínas que reconocen pares de bases emparejados erróneamente en el ADN de doble hebra (también denominadas enzimas de "reparación de emparejamientos erróneos del ADN") en sistemas definidos para detectar y mapear mutaciones puntuales en los ADNc de TLCC-2 obtenidos de muestras de células. Por ejemplo, la enzima mutY de E. coli escinde A en los emparejamientos erróneos G/A y la timidina ADN glicosilasa de las células HeLa escinde la T en los emparejamientos erróneos G/T (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15:1657-1662). De acuerdo con una realización ilustrativa, una sonda basada en una secuencia de TLCC-2, p. ej., una secuencia de TLCC-2 de tipo salvaje, es hibridada a un ADNc u otro producto de ADN de una o varias células de ensayo. El dúplex se trata con una enzima de reparación de emparejamientos erróneos de ADN, y los productos de escisión, si los hubiera, pueden ser detectados a partir de protocolos de electroforesis o similares. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos Núm. 5.459.039.

En otras realizaciones, se utilizarán alteraciones en la movilidad electroforética para identificar mutaciones en los genes de TLCC-2. Por ejemplo, se puede utilizar el polimorfismo en la conformación de cadenas sencillas (SSCP) para detectar diferencias en la movilidad electroforética entre ácidos nucleicos mutantes y de tipo salvaje (Orita et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.: 86:2766, véase también Cotton (1993) Mutat. Res. 285: 125-144; y Hayashi (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9:73-79). Los fragmentos de ADN de hebra sencilla de los ácidos nucleicos de TLCC-2 de la muestra y de control serán desnaturalizados y se dejará que se renaturalicen. La estructura secundaria de los ácidos nucleicos de hebra sencilla varía de acuerdo con la secuencia, la alteración resultante en la movilidad electroforética permite la detección incluso de un cambio de base individual. Los fragmentos de ADN pueden ser marcados o detectados con sondas marcadas. La sensibilidad del análisis puede ser intensificada utilizando ARN (en lugar de ADN), en el cual la estructura secundaria es más sensible a un cambio en la secuencia. En una realización preferida, el método sujeto utiliza análisis de heterodúplex para separar moléculas de heterodúplex de doble hebra basándose en los cambios en la movilidad electroforética (Keen et al. (1991) Trends Genet 7:5).

En otra realización más se analiza el movimiento de los fragmentos mutantes o de tipo salvaje en geles de poliacrilamida que contienen un gradiente de desnaturalizante utilizando electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) (Myers et al. (1985) Nature 313:495). Cuando se utiliza la DGGE como método de análisis, se modificará el ADN para asegurarse de que no se desnaturaliza completamente, por ejemplo añadiendo una pinza de GC de aproximadamente 40 pb de ADN rico en GC de elevado punto de fusión mediante PCR. En una realización adicional, se utiliza un gradiente de temperatura en lugar de un gradiente desnaturalizante para identificar diferencias en la movilidad del ADN de control y de la muestra (Rosenbaum y Reissner (1987) Biophys Chem 265:12753).

Los ejemplos de otras técnicas para detectar mutaciones puntuales incluyen, pero no están limitados a, hibridación selectiva de oligonucleótidos, amplificación selectiva, o prolongación selectiva de cebadores. Por ejemplo, se pueden preparar cebadores oligonucleotídicos en los cuales la mutación conocida se coloca en el centro y después se hibrida con ADN diana en condiciones que permiten la hibridación solamente si se encuentra el emparejamiento perfecto (Saiki et al. (1986) Nature 324:163); Saiki et al. (1989) Proc. Natl Acad Sci USA 86:6230); Semejantes oligonucleótidos específicos de los alelos se hibridan con el ADN diana amplificado por PCR o a numerosas mutaciones diferentes cuando los oligonucléotidos están anclados a la membrana hibridante e hibridan con el ADN diana marcado.

Alternativamente, se puede utilizar la tecnología de la amplificación específica de los alelos que depende de la amplificación selectiva por PCR junto con la presente invención. Los oligonucleótidos utilizados como cebadores para la amplificación específica pueden llevar la mutación de interés en el centro de la molécula (de manera que la amplificación depende de la hibridación diferencial) (Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17:2437-2448) o en el final del extremo 3' de un cebador donde, en condiciones apropiadas, se puede evitar el emparejamiento erróneo, o reducir la prolongación de la polimerasa (Prossner (1993) Tibtech 11:238). Además puede ser deseable introducir un sitio de restricción novedoso en la región de la mutación para crear una detección basada en la escisión (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1). Se prevé que en ciertas realizaciones la amplificación también se pueda realizar utilizando la ligasa Taq para la amplificación (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:189). En tales casos, la ligación ocurrirá solamente si existe un perfecto emparejamiento en el extremo 3' de la secuencia 5' haciendo posible detectar la presencia de una mutación conocida en un sitio específico buscando la presencia o ausencia de amplificación.

Los métodos descritos en la presente memoria se pueden realizar, por ejemplo, utilizando kits de diagnóstico pre-envasados que comprenden al menos un ácido nucleico sonda o un reactivo de anticuerpo descrito en la presente memoria, que puede ser utilizado convenientemente, p. ej., en entornos clínicos para diagnosticar pacientes que muestran síntomas o una historia familiar de una enfermedad o un padecimiento que implica un gen TLCC-2.

Además, se puede utilizar cualquier tipo de célula o tejido en el que TLCC-2 es expresada en los análisis pronósticos descritos en la presente memoria.

D. Métodos de tratamiento

La presente invención proporciona métodos tanto profilácticos como terapéuticos de tratamiento de un sujeto en riesgo de (o susceptible de) un trastorno o que tiene un trastorno asociado con una expresión o actividad aberrante o no deseada de TLCC-2, p. ej. un trastorno del SNC, un trastorno con dolor, o un trastorno de proliferación, crecimiento, diferenciación, o migración celular.

"Tratamiento", o "tratar" según se utiliza en la presente memoria, se define como la aplicación o administración de un agente terapéutico a un paciente, o la aplicación o administración de un agente terapéutico a un tejido o línea celular aislado de un paciente, que tiene una enfermedad o trastorno, un síntoma de enfermedad o trastorno o una predisposición a una enfermedad o trastorno, con el fin de curar, sanar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, mejorar, corregir o afectar la enfermedad o trastorno, los síntomas de la enfermedad o trastorno, o la predisposición a la enfermedad. Un agente terapéutico incluye, pero no está limitado a, moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos, ribozimas y oligonucleótidos antisentido.

Con respecto a los métodos tanto profilácticos como terapéuticos de tratamiento, tales tratamientos pueden ser adaptados o modificados específicamente, basándose en el conocimiento obtenido del campo de la farmacogenómica. La "farmacogenómica", como se emplea en esta memoria, hace referencia a la aplicación de las tecnologías de la genómica tales como la secuenciación de genes, la genética estadística, y el análisis de la expresión de los genes a los fármacos en desarrollo clínico y en el mercado. Más específicamente, el término hace referencia al estudio de cómo determinan los genes del paciente su respuesta a un fármaco (p. ej., el "fenotipo de respuesta al fármaco", o el "genotipo de respuesta al fármaco" de un paciente). De este modo, otro aspecto de la invención proporciona métodos para adaptar el tratamiento profiláctico o terapéutico de un individuo con moléculas de TLCC-2 de la presente invención o moduladores de TLCC-2 de acuerdo con el genotipo de respuesta al fármaco del individuo. La farmacogenómica permite a un clínico o médico dirigir tratamientos profilácticos o terapéuticos a pacientes que se beneficiarán sumamente del tratamiento y evitar el tratamiento de pacientes que experimentarán efectos secundarios tóxicos relacionados con el fármaco.

1. Métodos profilácticos

En un aspecto, la invención proporciona un método para prevenir en un sujeto, una enfermedad o afección asociada con una expresión o actividad aberrante o no deseada de TLCC-2, administrando al sujeto una TLCC-2 o un agente que modula la expresión de TLCC-2 o al menos una actividad de TLCC-2. Los sujetos en riesgo de una enfermedad causada por, o a la que contribuye, una expresión o actividad aberrante o no deseada de TLCC-2, pueden ser identificados, por ejemplo, mediante cualquiera de una combinación de análisis diagnósticos o pronósticos como se describe en la presente memoria. La administración de un agente profiláctico se puede producir antes de la manifestación de los síntomas característicos de la aberración de TLCC-2, de manera que se evite una enfermedad o trastorno o, alternativamente, se retrase su progreso. Dependiendo del tipo de aberración de TLCC-2, por ejemplo, se puede utilizar una TLCC-2, un agente agonista de TLCC-2 o un agente antagonista de TLCC-2 para tratar al sujeto. El agente apropiado puede ser determinado basándose en los análisis de escrutinio descritos en la presente memoria.

2. Métodos terapéuticos

Otro aspecto de la invención hace referencia a los métodos de modulación de la expresión o actividad de TLCC-2 con fines terapéuticos. Por consiguiente, en una realización ilustrativa, el método modulador de la invención implica poner en contacto una célula con una TLCC-2 o un agente que modula una o más de las actividades de la proteína TLCC-2 asociada con la célula. Un agente que modula la actividad de la proteína TLCC-2 puede ser un agente como se ha descrito en la presente memoria, tal como un ácido nucleico o una proteína, una molécula diana de origen natural de una proteína TLCC-2 (p. ej., un sustrato de TLCC-2), un anticuerpo de TLCC-2, un agonista o antagonista de TLCC-2, un peptidomimético de un agonista o antagonista de TLCC-2, u otra molécula pequeña. En una realización, el agente estimula una o más actividades de TLCC-2. Los ejemplos de tales agentes estimuladores incluyen la proteína TLCC-2 activa y una molécula de ácido nucleico que codifica TLCC-2 que ha sido introducida en la célula. En otra realización, el agente inhibe una o más actividades de TLCC-2. Los ejemplos de tales agentes inhibidores incluyen moléculas de ácido nucleico de TLCC-2 antisentido, ribozimas, anticuerpos anti-TLCC-2, e inhibidores de TLCC-2. Estos métodos moduladores se puede realizar in vitro (p. ej., cultivando la célula con el agente) o, alternativamente, in vivo (p. ej., administrando el agente a un sujeto). Como tal, la presente invención proporciona métodos de tratamiento de un individuo aquejado de una enfermedad o trastorno caracterizado por una expresión o actividad de una proteína o molécula de ácido nucleico de TLCC-2 aberrante o no deseada, p. ej., un trastorno con dolor. En una realización, el método implica administrar un agente (p. ej., un agente identificado por un análisis de escrutinio descrito en la presente memoria), o una combinación de agentes que modula (p. ej., regula al alza o regula a la baja) la expresión o actividad de TLCC-2. En otra realización, el método implica administrar una proteína o ácido nucleico de TLCC-2 como terapia para compensar una expresión o actividad de TLCC-2 reducida, aberrante, o no deseada.

La estimulación de la actividad de TLCC-2 es deseable en situaciones en las que TLCC-2 es regulada a la baja anómalamente y/o en las que es probable que un incremento de la actividad de TLCC-2 tenga un efecto beneficioso. Del mismo modo, la inhibición de la actividad de TLCC-2 es deseable en situaciones en las que TLCC-2 es regulada al alza anómalamente y/o en las que es probable que un descenso de la actividad de TLCC-2 tenga un efecto beneficioso, p. ej., en trastornos con dolor.

Ejemplos Ejemplo 1 Identificación y caracterización de ADNc de TLCC-2 humano

En este Ejemplo, se describe la identificación y caracterización del gen que codifica la TLCC-2 humana (clon Fbh54420FL).

Aislamiento del ADNc de TLCC-2

La invención está basada, al menos en parte, en el descubrimiento de un gen humano que codifica una proteína novedosa, referida en la presente memoria como TLCC-2. Se determinó la secuencia completa del clon Fbh54420FL humano y se encontró que contenía un marco de lectura abierto denominado "TLCC-2" humana. La secuencia de nucleótidos del gen TLCC-2 humano se expone en las Figuras 1 y en la Lista de Secuencias como SEQ ID NO:1 y 3. La secuencia de aminoácidos del producto de expresión de TLCC-2 humano se expone en las Figuras 1 y en la Lista de Secuencias como SEQ ID NO: 2.

La secuencia de nucleótidos que codifica la proteína TLCC-2 humana se muestra en la Figura 1 y se expone como SEQ ID NO: 1. La proteína codificada por este ácido nucleico comprende aproximadamente 580 aminoácidos y tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 1 y expuesta como SEQ ID NO: 2. La región codificante (marco de lectura abierto) del SEQ ID NO: 1 se expone como SEQ ID NO: 3.

Análisis de las moléculas de TLCC-2 humanas

Una búsqueda BLASTN 2.0 frente a la base de datos dbEST, utilizando una puntuación de 100 y una longitud de la palabra de 12 (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403) de la secuencia de nucleótidos de la TLCC-2 humana reveló que IC54420 humano es idéntico en un 99% al clon de ADNc Homo sapiens tb24a12.x1 NCI_CGAP_kid12 IMAGEN:2055262 3' similar a WP:R13A5.1 CE01370 (Número de Acceso AI307240) a lo largo de los nucleótidos 2077 a 1377. La búsqueda reveló adicionalmente que la TLCC-2 humana es idéntica en un 98% al clon de ADNc Homo sapiens 0004 de cerebro fetal Schneider au44h03.x1 IMAGEN:2517653 3' similar a WP:R13A5.1 CE01370 (Número de Acceso AI816064) a lo largo de los nucleótidos 2079-1375. Esta búsqueda reveló adicionalmente que la TLCC-2 humana es idéntica en un 97% al clon de ADNc Homo sapiens wv36f01.x1 NCI_CGAP_Ov18 IMAGEN:2531641 3' similar a WP:R13A5.1 CE01370 (Número de Acceso AI951554) a lo largo de los nucleótidos 2088 a 1407. Esta búsqueda reveló adicionalmente que la TLCC-2 humana es idéntica en un 97% al clon de ADNc Homo sapiens wp80f10.x1 NCI_CGAP_Brn25 IMAGEN:2468107 3' similar a WP:R13A5.1 CE01370 (Número de Acceso AI942492) a lo largo de los nucleótidos 2072-1422. La búsqueda reveló adicionalmente que la TLCC-2 humana es idéntica en un 96% al clon de ADNc Homo sapiens anr72c11.s1 NCI_CGAP_Pr24 IMAGEN:1173524 similar a WP:R13A5.1 CE01370 (Número de Acceso AA641031) a lo largo de los nucleótidos 2073-1407.

Una búsqueda BLASTX 2.0 frente a la base de datos NRP/protot, utilizando una puntuación de 100 y una longitud de la palabra de 3 (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403), de la secuencia de nucleótidos traducida de la TLCC-2 humana reveló que la TLCC-2 humana es idéntica en un 67% o menos a los fragmentos (p. ej., fragmentos de 185 aminoácidos o menos) de un producto proteico sin nombre de Homo sapiens (Número de Acceso AK001868). La búsqueda reveló adicionalmente que la TLCC-2 humana es idéntica en un 27% o menos a los fragmentos (p. ej., fragmentos de 75 aminoácidos o menos) de la enfermedad poliquística del riñón humana y el receptor de la proteína relacionada con la gelatina del huevo (Número de Acceso AF116458). Esta búsqueda reveló adicionalmente que la TLCC-2 humana es idéntica en un 43% o menos a los fragmentos (p. ej., fragmentos de 59 aminoácidos o menos) de la enfermedad poliquística del riñón y del receptor de la proteína relacionada con la gelatina del huevo de Mus musculus (Número de Acceso AF116459). Esta búsqueda reveló adicionalmente que la TLCC-2 humana es idéntica en un 70% o menos a los fragmentos (p. ej., fragmentos de 29 aminoácidos o menos) de una proteína hipotética de 110 aminoácidos de longitud de Aeropyrum pernix (Número de Acceso AP000060) a lo largo de toda la longitud de esta proteína.

Un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de TLCC-2 humana con las secuencias de aminoácidos del receptor vainilloide I y el receptor vainilloide 2 de Homo sapiens (Números de Acceso AAD26363 y AAD41724, SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:5, respectivamente) utilizando el programa de alineamiento múltiple de secuencias CLUSTAL W (1.74) se muestra en la Figura 6. Un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de TLCC-2 humana con la secuencia de aminoácidos de la proteína 2 de la enfermedad poliquística del riñón de Mus musculus (Número de Acceso NP032887, SEQ ID NO:6), utilizando el programa de alineamiento múltiple de secuencias CLUSTAL W (1.74) se muestra en la Figura 7A-B. Un alineamiento de la secuencia de aminoácidos de TLCC-2 humana con la secuencia de aminoácidos de la melastatina humana (Número de Acceso AAC8000, SEQ ID NO:7), utilizando el programa de alineamiento múltiple de secuencias CLUSTAL W (1.74) se muestra en la Figura 8A-B.

También se realizó una búsqueda frente a la base de datos Memsat (Figuras 2 y 3), dando como resultado la identificación de seis dominios transmembrana en la secuencia de aminoácidos de la TLCC-2 humana (SEQ ID NO:2) aproximadamente en los restos 70-86, 299-317, 354-371, 385-416, 428-447, y 497-521.

También se realizó una búsqueda frente a la base de datos Prosite (Figura 9) dando como resultado la identificación de cuatro sitios de N-glicosilación en la secuencia de aminoácidos de la TLCC-2 humana (SEQ ID NO:2) aproximadamente en los restos 159-162, 179-182, 220-223, y 230-233.

También se realizó una búsqueda frente a la base de datos HMM (Figura 4) dando como resultado la identificación de un dominio de fibronectina de tipo III en la secuencia de aminoácidos de la TLCC-2 humana (SEQ ID NO:2) aproximadamente en los restos 202-269 (puntuación = 5).

También se realizó una búsqueda frente a la base de datos ProDom (Figura 4) dando como resultado la identificación de un dominio de proteína RNA-4 de 31 K en la secuencia de aminoácidos de la TLCC-2 humana (SEQ ID NO:2) aproximadamente en los restos 397-443 (puntuación = 73). Los resultados de la búsqueda se exponen en la Figura 5.

Distribución en los tejidos de ARNm de TLCC-2 humana mediante análisis Northern

Este Ejemplo describe la distribución en los tejidos del ARNm de TLCC-2, determinada mediante análisis Northern.

Se realizan hibridaciones de transferencia Northern con las diversas muestras de ARN en condiciones normalizadas y se lavan en condiciones restrictivas, esto es, 0,2xSSC a 65ºC. La sonda de ADN se marca radiactivamente con dCTP-P^{32} utilizando el kit Prime-It (Stratagene, La Jolla, CA) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Los filtros que contienen ARNm humano (MultiTissue Northern I y MultiTissue Northern II de Clontech, Palo Alto, CA) se sondean en solución de hibridación ExpressHyb (Clontech) y se lavan en condiciones muy restrictivas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Distribución en los tejidos de ARNm de TLCC-2 mediante análisis in situ

Para el análisis in situ, se congelaron primero sobre hielo seco diversos tejidos, p. ej. tejidos obtenidos de cerebro y médula espinal de mono y rata. Se post-fijaron secciones de diez micrometros de grosor de los tejidos con formaldehído al 4% en DEPC tratado con 1X solución salina tamponada con fosfato a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de ser enjuagadas dos veces en DEPC 1X solución salina tamponada con fosfato y una vez en trietanolamina-HCl 0,1 M (pH 8,0). Después de la incubación en anhídrido acético al 0,25%-trietanolamina-HCl 0,1 M durante 10 minutos, las secciones se enjuagaron en DEPC 2X SSC (1X SSC es NaCl 0,15 M más citrato de sodio 0,015 M). Después el tejido se hidrató por medio de una serie de lavados con etanol, se incubó en cloroformo al 100% durante 5 minutos, y después se enjuago en etanol al 100% durante 1 minuto y etanol del 95% durante 1 minuto y se dejó secar al aire.

Las hibridaciones se realizaron con sondas de ARNc radiomarcadas con S^{35} (5 X 10^{7} cpm/ml). Las sondas se incubaron en presencia de una solución que contenía NaCl 600 mM, Tris 10 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM, ARN de esperma de salmón sometido a cizalla al 0,01%, ARNt de levadura al 0,01%, ARN total de levadura de tipo X1 al 0,05%, 1X solución de Denhardt, formamida al 50%, sulfato de dextrano al 10%, ditiotreitol 100 mM, dodecilsulfato de sodio al 0,1% (SDS), y tiosulfato de sodio al 0,1% durante 18 horas a 55ºC.

Después de la hibridación, los portas se lavaron con 2X SSC. Luego se incubaron sucesivamente las secciones a 37ºC en TNE (una solución que contenía Tris-HCl 10 mM (pH 7,6), NaCl 500 mM, y EDTA 1 mM), durante 10 minutos, en TNE con 10 \mug de ARNasa A por ml durante 30 minutos, y finalmente en TNE durante 10 minutos. Después se enjuagaron los portas con 2X SSC a la temperatura ambiente, se lavaron con 2X SSC a 50ºC durante 1 hora, se lavaron con 0,2X SSC a 55ºC durante 1 hora, y 0,2X SSC a 60ºC durante 1 hora. Luego las secciones se deshidrataron rápidamente por medio de una serie de concentraciones con etanol-acetato de sodio 0,3 M antes de ser secadas al aire y expuestas a película para la formación de imágenes científicas Kodak Biomax MR durante 24 horas y sumergidas con posterioridad en fotoemulsión NB-2 y expuestas a 4ºC durante 7 días antes de ser reveladas y contrateñidas.

Los resultados de la hibridación in situ mostraron la expresión en cerebro de mono y rata (incluyendo córtex, cuerpo estriado, e hipocampo), médula espinal, y neuronas de los ganglios de la raíz dorsal (DRG).

La hibridación in situ en modelos animales de rata mostró una regulación al alza del gen TLCC-2 10 días después de la lesión por constricción crónica unilateral (CCI). Hubo regulación al alza de TLCC-2 siete días después de la axotomía y después de la inyección intraplantar de coadyuvante completo de Freund (CFA). Estos niveles disminuyeron hasta los niveles normales en momentos puntuales más tardíos. No se observaron efectos contralaterales. Estos resultados indican que las moléculas de TLCC-2 de la presente invención son reguladas al alza en respuesta a estímulos dolorosos, y están implicadas por lo tanto en la nocicepción. La modulación, p. ej., la inhibición, de la expresión o la actividad de las moléculas de la invención puede modular por lo tanto la nocicepción y proporcionar tratamiento para los trastornos con dolor.

Análisis de la expresión en tejidos de ARNm de TLCC-2 utilizando el análisis Taqman

Este Ejemplo describe la distribución en tejidos del ARNm de TLCC-2 humana en una variedad de células y tejidos, como se determina utilizando el procedimiento TaqMan®. El procedimiento Taqman® es un planteamiento cuantitativo basado en la PCR de transcripción inversa, para detectar ARNm. La reacción RT-PCR explota la actividad nucleasa 5' de la ADN Polimerasa AmpliTaq Gold® para escindir una sonda TaqMan® durante la PCR. En resumen, se generó ADNc de muestras de interés, p. ej., cerebro humano, médula espinal, corazón, riñón, hígado, pulmón, ganglios de la raíz dorsal, y piel, y se utilizó como material de partida para la amplificación por PCR. Además de los cebadores específicos del gen 5' y 3', se incluyó en la reacción una sonda oligonucleotídica específica del gen (complementaria a la región que estaba siendo amplificada) (esto es, la sonda Taqman®). La sonda TaqMan® incluye el oligonucleótido con un colorante informador fluorescente unido covalentemente al extremo 5' de la sonda (tal como FAM (6-carboxifluoresceína), TET (6-carboxi-4,7,2',7'-tetraclorofluoresceína), JOE (6-carboxi-4,5-dicloro-2,7-dimetoxifluoresceína), o VIC) y un colorante extintor (TAMRA (6-carboxi-N,N,N',N'-tetrametilrodamina) en el extremo 3' de la sonda.

Durante la reacción PCR, la escisión de la sonda separa el colorante informador y el colorante extintor, dando como resultado un aumento de fluorescencia del informador. La acumulación de los productos de la PCR se detecta directamente controlando el incremento en la fluorescencia del colorante informador. Cuando la sonda está intacta, la proximidad del colorante informador al colorante extintor produce la supresión de la fluorescencia del informador. Durante la PCR, si la diana de interés está presente, la sonda hibrida específicamente entre los sitios de los cebadores directo e inverso. La actividad nucleolítica 5'-3'de la ADN Polimerasa AmpliTaq® Gold escinde la sonda entre el informador y el extintor solamente si la sonda hibrida con la diana. Los fragmentos de la sonda son desplazados después de la diana, y la polimerización de la hebra continúa. El extremo 3' de la sonda se bloquea para evitar la prolongación de la sonda durante la PCR. Este proceso se produce en cada ciclo y no interfiere en la acumulación exponencial del producto. El ARN se preparó utilizando el método del trizol y se trató con ADNasa para separar el ADN genómico contaminante. El ADNc se sintetizó utilizando técnicas normalizadas. La síntesis de supuesto ADNc en ausencia de transcriptasa inversa dio como resultado muestras con una amplificación por PCR no detectable del gen de control lo que confirma la eliminación eficaz de contaminación por ADN genómico.

Dos paneles de tejidos humanos normales indicaron una amplia distribución de la expresión de la TLCC-2 humana, con la mayor expresión en cerebro humano, seguido de testículo, placenta, glándula suprarrenal, médula espinal, piel, y ganglios de la raíz dorsal (DRG) (Véanse las Figuras 10 y 11).

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Ejemplo 2 Expresión de proteína IC54420 recombinante en células bacterianas

En este Ejemplo, se expresa TLCC-2 como un polipéptido de fusión de glutationa-S-transferasa recombinante (GST) en E. coli y el polipéptido de fusión se aísla y se caracteriza. Específicamente, la TLCC-2 se fusiona con GST y este polipéptido de fusión se expresa en E. coli, p. ej., cepa PEB199. La expresión de la proteína de fusión GST-TLCC-2 en PEB199 es inducida con IPTG. El polipéptido de fusión recombinante es purificado de los productos lisados bacterianos brutos de la cepa PEB199 inducida mediante cromatografía de afinidad sobre cuentas de glutationa. Utilizando el análisis electroforético en gel de poliacrilamida del polipéptido purificado de los productos lisados bacterianos, se determina el peso molecular del polipéptido de fusión resultante.

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Ejemplo 3 Expresión de la proteína IC54420 recombinante en células COS

Para expresar el gen TLCC-2 en células COS, se utiliza el vector pcDNA/Amp de Invitrogen Corporation (San Diego, CA). Este vector contiene un origen de replicación de SV40, un gen de resistencia a ampicilina, un origen de replicación de E. coli, un promotor de CMV seguido de una región poliligadora, y un intrón de SV40 y un sitio de poliadenilación. Se clona un fragmento de ADN que codifica la proteína TLCC-2 completa y una etiqueta HA (Wilson et al. (1984) Cell 37:767) o una etiqueta FLAG fusionada en marco con su extremo 3' del fragmento en la región poliligadora del vector, colocando de ese modo la expresión de la proteína recombinante bajo el control del promotor de CMV.

Para construir el plásmido, se amplifica la secuencia de ADN de TLCC-2 mediante PCR utilizando dos cebadores. El cebador 5' contiene el sitio de restricción de interés seguido de aproximadamente veinte nucleótidos de la secuencia codificante de TLCC-2 empezando en el sitio de iniciación; la secuencia del extremo 3' contiene secuencias complementarias al otro sitio de restricción de interés, un codón de terminación de la traducción, la etiqueta HA o la etiqueta FLAG y los 20 últimos nucleótidos de la secuencia codificante de TLCC-2. El fragmento amplificado mediante PCR y el vector pCDNA/Amp se digieren con las enzimas de restricción apropiadas y el vector se desfosforila utilizando la enzima CIAP (New England Biolabs, Beverly, MA). Preferiblemente los dos sitios de restricción seleccionados son diferentes de manera que el gen TLCC-2 es insertado en la orientación correcta. La mezcla de ligadura se transforma en células de E. coli (se pueden utilizar cepas HB101, DH5\alpha, SURE, asequibles de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA), el cultivo transformado se cultiva en placa sobre placas de medio con ampicilina, y se seleccionan las colonias resistentes. El ADN plasmídico se aísla de los transformantes y se examina mediante análisis de restricción en busca de la presencia del fragmento correcto.

Con posterioridad se transfectan células COS con el ADN del plásmido TLCC-2-pcDNA/Amp utilizando los métodos de precipitación simultánea con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección, o electroporación. Se pueden encontrar otros métodos adecuados para transfectar células anfitrionas en Sambrook, J., Fritsh, E. F., y Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. La expresión del polipéptido IC54420 se detecta mediante radiomarcaje (se puede utilizar metionina-S^{35} o cisteína-S^{35} asequibles de NEN, Boston, MA) e inmunoprecipitación (Harlow, E. y Lane, D. Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988) utilizando un anticuerpo monoclonal específico de HA. En resumen, las células se marcan durante 8 horas con metionina-S^{35} (o cisteína-S^{35}). Los medios de cultivo se recogen después y las células se someten a lisis utilizando detergentes (tampón RIPA, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5). Tanto el producto lisado celular como el medio de cultivo se precipitan con un anticuerpo monoclonal específico de HA. Los polipéptidos precipitados se analizan después mediante SDS-PAGE.

Alternativamente, el ADN que contiene la secuencia codificante de TLCC-2 se clona directamente en el poliligador del vector pCDNA/Amp utilizando los sitios de restricción apropiados. El plásmido resultante se transfecta en células COS de la manera descrita antes, y se detecta la expresión del polipéptido TLCC-2 mediante radiomarcaje e inmunoprecipitación utilizando un anticuerpo monoclonal específico de TLCC-2.

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Ejemplo 4 Regulación del influjo de calcio por medio de TLCC-2

Este experimento describe la regulación del influjo de calcio por medio de TLCC-2 en células HEK293 como se determina mediante experimentos con Lector de Placa de Imágenes Fluorescentes (FLIPR) (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA).

El FLIPR es una herramienta de escrutinio para análisis fluorescentes basados en células que permite la estimulación simultánea y la medida de poblaciones celulares separadas en un formato de alto rendimiento. Por lo tanto, utilizando este sistema, es posible cuantificar señales transitorias, tales como la liberación de calcio intracelular, a partir de poblaciones celulares, en paralelo y en tiempo real. El FLIPR contiene cámaras en las que se mantienen la placa de ensayo y las placas que contienen antagonistas o agonistas que se van a añadir a la placa de ensayo. El FLIPR utiliza un láser de argón que proporciona líneas espectrales discretas separadas aproximadamente 350 a 530 nm. Para su uso con colorantes de Ca^{2+} fluorescentes, se emplea la línea del láser de 88 nm. El láser ilumina simultáneamente los pocillos de una placa de ensayo. La imagen de cada pocillo de la placa es capturada por una cámara con un dispositivo de carga frío acoplado (CCD), que actualiza imágenes una vez por segundo, si se requiere, para la medida de respuestas de calcio rápidas. Debido a que se leen tanto la excitación como la emisión a través del fondo de la placa, de paredes negras, se utilizan placas de 96 pocillos de fondo transparente. Los datos capturados por la cámara con CCD se convierten en datos digitales y después se transfieren a un ordenador.

En resumen, se transfirió un indicador de calcio (p. ej., fluo-3/AM o Calcium Green-1/AM) al medio de cultivo. Debido a que FLIPR recoge la fluorescencia del fondo del pocillo, las células en suspensión requieren centrifugación hacia la base del pocillo después de la carga del colorante. Las células HEK293 viables se resuspendieron en medio de carga y se incubaron durante una hora. Las células se centrifugaron después y se resuspendieron con tampón de lavado. La suspensión celular que contenía el colorante se dividió en alícuotas en cada pocillo de la placa de 96 pocillos de paredes negras, de fondo transparente y la placa se centrifugó. El análisis FLIPR se llevó a cabo después y se analizaron los resultados. (Si se utilizan células adherentes, éstas se pueden cultivar en placa a una densidad apropiada en las placas de 96 pocillos y cultivar durante la noche. Después se puede cargar el colorante e incubar).

Los resultados demuestran un influjo de calcio constitutivo por medio de TLCC-2 en células HEK293 que fueron incubadas con NMDG/0 Ca^{+2} y estimuladas después de eso con Ca^{+2} 5 mM.

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<110> Millennium Pharmaceuticals, Inc.

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<120> 54420, UN CANAL DE CALCIO HUMANO NOVEDOSO

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<130> MNI-125CPPC

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<140>

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<141>

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<150> US 09/544,797

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<151> 07-04-2000

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<160> 7

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 2095

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221> CDS

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<222> (141)..(1880)

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<400> 1

1

2

3

4

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<210> 2

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<211> 580

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<212> ADN

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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5

6

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<210> 3

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<211> 1740

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<212>

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<221>

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<222> (1)..(1740)

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<400> 3

7

8

9

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<210> 4

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<211> 764

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<212>

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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10

11

12

13

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<210> 5

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<211> 764

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<212>

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<213> Homo sapiens

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<220>

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<223> Xaa en la posición 667 puede ser cualquier aminoácido

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<400> 5

14

15

16

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<210> 6

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<211> 966

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

17

18

19

20

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<210> 7

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<211> 1533

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<212>

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

21

22

23

24

25

26

Claims

1. Un método para identificar un compuesto que se une a un polipéptido o modula la capacidad de un polipéptido para transportar calcio a través de una membrana, donde el polipéptido se selecciona del grupo que consiste en:

(ii): un polipéptido que está codificado por una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es idéntica al menos en un 99% a un ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO:1 o la SEQ ID NO:3;

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2. Un método de identificación de una molécula de ácido nucleico asociada con un trastorno con dolor que comprende:

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3. Un método de identificación de un ácido nucleico asociado con un trastorno con dolor que comprende:

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4. Un método de identificación de un polipéptido asociado con un trastorno con dolor que comprende:

(a): poner en contacto una muestra que comprende los polipéptidos con un anticuerpo que se une selectivamente a un polipéptido de la SEQ ID NO: 2; y

(b): detectar la presencia de un polipéptido en dicha muestra que se une a dicho anticuerpo, identificando de ese modo un polipéptido asociado con un trastorno con dolor.

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5. El método de la reivindicación 4, donde dicho anticuerpo está marcado detectablemente.

6. Un método de identificación de un compuesto capaz de tratar un trastorno con dolor que comprende analizar la capacidad del compuesto para modular la expresión de una molécula de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en:

identificando de ese modo un compuesto capaz de tratar un trastorno con dolor.

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7. Un método de identificación de un compuesto capaz de tratar un trastorno con dolor que comprende analizar la capacidad del compuesto para modular la actividad del canal de calcio de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en:

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8. El método de la reivindicación 6, donde dicho compuesto inhibe la expresión de la molécula de ácido nucleico de la SEQ ID NO:1 o 3.

9. El método de la reivindicación 7, donde dicho compuesto inhibe la actividad de un polipéptido de la SEQ ID NO:2.

10. Un método de identificación de un compuesto capaz de modular la nocicepción que comprende:

(a): poner en contacto una célula con un compuesto de ensayo; y

identificando de ese modo un compuesto capaz de modular la nocicepción.

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11. Un método de identificación de un compuesto capaz de modular la nocicepción que comprende:

(a): poner en contacto una célula con un compuesto de ensayo; y