ES2540102T3 - Un gen que codifica un homólogo de glicoproteína P humana multifármaco-resistente en el cromosoma 7p15-21 y usos del mismo - Google Patents
Un gen que codifica un homólogo de glicoproteína P humana multifármaco-resistente en el cromosoma 7p15-21 y usos del mismo Download PDFInfo
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Abstract
Un método de enriquecimiento de células madre a partir de una mezcla celular, que comprende poner en contacto una mezcla celular con un anticuerpo monoclonal específico que reacciona específicamente con una glicoproteína P 7p que tiene una secuencia de proteína seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:1, NO:2, NO:3, NO:4, NO:5, NO:6, NO:7 y NO:8 y aislar células madre unidas al anticuerpo a partir de la mezcla celular, donde las células madre no son células madre embrionarias humanas.
Description
DESCRIPCIÓN
Un gen que codifica un homólogo de glicoproteína P humana multifármaco-resistente en el cromosoma 7p15-21 y usos del mismo.
Campo de la Invención
La invención se refiere a secuencias genéticas que codifican proteínas que exhiben rasgos estructurales y 5 funcionales característicos de los miembros de la familia de la glicoproteína P asociados con la multifármaco-resistencia del cáncer, funciones reguladoras inmunológicas, y funciones singulares en células madre pluripotentes humanas y otras células tisulares progenitoras. La invención abarca proteínas sustancialmente puras, tratamientos terapéuticos y usos diagnósticos relacionados con estas proteínas.
Antecedentes de la Invención 10
La glicoproteína P, una bomba de eflujo de fármacos dependiente de adenosina-trifosfato (ATP), está sobreexpresada en células tumorales multifármaco-resistentes (MDR). La misma reduce la concentración intracelular de xenobióticos citotóxicos, reduciendo con ello la eficacia de muchos regímenes quimioterapéuticos del cáncer. La glicoproteína P pertenece a la superfamilia de transportadores activos ABC (casete de fijación de ATP), y está codificada por una familia de multigenes en los eucariotas superiores. Los miembros de la familia de 15 glicoproteínas P de mamíferos pueden dividirse en tres clases. Las glicoproteínas P de clase I y clase II confieren multifármaco-resistencia, mientras que las proteínas de clase III no lo hacen.
En los humanos, la glicoproteína P está codificada por dos genes enlazados ("MDR1" y "MDR3") en el cromosoma 7q21.1. MDR3 funciona como una translocasa lipídica y las mutaciones en este gen están asociadas con colestasis intrahepática familiar. MDR1 confiere resistencia a fármacos en las células de ciertos cánceres. Además de estar 20 sobreexpresada en las células del cáncer, la glicoproteína P MDR1 se expresa ampliamente en los tejidos humanos normales, predominantemente secretorios y absorbentes, donde la misma funciona en diversos procesos fisiológicos que incluyen diferenciación celular, proliferación celular y supervivencia celular. En estos tipos de células normales, la glicoproteína P funciona en la liberación o captura transmembranal o de xenobióticos y ciertos fármacos terapéuticos, pequeñas moléculas peptídicas, ciertos compuestos esteroidales, y fosfolípidos. 25
La glicoproteína P es expresada también por poblaciones de células linfoides de la médula ósea humana y la sangre periférica. Específicamente, se ha demostrado que la glicoproteína P se expresa en la membrana de células madre pluripotentes, monocitos, células dendríticas, linfocitos T CD4+ y CD8+, células agresoras naturales, y linfocitos B. En las células inmunológicas, la glicoproteína P funciona en el transporte de citoquinas y otras moléculas pequeñas, que son críticas para que se produzcan las respuestas inmunológicas fisiológicas. El bloqueo 30 específico de la glicoproteína P puede suprimir la respuesta inmunológica a aloantígenos y antígenos nominales. Sin embargo, existe cierto grado de redundancia para la función de la glicoproteína P en estos tipos de células, que apunta a la existencia de moléculas afines adicionales no identificadas hasta ahora.
Las células madre pluripotentes y otras células progenitoras tisulares poseen también una actividad singular semejante a la glicoproteína P, caracterizada por acumulación intracelular reducida de colorantes fluorescentes, que 35 permite el aislamiento específico de estos tipos de células para usos terapéuticos. No obstante, se cree que esta función no está mediada por la glicoproteína P MDR1, sino más bien por un miembro de la familia de glicoproteínas P afín, no identificado todavía.
A pesar del papel irrefutable de la glicoproteína P MDR1 en la multifármaco-resistencia del cáncer, los intentos de mejorar la quimioterapia por inhibición de esta proteína han alcanzado sólo un éxito limitado. Así, puede inferirse 40 que existen proteínas homólogas que, como MDR1, son capaces de hacer las células resistentes a los agentes terapéuticos. Adicionalmente, puede inferirse que las proteínas MDR1 homólogas cumplen funciones semejantes a la glicoproteína P en los tejidos humanos fisiológicos, en particular en células del sistema inmunitario, células madre pluripotentes y células progenitoras tisulares, donde existe cualquier redundancia para la función de la glicoproteína P MDR1, o donde se sabe que la glicoproteína P MDR1 no promueve la actividad observada asociada a la 45 glicoproteína P.
Sumario de la Invención
La invención está dirigida a un nuevo miembro de la familia de genes de glicoproteínas P humanas localizado en el cromosoma 7p15-2, que codifican proteínas que confieren el fenotipo multifármaco-resistente a las células tumorales y/o atienden a funciones fisiológicas críticas en los tejidos humanos normales. 50
Un examen de la estructura del nuevo gen indica que el mismo codifica dos mitades homólogas semiautónomas, cada una de ellas con sus propios dominios transmembranales y de fijación de ATP. Por remodelación alternativa y expresión diferencial de genes y/o modificaciones posteriores a la transcripción y posteriores a la traducción, el nuevo gen de glicoproteína P puede codificar varias glicoproteínas P distintas:
La proteína de SEQ ID NO: 1 (aminoácidos 1-659) está codificada por 14 exones (SEQ ID NO: 9) del DNA 55 genómico humano del clon AC005060 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida por 5 dominios transmembranales y un dominio de fijación de ATP.
La proteína de SEQ ID NO: 2 (aminoácidos 1-812) está codificada por 19 exones (SEQ ID NO: 10) del DNA genómico humano de los clones contiguos AC002486 y AC005060 (AC002486 es el clon secuenciado a la izquierda del clon AC005060) en el cromosoma 7p15-21 y está constituida por 5 dominios transmembranales y dos dominios de fijación de ATP, el primero de los cuales está localizado en el lado N-terminal del dominio transmembranal #1, y el segundo en el lado C-terminal del dominio transmembranal #5 de la proteína, en el lado opuesto de la membrana 5 plasmática. La proteína de SEQ ID NO: 2 puede expresarse también como resultado de la trans-remodelación del mRNA (SEQ ID NO: 9) que codifica la proteína de SEQ ID NO: 1 y el mRNA (SEQ ID NO: 11) que codifica la proteína de SEQ ID NO: 3 descrita más adelante. Adicionalmente, la proteína de SEQ ID NO: 2 puede expresarse como resultado del procesamiento posterior a la traducción de las proteínas de SEQ ID NO: 1 y NO: 3.
La proteína de SEQ ID NO: 3 (aminoácidos 1-131) está codificada por 6 exones (SEQ ID NO: 11) del DNA 10 genómico humano del clon AC002486 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida por un solo dominio de fijación de ATP, careciendo de dominios transmembranales.
La proteína de SEQ ID NO: 4 (aminoácidos 1-1058) está codificada por 20 exones (SEQ ID NO: 12) del DNA genómico humano de los clones contiguos AC002486 y AC005060 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida por 8 dominios transmembranales y dos dominios de fijación de ATP, el primero de los cuales está localizado entre los 15 dominios transmembranales #3 y #4, y el segundo en el lado C-terminal de los dominios transmembranales #8, en el lado opuesto de la membrana plasmática.
La proteína de SEQ ID NO: 5 (aminoácidos 1-1222) está codificada por 23 exones (SEQ ID NO: 13) de DNA genómico humano de los clones contiguos AC002486 y AC005060 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida por 12 dominios transmembranales y dos dominios de fijación de ATP, el primero de los cuales está localizado entre los 20 dominios transmembranales #7 y #8, y el segundo en el lado C-terminal del dominio transmembranal #12, en el lado opuesto de la membrana plasmática.
La proteína de SEQ ID NO: 6 (aminoácidos 1-1195) está codificada por 24 exones (SEQ ID NO: 14) de DNA genómico humano de los clones contiguos AC002486 y AC005060 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida por 11 dominios transmembranales y dos dominios de fijación de ATP, el primero de los cuales está localizado entre los 25 dominios transmembranales #6 y #7, y el segundo en el lado C-terminal del dominio transmembranal #11, en el lado opuesto de la membrana plasmática.
La proteína de SEQ ID NO: 7 (aminoácidos 1-541) está codificada por 10 exones (SEQ ID NO: 15) de DNA genómico humano del clon AC002486 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida por 7 dominios transmembranales y un solo dominio de fijación de ATP, en el lado C-terminal del dominio transmembranal #7. 30
La proteína de SEQ ID NO: 8 (aminoácidos 1-514) está codificada por 11 exones (SEQ ID NO: 16) de DNA genómico humano del clon AC002486 en el cromosoma 7p15-21 y está constituida por 6 dominios transmembranales y un solo dominio de fijación de ATP, en el lado C-terminal del dominio transmembranal #6.
La multifármaco-resistencia del cáncer puede resultar de la expresión de cualquiera de las proteínas de SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5, NO: 6, NO: 7 y NO: 8. Las proteínas codificadas por el gen 7p15-21 de glicoproteína 35 P de la presente invención pueden utilizarse como marcadores para identificación de células que exhiben probablemente multifármaco-resistencia y pueden servir como dianas en el diseño de nuevas terapias para los pacientes de cáncer. Debe entenderse que, a menos que se indique lo contrario, la referencia a la glicoproteína P de la presente invención también incluye también cualquiera de las proteínas de SEQ ID NO:1, NO:2, NO:3, NO:4, NO:5, NO:6, NO:7 y NO:8. 40
La glicoproteína P 7p15-21 confiere quimiorresistencia a múltiples agentes quimioterapéuticos, con inclusión del cisplatino, por mediación del eflujo celular de fármaco. Por tanto, el bloqueo específico de esta función de eflujo, por ejemplo mediante inhibición de anticuerpos monoclonales específicos, puede aumentar la acumulación intracelular de fármaco y, como resultado, la toxicidad de los fármacos y la destrucción de las células tumorales. Adicionalmente, dado que la glicoproteína P 7p15-21 es funcional en la proliferación de las células tumorales, el 45 crecimiento de los tumores puede inhibirse terapéuticamente por administración de anticuerpos monoclonales bloqueantes específicos, incluso en ausencia de agentes quimioterapéuticos concurrentes. Entre las proteínas codificadas por el gen de la glicoproteína P 7p15-21, las proteínas de SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5 y NO: 6 son distintas de las proteínas de SEQ ID NO: 7 y NO: 8 en el sentido de que aquéllas se expresan selectivamente en ciertas células de cáncer pero no en tejidos normales no cancerosos. Adicionalmente, las 50 proteínas de SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5 y NO: 6 se expresan preferentemente en aquellos cánceres que exhiben los grados más altos de quimiorresistencia a los fármacos quimioterapéuticos, tales como por ejemplo el melanoma humano maligno. Debido a su expresión selectiva en ciertos cánceres pero no en los tejidos normales, las proteínas de SEQ ID NO: 1, NO: 2, NO: 3, NO: 4, NO: 5 y NO: 6 pueden direccionarse terapéuticamente no sólo por inhibición del eflujo de fármacos citotóxicos o la inhibición de la proliferación tumoral por anticuerpos 55 monoclonales específicos, sino también por medios adicionales, que incluyen la destrucción de las células específicas del tumor mediada por anticuerpos monoclonales específicos conjugados a toxinas celulares, o por administración terapéutica de preparaciones de vacuna específicas del antígeno a los pacientes afligidos.
Las proteínas de SEQ ID NO: 7 y NO: 8 codificadas por el gen 7p15-21 pueden expresarse también en ciertos tejidos humanos normales no cancerosos. La invención proporciona por tanto usos adicionales relacionados con la 60
función de estas proteínas seleccionadas en tejidos fisiológicos. Entre dichos tejidos normales, las proteínas de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 se expresan preferentemente a niveles altos en células madre pluripotentes y otras células tisulares progenitoras, donde aquéllas funcionan en el transporte transmembranal de xenobióticos y otras moléculas pequeñas. La invención proporciona así medios para detectar y enriquecer específicamente estas células madre y células progenitoras a partir de mezclas de células y preparaciones en las cuales están contenidas las 5 mismas, por detección de las células con anticuerpos monoclonales específicos marcados.
Las proteínas de SEQ ID NO: 7 y NO: 8 se expresan también en cierto grado en la mayoría de otros tejidos humanos normales, con inclusión de células del sistema inmunitario tales como las células T, monocitos y células presentadoras de antígeno diferenciadas, donde aquéllas funcionan en el eflujo de citoquinas y la captura de moléculas pequeñas con inclusión de péptidos y antígenos, cumpliendo así una función crítica para la integridad de 10 las respuestas inmunitarias normales. Cuando se inhiben estas funciones, por ejemplo por bloqueo de anticuerpos monoclonales específicos, la respuesta inmunitaria normal puede modularse, lo cual se puede utilizar en la prevención y/o la terapia del rechazo de aloinjertos en el trasplante clínico de órganos, y también en diversas enfermedades autoinmunes tales como la artritis reumatoide y la esclerosis múltiple. Adicionalmente, cuando se expresa en células inmunitarias humanas y otros tejidos humanos tales como el endotelio de la barrera 15 hematoencefálica y los epitelios del tracto gastrointestinal y el riñón, el bloqueo de la proteína puede emplearse además terapéuticamente para alterar de modo selectivo la captura y secreción, y por tanto la distribución farmacológica, la farmacocinética y la eficacia terapéutica de aquellos fármacos terapéuticos administrados por vía exógena que son sustratos de dichas proteínas.
En un primer aspecto, la invención está dirigida a proteínas sustancialmente puras constituidas esencialmente por la 20 secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. El término "constituida esencialmente por" debe entenderse que abarca proteínas que tienen exactamente las mismas secuencias de aminoácidos, así como proteínas con secuencias insustancialmente diferentes, como se evidencia por el hecho de que poseen las mismas propiedades funcionales básicas. Una isoforma "sustancialmente purificada" es una que se ha separado de otros componentes biológicos 25 acompañantes y comprenderá típicamente al menos 85% de una muestra, prefiriéndose porcentajes mayores. Están disponibles muchos medios para evaluar la pureza de una proteína en una muestra, con inclusión de análisis por electroforesis en gel de poliacrilamida, cromatografía y centrifugación analítica. Un método preferido para evaluar la pureza es mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo dirigido contra epítopes de la glicoproteína P 7p15-21 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID 30 NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. Se describen también "péptidos MDR" que se definen en esta memoria como constituidos por un elemento de secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, de al menos 10 y preferiblemente al menos 15 ó 20 residuos. Éstos pueden utilizarse en la generación de anticuerpos. Se estipula que un péptido MDR no puede tener una secuencia que sea la misma que cualquier serie de 10 a 15 residuos contiguos en la secuencia 35 LSGGQKQRIAIARAL (SEQ ID NO: 17). Estas proteínas y péptidos MDR pueden administrarse también terapéuticamente a pacientes de cáncer afligidos con tumores que expresan glicoproteína P 7p15-21, como una vacuna tumoral para provocar una respuesta inmunitaria endógena dirigida contra estos tumores, a fin de dar como resultado la destrucción de las células específicas del tumor.
La invención está dirigida a un anticuerpo producido por un proceso que comprende el paso de administrar a un 40 animal hospedador una proteína codificada por SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, o un péptido MDR como se ha descrito arriba. La proteína o el péptido deben administrarse al animal en una dosis suficiente para inducir la formación de anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. En el último caso, los anticuerpos se producen preferiblemente por inyección de una preparación farmacéuticamente aceptable en un ratón, seguido por fusión de 45 células del bazo del ratón con células de mieloma utilizando métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos obtenidos deberían fijarse selectivamente a las proteínas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. En este contexto, fijación selectiva significa que un anticuerpo tiene al menos una afinidad 100 veces mayor para una o más de esas proteínas que para cualquier otra proteína encontrada normalmente en las células humanas. 50
La invención también está dirigida a un polinucleótido sustancialmente puro constituido esencialmente por una secuencia de nucleótidos que codifica las proteínas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, o un péptido MDR. Preferiblemente, el polinucleótido está constituido esencialmente por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16. La invención incluye vectores 55 de expresión que comprenden un elemento codificante distinto constituido por estos polinucleótidos; y células hospedadoras transformadas con tales vectores. Un "elemento codificante distinto" hace referencia a la producción de un vector de expresión responsable de la determinación de la secuencia de aminoácidos de una proteína expresada. La invención comprende la totalidad de dichos elementos que producen proteínas correspondientes a las secuencias de aminoácidos que se muestran en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, 60 SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8, así como otras proteínas que tienen sustancialmente la misma estructura y función.
La invención incluye una proteína recombinante producida por células hospedadoras transformadas por un vector de expresión como se ha expuesto anteriormente. La proteína recombinante puede aislarse utilizando técnicas
estándar, que incluyen cromatografía de afinidad con anticuerpos contra los epítopes de la glicoproteína P 7p15-21. Preferiblemente, el polinucleótido utilizado en los vectores para expresar una glicoproteína P recombinante de este tipo está constituido esencialmente por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16. Oligonucleótidos complementarios a SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 5 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16 y que tienen al menos 15 nucleótidos de longitud pueden utilizarse como inhibidores antisentido. Éstos pueden administrarse a pacientes sometidos a quimioterapia del cáncer a fin de aumentar la eficacia de los fármacos citotóxicos. La transfección in vivo de células se conoce desde hace muchos años y puede realizarse utilizando vectores virales (véase v.g., U.S. 6.020.191); liposomas (véase v.g., Nicolau, Meth. Enzymol. 149: 157-176 (1987)); DNA complejado con agentes que facilitan la captura celular (véase v.g., U.S. 10 5.264.618; WO 98/14431); o incluso por simple inyección de DNA desnudo (véase v.g., U.S. 5.693.622). Cualquiera de estos procedimientos puede utilizarse para suministrar los oligonucleótidos antisentido de la presente invención.
La invención también está dirigida a un método para determinar si una célula de cáncer responderá a las terapias orientadas a invertir la multifármaco-resistencia por medida de la expresión de los genes que codifican las proteínas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o 15 SEQ ID NO: 8. Este método puede utilizarse para detectar la existencia del fenotipo multifármaco-resistente en células de cáncer o para rastrear el desarrollo de multifármaco-resistencia a lo largo del tiempo por monitorización de los cambios en la expresión génica en células cultivadas.
La invención proporciona un método de determinación de si un compuesto de test inhibe la multifármaco-resistencia en células causada por un gen codificante de las proteínas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID 20 NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8. Este método comprende expresar un gen que codifica uno o más de estos polipéptidos en células que por lo demás no son multifármaco-resistentes, y exponer estas células a uno o más fármacos citotóxicos en presencia de un compuesto de test. Se mide la supervivencia celular después de la exposición, y los resultados obtenidos se comparan con los de incubaciones realizadas esencialmente del mismo modo pero en ausencia del compuesto de test. Se llega a la conclusión de que el 25 compuesto de test inhibe la multifármaco-resistencia si la supervivencia celular se reduce en un grado significativo en las incubaciones realizadas en presencia del compuesto de test con relación a la observada en su ausencia.
Descripción Detallada de la Invención
La invención está dirigida a un nuevo miembro de la familia de glicoproteínas P de proteínas relacionadas con la resistencia a los fármacos, a secuencias genéticas que codifican esta proteína, a métodos de determinación de si 30 una célula de cáncer responderá a las terapias dirigidas a invertir la resistencia a los fármacos mediada por la glicoproteína P, y a un método de cribado de compuestos de test respecto a su capacidad para inhibir multifármaco-resistencia. El nuevo gen de glicoproteína P puede codificar las proteínas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 o SEQ ID NO: 8.
Debe entenderse que la invención abarca no sólo secuencias idénticas a las representadas, sino también 35 secuencias que son esencialmente iguales como se demuestra por el hecho de que retienen las mismas características estructurales y funcionales básicas. Por ejemplo, pueden utilizarse técnicas tales como la mutagénesis orientada para introducir variaciones en la estructura de una proteína. La invención abarca variaciones en la glicoproteína P introducidas por este u otros métodos similares, con la condición de que la proteína resultante retiene sus propiedades biológicas básicas, en particularmente en lo que respecta a la inducción de multifármaco-40 resistencia en células de mamífero.
Las secuencias de DNA que codifican las proteínas de la invención pueden obtenerse a partir de cualquier fuente de tejido o célula en la cual se expresen las mismas. Por ejemplo, pueden manipularse genéticamente líneas de células cultivadas para expresar el gen de glicoproteína P utilizando técnicas recombinantes o por exposición continua a agentes quimioterapéuticos. Alternativamente, las secuencias pueden aislarse de las células primarias 45 obtenidas de tumores.
Están disponibles muchos métodos para aislamiento de las secuencias de DNA, y pueden adaptarse para el aislamiento del gen de glicoproteína P del cromosoma 7p15-21 (en lo sucesivo "cromosoma 7p") (véase, v.g., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1989)). Por ejemplo, un método consiste en cribar una biblioteca de cDNA que se ha preparado por transcripción inversa de mRNA aislado 50 de tejidos o células que expresan el gen. La biblioteca puede prepararse a partir de, por ejemplo, tejido de melanocitos o de testículo humano, y pueden sintetizarse sondas para cribado basadas en las secuencias que se representan en el Listado de Secuencias. Las sondas tienen preferiblemente al menos 14 nucleótidos de longitud y se seleccionan óptimamente de una región que se cree es exclusiva para el gen de la glicoproteína P del cromosoma 7p. 55
Como alternativa, la amplificación de una secuencia deseada puede realizarse por la reacción en cadena de la polimerasa ("PCR") del RNA inverso transcrito. Iniciadores para la PCR pueden construirse utilizando las secuencias que se representan en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16, y la confirmación de la presencia del cDNA de la glicoproteína P del cromosoma 7p puede obtenerse por la secuenciación de los productos amplificados. 60
La expresión de proteína recombinante puede inducirse en una célula hospedadora por transformación de la misma con un vector de expresión apropiado. El vector debería contener señales de transcripción y traducción reconocibles por el hospedador junto con la secuencia estructural deseada, preferiblemente en forma bicatenaria, en un enlace operativo. Por ejemplo, la secuencia de DNA de la glicoproteína P debería estar posicionada de tal modo que las secuencias reguladoras presentes en el vector controlen la síntesis de mRNA y se produzca proteína que tenga la 5 secuencia deseada.
Preferiblemente, el ácido nucleico que codifica la glicoproteína P de la invención se expresa en células eucariotas, especialmente en células de mamífero. Dichas células son capaces de promover las modificaciones posteriores a la traducción necesarias para asegurar que la proteína recombinante es estructural y funcionalmente la misma que la proteína aislada de, por ejemplo, células tumorales multifármaco-resistentes. Ejemplos de células de mamífero que 10 se sabe proporcionan modificación apropiada posterior a la traducción de proteínas clonadas incluyen, inter alia, células NIH-3T3, células CHO, células HeLA, células LM(tk-), y análogas. Promotores eucariotas que se sabe controlan la expresión de genes recombinantes se utilizan preferiblemente para dirigir la transcripción del DNA de la glicoproteína P del cromosoma 7p, y pueden incluir el del gen de metalotioneína I del ratón, el promotor TK del Herpesvirus, el promotor temprano de CMV y el promotor temprano de SV40. La transcripción puede estar dirigida 15 también por promotores procariotas, tales como los capaces de reconocer la polimerasa T4, los promotores PR y PL del bacteriófago lambda, y los promotores trp, recA, choque térmico y lacZ de E. coli.
Pueden introducirse vectores de expresión en las células hospedadoras por métodos tales como precipitación con fosfato de calcio, microinyección, electroporación o transferencia viral, y pueden seleccionarse células que expresan la secuencia de proteínas recombinante por métodos conocidos en la técnica. La confirmación de la expresión 20 puede obtenerse por amplificación PCR de secuencias de glicoproteína P utilizando iniciadores seleccionados de las secuencias que se muestran en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 16.
La proteína recombinante puede purificarse utilizando métodos estándar bien conocidos en la técnica. Dichos métodos pueden incluir filtración, precipitación, cromatografía y métodos electroforéticos. La pureza puede 25 evaluarse por realización de la electroforesis en un gel de poliacrilamida y visualización de las proteínas utilizando metodología estándar de tinción. La transferencia Western puede realizarse también utilizando un anticuerpo para la glicoproteína P del cromosoma 7p.
La invención está dirigida también a anticuerpos generados contra la proteína P del cromosoma 7p. El proceso para producir tales anticuerpos puede implicar o bien inyectar la glicoproteína P 7p propiamente dicha en un animal 30 apropiado o inyectar péptidos antigénicos cortos construidos para corresponder a diferentes regiones de la proteína. Estos péptidos deberían tener al menos 5 aminoácidos de longitud y preferiblemente, deberían seleccionarse de regiones que se consideran exclusivas de la glicoproteína P 7p. Métodos para generación y detección de anticuerpos son bien conocidos en la técnica, y se exponen en referencias tales como: Harlow, et al., Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY (1988); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself 35 Discrimination, (1982); Kennett et al., Monoclonal Antibodies and Hybridomas: A New Dimension in Biological Analyses, (1980); y Campbell, "Monoclonal Antibody Technology", en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, (1984).
El término "anticuerpo", como se utiliza en esta memoria, debe entenderse que incluye moléculas intactas así como fragmentos que retienen su capacidad para fijar antígeno, tales como los fragmentos Fab y F(ab')2. El término 40 "anticuerpo" se define también en esta memoria como haciendo relación tanto a anticuerpos monoclonales como a anticuerpos policlonales. Los anticuerpos policlonales se derivan de los sueros de animales inmunizados con un antígeno de la glicoproteína P del cromosoma 7p. Los anticuerpos monoclonales para la proteína pueden prepararse utilizando la tecnología del hibridoma, como se expone en referencias tales como: Kohler, et al., Nature 256:495 (1975); y Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 45 (1981). En general, esta tecnología implica inmunizar un animal inmunocompetente, típicamente un ratón, sea con la glicoproteína P intacta del cromosoma 7p o con un fragmento derivado de la misma. Se extraen luego esplenocitos del animal inmunizado y se fusionan con células de mieloma adecuadas, tales como células SP2O. Después de ello, las células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT y se clonan luego por dilución limitada (Wands, et al., Gastroenterology, 80: 225-232 (1981)). Las células obtenidas por dicha 50 selección se ensayan luego para identificar clones que secreten anticuerpos capaces de fijar la glicoproteína P del cromosoma 7p.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos de la invención pueden utilizarse para detectar la presencia de la glicoproteína P del cromosoma 7p en cualquiera de una diversidad de inmunoensayos. Por ejemplo, pueden utilizarse anticuerpos en radioinmunoensayos o en ensayos inmunométricos, conocidos también como ensayos de 55 "dos sitios" o "sándwich" (véase Chard, "An Introduction to Radioimmune Assay and related Techniques," en: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, North Holland Publishing Co., NY (1978)). En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpo sin marcar se fija un soporte sólido que es insoluble en el fluido sometido a test, tal como sangre, linfa, extractos celulares y análogos. Después de la fijación inicial del antígeno al anticuerpo inmovilizado, se añade una cantidad de un segundo anticuerpo marcado detectablemente 60 (que puede ser o no el mismo que el primero) a fin de permitir la detección y/o cuantificación de antígeno fijado (véase, v.g. Radioimmune Assay Method, Kirkham, et al., Ed. pp. 199-206, E&S y Livingstone, Edimburgo (1970)). Muchas variaciones de estos tipos de ensayos se conocen en la técnica y pueden emplearse para la detección de la
glicoproteína P 7p.
Los anticuerpos para la glicoproteína P del cromosoma 7p pueden utilizarse también en procedimientos de purificación (véase en general, Dean et al., Affinity Chromatography, A Practical Approach, IRL Press (1986)). Típicamente, el anticuerpo se inmoviliza en una matriz cromatográfica tal como Sepharosa, 4B. La matriz se introduce luego como relleno en una columna y la preparación que contiene la glicoproteína P del cromosoma 7p se 5 hace pasar a su través en condiciones que promueven la fijación, v.g., condiciones bajas en sal. La columna se lava luego, y la proteína se eluye utilizando tampón que promueve la disociación del anticuerpo, v.g., un tampón que tiene un pH o concentración de sal alterados. La proteína eluida puede transferirse a un tampón, por ejemplo por diálisis, y almacenarse después de ello o utilizarse directamente. Pueden utilizarse también anticuerpos en transferencia Western para la detección de la glicoproteína P del cromosoma 7p en una muestra. Para estos tipos 10 de ensayos, puede utilizarse un anticuerpo que o bien se ha desarrollado específicamente para reaccionar con la glicoproteína P del cromosoma 7p o que reacciona con un epítope de la proteína.
La detección de la glicoproteína P del cromosoma 7p puede utilizarse para determinar si las células tumorales son multifármaco-resistentes. Análogamente, la detección de cambios en la expresión de la glicoproteína P puede ser útil en la predicción del desarrollo de multifármaco-resistencia en las células. El cDNA de esta glicoproteína P puede 15 ser útil en el diseño de iniciadores para PCR de diagnóstico, diseño de sondas para transferencia Northern de diagnóstico, ensayos de protección de RNAsas, y para el diseño de los oligonucleótidos antisentido complementarios al cDNA predicho para uso en estrategias de direccionamiento de genes para la inversión de la multifármaco-resistencia. Se contemplan usos diagnósticos y terapéuticos tanto in vitro como in vivo para secuencias de nucleótidos antisentido para la glicoproteína P del cromosoma 7p. 20
La secuencia de aminoácidos primaria y la estructura proteínica de la glicoproteína P del cromosoma 7p pueden utilizarse en la producción de anticuerpos monoclonales (mAbs) que pueden emplearse en la diagnosis y terapia del cáncer multifármaco-resistente. Por ejemplo, péptidos sintéticos que se asemejan a secuencias nativas de aminoácidos de dominios extracelulares particulares como se determinan por predicción de topología de membrana pueden ser útiles para desarrollar mAbs inhibidores dirigidos contra epítopes extracelulares de la glicoproteína P del 25 cromosoma 7p. Adicionalmente, secuencias peptídicas sintéticas de 10-20 meros derivadas de la secuencia primaria de aminoácidos no incluidas en las secuencias de bucle extracelular arriba mencionadas pueden ser útiles en el desarrollo de anticuerpos monoclonales específicos de diagnóstico. Pueden emplearse mAbs específicos en el análisis diagnóstico por FACS, transferencia Western, e inmunohistoquímica. Tales mAbs pueden emplearse también para usos diagnósticos in vivo, donde pueden utilizarse mAbs conjugados a un marcador para evaluar la 30 carga tumoral, la localización del tumor o la masa residual tumoral después de quimioterapia o terapia quirúrgica de tumores que expresan la glicoproteína P 7p15-21.
Pueden utilizarse también mAbs específicos para propósitos terapéuticos en pacientes de cáncer. En particular, aquéllos pueden administrarse para invertir la resistencia multifármaco del cáncer en pacientes que reciben agentes quimioterapéuticos que son sustratos para el eflujo de glicoproteína P 7p, v.g., cisplatino. Adicionalmente, pueden 35 utilizarse terapéuticamente mAbs específicos en pacientes de cáncer para destrucción de las células especificas del tumor, sea administrados en una forma no conjugada, que da como resultado la destrucción del tumor mediada por el sistema inmunitario, o en una forma conjugada con una toxina celular (por ejemplo conjugada a yodo reactivo o toxinas químicas), dando como resultado la destrucción directa de las células específicas del tumor.
Pueden utilizarse también mAbs específicos para propósitos terapéuticos distintos de la resistencia del cáncer a 40 multifármacos. Basándose en la función inmunorreguladora predicha de la glicoproteína P 7p, estos mAbs pueden administrarse a pacientes a fin de prevenir y/o tratar el rechazo de trasplantes de órganos, así como diversas enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide y esclerosis múltiple. Adicionalmente, dado que las glicoproteínas P funcionan en la captura, excreción y distribución específica de tejido de una diversidad de compuestos farmacológicos y químicos, y se han visto implicadas en mecanismos de biodisponibilidad oral, función 45 de la barrera hematoencefálica y mecanismos de excreción renal, hepática y biliar de diversos fármacos, pueden administrarse mAbs específicos terapéuticamente para alterar la farmacocinética y la disponibilidad de dichos fármacos terapéuticos que son sustratos para la función de trasporte mediada por la glicoproteína P 7p.
Las composiciones y métodos de la presente invención pueden tener cierto número de usos en además de los arriba descritos. Por ejemplo, se sabe que las células madre pluripotentes y células progenitoras tisulares tales 50 como células madre hematopoyéticas, células neuroprogenitoras y células progenitoras musculares poseen actividades de eflujo afines a la glicoproteína P para pequeñas moléculas y colorantes fluorescentes. La glicoproteína P del cromosoma 7p puede jugar un papel en el transporte de dichos sustratos, y puede servir por tanto como marcador para el aislamiento de tales células madre y células progenitoras mediante, por ejemplo, análisis FACS. Asimismo, dado que la glicoproteína P MDR1 parece estar implicada en la diferenciación celular, la 55 proliferación celular, la supervivencia celular, y ciertas respuestas inmunitarias, la glicoproteína P del cromosoma 7p, debido a su homología con la glicoproteína P MDR1, se espera que juegue también un papel en dichas funciones fisiológicas. Así pues, las secuencias del gen de la glicoproteína P y de la proteína del cromosoma 7p pueden ser útiles en la modulación de las alteraciones patofisiológicas de estas funciones relacionadas con MDR.
Ejemplos 60
Dado que actualmente está produciéndose nueva información de secuencias genómicas a un ritmo rápido por el
proyecto del genoma humano, las bases de datos que contienen dicha información genómica contienen potencialmente secuencias de miembros no identificados hasta ahora de la familia de glicoproteínas P. Los miembros de la familia de glicoproteínas P de mamífero comparten secuencias de aminoácidos y epítopes de proteínas característicos, y asumen conformaciones similares. Por ello, se ha realizado una investigación basada en homología de proteínas en un intento de identificar nuevos genes codificantes de glicoproteínas P. Se han utilizado 5 herramientas bioinformáticas de analítica de genes y analítica de proteínas para caracterizar ulteriormente la secuencia de ácido nucleico y la estructura predicha de las proteínas de los genes candidato identificados. Específicamente, se ha utilizado la aplicación tblastn del National Center for Biotechnology Information (NCBI) para comparar las secuencias de aminoácidos conservadas derivadas de la estructura conocida de la glicoproteína P MDR1 humana con la base de datos de la secuencia de nucleótidos de homo sapiens no redundante del NCBI 10 traducida dinámicamente en todos los marcos de lectura. Se ha utilizado la secuencia de firma común a los miembros de la familia de transportadores ABC, una secuencia de aminoácidos 15-meros LSGGQKQRIAIARAL (SEQ ID NO: 17), para identificar secuencias de DNA genómico humanas codificantes de estructuras de proteínas homólogas. Se han empleado también secuencias conocidas de aminoácidos hexámeros de tres epítopes de fijación de anticuerpos monoclonales (mAb) específicos de glicoproteína P. 15
Los clones de DNA genómico humano identificados de la manera arriba descrita se cribaron respecto a contaminación con vectores utilizando el programa VecScreen. Adicionalmente, se sometieron estos clones a mapeado sistemático de homología utilizando secuencias de aminoácidos 20-meros solapantes contiguas derivadas de la estructura de la proteína humana MDR1 y el programa de búsqueda tblastn. Se compararon las secuencias de DNA genómico candidato que codificaban secuencias de aminoácidos homólogas con secuencias de 20 marco de lectura abierto (ORF) predichas en cada clon de DNA utilizando el programa NCBI ORF Finder (Altschul, et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997)). Se analizaron luego las secuencias de DNA homólogas que contenían ORFs genómicos utilizando el paquete de software NetGene2 a fin de predecir sitios de remodelación de intrones en los genes candidato (Brunak et al., J. Biol. 220: 49-65 (1991)).
Se generó una secuencia de DNA por transcripción conceptual lineal de estructuras predichas de exones de DNA 25 adyacentes. Utilizando este enfoque, se identificaron dos clones genómicos humanos adyacentes solapantes, CTA-367017 (AC002486, de 79611 pares de bases de longitud) y CTB-86D3 (AC005060, de 120169 pares de bases de longitud, secuenciado a la derecha) como formando parte de una isla sin anclaje de orientación desconocida en el cromosoma 7p15-21. Se encontró que estos clones solapantes contienen una secuencia génica que codifica un nuevo miembro de la familia de glicoproteínas P humanas. 30
Con objeto de determinar si la estructura génica predicha se expresaba en tejidos humanos, la secuencia de cDNA generada se comparó con la base de datos humana NCBI dbest de marcadores de secuencia expresados (EST) no redundantes, como ha sido descrito por Altschul et al., y se identificaron varios ESTs complementarios a exones predichos del clon genómico AC002486. Se diseñaron luego iniciadores de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) basados en información de secuencias disponible en la base de datos del National Center for Biotechnology 35 Information (NCBI) y el análisis bioinformático que se ha descrito arriba. Utilizando estos iniciadores oligonucleotídicos específicos de genes y la técnica PCR sobre RNA mensajero total (mRNA) transcrito inversamente aislado de varias líneas de células de cáncer humanas y tejidos humanos normales, con inclusión de la línea de células del melanoma humano G3661, la línea de células del carcinoma de mama MCF-7, la línea de células del carcinoma de células escamosas SCC25, la línea de células de leucemia U937, y células 40 mononucleares de sangre periférica (PBMC) normales, se amplificaron secuencias de cDNA derivadas del nuevo gen de glicoproteína P 7p15-21 y los productos PCR se secuenciaron subsiguientemente utilizando el método de terminación de cadenas didesoxi en ambas cadenas.
La estructura intrón-exón de varios productos génicos codificados por el gen de glicoproteína P 7p15-21 se determinó por comparación de clones de cDNA predichos y secuenciados con información de secuencias genómica 45 del locus del gen de glicoproteína P 7p15-21 (clones AC002486 y AC005060) como se muestra en SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16. Se generaron luego estructuras de proteínas codificadas por el nuevo gen 7p15-21 por traducción conceptual de aminoácidos de las secuencias oligonucleotídicas predichas de SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16, como se muestra en SEQ ID 50 NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8. Estas secuencias de aminoácidos se compararon luego con la secuencia peptídica no redundante del NCBI respecto a homología de secuencia utilizando el programa blastp del NCBI. Las secuencias de aminoácidos predichas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8 se clasificaron también utilizando el Sistema de Clasificación de Familias de Proteínas PIR-55 International (Barker, et al., Nucleic Acids Res. 28: 41-4 (2000); Huang et al., Nucleic Acids Res. 28: 273-6 (2000)). Se determinaron las características funcionales potenciales de las proteínas predichas por análisis comparativo de la composición primaria de aminoácidos y por utilización del paquete de software TMHMM1.0 para predicción de la formación transmembranal de hélices en proteínas de mamífero (Sonnhammer et al., Ismb. 6: 175-82 (1998)).
El nuevo gen 7p15-21 de glicoproteína P puede codificar varias isoformas de glicoproteína P distintas que exhiben 60 68% de homología de secuencia a la vez con MDR1 y MDR3 humanas. Se encontró un grado similar de homología con isoformas respectivas de ratón y hámster de estos genes humanos. El análisis de la secuencia primaria de aminoácidos sugiere que la glicoproteína P del cromosoma 7p15-21 puede expresar el epítope de fijación de mAb C32 y anti-glicoproteína P, pero no el epítope C219 conservado en todas las restantes isoformas de glicoproteína P
conocidas (Georges et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 152-6 (1990)).
La predicción estructural reveló que el gen 7p15-21 de glicoproteína P codifica isoformas de glicoproteína P que exhiben similitudes estructurales pero también diferencias distintivas comparadas con miembros conocidos de la familia de glicoproteína P como se describe por Georges et al. Por ejemplo, la proteína de SEQ ID NO: 2 contiene dos dominios de fijación de ATP que están localizados en lados opuestos de la membrana plasmática, 5 proporcionando un dominio de fijación de ATP extracelular único que se predice fijará ATP extracelular. Basándose en estas diferencias distintivas, se predice que la glicoproteína P 7p15-21 está implicada no sólo en eflujo de moléculas pequeñas, sino que algunas de sus isoformas son funcionales también en la captura de moléculas pequeñas dependiente de energía. El sistema de clasificación PIR confirmó que la glicoproteína P del cromosoma 7p15-21 descubierta es un miembro de la familia de proteínas de multifármaco-resistencia y la familia de 10 superfamilias de homología de la casete de fijación de ATP.
El análisis PCR utilizando iniciadores específicos de genes demostró que el cDNA codificante de las proteínas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, que implica en cada caso exones codificados en el clon genómico AC005060, se expresaba preferentemente en células del melanoma humano pero no en la mayoría de los otros cánceres testados, al contrario que los cDNAs codificantes de las 15 proteínas de SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, que se encontró se expresaban en la mayoría de los cánceres examinados y también en tejidos humanos fisiológicos. Esto pone de manifiesto que un subconjunto de productos del gen de glicoproteína P 7p15-21 pueden direccionarse selectivamente en ciertos cánceres que exhiben grados particularmente altos de quimiorresistencia, tales como el melanoma humano.
Para evaluar la expresión y función de la glicoproteína P 7p15-21 y el efecto de la modulación específica sobre la 20 función de transporte y la quimiorresistencia, se generaron anticuerpos policlonales contra los péptidos MDR CGTSLILNGEPGYTI (SEQ ID NO: 18) y RFGAYLIQAGRMTPEGC (SEQ ID NO: 19), correspondientes a distintos epítopes de bucles extracelulares de la glicoproteína P 7p15-21, por inyección de ratones con estos péptidos antigénicos conjugados a la sustancia portadora KLH. A fin de evaluar la expresión superficial de la glicoproteína P 7p15-21 de las células tumorales humanas, se realizó una inmunotinción superficial indirecta y citometría de flujo 25 monocolor de células recién cosechadas. Para valorar los efectos de la inhibición de P-gp 7p15-21 sobre el eflujo de tintes fluorescentes mediado por P-gp, se incubaron células tumorales con Ab policlonal de anti-7p15-21 de glicoproteína P seguido por adición de calceína-AM y medidas seriadas subsiguientes de fluorescencia celular por citometría de flujo.
Estos estudios demostraron que la glicoproteína P se expresa en células tumorales, y que el epítope 30 RFGAYLIQAGRMTPEGC (SEQ ID NO: 19) contenido en las proteínas de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6, se expresa preferentemente en el melanoma humano a niveles altos, mientras que el epítope CGTSLILNGEPGYTI (SEQ ID NO: 18) contenido también en SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, se expresa también en otros tipos de cánceres humanos y en células humanas normales. Los anticuerpos contra el epítope CGTSLILNGEPGYTI (SEQ ID NO: 18) inhibían a la vez la captura de colorante y 35 asimismo el eflujo de colorante dependiente del tipo de célula, indicando una función dual de los diversos productos génicos de la glicoproteína P 7p15-21 en estos procesos distintos. Estos anticuerpos aumentaban también la citotoxicidad celular del cisplatino en ensayos específicos de destrucción de células en el melanoma y asimismo en el cáncer de mama entre otros, indicativos de su utilidad terapéutica potencial en el tratamiento de pacientes de cáncer. 40
Se sabe que ciertos cánceres exhiben reordenación cromosómica en la región 7p15-21, y dichas mutaciones pueden asociarse con la aparición del fenotipo MDR. Esto aumenta la posibilidad de que la reordenación génica en estos cánceres sea potencialmente resultado de la formación de episomas y minicromosomas dobles (DM) durante el proceso de amplificación génica de la glicoproteína P 7p15-21 bajo tensiones mutagénicas tales como la quimioterapia. Se sabe que las células que expresan multifármaco-resistencia mediada por MDR1 sufren tales 45 transposiciones cromosómicas y formación de cromosomas DM (Scehoenlein et al., Mol. Biol. Cell 3:507-20 (1992); Mickley et al., J. Clin. Invest. 99:1947-57 (1997); Knutsen et al., Genes Chromosomes Cancer 23:44-54 (1998)). Así pues, los productos génicos de la glicoproteína P del cromosoma 7p15-21 de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 pueden sobreexpresarse selectivamente en ciertas células de cáncer, contribuyendo con ello a la resistencia adquirida a los fármacos de dichas células de cáncer en tanto que se 50 mantienen silenciosos en las células normales. Este patrón de expresión diferencial puede emplearse en la detección e inversión de la multifármaco-resistencia de las células tumorígenas de mamífero.
1. Una proteína sustancialmente pura, constituida esencialmente por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8. 55
2. Un péptido constituido por un elemento de secuencia derivado de cualquiera de: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 o SEQ ID NO:8; donde dicho péptido tiene una longitud de al menos 10 residuos y siempre que dicha secuencia no sea la misma que cualquiera de los 10-15 aminoácidos contiguos en la secuencia LSGGQKQRIAIARAL.
3. Un anticuerpo generado mediante un proceso que comprende el paso de administrar la proteína o el péptido de 60 cualquiera de las reivindicaciones 1-2 a un animal capaz de producir dicho anticuerpo, donde dicha proteína o
péptido se administra con una dosis suficiente para inducir la formación de anticuerpos en dicho animal.
4. Un anticuerpo que se une preferentemente a la proteína de la reivindicación 1.
5. Un polinucleótido sustancialmente puro que codifica la proteína o el péptido de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2.
6. Un vector para expresar una glicoproteína P, que comprende un elemento codificante distinto constituido por el 5 polinucleótido de la reivindicación 5.
7. Una célula hospedadora transformada con el vector de la reivindicación 6.
8. Una glicoproteína P recombinante producida por la célula hospedadora de la reivindicación 7.
9. El polinucleótido de la reivindicación 5, donde dicho polinucleótido tiene una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido esencialmente por: SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID 10 NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16.
10. Un oligonucleótido que actúa como inhibidor antisentido de la expresión de la glicoproteína P, donde dicho oligonucleótido tiene una longitud de al menos 15 nucleótidos y está constituido por una secuencia complementaria a al menos 15 nucleótidos contiguos en cualquiera de: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 o SEQ ID NO:16. 15
11. Un vector para expresión de proteína, que comprende un elemento codificante distinto constituido por el polinucleótido de la reivindicación 9.
12. Una célula hospedadora transformada con el vector de la reivindicación 11.
13. Un método de determinación de si una célula de cáncer responderá a una terapia orientada a invertir la multifármaco-resistencia, que comprende el paso de medir la expresión de un gen que codifica una proteína 20 seleccionada del grupo de: SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8.
14. El método de la reivindicación 13, donde dicha expresión se determina utilizando amplificación PCR de mARN transcrito inversamente.
15. El método de la reivindicación 13, donde dicha expresión se determina utilizando el anticuerpo de la 25 reivindicación 4.
16. Un método de determinación de si un compuesto de test inhibe la multifármaco-resistencia causada por un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7 y SEQ ID NO:8; donde dicho método comprende:
(a) expresar dicho gen en células que por lo demás no son multifármaco-resistentes; 30
(b) exponer dichas células a uno o más agentes citotóxicos en presencia de dicho compuesto de test;
(c) medir la supervivencia celular después de exposición de las células a dichos uno o más agentes citotóxicos y comparar los resultados obtenidos en el paso (b) con los de células incubadas esencialmente del mismo modo con dichos agentes citotóxicos pero en ausencia de dicho compuesto de test; y
(d) deducir que dicho compuesto de test inhibe la multifármaco-resistencia si la supervivencia celular se reduce en 35 un grado significativo por incubación de células en presencia de dicho compuesto de test con relación a la supervivencia de las células en incubaciones realizadas en ausencia de dicho compuesto de test.
17. El método de la reivindicación 16, donde dicho gen está constituido esencialmente por una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo constituido por: SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15 y SEQ ID NO:16. 40
Claims (6)
- REIVINDICACIONES1. Un método de enriquecimiento de células madre a partir de una mezcla celular, que comprendeponer en contacto una mezcla celular con un anticuerpo monoclonal específico que reacciona específicamente con una glicoproteína P 7p que tiene una secuencia de proteína seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:1, NO:2, NO:3, NO:4, NO:5, NO:6, NO:7 y NO:8 y aislar células madre unidas al anticuerpo a partir de la mezcla 5 celular,donde las células madre no son células madre embrionarias humanas.
- 2. Un método para obtener células madre positivas para la glicoproteína P 7p que comprende:aislar las células positivas para la glicoproteína P 7p a partir de una muestra de células madre, donde las células positivas para la glicoproteína P 7p se aíslan utilizando un anticuerpo monoclonal específico contra la glicoproteína 10 P 7p que tiene una secuencia de proteína seleccionada del grupo constituido por la SEQ ID NO:1, NO:2, NO:3, NO:4, NO:5, NO:6, NO:7 y NO:8,y donde las células madre no son células madre embrionarias humanas.
- 3. El método de la reivindicación 2, donde las células positivas para glicoproteína P 7p se aíslan utilizando un anticuerpo inmovilizado contra la glicoproteína P 7p. 15
- 4. El método de la reivindicación 3, donde el anticuerpo está inmovilizado en microesferas.
- 5. El método de la reivindicación 2, donde las células con glicoproteína P 7p se aíslan utilizando un análisis FACS.
- 6. Un método de caracterización de una célula madre, que comprendeponer en contacto una célula madre con un anticuerpo monoclonal específico dirigido contra una glicoproteína P 7p que tiene una secuencia de proteína seleccionada del grupo constituido por SEQ ID NO:1, NO:2, NO:3, NO:4, NO:5, 20 NO:6, NO:7 y NO:8 para determinar si la célula madre es positiva para la glicoproteína P 7p,donde las células madre no son células madre embrionarias humanas.
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