ES2833962T3 - Respuesta antitumoral a epítopos propios modificados - Google Patents

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Abstract

Un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un epítopo asociado a un tumor que estimula una reacción inmunitaria contra el tumor para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer, en el que el epítopo tiene una modificación de la desiminación de arginina a citrulina, el ácido nucleico se dirige a un célula que expresa una enzima PAD, que es una célula presentadora de antígeno (APC), y el ácido nucleico se traduce y se modifica con citrulina postraduccionalmente dentro de la APC para estimular las células T que son específicas del epítopo citrulinado.

Description

DESCRIPCIÓN
Respuesta antitumoral a epítopos propios modificados
La presente invención se refiere, en general, a ácidos nucleicos que codifican péptidos modificados que pueden usarse como dianas para la inmunoterapia contra el cáncer. Estos ácidos nucleicos y péptidos modificados pueden usarse como vacunas o como dianas para la terapia de anticuerpos monoclonales (mAb). Tales vacunas o mAb pueden usarse en el tratamiento del cáncer.
El foco de las respuestas inmunitarias antitumorales se ha dirigido en gran medida a la generación de respuestas CD8 específicas de tumores debido, en parte, a la falta de expresión del MHC de clase II en la mayoría de los tumores sólidos. Por tanto, estos tumores constituyen mejores dianas para las células T CD8 que para las células T CD4. Sin embargo, las terapias que involucran a las células T CD8 han provocado en los pacientes sólo respuestas modestas y de corta duración. Se sabe desde hace muchos años que las células CD4 colaboradoras desempeñan un papel fundamental en la inducción de respuestas inmunitarias específicas de epítopo, ya sean mediadas por anticuerpos o por CD8. Se ha informado que las respuestas de CD8 de memoria se deterioran si se inducen en ausencia de la colaboración de CD4 [1, 2]. Inicialmente se creía que esto se debía a su secreción de IL-2 [3], pero más recientemente se cree que también se debe a la modificación/activación de las células dendríticas (DC) que a su vez activan las células c D8 [4-7]. En la mayoría de los casos, esta colaboración la proporcionan epítopos CD4 extraños que se originan a partir de patógenos o se insertan en vacunas. Sin embargo, también se requieren respuestas CD4 específicas del tumor en el sitio del tumor para potenciar la inflamación, lo que resulta en un mayor reclutamiento y retención de células CD8, células NK y otros mediadores inflamatorios de la inmunidad antitumoral [8-11]. La participación de las células T CD4 colaboradoras en la inmunidad contra el cáncer se construye además a partir de estudios que usan ratones deficientes en CD4 o MHC de clase II en los que se produce la progresión del tumor, lo que indica la importancia de las células T CD4 en la erradicación de tumores. Los informes más recientes en la literatura sugieren la importancia de las células T CD4 reactivas al tumor que juegan un papel directo en la erradicación del tumor, así como la acción superior de las células Th17 específicas del tumor para mediar la destrucción del tumor in vivo [12-15]. Pueden generarse respuestas CD4 de alta frecuencia y avidez a epítopos específicos de tumores si el repertorio no está sujeto a tolerancia [16-18]. Cuando el repertorio está sujeto a la tolerancia a lo propio, la inducción de respuestas CD4 específicas de epítopo es mucho más limitada y las respuestas resultantes son de menor frecuencia y avidez.
Hay varios tipos de epítopos tumorales que pueden dirigirse dentro de los tumores. Estos incluyen epítopos específicos de tumores y epítopos asociados a tumores. Los primeros surgen debido a mutaciones o duplicaciones o eliminaciones de segmentos más grandes de ADN que se adquieren durante la generación y patogénesis del tumor. Las mutaciones puntuales son difíciles de atacar por el sistema inmunológico, ya que deben crear nuevos epítopos porque crean nuevos residuos de anclaje que pueden unirse al MHC o nuevos aminoácidos que interactúan más fuertemente con los receptores de células T o B (TCR o BCR). Incluso si las mutaciones generan nuevos epítopos, con frecuencia solo se reconocen por una pequeña porción de individuos con el haplotipo MHC apropiado. Las duplicaciones y eliminaciones de genes son difíciles de dirigir, ya que suelen ser exclusivas de cánceres individuales. En contraste, los epítopos asociados a tumores son epítopos normales sobreexpresados. Dichos epítopos normales se expresan habitualmente dentro del timo directamente o mediante la enzima AIRE, y las células T que reconocen estos epítopos con alta afinidad se eliminan o diferencian en células T reguladoras naturales. Aunque se han informado respuestas de CD8 a epítopos asociados a tumores, hay muy pocas respuestas CD4 a epítopos asociados a tumores, lo que sugiere que el repertorio de estos epítopos está más fuertemente regulado para células CD4 que para células CD8. Las únicas respuestas CD4 informadas son a antígenos de cáncer de testículo que se expresan durante la embriogénesis pero que solo permanecen activos en los gametos en adultos y pueden no estar sujetos a tolerancia tímica, aunque la evidencia reciente es que AIRE también puede presentar estos epítopos en el timo. Por tanto, el desafío es encontrar un repertorio de células T que puedan reconocer epítopos propios y atacar tumores.
La US2009/148400 divulga péptidos inmunoterapéuticos para el tratamiento del cáncer, así como vacunas de ADN que codifican estos péptidos. La WO2006/120474 divulga vacunas de ADN, que incluye las que codifican epítopos de células T derivados de melanoma de NY-ESO-1. La WO2010/117694 divulga péptidos citrulinados para su uso en el diagnóstico y pronóstico de la artritis reumatoide. La US2007/248539 divulga un fragmento de vimentina y un ácido nucleico que codifica tal fragmento, que puede asociarse con el cáncer. La US2004/013649 divulga una vacuna de ADN contra el cáncer derivada de Bcl-2 y Gang Wang y otros, Human Vaccines, 7(12): 1271-1281 divulga vacunas de ADN contra el cáncer a partir de Muc1 y calreticulina.
Los inventores han descubierto inesperadamente que ciertas modificaciones de los epítopos de las células T o B resultan en que los epítopos provocan una respuesta inmunitaria más fuerte en comparación con los epítopos no modificados. Sorprendentemente, los inventores han descubierto que ciertos epítopos modificados están asociados con tumores y, en consecuencia, pueden usarse para generar una respuesta inmunitaria contra dichos tumores.
De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un epítopo asociado a un tumor que estimula una reacción inmunitaria contra el tumor para su uso en un procedimiento para tratar el cáncer, en el que el epítopo tiene una modificación de desiminación de arginina a citrulina, el ácido nucleico se dirige a una célula que expresa una enzima PAD, que es una célula presentadora de antígeno (APC), y el ácido nucleico se traduce y se modifica con citrulina postraduccionalmente dentro de la APC para estimular las células T que son específicas al epítopo citrulinado.
El epítopo puede ser un epítopo de células T o B. Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden usarse solos o en combinación. Además, pueden usarse en combinación con otros agentes terapéuticos, tales como agentes anticancerígenos, que incluyen, pero no se limitan a, fármacos bloqueadores de puntos de control como ipilimumab.
El epítopo se modifica por desiminación de arginina para formar citrulina. La arginina libre puede convertirse en citrulina libre por el óxido nítrico sintetasa en eucariotas o por la arginina deiminasa en bacterias. La citrulina es un aminoácido modificado, pero, como no tiene ARNt, no puede incorporarse directamente a las proteínas y es el resultado de la modificación postraduccional de la arginina mediante la acción de la peptidilarginina deiminasa (PAD), una familia de enzimas que se encuentran en una variedad de tejidos. El término "citrulinación" o "desiminación" se refiere a la modificación de arginina a citrulina, que puede ser una modificación postraduccional por la enzima PAD dentro de una secuencia peptídica. Esto se muestra con más detalle en la Figura 1 de los dibujos adjuntos. En la reacción de arginina a citrulina, uno de los átomos de nitrógeno terminales de la cadena lateral de arginina es reemplazado por oxígeno. La reacción usa una molécula de H2O y produce amoníaco como subproducto. Esta conversión de arginina en citrulina puede tener consecuencias importantes para la estructura y función de las proteínas, ya que la arginina está cargada positivamente a pH neutro, mientras que la citrulina no está cargada. Con el aumento de la hidrofobicidad de una proteína, puede haber cambios en el plegamiento de proteínas. Hay cinco enzimas PAD, a saber, PAD1, 2, 3, 4 y 6. Aunque son altamente homólogas con una identidad de secuencia del 5-60 % a nivel de aminoácidos, tienen diferentes ubicaciones (PAD1 - epidermis y útero; PAD2 -cerebro, tracto reproductor femenino, músculo esquelético y células hematopoyéticas; PAD3 - folículo piloso y epitelio; PAD 4: células hematopoyéticas, carcinomas de pulmón, esófago, mama y ovario, PAD 6: ovocitos y embriones preimplantacionales [19]. Aunque existe cierta superposición con respecto a las proteínas diana, cada miembro de la familia también parece dirigirse a un conjunto único de proteínas celulares. Esto está determinado por la exposición superficial y la agrupación de argininas que las convierten en buenas dianas y secuencias flanqueantes de aminoácidos preferidas. Para PAD4, se prefieren pequeños aminoácidos no polares en las posiciones -2 y 2 y las prolinas que flanquean la arginina evitan la citrulinación [20, 21]. Por tanto, no todas las argininas dentro de una proteína están citrulinadas y no todas se presentan en antígenos del MHC para el reconocimiento de células T.
Los ácidos nucleicos que codifican epítopos citrulinados derivados de BiP, NY-ESO-1, MMP7, citoqueratinas, MUC1, CEA.CAM5, CD59, bcl2, p-catenina, CXCL8, CXCL10, CXCI12, a enolasa, proteína básica de mielina, histona, nucleofosmina, B23, complejo coactivador, antitrombina, agregan, factor de elongación 1a, proteína asociada a adenilciclasa (CAP1), proteína regulada por glucosa, ALDH2, proteína de capa intermedia del cartílago (CLIP), aldolasa, fosfoglicerato quinasa 1 (PGK1), calreticulina, HSP60, HSP90, proteínas de unión a elementos secuencia arriba lejanos 1 y 2 (FUSE-BP), asporina, catepsina D, proteína de unión a heparina, p-actina, F-actina, subunidad a-1 de la proteína protectora (CapZa-1), albúmina, receptor de histamina g, precursor de proteína disulfuroisomerasa ER60, aldehído deshidrogenasa mitocondrial (ALDH2) y glucógeno sintasa quinasa-3p (GSK3p) pueden usarse para estimular la inmunidad anticancerosa de acuerdo con la presente invención. Las referencias de Uniprot para estas proteínas se establecen en la Figura 32 de los dibujos adjuntos.
En pacientes con artritis reumatoide (AR) se encuentran anticuerpos contra una variedad de proteínas citrulinadas, como filagrina, colágeno, a-enolasa, fibrinógeno y vimentina y se usan como marcadores específicos para diagnosticar la enfermedad [22-24]. Más recientemente, una serie de otras proteínas citrulinadas que incluyen histona, nucleofosmina, B23, complejo coactivador, antitrombina, agregan, factor de elongación 1a, proteína asociada a adenilciclasa (CAP1), proteína regulada por glucosa, ALDH2, proteína de capa intermedia del cartílago (CLIP ), aldolasa, fosfoglicerato quinasa 1 (PGK1), calreticulina, HSP60, HSP90, BiP, proteínas de unión a elementos secuencia arriba lejano 1 y 2 (FUSE-BP), asporina, catepsina D, proteína de unión a heparina, p-actina, F-actina, subunidad a-1 de la proteína protectora (CapZa-1), la albúmina, el receptor de histamina, el precursor de la proteína disulfuro-isomerasa ER60, la aldehído deshidrogenasa mitocondrial (ALDH2) se han descrito como dianas para los anticuerpos en pacientes con AR [49]. Además, se ha postulado que la citrulina por sí sola no es suficiente para generar una respuesta inmunitaria; más bien, los aminoácidos que rodean a la citrulina son esenciales para determinar la antigenicidad del epítopo [25-27].
Además de la citrulinación, se han observado varias otras modificaciones postraduccionales dentro de los péptidos unidos al MHC. Estos incluyen la nitración de residuos de tirosina [28] y la oxidación de residuos de triptófano [29]. La activación de macrófagos y células dendríticas incluye la producción de óxido nítrico y otras especies reactivas de oxígeno. La exposición de proteínas puede provocar la nitración de tirosinas y, en menor medida, de triptófano. Se ha demostrado que las células CD4 reconocen específicamente estas modificaciones en los epítopos derivados de la lisozima del huevo de gallina [29]. Sin embargo, aún no se ha establecido el papel de los epítopos nitrados en cualquier enfermedad. La presencia de niveles elevados de nitrotirosinas en linfocitos infiltrantes de tumores prostáticos sugiere la producción local de peroxinitritos. La inhibición de la actividad de la arginasa y el óxido nítrico sintetasa, enzimas clave en el metabolismo de la arginina que se expresan en gran medida en las próstatas malignas pero no normales, reduce la nitración de tirosina y la restauración de los linfocitos que infiltran el tumor [30]. La desaminación de la glutamina o asparagina puede resultar del envejecimiento, pero una proporción significativa de esta modificación se genera por mecanismos enzimáticos. La desaminación crea cadenas laterales predominantemente cargadas negativamente (glutamato o aspartato) y altera la capacidad de la glutamina y la asparagina para formar enlaces de hidrógeno. Las asparaginas pueden convertirse en aspartato mediante N-glucanasa y, por lo tanto, esta modificación está íntimamente ligada a la N-glicosilación. Los residuos de glutamina pueden desaminarse mediante transglutamato tisular. La desaminación de la glutamina en las gliadinas de los glútenes de trigo de la dieta es un factor central de la enfermedad celíaca, un trastorno autoinmunitario asociado con la intolerancia al gluten en individuos genéticamente predispuestos. Los haplotipos HLA, DQ2 y DQ8 tienen una fuerte afinidad por los péptidos de gliadina desaminada y estimulan las respuestas de las células T contra el revestimiento gastrointestinal [31].
El ácido nucleico para su uso en la presente invención puede codificar un epítopo que puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en una secuencia seleccionada de:
IQKLYGKRS, preferentemente SQDDIKGIQKLYGKRS (MMP7-247),
NILTIRLTAA, preferentemente PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR (NYESO-1-119),
ILTIRLTAA, preferentemente PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR (NYESO-1-119),
EIRELQSQ, preferentemente EEEIRELQSQISDTSVVLS (citoqueratina 8229-247), AKQDMARQLREYQEL, preferentemente AKQDMARQLREYQELMNVKL (citoqueratina 8: 363-382), AKQDMARQ, preferentemente LQRAKQDMARQLREYQELM (citoqueratina 8: 360-378),
ISSSSFSRV, preferentemente PGSRISSSSFSRVGSS (citoqueratina 8: 29-44),
PRAFSSRS, preferentemente STSGPRAFSSRSYTSg Pg (citoqueratina 8: 13-30),
EAALQRAKQ, preferentemente ELEAALQRAKQDMARQL (citoqueratina 8: 355-371), LEVDPNIQAVRTQE, preferentemente LEVDPNIQAVRTQEKEQI (citoqueratina 8: 78-95) y
QKKLKLVRT, preferentemente AQKKLKLVRTSPEYGMP (ING4158-174)
LKLVRTSPE, preferentemente AQKKLKLVRTSPEYGMP (ING4158-174)
KKLKLVRTS, preferentemente AQKKLKLVRTSPEYGMP (ING4158-174)
YMSSARSLS, MSSARSLSS o TEYMSSARS, preferentemente KLATEYMSSARSLSSEEK (ING444-58) FDLFENRKK, preferentemente RAPFDLFENRKKKNN (HSP90-346-360)
YLNFIRGVV o FIRGVVDSE, preferentemente IPEYLNFIRGVVDSE (HSP90 - 378-392)
LRYYTSASG, LLRYYTSAS o LSELLRYYT, preferentemente RKKLSELLRYYTSASGDEMVSL (HSP90-456-477) RRRLSELLRYHTSQS (HSP90 beta 456-460)
VGVFKNGRV o FKNGRVEII, preferentemente YSCVGVFKNGRVEII (BiP39-53)
YFNDAQRQA, preferentemente VPAYFNDAQRQATKDA (BiP 172-186)
VTFEIDVNG, preferentemente EVTFEIDVNGILRVT (BiP 497-511)
ITNDQNRLT, preferentemente KITITNDQNRLTPEE (BiP 522-536)
LQIVARLKN o VARLKNNNR, preferentemente NCALQIVARLKNNNR (CXCL12-54-68)
VEIIATMKK o RVEIIATMK, preferentemente CPRVEIIATMKKKGE (CXCL1057-71)
en el que uno o más de los residuos R se sustituye por citrulina. En NYESO-1-119, se prefiere si el primer residuo R (en la posición 136) se sustituye por citrulina. En la citoqueratina 8: 360-378, se prefiere si el segundo residuo R (en la posición 369) se sustituye por citrulina. En la citoqueratina 8: 29-44, se prefiere si el segundo residuo R (en la posición 40) se sustituye por citrulina. En las HSP90, BiP, ING4, CXCL10 y CXCL12 se prefiere si todos los residuos R dentro de las secuencias se sustituyen por citrulina. En la presente memoria es divulgado un péptido que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia de aminoácidos YVTTSTcitTYSLGSALcit, que opcionalmente comprende, consiste esencialmente en o que consiste en los aminoácidos de la secuencia citSYVTTSTcitTYSLGSALcitPSTS (vim28-49), en el que cit representa citrulina.
Un ácido nucleico preferido para su uso en la presente invención codifica un epítopo que se deriva de la vimentina y está citrulinado. Los inventores han descubierto inesperadamente que los epítopos citrulinados derivados de la vimentina pueden usarse para generar una respuesta inmunitaria contra tumores que incluyen, pero no se limitan a, melanoma, tumores de mama, endometrio, colorrectal y ovárico.
Un epítopo preferido de vimentina comprende, consiste esencialmente en o consiste en YVTTSTRTYSLGSALR (vimentina 30-45), que está citrulinado. Una o ambas argininas pueden estar citrulinadas. El epítopo puede comprender, consistir esencialmente en o consistir en RSYVTTSTRTYSLGSALRPSTS (vimentina 28-49), que está citrulinado. Cualquiera o dos, o todas, de las tres argininas presentes pueden estar citrulinadas. Se prefiere que los tres residuos R estén citrulinados. El segundo residuo R (en la posición 36) puede sustituirse por citrulina.
Los epítopos alternativos de la vimentina comprenden, consisten esencialmente en o consisten en al menos una de las siguientes secuencias:
VRLRSSVPG o RLRSSVPGV, preferentemente SAVRLRSSVPGVR (vim65-77) y
FSSLNLRET, preferentemente LPNFSSLNLRETNLDSLPL (vim415-433),
en el que uno o más de los residuos R se sustituye por citrulina. En vim65-77, se prefiere si el segundo residuo R (en la posición 70) se sustituye por citrulina.
Otros epítopos alternativos de vimentina comprenden, consisten esencialmente en o consisten en al menos una de las siguientes secuencias:
RSSVPGVRL, SAVRLRSSV, ATRSSAVRL, YATRSSAVRLRSSVPGVRL (vim 61-79),
RSSVPGVRL, GVRLLQDSV, RLRSSVPGVRLLQDSVDFS (vim 69-87),
QLKGQGKSR, KSRLGDLYE, EQLKGQGKSRLGDLYEEEM (vim125-154),
ELRRQVDQL, EMRELRRQV, DLYEEEMRELRRQVDQLTN (vim 148-166),
QLTNDKARV, VEVERDNLA, LTNDKARVE, VDQLTNDKARVEVERDNLA (vim 161-179),
EVERDNLAE, NDKARVEVERDNLAEDIMR (vim 166-184),
IMRLREKLQ, DNLAEDIMRLREKLQEEML (vim 176-194),
QREEAENTL, KLQEEMLQR, EKLQEEMLQREEAENTLQS (vim 187-205), y/o
FRQDVDNAS, ENTLQSFRQ, EAENTLQSFRQDVDNASLA (vim 198-216),
en el que uno o más de los residuos R pueden sustituirse por citrulina. En lo anterior, se subrayan los residuos R preferidos para la sustitución por citrulina. La secuencia o secuencias centrales se muestran antes del epítopo.
En la presente memoria es divulgado un epítopo que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia YVTTSTRTYSLGSALR y que comprende opcionalmente la secuencia RSYVTTSTRTYSLGSALRPSTS (vim28-49) y/o un ácido nucleico que codifica dicho epítopo, para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer.
También es divulgado en la presente memoria un epítopo que comprende, que consiste esencialmente en o que consiste en la secuencia fSs LNLRET, preferentemente LPNFSSLNLRETNLDSLPL (vim415-433) y/o un ácido nucleico que codifica dicho epítopo, para su uso en un procedimiento de tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. Los inventores han descubierto que este epítopo estimula una respuesta de IL10 que suprime la respuesta inmunitaria general.
A menos que se indique de otra forma, los residuos subrayados en las secuencias anteriores indican las secuencias centrales. Los aminoácidos fuera de estas secuencias centrales pueden sustituirse de forma conservadora por otros aminoácidos, preferentemente por aminoácidos que tienen un tamaño y/o carga similar al aminoácido nativo que están reemplazando, o pueden eliminarse. Adicional o alternativamente, 1, 2, 3, 4, 5 o todos los aminoácidos no centrales pueden sustituirse o eliminarse. Los epítopos útiles en la presente invención pueden tener una longitud, hidrofobicidad y/o carga óptima para el reconocimiento por las células T CD4+ en el contexto de moléculas HLA de clase II. Los epítopos útiles en la invención pueden comprender al menos 13, 14, 15, 16 o más aminoácidos. Los expertos en la técnica apreciarán que pueden identificarse epítopos adicionales útiles en la invención mediante el uso de las diversas técnicas que se exponen en el Ejemplo 10 en la presente memoria.
Los inventores han descubierto que la administración de ácido nucleico, como ADN o ARN, que codifica la vimentina de longitud completa (ver la secuencia de la vimentina humana en la Figura 2. El residuo de metionina N-terminal puede incluirse para excluirse), da lugar a fuertes respuestas inmunitarias. Esto constituye una realización adicional de la invención.
La vimentina (vim) está altamente conservada entre aquellas especies en las que se ha clonado el gen (pollo, ratón, perro, oveja, vaca, caballo, cerdo y humano). Por consiguiente, la vimentina y los epítopos derivados de la vimentina, como los que se discuten anteriormente, así como los ácidos nucleicos que los codifican, pueden usarse para tratar el cáncer en mamíferos no humanos.
El solicitante ha demostrado previamente que la incorporación de epítopos de células T dentro de una construcción de ADN de anticuerpos mejora tanto la frecuencia como la avidez de la respuesta de las células T [32, 33]. Como se discute con más detalle en los ejemplos siguientes, los inventores clonaron una variedad de epítopos extraños y epítopos propios en construcciones de anticuerpo-ADN y seleccionaron respuestas de células T en los ratones transgénicos HLA. Todos los epítopos extraños estimularon fuertes respuestas de células T, pero el único epítopo propio que estimuló una respuesta significativa fue la vimentina 28-49. Incluso el epítopo de gp100 humano, que solo difería en un cambio de aminoácido conservador del epítopo de ratón nativo, estimuló una fuerte respuesta en ratones, mientras que el epítopo de ratón completamente conservado no logró estimular una respuesta en ratones. Esto sugiere que existe tolerancia/eliminación completa de las células T que reconocen el epítopo de ratón, pero no el epítopo humano muy similar. La implicación es que el epítopo humano no estimulará las respuestas de las células T en humanos y, aunque el epítopo de ratón podría hacerlo, las células T no podrán reconocer el epítopo humano procesado naturalmente dentro del tumor. En contraste, el epítopo propio 28-49 de la vimentina estimuló una respuesta de IFNy en ratones transgénicos HLA-DR4. Estudios anteriores habían demostrado que el epítopo vim 28­ 49 no estimulaba una respuesta inmunitaria en donantes normales o en pacientes con artritis reumatoide (AR) [34]. En contraste, los inventores han demostrado que los pacientes con cáncer producen una respuesta inmunitaria al vim 28-49. Esto sugiere, inesperadamente, que este epítopo no está sujeto a la tolerancia a lo propio y existe un repertorio de células T tanto en ratones como en humanos que pueden reconocer y responder a este epítopo.
La vimentina (gi/4507895) es una proteína intracelular homodimérica que se encuentra en los filamentos intermedios (IF), específicamente los IF de clase III, en células mesenquimales y otras células no epiteliales. Los IF son un componente principal del citoesqueleto de las células eucariotas superiores y están compuestos por varias proteínas relacionadas estructuralmente diferentes. Los diferentes genes de la proteína IF se expresan en diferentes tejidos. Se han caracterizado los genes de la vimentina humana y murina (véase, por ejemplo, [35, 36]).
La vimentina, junto con otras proteínas IF, se ha usado en la clasificación histológica de tumores humanos (para revisiones, véase [37, 38]) y como marcador de desdiferenciación en varios tipos de tumores. Se han descrito diagnósticos y terapéuticos dirigidos a la vimentina para enfermedades neoplásicas resistentes a múltiples fármacos (Número de solicitud de patente de EE. UU. 20100260667), al igual que los marcadores tumorales que colocalizan con vimentina y otros IF, véase por ejemplo la WO0127269. Este último divulga un marcador novedoso para neuroblastomas llamado VIP54 y su uso en la detección y formación de imágenes celulares de IF como marcador del desarrollo y la progresión tumoral. Se conocen varios otros ejemplos que muestran cambios en el nivel expresado y la distribución intracelular de la vimentina en diferentes tipos de tumores sólidos humanos y líneas celulares de tumores sólidos [39, 40]. Sin embargo, hasta ahora no ha habido demostración de respuestas de células T a vimentina no modificada.
La vimentina humana es una proteína de 57 kDa, que comprende 466 aminoácidos (véase la Figura 2 de los dibujos adjuntos) y es una de las proteínas más ampliamente expresadas y altamente conservadas de la familia de proteínas IF de tipo III. Está ausente en el citosol, pero se expresa en el núcleo y como proteína extracelular. Está involucrada en la organización dinámica del citoesqueleto, con una función vital en el transporte de orgánulos, migración y proliferación celular.
Transición mesenquimal epitelial (EMT); La vimentina también se sobreexpresa en varios cánceres epiteliales, que incluyen el cáncer de próstata, el cáncer gastrointestinal, el cáncer de mama, el cáncer de pulmón, el melanoma maligno y los tumores del sistema nervioso central. También se encuentra en el cáncer de cuello uterino [41], el carcinoma de células renales de células claras [42], en ciertos tipos de linfomas [43], el carcinoma papilar de tiroides [44] y los carcinomas endometriales [45]. Su sobreexpresión en el cáncer se correlaciona con un crecimiento tumoral acelerado, invasión y mal pronóstico. En los cánceres gástricos, la expresión de vimentina se ha asociado con mayor frecuencia con el fenotipo invasivo del carcinoma gástrico y se sugiere que desempeña un papel importante en la metástasis de los carcinomas gástricos, además de servir como marcador pronóstico [46, 47]. Los sarcomas de tejidos blandos y algunos cánceres epiteliales que presentan fenotipos de transición epitelial a mesenquimatosa (EMT) expresan vimentina. El cambio de células de carcinoma de un fenotipo epitelial a tipo mesenquimatoso a través de un EMT se reconoce como un paso relevante en la metástasis de tumores sólidos (véase la Figura 3 de los dibujos adjuntos). Además, este cambio fenotípico de las células del carcinoma está asociado con la adquisición de mecanismos de resistencia tumoral que reducen los efectos antitumorales de la radiación, la quimioterapia y algunas terapias dirigidas por moléculas pequeñas. Aunque la vimentina se reconoce como un marcador de EMT, su papel en la tumorigénesis sigue sin estar claro. Uno de los inductores de EMT más estudiados es el TGFp, que se ha demostrado en múltiples tipos de tumores que coopera con las vías de señalización de RTK u otras vías para conducir las células tumorales hacia un fenotipo metastásico más mesenquimatoso. Ivaska [48] ha demostrado que la vimentina contribuye a la EMT al regular positivamente la expresión génica de varios genes ligados a la e Mt , especialmente la expresión del receptor promigratorio tirosina quinasa Axl. Varios estudios apoyan la noción de que la vimentina funciona como un regulador positivo de la EMT y su regulación positiva es un requisito previo para la inducción de la EMT [48, 49]. Todos los cánceres que se mencionan anteriormente pueden tratarse de acuerdo con la invención, independientemente del epítopo, así como el cáncer de ovario y el gastrointestinal. La invención también puede referirse, pero sin limitarse, al tratamiento de cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de pulmón, melanoma maligno, tumores del sistema nervioso central, cáncer de cuello uterino, carcinoma de células renales de células claras, linfomas, carcinoma papilar de tiroides y carcinomas de endometrio. El uso puede ser veterinario o humano.
Pueden administrarse in vivo vimentina 28-49 y otros epítopos como un péptido, opcionalmente en forma de péptido como es divulgado en la WO02/058728. Los inventores han descubierto sorprendentemente que los epítopos dan lugar a fuertes respuestas inmunitarias cuando se administran como péptidos. Dichos epítopos pueden administrarse simplemente como la secuencia del epítopo, o como un polipéptido que contiene el epítopo, o incluso como la proteína de longitud completa. Alternativamente, de acuerdo con la invención, pueden administrarse in vivo epítopos como un ácido nucleico que codifica el epítopo, que codifica un polipéptido que contiene el epítopo o incluso que codifica la proteína de longitud completa. Tales ácidos nucleicos pueden estar en forma de minigen, es decir, que codifican una secuencia líder y el epítopo o una secuencia líder y una proteína de longitud completa. Alternativamente, pueden estar en forma de ácidos nucleicos como es divulgado en la WO2008/116937. El ácido nucleico puede comprender al menos una secuencia que codifica una cadena pesada recombinante de una molécula de inmunoglobulina, teniendo la cadena pesada al menos un epítopo de células T heterólogo en el mismo, en el que el epítopo de células T es un epítopo útil en la invención, preferentemente vimentina 28-49. Preferentemente, el ácido nucleico comprende además un promotor no específico y puede ser ADN. La molécula de inmunoglobulina puede ser un anticuerpo. El epítopo puede insertarse en un CDR de la cadena pesada, preferentemente el CDR3 de la cadena pesada. Los ácidos nucleicos que codifican epítopos útiles en la presente invención pueden dirigirse a células presentadoras de antígenos y otras células que expresan enzimas PAD, preferentemente enzimas PAD4. Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden dirigirse al incluir un ácido nucleico que codifique un agente de dirección, como Fc o un anticuerpo monoclonal que se dirija a un antígeno diferente en las APC, por ejemplo, mAb anti-DEC205 o mediante inyección intradérmica, ya que la piel tiene un gran número de APC.
Estudios anteriores habían demostrado que el vim 26-44 citrulinado en las posiciones 28 y 36, vim 36-54 citrulinado en las posiciones 36 y 45 y el vim 415-433 citrulinado en la posición 424 pueden estimular las respuestas de las células T en ratones HLA-DR4 y/o en pacientes con AR [34]. Como es divulgado en detalle en los Ejemplos, para probar si los epítopos vim dentro de una construcción de ADN estimulaban respuestas inmunitarias contra la vimentina citrulinada, los ratones se inmunizaron con ADN que codifica los epítopos de vimentina y se cribaron en busca de respuestas contra los epítopos no modificados y citrulinados. Los ratones inmunizados con ADN de vim 28-49 o ADN que codifica la secuencia de vimentina completa respondieron más fuertemente al epítopo 28-49 citrulinado que los epítopos de tipo salvaje. Esto sugiere que, cuando se traduce el ADN, los epítopos vim están citrulinados, el epítopo citrulinado se une con mayor afinidad al MHC o que las células T estimuladas con epítopos vim no modificados reconocen los epítopos citrulinados con más avidez.
A diferencia de vim 28-49, el ADN de vim 415-433 o el ADN que codifica toda la secuencia de vimentina solo estimuló respuestas que reconocían el epítopo citrulinado vim415-433 pero no el vim415-433 de tipo salvaje, lo que confirma que el ADN dentro de las células presentadoras de epítopos (APC) se estaba traduciendo en un péptido que estaba siendo citrulinado. En este contexto, se ha demostrado recientemente que las células dendríticas expresan las enzimas citrulinantes PAD2 y PAD4 [51]. De mayor interés fue que el ADN que codifica vim 415-433 dio una fuerte respuesta Th17. Las vacunas de a Dn que codifican epítopos de MMP7 y NY-ESO-1 también estimularon las células T que podrían reconocer epítopos citrulinados y no modificados. La respuesta de MMP-7 fue predominantemente Th17 mientras que la respuesta de NYESO-1 fue predominantemente Th1. De manera similar, los pacientes con cáncer muestran respuestas a estos péptidos modificados y no modificados de MMP7 y NYESO-1.
Ha habido varios informes que indican que los monocitos expresan las enzimas PAD [27, 52, 53]. Más recientemente, se ha demostrado que tanto las células dendríticas derivadas de la médula ósea como los macrófagos peritoneales expresan pAD2 y PAD4 [51]. La citrulinación como parte del procedimiento inflamatorio apenas está comenzando a explorarse. La estimulación de las células mononucleares de sangre periférica con IFNy y ARN bicatenario provoca la citrulinación de las quimiocinas CXCL8 y CXCL10, con un efecto fundamental sobre el uso de sus receptores, el procesamiento proteolítico y las actividades biológicas [54-56]. Esto puede implicar que los mediadores del estrés celular a través de los receptores TOLL, los receptores DAMP o las proteínas de choque térmico pueden permitir la activación fisiológica de las enzimas PAD tanto dentro de las APC como dentro de las células diana, tales como las células infectadas o las células tumorales, para permitir la ruptura de la tolerancia a los epítopos propios modificados y la inducción de respuestas inmunitarias. La citrulinación dentro de las células dendríticas parece relacionarse con la autofagia [57], pero esto solo se ha demostrado con lisozima de huevo de gallina. Como es divulgado en la presente memoria, el ADN que codifica los epítopos no modificados puede estimular las respuestas de las células T que son específicas del epítopo citrulinado. Esto implica que el ADN debe traducirse y modificarse con citrulina postraduccionalmente dentro de las APC para estimular las células T que son específicas del epítopo citrulinado. Esta es la primera vez que se ha demostrado que las vacunas de ácido nucleico estimulan la citrulinación. No hay informes de tumores que modifiquen con citrulina ningún epítopo presentado en moléculas de MHC.
Además de mostrar que los epítopos que se codifican dentro del anticuerpo-ADN dan respuestas de mayor frecuencia y avidez, los inventores también han demostrado en la presente memoria que los péptidos citrulinados pueden estimular las respuestas de las células T. Los péptidos citrulinados vim 28-49 estimularon predominantemente las respuestas Th1 que reconocieron epítopos modificados, aunque hubo alguna reacción cruzada contra péptidos de tipo salvaje. El péptido vim 28-49 de tipo salvaje estimuló las respuestas Th1 contra epítopos tanto de tipo salvaje como modificados. Cuando los pacientes con cáncer se estimularon con cualquiera de los péptidos, 2/11 respondieron a los epítopos no modificados y 5/11 a vim 28-49 citrulinado. Hill y otros [50] han demostrado previamente que un epítopo vim 65-77 citrulinado modificado que sustituye A por L en la posición 33 se une más fuertemente al HLA-DR4 que el epítopo no modificado. Sin embargo, este es un antígeno sintético y se ha demostrado en los ratones transgénicos d R4 que el epítopo natural vim 65-77, incluso si está citrulinado, no induce respuestas inmunitarias [34]. En contraste, hemos demostrado que en los ratones HLA-DR4, los péptidos citrulinados vim 28-49 y vim 65-77 estimularon respuestas Th1 que reconocían predominantemente el epítopo modificado, mientras que el epítopo de tipo salvaje era un inmunógeno pobre. Un análisis adicional confirmó que estas respuestas fueron mediadas por las células T CD4. El vim65-77 citrulinado también estimuló respuestas en los ratones transgénicos HLA-A2.DR1. Sin embargo, un análisis más detallado reveló que se trataba de una respuesta CD8 y que el epítopo específico era RLcitSSVPGV. Este es el primer epítopo de CD8 citrulinado que se divulga.
Inesperadamente, hemos demostrado que, en pacientes con cáncer, 4/9 pacientes respondieron a vim 65-77 y 4/9 a vim 65-77 citrulinado, pero solo dos de estos pacientes respondieron a ambos péptidos. Al igual que con la inmunización con ADN, los ratones inmunizados con el péptido vim 415-433 citrulinado estimularon respuestas que eran específicas de los epítopos modificados, mientras que el epítopo de tipo salvaje no logró estimular una respuesta. Además, el péptido vim 415-433 citrulinado estimuló una respuesta IL-17 muy fuerte. En contraste, en pacientes con cáncer, 8/11 respondieron al epítopo de tipo salvaje mientras que solo 5/11 respondieron al vim 415­ 433 citrulinado. Esto sugiere que tanto los epítopos no modificados como los modificados pueden estimular las respuestas de las células T en pacientes y que estas respuestas de las células T no siempre reaccionan de forma cruzada. Esta es también la primera demostración de que los pacientes con cáncer pueden responder a los epítopos citrulinados, que anteriormente se pensaba que estaba restringido a los pacientes con AR.
Los péptidos modificados y el ADN que codifica dichos péptidos pueden estimular respuestas inmunitarias a epítopos modificados, y estos epítopos modificados se expresan en células tumorales diana. La vimentina citrulinada está presente en macrófagos inflamatorios [58, 59] y se observa durante la apoptosis de macrófagos humanos y de ratón inducida por ionóforo de calcio. Los macrófagos expresan PAD tanto a nivel de ARN como de proteína [60] y se expresa la vimentina citrulinada in vitro en células similares a macrófagos después del influjo de Ca2+ inducido por ionóforos [27, 58]. Sin embargo, normalmente la concentración de Ca2+ citosólico (aproximadamente 10'7M) es demasiado baja para la actividad de la enzima PAD. La concentración de Ca2+ mínima requerida para la actividad de la PAD es aproximadamente 100 veces mayor que la concentración normal de Ca2+ citosólico. Como estos ionóforos y el influjo concomitante de Ca2+ causa apoptosis, se sugirió que la citrulinación de vimentina está asociada con la apoptosis. De hecho, la citrulina juega un papel importante en la preparación de las proteínas intracelulares para su degradación durante la apoptosis. Se ha demostrado que la vimentina está citrulinada en los macrófagos que experimentan apoptosis, y se ha demostrado que se generan anticuerpos contra la vimentina citrulinada en caso de la eliminación inadecuada del material apoptótico [27]. Tales estudios sugieren un papel importante para las modificaciones postraduccionales en la regulación de la función de vimentina, especialmente dado que las modificaciones parecen ser específicas de células y tejidos. Sin embargo, si las PAD solo se activan en células tumorales apoptóticas, las proteínas citrulinadas serían dianas pobres, ya que estas células ya están muriendo. Sin embargo, los inventores han demostrado que las células T que reconocen epítopos modificados producen potentes respuestas antitumorales, lo que sugiere que las células tumorales viables como las APC pueden liberar niveles de calcio intracelular localmente altos que resultan en la citrulinación de proteínas diana. Además, las células T inducidas por los vim 415-433 y vim 28-49 citrulinados inducen células T CD4 que pueden reconocer y destruir células tumorales en el contexto del MHC de clase II y la expresión de epítopos, pero no las células normales.
Aunque se demostró que el vim 415-433 citrulinado estimula las respuestas de las células T mientras que el epítopo no modificado no lo hizo, esto podría haber estado relacionado con la diferencia de dos aminoácidos entre el vim 415-433 humano y de ratón. Por tanto, los ratones se cribaron en busca de respuestas contra el epítopo de ratón. Los ratones inmunizados con vimentina humana citrulinada reconocieron la vimentina de ratón. Además, al igual que el epítopo humano, esta fue una respuesta Th1/Th17. Previamente, se ha demostrado que la inducción de respuestas Th1 o Th17 está fuertemente influenciada por los adyuvantes inmunes que crean el medio de citocinas correcto para las respuestas apropiadas. El IFNy y la IL-12 desencadenan la diferenciación de las células Th1. Las células Th1 producen IFNy, IL-2, TNF y GM-CSF y estimulan, por ejemplo, la activación de las células T CD8+. En contraste, las células Th2 se diferencian por la IL-4. Secretan IL-4, IL-5 e IL-13 y ayudan a las células B en la producción de anticuerpos y regulan negativamente las respuestas proinflamatorias inducidas por las células Th1. El TGFp, la IL-1, IL-6, IL-21 e IL-23 desencadenan la diferenciación de las células Th17. Estas producen IL-17 e IL-6. Las células T CD4+ se diferencian en iTreg en ausencia de citocinas proinflamatorias, pero altas concentraciones de TGFp (véase la Figura 4 de los dibujos adjuntos). Estas células secretan TGFp e iL-10, y se caracterizan por el factor de transcripción forkhead box p3 (Foxp3). Controlan y contrarrestan las respuestas inmunitarias de otras células T efectoras y participan en la prevención de la autoinmunidad [61].
Por tanto, el péptido vim 415-433 citrulinado se inmunizó con una variedad de adyuvantes o de hecho sin adyuvante. Los adyuvantes inmunoestimuladores tales como CpG/MPLA y GMCSF estimularon las respuestas Th1/Th17 y fueron necesarios, ya que no hubo respuesta en ausencia de adyuvante. Los adyuvantes inertes como el alumbre y el adyuvante incompleto de Freund provocaron la inducción de respuestas predominantemente de IL-10 similares a la inmunización con el péptido vim 415-433 de tipo salvaje que también indujo una respuesta de IL-10, lo que sugiere la inducción de una respuesta iTreg. En contraste, la combinación del péptido vim 415-433 citrulinado con un adyuvante óptimo indujo una respuesta de IFNy/IL-17, lo que sugiere una respuesta Th17. Esta es la primera ilustración de que los epítopos de las células T pueden determinar la diferenciación de las células T colaboradoras.
Como los ratones respondieron con una fuerte respuesta Th1/Th17 a una única inmunización con el péptido vim 415-433 citrulinado, esto puede haber reflejado un impulso a una respuesta Treg natural. Sin embargo, la eliminación de las Treg naturales no influyó en la frecuencia o la avidez de la respuesta inmunitaria contra el vim 415-433 citrulinado, lo que sugiere que esto era poco probable. Puede haber sido que el epítopo vim 415-433 de tipo salvaje presentado in situ haya estimulado una respuesta iTreg, caracterizada por la producción de IL-10. De hecho, los ratones inmunizados con el péptido vim 415-433 citrulinado produjeron respuestas de IFNy, IL-17 e IL-10, mientras que los ratones inmunizados con el epítopo no modificado solo estimularon una respuesta de IL-10. El péptido vim 415-433 sin modificar también estimuló las respuestas de IL-10 en pacientes con cáncer. Los mabs anti-CTLA-4 pueden bloquear la interacción del CTLA-4 con su receptor análogo CD80/86, y evitar así la inhibición de las células T inducida por este ligando. La inmunización de los ratones con el péptido vim 415-433 citrulinado en presencia de un mab anti-CTLA-4 aumentó significativamente la avidez de la respuesta de las células T de 10-6M a 10-8M.
En la presente memoria es divulgado un epítopo modificado que estimula una reacción inmunitaria de IL-10 contra antígenos propios y/o un ácido nucleico que codifica dicho epítopo, para su uso en medicina, teniendo el epítopo una modificación seleccionada de desiminación de arginina a citrulina, nitración de tirosina, oxidación de triptófano y desaminación de glutamina o asparagina. También es divulgado en la presente memoria un procedimiento para modular la diferenciación de las células T colaboradoras, que comprende poner en contacto una célula T colaboradora con un epítopo y/o ácido nucleico como se define en la presente memoria y opcionalmente un adyuvante. También es divulgado en la presente memoria un epítopo y/o un ácido nucleico como se define en la presente memoria y, opcionalmente, un adyuvante para su uso en un procedimiento de modular la diferenciación de células T colaboradoras. También es divulgado en la presente memoria el uso de un epítopo y/o un ácido nucleico como se define en la presente memoria y opcionalmente un adyuvante en la fabricación de un medicamento para modular la diferenciación de células T colaboradoras. Los epítopos útiles en estos pueden ser un epítopo como se define en la presente memoria, y/o puede ser un epítopo modificado que estimula una reacción inmunitaria de IL-10 contra antígenos propios, teniendo el epítopo una modificación seleccionada de desiminación de arginina a citrulina, nitración de tirosina, oxidación de triptófano y desaminación de glutamina o asparagina. El adyuvante puede ser adyuvante incompleto de Freund, CpG, MPLA, GMCSF y adyuvante completo de Freund.
Pueden usarse epítopos y/o ácidos nucleicos útiles en la invención para dirigir la diferenciación de células T colaboradoras para estimular una respuesta inmunitaria. Como tales, pueden usarse junto con vacunas para aumentar la eficacia de tales vacunas. Como demostraron los inventores, el péptido vim 415-433 citrulinado indujo una respuesta de IFNy/IL-17, lo que sugiere una respuesta de Th17. Esto contrasta con la respuesta normal para vim 415-433 y otros epítopos propios, que causan la diferenciación de células T colaboradoras en células iTreg. Alternativamente, pueden usarse epítopos y/o ácidos nucleicos útiles en la invención para dirigir la diferenciación de células T colaboradoras para suprimir una respuesta inmunitaria. El ING4 citrulinado da lugar a una respuesta de IL-10, lo que sugiere una respuesta iTreg y la supresión de una respuesta inmunitaria. Tales epítopos pueden usarse en el tratamiento de enfermedades en las que es deseable la inmunosupresión, tales como enfermedades autoinmunitarias y enfermedad de injerto contra huésped (GVHD). Los ejemplos de enfermedades autoinmunitarias incluyen la alopecia areata, la espondilitis anquilosante, el síndrome antifosfolípido, la enfermedad de Addison autoinmunitaria, la anemia hemolítica autoinmunitaria, la hepatitis autoinmunitaria, la enfermedad autoinmunitaria del oído interno, el síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS), la Púrpura Trombocitopénica autoinmunitaria (ATP), la enfermedad de Behcet, la cardiomiopatía penfigoide bulloso, la dermatitis esprue celíaca, el síndrome de fatiga crónica inmune, el Síndrome de Deficiencia (CFIDS), la polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, el penfigoide cicatricial, la enfermedad de las aglutininas frías, el síndrome CREST, la enfermedad de Crohn, la enfermedad de Dego, la dermatomiositis, la dermatomiositis juvenil, el lupus discoide, la crioglobulinemia mixta esencial, la fibromialgia-fibromiositis, la enfermedad de Grave, de Guillain-Barre, la tiroiditis de Hashimoto, la fibrosis pulmonar idiopática, la Púrpura de Trombocitopenia Idiopática (ITP), la nefropatía IgA, la diabetes insulinodependiente (Tipo I), la artritis juvenil, el lupus, la enfermedad de Meniere, la enfermedad del tejido conjuntivo mixta, la esclerosis múltiple, la miastenia grave, el pénfigo vulgar, la anemia perniciosa, la poliarteritis nudosa, la policondritis, los síndromes poliglanculares, la polimialgia reumática, la polimiositis y dermatomiositis, la agammaglobulinemia primaria, la cirrosis biliar primaria, la psoriasis, el fenómeno de Raynaud, el síndrome de Reiter, la fiebre reumática, la artritis reumatoide, la sarcoidosis, la escleroderma, el síndrome de Sjogren, el síndrome del hombre rígido, la arteritis de Takayasu, la arteritis temporal/arteritis de células gigantes, la colitis ulcerosa, la uveítis, la vasculitis, el vitíligo y la granulomatosis de Wegener.
En la presente memoria es divulgado un procedimiento para predecir la supervivencia en el cáncer colorrectal, que comprende determinar el nivel de peptidilarginina deiminasa 4 (PAD4) en una célula de cáncer colorrectal. El 94 % de los tumores expresan PAD4. Las células tumorales que pierden la expresión de PAD4 indican un mal pronóstico y sugieren una supervivencia reducida. Por lo tanto, si un cáncer colorrectal muestra poca o ninguna expresión de PAD4, el paciente tiene un mal pronóstico. Sin desear estar ligado a la teoría, esto puede relacionarse con la falta de epítopos citrulinados que puedan ser reconocidos y destruidos por las células T. Por tanto, el tumor evade la vigilancia inmunitaria. En contraste, si el tumor expresa la PAD4, las dianas se eliminan, el crecimiento del tumor está controlado por la respuesta inmunitaria y el paciente tiene un mejor pronóstico.
El nivel de PAD4 puede determinarse mediante el uso de un anticuerpo u otro inmunoensayo para medir la cantidad de proteína PAD4 en la célula. Alternativamente, el nivel de ARNm de PAD4 puede medirse mediante hibridación in situ. Los expertos en la técnica conocen técnicas alternativas adecuadas para determinar el nivel de ARNm, así como técnicas alternativas para determinar el nivel de una proteína.
El 90 % de los tumores colorrectales expresaron vimentina, encontrándose principalmente en células estromales e infiltrantes. En el 15 % de las células, también se tiñeron algunas células epiteliales y en el 12 % de los tumores se tiñeron más del 75 % de todas las células. Solo el 6 % de los tumores colorrectales no se tiñeron con un mAb específico de PAD4. El análisis de supervivencia de Kaplan Meier mostró que había una correlación con la intensidad y la supervivencia de PAD4. En un modelo multivariado, el estadio TNM (p=<0,0001), la invasión vascular (p=<0,0001) y la expresión de PAD4 (p=0,004) fueron predictores independientes de la supervivencia del paciente, lo que sugiere que PAD4 podría ser un marcador pronóstico útil en el cáncer colorrectal. Hubo una correlación entre la expresión de PAD4 y BCL2 (p=0,01), p-catenina (p=0,001), número de células T CD8 (p=0,006), MUC1 (p=0,000), CEA (p=0,000), CD59 (p=0,038) y vimentina (p=0,000), lo que sugiere que todos estos pueden ser dianas para proteínas modificadas.
En experimentos llevados a cabo por los inventores, el 89 % de los tumores de ovario se tiñeron fuertemente para vimentina y solo el 4 % no se tiñó con un anticuerpo anti-PAD4. Además, el 82 % también expresó citrulina, lo que sugiere que la enzima estaba activa. La expresión de PAD4 se correlacionó con las proteínas relacionadas con el estrés RAET1E y ULBP1, lo que sugiere la activación de esta enzima cuando las células están estresadas. También hubo una fuerte correlación con la vimentina, lo que sugiere que la vimentina citrulinada es una buena diana en el cáncer de ovario. La HMGB1 se expresó en el 87 % de los tumores y también se correlacionó con la expresión de vimentina.
En la presente memoria es divulgado un procedimiento para predecir la supervivencia en cáncer de ovario, que comprende determinar el nivel de peptidilarginina deiminasa 2 (PAD2) y/o la proteína B1 del grupo de alta movilidad (HMGB1) en una célula de cáncer de ovario. El 91 % de los tumores expresan PAD2. Las células tumorales que pierden la expresión de PAD2 indican un mal pronóstico y sugieren una supervivencia reducida. Por tanto, si un cáncer de ovario muestra poca o ninguna expresión de PAD2, la paciente tiene un mal pronóstico. Sin desear estar ligado a la teoría, esto puede relacionarse con la falta de epítopos citrulinados que puedan ser reconocidos y destruidos por las células T. Por tanto, el tumor evade la vigilancia inmunitaria. En contraste, si el tumor expresa PAD2, las dianas se eliminan, el crecimiento del tumor está controlado por la respuesta inmunitaria y el paciente tiene un mejor pronóstico.
En experimentos llevados a cabo por los inventores, el 16 % de los tumores de ovario se tiñeron fuertemente para PAD2. Además, el 91 % también expresa citrulina. La expresión de PAD2 se correlacionó con la expresión de HMGB1, lo que sugiere una asociación con la autofagia y con la expresión de MHC, lo que sugiere un vínculo con las respuestas inmunitarias.
El 87 % de los tumores expresan HMGB1. Las células tumorales que pierden la expresión de HMGB1 indican un mejor pronóstico y sugieren una mayor supervivencia. Los tumores con altos niveles de HMGB1 tenían una fuerte autofagia, que es un poderoso mecanismo de supervivencia y se correlaciona con un mal pronóstico. Por lo tanto, si un cáncer de ovario muestra poca o ninguna expresión de HMGB1, entonces la paciente tiene un buen pronóstico, niveles bajos un mejor pronóstico y una alta expresión un mal pronóstico.
El nivel de HMGB1 puede determinarse mediante el uso de un anticuerpo u otro inmunoensayo para medir la cantidad de proteína HMGB1 en la célula. Alternativamente, el nivel de ARNm de HMGB1 puede medirse mediante hibridación in situ. Los expertos en la técnica conocen técnicas alternativas adecuadas para determinar el nivel de ARNm, así como técnicas alternativas para determinar el nivel de una proteína.
El 87 % de los tumores de ovario expresaron HMGB1, encontrándose principalmente en núcleos y citoplasma. El análisis de supervivencia de Kaplan Meier mostró que había una correlación con los niveles de HMBG1 y la supervivencia (p=0,001). En un modelo multivariado, el estadio TNM (p=<0,0001), el tipo de tumor (p=0,031) la respuesta a la quimioterapia (p=<0,001) y la pérdida de HMGB1 (p=0,002) fueron predictores independientes de la supervivencia de la paciente, lo que sugiere que el HMGB1 podría ser un marcador pronóstico útil en el cáncer de ovario.
En los pacientes que mostraron alta expresión de HMGB1 y baja PAD2, 219 de 310 pacientes (70 %) tuvieron la peor mediana de supervivencia de 50 meses, y los pacientes con baja HMGB1 y baja PAD2 mostraron la mejor supervivencia, con 41 de 310 pacientes (13 %) con una mediana de supervivencia de 101 meses. Sin desear ceñirse a la teoría, esto puede relacionarse con la falta de epítopos citrulinados y la falta de autofagia, el tumor evade la monitorización inmunitaria y tiene una capacidad de supervivencia deficiente.
En los mamíferos, se han identificado cinco isotipos de PAD, cada uno codificado por un gen distinto [60]. Todas estas enzimas dependen en gran medida de la presencia de Ca2+ para la actividad. Todos los isotipos de PAD muestran amplias homologías de secuencia mutua. La diferencia más notable entre los isotipos es su expresión específica de tejido. Todos los isotipos pueden modificar con citrulina a la mayoría de las proteínas con argininas accesibles in vitro [62], aunque ciertas proteínas se modifican con citrulina más rápidamente que otras por los PAD individuales [63]. Los estudios de péptidos indican que ciertos aminoácidos que flanquean los residuos de arginina influyen en su susceptibilidad a la citrulinación [20].
Todas estas enzimas dependen en gran medida de la presencia de Ca2+ para la actividad. Todos los isotipos de PAD muestran amplias homologías de secuencia mutua. La diferencia más notable entre los isotipos es su expresión específica de tejido. Todos los isotipos pueden modificar con citrulina a la mayoría de las proteínas con argininas accesibles in vitro [62], aunque ciertas proteínas se modifican con citrulina más rápidamente que otras por los PAD individuales [63]. Los estudios de péptidos indican que ciertos aminoácidos que flanquean los residuos de arginina influyen en su susceptibilidad a la citrulinación [20].
El isotipo de PAD más ampliamente expresado, el PAD2, está presente en muchos tejidos diferentes, como músculo esquelético, cerebro, bazo, glándulas secretoras y macrófagos. A pesar de este patrón de expresión amplio, solo la proteína de unión a mielina (MBP) en el sistema nervioso central, donde la citrulinación fisiológica es importante para asegurar el aislamiento eléctrico de las vainas de mielina, y la vimentina se han identificado como sustratos naturales. En la esclerosis múltiple (EM), un trastorno inflamatorio crónico del SNC, la vaina de mielina se destruye y los pacientes generan respuestas autoinmunitarias a la MBP citrulinada. En adultos sanos, el 18 % de la MBP está citrulinada, mientras que en la EM más del 45 % está citrulinada, lo que conduce a un mayor despliegue y degradación.
La PAD1 se expresa principalmente en la epidermis y el útero y, durante la diferenciación terminal de los queratinocitos, las queratinas (K1 y K10) y la proteína filagrina asociada a la queratina se modifican con citrulina. En general, la citrulinación disminuye la carga de las proteínas, lo que conduce al despliegue auricular, la reducción de la flexibilidad y la cornificación de la epidermis. La psorasis es causada por la citrulinación aberrante en la epidermis psoriática por PAD1. La PAD3 está restringida a los folículos de pelo/lana donde su sustrato natural es la tricohialina, que es una proteína estructural principal de las células de la vaina de la raíz interna de los folículos pilosos. La PAD6 se expresa en los óvulos y el embrión.
Los leucocitos inflamatorios, que incluye las células sinoviales T y B, los macrófagos, los neutrófilos, así como los sinoviocitos similares a los fibroblastos, expresan dos isoformas de PAD, 2 y 4 [27, 64]. A diferencia de otras PAD, que se localizan principalmente en el citoplasma de las células, la PAD4 se localiza en el núcleo. La señal de localización nuclear de PAD4 se encontró en la región N-terminal de la proteína. La PAD4 se expresa principalmente en granulocitos y monocitos de sangre periférica. La PAD4 también se expresa en muchos tejidos tumorales, que incluye los adenocarcinomas [65]. La inmunohistoquímica también detectó la colocalización de PAD4 con citoqueratina y la transferencia Western detectó señales de citrulina en citoqueratina extraída de tumores. Además, la citoqueratina 8, citoqueratina 18, citoqueratina 19 después de la citrulinación in vitro resistieron la digestión por las caspasas. Esto podría conferir una ventaja de crecimiento a los tumores. La proteína que contiene citrulina no fue detectable en leucocitos periféricos incluso a través de estas células que exhibieron una fuerte expresión de PAD4. Se ha sugerido que la concentración de calcio es un factor clave en la activación de PAD4 y la consiguiente citrulinación. Además, la citrulinación de la sinovial de la artritis reumatoide (AR) se produjo principalmente en sus depósitos extracelulares, mientras que la proteína citrulinada se ha localizado dentro de las células tumorales. La citrulinación de histonas puede alterar la expresión génica dentro de los tumores y la citrulinación de ING4 inhibe su asociación con p53, lo que lleva a la inactivación de este potente gen supresor de tumores [66].
La invención también incluye dentro de su ámbito ácidos nucleicos para su uso que codifican polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos establecida anteriormente y/o en la Tabla 3, 8, 9 o 10 y secuencias que tienen una identidad sustancial con los mismos, por ejemplo, un 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % de identidad con los mismos. El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos se determina generalmente al alinear las secuencias con fines de comparación óptimos (por ejemplo, pueden introducirse espacios en la primera secuencia para una mejor alineación con la segunda secuencia) y comparar los residuos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones correspondientes. La "mejor alineación" es una alineación de dos secuencias que resulta en el mayor porcentaje de identidad. El porcentaje de identidad se determina al comparar el número de nucleótidos o residuos de aminoácidos idénticos dentro de las secuencias (es decir, % identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100).
La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse mediante el uso de un algoritmo matemático conocido por los expertos en la técnica. Un ejemplo de un algoritmo matemático para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul modificado como en [67]. Los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, y otros han incorporado dicho algoritmo [68]. Las búsquedas de nucleótidos en BLAST pueden realizarse con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener las secuencias de nucleótidos homólogas a unas moléculas de ácido nucleico de la invención. Las búsquedas de proteínas en BLAST pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener las secuencias de aminoácidos homólogas a una molécula proteica que se divulga en la presente memoria. Para obtener las alineaciones con interrupciones para propósitos de comparación, puede usarse Gapped BLAST como se divulga en [69]. Alternativamente, puede usarse PSI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecte las relaciones de distancia entre las moléculas. Cuando se usan los programas BLAST, Gapped BLAST, y PSI-Blast, pueden usarse los parámetros predeterminados de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase, http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo de un algoritmo matemático usado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller [70]. El programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete de programas informáticos de alineación de secuencias del GCG. Otros algoritmos para el análisis de secuencias conocidos en la técnica incluyen ADVANCE y ADAM como es divulgado en [71] y FASTA que es divulgado en [72]. Dentro de FASTA, ktup es una opción de control que establece la sensibilidad y velocidad de la búsqueda.
Como se usa en la presente memoria, el término "tratamiento" incluye cualquier régimen que pueda beneficiar a un animal humano o no humano. El polipéptido o ácido nucleico puede emplearse en combinación con un portador o portadores farmacéuticamente aceptables. Tales portadores pueden incluir, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, liposomas, agua, glicerol, etanol y combinaciones de estos
Los péptidos útiles en la presente memoria pueden sintetizarse mediante el uso de la química Fmoc u otras técnicas estándares conocidas por los expertos en la técnica.
Se prevé que las inyecciones serán la ruta principal para la administración terapéutica de las composiciones de la invención, aunque también puede usarse la administración a través de un catéter u otro tubo quirúrgico. Algunas vías de administración adecuadas incluyen la administración intravenosa, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal e intramuscular. Pueden usarse formulaciones líquidas después de la reconstitución a partir de formulaciones en polvo.
Para la inyección intravenosa o la inyección en el sitio de la afección, el ingrediente activo estará en forma de una solución acuosa aceptable por vía parenteral que está libre de pirógenos y tiene un pH adecuado, es isotónica y mantiene su estabilidad. Aquellos con experiencia relevante en la técnica son capaces de preparar soluciones adecuadas mediante el uso de, por ejemplo, vehículos isotónicos, tales como cloruro de sodio para inyección, inyección de Ringer o inyección de lactato de Ringer. Los conservantes, estabilizadores, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos pueden incluirse, según se requiera.
Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en forma de tableta, cápsula, polvo o líquido. Una tableta puede comprender un portador sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un portador líquido, tal como agua, petrolato, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Pueden incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacárido o glicoles, tales como glicol de etileno, glicol de propileno o glicol de polietileno. Cuando la formulación es un líquido, puede ser, por ejemplo, una solución salina fisiológica que contiene tampón sin fosfato a pH 6,8-7,6, o un polvo liofilizado.
La composición puede administrarse de manera localizada en un sitio tumoral u otro sitio deseado o puede administrarse de una manera en la que se dirija al tumor u otras células.
Las composiciones se administran preferentemente a un individuo en una "cantidad terapéuticamente efectiva", que es suficiente para mostrar beneficio al individuo. La cantidad real administrada y la velocidad y el curso temporal de la administración, dependerán de la naturaleza y gravedad de lo que se trata. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, decisiones sobre la dosificación, periodicidad, etc., está dentro de la responsabilidad de los médicos generales u otros doctores en medicina, y típicamente tiene en cuenta el trastorno que se trata, el estado del paciente individual, el sitio de suministro, el procedimiento de administración y otros factores conocidos por los médicos. Las composiciones de la invención son particularmente relevantes para el tratamiento del cáncer y en la prevención de la recurrencia de tales afecciones después del tratamiento o cirugía inicial. Ejemplos de las técnicas y protocolos que se mencionan anteriormente pueden encontrarse en el Pharmaceutical Sciences de Remington [73]. Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, ya sea simultáneamente o secuencialmente en dependencia de la afección a tratar. Otros tratamientos contra el cáncer incluyen otros anticuerpos monoclonales, otros agentes quimioterapéuticos, otras técnicas de radioterapia u otra inmunoterapia conocida en la técnica. Una aplicación particular de las composiciones de la invención es como complemento de la cirugía, es decir, para ayudar a reducir el riesgo de que el cáncer vuelva a aparecer después de la extirpación de un tumor. Las composiciones de la presente invención pueden generarse total o parcialmente mediante síntesis química. La composición puede prepararse fácilmente de acuerdo con los métodos de síntesis de péptidos líquidos estándares bien establecidos o, preferentemente, en fase sólida, cuyas descripciones generales están ampliamente disponibles (véase, por ejemplo, en Síntesis de péptidos en fase sólida, 2.a edición en [74], en The Practice of Peptide Synthesis [75] y Applied Biosystems 430A Manual de uso, ABI Inc., o pueden prepararse en solución, por el procedimiento de fase líquida o por cualquier combinación de química de fase sólida, fase líquida y solución, por ejemplo, completando primero la porción de péptido respectiva y luego, si se desea y es apropiado, después de la eliminación al estar presentes los grupos, mediante la introducción del residuo X mediante la reacción del ácido carbónico o sulfónico respectivo o un derivado reactivo de este.
Otra forma conveniente de producir una composición divulgada en la presente memoria es expresar el ácido nucleico que la codifica, mediante el uso del ácido nucleico en un sistema de expresión.
Se proporciona en la presente memoria un ácido nucleico aislado que codifica una composición como es divulgado en la presente memoria. Se proporciona un ácido nucleico que codifica una composición como se define anteriormente. El experto en la técnica podrá determinar sustituciones, eliminaciones y/o adiciones a tales ácidos nucleicos que aún proporcionarán tal composición. El ácido nucleico puede ser ADN, ADNc o ARN tal como ARNm obtenido por clonación o producido por síntesis química. Para uso terapéutico, el ácido nucleico se encuentra preferentemente en una forma capaz de expresarse en el sujeto a tratar. El ácido nucleico para su uso de la presente invención puede proporcionarse como un aislado, en forma aislada y/o purificada, o libre o sustancialmente libre de material con el que está asociado naturalmente. Puede estar libre o sustancialmente libre de ácido nucleico que flanquea el gen en el genoma humano, excepto posiblemente una o más secuencias reguladoras para la expresión. El ácido nucleico puede ser total o parcialmente sintético y puede incluir ADN genómico, ADNc o ARN. Cuando el ácido nucleico de acuerdo con la invención incluye ARN, la referencia a las secuencias que se muestran deben interpretarse como referencia al ARN equivalente, con sustitución de T por U.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican un polipéptido pueden prepararse fácilmente por un experto, por ejemplo, mediante el uso de la información y referencias contenidas en la presente memoria y las técnicas conocidas en la técnica (por ejemplo, véase [76, 77]), dadas las secuencias de ácido nucleico y los clones disponibles. Estas técnicas incluyen (i) el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar las muestras de tal ácido nucleico, por ejemplo, a partir de fuentes genómicas, (ii) síntesis química o (iii) preparar secuencias de ADNc. El ADN que codifica el polipéptido puede generarse y usarse de cualquier forma adecuada conocida por los expertos en la técnica, que incluye tomar el ADN codificante, identificar sitios de reconocimiento de enzimas de restricción adecuados a cada lado de la porción a expresar y cortar dicha porción del ADN. A continuación, la porción puede unirse operativamente a un promotor adecuado en un sistema de expresión estándar disponible comercialmente. Otro enfoque recombinante es amplificar la parte relevante del ADN con cebadores de PCR adecuados. Pueden realizarse modificaciones en las secuencias, por ejemplo, mediante el uso de la mutagénesis dirigida al sitio, para conducir a la expresión del péptido modificado o para tener en cuenta las preferencias de codones en las células huésped usadas para expresar el ácido nucleico.
En la presente memoria se divulgan construcciones en la forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o de expresión que comprenden al menos un ácido nucleico como se describió anteriormente. También es divulgada en la presente memoria una célula huésped recombinante que comprende una o más construcciones como anteriormente. Un procedimiento de producción de una composición divulgado en la presente memoria puede comprender la expresión de un ácido nucleico codificante. La expresión puede lograrse convenientemente mediante el cultivo en condiciones adecuadas de células hospederas recombinantes que contienen el ácido nucleico. Después de la producción por expresión, una composición puede aislarse y/o purificarse mediante el uso de cualquier técnica adecuada, que se usa según corresponda.
Los sistemas de clonación y expresión de un polipéptido en una variedad de células huésped diferentes se conocen bien. Las células huésped adecuadas incluyen bacterias, células de mamíferos, levaduras y sistemas de baculovirus. Las líneas celulares de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen las células de ovario de hámster chino, las células HeLa, las células de riñón de hámster bebé, las células de melanoma de ratón NSO y muchas otras. Un huésped bacteriano común, preferido es la E. coli. La expresión de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos en células procariotas tales como la E. coli está bien establecido en la técnica. Para una revisión, véase por ejemplo [78]. La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la técnica como una opción para la producción de un miembro de unión específico, véase para una revisión reciente, por ejemplo [79, 80].
Pueden elegirse o construirse vectores adecuados, que contienen secuencias reguladoras apropiadas, que incluyen secuencias promotoras, secuencias de terminación, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias, según corresponda. Los vectores pueden ser plásmidos, virales, por ejemplo, fagos o fagémidos, según corresponda. Para más detalles véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual [76]. Muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación del ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácido nucleico, mutagénesis, secuenciación, introducción de a Dn en las células y expresión génica y análisis de las proteínas, se describen en detalle en Short Protocols in Molecular Biology [77]. Por tanto, en la presente memoria es divulgada una célula huésped, que puede aislarse, que contiene ácido nucleico como es divulgado en la presente memoria. En la presente memoria es divulgado un procedimiento que comprende la introducción de tal ácido nucleico en una célula huésped. La introducción puede emplear cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir la transfección con fosfato de calcio, DEAE-dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción mediante el uso de retrovirus u otros virus, por ejemplo, vaccinia o, en células de insecto, baculovirus. Para las células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir la transformación con cloruro de calcio, la electroporación y la transfección mediante el uso de bacteriófagos. La introducción puede seguirse por originar o permitir la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, mediante el cultivo de las células huésped en las condiciones para la expresión del gen.
En una realización, el ácido nucleico para su uso de la invención se integra en el genoma (por ejemplo, el cromosoma) de la célula huésped. La integración puede promoverse mediante la inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con las técnicas estándar.
En la presente memoria también se divulga un procedimiento que comprende el uso de una construcción como se indicó anteriormente en un sistema de expresión con el fin de expresar un polipéptido como se describió anteriormente.
Las características preferidas de cada aspecto de la invención son las mismas que para cada uno de los otros aspectos mutatis mutandis. Los documentos de la técnica anterior mencionados en la presente memoria se incorporan en la mayor medida permitida por la ley.
Ejemplos
La presente invención se describirá adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos y a los dibujos adjuntos.
Figura 1: La conversión enzimática de arginina en citrulina dentro de las proteínas es catalizada por PAD.
Figura 2: Secuencia de aminoácidos de la vimentina humana.
Figura 3: Cambios fenotípicos relevantes que definen la transición epitelial a mesenquimal (EMT) y su procedimiento inverso, la transición mesenquimal a epitelial (MET). Figura tomada de [81].
Figura 4: Subpoblaciones de células T CD4+. Las principales poblaciones de células T CD4+ son Th1, Th2 y Th17, así como iTreg. Las Treg controlan las respuestas de las células efectoras inmunitarias. Figura tomada de Kaufmann [61].
Figura 5. Las respuestas de las células T CD4 a los epítopos colaboradores codificados dentro del ADN del anticuerpo. Se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR4 o HLA-DR1 con una construcción de ADN del anticuerpo que contenía los epítopos colaboradores en CDRL1 o CDRH3 mediante una pistola de genes. Todos los ratones se inmunizaron tres veces los días 0, 7 y 14. Las respuestas específicas para el epítopo colaborador se analizaron ex vivo el día 20 mediante el ensayo Elispot de IFNy contra el péptido colaborador relevante y un control irrelevante. Las respuestas se miden como manchas/millón de esplenocitos.
Figura 6. El epítopo colaborador 28-49 de la vimentina insertado en el sitio CDRH3 del vector de doble expresión de ADN del anticuerpo huIgG1 se procesa, se modifica con citrulina y se presenta in vivo.
Se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR4 con la construcción de ADN del anticuerpo mediante pistola de genes una vez a la semana durante 3 semanas consecutivas. El día 19, los esplenocitos se analizaron in vitro contra los péptidos 28-49 citrulinados y de tipo salvaje de la vimentina humana a una concentración de 5 pM mediante elispot de (i) IFN gamma (ii) lL-17 e (iii) IL-2.
Figura 7. El epítopo colaborador 415-433 de la vimentina insertado en el sitio CDRH3 del vector de doble expresión de ADN del anticuerpo huIgG1 se procesa, se modifica con citrulina y se presenta in vivo.
Se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR4 con la construcción de a Dn del anticuerpo mediante pistola de genes una vez a la semana durante 3 semanas consecutivas. El día 19, los esplenocitos se analizaron in vitro contra los péptidos 415-433 citrulinados y de tipo salvaje de la vimentina humana a una concentración de 5 pM mediante elispot de (i) IFN gamma (ii) IL-17 e (iii) IL-2.
Figura 8. Respuestas CD4 en los ratones DR1 provocadas por inmunización con una construcción de ADN de anticuerpo que codifica el epítopo colaborador MMP-7.
Se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR1 con una construcción huIgG1 de ADN de anticuerpo que contenía el epítopo colaborador MMP-7247 en el CDRL1 mediante una pistola de genes. Todos los ratones se inmunizaron tres veces los días 0, 7 y 14. Las respuestas específicas para el epítopo colaborador se analizaron ex vivo en el día 20 contra ambos los péptidos MMP7 humana 247 de tipo salvaje y citrulinados mediante ensayos elispot de (i) IFNy (n = 14) (ii) lL-17 (n = 14). Las respuestas se miden como manchas/millón de esplenocitos.
Figura 9. El epítopo CD4 de NYESO1 119-143 codificado dentro de un ADN de anticuerpo estimula las respuestas CD4 que se acompañan de una respuesta antitumoral.
Se inyectaron los ratones transgénicos HHDII/DR1 el día 0 con 2,5 x 104 células B16 HHDII NYESO-1. Los ratones se inmunizaron los días 3, 10 y 17 con ADN de anticuerpo, ADN de huIgG1 que contenía el epítopo colaborador NYESO-1 119-143 en el sitio CDRL1 mediante una pistola de genes. (i) Las respuestas específicas para el epítopo colaborador se analizaron ex vivo en el día 20 mediante el ensayo Elispot de IFNy contra los péptidos colaboradores NYESO-1 119-143 citrulinados de tipo salvaje y un control irrelevante. Las respuestas se miden como manchas/millón de esplenocitos. (ii) La supervivencia de los animales inmunizados con ADN del anticuerpo NYESO-1 solo o con adyuvante homspera o con homspera solo.
Figura 10. Los epítopos 28-49 y 415-433 de la vimentina se procesan, se modifican con citrulina y se presentan in vivo a partir de una construcción de ADN de antígeno completo.
Se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR4 con una construcción de ADN que codifica la vimentina murina mediante pistola de genes o con los péptidos citrulinados Vim 28-49 y 415-433 en CpG/MPLA por vía s.c. una vez a la semana durante 3 semanas consecutivas. El día 19, los esplenocitos se analizaron in vitro contra los péptidos 28-49 y 415-433 citrulinados y de tipo salvaje de la vimentina a una concentración de 5 pM por ensayo elispot de IFN gamma.
Figura 11. Comparación de las respuestas CD4 en los ratones transgénicos HLA-DR4 obtenidas de la inmunización con los péptidos 28-49 citrulinados y de tipo salvaje de la vimentina humanas.
Se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR4 con 25 pg de los péptidos 28-49 citrulinados o de tipo salvaje de la vimentina humana el día 0. El día 14, los esplenocitos se analizaron in vitro contra (a) los péptidos 28-49 citrulinados y de tipo salvaje de la vimentina humana a una concentración de 5 pM por ensayos elispot de (i) IFNy (ii) IL-17 (iii) iL-2 (iv) iL-10, (b) la avidez de las respuestas específicas al epítopo cit mediante la medición de las respuestas al aumento de la concentración de los péptidos en los ensayos elispot de IFNy e IL-17, (c) los péptidos 28-49 simple, doble y triple citrulinados de la vimentina a una concentración de 5 pM mediante el ensayo elispot de IFNy. Las respuestas se miden como manchas promedio/millón de esplenocitos.
Figura 12. Unión de los péptidos vim 28-49, 415-433, vim 415-433 cit y vim 28-49 cit a1HLA-DR0401 en un ensayo de unión competitiva. Los péptidos se mezclaron con una concentración predeterminada del péptido biotinilado de Influenza (HA306-318) y luego se ensayó para determinar la unión a1HLA-DR0401 purificado. El péptido HA 306-318 sin marcar se usó como control positivo.
Figura 13. Comparación de las respuestas CD4 en los ratones transgénicos HLA-DR4 obtenidas de la inmunización con los péptidos 415 citrulinados y de tipo salvaje de la vimentina humana.
Se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR4 con 25 pg de los péptidos 415 de la vimentina humana el día 0. El día 14, los esplenocitos se analizaron in vitro contra (a) los péptidos 415 citrulinados y de tipo salvaje de la vimentina humana a una concentración de 5 pM mediante ensayos elispot de (i) IFNy (ii) IL-17 (iii) IL-2 (iv) IL-10. (b) La avidez de las respuestas específicas de epítopo mediante la medición de las respuestas al aumento de la concentración de los péptidos en los ensayos elispot de IFNy e IL-17. Las respuestas se miden como manchas promedio/millón de esplenocitos.
Figura 14. Respuestas CD4 en los ratones transgénicos HLA-DR4 obtenidas por la inmunización con el péptido 415 citrulinado de la vimentina humana y la reactividad cruzada con el péptido citrulinado murino equivalente. Se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR4 con 25 pg de péptido 415-433 citrulinado de la vimentina humana el día 0. El día 14, los esplenocitos se analizaron in vitro contra los péptidos 415 citrulinados de la vimentina humana y murina a una concentración de 5 pM mediante ensayos elispot de (i) IFNy (ii) IL-17. Las respuestas se miden como manchas promedio/millón de esplenocitos.
Figura 15. Confirmación que las respuestas de células T provocadas en los ratones transgénicos HLA-DR4 a partir de la inmunización con el péptido 415 citrulinado de la vimentina humana (a) y el péptido 28 citrulinado de la vimentina (b) son respuestas c D4. Se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR4 con 25 pg de péptido 415-433 citrulinado de la vimentina humana el día 0. El día 14, ya sea los esplenocitos totales o los esplenocitos con los CD4 eliminados se analizaron in vitro contra los péptidos 415 o 28 citrulinados de la vimentina humana a una concentración de 5 pM en presencia o ausencia del anticuerpo bloqueante L243 HLA-DR mediante ensayos elispot de IFNy. Las respuestas se miden como manchas promedio/millón de esplenocitos.
Figura 16. Las respuestas CD4 en los ratones transgénicos HLA-DR4 y HLA-A2/DR1 se obtuvieron a partir de la inmunización con el péptido 65 citrulinado de la vimentina.
Se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR4 (a) o HLA-A2/DR1 (b) con 25 pg de péptidos 65 citrulinados de la vimentina el día 0. El día 14, los esplenocitos se analizaron in vitro contra los péptidos 65 citrulinados y de tipo salvaje de la vimentina humana a una concentración de 5 pM mediante ensayos elispot de IFNy, IL-17 o IL-10 c) el día 14, los esplenocitos totales se analizaron in vitro contra los péptidos 65 citrulinados de la vimentina humana a una concentración de 5 pM en presencia o ausencia del anticuerpo bloqueante L243 HLA-DR mediante ensayos elispot de IFNy. Las respuestas se miden como manchas promedio/millón de esplenocitos. d) Marcaje inmunofluorescente y análisis de FACS de los esplenocitos marcados para CD8, IFNy y TNFa. e) El día 14, los esplenocitos se estimularon in vitro con explosiones de LPS pulsadas con el péptido 65 citrulinado de la vimentina humana. Seis días después de la estimulación, las líneas de CTL se evaluaron mediante un ensayo de liberación de cromo para determinar su capacidad para lisar células tumorales T2 o B16HHD pulsadas con el péptido 65 citrulinado de la vimentina humana y las células T2 o B16HHD solas. Las respuestas se miden como % de citotoxicidad. Los valores de p que se indican en el gráfico son para la relación diana/efector 100:1) los esplenocitos de ratones inmunizados se analizaron in vitro contra los péptidos 68 y 65 cortos de unión a1HLA-A2 citrulinados y de tipo salvaje de la vimentina mínimos predichos, así como los péptidos 65 citrulinados y de tipo salvaje de la vimentina humana a una concentración de 5 pM mediante ensayo elispot de IFNy. g) los esplenocitos de ratones inmunizados se ensayaron para determinar las respuestas a los péptidos Vim 65 y Vim 68 cit y de tipo salvaje y las células diana tumorales EL4 HHD y B16 mediante ensayo elispot de IFNg.
Figura 17. Respuestas colaboradoras generadas al péptido 415-433 citrulinado de la vimentina murina en presencia o ausencia de las células reguladoras T naturales.
Se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR4 con 25 pg del péptido 415-433 citrulinado de la vimentina murina el día 0. La eliminación de las células T reguladoras se realizó mediante el uso de un anticuerpo monoclonal anti-CD25 (PC61) tres días antes de la inmunización. El día 14, los esplenocitos se analizaron mediante ensayo elispot de IFNy frente a concentraciones de titulación del péptido 415 citrulinado de la vimentina murina.
Figura 18. Los adyuvantes influyen en el equilibrio Th1/Th17 en respuesta a los epítopos 415 y 28 citrulinados de la vimentina.
Se administraron por vía s.c. los péptidos 415-433 y 28-49 citrulinados de la vimentina humana (25 pg) en el adyuvante alumbre, IFA, GMCSF, MPLA y CpG o TMX201. Catorce días después de la inmunización, se analizaron los esplenocitos en busca de respuestas específicas al epítopo colaborador mediante ensayos elispot de (i) IFNy, (ii) IL-17 e (iii) IL-10 contra los péptidos citrulinados y de tipo salvaje y un control irrelevante. Las respuestas se miden como manchas/millón de esplenocitos.
Figura 19. El mab anti-CTLA-4 aumenta la avidez de la respuesta al péptido 415 citrulinado de la vimentina. Se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR4 con 25 |jg del péptido 415 citrulinado de la vimentina humana los días 0, 7 y 14. La mitad de los ratones también recibieron el mab anti-CTLA-4 los días 7 y 14. El día 21, los esplenocitos se analizaron in vitro contra (i) la vimentina 415 citrulinada a una concentración de 5 jM mediante ensayo elispot de IFNy. (ii) Se midió la avidez de las respuestas específicas al epítopo para aumentar la concentración de péptido en el ensayo elispot de IFNy. Las respuestas se miden como manchas/millón de esplenocitos.
Figura 20. Respuestas proliferativas de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) aisladas de pacientes con cáncer a los péptidos citrulinados y de tipo salvaje.
Las PBMC de los pacientes se estimularon con 1o pg/ml de (i) péptidos 415-433 citrulinados y de tipo salvaje de la vimentina humana (ii) la vimentina 28-49 citrulinada y de tipo salvaje humana (iii) la vimentina 65-77 humana de tipo salvaje y citrulinada de tipo salvaje y péptidos citrulinados (iv) NYESO-1 119-143 cultivados durante 4, 7 y 11 días. La proliferación de linfocitos se evaluó mediante la incorporación de 3[H]-timidina. Las respuestas proliferativas se representan como índice de estimulación (SI). El SI se calculó como la relación entre los promedios de cpm de los cultivos estimulados con el péptido y los promedios de cpm de los cultivos no estimulados.
Figura 21. a) Supervivencia de Kaplan Meier de las pacientes de ovario cuyo tumor expresa PAD2. b) Supervivencia de Kaplan Meier de las pacientes de ovario cuyos tumores expresan HMGB1 c) Supervivencia de Kaplan Meier de las pacientes de ovario cuyos tumores expresan PAD2 y HMGB1 d) Supervivencia de Kaplan Meier de los pacientes colorrectales cuyos tumores expresan PAD4
Figura 22. Se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR4 los días 0, 7 y 14 con el péptido 415-433 citrulinado de la vimentina humana (b) o con el péptido vim 28-48 citrulinado (c) o ambos (a, d & e) en CPG y MPLA. A, el día 14, los esplenocitos se analizaron in vitro contra los péptidos 415 y 28 citrulinados y no citrulinados de la vimentina humana a una concentración de 5 jM y las células diana tumorales B16DR4 inducidas en autofagia por privación de suero en presencia o ausencia de 3-MA o Cl-amidina mediante el ensayo elispot de IFNy. B-E, El sobrenadante del ensayo de elispot de IFNy ex vivo se analizó para determinar la presencia de GranzimaB mediante ELISA.
Figura 23. Muerte de las células tumorales in vitro
(ai) Se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR4 los días 0, 7 y 14 con el péptido 415-433 citrulinado de la vimentina humana en CPG y MPLA. El día 19, los esplenocitos se estimularon in vitro con explosiones pulsadas del péptido 415-433 citrulinado de la vimentina humana. Seis días después de la estimulación, las líneas de CTL se evaluaron mediante un ensayo de liberación de cromo para determinar su capacidad para lisar esplenocitos DR4 pulsados con el péptido 415-433 citrulinado de la vimentina humana, las células tumorales T2 DR4 pulsadas con el péptido 415-433 citrulinado de la vimentina humana y las células T2 DR4 solas. Las respuestas se miden como % de citotoxicidad. Los valores de P indicados en el gráfico son para la relación diana/efector de 10:1. Los valores de P para 20:1 y 40:1 son todos muy significativos P < 0,0001. (aii) Se inmunizaron los ratones transgénicos HHD/DR1 los días 0, 7 y 14 con el péptido 28-49 citrulinado de la vimentina humana en CPG y MPLA. El día 19, los esplenocitos se estimularon in vitro con explosiones pulsadas del péptido 28-49 citrulinado de la vimentina humana. Seis días después de la estimulación, las líneas de CTL se evaluaron mediante un ensayo de liberación de cromo para determinar su capacidad para lisar las células tumorales T2 DR1 pulsadas con el péptido 28-49 citrulinado de la vimentina humana, las células T2 DR1 solas y las células T2 solas. Las respuestas se miden como % de citotoxicidad. Los valores de P indicados en el gráfico son significativos y la relación entre la diana y el efector es de 12,5:1. Los valores de p para 25:1 (T2DR1 P = 0,0017, T2 DR1 vim28 cit P < 0,0001) y 50:1 (T2DR1 P = 0,0008, T2 DR1 vim28 cit P = 0,0005) son todos muy significativos.
Figura 24. Las respuestas CD4 a la Vimentina 415-433 y la vim 28-49 citrulinadas influyen en las respuestas inmunitarias antitumorales.
Se inyectaron los ratones transgénicos HLA-DR4 el día 0 con 2,5 x 104 células B16F1-DR4. (a) Los ratones se inmunizaron mediante pistola de genes en los días 4, 11 y 18 con ADN del anticuerpo de control o la vacuna de ADN del anticuerpo que codifica el epítopo colaborador vim415 restringido a1HLA-DR4 en el CDRH3 o con el péptido 415-433 citrulinado de la vimentina murina (25 jg ) en CpG y adyuvante de MPLA administrado por vía s.c. (i) (b) Los ratones se inmunizaron mediante pistola de genes en los días 4, 11 y 18 con ADN del anticuerpo de control o la vacuna de ADN del anticuerpo que codifica el epítopo colaborador vim28 restringido a1HLA-DR4 en el CDRH3 o con el péptido 28-49 citrulinado o de tipo salvaje de la vimentina (25 jg ) en adyuvante CpG y MPLA administrado por vía s.c. (c) Los ratones se inmunizaron con el péptido 415-433 citrulinado de la vimentina (25 jg ) o el péptido 28-49 citrulinado de la vimentina (25 jg ) o ambos en adyuvante CpG y MPLA administrado por vía s.c. (d) Los ratones se inmunizaron con el péptido 415-433 citrulinado de la vimentina (25 jg ) en adyuvante CpG y MPLA administrado por vía s.c. en combinación con el anticuerpo anti-CD4 (clon GK1.5). (e) Los ratones se inmunizaron con el péptido 28-49 citrulinado de la vimentina (25 |jg) en adyuvante CpG y MPLA administrado por vía s.c. en combinación con el anticuerpo anti-CD4 (clon GK1.5).
Figura 25 Las respuestas inmunitarias antitumorales de la vimentina 415-433 citrulinada y la vimentina 28-49 están mediadas en parte por IFNy e IL-17.
Se inyectaron los ratones transgénicos HLA-DR4 el día 0 con 2,5 x 104 células B16F1-DR4. Los ratones se inmunizaron por vía s.c. con (a y c) el péptido 415-433 citrulinado de la vimentina (25 jg ) o (b y d) el péptido 28­ 49 citrulinado de la vimentina (25 jg ) en adyuvante CpG y MPLA en presencia o ausencia del anticuerpo monoclonal neutralizante de IFNy (a y b) o el anticuerpo neutralizante de IL-17 (c y d).
Figura 26 Las respuestas inmunitarias antitumorales de la vimentina 415-433 citrulinada, pero no de la vimentina 28-49, están mediadas en parte por el reconocimiento directo del HLA-DR0401 en las células tumorales.
Se inyectaron los ratones transgénicos HLA-DR4 el día 0 con 2,5 x 104 de células B16F1 (a) o células B16F1-DR4 (b). Los ratones se inmunizaron por vía s.c. con (a) el péptido 415-433 citrulinado de la vimentina (25 jg ) o el péptido 28-49 de la vimentina (25 jg ) o ambos en adyuvante CpG y MPLA. (b) el péptido 415-433 de la vimentina (25 jg ) en adyuvante CpG y MPLA en presencia o ausencia del anticuerpo monoclonal neutralizante HLA-DR0401.
Figura 27. Homología de la Vimentina entre diferentes especies.
Figura 28. Cribado de la vimentina en busca de nuevos epítopos que estimulen las respuestas de las células T. Los péptidos citrulinados de la vimentina humana se administraron por vía s.c. (3 x 10 jg ) en adyuvante MPLA y CPG. Catorce días después de la inmunización, los esplenocitos se analizaron en busca de respuestas específicas a los epítopos colaboradores mediante ensayos elispot de (i) IFNy e (ii) IL-17 contra el péptido colaborador y un control irrelevante en los ratones a) HLA-A2/DR1 y b) C57/BI. C) el péptido citrulinado vim 14 se administró por vía s.c. en adyuvante MPLA y CpG. Catorce días después de la inmunización, los esplenocitos se analizaron en busca de respuestas específicas al epítopo colaborador mediante elispot de IFNy. Las respuestas se miden como manchas/millón de esplenocitos.
Figura 29. Cribado de la citoqueratina 8 en busca de nuevos epítopos que estimulen las respuestas de las células T.
Los péptidos citrulinados de la citoqueratina humana se administraron por vía s.c. (3 x 10jg) en adyuvante CpG y MPLA. Catorce días después de la inmunización, los esplenocitos se analizaron en busca de respuestas específicas a los epítopos colaboradores mediante ensayos elispot de (i) IFNy e (ii) IL-17 contra el péptido colaborador y un control irrelevante en los ratones a) HLA-A2/DR1 y b) C57/BI. Las respuestas se miden como manchas/millón de esplenocitos.
Figura 30 La vimentina de tipo salvaje estimula las respuestas de las células iTreg que secretan IL-10.
El péptido 415 de la vimentina humana (25 jg ) se administró por vía s.c. en adyuvante MPLA y CpG. Catorce días después de la inmunización, los esplenocitos se analizaron en busca de respuestas específicas a los epítopos colaboradores mediante ensayos elispot de (i) IFNy, (ii) IL-17 e (iii) IL-10 contra el péptido colaborador y un control irrelevante en los ratones HLA-DR4. Las respuestas se miden como manchas/millón de esplenocitos. Figura 31 El ING4 citrulinado estimula las respuestas CD4.
El péptido 158-174 citrulinado de ING4 (25 jg ) se administró por vía s.c. en adyuvante MPLA y de CPG los días 0, 7 y 14. Siete días después de la última inmunización, los esplenocitos se analizaron en busca de respuestas específicas a los epítopos colaboradores mediante ensayos elispot de IFNy contra el péptido colaborador en presencia o ausencia de un anticuerpo monoclonal bloqueante de HLA-DR en los ratones HLA-A2/DR1. Las respuestas se miden como manchas/millón de esplenocitos.
Figura 32: Referencias de Uniprot para las proteínas de las que pueden derivarse epítopos útiles en la presente invención.
Figura 33. El ADN del antígeno completo de la vimentina induce respuestas de células T específicas a la vimentina citrulinada. Los ratones transgénicos HLA-DR4 (a) o los ratones transgénicos HLA-A2/DR1 (b) se inmunizaron con 1 jg de ADN que codifica la secuencia completa de la vimentina murina mediante pistola de genes los días 0, 7 y 14. El día 20 los esplenocitos se analizaron para las respuestas de IFNy a un panel de péptidos citrulinados de la vimentina que abarcan toda la proteína mediante un ensayo de elispot. Las respuestas se miden como manchas/millón de esplenocitos.
Figura 34. Cribado de los péptidos predichos para las respuestas inmunitarias específicas a la citrulina.
Los péptidos citrulinados previstos (25 ug) de BiP, HSP90 e ING4 se administraron por vía s.c. en adyuvante CpG y MPLA en los días 0 o 0, 7 y 14 en los ratones transgénicos HLA-DR4. Los esplenocitos se analizaron en busca de respuestas inmunitarias en el día 14 o 20 mediante el ensayo elispot de IFNg frente a los péptidos citrulinados y no modificados (5 uM) relevantes y un control de fondo. Las respuestas se miden como manchas promedio/millón de esplenocitos.
Procedimientos
2.1. MAb comerciales
La vimentina antihumana de conejo primaria (clon EPR3776), la PAD2 antihumana de conejo (clon pab0197), la citrulina antihumana de conejo (clon ab6464) se adquirieron en Abcam. El PAD-4 antihumano primario de conejo (clon pab 0199) se obtuvo de Covalab y el anticuerpo conjugado anti-HLA-DR PE-Cy7 humano (clon L243) de eBioscience. El anticuerpo anti-CD25 (clon PC61), el anticuerpo anti-IFNy (clon XMG1.2), el anticuerpo anti-IL-17 (clon 17F3) y el anticuerpo anti-CD4 (clon GK1.5) se adquirieron de BioXcell. El anticuerpo anti-CTLA4 se purificó del sobrenadante de cultivo de células de hibridoma HB304 (ATCC, EE.UU.) mediante cromatografía de afinidad de proteína G sefarosa. El anticuerpo anti-HLA-DR (clon L243) se purificó a partir del sobrenadante del cultivo de células de hibridoma HB-55 (ATCC, EE.UU.) mediante cromatografía de afinidad de proteína G en sefarosa. El mAb anti HMGB1 de conejo (clon D3E5) se adquirió de Cell Signaling Technology.
2.2. Líneas celulares
La línea celular híbrida T2 de células T/células B [80] transfectadas de manera estable con la clase funcional II DR4 (DRB1*0401; T2 DR4) o DR1 (DRB1*0101; T2DR1) han sido descritos [82, 83] y fueron amablemente proporcionados por la Dra. Janice Blum y el Profesor Lawrence Stern. Las líneas celulares de melanoma murino B16F1 y B16F10 se obtuvieron de la ATCC. Todas las líneas celulares se cultivaron en medio RPMI 1640 (GIBCO/BRL) suplementado con FCS al 10 %, L-glutamina (2 mM) y tampón de bicarbonato de sodio a menos que se indique de otra forma. Las células de hibridoma HB304 se cultivaron en Hybridoma SFM (Invitrogen, Reino Unido).
Para generar dianas tumorales que presentan epítopos citrulinados para los ensayos in vitro, las células se trataron con ácido cítrico 0,1 M (pH 3,0) que contenía BSA al 1 % a 4 °C durante 2 minutos. Posteriormente, las células se lavaron con medio y se cultivaron en ausencia de suero durante 20 horas a 37 °C. Se añadieron inhibidores de autofagia y PAD, 3-metiladenina (Sigma) y Cl-amidina (Calbiochem), para el cultivo de 20 horas en medio libre de suero a concentraciones finales de 10 mM y 50 pg/ml respectivamente.
2.3. Inmunógenos
2.3.1. Péptidos
Los péptidos > 90 % de pureza se sintetizaron por Peptide Synthetics (Fareham, Reino Unido). Se almacenaron liofilizados en alícuotas de 0,2 mg a -80 °C. El día de su uso se reconstituyeron a la concentración apropiada en dimetilformamida al 10 %.
2.4. Plásmidos
La generación de construcciones de ADN de anticuerpos se ha descrito en detalle en otro lugar [84]. En breve, para generar las construcciones de ADN de anticuerpos, se incorporaron epítopos en regiones determinantes complementarias de las regiones variables pesadas y ligeras de las cadenas de anticuerpos mediante el uso de técnicas de biología molecular estándares. Los epítopos restringidos al HLA-DR4 de las CD4 colaboradoras a partir de los epítopos tirosinasa 448-462 (DYSYLQDSDPDSFQD), el epítopo gp100 44-59 murino y humano (WNRQLYPEWTEVQGSN/WNRQLYPEWTEAQRLD) y el epítopo restringido al I-Ab a partir de la nucleoproteína HepB 128-140 (TPPAYRPPNAPIL) se insertaron en reemplazo del CDRL1 de la cadena kappa. De manera similar, los epítopos restringidos el HLA-DR1 de las CD4 colaboradoras a partir de los epítopos MMP7 247-262 (SQDDIKGQKLYGKRS), SSX2 33-48 (KEEWEKMKASEKIFY), NYESO-1 87-111 (LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ) y 119-143 (PGVLLKEFTVSGNILTIRLTAADHR) se incorporaron dentro del CDRL1 mientras que el epítopo modificado a partir del epítopo triosafosfato isomerizado 23-37 (GELIGILNAAKVPAD) se insertó en reemplazo del CDRL3 de la cadena kappa. Los epítopos restringidos a1HLA-DR4 de CD4 de la vimentina 415-433 (LPNFSSLNLRETNLDSLPL) y al HLA-DR1 28-49 (RSYVTTSTRTYSLGSALRPSTS) se incorporaron ambos en el CDRH3. El DR1 de CD4 NYESO-1 87-111 (LLEFYLAMPFATPMEAELARRSLAQ) también se codificó dentro de la secuencia extendida 83-111 clonada en el sitio CDRH3 del vector de doble expresión de ADN del anticuerpo. También se generaron los vectores inmunocuerpo de la IgG1 humana y la IgG2a murina que contienen los tres epítopos de vimentina. Los epítopos 28­ 49 (RSYVTTSTRTYSLGSALRPSTS), 65-77 (SAVRLRSSVPGVR) restringidos al HLA-DR1, y el 415-433 (LPNFSSLNLRETNLDSLPL) restringido al HLA-DR4 de CD4 de la vimentina humana se incorporaron en los sitios CDRH1, CDRH2 y CDRH3, respectivamente.
El plásmido pVax1Murine de la vimentina de longitud completa se generó mediante la amplificación de la secuencia de longitud completa mediante el uso del molde ADNc a partir del ARNm que se había aislado de la línea celular B16F1. Los cebadores directos e inversos usados se diseñaron para incorporar un sitio HindlII y BamHI respectivamente. Tras la amplificación y confirmación de la secuencia de tipo salvaje, se incorporó la vimentina murina de longitud completa en los sitios HindIII/BamHI del sitio de clonación múltiple dentro del vector de expresión de mamífero pVaxI (Invitrogen).
Para generar el plásmido pVitro 2, se generó el ADNc del HLA-DR401 quimérico a partir del ARNm aislado de los esplenocitos de ratones HLA-DR4 transgénicos. Esto se usó como molde para amplificar las cadenas alfa y beta quiméricas por separado mediante el uso de cebadores directos e inversos que incorporaron sitios fspI/EcoRI y BamHI/SalI respectivamente. Tras la confirmación de la secuencia, se ligó la cadena alfa quimérica de longitud completa que comprende la H2-Ea murina con dominio alfa 1 del HLA-DRA humano en el mcs2 fspI/EcoRI del vector pVITRO2-hygro-mcs (Invivogen). La cadena beta que comprende el H2-Eb murino con el dominio Beta 1 del DRB1*0401 humano después se insertó dentro del mcs1 BamHI/Sall del vector junto con la cadena alfa quimérica.
Para generar el plásmido HHD, se sintetizó el ADNc a partir del ARN total aislado de las células EL4-HHD. Esto se usó como molde para amplificar la HHD mediante el uso de los cebadores directo e inverso y se subclonó dentro del pCR2.1. La cadena HHD, que comprende un líder HLA-A2 humano, la molécula de microglobulina B2 humana unida covalentemente a través de un enlazador de serina glicina a los dominios a 1 y 2 de la molécula de clase 1 del MHC HLA-0201 humano y los dominios a3, transmembrana y citoplasmático de la molécula de H-2Db de clase 1 murina se insertaron después en los sitios EcoRV/HindIII del vector de expresión de mamífero pCDNA3.1 obtenido a partir de invitrogen.
Para construir el plásmido de expresión doble de mamífero que codifica las cadenas de longitud completa Tap2 y NYESO-1 murinas, el NYESO-1 se amplificó a partir de los clones IMAGE 40146393 obtenidos de geneservice con cebadores directos e inversos que incorporaron un sitio BamH1/XhoI respectivamente. Tras la confirmación de la secuencia, el NYESO-1 de longitud completa se ligó en el sitio de clonación múltiple BamHI/Xho1 del vector de doble expresión de ADN del anticuerpo en sustitución de la cadena ligera. El Tap2 murino se amplificó a partir del clon de imagen 6530488 después de la eliminación de un sitio HindIII de la secuencia codificante y la incorporación de este sitio antes del codón de inicio, y se clonó en el vector de expresión pOrigHIB mediante el uso de HindIII/EcoRV. Después el Tap2 murino se transfirió en reemplazo de la cadena pesada mediante el uso de HindIII/AvrII en el vector de expresión doble junto con el NYESO-1 de longitud completa.
Con el fin de eliminar la expresión de microglobulina B2 murina y MHC clase II murina en la línea celular B16F10, se usó el ARN de interferencia. Los oligonucleótidos complementarios que se dirigen a la secuencia 266 de la microglobulina B2 murina y 159 de MHC de clase II murina se hibridaron y se insertaron por separado en el pCDNA6.2 GW miR (Invitrogen). El casete de expresión de pre-miARN que contenía el miARN 266 se cortó mediante el uso de BamHI/Xhol y se ligó en el sitio XhoI/BgIII del pCDNA6.2 GW miR 159 para encadenar los dos miARN y expresarlos en una transcripción primaria dentro del mismo vector.
El ADN plasmídico libre de endotoxinas se generó mediante el uso del kit endofree Qiagen maxiprep (Qiagen, Crawley)
2.5. Transfección
Las células B16F10 se transfectaron sucesivamente mediante el uso del reactivo de transfección de lipofectamina con vectores de expresión que codifican el NY-ESO-1 de longitud completa y el Tap2 murino, e1HHDII y un ARNip para anular la expresión del MHC de clase II murino y la microglobulina p2 murina. Las células transfectadas se seleccionaron mediante crecimiento en presencia de zeocina (300 pg/ml), G418 (500 pg/ml) y blasticidina (4 pg/ml) respectivamente. Las líneas se clonaron mediante dilución limitante y la expresión se confirmó mediante citometría de flujo.
Las células B16F1 se transfectaron mediante el uso del reactivo de transfección lipofectamina (Invitrogen) con 4 pg del plásmido pVitro 2 Chimeric HLA-DR401 que codifica tanto las cadenas alfa como beta quiméricas de longitud completa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las células transfectadas se seleccionaron mediante crecimiento en presencia de higromicina B (200 pg/ml). Las líneas se clonaron mediante dilución limitante y la expresión se confirmó mediante citometría de flujo mediante el uso del anticuerpo conjugado anti-HLA-DR PE-Cy7 humano (clon L243) de eBioscience.
2.6 Estudios de unión de HLADR0401
En breve, los péptidos de interés se mezclaron con una concentración predeterminada del péptido de referencia HA306-318 biotinilado a concentraciones crecientes y añadido al HLA DR0401 unido a placa. Las cantidades de péptido de referencia biotinilado que se unen al HLA DR0401 se cuantificaron mediante el uso de una etapa de enzima ligada a estreptavidina seguida de detección con sustrato cromogénico. La unión máxima se toma como el valor alcanzado por el péptido HA306-318 biotinilado solo. El péptido HA306-318 sin marcar se usó como control positivo sin marcar para competir con la versión biotinilada.
2.7. Inmunizaciones
2.7.1. Protocolo de inmunización
Se usaron ratones C57BL/6 (Charles River, Reino Unido), ratones HLA-DR4 (Taconic, EE. UU.), ratones HHDII (instituto Pasteur, Francia) y ratones HHDII/DR1 (instituto Pasteur, Francia), con edades comprendidas entre 8 y 12 semanas, y cuidados por el personal de la Universidad de Nottingham Trent. Todo el trabajo se realizó bajo una licencia de proyecto de Ministerio del Interior. Los péptidos se disolvieron en dimetilformamida al 10 % a 1 mg/ml y después se emulsionaron (una serie de diluciones) con diferentes adyuvantes: CpG y MPLA 6 pg/ratón de cada uno (Invivogen, Reino Unido), 50 pl/ratón de incompleto de Freund (Sigma, Reino Unido) y GMCSF 10 pg/ratón (Peprotech, Reino Unido). Los péptidos (25 pg/ratón) se inyectaron por vía subcutánea en la base de la cola. El ADN (1 pg/ratón) se recubrió sobre partículas de oro de 1,0 pm (BioRad, Hemel Hempstead, Reino Unido) mediante el uso de las instrucciones del fabricante y se administró por vía intradérmica mediante pistola de genes (BioRad). La Homspera (10 nM/ratón) se inyectó por vía intradérmica (PeptideSynthetics, Reino Unido) con inmunización con pistola de genes. Los ratones se inmunizaron el día 0 para la inmunización con los péptidos o los días 0, 7 y 14 para la inmunización con los péptidos y la pistola de genes. Los bazos se extrajeron para el análisis el día 14 para el péptido y el día 20 para la inmunización con péptido o pistola de genes a menos que se indique de otra forma. Se administraron por vía i.p. 400 pg de anticuerpo anti-CD25 (PC61) en solución salina 3 días antes de la inmunización. Se administraron por vía i.p. 200 pg de anticuerpo anti-CTLA-4 (UC10-4F10-11) en solución salina los días 7 y 14 con inmunización con pistola de genes o con el péptido.
Para los experimentos de exposición a tumores, los ratones se expusieron a 2,5x104 células 1F10 sip2m NYESO/TAP2 HHDDII B16 o a células B16 DR42E7 por vía subcutánea en el flanco derecho 3 días antes de la inmunización primaria y luego se inmunizaron como anteriormente. El anticuerpo anti-IFNy (300 pg/dosis), el anticuerpo anti-IL-17 (200 pg/dosis) y el anticuerpo anti-HLA-DR (300 pg/dosis) se administraron por vía i.p. en solución salina los días 2, 7, 11 y 14 después del implante del tumor. El anticuerpo anti-CD4 (500 pg/dosis) se administró con solución salina por vía i.p. los días 2 y 8 después del implante del tumor. El crecimiento del tumor se controló a intervalos de 3-4 días y los ratones se sacrificaron humanitariamente una vez que el tumor alcanzó >10 mm de diámetro.
2.8. Análisis de la respuesta inmunitaria
2.8.1. Ensayo Elispot ex vivo
Los ensayos Elispot se realizaron mediante el uso de reactivos de captura y detección de IFNy, IL-17 e IL-10 murinos de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Mabtech, Suecia). En breve, los anticuerpos anti-IFNY, IL-17 e IL-10 se recubrieron en los pocillos de la placa Immobilin-P de 96 pocillos. Los péptidos sintéticos (en una variedad de concentraciones) y 5x105 esplenocitos por pocillo se añadieron a los pocillos de la placa por triplicado. Las células diana tumorales se agregaron cuando fue relevante a 5x104/pocillo por triplicado y las placas se incubaron durante 40 horas a 37 °C. Después de la incubación, se detectaron IFNy, IL-2, IL-17 e IL-10 capturados mediante los anticuerpos anti-IFNY, IL-17 e IL-10 biotinilados y se desarrollaron con una fosfatasa alcalina de estreptavidina y un sustrato cromogénico. Las manchas se analizaron y contaron mediante el uso de un lector de placas automático (Cellular Technologies Ltd). La avidez funcional se calculó como la concentración que media al 50 % de la función efectora máxima mediante el uso de un gráfico de la función efectora frente a la concentración de péptido.
2.8.2 Eliminación ex vivo de las células CD8 y CD4 de los cultivos de esplenocitos
Los esplenocitos se sometieron a aislamiento positivo de células CD4 o CD8 mediante el uso de perlas magnéticas recubiertas de anticuerpo (Miltenyi Biotech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para los estudios de bloqueo del MHC de clase II, se añadieron 20 pg/ml de anticuerpo anti-HLA-DR (clon L243) a los ensayos elispot. 2.8.3 Elisa de granzima B
El sobrenadante de los ensayos elispot de IFNy ex vivo en esplenocitos se eliminó después de 40 horas y se evaluó para Granzima B mediante el ensayo Elisa (sistemas de I D) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 2.8.4 Ensayo multiplexado Luminex
Se usó un procedimiento indirecto de tres pasos para el ensayo Luminex multiplexado (Invitrogen) para los anticuerpos IgG contra IL-10, IL-17, IFNy, TNFa, IL-2 e IL-4. Los sueros estándar, de control y desconocidos se diluyeron 1:2 en tampón diluyente de ensayo al 50 % (Invitrogen) y RPMI libre de suero al 50 %. En cada ensayo se incluyeron diluciones estándar en serie. Cada dilución de sueros estándar, de control y desconocidos se mezcló con un conjunto de microesferas Luminex acopladas en placas de filtración de 96 pocillos (Millipore Multiscreen; Millipore Corporation, Bedford, MA) y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. Las microesferas se recogieron mediante filtración al vacío y se lavaron con PBST. El anticuerpo detector biotinilado se añadió a cada pocilio durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Las microesferas se recogieron mediante filtración al vacío y se lavaron con PBST. La R-ficoeritrina conjugada con estreptavidina se añadió a cada pocillo. Después de una incubación de 30 minutos y un paso de lavado, las microesferas se resuspendieron en PBST y se leyeron en un analizador Biorad BioPlex Luminex equipado con una plataforma XY. La adquisición y análisis de datos se realizó con el software Luminex (BioPlex Systems)
2.8.5 Ensayo de proliferación
Se aislaron PBMC de sangre heparinizada recién extraída mediante centrifugación en gradiente de Ficol-Hypaque (Sigma). Las PBMC (1,5 x 106 células/pocillo) se estimularon con los péptidos individuales (concentración final 10 |jg/ml) en RPMI que contenía suero humano autólogo combinado al 5 %, glutamina 2 mM, HEPES 20 mM y penicilina-estreptomicina (1 %) en un volumen final de 2 ml. La estimulación con el derivado proteico purificado, PPD (concentración final 10 jg/ml) sirvió como control positivo de la capacidad proliferativa de las PBMC. Como control negativo, se incubaron las PBMC con medio solo. Las PBMC se cultivaron a 37 °C en una atmósfera de 5 % de CO2 durante 4, 7 y 11 días. Para evaluar la proliferación en estos puntos de tiempo, se tomaron alícuotas de 100 j l por triplicado de cada cultivo en un pocillo de fondo redondo de una placa de 96 pocillos y se añadió H-timidina3 (0,0185 MBq/pocillo) y se incubó a 37 °C durante 8 horas más. Los cultivos se recolectaron en placas unifiltradoras y se determinó la incorporación de la H-timidina3 mediante recuento de centelleo p. Los resultados se evaluaron al calcular el índice de estimulación (SI) como la relación entre la media de recuentos por minuto (cpm) de cultivos estimulados con epítopo y la media de cultivos no estimulados. El ensayo proliferativo se consideró positivo cuando SI > 2,5.
2.8.6 Ensayo de liberación de Cr51
Las células diana se marcaron durante 1 hora con 1,85 MBq de cromato (51Cr) de sodio (Amersham, Essex, Reino Unido) con o sin el péptido 10 jg/ml. Después de la incubación, se lavaron 3 veces en RPMI. Las dianas 5x103/pocillo de placas con fondo en V de 96 pocillos se montaron y se incubaron conjuntamente con diferentes densidades de células efectoras en un volumen final de 200 j l de RPMI, FCS al 10 % (Sigma), tampón HEPES 20 mM, L-glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina y 100 jg/ml de estreptomicina. Después de 20 horas a 37 °C, se retiraron 50 j l de los sobrenadantes de cada pocillo y se transfirieron a un Lumaplate (Packard, Rigaweg, Holanda). Las placas se leyeron en un contador de centelleo de microplacas Topcount (Packard). El porcentaje de lisis específica se calculó mediante el uso de la siguiente fórmula: lisis específica = 100x [(liberación experimentalliberación espontánea)/(liberación máxima-liberación espontánea)]
2.9 Análisis inmunohistoquímico
Las secciones de la matriz de tejidos se desparafinaron primero con xileno, se rehidrataron con alcohol graduado y se sumergieron en metanol que contenía peróxido de hidrógeno al 0,3 % durante 20 minutos para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena. Para recuperar la antigenicidad, las secciones se sumergieron en 500 ml de tampón de citrato de pH 6,0 y se calentaron durante 20 minutos en el 6th sentido de ajuste de un microondas. La unión endógena de avidina/biotina se bloqueó mediante el uso de un kit de bloqueo de avidina/biotina (Vector Labs). Para bloquear la unión no específica del anticuerpo primario, todas las secciones después se trataron con 100 j l de suero de caballo normal (NHS) 1/5 en PBS durante 15 minutos. Las secciones de prueba se incubaron con 100 j l de anticuerpo primario diluido en PBS durante 1 hora a 22 °C o durante la noche a 4 °C. El tejido de control positivo comprendía secciones completas de tejido de cáncer colorrectal teñidas con p2-microglobulina a una dilución de 1/1000 (en PBS; Dako). El anticuerpo primario se omitió del control negativo, que se dejó incubando en NHS. Después de lavar con PBS, todas las secciones se incubaron con 100 j l de inmunoglobulina de cabra antiratón/conejo biotinilada (Dako) diluida 1:100 en NHS, durante 30 minutos. Las secciones se lavaron de nuevo en PBS y se incubaron con 100 j l de complejo estreptavidina-biotina/HRP preformado (Dako) durante 60 minutos a temperatura ambiente (TA). Posteriormente, se logró la visualización de la expresión del epítopo mediante el uso de DAB. Finalmente, las secciones se contramarcaron ligeramente con hematoxilina (Dako), se deshidrataron en alcohol, se aclararon en xileno (GentaMedica, York, Reino Unido) y se montaron con diestireno, plastificante y xileno (DPX; BDH).
Evaluación de la tinción: Para permitir el almacenamiento permanente de los portaobjetos, se obtuvieron imágenes de x20 mediante el uso de un sistema de imágenes de portaobjetos NanoZoomer 2.0 (Hamamatsu, Higashi-ku, Japón). La expresión de los marcadores en el tejido se analizó mediante el uso de las imágenes en el visor de diapositivas virtual de patología digital NanoZoomer (Hamamatsu). El cribado de la expresión del marcador se realizó simultáneamente por dos investigadores con experiencia previa en la puntuación, cegados a la información clínica. Para la puntuación H, se analizaron brevemente los núcleos y se usaron núcleos representativos de núcleos negativos, débiles, moderados y fuertes como guías para la micromatriz de tejido completo (TMA). Además de la intensidad de la tinción, se estimó el porcentaje de células tumorales teñidas positivamente. Después, las dos puntuaciones se combinaron para formar la puntuación H, donde H = porcentaje de células teñidas con intensidad X (rango = 0-300). Con el visor de diapositivas NanoZoomer, se midió el área del tumor y del estroma y se contó el número de células positivas en cada área. Después se calculó un valor de células positivas por mm2
2.9.1. TMA de tumor colorrectal
Los antisueros se seleccionaron para determinar la unión del tumor en un TMA de cáncer gástrico.
Estudio y diseño de pacientes: La población de estudio comprendió una serie de 462 pacientes consecutivos sometidos a resección quirúrgica electiva de un cáncer colorrectal primario esporádico probado histológicamente en el Hospital Universitario de Nottingham, Reino Unido (Tabla 1). Estos pacientes se trataron entre el 1 de enero de 1994 y el 31 de diciembre de 2000; este período de tiempo permitió una evaluación significativa de los marcadores pronósticos estudiados. Todos los pacientes tratados durante este período de tiempo se consideraron elegibles para su inclusión en el estudio. Los tumores se clasificaron como carcinoma mucinoso, cuando más del 50 % del volumen tumoral consistía en mucina.
Tabla 1: Variables clinicopatológicas para la cohorte de pacientes con MAT colorrectal (n = 462)
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Clinicopatología: Solo se excluyeron del estudio los casos en los que el material patológico relevante no estaba disponible. El seguimiento se calculó desde el momento de la resección del tumor original con todos los casos supervivientes censurados para el análisis de datos al 31 de diciembre de 2003, esto produjo una mediana de seguimiento de 37 meses (intervalo 0-116) para todos los pacientes y 75 meses (intervalo 36-116) para los sobrevivientes.
Se usó una base de datos mantenida de forma prospectiva para registrar los datos clinicopatológicos relevantes, con datos proporcionados por la Oficina de Estadísticas Nacionales del Reino Unido; esto estaba disponible en más del 99 % de los casos. La información recopilada se validó de forma independiente mediante la revisión de notas de casos de pacientes fallecidos. La supervivencia específica de la enfermedad se usó como criterio de valoración principal; sin embargo, también se recopilaron datos sobre los otros parámetros clínicos e histopatológicos relevantes que se resumen en la tabla 2.3. La quimioterapia adyuvante que consiste en FOLFOX se reservó para aquellos pacientes con ganglios linfáticos positivos, aunque el tratamiento quirúrgico y adyuvante quedó a criterio del médico supervisor. La revisión ética previa del estudio se realizó por el Comité de Ética e Investigación Local de Nottingham, que otorgó la aprobación para el estudio.
La construcción de los bloques de la matriz incorporó un amplio espectro de tumores colorrectales resecados electivamente y se encontró que era ampliamente representativo de la población de cáncer colorrectal en el Reino Unido. 266 (58 %) pacientes eran hombres y 196 (42 %) mujeres. La mediana de edad en el momento de la cirugía era de 72 años, lo que coincide con una mediana de edad en el momento del diagnóstico de cáncer colorrectal de 70-74 años en el Reino Unido [85]. De los tumores presentados 69 (15 %) fueron tumores, en estadio de metástasis ganglionar (TNM) 1, 174 (38 %) en estadio 2, 155 (34 %) en estadio 3 y 54 (11 %) en estadio 4; hubo 3 casos de enfermedad in situ. Estas cifras son comparables con las cifras nacionales para la distribución del estadio 1-4 en el momento del diagnóstico del 11, 35, 26 y 29 %, respectivamente [85]. La mayoría de los tumores (392, 85 %) eran adenocarcinomas y, con mayor frecuencia, tenían un grado histológico moderado (353, 77 %). Se observó que 128 (28 %) tumores tenían evidencia histológica de invasión vascular extramural, 224 (48 %) no tenían evidencia de invasión vascular y esta información no estaba disponible en 110 (24 %) casos. En el momento de la censura para el análisis de datos, 228 (49 %) pacientes habían muerto a causa de su enfermedad, 64 (14 %) habían fallecido por todas las demás causas y 169 (37 %) estaban vivos. La mediana de supervivencia específica de la enfermedad a cinco años para la cohorte fue de 58 meses, comparable con el promedio nacional de aproximadamente el 45 % de supervivencia a cinco años para el cáncer colorrectal en el Reino Unido [86].
2.9.2. TMA de cáncer de ovario
Los antisueros se seleccionaron para determinar la unión del tumor a una TMA de cáncer de ovario. El TMA de cáncer de ovario representa una cohorte de 362 pacientes con cáncer de ovario primario tratadas en los hospitales de la Universidad de Nottingham entre 2000 y 2007. El estadiaje de los cánceres se realizó mediante el uso de los criterios de la Federación Internacional de Obstetricia y Ginecología (FIGO). Todos los pacientes incluidos en este estudio se trataron de acuerdo con los regímenes de quimioterapia estándar actuales con carboplatino como agente único en 65 pacientes (41,4 %) o quimioterapia combinada a base de platino en 89 pacientes (56,7 %), y 3 pacientes rechazaron la quimioterapia. Los casos resistentes al platino se definieron como pacientes que progresaron con la quimioterapia con platino de primera línea durante el tratamiento o que recayeron dentro de los 6 meses posteriores al tratamiento. Todos los pacientes se sometieron a cirugía; más del 44 % de los casos (n = 69) se consideró una citorreducción subóptima (el tumor restante <1 cm) después de la cirugía inicial. Los pacientes se siguieron mediante exploración física, tomografía computarizada y niveles de CA-125. Los cortes de los tumores de estos pacientes teñidos con hematoxilina y eosina se revisaron por un ginepatólogo que desconocía los datos clínicos y el diagnóstico patológico. Para cada tumor, SD también realizó una revisión de su tipo y diferenciación. Los datos clínicos asociados a cada caso se recopilaron y registraron a partir de las notas de los pacientes o mediante los registros electrónicos del hospital (NotIS). Tal información incluyó: la edad de los pacientes en el momento del diagnóstico, el estadio FIGO, el grado de citorreducción quirúrgica y el tipo, duración y respuesta a la quimioterapia. Se documentaron los detalles del tratamiento adyuvante, la supervivencia específica de la enfermedad (DSS) y la supervivencia general (SG) de todos los pacientes. La supervivencia se calculó desde la fecha de la operación hasta el 30 de mayo de 2008, cuando se censuró a los supervivientes restantes. La mediana de seguimiento fue de 36 meses. La aprobación ética para recoger las muestras y los datos relevantes para el estudio fue otorgada por el Comité de Ética de Investigación Local de Nottinghamshire.
2.9.3. TMA de tejido normal
El TMA de tejido normal contenía 59 núcleos que representan 38 órganos normales. Cada núcleo se categorizó de acuerdo con el origen de la muestra; tejido normal de un paciente sin cáncer, tejido normal de un paciente con cáncer, pero el cáncer involucra un órgano no relacionado, tejido normal adyacente al cáncer. El tipo de tejido y la categoría se detallan en la Tabla 2.
Tabla 2: Detalles de TMA de tejido normal y tipo de tejido
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(continuación)
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Ejemplo 1. Respuestas de CD4 a epítopos propios y extraños en ratones de tipo salvaje
Las respuestas de las células T a los epítopos asociados a tumores son a menudo débiles o inexistentes debido a la tolerancia y la eliminación de las células T dentro del timo. No obstante, examinamos una variedad de epítopos CD4 propios y extraños para determinar su capacidad para estimular respuestas colaboradoras. Como estudios anteriores han demostrado que las construcciones de ADN de anticuerpos dieron las respuestas inmunitarias más fuertes [84], se incorporaron una variedad de epítopos CD4 extraños y epítopos propios en construcciones separadas y se cribaron en ratones de tipo salvaje. La Tabla 3 enumera las secuencias de todos los epítopos y sus homólogos de ratón cuando es apropiado.
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La Figura 5 muestra buenas respuestas CD4 a la mayoría de los epítopos de CD4 extraños, pero no a los epítopos propios. La nucleoproteína 128-140 de la hepatitis B, epítopo colaborador CD4 I-Ab mostró una respuesta por ELISPOT de 50-1.000/millón de esplenocitos (media 382/millón de esplenocitos) en ratones C57BI. El epítopo de testículos de cáncer NYESO-1 y s Sx2 son epítopos extraños en ratones y los epítopos DR1 NYESO-1 (87-111) y SSX2 (34-48) estimularon buenas respuestas en ratones transgénicos HLA-DR1; Ny EsO-1 (87-111) 250-900/millón de esplenocitos (media 567/millón de esplenocitos) y SSX2 (34-48) 500-1.200/millón de esplenocitos (media 765/millón de esplenocitos). Los epítopos de TPI mutados de HLA-DR1 que solo difieren del tipo salvaje en un aminoácido muestran una respuesta de 300-1.300/millón de esplenocitos. El epítopo 44-59 de gp100 HLA-DR4 humano tiene un cambio de aminoácido con respecto al epítopo de ratón homólogo y muestra respuestas de 263-1.521/millón de esplenocitos (mediana 745/millón de esplenocitos). En contraste, el autoepítopo de ratón homólogo no logró estimular una respuesta en los ratones transgénicos HLA-DR4. El epítopo de tirosinasa HLA-DR4 humano tiene 6 cambios de aminoácidos del epítopo de ratón homólogo y muestra respuestas de 405-832/millón de esplenocitos (mediana 555/millón de esplenocitos). El epítopo 247-262 de MMP7 HLA-DR1 tiene 4 cambios de aminoácidos entre ratones y humanos, uno de los cuales se prevé que esté en la región central de reconocimiento de unión de MHC/TCR (Tabla 3). Este epítopo falló en estimular una respuesta por encima del fondo en los ratones transgénicos HLA-DR1. El epítopo 415-433 de vimentina de HLA-DR4 tiene dos diferencias de aminoácidos entre humanos y ratones, pero no se prevé que estén en la región central de reconocimiento de unión MHC/TCR (Tabla 3). No logró estimular una respuesta en los ratones transgénicos HLA-DR4 de tipo salvaje. En contraste, la vimentina 28-49 es homóloga en ratones y seres humanos y es un verdadero autoepítopo que estimula una respuesta de 200-500/millón de esplenocitos (media 390/millón de esplenocitos) en los ratones transgénicos HLA-DR4. Esta respuesta fue intrigante y nos llevó a intentar explicar por qué no hubo eliminación/tolerancia a este epítopo.
Ejemplo 2. La inmunización con ADN resulta en respuestas a vim 28, vim 415, MMP7 y NY-ESO-1 citrulinados.
Se ha demostrado que los pacientes con AR producen respuestas de células T a epítopos de vimentina citrulinados. Como las APC pueden modificar epítopos con citrulina de manera constitutiva, era posible que las construcciones de ADN del anticuerpo estuvieran siendo citrulinadas y esto estuviera estimulando la respuesta. Por tanto, se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR4 con una construcción de anticuerpo-ADN que codifica el epítopo propio-vim 28. Las células T estimuladas de estos ratones se cribaron in vitro para las respuestas de IFNy, iL-17 e IL-2 al péptido vim 28 citrulinado y no citrulinado. La Figura 6 muestra que, aunque los ratones respondieron según lo ensayado por ELISPOT al péptido de tipo salvaje mediante la producción de las tres citocinas (media: IFNy 400, IL-17 120 e IL-2 150/millón de esplenocitos) las respuestas al péptido citrulinado fueron significativamente mayores para IFNy e IL-17 (media: IFNy 1.250/millón de esplenocitos; p = 0,0046, IL-17 250/millón de esplenocitos; p = 0,0392 pero no para IL-2250/millón de esplenocitos. Para ver si se generaron respuestas similares al anticuerpo del epítopo vim 415, se usaron construcciones de ADN para inmunizar los ratones (Figura 7). En contraste con el vim 28-49 y de acuerdo con nuestra observación original, no hubo respuestas a vim 415-433 de tipo salvaje pero las respuestas fuertes al péptido citrulinado y las respuestas a IL-17 fueron tan fuertes como las respuestas de IFNy (media: IFNy 400/millón de esplenocitos; p = 0,0067, IL-17350/millón de esplenocitos; p = 0,002 e iL-2250/millón de esplenocitos; p = 0,0056). Esto confirma que cuando se traduce el ADN del anticuerpo, se citrulina.
En contraste, cuando MMP7247-262 se incorporó a una vacuna de ADN (Figura 8), no se observaron respuestas de IFNy al péptido de tipo salvaje o citrulinado, pero se observaron respuestas de IL-17 significativas a ambos de tipo salvaje (media: 312/millón de esplenocitos; p = 0,0061) y péptidos citrulinados (media: 309/millón de esplenocitos; p = 0,0267).
Cuando se inyectaron los ratones con células tumorales B16 HHDII NYESO-1 y luego se inmunizaron con NYESO-1 119 incorporado en una vacuna de anticuerpo-ADN (figura 9) con o sin el adyuvante homspera, las respuestas de IFNy solo se observaron a los péptidos citrulinados, pero no a los de tipo salvaje y esto fue acompañado por una respuesta antitumoral.
Como las células presentadoras de antígeno pueden modificar epítopos con citrulina de manera constitutiva, fue interesante ver si se podían inducir respuestas específicas de autoepítopo citrulinado mediante el uso de antígeno de longitud completa administrado como una vacuna de ADN. Por tanto, se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR4 con la construcción de ADN que codifica el antígeno de la vimentina murina completo. Las células T estimuladas de estos ratones se cribaron in vitro para las respuestas de IFNy a los péptidos vim 28-49 y 415-433 tanto citrulinados como no citrulinados. La Figura 10 muestra que los ratones inmunizados con la construcción de ADN demuestran respuestas de IFNy a ambos péptidos citrulinados, pero no a las versiones de tipo salvaje. Esto confirma que cuando el ADN se traduce se citrulina.
Estos resultados sugieren que los epítopos de las construcciones de anticuerpo-ADN se están modificando con citrulina y que las células T que reconocen estos péptidos modificados no se han eliminado/anergizado.
Ejemplo de Referencia 1. La inmunización con los péptidos resulta en respuestas a vim 28, vim 415 y vim 65 citrulinados.
Para determinar si esto estaba restringido a las vacunas de ADN o si los péptidos citrulinados también podrían estimular este repertorio, se inmunizaron los ratones con péptidos vim 28-49 citrulinados y de tipo salvaje y vim 415­ 433 citrulinados en combinación con adyuvantes CpG y MPLA. La Figura 11 muestra que el vim 28-49 citrulinado estimuló fuertes respuestas de IFNy (media 600/millón de esplenocitos; p = 0,0037) contra el péptido citrulinado y respuestas más débiles al péptido de tipo salvaje (media 250/millón de esplenocitos; p = 0,0175). El péptido de tipo salvaje estimuló respuestas de IFNy similares a los péptidos no citrulinados (media 700/millón de esplenocitos; p = 0,003) y citrulinados (media 1.100/millón de esplenocitos; p = 0,0182) y respuestas débiles de IL-17 e IL-2. No se observan respuestas significativas de IL-10. La avidez de las respuestas tanto a IFNy como a IL-17 fue de 10'6M. La respuesta en los ratones a vim 28-49 es propia, ya que la secuencia de aminoácidos es idéntica en ratones y seres humanos, lo que sugiere que el repertorio de células T para este epítopo no se ha eliminado. La respuesta a vim 28­ 49 citrulinado es a uno propio modificado, pero los ratones también pueden reconocer el péptido de tipo salvaje. Estudios anteriores han demostrado que el péptido 30-49 citrulinado en las posiciones 36 y 45 puede estimular las respuestas de las células T en los ratones transgénicos HLA-DR4. Notamos que había más arginina en la posición 28, por lo que extendimos este péptido para dar las posiciones 28-49 y citrulinadas 28, 36 y 45 (figura 11c). Los péptidos vim 28-49 triples citrulinados nos dieron una respuesta significativamente más fuerte que el péptido vim28-49 citrulinado en las posiciones 36,45 del péptido (p = 0,02 y p = 0,0007 respectivamente). El vim 28-49 solo citrulinado en la posición 28 dio una respuesta al péptido tricitrulinado y al péptido citrulinado vim45. El péptido citrulinado vim 28 y 36 también respondió al triple. Estos datos demuestran que la posición de la citrulina marca una diferencia en la magnitud de la respuesta inmunitaria generada para esta secuencia y sugiere que la posición 28 es la más importante. Sin embargo, el péptido triple cit induce respuestas con mayor reactividad cruzada con otras versiones citrulinadas. El péptido tricitrulinado vim 28-49 muestra una mejor unión a1HLA-DR0401 en comparación con la versión de tipo salvaje como lo indica una mejor competencia con el péptido de referencia HA306-318 en el ensayo de unión de HLA-DR0401 (Figura 12). La Figura 13 muestra que el vim 415 citrulinado estimuló fuertes respuestas de IFNy (media 1.000/millón de esplenocitos; p = <0,0001) contra el péptido citrulinado y ninguna respuesta al péptido de tipo salvaje. También estimuló fuertes respuestas de IL-17 (media de 530/millón de esplenocitos; p = <0,0001) contra el péptido citrulinado y respuestas débiles al péptido de tipo salvaje (media de 140/millón de esplenocitos; p = 0,04). La avidez de las respuestas tanto a IFNy como a IL-17 fue de 10'6M. Las respuestas de IL-2 al epítopo citrulinado fueron más variables (media 350/millón de esplenocitos; p = 0,046) pero no hubo respuesta al péptido de tipo salvaje. El péptido vim 415-433 de tipo salvaje estimuló una respuesta de IL-2 débil a los péptidos citrulinados. No se observaron respuestas significativas de IL-10. El epítopo vim 415-433 humano se diferencia del epítopo homólogo de ratón en dos aminoácidos que no se prevé que estén en la región central de reconocimiento de unión MHC/TCR. Para probar esta hipótesis, se inmunizaron los ratones con el péptido vim 415 cit humano y luego se cribaron contra el vim 415 cit de ratón. Las células T mostraron respuestas iguales a ambos péptidos (figura 14). Se demostró que las respuestas al vim 415-433 cit y 28-49 cit estaban mediadas por CD4 por la eliminación de las células CD4 antes del ensayo elispot ex vivo o la adición del anticuerpo bloqueante del MHC de clase II en el cultivo elispot (Figura 15). Tanto el vim 28cit como el vim 415 cit se usaron para inmunizar los ratones C57BI y los ratones HHD1/DR1 pero no lograron generar una respuesta en ninguna de estas tinciones, lo que sugiere que los epítopos no se presentan ni en I-Ab ni en HLA-DR0101.
La Figura 16a muestra que el péptido vim 65 citrulinado estimuló las respuestas de IFNy (media 550/millón de esplenocitos; p = 0,0046) en los ratones HLA-DR4 contra el péptido citrulinado y ninguna respuesta al péptido de tipo salvaje. También estimuló las respuestas de IL-17 (media 550/millón de esplenocitos) contra el péptido citrulinado y ninguna respuesta al péptido de tipo salvaje. El péptido vim 65-77 de tipo salvaje estimuló una respuesta débil de IFNy e IL-17 a los péptidos de tipo salvaje y citrulinados. El péptido vim 65-77 también se probó en los ratones HLA-A2/DR1 y mostró respuestas de IFNy de alta frecuencia al péptido citrulinado que demostró cierta reactividad cruzada con el péptido de tipo salvaje (Figura 16b).
También se observaron respuestas de IL-10 de baja frecuencia al péptido citrulinado. El bloqueo del MHC de clase II no elimina la respuesta específica del péptido citrulinado, lo que indica que la respuesta específica al vim 65-77 está restringida por el MHC de clase I (Figura 16c). Esto se confirma adicionalmente mediante la tinción con citocinas intracelulares que demuestra que las células que producen IFNy y TNFa en respuesta a la estimulación con el péptido vim 65-77 citrulinado son CD8 positivas (Figura 16d). La respuesta específica al vim 65-77 cit también demuestra la citotoxicidad de las células diana positivas para HLA-A2 pulsadas con los péptidos (Figura 16e), lo que indica restricción a través del HLA-A2. Los intentos de mapear el epítopo mínimo dentro de la secuencia de vim 65­ 77 restringido al HLA-A2 mediante el uso de dos péptidos de 9 mer con una unión de HLA-A2 predicha alta revelan que la secuencia óptima está en la región de vim 68-76 (Figura 16f). Las respuestas específicas para el péptido 9mer citrulinado no reaccionan de forma cruzada con las versiones de tipo salvaje. El análisis de las respuestas a las células diana tumorales revela un buen reconocimiento de la línea celular EL4 modificada con e1HLA-A2 transgénico (EL4 HHD) a las respuestas inducidas por el péptido Vim 65-77cit ex vivo sobre la de las células B16 no emparejadas con el HLA (Figura 16g).
Ejemplo de Referencia 2. Determinación de si las respuestas CD4 a los epítopos propios son una respuesta virgen, de memoria o Treg
Los ratones produjeron una potente respuesta de IFNy e IL-17 a una única inmunización del vim 415 cit humano, lo que sugiere que estaba potenciando una respuesta de memoria o Treg. Para determinar si se trataba de una respuesta de Treg natural que se estaba convirtiendo en una respuesta de IFNy/IL-17, las Treg naturales de los ratones se eliminaron con el mAb anti-CD25 y se inmunizaron con el vim 415 cit de ratón. La eliminación de las Treg naturales no influyó en la frecuencia o la avidez de la respuesta, lo que sugiere que las Treg naturales no fueron la población que respondió (figura 17). Para determinar si esta respuesta también se indujo con otros adyuvantes, se inmunizaron los ratones con vim 415-433 cit y 28-49 cit en alumbre, adyuvante incompleto de Freund (IFA), GMCSF, MPLA, TMX201, MPLA/TMX201 o CpG/MPLA y cribado para la producción de IFNy, IL-17 o IL-10 (figura 18). Se indujeron respuestas potentes de IFNy/IL-17 a epítopos de vim 415-433 cit y 28-49 cit con adyuvantes CpG/MPLA, GMCSF y TMX201, sin embargo, no se observó respuesta cuando los péptidos se administraron en alumbre o IFA. La inmunización con el péptido en IFA indujo respuestas de IL-10 de alta frecuencia a los péptidos citrulinados.
Los mabs anti-CTLA-4 pueden bloquear la interacción del CTLA-4 con su receptor análogo CD80/86, y evitar así la inhibición de las células T inducida por este ligando. La inmunización de los ratones con el péptido vim 415 cit en presencia de un mab anti-CTLA-4 aumentó significativamente la avidez de la respuesta de las células T de 10'6M a 10-8M (figura 19).
Ejemplo 3. Respuesta de los pacientes con cáncer a los péptidos propios.
Se examinaron nueve pacientes con melanoma para determinar sus respuestas a una serie de péptidos propios (Figura 20). Cinco de ocho pacientes mostraron una respuesta a vim 415 cit en el día 4 (1), día 7 (1) o > día 11 (3). Seis de los once pacientes respondieron al vim 415 sin modificar en > día 10. Solo cuatro de estos pacientes respondieron tanto al péptido modificado como al no modificado. Dos de ocho pacientes mostraron una respuesta a vim 28 el día 11, mientras que cinco pacientes respondieron a vim 28 cit. Los dos pacientes que respondieron al péptido no modificado también reconocieron el péptido modificado. Cuatro de ocho pacientes respondieron a vim 65 y tres de ocho a vim 65 cit. Solo dos de estos pacientes respondieron tanto al péptido modificado como al no modificado. Ocho pacientes también mostraron una respuesta al NYESO-1 119-143 citrulinado; seis de estas respuestas alcanzaron su punto máximo en el día 4-7, lo que sugiere una respuesta fuerte o de memoria. Ocho pacientes mostraron una respuesta a NYESO-1 119-143 sin modificar. Estos pacientes tenían una variedad de tipos de HLA (tabla 4). Solo uno fue HLA-DR4, lo que sugiere que otros haplotipos de HLA pueden responder a estos péptidos.
Tabla 4. Haplotipos de pacientes con cáncer
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Ejemplo 4. Expresión de las enzimas PAD, vimentina y citrulina.
La citrulinación se lleva a cabo mediante las enzimas PAD y, en particular, las enzimas PAD2 y PAD4. Estos requieren altos niveles de calcio y generalmente se activan en las células muertas o moribundas. Por tanto, parecía poco probable que las células tumorales sanas expresaran proteínas citrulinadas. Por lo tanto, se tiñeron tumores colorrectales y ováricos y tejidos normales para detectar la vimentina, la citrulinación y la expresión de las enzimas PAD2 y PAD4.
Tejidos normales
La expresión de vimentina, PAD2, PAD4 y citrulina se muestra para tejidos normales en la Tabla 5.
Las células mesenquimales, como las células del tejido conjuntivo, las células sanguíneas y las neuronales, expresan vimentina como una proteína citoesquelética. La mayoría de las células del bazo, tiroides, testículos, cuello uterino, ovario, amígdalas, útero, pulmón, timo y mama se tiñeron intensamente para la vimentina. Se observó una tinción débil de menos del 50 % de las células en placenta, recto, colon, páncreas y duodeno, músculo esquelético y liso, vesícula biliar, esófago, riñón, hígado, vejiga, íleon, yeyuno, estómago. No se observó tinción en piel, tejido adiposo, músculo esquelético, recto, cerebro, cerebelo, diafragma o corazón.
La mayoría de las células hepáticas se tiñeron fuertemente con el mAb anti-PAD2. La mayoría de las células del músculo liso y del cerebro se tiñeron débilmente. Más de la mitad de las células del cerebelo, el páncreas y los testículos se tiñeron intensamente con PAD2. Menos del 50 % de las células dentro de la vesícula biliar, íleon, yeyuno, estómago y colon se tiñeron fuertemente para PAD2. Mientras que las células del esófago, recto, músculo esquelético, vejiga, mama, riñón, placenta, corazón, diafragma, duodeno, tiroides y pulmón tiñeron débilmente menos del 50% de sus células. La piel, el tejido adiposo, el bazo, las amígdalas, el timo, los ovarios y el útero fueron negativos.
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La mayoría de las células del hígado y del cerebelo se tiñeron fuertemente con el mab anti-PAD4. La mayoría de las células del cerebro y el corazón se tiñeron débilmente. Menos del 50 % de las células dentro del colon y el estómago se tiñeron fuertemente para PAD4 mientras que menos del 50 % de las células dentro del íleon, diafragma, duodeno, tiroides, testículos, mama, vesícula biliar, esófago se tiñeron débilmente. La piel, el músculo esquelético y liso, la vejiga, el bazo, yeyuno, riñón, hígado, cuello uterino, pulmón, ovario, las amígdalas, el páncreas, útero, recto, tejido adiposo, timo y útero fueron negativos.
El cerebelo y el hígado se tiñeron fuertemente con el mab anti-citrulina. La mayoría de las células de la piel, el corazón, riñón, pulmón, páncreas y cerebro se tiñeron débilmente. Más del 50 % del duodeno se tiñó intensamente y más del 50 % de las células mamarias y testiculares se tiñeron débilmente. Menos del 50 % de las células del timo, el colon y el yeyuno se tiñeron débilmente. Menos del 25 % de las células dentro del timo se tiñeron fuertemente y más del 25 % dentro del esófago, el recto, la vesícula biliar, el músculo esquelético, la vejiga, el íleon, timo, las amígdalas, el diafragma y el útero se tiñeron débilmente. El bazo, la piel, el estómago, ovario, las amígdalas, el tejido adiposo, la placenta y el cuello uterino fueron negativos para la citrulina.
Tumores de ovario
Los tumores de ovario son de origen mesenquimatoso y, por tanto, se esperaría que expresaran vimentina. La PAD4 se expresa débilmente por el ovario normal. Se tiñeron 219 tumores de ovario con un mAb específico de vimentina. Solo 9/219 (4 %) de los tumores no se tiñeron, 16/219 (7 %) más se tiñeron débilmente, mientras que 194/219 (89 %) se tiñeron fuertemente. El análisis de supervivencia de Kaplan Meier mostró que no había correlación con la expresión de vimentina y la supervivencia. Hubo una correlación débil entre la expresión de vimentina y la proteína relacionada con el estrés ULBP1 (p = 0,017), PAD4 (p = 0,018) y CEA-CAM4 (p = 0,033).
Se tiñeron 219 tumores de ovario con un mAb específico de PAD4 (figura 23). Solo 9/219 (4 %) de los tumores no se tiñeron, 126/219 (58 %) más se tiñeron débilmente mientras que 84/219 (38 %) se tiñeron fuertemente. El análisis de supervivencia de Kaplan Meier mostró que no había correlación con la expresión de PAD4 y la supervivencia. Hubo una correlación débil entre la expresión de PAD4 y las proteínas relacionadas con el estrés RAET1E (p = 0,036) y ULBP1 (p = 0,016) y una fuerte correlación con la expresión de vimentina (p = 0,001) y Lewisy (p = 0,006).
Aunque los tumores expresan PAD4, solo debería activarse en células moribundas. Para evaluar si esto es cierto, los tumores de ovario se tiñeron con un mAb específico del péptido anticitrulina. Solo 7/228 (3 %) de los tumores no se tiñeron, otros 34/228 (15 %) se tiñeron débilmente mientras que 187/228 (82 %) se tiñeron fuertemente. Sin embargo, no todas las células de un tumor se tiñeron. En 69/228 (30 %) menos del 25 % de las células se tiñeron. En 83/228 (36 %) se tiñeron entre el 25-50 % de las células y, como anteriormente, estas eran principalmente de origen estromal. En 53/228 (23 %), el 50-75 % de las células teñidas, que incluye algunas células epiteliales, y en 16/228 (7 %) de los tumores, más del 75 % de las células teñidas. El análisis de supervivencia de Kaplan Meier mostró que no había correlación con la expresión de citrulina y la supervivencia. Hubo una correlación entre la intensidad de expresión de citrulina y CEA-CAM5 (p = 0,037), Bc L2 (p = 0,011) y Lewisy (p = 0,053). Hubo una correlación entre el porcentaje de células que expresan citrulina y el grado (p = 0,034), BCL2 (p = 0,035), CD59 (p = 0,049) y ULBP1 (p = 0,044).
Se tiñeron 360 tumores de ovario para la PAD2. El 9 % no pudo evaluarse debido a la ausencia de suficiente centro de tejido o la ausencia de células tumorales evaluables (es decir, todo el estroma) en el centro. De los 329 tumores de ovario evaluables teñidos con un mAb específico de PAD2, todos los tumores expresaron PAD2. Otros 277/329 (84 %) se tiñeron débilmente, 52/329 (16 %) se tiñeron fuertemente. El análisis de Kaplan Meier (Figura 21a) mostró que había una correlación con la expresión de PAD2 y la supervivencia con una alta expresión de PAD2 que era protectora (p = 0,033). Hubo una correlación entre la expresión de PAD2 con la expresión de MHC (p = 0,038) y la expresión de HMGB1 (P = 0,008). Después del análisis multivariado, PAD2 siguió siendo un factor pronóstico independiente (p = 0,002).
Se tiñeron 360 tumores de ovario para HMGB1. El 10 % no pudo evaluarse debido a la ausencia de suficiente centro de tejido o de células tumorales evaluables (es decir, todo el estroma) en el centro. De los 316 tumores de ovario evaluables teñidos con un mAb específico de HMGB-1, sólo 23/360 (7 %) tumores no se tiñeron. Otros 42/316 (13 %) se tiñeron débilmente, 52/329 (87 %) se tiñeron fuertemente. El análisis de Kaplan Meier (Figura 21b) mostró que había una correlación de la expresión de HMGB1 y la supervivencia con una baja expresión de HMGB1 que era protectora (p = 0,002). Hubo una correlación débil entre la expresión de HMGB1 y vimentina (p = 0,034). Después del análisis multivariado, el HMGB1 siguió siendo un factor pronóstico independiente (p = 0,02). El estadio del tumor, el tipo de tumor y la respuesta a la quimioterapia también se correlacionan con la supervivencia del paciente. En un modelo multivariado, el estadio TNM (p = <0,0001), el tipo de tumor (p = <0,031), la respuesta a la quimioterapia (p = <0,0001) y la expresión de HMGB1 (p = 0,002) fueron predictores independientes de la supervivencia del paciente.
Cuando se comparó la expresión alta y baja de PAD2 de las células tumorales con la expresión de HMGB1 alta y baja (Figura 21c), en pacientes que mostraron una expresión alta de HMGB1 y baja de PAD2, 219 de 310 pacientes (70 %) tuvieron la peor mediana de supervivencia de 50 meses, y los pacientes con HMGB1 bajo y PAD2 bajo mostraron la mejor supervivencia, con 41 de 310 pacientes (13 %) con una mediana de tiempo de supervivencia de 101 meses.
Tumores colorrectales
Los tumores colorrectales son de origen epitelial y no se espera que expresen vimentina a menos que estén experimentando una transición epitelial a mesenquimatosa. Se observó la expresión de PAD2 y PAD4 en el colon normal.
Se tiñeron 282 tumores colorrectales con un mAb específico de vimentina. Solo 25/282 (9 %) de los tumores no se tiñeron, 4/282 (1 %) más se tiñeron débilmente mientras que 253/282 (90 %) se tiñeron fuertemente. Sin embargo, no todas las células de un tumor se tiñeron. De 114/282 (40 %) menos del 25 % de las células teñidas y todas eran células del estroma. De 68/282 (24 %) entre el 25-50 % de las células teñidas y nuevamente estas eran principalmente de origen estromal. De 42/282 (15 %) el 50-75 % de las células teñidas, que incluyen algunas células epiteliales, y en 33/282 (12 %) de los tumores, más del 75 % de las células se tiñeron. El análisis de supervivencia de Kaplan Meier mostró que no había correlación con la intensidad de vimentina o el porcentaje de células teñidas y la supervivencia. Hubo una correlación entre la expresión de vimentina y TRAIL R2 (p=0,003), IL-17 en tumores (p=,021), MUC1 p=0,001), PAD2 (p=0,025) y PAD4 (p=<0,0001).
Se tiñeron 296 tumores colorrectales con un mAb específico de PAD2 (figura 26). Solo el 45/296 (15 %) de los tumores no se tiñeron, otros 60/296 (20 %) se tiñeron débilmente mientras que 191/296 (65 %) se tiñeron fuertemente. Sin embargo, no todas las células de un tumor se tiñeron. De 99/296 (33 %) menos del 25 % de las células se tiñeron. De 82/296 (28 %) entre el 25-50 % de las células se tiñeron y nuevamente estas eran principalmente de origen estromal. De 55/296 (19 %) el 50-75 % de las células se tiñeron y en 15/296 (5 %) de los tumores más del 75 % de las células se tiñeron. El análisis de supervivencia de Kaplan Meier mostró que no había correlación con la intensidad de PAD2 o el porcentaje de células teñidas y la supervivencia. Hubo una correlación entre la expresión de PAD2 y CD59 (p=0,006) p-catenina (p=0,005), número de células T CD8 (p=0,009), MUC1 (p=0,012), vimentina (p=0,038) y PAD4 (p=0,000).
Se tiñeron 291 tumores colorrectales con un mAb específico de PAD4 (figura 26). Solo 18/291 (6 %) de los tumores no se tiñeron, 158/291 (54 %) más se tiñeron débilmente mientras que 115/291 (40 %) se tiñeron fuertemente. Sin embargo, no todas las células de un tumor se tiñeron. De 65/291 (22 %) menos del 25 % de las células se tiñeron. De 68/291 (23 %) entre el 25-50 % de las células se tiñeron y nuevamente estas eran principalmente de origen estromal. De 98/291 (34 %) el 50-75 % de las células se tiñeron y en 42/291 (14 %) de los tumores más del 75 % de las células se tiñeron. El análisis de supervivencia de Kaplan Meier mostró que había una correlación con la intensidad de PAD4 y la supervivencia (Figura 21d, Tabla 6; p=0,032).
Tabla 6. Medias para el tiempo de supervivencia de los pacientes con cáncer colorrectal que expresan PAD4.
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El estadio del tumor y la invasión vascular también se correlacionan con la supervivencia del paciente. En un modelo multivariado, el estadio TNM (p=<0,0001), la invasión vascular (p=<0,0001) y la expresión de PAD4 (p=0,017) fueron predictores independientes de la supervivencia del paciente.
Hubo una correlación entre la expresión de PAD4 y BCL2 (p=0,01), p-catenina (p=0,001), número de células T CD8 (p=0,006), MUC1 (p=0,000), CEA.CAM5 (p=0,000) ), CD59 (p=0,038) vimentina (p=0,000) y PAD2 (p=0,000).
Aunque los tumores expresan PAD4, solo debe activarse en células moribundas. Para evaluar si esto es cierto, los tumores colorrectales se tiñeron con un mAb anticitrulina específico del péptido. Todos los tumores teñidos 41/316 (13 %) se tiñeron débilmente mientras que 275/316 (87 %) se tiñeron fuertemente. El análisis de supervivencia de Kaplan Meier mostró que había una correlación débil con la expresión de citrulina y la supervivencia (p = 0,078). Hubo una correlación entre la expresión de citrulina y la radioterapia (p>0,001).
Ejemplo 5. Respuestas antitumorales a péptidos citrulinados.
Tanto los ratones como los humanos muestran respuestas a los péptidos propios citrulinados y las vacunas de ADN. Sin embargo, si estos epítopos no se modifican con citrulina en los tumores, las células T no tendrán actividad antitumoral.
Como los tumores humanos expresan vimentina, PAD2/4 y citrulina, se evaluó la respuesta antitumoral de la vimentina citrulinada en un modelo de ratón. Se evaluó la capacidad de los esplenocitos de ratones inmunizados con los péptidos 415-433 y 28-49 citrulinados de la vimentina para responder a las células tumorales B16 in vitro. La Figura 22a muestra la liberación de IFNy específica para las células tumorales B16 que expresan HLA-DR4 (B16DR4) a las que se les indujo la autofagia por inanición de suero en comparación con las células no tratadas o las células no emparejadas con HLA que indican el reconocimiento de las células tumorales (p <0,0001). El reconocimiento de las células B16DR4 inducidas a la autofagia disminuye significativamente cuando se trata en presencia del inhibidor de la autofagia 3-metil adenina (3-MA) (p<0,0001) o el inhibidor de PAD CI amidina (p=0,0012). Por lo tanto, indica que este reconocimiento depende de la autofagia y la citrulinación. Los esplenocitos de ratones inmunizados con los péptidos vim 28-49 o vim 415-433 citrulinados o ambos demuestran la liberación de Granzima B, un marcador de citotoxicidad, tras la estimulación con los péptidos citrulinados Vim 415-433 (p<0,0001) y vim 28-49 (p<0,0001) pero no las versiones de tipo salvaje (Figura 22b-d). La granzima B también se libera tras la respuesta a células diana tumorales B16DR4 privadas de suero, lo que sugiere la citotoxicidad de las diana tumorales que presentan los epítopos citrulinados (p=0,014) (Figura 22e).
Se evaluó la capacidad de los ratones inmunizados con vim 415 cit o vim 28 cit para destruir células tumorales T2 transfectadas con el DR4 humano in vitro. La Figura 23a muestra que ambos péptidos citrulinados pueden inducir células CD4 que destruyen dianas transfectadas tanto si se pulsaron con el péptido apropiado como si no. Como las células T2 expresan vimentina, esto implica que estos péptidos son presentados de forma endógena por las células T2. En contraste, no hubo muerte de esplenocitos normales que también expresan vimentina pero no las enzimas PAD.
A los ratones transgénicos HLA/DR4 se les implantaron tumores B16 transfectados con DR4. Se inmunizaron con el péptido citrulinado vim 415-433 o la vacuna de ADN que codifica la secuencia vim 415-433 y se controló el crecimiento tumoral. Los ratones inmunizados con el péptido vim 415-433 cit o vim 415-433 codificado dentro de una vacuna de ADN estimulan fuertes respuestas antitumorales (figura 24a). En ratones no inmunizados, el tumor creció rápidamente y todos los ratones tuvieron que sacrificarse el día 23. En contraste, el 50 % de los ratones inmunizados con el péptido vim 415 cit no tenían tumor el día 35 y el 30 % se curó de su tumor. La inmunización de los ratones con el péptido citrulinado vim 28-49 o una vacuna de ADN que codifica la secuencia vim 28-49 muestra una supervivencia significativamente mejorada sobre el control no inmunizado o los inmunizados con el péptido vim 28-49 de tipo salvaje (Figura 24b). Los ratones inmunizados con el péptido vim 28-49 de tipo salvaje mostraron una respuesta antitumoral que casi alcanzó significación. La inmunización con los péptidos citrulinados vim 415-433 y 28-49 en combinación muestra una protección tumoral y una supervivencia global incluso mejores en comparación con el control (p<0,0001) (Figura 24c). Estos estudios muestran que los tumores expresan la vimentina citrulinada que es entonces una diana para las células T CD4 citotóxicas asesinas. Para demostrar que estas respuestas antitumorales están mediadas por células T CD4, se trataron los ratones con anticuerpos antiCD4 para eliminar las células CD4 in vivo. La vacunación en combinación con la eliminación de las células T CD4 anula totalmente la respuesta antitumoral mediada por los péptidos Vim 415cit (p=0,0005) y Vim 28cit (p=0,0001 Figura 24d y e).
Ambos péptidos citrulinados vim 415-433 y vim 28-49 inducen respuestas de IFNy de alta frecuencia. El bloqueo de IFNy in vivo anula las respuestas antitumorales específicas de los péptidos citrulinados vim 415-433 y vim 28-49 (Figura 25a y b). Las respuestas específicas de Vim 415-433cit también muestran respuestas de IL-17. El bloqueo de estos in vivo tiene una influencia significativa baja sobre los efectos antitumorales in vivo (Figura 25c). El bloqueo de IL-17 también tuvo una influencia significativa de efecto pequeño sobre la respuesta antitumoral específica de vim 28-49 cit in vivo (Figura 25d).
Para determinar la importancia del reconocimiento directo del tumor por las respuestas específicas de vim 415-433 y vim 28-49 cit, los ratones se expusieron al tumor B16 que carecía de expresión de HLA-DR0401 y posteriormente se inmunizaron con los péptidos citrulinados Vim 415-433 o vim 28-49. Los ratones inmunizados con los péptidos citrulinados vim 28-49 muestran un crecimiento tumoral retrasado y una supervivencia mejorada en comparación con el control (Figura 26a), lo que sugiere que el reconocimiento directo de HLA-DR4 y los péptidos afines en las células tumorales no era necesario para la respuesta antitumoral, pero que la liberación testigo de IFNy en respuesta a las células presentadoras de antígeno que expresan el péptido afín y HLA-DR4 dentro del entorno tumoral fueron responsables de la respuesta antitumoral. En contraste, los ratones inmunizados con vim 415-433 citrulinado no mostraron ninguna respuesta tumoral en este modelo, lo que sugiere que el reconocimiento directo de células tumorales que expresan HLA-DR4 y el péptido afín era esencial para la respuesta antitumoral de este epítopo. Para confirmar que las respuestas específicas de vim 415-433 dependen del reconocimiento directo del tumor, se inmunizaron los ratones expuestos al tumor B16 que expresaba HLA-DR0401 con el péptido citrulinado vim 415-433 en combinación con un anticuerpo de bloqueo anti-HLA-DR. El bloqueo de HLA-DR evita la respuesta antitumoral (Figura 26b).
Ejemplo 6. Homología de la Vimentina entre diferentes especies.
La vimentina se conserva altamente entre pollo, ratón, perro, oveja, vacas, caballos, cerdos y humanos (figura 27). Dado que la vacuna induce respuestas de células T en humanos y ratones y respuestas antitumorales en ratones, puede suponerse que se observarán respuestas similares en otras especies.
Ejemplo de Referencia 3. Respuestas a la vimentina restringidas a través de otros haplotipos HLA.
Los ratones HLA-DR4 produjeron una potente respuesta de IFNy e IL-17 a una única inmunización del péptido vim 415 cit humano. Para determinar si este u otros epítopos citrulinados de la vimentina podrían inducir respuestas inmunitarias en otros haplotipos, se cribó un rango de péptidos de 20 mers (tabla 8) que cubren todo el intervalo de la vimentina e incorporan cada arginina reemplazada con residuos de citrulina para las respuestas de IFNy/IL-17 en los ratones HLA-DR1 y C57/BI (figura 28). Los ratones se inmunizaron con una combinación de 3 péptidos citrulinados vim en combinación con adyuvantes CpG y MPLA y luego se cribaron para las respuestas de IFNy e IL-17 contra cada péptido individual en la combinación. La Figura 28a muestra que los péptidos citrulinados vim 9, 10, 14, 15 y 16 mostraron respuestas de IFNy significativas (200-350 manchas/millón de esplenocitos p<0,02) y el péptido 10 mostró una respuesta de IL-17 (350 manchas/millón de esplenocitos) en los ratones transgénicos HLA-DR1. La Figura 28b muestra que los péptidos citrulinados vim 16, 17, 18, 19 y 20 mostraron respuestas de IFNy significativas (300-500 manchas/millón de esplenocitos p<0,02) y los péptidos 19 y 20 mostraron una respuesta de IL-17 (~400 manchas/millón de esplenocitos, p<0,05) en ratones C57BI/6. La Tabla 7 muestra las secuencias de estos péptidos, la posición de los aminoácidos citrulina y la posición dentro de la proteína vimentina.
La Figura 28c muestra las respuestas en los ratones HLA-A2/DR1 inmunizados con el péptido citrulinado vim 14.
Tabla 7. Respuestas de IFNy/IL-17 de la vimentina citrulinada
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(continuación)
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Ejemplo 7. Cómo cribar epítopos citrulinados de células T
Cualquier proteína citrulinada que se describa en la bibliografía puede ser una diana potencial para las células T. Sin embargo, primero debe tener la capacidad de presentarse en antígenos MHC de clase I y/o clase II y debe reconocerse por un receptor de células T. Las células presentadoras de antígeno se someten de manera constitutiva a autofagia y es dentro de estos autofagosomas de doble membrana donde puede acumularse suficiente Ca2+ intracelular para activar las enzimas PAD, los epítopos de citrulinato que luego se presentan en los antígenos del MHC. Finalmente, para ser una diana antitumoral, las células tumorales también deben inducir la citrulinación dentro de los autofagosomas y presentar el mismo epítopo modificado en los antígenos del MHC. Por lo tanto, para identificar los epítopos citrulinados que aún puedan estimular la inmunidad antitumoral, es necesario cribar las proteínas diana para la inducción de respuestas de células T y para el reconocimiento de tumores.
a) Proliferación in vitro de las células T de sangre periférica humana por los péptidos citrulinados.
La sangre periférica humana puede estimularse in vitro como se divulga en el Ejemplo 5. Los péptidos citrulinados de 20 mers que abarcan toda la proteína pueden seleccionarse para determinar la proliferación de células T. La clasificación de las células T CD4 y CD8 puede identificar los epítopos CD4 y CD8 y la restricción de HLA puede identificarse tipificando el HLA del donante.
b) Estimular las células de los ratones transgénicos convencionales o HLA in vitro o in vivo con los péptidos citrulinados de 20 mer que abarcan la totalidad de una proteína diana
Para determinar si los epítopos citrulinados de la citoqueratina-8 podrían inducir respuestas inmunitarias, se cribó un intervalo de péptidos de 20 mers (tabla 8) que cubren todo el intervalo de citoqueratina-8 e incorporan argininas en la región central de unión predicha reemplazada con residuos de citrulina para las respuestas de IFNy/IL-17 en los ratones HLA-DR1 y C57 BI (figura 29). Los ratones se inmunizaron con una combinación de 3 péptidos citrulinados de citoqueratina 8 en combinación con adyuvantes CpG y MPLA y luego se cribaron para las respuestas de IFNy e IL-17 contra cada péptido individual en la combinación. La Figura 28a muestra que los péptidos citrulinados 1, 2, 3, 13, 16 y 17 de la citoqueratina 8 mostraron respuestas de IFNy significativas (200-300 manchas/millón de esplenocitos p<0,02) y los péptidos 1, 2, 3, 13 y 14 mostraron una respuesta de IL- 17 (250-350 manchas/millón de esplenocitos; p<0,02) en los ratones transgénicos HLA-DR1. La Figura 29b muestra que los péptidos de citoqueratina 8 no estimularon una respuesta en ratones C57BI.
Tabla 8 Respuestas de IFNy/IL-17 de la citoqueratina citrulinada
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c) Cribar los epítopos citrulinados conocidos para las respuestas de células T
La proteína ING4 es citrulinada por PAD4 en la posición 133 en su región NLS. Esto evita su asociación con p53, que es esencial para la activación de p53. La proteína ING4 citrulinada se degrada rápidamente, lo que sugiere que puede expresarse abundantemente en el MHC de clase II. El péptido AQKKLKLVrTs PEYGMP de ING4 no logró estimular ninguna respuesta inmunitaria en los ratones transgénicos HLA-DR1, pero el AQKKLKLVcitTSPEYGMP estimuló una respuesta de IFNy/IL-17 (media de 200 puntos/millón de esplenocitos) al péptido citrulinado, pero no respondió al péptido de tipo salvaje. La respuesta a los péptidos citrulinados se bloqueó con un mab bloqueante del MHC de clase II (figura 31a). Este es un ejemplo más de una proteína que puede estimular respuestas CD4 citrulinadas/específicas de tumores.
d) Cribar cualquier proteína para epítopos citrulinados de células T.
Como hemos mostrado en el ejemplo 2, la inmunización con ADN que codifica un antígeno completo resulta en respuestas a péptidos citrulinados. Aquí mostramos que si inmunizamos con ADN que codifica el antígeno completo y cribamos contra todos los péptidos citrulinados de 20 mers posibles, solo las respuestas de las células T a los epítopos citrulinados presentados por las moléculas HLA estimulan una respuesta inmunitaria. El panel de péptidos citrulinados se detalla en la tabla 7. La Figura 33a muestra las respuestas generadas a partir de la inmunización con ADN de vimentina en los ratones transgénicos HLA-DR4 y la Figura 34b muestra las respuestas en los ratones transgénicos HLA-A2/DR1. Los ratones transgénicos HLA-DR4 muestran respuestas específicas de alta frecuencia para los péptidos citrulinados 28-49 y 415-433 de la vimentina, así como respuestas de frecuencia más baja para los péptidos 19-33, 26-44 y 36-54 de la vimentina. Los ratones transgénicos HLA-A2/DR1 demuestran respuestas específicas de alta frecuencia para el péptido citrulinado 65-77 de la vimentina. Esto ejemplifica el uso de ADN que codifica antígenos completos para inducir respuestas de células T citrulinadas y es un procedimiento excelente para el cribado de epítopos citrulinados adicionales de células T. De manera similar, las proteínas pueden modificarse con citrulina ex vivo al incubarse con enzimas PAD en presencia de altos niveles de calcio. Estas proteínas pueden usarse para inmunizar ratones y después las células T se criban contra todos los posibles péptidos citrulinados de 20 mers.
e) cribar péptidos predichos seleccionados en base a la puntuación de unión al MHC y los residuos de arginina dentro de la región central.
Hemos demostrado que pueden inducirse respuestas a epítopos citrulinados conocidos, pero aquí también demostramos que los epítopos de péptidos pueden seleccionarse en base a las puntuaciones de unión del MHC predichas y la presencia de residuos de arginina dentro de la región de unión del MHC central. Para este ejemplo, los péptidos fueron seleccionados de BiP, HSP90, CXCL10, CXCL12 e ING4 que tenían una alta unión a h La -Dr4 predicha mediante el uso del algoritmo de predicción SYFPEITHI (www.syfpeithi.de) y después restringido aún más a través de la presencia de argininas en la región central de unión (determinada mediante el algoritmo de predicción IEDB ( www.iedb.org) (Tabla 9). Se probaron los péptidos que contenían todas las argininas transformadas en citrulina.
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Se inmunizaron los ratones transgénicos HLA-DR4 hasta en tres ocasiones con los péptidos citrulinados y se evaluaron las respuestas ex vivo mediante elispot de IFNg frente a péptidos citrulinados y no modificados relevantes. La Figura 34 muestra respuestas significativas a BiP 39-53, BiP 172-186, HSP90346-360, HSP90456-477 e ING4 44-58 citrulinados sobre el péptido no modificado o control de fondo. Esto proporciona otro procedimiento efectivo para la selección de epítopos citrulinados de células T.
Para demostrar que las células T reconocen tumores, pueden cribarse para el reconocimiento de células diana tumorales, el ácido eliminado para estimular el reciclaje del MHC y privar de suero para inducir la autofagia (figura 22a y e). El papel de la citrulinación y la autofagia puede confirmarse mediante el uso de PAD e inhibidores de la autofagia (Figura 22a). Las respuestas antitumorales in vivo pueden medirse al iniciar tumores, al inmunizar con péptidos citrulinados y al controlar el crecimiento tumoral como se muestra en las figuras (24-26).
Ejemplo 8.
Estudios previos han demostrado que es posible determinar la diferenciación de células CD4 vírgenes a diferentes fenotipos colaboradores en dependencia de su medio de citocinas presente cuando son estimuladas. En contraste, hemos demostrado por primera vez en la Figura 15 que ciertos epítopos pueden determinar la diferenciación de las células T colaboradoras a pesar del entorno de citocinas. El vim415 cit estimuló un fenotipo Th1/IL-17 incluso cuando se inmunizó en presencia del adyuvante Th2 adyuvante completo de Freund. Esto sugiere que la fuerza de la interacción del receptor de células T CD4 con el péptido MHC puede determinar la diferenciación de las células T. En este contexto, hemos demostrado que el vim415 de tipo salvaje estimula una respuesta de IL-10 (figura 30; media de 580 puntos/millón de esplenocitos p=0,0249) incluso en presencia de los adyuvantes Th1 CpG/MPLA. Sin embargo, no logró estimular una respuesta significativa de IFNy o IL-17.
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Claims (11)

REIVINDICACIONES
1. Un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica un epítopo asociado a un tumor que estimula una reacción inmunitaria contra el tumor para su uso en un procedimiento de tratamiento del cáncer, en el que el epítopo tiene una modificación de la desiminación de arginina a citrulina, el ácido nucleico se dirige a un célula que expresa una enzima PAD, que es una célula presentadora de antígeno (APC), y el ácido nucleico se traduce y se modifica con citrulina postraduccionalmente dentro de la APC para estimular las células T que son específicas del epítopo citrulinado.
2. El ácido nucleico para su uso de la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico se dirige a una APC mediante inyección intradérmica.
3. El ácido nucleico para su uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que el ácido nucleico está en forma de un minigen que codifica una secuencia líder y el epítopo
4. El ácido nucleico para su uso de cualquier reivindicación anterior, en el que el epítopo se deriva de citoqueratinas, ING4, MUC1, CEA.CAM5, CD59, bcl2, p-catenina, CXCL8, CXCL10, CXCL12, a enolasa, proteína básica de mielina, histona, nucleofosmina, B23, complejo coactivador, antitrombina, agregan, factor de elongación 1a, proteína asociada a adenilciclasa (CAPI), proteína regulada por glucosa, ALDH2, proteína de capa intermedia del cartílago (CLIP), aldolasa, fosfoglicerato quinasa 1 (PGK1), calreticulina, HSP60, proteínas 1 y 2 de unión a elementos secuencia arriba lejanas (FUSE-BP), asporina, catepsina D, proteína de unión a heparina, p-actina, F-actina, subunidad a-1 de la proteína protectora (CapZa-1), albúmina, receptor de histamina g, precursor de la proteína disulfuro-isomerasa ER60, aldehído deshidrogenasa mitocondrial (ALDH2), BiP (GRP78), hSp90 o GSK3p.
5. El ácido nucleico para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el epítopo se deriva de la vimentina.
6. El ácido nucleico para su uso de la reivindicación 5, en el que el epítopo comprende al menos una de las siguientes secuencias:
VRLRSSVPG,
RLRSSVPGV, y
FSSLNLRET,
en el que uno o más de los residuos R se sustituye por citrulina.
7. El ácido nucleico para su uso de la reivindicación 6, en el que el epítopo comprende al menos una de las siguientes secuencias:
SAVRLRSSVPGVR (vim65-77)
LPNFSSLNLRETNLDSLPL (vim415-433).
8. El ácido nucleico para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que el epítopo comprende al menos una de las siguientes secuencias:
RSSVPGVRL, SAVRLRSSV, ATRSSAVRL, YATRSSAVRLRSSVPGVRL (vim 61-79),
RSSVPGVRL, GVRLLQDSV, RLRSSVPGVRLLQDSVDFS (vim 69-87),
QLKGQGKSR, KSRLGDLYE, EQLKGQGKSRLGDLYEEEM (vim125-154),
ELRRQVDQL, EMRELRRQV, DLYEEEMRELRRQVDQLTN (vim 148-166),
QLTNDKARV, VEVERDNLA, LTNDKARVE, VDQLTNDKARVEVERDNLA (vim 161-179),
EVERDNLAE, NDKARVEVERDNLAEDIMR (vim 166-184),
IMRLREKLQ, DNLAEDIMRLREKLQEEML (vim 176-194),
QREEAENTL, KLQEEMLQR, EKLQEEMLQREEAENTLQS (vim 187-205), y/o
FRQDVDNAS, ENTLQSFRQ, EAENTLQSFRQDVDNASLA (vim 198-216),
en el que uno o más de los residuos R se sustituye por citrulina.
9. El ácido nucleico para su uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el epítopo comprende una secuencia seleccionada de:
IQKLYGKRS, preferentemente SQDDIKGIQKLYGKRS (MMP7-247),
EIRELQSQ, preferentemente EEEIRELQSQISDTSVVLS (citoqueratina 8229-247),
AKQDMARQLREYQEL, preferentemente AKQDMARQLREYQELMNVKL (citoqueratina 8: 363-382),
AKQDMARQ, preferentemente LQRAKQDMARQLREYQELM (citoqueratina 8: 360-378),
ISSSSFSRV, preferentemente PGSRISSSSFSRVGSS (citoqueratina 8: 29-44),
PRAFSSRS, preferentemente STSGPRAFSSRSYTSg Pg (citoqueratina 8: 13-30),
EAALQRAKQ, preferentemente ELEAALQRAKQDMARQL (citoqueratina 8: 355-371), LEVDPNIQAVRTQE, preferentemente LEVDPNIQAVRTQEKEQI (citoqueratina 8: 78-95),
QKKLKLVRT, preferentemente AQKKLKLVRTSPEYGMP (ING4158-174),
LKLVRTSPE, preferentemente AQKKLKLVRTSPEYGMP (ING4158-174), y
KKLKLVRTS, preferentemente AQKKLKLVRTSPEYGMP (ING4158-174),
YMSSARSLS, MSSARSLSS, TEYMSSARS, preferentemente KLATEYMSSARSLSSEEK (ING444-58) FDLFENRKK, preferentemente RAPFDLFENRKKKNN (HSP90-346-360)
YLNFIRGW o FIRGVVDSE, preferentemente IPEYLNFIRGVVDSE (HSP90 - 378-392)
LRYYTSASG, LLRYYTSAS o LSELLRYYT, preferentemente RKKLSELLRYYTSASGDEMVSL (HSP90-456-477) RRRLSELLRYHTSQS (HSP90 beta 456-460)
VGVFKNGRV o FKNGRVEII, preferentemente YSCVGVFKNGRVEII (BiP39-53)
YFNDAQRQA, preferentemente VPAYFNDAQRQATKDA (BiP 172-186)
FEIDVNGIL o VTFEIDVNG, preferentemente EVTFEIDVNGILRVT (BiP 497-511)
ITNDQNRLT, preferentemente KITITNDQNRLTPEE (BiP 522-536)
LQIVARLKN o VARLKNNNR, preferentemente NCALQIVARLKNNNR (CXCL12-54-68)
VEIIATMKK o RVEIIATMK, preferentemente CPRVEIIATMKKKGE (CXCL1057-71)
en el que uno o más de los residuos R se sustituye por citrulina.
10. El ácido nucleico para su uso de cualquier reivindicación anterior, en el que el cáncer es melanoma, cáncer de mama, endometrial, colorrectal u ovárico.
11. El ácido nucleico para su uso de cualquier reivindicación anterior, en el que el uso es humano o veterinario.
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