ES2827020T3 - Respuestas inmunitarias antitumorales contra autoepítopos modificados - Google Patents

Abstract

Un péptido que consiste en: i) una secuencia de aminoácidos seleccionada de: VIGMDVAASEFFcitSGKYDLD, VIGMDVAASEFYcitSGKYDLD, EVDLFTSKGLFcitAAVPSGAS, EVDLYTAKGLFcitAAVPSGAS, KGVPLYcitHIADLAGNSEVIL, KGVPLYcitHIADLAGNPEVIL, VGDDLTVTNPKcitIAKAVNEK o VGDDLTVTNPKcitIAKAASEK en donde "cit" representa citrulina, o ii) la secuencia de aminoácidos de i), con la excepción de 1, 2 o 3 cambios de aminoácidos seleccionados de sustituciones, inserciones y/o deleciones en una posición que no es de citrulina, en donde el péptido puede utilizarse para generar una respuesta inmunitaria contra tumores; o iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos de i), en donde los cambios de aminoácidos están en una posición que no es de citrulina y en donde el péptido puede utilizarse para generar una respuesta inmunitaria contra tumores; o iv) la secuencia de aminoácidos: IFDScitGNPTVEVDLY.

Description

DESCRIPCIÓN

Respuestas inmunitarias antitumorales contra autoepítopos modificados

La presente invención se refiere, en líneas generales, a péptidos modificados que pueden utilizarse como dianas para inmunoterapia contra el cáncer. Los péptidos modificados pueden ser péptidos de enolasa citrulinados. Estos péptidos modificados pueden utilizarse como vacunas o como dianas para terapia con anticuerpos monoclonales (mAb, monoclonal antibody). Dichas vacunas o mAb pueden utilizarse en el tratamiento del cáncer.

Para que sean eficaces, las vacunas contra el cáncer deben inducir una fuerte respuesta inmunitaria que pueda romper la tolerancia y superar el entorno tumoral inmunosupresor. Recientemente se ha destacado la importancia de los linfocitos T CD4 en la mediación de la destrucción de tumores, sin embargo, la inducción de respuestas CD4 autoespecíficas ha resultado ser más difícil. En cambio, se ha demostrado que los linfocitos T CD4 reconocen autoepítopos modificados que desempeñan un papel en la fisiopatología de diversas enfermedades autoinmunitarias tales como artritis reumatoide (AR), artritis inducida por colágeno II, sarcoidosis, celiaquía y soriasis (Choy, 2012, Grunewald y Eklund, 2007, Coimbra et al., 2012, Holmdahl et al., 1985). Una de estas modificaciones habituales es la citrulinación de la arginina, que implica la conversión del grupo aldimina con carga positiva (= NH) de la arginina al grupo cetona con carga neutra (= O) de la citrulina. La citrulinación está mediada por peptidilarginina deiminasas (PAD), que son una familia de enzimas dependientes de calcio que se encuentran en una variedad de tejidos. En un informe reciente de Ireland et al. 2011, se demuestra que la presentación de epítopos de linfocitos T citrulinados en las APC (por las siglas del inglés Antigen-Presenting Cells, células presentadoras de antígeno), también depende de la autofagia y de la actividad de las PAD. Este proceso también ha demostrado ser un mecanismo eficaz para permitir el procesamiento de antígenos endógenos para su presentación en moléculas del MHC (del inglés Major Histocompatibility Complex, complejo principal de histocompatibilidad) de clase II, en APC profesionales, así como en células epiteliales (Munz, 2012, Schmid et al., 2007). La autofagia es constitutiva en las APC, pero solo es inducida por estrés en otras células (Green y Levine, 2014). Por tanto, los linfocitos T que reconocen epítopos citrulinados no tienen una diana en las células sanas normales. La autofagia se desencadena debido a estrés, tal como hipoxia y falta de nutrientes, y se regula al alza para promover la supervivencia tumoral (Green y Levine, 2014).

Una proteína que está citrulinada es la enolasa, que es una enzima glucolítica que se encuentra en el citoplasma. También se expresa en la superficie celular donde actúa como un receptor de plasminógeno (Miles et al., 1991). En los mamíferos hay cuatro isoformas de la enzima enolasa que están codificadas por cuatro genes distintos (Diaz-Ramos et al., 2012). El gen ENO1 codifica la alfa-enolasa que se expresa en casi todos los tejidos adultos. ENO2 (beta-enolasa) se expresa en el tejido muscular y ENO3 (gamma-enolasa) se encuentra en neuronas (Marangos et al., 1978). Más recientemente se ha identificado una cuarta variante ENO4 que se expresa exclusivamente en el esperma (Nakamura et al., 2013). La enolasa enzimáticamente activa está formada por dos subunidades que pueden ser homo o heterodiméricas (Pancholi, 2001).

ENO1 y ENO3 se identificaron como proteínas citrulinadas en el SNC (Jang et al., 2008, Jang et al., 2010) y como autoantígenos en la artritis reumatoide (Kinloch et al., 2005, Kinloch et al., 2008, Lundberg et al., 2008, Mahdi et al., 2009). Más recientemente se han descrito anticuerpos monoclonales que reconocen la citrulinación de Arg9 en ENO1, la citrulinación de Arg9 en ENO1 y ENO3 y la citrulinación de Arg9 en ENO3 (Jang et al., 2012) y se ha demostrado que la enolasa citrulinada pierde su actividad enzimática y se degrada más rápidamente por la calpaína-1 aunque la citrulinación aumenta la actividad de unión del plasminógeno ENO1 y ENO3. Se han descrito diversos péptidos de enolasa citrulinados que se unen al MHC II humano (documento WO2012138294 A1) y que pueden activar linfocitos T en pacientes con artritis reumatoide para producir IL-17.

El papel de la enolasa en la glucólisis anaerobia y en la localización del plasminógeno en la superficie celular, la ha destacado como una posible diana para las terapias antitumorales. En primer lugar, en el microambiente tumoral, la hipoxia es un factor importante durante el crecimiento de un tumor sólido. Por lo tanto, la regulación al alza de las enzimas glucolíticas es necesaria para la supervivencia del tumor. El promotor ENO1 contiene un elemento sensible a hipoxia que se regula al alza en las células en respuesta al estrés hipóxico (Semenza et al., 1996). En segundo lugar, la enolasa de la superficie celular actúa como una molécula de unión a plasminógeno que permite la escisión del plasminógeno en plasmina a través del activador de plasminógeno. Este proceso es importante para la invasión celular con niveles elevados de activador de plasminógeno relacionados con neoplasia maligna (Andreasen et al., 2000). Conjuntamente, estas funciones significan que la enolasa juega un papel activo en el crecimiento y la metástasis tumoral. Se han desarrollado múltiples enfoques para dirigirse terapéuticamente a la enolasa. El silenciamiento de ENO1 reduce la glicólisis de las células del endometrio, la proliferación y la migración in vitro e inhibe significativamente el crecimiento celular in vivo (Zhou et al., 2010). De manera similar, se ha demostrado que la administración del mAb anti-ENO1 reduce el crecimiento y la metástasis in vivo de la línea celular pancreática humanas CFPAC-1 (Principe et al., 2015). Se ha demostrado que ENO1 se sobreexpresa en diversos tejidos de cáncer, entre los que se incluyen carcinoma de endometrio, adenocarcinoma ductal de páncreas y cáncer de pulmón no microcítico (Zhao et al., 2015, Cappello et al., 2009, Fu et al., 2015). Además, la alta expresión de enolasa se ha correlacionado con un mal resultado clínico en diversos tumores, incluidos los de mama, hepatocelular y gástrico (Revisado por Capello et al., 2011). En el cáncer de pulmón, la regulación al alza de la expresión de ENO1 en células tumorales se observó en 11 pacientes de 17. La expresión más alta de ENO1 se correlacionó con una recidiva de la enfermedad y un estadio avanzado del tumor (Chang et al., 2006).

En muchos pacientes, incluidos los pacientes con cáncer de páncreas, leucemia, melanoma, cabeza y cuello, mama y pulmón, se ha demostrado que ENO1 es un autoantígeno (Capello et al., 2011). En el cáncer de páncreas, ENO1 suscita una respuesta de linfocitos T CD4 y CD8 tanto in vitro como in vivo (Cappello et al., 2009) que inhibe el crecimiento de células de adenocarcinoma ductal pancreático pero no se identificaron epítopos T específicos. En el cáncer de cabeza y cuello, un péptido restringido HLA-DR8 (aa 321-336) estimuló las respuestas de linfocitos T CD4 citotóxicos (Kondo et al., 2002). En un modelo genético de adenocarcinoma de páncreas, la vacunación con ADN de ENO1 suscitó respuestas inmunitarias humorales y celulares contra tumores que retrasaban la progresión tumoral y prolongaban significativamente la supervivencia (Cappello et al., 2013). Se ha descrito el uso del antígeno de enolasa de tipo silvestre como agente de diagnóstico y terapéutico en el cáncer (documento US 7645453 B2). Además, se han descrito agentes dirigidos a la alfa-enolasa como una forma de aumentar la sensibilidad de las células neoplásicas a los agentes quimioterapéuticos (documento WO 2007072219 A2). Hemos demostrado previamente que los péptidos de vimentina citrulinados pueden inducir respuestas inmunitarias mediadas por CD4 que dan como resultado el rechazo del tumor y la supervivencia prolongada (documento WO2014023957 A2). Sin embargo, todas las respuestas inmunitarias medidas frente a la enolasa reconocieron la enolasa de tipo silvestre o fosforilada pero no la enolasa citrulinada, lo que sugiere que esta enzima no estaba citrulinada en el cáncer.

Los autores de la invención han demostrado que, en donantes normales y en ratones transgénicos para HLA, existe un repertorio de linfocitos T que reconocen péptidos de enolasa citrulinados y que producen IFNy. También han demostrado que ciertos péptidos de enolasa citrulinados generan una respuesta de linfocitos T in vivo y, como tales, pueden utilizarse como diana de vacuna para la terapia del cáncer.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un péptido que consiste en:

i) una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

VIGMDVAASEFFcitSGKYDLD (Eno1 241-260),

VIGMDVAASEFYcitSGKYDLD (Eno2/3241-260),

EVDLFTSKGLFcitAAVPSGAS (Eno1 21-40),

EVDLYTAKGLFcitAAVPSGAS (Eno321-40),

KGVPLYcitHlADLAGNSEVIL (Eno1 126-145),

KGVPLYcitHlADLAGNPEVIL (Eno1 126-145 de ratón),

VGDDLTVTNPKcitlAKAVNEK (Eno1 316-335) o

VGDDLTVTNPKcitlAKAASEK (Eno1 316-335 de ratón)

donde "cit" representa citrulina,

ii) la secuencia de aminoácidos de i), con la excepción de 1, 2 o 3 cambios de aminoácidos seleccionados de sustituciones, inserciones y/o deleciones en una posición que no es de citrulina, en donde el péptido puede utilizarse para generar una respuesta inmunitaria contra tumores, o

iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos de i), en donde los cambios de aminoácidos están en una posición que no es de citrulina y en donde el péptido puede utilizarse para generar una respuesta inmunitaria contra tumores; o

iv) la secuencia de aminoácidos IFDScitGNPTVEVDLY (Eno3/Eno1 11-25 de ratón).

Los autores de la invención han descubierto, de manera inesperada, que los epítopos citrulinados procedentes de enolasa pueden utilizarse para generar una respuesta inmunitaria contra tumores, incluyendo, aunque sin limitación, tumor pancreático, leucemia, melanoma, tumor de cabeza y cuello, de mama y pulmón. Los inventores han demostrado que solo dos péptidos

VIGMDVAASEFFcitSGKYDLD/VIGMDVAASEFYcitSGKYDLD - enolasa 241-260 citrulinada en la posición 253 y EVDLFTSKGLFcitAAVPSGAS/EVDLYTAKGLFcitAAVPSGAS - enolasa 21-40 citrulinada en la posición 32 generaban una respuesta de linfocitos T in vivo contra autoepítopos de enolasa citrulinados. Tres péptidos KGVPLYcitHlADLAGNSEVIL/KGVPLYcitHlADLAGNPEVIL - enolasa 126-145 citrulinada en la posición 132, VGDDLTVTNPKcitlAKAVNEK/VGDDLTVTNPKcitlAKAASEK - enolasa 316-335 citrulinada en la posición 328 y IFDScitGNPTVEVDLF/IFDScitGNPTVEVDLY - enolasa 11-25 citrulinada en la posición 15

generaron una respuesta de linfocitos T in vivo contra epítopos humanos citrulinados que no eran homólogos de ratón y, por lo tanto, se reconocieron como antígenos extraños.

Se sabe que los péptidos citrulinados estimulan las respuestas de las linfocitos T en pacientes autoinmunitarios con el motivo DR4DR4 de HLA compartido. En cambio, los autores de la invención son los primeros en demostrar que la enolasa 241-260 citrulinada en la posición 253, puede estimular fuertes respuestas de linfocitos T en ratones HLA-DP4 transgénicos. Dado que HLA-DP4 se expresa en el 70 % de la población, lo convierte en una vacuna prometedora para el tratamiento de tumores sólidos. Todos los donantes normales que mostraron respuestas a enolasa 241-260 citrulinada en la posición 253, expresaron HLA-DP4. La respuesta a enolasa 241-260 citrulinada en la posición 253 fue la más fuerte y mostró una reactividad mínima a la secuencia no modificada. Los linfocitos T específicos para este epítopo de péptido citrulinado pueden dirigirse a las células tumorales para suscitar fuertes efectos antitumorales in vivo, proporcionando así la primera prueba respecto al uso de enolasa 241-260 citrulinada como una diana de vacuna para la terapia del cáncer.

ENO1, ENO2 y ENO3 están sumamente conservados y todos ellos expresan uno u otro de los dos péptidos de enolasa 241-260 citrulinada en la posición 253. En cambio, e NO4 tiene una gran inversión en este punto de la secuencia del gen. Por consiguiente, la enolasa 241-260 citrulinada en la posición 253, así como los ácidos nucleicos que la codifican, pueden utilizarse para dirigirse a ENO1, ENO2 o ENO3.

Estudios anteriores habían demostrado que la enolasa 241-260 citrulinada en la posición 253 podía estimular las respuestas de los linfocitos T en pacientes con AR (documento WO2012138294). Como se describe con detalle en los ejemplos del presente documento, para comprobar si los epítopos de enolasa dentro de una construcción de ADN estaban estimulando respuestas inmunitarias contra la enolasa citrulinada, se inmunizaron ratones con ADN que codificaba los epítopos de enolasa y sus respuestas se exploraron contra los epítopos no modificados y citrulinados. Los ratones inmunizados con ADN que codifica la secuencia de enolasa completa, respondieron solo a enolasa 241­ 260 citrulinada en la posición 253. Esto sugiere que, cuando se traduce el a Dn , el péptido de enolasa 241-260 está preferentemente citrulinado, el epítopo citrulinado que se une con mayor afinidad al MHC o que los linfocitos T estimulados con epítopos de enolasa no modificados, reconocen los péptidos citrulinados con más avidez.

Además de demostrar que ese epítopo codificado dentro del ADN daba respuestas de linfocitos T citrulinados, el péptido de enolasa 241-260 citrulinada en la posición 253, solo estimulaba respuestas Th1 que solo reconocían epítopos modificados y no hubo reacción cruzada contra el péptido de tipo silvestre. Cuando los donantes normales fueron estimulados con el péptido de enolasa 241-260 citrulinada en la posición 253, 4/6 donantes mostraron una respuesta a péptidos de enolasa 241-260 citrulinada en la posición 253, pero no a péptidos de tipo silvestre. Se demostró que esta respuesta era una respuesta Th1 CD4. En cambio, cabe destacar que en los pacientes con AR no se produjo IL-17.

El péptido de enolasa 241-260 citrulinada en la posición 253, se inmunizó con una variedad de adyuvantes. Los adyuvantes inmunoestimuladores, tales como CpG/MPLA, Poli I: C e imiquimod, estimularon respuestas Th1 y fueron requeridos, ya que no hubo respuesta en ausencia de adyuvante. Los adyuvantes inertes, tales como el adyuvante incompleto de Freund, causaron la inducción de respuestas que eran predominantemente de IL-10, lo que sugiere la inducción de una respuesta de tipo iTreg (linfocito T regulador inducible).

Los aminoácidos insertados y los aminoácidos de reemplazo pueden ser aminoácidos naturales o pueden ser aminoácidos no naturales y, por ejemplo, pueden contener una cadena lateral no natural. Si se sustituye y/o inserta más de un resto de aminoácido, los restos de aminoácidos de reemplazo/insertados pueden ser iguales o diferentes entre sí. Cada aminoácido de reemplazo puede tener una cadena lateral diferente a la del aminoácido que se reemplaza.

La enolasa está sumamente conservada entre aquellas especies en las que se ha clonado el gen (pollo, ratón, perro, oveja, vaca, caballo, cerdo y ser humano). Por consiguiente, un péptido de la invención, opcionalmente en combinación con un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica dicho péptido, puede utilizarse para tratar el cáncer en mamíferos no humanos.

La invención incluye, dentro de su alcance, péptidos que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 99 % con la secuencia de aminoácidos en i) anterior, en donde los cambios de aminoácidos están en una posición que no es de citrulina y en donde el péptido puede utilizarse para generar una respuesta inmunitaria contra tumores. El porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácido nucleico se determina en general alineando las secuencias con fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en la primera secuencia para la mejor alineación con la segunda secuencia) y comparando los restos de aminoácido o de nucleótidos en las posiciones correspondientes. La "mejor alineación" es una alineación de dos secuencias que da lugar al porcentaje de identidad más elevado. El porcentaje de identidad se determina comparando el número de restos de aminoácido o nucleótidos idénticos dentro de las secuencias (es decir, % de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100).

La determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede realizarse utilizando un algoritmo matemático conocido por los expertos en la materia. Un ejemplo de un algoritmo matemático para comparar dos secuencias, es el algoritmo de Karlin y Altschul modificado como en (Karlin y Altschul, 1993) (Karlin y Altschul, 1993). Los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, et al. han incorporado dicho algoritmo (Altschul et al., 1990). Con el programa NBLAST, pueden realizarse búsquedas BLAST de nucleótidos, puntuación = 100, longitud de palabra = 12 para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a las de las moléculas de ácido nucleico de la invención. Con el programa XBLAST, pueden realizarse búsquedas BLAST de proteínas, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a las de las moléculas de proteína de la invención. Para obtener alineaciones con huecos con fines de comparación, se puede utilizar BLAST con huecos, como se describe en (Altschul et al., 1997). Como alternativa, puede utilizarse PSI-Blast para realizar una búsqueda iterada que detecte relaciones distantes entre moléculas. Cuando se utilizan los programas BLAST, BLAST con huecos y PSI-Blast, pueden utilizarse los parámetros por defecto de los respectivos programas (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Otro ejemplo de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller (Myers y Miller, 1989). El programa ALIGN (versión 2.0) que es parte del paquete del programa informático de alineación de secuencias GCG ha incorporado dicho algoritmo. Otros algoritmos para el análisis de secuencias conocidos en la técnica incluyen ADVANCE y ADAM como se describe en (Torelli y Robotti, 1994) y FASTA descrito en (Pearson y Lipman, 1988). Dentro de FASTA, ktup es una opción de control que establece la sensibilidad y la velocidad de la búsqueda.

Los péptidos de la invención pueden sintetizarse utilizando química de Fmoc u otras técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia.

Otra manera conveniente de producir un péptido de acuerdo con la presente invención, es expresar el ácido nucleico que los codifica, utilizando ácido nucleico en un sistema de expresión.

Los autores de la invención han demostrado que la inmunización con ácidos nucleicos que codifican los péptidos de la invención proporcionan respuestas inmunitarias contra péptidos citrulinados pero no contra péptidos no citrulinados de tipo silvestre. Por consiguiente, en el presente documento se desvela un ácido nucleico aislado que codifica un péptido de la presente invención. En el presente documento se desvela un ácido nucleico que codifica un péptido de la invención como se define anteriormente.

Los autores de la invención también han descubierto que la administración de ácido nucleico, tal como ADN o ARN, que codifica la enolasa de longitud completa, da lugar a fuertes respuestas inmunitarias contra solo enolasa 241-260 citrulinada en la posición 253. En los Ejemplos y dibujos del presente documento se proporcionan ejemplos de la secuencia de aminoácidos de la enolasa de longitud completa y un experto en la materia tiene la capacidad de proporcionar secuencias de ácido nucleico que codifiquen dichas secuencias de aminoácidos.

El experto en la materia podrá determinar sustituciones, deleciones y/o adiciones en dichos ácidos nucleicos. El ácido nucleico puede ser ADN, ADNc o ARN, tal como ARNm obtenido por clonación o producido mediante síntesis química. Para uso terapéutico, el ácido nucleico está preferentemente en una forma que puede expresarse en el sujeto a tratar. El péptido o el ácido nucleico de la presente invención, puede proporcionarse como un aislado, en forma aislada y/o purificada, o puede carecer o carecer sustancialmente de material con el que está asociado de manera natural. En el caso de un ácido nucleico, este puede carecer o carecer sustancialmente de ácido nucleico que flanquea el gen en el genoma humano, excepto posiblemente de una o más secuencias reguladoras para la expresión. El ácido nucleico puede ser completa o parcialmente sintético y puede incluir ADN genómico, ADNc o ARN. Cuando el ácido nucleico incluye ARN, la referencia a la secuencia mostrada debe interpretarse como una referencia al equivalente en ARN, con la U sustituida por la T.

El experto en la materia puede preparar fácilmente secuencias de ácido nucleico que codifican un péptido de la presente invención, por ejemplo, utilizando la información y las referencias incluidas en este documento y las técnicas conocidas en la materia (véase, por ejemplo, (Sambrook, 1989, Ausubel, 1992)), dadas las secuencias de ácido nucleico y los clones disponibles. Estas técnicas incluyen (i) el uso de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) para amplificar muestras de dicho ácido nucleico, por ejemplo, de fuentes genómicas, (ii) síntesis química o (iii) preparación de secuencias de ADNc. El ADN que codifica el polipéptido puede generarse y utilizarse de cualquier manera adecuada conocida por los expertos en la materia, incluyendo recoger ADN codificante, identificar sitios adecuados de reconocimiento de enzimas de restricción en cualquier lado de la parte a expresar, y cortar dicha parte del ADN. Después, la parte puede operativamente a un promotor adecuado en un sistema de expresión convencional disponible en el comercio. Otra estrategia recombinante es amplificar la parte pertinente del ADN con cebadores adecuados de PCR. Pueden hacerse modificaciones a las secuencias, por ejemplo, utilizando mutagénesis dirigida, para dar lugar a la expresión de un péptido modificado o para tener en cuenta las preferencias de codones en las células hospedadoras utilizadas para expresar el ácido nucleico. Pueden proporcionarse construcciones en forma de plásmidos, vectores, casetes de transcripción o de expresión que comprendan al menos un ácido nucleico como el desvelado anteriormente en el presente documento. En el presente documento también se desvela una célula hospedadora recombinante que comprende una o más construcciones como se ha indicado anteriormente. Como se ha mencionado, en el presente documento se desvela un ácido nucleico que codifica un péptido de la invención, así como un método de producción de la composición, cuyo método comprende la expresión del ácido nucleico codificante. La expresión puede realizarse convenientemente cultivando en condiciones apropiadas células hospedadoras recombinantes que contengan el ácido nucleico. Después de la producción mediante expresión, una composición puede aislarse y/o purificarse utilizando cualquier técnica adecuada, y después utilizarse según sea apropiado.

Se conocen bien sistemas de clonación y expresión de un polipéptido en una diversidad de diferentes células hospedadoras. Las células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias, células de mamífero, sistemas de levaduras y baculovirus. Las células de mamífero disponibles en la técnica para la expresión de un polipéptido heterólogo incluyen células de ovario de hámster chino, células HeLa, células de riñón de cría de hámster, células de melanoma de ratón NSO y muchas otras. Un hospedador bacteriano habitual y preferido es E. coli. La expresión de anticuerpos y de fragmentos de anticuerpos en células procariotas tales como E. coli está bien establecida en la técnica. La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la materia como una opción en la producción de un miembro de unión específico, para una reciente revisión, véase, por ejemplo (Reff, 1993, Trill et al., 1995). Para una revisión, véase, por ejemplo (Pluckthun, 1991). La expresión en células eucariotas en cultivo también está disponible para los expertos en la materia como una opción en la producción de un miembro de unión específico, para una reciente revisión, véase, por ejemplo (Reff, 1993, Trill et al., 1995).

Se pueden elegir o construir vectores adecuados, que contengan secuencias reguladoras apropiadas, incluyendo secuencias promotoras, secuencias terminadoras, secuencias de poliadenilación, secuencias potenciadoras, genes marcadores y otras secuencias según sea apropiado. Los vectores pueden ser plásmidos, virus, por ejemplo, fagos o fagémidos, según sea apropiado. Para más detalles, véase, por ejemplo, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, 1989). En Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel, 1992) se describen con detalle muchas técnicas y protocolos conocidos para la manipulación de ácido nucleico, por ejemplo, en la preparación de construcciones de ácidos nucleicos, mutagénesis, secuenciación, introducción de ADN en células y expresión génica, y análisis de proteínas.

En el presente documento se desvelan células hospedadoras que contienen ácido nucleico y que pueden aislarse. Se desvelan métodos que comprenden la introducción de dicho ácido nucleico en una célula hospedadora. Para la introducción puede emplearse cualquier técnica disponible. Para las células eucariotas, las técnicas adecuadas pueden incluir transfección con fosfato de calcio, con DEAE-dextrano, electroporación, transfección mediada por liposomas y transducción utilizando retrovirus u otros virus, por ejemplo, virus de la variolovacuna o, para células de insectos, baculovirus. Para las células bacterianas, las técnicas adecuadas pueden incluir transformación con cloruro de calcio, electroporación y transfección utilizando bacteriófagos. La introducción puede ir seguida de causar o permitir la expresión del ácido nucleico, por ejemplo, cultivando células hospedadoras en condiciones para la expresión del gen.

El ácido nucleico puede integrarse en el genoma (por ejemplo, cromosoma) de la célula hospedadora. La integración puede promoverse mediante la inclusión de secuencias que promueven la recombinación con el genoma, de acuerdo con las técnicas convencionales.

En el presente documento se desvela un método que comprende el uso de una construcción, como se indicó anteriormente, en un sistema de expresión, para expresar un polipéptido.

Los polipéptidos de la invención pueden utilizarse para identificar y/o aislar fracciones de unión que se unen específicamente al polipéptido de la invención. Dichas fracciones de unión pueden utilizarse como reactivos inmunoterapéuticos y pueden incluir anticuerpos. Por lo tanto, en un aspecto adicional, la invención proporciona una fracción de unión que se une al polipéptido de la invención, en donde la fracción de unión es un anticuerpo.

El término "anticuerpo", tal como se usa en el presente documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y a partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se unen específicamente a un antígeno, ya sea natural o parcial o totalmente producido de manera sintética. El término "anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpos, derivados, equivalentes funcionales y homólogos de anticuerpos, anticuerpos humanizados, incluyendo cualquier polipéptido que comprenda un dominio de unión a inmunoglobulina, ya sea natural o total o parcialmente sintético y cualquier polipéptido o proteína que tenga un dominio de unión que sea, o sea homólogo a, un dominio de unión a anticuerpos. Por lo tanto, se incluyen moléculas quiméricas que comprenden un dominio de unión a inmunoglobulina, o equivalente, fusionado a otro polipéptido. La clonación y la expresión de anticuerpos quiméricos se describen en los documentos EP-A-0120694 y EP-A-0125023. Un anticuerpo humanizado puede ser un anticuerpo modificado que tiene las regiones variables de un anticuerpo no humano, por ejemplo, murino, y la región constante de un anticuerpo humano. Por ejemplo, en la patente de Estados Unidos N.° 5225539 se describen métodos para crear anticuerpos humanizados. Son ejemplos de anticuerpos los isotipos de inmunoglobulina (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD e IgA) y sus subclases isotípicas; fragmentos que comprenden un dominio de unión a antígeno, tal como Fab, scFv, Fv, dAb, Fd; y diacuerpos. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales. En el presente documento un anticuerpo monoclonal puede denominarse "mAb".

Es posible tomar un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, y utilizar tecnología de ADN recombinante para producir otros anticuerpos o moléculas quiméricas que conserven la especificidad del anticuerpo original. Dichas técnicas pueden implicar la introducción de ADN que codifique la región variable de inmunoglobulina, o las regiones determinantes de la complementariedad (CDR, Complementary Determining Regions), de un anticuerpo en las regiones constantes, o en las regiones constantes y las regiones estructurales, de una inmunoglobulina diferente (véanse, por ejemplo, los documentos EP-A-184187, GB 2188638A o EP-A-239400). Un hibridoma (u otra célula que produzca anticuerpos) puede estar sujeto a mutación genética o a otros cambios, que pueden o no alterar la especificidad de unión de los anticuerpos producidos.

Se ha demostrado que los fragmentos de un anticuerpo completo pueden realizar la función de unir antígenos. Son ejemplos de fragmentos de unión (i) el fragmento Fab que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) el fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) el fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un único anticuerpo; (iv) el fragmento dAb (Ward, E.S. et al., Nature 341:544-546 (1989)) que consiste en un dominio VH; (v) regiones CDR aisladas; (vi) fragmentos F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos (vii) moléculas Fv monocatenarias (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL están unidos por un enlazador peptídico que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno (Bird et al., Science 242:423-426 (1988); Huston et al., PNAS USA 85:5879-5883 (1988)); (viii) dímeros de Fv monocatenarios biespecíficos (documento PCT/US92/09965) y (ix) "diacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos construidos por fusión génica (documento WO94/13804; P. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)). Los diacuerpos son multímeros de polipéptidos, comprendiendo cada polipéptido un primer dominio que comprende una región de unión de una cadena ligera de inmunoglobulina y un segundo dominio que comprende una región de unión de una cadena pesada de inmunoglobulina, estando los dos dominios unidos (por ejemplo, por un enlazador peptídico) pero siendo incapaces de asociarse entre sí para formar un sitio de unión a antígeno: los sitios de unión a antígeno se forman mediante la asociación del primer dominio de un polipéptido dentro del multímero con el segundo dominio de otro polipéptido dentro del multímero (documento WO94/13804). Cuando van a utilizarse anticuerpos biespecíficos, estos pueden ser anticuerpos biespecíficos convencionales, que pueden fabricarse de diversas formas (Hollinger & Winter, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449 (1993)), por ejemplo, prepararse químicamente o a partir de hibridomas híbridos, o pueden ser cualquiera de los fragmentos de anticuerpos biespecíficos mencionados anteriormente. Preferentemente pueden utilizarse dímeros de scFv o diacuerpos en lugar de anticuerpos completos. Los diacuerpos y scFv pueden construirse sin una región Fc, utilizando solo dominios variables, lo que posiblemente reduce los efectos de reacción antiidiotípica. Otras formas de anticuerpos biespecíficos incluyen las "janusinas" monocatenarias descritas en Traunecker et al., EMBO Journal 10:3655-3659 (1991). A diferencia de los anticuerpos completos biespecíficos, los diacuerpos biespecíficos, también pueden ser útiles porque pueden construirse y expresarse fácilmente en E. coli. Los diacuerpos (y muchos otros polipéptidos tales como fragmentos de anticuerpo) de especificidades de unión apropiadas, pueden seleccionarse fácilmente utilizando la presentación en fagos (documento WO94/13804) a partir de bibliotecas. Si un brazo del diacuerpo debe mantenerse constante, por ejemplo, con una especificidad dirigida contra el antígeno X, entonces puede fabricarse una biblioteca donde se modifique el otro brazo y se seleccione un anticuerpo de especificidad apropiada. Un "dominio de unión a antígeno" es la parte de un anticuerpo que comprende la zona que se une específicamente y es complementaria a parte o todo un antígeno. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo solo puede unirse a una parte particular del antígeno, cuya parte se denomina epítopo. Un dominio de unión a antígeno puede ser proporcionado por uno o más dominios variables de anticuerpo. Un dominio de unión a antígeno comprende una región variable de cadena ligera (VL) de anticuerpo y una región variable de cadena pesada (VH) de anticuerpo.

En la presente invención también se incluyen fracciones de unión basadas en armazones proteicos genomodificados. Los armazones proteicos proceden de estructuras proteicas naturales, estables y solubles, que se han modificado para proporcionar un sitio de unión para una molécula diana de interés. Los ejemplos de armazones proteicos genomodificados incluyen, pero sin limitación, aficuerpos, que se basan en el dominio Z de la proteína A estafilocócica que proporciona una interfaz de unión en dos de sus hélices a (Nygren, P. A.(2008). FEBs J 275(11): 2668-76); anticalinas, procedentes de lipocalinas, que incorporan sitios de unión para ligandos pequeños en el extremo abierto de un plegamiento de barril beta (Skerra, A. (2008) FEBS J 275 (11): 2677-83), nanocuerpos y DARPins. Los armazones proteicos genomodificados se dirigen normalmente a unir las mismas proteínas antigénicas que los anticuerpos y son posibles agentes terapéuticos. Pueden actuar como inhibidores o antagonistas, o como vehículos de suministro a moléculas diana, tales como toxinas, a un tejido específico in vivo (Gebauer, M. y A. Skerra (2009). Curr Opin Chem Biol 13(3): 245-55). También pueden utilizarse péptidos cortos para unir una proteína diana. Los filómeros son péptidos estructurados naturales procedentes de genomas bacterianos. Dichos péptidos representan una diversa variedad de plegamientos estructurales de proteínas y pueden utilizarse para inhibir/interrumpir interacciones entre proteínas in vivo (Watt, P. M. (2006). Nat Biotechnol 24(2): 177-83)].

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un péptido del primer aspecto y/o una fracción de unión de la invención, para su uso en medicina.

La invención también proporciona un péptido del primer aspecto y/o una fracción de unión de la invención, para su uso en un método para el tratamiento del cáncer. En el presente documento se desvela el uso de dicho péptido y/o fracción de unión, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. En el presente documento se desvela un método para tratar el cáncer, que comprende administrar, a un sujeto que necesite dicho tratamiento, un péptido del primer aspecto y/o una fracción de unión de la invención. El cáncer puede ser cáncer de mama, incluido el cáncer de mama negativo a receptores de estrógeno, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de ovario, incluido el carcinoma de endometrio, cáncer de páncreas, incluido el adenocarcinoma ductal pancreático, leucemia, melanoma, cáncer de cabeza y cuello o de pulmón.

El péptido puede ser un epítopo de linfocitos T o B. Los epítopos de acuerdo con la presente invención pueden utilizarse en solitario o en combinación. Además, pueden utilizarse en combinación con otros agentes terapéuticos, tales como agentes antineoplásicos incluyendo, pero sin limitación, fármacos tales como ipilimumab, que bloquean el punto de control.

Los péptidos de acuerdo con la invención pueden administrarse in vivo como un péptido, opcionalmente en forma de un péptido como se desvela en el documento WO02/058728. Los autores de la invención han descubierto, de manera sorprendente, que los péptidos de la invención proporcionan fuertes respuestas inmunitarias cuando se administran como un péptido. Dichos epítopos pueden administrarse como la secuencia del epítopo tal cual, o como un polipéptido que contiene el epítopo, o incluso como la proteína de longitud completa. Como alternativa, el péptido de acuerdo con la invención puede administrarse in vivo como un ácido nucleico que codifica el péptido, que codifica un polipéptido que contiene el péptido o incluso que codifica la proteína de longitud completa. Dichos ácidos nucleicos pueden estar en forma de un mini gen, es decir, que codifica una secuencia líder y el péptido o una secuencia líder y la proteína de longitud completa. Los ácidos nucleicos que codifican epítopos útiles en la presente invención, pueden dirigirse a células presentadoras de antígeno y a otras células que expresan enzimas PAD, preferiblemente enzimas PAD4. Los ácidos nucleicos pueden dirigirse al incluir un ácido nucleico que codifique un agente de direccionamiento, tal como un Fc o un anticuerpo monoclonal dirigido a un antígeno diferente en las APC, por ejemplo, un mAb anti-DEC205 o mediante una inyección intradérmica ya que la piel tiene una gran cantidad de a Pc .

Como se usa en el presente documento, el término "tratamiento" incluye cualquier régimen que pueda beneficiar a un ser humano o a un animal no humano. El polipéptido y/o la fracción de unión pueden emplearse en combinación con uno o más transportadores farmacéuticamente aceptables para formar una composición farmacéutica. Dichos transportadores pueden incluir, pero sin limitación, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, liposomas, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.

Se contempla que las inyecciones serán la vía principal para la administración terapéutica de las composiciones de la invención, aunque también puede utilizarse el suministro a través de un catéter u otros tubos quirúrgicos. Algunas vías adecuadas de administración incluyen la administración intravenosa, subcutánea, intradérmica, intraperitoneal e intramuscular. Pueden utilizarse formulaciones líquidas después de su reconstitución a partir de formulaciones en polvo.

Para la inyección intravenosa, o inyección en el sitio afectado, el principio activo estará en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable que será apirógena, tendrá un pH adecuado, será isotónica y que conservará la estabilidad. Los expertos pertinentes en la materia serán muy capaces de preparar soluciones adecuadas utilizando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como solución de cloruro de sodio, solución de Ringer o solución lactado de Ringer. Pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según sea necesario.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en comprimidos, cápsulas, polvos o en forma líquida. Un comprimido puede comprender un transportador sólido tal como gelatina o un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas generalmente comprenden un transportador líquido tal como agua, petróleo, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Puede incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra solución de sacáridos o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol. Cuando la formulación es un líquido, este puede ser, por ejemplo, una solución salina fisiológica que contenga tampón que no es fosfato a un pH comprendido entre 6,8 y 7,6, o un polvo liofilizado.

La composición puede administrarse de una manera localizada a un sitio tumoral u otro sitio deseado o puede suministrarse de una manera que se dirija al tumor o a otras células.

Las composiciones se administran preferentemente a un individuo a una "cantidad terapéuticamente eficaz", que es suficiente para mostrar un beneficio al individuo. La cantidad real administrada, y la velocidad y la evolución temporal de la administración, dependerán de la naturaleza y de la gravedad de lo que se esté tratando. La prescripción del tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la posología, etc., son responsabilidad de los médicos de cabecera y otros facultativos, y normalmente se tiene en cuenta el trastorno que ha de tratarse, el estado del paciente individual, el sitio de administración, el método de administración y otros factores conocidos por los facultativos. Las composiciones de la invención son particularmente pertinentes para el tratamiento del cáncer, y en la prevención de la reaparición de dichas afecciones después del tratamiento inicial o la cirugía. Los ejemplos de las técnicas y protocolos mencionados anteriormente, pueden encontrarse en Remington's Pharmaceutical Sciences [1980]. Una composición puede administrarse sola o en combinación con otros tratamientos, de forma simultánea o secuencial dependiendo de la afección que se vaya a tratar. Otros tratamientos contra el cáncer incluyen otros anticuerpos monoclonales, otros agentes quimioterapéuticos, otras técnicas radioterapéuticas u otra inmunoterapia conocida en la técnica. Una aplicación particular de las composiciones de la invención es como un complemento a la cirugía, es decir, para ayudar a reducir el riesgo de la reaparición del cáncer después de eliminar un tumor. Las composiciones de la presente invención pueden generarse total o parcialmente por síntesis química. La composición puede prepararse fácilmente de acuerdo con métodos convencionales y bien establecidos, de síntesis de péptidos en fase líquida o, preferentemente, en fase sólida, cuyas descripciones generales están extensamente disponibles (véase, por ejemplo, en Solid Phase Peptide Synthesis, 2a edición (Stewart, 1984), en The Practice of Peptide Synthesis (Bodanzsky, 1984) y Applied Biosystems 430a User's Manual, ABI Inc., o pueden prepararse en solución, mediante el método en fase líquida o mediante cualquier combinación de química en fase sólida, fase líquida y en solución, por ejemplo, completando en primer lugar la parte peptídica respectiva y, después, si se desea y es apropiado, tras la eliminación de cualquier grupo protector que esté presente, mediante la introducción del resto X por reacción del ácido carbónico o sulfónico respectivo o un derivado reactivo del mismo.

Los polipéptidos y fracciones de unión de la invención, pueden ser de origen no natural y/o pueden purificarse y/o gemodificarse y/o recombinarse y/o aislarse y/o sintetizarse.

Ejemplos

La presente invención se describirá ahora también con referencia a los siguientes ejemplos y a los dibujos adjuntos. Figura 1: Alineaciones de secuencias de enolasa humana.

Alineación de las subunidades de enolasa humana ENOA (ENO1, a), ENOB (ENO3, p), ENOG (ENO2, y) y ENO4 que representan homología. Las regiones homólogas se indican en gris claro, y las no homólogas en gris oscuro con ENO4.

Figura 2. Exploración de respuestas de IFNy contra grupos de péptidos

Para explorar respuestas de IFNy contra péptidos, se utilizaron cepas de ratones transgénicos con DR4 humano (A) o DR1/HHD (B) y C57BL/6 precursor (C). Los ratones se inmunizaron con grupos de 4-6 péptidos de enolasa citrulinados humanos no solapantes. 14 días después de la vacunación, los ratones se sacrificaron y se recogieron los esplenocitos. Las respuestas ex vivo a la estimulación con péptidos equivalentes de ratón y ser humano se evaluaron mediante ensayo Elispot para IFNy. Como control negativo se utilizaron únicamente respuestas a los medios. Para cada grupo n = 3. La significación estadística de las respuestas a los péptidos en comparación con las respuestas a los medios de cada grupo, se determinó mediante ANOVA con la prueba de Dunnett a posteriori * p<0,5, ** p<0,01, *** p<0,001.

Figura 3. El péptido citrulinado de enolasa 241-260 humana induce fuertes respuestas de IFNy

Se administró una sola inmunización del péptido 241 cit humano a ratones DR4 transgénicos. El ensayo Elispot ex vivo se utilizó para determinar las respuestas de IFNy (A) e IL-10 (B) generadas contra los péptidos citrulinados (cit) equivalentes de ratón y ser humano y las secuencias de tipo silvestre (ts). Las respuestas de IFNy contra péptidos citrulinados en presencia de anticuerpo bloqueante del MHC de clase II (L243), también se evaluaron mediante ensayo Elispot (C). En todos los ensayos, como control negativo, se utilizaron únicamente respuestas a los medios. En cada experimento n = 3. Se muestran los valores de p.

Figura 4. Múltiples péptidos de enolasa citrulinados inducen respuestas de IFNy de bajo nivel

Los ratones recibieron una sola inmunización de péptidos de enolasa humana citrulinada correspondientes a las posiciones 21-40 (A), 126-145 (B) y 316-335 (C). Para determinar las respuestas a IFNy en los ratones DR4 y DR1/HHD, se utilizó el ensayo Elispot ex vivo. Se muestran las respuestas contra los péptidos citrulinados de ratón y ser humano y sus equivalentes de tipo silvestre, cuando están disponibles. Como control negativo se utilizaron únicamente respuestas a los medios. Para cada péptido n = 3. La significación estadística de las respuestas en comparación con el control de los medios se determinó mediante ANOVA con la prueba de Dunnett a posteriori * p<0,5, ** p<0,01, *** p<0,001.

Figura 5. El péptido de enolasa 241cit induce respuestas en ratones DP4.

Durante tres semanas se inmunizaron ratones transgénicos DP4 con tres dosis de péptido de enolasa 241cit. Los esplenocitos se recogieron 21 días después de la administración de la dosis inicial. Para determinar la respuesta a los péptidos de enolasa 241, se utilizó el ensayo Elispot ex vivo.

Figura 6. El péptido de enolasa 241cit humano proporciona una ventaja de supervivencia in vivo en estudios antitumorales

Inmunotransferencia (A) de lisados de líneas celulares B16F1 (carril 1), ID8 (carril 2), TrampC1 (carril 3), Pan02 (carril 4), LLC/2 (carril 5), RTLCL (carril 6), HeLa (carril 7) contra la escalera sondada para a Enolasa (ENO1) y p actina. Las bandas corresponden al tamaño esperado de ENO-1 (47kDa) y p-actina (42kDa).

Ratones DR4 se expusieron al tumor B16DR4. Se muestran la supervivencia (B) y el tamaño del tumor el día 17 después del implante del tumor (C) de los animales de control no inmunizados y de los animales inmunizados con péptido de enolasa 241cit cuatro días después del implante del tumor n = 10, los resultados mostrados son de dos experimentos independientes.

Ratones DR4 se expusieron al tumor B16 que expresa DR4 inducible por IFNy. Se muestran la supervivencia (D) y el tamaño del tumor el día 17 después del implante del tumor (E) de los animales de control no inmunizados y de los animales inmunizados con péptido de enolasa 241 cit cuatro días después del implante del tumor n = 10. Los ratones supervivientes del grupo inmunizado se volvieron a exponer a la misma línea de células tumorales el día 42 después del implante del tumor inicial (indicado con una flecha). Se muestran (F) los datos de supervivencia de los ratones reexpuestos y de un grupo de control previo no expuesto. Se muestran valores de p significativos. Para el volumen del tumor se muestran las medianas y los valores de p determinados mediante la prueba U de Mann Whitney.

Figura 7. El péptido de enolasa 241cit proporciona una ventaja de supervivencia en un modelo de tumor LLC2 Ratones DR4 se expusieron a la línea celular LLC2 de carcinoma de pulmón de Lewis. Cuatro días después de la exposición al tumor, los ratones se inmunizaron con péptido de enolasa 241cit humano. Se muestran los datos de supervivencia de ratones expuestos a LLC2 de tipo silvestre (A) o transfectados LLC2 con DR4 quimérico constitutivo (B). Las diferencias estadísticas entre los ratones de control inmunizados y no inmunizados se determinaron mediante la prueba de Mantel-Cox, se muestran los valores de p, n=10.

Figura 8. La vacunación con ADN de ENO1 induce una respuesta similar a la del péptido de Enolasa241cit Utilizando un cañón de genes, los ratones DR4 recibieron dos inmunizaciones de balas de ADN de ENO1. Catorce (14) días después de la segunda inmunización, los ratones se sacrificaron y se recogieron los esplenocitos. Para determinar las respuestas a IFNy (A) e IL-10 (B) contra la estimulación con péptidos de enolasa 241, se realizaron ensayos Elispot ex vivo. Los ratones se expusieron a la línea celular tumoral B16DR4 que expresaba de manera constitutiva DR4 y después de 4 días se inmunizaron con ADN de ENO1, se muestran los datos de supervivencia (C) y el volumen del tumor el día 11 (D).

Figura 9. Efectos adyuvantes de la respuesta inducida contra el péptido de enolasa 241cit.

Los ratones DR4 recibieron una sola inmunización de enolasa 241cit humana en presencia de adyuvante CpG/MPLA o IFA. Las respuestas de IFNy (A) e IL-10 (B) se determinaron mediante Elispot ex vivo. Para estos estudios n = 3. Se determinaron las respuestas de IFNy en ratones que recibieron una o tres inmunizaciones de 5 |jg o 25 |jg de péptido de enolasa 241cit en presencia de GM-CSF (C). Para estos estudios n = 3. Los ratones d R4 también se expusieron al tumor B16DR4 y se determinó la supervivencia (D) de los animales de control no inmunizados o los animales inmunizados con 3 dosis de 5 jg de péptido de enolasa 241cit con GM-CSF comenzando cuatro días después del implante del tumor n = 10.

Figura 10. Las respuestas se desarrollan rápidamente, lo que sugiere una respuesta preexistente a enolasa 241cit. Los ratones DR4 se inmunizaron con una sola dosis de péptido de enolasa 241cit en CpG/MPLA, 2, 6 o 14 días antes de su sacrificio y para determinar las respuestas de IFNy se utilizaron ensayos Elispotex vivo, n = 3, los valores de p representan diferencias significativas en comparación con las respuestas de péptidos el día 2.

Figura 11. El péptido de enolasa 241cit induce respuestas en PBMC humanas.

Se aislaron PBMc de 6 donantes sanos y se cultivaron con medios, con péptido de enolasa 241cit humana o de enolasa 241ts. Después de 4, 7 y 11 días (A) se realizaron ensayos de timidina para determinar la proliferación. La tipificación de HLA se realizó en cada donante. El día 11 se recogieron los sobrenadantes del donante 4 y utilizando luminex, se analizaron los niveles de citocinas (B). Los datos mostrados representan la respuesta por encima del fondo de control de los medios de cada citocina. Las PBMC del donante 4 se marcaron con CFSE antes de la estimulación con péptidos de tipo silvestre y citrulinados. Las poblaciones de CD4 y CD8 de la población de células marcadas con CFSE, se evaluaron con respecto a las muestras estimuladas con péptido mediante citometría de flujo el día 7 y el día 10 (C).

Figura 12. Alineación de la subunidad a de enolasa (ENOA) humana con secuencias equivalentes de otras especies (ratón, rata, vaca, cerdo, caballo, pollo, gato, perro, conejo y oveja) que representan homología.

Figura 13. Alineación de la subunidad p de Enolasa (ENOB) humana con secuencias equivalentes de otras especies (ratón, rata, vaca, cerdo, caballo, pollo, gato, perro, conejo y oveja) que representan homología.

Figura 14. Alineación de la subunidad de la enolasa y humana (ENOG) con secuencias equivalentes de otras especies (ratón, rata, vaca, cerdo, caballo, pollo, gato, perro, conejo y oveja) que representan homología.

Figura 15. El péptido de enolasa 241-260 humana citrulinada induce respuestas CD4.

Se inmunizaron ratones transgénicos DR4 con péptido 241 cit humano. Para determinar las respuestas de IFNy generadas contra los péptidos citrulinados (cit) equivalentes de ratón y ser humano y las secuencias de tipo silvestre (ts), se utilizó el ensayo Elispot ex vivo. Se evaluaron las respuestas de IFNy contra péptidos citrulinados en presencia de anticuerpo bloqueante del MHC de clase II (L243), de anticuerpo bloqueante de CD4 o de anticuerpo bloqueante de CD8 (A) o en fracciones de células enriquecidas o empobrecidas en CD4 (B). También se analizaron las respuestas de IFNy contra secuencias peptídicas más cortas (C). En todos los ensayos, como control negativo, se utilizaron únicamente respuestas a los medios. En cada experimento n = 3. Se muestran los valores de p.

Figura 16. Caracterización de respuestas en ratones HHDII/DP4.

Durante tres semanas, se inmunizaron ratones DP4 transgénicos con tres dosis de péptido de enolasa 241cit de ser humano (A-E) o de ratón (F). Los esplenocitos se recogieron 21 días después de la administración de la dosis inicial. Para determinar la respuesta a los péptidos de enolasa 241, se utilizó el ensayo Elispot ex vivo. Se evaluó la avidez de las respuestas al péptido humano mediante titulación de péptidos (A), secreción de IL-10 (B) y secreción de Granzima B (C). También se analizaron las respuestas de IFNy en presencia de anticuerpo bloqueante de CD4 (D) y de secuencias peptídicas más cortas (E). En todos los ensayos, como control negativo, se utilizaron únicamente respuestas a los medios. En cada experimento n = 3. Se muestran los valores de p.

Figura 17. El péptido de enolasa 241cit humano proporciona una ventaja de supervivencia in vivo en estudios antitumorales de melanoma B16 en ratones transgénicos HHDII/DP4.

Los ratones transgénicos DP4 se expusieron al tumor B16DP4. Se muestra la supervivencia de los animales de control no inmunizados y animales inmunizados con péptido de enolasa 241 cit cuatro días después del implante del tumor. n = 10. Las diferencias estadísticas entre los ratones de control inmunizados y no inmunizados se determinaron mediante la prueba de Mantel-Cox, se muestran los valores de p, n=10.

Figura 18. El péptido de enolasa 241cit proporciona una ventaja de supervivencia en el modelo de tumor Pan02 (pancreático).

Los ratones transgénicos DR4 se expusieron a la línea de carcinoma pancreático Pan02 que expresaba DR4 constitutivo. Cuatro días después de la exposición al tumor, los ratones se inmunizaron con péptido de enolasa 241cit humano y se comprobó la supervivencia. Las diferencias estadísticas entre los ratones de control inmunizados y no inmunizados se determinaron mediante la prueba de Mantel-Cox, se muestran los valores de p, n=10.

Figura 19. La respuesta contra el péptido de enolasa 241cit puede inducirse en combinación con una variedad de adyuvantes.

Se inmunizaron ratones transgénicos DR4 (A y B) o HHDII/DP4 (C y D) con enolasa 241cit humana en presencia de adyuvante CpG/MPLA (6 |jg cada uno), IFA, Poli I:C (10 |jg) o Imiquimod (25 |jg). Las respuestas de IFNy (A y C) e IL-10 (B y D) se determinaron mediante Elispot ex vivo. Para estos estudios n = 3.

Figura 20. Las respuestas específicas a enolasa 241 cit reactivadas de donantes normales producen predominantemente citocinas Th1 y están mediadas por CD4.

Las PBMC de los donantes 1 y 4 se cultivaron con péptido de enolasa 241cit humana o con péptido de ts y el día 13 se midió la liberación de IFNg en el ensayo Elispot de IFNy (A). Las respuestas de IFNy se analizaron mediante tinción intracelular de citocinas en combinación con marcadores CD4 y CD8 (B). El sobrenadante de los cultivos de las PBMC de los donantes 1,4 y 7 se analizó para determinar los niveles de citocinas los días 2, 5 y 12 mediante ensayo luminex (C).

Figura 21. El péptido de eno 21cit induce respuestas CD4 en ratones.

Se inmunizaron ratones C57BI/6 con péptido de enolasa 21cit humana. Para determinar las respuestas de IFNy generadas contra las secuencias de péptido citrulinado (cit) humano y de tipo silvestre (ts) se utilizó Elispot ex vivo (A). Se evaluaron las respuestas de IFNy contra péptidos citrulinados en presencia de anticuerpo bloqueante de CD4 o anticuerpo bloqueante de CD8 (B). En todos los ensayos, como control negativo, se utilizaron únicamente respuestas a los medios. En cada experimento n = 3. Se muestran los valores de p.

Figura 22. El péptido de eno 11cit induce respuestas CD4 en ratones.

Se inmunizaron ratones C57BI/6 con péptido de enolasa 11 cit humana. Para determinar las respuestas de IFNy generadas contra las secuencias de péptidos citrulinados (cit) de ratón y ser humano y de tipo silvestre (ts), se utilizó ensayo Elispot ex vivo. Se evaluaron las respuestas de IL-10 contra el péptido cit humano (B). Se evaluaron las respuestas de IFNy contra el péptido citrulinado humano en presencia de anticuerpo bloqueante de CD4 o anticuerpo bloqueante de CD8 (C). En todos los ensayos, como control negativo, se utilizaron únicamente respuestas a los medios. En cada experimento n = 3. Se muestran los valores de p.

Métodos

2.1. mAb comerciales

El anticuerpo anti-HLA-DR (clon L243) se purificó de sobrenadante de cultivo de células de hibridoma HB-55 (ATCC, EE. UU.) mediante cromatografía de afinidad con proteína G en Sepharose. Se utilizó el anticuerpo monoclonal de conejo [EPR10864 (B)] contra ENO1. El anti-CD4 de ratón (clon GK1.5) y anti-CD8 de ratón (clon 2.43) se adquirieron en BioXcell, EE.UU.

2.2. Líneas celulares

Las líneas celulares B16F1 de melanoma murino y LLC/2 de carcinoma de pulmón de Lewis murino, se obtuvieron en la ATCC. La línea celular Pan02 murina se obtuvo en el depósito de tumores del Instituto Nacional del Cáncer. La línea celular B16F1 se cultivó en medio RPMI 1640 (GIBCO/b Rl ) y las líneas celulares LLC/2 y Pan02 en DMEM. Ambas se complementaron con FCS al 10 %, L-glutamina (2 mM) y bicarbonato de sodio tamponado a menos que se indique lo contrario.

2.3.lnmunógenos

2.3.1. Péptidos

Los péptidos con una pureza >90 % se sintetizaron en Genscript (Nueva Jersey, EE. UU.). Se conservaron liofilizados en alícuotas de 0,2 mg a -80 °C. El día de su uso se reconstituyeron en PBS a la concentración apropiada.

2.4. Plásmidos

El vector de expresión de mamífero pCMVSPORT6 que codifica el ADNc de longitud completa de la alfa enolasa murina (ENO-1) (IMAGEN ID 5376359) se obtuvo en Source Bioscience.

Para construir el plásmido pVITRO2 Humano HLA-DP4, se sintetizó la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa humana de HlA-DPA*0103 de longitud completa flanqueada por Fspl/EcoRI y la cadena beta de HLA-DPB*0401 flanqueada por sitios de restricción BamHI/Sall. Después de la confirmación de la secuencia, la cadena HLA-DPA*0103 se clonó en el Fspl/EcoRI mcs2 del vector pVITRO2-higro-mcs (Invivogen). La cadena HLA-DPB*0401 se insertó posteriormente en el mcs1 BamHI/Sall del vector de expresión de mamíferos junto con la cadena alfa HLA-DPA*0103 presente en mcs2.

Para generar el plásmido HHDII, el ADNc se sintetizó a partir de ARN total aislado de células EL4-HHD. Esto se usó como molde para amplificar HHD utilizando los cebadores directo e inverso y se subclonó en pCR2.1. La cadena HHD, que comprende la secuencia líder HLA-A2 humana, la molécula de p2-microglobulina (p2M) humana unida covalentemente mediante un enlazador de glicina y serina a los dominios a 1 y 2 de la molécula del MHC de clase 1 HLA-0201 humana y los dominios a3, transmembranario y citoplasmático de la molécula de H-2Db de clase 1 murina, se insertó después en los sitios EcoRV/Hindlll del vector de expresión de mamífero pCDNA3.1 obtenido en Invitrogen. Para generar el plásmido pVitro 2, se generó el ADNc de HLA-DR401 quimérico a partir de ARNm aislado de los esplenocitos de ratones HLA-DR4 transgénicos. También se usó como molde para amplificar las cadenas alfa y beta quiméricas por separado utilizando cebadores directos e inversos que incorporaban sitios fspI/EcoRI y BamHI/SalI, respectivamente. Tras la confirmación de la secuencia, la cadena alfa quimérica de longitud completa que comprende la H2-Ea murina con el dominio de alfa 1 HLA-DRA humano se ligó en el FspI/EcoRI mcs2 del vector pVITRO2-higromcs (Invivogen).

La cadena beta que comprende H2-Eb murino con el dominio Beta 1 de DRB1*0401 humano se insertó después en el BamHI/SalI mcs1 del vector a lo largo de la cadena alfa quimérica.

Para construir el plásmido pDCGAS quimérico HLA-DR401, inducible por IFNy, las cadenas quiméricas alfa y beta, se clonaron en el vector pDCOrig descrito en otra parte (Metheringham et al., 2009) en sustitución de la cadena pesada y ligera. El promotor inducible por IFNy que consiste en una secuencia TATA y el elemento potenciador de repetición directa GAS (secuencia activada por IFNy) se amplificó mediante PCR utilizando, como molde, el vector pGAS-Luc (Agilent). El promotor de CMV dentro de cada casete se escindió y se reemplazó por el promotor inducible por IFNy que impulsa la expresión de las cadenas HLA-DR401 dentro de la estructura del vector pDCOrig.

Se generó ADN plasmídico sin endotoxinas utilizando el kit endofree Qiagen maxiprep (Qiagen, Crawley)

2.5. Transfección

Las células LLC2 se transfectaron utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine (Invitrogen) con 4 |jg del plásmido pVitro 2 quimérico de HLA-DR401 que codifica tanto la cadena alfa como la cadena beta quiméricas de longitud completa de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La línea celular B16F1 previamente inactivada para el MHC de clase II murino mediante tecnología de dedos de cinc (Sigma Aldrich), se transfectó con los plásmidos pDC GAS quimérico HLA-DR401 o pVitro 2 quimérico HLA-DR401 en donde el HLA-DR401 quimérico está bajo expresión del promotor inducible por IFNy o el promotor constitutivo que impulsa un alto nivel de expresión respectivamente. Las células transfectadas se seleccionaron por crecimiento en presencia de higromicina B (300 jg/m l) o zeocina (300 jg/ml). Las líneas se clonaron por dilución limitante y la expresión se confirmó mediante citometría de flujo utilizando el anticuerpo anti-HLA-DR humano conjugado con PE-Cy7 (clon L243) de eBioscience. Las células transfectadas con el plásmido inducible por IFNy, se incubaron durante la noche en ausencia o presencia de IFNy murino (30 ng/ml, Gibco life technologies) antes de la tinción con el anticuerpo.

La línea celular B16F1 previamente inactivada para el MHC de clase I y II murino mediante tecnología de dedos de cinc (Sigma Aldrich), se transfectó utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine (Invitrogen) con 4 jg de cada uno de los plásmidos pCDNA3 HHDII y pVITRO2 Humano HLA-DP4. Las células transfectadas se seleccionaron por crecimiento en presencia de G418 (500 jg/m l) e higromicina B (300 jg/ml). Las líneas se clonaron por dilución limitante y la expresión se confirmó mediante citometría de flujo utilizando los anticuerpos anti-microglobulina beta 2 humano conjugado con FITC y anti-HLA-DR/DP/DQ humano (clon WR18) conjugado con PE de Serotec y Abcam respectivamente.

2.6 Transferencia de Western

Los lisados celulares se prepararon en tampón RIPA que contenía un cóctel inhibidor de proteasa (Sigma) y las proteínas se separaron en un gel NuPAGE Bis-Tris al 4-12 % (Invitrogen) seguido de transferencia a una membrana de PVDF. La membrana se bloqueó durante 1 hora con BSA al 3 % y después se exploró con anticuerpos contra ENO1 humana/ratón (clon EPR10863 (B), Abcam) 1 en 1000 y p actina (clon AC-15, Sigma) 1 en 15000. Las proteínas se visualizaron utilizando el anticuerpo secundario fluorescente IRDye 800RD contra anticuerpo secundario IRDye 680RD de conejo (para ENO-1) y de ratón (para p actina). Se obtuvieron imágenes de las membranas utilizando un escáner Licor Odyssey.

2.7. Inmunizaciones

2.7.1. Protocolo de inmunización

Se utilizaron ratones C57BL/6 (Charles River, RU), ratones HLA-DR4 (Taconic, EE. UU.), ratones HHDII/DR1 (instituto Pasteur, Francia) y la cepa transgénica de ratón HHD/HLA-DP4 descrita en la patente WO2013/017545 A1 (depósito EMMA, Francia), con edades comprendidas entre 8 y 12 semanas que estaban a cargo del personal de la Nottingham Trent University. Todo el trabajo se realizó bajo una licencia de proyecto del Ministerio del Interior. Los péptidos se disolvieron en PBS a 1 mg/ml y después se emulsionaron (una serie de diluciones) con diferentes adyuvantes: CpG y MPLA, 6 pg/ratón de cada uno (Invivogen, RU), adyuvante incompleto de Freund 50 pl/ratón (Sigma, RU), poli I:C 10 pg/ratón (Invivogen, RU), Imiquimod 25 pg/ratón (Invivogen, RU) y GMCSF 10 pg/ratón (Peprotech, RU). Los péptidos (25 pg/ratón) se inyectaron por vía subcutánea en la base de la cola. Se aplicó ADN (1 pg/ratón) sobre partículas de oro de 1,0 pm (BioRad, Hemel Hempstead, RU) utilizando las instrucciones del fabricante y se administró por vía intradérmica con un cañón de genes (BioRad). Por vía intradérmica, se inyectó Homspera (10 nM/ratón) (PeptideSynthetics, RU) con un cañón de genes para la inmunización. A menos que se indique otra cosa, los ratones se inmunizaron el día 0 para la inmunización con péptidos o los días 0 y 7 para la inmunización con cañón de genes. A menos que se indique otra cosa, el día 14, los bazos se extirparon para su análisis para la inmunización con péptidos y el día 20 para la inmunización con péptidos o con cañón de genes.

Para experimentos de exposición a tumores, los ratones se expusieron a 2,5x104 células B16 DR4 o 1x106 células LLC2/l Lc 2 DR4, 2,5x105 células Pan02 DR4 en matrigel o 4x105 células B16 HHDII DP4 por vía subcutánea en el costado derecho 3 días antes de la inmunización primaria y después se inmunizaron como se ha indicado anteriormente. El crecimiento del tumor se comprobó a intervalos de 3-4 días y los ratones se sacrificaron compasivamente una vez que el tumor alcanzó un diámetro >10 mm.

2.8. Análisis de la respuesta inmunitaria

2.8.1. Ensayo Elispot ex vivo

Se realizaron ensayos Elispot utilizando reactivos de captura y detección de IFNy, IL-17 e IL-10 murinos de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Mabtech, Suecia). Resumiendo, los anticuerpos anti IFNy, IL-17 e IL-10, se aplicaron sobre los pocillos de una placa Immobilin-P de 96 pocillos. A los pocillos de la placa, se añadieron por triplicado péptidos sintéticos (a diversas concentraciones) y 5x105 esplenocitos por pocillo. Se añadieron células diana tumorales cuando fue pertinente a 5x104/pocillo por triplicado y las placas se incubaron durante 40 horas a 37 °C. Después de la incubación, el IFNy e IL-10 capturados se detectaron mediante anticuerpos anti-IFNY e IL-10 biotinilados y se revelaron con una fosfatasa alcalina y estreptavidina y un sustrato cromogénico. Las manchas se analizaron y se contaron utilizando un lector de placa automatizado (Cellular Technologies Ltd).

2.8.2 Ensayo de multiplexado Luminex

Para el ensayo de multiplexado Luminex (Invitrogen), se utilizó un procedimiento indirecto de tres etapas para anticuerpos de IgG contra IL-10, IL-17, IFNy, TNFa, IL-2 e IL-4. Se diluyeron sueros convencional, de control y desconocido a 1:2 en tampón diluyente de ensayo al 50 % (Invitrogen) y en RPMI sin suero al 50 %. En cada ensayo se incluyeron diluciones convencionales en serie. Cada dilución de suero convencional, de control y desconocido, se mezcló con un conjunto de microesferas Luminex acopladas en placas de filtración de 96 pocillos (Millipore Multiscreen; Millipore Corporation, Bedford, Mass.) y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación. Las microesferas se recogieron por filtración al vacío y se lavaron con PBST. A cada pocillo se añadió anticuerpo detector biotinilado durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación. Las microesferas se recogieron por filtración al vacío y se lavaron con PBST. A cada pocillo se añadió R-ficoeritrina conjugada con estreptavidina. Después de 30 minutos de incubación y una etapa de lavado, las microesferas se resuspendieron en PBST y se leyeron en un analizador Biorad BioPlex Luminex equipado con una plataforma XY. La adquisición y el análisis de los datos se realizaron con el programa informático Luminex (BioPlex Systems)

2.8.3 Ensayo de proliferación (Timidina)

A través de centrifugación en gradiente de Ficol-Hypaque (Sigma), se aislaron PBMC de sangre heparinizada recién extraída. Las PBMC (1,5 x 106 células/pocillo) se estimularon con péptidos individuales (concentración final 10 pg/ml) en RPMI que contenía suero humano autólogo combinado al 5 %, glutamina 2 mM, HEPES 20 mM y penicilinaestreptomicina (1 %) en un volumen final de 2 ml. La estimulación con derivado proteico purificado, PPD (concentración final 10 pg/ml) sirvió como control positivo para la capacidad proliferativa de PBMC. Como control negativo, se incubaron PBMC solo con medio. Las PBMC se cultivaron a 37 °C en una atmósfera de CO² al 5 % durante 4, 7 y 11 días. Para evaluar la proliferación en estos puntos temporales, se tomaron alícuotas de 100 |jl por triplicado de cada cultivo en un pocillo de fondo redondo de una placa de 96 pocillos y se añadió 3H-timidina (0,0185 MBq/pocillo) y se incubaron a 37 °C durante 8 horas más. Los cultivos se recogieron en placas Unifilter y la incorporación de 3H-timidina se determinó mediante recuento de centelleo p. Los resultados se evaluaron calculando el índice de estimulación (IE) como la relación de la media de las cuentas por minuto (cpm) de los cultivos estimulados con epítopo con respecto a la media de los cultivos no estimulados. El ensayo proliferativo se consideró positivo cuando el IE > 2,5.

2.8.4 Ensayo de proliferación (CFSE)

A través de centrifugación en gradiente de Ficol-Hypaque (Sigma), se aislaron PBMC de sangre heparinizada recién extraída. Las PBMC (1,5 x 106 células/pocillo) se estimularon con péptidos individuales (concentración final 10 jg/m l) en RPMI que contenía suero humano autólogo combinado al 5 %, glutamina 2 mM, HEPES 20 mM y penicilinaestreptomicina (1 %) en un volumen final de 2 ml. Como control negativo, se incubaron PBMC solo con medio. Las PBMC se cultivaron a 37 °C en una atmósfera de CO² al 5 % durante 7 y 10 días. Para evaluar la proliferación en estos puntos temporales, se tomaron muestras de las células y se tiñeron con marcadores de superficie CD4 y CD8 utilizando anticuerpos marcados con PE-Cy5 y efluor 450, respectivamente. Después de la tinción, las células se fijaron y analizaron en un citómetro de flujo Milteny MACSQuant.

2.8.5 Cultivo de PBMC y Elispot de IFNy

A través de centrifugación en gradiente de Ficol-Hypaque (Sigma), se aislaron PBMC de sangre heparinizada recién extraída. Las PBMC (1,5 x 106 células/pocillo) se estimularon con péptidos individuales (concentración final 10 jg/m l) en RPMI que contenía suero humano autólogo combinado al 5 %, glutamina 2 mM, HEPES 20 mM, Penicilinaestreptomicina (1 %), 10 ng/ml de IL-15 humana recombinante y 5 ng/ml de IL-7 humana recombinante en un volumen final de 2 ml. Se añadió IL-2 humana recombinante el día 3 a 20 Ul/ml. El día 13, las células se lavaron y se añadieron al ensayo Elispot de IFNy humano. Los ensayos Elispot se realizaron utilizando reactivos de captura y detección de IFNy humano de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Mabtech, Suecia). Resumiendo, el anticuerpo anti-IFNY se aplicó sobre pocillos de una placa Immobilin-P de 96 pocillos. A los pocillos de la placa, se añadieron por cuadruplicado péptidos sintéticos (a 10 jg/m l) y 1x105 PBMC y las placas se incubaron durante 20 horas a 37 °C. Después de la incubación, El IFNy capturado se detectó mediante un anticuerpo anti-IFNY biotinilado y se reveló con una fosfatasa alcalina y estreptavidina y un sustrato cromogénico. Las manchas se analizaron y se contaron utilizando un lector de placa automatizado (Cellular Technologies Ltd).

2.8.6 Análisis de citocinas intracelulares

Se prepararon cultivos de PBMC como se detalla anteriormente. El día 14, las PBMC se lavaron y se cultivaron con péptido sintético (10 jg/m l) en presencia de brefeldina A durante 20 horas a 37 °C. Las células se tiñeron con marcadores de superficie celular CD4 y CD8 utilizando anticuerpos marcados con PE-Cy5 y efluor450, respectivamente. Posteriormente, las células se fijaron y permeabilizaron y se tiñeron con anticuerpo contra IFNy marcado con PE-Cy7. Después de la tinción, las células se fijaron y analizaron en un citómetro de flujo Miltenyi MACSQuant.

2.9 Análisis inmunohistoquímico

La unión al tejido normal y tumoral se realizó mediante inmunohistoquímica (IHQ) como se describió anteriormente (Durrant et al., 2006). La tinción inmunohistoquímica se realizó en secciones de 4 jm utilizando el sistema de detección de polímeros Novolink (Leica Biosystems, RE7150-K). Brevemente, los portaobjetos se desparafinaron con xileno y se rehidrataron mediante tres cambios de alcohol, la recuperación del antígeno se realizó en tampón citrato (pH 6,0) durante 20 min utilizando un horno microondas. La actividad de la peroxidasa endógena se bloqueó con Peroxidase Block durante 5 min. Los portaobjetos se lavaron con TBS (pH 7,6), seguido de la aplicación de Protein Block durante 5 min. Después de otro lavado con TBS, se aplicó anticuerpo primario, óptimamente diluido, en diluyente para anticuerpos Leica (RE7133), y se incubó durante 60 min. El anticuerpo monoclonal de conejo anti-ENO1, EPR10864 (B), se utilizó a 1/200. Los portaobjetos se lavaron con TBS seguido de incubación con Post-Primary Block durante 30 min seguido de un lavado con t Bs . Durante 30 min. se aplicó polímero Novolink. La solución de trabajo DAB estaba compuesta por cromógeno DAB 1:20 en un tampón de sustrato DAB que se preparó y se aplicó durante 5 min. Los portaobjetos se tiñeron por contraste con hematoxilina Novolink durante 6 min y se deshidrataron.

Los portaobjetos de TMA se evaluaron inicialmente a través de evaluación de la calidad y especificidad de la tinción con microscopio óptico. Después, los portaobjetos se escanearon en imágenes digitales de alta resolución (0,45 jm/píxel) utilizando un escáner de portaobjetos NanoZoomer (Hamamtsu Photonics, Welwyn Garden City, RU) y se accedió utilizando un visor NDP de interfaz basado en web (Nanozoomer Digital Pathology). Se puntuaron con un aumento de 920 utilizando un mínimo de 2400 barridos de alta resolución (91920 1080). Los casos se puntuaron sin conocer el estado de ENO1 y el resultado del paciente y dos personas (MG y MM) los puntuaron. La evaluación de la tinción se basó en una estrategia semicuantitativa utilizando una puntuación histoquímica modificada (puntuación H) que tenía en cuenta la intensidad de la tinción y el porcentaje de células teñidas. Para la intensidad, se utilizó un índice de puntuación de 0, 1,2 y 3 correspondiente a la intensidad de tención negativa, débil, moderada y fuerte, y se estimó subjetivamente el porcentaje de células positivas en cada intensidad. El análisis estadístico se realizó utilizando SPSS 13.0 (SPSS Inc, Chicago). Los valores de corte de estratificación para el análisis de supervivencia se determinaron utilizando el programa informático X-Tile (Camp et al., 2004) y los valores de P <0,05 se consideraron significativos.

Cohortes de pacientes Las poblaciones de estudio incluyen cohortes de series consecutivas de 462 especímenes de cáncer colorrectal archivados (Simpson et al., 2010) (1994-2000; seguimiento medio de 42 meses; con censura estadística en diciembre de 2003; los pacientes con enfermedad ganglionar positiva recibieron quimioterapia antineoplásica habitual con 5-fluorouracilo/ácido folínico), 350 muestras de cáncer de ovario (Duncan et al., 2007) (1982-1997; seguimiento medio de 192 meses: con censura estadística en noviembre de 2005: los pacientes con enfermedad en estadio II a IV recibieron quimioterapia antineoplásica convencional que en años posteriores se basó en platino), 142 muestras de cáncer gástrico (Abdel-Fatah et al., 2013) (2001-2006; seguimiento medio de 66 meses; con censura estadística en enero de 2009; sin quimioterapia) 68 muestras de cáncer de páncreas y 120 muestras de cáncer biliar/ampular (Storr et al., 2012) (1993-2010: seguimiento medio de 45 meses; con censura estadística en 2012; el 25-46 % de los pacientes recibió quimioterapia antineoplásica con 5-fluorouracilo/ácido folínico y gemcitabina) y 220 cánceres de pulmón no microcítico (01/1996-07/2006: seguimiento medio de 36 meses con censura estadística en mayo de 2013; ningún paciente recibió quimioterapia antes de la cirugía, pero 11 pacientes recibieron radioterapia y 9 pacientes recibieron al menos 1 ciclo de quimioterapia antineoplásica posquirúrgica), obtenidas de pacientes sometidos a extirpación quirúrgica electiva de un cáncer demostrado histológicamente en los hospitales de la Universidad de Nottingham o Derby. No se excluyeron casos a menos que el material/datos clínico-patológicos relevantes no estuvieran disponibles. Este estudio retrospectivo se basó en una serie consecutiva de 902 pacientes con carcinomas de mama invasivos primarios que fueron diagnosticados de 1987 a 1998 y entraron en la serie de carcinomas de mama primarios de Nottingham Tenovus. Ésta es una serie bien caracterizada de pacientes menores de 71 años (mediana de 55 años) con seguimiento prolongado. Todos los pacientes fueron tratados de manera uniforme en un solo centro y se han investigado con respecto a una amplia gama de expresión de proteínas.

Todos los pacientes recibieron tratamiento quirúrgico convencional de mastectomía o escisión local amplia con radioterapia. Antes de 1988, los pacientes no recibieron terapia antineoplásica sistémica. Desde 1988 en adelante, los pacientes fueron seleccionados para el tratamiento antineoplásico sistémico basándose en la puntuación del NPI y en el estado de receptores hormonales. Los pacientes con un NPI<3,4 no recibieron terapia antineoplásica; los que tenían una puntuación antineoplásica superior a 3,4 recibieron tamoxifeno si eran positivos para receptores de estrógeno (±goserelina si eran mujeres premenopáusicas) o ciclofosfamida, metotrexato y fluorouracilo clásicos, si eran negativos para el RE (receptor de estrógenos) y lo suficientemente aptos para tolerar la quimioterapia. Los datos de supervivencia se mantuvieron de forma prospectiva. La supervivencia específica del cáncer de mama (BCSS, breast cancer specific survival) se definió como el tiempo (en años) desde la fecha del tratamiento quirúrgico primario hasta el momento de la muerte por cáncer de mama. La supervivencia fue objeto de censura si el paciente seguía con vida, si su seguimiento era imposible (n = 73) o si moría por otras causas.

Ejemplo 1. Alineación de secuencias y homología de enolasas.

En los mamíferos hay cuatro isoformas de la enzima enolasa, ENO1 (A); ENO2 (B), ENO3 (G) y ENO4 que están codificadas por cuatro genes distintos. Están sumamente conservadas y tienen un alto grado de homología de aminoácidos (Figura 1).

Ejemplo 2. Respuestas de CD4 a Enolasa citrulinada

La secuencia del péptido de alfa-enolasa humano se dividió en 20 meros (unidades monoméricas) solapantes. Se seleccionó cualquiera de los 20 meros que contuviese una arginina y los restos de arginina se reemplazaron por citrulina (cit). En la Tabla 1 se resumen los péptidos de 20 meros seleccionados.

Tabla 1. Pé tidos de enolasa utilizados.

continuación

Exploración de respuestas del péptido de enolasa

Se realizó una exploración para identificar posibles epítopos de enolasa citrulinada en ratones. Los ratones se inmunizaron con grupos de 4-6 péptidos citrulinados humanos. Para reducir el efecto de la posible reactividad cruzada, los péptidos de cada grupo se eligieron de modo que no contuvieran ninguna secuencia de aminoácidos solapante. Cada grupo recibió una administración de una sola inmunización que contenía 20 |jg de cada péptido y CpG/MPLA como adyuvante. Después de 14 días, los ratones se sacrificaron y se evaluaron las respuestas inmunitarias contra cada péptido dentro del grupo de inmunización mediante ensayo Elispot ex vivo (Figura 2). Además, los esplenocitos se exploraron frente a las secuencias equivalentes murinas. Anteriormente hemos demostrado que los péptidos citrulinados pueden inducir respuestas en la cepa de ratón transgénico DR4. Dado que diferentes cepas de ratón tienen diferentes repertorios de MHC, se utilizaron diversas cepas para la exploración. Las respuestas peptídicas se evaluaron en ratones C57BL/6 así como en cepas transgénicas que expresaban DR4 o HHD/DR1 humanos en un fondo C57BL/6 (véase el apartado de Materiales y Métodos).

Se detectaron respuestas significativas de IFNy contra diversos péptidos diferentes. En los ratones DR4, el grupo que contenía el péptido de enolasa 241-260 citrulinada, indujo una respuesta significativa a 241cit humano (p <0,05) y 241cit de ratón (p <0,0001). Ningún otro péptido mostró respuestas de IFNy significativas en ratones d R4. En los ratones HHD/DR1, el grupo tratado con el péptido de enolasa 126-145 indujo una respuesta significativa contra 126cit de ser humano (p <0,05) pero no contra 126cit de ratón. El grupo tratado con el péptido de enolasa 316-335 indujo una respuesta significativa contra 316cit de ser humano(p <0,05) pero no contra 316cit de ratón. El conjunto que contenía el péptido de enolasa 1-20 no indujo ninguna respuesta significativa contra péptido humano, pero indujo una respuesta contra 1cit de ratón (p <0,05). En los ratones C57BL/6, el grupo que contenía el péptido de enolasa 21-40 indujo una respuesta significativa contra 21cit de ser humano(p <0,05) pero contra 21cit de ratón. El grupo con el péptido de enolasa 126-145 indujo una respuesta significativa contra 126cit de ratón (p <0,05) pero no contra 126cit de ser humano. El grupo tratado con el péptido de enolasa 261-280 indujo una respuesta significativa contra 261cit de ser humano(p <0,05) pero no contra 261cit de ratón. Esto sugiere que los péptidos 21-40, 126-145, 241-260 y 316­ 335, justificaron una investigación adicional.

A partir de la exploración inicial, la inmunización con enolasa 241cit en ratones DR4 indujo la respuesta inmunitaria más fuerte. Por lo tanto, este péptido se investigó adicionalmente. Ratones DR4 recibieron una sola inmunización con 25 jg del péptido 241cit de ser humano y CpG/MPLA. El ensayo Elispot ex vivo en esplenocitos mostró una respuesta de IFNy significativa contra péptidos citrulinados en comparación con controles de medios tanto para la secuencia de ratón (p = 0,0008) como para la secuencia de ser humano (p = 0,0124) (Figura 3A). La secuencia del ratón es en realidad la misma secuencia que aa241-260 de ENO2 y ENO3, por lo que sigue siendo un autoantígeno. Curiosamente, ni la secuencia de tipo silvestre (ts) de ser humano ni la de ratón, en donde el resto de arginina en la posición 253 no se ha reemplazado por una citrulina, produjo una respuesta inmunitaria. Esto confirmó que la enolasa 241 cit indujo una respuesta de IFNy específica de citrulina en ratones DR4.

Para determinar el tipo de respuesta a las citocinas generadas por el péptido de enolasa 241 cit ex vivo también se ensayó la IL-10. En los ensayos ELISpot no se observó ningún aumento significativo en la producción de IL-10 en respuesta a la estimulación peptídica (Figura 3B).

Se ha demostrado que las respuestas específicas de los péptidos previamente citrulinados están mediadas por CD4. Para determinar si la respuesta a 241cit es dependiente de CD4, se realizó un ensayo Elispot con un anticuerpo bloqueante del MHC de clase II humano (clon L243) (Figura 3C). La respuesta de IFNy se redujo significativamente por L243 en respuesta tanto a la enolasa 241cit humana (p = 0,0171) como a la 241cit de ratón (p = 0,0023). Para confirmar adicionalmente que las respuestas específicas de 241 cit estaban mediadas por CD4, se realizó un ensayo Elispot que incluía un anticuerpo bloqueante de CD4 o CD8 murino (clon GK1.5 o clon 2.43 respectivamente) o utilizando fracciones de células enriquecidas o empobrecidas en CD4. Las respuestas a la enolasa 241cit humana se redujeron significativamente en presencia del anticuerpo bloqueante de CD4 pero no del anticuerpo bloqueante de CD8 (Figura 15A). Las respuestas también estuvieron presentes en la fracción enriquecida en CD4 pero no en la fracción empobrecida en c D4 (Figura 15B). Dado que la enolasa 241-260 es un péptido largo, buscamos determinar la secuencia óptima de 15 meros que reconoce las respuestas. Se analizaron dos péptidos de 15 meros que abarcaban la secuencia 241-260 para determinar las respuestas con respuestas específicas estimulantes de aa241-255 pero sin respuesta a aa246-260 (Figura 15C).

Para confirmar las respuestas de frecuencia más baja observadas en las exploraciones iniciales, los ratones DR4, C57BI/6 y HHD/DR1 recibieron una sola inmunización de los péptidos de enolasa citrulinados humanos correspondientes a las secuencias en las posiciones 21-40, 126-145 y 316-335 (Figura 4). La enolasa 21cit indujo un nivel bajo pero una respuesta significativa en ratones DR4 contra la secuencia de ratón (p <0,01) pero no contra la de ser humano. En ratones C57BI/6 se observaron fuertes respuestas de IFNy que responden al péptido citrulinado pero no al péptido de ts (Figura 21a). Estas parecen estar mediadas por CD4 ya que se bloquean eficazmente con un anticuerpo bloqueante de CD4 pero no con un anticuerpo bloqueante de c D8 (Figura 21b). La enolasa 126cit indujo una respuesta significativa de bajo nivel contra péptido humano en ratones DR4 (p <0,05) pero no en ratones DR1/HHD. La enolasa 316cit indujo una respuesta moderada contra la secuencia humana pero no contra la de ratón, en ratones tanto DR4 (p<0,01) como DR1/HHD (p<0,01).

Las secuencias de enolasa también estaban sujetas a análisis informático con respecto a secuencias de péptidos con alta afinidad de unión al MHC de clase II humano y murino utilizando el programa de predicción IEDB en línea. Esto sugirió que la secuencia de aa11-25 era fuerte para el MHC de clase II (I-Ab) murino, por lo que se analizó el péptido aa11-25 citrulinado para determinar las respuestas en ratones C57BI/6. Los ratones mostraron respuestas de IFNy a este péptido citrulinado que reaccionó en cruzado con la secuencia equivalente de la secuencia murina con una reactividad mínima contra el péptido de ts (Figura 22a). No se observaron respuestas de IL-10 contra el péptido eno11 citrulinado (Figura 22b). La respuesta de IFNy específica de enolasa 11cit fue mediada por células CD4 ya que bloquearlas con un anticuerpo bloqueante de CD4 anulaba la respuesta mientras que el uso de un anticuerpo bloqueante de CD8 no tuvo efecto sobre la respuesta (Figura 22c).

Para determinar si HLA-DP4 también podría presentar el péptido de enolasa 241 cit, se utilizaron ratones DP4 transgénicos. Se inmunizaron ratones DP4 con tres dosis de péptido de enolasa 241 citrulinada de ser humano o de ratón. Las respuestas de IFNy se determinaron mediante ensayo Elispot (Figura 5). Los ratones inmunizados con los péptidos de enolasa 241 cit humana mostraron respuestas tanto a la enolasa 241cit humana (p <0,0001) como a la 241cit de ratón (p <0,0001) y mostraron respuestas de IFNy aumentadas en comparación con los péptidos de tipo silvestre (Figura 5a ). Estas respuestas muestran una avidez de entre 1 y 0,1 pg/ml de péptido (Figura 16A). Las células de los ratones inmunizados con el péptido 241-260cit humano muestran liberación de granzima B pero no de IL-10 en respuesta al péptido cit pero no al péptido de ts (Figura 16B y C). Las respuestas específicas para el péptido 241-260cit humano en los ratones DP4 también se bloquean con un anticuerpo bloqueante de CD4 pero no con un anticuerpo bloqueante de CD8 y muestran reactividad cruzada con un péptido más corto que abarca el tramo de aa241-255 (Figura 16D y E). La inmunización de ratones transgénicos DP4 con el péptido de enolasa 241-260 murino también induce respuestas específicas contra el péptido citrulinado pero no contra el de tipo silvestre (Figura 16F).

Ejemplo 3: El péptido de enolasa cit presentado en las células tumorales puede dirigirse a la terapia tumoral.

Ya se había establecido mediante transferencia Western que las líneas celulares de melanoma B16F1 y de carcinoma de pulmón de Lewis expresaban de manera constitutiva alfa-enolasa (Figura 6A). A continuación, se evaluó in vivo el efecto antitumoral de la inmunización con el péptido de enolasa 241 cit. Se evaluó el efecto de la inmunización con enolasa sobre el crecimiento de la línea celular de melanoma B16 de ratón transfectada con DR4 humano constitutivo (B16DR4). Los ratones se expusieron a B16DR4, 3 días antes de la inmunización con el péptido de enolasa 241cit. Los ratones inmunizados con el péptido de enolasa 241cit mostraron una ventaja de supervivencia significativa sobre los ratones de control (Figura 6B). Los ratones no inmunizados mostraron una supervivencia del 15 % después de 45 días, mientras que los ratones inmunizados con enolasa 241cit mostraron una supervivencia del 50 % (p=0,0001). El volumen del tumor (Figura 6C) también fue significativamente más pequeño en los ratones inmunizados con enolasa 241cit (mediana de 0 mm3) en comparación con el grupo de control (mediana de 49 mm3) el día 17 después del implante del tumor (p=0,0043).

Dado que también se han demostrado respuestas al epítopo 241-260cit en ratones DP4, se expusieron ratones transgénicos DP4 con la línea de melanoma B16 de ratón que expresaba la DP4 humana constitutiva (B16DP4) y posteriormente se inmunizaron con el péptido de enolasa 241cit. Los ratones inmunizados con péptido de enolasa 241cit mostraron una ventaja de supervivencia significativa (p=0,0058) sobre los ratones no inmunizados con tasas de supervivencia después de 60 días de 70 % y 10 % respectivamente (Figura 17).

Para determinar si la supervivencia se ve afectada por la expresión constitutiva del MHC de clase II en esta línea de células tumorales, el efecto antitumoral se evaluó en células B16 en donde la expresión de HLA-DR4 es inducible por IFNy (iDR4). Los ratones se expusieron a B16iDR44 días antes de la inmunización con el péptido de enolasa 24lcit (Figura 6D). La supervivencia aumentó significativamente en el grupo inmunizado con enolasa 241cit (90 %) en comparación con los animales de control no inmunizados (supervivencia de 0 %) el día 42 (p<0,0001). El volumen del tumor el día 17 después del implante del tumor (Figura 6E) también fue significativamente más pequeño en los ratones inmunizados con enolasa 241cit (mediana de 0 mm3) en comparación con los ratones de control no inmunizados (mediana de 65 mm3, p=0,0048). Dado el alto porcentaje de supervivencia en el grupo inmunizado, estos ratones volvieron a exponerse a B16iDR4 el día 42 para ver si se había establecido la memoria. Los nuevos ratones no tratados también se expusieron al tumor como grupo de control. Los supervivientes inmunizados con enolasa mostraron una ventaja de supervivencia significativa tras la reexposición en comparación con los ratones de control no tratados previamente (Figura 6F). Treinta y nueve (39) días después de la reexposición, la supervivencia en el grupo inmunizado con enolasa 241 cit fue del 67 %, mientras que todos los del grupo de control murieron el día 29 (p=0,01l2).

Para determinar si este efecto antitumoral es específico del modelo B16DR4, a continuación, los ratones se expusieron a la línea celular LLC2 de carcinoma de pulmón de Lewis (Figura 7A). Los estudios preliminares sugirieron que se requería un mayor número de células implantadas para obtener un crecimiento constante de las células LLC2 en comparación con las células B16 (datos no mostrados). Por este motivo, en nuestras manos el modelo LLC2 es más agresivo que el modelo B16. Los ratones se expusieron a LLC2 precursor o LLC2 transfectado para expresar de manera constitutiva DR4 (LLCDR4) cuatro días antes de la inmunización con el péptido de enolasa 241 cit. Los datos de supervivencia muestran que la inmunización con enolasa 241cit proporcionó una ventaja de supervivencia contra el tumor LLCDR4 (p=0,0142) sobreviviendo el 40 % de los ratones hasta el día 58 en comparación con el control en donde todos los ratones murieron el día 48. Sin embargo, en los ratones expuestos al tumor LLC2 parental, aunque que los ratones se inmunizaron con enolasa 241cit mostraron un aumento pequeño pero significativo en el tiempo de supervivencia (p=0,0005). Estos resultados sugieren que la expresión de DR4 humano en células tumorales es importante para el rechazo de tumores en este modelo.

La enolasa también se expresa a través de la línea de tumor pancreático Pan02 (Figura 6A). Esta línea se genomodificó para expresar de manera constitutiva HLA-DR4 y los ratones transgénicos DR4 se expusieron a un tumor seguido 4 días más tarde de inmunización con el péptido de enolasa 241 cit. Los ratones inmunizados con el péptido de enolasa 241cit muestran una supervivencia significativamente mejorada (p=0,0076) en el modelo Pan02 d R4 en comparación con ratones DR4 de control no inmunizados. El 50 % de los ratones muestra supervivencia el día 60 en comparación con ninguno de los ratones no inmunizados (Figura 18).

Ejemplo 4. La inmunización con ADN da como resultado respuestas a la enolasa citrulinada

Dado que las APC pueden citrulinar epítopos de manera constitutiva, es posible que una construcción de ADN que codifique una enolasa pueda citrulinarse y estimular una respuesta. Por lo tanto, se inmunizaron ratones transgénicos HLA-DR4 con una construcción de ADN que codificaba la enolasa de ratón. Se exploraron linfocitos T estimulados de estos ratones in vitro para determinar respuestas de IFNy, tanto contra el péptido enolasa 241 citrulinada como no citrulinada. La Figura 8A muestra que los ratones solo respondieron al péptido de ratón citrulinado (media: IFNy 180/millones de esplenocitos; p=0,0001). No se observó respuesta contra IL-10 (Figura 8B).

A continuación, se evaluó el efecto antitumoral de la inmunización con ADN de enolasa in vivo. Los ratones se expusieron a B16DR4 cuatro días antes de la inmunización con ADN de enolasa. Los ratones inmunizados con ADN de enolasa mostraron una ventaja de supervivencia significativa sobre los ratones de control (Figura 8C). Los ratones no inmunizados mostraron una supervivencia del 15 % después de 45 días, mientras que los ratones inmunizados con ADN de enolasa mostraron una supervivencia del 60 % (p=0,0001). El volumen del tumor (Figura 8D) también fue significativamente más pequeño en los ratones inmunizados con ADN de enolasa (mediana de 20 mm3) en comparación con el grupo de control (mediana de 150 mm3) el día 17 después del implante del tumor (p=0,0088).

Ejemplo 5. Determinación de si las respuestas de CD4 a los péptidos de enolasa varían cuando se combinan con diferentes adyuvantes y a diferentes dosis

El péptido de enolasa 241cit induce una fuerte respuesta de IFNy cuando se administra como una sola dosis de 25 |jg con el adyuvante CpG/MPLA. Se investigó el efecto del adyuvante y el régimen de dosis sobre la respuesta generada. Los ratones se inmunizaron con una sola dosis de péptido de enolasa 241cit con CpG/MPLA o adyuvante incompleto de Freund (IFA) como adyuvante. Las respuestas de If Ny a péptidos de enolasa 24lc it fueron detectadas por Elispot cuando se utilizaba CpG/MPLA (p = 0,0028) como adyuvante, pero no se observó ninguna respuesta de IFNy cuando se utilizaba IFA como adyuvante (Figura 9A). Cuando el péptido de enolasa 241cit se administraba con IFA se detectaron respuestas de IL-10 por Elispot (p<0,0001) pero no se detectaban cuando se administraba con CpG/MPLA (Figura 9B). Además de estas respuestas de adyuvantes en combinación con otros agonistas de TLR, se evaluaron Poli I:C (TLR3) e imiquimod (TLR7) en ratones transgénicos DR4 y DP4. La combinación con poli I:C induce respuestas de IFNy pero no de IL-10 (Figura 19) en ambas cepas de ratón. El péptido de enolasa 241cit combinado con imiquimod induce respuestas de IFNy en ratones transgénicos DP4 pero no en ratones transgénicos DR4 (Figura 19). Esto sugiere que el tipo de respuesta de citocinas generada por la inmunización con el péptido de enolasa 241 cit puede verse fuertemente afectado por el adyuvante seleccionado.

A continuación, se evaluaron las respuestas de dosis a la inmunización con GM-CSF. Los ratones recibieron una sola o tres inmunizaciones de 25 |jg o 5 |jg de péptido de enolasa 241cit. Las respuestas de IFNy se evaluaron mediante ensayo Elispot (Figura 9C). Se pudieron observar respuestas detectables después de 1 o 3 dosis con 25 jg de péptido. A continuación, los ratones se expusieron a B16DR4 y después recibieron tres dosis de 5 jg de enolasa en GM-CSF durante tres semanas, para determinar si esto es suficiente para inducir una respuesta antitumoral (Figura 9D). Los ratones inmunizados con enolasa 241 cit tuvieron una ventaja de supervivencia significativa sobre los ratones de control (p=0,0045) sobreviviendo el 70 % de los animales el día 45 en comparación con el 0 % en el grupo de control el día 28.

Ejemplo 6. Respuestas de memoria de enolasa 241cit

La capacidad de los diferentes adyuvantes para polarizar las respuestas a la inmunización con el péptido de enolasa 241 cit puede sugerir la plasticidad de la población de linfocitos T implicados. Esto puede indicar una respuesta preexistente o de memoria. Por lo tanto, a continuación, se determinó la velocidad con la que se desarrollaba una respuesta de enolasa cit. Los ratones se inmunizaron con una sola dosis de péptido de enolasa 241cit en CpG/MPLA 2, 6 o 14 días antes de ser sacrificados. Para determinar las respuestas de iFNy (Figura 10), se utilizaron ensayos Elispot ex vivo. La inmunización con la versión del péptido de ratón indujo una respuesta de IFNy que pudo detectarse 2 días después. No hubo diferencias significativas entre las respuestas observadas después de 2, 6 o 14 días. La inmunización con el péptido de enolasa 241cit humano condujo a una respuesta de IFNy que fue detectable después de 6 días. Las respuestas aumentaron significativamente después de 6 (p=0,0009) y 14 (p=0,0092) días en comparación con las respuestas después de 2 días. Estos resultados sugieren que puede haber una respuesta preexistente al péptido de enolasa 241 cit que es específica para el péptido murino endógeno.

Ejemplo 7. Respuestas en donantes humanos sanos

La respuesta del ratón al péptido de enolasa 241 cit también puede detectarse tan pronto como 2 días después de la inmunización. Esto planteó la cuestión de si los seres humanos tendrían una respuesta preexistente a los péptidos de enolasa 241cit que pudiese detectarse. Para investigar esto, se aislaron PBMC de 6 donantes sanos y se cultivaron en presencia de péptidos de enolasa de ser humano. Se realizaron ensayos de proliferación de timidina en las células después de 4, 7 y 11 días y se calculó el índice de proliferación de cada uno de ellos (Figura 11A). De los 6 donantes, 5 mostraron proliferación al péptido de enolasa 241 cit en al menos uno de los días de la muestra. Por ejemplo, El donante 1 mostró una respuesta proliferativa a enolasa 241cit el día 11 (media de 20,4) y el día 7 (media de 28,6) pero no el día 4 (media de 0,8). Las respuestas a enolasa 241ts fueron consistentemente bajas el día 11 (media de 0,9), 7 (media de 1,2) y 4 (media de 0,3). En cambio, el donante 2 mostró solo una respuesta de bajo nivel el día 11 (media de 2,7) y el donante 6 no respondió. Para cada donante, se determinaron los tipos de HLA que se muestran en la figura.

El donante 4 presentó un índice de proliferación alto el día 4 (media de 12,5) y el día 7 (media de 28) y el día 11 (4,4). Este donante fue elegido para un análisis adicional. Se tomaron los sobrenadantes de las células en cada punto temporal y a través de Luminex se analizaron los niveles de citocinas. Para cada citocina, se calculó la respuesta por encima del nivel de fondo del control de sólo medios (Figura 11B). El IFNy y la IL-10 dieron respuestas específicas de péptidos citrulinados que aumentaron con el tiempo. Se observó algún aumento en los niveles de IL-17, Granzima B y TNFa en las células estimuladas de tipo silvestre; sin embargo, estas respuestas fueron mayores en las muestras estimuladas con péptidos citrulinados.

A continuación, las PBMC de 4 donantes se marcaron con éster de succinimidil-carboxifluoresceína (CFSE) antes del cultivo ex vivo en presencia de péptidos. Los días 7 y 10, las células se retiraron y se tiñeron con anticuerpos anti-CD8 y anti-CD4 conjugados con fluorocromos y se analizaron mediante citometría de flujo (Figura 11C). De la población de CFSEbajo que prolifera, entre el 73-96 % de las células eran CD4+ y el 0-2 % eran Cd 8+. El péptido de enolasa 241 cit mostró mayores proporciones de células CD4+CFSEbajo en comparación con el péptido de enolasa 241ts. El día 10, el 15 % de los linfocitos de enolasa 241cit eran CD4+CFSEbajo mientras que el 1 % de los péptidos de enolasa 241ts eran CD4+CFSEbajo

Las respuestas de IFNy también se han mostrado mediante ensayo Elispot de IFNy en el cual, las PBMC cultivadas durante 13 días en péptidos de enolasa 241 cit o ts, se reestimularon con péptido de enolasa 241 citrulinado o de ts y se midió la liberación de citocinas. La Figura 20A muestra los resultados del ensayo Elispot de IFNy en los donantes 1 y 4. Las células de ambos donantes muestran respuestas al péptido citrulinado pero no al péptido de ts. Un análisis adicional de estas respuestas mediante tinción intracelular de citocinas revela que las respuestas de IFNy están mediadas por CD4. La Figura 20B muestra la tinción intracelular de citocinas en las PBMC del donante 4 cultivadas durante 13 días en péptido de enolasa 241 cit y reestimuladas con péptido citrulinado o con péptido de ts. Se observan células CD4 positivas para IFNy tras la estimulación con el péptido citrulinado (0,44 %) pero no con el péptido de ts. Los datos de Luminex de cultivos en 3 donantes muestran respuestas de IFNy al péptido de enolasa 241 citrulinado con una respuesta mínima al péptido de ts y bajo nivel de IL-10, Respuestas de TNFa o IL-17 (Figura 20C).

Estos resultados sugieren que los seres humanos sanos pueden desarrollar una respuesta proliferativa de CD4 al péptido de enolasa 241cit que es específico de citrulina y capaz de producir citocinas Th1.

Ejemplo 8. Inmunohistoquímica

La citrulinación se lleva a cabo mediante enzimas PAD y en particular las enzimas PAD2 y PAD4. Estas requieren altos niveles de calcio y suelen activarse en células muertas o moribundas o en células en proceso de autofagia. Las células sanas no deben expresar proteínas citrulinadas, pero los tumores debidos a hipoxia o estrés nutricional activarán la autofagia y la enolasa citrulinada. Por lo tanto, para detectar la expresión de la enolasa se tiñeron tumores colorrectales, gástricos, pulmonares, mamarios y ováricos.

Tumores colorrectales: Se tiñeron 232 tumores colorrectales con un anticuerpo monoclonal específico de ENO-1 (Tabla 2). Un 28 % de los tumores no se tiñó, un 56 % mostró tinción débil (puntuación H de 1-100), un 13 % mostró tinción moderada (puntuación H de 101-200) y un 3 % mostró tinción fuerte (puntuación H de 201-300), la mayor parte de las células se tiñeron intensamente.

Tab o-1

Tumores gástricos: Se tiñeron 70 tumores gástricos con un anticuerpo monoclonal específico de ENO-1 (Tabla 3). Un 16 % de los tumores no se tiñó, un 62 % mostró tinción débil (puntuación H de 1-100), un 19 % mostró tinción moderada (puntuación H de 101-200) y un 3 % mostró tinción fuerte (puntuación H de 201-300), la mayor parte de las células se tiñeron intensamente.

Tabla 3: Tinción inmunohistoquímica de diversos tumores gástricos para detectar Eno-1 Ne ativa Baa Moderada Alta

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Tumores de pulmón no microcíticos: Se tiñeron 223 tumores de pulmón no microcíticos con un anticuerpo monoclonal específico de ENO-1 (Tabla 4). Un 20 % de los tumores no se tiñó, un 59 % mostró tinción débil (puntuación H de 1­ 100), un 17 % mostró tinción moderada (puntuación H de 101-200) y un 4 % mostró tinción fuerte (puntuación H de 201-300), la mayor parte de las células se tiñeron intensamente.

Tumores de ovario: Se tiñeron 223 tumores de ovario con un anticuerpo monoclonal específico de ENO-1 (Tabla 5). Un 42 % de los tumores no se tiñó, un 51 % mostró tinción débil (puntuación H de 1-100), un 2 % mostró tinción moderada (puntuación H de 101-200) y un 5 % mostró tinción fuerte (puntuación H de 201-300), la mayor parte de las células se tiñeron intensamente.

Tabla 5: Tinción inmunohistoquímica de diversos tumores de ovario para detectar Eno-1 Ne ativa Baa Moderada Alt

0

0

Tumores de mama: Se tiñeron 858 tumores de mama con un anticuerpo monoclonal específico de ENO-1 (Tabla 6). Un 28 % de los tumores no se tiñó, un 19 % mostró tinción débil (puntuación H de 1-100), un 36 % mostró tinción moderada (puntuación H de 101-200) y un 17 % mostró tinción fuerte (puntuación H de 201-300), la mayor parte de las células se tiñeron intensamente.

Tabla 6: Tinción inmunohistoquímica de diversos tumores de mama para^ detectar Eno-1 Ne ativa Baa Moderada Alta

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Tumores de mama negativos a receptores de estrógeno: Se tiñeron 249 tumores de mama negativos a receptores de estrógeno con un anticuerpo monoclonal específico de ENO-1 (Tabla 7). Un 8 % de los tumores no se tiñó, un 14 % mostró tinción débil (puntuación H de 1-100), un 55 % mostró tinción moderada (puntuación H de 101-200) y un 23 % mostró tinción fuerte (puntuación H de 201-300), la mayor parte de las células se tiñeron intensamente.

Tabla 7: Tinción inmunohistoquímica de diversos tumores de mama negativos a receptores de estrógeno para r En -1

Ejemplo 9 Homología de enolasas entre diferentes especies.

Las enolasas están sumamente conservadas entre, ratón, perro, oveja, vaca, caballo, cerdo y ser humano (figura 12­ 14). Como la vacuna induce respuestas de linfocitos T en seres humanos y en ratones y respuestas antitumorales en ratones, puede suponerse que se observarán respuestas similares en otras especies.

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Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido que consiste en:

i) una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

VIGMDVAASEFFcitSGKYDLD,

VIGMDVAASEFYcitSGKYDLD,

EVDLFTSKGLFcitAAVPSGAS,

EVDLYTAKGLFcitAAVPSGAS,

KGVPLYcitHIADLAGNSEVIL,

KGVPLYcitHIADLAGNPEVIL,

VGDDLTVTNPKcitIAKAVNEK o

VGDDLTVTNPKcitIAKAASEK

en donde "cit" representa citrulina, o

ii) la secuencia de aminoácidos de i), con la excepción de 1, 2 o 3 cambios de aminoácidos seleccionados de sustituciones, inserciones y/o deleciones en una posición que no es de citrulina, en donde el péptido puede utilizarse para generar una respuesta inmunitaria contra tumores; o

iii) una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de al menos 80 % con la secuencia de aminoácidos de i), en donde los cambios de aminoácidos están en una posición que no es de citrulina y en donde el péptido puede utilizarse para generar una respuesta inmunitaria contra tumores; o

iv) la secuencia de aminoácidos: IFDScitGNPTVEVDLY.

2. Una fracción de unión que se une al péptido de la reivindicación 1, en donde la fracción de unión es un anticuerpo.

3. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la reivindicación 1 y/o la fracción de unión de la reivindicación 2, en combinación con un transportador farmacéuticamente aceptable.

4. El péptido de la reivindicación 1 y/o la fracción de unión de la reivindicación 2, para su uso en medicina.

5. El péptido y/o la fracción de unión para el uso de la reivindicación 4, para su uso en el tratamiento del cáncer.

6. El péptido y/o la fracción de unión para el uso de la reivindicación 5, en donde el cáncer es cáncer de mama, incluido el cáncer de mama negativo a receptores de estrógeno, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de ovario, incluido el carcinoma de endometrio, cáncer de páncreas, incluido el adenocarcinoma ductal pancreático, leucemia, melanoma, cáncer de cabeza y cuello o de pulmón.

7. El péptido y/o la fracción de unión para el uso de la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en donde el uso es uso humano o veterinario.