JP2022058412A - 修飾自己エピトープに対する抗腫瘍免疫応答 - Google Patents

Abstract

【課題】がん免疫療法のための標的として使用することができる修飾ペプチドを提供する。【解決手段】本発明は、がん免疫療法のための標的として使用することができる修飾シトルリン化エノラーゼペプチドに関する。このペプチドは、ワクチンとしてまたはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）療法のための標的として使用することができる。そのようなワクチンまたはｍＡｂは、がんの処置において使用してもよい。【選択図】なし

Description

本発明は、全般的に、がん免疫療法のための標的として使用することができる修飾ペプチドに関する。修飾ペプチドは、シトルリン化エノラーゼペプチドであってもよい。この修飾ペプチドは、ワクチンとしてまたはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）療法のための標的として使用することができる。そのようなワクチンまたはｍＡｂは、がんの処置において使用してもよい。

効果的であるためには、がんワクチンは、寛容性を破壊し、免疫抑制腫瘍環境を克服することができる強力な免疫応答を誘導する必要がある。腫瘍破壊を媒介するＣＤ４ Ｔ細胞の重要性が最近着目されてきたが、自己特異的ＣＤ４応答の誘導はより難しいことが分かってきた。対照的に、修飾自己エピトープを認識するＣＤ４ Ｔ細胞は、いくつかの自己免疫疾患、たとえば、関節リウマチ（ＲＡ）、コラーゲンＩＩ誘導関節炎、サルコイドーシス、セリアック病、および乾癬の病理において役割を果たすことが示されてきた（Choy, 2012、Grunewald and Eklund, 2007、Coimbra et al., 2012、Holmdahl et al., 1985）。これらの一般的修飾の１つは、アルギニンの正荷電アルジミン基（＝ＮＨ）からシトルリンの中性荷電ケトン基（＝Ｏ）への変換を含む、アルギニンのシトルリン化である。シトルリン化は、様々な組織で見出されるカルシウム依存性酵素のファミリーであるペプチジルアルギニンデイミナーゼ（ＰＡＤ：peptidyl arginine deiminase）によって媒介される。Ireland et al. 2011による最近の報告により、ＡＰＣ上のシトルリン化Ｔ細胞エピトープの提示が、オートファジーおよびＰＡＤ活性にも依存していることが実証されている。さらにこのプロセスは、プロフェッショナルＡＰＣならびに上皮細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ分子上の提示のための内因性抗原のプロセシングを可能にする効率的なメカニズムであることも実証された（Munz, 2012、Schmid et al., 2007）。オートファジーは、ＡＰＣでは構成的であるが、他の細胞ではストレスによってのみ誘導される（Green and Levine, 2014）。したがって、シトルリン化エピトープを認識するＴ細胞は、通常の健常な細胞は標的としない。オートファジーは、ストレス、たとえば、低酸素および栄養飢餓によって引き起こされ、腫瘍生存を促進するために上方調節される（Green and Levine, 2014）。

シトルリン化される一つのタンパク質は、細胞質で見出される解糖系酵素のエノラーゼである。エノラーゼは、細胞表面でも発現してプラスミノーゲン受容体として作用する（Miles et al., 1991）。哺乳類では、４つの別個の遺伝子によってコードされている、エノラーゼ酵素の４つのアイソフォームがある（Diaz-Ramos et al., 2012）。ＥＮＯ１遺伝子は、ほぼ全ての成体組織において発現しているα－エノラーゼをコードしている。ＥＮＯ２（β－エノラーゼ）は、筋肉組織で発現しており、ＥＮＯ３（γ－エノラーゼ）は、ニューロンで見出される（Marangos et al., 1978）。より最近では、専ら精子で発現している第４の変異型ＥＮＯ４が特定された（Nakamura et al., 2013）。酵素的に活性なエノラーゼは、ホモまたはヘテロ二量体であることができる２つのサブユニットで形成されている（Pancholi, 2001）。

ＥＮＯ１およびＥＮＯ３は、ＣＮＳにおいてシトルリン化タンパク質として特定され（Jang et al., 2008、Jang et al., 2010）、関節リウマチにおいて自己抗原として特定された（Kinloch et al., 2005、Kinloch et al., 2008、Lundberg et al., 2008、Mahdi et al., 2009）。ＥＮＯ１におけるＡｒｇ９のシトルリン化、ＥＮＯ１およびＥＮＯ３におけるＡｒｇ９のシトルリン化、ならびにＥＮＯ３におけるＡｒｇ９のシトルリン化を認識するモノクローナル抗体が最近記述され（Jang et al., 2012）、シトルリン化エノラーゼはその酵素活性を失っており、カルパイン－１により急速に分解されるが、シトルリン化はＥＮＯ１およびＥＮＯ３のプラスミノーゲン結合活性を増加させることが示された。いくつかのシトルリン化エノラーゼペプチドは、ヒトＭＨＣ ＩＩに結合し（WO2012/138294 A1）、関節リウマチ患者におけるＴ細胞を活性化してＩＬ－１７を産生できることが記述されている。

嫌気的解糖および細胞表面でのプラスミノーゲン局在化におけるエノラーゼの役割により、エノラーゼは、抗腫瘍療法のための潜在的標的として着目されてきた。第１に、腫瘍微小環境における低酸素は、固体腫瘍の増殖における主要因子である。したがって、解糖系酵素の上方調節が、腫瘍生存のために必要となる。ＥＮＯ１プロモータは、低酸素ストレスに応答して細胞内で上方調節される低酸素応答エレメントを含有している（Semenza et al., 1996）。第２に、細胞表面エノラーゼは、プラスミノーゲン活性化因子によるプラスミノーゲンのプラスミンへの切断を可能にするプラスミノーゲン結合分子として作用する。このプロセスは、悪性腫瘍と関連するプラスミノーゲン活性化因子のレベル上昇を伴う細胞浸潤にとって重要である（Andreasen et al., 2000）。これらの機能はまとまって、エノラーゼが腫瘍増殖および転移において積極的役割を果たしていることを意味する。エノラーゼを治療的に標的にする複数のアプローチが開発されてきた。ＥＮＯ１サイレンシングは、in vitroで子宮内膜細胞の解糖、増殖および遊走を減少させ、in vivoで細胞増殖を顕著に阻害した（Zhou et al., 2010）。同様に、抗ＥＮＯ１ｍＡｂの投与は、ヒト膵臓細胞株ＣＦＰＡＣ－１のin vivo増殖および転移を減少させることが示されている（Principe et al., 2015）。ＥＮＯ１は、子宮内膜癌、膵管腺癌および非小細胞肺がんを含むいくつかのがん組織において過剰発現することが示されている（Zhao et al., 2015、Cappello et al., 2009、Fu et al., 2015）。さらにエノラーゼの高発現は、乳房、肝細胞および胃を含むいくつかの腫瘍について、不良な臨床転帰と相関していた（Capello et al., 2011のレビュー）。肺がんにおいて、腫瘍細胞におけるＥＮＯ１発現の上方調節が、１７人の患者のうち１１人で観察された。ＥＮＯ１発現が高いことは、疾患再発および腫瘍ステージの進行と関連していた（Chang et al., 2006）。

膵臓、白血病、メラノーマ、頭頸部、乳房および肺を含む多くの患者において、ＥＮＯ１は、自己抗原であることが示されている（Capello et al., 2011）。膵臓がんにおいて、ＥＮＯ１は、in vitroとin vivoの両方において、ＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答を誘発し（Cappello et al., 2009）、これにより膵管腺癌細胞の増殖を阻害したが、特異的Ｔエピトープは特定されなかった。頭頸部がんにおいて、ＨＬＡ－ＤＲ８制限ペプチド（ａａ３２１－３３６）は、細胞障害性ＣＤ４ Ｔ細胞応答を刺激した（Kondo et al., 2002）。膵臓腺癌の遺伝子モデルにおいて、ＥＮＯ１ ＤＮＡを用いたワクチン接種は、腫瘍に対する体性および細胞性免疫応答を誘発し、腫瘍進行を遅延し、著しく生存を延長した（Cappello et al., 2013）。がんにおける診断および治療剤として野生型エノラーゼ抗原の使用が記述されている（US7645453 B2）。さらにα－エノラーゼを標的とする薬剤が、化学療法剤に対する新生細胞の感受性を増加させる手法として記述されている（WO2007/072219 A2）。我々は以前に、シトルリン化ビメンチンペプチドが、腫瘍拒絶および長期生存をもたらすＣＤ４媒介免疫応答を誘導しうることを示した（WO2014/023957 A2）。しかしながら、エノラーゼに対して測定された免疫応答の全てが、野生型またはリン酸化エノラーゼを認識したがシトルリン化エノラーゼは認識せず、この酵素が、がんにおいてシトルリン化されていなかったことが示唆される。

本発明者らは、正常ドナーおよびＨＬＡトランスジェニックマウスにおいて、シトルリン化エノラーゼペプチドを認識し、ＩＦＮγを産生するＴ細胞のレパートリが存在することを示した。さらに本発明者らは、ある特定のシトルリン化エノラーゼペプチドがin vivoでＴ細胞応答を生じ、そのようにがん療法に対するワクチン標的として使用しうることも示した。

本発明の第１の側面によれば、
ＶＩＧＭＤＶＡＡＳＥＦＦｃｉｔＳＧＫＹＤＬＤ（Ｅｎｏ１ ２４１－２５９）、
ＶＩＧＭＤＶＡＡＳＥＦＹｃｉｔＳＧＫＹＤＬＤ（Ｅｎｏ２／３ ２４１－２５９）、ＥＶＤＬＦＴＳＫＧＬＦｃｉｔＡＡＶＰＳＧＡＳ（Ｅｎｏ１ ２１－４０）、
ＥＶＤＬＹＴＡＫＧＬＦｃｉｔＡＡＶＰＳＧＡＳ（Ｅｎｏ３ ２１－４０）、
ＫＧＶＰＬＹｃｉｔＨＩＡＤＬＡＧＮＳＥＶＩＬ（Ｅｎｏ１ １２６－１４５）、
ＫＧＶＰＬＹｃｉｔＨＩＡＤＬＡＧＮＰＥＶＩＬ（マウスＥｎｏ１ １２６－１４５）、ＶＧＤＤＬＴＶＴＮＰＫｃｉｔＩＡＫＡＶＮＥＫ（Ｅｎｏ１ ３１６－３３５）、またはＶＧＤＤＬＴＶＴＮＰＫｃｉｔＩＡＫＡＡＳＥＫ（マウスＥｎｏ１ ３１６－３３５）、ＩＦＤＳｃｉｔＧＮＰＴＶＥＶＤＬＦ（Ｅｎｏ１ １１－２５）、
ＩＦＤＳｃｉｔＧＮＰＴＶＥＶＤＬＹ（Ｅｎｏ３／マウスＥｎｏ１ １１－２５）
（ここで「ｃｉｔ」は、シトルリンを表す）から選択されるアミノ酸配列、あるいは
ｉｉｉ）非シトルリン位置での１、２もしくは３個のアミノ酸置換および／または１、２もしくは３個のアミノ酸挿入および／または１、２もしくは３個のアミノ酸欠失を有するｉ）のアミノ酸配列
を含むか、またはそのアミノ酸配列から本質的になるか、またはそのアミノ酸配列からなるペプチドが提供される。

本発明者らは、エノラーゼから誘導されたこれらのシトルリン化ペプチドが、腫瘍、たとえば、限定されないが、膵臓、白血病、メラノーマ、頭頸部、乳房および肺腫瘍に対して、免疫応答を高めるために使用しうることを予想外に見出した。本発明者らは、わずか２つのペプチド：
ＶＩＧＭＤＶＡＡＳＥＦＦｃｉｔＳＧＫＹＤＬＤ／ＶＩＧＭＤＶＡＡＳＥＦＹｃｉｔＳＧＫＹＤＬＤ － ２５３位でシトルリン化されたエノラーゼ２４１－２６０、および
ＥＶＤＬＦＴＳＫＧＬＦｃｉｔＡＡＶＰＳＧＡＳ／ＥＶＤＬＹＴＡＫＧＬＦｃｉｔＡＡＶＰＳＧＡＳ － ３２位でシトルリン化されたエノラーゼ２１－４０
が、シトルリン化自己エノラーゼエピトープに対してin vivoでＴ細胞応答を生じさせたことを示した。３つのペプチド：
ＫＧＶＰＬＹｃｉｔＨＩＡＤＬＡＧＮＳＥＶＩＬ／ＫＧＶＰＬＹｃｉｔＨＩＡＤＬＡＧＮＰＥＶＩＬ － １３２位でシトルリン化されたエノラーゼ１２６－１４５、
ＶＧＤＤＬＴＶＴＮＰＫｃｉｔＩＡＫＡＶＮＥＫ／ＶＧＤＤＬＴＶＴＮＰＫｃｉｔＩＡＫＡＡＳＥＫ － ３２８位でシトルリン化されたエノラーゼ３１６－３３５、および
ＩＦＤＳｃｉｔＧＮＰＴＶＥＶＤＬＦ／ＩＦＤＳｃｉｔＧＮＰＴＶＥＶＤＬＹ － １５位でシトルリン化されたエノラーゼ１１－２５
は、マウスに対して相同でないシトルリン化ヒトエピトープに対してin vivoでＴ細胞応答を生じさせ、それゆえ外来抗原として認識されていた。

シトルリン化ペプチドは、共通ＨＬＡ ＤＲ４ＤＲ４モチーフを有する自己免疫患者においてＴ細胞応答を刺激することが知られている。これに対して、本発明者らは、２５３位でシトルリン化されたエノラーゼ２４１－２６０が、ＨＬＡ－ＤＰ４トランスジェニックマウスにおいて強力なＴ細胞応答を刺激しうることを初めて示す。ＨＬＡ－ＤＰ４は集団の７０％で発現しているので、固形腫瘍の処置のためのワクチンとして有望である。２５３位でシトルリン化されたエノラーゼ２４１－２６０に対する応答を示す全ての正常ドナーは、ＨＬＡ－ＤＰ４を発現した。２５３位でシトルリン化されたエノラーゼ２４１－２６０に対する応答が最も強く、非修飾配列に対する最小の反応性を示した。このシトルリン化ペプチドエピトープに対して特異的なＴ細胞は、腫瘍細胞を標的として強力な抗腫瘍効果をin vivoで誘発することができ、したがって、シトルリン化エノラーゼ２４１－２６０をがん療法のためのワクチン標的として使用することの第１の根拠が提供される。

ＥＮＯ１、ＥＮＯ２およびＥＮＯ３は高度に保存されており、全て、２５３位でシトルリン化された２つのエノラーゼ２４１－２６０の一方または他方を発現する。対照的に、ＥＮＯ４は、遺伝子配列のこの位置で大きな逆位を有する。したがって、２５３位でシトルリン化されたエノラーゼ２４１－２６０ならびにそれをコードする核酸は、ＥＮＯ１、ＥＮＯ２またはＥＮＯ３を標的とするために使用することができる。

先の研究において、２５３位でシトルリン化されたエノラーゼ２４１－２６０が、ＲＡ患者においてＴ細胞応答を刺激できることが示されている（WO2012/138294）。ここでの例において詳細に記述しているように、ＤＮＡ構築物内のエノラーゼエピトープがシトルリン化エノラーゼに対する免疫応答を刺激するかどうかを試験するために、マウスを、エノラーゼエピトープをコードするＤＮＡで免疫化し、非修飾およびシトルリン化エピトープに対する応答についてスクリーニングした。全エノラーゼ配列をコードするＤＮＡで免疫化したマウスは、２５３位でシトルリン化されたエノラーゼ２４１－２６０に対してのみ応答した。このことは、ＤＮＡが翻訳されたとき、エノラーゼ２４１－２６０ペプチドが優先的にシトルリン化され、シトルリン化ペプチドがより高い親和性でＭＨＣに結合するか、または非修飾エノラーゼエピトープで刺激されたＴ細胞がシトルリン化ペプチドをより貪欲に認識することを示唆する。

ＤＮＡ内のコード化エピトープがシトルリン化Ｔ細胞応答を与えることが示されたことに加えて、２５３位でシトルリン化したエノラーゼ２４１－２６０ペプチドは、単独で、修飾エピトープのみを認識するＴｈ１応答を刺激し、野生型ペプチドに対する交差反応はなかった。正常ドナーを２５３位でシトルリン化したエノラーゼ２４１－２６０ペプチドで刺激したとき、４／６のドナーは、２５３位でシトルリン化したエノラーゼ２４１－２６０に対して応答を示したが、野生型ペプチドに対しては応答を示さなかった。この応答は、ＣＤ４ Ｔｈ１応答であることが示された。ＲＡ患者とは極めて対照的に、ＩＬ－１７は産生されなかった。

２５３位でシトルリン化したエノラーゼ２４１－２６０ペプチドを、様々なアジュバントと共に免疫化した。免疫刺激アジュバント、たとえばＣｐＧ／ＭＰＬＡ、ポリＩ：Ｃおよびイミキモド（Immiquimod）は、Ｔｈ１応答を刺激したが、アジュバントが無いと応答がなかったので、これらのアジュバントはＴｈ１応答に必要であった。不活性アジュバント、たとえば不完全フロイントアジュバントは、主にＩＬ－１０応答の誘導を引き起こすことから、ｉＴｒｅｇ応答の誘導が示唆される。

挿入アミノ酸および置きかえアミノ酸は、天然に存在するアミノ酸であってもよくまたは天然に存在しないアミノ酸であってもよく、たとえば、非天然側鎖を含んでもよい。２以上のアミノ酸残基が置換および／または挿入される場合、置きかえ／挿入アミノ酸残基は、互いに同じであってもよくまたは互いに異なっていてもよい。それぞれの置きかえアミノ酸は、置きかえられるアミノ酸に対して異なる側鎖を含んでもよい。

エノラーゼは、遺伝子がクローニングされた種（ニワトリ、マウス、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、およびヒト）の間で高度に保存されている。したがって、本発明のペプチドは、任意に、そのようなペプチドをコードする配列を含む核酸と組み合わされて、非ヒト哺乳類におけるがんを処置するために使用することができる。

さらに本発明は、その範囲内において、上記に示すアミノ酸配列およびそのアミノ酸配列と実質的同一性を有する、たとえばそのアミノ酸配列と７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を有するペプチド、ならびに薬、および特にがんを処置するための方法におけるそれらのペプチドの使用を含む。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントは、一般に、最適に比較されるように配列を整列し（たとえば、第２配列との最良のアラインメントのために第１の配列内にギャップを導入してもよい）、アミノ酸残基またはヌクレオチドを対応する位置で比較することにより決定される。「最良のアラインメント」とは、２つの配列が最も高い同一性パーセントに至るアラインメントである。同一性パーセントは、配列内の同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドの数を比較することにより決定される（つまり、同一性％＝同一の位置の数／位置の総数×１００）。

２つの配列間の同一性パーセントの決定は、当業者に既知の数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列を比較するための数学的アルゴリズムの一例は、（Karlin and Altschul, 1993）に示される、KarlinおよびAltschulの改変されたアルゴリズムである。AltschulらのＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムは、そのようなアルゴリズム（Altschul et al., 1990）を取り入れている。本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて、ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施してもよい。本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施してもよい。比較のためのギャップアラインメントを得るために、（Altschul et al., 1997）に記載されるギャップＢＬＡＳＴを利用してもよい。あるいは、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の遠い関係を検出する反復検索を実施してもよい。ＢＬＡＳＴ、ギャップＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用するとき、各プログラム（たとえば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用してもよい。http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照。配列の比較のために利用される数学的なアルゴリズムの別の例は、MyersおよびMillerのアルゴリズムである（Myers and Miller, 1989）。ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）は、そのようなアルゴリズムを取り入れている。配列解析のための当該技術分野で既知の他のアルゴリズムとしては、（Torelli and Robotti, 1994）に記載されているＡＤＶＡＮＣＥおよびＡＤＡＭ、ならびに（Pearson and Lipman, 1988）に記載されるＦＡＳＴＡが含まれる。ＦＡＳＴＡ内において、ｋｔｕｐは、検索の感度および速度を設定する制御オプションである。

本発明のペプチドは、Ｆｍｏｃ化学または当業者に既知の他の標準技術を使用して合成されてもよい。

本発明によるペプチドを作製する別の便利な方法は、発現系における核酸の利用により、そのペプチドをコードする核酸を発現させることである。

本発明者らは、本発明のペプチドをコードする核酸を用いた免疫化が、シトルリン化ペプチドに対する免疫応答を生じさせるが、野生型の非シトルリン化ペプチドに対する免疫応答は生じさせないことを示した。したがって、本発明は、本発明のペプチドをコードする単離された核酸をさらに提供する。好ましい側面では、本発明は、上記で定義された本発明のペプチドをコードする核酸を提供する。

また本発明者らは、全長エノラーゼをコードしている核酸、たとえばＤＮＡまたはＲＮＡの投与が、２５３位でシトルリン化されたエノラーゼ２４１－２６０のみに強い免疫応答を生じさせることも見出した。このことは、本発明のさらなる側面を形成する。全長エノラーゼのアミノ酸配列の例は、ここでの例および図面に提供されており、そのようなアミノ酸配列をコードする核酸配列を得ることは、当業者の技能の範囲内である。

当業者であれば、本発明のペプチドを依然としてもたらす、そのような核酸への置換、欠失および／または付加を決定することができるであろう。核酸は、クローニングにより取得されるもしくは化学合成により製造されるＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはＲＮＡ、たとえばｍＲＮＡであってもよい。治療的使用について、核酸は、好ましくは、処置される対象において発現することが可能な形態である。本発明のペプチドまたは本発明の核酸は、単離体、単離されたおよび／または精製された形態、天然と関連する材料を含まないまたは実質的に含まないものとして提供されてもよい。核酸の場合に、おそらくは発現のための１つ以上の制御配列を除いて、ヒトゲノム内の遺伝子に隣接する核酸は無くてもよくまたは実質的に無くてもよい。核酸は全体または一部が合成されたものでもよく、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいてもよい。本発明による核酸がＲＮＡを含む場合、示される配列に対する参照は、Ｔの代わりにＵを有するＲＮＡ等価物に対する参照として解釈されるべきである。

本発明のペプチドをコードする核酸配列は、たとえばここに含まれる情報および参考文献ならびに当該技術分野で既知の技術（たとえば、Sambrook, 1989、Ausubel, 1992を参照）を使用して、核酸配列およびクローンが入手可能であれば、当業者が容易に調製することができる。これらの技術には、（ｉ）そのような核酸の試料をたとえばゲノム源から増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、（ｉｉ）化学合成、または（ｉｉｉ）ｃＤＮＡ配列の調製が含まれる。ポリペプチドをコードするＤＮＡは、当業者に既知の任意の適切な方法で、たとえばコード化ＤＮＡを取得し、発現される部分のいずれかの端で適切な制限酵素認識部位を特定し、ＤＮＡから前記部分を切断することによって、生成し、使用してもよい。その部分を、次いで、標準的な市販の発現系における適切なプロモータに操作可能に連結してもよい。別の組換えアプローチは、ＤＮＡの関連部分を適切なＰＣＲプライマーを用いて増幅することである。修飾ペプチドの発現を導くために、または核酸を発現するために使用される宿主細胞内のコドン優先性を考慮して、配列に対する修飾を、たとえば部位特異的変異誘発を使用して行ってもよい。

また本発明は、少なくとも１つの上記の核酸を含む、プラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態の構築物を提供する。さらに本発明は、上記の１つ以上の構築物を含む組換え宿主細胞を提供する。上述のように、本発明のペプチドをコードする核酸は本発明の一側面を形成し、同様に、コード化核酸からの発現を含む、組成物を製造する方法も、本発明の一側面を形成する。発現は、核酸を含有する組換え宿主細胞を、適切な条件下で培養することにより、便宜に達成してもよい。発現による産生後、任意の適切な技術を使用して、組成物を単離および／または精製してもよく、次いで適宜使用してもよい。

様々に異なる宿主細胞において、ポリペプチドをクローニングおよび発現するための系は周知である。適切な宿主細胞には、細菌、哺乳類細胞、酵母、およびバキュロウイルス系が含まれる。異種ポリペプチドの発現のために当該技術分野で利用可能な哺乳類細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウスメラノーマ細胞および他の多くの細胞が含まれる。一般的な好ましい細菌宿主は、大腸菌である。原核細胞、たとえば、大腸菌における抗体および抗体断片の発現は、当該技術分野において十分確立されている。真核細胞の培養での発現も、特定の結合メンバーを作製するためのオプションとして当業者が容易に利用可能である。最近の総説について、たとえば、Reff, 1993、Trill et al., 1995を参照。総説について、たとえば、Pluckthun, 1991を参照。真核細胞の培養での発現も、特定の結合メンバーを作製するためのオプションとして当業者が容易に利用可能である。最近の総説について、たとえば、Reff, 1993、Trill et al., 1995を参照。

適切なベクターは、プロモータ配列、ターミネーター配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列、マーカー遺伝子、および必要に応じて他の配列を含む、適切な制御配列を含んで選択または構築することができる。ベクターは、プラスミド、ウイルス、たとえばファージ、または必要に応じてファージミドであってもよい。さらなる詳細について、たとえば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, 1989)を参照のこと。核酸の操作、たとえば核酸構築物の調製における操作、変異誘発、シーケンシング、ＤＮＡの細胞への導入、および遺伝子発現、ならびにタンパク質の解析に関する多くの既知の技術およびプロトコルは、Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel, 1992)において詳細に記述されている。

そのように、本発明のさらなる側面は、ここで開示されている核酸を含有する、単離されてもよい宿主細胞を提供する。なおさらなる側面は、そのような核酸を宿主細胞に導入することを含む方法を提供する。導入は、任意の利用可能な技術を使用してもよい。真核細胞について、適切な技術は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介トランスフェクション、ならびにレトロウイルスまたは他のウイルス、たとえばワクシニアウイルス、または昆虫細胞について、バキュロウイルスを使用する形質導入を含んでもよい。細菌細胞について、適切な技術は、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、およびバクテリオファージを用いたトランスフェクションを含んでもよい。導入に続き、たとえば遺伝子を発現する条件下で宿主細胞を培養することによって、核酸からの発現を生じさせてもよくまたは発現を可能としてもよい。

一態様では、本発明の核酸は、宿主細胞のゲノム（たとえば、染色体）に組み込まれる。組み込みは、標準技術に従って、ゲノムの組換えを促進する配列を含有することにより促進されてもよい。

また本発明は、上記に示すポリペプチドを発現するために、上記に示す構築物を発現系で使用することを含む方法も提供する。

本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する結合部分を特定および／または単離するために使用することができる。そのような結合部分は、免疫療法試薬として使用されてもよく、抗体を含んでもよい。したがって、さらなる側面では、本発明は、本発明のポリペプチドに結合する結合部分を提供する。

本発明の結合部分は、抗体であってもよい。用語「抗体」は、ここで使用されるとき、天然に産生されたものであろうとまたは部分的もしくは全体的に合成により製造されたものであろうと、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、つまり、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。用語「抗体」は、抗体断片、抗体の誘導体、機能的等価体および相同体、ヒト化抗体を含み、たとえば、天然物であろうとまたは全体的にもしくは部分的に合成されたものであろうと、免疫グロブリン結合ドメインを含む任意のポリペプチド、および抗体結合ドメインであるまたは抗体結合ドメインと相同である結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質を含む。したがって、別のポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメインまたは等価体を含むキメラ分子が含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現は、EP-A-0120694およびEP-A-0125023に記載されている。ヒト化抗体は、非ヒト抗体、たとえばマウス抗体の可変領域およびヒト抗体の定常領域を有する修飾抗体であってもよい。ヒト化抗体を作製するための方法は、たとえば、米国特許第5225539号に記載されている。抗体の例は、免疫グロブリンのアイソタイプ（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＡ）ならびにそれらのアイソタイプのサブクラス、抗原結合ドメイン、たとえば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆｄを含む断片、ならびにダイアボディである。抗体は、ポリクローナルであってもモノクローナルであってもよい。モノクローナル抗体は、ここで「ｍａｂ」として参照されてもよい。

抗体、たとえばモノクローナル抗体を利用すること、また組換えＤＮＡ技術を使用して、元の抗体の特異性を保持する他の抗体またはキメラ分子を製造することも可能である。そのような技術は、抗体の免疫グロブリン可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするＤＮＡを、異なる免疫グロブリンの定常領域に、またはフレームワーク領域を加えた定常領域に導入することを含んでもよい（たとえば、EP-A-184187、GB2188638 AまたはEP-A-239400を参照）。ハイブリドーマ（または抗体を産生する他の細胞）は、産生する抗体の結合特異性を変化させてもよく変化させなくてもよい遺伝子変異または他の変更が施されてもよい。

抗体全体の断片が、結合抗原の機能を果たしうることが知られている。結合断片の例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなるＦａｂ断片；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward, E.S. et al., Nature 341:544-546 (1989)）、（ｖ）単離ＣＤＲ領域、（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、２つの連結されたＦａｂ断片を含む二価断片、（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）であって、ＶＨドメインとＶＬドメインとが２つのドメインを会合させて抗原結合部位を形成させるペプチドリンカーにより連結されている分子（Bird et al., Science 242:423-426 (1988)、Huston et al., PNAS USA 85:5879-5883 (1988)）、（ｖｉｉｉ）二重特異性単鎖Ｆｖダイマー（PCT/US92/09965）、ならびに（ｉｘ）「ダイアボディ」、遺伝子融合により構築された多価または多重特異的断片（WO94/13804、P. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)）である。ダイアボディは、ポリペプチドのマルチマーであり、各ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメインと免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２ドメインとを含み、２つのドメインは（たとえばペプチドリンカーにより）連結されているが互いに会合して抗原結合部位を形成することはできない：抗原結合部位は、マルチマー内の１つのポリペプチドの第１ドメインと、マルチマー内の別のポリペプチドの第２ドメインとの会合により形成される（WO94/13804）。二重特異性抗体が使用される場合、これらの抗体は、様々な方法（Hollinger & Winter, Current Opinion Biotechnol. 4:446-449 (1993)）で製造することができ、たとえば化学的にまたはハイブリッドハイブリドーマから調製される従来の二重特異性抗体であってもよく、または上述のいずれかの二重特異性抗体断片であってもよい。全抗体でなくむしろｓｃＦｖダイマーまたはダイアボディを使用することが好ましくてもよい。ダイアボディおよびｓｃＦｖは、Ｆｃ領域なしで、可変ドメインのみを使用し、潜在的に抗イディオタイプ反応の影響を低減させて構築することができる。二重特異性抗体の他の形態には、Traunecker et al., EMBO Journal 10:3655-3659 (1991)に記載の単鎖「Janusins」が含まれる。また二重特異性ダイアボディは、二重特異性全抗体とは対照的に、大腸菌内で容易に構築され発現されうるために有用であってもよい。適切な結合特異性を有するダイアボディ（および多くの他のポリペプチド、たとえば抗体断片）は、ライブラリからファージディスプレイ（WO94/13804）を使用して容易に選択することができる。ダイアボディの一方のアームが、たとえば、抗原Ｘに対する特異性を一貫して維持すべきである場合は、他のアームを変動させたライブラリを作製し、適切な特異性を有する抗体を選択してもよい。「抗原結合ドメイン」は、抗原の部分または全てに特異的に結合し、相補的である領域を含む、抗体の部分である。抗原が大きい場合には、抗体は、エピトープと称される抗原の特定の部分にのみに結合してもよい。抗原結合ドメインは、１つ以上の抗体可変ドメインにより提供されてもよい。抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでもよい。

改変タンパク質骨格に基づく結合部分も本発明に包含される。タンパク質骨格は、目的の標的分子に対して結合部位を与えるように修飾された、安定で可溶性の天然のタンパク質構造から誘導される。改変タンパク質骨格の例には、限定されないが、そのα－ヘリックスの２つに結合面を提供するブドウ球菌蛋白質ＡのＺドメインに基づくアフィボディ（Nygren, P. A. (2008). FEBS J 275(11): 2668-76）、リポカリンから誘導され、β－バレル折り畳みの開口端に小リガンドのための結合部位を組み込むアンチカリン（Skerra, A. (2008) FEBS J 275(11): 2677-83）、ナノボディ、およびＤＡＲＰｉｎが含まれる。改変タンパク質骨格は、通常、抗体と同じ抗原タンパク質に結合するように標的化されており、有望な治療剤である。それらは阻害剤またはアンタゴニストとして、または標的分子に対する送達ビヒクルとして、たとえばin vivoで特定の組織に対する毒素として、作用してもよい（Gebauer, M. and A. Skerra (2009). Curr Opin Chem Biol 13(3): 245-55）。短いペプチドを、標的タンパク質に結合するために使用してもよい。フィロマー（Phylomer）は、細菌ゲノムから誘導された天然の構造化ペプチドである。そのようなペプチドは、タンパク質の構造折り畳みの多様なアレイを表し、in vivoタンパク質－タンパク質相互作用を阻害／破壊するために使用することができる（Watt, P. M. (2006). Nat Biotechnol 24(2): 177-83）。

さらなる側面において、本発明は、薬における使用のための、本発明の第１の側面のペプチドおよび／またはそのようなペプチドをコードする配列を含む核酸および／または結合部分を提供する。

さらに本発明は、がんを処置する方法に使用するための、本発明の第１の側面のペプチドおよび／またはそのようなペプチドをコードする配列を含む核酸および／または結合部分、ならびにがんの処置のための医薬の製造におけるそのようなペプチドおよび／または核酸および／または結合部分の使用を提供する。本発明は、本発明の第１の側面のペプチドおよび／またはそのようなペプチドをコードする配列を含む核酸および／または結合部分を、がんの処置を必要とする対象に投与することを含む、がんを処置する方法も提供する。がんは、エストロゲン受容体陰性乳がんを含む乳がん、結腸直腸がん、胃がん、非小細胞肺がん、子宮内膜癌を含む卵巣がん、膵管腺癌を含む膵臓がん、白血病、メラノーマ、頭頸部がんまたは肺がんであってもよい。

ペプチドは、ＴまたはＢ細胞エピトープであってもよい。本発明によるペプチドは、単独で使用してもよくまたは組み合わせで使用してもよい。さらにそれらは、他の治療剤、たとえば抗がん剤、たとえば、限定されないがチェックポイント阻害薬、たとえばイピリムマブと組み合わせて使用されてもよい。

本発明によるペプチドは、in vivoでペプチドとして、任意にWO02/058728に開示されるペプチドの形態で、送達されてもよい。本発明者らは、驚くべきことに、本発明のペプチドが、ペプチドとして投与されるとき、強力な免疫応答を生じることを見出した。そのようなペプチドは、ペプチドのみの配列として、またはペプチドを含有するポリペプチドとして、またはさらには全長タンパク質として投与されてもよい。あるいは、本発明によるペプチドは、ペプチドをコードする核酸、ペプチドを含有するポリペプチドをコードする核酸、またさらには全長タンパク質をコードする核酸としてin vivoで投与されてもよい。そのような核酸は、ミニ遺伝子の形態、つまりリーダー配列とペプチドまたはリーダー配列と全長タンパク質をコードする形態であってもよい。本発明で有用なエピトープをコードする核酸は、ＰＡＤ酵素、好ましくはＰＡＤ４酵素を発現する抗原提示細胞および他の細胞を標的としてもよい。本発明の核酸は、標的化剤、たとえばＦｃ、またはＡＰＣ上の様々な抗原を標的とするモノクローナル抗体、たとえば抗ＤＥＣ２０５ｍＡｂをコードする核酸を含めることによって、または皮膚が多数のＡＰＣを有するとき皮内注射によって、標的化されてもよい。

ここで使用されるとき、用語「処置」は、ヒトまたは非ヒト動物に利益を与えることができるあらゆるレジメンを含む。ポリペプチドおよび／または核酸および／または結合部分は、薬学的に許容される担体（単数または複数）と組み合わされて、医薬組成物を形成してもよい。そのような担体は、限定されないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、リポソーム、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含んでもよい。

本発明の組成物の治療的投与の主な経路は注射であるが、カテーテルまたは他の外科チューブを通じた送達も使用されてよいことが企図されている。いくつかの適切な投与経路には、静脈内、皮下、皮内、腹腔内および筋肉内投与が含まれる。液体製剤は、粉末製剤から再構成後に利用されるものでもよい。

静脈内注射または患部での注射について、活性成分は、発熱物質不含で、適切なｐＨであり、等張であり、安定性を維持する非経口的（parentally）に許容される水溶液の形態であろう。当該技術分野で関連する技能を有する者は、たとえば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、または乳酸加リンゲル液などの等張ビヒクルを使用して、適切な溶液を十分に調製することができる。保存剤、安定剤、バッファー、抗酸化剤、および／または他の添加剤を、必要に応じて含めてもよい。

経口投与のための医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体の形態であってもよい。錠剤は、固体担体、たとえばゼラチン、またはアジュバントを含んでもよい。液体医薬組成物は、一般に、液体担体、たとえば、水、石油、動物もしくは植物油、鉱物油または合成油を含む。生理食塩液、ブドウ糖もしくは他の糖類溶液、またはグリコール、たとえばエチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどが含まれていてもよい。製剤が液体の場合、製剤は、たとえば、ｐＨ６．８～７．６の非リン酸バッファーを含む生理食塩水、または凍結乾燥粉末であってもよい。

組成物は、腫瘍部位または他の所望の部位に局在化する様式で投与されてもよく、または腫瘍もしくは他の細胞を標的とする様式で送達されてもよい。

組成物は、好ましくは、個体への利益を示すために十分な「治療有効量」で個体に投与される。投与される実際の量ならびに投与の速度および時間経過は、処置されるものの性質および重症度に依存する。処置の処方、たとえば投与量の決定などは、一般開業医および他の医師の責任能力の範囲内であり、処置される障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、および開業医に既知の他の因子が、通常、考慮に入れられる。本発明の組成物は、がんの処置および初回の処置または手術後のそのような状態の再発の予防に特に関連する。上述の技術および手順の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Remington, 1980)において見出すことができる。組成物は、単独で、または他の処置との組み合わせで、処置される状態に応じて同時にまたは逐次に投与されてもよい。他のがん処置には、当該技術分野で既知の他のモノクローナル抗体、他の化学療法剤、他の放射線療法技術、または他の免疫療法が含まれる。本発明の組成物のある特定の適用は、手術の補助としての適用、つまり、腫瘍を除去した後にがんが再発するリスクを減少させることを助けるための適用である。本発明の組成物は、化学合成により全体的にまたは部分的に生成されてもよい。組成物は、十分に確立された、標準的な液相、または好ましくは固相のペプチド合成方法に従って容易に調製することができ、これらの一般的な説明は、広く入手可能である（たとえば、Solid Phase Peptide Synthesis, 2^nd edition (Stewart, 1984), in The Practice of Peptide Synthesis (Bodanzsky, 1984)及びApplied Biosystems 430A User’s Manual, ABI Inc.を参照）。または、組成物は、溶液中で、液相法により、または固相、液相、および溶液化学の任意の組み合わせにより、たとえば、各ペプチド部分を最初に完了させ、その後、望ましくはおよび適切であれば、存在する任意の保護基を除去した後に、それぞれの炭酸または硫酸の反応により、残基Ｘまたはその反応誘導体を導入することにより、調製してもよい。

本発明のポリペプチド、複合体、核酸分子、ベクター、細胞および結合部分は、天然に存在しないおよび／または精製されたおよび／または改変されたおよび／または組換えおよび／または単離されたおよび／または合成物であってもよい。

本発明のペプチドは、
ＶＡＡＳＥＦＦＲＳＧＫＹＤＬＤＦＫＳＰＤ
ＶＡＡＳＥＦＹＲＳＧＫＹＤＬＤＦＫＳＰＤ
ＴＳＫＧＬＦｃｉｔＡＡＶＰＳＧＡＳＴＧＩＹＥ
ＴＡＫＧＬｃｉｔＡＡＶＰＳＧＡＳＴＧＩＹＥ
ＡＧＡＶＥＫＧＶＰＬＹｃｉｔＨＩＡＤＬＡＧＮ
ＴＶＴＮＰＫｃｉｔＩＡＫＡＶＮＥＫＳＣＮＣＬ、または
ＴＶＴＮＰＫｃｉｔＩＡＫＡＡＳＥＫＳＣＮＣＬ
から選択される配列を含まない、その配列から本質的になるものでない、またはその配列からなるものでないことが好ましい。

本発明の各側面の好ましい特徴は、必要な変更を加えて、他の側面のそれぞれにも準用される。ここで言及する先行文献は、法で認められる最大限の範囲まで組み込まれる。

本発明を、以下の例および添付の図面を参照してさらに記述する。

ヒトエノラーゼの配列アラインメント。

ヒトエノラーゼサブユニットＥＮＯＡ（ＥＮＯ１、α）、ＥＮＯＢ（ＥＮＯ３、β）、ＥＮＯＧ（ＥＮＯ２、γ）およびＥＮＯ４の、相同性を示すアライメント。薄い灰色はＥＮＯ４と相同な領域、濃い灰色はＥＮＯ４と相同でない領域。

ペプチドプールに対するＩＦＮγ応答のスクリーニング。 ヒトＤＲ４（Ａ）またはＤＲ１／ＨＨＤ（Ｂ）と親Ｃ５７ＢＬ／６（Ｃ）マウスとのトランスジェニックマウス株を使用してペプチドに対するＩＦＮγ応答をスクリーニングした。マウスを、４～６の非重複ヒトシトルリン化エノラーゼペプチドのプールを用いて免疫化した。免疫化の１４日後、マウスを屠殺し、脾細胞を採取した。ヒトおよびマウス等価ペプチドを用いた刺激に対するex vivo応答をＩＦＮγエリスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）により評価した。培地のみの応答を陰性対照として使用した。各プールについて、ｎ＝３。各プールについて、培地応答と比較したペプチド応答の統計学的有意性を、ＡＮＯＶＡおよびDunnett事後検定により決定した。^＊p<0.5、^＊＊p<0.01、^＊＊＊p<0.001。

ヒトエノラーゼ２４１－２６０シトルリン化ペプチドは強力なＩＦＮγ応答を誘導する。 ヒト２４１ｃｉｔペプチドの単回免疫化を、トランスジェニックＤＲ４マウスに与えた。ex vivoエリスポットを使用して、ヒトおよびマウス等価シトルリン化（ｃｉｔ）ペプチドならびに野生型（ｗｔ）配列に対して生じたＩＦＮγ（Ａ）およびＩＬ－１０（Ｂ）応答を決定した。ＭＨＣクラスＩＩブロッキング抗体（Ｌ２４３）の存在下におけるシトルリン化ペプチドに対するＩＦＮγ応答も、エリスポットにより評価した（Ｃ）。全てのアッセイについて、培地のみの応答を陰性対照として使用した。各実験について、ｎ＝３。ｐ値を示す。

複数のシトルリン化エノラーゼペプチドは低レベルのＩＦＮγ応答を誘導する。 マウスに、２１～４０位（Ａ）、１２６～１４５位（Ｂ）および３１６～３３５位（Ｃ）に対応するシトルリン化ヒトエノラーゼペプチドの単回免疫化を与えた。ex vivoエリスポットを使用してＤＲ４およびＤＲ１／ＨＨＤマウスにおけるＩＦＮγ応答を決定した。応答は、ヒトおよびマウスシトルリン化ペプチドならびに利用可能である場合はそれらの野生型等価物について示す。培地のみの応答を陰性対照として使用した。各ペプチドについて、ｎ＝３。培地対照と比較した応答の統計学的有意性をＡＮＯＶＡおよびDunnett事後検定により決定した。^＊p<0.5、^＊＊p<0.01、^＊＊＊p<0.001。

エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドは、ＤＰ４マウスの応答を誘導する。 トランスジェニックＤＰ４マウスをエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドの３用量で３週間にわたり免疫化した。脾細胞を初回用量の投与後２１日間で収集した。ex vivo ＩＦＮγエリスポットを使用して、エノラーゼ２４１ペプチドに対する応答を決定した。

ヒトエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドは抗腫瘍試験においてin vivo生存優位性をもたらす。 Ｂ１６Ｆ１（レーン１）、ＩＤ８（レーン２）、ＴｒａｍｐＣ１（レーン３）、Ｐａｎ０２（レーン４）、ＬＬＣ／２（レーン５）、ＲＴＬＣＬ（レーン６）、ＨｅＬａ（レーン７）細胞株からの溶解物の、αエノラーゼ（ＥＮＯ１）およびβアクチンについて探索されるラダーに対する免疫ブロット（Ａ）。バンドは、ＥＮＯ－１（４７ｋＤａ）およびβ－アクチン（４２ｋＤａ）に対する推定サイズと一致する。

ＤＲ４マウスを、Ｂ１６ＤＲ４腫瘍でチャレンジした。生存（Ｂ）および腫瘍移植後１７日目の腫瘍サイズ（Ｃ）を、非免疫化対照動物および腫瘍移植後４日でエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドを用いて免疫化した動物についての生存を示す。ｎ＝１０。示した結果は２つの独立した実験からのものである。

ＤＲ４マウスを、ＩＦＮγ誘導性ＤＲ４を発現しているＢ１６腫瘍でチャレンジした。生存（Ｄ）および腫瘍移植後１７日目の腫瘍サイズ（Ｅ）を、非免疫化対照動物と腫瘍移植後４日でエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドを用いて免疫化した動物とについて示す。ｎ＝１０。免疫化群からの生存マウスを、初回腫瘍移植後４２日目に、同じ腫瘍細胞株で再チャレンジした（矢印で示す）。再チャレンジしたマウスおよび以前にチャレンジしていない対照群についての統計データを示す（Ｆ）。有意なｐ値を示す。腫瘍体積について、マン・ホイットニー（Mann Whitney）Ｕ検定によって決定される中央値およびｐ値を示す。

エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドは、ＬＬＣ２腫瘍モデルにおいて生存優位性をもたらす。 ＤＲ４マウスを、Ｌｅｗｉｓ肺癌細胞株ＬＬＣ２でチャレンジした。腫瘍チャレンジ４日後、マウスをヒトエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドで免疫化した。野生型ＬＬＣ２（Ａ）または構成性キメラＤＲ４（Ｂ）でトランスフェクトし、ＬＬＣ２でチャレンジしたマウスについての生存データを示す。免疫化マウスと非免疫化対照マウスとの間の統計学的差異をマンテル・コックス（Mantel-Cox）検定により決定した。ｐ値を示す。ｎ＝１０。 ＥＮＯ１ ＤＮＡワクチン接種は、エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドに対して同様の応答を誘導する ＤＲ４マウスに、遺伝子銃を使用してＥＮＯ１ ＤＮＡ弾丸の２回の免疫化を行った。第２の免疫化の１４日後、マウスを屠殺し、脾細胞を採取した。ex vivoエリスポットを行って、エノラーゼ２４１ペプチドを用いた刺激に対するＩＦＮγ（Ａ）およびＩＬ－１０（Ｂ）応答を決定した。マウスを、構成的にＤＲ４を発現するＢ１６ＤＲ４腫瘍細胞株でチャレンジし、４日後、ＥＮＯ１ ＤＮＡで免疫化した。生存データ（Ｃ）および１１日目の腫瘍体積（Ｄ）を示す。

アジュバントは、エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドに対して誘導された応答に影響する。 ＤＲ４マウスに、アジュバントＣｐＧ／ＭＰＬＡまたはＩＦＡの存在下で、ヒトエノラーゼ２４１ｃｉｔの単回免疫化を行った。ＩＦＮγ（Ａ）およびＩＬ－１０（Ｂ）応答を、ex vivoエリスポットにより決定した。これらの試験について、ｎ＝３。ＧＭ－ＣＳＦの存在下に５μｇまたは２５μｇのエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドの１回または３回の免疫化を行ったマウスにおけるＩＦＮγ応答を決定した（Ｃ）。これらの試験について、ｎ＝３。またＤＲ４マウスをＢ１６ＤＲ４腫瘍でチャレンジし、非免疫化対照動物または腫瘍移植後４日から開始して５μｇのエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドとＧＭ－ＣＳＦとの３用量で免疫化した動物の生存（Ｄ）を決定した。ｎ＝１０。

応答が迅速に発生し、既存のエノラーゼ２４１ｃｉｔ応答を示唆する。 ＤＲ４マウスを、マウスが屠殺される２、６または１４日前にＣｐＧ／ＭＰＬＡ中のエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドの単回用量で免疫化し、ex vivoエリスポットを使用してＩＦＮγ応答を決定した。ｎ＝３。ｐ値は、２日目のペプチド応答と比較して有意な差を表す。

エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドは、ヒトＰＢＭＣの応答を誘導する。 ＰＢＭＣを、６人の健常ドナーから単離し、培地、ヒトエノラーゼ２４１ｃｉｔまたはエノラーゼ２４１ｗｔペプチドと共に培養した。チミジンアッセイを行い、４、７および１１日後の増殖を決定した（Ａ）。ＨＬＡタイピングを、各ドナーに対して行った。１１日目にドナー４からの上清を収集し、Luminexを使用してサイトカインレベルを解析した（Ｂ）。示されたデータは、各サイトカインについての培地対照バックグラウンドを超える応答を表す。ドナー４からのＰＢＭＣをＣＦＳＥで標識した後、野生型およびシトルリン化ペプチドで刺激した。ＣＦＳＥ標識細胞集団内のＣＤ４およびＣＤ８集団を、ペプチド刺激試料について、フローサイトメトリーにより７日目および１０日目に評価した（Ｃ）。 ヒトエノラーゼα（ＥＮＯＡ）サブユニットと他種（マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ウサギ、およびヒツジ）の等価配列との、相同性を示すアラインメント。 ヒトエノラーゼβ（ＥＮＯＢ）サブユニットと他種（マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ウサギ、およびヒツジ）の等価配列との、相同性を示すアラインメント。 （続き） ヒトエノラーゼγ（ＥＮＯＧ）サブユニットと他種（マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ウサギ、およびヒツジ）の等価配列との、相同性を示すアラインメント。 （続き）

ヒトエノラーゼ２４１－２６０シトルリン化ペプチドは、ＣＤ４応答を誘導する。 ＤＲ４トランスジェニックマウスを、ヒト２４１ｃｉｔペプチドで免疫化した。ex vivoエリスポットを使用して、ヒトおよびマウス等価シトルリン化（ｃｉｔ）ペプチドならびに野生型（ｗｔ）配列に対して生じたＩＦＮγ応答を決定した。ＭＨＣクラスＩＩブロッキング抗体（Ｌ２４３）、ＣＤ４ブロッキング抗体もしくはＣＤ８ブロッキング抗体（Ａ）の存在下におけるまたはＣＤ４枯渇もしくは濃縮細胞画分（Ｂ）におけるシトルリン化ペプチドに対するＩＦＮγ応答を評価した。より短いペプチド配列に対するＩＦＮγ応答をさらに試験した（Ｃ）。全てのアッセイについて、培地のみの応答を陰性対照として使用した。各実験について、ｎ＝３。ｐ値を示す。

ＨＨＤＩＩ／ＤＰ４マウスにおける応答の特徴づけ。 トランスジェニックＤＰ４マウスを、ヒト（Ａ～Ｅ）またはマウス（Ｆ）エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドの３用量で３週間にわたり免疫化した。脾細胞を初回用量の投与後２１日で収集した。ex vivo ＩＦＮｙエリスポットを使用して、エノラーゼ２４１ペプチドに対する応答を決定した。ヒトペプチドに対する応答を、ペプチド滴定によるアビディティ（Ａ）、ＩＬ－１０分泌（Ｂ）、およびグランザイムＢ分泌（Ｃ）について試験した。ＣＤ４ブロッキング抗体の存在下におけるＩＦＮγ応答（Ｄ）およびより短いペプチド配列に対するＩＦＮγ応答（Ｅ）も試験した。全てのアッセイについて、培地のみの応答を陰性対照として使用した。各実験について、ｎ＝３。ｐ値を示す。

ヒトエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドはＨＨＤＩＩ／ＤＰ４トランスジェニックマウスにおけるＢ１６メラノーマ抗腫瘍試験におけるin vivo生存優位性をもたらす。 ＤＰ４トランスジェニックマウスを、Ｂ１６ＤＰ４腫瘍でチャレンジした。非免疫化対照動物および腫瘍移植後４日でエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドを用いて免疫化した動物についての生存を示す。ｎ＝１０。免疫化マウスと非免疫化対照マウスとの間の統計学的差異をマンテル・コックス検定により決定した。ｐ値を示す。ｎ＝１０。

エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドは、生存優位性Ｐａｎ０２（膵臓）腫瘍モデルをもたらす。 ＤＲ４トランスジェニックマウスを、構成性ＤＲ４を発現するＰａｎ０２膵臓癌株でチャレンジした。腫瘍チャレンジ後４日で、マウスをヒトエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドで免疫化し、生存をモニターした。免疫化マウスと非免疫化対照マウスとの間の統計学的差異をマンテル・コックス検定により決定した。ｐ値を示す。ｎ＝１０。

エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドと様々なアジュバントとの組み合わせに対して、応答を誘導することができる。 ＤＲ４（Ａ＆Ｂ）またはＨＨＤＩＩ／ＤＰ４（Ｃ＆Ｄ）トランスジェニックマウスを、アジュバントＣｐＧ／ＭＰＬＡ（各６μｇ）、ＩＦＡ、ポリＩ：Ｃ（１０μｇ）またはイミキモド（２５μｇ）の存在下でヒトエノラーゼ２４１ｃｉｔを用いて免疫化した。ＩＦＮγ（Ａ＆Ｃ）およびＩＬ－１０（Ｂ＆Ｄ）応答を、ex vivoエリスポットにより決定した。これらの試験について、ｎ＝３。

正常ドナーから再活性化したエノラーゼ２４１ｃｉｔ特異的応答は主にＴｈ１サイトカインを産生し、ＣＤ４媒介される。 ドナー１および４由来のＰＢＭＣを、ヒトエノラーゼ２４１ｃｉｔまたはｗｔペプチドと共に培養し、ＩＦＮｇ放出をＩＦＮγエリスポットで１３日目に測定した（Ａ）。ＩＦＮγ応答を、ＣＤ４およびＣＤ８マーカーと組み合わせて細胞内サイトカイン染色により解析した（Ｂ）。 ドナー１、４および７のＰＢＭＣ培養物からの上清を、２、５および１２日目にサイトカインレベルについてluminexアッセイにより解析した（Ｃ）。

Ｅｎｏ２１ｃｉｔペプチドはマウスにおけるＣＤ４応答を誘導する。 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、ヒトエノラーゼ２１ｃｉｔペプチドで免疫化した。ex vivoエリスポットを使用して、ヒトシトルリン化（ｃｉｔ）ペプチドおよび野生型（ｗｔ）配列（Ａ）に対して生じたＩＦＮγ応答を決定した。ＣＤ４ブロッキング抗体またはＣＤ８ブロッキング抗体（Ｂ）の存在下におけるシトルリン化ペプチドに対するＩＦＮγ応答を評価した。全てのアッセイについて、培地のみの応答を陰性対照として使用した。各実験について、ｎ＝３。ｐ値を示す。

Ｅｎｏ １１ｃｉｔペプチドはマウスにおけるＣＤ４応答を誘導する。 Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを、ヒトエノラーゼ１１ｃｉｔペプチドで免疫化した。ex vivoエリスポットを使用して、ヒトおよびマウスシトルリン化（ｃｉｔ）ペプチドならびにヒト野生型（ｗｔ）配列に対して生じたＩＦＮγ応答を決定した（Ａ）。ヒトｃｉｔペプチドに対するＩＬ－１０応答を評価した（Ｂ）。ＣＤ４ブロッキング抗体またはＣＤ８ブロッキング抗体の存在下におけるヒトシトルリン化ペプチドに対するＩＦＮγ応答（Ｃ）を評価した。全てのアッセイについて、培地のみの応答を陰性対照として使用した。各実験について、ｎ＝３。ｐ値を示す。

方法
２．１．市販ｍＡｂ
抗ＨＬＡ－ＤＲ抗体（クローンＬ２４３）を、セファロースタンパク質ＧアフィニティクロマトグラフィーによるＨＢ－５５ハイブリドーマ細胞（ATCC, USA）培養上清から精製した。ＥＮＯ１に対するウサギモノクローナル抗体［ＥＰＲ１０８６４（Ｂ）］を使用した。抗マウスＣＤ４（クローンＧＫ１．５）および抗マウスＣＤ８（クローン２．４３）を、BioXcell, USAから購入した。

２．２．細胞株
マウスメラノーマＢ１６Ｆ１およびマウスＬｅｗｉｓ肺癌ＬＬＣ／２細胞株は、ＡＴＣＣから取得した。マウスＰａｎ０２細胞株を、米国国立がん研究所腫瘍レポジトリから取得した。Ｂ１６Ｆ１細胞株をＲＰＭＩ培地１６４０（GIBCO/BRL）中で培養し、ＬＬＣ／２およびＰａｎ０２をＤＭＥＭ中で培養する。別様に示されない限り、両方に１０％ＦＣＳ、Ｌ－グルタミン（２ｍＭ）および炭酸水素ナトリウム緩衝液を補足する。

２．３．免疫原
２．３．１．ペプチド
純度＞９０％のペプチドをGenscriptPeptide Synthetics（New Jersey, USA）により合成した。０．２ｍｇのアリコート中に凍結乾燥物を－８０℃で保存した。使用の当日に、ＰＢＳで適切な濃度に再構成した。

２．４．プラスミド
マウスαエノラーゼ（ＥＮＯ－１）をコードする哺乳類発現ベクターｐＣＭＶＳＰＯＲＴ６全長ｃＤＮＡ（IMAGE ID 5376359）を、Source Bioscienceから取得した。

プラスミドｐＶＩＴＲＯ２ヒトＨＬＡ－ＤＰ４を構築するために、ＦｓｐＩ／ＥｃｏＲＩにより隣接された全長ヒトＨＬＡ－ＤＰＡ^＊０１０３α鎖およびＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ制限部位により隣接されたＨＬＡ－ＤＰＢ^＊０４０１β鎖をコードするヌクレオチド配列を合成した。配列確認後、ＨＬＡ－ＤＰＡ^＊０１０３鎖を、ベクターｐＶＩＴＲＯ２－ｈｙｇｒｏ－ｍｃｓ（Invivogen）のＦｓｐＩ／ＥｃｏＲＩ ｍｃｓ２にクローニングした。続いて、ＨＬＡ－ＤＰＢ^＊０４０１鎖を、哺乳類発現ベクターのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ ｍｃｓ１に、ｍｃｓ２中に存在するαＨＬＡ－ＤＰＡ^＊０１０３鎖と並べて、挿入した。

ＨＨＤＩＩプラスミドを生成するために、ｃＤＮＡを、ＥＬ４－ＨＨＤ細胞から単離した全ＲＮＡから合成した。これをテンプレートとして使用し、フォワードおよびリバースプライマーを用いてＨＨＤを増幅し、ｐＣＲ２．１にサブクローニングした。ヒトＨＬＡ－Ａ２リーダー配列、ヒトＨＬＡ－０２０１ＭＨＣクラス１分子のα１および２ドメインにグリシンセリンリンカーを介して共有結合されたヒトβ２－ミクログロブリン（β２Ｍ）分子、ならびにマウスＨ－２Ｄｂクラス１分子のα３、膜貫通および細胞質ドメインを含むＨＨＤ鎖を、Invitrogenから取得した哺乳類発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１のＥｃｏＲＶ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位に挿入した。

プラスミドｐＶｉｔｒｏ２キメラＨＬＡ－ＤＲ４０１を生成するために、トランスジェニックＨＬＡ－ＤＲ４マウスの脾細胞から単離したｍＲＮＡから、ｃＤＮＡを生成した。これをテンプレートとして使用し、ＦｓｐＩ／ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ部位をそれぞれ組み込んだフォワードおよびリバースプライマーを使用して、キメラα鎖およびβ鎖を別個に増幅した。配列を確認したら、マウスＨ２－ＥａおよびヒトＨＬＡ－ＤＲＡα１ドメインを含む全長キメラα鎖を、ベクターｐＶＩＴＲＯ２－ｈｙｇｒｏ－ｍｃｓ（Invivogen）のＦｓｐＩ／ＥｃｏＲＩ ｍｃｓ２にライゲートした。次いで、マウスＨ２－ＥｂおよびヒトＤＲＢ１^＊０４０１β１ドメインを含むβ鎖を、ベクターのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ ｍｃｓ１に、キメラα鎖と並べて、挿入した。

ＩＦＮγ誘導性プラスミドｐＤＣＧＡＳキメラＨＬＡ－ＤＲ４０１を構築するために、キメラα鎖およびβ鎖を、他に記載（Metheringham et al., 2009）のｐＤＣＯｒｉｇベクターに、重および軽鎖を置きかえてクローニングした。ＴＡＴＡボックスおよびＧＡＳ（ＩＦＮγ活性化配列）直接リピートエンハンサーエレメントからなるＩＦＮγ誘導性プロモータを、テンプレートとしてベクターｐＧＡＳ－Ｌｕｃ（Agilent）を利用してＰＣＲにより増幅した。各カセット内のＣＭＶプロモータを切り出し、ｐＤＣＯｒｉｇベクター骨格内のＨＬＡ－ＤＲ４０１鎖の発現を駆動するＩＦＮγ誘導性プロモータで置きかえた。

エンドトキシンフリーのプラスミドＤＮＡを、endofree Qiagenマキシプレップキット（Qiagen, Crawley）を使用して生成した。

２．５．トランスフェクション
ＬＬＣ２細胞を、Lipofectamineトランスフェクション試薬（Invitrogen）を使用して、全長キメラα鎖とβ鎖の両方をコードする４μｇのプラスミドｐＶｉｔｒｏ２キメラＨＬＡ－ＤＲ４０１で、製造業者の指示に従ってトランスフェクトした。Zinc finger Technology（Sigma Aldrich）によりマウスＭＨＣクラスＩＩについて先にノックアウトしたＢ１６Ｆ１細胞株を、ｐＤＣ ＧＡＳキメラＨＬＡ－ＤＲ４０１またはｐＶｉｔｒｏ２キメラＨＬＡ－ＤＲ４０１プラスミドのいずれかでトランスフェクトした。この場合、キメラＨＬＡ－ＤＲ４０１は、高レベル発現をそれぞれ駆動するＩＦＮγ誘導性プロモータまたは構成性プロモータの発現下に置かれている。トランスフェクトした細胞を、ハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）またはゼオシン（３００μｇ／ｍｌ）の存在下での増殖により選択した。株を限界希釈によりクローニングし、発現をeBioscience社製の抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート抗体（クローンＬ２４３）を使用してフローサイトメトリーにより確認した。細胞をＩＦＮγ誘導性プラスミドでトランスフェクトし、マウスＩＦＮγ（３０ｎｇ／ｍｌ，Gibco life technologies）の非存在または存在下で一晩インキュベートした後、抗体で染色した。

Zinc finger Technology（Sigma Aldrich）によるマウスＭＨＣクラスＩおよびＩＩについて先にノックアウトしたＢ１６Ｆ１細胞株を、Lipofectamineトランスフェクション試薬（Invitrogen）を使用して、それぞれ４μｇのプラスミドｐＣＤＮＡ３ ＨＨＤＩＩおよびｐＶＩＴＲＯ２ヒトＨＬＡ－ＤＰ４プラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞を、Ｇ４１８（５００μｇ／ｍｌ）およびハイグロマイシンＢ（３００μｇ／ｍｌ）の存在下での増殖により、選択した。株を限界希釈によりクローニングし、発現を、それぞれSerotecおよびAbcamの抗ヒトβ２ミクログロブリンＦＩＴＣおよび抗ヒトＨＬＡ－ＤＲ／ＤＰ／ＤＱ（クローンＷＲ１８）ＰＥ抗体を使用して、フローサイトメトリーにより確認した。

２．６ ウェスタンブロッティング
細胞溶解液を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Sigma）を含むＲＩＰＡバッファー中で調製し、タンパク質を４～１２％ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓゲル（Invitrogen）で分離し、ＰＶＤＦ膜上に移した。膜を、３％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、次いで、抗体を用いてヒト／マウスＥＮＯ－１（クローンＥＰＲ１０８６３（Ｂ）、Abcam）１対１０００およびβアクチン（クローンＡＣ－１５，Sigma）１対１５０００について探索した。タンパク質は、ウサギに対する蛍光二次抗体ＩＲＤｙｅ８００ＲＤ（ＥＮＯ－１に関して）およびＩＲＤｙｅ６８０ＲＤ二次抗マウス（βアクチンに関して）を使用して視覚化した。膜を、Licor Odysseyスキャナーを使用して画像化した。

２．７．免疫化
２．７．１．免疫化プロトコル
８～１２週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（Charles River, UK）、ＨＬＡ－ＤＲ４マウス（Taconic, USA）、ＨＨＤＩＩ／ＤＲ１マウス（Pasteur institute, France）および特許文献WO2013/017545 A1（EMMA repository, France）に記載のマウスのＨＨＤ／ＨＬＡ－ＤＰ４トランスジェニック株を使用し、Nottingham Trent Universityのスタッフにより飼育した。全ての作業は、Home Officeプロジェクトライセンス下に実施した。ペプチドを、ＰＢＳで溶解して１ｍｇ／ｍｌとし、次いで様々なアジュバント：ＣｐＧおよびＭＰＬＡ６μｇ／各マウス（Invivogen, UK）、不完全フロイント５０μｌ／マウス（Sigma, UK）、ポリＩ：Ｃ１０μｇ／マウス（Invivogen, UK）、イミキモド２５μｇ／マウス（Invivogen, UK）およびＧＭＣＳＦ１０μｇ／マウス（Peprotech, UK）を用いて（一連の希釈液）で乳化した。ペプチド（２５μｇ／マウス）を尾の基部に皮下注射した。ＤＮＡ（１μｇ／マウス）を１．０μｍの金粒子（BioRad, Hemel Hempstead, UK）に製造業者の指示書を使用して被覆し、遺伝子銃（BioRad）で皮膚内に投与した。Homspera（１０ｎＭ／マウス）（PeptideSynthetics, UK）を、遺伝子銃免疫化により皮膚内に注射した。マウスは、別様に示されない限り、ペプチド免疫化について０日目、または遺伝子銃免疫化について０および７日目のいずれかで免疫化した。脾臓は、別のことが示されない限り、ペプチド免疫化の１４日目におよびペプチドもしくは遺伝子銃免疫化の２０日目に、解析のために取り出した。

腫瘍チャレンジ実験について、一次免疫化の３日前に、マウスを２．５×１０^４Ｂ１６ＤＲ４細胞または１×１０^６ＬＬＣ２／ＬＬＣ２ ＤＲ４細胞、マトリゲル中の２．５×１０^５Ｐａｎ０２ＤＲ４細胞、または４×１０^５Ｂ１６ ＨＨＤＩＩ ＤＰ４細胞で、皮下的に右側腹部にチャレンジし、次いで上記のように免疫化した。腫瘍増殖を３～４日間隔でモニターし、腫瘍が直径≧１０ｍｍに達したら、マウスを人道的に安楽死させた。

２．８．免疫応答の解析
２．８．１．ex vivoエリスポットアッセイ
エリスポットアッセイを、マウスＩＦＮγ、ＩＬ－１７およびＩＬ－１０捕捉および検出試薬を使用して、製造業者の指示（Mabtech, Sweden）に従って実施した。簡単に述べると、抗ＩＦＮγ、ＩＬ－１７およびＩＬ－１０抗体を９６ウェルのImmobilin-Pプレートのウェル上にコートした。合成ペプチド（各種濃度）およびウェルあたり５×１０^５の脾細胞をプレートのウェルに３連で添加した。腫瘍標的細胞を、適所に、５×１０^４／ウェルに３連で加え、プレートを３７℃で４０時間インキュベートした。インキュベーション後、捕捉されたＩＦＮγおよびＩＬ－１０をビオチン化抗ＩＦＮγおよびＩＬ－１０抗体で検出し、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼおよび発色基質で発色させた。スポットを解析し、自動プレートリーダー（Cellular Technologies Ltd）を使用して計数した。

２．８．２ Luminexマルチプレックスアッセイ
３工程の間接的手法を、ＩＬ－１０、ＩＬ－１７、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２＆ＩＬ－４に対するＩｇＧ抗体のマルチプレックスLuminexアッセイ（Invitrogen）について使用した。標準、対照、および未知の血清を、５０％アッセイ希釈バッファー（Invitrogen）＆５０％無血清ＲＰＭＩで１：２希釈した。標準段階希釈を、各アッセイに加えた。標準、対照，および未知の血清の各希釈液を、９６ウェル濾過プレート（Millipore Multiscreen; Millipore Corporation, Bedford, Mass.）中で一組の対のLuminexマイクロスフェアと混合し、室温で振盪しながら２時間インキュベートした。マイクロスフェアを真空濾過により収集し、ＰＢＳＴで洗浄した。ビオチン化検出抗体を、室温で１時間、各ウェルに振盪しながら加えた。マイクロスフェアを真空濾過により収集し、ＰＢＳＴで洗浄した。ストレプトアビジン共役Ｒ－フィコエリトリンを各ウェルに加えた。３０分のインキュベーションおよび洗浄工程後、マイクロスフェアをＰＢＳＴ中に再懸濁し、ＸＹプラットフォーム搭載Biorad BioPlex Luminex解析機で読んだ。データ取得および解析を、Luminexソフトウェア（BioPlex Systems）で実施した。

２．８．３ 増殖アッセイ（チミジン）
ＰＢＭＣを、新たに採取したヘパリン化血液からFicol-Hypaque（Sigma）勾配遠心分離により単離した。ＰＢＭＣ（１．５×１０^６細胞／ウェル）を、５％のプールされた自家ヒト血清、２ｍＭのグルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、およびペニシリン－ストレプトマイシン（１％）を含有する最終体積２ｍｌのＲＰＭＩ中の単一ペプチド（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）で刺激した。精製タンパク質誘導体ＰＰＤ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）を用いた刺激を、ＰＢＭＣの増殖能力についての陽性対照とした。陰性対照として、ＰＢＭＣを培地のみと共にインキュベートした。ＰＢＭＣを５％ＣＯ_２の雰囲気中で４、７および１１日間３７℃で培養した。これらの時間点で増殖を評価するために、各培養物から１００μｌを３連で９６ウェルプレートの丸底ウェルにアリコートし、^３Ｈ－チミジンを加え（０．０１８５ＭＢｑ／ウェル）、３７℃でさらに８時間インキュベートした。培養物をunifilterプレート上に採集し、^３Ｈ－チミジンの取り込みをβ－シンチレーション計数によって決定した。結果は、未刺激培養物の平均に対するエピトープ刺激物の１分あたりの計数（ｃｐｍ）の平均の比として、刺激指標（ＳＩ）を計算することにより評価した。ＳＩ＞２．５であるとき、増殖アッセイを陽性と考えた。

２．８．４ 増殖アッセイ（ＣＦＳＥ）
ＰＢＭＣを、新たに採取したヘパリン化血液からFicol-Hypaque（Sigma）勾配遠心分離により単離した。ＰＢＭＣ（１．５×１０^６細胞／ウェル）を、５％のプールされた自家ヒト血清、２ｍＭのグルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、およびペニシリン－ストレプトマイシン（１％）を含む、最終体積２ｍｌのＲＰＭＩ中の単一ペプチド（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）で刺激した。陰性対照として、ＰＢＭＣを培地のみとインキュベートした。ＰＢＭＣを５％ＣＯ_２の雰囲気中で７および１０日間３５℃で培養した。これらの時間点での増殖を評価するために、細胞を試料採取し、ＰＥ－Ｃｙ５およびefluor450でそれぞれ標識した表面マーカーＣＤ４およびＣＤ８抗体を用いて染色した。染色後、細胞を固定し、Milteny MACSQuantフローサイトメーターで解析した。

２．８．５ ＰＢＭＣ培養およびＩＦＮγエリスポット
ＰＢＭＣを、新たに採取したヘパリン化血液からFicol-Hypaque（Sigma）勾配遠心分離により単離した。ＰＢＭＣ（１．５×１０^６細胞／ウェル）を、５％のプールされた自家ヒト血清、２ｍＭのグルタミン、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ペニシリン－ストレプトマイシン（１％）、１０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－１５および５ｎｇ／ｍｌ組換えヒトＩＬ－７を含む、最終体積２ｍｌのＲＰＭＩ中の単一ペプチド（最終濃度１０μｇ／ｍｌ）で刺激した。組換えヒトＩＬ－２を、３日目に２０ＩＵ／ｍｌで加えた。１３日目に細胞を洗浄し、ヒトＩＦＮγエリスポットアッセイに加えた。エリスポットアッセイを、ヒトＩＦＮγ捕捉および検出試薬を使用して、製造業者の指示（Mabtech, Sweden）に従って実施した。簡単に述べると、抗ＩＦＮγ抗体を、９６ウェルのImmobilin-Pプレートのウェルにコートした。合成ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）およびウェルあたり１×１０^５のＰＢＭＣを、プレートのウェルに４連で加え、プレートを３７℃で２０時間インキュベートした。インキュベーション後、捕捉されたＩＦＮγをビオチン化抗ＩＦＮγ抗体で検出し、ストレプトアビジンアルカリホスファターゼおよび発色基質で発色させた。スポットを解析し、自動プレートリーダー（Cellular Technologies Ltd）を使用して計数した。

２．８．６ 細胞内サイトカイン解析
ＰＢＭＣ培養物を上記の通り設定した。１４日目にＰＢＭＣを洗浄し、ブレフェルジンＡの存在下で合成ペプチド（１０μｇ／ｍｌ）と共に３７℃で２０時間培養した。細胞を、ＰＥ－Ｃｙ５およびefluor450でそれぞれ標識した抗体を用いて細胞表面マーカーＣＤ４およびＣＤ８で染色した。続いて細胞を固定し、浸透させ、ＩＦＮγＰＥ－Ｃｙ７標識抗体を用いて染色した。染色後、細胞を固定し、Miltenyi MACSQuantフローサイトメーターで解析した。

２．９ 免疫組織化学解析
正常および腫瘍組織の結合を、先に記述されているように（Durrant et al., 2006）、免疫組織化学（ＩＨＣ）により解析した。免疫組織化学染色を、４μｍ切片に、Novolinkポリマー検出システム（Leica Biosystems, RE7150-K）を使用して実施した。簡単に述べると、スライドをキシレンで脱パラフィンし、３回のアルコール交換を通じて再水和し、抗原賦活化を、クエン酸バッファー（ｐＨ６．０）中で２０分間、電子レンジを使用して実施した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、Peroxidase Blockにより５分間ブロッキングした。スライドをＴＢＳ（ｐＨ７．６）で洗浄し、続いて、Protein Blockを５分間適用した。さらに１回のＴＢＳ洗浄後、Leica抗体希釈液（RE7133）で至適希釈した一次抗体を適用し、６０分間インキュベートした。抗ＥＮＯ１ウサギモノクローナルＥＰＲ１０８６４（Ｂ）は１／２００で使用した。スライドをＴＢＳで洗浄し、続いてPost-Primary Blockと共に３０分間インキュベーションした後、ＴＢＳで洗浄した。Novolinkポリマーを３０分間適用した。ＤＡＢ色素原のＤＡＢ基質緩衝液１：２０で構成されるＤＡＢ作用溶液を調製し、５分間適用した。スライドを、Novolinkヘマトキシリンで６分間対比染色し、脱水した。

ＴＭＡスライドを、最初に、光学顕微鏡評価により、染色性（staining quality）および特異性について評価した。次いで、スライドを、NanoZoomerスライドスキャナー（Hamamtsu Photonics, Welwyn Garden City, UK）を使用して高解像度デジタル画像（０．４５μｍ／pixel）へスキャンし、ウェブベースのインターフェイスＮＤＰビューア（Nanozoomer Digital Pathology）を使用してアクセスした。それらを最小２４００の高解像度スクリーン（91920 1080）を使用して９２０倍率でスコア化した。事例は、ＥＮＯ１状態および患者の転帰の情報なしにスコア化され、２人（ＭＧおよびＭＭ）によりスコア化された。染色の評価は、染色の強度および染色細胞の割合を考慮に入れた改変された組織学的スコア（Ｈスコア）を使用する半定量的アプローチに基づいた。強度について、陰性、弱い、中程度、および強い染色強度に対応するスコアインデックス０、１、２、および３を使用し、各強度での陽性細胞の割合を、主観的に評価した。統計解析は、ＳＰＳＳ１３．０（SPSS Inc, Chicago）を使用して実施した。生存解析についての統計カットポイント（cut-point）はＸ－Ｔｉｌｅソフトウェア（Camp et al., 2004）を使用して決定し、<0.05のＰ値を有意とみなした。

患者コホート
試験集団は、NottinghamまたはDerby大学病院で、組織学的に証拠付けられたがんの待機的外科手術を受けた患者から取得した、４６２のアーカイブ結腸直腸がんの連続的シリーズ（Simpson et al., 2010）検体（１９９４－２０００；追跡期間中央値４２ケ月；打ち切り２００３年１２月；リンパ節陽性疾患を有する患者は日常的に５－フルオロウラシル／フォリン酸のアジュバント化学療法を受けた）、３５０の卵巣がん（Duncan et al., 2007）試料（１９８２－１９９７；追跡期間中央値１９２ケ月：打ち切り２００５年１１月：疾患ステージＩＩ～ＩＶを有する患者は、後年に白金ベースであった標準的アジュバント化学療法を受けた）、１４２の胃がん（Abdel-Fatah et al., 2013）試料（２００１－２００６；追跡期間中央値６６ケ月；打ち切り２００９年１月；化学療法なし）、６８の膵臓および１２０の胆道（billary）／膨大部がん（Storr et al., 2012）試料（１９９３－２０１０：中央値４５ケ月；打ち切り２０１２；２５～４６％の患者は、５－フルオロウラシル／フォリン酸およびゲムシタビンでのアジュバント化学療法を受けた）、２２０の非小細胞肺がん（０１／１９９６－０７／２００６：追跡期間中央値３６ケ月、打ち切り２０１３年５月；いずれの患者も手術前は化学療法を受けなかったが、手術後に１１人の患者は放射線療法を受け、９人の患者は少なくとも１サイクルのアジュバント化学療法を受けた）のコホートを含んだ。関連する臨床－病理学的材料／データが入手不可能な場合を除き、除外した事例は無かった。この遡及研究は、１９８７年から１９９８年に診断され、Nottingham Tenovus原発性乳癌シリーズに組み入れられた原発浸潤性乳癌を有する９０２人の患者の連続的シリーズに基づく。これは、長期追跡期間のある、７１歳未満の患者（中央値５５歳）で良く特徴付けられたシリーズである。全ての患者は単一の機関で統一された方法で処置を受け、広範囲のタンパク質の発現について調査を受けた。

全ての患者は、乳房切除または広範囲局所切除と放射線療法の標準的な外科処置を受けた。１９８８年より前に、患者は全身アジュバント療法を受けていなかった。１９８８年以降、患者は、ＮＰＩスコアおよびホルモン受容体の状態に基づき、全身アジュバント処置について選択された。ＮＰＩ＜３．４の患者はアジュバント療法を受けなかった；アジュバントスコアが３．４より高い患者は、エストロゲン受容体陽性（閉経前であれば±ゴセレリン）の場合はタモキシフェンを受け、またはＥＲ陰性で化学療法を忍容する十分な適性があれば、古典的なシクロホスファミド、メトトレキサートおよびフルオロウラシルを受けた。生存データは、前向きに維持された。乳がん特異的生存率（ＢＣＳＳ：Breast cancer specific survival）は、初回外科処置の日から乳がんによる死亡時までの時間（年）として定義した。生存は、患者が依然として生きていたか、追跡不能であるか（ｎ＝７３）または他の原因により死亡した場合は、打ち切りとした。

実施例１ エノラーゼの配列アラインメントおよび相同性
哺乳類では、エノラーゼ酵素の４つの異性体ＥＮＯ１（Ａ）、ＥＮＯ２（Ｂ）、ＥＮＯ３（Ｇ）およびＥＮＯ４があり、これらは４つの別個の遺伝子でコードされている。それらは高度に保存されており、高いアミノ酸相同性を有する（図１）。

実施例２ シトルリン化エノラーゼに対するＣＤ４応答
ヒトα－エノラーゼペプチド配列を、重複する２０ｍｅｒに分断した。アルギニンを含有する任意の２０ｍｅｒを選択し、アルギニン残基をシトルリン（ｃｉｔ）で置きかえた。選択された２０ｍｅｒのペプチドを表１に列挙する。

エノラーゼペプチド応答のスクリーニング
マウスにおける候補シトルリン化エノラーゼエピトープを特定するためにスクリーニングを実施した。マウスを４～６ヒトシトルリン化ペプチドのプールで免疫化した。潜在的な交差反応性の影響を減少するために、各プール内のペプチドを、任意の重複するアミノ酸配列を含まないように選択した。各プールを、２０μｇの各ペプチドおよびアジュバントとしてＣｐＧ／ＭＰＬＡを含有する単回免疫化として投与した。１４日目に、マウスを選別し、免疫化プール内の各ペプチドに対する免疫応答をex vivoエリスポットにより評価した（図２）。さらに、脾細胞を、マウス等価配列に対してスクリーニングした。我々は、トランスジェニックＤＲ４マウス株においてシトルリン化ペプチドが応答を誘導しうることを以前に示している。様々なマウス株が異なるＭＨＣレパートリを有することを考慮して、いくつかの株をスクリーニングに使用した。ペプチド応答を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドでヒトＤＲ４またはＨＨＤ／ＤＲ１を発現するトランスジェニック株で評価した（材料および方法参照）。

有意なＩＦＮγ応答がいくつかの異なるペプチドで検出された。ＤＲ４マウスにおいて、エノラーゼ２４１－２６０シトルリン化ペプチドを含有するプールは、ヒト２４１ｃｉｔ（p<0.05）およびマウス２４１ｃｉｔ（p<0.0001）に対して有意な応答を誘導した。他のペプチドは、ＤＲ４マウスにおいて有意なＩＦＮγ応答を示さなかった。ＨＨＤ／ＤＲ１マウスにおいて、エノラーゼペプチド１２６－１４５を有するプールは、ヒト１２６ｃｉｔ（p<0.05）に対して有意な応答を誘導したが、マウス１２６ｃｉｔに対しては有意な応答を誘導しなかった。エノラーゼペプチド３１６－３３５を有するプールは、ヒト３１６ｃｉｔ（p<0.05）に対して有意な応答を誘導したが、マウス３１６ｃｉｔに対しては有意な応答を誘導しなかった。ペプチドエノラーゼ１－２０を含有するプールは、ヒトペプチドに対して有意な応答を誘導しなかったが、マウス１ｃｉｔに対しては有意な応答を誘導した（p<0.05）。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、ペプチドエノラーゼ２１－４０を含有するプールは、ヒト２１ｃｉｔ（p<0.05）に対して有意な応答を誘導したが、マウス２１ｃｉｔに対しては有意な応答を誘導しなかった。エノラーゼペプチド１２６－１４５を有するプールは、マウス１２６ｃｉｔ（p<0.05）に対して有意な応答を誘導したが、ヒト１２６ｃｉｔに対しては有意な応答を誘導しなかった。エノラーゼペプチド２６１－２８０を有するプールは、ヒト２６１ｃｉｔ（p<0.05）に対して有意な応答を誘導したが、マウス２６１ｃｉｔに対しては有意な応答を誘導しなかった。このことは、ペプチド２１－４０、１２６－１４５、２４１－２６０および３１６－３３５がさらなる調査に適当であることを示唆する。

初回スクリーニングから、ＤＲ４マウスにおけるエノラーゼ２４１ｃｉｔ免疫化は最強の免疫応答を誘導した。したがって、このペプチドをさらに調べた。ＤＲ４マウスに、２５μｇのヒト２４１ｃｉｔペプチドおよびＣｐＧ／ＭＰＬＡで単回免疫化を行った。脾細胞に対するex vivoエリスポットにより、マウス（p=0.0008）配列とヒト（p = 0.0124）配列の両方において、培地対照と比較してシトルリン化ペプチドに対する有意なＩＦＮγ応答が示された（図３Ａ）。マウス配列は、実際に、ＥＮＯ２およびＥＮＯ３由来のａａ２４１－２６０と同じ配列であり、したがって依然として自己抗原である。興味深いことに、２５３位のアルギニン残基がシトルリンで置きかえられていないヒトまたはマウス野生型（ｗｔ）配列のいずれも免疫応答を生じなかった。これにより、エノラーゼ２４１ｃｉｔがＤＲ４マウスにおいてシトルリン特異的ＩＦＮγ応答を誘導したことが確認された。

エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドにより生じたサイトカイン応答の種類を決定するために、ex vivo ＩＬ－１０も評価した。ペプチド刺激に対する応答におけるエリスポットアッセイにおいて、ＩＬ－１０産生の有意な増加は観察されなかった（図３Ｂ）。

以前にシトルリン化ペプチド特異的応答は、ＣＤ４媒介されていることが示された。２４１ｃｉｔに対する応答がＣＤ４依存性であるかを決定するために、エリスポットアッセイを、ヒトＭＨＣクラスＩＩブロッキング抗体を用いて行った（クローンＬ２４３）（図３Ｃ）。ＩＦＮγ応答は、ヒトエノラーゼ２４１ｃｉｔ（p=0.0171）とマウス２４１ｃｉｔ（p=0.0023）の両方に対する応答において、Ｌ２４３により有意に減少した。２４１ｃｉｔ特異的応答がＣＤ４媒介されたかをさらに確認するために、エリスポットアッセイを、マウスＣＤ４もしくはＣＤ８ブロッキング抗体（それぞれクローンＧＫ１．５もしくはクローン２．４３）を含めてまたはＣＤ４濃縮または枯渇細胞画分を使用して実施した。ヒトエノラーゼ２４１ｃｉｔに対する応答は、ＣＤ４ブロッキング抗体の存在下において有意に減少したが、ＣＤ８ブロッキング抗体の存在下においては有意に減少しなかった（図１５Ａ）。応答も、ＣＤ４濃縮画分ではあったが、ＣＤ４枯渇画分ではなかった（図１５Ｂ）。エノラーゼ２４１－２６０は長いペプチドであるため、応答を認識する最適な１５ｍｅｒ配列を決定することとした。２４１－２６０配列にまたがる２つの１５ｍｅｒペプチドを応答について試験し、ａａ２４１－２５５は特異的応答を刺激したが、ａａ２４６－２６０について応答はなかった（図１５Ｃ）。

初回スクリーニングでみられた低頻度の応答を確認するために、ＤＲ４、Ｃ５７Ｂｌ／６およびＨＨＤ／ＤＲ１マウスに、２１－４０、１２６－１４５および３１６－３３５の位置の配列に対応するヒトシトルリン化エノラーゼペプチドの単回免疫化を行った（図４）。エノラーゼ２１ｃｉｔは、ＤＲ４マウスにおいてマウス配列に対して低レベルであるが有意な応答を誘導したが（p<0.01）、ヒト配列に対しては有意な応答は誘導しなかった。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいて、シトルリン化されたペプチドに対して応答する強力なＩＦＮγ応答が観察されたが、ｗｔペプチドに対しては観察されなかった（図２１ａ）。これらの応答は、ＣＤ４ブロッキング抗体で効率的にブロッキングされるが、ＣＤ８ブロッキング抗体では効率的にブロッキングされないので、ＣＤ４媒介されているようである（図２１ｂ）。エノラーゼ１２６ｃｉｔは、ＤＲ４マウスにおいてヒトペプチドに対して低レベルの有意な応答を誘導したが（p<0.05）、ＤＲ１／ＨＨＤマウスにおいては有意な応答は誘導しなかった。エノラーゼ３１６ｃｉｔは、ＤＲ４（p<0.01）マウスとＤＲ１／ＨＨＤ（p<0.01）マウスの両方において、ヒト配列に対して中程度の応答を誘導したが、マウス配列に対しては誘導しなかった。

またエノラーゼ配列を、オンラインＩＥＤＢ予測プログラムを使用して、ヒトおよびマウスＭＨＣクラスＩＩに対して高い結合親和性を有するペプチド配列についてin silico解析にかけた。これにより、ａａ１１－２５配列が、マウスＭＨＣクラスＩＩ（Ｉ－Ａｂ）に対して強力であることが示唆され、したがって、シトルリン化ａａ１１－２５ペプチドをＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける応答について試験した。マウスは、ｗｔペプチドに対して最小の反応性を有するマウス配列由来の等価配列と交差反応するこのシトルリン化ペプチドに対して、ＩＦＮγ応答を示した（図２２ａ）。ＩＬ－１０応答は、シトルリン化ｅｎｏ１１ペプチドに対しては見られなかった（図２２ｂ）。エノラーゼ１１ｃｉｔ特異的ＩＦＮγ応答は、ＣＤ４細胞によって媒介されており、その理由は、ＣＤ４ブロッキング抗体を用いてこれらをブロッキングすると応答が抑制されるが、一方でＣＤ８ブロッキング抗体を使用する場合は応答が影響されないからである（図２２ｃ）。

またＨＬＡ－ＤＰ４がエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドを提示することができるかを決定するために、トランスジェニックＤＰ４マウスを利用した。ＤＰ４マウスを、ヒトまたはマウスエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドのいずれかの３用量で免疫化した。ＩＦＮγ応答をエリスポットにより決定した（図５）。ヒトエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドで免疫化したマウスは、ヒトエノラーゼ２４１ｃｉｔ（p<0.0001）とマウス２４１ｃｉｔ（p<0.0001）の両方に対して応答を示し、野生型ペプチドと比較して増加したＩＦＮγ応答を示した（図５Ａ）。これらの応答は、１～０．１ｕｇ／ｍｌのペプチドのアビディティを示す（図１６Ａ）。ヒト２４１－２６０ｃｉｔペプチドで免疫化したマウス由来の細胞は、ｃｉｔペプチドではグランザイムＢを放出し、ＩＬ－１０は放出しない応答を示したが、ｗｔペプチドでは応答を示さなかった（図１６ＢおよびＣ）。またＤＰ４マウスにおけるヒト２４１－２６０ｃｉｔペプチドに対して特異的な応答も、ＣＤ４ブロッキング抗体によりブロックされるが、ＣＤ８ブロッキング抗体ではブロックされず、ａａ２４１－２５５にわたるより短いペプチドに対して交差反応性を示す（図１６ＤおよびＥ）。マウスエノラーゼ２４１－２６０ペプチドを用いたＤＰ４トランスジェニックマウスの免疫化も、シトルリン化ペプチドに対して特異的な応答を誘導したが、野生型に対しては誘導しなかった（図１６Ｆ）。

実施例３ 腫瘍細胞上に提示されるＣｉｔエノラーゼペプチドは、腫瘍療法のための標的とすることができる。

我々は、メラノーマＢ１６Ｆ１およびＬｅｗｉｓ肺癌細胞株が構成的にαエノラーゼを発現することをウェスタンブロッティングにより既に確立している（図６Ａ）。次に、エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチド免疫化の抗腫瘍効果をin vivoで評価した。構成性ヒトＤＲ４（Ｂ１６ＤＲ４）でトランスフェクトしたマウスＢ１６メラノーマ細胞株の増殖に対するエノラーゼ免疫化の効果を評価した。マウスは、エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドで免疫化する前に、Ｂ１６ＤＲ４で３日間チャレンジした。エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチド免疫化マウスは、対照マウスに対して有意な生存優位性を示した（図６Ｂ）。非免疫化マウスでは、４５日後に１５％の生存を示したが、エノラーゼ２４１ｃｉｔ免疫化マウスは５０％の生存を示した（p=0.0001）。腫瘍体積（図６Ｃ）は、腫瘍移植後１７日目に、対照群（中央値４９ｍｍ^３）と比較して、エノラーゼ２４１ｃｉｔ免疫化マウス（中央値０ｍｍ^３）で有意に低かった（p=0.0043）。

２４１－２６０ｃｉｔエピトープに対する応答がＤＰ４マウスでも実証されたので、ＤＰ４トランスジェニックマウスを、構成性ヒトＤＰ４（Ｂ１６ＤＰ４）を発現するマウスＢ１６メラノーマ株でチャレンジし、続いてエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドで免疫化した。エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチド免疫化マウスは、非免疫化マウスに対して有意な生存優位性（p=0.0058）を示し、６０日後の生存率はそれぞれ７０％および１０％であった（図１７）。

生存がこの腫瘍細胞株におけるＭＨＣクラスＩＩの構成性発現により影響されるかを決定するために、抗腫瘍効果をＨＬＡ－ＤＲ４発現がＩＦＮγ誘導性である（ｉＤＲ４）Ｂ１６細胞で評価した。マウスは、エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドで免疫化する前に、Ｂ１６ｉＤＲ４で４日間チャレンジした（図６Ｄ）。生存は、４２日目で、非免疫化対照動物（生存０％）と比較してエノラーゼ２４１ｃｉｔ免疫化群（９０％）で有意に増加した（p<0.0001）。腫瘍移植後１７日目の腫瘍体積（図６Ｅ）も、非免疫化対照マウス（中央値６５ｍｍ^３）と比較して、エノラーゼ２４１ｃｉｔ免疫化マウス（中央値０ｍｍ^３）で有意に低かった（p=0.0048）。免疫化群での高い生存％を考慮して、メモリが確立されていたかどうかを確認するために、これらのマウスをＢ１６ｉＤＲ４で４２日目に再チャレンジした。新たな未処置マウスも、対照群として腫瘍でチャレンジした。エノラーゼ免疫化生存マウスは、先の未処置対照マウスと比較して、再チャレンジで有意な生存優位性を示した（図６Ｆ）。再チャレンジの３９日後、エノラーゼ２４１ｃｉｔ免疫化群の生存は６７％であり、一方で対照群の全ては２９日目で死亡した（p=0.0112）。

この抗腫瘍効果がＢ１６ＤＲ４モデルに特異的であるかどうかを決定するために、マウスを次いでＬｅｗｉｓ肺癌細胞株ＬＬＣ２でチャレンジした（図７Ａ）。予備的研究により、ＬＬＣ２細胞はＢ１６細胞と比較して一貫した増殖を得るために、高い移植細胞数が要求されることが示唆された（データ示さず）。この理由により、我々の掌握している範囲で、ＬＬＣ２モデルはＢ１６モデルより攻撃的である。マウスを、親ＬＬＣ２または構成的にＤＲ４（ＬＬＣＤＲ４）を発現するようにトランスフェクトしたＬＬＣ２でチャレンジして、４日後エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドで免疫化した。生存データは、エノラーゼ２４１ｃｉｔ免疫化が、ＬＬＣＤＲ４腫瘍（p=0.0142）に対して生存優位性を与えることを示し、４０％のマウスが５８日目に生存していたが、対照では全てのマウスが４８日目に死亡した。しかしながら、親ＬＬＣ２腫瘍でチャレンジし、エノラーゼ２４１ｃｉｔで免疫化したマウスでは、わずかだが有意な生存時間の延長を示した（p=0.0005）。これらの結果は、腫瘍細胞におけるヒトＤＲ４発現は、このモデルの腫瘍拒絶のために重要であることを示唆する。

エノラーゼは、膵臓腫瘍株Ｐａｎ０２によっても発現される（図６Ａ）。この株を、構成的にＨＬＡ－ＤＲ４を発現するように改変し、ＤＲ４トランスジェニックマウスを腫瘍でチャレンジし、その４日後に、エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドで免疫化した。エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチド免疫化マウスは、非免疫化対照ＤＲ４マウスと比較してＰａｎ０２ＤＲ４モデルにおける有意に増強された生存（p=0.0076）を示す。５０％のマウスが６０日目で生存を示したが、非免疫化マウスは６０日目に生存していなかった（図１８）。

実施例４ ＤＮＡ免疫化によりシトルリン化エノラーゼに対する応答がもたらされる
ＡＰＣはシトルリン化エピトープを構成的に発現することができるので、エノラーゼをコードしているＤＮＡ構築物は、シトルリン化されており、応答を刺激してもよい可能性があった。したがって、ＨＬＡ－ＤＲ４トランスジェニックマウスを、マウスエノラーゼをコードしているＤＮＡ構築物で免疫化した。これらのマウスからの刺激されたＴ細胞を、シトルリン化と非シトルリン化エノラーゼ２４１ペプチドの両方に対するＩＦＮγの応答についてin vitroでスクリーニングした。図８Ａは、マウスが、シトルリン化マウスペプチドに対してのみ応答したことを示す（平均：ＩＦＮγ１８０／１００万個の脾細胞；p=0.0001）。Ｉｌ－１０応答は観察されなかった（図８Ｂ）。

次に、エノラーゼＤＮＡ免疫化の抗腫瘍効果をin vivoで評価した。マウスは、Ｂ１６ＤＲ４でチャレンジし、４日後にエノラーゼＤＮＡで免疫化した。エノラーゼＤＮＡ免疫化マウスは、対照マウスに対して有意な生存優位性を示した（図８Ｃ）。非免疫化マウスでは、４５日後に１５％の生存を示したが、エノラーゼＤＮＡ免疫化マウスは６０％の生存を示した（p=0.0001）。また腫瘍体積（図８Ｄ）は、腫瘍移植後１７日目に、対照群（中央値１５０ｍｍ^３）と比較して、エノラーゼＤＮＡ免疫化マウス（中央値２０ｍｍ^３）で有意に低かった（p=0.0088）。

実施例５ 様々なアジュバントおよび様々な用量で比較するとき、エノラーゼペプチドに対するＣＤ４応答が変動するかどうかの決定
エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドは、２５ｕｇの用量でアジュバントＣｐＧ／ＭＰＬＡと共に単回投与するとき、強力なＩＦＮγ応答を誘導する。生成される応答に対するアジュバントおよび用量レジメンの影響を調査した。マウスを、単回用量のエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドで、アジュバントとしてＣｐＧ／ＭＰＬＡまたは不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）のいずれかを用いて、免疫化した。ＣｐＧ／ＭＰＬＡ（p=0.0028）をアジュバントとしたとき、エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドに対するＩＦＮγ応答がエリスポットにより検出されたが、ＩＦＡをアジュバントとして使用したときは、ＩＦＮγ応答は見られなかった（図９Ａ）。ＩＬ－１０応答は、エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドをＩＦＡ（p<0.0001）と一緒に投与したときはエリスポットにより検出されたが、ＣｐＧ／ＭＰＬＡと一緒に投与したときは検出されなかった（図９Ｂ）。これらのアジュバントに加えて、他のＴＬＲアゴニストポリＩ：Ｃ（ＴＬＲ３）およびイミキモド（ＴＬＲ７）と組み合わせた応答を、ＤＲ４マウスとＤＰ４トランスジェニックマウスの両方で評価した。ポリＩ：Ｃとの組み合わせは、両方のマウス株でＩＦＮγ応答を誘導するが、ＩＬ－１０応答は誘導しない（図１９）。イミキモドと組み合わせたエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドは、ＤＰ４トランスジェニックマウスでＩＦＮγ応答を誘導するが、ＤＲ４トランスジェニックマウスでは誘導しない（図１９）。このことは、エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドを用いた免疫化により生じるサイトカイン応答の種類は、選択したアジュバントにより強く影響を受けうることを示唆している。

次に、ＧＭ－ＣＳＦを用いた免疫化に対する用量応答を評価した。マウスに２５μｇまたは５μｇのエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドのいずれかを用いて単回または３回免疫化を行った。ＩＦＮγ応答をエリスポットにより評価した（図９Ｃ）。検出可能な応答が２５μｇのペプチドを用いた１回または３回用量後に観察できた。次に、マウスを、Ｂ１６ＤＲ４でチャレンジし、ＧＭ－ＣＳＦ中５μｇのエノラーゼの３用量を３週間にわたって与え、抗腫瘍応答を誘導するために十分であるかを決定した（図９Ｄ）。エノラーゼ２４１ｃｉｔ免疫化マウスは、４５日目に７０％のマウスが生存したのに対して、対照群では２８日目に生存が０％であり、対照マウスに対して有意な生存優位性を有した（p=0.0045）。

実施例６ エノラーゼ２４１ｃｉｔメモリ応答
様々なアジュバントがエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドを用いた免疫化に対する応答を分極化する能力は、関与するＴ細胞集団の柔軟性を示唆し得る。これは既存のまたはメモリ応答を示してもよい。したがって、次に、エノラーゼｃｉｔ応答が発生する速さを決定した。マウスを、ＣｐＧ／ＭＰＬＡ中のエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドの単回用量で、屠殺される２、６または１４日前に免疫化した。ex vivoエリスポットを使用して、ＩＦＮγ応答を決定した（図１０）。ペプチドのマウスバージョンを用いた免疫化によりＩＦＮγ応答が誘導され、２日後に検出することができた。２、６または１４日後にみられる応答の間に有意な差異はなかった。ヒトエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドを用いた免疫化によりＩＦＮγ応答が導かれ、６日後に検出可能であった。応答は、２日後の応答と比較して、６日後（p=0.0009）および１４日後（p=0.0092）に有意に増加した。これらの結果は、内因性マウスペプチドに特異的であるエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドに対する既存の応答があってもよいことを示唆する。

実施例７ 健常ヒトドナーにおける応答
エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドに対するマウス応答は、免疫化後早くも２日目に検出することができる。このことは、ヒトがエノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドに対する検出可能な既存の応答を有しているかどうかという疑問を提起する。このことを調査するために、ＰＢＭＣを、６人の健常ドナーから単離し、ヒトエノラーゼペプチドの存在下で培養した。チミジン増殖アッセイを４、７および１１日後に細胞に対して実施し、それぞれについての増殖指標を計算した（図１１Ａ）。５／６のドナーが、試料採取日の少なくとも１つで、エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドに対する増殖を示した。たとえば、ドナー１は、エノラーゼ２４１ｃｉｔに対する増殖応答を１１日目（平均２０．４）および７日目（平均２８．６）に示したが、４日目は示さなかった（平均０．８）。エノラーゼ２４１ｗｔに対する応答は、１１日目（平均０．９）、７日目（平均１．２）および４日目（平均０．３）で一貫して低かった。対照的に、ドナー２は、１１日目で低レベルの応答（平均２．７）のみを示し、ドナー６は非応答者であった。それぞれのドナーについて、ＨＬＡ型を決定し、図に示す。

ドナー４は、４日目（平均１２．５）、７日目（平均２８）および１１日目（４．４）に高い増殖指標を示した。このドナーをさらなる解析のために選択した。上清を各時間点で細胞から取り出し、サイトカインレベルをLuminexにより解析した。培地のみの対照のバックグラウンドレベルを超える応答を、各サイトカインについて計算した（図１１Ｂ）。ＩＦＮγおよびＩＬ－１０は、経時的に増加したシトルリン化ペプチド特異的応答を示した。ＩＬ－１７、グランザイムＢおよびＴＮＦαレベルのいくらかの増加が野生型刺激細胞でみられたが、これらの応答はシトルリン化ペプチド刺激試料においてより高かった。

次いで、ドナー４からのＰＢＭＣをカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ：carboxyfluorescein succinimidyl ester）で標識した後、ペプチドの存在下でex vivo培養した。７および１０日目に、細胞を除去し、抗ＣＤ８および抗ＣＤ４蛍光色素（fluorochome）コンジュゲート抗体で染色し、フローサイトメトリーにより解析した（図１１Ｃ）。増殖ＣＦＳＥ^ｌｏｗ集団のうち、７３～９６％の細胞はＣＤ４＋であり、０～２％はＣＤ８＋であった。エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドは、エノラーゼ２４１ｗｔペプチドと比較して、ＣＦＳＥ^ｌｏｗＣＤ４^＋細胞の割合増加を示した。１０日目に、１５％のエノラーゼ２４１ｃｉｔリンパ球がＣＦＳＥ^ｌｏｗＣＤ４^＋であり、一方で１％のエノラーゼ２４１ｗｔペプチドがＣＦＳＥ^ｌｏｗＣＤ４^＋であった。

ＩＦＮγ応答は、エノラーゼ２４１ｃｉｔまたはｗｔペプチドで１３日間培養したＰＢＭＣをシトルリン化またはｗｔエノラーゼ２４１ペプチドで再刺激し、サイトカイン放出を測定したＩＦＮγエリスポットアッセイによっても、示された。図２０Ａは、ドナー１および４についてのＩＦＮγエリスポットアッセイの結果を示す。両方のドナーからの細胞は、シトルリン化ペプチドに対して応答を示すが、ｗｔペプチドに対しては応答を示さない。さらに、細胞内サイトカイン染色によるこれらの応答の解析は、ＩＦＮγ応答が、ＣＤ４媒介されていることを明らかにする。図２０Ｂは、ドナー４由来であり、１３日間エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドで培養し、シトルリン化またはｗｔペプチドのいずれかで再刺激したＰＢＭＣに対する細胞内サイトカイン染色を示す。ＩＦＮγ陽性ＣＤ４細胞は、シトルリン化ペプチド（０．４４％）を用いた刺激で観察されるが、ｗｔペプチドでは観察されない。３人のドナーの培養物からのLuminexデータは、シトルリン化エノラーゼ２４１ペプチドに対するＩＦＮγ応答を示しており、ｗｔペプチドに対する応答は最小であり、ＩＬ－１０、ＴＮＦαまたはＩＬ－１７応答は低レベルである（図２０Ｃ）。

これらの結果は、健常なヒトが、シトルリン特異的であってＴｈ１サイトカインを産生可能である、エノラーゼ２４１ｃｉｔペプチドに対するＣＤ４増殖応答を発生しうることを示唆する。

実施例８ 免疫組織化学
シトルリン化は、ＰＡＤ酵素、特にＰＡＤ２およびＰＡＤ４酵素によって実施される。これらは高レベルのカルシウムを必要とし、通常、死細胞、瀕死の細胞、またはオートファジーを経ている細胞において活性化される。健常細胞はシトルリン化タンパク質を発現しないが、腫瘍は、低酸素または栄養ストレスにより、オートファジーおよびシトルリン化エノラーゼを活性化する。それゆえ、結腸直腸、胃、肺、乳房および卵巣腫瘍は、エノラーゼの発現について染色された。

結腸直腸腫瘍： ２３２結腸直腸腫瘍を、ＥＮＯ－１特異的モノクローナル抗体で染色した（表２）。２８％の腫瘍は染色されなかったが、５６％は弱い染色（Ｈスコア１－１００）を示し、１３％は中程度の染色（Ｈスコア１０１－２００）を示し、３％は強い染色（Ｈスコア２０１－３００）を示し、ほとんどの細胞が激しく染色された。

胃腫瘍： ７０の胃腫瘍を、ＥＮＯ－１特異的モノクローナル抗体で染色した（表３）。１６％の腫瘍は染色されなかったが、６２％は弱い染色（Ｈスコア１－１００）を示し、１９％は中程度の染色（Ｈスコア１０１－２００）を示し、３％は強い染色（Ｈスコア２０１－３００）を示し、ほとんどの細胞が激しく染色された。

非小細胞肺腫瘍： ２２３の非小細胞肺腫瘍を、ＥＮＯ－１特異的モノクローナル抗体で染色した（表４）。２０％の腫瘍は染色されなかったが、５９％は弱い染色（Ｈスコア１－１００）を示し、１７％は中程度の染色（Ｈスコア１０１－２００）を示し、４％は強い染色（Ｈスコア２０１－３００）を示し、ほとんどの細胞が激しく染色された。

卵巣腫瘍： ２２３の卵巣腫瘍をＥＮＯ－１特異的モノクローナル抗体（表５）で染色した。４２％の腫瘍は染色されなかったが、５１％は弱い染色（Ｈスコア１－１００）を示し、２％は中程度の染色（Ｈスコア１０１－２００）を示し、５％は強い染色（Ｈスコア２０１－３００）を示し、ほとんどの細胞が激しく染色された。

乳房腫瘍： ８５８の乳房腫瘍を、ＥＮＯ－１特異的モノクローナル抗体で染色した（表６）。２８％の腫瘍は染色されなかったが、１９％は弱い染色（Ｈスコア１－１００）を示し、３６％は中程度の染色（Ｈスコア１０１－２００）を示し、１７％は強い染色（Ｈスコア２０１－３００）を示し、ほとんどの細胞が激しく染色された。

エストロゲン受容体陰性乳房腫瘍： ２４９のエストロゲン受容体陰性乳房腫瘍を、ＥＮＯ－１特異的モノクローナル抗体で染色した（表７）。８％の腫瘍は染色されなかったが、１４％は弱い染色（Ｈスコア１－１００）を示し、５５％は中程度の染色（Ｈスコア１０１－２００）を示し、２３％は強い染色（Ｈスコア２０１－３００）を示し、ほとんどの細胞が激しく染色された。

実施例９
異なる種間のエノラーゼの相同性
エノラーゼは、マウス、イヌ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタおよびヒトの間で高度に保存されている（図１２～１４）。ワクチンはヒトおよびマウスにおけるＴ細胞応答ならびにマウスにおける抗腫瘍応答を誘導するので、同様の応答が他種でもみられると推定することができる。

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Claims (10)

1. ＶＩＧＭＤＶＡＡＳＥＦＦｃｉｔＳＧＫＹＤＬＤ、
   ＶＩＧＭＤＶＡＡＳＥＦＹｃｉｔＳＧＫＹＤＬＤ、
   ＥＶＤＬＦＴＳＫＧＬＦｃｉｔＡＡＶＰＳＧＡＳ、
   ＥＶＤＬＹＴＡＫＧＬＦｃｉｔＡＡＶＰＳＧＡＳ、
   ＫＧＶＰＬＹｃｉｔＨＩＡＤＬＡＧＮＳＥＶＩＬ、
   ＫＧＶＰＬＹｃｉｔＨＩＡＤＬＡＧＮＰＥＶＩＬ、
   ＶＧＤＤＬＴＶＴＮＰＫｃｉｔＩＡＫＡＶＮＥＫ、
   ＶＧＤＤＬＴＶＴＮＰＫｃｉｔＩＡＫＡＡＳＥＫ、
   ＩＦＤＳｃｉｔＧＮＰＴＶＥＶＤＬＦ、または
   ＩＦＤＳｃｉｔＧＮＰＴＶＥＶＤＬＹ
   （ここで「ｃｉｔ」は、シトルリンを表す）から選択されるアミノ酸配列、あるいは
   ｉｉｉ）非シトルリン位置での１、２もしくは３個のアミノ酸置換および／または１、２もしくは３個のアミノ酸挿入および／または１、２もしくは３個のアミノ酸欠失を有するｉ）のアミノ酸配列
   を含むか、またはそのアミノ酸配列から本質的になるか、またはそのアミノ酸配列からなるペプチド。
2. 請求項１に記載のペプチドをコードする核酸。
3. 請求項１に記載のペプチドに結合する結合部分。
4. 抗体である、請求項３に記載の結合部分。
5. 請求項１に記載のポリペプチドおよび／または請求項２に記載の核酸および／または請求項３もしくは請求項４に記載の結合部分を、薬学的に許容される担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
6. 薬における使用のための、請求項１に記載のペプチドおよび／または請求項２に記載の核酸および／または請求項３もしくは請求項４に記載の結合部分。
7. がんの処置における使用のための、請求項４に記載の使用のためのペプチドおよび／または核酸および／または結合部分。
8. 前記がんが、エストロゲン受容体陰性乳がんを含む乳がん、結腸直腸がん、胃がん、非小細胞肺がん、子宮内膜癌を含む卵巣がん、膵管腺癌を含む膵臓がん、白血病、メラノーマ、頭頸部がんまたは肺がんである、請求項５に記載の使用のためのペプチドおよび／または核酸および／または結合部分。
9. 前記使用が、ヒトまたは獣医学的使用である、請求項７または請求項８に記載の使用のためのペプチドおよび／または核酸および／または結合部分。
10. 前記核酸がエノラーゼをコードしている、請求項７、８または９に記載の使用のための核酸。

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