KR20180030552A - 개질된 자가-에피토프에 대한 항종양 면역 반응 - Google Patents

개질된 자가-에피토프에 대한 항종양 면역 반응 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암 면역요법을 위한 표적으로서 사용될 수 있는 개질된 시트룰린화된 에놀라제 펩타이드(modified citrullinated enolase peptide)에 관한 것이다. 이러한 펩타이드는 백신 또는 단일클론성 항체(mAb) 요법을 위한 표적으로 사용될 수 있다. 이러한 백신 또는 단일클론성 항체는 암 치료에 사용될 수 있다.

Description

개질된 자가-에피토프에 대한 항종양 면역 반응
본 발명은 일반적으로 암 면역요법을 위한 표적으로서 사용될 수 있는 개질된 펩타이드에 관한 것이다. 개질된 펩타이드는 시트룰린화된 에놀라제 펩타이드(citrullinated enolase peptide)일 수 있다. 이러한 개질된 펩타이드는 백신 또는 단일클론성 항체(mAb) 요법을 위한 표적으로 사용될 수 있다. 이러한 백신 또는 단일클론성 항체는 암 치료에 사용될 수 있다.
효과적이기 위해서, 암 백신은 내약성을 파괴하고 면역억제성 종양 환경을 극복할 수 있는 강력한 면역 반응을 유도할 필요가 있다. 종양 파괴를 매개하는데 있어 CD4 T 세포의 중요성이 최근 강조되었지만 자아-특이적 CD4 반응의 유도가 더욱 어렵다는 것이 입증되었다. 대조적으로, 개질된 자가-에피토프를 인식하는 CD4 T 세포는 류마티스성 관절염 (rheumatoid arthritis, RA), 콜라겐 II-유도성 관절염, 유육종증, 복강 질환 및 건선과 같은 여러 가지 자가면역 질환의 병태 생리학에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다(Choy, 2012, Grunewald and Eklund, 2007, Coimbra et al., 2012, Holmdahl et al., 1985)). 이러한 일반적인 개질 중 하나는 아르기닌의 양전하 알디민 기(= NH)가 시트룰린(citrulline)의 중성 전하 케톤 기(= O)로 전환되는 것을 포함하는 아르기닌의 시트룰린화이다. 시트룰린화(Citrullination)는 다양한 조직에서 발견되는 칼슘 의존 효소 계열인 펩티딜아르기닌 데이미나제 (peptidylarginine deiminase, PAD)에 의해 매개된다. 아일랜드(Ireland) 등의 최근 보고서(2011년)에서는 APC 상 시트룰린화된 T 세포 에피토프의 존재가 또한 자가포식(autophagy) 및 PAD 활성에 좌우된다는 것을 입증한다. 이 과정은 전문적인 APC 및 상피 세포 내 MHC 유형 II 분자 상에 제공하기 위한 내인성 항원의 처리를 가능하게 하는 효율적인 메카니즘임이 증명되었다(참고문헌: Munz, 2012, Schmid 등, 2007). 자가포식은 APC에서 구성되지만 다른 세포의 스트레스(stress)에 의해서만 유도된다(참고문헌: Green and Levine, 2014). 이에 따라, 시트룰린화된 에피토프를 인식하는 T 세포는 정상적인 건강한 세포에는 표적을 갖지 않는다. 자가포식은 저산소증 및 영양 결핍과 같은 스트레스에 의해 유발되고 종양 생존을 촉진하기 위해 상향 조절된다(참고문헌: Green and Levine, 2014).
시트룰린화된 하나의 단백질은 세포질에서 발견되는 당분해효소(glycolytic enzyme)인 에놀라제(enolase)이다. 또한 플라스미노겐(plasminogen) 수용체로서 역할을 하는 세포 표면에서도 발현된다(참고문헌: Miles 등, 1991). 포유 동물에는 4가지의 분명한 유전자에 의해 암호화되는 4 가지 아형의 에놀라제 효소가 존재한다(참고문헌: Diaz-Ramos 등, 2012). ENO1 유전자는 거의 모든 성인 조직에서 발현되는 알파-에놀라제를 암호화(encode)한다. ENO2 (베타-에놀라제)는 근육 조직에서 발현되고 ENO3(감마-에놀라제)는 뉴런에서 발견된다(참고문헌: Marangos 등, 1978). 보다 최근에는 정자에서만 독점적으로 발현되는 제4 변이체 ENO4가 동정되었다(참고문헌: Nakamura 등, 2013). 효소 활성인 에놀라제는 동종- 또는 이종 이량체일 수 있는 2개의 서브유닛(subunit)으로 구성된다(참고문헌: Pancholi, 2001).
ENO1 및 ENO3은 CNS에서 시트룰린화된 단백질(참고문헌: Jang 등, 2008, Jang 등, 2010)으로서 및 류마티스성 관절염에서 자가항원(참고문헌: Kinloch 등, 2005, Kinloch 등, 2008, Lundberg 등, 2008, Mahdi 등, 2009)으로서 동정된다. 보다 최근에는 ENO1에서 Arg9의 시트룰린화, ENO1 및 ENO3에서 Arg9의 시트룰린화 및 ENO3에서 Arg9의 시트룰린화를 인식하는 단클론 항체가 기재되어 있으며(참고문헌: Jang 등, 2012), 시트룰린화된 에놀라제가 효소 활성을 상실하고, 칼파인(calpain)-1에 의해 보다 빠르게 분해되지만, 시트룰린화는 ENO1과 ENO3의 플라스미노겐 결합 활성을 증가시킴이 나타났다. 다수의 시트룰린화된 에놀라제 펩타이드가 인간 MHC II에 결합된다는 사실이 기재되어 있으며(참고문헌: WO2012138294 A1) 시트룰린화된 에놀라제 펩타이드는 류마티스성 관절염 환자에서 T 세포를 활성화시켜 IL-17을 생산할 수 있다.
세포 표면에서 혐기성 당분해 및 플라스미노겐의 국소화와 관련된 에놀라제의 역할은 항종양 요법을 위한 가능한 목표로서 강조되고 있다. 첫째, 종양 미세환경에서의 저산소증은 고형 종양의 성장 중에 중요한 요소이다. 그러므로, 분해 효소의 상향 조절은 종양 생존을 위해 필요하다. ENO1 프로모터는 저산소 스트레스에 반응하여 세포에서 상향 조절되는 저산소 반응 요소를 포함한다(참고문헌: Semenza 등, 1996). 둘째, 세포 표면 에놀라제는 플라스미노겐 활성제에 의해 플라스미노겐을 플라스민으로 절단시키는 플라스미노겐 결합 분자로서 작용한다. 이 과정은 악성종양과 연관된 상승된 수준의 플라스미노겐 활성제와 함께 세포 침입에 중요하다(참고문헌: Andreasen 등, 2000). 이 모든 기능들은 에놀라제가 종양 성장 및 전이에 적극적인 역할을 수행한다는 것을 의미한다. 에놀라제를 치료학적으로 표적화하기 위한 여러 접근법이 개발되었다. ENO1 사일런싱(silencing)은 생체 외에서 자궁 내막 세포 당분해, 증식 및 이동을 감소 시켰으며 생체 내에서 세포 성장을 유의하게 억제하였다(참고문헌: Zhou 등, 2010). 유사하게, 항-ENO1 mAb의 투여는 인간 췌장 세포주 CFPAC-1의 생체 내 성장 및 전이를 감소시키는 것으로 나타났다(참고문헌: Principe 등, 2015).
ENO1은 자궁 내막 암종(endometrial carcinoma), 췌장관 선암(pancreatic ductal adenocarcinoma), 및 비-소세포성 폐암(non-small cell lung cancer)을 포함하는 다수의 암 조직에서 과발현되는 것으로 나타났다(참고문헌: Zhao 등, 2015, Cappello 등, 2009, Fu 등, 2015). 또한, 높은 에놀라제 발현은 유방암, 간세포암 및 위암을 포함하는 다수의 종양에 대한 불량한 임상 결과와 상관 관계가 있다(참고문헌: Capello 등, 2011에 검토됨). 폐암의 경우, 17 명의 환자 중 11 명에게서 종양 세포에서 ENO1 발현의 상향 조절이 관찰되었다. ENO1 발현이 높을수록 질병 재발 및 진행된 종양 단계와 상관 관계가 있었다(참고문헌: Chang 등, 2006).
췌장암(pancreatic), 백혈병(leukaemia), 흑색종(melanoma), 두경부암(head and neck), 유방암(breast) 및 폐암(lung)을 포함한 다수의 환자에서 ENO1이 자가 항원으로 밝혀졌다(참고문헌: Capello 등, 2011). 췌장암에서, ENO1은 생체 외(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 둘 다에서 CD4 및 CD8 T 세포 반응을 유도(참고문헌: Cappello 등, 2009)하여 췌장관 선암 세포의 성장을 억제하였으나 특이성 T 에피토프는 동정되지 않았다. 두경부암에서, HLA-DR8 제한 펩타이드(aa 321-336)는 세포 독성 CD4 T 세포 반응을 자극했다(참고문헌: Kondo 등, 2002). ENO1로 백신접종한 췌장관 선암(pancreatic adenocarcinoma) 유전 모델에서, 종양에 대한 DNA 유발된 체액성 및 세포성 면역 반응은 종양 진행을 지연시키고 생존율을 현저하게 증가시킨다(참고문헌: Cappello 등, 2013). 암에서의 진단 및 치료제로서의 야생형 에놀라제 항원의 용도가 기술되어있다(참고문헌 미국 특허 제7645453호 B2). 또한, 알파-에놀라제를 표적으로 하는 제제는 종양 세포의 화학 요법제에 대한 감수성을 증가시키는 방법으로 기술되었다(참고문헌 WO 2007072219 A2). 우리는 시트룰린화된 비멘틴 펩타이드(citrullinated Vimentin peptide)가 종양 거부 및 장기간 생존이라는 결과를 가져오는 CD4-매개 면역 반응을 유도할 수 있음을 앞서 밝혀냈다(참고문헌: (WO2014023957 A2). 그러나, 에놀라제에 대해 측정된 모든 면역 반응은 야생형 또는 인산화된 에놀라제를 인식하였지만 시트룰린화된 에놀라제를 인식하지 않았으며, 이는 이 효소가 암에서 시트룰린화되지 않았음을 시사한다.
본 발명자들은 정상 공여자 및 HLA 유전자이식 마우스에서, 시트룰린화된 에놀라제 펩타이드를 인식하고 IFNγ를 생성하는 T 세포의 레퍼토리(repertoire)가 있음을 보여 주었다. 본 발명자들은 또한 특정 시트룰린화된 에놀라제 펩타이드가 생체 내에서 T 세포 반응을 발생시키고 이로써 암 치료를 위한 백신 표적으로 사용될 수 있음을 보여주었다.
본 발명의 제1 국면에 따르면,
VIGMDVAASEFFcitSGKYDLD (Eno1 241-259),
VIGMDVAASEFYcitSGKYDLD (Eno2/3 241-259),
EVDLFTSKGLFcitAAVPSGAS (Eno1 21-40),
EVDLYTAKGLFcitAAVPSGAS (Eno3 21-40),
KGVPLYcitHIADLAGNSEVIL (Eno1 126-145),
KGVPLYcitHIADLAGNPEVIL (마우스 Eno1 126-145),
VGDDLTVTNPKcitIAKAVNEK (Eno1 316-335) 또는
VGDDLTVTNPKcitIAKAASEK (마우스 Eno1 316-335)
IFDScitGNPTVEVDLF (Eno1 11-25)
IFDScitGNPTVEVDLY (Eno3/마우스 Eno1 11-25)로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 또는 구성된 펩타이드로서,
여기서 "cit"는 시트룰린(citrulline)을 나타내거나, 또는
iii) 비-시트룰린(non-citrulline) 위치에서 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 삽입, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실을 제외한, i)의 아미노산 서열인, 펩타이드를 제공한다.
본 발명자들은 예상치 않게 에놀라제 유래의 이들 시트룰린화된 펩타이드를 사용하여 췌장암, 백혈병, 흑색종, 두경부암, 유방암 및 폐 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는 종양에 대해 면역 반응을 일으킬 수 있음을 밝혀냈다. 본 발명자들은 단지 다음의 2 개의 펩타이드가 시트룰린화된 자가 에놀라제 에피토프에 대해 생체 내에서 T 세포 반응을 발생시켰음을 보여주었다:
VIGMDVAASEFFcitSGKYDLD/VIGMDVAASEFYcitSGKYDLD - 253 번 위치에서 시트룰린화된 에놀라제 241-260 및 EVDLFTSKGLFcitAAVPSGAS/EVDLYTAKGLFcitAAVPSGAS - 32 번 위치에서 시트룰린화된 에놀라제 21-40
다음의 3 개의 펩타이드는 마우스와 상동성이 없어서 외부 항원으로 인식되는 시트룰린화된 인간 에피토프에 대해 생체 내에서 T 세포 반응을 발생시켰다:
KGVPLYcitHIADLAGNSEVIL/KGVPLYcitHIADLAGNPEVIL - 132 번 위치에서 시트룰린화된 에놀라제 126-145,
VGDDLTVTNPKcitIAKAVNEK/VGDDLTVTNPKcitIAKAASEK - 328 번 위치에서 시트룰린화된 에놀라제 316-335, 및
IFDScitGNPTVEVDLF/ IFDScitGNPTVEVDLY - 15 번 위치에서 시트룰린화된 에놀라제 11-25.
시트룰린화된 펩타이드는 자가면역 환자에서 공유 HLA DR4DR4 모티프(the shared HLA DR4DR4 motif)로 T 세포 반응을 자극하는 것으로 알려져 있다. 대조적으로, 본 발명자는 253 위치에서 시트룰린화된 에놀라제 241-260이 HLA-DP4 유전자이식 마우스에서 강력한 T 세포 반응을 자극할 수 있다는 것을 처음으로 보여 주었다. HLA-DP4는 개체군의 70%에서 발현되므로 고형 종양 치료에 유망한 백신이 된다. 253 위치에서 시트룰린화된 에놀라제 241-260에 대한 반응을 보이는 모든 정상 공여자는 HLA-DP4를 발현하였다. 253번 위치에서 시트룰린화된 에놀라제 241-260에 대한 반응은 가장 강했고 개질되지 않은 서열에 대해 최소한의 반응성을 보였다. 이 시트룰린화된 펩타이드 에피토프에 특이적인 T 세포는 종양 세포를 표적하여 생체 내에서 강한 항종양 효과를 유도할 수 있고, 이에 따라, 암 치료를 위한 백신 표적으로서 시트룰린화된 에놀라제 241-260를 사용하는 것에 관한 첫 번째 증거가 제공된다.
ENO1, ENO2 및 ENO3는 고도로 보존되어 있고, 모두 253번 펩타이드 위치에서 시트룰린화된 두 개의 에놀라제 241-260 중 하나 또는 다른 하나를 발현한다. 대조적으로, ENO4는 유전자 서열 내 이 시점에서 큰 반전을 갖는다. 따라서, ENO1, ENO2 또는 ENO3를 표적화하기 위해, 253번 위치에서 시트룰린화된 에놀라제 241-260 및 이를 암호화하는 핵산을 사용할 수 있다.
이전의 연구는 253 위치에서 시트룰린화된 에놀라제 241-260이 RA 환자에서 T 세포 반응을 자극할 수 있음을 보여 주었다(참고문헌: WO2012138294). 본 명세서의 실시예에서 상세히 기술된 바와 같이, DNA 작제물(DNA construct) 내의 에놀라제 에피토프가 시트룰린화된 에놀라제에 대한 면역 반응을 자극하는지 여부를 시험하기 위해, 마우스를 에놀라제 에피토프를 암호화하는 DNA로 면역화시키고 비개질된(unmodified) 에피토프 및 시트룰린화된 에피토프에 대한 반응을 스크리닝하였다. 전체 에놀라제 서열을 암호화하는 DNA로 면역화된 마우스는 253번 위치에서 시트룰린화된 에놀라제 241-260에만 반응하였다. 이것은 DNA가 번역될 때, 에놀라제 241-260 펩타이드가 우선적으로 시트룰린화되고, 시트룰린화된 펩타이드가 MHC에 보다 높은 친화성으로 결합하거나, 또는 개질되지 않은 에놀라제 에피토프로 자극된 T 세포가 시트룰린화된 펩타이드를 보다 열광적으로 인식한다는 것을 시사한다.
DNA 내 암호화하는 에피토프는 시트룰린화된 T 세포 반응을 제공하였다는 것을 보여주는 것 외에도, 253번 위치 펩타이드 단독에서 시트룰린화된 에놀라제 241-260가 개질된 에피토프만을 인식하는 Th1 반응을 자극하였고, 야생형 펩타이드에 대해서는 교차 반응(cross reaction)이 없음을 보여주었다. 정상 공여자가 253번 위치 펩타이드에서 시트룰린화된 에놀라제 241-260으로 자극되었을 때, 4/6 공여자는 253번 위치에서 시트룰린화된 에놀라제 241-260에 대한 반응을 나타내지만 야생형 펩타이드는 반응하지 않았다. 이 반응은 CD4 Th1 반응인 것으로 나타났다. RA 환자와 현저하게 대조적으로, IL-17은 생산되지 않았다.
253번 위치 펩타이드에서 시트룰린화된 에놀라제 241-260을 다양한 보조제로 면역화하였다. CpG/MPLA, Poly I:C, 이미퀴모드(immiquimod)와 같은 면역 자극 보조제는 Th1 반응을 자극했으며, 보조제가 없을 때 반응이 없었기 때문에 필요했다. 불완전 프로인트 보조제(Incomplete Freund's adjuvant)와 같은 불활성 보조제는 대부분의 IL-10 반응의 유도를 유발하여 iTreg 반응을 유도하였다.
삽입된 아미노산 및 치환된 아미노산은 자연 발생 아미노산일 수 있거나 또는 자연 발생이 아닌 아미노산일 수 있으며, 예를 들어, 비-자연 측쇄(non-natural side chain)를 함유할 수 있다. 하나 이상의 아미노산 잔기(amino acid residue)가 치환 및/또는 삽입되는 경우, 치환/삽입된 아미노산 잔기(amino acid residue)는 서로 동일하거나 상이할 수 있다. 각각의 치환 아미노산은 치환되는 아미노산과는 다른 측쇄를 가질 수 있다.
에놀라제는 유전자가 클로닝된 이들 종(닭, 마우스, 개, 양, 소, 말, 돼지 및 인간)간에 고도로 보존되어있다. 따라서, 본 발명의 펩타이드는, 이러한 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산과 임의로 조합하여, 인간이 아닌 포유 동물에서 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 위에 제시한 아미노산 서열을 갖는 펩타이드 및 이에 대해 실질적인 동일성, 예를 들어 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%의 동일성을 갖는 펩타이드, 의약에 있어서 이들 펩타이드의 용도, 및 특히 암 치료 방법에서의 용도를 본 발명의 범위 내에 포함한다. 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 핵산 서열의 퍼센트 동일성은 일반적으로 최적의 비교 목적을 위해 서열을 정렬하고(예를 들어, 갭(Gaps)은 제2 서열과의 최상의 정렬을 위해 제1 서열에 도입될 수 있음) 상응하는 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교함으로써 결정된다. "최상의 정렬(best alignment)"은 가장 높은 퍼센트의 동일성을 가져오는 두 개의 서열의 정렬이다. 퍼센트 동일성은 서열 내의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 수(즉, %동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100)를 비교함으로써 결정된다.
두 서열 간의 동일성 퍼센트의 결정은 당업자에게 공지된 수학적 알고리즘을 사용하여 달성할 수 있다. 두 서열을 비교하기 위한 수학적 알고리즘의 예는 문헌(Karlin and Altschul, 1993)에서와 같이 개질된 칼린(Karlin) 및 알츠슐(Altschul)의 알고리즘이다. 알츠슐 등의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램은 이러한 알고리즘을 통합했다 (Altschul 등, 1990). BLAST 뉴클레오타이드 검색은 NBLAST 프로그램, 스코어(program, score) = 100, 단어 길이(wordlength) = 12로 수행되어 본 발명의 핵산 분자에 상동인 뉴클레오타이드 서열을 수득할 수 있다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어 = 50, 단어 길이 = 3으로 수행되어 본 발명의 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 비교 목적을 위한 갭 정렬을 얻기 위해, Gapped BLAST를 문헌(Altschul 등, 1997)에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. 대안적으로, PSI-Blast를 사용하여 분자 간의 먼 관계를 감지하는 반복 검색을 수행할 수 있다. BLAST, Gapped BLAST 및 PSI-Blast 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램 (예: XBLAST 및 NBLAST)의 기본 매개 변수를 사용할 수 있다. 사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)를 참조한다. 서열 비교에 사용되는 수학 알고리즘의 또 다른 예는 마이어스(Myers) 및 밀러(Miller) (참고: Myers and Miller, 1989)의 알고리즘이다. GCG 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)은 이러한 알고리즘을 통합하였다. 당업계에 공지된 서열 분석을 위한 기타 알고리즘은 문헌(Torelli and Robotti, 1994)에 기재된 ADVANCE 및 ADAM 및 문헌(Pearson and Lipman, 1988)에 기재된 FASTA를 포함한다. FASTA에서 ktup은 검색의 민감도와 속도를 설정하는 제어 옵션이다.
본 발명의 펩타이드는 Fmoc 화학 또는 당업자에게 공지된 기타 표준 기술을 사용하여 합성될 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드를 생산하는 또 다른 편리한 방법은 펩타이드를 암호화하는 핵산을 발현하는 것으로, 발현 시스템에서 핵산을 사용한다.
본 발명자들은 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 핵산으로 면역화하는 것이 시트룰린화된 펩타이드에 대한 면역 반응을 제공하지만 야생형 비-시트룰린화된 펩타이드에 대한 면역 반응을 제공하지 않는다는 것을 보여 주었다. 이에 따라, 본 발명은 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 분리된 핵산을 추가로 제공한다. 바람직한 국면에서, 본 발명은 위에 정의된 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 핵산을 제공한다.
본 발명자들은 또한 전장 에놀라제가 암호화된 DNA 또는 RNA와 같은 핵산의 투여가 253번 위치에서 시트룰린화된 에놀라제 241-260에만 강한 면역 반응을 일으킨다는 것을 발견했다. 이는 본 발명의 추가의 국면을 형성한다. 전장의 에놀라제의 아미노산 서열의 예는 본 명세서의 실시예 및 도면에 기재되어 있으며, 당해 기술 분야의 당업자의 기술에서 이러한 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열이 제공된다.
당업자는 여전히 본 발명의 펩타이드를 제공할 수 있는 이러한 핵산에 대한 치환, 결실 및/또는 부가를 결정할 수 있을 것이다. 핵산은 클로닝에 의해 수득되거나 또는 화학 합성에 의해 제조된 mRNA와 같은 DNA, cDNA 또는 RNA일 수 있다. 치료학적 사용을 위해, 핵산은 바람직하게는 치료될 대상에서 발현될 수 있는 형태이다. 본 발명의 펩타이드 또는 본 발명의 핵산은 분리물(isolate)로서 분리된 및/또는 정제된 형태로 제공되거나 또는 자연적으로 결합된 물질을 함유하지 않거나 실질적으로 함유하지 않을 수 있다. 핵산의 경우, 발현을 위한 하나 이상의 조절 서열(들)을 가능한 제외하고 인간 게놈에서 유전자에 인접한 핵산이 존재하지 않거나 실질적으로 존재하지 않을 수 있다. 핵산은 전적으로 또는 부분적으로 합성될 수 있으며 게놈 DNA, cDNA 또는 RNA를 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 핵산이 RNA를 포함하는 경우, 나타낸 서열에 대한 참조는 RNA 등가물에 대한 참조로 해석되어야 하며, U는 T로 치환된다.
본 발명의 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 예를 들어 본 명세서에 포함된 정보 및 참고 문헌 및 당업계에 공지된 기술(예를 들어 참고문헌: Sambrook, 1989, Ausubel, 1992)을 사용하여 당업자가 용이하게 제조할 수 있으며, 이용 가능한 핵산 서열 및 클론을 제공한다. 이러한 기술은 (i) 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 사용하여 예를 들어 게놈 공급원으로부터 이러한 핵산의 시료를 증폭하는 단계, (ii) 화학적 합성 단계, 또는 (iii) cDNA 서열을 제조하는 단계를 포함한다. 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA는 암호화하는 DNA를 취하고, 발현될 부분의 어느 한 면의 적당한 제한 효소 인식 부위를 동정하고, DNA로부터 상기 부분을 잘라내는 것을 포함하여, 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법으로 생성되고 사용될 수 있다. 이어서, 상기 부분은 상업적으로 이용 가능한 표준 발현 시스템에서 적합한 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 또 다른 재조합 방법은 적합한 PCR 프라이머로 DNA의 관련 부분을 증폭시키는 것이다. 서열에 대한 개질은 예를 들어, 부위 지정 돌연변이 유발(site directed mutagenesis)을 사용하여 개질된 펩타이드의 발현을 유도하거나 또는 핵산을 발현하는데 사용된 숙주 세포에서 코돈 선호도를 고려하기 위해 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 위에 기재한 바와 같은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 플라스미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트(expression cassettes) 형태의 작제물(constructs)을 제공한다. 본 발명은 또한 위에 기재한 바와 같은 하나 이상의 작제물을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 언급한 바와 같이, 본 발명의 펩타이드를 암호화하는 핵산은 본 발명의 하나의 국면을 형성하고, 암호화한 핵산으로부터 발현을 포함하는, 조성물의 생산 방법을 포함한다. 발현은 핵산을 함유하는 재조합 숙주 세포를 적절한 조건하에 배양함으로써 편리하게 달성될 수 있다. 발현에 의한 생산 후, 임의의 적합한 기술을 사용하여 조성물을 분리 및/또는 정제한 다음 적절하게 사용할 수 있다.
다양한 상이한 숙주 세포에서 폴리펩타이드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템은 잘 알려져 있다. 적합한 숙주 세포는 박테리아, 포유류 세포, 효모 및 바큘로바이러스 시스템을 포함한다. 이종 폴리펩타이드의 발현을 위해 당업계에서 이용 가능한 포유류 세포주에는 차이니즈 햄스터 난소 세포, HeLa 세포, 베이비 햄스터 신장 세포, NSO 마우스 흑색종 세포 및 많은 다른 것들이 포함된다. 일반적으로 선호되는 박테리아 숙주는 대장균(E. coli)이다. 대장균과 같은 원핵 세포에서의 항체 및 항체 단편의 발현은 당업계에 잘 확립되어있다. 배양 중 진핵 세포에서의 발현은 또한 예를 들어 최근 검토된 문헌(참고: Reff, 1993, Trill 등, 1995)을 참조하여 특정 결합 구성원의 생산을 위한 옵션으로서 당업자에게 이용 가능하다. 검토를 위해 예를 들어 문헌(Pluckthun, 1991)을 참고한다. 배양 중 진핵 세포에서의 발현은 또한 예를 들어 최근 검토된 문헌(참고: Reff, 1993, Trill 등, 1995)을 참조하여 특정 결합 구성원의 생산을 위한 옵션으로서 당업자에게 이용 가능하다.
적절한 벡터는 프로모터 서열, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 마커 유전자 및 기타 적절한 서열을 포함하는 적절한 조절 서열을 함유하도록 선택되거나 구성될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스성일 수 있으며, 적절한 경우, 파지 또는 파지 미드일 수 있다. 자세한 내용은 예를 들어, 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, 1989)]을 참고한다. 핵산 조작을 위한 많은 공지된 기술 및 프로토콜, 예를 들어 핵산 구조물의 준비, 돌연변이 유발, 시퀀싱, DNA의 세포 내로의 도입 및 유전자 발현, 단백질 분석은 문헌[참고: Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel, 1992)]에 상세하게 기재되어 있다.
따라서, 본 발명의 추가의 국면은 본 명세서에 개시된 바와 같은 핵산을 함유하는, 분리될 수 있는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 국면은 이러한 핵산을 숙주 세포에 도입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 임의로 가능한 기술을 사용하여 도입할 수 있다. 진핵 세포의 경우, 적절한 기술에는 인산칼슘 형질감염(calcium phosphate), DEAE-덱스트란(DEAE-Dextran), 전기천공법(electroporation), 리포좀-매개 형질감염(liposome-mediated transfection) 및 레트로 바이러스(retrovirus) 또는 기타 바이러스, 예를 들면, 우두바이러스(vaccinia) 또는 곤충 세포의 경우 바큘로 바이러스(baculovirus)를 이용한 형질도입이 포함될 수 있다. 박테리아 세포의 경우 적합한 기술로는 염화칼슘 형질전환, 전기천공법, 및 박테리오파지(bacteriophage)를 이용한 형질감염이 포함될 수 있다. 핵산으로부터의 발현, 예를 들면, 유전자 발현 조건 하에서 숙주 세포를 배양함으로써 발현을 야기하거나 허용함으로써 도입될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈(예: 염색체)에 통합된다. 통합은 표준 기술에 따라 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 포함시킴으로써 촉진될 수 있다.
본 발명은 또한 기술한 바와 같이 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 발현 시스템에서 위에 언급된 바와 같은 작제물을 사용하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 본 발명의 폴리펩타이에 특이적으로 결합하는 결합 잔기를 동정 및/또는 분리하는데 사용될 수 있다. 이러한 결합 잔기는 면역 요법 시약으로서 사용될 수 있고 항체를 포함할 수 있다. 따라서, 추가적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 폴리펩타이드에 결합하는 결합 잔기를 제공한다.
본 발명의 결합 잔기(binding moiety)는 항체일 수 있다. 본 명세서에 사용된 용어 "항체"는, 천연적으로 또는 부분적으로 또는 완전히 합성적으로 생성되는 것에 관계없이 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 부분, 즉 항원에 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 의미한다. 용어 "항체"는, 천연적으로 또는 완전히 또는 부분적으로 합성적이든지 간에 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩타이드, 또는 항체 결합 도메인에 상동인 결합 도메인을 갖는 임의의 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함하는 항체 단편, 항체의 유도체, 기능적 동등물 및 동족체를 포함한다. 따라서, 다른 폴리펩타이드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인 또는 동등물을 포함하는 키메라 분자가 포함된다. 키메라 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023에 기재되어있다. 인간화된 항체는 인간이 아닌, 예를 들어, 생쥐 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 불변 영역을 갖는 개질된 항체일 수 있다. 인간화 항체를 제조하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5225539호에 기재되어 있다. 항체의 예는 면역글로불린 동형(예: IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA) 및 이들의 동형 하위분류; Fab, scFv, Fv, dAb, Fd와 같은 항원 결합 도메인을 포함하는 단편; 그리고 디아바디(diabody)를 포함한다. 항체는 다중클론성 또는 단일클론성일 수 있다. 단일클론성 항체는 본 명세서에서 "mab"로 지칭될 수 있다.
항체, 예를 들어 단일클론성 항체를 취하여 원래 항체의 특이성을 유지하는 기타 항체 또는 키메라 분자를 생산하기 위해 재조합 DNA 기술을 사용하는 것이 가능하다. 이러한 기술은 상이한 면역글로불린의 불변 영역, 또는 불변 영역(constant region) + 프레임 워크 영역(framework region)에 대한 항체의 면역 글로불린 가변 영역 또는 상보적 결정 영역(complementary determining regions, CDR)을 암호화하는 DNA를 도입하는 것을 포함할 수 있다(예를 들어, EP-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400). 하이브리도마(또는 항체를 생산하는 기타 세포)는 생성된 항체의 결합 특이성을 변경시키거나 변경시키지 않을 수 있는 유전적 돌연변이 또는 기타 변화를 겪을 수 있다.
전항체(whole antibody)의 단편이 결합 항원의 기능을 수행할 수 있는 것으로 나타났다. 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward, E. S. 등, Nature 341 : 544-546 (1989)); (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) 단일 쇄 Fv 분자 (single chain Fv molecules, scFv)(여기서 VH 도메인 및 VL 도메인은 2 개의 도메인이 결합하여 항원 결합 부위를 형성하게 하는 펩타이드 링커에 의해 연결됨)[참고 문헌: Bird 등., Science 242:423-426 (1988); Huston 등, PNAS USA 85:5879-5883 (1988)]; (viii) 이중특이성 단일 쇄 Fv 다이머(PCT/US92/09965), 및 (ix) 유전자 융합에 의해 구축된 다가 또는 다중특이적 단편인 "디아바디" [참고 문헌: WO94/13804; P. Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]가 있다. 디아바디는 폴리펩타이드의 다량체이며, 각각의 폴리펩타이드는 면역 글로불린 경쇄의 결합 영역을 포함하는 제1 도메인 및 면역글로불린 중쇄의 결합 영역을 포함하는 제2 도메인을 포함하며, 2개의 도메인은 (상기 펩타이드 링커에 의해) 결합되지만 서로 결합하여 항원 결합 부위를 형성할 수 없으며, 여기서 항원 결합 부위는 다량체 내의 하나의폴리 펩타이드의 제1 도메인과 다향체 내의 또 다른 폴리펩타이드의 제2 도메인의 결합에 의해 형성된다(참고: WO94/13804). 이중특이성 항체가 사용되는 경우, 이들은 다양한 방식, 예를 들면, 화학적으로 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있는 통상적인 이중특이성 항체일 수 있거나(참고문헌: Hollinger & Winter, Current Opinion Biotechnol.4 : 446-449 (1993)), 또는 위에 언급된 임의의 이중특이성 항체 단편일 수 있다. 전항체보다는 scFv 이량체 또는 디아바디(diabody)를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 디아바디 및 scFv는 Fc 영역없이 가변 도메인(variable domain)만을 사용하여 구성될 수 있어 잠재적으로 항-유전자형 반응의 영향을 감소시킨다. 다른 형태의 이중특이성 항체는 문헌(참조: Traunecker 등, EMBO Journal 10 : 3655-3659 (1991)에 기재된 단일쇄 "Janusins"를 포함한다. 이중특이성 항체는 또한, 전항체와 반대로, 대장균에서 용이하게 구성되고 발현될 수 있기 때문에 유용할 수 있다. 적합한 결합 특이성의 디아바디(및 항체 단편과 같은 다수의 기타 폴리펩타이드)는 라이브러리로부터 파지 디스플레이(WO94/13804)를 사용하여 용이하게 선택될 수 있다. 디아바디의 하나의 암(arm)이 예를 들어 항원 X에 대한 특이성과 함께 일정하게 유지되어야 한다면 다른 암이 변화하고 적절한 특이성의 항체가 선택되는 라이브러리를 만들 수 있다. "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 상보적인 영역을 포함하는 항체의 일부이다. 항원이 큰 경우, 항체는 항원의 특정 부분에만 결합할 수 있으며, 이 부분은 에피토프로 불린다. 항원 결합 도메인은 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변 영역(VH)을 포함할 수 있다.
또한, 조작된 단백질 스캐폴드(engineered protein scaffold)를 기본으로 하는 결합 잔기가 본 발명에 포함된다. 단백질 스캐폴드는 관심있는 표적 분자에 대한 결합 부위를 제공하도록 개질된 안정한 가용성의 천연 단백질 구조로부터 유도된다. 조작된 단백질 스캐폴드의 예로는 2개의 나선형 상에 결합 인터페이스를 제공하는 포도상구균 단백질 A의 Z-도메인을 기초로 한 에피바디(affibody)(Nygren, P. A. (2008). FEBS J 275(11): 2668-76); 베타-배럴 폴드(beta-barrel fold)(Skerra, A. (2008) FEBS J 275(11): 2677-83)의 오픈 말단에서 작은 리간드, 나노바디 및 DARPin에 대한 결합 부위를 통합하는, 리포칼린(lipocalin)으로부터 유래된 안티칼린(anticalin)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 조작된 단백질 스캐폴드는 전형적으로 항원과 동일한 항원 단백질에 결합하도록 표적화되며 잠재적 치료제이다. 이들은 억제제 또는 길항제로서, 또는 전달 비히클로서 작용하여 독소와 같은 분자를 생체 내 특정 조직으로 표적화할 수 있다[참조문헌: Gebauer, M. and A. Skerra (2009). Curr Opin Chem Biol 13(3): 245-55]. 짧은 펩타이드는 또한 표적 단백질을 결합시키는데 사용될 수 있다. 필로머(Phylomer)는 세균 게놈에서 유래된 천연 구조화된 펩타이드이다. 이러한 펩타이드는 다양한 어레이의 단백질 구조 폴드를 나타내며 생체 내에서 단백질-단백질 상호 작용을 억제/파괴하는데 사용될 수 있다[참고문헌: Watt, P. M. (2006), Nat Biotechnol 24 (2) : 177-83)].
추가의 국면에서, 본 발명은 의약(medicine)에 사용하기 위한 제1 국면의 펩타이드 및/또는 이러한 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 및/또는 본 발명의 결합 잔기를 제공한다.
본 발명은 또한 암을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 제1 국면의 펩타이드 및/또는 이러한 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 및/또는 본 발명의 결합 잔기를 제공할 뿐만 아니라, 암의 치료를 위한 약제의 제조에서, 이러한 펩타이드 및/또는 핵산 및/또는 결합 잔기의 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 암을 치료하는 것을 필요로 하는 대상에게 제1 국면의 펩타이드 및/또는 이러한 펩타이드를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산 및/또는 본 발명의 결합 잔기를 투여하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다. 암은 에스트로겐 수용체 음성 유방암을 포함하는 유방암, 결장직장암, 위암, 비-소세포성 폐암, 자궁 내막암을 포함한 난소암, 췌장관 선암을 포함하는 췌장암, 백혈병, 흑색종, 두경부암 또는 폐암일 수 있다.
펩타이드는 T 또는 B 세포 에피토프일 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드는 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 또한, 펩타이드는 이피리무맙(ipilimumab)과 같은 체크포인트 차단 약물을 포함하지만 이에 한정되지 않는 항암제와 같은 기타 치료제와 조합하여 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 펩타이드는, 펩타이드로서, 선택적으로 WO02/058728에 개시된 바와 같은 펩타이드의 형태로 생체내 전달될 수 있다. 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 펩타이드가 펩타이드로서 투여될 때 강한 면역 반응을 일으킨다는 것을 발견했다. 이러한 펩타이드는 단지 펩타이드의 서열로서 또는 펩타이드를 함유하는 폴리펩타이드로서 또는 전장 단백질로서 투여될 수 있다. 대안적으로는, 본 발명에 따른 펩타이드는 펩타이드를 암호화하거나 펩타이드를 함유하는 폴리펩타이드를 암호화하거나 또는 심지어 전장 단백질(full length protein)을 암호화하는 핵산으로서 생체 내에서 투여될 수 있다. 이러한 핵산은 미니 유전자, 즉 리더 서열 및 펩타이드 또는 리더 서열 및 전장 단백질을 암호화하는 형태일 수 있다. 본 발명에서 유용한 에피토프를 암호화하는 핵산은 PAD 효소, 바람직하게는 PAD4 효소를 발현하는 항원 제시 세포 및 기타 세포에 표적화될 수 있다. 본 발명의 핵산은 표적화 제제, 예를 들어 Fc 또는 APC상의 상이한 항원을 표적으로 하는 단일클론성 항체, 예를 들어, 항-DEC205 mAb를 암호화하는 핵산을 포함시킴으로써 또는 다수의 APC를 갖는 피부로서 피내주입하여 표적화할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "치료"는 인간 또는 인간이 아닌 동물에게 유익할 수 있는 임의의 섭생(regime)을 포함한다. 폴리펩타이드 및/또는 핵산 및/또는 결합 잔기는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 담체들과 조합하여 사용하여 약제학적 조성물을 형성할 수 있다. 이러한 담체는 식염수, 완충 식염수, 덱스트로스, 리포좀, 물, 글리세롤, 에탄올 및 이의 조합물을 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
카테터 또는 다른 외과용 튜빙을 통한 전달이 또한 사용될 수 있지만, 본 발명의 조성물의 치료학적 투여를 위한 주요 경로는 주사일 일 것으로 예상된다. 적절한 투여 경로로는 정맥 내, 피하, 피부 내, 복강 내 및 근육 내 투여가 포함된다. 액체 제제는 분말 제제로부터 재구성 한 후에 사용할 수 있다.
정맥 내 주사 또는 고통이 동반된 부위에 주사하기 위해, 활성 성분은 발열 물질이 없고, 적당한 pH를 가지며, 등장성이고 안정성을 유지하는 육체적으로 허용되는 수용액의 형태로 존재할 것이다. 당해 기술 분야의 숙련자는 예를 들어 염화나트륨 주사, 링거 주사 또는 젖산 링거 주사와 같은 등장성 비히클을 사용하여 적합한 용액을 제조할 수 있다. 방부제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요에 따라 포함될 수 있다.
경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액상 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체, 예컨대 젤라틴 또는 보조제를 포함할 수 있다. 액체 약제학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물유 또는 식물유, 광유 또는 합성유와 같은 액체 담체를 포함한다. 생리 식염수, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다. 제제가 액체인 경우, 예를 들어, pH 6.8 내지 7.6에서 비-인산(non-phosphate) 완충액을 함유하는 생리 식염 용액 또는 동결건조된 분말일 수 있다.
조성물은 종양 부위 또는 다른 원하는 부위에 국부적으로 투여될 수 있거나 종양 또는 다른 세포를 표적으로 하는 방식으로 전달될 수 있다.
조성물은 바람직하게는 개체에게 이익을 나타내는데 충분한 "치료학적 유효량"으로 개체에게 투여된다. 실제 투여된 양, 투여 속도 및 투여 시간 코스는 치료 대상의 성질 및 중증도에 좌우될 것이다. 치료 처방, 예를 들어, 복용량 결정 등은 일반 주치의와 다른 의사의 책임하에 있으며, 일반적으로 치료할 질환, 개별 환자의 상태, 전달 장소, 투여 방법 및 주치의에게 알려진 기타 요인을 고려한다. 본 발명의 조성물은 특히 암의 치료 및 초기 치료 또는 수술 후 이러한 상태의 재발 방지와 관련된다. 위에서 언급한 기술 및 프로토콜의 예는 다음 문헌[Remington 's Pharmaceutical Sciences (Remington, 1980)]에서 찾을 수 있다. 조성물은 치료될 상태에 따라 동시에 또는 순차적으로 단독으로 또는 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 기타 암 치료법은 당업계에 공지된 기타 단클론 항체, 기타 화학 요법제, 기타 방사선 요법 또는 기타 면역 요법을 포함한다. 본 발명의 조성물의 한 특정 용도는 수술 보조기구로서, 즉 종양이 제거된 후에 암 재발의 위험을 감소시키는 것을 돕는다. 본 발명의 조성물은 화학적 합성에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 생성될 수 있다. 조성물은 잘 확립된 표준 액체 또는 바람직하게는 고체상 펩타이드 합성 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있으며, 이들의 일반 기술은 널리 이용 가능하거나(예를 들어, 참고문헌[Solid Phase Peptide Synthesis, 제2판, (Stewart, 1984)], 참고문헌[Practice of Peptide Synthesis, (Bodanzsky, 1984)], 및 참고문헌(Applied Biosystems 430A User's Manual, ABI Inc.)를 참고한다) 또는 용액 상태, 액상 방법 또는 고상, 액상 및 용액 화학의 임의의 조합에 의해, 예를 들어, 먼저 각각의 펩타이드 부분을 완성시킨 다음, 바람직하고 적절한 경우, 존재하는 임의의 보호기를 제거한 후, 각각의 탄산 또는 설폰산 또는 이의 반응성 유도체의 반응에 의한 잔기 X를 도입함으로써 용액으로 제조할 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드, 복합체, 핵산 분자, 벡터, 세포 및 결합 잔기는 비-자연 발생적이고/이거나 정제되고/되거나 조작되고/되거나 재조합적이고/이거나 분리되고/되거나 합성적인 것일 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 하기로부터 선택되는 서열을 포함하지 않거나, 서열로 본질적으로 구성되지 않거나, 서열로 구성되지 않는 것이 바람직하다:
VAASEFFRSGKYDLDFKSPD
VAASEFYRSGKYDLDFKSPD
TSKGLFcitAAVPSGASTGIYE
TAKGLcitAAVPSGASTGIYE
AGAVEKGVPLYcitHIADLAGN
TVTNPKcitIAKAVNEKSCNCL 또는
TVTNPKcitIAKAASEKSCNCL.
본 발명의 각각의 국면의 바람직한 특징은 기타 국면 각각에 대해 필요한 부분만 약간 수정할 뿐 유사하다. 본 명세서에 언급된 선행 기술 문서는 법이 허용하는 한도 내에서 통합된다.
도 1: 인간 에놀라제의 서열 정렬.
상동성을 나타내는 인간 에놀라제 서브유닛 ENOA(ENO1, α), ENOB(ENO3, β), ENOG(ENO2, γ) 및 ENO4의 정렬. 밝은 회색은 상동성 영역(homologous region)을 나타내고, 진한 회색은 ENO4와 상동성이 없는 영역을 나타낸다.
도 2. 펩타이드 풀에 대한 IFNγ 반응의 스크리닝
인간 DR4 (A) 또는 DR1/HHD (B) 및 모체 C57BL/6 (C) 마우스를 갖는 유전자이식 마우스 균주를 사용하여 펩타이드에 대한 IFNγ 반응을 스크리닝하였다. 마우스를 4 내지 6개의 비-중첩 인간 시트룰린화된 에놀라제 펩타이드(non-overlapping Human citrullinated Enolase peptide)의 풀(pool)로 면역화시켰다. 면역화 14 일 후, 마우스를 희생시키고 비장 세포를 수집하였다. 인간 및 마우스 등가 펩타이드로 자극에 대한 생체 외 응답은 IFNγ 엘리스폿(Elispot)에 의해 평가되었다. 배지만의 반응을 음성 대조군으로 사용하였다. 각 풀에서, n은 3이었다. 각 풀에 대한 배지 반응과 비교한 펩타이드 반응의 통계적 유의성은 던넷(Dunnett)의 사후 검증(* p <0.5, ** p <0.01, *** p <0.001)로 ANOVA에 의해 결정하였다.
도 3. 인간 에놀라제 241-260 시트룰린화된 펩타이드는 강력한 IFNγ 반응을 유도한다. 유전자이식 DR4 마우스를 인간 241cit 펩타이드로 단일 면역화(single immunisation)하였다. 생체 외(Ex vivo) 엘리스폿(Elispot)을 사용하여 인간 및 마우스 등가(equivalent) 시트룰린화된(cit) 펩타이드 및 야생형(wt) 서열에 발생된 IFNγ (A) 및 IL-10 (B) 반응을 결정하였다. MHC 유형 II 차단 항체(L243)의 존재하에 시트룰린화된 펩타이드에 대한 IFNγ 반응 또한 엘리스폿(Elispot) (C)에 의해 평가되었다. 모든 검정에서, 배지만의 반응을 음성 대조군으로 사용하였다. 각 실험에서, n은 3이었다. p 값이 제시되어 있다.
도 4. 다중 시트룰린화된 에놀라제 펩타이드는 낮은 수준의 IFNγ 반응을 유도한다.
마우스를 21-40 (A), 126-145 (B) 및 316-335 (C) 위치에 해당하는 시트룰린화된 인간 에놀라제 펩타이드로 단일 면역화하였다. 생체 외 엘리스폿을 사용하여 DR4 및 DR1/HHD 마우스에서 IFNγ 반응을 결정하였다. 반응은 인간 및 마우스 시트룰린화된 펩타이드 및 이용가능한 경우 이들의 야생형 동등물에 나타난다. 배지만의 반응을 음성 대조군으로 사용하였다. 각 실험에서, n은 3이었다. 배지 대조군과 비교한 반응의 통계적 유의성은 던넷(Dunnett)의 사후 검증(* p <0.5, ** p <0.01, *** p <0.001)로 ANOVA에 의해 결정하였다.
도 5. 에놀라제 241cit 펩타이드는 DP4 마우스에서 반응을 유도한다.
유전자이식 DP4 마우스에 3 주에 걸쳐 에놀라제 241cit 펩타이드를 3 회 투여하여 면역화하였다. 초기 용량을 투여한 지 21일 후에 비장 세포를 수집하였다. 생체외 IFNγ 엘리스폿(Elispot)을 사용하여 에놀라제 241 펩타이드에 대한 반응을 결정하였다.
도 6. 인간 에놀라제 241cit 펩타이드는 항종양 연구에서 생체 내 생존의 이점을 제공한다
α 에놀라제 (ENO1)와 β 액틴(actin)에 대하여 프로빙(probing)된 래더(ladder)에 대한, B16F1 (레인 1), ID8 (레인 2), TrampC1 (레인 3), Pan02 (레인 4), LLC/2 (레인 5), RTLCL (레인 6), HeLa (레인 7) 세포주로부터의 용출액의 면역 블롯(immunoblot) (A). 밴드는 ENO-1(47kDa) 및 β-액틴(42kDa)의 예상 크기에 해당한다.
DR4 마우스에 B16DR4 종양을 투여하였다. 면역화되지 않은 대조군 동물 및 종양 이식 4일 후에 에놀라제 241cit 펩타이드로 면역화된 동물에 대한 생존율 (B) 및 종양 이식 17일 후 종양 크기 (C)가 도시된다. n은 10이고, 두 개의 독립적인 실험 결과가 나타난다.
DR4 마우스에 IFNγ 유도성 DR4를 발현하는 B16 종양을 투여하였다. 면역화되지 않은 대조군 동물 및 종양 이식 4일 후에 에놀라제 241cit 펩타이드로 면역화된 동물에 대한 생존율 (D) 및 종양 이식 17일 후 종양 크기 (E)가 도시된다. n은 10이었다. 면역화된 그룹으로부터 살아남은 마우스는 초기 종양 이식 후 42일에 동일한 종양 세포주로 재투여되었다(화살표로 표시됨). 재투여된 마우스 및 이전에 투여되지 않은 대조군에 대한 생존 데이터가 나타난다(F). 유의적인 p 값이 제시되어 있다. 종양 용적에 대해, 중간값 및 p 값은 만-휘트니 유 시험(Mann Whitney U tesst)에 의해 결정된 바와 같다.
도 7. 에놀라제 241cit 펩타이드는 LLC2 종양 모델에서 생존 이점을 제공한다.
DR4 마우스에 루이스 폐암 세포주 LLC2를 투여하였다. 종양 투여 4일 후에 마우스를 인간 에놀라제 241cit 펩타이드로 면역화하였다. 야생형 LLC2 (A) 또는 구성형 키메라 DR4 (B)로 형질 감염된 LLC2로 처리 된 마우스에 대한 생존 데이터가 나타난다. 면역화된 마우스와 면역화되지 않은 마우스의 통계적 차이는 만텔-콕스 시험(Mantel-Cox test)에 의해 결정되었으며, p 값은 제시되어 있고, n은 10이었다.
도 8. ENO1 DNA 백신 접종은 에놀라제 241cit 펩타이드와 유사한 반응을 유도한다.
DR4 마우스를 유전자 총을 사용하여 ENO1 DNA 불렛(bullet)으로 2회 면역화하였다. 면역화 14 일 후, 제2 면역화 마우스를 희생시키고 비장 세포를 수집하였다. 에놀라제 241 펩타이드의 자극에 대한 IFNγ (A) 및 IL-10 (B) 반응을 결정하기 위해 생체 외 엘리스폿(Elispot)을 수행하였다. 마우스에 DR4를 구성적으로 발현하는 B16DR4 종양 세포주를 투여하였고, 4 일 후에 ENO1 DNA로 면역화시킨 후 생존 데이터 (C) 및 11 일째 종양 체적 (D)이 도시된다.
도 9. 보조제는 에놀라제 241cit 펩타이드에 대한 반응을 유도한다.
DR4 마우스를 보조제 CpG/MPLA 또는 IFA의 존재하에 인간 에놀라제 241cit로 단일 면역화하였다. IFNγ (A) 및 IL-10 (B) 반응은 생체 외 엘리스폿에 의해 결정되었다. 이들 연구에서 n은 3이었다. GM-CSF 존재 하에 5 μg 또는 25 μg의 에놀라제 241cit 펩타이드로 단일 또는 3 회 면역화된 마우스의 IFNγ 반응을 결정하였다(C). 이들 연구에서 n은 3이었다. 또한, DR4 마우스에 B16DR4 종양을 투여하였고, 면역화되지 않은 대조군 동물 또는 종양 이식 후 초기 4일째에 GM-CSF로 5㎕의 에놀라제 241cit 펩타이드를 3 회 투여하여 면역화된 동물의 생존율 (D)을 결정하였다. n은 10이었다.
도 10. 이미 존재하는 에놀라제 241cit 반응을 제안하며 반응이 빠르게 발전한다.
마우스를 희생시키기 전, 2, 6 또는 14일 동안 CpG/MPLA 중 에놀라제 241cit 펩타이드를 단일 투여하여 DR4 마우스를 면역화시키고, 생체 외 엘리스폿(Elispot)을 사용하여 IFNγ 반응을 결정하였다. n은 3이었고, p 값은 2 일째 펩티드 반응과 비교하여 유의한 차이를 나타낸다.
도 11. 에놀라제 241cit 펩타이드는 인간 PBMC에서 반응을 유도한다.
PBMC를 6 명의 건강한 공여자로부터 분리하고 배지, 인간 에놀라제 241cit 또는 에놀라제 241wt peptide와 함께 배양하였다. 4, 7, 11일 후 증식을 결정하기 위해 티미딘(thymidine) 검정을 수행하였다 (A). HLA 타이핑(typing)은 각 공여자에게 수행되었다. 11 일째 공여자 4의 상등액을 수집하여 루미넥스(luminex) (B)를 사용하여 사이토카인 수준을 분석하였다. 나타낸 데이터는 각 사이토카인에 대한 배지 대조군 배경에 대한 반응을 나타낸다. 공여자 4의 PBMC를 야생형 및 시트룰린화된 펩타이드로 자극하기 전에 CFSE로 표지하였다. CFSE로 표지된 세포 집단 내의 CD4 및 CD8 집단을 7 일째 및 10 일째에 유동 세포 계측법(flow cytometry)에 의해 펩타이드 자극된 시료에 대해 평가 하였다 (C).
도 12. 상동성을 묘사한 다른 종(마우스, 쥐, 암소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개, 토끼 및 양)으로부터 동등한 서열을 갖는 인간 에놀라제 α(ENOA) 서브유닛의 정렬.
도 13. 상동성을 묘사한 다른 종(마우스, 쥐, 암소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개, 토끼 및 양)으로부터 동등한 서열을 갖는 인간 에놀라제 β(ENOB) 서브유닛의 정렬.
도 14. 상동성을 묘사한 다른 종(마우스, 쥐, 암소, 돼지, 말, 닭, 고양이, 개, 토끼 및 양)으로부터 동등한 서열을 갖는 인간 에놀라제 γ(ENOG) 서브유닛의 정렬.
도 15. 인간 에놀라제 241-260 시트룰린화된 펩타이드는 CD4 반응을 유도한다.
DR4 유전자이식 마우스를 인간 241cit 펩타이드로 면역화하였다. 생체 외 엘리스폿(Elispot)을 사용하여 인간 및 마우스 등가 시트룰린화된(cit) 펩타이드 및 야생형 (wt) 서열에 발생된 IFNγ 반응을 결정하였다. MHC 유형 II 블록킹 항체 (L243), CD4 블록킹 항체 또는 CD8 블록킹 항체의 존재하에(A) 또는 CD4 고갈된 또는 농축된 세포 분획(B)에 있어서 시트룰린화된 펩타이드에 대한 IFNγ 반응을 평가하였다. 짧은 펩타이드 서열에 대한 IFNγ 반응도 시험하였다(C). 모든 검정에서, 배지만의 반응을 음성 대조군으로 사용하였다. 각 실험에서, n은 3이었다. p 값이 제시되어 있다.
도 16. HHDII/DP4 마우스에서의 반응의 특성.
유전자이식 DP4 마우스를 3 주에 걸쳐 인간 (A 내지 E) 또는 마우스 (F) 에놀라제 241cit 펩타이드로 3 회 투여하여 면역화하였다. 초기 용량을 투여한 지 21일 후에 비장 세포를 수집하였다. 생체외 IFNγ 엘리스폿(Elispot)을 사용하여 에놀라제 241 펩타이드에 대한 반응을 결정하였다. 인간 펩타이드에 대한 반응을 펩타이드 적정 (A), IL-10 분비 (B) 및 그랜자임 B(Granzyme B) 분비 (C)에 의해 결합력에 대해 시험하였다. CD4 블록킹 항체의 존재하에(D) 및 더 짧은 펩타이드 서열(E)에 대한 IFNγ 반응도 시험하였다. 모든 검정에서, 배지만의 반응을 음성 대조군으로 사용하였다. 각 실험에서, n은 3이었다. p 값이 제시되어 있다.
도 17. 인간 에놀라제 241cit 펩타이드는 HHDII/DP4 유전자이식 마우스에서 B16 흑색종 항종양 연구에서의 생체내 생존 이점을 제공한다.
DP4 유전자이식 마우스에 B16DP4 종양을 투여하였다. 면역화되지 않은 대조 동물 및 종양 이식 4 일 후에 에놀라제 241cit 펩타이드로 면역화된 동물에 대한 생존율이 제시된다. n은 10이었다. 면역화된 마우스와 면역화되지 않은 대조군 마우스의 통계적 차이는 만텔-콕스 시험(Mantel-Cox test)에 의해 결정되었으며, p 값은 제시되어 있고, n은 10이었다.
도 18. 에놀라제 241cit 펩타이드는 Pan02 (췌장암) 종양 모델에서 생존 이점을 제공한다.
DR4 유전자이식 마우스에 구성적인 DR4를 발현하는 Pan02 췌장암 세포주를 투여하였다. 종양 투여 4일 후에 마우스를 인간 에놀라제 241cit 펩타이드로 면역화하고 생존을 모니터링하였다. 면역화된 마우스와 면역화되지 않은 대조군 마우스의 통계적 차이는 만텔-콕스 시험(Mantel-Cox test)에 의해 결정되었으며, p 값은 제시되어 있고, n은 10이었다.
도 19. 다양한 보조제와 조합하여 에놀라제 241cit 펩타이드에 반응이 유도될 수 있다.
보조제 CpG/MPLA (각각 6 μg), IFA, Poly I:C (10 μg) 또는 이미퀴모드(Imiquimod) (25 μg)의 존재하에 DR4 (A 및 B) 또는 HHDII/DP4 (C 및 D) 유전자이식 마우스를 인간 에놀라제 241cit으로 면역화하였다. IFNγ (A 및 C) 및 IL-10 (B 및 D) 반응은 생체 외 엘리스폿에 의해 결정되었다. 이들 연구에서 n은 3이었다.
도 20. 정상적인 공여자로부터 재활성화된 에놀라제 241cit 특이적 반응은 주로 Th1 사이토카인을 생산하고 CD4 매개된다.
공여자 1 및 4의 PBMC를 인간 에놀라제 241cit 또는 wt 펩타이드와 함께 배양하고 13 일에 IFNγ 엘리스폿(elispot)에서 IFNg 방출을 측정하였다(A). IFNγ 반응은 CD4 및 CD8 마커와 조합하여 세포내 사이토카인 염색에 의해 분석되었다(B). 공여자 1, 4 및 7의 PBMC 배양물의 상층액을 루미넥스 검정(luminesx assay)에 의해 2, 5 및 12 일째에 사이토카인 수준을 분석하였다(C).
도 21. 에놀라제 21cit 펩타이드는 마우스에서 CD4 반응을 유도한다.
C57Bl/6 마우스를 인간 에놀라제 21cit 펩타이드로 면역화하였다. 생체 외 엘리스폿(Elispot)을 사용하여 인간 시트룰린화된(cit) 펩타이드 및 야생형 (wt) 서열에 발생된 IFNγ 반응을 결정하였다(A). CD4 블록킹 항체 또는 CD8 블록킹 항체의 존재하에 시트룰린화된 펩타이드에 대한 IFNγ 반응을 평가하였다(B). 모든 검정에서, 배지만의 반응을 음성 대조군으로 사용하였다. 각 실험에서, n은 3이었다. p 값이 제시되어 있다.
도 22. 에놀라제 11cit 펩타이드는 마우스에서 CD4 반응을 유도한다.
C57Bl/6 마우스를 인간 에놀라제 11cit 펩타이드로 면역화하였다. 생체 외 엘리스폿(Elispot)을 사용하여 인간 및 마우스 시트룰린화된(cit) 펩타이드 및 인간 야생형 (wt) 서열에 발생된 IFNγ 반응을 결정하였다(A). 인간 cit 펩타이드에 대한 IL-10 반응을 평가하였다(B). CD4 블록킹 항체 또는 CD8 블록킹 항체의 존재하에 인간 시트룰린화된 펩타이드에 대한 IFNγ 반응을 평가하였다(C). 모든 검정에서, 배지만의 반응을 음성 대조군으로 사용하였다. 각 실험에서, n은 3이었다. p 값이 제시되어 있다.
실시예
이하, 본 발명은 다음의 실시예 및 첨부된 도면을 참조하여 추가로 기술될 것이다.
방법
2.1. 상업용 mAb
HB-55 하이브리도마 세포(ATCC, USA) 배양 상등액으로부터 세파로스 단백질 G 친화성 크로마토 그래피를 이용하여 항-HLA-DR 항체(클론 L243)를 정제하였다. ENO1에 대한 래빗 단일클론성 항체 [EPR10864 (B)]를 사용하였다. 항-마우스 CD4 (클론 GK1.5) 및 항-마우스 CD8 (클론 2.43)은 미국 BioXcell회사에서 구입하였다.
2.2. 세포주
뮤린 흑색종 B16F1(murine melanoma B16F1) 및 마우스 루이스 폐암 LLC/2 세포주(Lewis lung carcinoma LLC/2 cell line)를 ATCC로부터 수득하였다. 뮤린 Pan02 세포주는 국립 암 연구소(National Cancer Institute) 종양 저장소에서 수득하였다. B16F1 세포주를 RPMI 배지 1640(GIBCO/BRL)에서 배양하고, LLC/2 및 Pan02는 DMEM에서 배양한다. 달리 언급하지 않는 한, 둘 다는 10% FCS, L-글루타민 (2 mM) 및 중탄산 나트륨 완충액이 보충된다.
2.3. 면역원
2.3.1. 펩타이드
90% 순도를 초과하는 펩타이드를 겐스크립트(Genscript: 미국 뉴저지 소재)에서 합성하였다. -80℃에서 0.2 mg 분취량으로 동결 건조시켜 저장하였다. 사용 당일에 PBS 중 적절한 농도로 재구성하였다.
2.4. 플라스미드
뮤린 알파 에놀라제(ENO-1) 전장 cDNA (IMAGE ID 5376359)를 암호화하는 포유 동물 발현 벡터 pCMVSPORT6를 소스 바이오사이언스(Source Bioscience)로부터 입수하였다.
플라스미드 pVITRO2 인간 HLA-DP4를 작제하기 위해, FspI/EcoRI에 인접한 전장 인간 HLA-DPA*0103 알파 쇄(alpha chain) 및 BamHI/SalI 제한 부위(restriction site)에 인접한 HLA-DPB*0401 베타 쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 합성 하였다. 서열 확인 후, HLA-DPA*0103 쇄를 벡터 pVITRO2-hygro-mcs (Invivogen)의 FspI/EcoRI mcs2 내로 클로닝하였다. 이어서 HLA-DPB*0401 쇄를 mcs2 내에 존재하는 알파 HLA-DPA*0103 쇄와 함께 포유류 발현 벡터의 BamHI/SalI mcs1에 삽입하였다.
HHDII 플라스미드를 생성하기 위해, EL4-HHD 세포로부터 분리된 전체 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA를 주형으로 사용하여 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 HHD를 증폭시키고 pCR2.1로 서브클로닝하였다. 이후, 인간 HLA-A2 리더 서열, 글리신 세린 링커를 통해 인간 HLA-0201 MHC 유형(class) 1 분자의 α1 및 2 도메인 및 뮤린 H-2Db 유형 1 분자의 α3, 트랜스 멤브레인 및 세포질 도메인에 공유결합된 인간 β2-마이크로글로불린(β2M) 분자를 포함하는 HHD 쇄를, Invitrogen으로부터 입수한 포유 동물 발현 벡터 pCDNA3.1의 EcoRV/HindIII 부위에 삽입 하였다.
플라스미드 pVitro 2를 생성하기 위해, 유전자이식 HLA-DR4 마우스의 비장 세포로부터 분리된 mRNA로부터 키메라 HLA-DR401 cDNA를 생성하였다. cDNA를 주형으로 사용하여 FspI/EcoRI 및 BamHI/SalI 부위를 각각 포함하는 순방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 키메라 알파 및 베타 쇄를 별개로 증폭하였다. 서열 확인 중에, 인간 HLA-DRA 알파 1 도메인을 갖는 뮤린 H2-Ea를 포함하는 전장 키메라 알파 쇄를 벡터 pVITRO2-hygro-mcs (Invivogen)의 FspI/EcoRI mcs2에 결찰(ligation)시켰다. 인간 DRB1*0401 베타 1 도메인을 갖는 뮤린 H2-Eb를 포함하는 베타 쇄를 키메라 알파 쇄와 함께 벡터의 BamHI/SalI mcs1에 삽입하였다.
IFNγ 유도성 플라스미드 pDCGAS 키메라 HLA-DR401를 작제하기 위해, 키메라 알파 및 베타 쇄를 중쇄 및 경쇄를 대체하는 다른 장소(참고문헌: Metheringham 등, 2009)에서 기술된 pDCOrig 벡터에 클로닝하였다. TATA 박스 및 GAS(IFNγ 활성화 서열) 직접 반복 인핸서 요소로 구성된 IFNγ 유도성 프로모터를, 벡터 pGAS-Luc (Agilent)를 주형으로 사용하여 PCR로 증폭시켰다. 각 카세트 내의 CMV 프로모터를 잘라내어 pDCOrig 벡터 백본 내 HLA-DR401 쇄의 발현을 작동하는 IFNγ 유도성 프로모터로 대체하였다.
엔도톡신 프리(Endotoxin free) 플라스미드 DNA를 엔도프리 퀴아겐 맥시프렙 키트(endofree Qiagen maxiprep kit) (크롤리 소재의 Qiagen 사)를 이용하여 생성시켰다.
2.5. 형질주입(Transfection)
LLC2 세포는 제조사의 지시에 따라 전장 키메라 알파 및 베타 쇄 둘 다를 암호화하는 플라스미드 pVitro 2 키메라 HLA-DR401 4 μg과 함께 리포펙타민(Lipofectamine) 형질주입 시약(Invitrogen)을 사용하여 형질주입시켰다. 징크 핑거 테크놀로지(Zinc finger Technology)[시그마 알드리치(Sigma Aldrich)]를 이용하여 뮤린 MHC 유형 II에 대해 미리 녹아웃(knock out)된 B16F1 세포주를 pDC GAS 키메라 HLA-DR401 또는 pVitro 2 키메라 HLA-DR401 (여기서 키메라 HLA-DR401은 각각 IFNγ 유도성 프로모터(inducible promoter) 또는 고수준 발현을 작동하는 구성성 프로모터(constitutive promoter)로 발현됨)로 형질주입시켰다.
형질주입된 세포는 하이그로마이신(Hygromycin) B (300 μg/ml) 또는 제오신(zeocin) (300 μg/ml)의 존재 하에서 성장에 의해 선택되었다. 제한 희석에 의해 라인을 클로닝하고 이바이오사이언스(eBioscience)으로부터 항-인간 HLA-DR PE-Cy7 접합 항체(클론 L243)를 사용하여 유세포 분석에 의해 발현을 확인하였다. IFNγ 유도성 플라스미드로 형질 감염된 세포는 항체로 염색하기 전에 뮤린 IFNγ[30 ng/ml, 깁코 라이프 테크놀로지스(Gibco life technologies)]의 부재 또는 존재하에 밤새 배양했다.
징크 핑거 테크놀로지(Sigma Aldrich)를 이용하여 뮤린 MHC 유형 I 및 II에 대해 미리 녹아웃된 B16F1 세포주를 각각 4 μg의 플라스미드 pCDNA3 HHDII 및 pVITRO2 인간 HLA-DP4 플라스미드를 갖는 리포펙타민 형질주입 시약(Invitrogen)을 사용하여 형질 감염시켰다. 형질주입된 세포는 G418 (500 μg/ml) 및 하이그로마이신(Hygromycin) B (300 μg/ml)의 존재 하에서 성장에 의해 선택되었다. 제한 희석에 의해 라인을 클로닝하고, 세로텍(Serotec) 및 에이비캠(Abcam)의 항-인간 베타 2 마이크로글로불린 FITC 및 항-인간 HLA-DR/DP/DQ (클론 WR18) PE 항체를 사용하여 유동 세포 계측법에 의해 발현을 확인하였다.
2.6. 웨스턴 블롯팅(Western Blotting)
세포 용해물은 프로테아제 억제제 칵테일(Sigma)을 함유한 RIPA 완충액 중에 제조하고 단백질을 4 내지 12% NuPAGE Bis-Tris 겔(Invitrogen) 상에 분리한 다음 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 3% BSA로 1시간 동안 블록킹시킨 다음, 1000 분의 1의 인간/마우스 ENO-1 (클론 EPR10863(B), Abcam)로 및 15000 분의 1의 β 액틴 (클론 AC-15, Sigma)에 대한 항체로 프로빙하였다. 단백질은 래빗(ENO-1 용) 및 IRDye 680RD 이차 항 마우스(β 액틴 용)에 대해 형광 이차 항체 IRDye 800RD를 사용하여 시각화하였다. 멤브레인을 리코 오디세이(Licor Odyssey) 스캐너를 사용하여 이미지화하였다.
2.7. 면역화(Immunisation)
2.7.1. 면역화 프로토콜
8주 내지 12 주된, C57BL/6 마우스[영국, 찰스 리버(Charles River)], HLA-DR4 마우스[미국, 타코닉(Taconic)], HHDII/DR1 마우스[프랑스, 파스테르 인스티튜트(Pasteur institute)] 및 특허 WO2013/017545 A1에 기재된 HHD/HLA-DP4 유전자이식 균주[프랑스, EMMA 레포지토리(repository)]의 마우스를 사용하였고, 노팅엄 트렌트 대학(Nottingham Trent University)에서 스태프에 의해 보살펴졌다. 모든 작업은 홈 오피스 프로젝트 라이센스하에 수행되었다. 펩타이드를 1 mg/ml로 PBS에 용해시킨 다음 상이한 보조제: 각각 6 μg/마우스 양의 CpG 및 MPLA[영국, 인비보겐(Invivogen)], 불완전 프로인트(Incomplete Freund's) 50 μl/마우스 [영국, 시그마(sigam)], 폴리 I:C 10 μg/마우스[영국, 인비보겐(Invivogen)], 이미퀴모드 25 μg/마우스[영국, 인비보겐(Invivogen)] 및 GMCSF 10 μg/마우스[영국, 페프로텍(Peprotech)]를 사용하여 유화(일련의 희석)시켰다. 펩타이드(25 μg/마우스)를 꼬리 바닥에 피하 주사하였다. DNA (1 μg/마우스)를 제조사의 지침서를 사용하여 1.0 μm 금 입자[영국 헤멜 헴프스테드 소재의 바이오라드(BioRad)]에 코팅하고 유전자 총(BioRad)에 의해 피내 투여하였다. 홈스페라(Homspera, 10 nM/마우스)[영국 소재의 펩타이드 신세틱스(PeptideSynthetics)]를 유전자 총 면역화(genegun immunisation)로 피내 주사하였다. 마우스는 특별한 언급이 없는 한, 펩타이드 면역화를 위해 0 일째 또는 유전자 총 면역화를 위해 0 일 및 7 일째에 면역화시켰다. 달리 명시되지 않는 한, 14 일째에 펩타이드에 대해 그리고 20 일째에 펩타이드 또는 유전자 총 면역화에 대한 분석을 위해 비강을 제거하였다.
종양 접종 실험을 위해, 1차 면역화 3 일 전에 마우스 우측 옆구리에 2.5 x 104 B16 DR4 세포 또는 1 x 106 LLC2/LLC2 DR4 세포, 매트리겔(mattrigel) 중 2.5 x 105 Pan02 DR4 세포 또는 4 x 105 B16 HHDII DP4 세포로 마우스에 피하 접종한 다음, 위에서와 같이 면역화하였다. 종양의 성장은 3 내지 4 일 간격으로 모니터링하고 종양이 직경 10mm 이상에 도달하면 마우스를 인도적으로 안락사시켰다.
2.8. 면역 반응 분석
2.8.1. 생체 외 엘리스폿 검정(Ex vivo Elispot assay)
엘리스폿 분석은 제조사의 지침[스웨덴 맙테크(Mabtech)]에 따라 뮤린 IFNγ, IL-17 및 IL-10 포획 및 검출 시약을 사용하여 수행하였다. 간결하게는, 항-IFNγ, IL-17 및 IL-10 항체를 96-웰 임모빌린(Immobilin)-P 플레이트의 웰에 코팅하였다. 합성 펩타이드(다양한 농도로 제공됨) 및 5 × 105 개/웰의 비장 세포를 플레이트의 웰에 3배 첨가 하였다. 종양 표적 세포를 5 x 104/웰에서 3배로 적절한 곳에 첨가하고 플레이트를 37℃에서 40 시간 동안 배양하였다. 배양 후, 포획된 IFNγ 및 IL-10은 바이오틴화된 항-IFNγ 및 IL-10 항체에 의해 검출되고, 스트렙트아비딘 알칼라인 포스파타제(streptavidin alkaline phosphatase) 및 발색 기질(chromogenic substrate)로 전개되었다. 자동화된 플레이트 판독기(셀룰러 테크놀로지 리미티드(Cellular Technologies Ltd)를 사용하여 스폿을 분석하고 계수하였다.
2.8.2. 루미넥스 다중 검정(Luminex multiplexed assay)
IL-10, IL-17, IFNy, TNFα, IL-2 및 IL-4에 대한 IgG 항체에 대해 다중 루미넥스 검정(인비트로겐: Invitrogen)을 위해 3 단계 간접 과정(three-step indirect procedure)을 사용했다. 표준, 대조 및 미지 혈청을 50% 분석 희석액 완충액(인비트로겐) 및 50% 혈청이 없는 RPMI에서 1 : 2로 희석하였다. 연속 표준 희석액을 각 검정에 포함시켰다. 표준, 대조 및 미지 혈청(unknown sera )의 각 희석액을 96-웰 여과 플레이트(매사추세츠 베드포드 소재의 밀리포어 코포레이션의 밀리포어 멀티스크린(Millipore Multiscreen)에서 결합된 루미넥스 마이크로스피어(Luminex microspheres) 세트와 혼합하고 실온에서 2 시간 동안 진탕 배양하였다. 마이크로스피어를 진공 여과로 수집하고 PBST로 세척하였다. 바이오티닐화 검출기 항체(Biotinylated detector antibody)를 실온에서 1 시간 동안 진탕하면서 각 웰에 첨가하였다. 마이크로스피어를 진공 여과로 수집하고 PBST로 세척하였다. 스트렙트아비딘 접합된 R-피코에리트린(R-phycoerythrin)을 각 웰에 첨가하였다. 30 분 배양 및 세척 단계 후에, 마이크로스피어를 PBST에 재현탁하고, XY 플랫폼이 장착된 바이오라드 바이오플렉스 루미넥스 분석기(Biorad BioPlex Luminex analyzer)에서 판독하였다. 루미넥스 소프트웨어(바이오플렉스 시스템즈: BioPlex Systems)로 데이터를 수집 및 분석하였다.
2.8.3 증식 검정 (티미딘: Thymidine)
PBMC는 피콜 하이페이크(Ficoll-Hypaque, sigma) 구배 원심분리에 의해 신선하게 추출된 헤파린화된 혈액으로부터 분리하였다. 최종 부피 2 ml 중 5% 풀링된 자가 인간 혈청(pooled autologous human serum), 2 mM 글루타민, 20 mM HEPES 및 페니실린-스트렙토마이신(1%)을 함유하는 RPMI에서 단일 펩타이드(최종 농도 10 μg/㎖)로 PBMC (1.5 x 106 세포/웰)을 자극하였다. 정제된 단백질 유도체인 PPD(최종 농도 10 μg/ml)를 이용한 자극은 PBMC의 증식능에 대한 양성 대조군으로 사용되었다. 음성 대조군으로서 PBMC를 배지 단독으로 배양하였다. PBMC를 37℃, 5% CO2의 환경에서 4, 7, 11 일 동안 배양하였다. 이 시점에서 증식을 평가하기 위해 3개의 배양액으로부터 각각 100 ㎕를 96 웰 플레이트의 둥근 바닥 웰에 나누어 주었고 3H-티미딘(0.0185MBq/웰)을 첨가하고 37℃에서 8 시간 더 배양하였다. 배양물을 유니 필터 플레이트 상에 수거하고 3H-티미딘의 통합을 β-섬광 계수(β-scintillation counting)에 의해 결정하였다. 결과는 자극되지 않은 배양액의 평균에 대한 에피토프-자극의 분당 카운트 수(counts per minute, cpm)의 평균의 비율로서 자극 지수(stimulation index, SI)를 계산함으로써 평가하였다. 증식 검정은 SI> 2.5 일 때 양성으로 간주되었다.
2.8.4 증식 검정(CFSE)
PBMC는 피콜 하이페이크(Ficoll-Hypaque, 시그마) 구배 원심분리에 의해 신선하게 추출된 헤파린화된 혈액으로부터 분리하였다. 최종 부피 2 ml 중 5% 풀링된 자가 인간 혈청, 2 mM 글루타민, 20 mM HEPES 및 페니실린-스트렙토마이신(1%)을 함유하는 RPMI에서 단일 펩타이드(최종 농도 10 μg/㎖)로 PBMC (1.5 x 106 세포/웰)을 자극하였다. 음성 대조군으로서 PBMC를 배지 단독으로 배양하였다. PBMC를 37℃, 5% CO2의 환경에서 7 및 10일 동안 배양하였다. 이 시점에서 증식을 평가하기 위해 세포를 샘플링하고 각각 PE-Cy5 및 efluor450으로 표지한 표면 마커 CD4 및 CD8 항체로 염색하였다. 염색 후 세포를 고정시키고 밀테니 맥스퀀트(Milteny MACSQuant) 유동 세포 계수기로 분석하였다.
2.8.5 PBMC 배양과 IFNγ 엘리스폿
PBMC는 피콜 하이페이크(Ficoll-Hypaque, sigam) 구배 원심분리에 의해 신선하게 추출된 헤파린화된 혈액으로부터 분리하였다. 최종 부피 2 ml 중 5% 풀링된 자가 인간 혈청, 2 mM 글루타민, 20 mM HEPES, 페니실린-스트렙토마이신(1%), 재조합 인간 IL-15 10 ng/ml 및 재조합 인간 IL-7 5 ng/ml을 함유하는 RPMI에서 단일 펩타이드(최종 농도 10 μg/㎖)로 PBMC (1.5 x 106 세포/웰)을 자극하였다. 재조합 인간 IL-2를 3 일에 20 IU/ml로 첨가하였다. 13 일째에 세포를 세척하고 인간 IFNγ 엘리스폿 검정에 첨가하였다. 제조자의 지침(Mabtech, Sweden)에 따라 인간 IFNγ 포획 및 검출 시약을 사용하여 엘리스폿 검정을 수행하였다. 간결하게는, 항-IFNγ 항체를 96-웰 임모빌린-P 플레이트(Immobilin-P plate)의 웰에 코팅 하였다. 합성 펩타이드(10 μg/ml)와 1x105/웰PBMC를 4개의 플레이트에 넣고 플레이트를 20 시간 동안 37℃에서 배양하였다. 배양 후, 포획된 IFNγ를 바이오틴화된 항-IFNγ 항체로 검출하고, 스트렙트아비딘 알칼라인 포스파타제 및 발색 기질로 전개시켰다. 자동화된 플레이트 판독기(셀룰러 테크놀로지 리미티드(Cellular Technologies Ltd)를 사용하여 스폿을 분석하고 계수하였다.
2.8.6 세포내 사이토카인 분석
PBMC 배양물을 위에 상세히 설명한 바와 같이 준비하였다. 14 일째 PBMC를 세척하고 브레펠딘 A(brefeldin A)의 존재하에 합성 펩타이드(10 μg/ml)와 함께 37℃에서 20 시간 동안 배양하였다. 세포를 각각 PE-Cy5 및 efluor450으로 표지된 항체를 사용하여 세포 표면 마커 CD4 및 CD8로 염색하였다. 이어서 세포를 고정시키고 투과성으로 만들고 IFNγ PE-Cy7 표지 항체로 염색하였다. 염색 후 세포를 고정시키고 밀테니 맥스퀀트(Milteny MACSQuant) 유동 세포 계수기로 분석하였다.
2.9 면역조직화학 분석(Immunohistochemical analysis)
정상 및 종양 조직 결합은 앞서 기재한 바와 같이 면역조직화학(immunohistochemistry, IHC)에 의해 수행되었다(참고문헌: Durrant 등, 2006). 면역조직화학 염색은 노볼링크 폴리머 검출 시스템[Novolink polymer detection system, 레이카 바이오시스템즈(Leica Biosystems), RE7150-K]을 사용하여 4 μm 단면에서 수행하였다. 간단히 말하면, 슬라이드를 크실렌으로 탈-파라핀화시키고(deparaffinised) 알코올을 3회 바꿔가며 다시 수화시킨 후, 전자레인지를 사용하여 구연산염 완충액(pH 6.0)에서 20 분간 항원-회수(antigen-retrieval)를 수행하였다. 내인성 퍼옥시다제(Endogenous peroxidase) 활성은 퍼옥시다제 블록(Peroxidase Block)에 의해 5 분간 블록킹되었다. 슬라이드를 TBS(pH 7.6)로 세척하고, 5분 동안 프로테인 블록(Protein Block)을 적용하였다. 다시 한번 TBS로 세척한 후, 레이카(Leica) 항체 희석제 (RE7133)에서 최적으로 희석된 1차 항체를 적용하고 60 분 동안 배양하였다. 항-ENO1 래빗 단일클론성 EPR10864 (B)는 1/200로 사용되었다. 슬라이드를 TBS로 세척한 후 포스트-프라이머 블록(Post-Primary Block)으로 30분 동안 배양한 후 TBS로 세척하였다. 노볼링크(Novolink) 중합체를 30분 동안 적용하였다. DAB 작업 용액은 DAB 기질 완충액에 1 : 20 DAB 크로모겐(chromogen)으로 구성되었고 5분 동안 적용되었다. 슬라이드를 6 분 동안 노볼링크 헤마톡실린(Novolink haematoxylin)으로 대조 염색하고 건조시켰다.
TMA 슬라이드는 초기에 염색 품질 및 특이성의 광학 현미경 평가에 의해 평가되었다. 슬라이드는 나노주머(NanoZoomer) 슬라이드 스캐너(영국 웰윈 가든 시티 소재의 하마츠 포토닉스(Hamamtsu Photonics)를 사용하여 고해상도 디지털 이미지(0.45 μm/픽셀)로 스캔하고 웹-기반 인터페이스 NDP 뷰어(나노주머 디지털 패톨로지: Nanozoomer Digital Pathology)를 사용하여 액세스하였다. 최소 2400 고해상도 스크린(91920 1080)을 사용하여 920 배율로 점수를 매겼다. ENO1 상태와 환자 결과에 대한 공지 없이 점수가 매겨졌으며 두 사람(MG 및 MM)이 점수를 매겼다. 염색의 평가는 염색의 강도 및 염색된 세포의 비율을 고려한 개질된 조직 화학적 점수(histochemical score, H-score)를 사용하는 반-정량적 접근법(semi-quantitative approach)을 기반으로 하였다. 강도에 대해서는 음성(negative) 약한(weak), 보통(moderate) 및 강한(strong) 염색 강도에 해당하는 0, 1, 2 및 3의 스코어 지수를 사용하였고, 각 강도에서의 양성 세포의 백분율을 주관적으로 측정하였다. 통계 분석은 SPSS 13.0 (Chicago, SPSS Inc)을 사용하여 수행되었다. 생존 분석을 위한 계층화 컷 포인트(Stratification cut-point)는 X-Tile 소프트웨어(참고문헌: Camp 등, 2004)를 사용하여 결정되었고 P 값은 0.05 미만이 유의하다고 간주되었다.
환자 집단( Patient cohorts )
연구 대상자들은, 노팅엄(Nottingham) 또는 더비 대학 병원(Derby University Hospitals)에서 조직학적으로 입증된 암의 선별 수술적 절제술을 받은 환자들에게서 수득한, 연속된 계열의 462 명의 결장직장암(colorectal cancer)(참고문헌: Simpson 등, 2010) 표본 (1994-2000, 평균 추적 관찰기간 42 개월, 2003 년 12 월 검열; 5-플루오로우라실/폴린산(5-flurouracil/folinic acid)을 사용한 정기적인 보조 화학요법을 받은 림프절 양성 질환 환자), 350 명의 난소암(참고문헌: Duncan 등, 2007) 표본 (1982-1997년; 평균 추적 관찰기간 192 개월: 2005 년 11 월 검열됨: 후에 II 기에서 IV 기까지는 표준 보조 화학 요법을 받은 환자), 142명의 위암 (참고문헌: Abdel-Fatah 등, 2013) 표본 (2001-2006; 평균 추적관찰기간 66 개월; 2009년 1월 검열; 화학요법없음), 68명의 췌장암과 120명의 담도암/팽대암(billary/ampullary cancer)(참고문헌: Storr 등, 2012) 표본 (1993-2010: 평균 45 개월, 2012 년 검열, 25 내지 46%의 환자가 5-플루오로우라실/폴린산 및 겜시타빈을 사용한 보조 화학요법을 받음), 220명의 비-소세포성 폐암(non-small cell lung cancers)(1996 년 1월부터 2006년 7월: 평균 추적 관찰 기간: 36 개월, 2013 년 5 월 검열; 수술 전 화학 요법을 받은 환자는 없었지만 방사선 치료를 받은 환자는 11명, 및 수술 후 최소 1주기의 보조 화학 요법을 받은 9 명)의 환자 집단을 포함한다. 관련 임상 병리학 자료/데이터를 이용할 수 없는 경우를 제외하고는 어떠한 경우도 제외되지 않았다. 이러한 후향 연구(retrospective study)는 1987 년부터 1998 년까지 진단 받고 노팅엄 테노부스 원발성 유방암종 계열(Nottingham Tenovus Primary Breast Carcinoma series)에 입원한 원발 침윤성 유방암(primary invasive breast carcinomas) 환자 902 명을 연속적으로 대상으로 하였다. 이것은 장기 추적관찰한 71세 미만(평균 55 세)의 일련의 환자로 특징된다. 모든 환자는 단일 기관에서 동일한 방식으로 치료를 받았고 광범위한 단백질 발현에 대해 조사하였다.
모든 환자는 유방 절제술 또는 방사선 치료로 광범위한 국소 절제술 중 하나를 표준 수술로 치료받았다. 1988 년 이전에는 전신적인 보조 요법을 받지 못했다. 1988 년 이후 NPI 점수와 호르몬 수용체 상태에 근거하여 전신 보조제 치료를 위해 환자를 선택했다. NPI가 3.4 미만인 환자는 보조 요법을 받지 않았고; 3.4보다 높은 보조제 점수를 가진 환자 중 에스트로겐 수용체 양성인 경우 타목시펜(tamoxifen)(및/또는 폐경전이라면 ± 고세렐린(goserelin))을 투여받거나, 또는 ER 음성이었고 화학 요법을 견디기에 충분한 경우 고전적인 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 메토트렉세이트(methotrexate), 플루오로우라실(fluorouracil)을 투여받았다. 생존데이터는 전향적으로 유지되었다. 유방암 특이성 생존(Breast cancer specific survival, BCSS)은 원발성 외과적 치료(the primary surgical treatment) 날짜부터 유방암으로 사망할 때까지의 시간(년)으로 정의했다. 환자가 아직 살아있었거나 추적관찰을 놓쳤거나(n=73) 다른 원인으로 사망한 경우 검열되었다.
실시예 1. 에놀라제의 서열 정렬 및 상동성.
포유류에는 4가지의 분명한 유전자에 의해 암호화되는 4 가지 아형의 에놀라제 효소, ENO1(A), ENO2(B), ENO3(G) 및 ENO4이 존재한다. 이들은 고도로 보존되어 있으며 아미노산 상동성이 높다(도 1).
실시예 2 시트룰린화된 에놀라제에 대한 CD4 반응
인간 알파-에놀라제 펩타이드 서열은 중첩 20-mer로 분해되었다. 아르기닌을 함유하는 임의의 20-mer를 선택하고 아르기닌 잔기를 시트룰린 (cit)으로 대체하였다. 선택된 20mer 펩타이드를 표 1에 요약하였다.
활용된 에놀라제 펩타이드 - 마우스 및 인간 서열이 상동임을 나타내고, 마우스 서열에서 변경된 aa는 굵게 강조 표시된다.
에놀라제 펩타이드
(aa 좌표) 		펩타이드 서열
인간 펩타이드 마우스 동족체
1-20 MSILKIHA-CIT-EIFDSRGNPTV MSILRIHA-CIT-EIFDSRGNPTV
6-25 IHA-CIT-EIFDS-CIT-GNPTVEVDLF IHA-CIT-EIFDS-CIT-GNPTVEVDLY
21-40 EVDLFTSKGLF-CIT-AAVPSGAS EVDLYTAKGLF-CIT-AAVPSGAS
26-45 TSKGLF-CIT-AAVPSGASTGIYE TAKGLF-CIT-AAVPSGASTGIYE
36-55 PSGASTGIYEALEL-CIT-DNDKT -
46-65 ALEL-CIT-DNDKT-CIT-YMGKGVSKA ALEL-CIT-DNDKT-CIT-FMGKGVSQA
56-75 -CIT-YMGKGVSKAVEHINKTIAP -CIT-FMGKGVSQAVEHINKTIAP
121-140 AGAVEKGVPLY-CIT-HIADLAGN -
126-145 KGVPLY-CIT-HIADLAGNSEVIL KGVPLY-CIT-HIADLAGNPEVIL
171-190 LPVGAANF-CIT-EAM-CIT-IGAEVYH LPVGASSF-CIT-EAM-CIT-IGAEVYH
176-195 ANF-CIT-EAM-CIT-IGAEVYHNLKNV SSF-CIT-EAM-CIT-IGAEVYHNLKNV
241-260 VIGMDVAASEFF-CIT-SGKYDLD VIGMDVAASEFY-CIT-SGKYDLD
246-265 VAASEFF-CIT-SGKYDLDFKSPD VAASEFY-CIT-SGKYDLDFKSPD
256-275 KYDLDFKSPDDPS-CIT-YISPDQ KYDLDFKSPDDPS-CIT-YITPDQ
261-280 FKSPDDPS-CIT-YISPDQLADLY FKSPDDPS-CIT-YITPDQLADLY
316-335 VGDDLTVTNPK-CIT-IAKAVNEK VGDDLTVTNPK-CIT-IAKAASEK
321-340 TVTNPK-CIT-IAKAVNEKSCNCL TVTNPK-CIT-IAKAASEKSCNCL
326-345 K-CIT-IAKAVNEKSCNCLLLKVN K-CIT-IAKAASEKSCNCLLLKVN
361-380 QANGWGVMVSH-CIT-SGETEDTF QSNGWGVMVSH-CIT-SGETEDTF
366-385 GVMVSH-CIT-SGETEDTFIADLV -
391-410 GQIKTGAPC-CIT-SE-CIT-LAKYNQL -
396-415 GAPC-CIT-SE-CIT-LAKYNQLL-CIT-IEE GAPC-CIT-SE-CIT-LAKYNQIL-CIT-IEE
401-420 SE-CIT-LAKYNQLL-CIT-IEEELGSK SE-CIT-LAKYNQIL-CIT-IEEELGSK
406-425 KYNQLL-CIT-IEEELGSKAKFAG KYNQIL-CIT-IEEELGSKAKFAG
416-434 ELGSKAKFAG-CIT-NF-CIT-NPLAK ELGSKAKFAG-CIT-SF-CIT-NPLAK
에놀라제 펩타이드 반응의 스크리닝
마우스에서 잠재적 시트룰린화된 에놀라제 에피토프를 동정하기 위해 스크리닝을 수행하였다. 마우스를 4 내지 6개의 인간 시트룰린화된 펩타이드의 풀로 면역화하였다. 가능한 교차 반응성의 영향을 줄이기 위해 각 풀 내의 펩타이드는 중첩 아미노산 서열을 포함하지 않도록 선택되었다. 각각의 풀은 20 μg의 각 펩타이드와 CpG/MPLA를 보조제로 포함하는 단일 면역화로 투여되었다. 14일 후, 마우스를 추려 내고, 면역화된 풀 내의 각 펩타이드에 대한 면역 반응을 생체 외 엘리스폿(도 2)에 의해 평가하였다. 또한, 뮤린의 등가 서열에 대하여 비장 세포를 스크리닝하였다. 본 발명자들은 시트룰린화된 펩타이드가 유전자이식 DR4 마우스 균주에서 반응을 유도할 수 있다는 것을 이전에 밝혀냈다. 상이한 마우스 균주가 상이한 MHC 레퍼토리를 갖는 것을 감안할 때, 다수의 균주(strain)를 스크리닝에 사용하였다. 펩타이드 반응은 C57BL/6 마우스뿐만 아니라 C57BL/6 배경에서 인간 DR4 또는 HHD/DR1을 발현하는 유전자이식 균주에서 평가되었다(물질 및 방법 참조).
유의한 IFNγ 반응이 다수의 상이한 펩타이드에 대해 검출되었다. DR4 마우스에서 에놀라제 241-260 시트룰린화된 펩타이드를 함유한 풀은 인간 241cit (p <0.05) 및 마우스 241cit (p <0.0001)에 대한 유의한 반응을 유도하였다. 다른 펩타이드는 DR4 마우스에서 유의한 IFNγ 반응을 나타내지 않았다. HHD/DR1 마우스에서 에놀라제 펩타이드 126-145를 가진 풀은 인간 126cit (p <0.05)에 대해 유의한 반응을 유도했지만, 마우스 126cit에는 유도하지 않았다. 에놀라제 펩타이드 316-335를 가진 풀은 인간 316cit (p <0.05)에 대해 유의한 반응을 유도했지만, 마우스 316cit에는 유도하지 않았다. 펩타이드 에놀라제 1-20을 함유한 풀은 인간 펩타이드에 유의한 반응을 유도하지는 않았으나 마우스 1cit에 대한 반응을 유도하였다(p <0.05). C57BL/6 마우스에서 펩타이드 에놀라제 21-40을 가진 풀은 인간 21cit (p <0.05)에 대해 유의한 반응을 유도했지만, 마우스 21cit에는 유도하지 않았다. 에놀라제 펩타이드 126-145를 가진 풀은 마우스 126cit (p <0.05)에 대해 유의한 반응을 유도했지만, 인간 126cit에는 유도하지 않았다. 에놀라제 펩타이드 261-280을 가진 풀은 인간 261cit (p <0.05)에 대해 유의한 반응을 유도했지만, 마우스 261cit에는 유도하지 않았다. 이것은 펩타이드 21-40, 126-145, 241-260 및 316-335의 추가 조사를 정당화 함을 시사한다.
초기 스크리닝에서, DR4 마우스의 에놀라제 241cit 면역화가 가장 강력한 면역 반응을 유도하였다. 따라서, 이 펩타이드를 추가로 조사하였다. DR4 마우스를 25 μg의 인간 241cit 펩타이드와 CpG/MPLA로 단일 면역화하였다. 비장세포에 대한 생체 외 엘리스폿은 마우스(p = 0.0008) 및 인간(p = 0.0124) 서열 둘 다에 대해 배지 대조군에 비해 시트룰린화된 펩타이드에 대한 유의한 IFNγ 반응을 보였다 (도 3A). 마우스 서열은 실제로 ENO2와 ENO3의 aa241-260과 동일한 순서이므로 여전히 자가-항원(self-antigen)이다. 흥미롭게도, 253 위치의 아르기닌 잔기가 시트룰린으로 대체되지 않은 인간 또는 마우스 야생형(wt) 서열은 면역 반응을 일으키지 않았다. 이것은 에놀라제 241cit이 DR4 마우스에서 시트룰린 특이적 IFNγ 반응을 유도한다는 것을 확인해주었다.
에놀라제 241cit 펩타이드에 의해 생성된 사이토카인 반응의 유형을 결정하기 위해, 생체 외 IL-10도 분석하였다. 펩타이드 자극에 대한 반응으로 엘리스폿 분석에서 IL-10 생산의 유의한 증가는 관찰되지 않았다 (도 3B).
앞서 시트룰린화된 펩타이드 특이성 반응은 CD4 매개되는 것으로 나타났다. 241cit에 대한 반응이 CD4에 의존적인지 여부를 결정하기 위해, 엘리스폿 검정을 인간 MHC 유형 II 블록킹 항체(클론 L243)로 수행하였다 (도 3C). IFNγ 반응은 인간 에놀라제 241cit (p = 0.0171) 및 마우스 241cit (p = 0.0023)에 반응하여 L243에 의해 유의하게 감소되었다. 241cit 특이적 반응이 CD4 매개성임을 확인하기 위해, 뮤린 CD4 또는 CD8 블록킹 항체 (각각 클론 GK1.5 또는 클론 2.43)를 포함하는 CD4가 풍부하거나 고갈된 세포 분획을 엘리스폿 검정을 수행하였다. 인간 에놀라제 241cit에 대한 반응은 CD4 블록킹 항체의 존재 하에서 유의하게 감소되었지만 CD8 블록킹 항체의 경우에는 감소되지 않았다 (도 15A). 또한 CD4가 풍부한 분획에는 반응이 존재하나 CD4 고갈된 분획에는 반응이 존재하지 않는다 (도 15B). 에놀라제 241-260은 긴 펩타이드이므로 반응을 인식하는 최적의 15mer 서열을 결정하고자 하였다. 241-260 서열에 걸쳐있는 두 개의 15mer 펩타이드를 특정 반응을 자극하는 aa241-255와의 반응에 대해 시험하였으나, aa246-260에 대한 반응은 없었다 (도 15C).
초기 스크린에서 보이는 낮은 빈도 반응(lower frequency response)을 확인하기 위해, DR4, C57Bl/6 및 HHD/DR1 마우스를 21-40, 126-145 및 316-335 위치의 서열에 해당하는 인간 시트룰린화된 에놀라제 펩타이드로 단일 면역화하였다 (도 4). 에놀라제 21cit은 마우스에 대해서 DR4 마우스에서 낮은 수준이지만 유의한 반응을 유도하였으나(p <0.01) 인간 서열에 대해서는 그렇지 않았다. C57Bl/6 마우스에서, 시트룰린화된 펩타이드에 반응하지만 wt 펩타이드에는 반응하지 않는 강한 IFNγ 반응이 관찰되었다 (도 21a). 이들은 CD4 블록킹 항체에 의해 효과적으로 블록킹되지만 CD8 블록킹 항체에 의해서는 아니므로 CD4 매개성인 것으로 보인다 (도 21b). 에놀라제 126cit은 DR4 마우스(p <0.05)에서 인간 펩타이드에 대해 낮은 수준의 유의한 반응을 유도했지만 DR1/HHD 마우스에서는 그렇지 않았다. 에놀라제 316cit은 인간에 적당한 반응을 유도하였으나, DR4(p <0.01)와 DR1/HHD (p <0.01) 마우스 모두에서는 그렇지 않았다.
에놀라제 서열은 또한 온라인 IEDB 예측 프로그램을 사용하여 인간 및 뮤린 MHC 유형 II에 높은 결합 친화력을 갖는 펩타이드 서열에 대한 인 실리코(in silico) 분석을 수행하였다. 이것은 aa11-25 서열이 뮤린 MHC 유형 II(I-Ab)에 대해 강력할 것임을 제안하였고, 따라서 시트룰린화된 aa11-25 펩타이드는 C57Bl/6 마우스에서의 반응에 대해 시험하였다. 마우스는 wt 펩타이드에 대해 최소한의 반응성으로 뮤린 서열로부터 등가 서열과 교차 반응하는 이 시트룰린화된 펩타이드에 대해 IFNγ 반응을 보였다 (도 22a). 시트룰린화된 eno11 펩타이드에는 IL-10 반응이 관찰되지 않았다 (도 22b). 에놀라제 11cit 특이적인 IFNγ 반응은 CD8 블록킹 항체의 사용이 반응에 아무런 영향을 미치지 않는 반면에 CD4 블록킹 항체가 반응을 중지시킴으로써 이들을 차단함으로써 CD4 세포에 의해 매개된다 (도 22c).
HLA-DP4가 또한 존재할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 에놀라제 241cit 펩타이드 유전자이식 DP4 마우스를 활용하였다. DP4 마우스를 3회 용량의 인간 또는 마우스 에놀라제 241cit 펩타이드 중의 하나로 면역화하였다. IFNγ 반응은 엘리스폿에 의해 결정되었다 (도 5). 인간 에놀라제 241cit 펩타이드로 면역화된 마우스는 인간 에놀라제 241cit (p <0.0001) 및 마우스 241cit (p <0.0001) 둘 다에 대한 반응을 나타내었고, 야생형 펩타이드와 비교했을 때 증가된 IFNγ 반응을 보였다 (도 5A). 이러한 반응은 1 내지 0.1 ug/ml 펩타이드의 결합력을 나타낸다 (도 16A). 인간 241-260cit 펩타이드로 면역화된 마우스의 세포는 그랜자임 B 방출을 나타내지만 IL-10은 cit 펩타이드에 대해 반응하지 않으며, 그러나 wt 펩타이드는 그렇지 않다 (도 16B 및 C). DP4 마우스에서 인간 241-260 cit 펩타이드에 대한 특이적 반응은 또한 CD4 블록킹 항체에 의해 블록킹되지만 CD8 블록킹 항체에 의해서는 블록킹되지 않으며, aa241-255에 걸친 더 짧은 펩타이드에 대한 교차 반응성을 나타낸다 (도 16D 및 E). 뮤린 에놀라제 241-260 펩타이드로 DP4 유전자이식 마우스를 면역화하면 시트룰린화된 펩타이드에 특이적인 반응을 유도하지만 야생형에 대한 반응을 유도하지는 않는다 (도 16F).
실시예 3: 종양 세포에 제시된 Cit 에놀라제 펩타이드는 종양 요법을 위한 표적이 될 수 있다.
본 발명자들은 흑색종 B16F1과 루이스 폐 암종 세포주가 알파 에놀라제를 구성적으로 발현한다는 것을 웨스턴 블롯팅(Western blotting)으로 확인하였다 (도 6A). 다음으로, 에놀라제 241cit 펩타이드 면역화의 항종양 효과를 생체 내에서 평가하였다. 구성적 인간 DR4 (B16DR4)로 형질주입된 마우스 B16 흑색종 세포주의 성장에 대한 에놀라제 면역화의 영향을 평가하였다. 에놀라제 241cit 펩타이드로 면역화하기 3일 전에 마우스에 B16DR4를 접종하였다. 에놀라제 241cit 펩타이드 면역화된 마우스는 대조군 마우스에 비해 유의한 생존율을 보였다 (도 6B). 면역화되지 않은 마우스는 45일 후에 15%의 생존율을 보였지만 에놀라제 241cit 면역화된 마우스는 50%의 생존율을 보였다 (p = 0.0001). 종양 이식 후 17 일째에 (p = 0.0043) 대조군 (중간값 49 mm3)과 비교하여 종양 용적은 에놀라제 241cit 면역화된 마우스 (중간값 0 mm3)에서 유의하게 낮았다 (도 6C).
241-260cit 에피토프에 대한 반응이 DP4 마우스에서도 입증되었기 때문에, DP4 형질 전환 마우스에 구성적 인간 DP4 (B16DP4)를 발현하는 B16 흑색종 세포주를 접종한 다음, 이어서 에놀라제 241cit 펩타이드로 면역화하였다. 에놀라제 241cit 펩타이드 면역화된 마우스는 면역화되지 않은 마우스에 비해 60 일 후 생존율이 각각 70%와 10%로 유의한 생존 이점(p = 0.0058)을 보였다 (도 17).
생존이 종양 세포주에서 MHC 유형 II의 구성적 발현에 의해 영향을 받는지 여부를 결정하기 위해, HLA-DR4 발현이 IFNγ 유도성(iDR4)인 B16 세포에서 항종양 효과를 평가하였다. 에놀라제 241cit 펩타이드로 면역화하기 4일 전에 마우스에 B16iDR4를 접종하였다 (도 6D). 42 일째에 (p <0.0001) 면역화되지 않은 대조군 동물 (생존율 0%)과 비교하여 에놀라제 241cit 면역화 그룹 (90%)에서 생존율이 유의하게 증가하였다. 종양 이식 후 17 일째에 면역화되지 않은 대조군 마우스(중간값 65 mm3, p=0.0048)와 비교하여 종양 용적 또한 에놀라제 241cit 면역화된 마우스 (중간값 0 mm3)에서 유의하게 낮았다. 면역화된 그룹에서 높은 생존율을 감안할 때, 메모리(memory)가 확립되었는지를 알기 위해 42 일째에 이 마우스에 B16iDR4를 재접종하였다. 새로운 미처리 마우스에게 대조군으로서 종양을 접종하였다. 에놀라제 면역화된 생존자는 이전에 치료받지 않은 대조군 마우스와 비교하여 재접종에서 상당한 생존 이점을 보였다 (도 6F). 재접종후 39 일째에 에놀라제 241cit 면역화된 그룹에서 생존율이 67%이었고 모든 대조군은 29일째 사망하였다 (p = 0.0112).
이러한 항종양 효과가 B16DR4 모델에 특이적인지를 결정하기 위해, 마우스에 루이스 폐암 세포주 LLC2를 접종하였다 (도 7A). 예비 연구에 따르면, B16 세포에 비해 LLC2 세포의 지속적인 성장을 얻기 위해서는 높은 이식 세포 수가 필요함을 제시되었다 (데이터는 표시되지 않음). 이러한 이유로 본 발명자 입장에서는 LLC2 모델은 B16 모델보다 훨씬 공격적이다. 마우스는 에놀라제 241cit 펩타이드로 면역화하기 4 일 전에 DR4 (LLCDR4)를 구성적으로 발현하도록, 부모 LLC2 또는 형질주입된 LLC2로 시험하였다. 생존 데이터는 모든 마우스가 48 일째에 사망한 대조군과 비교하여 58일째에 마우스의 40%가 생존해 있어서 에놀라제 241cit 면역화가 LLCDR4 종양 (p = 0.0142)에 대한 생존 이점을 제공함을 나타내었다. 그러나, 부모 LLC2 종양으로 접종한 마우스에서, 에놀라제 241cit 면역화된 마우스가 생존 시간에서 작지만 유의한 증가를 보였다(p = 0.0005). 이러한 결과는 종양 세포에서의 인간 DR4 발현이 이 모델에서 종양 거부에 중요하다는 것을 시사한다.
에놀라제는 또한 췌장 종양 세포주 Pan02 (도 6A)에 의해 발현된다. 이 세포주를, 구성적으로 HLA-DR4를 발현하도록 조작하고, DR4 유전자이식 마우스에 종양을 접종하고 4일 후에 에놀라제 241cit 펩타이드로 면역화하였다. 에놀라제 241cit 펩타이드 면역화된 마우스는 면역화되지 않은 대조군 DR4 마우스와 비교하여 Pan02 DR4 모델에서 유의하게 향상된 생존율(p = 0.0076)을 나타낸다. 50%의 마우스가 60 일째에 생존을 나타내는 것에 비해 면역화되지 않은 마우스는 생존하지 않았다 (도 18).
실시예 4 DNA 면역화는 시트룰린화된 에놀라제에 대한 반응을 일으킨다.
APC가 에피토프를 구성적으로 시트룰린화할 수 있기 때문에, 에놀라제를 암호화하는 DNA 작제물이 시트룰린화되어 반응을 자극하는 것이 가능하였다. 따라서, HLA-DR4 유전자이식 마우스를 마우스 에놀라제를 암호화하는 DNA 작제물로 면역화하였다. 이들 마우스로부터 자극된 T 세포를 시험관 내에서 IFNγ에 대해 시트룰린화된 및 시트룰린화되지 않은 에놀라제 241 펩타이드 둘 다에 대한 반응을 스크리닝하였다. 도 8A는 마우스가 시트룰린화된 마우스 펩타이드(평균 : IFNγ 180/백만개의 비장세포; p = 0.0001)에만 반응한다는 것을 보여준다. IL-10 반응은 관찰되지 않았다 (도 8B).
다음으로, 에놀라제 DNA 면역화의 항종양 효과를 생체 내에서 평가하였다. 에놀라제 DNA로 면역화하기 4일 전에 마우스에게 B16DR4를 접종하였다. 에놀라제 DNA 면역화된 마우스는 대조군 마우스에 비해 유의한 생존 이점을 보였다 (도 8C). 면역화되지 않은 마우스는 45일 후에 15%의 생존율을 보였지만 에놀라제 DNA 면역화된 마우스는 60%의 생존율을 보였다 (p = 0.0001). 종양 이식 후 17 일째에 (p = 0.0088) 대조군 (중간값 150 mm3)과 비교하여 종양 용적은 에놀라제 DNA 면역화된 마우스 (중간값 20 mm3)에서 유의하게 낮았다 (도 8D).
실시예 5 에놀라제 펩타이드에 대한 CD4 반응이 다른 보조제 및 다른 용량에서 결합할 때 달라지는 지 여부에 대한 결정
에놀라제 241cit 펩타이드는 CpG/MPLA 보조제와 함께 단일 25 ug 용량으로 투여했을 때 강한 IFNγ 반응을 유도한다. 생성된 반응에 대한 보조제 및 용량 섭생의 효과가 조사되었다. 마우스는 CpG/MPLA 또는 불완전 프로인트 보조제(IFA)를 보조제로 사용하여 단일 용량의 에놀라제 241cit 펩타이드로 면역화하였다. 에놀라제 241cit 펩타이드에 대한 IFNγ 반응은 CpG/MPLA (p = 0.0028)가 보조제로 사용된 경우 엘리스폿에 의해 검출되었지만 IFA가 보조제로 사용된 경우 IFNγ 반응은 보이지 않았다 (도 9A). 에놀라제 241cit 펩타이드를 IFA (p <0.0001)와 투여한 경우 IL-10 반응이 검출되었으나 에놀라제 241cit 펩타이드를 CpG/MPLA와 투여한 경우는 그렇지 않았다 (도 9B). 이들 보조제 이외에, 다른 TLR 작용제(agonist), 폴리 I:C (TLR3) 및 이미퀴모드(imiquimod) (TLR7)를 조합한 반응을 DR4 및 DP4 유전자이식 마우스 모두에서 평가하였다. 폴리 I:C와의 결합은 마우스 계통 모두에서 IFNγ 반응을 유도하지만 IL-10은 그렇지 않았다 (도 19). 이미퀴모드와 결합된 에놀라제 241cit 펩타이드는 DP4 유전자이식 마우스에서는 IFNγ 반응을 유도하지만 DR4 유전자이식 마우스에서는 그렇지 않았다 (도 19). 이것은 에놀라제 241cit 펩타이드로 면역화하여 생성된 사이토카인 반응의 유형이 선택된 보조제에 의해 크게 영향을 받을 수 있음을 시사한다.
다음으로, GM-CSF로 면역화에 대한 용량 반응을 평가하였다. 마우스는 에놀라제 241cit 펩타이드 25 μg 또는 5 μg 중 하나로 단일 용량 또는 3 용량으로 면역화하였다. IFNγ 반응은 엘리스폿에 의해 평가되었다 (도 9C). 검출가능한 반응은 펩타이드 25 μg로 1 또는 3 용량 후에 관찰될 수 있었다. 다음, 마우스에게 B16DR4를 투여한 다음 GM-CSF에 에놀라제 5 μg의 3 용량을 3 주에 걸쳐 투여하여 이것이 항종양 반응을 유도하기에 충분한 지 여부를 결정하였다 (도 9D). 에놀라제 241cit 면역화된 마우스는 대조군의 마우스보다 유의하게 생존율이 높았으며 (p = 0.0045), 28 일째에 대조군이 0%의 생존율을 보인 것에 비해 45일째에 70%의 동물이 생존하였다.
실시예 6 에놀라제 241cit 메모리 반응(memory response)
에놀라제 241cit 펩타이드로 면역화하는 것에 대한 반응을 분극화시키는 서로 다른 보조제의 능력은 관련된 T 세포 집단의 가소성(plasticity)을 제안할 수 있다. 이는 기존 또는 메모리 반응을 나타낼 수 있다. 따라서 다음으로, 에놀라제 cit 반응이 개발되는 속도를 결정하였다. 마우스를 희생시키기 전에 CpG/MPLA에서 2, 6 또는 14 일에 단일 용량의 에놀라제 241cit 펩타이드로 면역화하였다. 생체 외 엘리스폿은 IFNγ 반응을 결정하는 데 사용되었다 (도 10). 마우스 버전의 펩타이드로 면역화하면 2일 후에 검출될 수 있는 IFNγ 반응이 유도되었다. 2, 6 또는 14 일 후에 나타나는 반응 간에는 유의한 차이가 없었다. 인간 에놀라제 241cit 펩타이드로 면역화하면 6일 후에 검출할 수 있는 IFNγ 반응이 유도되었다. 2 일 후 반응과 비교하여 6일 (p = 0.0009) 및 14 일 (p = 0.0092) 후에 반응이 유의하게 증가하였다. 이러한 결과는 내인성 뮤린 펩타이드에 특이적인, 에놀라제 241cit 펩타이드에 대한 반응이 있을 수 있음을 시사한다.
실시예 7 건강한 인간 공여자에서의 반응
에놀라제 241cit 펩타이드에 대한 마우스의 반응은 면역화 2 일 후에 조기에 발견될 수 있다. 이것은 인간이 검출할 수 있는 에놀라제 241cit 펩타이드에 대한 기존의 반응을 가지고 있는지에 대한 의문을 제기하였다. 이를 조사하기 위해 6 명의 건강한 공여자로부터 PBMC를 분리하고 인간 에놀라제 펩타이드의 존재 하에서 배양하였다. 티미딘 증식 검정은 4 일, 7 일 및 11 일 후에 세포에서 수행되었고, 각각에 대한 증식 지수를 계산하였다 (도 11A). 공여자 중 5/6 명이 적어도 하나의 샘플 날에 에놀라제 241cit 펩타이드에 증식을 보였다. 예를 들어, 공여자 1은 11 일째 (평균 20.4) 및 7 일째 (평균 28.6)에 에놀라제 241cit에 대한 증식 반응을 보였지만, 4 일째 (평균 0.8)에는 그렇지 않았다. 에놀라제 241wt에 대한 반응은 11 일 (평균 0.9), 7일 (평균 1.2) 및 4일 (평균 0.3)에서 일관되게 낮았다. 대조적으로, 공여자 2는 11 일째에 낮은 수준의 반응(평균 2.7)을 나타내었고 공여자 6은 반응하지 않았다. 각 공여자에 대해 HLA 유형이 결정되었고 도에 표시되어 있다.
공여자 4는 4 일 (평균 12.5) 및 7 일 (평균 28 일) 및 11 일 (4.4 일)에 높은 증식 지수를 나타내었다. 이 공여자는 추가 분석을 위해 선택되었다. 상등액을 각 시점에서 세포로부터 채취하고 사이토카인 수준을 루미넥스 (Luminex)에 의해 분석하였다. 배지 전용 대조군의 배경 수준 이상의 반응을 각 사이토카인에 대해 계산하였다 (도 11B). IFNγ 및 IL-10은 시트룰린화된 펩타이드 특이적 반응을 나타내었고, 시간에 따라 증가하였다. 야생형 자극된 세포에서는 IL-17, 그랜자임 B 및 TNFα 수준이 약간 증가했지만 이들 반응은 시트룰린화된 펩타이드 자극된 시료에서 더 높았다.
다음으로, 공여자 4의 PBMC를, 펩타이드 존재하에 생체 외 배양하기 전에, 카르복시플루오레신 숙신이미딜 에스테르(Carboxyfluorescein succinimidyl ester, CFSE)로 표지하였다. 7 일 및 10 일에 세포를 제거하고 항-CD8 및 항-CD4 형광색소 콘쥬게이트된 항체로 염색하고 유동 세포 계측법으로 분석하였다 (도 11C). 증식하는 CFSElow 집단 중 73 내지 96%의 세포가 CD4+이었고 0 내지 2%의 세포가 CD8+이었다. 에놀라제 241cit 펩타이드는 에놀라제 241wt 펩타이드와 비교하여 CFSElowCD4+ 세포의 비율을 증가시켰다. 10 일째, 에놀라제 241cit 림프구의 15%는 CFSElowCD4+인 반면, 에놀라제 241wt 펩타이드의 1%는 CFSElowCD4+이다.
IFNγ 반응은 또한 에놀라제 241 cit 또는 wt 펩타이드에서 13 일 동안 배양 된 PBMC를 시트룰린화된 또는 wt 에놀라제 241 펩타이드로 재자극한 IFNγ 엘리스폿 검정에 의해 나타내어졌으며, 사이토카인 방출을 측정하였다. 도 20A는 공여자 1 및 4에 대한 IFNγ 엘리스폿 검정의 결과를 도시한다. 두 공여자로부터의 세포는 시트룰린화된 펩타이드에 대한 반응을 나타내지 만 wt 펩타이드에 대한 반응을 나타내지 않는다. 세포 내 사이토카인 염색에 의한 이들 반응의 추가 분석은 IFNγ 반응이 CD4 매개성임을 나타낸다. 도 20B는 에놀라제 241cit 펩타이드에서 13 일 동안 배양되고 시트룰린화된 또는 wt 펩타이드로 재자극 된 공여자 4로부터의 PBMCs에 대한 세포내 사이토카인 염색을 도시한다. IFNγ 양성 CD4 세포는 시트룰린화된 펩타이드(0.44 %)로 자극시 관찰되지만 wt 펩티드는 관찰되지 않는다.
3 명의 공여자에 대한 배양물의 루미넥스 (Luminex) 데이터는 wt 펩티드 및 저급 IL-10, TNFα 또는 IL-17 반응에 대한 최소 반응으로 시트룰린화된 에놀라제 241 펩타이드에 대한 IFNγ 반응을 나타낸다 (도 20C).
이러한 결과는 건강한 사람은 시트룰린 특이적이며 Th1 사이토카인을 생산할 수 있는 에놀라제 241cit 펩타이드에 대한 CD4 증식 반응을 발전시킬 수 있음을 시사한다.
실시예 8 면역 조직 화학
시트룰린화는 PAD 효소, 특히 PAD2와 PAD4 효소에 의해 수행된다. 이들은 높은 수준의 칼슘을 필요로 하며, 일반적으로 죽은 세포 또는 죽어가는 세포 또는 자가포식이 진행되는 세포에서 활성화된다. 건강한 세포는 시트룰린화된 단백질을 발현하면 안되지만 저산소증 또는 영양 스트레스로 인해 종양이 자가포식 및 시트룰린화된 에놀라제를 활성화시킨다. 따라서 결장직장, 위, 폐, 유방 및 난소 종양은 에놀라제의 발현을 위해 염색되었다.
결장직장 종양(Colorectal tumours ): 232 개의 결장직장 종양을 ENO-1 특이적 단일클론성 항체로 염색하였다 (표 2). 28%의 종양이 염색에 실패하였고, 56%가 약한 염색(H스코어 1-100)을 보였고, 13%는 중간 염색(H스코어 101-200)을 보였으며, 3%는 강한 염색(Hscore 201-300)을 보여 대부분의 세포는 강하게 염색되었다.
Eno -1에 대한 결장직장 종양 어레이의 면역조직화학 염색
음성(negative) 저(low) 중간(moderate) 고(high) 총(total)
H-스코어 0 1-100 101-200 201-300
Cores 655 129 30 8 232
28% 56% 13% 3%
위 종양(Gastric tumours ): 70 개의 위 종양을 ENO-1 특이적 단일클론성 항체로 염색하였다 (표 3). 16%의 종양이 염색에 실패하였고, 62%가 약한 염색(H스코어 1-100)을 보였고, 19%는 중간 염색(H스코어 101-200)을 보였으며, 3%는 강한 염색(Hscore 201-300)을 보여 대부분의 세포는 강하게 염색되었다.
Eno -1에 대한 위 종양 어레이의 면역조직화학 염색
음성 저 중간 고 총
H-스코어 0 1-100 101-200 201-300
cores 11 44 13 2 70
16% 62% 19% 3%
비- 소세포성 폐 종양(Non-small cell lung tumours): 223 개의 비-소세포성 폐 종양을 ENO-1 특이적 단일클론성 항체로 염색하였다 (표 4). 20%의 종양이 염색에 실패하였고, 59%가 약한 염색(H스코어 1-100)을 보였고, 17%는 중간 염색(H스코어 101-200)을 보였으며, 4%는 강한 염색(Hscore 201-300)을 보여 대부분의 세포는 강하게 염색되었다.
Eno -1에 대한 비- 소세포성 폐 종양 어레이의 면역조직화학 염색
음성 저 중간 고 총
H-스코어 0 1-100 101-200 201-300
cores 45 132 37 9 223
% 20 59 17 4
난소 종양(Ovarian tumours ): 223 개의 난소 종양을 ENO-1 특이적 단일클론성 항체로 염색하였다 (표 5). 42%의 종양이 염색에 실패하였고, 51%가 약한 염색(H스코어 1-100)을 보였고, 2%는 중간 염색(H스코어 101-200)을 보였으며, 5%는 강한 염색(Hscore 201-300)을 보여 대부분의 세포는 강하게 염색되었다.
Eno -1에 대한 난소 종양 어레이의 면역조직화학 염색
음성 저 중간 고 총
H-스코어 0 1-100 101-200 201-300
cores 93 115 5 10 223
% 42 51 2 5
유방 종양(Breast tumours ): 858 개의 유방 종양을 ENO-1 특이적 단일클론성 항체로 염색하였다 (표 6). 28%의 종양이 염색에 실패하였고, 19%가 약한 염색(H스코어 1-100)을 보였고, 36%는 보통 염색(H스코어 101-200)을 보였으며, 17%는 강한 염색(Hscore 201-300)을 보여 대부분의 세포는 강하게 염색되었다.
Eno -1에 대한 유방 종양 어레이의 면역조직화학 염색
음성 저 중간 고 총
H-스코어 0 1-100 101-200 201-300
cores 239 165 310 144 858
% 28% 19% 36% 17%
에스트로겐 수용체 음성 유방 종양(Oestrogen receptor negative breast tumours): 249 개의 에스트로겐 수용체 음성 유방 종양을 ENO-1 특이적 단일클론성 항체로 염색하였다 (표 7). 8%의 종양이 염색에 실패하였고, 14%가 약한 염색(H스코어 1-100)을 보였고, 55%는 중간 염색(H스코어 101-200)을 보였으며, 23%는 강한 염색(Hscore 201-300)을 보여 대부분의 세포는 강하게 염색되었다.
Eno -1에 대한 에스트로겐 수용체 음성 유방 종양 어레이의 면역조직화학 염색
음성 저 중간 고 총
H-스코어 0 1-100 101-200 201-300
cores 19 36 136 58 249
% 8% 14% 55% 23%
실시예 9
다른 종 사이에서의 에놀라제의 상동성.
에놀라제는 마우스, 개 양, 소, 말, 돼지 및 인간 사이에서 고도로 보존된다 (도 12-14). 백신이 인간과 마우스에서 T 세포 반응을 유도하고 마우스에서 항종양 반응을 유도함에 따라, 기타 종에서 유사한 반응이 나타나는 것으로 가정할 수 있다.
참고문헌
ABDEL-FATAH, T., ARORA, A., GORGUC, I., ABBOTTS, R., BEEBEEJAUN, S., STORR, S., MOHAN, V., HAWKES, C., SOOMRO, I., LOBO, D. N., PARSONS, S. L. & MADHUSUDAN, S. (2013) Are DNA repair factors promising biomarkers for personalized therapy in gastric cancer? Antioxid Redox Signal, 18, 2392-8.
ALTSCHUL, S. F., GISH, W., MILLER, W., MYERS, E. W. & LIPMAN, D. J. (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol, 215, 403-10.
ALTSCHUL, S. F., MADDEN, T. L., SCHAFFER, A. A., ZHANG, J., ZHANG, Z., MILLER, W. & LIPMAN, D. J. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res, 25, 3389-402.
ANDREASEN, P. A., EGELUND, R. & PETERSEN, H. H. (2000) The plasminogen activation system in tumor growth, invasion, and metastasis. Cell Mol Life Sci, 57, 25-40.
AUSUBEL, J. (1992) Short protocols in molecular biology, John Wiley & Sons
BODANZSKY, B. (1984) The practice of peptide synthesis, New York, Springer Verlag.
CAMP, R. L., DOLLED-FILHART, M. & RIMM, D. L. (2004) X-tile: a new bio-informatics tool for biomarker assessment and outcome-based cut-point optimization. Clin Cancer Res, 10, 7252-9.
CAPELLO, M., FERRI-BORGOGNO, S., CAPPELLO, P. & NOVELLI, F. (2011) alpha-Enolase: a promising therapeutic and diagnostic tumor target. FEBS J, 278, 1064-74.
CAPPELLO, P., ROLLA, S., CHIARLE, R., PRINCIPE, M., CAVALLO, F., PERCONTI, G., FEO, S., GIOVARELLI, M. & NOVELLI, F. (2013) Vaccination with ENO1 DNA prolongs survival of genetically engineered mice with pancreatic cancer. Gastroenterology, 144, 1098-106.
CAPPELLO, P., TOMAINO, B., CHIARLE, R., CERUTI, P., NOVARINO, A., CASTAGNOLI, C., MIGLIORINI, P., PERCONTI, G., GIALLONGO, A., MILELLA, M., MONSURRO, V., BARBI, S., SCARPA, A., NISTICO, P., GIOVARELLI, M. & NOVELLI, F. (2009) An integrated humoral and cellular response is elicited in pancreatic cancer by alpha-enolase, a novel pancreatic ductal adenocarcinoma-associated antigen. Int J Cancer, 125, 639-48.
CHANG, G. C., LIU, K. J., HSIEH, C. L., HU, T. S., CHAROENFUPRASERT, S., LIU, H. K., LUH, K. T., HSU, L. H., WU, C. W., TING, C. C., CHEN, C. Y., CHEN, K. C., YANG, T. Y., CHOU, T. Y., WANG, W. H., WHANG-PENG, J. & SHIH, N. Y. (2006) Identification of alpha-enolase as an autoantigen in lung cancer: its overexpression is associated with clinical outcomes. Clin Cancer Res, 12, 5746-54.
CHOY, E. (2012) Understanding the dynamics: pathways involved in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Rheumatology (Oxford), 51 Suppl 5, v3-11.
COIMBRA, S., FIGUEIREDO, A., CASTRO, E., ROCHA-PEREIRA, P. & SANTOS-SILVA, A. (2012) The roles of cells and cytokines in the pathogenesis of psoriasis. Int J Dermatol, 51, 389-95; quiz 395-8.
DIAZ-RAMOS, A., ROIG-BORRELLAS, A., GARCIA-MELERO, A. & LOPEZ-ALEMANY, R. (2012) alpha-Enolase, a multifunctional protein: its role on pathophysiological situations. J Biomed Biotechnol, 2012, 156795.
DUNCAN, T. J., ROLLAND, P., DEEN, S., SCOTT, I. V., LIU, D. T., SPENDLOVE, I. & DURRANT, L. G. (2007) Loss of IFN gamma receptor is an independent prognostic factor in ovarian cancer. Clin Cancer Res, 13, 4139-45.
DURRANT, L. G., HARDING, S. J., GREEN, N. H., BUCKBERRY, L. D. & PARSONS, T. (2006) A new anticancer glycolipid monoclonal antibody, SC104, which directly induces tumor cell apoptosis. Cancer Res, 66, 5901-9.
FU, Q. F., LIU, Y., FAN, Y., HUA, S. N., QU, H. Y., DONG, S. W., LI, R. L., ZHAO, M. Y., ZHEN, Y., YU, X. L., CHEN, Y. Y., LUO, R. C., LI, R., LI, L. B., DENG, X. J., FANG, W. Y., LIU, Z. & SONG, X. (2015) Alpha-enolase promotes cell glycolysis, growth, migration, and invasion in non-small cell lung cancer through FAK-mediated PI3K/AKT pathway. J Hematol Oncol, 8, 22.
GREEN, D. R. & LEVINE, B. (2014) To be or not to be? How selective autophagy and cell death govern cell fate. Cell, 157, 65-75.
GRUNEWALD, J. & EKLUND, A. (2007) Role of CD4+ T cells in sarcoidosis. Proc Am Thorac Soc, 4, 461-4.
HOLMDAHL, R., KLARESKOG, L., RUBIN, K., LARSSON, E. & WIGZELL, H. (1985) T lymphocytes in collagen II-induced arthritis in mice. Characterization of arthritogenic collagen II-specific T-cell lines and clones. Scand J Immunol, 22, 295-306.
JANG, B., JEON, Y. C., CHOI, J. K., PARK, M., KIM, J. I., ISHIGAMI, A., MARUYAMA, N., CARP, R. I., KIM, Y. S. & CHOI, E. K. (2012) Peptidylarginine deiminase modulates the physiological roles of enolase via citrullination: links between altered multifunction of enolase and neurodegenerative diseases. Biochem J, 445, 183-92.
JANG, B., JIN, J. K., JEON, Y. C., CHO, H. J., ISHIGAMI, A., CHOI, K. C., CARP, R. I., MARUYAMA, N., KIM, Y. S. & CHOI, E. K. (2010) Involvement of peptidylarginine deiminase-mediated post-translational citrullination in pathogenesis of sporadic Creutzfeldt-Jakob disease. Acta Neuropathol, 119, 199-210.
JANG, B., KIM, E., CHOI, J. K., JIN, J. K., KIM, J. I., ISHIGAMI, A., MARUYAMA, N., CARP, R. I., KIM, Y. S. & CHOI, E. K. (2008) Accumulation of citrullinated proteins by up-regulated peptidylarginine deiminase 2 in brains of scrapie-infected mice: a possible role in pathogenesis. Am J Pathol, 173, 1129-42.
KARLIN, S. & ALTSCHUL, S. F. (1993) Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences. Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 5873-7.
KINLOCH, A., LUNDBERG, K., WAIT, R., WEGNER, N., LIM, N. H., ZENDMAN, A. J., SAXNE, T., MALMSTROM, V. & VENABLES, P. J. (2008) Synovial fluid is a site of citrullination of autoantigens in inflammatory arthritis. Arthritis Rheum, 58, 2287-95.
KINLOCH, A., TATZER, V., WAIT, R., PESTON, D., LUNDBERG, K., DONATIEN, P., MOYES, D., TAYLOR, P. C. & VENABLES, P. J. (2005) Identification of citrullinated alpha-enolase as a candidate autoantigen in rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther, 7, R1421-9.
KONDO, H., SAHARA, H., MIYAZAKI, A., NABETA, Y., HIROHASHI, Y., KANASEKI, T., YAMAGUCHI, A., YAMADA, N., HIRAYAMA, K., SUZUKI, M., HAMURO, J., TORIGOE, T., TAKAHASHI, N., KOHAMA, G. I., IKEDA, H. & SATO, N. (2002) Natural antigenic peptides from squamous cell carcinoma recognized by autologous HLA-DR8-restricted CD4+ T cells. Jpn J Cancer Res, 93, 917-24.
LUNDBERG, K., KINLOCH, A., FISHER, B. A., WEGNER, N., WAIT, R., CHARLES, P., MIKULS, T. R. & VENABLES, P. J. (2008) Antibodies to citrullinated alpha-enolase peptide 1 are specific for rheumatoid arthritis and cross-react with bacterial enolase. Arthritis Rheum, 58, 3009-19.
MAHDI, H., FISHER, B. A., KALLBERG, H., PLANT, D., MALMSTROM, V., RONNELID, J., CHARLES, P., DING, B., ALFREDSSON, L., PADYUKOV, L., SYMMONS, D. P., VENABLES, P. J., KLARESKOG, L. & LUNDBERG, K. (2009) Specific interaction between genotype, smoking and autoimmunity to citrullinated alpha-enolase in the etiology of rheumatoid arthritis. Nat Genet, 41, 1319-24.
MARANGOS, P. J., ZIS, A. P., CLARK, R. L. & GOODWIN, F. K. (1978) Neuronal, non-neuronal and hybrid forms of enolase in brain: structural, immunological and functional comparisons. Brain Res, 150, 117-33.
METHERINGHAM, R. L., PUDNEY, V. A., GUNN, B., TOWEY, M., SPENDLOVE, I. & DURRANT, L. G. (2009) Antibodies designed as effective cancer vaccines. MAbs, 1, 71-85.
MILES, L. A., DAHLBERG, C. M., PLESCIA, J., FELEZ, J., KATO, K. & PLOW, E. F. (1991) Role of cell-surface lysines in plasminogen binding to cells: identification of alpha-enolase as a candidate plasminogen receptor. Biochemistry, 30, 1682-91.
MUNZ, C. (2012) Antigen Processing for MHC Class II Presentation via Autophagy. Front Immunol, 3, 9.
MYERS, E. W. & MILLER, W. (1989) Approximate matching of regular expressions. Bull Math Biol, 51, 5-37.
NAKAMURA, N., DAI, Q., WILLIAMS, J., GOULDING, E. H., WILLIS, W. D., BROWN, P. R. & EDDY, E. M. (2013) Disruption of a spermatogenic cell-specific mouse enolase 4 (eno4) gene causes sperm structural defects and male infertility. Biol Reprod, 88, 90.
PANCHOLI, V. (2001) Multifunctional alpha-enolase: its role in diseases. Cell Mol Life Sci, 58, 902-20.
PEARSON, W. R. & LIPMAN, D. J. (1988) Improved tools for biological sequence comparison. Proc Natl Acad Sci U S A, 85, 2444-8.
PLUCKTHUN, A. (1991) Antibody engineering: advances from the use of Escherichia coli expression systems. Biotechnology (N Y), 9, 545-51.
PRINCIPE, M., CERUTI, P., SHIH, N. Y., CHATTARAGADA, M. S., ROLLA, S., CONTI, L., BESTAGNO, M., ZENTILIN, L., YANG, S. H., MIGLIORINI, P., CAPPELLO, P., BURRONE, O. & NOVELLI, F. (2015) Targeting of surface alpha-enolase inhibits the invasiveness of pancreatic cancer cells. Oncotarget.
REFF, M. E. (1993) High-level production of recombinant immunoglobulins in mammalian cells. Curr Opin Biotechnol, 4, 573-6.
REMINGTON, R. (1980) Remington's pharmaceutical sciences, Mack Pub. Co.
SAMBROOK, J., FRITSCH AND MANIATIS (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.
SCHMID, D., PYPAERT, M. & MUNZ, C. (2007) Antigen-loading compartments for major histocompatibility complex class II molecules continuously receive input from autophagosomes. Immunity, 26, 79-92.
SEMENZA, G. L., JIANG, B. H., LEUNG, S. W., PASSANTINO, R., CONCORDET, J. P., MAIRE, P. & GIALLONGO, A. (1996) Hypoxia response elements in the aldolase A, enolase 1, and lactate dehydrogenase A gene promoters contain essential binding sites for hypoxia-inducible factor 1. J Biol Chem, 271, 32529-37.
SIMPSON, J. A., AL-ATTAR, A., WATSON, N. F., SCHOLEFIELD, J. H., ILYAS, M. & DURRANT, L. G. (2010) Intratumoral T cell infiltration, MHC class I and STAT1 as biomarkers of good prognosis in colorectal cancer. Gut, 59, 926-33.
STEWART (1984) Solid phase peptide synthesis, Rockford, Illinois Pierce Chemical Company.
STORR, S. J., ZAITOUN, A. M., ARORA, A., DURRANT, L. G., LOBO, D. N., MADHUSUDAN, S. & MARTIN, S. G. (2012) Calpain system protein expression in carcinomas of the pancreas, bile duct and ampulla. BMC Cancer, 12, 511.
TORELLI, A. & ROBOTTI, C. A. (1994) ADVANCE and ADAM: two algorithms for the analysis of global similarity between homologous informational sequences. Comput Appl Biosci, 10, 3-5.
TRILL, J. J., SHATZMAN, A. R. & GANGULY, S. (1995) Production of monoclonal antibodies in COS and CHO cells. Curr Opin Biotechnol, 6, 553-60.
ZHAO, M., FANG, W., WANG, Y., GUO, S., SHU, L., WANG, L., CHEN, Y., FU, Q., LIU, Y., HUA, S., FAN, Y., LIU, Y., DENG, X., LUO, R., MEI, Z., JIANG, Q. & LIU, Z. (2015) Enolase-1 is a therapeutic target in endometrial carcinoma. Oncotarget.
ZHOU, W., CAPELLO, M., FREDOLINI, C., PIEMONTI, L., LIOTTA, L. A., NOVELLI, F. & PETRICOIN, E. F. (2010) Mass spectrometry analysis of the post-translational modifications of alpha-enolase from pancreatic ductal adenocarcinoma cells. J Proteome Res, 9, 2929-36.
SEQUENCE LISTING <110> Scancell Limited <120> Anti-tumour immune responses to modified self-epitopes <130> P63389WO <140> PCT/GB2016/052181 <141> 2016-07-19 <150> GB 1512703.8 <151> 2015-07-20 <160> 106 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> citrulline <222> (13)..(13) <400> 1 Val Ile Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe Phe Glx Ser Gly Lys 1 5 10 15 Tyr Asp Leu Asp 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> citrulline <222> (13)..(13) <400> 2 Val Ile Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Glx Ser Gly Lys 1 5 10 15 Tyr Asp Leu Asp 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> citrulline <222> (12)..(12) <400> 3 Glu Val Asp Leu Phe Thr Ser Lys Gly Leu Phe Glx Ala Ala Val Pro 1 5 10 15 Ser Gly Ala Ser 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> citrulline <222> (12)..(12) <400> 4 Glu Val Asp Leu Tyr Thr Ala Lys Gly Leu Phe Glx Ala Ala Val Pro 1 5 10 15 Ser Gly Ala Ser 20 <210> 5 <211> 20 <212> 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Lys 50 55 60 Ala Val Asp His Ile Asn Thr Thr Ile Ala Pro Ala Leu Ile Ser Ser 65 70 75 80 Gly Leu Ser Val Val Glu Gln Glu Lys Leu Asp Asn Leu Met Leu Glu 85 90 95 Leu Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Lys Phe Gly Ala Asn Ala Ile Leu 100 105 110 Gly Val Ser Leu Ala Val Cys Lys Ala Gly Ala Ala Glu Arg Asp Leu 115 120 125 Pro Leu Tyr Arg His Ile Ala Gln Leu Ala Gly Asn Ser Asp Leu Ile 130 135 140 Leu Pro Val Pro Ala Phe Asn Val Ile Asn Gly Gly Ser His Ala Gly 145 150 155 160 Asn Lys Leu Ala Met Gln Glu Phe Met Ile Leu Pro Val Gly Ala Glu 165 170 175 Ser Phe Arg Asp Ala Met Arg Leu Gly Ala Glu Val Tyr His Thr Leu 180 185 190 Lys Gly Val Ile Lys Asp Lys Tyr Gly Lys Asp Ala Thr Asn Val Gly 195 200 205 Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn Ile Leu Glu Asn Ser Glu Ala Leu 210 215 220 Glu Leu Val Lys Glu Ala Ile Asp Lys Ala Gly Tyr Thr Glu Lys Ile 225 230 235 240 Val Ile Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe His Arg Asp Gly Lys 245 250 255 Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Ser Pro Ala Asp Pro Ser Arg Tyr Ile Thr 260 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Ser Gly Ala Ser Thr Gly Ile Tyr Glu Ala Leu Glu 35 40 45 Leu Arg Asp Gly Asp Lys Gln Arg Tyr Leu Gly Lys Gly Val Leu Lys 50 55 60 Ala Val Gly His Ile Asn Asn Thr Ile Ala Pro Ala Leu Val Ser Ser 65 70 75 80 Gly Leu Ser Val Val Glu Gln Glu Lys Leu Asp Asn Leu Met Leu Glu 85 90 95 Leu Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Lys Phe Gly Ala Asn Ala Ile Leu 100 105 110 Gly Val Ser Leu Ala Val Cys Lys Ala Gly Ala Ala Glu Arg Glu Leu 115 120 125 Pro Leu Tyr Arg His Ile Ala Gln Leu Ala Gly Asn Ser Asp Leu Ile 130 135 140 Leu Pro Val Pro Ala Phe Asn Val Ile Asn Gly Gly Ser His Ala Gly 145 150 155 160 Asn Lys Leu Ala Met Gln Glu Phe Met Ile Leu Pro Val Gly Ala Glu 165 170 175 Ser Phe Arg Asp Ala Met Arg Leu Gly Ala Glu Val Tyr His Thr Leu 180 185 190 Lys Gly Val Ile Lys Asp Lys Tyr Gly Lys Asp Ala Thr Asn Val Gly 195 200 205 Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn Ile Leu Glu Asn Ser Glu Ala Leu 210 215 220 Glu Leu Val Lys Glu Ala Ile Asp Lys Ala Gly Tyr Thr Glu Lys Ile 225 230 235 240 Val Ile Gly Met Asp Val Ala 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Claims (10)

  1. VIGMDVAASEFFcitSGKYDLD,
    VIGMDVAASEFYcitSGKYDLD,
    EVDLFTSKGLFcitAAVPSGAS,
    EVDLYTAKGLFcitAAVPSGAS,
    KGVPLYcitHIADLAGNSEVIL,
    KGVPLYcitHIADLAGNPEVIL,
    VGDDLTVTNPKcitIAKAVNEK,
    VGDDLTVTNPKcitIAKAASEK,
    IFDScitGNPTVEVDLF, 또는
    IFDScitGNPTVEVDLY로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하거나, 본질적으로 구성되거나 또는 구성된 펩타이드로서,
    여기서 "cit"는 시트룰린을 나타내거나, 또는
    iii) 비-시트룰린 위치에서 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 삽입, 및/또는 1, 2 또는 3개의 아미노산 결실을 제외한, i)의 아미노산 서열인, 펩타이드.
  2. 제1항의 펩타이드를 암호화하는 핵산.
  3. 제1항의 펩타이드에 결합하는 결합 잔기.
  4. 제3항에 있어서,
    항체인 결합 잔기.
  5. 약제학적으로 허용가능한 담체와 조합하여, 제1항의 폴리펩타이드 및/또는 제2항의 핵산 및/또는 제3항 또는 제4항의 결합 잔기를 포함하는 약제학적 조성물.
  6. 의약(medicine)에 사용하기 위한 제1항의 펩타이드 및/또는 제2항의 핵산 및/또는 제3항 또는 제4항의 결합 잔기.
  7. 제4항에 있어서,
    암 치료에 사용하기 위한, 펩타이드 및/또는 핵산 및/또는 결합 잔기.
  8. 제5항에 있어서,
    암은 에스트로겐 수용체 음성 유방암을 포함하는 유방암, 결장직장암, 위암, 비-소세포성 폐암, 자궁 내막암을 포함한 난소암, 췌장관 선암을 포함하는 췌장암, 백혈병, 흑색종, 두경부암 또는 폐암을 포함하는,
    펩타이드 및/또는 핵산 및/또는 결합 잔기.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서,
    인간 또는 수의학적 용도로 사용되는, 펩타이드 및/또는 핵산 및/또는 결합 잔기.
  10. 제7항, 제8항 또는 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산이 에놀라제(enolase)를 암호화하는, 핵산.
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Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112142824B (zh) * 2019-06-27 2022-03-11 深圳市东贵博康生化科技有限公司 具有诱导细胞毒性t淋巴细胞能力的多肽及其应用
CN111398308B (zh) * 2020-03-27 2023-01-17 上海健康医学院 一种片剂、胶囊铝塑泡罩包装质量自动检测方法及系统
IT202100024779A1 (it) * 2021-09-28 2023-03-28 Univ Degli Studi Di Torino Vaccino a DNA per l’uso nel trattamento profilattico o terapeutico dell’adenocarcinoma duttale pancreatico
CN114478784B (zh) * 2022-01-07 2022-11-25 陕西脉元生物科技有限公司 一种eno2单克隆抗体1c5及其制备方法和应用

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1541585B1 (en) 2002-08-27 2013-01-30 Biokine Therapeutics Ltd. Cxcr4 antagonist and use thereof
US7670604B2 (en) 2002-12-13 2010-03-02 Aurelium Biopharma, Inc. Vimentin directed diagnostics and therapeutics for multidrug resistant neoplastic disease
DE102005029845B4 (de) 2005-06-27 2017-03-23 Orgentec Diagnostika Gmbh Verfahren zur Diagnose von rheumatischen Erkrankungen
US20070248628A1 (en) 2005-12-06 2007-10-25 Keller Lorraine H Immunogens in cancer stem cells
US8404810B2 (en) 2006-02-17 2013-03-26 Five Prime Therapeutics, Inc. Compositions and methods of use for modulators of polypeptides and polynucleotides in treating breast cancer and melanoma
US20070248539A1 (en) 2006-04-24 2007-10-25 Shantha West Inc. AgRM2 antigen
SI2567707T1 (sl) 2007-07-27 2017-01-31 Immatics Biotechnologies Gmbh Sestava s tumorjem povezanih peptidov in zadevnih cepiv proti raku
IL225538A0 (en) 2009-03-30 2013-06-27 Nestec Sa Methods for the identification of anti-immune reaction peptides of anti-citrullinates
US20130303460A1 (en) 2011-01-10 2013-11-14 Biokine Therapeutics Ltd. Peptides and compositions for the treatment of neuroectodermal derived tumors and retinoblastoma
EP2667888A4 (en) 2011-01-28 2015-11-11 Univ Oregon Health & Science LIGMPHES OF RECOMBINANT T LYMPHOCYTES AND ANTIBODIES BINDING TO LYMPHOCYTES B FOR THE TREATMENT OF AUTOIMMUNE DISEASES
EP2694530B1 (en) * 2011-04-05 2018-02-14 Curara AB Novel peptides that bind to types of mhc class ii and their use in diagnosis and treatment
US20120295292A1 (en) 2011-05-19 2012-11-22 University Of South Carolina Detecting Protein Arginine Deiminase (PAD) Activity in Human Tissues and Sera
US20130274125A1 (en) 2012-04-16 2013-10-17 Bio-Rad Laboratories Inc. Multiplex immunoassay for rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases
GB201214007D0 (en) 2012-08-07 2012-09-19 Scancell Ltd Anti-tumour immune responses to modified self-epitopes

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