IT202100024779A1 - Vaccino a DNA per l’uso nel trattamento profilattico o terapeutico dell’adenocarcinoma duttale pancreatico - Google Patents
Vaccino a DNA per l’uso nel trattamento profilattico o terapeutico dell’adenocarcinoma duttale pancreatico Download PDFInfo
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Description
Descrizione dell?invenzione industriale dal titolo: ?Vaccino a DNA per l?uso nel trattamento profilattico o terapeutico dell?adenocarcinoma duttale pancreatico?
DESCRIZIONE
Campo dell?invenzione
La presente invenzione rientra nel settore dell?immunoterapia quale approccio profilattico o terapeutico per la cura di patologie tumorali.
Pi? specificamente l?invenzione riguarda un vaccino a DNA per il trattamento profilattico o terapeutico dell?adenocarcinoma duttale pancreatico, altres? indicato come ?ADP?.
Sfondo dell?invenzione
Tra i tumori del pancreas, l?ADP ? il pi? frequente e rappresenta la quarta causa di morte negli Stati Uniti e in Europa, ma si prevede che entro il 2025 diventi la seconda causa. Infatti, l?ADP ha una prognosi molto sfavorevole con una sopravvivenza mediana di 6 mesi e una probabilit? di sopravvivenza a 5 anni dalla diagnosi dell?8%. L?intervento chirurgico rimane il trattamento curativo per eccellenza quando si riesce ad effettuare una diagnosi precoce, che tuttavia ? applicabile solo al 10-20% dei casi. La sopravvivenza complessiva a 5 anni dopo la duodenectomia pancreatica ? di circa il 25-30% nei casi di tumore nodo-negativi e del 10% nei casi nodo-positivi, in quanto nella restante parte dei pazienti si sviluppa spesso una recidiva locoregionale o distante.
Nonostante i notevoli sforzi compiuti nel settore dell?oncologia medica, i trattamenti chemioterapici e radioterapici utilizzati riescono solo marginalmente ad aumentare la sopravvivenza.
In tale contesto, si pone l?urgenza di terapie anti-tumorali innovative che siano capaci di intervenire con superiore efficacia sui meccanismi patogenetici alla base dello sviluppo dell?ADP, consentendo un miglioramento significativo del tasso di sopravvivenza dei pazienti.
Negli ultimi decenni, tra le prospettive di cura dei tumori ha assunto un ruolo importante l?immunoterapia, il cui sviluppo ? stato consentito dall?identificazione di un numero sempre crescente di antigeni tumorali che, essendo espressi in modo aberrante nelle cellule tumorali, rappresentano un bersaglio ideale contro cui indurre o ripristinare una risposta immunitaria specifica in grado di provocare la morte delle stesse. I vaccini antitumorali costituiscono uno degli approcci pi? promettenti nel campo dell?immunoterapia oncologica, al pari - o anche pi? - degli anticorpi monoclonali, in quanto in molti pazienti o tipi tumorali gli anticorpi non risultano efficaci.
L?avanzamento delle conoscenze nel campo della biologia molecolare e cellulare ha consentito, in tempi recenti, lo sviluppo di una tipologia alternativa di vaccino, basata sulla somministrazione, anzich? dell?antigene come proteina capace di indurre una risposta immunitaria protettiva, della sequenza di DNA codificante per la proteina antigenica inserita in un vettore. Inoltre, sono noti vaccini basati su RNA sviluppati in tempi molto recenti per contrastare la pandemia da Sars-Cov-2.
Nel caso di vaccini a DNA, le molecole di DNA ricombinante impiegate per l?immunizzazione, una volta captate dalle cellule bersaglio, determinano l?espressione della sequenza codificante e la produzione della proteina corrispondente, atta a stimolare una risposta immunitaria completa. Infatti, a differenza dei vaccini convenzionali che inducono esclusivamente una protezione di tipo umorale, i vaccini a DNA consentono anche la stimolazione della via del complesso maggiore di istocompatibilit? I o Major Histocompatibility Complex (MHC) I attraverso la presentazione intracellulare dell?antigene, con conseguente innalzamento dell?immunit? cellulo-mediata. In aggiunta, gli acidi nucleici impiegati con funzione di vaccino associano alle potenzialit? terapeutiche anti-tumorali il vantaggio della sintesi della proteina immunogenica direttamente nell?organismo ospite, consentendo di fornire alla cellula le informazioni genetiche necessarie per la produzione in vivo di antigeni complessi, altrimenti difficili da isolare o sintetizzare in vitro, e garantendo allo stesso tempo la produzione di proteine caratterizzate dalla medesima conformazione.
Tra gli antigeni associati all?ADP nell?uomo, l?antigene sialilato del gruppo sanguigno Lewis CA19.9 viene attualmente considerato il marcatore sierologico di maggior rilievo diagnostico e prognostico, malgrado le numerose evidenze della sua ridotta specificit?.
Allo scopo di identificare marcatori pi? affidabili di ADP, negli ultimi anni sono stati eseguiti studi sul sangue e sui tessuti di pazienti affetti da ADP con i quali, avvalendosi delle tecniche di analisi dell?espressione su larga scala di RNA o proteine, ? stato reso possibile il monitoraggio dei livelli di espressione di un vasto numero di proteine umane in rapporto all?insorgenza e alla progressione dell?ADP e al suo andamento prognostico.
Le ricerche descritte in Tomaino B, Cappello P, Capello M, et al. Circulating autoantibodies to phosphorylated ?-enolase are a hallmark of pancreatic cancer. J Proteome Res. 2011;10(1):105-112 sui profili siero-proteomici di un?ampia coorte di pazienti affetti da ADP e relativi controlli hanno rivelato un?associazione specifica tra questo tumore e l?aumento dei livelli pancreatici dell?enzima glicolitico alfa-enolasi (?ENO1? o ?ENOA?) e, in particolare, delle sue isoforme fosforilate sulla serina in posizione 419. In aggiunta, nel 62% dei sieri di pazienti sono stati riscontrati autoanticorpi circolanti rivolti verso gli epitopi fosforilati delle isoforme ENOA1-2, diversamente da quanto emerso nel gruppo dei controlli in cui la suddetta immunoreattivit? era presente soltanto nel 4% dei campioni. Ad ulteriore supporto della valenza clinica di questi risultati, gli autori hanno dimostrato che la risposta anticorpale verso le isoforme fosforilate dell?alfa-enolasi ? correlata nella maggior parte dei casi con una prognosi pi? favorevole della malattia e con un incremento significativo della stima di sopravvivenza. In due studi paralleli, inoltre, ? stata dimostrata la presenza di linfociti T in grado di riconoscere specificatamente la proteina ENO1 e di attivarsi. Tali cellule sono state isolate sia dal sangue dei pazienti affetti da ADP, dove peraltro correlano con la presenza di anticorpi circolanti contro ENO1 stessa [Tomaino B et al. J. Proteome Res. 2007, 6, 10, 4025?4031 Publication Date:September 8, 2007], sia dalle biopsie [Amedei A, Niccolai E, Benagiano M, et al. Ex vivo analysis of pancreatic cancerinfiltrating T lymphocytes reveals that ENO-specific Tregs accumulate in tumor tissue and inhibit Th1/Th17 effector cell functions. Cancer Immunol Immunother. 2013;62(7):1249-1260].
La specifica associazione dell?antigene alfaenolasi con l?ADP rende questa proteina un candidato ideale per lo sviluppo di un marcatore prognostico per questa neoplasia. Nella domanda di brevetto italiano n. TO2009000697 ? descritto l?impiego dell?isoforma fosforilata dell?alfaenolasi umana come biomarcatore per la diagnosi dell?ADP, insieme a peptidi da essa derivati e contenenti il sito di fosforilazione e ad anticorpi capaci di legare specificamente l?epitopo fosforilato.
In aggiunta all?applicazione immunodiagnostica, sono anche state condotte ricerche per impiegare l?antigene ENO1 nell?ambito terapeutico, pi? specificamente immunoterapeutico, allo scopo di sviluppare approcci che, in alternativa o in combinazione con le strategie convenzionali, consentano un?azione efficace nei confronti delle cellule pancreatiche tumorali, rallentando in tal modo la progressione della patologia neoplastica.
La domanda di brevetto italiano TO2009000697 suggerisce l?impiego terapeutico di anticorpi rivolti verso un epitopo fosforilato dell?alfaenolasi ma non fornisce alcun supporto sperimentale al riguardo.
La domanda di brevetto italiano TO2010A000966 descrive un vaccino a DNA per il trattamento terapeutico o profilattico dell?ADP, che comprende un vettore di espressione contenente una sequenza nucleotidica ricombinante codificante l?intera proteina alfa-enolasi. Un vaccino a DNA basato su una sequenza nucleotidica codificante per l?intera alfa-enolasi (ENO1) umana ? descritto anche in Cappello P, Rolla S, Chiarle R, et al. Vaccination with ENO1 DNA prolongs survival of genetically engineered mice with pancreatic cancer. Gastroenterology. 2013;144(5):1098-1106. In questo lavoro gli autori hanno dimostrato che 3 o 4 immunizzazioni di topi che sviluppano spontaneamente ADP con il vettore esprimente la proteina intera ENO1 sono sufficienti a prolungare l?aspettativa di vita degli animali di quasi il 30%.
Descrizione dell?invenzione
Poich? la sequenza della proteina ENO1 ? molto lunga, gli inventori hanno ipotizzato che essa contenga regioni amminoacidiche non immunogeniche che riducono l?entit? e la selettivit? della risposta immunitaria.
Onde superare questi ed altri inconvenienti della tecnica nota, gli inventori hanno identificato delle regioni della proteina ENO1 che sono immunogeniche e che pertanto si prestano ad essere utilizzate in un vaccino a base di acido nucleico. La presente invenzione mette quindi a disposizione un vettore di espressione ricombinante comprendente almeno una sequenza nucleotidica ricombinante codificante per un peptide della proteina ENO1 umana, detta almeno una sequenza nucleotidica ricombinante essendo operativamente collegata ad una sequenza promotore e ad eventuali ulteriori elementi regolatori della trascrizione, caratterizzato dal fatto che il peptide della proteina ENO1 umana ? un peptide immunogenico scelto dal gruppo che consiste di SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 e qualsiasi loro combinazione.
In una forma di realizzazione preferita, il peptide immunogenico di ENO1 umana ? SEQ ID NO:15, costituito dalla fusione di tutte le sequenze SEQ ID NOs:1, 2, 4, 5, 8 e 9.
In un?altra forma di realizzazione preferita, il peptide immunogenico di ENO1 umana ? SEQ ID NO:16, costituito dalla fusione delle sequenze SEQ ID NO:1 e SEQ ID NO:2.
In un?ulteriore forma di realizzazione preferita, il peptide immunogenico di ENO1 umana ? SEQ ID NO:17, costituito dalla fusione delle sequenze SEQ ID NO:4 e SEQ ID NO:5.
In ancora un?altra forma di realizzazione preferita, il peptide immunogenico di ENO1 umana ? SEQ ID NO:18, costituito dalla fusione delle sequenze SEQ ID NO:8 e SEQ ID NO:9.
Ulteriori forme di realizzazione preferite del vettore di espressione ricombinante dell?invenzione formano oggetto delle restanti rivendicazioni dipendenti e indipendenti, il cui contenuto ? parte integrante della presente descrizione.
Nell?ambito della presente descrizione il termine ?peptide immunogenico? indica una sequenza aminoacidica capace di evocare una risposta immunitaria nell?organismo bersaglio.
Il vettore di espressione ricombinante secondo l?invenzione ? quindi capace di suscitare una risposta immunitaria contro cellule di ADP, per cui si presta ad essere utilizzato sia per scopi profilattici sia per scopi terapeutici.
La protezione conferita dal vettore di espressione ricombinante dell?invenzione si realizza mediante l?inoculo di una sequenza nucleotidica codificante per uno o pi? dei peptidi maggiormente immunogenici della proteina ENO1 nelle cellule di un organismo bersaglio, ove essa viene tradotta in uno o pi? peptidi altamente immunoreattivi e quindi in grado di attivare il sistema immunitario dell?ospite.
Come verr? illustrato in maggior dettaglio nella parte sperimentale che segue, un notevole vantaggio del presente approccio immunoterapeutico ? l?induzione di una risposta immunitaria completa ed integrata, che consta di una componente umorale, associata ad un sensibile incremento del livello sierico delle immunoglobuline IgG specifiche anti-ENO1, e allo stesso tempo di una componente cellulo-mediata, rappresentata dall?attivazione di linfociti T ENO1-specifici.
Pertanto, nell?ambito dell?invenzione rientra anche l?uso del vettore di espressione ricombinante dell?invenzione nel trattamento profilattico o terapeutico dell?ADP in un soggetto, quale ad esempio un essere umano.
In una forma di realizzazione preferita, il vettore di espressione ricombinante dell?invenzione comprende una sequenza promotore ed eventuali ulteriori sequenze di regolazione della trascrizione, come ad esempio una sequenza segnale di poliadenilazione. Ad esempio, il vettore pu? essere un plasmide batterico in cui la sequenza nucleotidica codificante ricombinante ? sotto il controllo di un promotore virale forte. Le tecniche di preparazione di vettori contenenti i suddetti elementi regolatori ed eventuali ulteriori elementi, quali uno o pi? siti di clonaggio, una o pi? sequenze enhancer, una sequenza codificante un peptide segnale, uno o pi? geni marcatori come ad esempio geni di resistenza ad antibiotici, e/o uno o pi? introni sintetici, rientrano nelle conoscenze e nelle capacit? del tecnico medio del settore.
In una forma di realizzazione preferita, il vettore di espressione ricombinante ? incapace di replicarsi in una cellula di mammifero. Allo scopo di sopprimere la capacit? replicativa nelle cellule bersaglio, possono essere adottati vari accorgimenti, tra cui si citano a titolo esemplificativo e non limitativo l?impiego di vettori contenenti una o pi? origini di replicazione procariotiche.
Gli inventori hanno dimostrato che il plasmide pVAX1 ? particolarmente adatto come vettore. Il plasmide pVAX1 contiene un?origine di replicazione pUC, un promotore virale preso dal Citomegalovirus (CMV) e le sequenze di restrizione per gli enzimi NotI e XbaI. Tuttavia, possono essere impiegati altri vettori di per s? noti come idonei all?uso in vaccini a DNA o RNA, che possono essere facilmente selezionati dal tecnico medio del settore. Si citano a titolo esemplificativo, ma non limitativo, il vettore plasmidico pVAC, oppure vettori virali quali ad esempio vettori basati su adenovirus o su virus adeno-associati.
L?incapacit? del vettore ricombinante di replicarsi nelle cellule dell?ospite e quindi di integrarsi nel loro genoma, conferisce al vaccino un profilo di elevata sicurezza.
Preferibilmente, il vettore di espressione ricombinante dell?invenzione ? fornito sotto forma di una composizione farmaceutica comprendente, oltre al vettore di espressione ricombinante dell?invenzione, eccipienti, veicoli e/o diluenti farmaceuticamente accettabili.
Inoltre, la composizione farmaceutica comprende opzionalmente uno o pi? adiuvanti atti a potenziare l?efficacia della risposta immunitaria evocata dal vettore ricombinante sui sistemi effettori, anticorpale e cellulare.
Gli adiuvanti sono una famiglia eterogenea di composti che differiscono per la loro struttura chimica e per il loro meccanismo d?azione, e tra questi si annoverano sostanze minerali, emulsioni oleose e derivati batterici. Fra le sostanze idonee all?impiego come adiuvanti nella composizione farmaceutica dell?invenzione si citano a titolo esemplificativo gli agonisti dei recettori di tipo Toll quali le sequenze CpG e il composto Imiquimod, la proteina High-mobility group protein B1 (HMGB1) mediatore dell?infiammazione, gli agonisti sintetici dei linfociti iNKT, gli agonisti dei linfociti T gd.
Opzionali componenti aggiuntivi della composizione farmaceutica dell?invenzione sono, ad esempio, sostanze con funzioni stabilizzanti e/o conservanti.
In una forma di realizzazione preferita, la composizione farmaceutica dell?invenzione ? in una formulazione idonea alla somministrazione per via orale, nasale, intradermica, sottocutanea o intramuscolare.
Il DNA della composizione farmaceutica dell?invenzione pu? trovarsi sotto forma di sospensione in un mezzo appropriato, come ad esempio un tampone salino, quindi in una forma particolarmente adatta alla somministrazione per via parenterale. In alternativa, le molecole di DNA della composizione farmaceutica dell?invenzione possono essere veicolate nel tessuto bersaglio incapsulate dai liposomi oppure adsorbite su microparticelle costituite da polilattatopoliglicolato (PLG), un polimero biodegradabile e biocompatibile atto a prevenire la degradazione del DNA del vaccino.
Recentemente, allo scopo di incrementare l?immunogenicit? dei vaccini a DNA, sono state implementate strategie diverse che, se associate alle modalit? tradizionali di somministrazione dei vaccini, consentono l?assorbimento di un numero significativamente superiore di molecole di DNA vaccinale. A titolo esemplificativo, si cita la tecnologia dell?elettroporazione, che viene applicata sulle cellule del tessuto bersaglio nel punto di inoculo del vaccino, in genere in seguito ad iniezione intramuscolare o intradermica, determinando l?apertura delle membrane cellulari e facilitando l?ingresso delle molecole di DNA. Nel caso di somministrazioni vaccinali per via intradermica, sono stati raggiunti risultati ragguardevoli impiegando particolari apparecchi detti ?spara-geni? (gene-guns) che consentono di immettere ad alta pressione attraverso la cute le molecole di DNA adese a microsfere d'oro.
La composizione farmaceutica dell?invenzione pu? essere somministrata in dose unica oppure con dosi ripetute a predeterminati intervalli temporali.
La selezione della tipologia di formulazione del vaccino, della modalit? di somministrazione e del dosaggio pi? adeguati per ottenere una elevata efficacia protettiva rientra nelle capacit? del tecnico medio del settore. Anche la scelta del veicolo e degli eventuali eccipienti farmaceutici rientra nelle capacit? del tecnico medio del settore.
Infine, il vettore di espressione ricombinante dell?invenzione ? idoneo ad essere somministrato come terapia combinata con un secondo principio attivo di per s? noto come efficace nel trattamento terapeutico dell?ADP, quale un agente chemioterapico e/o un agente immunomodulatore.
Pertanto, un ulteriore aspetto dell?invenzione ? una preparazione combinata comprendente un vettore di espressione ricombinante dell?invenzione ed almeno un agente chemioterapico e/o almeno un agente immunomodulatore, per l?uso simultaneo, separato o sequenziale nel trattamento profilattico o terapeutico dell?adenocarcinoma pancreatico duttale in un soggetto. Immunomodulatori di per s? noti, adatti all?impiego in terapia combinata con il vettore ricombinante della presente invenzione sono, a titolo esemplificativo e non limitativo, gli inibitori di citochine soppressive quali anticorpi o molecole Sh RNA contro l?interleuchina 10, i farmaci inibitori dell?attivit? soppressoria dei linfociti T reg, ad esempio la ciclofosfamide e gli anticorpi anti-IL-2Ra (CD25), le molecole di costimolazione come la molecola di fusione B7-IgG, gli inibitori delle cellule MSDC tra cui gli inibitori specifici dell?enzima fosfodiesterasi-5 come i composti Sildenafil, Tadalafil, e Vardenafil, gli anticorpi monoclonali anti- CTLA4. Breve descrizione delle figure
La Figura 1 mostra i risultati delle analisi in silico effettuate con i programmi bioinformatici NetMHC-4.0 e NetMHCII-2.3 come descritto nell?Esempio 1. Tali risultati sono rappresentati graficamente come heatmaps. Le heatmaps riportano i valori di predizione come %-Rank. I quadrati blu scuro indicano una forte affinit? di legame tra peptide e allele HLA, mentre i quadrati bianchi indicano una nulla o quasi affinit? di legame. Ad ogni colonna corrisponde uno dei 14 peptidi di ENO1 e ad ogni riga corrisponde un allele HLA-A (pannello A), HLA-B (pannello B) e HLA-DRB1 (pannello C). I pannelli A e B rappresentano la mappa di predizione per i loci HLA-A e HLA-B ottenuta con NetMHC-4.0 ponendo la soglia a 1%-Rank. Il pannello C rappresenta la mappa di predizione ottenuta da NetMHCII-2.3 ponendo la soglia a 2%-Rank.
La Figura 2 mostra tre grafici a torta che rappresentano le percentuali delle frequenze geniche dei loci HLA-A, HLA-B e HLA-DRB1 presenti nella coorte di donatori analizzati rispetto alla totalit? delle frequenze geniche presenti nella popolazione italiana (Amoroso, A.; Ferrero, N.M.; Rendine, S. Le Caratteristiche HLA Della Popolazione Italiana: Analisi Di 370.000 Volontari Iscritti All?IBMDR. Analysis 2010, 1?2, 23?102).
La Figura 3 mostra i risultati degli esperimenti condotti su una coorte di donatori sani relativi alla risposta proliferativa indotta da ENO1 intera ricombinante (rENO1) e dai 14 peptidi di ENO1 della Tabella 1. Il pannello A descrive la capacit? proliferativa, indicata come indice di stimolazione (SI), dei linfociti T della coorte di donatori stimolati con i 14 peptidi di ENO1 e rENO1. Ogni cerchio blu rappresenta un donatore e la linea orizzontale di ciascuna colonna rappresenta la media. Il pannello B riporta per ciascun donatore la tipizzazione e l?SI, evidenziato in azzurro quando ? 2. Il pannello C mostra il ?tono immunologico?, espresso come il rapporto tra la produzione di IFN-? e quella di IL-10. I valori maggiori di 1 indicano un fenotipo effettore, spostato verso la produzione di IFN- ?, mentre i valori minori di 1 indicano un fenotipo soppressorio, spostato verso la produzione di IL-10. La significativit? statistica ? mostrata in ciascun grafico.
La Figura 4 riguarda gli esperimenti di validazione dei peptidi immunogenici di ENO1 in una coorte di pazienti con ADP. Il pannello A mostra la proliferazione, misurata come SI, dei linfociti T stimolati con i 6 peptidi immunogenici di ENO1 e rENO1. Ogni cerchio blu rappresenta un paziente e la linea orizzontale di ciascuna colonna rappresenta la media. Il pannello B riporta per ciascun paziente la tipizzazione, l?SI e il valore del rapporto IFN- ?/IL-10 indice del tono immunologico. La risposta effettrice (IFN-?/IL-10 > 1) ? stata evidenziata con una gradazione di colore rosso, mentre la risposta soppressoria (IFN-?/IL-10 < 1) ? stata evidenziata con una gradazione di colore blu. Nei linfociti T dei pazienti stimolati con i peptidi selezionati si osserva una prevalente risposta effettrice, al contrario di quelli stimolati con rENO1 in cui ? prevalente la risposta soppressoria. La significativit? statistica ? mostrata in ciascun grafico.
La Figura 5, pannello A, riporta la sequenza dei 6 peptidi immunogenici di ENO1 espressi come proteina di fusione secondo una forma di realizzazione dell?invenzione, pi? le due sequenze di restrizione (sottolineate). Il pannello B mostra la mappa del vettore ottenuto pVAX3PEP.
La parte sperimentale che segue ? fornita a scopo illustrativo e non limitativo della portata dell?invenzione come definita nelle annesse rivendicazioni.
Parte sperimentale
Materiali e metodi
Preparazione del campione biologico
Le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono state ottenute da volontari iscritti al registro dei Donatori di Sangue presso la Banca del Sangue e Immunoematologia della Citt? della Salute e della Scienza di Torino e da pazienti con ADP appartenenti allo studio ENOAPA, approvato dal comitato etico dell?Azienda Ospedaliera Citt? della Salute e della Scienza di Torino.
I PBMC sono stati isolati dal sangue venoso mediante frazionamento del sangue intero per centrifugazione in gradiente di densit? utilizzando il terreno HiSep (Himedia Cell Culture, Einhausen, Germania). I PBMC isolati sono stati congelati in terreno RPMI (EuroClone spa, Milano, Italia) e dimetilsolfossido (DMSO, Sigma-Aldrich, Milano, Italia) al 10% e conservati in azoto liquido.
Tipizzazione HLA
Tutti i donatori sani e i pazienti con ADP sono stati tipizzati per gli alleli HLA di classe I (loci A e B) e di classe II (DRB1). La tipizzazione HLA ? stata eseguita su DNA genomico estratto da campioni di sangue intero utilizzando la tecnologia Luminex ad alta risoluzione.
Predizione in silico degli epitopi
Il metodo NetMHC-4.0 (DTU Health Tech, Lyngby, Danimarca) identifica gli epitopi di 9 aminoacidi in grado di legare con maggiore affinit? i supertipi di HLA di classe I. Il metodo NetMHCII-2.3 (DTU Health Tech) identifica gli epitopi di 15 aminoacidi in grado di legare con maggiore affinit? l?allele HLA-DRB1. I valori di predizione sono stati forniti come %-Rank rispetto a un gruppo di 1.000.000 di peptidi naturali casuali. La soglia utilizzata per definire un peptide molto affine ? 1%-Rank per l?analisi NetMHC-4.0 e 2%-Rank per l?analisi NetMHCII-2.3.
Libreria dei peptidi di ENO1
I peptidi sono stati sintetizzati da PEPperPRINT GmbH (Heidelberg, Germania). Tutti i peptidi presentano un grado di purezza maggiore del 95% come indicato dall?analisi di cromatografia liquida ad alta prestazione. I peptidi liofilizzati sono stati diluiti in acqua per biologia molecolare alla concentrazione finale di 1 mg/ml. Le aliquote sono state conservate a -20?C. La libreria ? composta da 14 peptidi di 50 amminoacidi ciascuno, tranne l?ultimo di 44 amminoacidi, con una sovrapposizione consecutiva di 20 amminoacidi, coprendo cos? l?intera sequenza amminoacidica di ENO1, a partire dall?estremit? N-terminale della proteina verso quella C-terminale (Tabella 1).
Tabella 1. Sequenze amminoacidiche della libreria dei peptidi di ENO1 utilizzata nello studio
SEQ ID SEQ AA SEQUENZA
Saggi in vitro su PBMC
I PBMC dei donatori sono stati seminati ad una densit? di 5x10<6 >per pozzetto in terreno senza siero TexMACS (Miltenyi Biotec, Bologna, Italia) in piastre da 6 pozzetti e stimolati con l?intera sequenza di rENO1 alla concentrazione di 10 ?g/ml (Sigma-Aldrich). Dopo 3 giorni di coltura, ? stata aggiunta IL-2 ricombinante umana (rIL-2, Peprotech, Hamburg, Germania) alla concentrazione di 10 U/ml. Dopo una settimana, ai linfociti T stimolati ed espansi in presenza di rENO1 sono stati aggiunti, come cellule presentanti l?antigene, i PBMC autologhi irradiati (3000 rad) in rapporto 1:1, precedentemente caricati con ciascuno dei 14 peptidi di ENO1 riportati in Tabella 1.
I PBMC di pazienti con ADP sono stati seminati a una concentrazione di 0,1x10<6 >per pozzetto in terreno senza siero TexMACS (Miltenyi Biotec) in piastra da 96 pozzetti e stimolati 10 ?g/ml dei singoli i peptidi (1,2,4,5,8, 9) o rENO1. Dopo 3 giorni di coltura, ? stata aggiunta rIL-2 (Peprotech) alla concentrazione di 10 U/ml.
La proliferazione e la produzione delle citochine IFN-? e IL-10 da parte dei linfociti T dei donatori e dei pazienti ? stata valutata dopo 5 giorni dalla stimolazione. La proliferazione ? stata misurata mediante incorporazione di bromodeossiuridina (BrdU) come fluorescenza risolta nel tempo (TRF) (PerkinElmer, Milano, Italia). L?indice di stimolazione della proliferazione dei linfociti T ? stato calcolato con la seguente formula: TRF dei PBMC coltivati in presenza dei peptidi o rENO1/TRF dei PBMC coltivati in presenza di solo terreno in assenza di stimolo. Si considera come valore positivo un indice di stimolazione superiore a 2. La produzione di IFN-? e IL-10 ? stata misurata mediante test ELISA (BioLegend, Campoverde, Milano, Italia), seguendo il protocollo fornito dal produttore. Il rapporto tra la concentrazione di IFN- ? e IL-10 ? definito tono immunologico ? ? stato utilizzato per valutare le risposte dei donatori e dei pazienti verso il singolo peptide o la proteina intera come effettrici o soppressorie. ? noto, infatti, che una prevalente produzione di IFN-? determini una risposta immunitaria anti-tumorale definita ?effettrice?, mentre una prevalente produzione di IL-10 determina una inibizione della risposta antitumorale definita ?soppressoria?.
Analisi statistica
L?analisi statistica dei dati ottenuti ? stata eseguita utilizzando il programma GraphPad (versione 8, San Diego, CA) mediante il test ANOVA paragonando l?indice proliferativo e il tono immunologico in seguito a stimolazione con i singoli peptidi rispetto alla proteina intera di ENO1. I gruppi statisticamente significativi sono mostrati nei rispettivi grafici.
Risultati
Predizione in silico degli epitopi maggiormente riconosciuti dai linfociti T di donatori sani nell?intera sequenza di ENO1.
Al fine di individuare gli epitopi di ENO1 che legano con maggiore affinit? le molecole HLA di classe I e classe II, sono stati utilizzati rispettivamente due programmi bioinformatici NetMHC-4.0 e NetMHCII-2.3. Come noto, la predizione della specificit? di legame di alleli HLA di classe II ? meno accurata rispetto a quella di classe I a causa della maggiore variabilit? sia nella lunghezza che nella composizione della sequenza amminoacidica legata, 9 amminoacidi per gli alleli HLA di classe I e 15 amminoacidi per gli alleli HLA di classe II. Come illustrato nella figura 1, i peptidi 1, 2, 4, 5, 8, 9 sono tra quelli predetti dal programma capaci di legare la maggior parte degli alleli HLA-A e HLA-B (rispettivamente pannello A e B). La stessa analisi, considerando l?allele DRB1 di classe II, nella presentazione mette in evidenza i medesimi peptidi come potenzialmente legati dalla maggior parte degli alleli (Figura 1C).
Valutazione dell?indice proliferativo e della risposta citochinica di linfociti T in una coorte di donatori sani rappresentativi della popolazione italiana.
Saggi immunologici in vitro sono quindi stati impiegati per validare la predizione in silico e completare l?identificazione degli epitopi maggiormente immunogenici. ? stata selezionata una coorte di 17 donatori sani (Tabella 2) rappresentativi dei pi? frequenti alleli HLA della popolazione italiana. Infatti, come si evince dal grafico in figura 2, basandosi sulla distribuzione delle frequenze geniche della popolazione italiana [7], gli aplotipi HLA dei donatori utilizzati per lo studio, coprono l?86,50% delle frequenze del locus A di HLA di classe I, circa il 90% delle frequenze del locus B di HLA di classe I e quasi la totalit? delle frequenze dell?HLA-DRB1.
Tabella 2. Tipizzazione per i loci HLA-A, HLA-B e HLA-DRB1 di ciascun donatore della coorte utilizzata nello studio
I linfociti T dei 17 donatori, espansi in presenza di rENO1 per una settimana, sono stati stimolati con i PBMC autologhi irradiati come cellule presentanti l?antigene e caricati con i 14 peptidi di ENO1 al fine di valutarne la capacit? proliferativa.
In generale, la risposta proliferativa verso rENO1 si verifica solo in 1 donatore su 17 (6%) mentre, come illustrato in figura 3A-B, i peptidi 1 e 2 attivano la proliferazione (SI ? 2) dei linfociti T nel 79% dei donatori e i peptidi 8 e 9 attivano la proliferazione nell?82% dei donatori. Malgrado l?elevata risposta proliferativa nei confronti dei peptidi 1, 2, 8 e 9, dalla predizione in silico ? emerso che il gene HLA-A2, espresso in oltre il 25% della popolazione caucasica, lega con pi? elevata affinit? i peptidi 4 e 5. Infatti, dal momento che 4 su 7 donatori HLA-A2 (57%) proliferano in risposta ai peptidi 4 e/o 5, anche questi peptidi sono stati selezionati.
Al fine di valutare il tono immunologico della risposta (effettrice o soppressoria) alla stimolazione con i singoli peptidi rispetto a rENO1, ? stato misurato il rapporto tra la produzione di IFN-? e quella di IL-10 (Figura 3C). In generale, la risposta indotta dalla stimolazione con rENO1 ? prevalentemente soppressoria rispetto a quella effettrice osservata nei linfociti T stimolati da tutti i singoli peptidi di ENO1. Inoltre, i peptidi selezionati in base alla risposta proliferativa mostrano anche una risposta effettrice significativamente maggiore rispetto a rENO1 (Figura 3C).
Validazione dei peptidi immunogenici di ENO1 in una coorte di pazienti con ADP.
I peptidi di ENO1 selezionati (1, 2, 4, 5, 8 e 9) dai precedenti saggi in vitro sono stati utilizzati per stimolare i PBMC di pazienti con ADP al fine di saggiarne l?indice proliferativo ed il tono immunologico della risposta.
Come illustrato in figura 4A-B, la risposta proliferativa a rENO1 (SI > 2) si osserva in 7 pazienti su 13 (53,8%), confermando gli studi precedenti sull?espressione di ENO1 nei pazienti con ADP [5], mentre stimolando con i peptidi selezionati si osserva una risposta proliferativa con SI > 2 in 11 pazienti (84,6%). Analizzando il rapporto IFN- ?/IL-10, si evince che il tono immunologico della risposta verso i singoli peptidi ? completamente orientata verso una risposta effettrice caratterizzata da un?elevata produzione di IFN- ? rispetto a quella soppressoria che si osserva stimolando con rENO1 (Figura 4B-C).
La Tabella 3 riporta per ciascun paziente la tipizzazione per i loci HLA-A, HLA-B e HLA-DRB1, SI e il tono immunologico. In giallo sono evidenziati i casi in cui, in seguito alla stimolazione con i peptidi selezionati, si ha un miglioramento della risposta anti-tumorale, sia in termini di proliferazione che di tono immunologico rispetto ad rENO1. In seguito a stimolazione con rENO1, solo 1 paziente su 13 (7,7%) presenta una risposta effettrice ed un SI > 2, mentre, in seguito a stimolazione con i peptidi di ENO1 si osserva una risposta effettrice ed un SI > 2 in tutti pazienti (100%) (Tabella 3).
Tabella 3. Risposta proliferativa e tono immunologico in pazi stimolati con i peptidi selezionati o rENO1
I risultati in Tabella 3 indicano che le porzioni di ENO1 maggiormente immunogeniche corrispondono ai peptidi 1, 2, 4, 5, 8 e 9. Questa invenzione si propone di utilizzare le 6 sequenze identificate in un vettore a DNA che presenta le 6 sequenze continuative e precedute da un?unica sequenza iniziale Kozak in modo da non creare nuovi epitopi (Figura 5A). Il costrutto presenta un sito di origine di replicazione (pUC), un sito di antibiotico resistenza per selezionare i soli batteri che hanno integrato correttamente la sequenza, un promotore CMV che permette la replicazione e i due siti di restrizione per gli enzimi NotI e XbaI per permettere l?inserzione del cDNA. La mappa del vettore con tali caratteristiche, gi? approvato per l?utilizzo clinico, ? riportata in Figura 5B.
Claims (18)
1. Vettore di espressione ricombinante comprendente almeno una sequenza nucleotidica ricombinante codificante per un peptide immunogenico dell?alfa-enolasi umana, detta almeno una sequenza nucleotidica ricombinante essendo operativamente collegata ad una sequenza promotore e opzionalmente a ulteriori elementi regolatori della trascrizione,
caratterizzato dal fatto che il peptide immunogenico dell?alfa-enolasi umana ? scelto dal gruppo che consiste di SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 e qualsiasi loro combinazione.
2. Vettore di espressione ricombinante secondo la rivendicazione 1, in cui il peptide immunogenico ? scelto dal gruppo che consiste di SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18.
3. Vettore di espressione ricombinante secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detta almeno una sequenza nucleotidica ricombinante comprende un segnale di poliadenilazione.
4. Vettore di espressione ricombinante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 3, che ? incapace di replicarsi in una cellula di mammifero.
5. Vettore di espressione ricombinante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 4, che ? un vettore plasmidico.
6. Composizione farmaceutica comprendente un vettore di espressione ricombinante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5, in combinazione con almeno un veicolo, eccipiente, diluente, stabilizzante, e/o conservante farmaceuticamente accettabile/i.
7. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 6, in cui il vettore di espressione ricombinante ? adsorbito su micro-particelle di polilattato-poliglicolato (PLG).
8. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 6 o 7, comprendente un adiuvante preferibilmente scelto dal gruppo che consiste di agonisti dei recettori di tipo Toll, proteina Highmobility group protein B1 (HMGB1), agonisti sintetici dei linfociti iNKT, agonisti dei linfociti T gd.
9. Composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 6 a 8, che ? in una forma idonea alla somministrazione orale, nasale, sottocutanea, intradermica o intramuscolare.
10. Vettore di espressione ricombinante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5 o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 6 a 9, per l?uso nel trattamento profilattico o terapeutico dell?adenocarcinoma duttale pancreatico in un soggetto.
11. Vettore di espressione ricombinante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5 o composizione farmaceutica secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 6 a 9, per l?uso nello stimolare una risposta immunitaria contro l?antigene alfa-enolasi in un soggetto.
12. Vettore di espressione ricombinante o composizione farmaceutica per l?uso secondo la rivendicazione 10 o 11, in cui il soggetto ? affetto da adenocarcinoma pancreatico duttale.
13. Vettore di espressione ricombinante o composizione farmaceutica per l?uso secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 10 a 12, in cui il soggetto ? un essere umano.
14. Acido nucleico isolato codificante per un peptide immunogenico dell?alfa-enolasi umana scelto dal gruppo che consiste di SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 e qualsiasi loro combinazione.
15. Acido nucleico isolato secondo la rivendicazione 14, in cui il peptide immunogenico dell?alfa-enolasi umana ? scelto dal gruppo che consiste di SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18.
16. Peptide immunogenico isolato dell?alfa-enolasi umana scelto dal gruppo che consiste di SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 e qualsiasi loro combinazione.
17. Peptide immunogenico isolato dell?alfa-enolasi umana scelto dal gruppo che consiste di SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17 e SEQ ID NO:18.
18. Preparazione combinata comprendente un vettore di espressione ricombinante secondo una qualsiasi delle rivendicazioni 1 a 5 ed almeno un agente chemioterapeutico e/o almeno un agente immunomodulatore, per l?uso simultaneo, separato o sequenziale nel trattamento profilattico o terapeutico dell?adenocarcinoma duttale pancreatico in un soggetto.
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