CN112739375A - 靶向共同抗原的抗原结合蛋白 - Google Patents

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Abstract

本文提供了HLA‑肽靶标和结合HLA‑肽靶标的抗原结合蛋白。还公开了用于鉴定HLA‑肽靶标以及鉴定一种或多种结合给定的HLA‑肽靶标的抗原结合蛋白的方法。

Description

靶向共同抗原的抗原结合蛋白
交叉引用
本申请要求于2018年8月17日提交的美国临时申请第62/719,565号、于2019年2月21日提交的美国临时申请第62/808,775号和2019年7月2日提交的美国临时申请第62/869,923号的权益，所述申请据此通过引用整体并入。
相关申请
本申请涉及2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997以及2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793，所述申请通过引用整体并入。
序列表
[插入]
背景技术
免疫系统采用两种类型的适应性免疫应答来提供针对病原体的抗原特异性保护，即体液免疫应答和细胞免疫应答，它们分别通过B淋巴细胞和T淋巴细胞对病原体抗原进行特异性识别。
由于T淋巴细胞是细胞免疫的抗原特异性效应子，因此T淋巴细胞在身体防御细胞内病原体(如病毒、细胞内细菌、支原体和细胞内寄生虫)介导的疾病以及通过直接细胞溶解所述受累细胞而抵御癌细胞方面起着核心作用。T淋巴细胞应答的特异性由T细胞受体(TCR)与受累细胞表面上的(主要组织相容性复合物)MHC分子的结合来赋予并通过其而被激活。T细胞受体是克隆分布在个体T淋巴细胞上的抗原特异性受体，其抗原特异性库是经由体细胞基因重排机制产生的，类似于涉及产生抗体基因库的机制。T细胞受体包括跨膜分子的异二聚体，其主要类型由α-β多肽二聚体和较小子集的γ-δ多肽二聚体构成。T淋巴细胞受体亚基包含在胞外结构域中类似于免疫球蛋白的可变区和恒定区、具有促进α和β链配对的半胱氨酸的短铰链区、跨膜区以及短胞质区。TCR触发的信号转导是通过CD3-ζ间接介导的，CD3-ζ是包含信号转导亚基的相关多亚基复合物。
T淋巴细胞受体通常不识别天然抗原，而是识别细胞表面展示的复合物，包括与用于呈现肽抗原的主要组织相容性复合物(MHC)缔合的细胞内加工的抗原片段。主要组织相容性复合物基因在物种种群中具有高多态性，包括每一个体基因的多个共同的等位基因。在人中，MHC被称为人白细胞抗原(HLA)。
主要组织相容性复合物I类分子在体内几乎所有成核细胞的表面表达，并且是包含跨膜重链(包含肽抗原结合沟)和较小的称为β2-微球蛋白的胞外链的二聚体分子。MHC I类分子呈现的肽衍生自蛋白酶体降解胞质蛋白，蛋白酶体是细胞质中的多亚基结构(Niedermann G.,2002.Curr Top MicrobiolImmunol.268:91-136；关于细菌抗原的加工，参考Wick M J和Ljunggren HG.,1999.Immunol Rev.172:153-62)。裂解的肽通过与抗原加工相关的转运蛋白(TAP)转运到内质网(ER)的内腔，在这里所述肽与组装的I类分子的沟结合，然后将所得MHC/肽复合物转运到细胞膜，使抗原能够呈递给T淋巴细胞(Yewdell J W.,2001.Trends Cell Biol.11:294-7；Yewdell J W和Bennink J R.,2001.Curr OpinImmunol.13:13-8)。替代地，裂解的肽可以以TAP非依赖的方式负载到MHC I类分子上，并且还可以通过交叉呈递的方法呈递细胞外来源的蛋白。这样，一旦确定了复合物的结构(肽序列和MHC亚型)的身份，给定的MHC/肽复合物则在细胞表面呈现出可以被新型抗原结合蛋白(例如，抗体或TCR)所靶向的新型蛋白质结构。
肿瘤细胞可以表达抗原，并且可在肿瘤细胞的表面展示此类抗原。此类肿瘤相关抗原可用于开发新型免疫治疗试剂，以特异性靶向肿瘤细胞。例如，肿瘤相关抗原可用于鉴定治疗性抗原结合蛋白，例如，TCR、抗体或抗原结合片段。此类肿瘤相关抗原也可以用于药物组合物，例如，疫苗。
发明内容
本文提供了分离的抗原结合蛋白(ABP)，其与人白细胞抗原(HLA)-肽靶标特异性结合，其中所述HLA-肽靶标包含与HLA I类分子复合的HLA-限制性肽，其中所述HLA-限制性肽位于所述HLA I类分子的α1/α2异二聚体部分的肽结合沟中，其中：所述HLA I类分子为HLA亚型B*35:01(参考序列：MGSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRTEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQIFKTNTQTYRESLRNLRGYYNQSEAGSHIIQRMYGCDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLR)，并且所述HLA-限制性肽包含序列EVDPIGHVY，并且其中所述ABP与以下中的任一个或多个结合：(a)限制性肽EVDPIGHVY的氨基酸位置2-9中的任一个或多个；(b)HLA亚型B*35:01的α1螺旋的氨基酸位置50、54、55、57、61、62、74、81、82和85中的任一个或多个；和(c)HLA亚型B*35:01的α2螺旋的氨基酸位置147和148中的任一个或多个。注意，列举的范围包括末端残基。例如，结合限制性肽EVDPIGHVY的位置2-9中的任一个或多个的ABP接触限制性肽EVDPIGHVY的残基2、3、4、5、6、7、8和9中的至少一个。
在一些实施方案中，所述ABP与限制性肽EVDPIGHVY的氨基酸位置2-8中的任一个或多个结合。
在一些实施方案中，所述ABP与限制性肽EVDPIGHVY的氨基酸位置5-9中的任一个或多个结合。
在一些实施方案中，HLA I类分子是HLA亚型B*35:01，并且HLA-限制性肽由序列EVDPIGHVY组成。
在一些实施方案中，所述ABP包含CDR-H3，所述CDR-H3包含选自以下的序列：CARDGVRYYGMDVW、CARGVRGYDRSAGYW、CASHDYGDYGEYFQHW、CARVSWYCSSTSCGVNWFDPW、CAKVNWNDGPYFDYW、CATPTNSGYYGPYYYYGMDVW、CARDVMDVW、CAREGYGMDVW、CARDNGVGVDYW、CARGIADSGSYYGNGRDYYYGMDVW、CARGDYYFDYW、CARDGTRYYGMDVW、CARDVVANFDYW、CARGHSSGWYYYYGMDVW、CAKDLGSYGGYYW、CARSWFGGFNYHYYGMDVW、CARELPIGYGMDVW和CARGGSYYYYGMDVW。
在一些实施方案中，所述ABP包含CDR-L3，所述CDR-L3包含选自以下的序列：CMQGLQTPITF、CMQALQTPPTF、CQQAISFPLTF、CQQANSFPLTF、CQQANSFPLTF、CQQSYSIPLTF、CQQTYMMPYTF、CQQSYITPWTF、CQQSYITPYTF、CQQYYTTPYTF、CQQSYSTPLTF、CMQALQTPLTF、CQQYGSWPRTF、CQQSYSTPVTF、CMQALQTPYTF、CQQANSFPFTF、CMQALQTPLTF和CQQSYSTPLTF。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的CDR-H3和CDR-L3，所述scFv被命名为G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07或G5R4-P4B01。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的所有3个重链CDR和所有3个轻链CDR，所述scFv被命名为G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07或G5R4-P4B01。
在一些实施方案中，ABP包含VH序列，所述VH序列选自：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGIINPRSGSTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGVRYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSHDINWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGDTGYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGVRGYDRSAGYWGQGTLVIVSS、EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSSYWMSWVRQAPGKGLEWISYISGDSGYTNYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCASHDYGDYGEYFQHWGQGTLVTVSS、EVQLLQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSDMNWVRQAPGKGLEWVAYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSWYCSSTSCGVNWFDPWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSDMNWVRQAPGKGLEWVASISSSGGYINYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVNWNDGPYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNFGVSWLRQAPGQGLEWMGGIIPILGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPTNSGYYGPYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDVMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSGYLVSWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNTAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFRNYPMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDNGVGVDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNIGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGIADSGSYYGNGRDYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYGISWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGVTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGDTKYSQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGTRYYGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSYTNYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDVVANFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWMNPDSGSTGYAQRFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGHSSGWYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMHWVRQAPGKGLEWVSSITSFTNTMYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLGSYGGYYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSWFGGFNYHYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARELPIGYGMDVWGQGTTVTVSS和QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIVGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS。
在一些实施方案中，ABP包含VL，所述VL选自：DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLQTPITFGQGTRLEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSSRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPPTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAISFPLTFGQSTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYMMPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYITPWTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYITPYTFGQGTKLEIK、DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKTSQSVLYRPNNENYLAWYQQKPGQPPKLLIYQASIREPGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRFLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRPQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSHRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK、EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYAASARASGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYGSWPRTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPVTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDISNHLNWYQQKPGKAPKLLIYDALSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGQGTKVEIK和DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的VH序列和VL序列，所述scFv被命名为G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07和G5R4-P4B01。
本文还提供了特异性结合人白细胞抗原(HLA)-肽靶标的分离的抗原结合蛋白(ABP)，其中所述HLA-肽靶标包括与HLA I类分子复合的HLA-限制性肽，其中所述HLA-限制性肽位于HLA I类分子的α1/α2异二聚体部分的肽结合沟中，所述HLA I类分子为HLA亚型A*01:01(参考序列：MGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQKMEPRAPWIEQEGPEYWDQETRNMKAHSQTDRANLGTLRGYYNQSEDGSHTIQIMYGCDVGPDGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAVHAAEQRRVYLEGRCVDGLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLR)，并且所述HLA-限制性肽包含序列NTDNNLAVY，并且其中所述ABP与以下中的任一个或多个结合：(a)限制性肽NTDNNLAVY的残基3-9中的任一个或多个，(b)HLA亚型等位基因A*01:01的α1螺旋的残基70-85中的任一个或多个，以及(c)HLA亚型等位基因A*01:01的α2螺旋的残基140-160中的任一个或多个。
在一些实施方案中，所述ABP与限制性肽NTDNNLAVY的残基6-9中的任一个或多个结合。
在一些实施方案中，所述ABP与限制性肽NTDNNLAVY的残基7-8中的任一个或多个结合。
在一些实施方案中，所述ABP与HLA亚型等位基因A*01:01的α2螺旋的残基157-160中的任一个或多个结合。
在一些实施方案中，所述ABP与限制性肽NTDNNLAVY的残基6-9中的任一个或多个以及HLA亚型等位基因A*01:01的α2螺旋的残基157-160中的任一个或多个结合。
在一些实施方案中，所述HLA I类分子是HLA亚型A*01:01，并且HLA-限制性肽由序列NTDNNLAVY组成。
在一些实施方案中，所述ABP包含CDR-H3，所述CDR-H3包含选自以下的序列：CAATEWLGVW、CARANWLDYW、CARANWLDYW、CARDWVLDYW、CARGEWLDYW、CARGWELGYW、CARDFVGYDDW、CARDYGDLDYW、CARGSYGMDVW、CARDGYSGLDVW、CARDSGVGMDVW、CARDGVAVASDYW、CARGVNVDDFDYW、CARGDYTGNWYFDLW、CARANWLDYW、CARDQFYGGNSGGHDYW、CAREEDYW、CARGDWFDPW、CARGDWFDPW、CARGEWFDPW、CARSDWFDPW、CARDSGSYFDYW、CARDYGGYVDYW、CAREGPAALDVW、CARERRSGMDVW、CARVLQEGMDVW、CASERELPFDIW、CAKGGGGYGMDVW、CAAMGIAVAGGMDVW、CARNWNLDYW、CATYDDGMDVW、CARGGGGALDYW、CALSGNYYGMDVW、CARGNPWELRLDYW和CARDKNYYGMDVW。
在一些实施方案中，所述ABP包含CDR-L3，所述CDR-L3包含选自以下的序列：CQQSYNTPYTF、CQQSYSTPYTF、CQQSYSTPYSF、CQQSYSTPFTF、CQQSYGVPYTF、CQQSYSAPYTF、CQQSYSAPYTF、CQQSYSAPYSF、CQQSYSTPYTF、CQQSYSVPYSF、CQQSYSAPYTF、CQQSYSVPYSF、CQQSYSTPQTF、CQQLDSYPFTF、CQQSYSSPYTF、CQQSYSTPLTF、CQQSYSTPYSF、CQQSYSTPYTF、CQQSYSTPYTF、CQQSYSTPFTF、CQQSYSTPTF、CQQTYAIPLTF、CQQSYSTPYTF、CQQSYIAPFTF、CQQSYSIPLTF、CQQSYSNPTF、CQQSYSTPYSF、CQQSYSDQWTF、CQQSYLPPYSF、CQQSYSSPYTF、CQQSYTTPWTF、CQQSYLPPYSF、CQEGITYTF、CQQYYSYPFTF和CQHYGYSPVTF。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的CDR-H3和CDR-L3，所述scFv被命名为G2-P1H11、G2-P2E07、G2-P2E03、G2-P2A11、G2-P2C06、G2-P1G01、G2-P1C02、G2-P1H01、G2-P1B12、G2-P1B06、G2-P2H10、G2-P1H10、G2-P2C11、G2-P1C09、G2-P1A10、G2-P1B10、G2-P1D07、G2-P1E05、G2-P1D03、G2-P1G12、G2-P2H11、G2-P1C03、G2-P1G07、G2-P1F12、G2-P1G03、G2-P2B08、G2-P2A10、G2-P2D04、G2-P1C06、G2-P2A09、G2-P1B08、G2-P1E03、G2-P2A03、G2-P2F01或G2-P1D06。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自命名为G2-P1H11的scFv的CDR-H3和CDR-L3。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的所有3个重链CDR和所有3个轻链CDR，所述scFv被命名为G2-P1H11、G2-P2E07、G2-P2E03、G2-P2A11、G2-P2C06、G2-P1G01、G2-P1C02、G2-P1H01、G2-P1B12、G2-P1B06、G2-P2H10、G2-P1H10、G2-P2C11、G2-P1C09、G2-P1A10、G2-P1B10、G2-P1D07、G2-P1E05、G2-P1D03、G2-P1G12、G2-P2H11、G2-P1C03、G2-P1G07、G2-P1F12、G2-P1G03、G2-P2B08、G2-P2A10、G2-P2D04、G2-P1C06、G2-P2A09、G2-P1B08、G2-P1E03、G2-P2A03、G2-P2F01或G2-P1D06。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自命名为G2-P1H11的scFv的所有3个重链CDR和所有3个轻链CDR。
在一些实施方案中，所述ABP包含VH序列，所述VH序列选自：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGMINPSGGGTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGNPWELRLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSATISWVRQAPGQGLEWMGWIYPNSGGTVYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAATEWLGVWGQGTTVTVSS、EVQLLQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTISAPNFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARANWLDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYDLAWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARANWLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYSFDSYVVNWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDWVLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGEWLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGWELGYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTINWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDFVGYDDWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGITWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDYGDLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSNYILSWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTRYNMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSGLDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWINPNNGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDSGVGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFNNYAFSWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGVAVASDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSSYNMHWVRQAPGQGLEWMGWINGNTGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVNVDDFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAFSWVRQAPGQGLEWMGWINPDTGYTRYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYTGNWYFDLWGRGTLVTVSS、EVQLLESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARANWLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGYTNYAQNLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDQFYGGNSGGHDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARE-EDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTINWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGANYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYLMHWVRQAPGQGLEWMGWISPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSDYYVHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGEWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSDWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSNYAINWVRQAPGQGLEWMGWISPYSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDSGSYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIYPNTGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDYGGYVDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGPAALDVWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSHLIHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARERRSGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYIVHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVLQEGMDVWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNFLINWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASERELPFDIWGQGTMVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYQMFWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGGGGYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAAMGIAVAGGMDVWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYHMHWVRQAPGQGLEWMGWIHPDSGGTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARNWNLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCATYDDGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTVNWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTKYAQNFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGGALDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGMINPRDDTTDYARDFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCALSGNYYGMDVWGQGTTVTVSS和QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSQYMHWVRQAPGQGLEWMGRIIPLLGIVNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDKNYYGMDVWGQGTTVTVSS。
在一些实施方案中，所述ABP包含VL序列，所述VL序列选自：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTVQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYGVPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVGNWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIGNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSVPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISKWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSVPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIGRAVGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLDSYPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSSPYTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYSFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFAQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYAIPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYIAPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGVSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSNPTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWVAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSDQWTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYLPPYSFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTYFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSSPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPWTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYLPPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQEGITYTFGQGTKVEIK和EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSRNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQHYGYSPVTFGQGTKLEIK。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的VH序列和VL序列，所述scFv被命名为G2-P1H11、G2-P2E07、G2-P2E03、G2-P2A11、G2-P2C06、G2-P1G01、G2-P1C02、G2-P1H01、G2-P1B12、G2-P1B06、G2-P2H10、G2-P1H10、G2-P2C11、G2-P1C09、G2-P1A10、G2-P1B10、G2-P1D07、G2-P1E05、G2-P1D03、G2-P1G12、G2-P2H11、G2-P1C03、G2-P1G07、G2-P1F12、G2-P1G03、G2-P2B08、G2-P2A10、G2-P2D04、G2-P1C06、G2-P2A09、G2-P1B08、G2-P1E03、G2-P2A03、G2-P2F01或G2-P1D06。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自命名为G2-P1H11的scFv的VH序列和VL序列。
本文还提供了特异性结合人白细胞抗原(HLA)-肽靶标的分离的抗原结合蛋白(ABP)，其中所述HLA-肽靶标包括与HLA I类分子复合的HLA-限制性肽，其中所述HLA-限制性肽位于HLA I类分子的α1/α2异二聚体部分的肽结合沟中，其中所述HLA I类分子为HLA亚型A*02:01(参考序列：MGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLR)，所述HLA-限制性肽包含序列AIFPGAVPAA，并且其中所述ABP与以下中的任一个或多个结合：(a)限制性肽AIFPGAVPAA的氨基酸位置1-6中的任一个或多个，(b)HLA亚型A*02:01的α1螺旋的氨基酸位置46、49、55、61、74、76、77、78、81和84中的任一个或多个，(c)HLA亚型A*02:01的α1螺旋的氨基酸位置45-60、66、67和73中的任一个或多个，(d)HLA亚型A*02:01的α2螺旋的氨基酸位置138、145、147、152-156、164、167中的任一个或多个，以及(e)HLA亚型A*02:01的氨基酸位置56、59、60、63、64、66、67、70、73、74、132、150-153、155、156、158-160、162-164、166-168、170和171中的任一个或多个。
在一些实施方案中，所述ABP与限制性肽AIFPGAVPAA的氨基酸位置1-5中的任一个或多个结合。
在一些实施方案中，所述ABP与限制性肽AIFPGAVPAA的氨基酸位置4和5之一或两者结合。
在一些实施方案中，所述ABP与限制性肽AIFPGAVPAA的氨基酸位置5和6中之一或两者结合。
在一些实施方案中，所述ABP与限制性肽AIFPGAVPAA的氨基酸位置6结合。
在一些实施方案中，所述ABP与HLA亚型A*02:01的α1螺旋的氨基酸位置46、49、55、66、67和73中的任一个或多个结合。
在一些实施方案中，所述ABP包含含有互补位的VH区，所述互补位包含如根据Kabat编号系统编号的序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTLSSYPINWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGHADYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYDYGDYLNFDYWGQGTLVTVSS所示的VH区的残基Tyr32、Gly99、Asp100和Tyr100A的至少一个、两个、三个或四个残基。
在一些实施方案中，所述ABP包含含有互补位的VH区，互补位包含如根据Kabat编号系统编号的序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTLSSYPINWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGHADYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYDYGDYLNFDYWGQGTLVTVSS所示的VH区的残基Thr28、Leu 29、Ser30、Ser 31、Tyr 32、Pro 33、Trp 47、Trp 50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、His 56、Asp 58、Tyr 59、Gln 61、Gln 64、Asp 97、Tyr 98、Gly 99、Asp100、Tyr100A、Leu100B和Asn100C中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个残基。
在一些实施方案中，所述互补位包含如根据Kabat编号系统编号的VH区的残基Ser30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 98、Gly 99、Asp 100和Tyr 100A中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个残基。
在一些实施方案中，所述ABP包含含有互补位的VL区，所述互补位包含如根据Kabat编号系统编号的序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPPTFGGGTKVDIK所示的VL区的残基Tyr32、Ser 91和Tyr 92中的至少一个、两个或三个残基。
在一些实施方案中，所述ABP包含含有互补位的VL区，所述互补位包含如根据Kabat编号系统编号的序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPPTFGGGTKVDIK所示的VL区的残基Asp1、Ser30、Asn31、Tyr32、Tyr49、Ala50、Ser53、Ser67、Ser91、Tyr92、Ser93、Ile94和Pro95中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个残基。
在一些实施方案中，所述互补位包含如根据Kabat编号系统编号的VL区的残基Asp1、Asn31、Tyr32、Ser91、Tyr92和Ile94中的至少1个、2个、3个、4个、5个或6个残基。
在一些实施方案中，HLA I类分子是HLA亚型A*02:01，并且HLA-限制性肽由序列AIFPGAVPAA组成。
在一些实施方案中，所述ABP包含CDR-H3，所述CDR-H3包含选自以下的序列：CARDDYGDYVAYFQHW、CARDLSYYYGMDVW、CARVYDFWSVLSGFDIW、CARVEQGYDIYYYYYMDVW、CARSYDYGDYLNFDYW、CARASGSGYYYYYGMDVW、CAASTWIQPFDYW、CASNGNYYGSGSYYNYW、CARAVYYDFWSGPFDYW、CAKGGIYYGSGSYPSW、CARGLYYMDVW、CARGLYGDYFLYYGMDVW、CARGLLGFGEFLTYGMDVW、CARDRDSSWTYYYYGMDVW、CARGLYGDYFLYYGMDVW、CARGDYYDSSGYYFPVYFDYW和CAKDPFWSGHYYYYGMDVW。
在一些实施方案中，所述ABP包含CDR-L3，所述CDR-L3包含选自以下的序列：CQQNYNSVTF、CQQSYNTPWTF、CGQSYSTPPTF、CQQSYSAPYTF、CQQSYSIPPTF、CQQSYSAPYTF、CQQHNSYPPTF、CQQYSTYPITI、CQQANSFPWTF、CQQSHSTPQTF、CQQSYSTPLTF、CQQSYSTPLTF、CQQTYSTPWTF、CQQYGSSPYTF、CQQSHSTPLTF、CQQANGFPLTF和CQQSYSTPLTF。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的CDR-H3和CDR-L3，所述scFv被命名为G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01或G8-P2C11。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的所有3个重链CDR和所有3个轻链CDR，所述scFv被命名为G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01或G8-P2C11。
在一些实施方案中，所述ABP包含VH序列，所述VH序列选自：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSRSAITWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGATNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDDYGDYVAYFQHWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFIGQYLHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGDSATYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDLSYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPIGGGTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVYDFWSVLSGFDIWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVEQGYDIYYYYYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTLSSYPINWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGHADYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYDYGDYLNFDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSSISGRGDNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARASGSGYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYFMHWVRQAPGQGLEWMGMVNPSGGSETFAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAASTWIQPFDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASNGNYYGSGSYYNYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTTYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAVYYDFWSGPFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGGIYYGSGSYPSWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYGVSWVRQAPGQGLEWMGWISPYSGNTDYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNMYLHWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGDTNYAQTFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYGDYFLYYGMDVWGQGTKVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLLGFGEFLTYGMDVWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSTTYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDRDSSWTYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSNYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYGDYFLYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSHAISWVRQAPGQGLEWMGVIIPSGGTSYTQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYDSSGYYFPVYFDYWGQGTLVTVSS和QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDPFWSGHYYYYGMDVWGQGTTVTVSS。
在一些实施方案中，所述ABP包含VL序列，所述VL序列选自：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSITSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNYNSVTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCWASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTPWTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAISNSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSYSTPPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPPTFGGGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNSYPPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPITIGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPWTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHSTPQTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSTPWTFGQGTKLEIK、EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGNSLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYGSSPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISGYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHSTPLTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYTYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANGFPLTFGGGTKVEIK和DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的VH序列和VL序列，所述scFv被命名为G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01或G8-P2C11。
本文还提供了分离的抗原结合蛋白(ABP)，其特异性结合人白细胞抗原(HLA)-肽靶标，其中所述HLA-肽靶标包括与HLA I类分子复合的HLA-限制性肽，其中所述HLA-限制性肽位于HLA I类分子的α1/α2异二聚体部分的肽结合沟中，其中所述HLA I类分子是HLA亚型A*01:01(参考序列:MGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQKMEPRAPWIEQEGPEYWDQETRNMKAHSQTDRANLGTLRGYYNQSEDGSHTIQIMYGCDVGPDGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAVHAAEQRRVYLEGRCVDGLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLR)，并且所述HLA-限制性肽包含序列ASSLPTTMNY，并且其中所述ABP与以下中的任一个或多个结合：(a)所述限制性肽ASSLPTTMNY的氨基酸位置4、6、7、8和9中的任一个或多个，(b)HLA亚型A*01:01的氨基酸位置49-56中的任一个或多个，(c)HLA亚型A*01:01的氨基酸位置59-66中的任一个或多个，(d)HLA亚型A*01:01的氨基酸位置136-147中的任一个或多个，以及(e)HLA亚型A*01:01的氨基酸位置157-160中的任一个或多个。
在一些实施方案中，所述ABP与限制性肽ASSLPTTMNY的氨基酸位置6-9中的任一个或多个结合。
在一些实施方案中，所述ABP与限制性肽ASSLPTTMNY中的氨基酸位置6-7中的任一个或多个结合。
在一些实施方案中，所述ABP与限制性肽ASSLPTTMNY中的氨基酸位置6结合。
在一些实施方案中，所述ABP与以下结合：(a)HLA亚型A*01:01的氨基酸位置52-54中的任一个或多个，(b)HLA亚型A*01:01的氨基酸位置136-139中的任一个或多个，(c)HLA亚型A*01:01的氨基酸位置141-147中的任一个或多个，或(d)HLA亚型A*01:01的氨基酸位置136-139中的任一个或多个以及氨基酸位置141-147中的任一个或多个。
在包含抗体或其抗原结合片段的ABP的一些实施方案中，所述HLA I类分子是HLA亚型A*01:01，并且所述HLA-限制性肽由序列ASSLPTTMNY组成。
在一些实施方案中，所述ABP包含CDR-H3，所述CDR-H3包含选自以下的序列：CARDQDTIFGVVITWFDPW、CARDKVYGDGFDPW、CAREDDSMDVW、CARDSSGLDPW、CARGVGNLDYW、CARDAHQYYDFWSGYYSGTYYYGMDVW、CAREQWPSYWYFDLW、CARDRGYSYGYFDYW、CARGSGDPNYYYYYGLDVW、CARDTGDHFDYW、CARAENGMDVW、CARDPGGYMDVW、CARDGDAFDIW、CARDMGDAFDIW、CAREEDGMDVW、CARDTGDHFDYW、CARGEYSSGFFFVGWFDLW和CARETGDDAFDIW。
在一些实施方案中，所述ABP包含CDR-L3，所述CDR-L3包含选自以下的序列：CQQYFTTPYTF、CQQAEAFPYTF、CQQSYSTPITF、CQQSYIIPYTF、CHQTYSTPLTF、CQQAYSFPWTF、CQQGYSTPLTF、CQQANSFPRTF、CQQANSLPYTF、CQQSYSTPFTF、CQQSYSTPFTF、CQQSYGVPTF、CQQSYSTPLTF、CQQSYSTPLTF、CQQYYSYPWTF、CQQSYSTPFTF、CMQTLKTPLSF和CQQSYSTPLTF。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的CDR-H3和CDR-L3，所述scFv被命名为R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08或R3G10-P5C08。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的所有3个重链CDR和所有3个轻链CDR，所述scFv被命名为R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08或R3G10-P5C08。
在一些实施方案中，所述ABP包含VH序列，所述VH序列选自：EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGISARSGRTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDQDTIFGVVITWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIHPGGGTTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDKVYGDGFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDDSMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFIGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDSSGLDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVGNLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGVTFSTSAISWVRQAPGQGLEWMGWISPYNGNTDYAQMLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDAHQYYDFWSGYYSGTYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSNSIINWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREQWPSYWYFDLWGRGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSTHDINWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSAIYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDRGYSYGYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGNTFIGYYVHWVRQAPGQGLEWVGIINPNGGSISYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSGDPNYYYYYGLDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLSYYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTGTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGDHFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIGPSDGSTTYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAENGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYVHWVRQAPGQGLEWMGIIAPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGGYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYLHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGDAFDIWGQGTMVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGRISPSDGSTTYAPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDMGDAFDIWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEDGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLSYYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTGTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGDHFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNNFAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDATNYAQKFQGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGEYSSGFFFVGWFDLWGRGTQVTVSS和QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYNFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIAPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARETGDDAFDIWGQGTMVTVSS。
在一些实施方案中，所述ABP包含VL序列，所述VL序列选自：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYFTTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIFDASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAEAFPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPITFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYIIPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQTYSTPLTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYSFPWTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYSTPLTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISRYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPRTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSLPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASKLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYGVPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPWTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQTLKTPLSFGGGTKVEIK和DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的VH序列和VL序列，所述scFv被命名为R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06,R3G10-P5A08或R3G10-P5C08。
本文还提供了分离的抗原结合蛋白(ABP)，其特异性结合人白细胞抗原(HLA)-肽靶标，其中所述HLA-肽靶标包括与HLA I类分子复合的HLA-限制性肽，其中所述HLA-限制性肽位于HLA I类分子的α1/α2异二聚体部分的肽结合沟中，并且其中所述HLA I类分子是HLA亚型A*02:01(参考序列：MGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLR)，并且所述HLA-限制性肽包含序列LLASSILCA，并且其中所述ABP与以下中的任一个或多个结合：(a)所述限制性肽LLASSILCA的残基1-5中的任一个或多个，(b)所述HLA-A*02:01α1螺旋的残基49-85中的任一个或多个，以及(c)所述HLA-A*02:01α1螺旋的残基57-67中的任一个或多个。
在包含抗体或其抗原结合片段的ABP的一些实施方案中，所述HLA I类分子是HLA亚型A*02:01，并且所述HLA-限制性肽由序列LLASSILCA组成。
在一些实施例中，所述ABP包含CDR-H3，所述CDR-H3包含选自以下的序列：CARDGYDFWSGYTSDDYW,CASDYGDYR、CARDLMTTVVTPGDYGMDVW、CARQDGGAFAFDIW、CARELGYYYGMDVW、CARALIFGVPLLPYGMDVW、CAKDLATVGEPYYYYGMDVW和CARLWFGELHYYYYYGMDVW。
在一些实施方案中，所述ABP包含CDR-L3，所述CDR-L3包含选自以下的序列：CHHYGRSHTF、CQQANAFPPTF、CQQYYSIPLTF、CQQSYSTPPTF、CQQSYSFPYTF、CMQALQTPLTF、CQQGNTFPLTF和CMQGSHWPPSF。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的CDR-H3和CDR-L3，所述scFv被命名为G7R3-P1C6、G7R3-P1G10、1-G7R3-P1B4、2-G7R4-P2C2、3-G7R4-P1A3、4-G7R4-B5-P2E9、5-G7R4-B10-P1F8或B7(G7R3-P3A9)。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的所有三个重链CDR和所有三个轻链CDR，所述scFv被命名为G7R3-P1C6、G7R3-P1G10、1-G7R3-P1B4、2-G7R4-P2C2、3-G7R4-P1A3、4-G7R4-B5-P2E9、5-G7R4-B10-P1F8或B7(G7R3-P3A9)。
在一些实施方案中，所述ABP包含选自以下的VH序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSNYGISWVRQAPGQGLEWMGIINPGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYDFWSGYTSDDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASDYGDYRGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNYYIHWVRQAPGQGLEWMGWLNPNSGNTGYAQRFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDLMTTVVTPGDYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASMKVSCKASGYTFTTDGISWVRQAPGQGLEWMGRIYPHSGYTEYAKKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARQDGGAFAFDIWGQGTMVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSQYMHWVRQAPGQGLEWMGWISPNNGDTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARELGYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASRYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGRIIPMLNIANYAPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARALIFGVPLLPYGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSWMHWVRQAPGKGLEWVSFISTSSGYIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLATVGEPYYYYGMDVWGQGTTVTVSS和QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDTFNTYALSWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNAGYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLWFGELHYYYYYGMDVWGQGTMVTVSS。
在一些实施方案中，所述ABP包含选自以下的VL序列：EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCHHYGRSHTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANAFPPTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVFYSSNNKNQLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSIPLTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIFKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPYTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCSSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASNLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTFPLTFGQGTKVEIK和DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGSHWPPSFGQGTRLEIK。
在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的VH序列和VL序列，所述scFv被命名为G7R3-P1C6、G7R3-P1G10、1-G7R3-P1B4、2-G7R4-P2C2、3-G7R4-P1A3、4-G7R4-B5-P2E9、5-G7R4-B10-P1F8或B7(G7R3-P3A9)。
在一些实施方案中，所述ABP包含抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原结合蛋白连接至支架，任选地，所述支架包含血清白蛋白或Fc，任选地，其中Fc是人Fc且为IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM同种型Fc。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白通过接头连接至支架，任选地，所述接头是肽接头，任选地，所述肽接头是人抗体的铰链区。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白包括Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、scFv片段、scFv-Fc片段和/或单结构域抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含scFv片段。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含一个或多个抗体互补决定区(CDR)，任选地，六个抗体CDR。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白包括抗体。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白是单克隆抗体。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白是人源化的、人的或嵌合的抗体。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白是多特异性的，任选地是双特异性的。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白结合单一抗原上的多于一个抗原或多于一个表位。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的类别的重链恒定区。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含类别人IgG和选自IgG1、IgG4、IgG2和IgG3的亚类的重链恒定区。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含一个或多个延长半衰期的修饰。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含经修饰的Fc，任选地，所述经修饰的Fc包含延长半衰期的一个或多个突变，任选地，所述一个或多个延长半衰期的突变是YTE。
在所述分离的ABP的一些实施方案中，所述ABP包含T细胞受体(TCR)或其抗原结合部分。在一些实施方案中，所述TCR或其抗原结合部分包含TCR可变区。在一些实施方案中，所述TCR或其抗原结合部分包含一个或多个TCR互补决定区(CDR)。
在一些实施方案中，所述TCR包含α链和β链。在一些实施方案中，所述TCR包含γ链和δ链。
在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)的一部分，其包含：包含抗原结合蛋白的胞外部分；和胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述抗原结合蛋白包含scFv，而所述胞内信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸基激活基序(ITAM)。在一些实施方案中，所述胞内信号传导结构域包括CD3-ζ(CD3)链的ζ链的信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述ABP还包含连接胞外结构域和胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述跨膜结构域包含CD28的跨膜部分。
在一些实施方案中，所述ABP还包含T细胞共刺激分子的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述T细胞共刺激分子是CD28、4-1BB、OX-40、ICOS或其任意组合。
本文还提供了编码如本文所述的分离的ABP的分离的多核苷酸。
在ABP的一些实施方案中，所述抗原结合蛋白通过与HLA I类分子的接触点和通过与HLA-肽靶标的HLA-限制性肽的接触点来与HLA-肽靶标结合。在ABP的一些实施方案中，所述ABP与限制性肽或HLA亚型上的氨基酸位置的结合或直接或间接影响HLA-肽靶标与ABP结合的接触点或残基通过位置扫描、氢-氘交换或蛋白质晶体学来确定。
在一些实施方案中，所述ABP可用作药物。在一些实施方案中，所述ABP可用于治疗癌症，任选地，其中所述癌症表达或预计表达HLA-肽靶标。在一些实施方案中，所述ABP可用于治疗癌症，其中所述癌症选自实体瘤和血液肿瘤。
本文还提供了ABP，其是本文所描述的ABP的保守修饰的变体。本文还提供了竞争与本文所描述的抗原结合蛋白的结合的抗原结合蛋白(ABP)。本文还提供了结合由本文所描述的抗原结合蛋白结合的相同的HLA-肽表位的抗原结合蛋白(ABP)。
本文还提供了表达包含本文所描述的抗原结合蛋白的受体的工程改造的细胞。在一些实施方案中，所述工程改造的细胞是T细胞，任选地，细胞毒性T细胞(CTL)。在工程改造的细胞的一些实施方案中，所述抗原结合蛋白自异源启动子表达。
本文还提供了编码本文所述的抗原结合蛋白或其抗原结合部分的分离的多核苷酸或多核苷酸组。
本文还提供了编码本文所述的HLA/肽靶标的分离的多核苷酸或多核苷酸组。
本文还提供了包含本文所描述的多核苷酸或多核苷酸组的载体或载体组。
本文还提供了包含本文所描述的多核苷酸或多核苷酸组或本文所描述的载体或载体组的宿主细胞，任选地，其中所述宿主细胞是CHO或HEK293，或任选地，其中所述宿主细胞是T细胞。
本文还提供了产生抗原结合蛋白的方法，其包括：用如本文所描述的宿主细胞表达抗原结合蛋白和分离所表达的抗原结合蛋白。
本文还提供了包含本文所描述的抗原结合蛋白和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
本文还提供了治疗受试者的癌症的方法，其包括：向受试者施用有效量的本文所描述的抗原结合蛋白或本文所描述的药物组合物，任选地，其中所述癌症选自实体瘤和血液肿瘤。在一些实施方案中，所述癌症表达或预计表达HLA-肽靶标。
本文还提供了试剂盒，其包括本文所描述的抗原结合蛋白或本文所描述的药物组合物和使用说明。
本文还提供了包含至少一种本文所描述的HLA-肽靶标和佐剂的组合物。
本文还提供了包含本文所描述的至少一种HLA-肽靶标和药学上可接受的赋形剂的组合物。
本文还提供了包含如下氨基酸序列的组合物，所述氨基酸序列包括表A、表A1或表A2中所公开的至少一种HLA-肽靶标的多肽，任选地，所述氨基酸序列基本上由所述多肽组成或由所述多肽组成。
本文还提供了包含本文所描述的分离的多核苷酸或多核苷酸组的病毒。在一些实施方案中，所述病毒是丝状噬菌体。
本文还提供了包含本文所描述的分离的多核苷酸或多核苷酸组的酵母细胞。
附图说明
以下描述和附图有助于更好地理解本发明的这些和其它特征、方面和优点，其中：
图1显示了人白细胞抗原(HLA)I类分子的一般结构。用户atropos235通过en.wikipedia发布的个人作品，CC BY 2.5，https://commons.wikimedia.org/w/index.php？curid＝1805424
图2描绘了用于将TCR克隆到用于治疗开发的表达系统中的示例性构建体元件。
图3显示了HLA-肽靶标“G5”的靶标和微型集合阴性对照设计。
图4显示了HLA-肽靶标“G8”和“G10”的靶标和微型集合阴性对照设计。
图5A和图5B显示了G5反向筛选“微型集合”和G5靶标的HLA稳定性结果。
图6A-图6E显示了G5“完整”集合反向筛选肽的HLA稳定性结果。
图7A和图7B显示了反向筛选肽和G8靶标的HLA稳定性结果。
图8A和图8B显示了G10反向筛选“微型集合”和G10靶标的HLA稳定性结果。
图9A-图9D显示了附加的G8和G10“完整”集合反向筛选肽的HLA稳定性结果。
图10A-图10C显示了噬菌体上清液ELISA结果，表明G5-、G8和G10结合噬菌体随着连续淘选轮的进行而逐渐富集。
图11显示了描述抗体选择过程的流程图，包括scFv、Fab和IgG形式的标准和预期应用。
图12A、图12B和图12C描绘了Fab克隆G5-P7A05至HLA肽靶标B*35:01-EVDPIGHVY、Fab克隆R3G8-P2C10和G8-P1C11至HLA肽靶标A*02:01-AIFPGAVPAA和Fab克隆R3G10-P1B07至HLA肽靶标A*01:01-ASSLPTTMNY的生物层干涉测量(BLI)结果。
图13示出了位置扫描实验的一般实验设计。
图14A显示了G5位置变体-HLA的稳定性结果。
图14B显示Fab克隆G5-P7A05与G5位置变体-HLA的结合亲和力。
图15A显示了G8位置变体HLAs的稳定性结果。
图15B显示了Fab克隆G8-P2C10与G8位置变体HLA的结合亲和力。
图16A显示了G10位置变体-HLA的稳定性结果。
图16B显示了Fab克隆G10-P1B07与G10位置变体HLA的结合亲和力。
图17A、图17B和图17C显示了通过流式细胞术检测到的与G5-、G8-或G10-呈递K562细胞结合的抗体的代表性实例。
图18A-图18C显示了K562细胞与产生的靶标特异性抗体结合的直方图。
图19A-图19C显示了使用表达HLA亚型和选定的HLA-肽靶标的靶基因的肿瘤细胞系的细胞结合测定的直方图。
图20A和图20B显示了来自所测试的供体的靶标特异性T细胞的数量(A)和靶标特异性独特TCR克隆型的数量(B)。
图21A显示了scFv G8-P1H08的示例性热图，其使用综合扰动视图在HLA-肽靶标G8的整个HLA部分上可视化。图21B显示了来自绘制在晶体结构(1jf1.pdb，可在http://www.rcsb.org/structure/1JF1获得)上的scFvG8-P1H08的HDX数据的实例。
图22A显示了针对HLA-肽靶标G8(HLA-A*02:01_AIFPGAVPAA)所测试的所有ABP的HLAα1螺旋的热图。图22B显示了针对HLA-肽靶标G8(HLA-A*02:01_AIFPGAVPAA)所测试的所有ABP的HLAα2螺旋的热图。图22C显示了所有测试的ABP的限制性肽AIFPGAVPAA的所得热图。
图23A显示了scFv R3G10-P2G11的示例性热图，其使用综合扰动视图在HLA-肽靶标G10的整个HLA部分上可视化。
图23B显示了来自绘制在晶体结构PDB5bs0上的scFv R3G10-P2G11的HDX数据的实例。
图23C显示了来自绘制在晶体结构PDB5bs0上的scFv G10-P5A08的HDX数据的实例。
图24A显示了针对HLA-肽靶标G10(HLA-A*01:01_ASSLPTTMNY)测试的所有ABP的HLAα1螺旋的所得热图。图24B显示了针对HLA-肽靶G10(HLA-A*01:01_ASSLPTTMNY)测试的所有ABP的HLAα2螺旋的所得热图。图24C显示了所有测试的ABP的限制性肽ASSLPTTMNY的所得热图。
图25描绘了肽EVDPIGHVY的示例性谱数据。该图包含肽片段化信息以及与患者样品相关的信息，包括HLA类型。
图26描绘了肽AIFPGAVPAA的示例性谱数据。该图包含肽片段化信息以及与患者样品相关的信息，包括HLA类型。
图27描绘了肽ASSLPTTMNY的示例性谱数据。该图包含肽片段化信息以及与患者样品相关的信息，包括HLA类型。
图28A和图28B描绘了尺寸排阻色谱级分(A)和在还原条件下色谱级分的SDS-PAGE分析(B)。
图29描绘了包含Fab克隆G8-P1C11和HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)的复合物的示例性晶体的显微照片。
图30描绘了通过Fab克隆G8-P1C11与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)结合形成的复合物的整体结构。
图31描绘了与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11的晶体结构的精细电子密度区，所描绘的区域对应于限制性肽AIFPGAVPAA。
图32描绘了HLA与限制性肽之间相互作用的LigPlot。晶体结构对应于与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11。
图33描绘了Fab VH和VL链与限制性肽之间相互作用残基的图。晶体结构对应于与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11。
图34描绘了限制性肽链和Fab链之间相互作用的LigPlot。晶体结构对应于与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11。
图35描绘了Fab VH链与HLA之间相互作用的LigPlot。晶体结构对应于与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11。
图36描绘了Fab VL链与HLA之间的相互作用的LigPlot。晶体结构对应于与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11。
图37描绘了HLA与限制性肽之间相互作用的Pisa分析的界面概述。晶体结构对应于与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11。
图38描绘了HLA与限制性肽之间相互作用残基的Pisa分析。晶体结构对应于与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11。
图39描绘了Fab VH链和与限制性肽之间相互作用残基的Pisa分析。晶体结构对应于与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11。
图40描绘了Fab VL链与限制性肽之间相互作用残基的Pisa分析。晶体结构对应于与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11。
图41描绘了Fab VH链与HLA之间相互作用的Pisa分析的界面概述。晶体结构对应于与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11。
图42描绘了Fab VH链与HLA之间相互作用残基的Pisa分析。晶体结构对应于与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11。
图43描绘了Fab VL链与HLA之间相互作用的Pisa分析的界面概述。晶体结构对应于与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11。
图44描绘了Fab VL链与HLA之间相互作用残基的Pisa分析。晶体结构对应于与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11。
图45A描绘了当与scFv克隆G8-P1C11一起孵育时，G8 HLA-肽复合物的HLA部分的示例性热图，其使用综合扰动使其整体可视图化。
图45B描绘了来自绘制在与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11的晶体结构上的scFv G8-P1C11的HDX数据的实例。
图46描绘了Fab克隆G8-P1C11对G8位置变体HLA的结合亲和力。
图47显示了与G8-P1C11(针对HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)的靶标特异性抗体)结合的K562细胞的直方图。
图48描绘了用于将TCR克隆到用于治疗开发的表达系统中的示例性构建体骨架序列。
图49描绘了用于将对A*0201_LLASSILCA特异的TCR克隆到用于治疗开发的表达系统中的示例性构建体序列。
图50描绘了用于将对A*0101_EVDPIGHLY特异的TCR克隆到用于治疗开发的表达系统中的示例性构建体序列。
图51显示了肽EVDPIGHLY的光谱数据。该图包含肽片段化信息以及与患者样品相关的信息，包括HLA类型。
图52显示了肽GVHGGILNK的光谱数据。该图包含肽片段化信息以及与患者样品相关的信息，包括HLA类型。
图53显示了肽GVYDGEEHSV的光谱数据。
图54显示了肽NTDNNLAVY的光谱数据。
图55-63显示了表A中公开的其它肽的光谱数据
图64显示了G2靶标HLA-A*01:01_NTDNNLAVY的靶标筛选1的设计。
图65A显示了G2靶标的靶标和微型集合阴性对照设计。
图65B显示了G2反向筛选“微型集合”和G2靶标的稳定性ELISA结果。
图66显示了附加的G2“完整”集合反向筛选肽的稳定性ELISA结果。
图67显示了G7靶标HLA-A*02:01_LLASSILCA的靶标筛选2的设计。
图68显示了附加的G7“完整集合”反向筛选肽的稳定性ELISA结果。
图69A显示了G7靶标的靶标和微型集合阴性对照设计。
图69B显示了G7反向筛选“微型集合”和G7靶标的稳定性ELISA结果。
图70A和图70B分别显示了G2和G7靶标的噬菌体淘选结果。
图71A和71B分别显示G2靶标Fab克隆G-2P1H11和G7靶标G7R4-B5-P2E9的生物层干涉测量(BLI)结果。
图72显示了本文所述位置扫描实验的氨基酸取代图谱。
图73A显示了G2位置变体-HLA的稳定性热图。
图73B显示了Fab克隆G2-P1H11的亲和力热图。
图74A显示了G7位置变体的稳定性热图。
图74B显示了Fab克隆G7R4-B5-P2E9的亲和力热图。
图75显示了Fab克隆G2-P1H11和G7R4-B5-P2E9与用靶标或阴性对照肽冲击的HLA转导的K562细胞的细胞结合结果。
图76显示了Fab克隆G2-P1H11和G7R4-B5-P2E9与用靶标或阴性对照肽冲击的HLA转导的K562细胞的细胞结合结果。
图77显示了在晶体结构PDB 5bs0上绘制的氢-氘交换(HDX)数据的实例。
图78显示了scFv克隆G2-P1G07的示例性HDX热图，使用综合扰动视图将其整体可视化。
图79显示了所测试的G2 scFv和Fab克隆的跨HLAα1和α2螺旋的HDX热图。
图80显示了所测试的G2 scFv和Fab克隆的限制性肽NTDNNLAVY的HDX热图。
图81描绘了实验工作流程，通过该流程可以分离出特异性结合HLA-肽靶标的TCR。
图82显示了用于分选MHC靶特异性CD8+T细胞的流式细胞术分选程序。
图83显示了示例性HLA-肽靶标B*44:02_GEMSSNSTAL和A*01:01_EVDPIGHLY的流式细胞术结果。
图84显示了HLA-肽靶标A*03:01_GVHGGILNK的流式细胞术结果。
图85A显示了所有测试的供体中总计的每个HLA-肽靶标的分离的CD8+T细胞的总数。
图85B显示了所有测试的供体中总计的每个HLA-肽靶标的分离的CD8+T细胞的频率。
图86A描绘了对于每个测试的供体的每个HLA-肽靶标的独特TCR克隆型的数量。
图86B描绘了所有测试的供体中总计的每个HLA-肽靶标的独特的克隆型的总数。
图87显示了表达A*0201_LLASSILCA、A*0201_GVYDGEEHSV、B*4402_GEMSSNSTAL和A*0101_EVDPIGHLY-特异性TCR的Jurkat细胞的实例，所述TCR与它们各自的HLA-肽靶标结合，但不与对照肽四聚体结合。
图88显示了设门策略和流动数据，所述流动数据表明用本文鉴定的TCR转导的人CD8+细胞与其特异性的HLA-肽靶标结合。
图89显示了可用于用本文公开的TCR转导受体细胞的示例性慢病毒载体。
图90显示G2靶标Fab克隆G2-P2C06的BLI结果。
图91A描绘了来自G2位置变体HLA的第二实验的稳定性结果。
图91B描绘了Fab克隆G2-P2C06与G2位置变体HLA的结合亲和力。
图92显示了来自各种测试的G10 ABP的HLAα1螺旋、HLAα2螺旋和限制性肽ASSLPTTMNY内的第二轮HDX实验的HDX热图。
图93显示了来自测试的G2 ABP的HLAα1螺旋、HLAα2螺旋和限制性肽NTDNNLAVY内的第二轮HDX实验的HDX热图。
图94显示了来自绘制在晶体结构PDB 5bs0上的scFv G2-P2C11的HDX数据的实例。
图95显示了绘制在晶体结构PDB 5bs0上的高分辨率HDX数据。如实验程序中所述，通过电子转移解离(ETD)将肽片段化，获得了与四种不同scFv结合的G2的数据。具有高分辨率数据(在大致单个氨基酸分辨率下)和残基157-160的肽片段加圈表示。
图96显示了来自针对HLA-肽靶标G5(HLA-B*35:01_EVDPIGHVY)测试的所有ABP的HLAα1螺旋、HLAα2螺旋和限制性肽EVDPIGHVY内的HDX实验的彩色热图。
图97显示了图96的彩色热图的数字表示。
图98显示了来自绘制在HLA-B*35:01的晶体结构上的scFv克隆G5-P1C12的数据的实例(5xos.pdb；https://www.rcsb.org/structure/5XOS)。
图99显示了来自针对HLA-肽靶标G8(HLA-A*02:01_AIFPGAVPAA)测试的所有ABP的HLAα1螺旋、HLAα2螺旋和限制性肽AIFPGAVPAA内的第二轮HDX实验的彩色热图。
图100显示了图99的彩色热图的数字表示。
图101显示了来自绘制在与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11的晶体结构上的scFv G8-P1H08的高分辨率HDX数据的实例。
图102显示了流式细胞术实验的结果，其中用50μM的靶标肽EVDPIGHVY(“EVD”)或阴性对照肽IPSINVHHY(“IPS”)冲击HLA-B*35:01转导的K562细胞，并通过流式细胞术检测pHLA特异性抗体。
图103显示了流式细胞术实验的结果，其中用50μM的靶标肽AIFPGAVPAA(“AIF”)或阴性对照肽FLLTRILTI(“FLL”)冲击HLA-A*02:01转导的K562细胞，并通过流式细胞术检测pHLA特异性抗体。
图104显示了流式细胞术实验的结果，其中用50μM的靶标肽ASSLPTTMNY(“ASSL”)或阴性对照肽ATDALMTGY(“ATDA”)冲击HLA-A*01:01转导的K562细胞，并通过流式细胞术检测pHLA特异性抗体。
图105显示了G8靶标Fab克隆G8-P4F05、G8-P1B03和G8-P5G08与HLA-肽靶标A*02:01-AIFPGAVPAA的BLI结果；以及G5靶标Fab克隆G5-P1C12与HLA-肽靶标B*35:01-EVDPIGHVY的BLI结果。
具体实施方式
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其它科学术语旨在具有本领域技术人员通常理解的含义。在一些情况下，为了清楚和/或易于参考，本文定义了具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不一定理解为表示与本领域通常理解的含义有区别。本文描述的或参考的方法和过程是本领域技术人员通常容易理解的并通常使用常规方法论来应用的方法和程序，如，例如，Sambrook等人Molecular Cloning:ALaboratoryManual第4版(2012)Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpringHarbor,NY中描述的广泛使用的分子克隆方法。适当地，除非另有说明，否则通常根据制造商定义的协议和条件执行关于使用市售试剂盒和试剂的程序。
除非上下文另外明确指出，否则本文所使用的单数形式“一个/种(a)”、“一个/种(an)”以及“所述(the)”包括复数指示物。除非另外明确指出，术语“包括”、“如”等旨在传达包括但不限制的含义。
除非另外具体指出，否则本文所使用的术语“包含”还具体包括实施方案“由所列举的要素组成”和“基本上由所列举的要素组成”。例如，“包含双功能抗体”的多特异性ABP包括“由双功能抗体组成”的多特异性ABP和“基本上由双功能抗体组成”的多特异性ABP。
术语“约”指且涵盖指示值以及大于和小于所述值的范围。在某些实施方案中，术语“约”表示指定值±10％、±5％或±1％。在某些实施方案中，若适用，术语“约”表示指定值±所述值的一个标准偏差。
术语“免疫球蛋白”是指一类结构相关的蛋白，通常包含两对多肽链：一对轻链(L)和一对重链(H)链。在“完整的免疫球蛋白”中，所有这四个链均通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已被很好地表征。参见，例如，Paul,Fundamental Immunology第7版，第5章(2013)Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA.。简而言之，每个重链通常包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区通常包含三个结构域，缩写为CH1、CH2和CH3。每个轻链通常包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区。轻链恒定区通常包含一个结构域，缩写为CL。
本文使用的术语“抗原结合蛋白”或“ABP”以其最广义使用且包括某些类型的分子，所述分子包含与抗原或表位特异性结合的一个或多个抗原结合结构域。
在一些实施方案中，ABP包含抗体。在一些实施方案中，ABP由抗体组成。在一些实施方案中，ABP基本上由抗体组成。ABP具体包含完整的抗体(例如，完整的免疫球蛋白)、抗体片段、ABP片段和多特异性抗体。在一些实施方案中，ABP包含替代支架。在一些实施方案中，ABP由替代支架组成。在一些实施方案中，ABP基本上由替代支架组成。在一些实施方案中，ABP包含抗体片段。在一些实施方案中，ABP由抗体片段组成。在一些实施方案中，ABP基本上由抗体片段组成。在一些实施方案中，ABP包含TCR或其抗原结合部分。在一些实施方案中，ABP由TCR或其抗原结合部分组成。在一些实施方案中，ABP基本上由TCR或其抗原结合部分组成。在一些实施方案中，CAR包括ABP。如本文提供的，“HLA-肽ABP”、“抗-HLA-肽ABP”或“HLA-肽特异性ABP”是与抗原HLA-肽特异性结合的ABP。ABP包括含有一个或多个抗原结合结构域的蛋白，所述蛋白通过可变区，如源自B细胞(例如，抗体)或T细胞(例如，TCR)的可变区，与抗原或表位特异性结合。
本文的术语“抗体”以其最广义使用且包括多克隆抗体和单克隆抗体，包括完整的抗体和功能性(抗原结合的)抗体片段，这些片段包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段，能够特异性结合抗原的可变重链(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))和单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖基因工程和/或其它方式修饰的免疫球蛋白形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和缀合抗体、多特异性抗体((例如，双特异性抗体))、双抗体、三抗体和四抗体、串联双价scFv、串联三价scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类的抗体，包括IgG及其亚类，IgM、IgE、IgA和IgD。
本文使用的“可变区”是指由重组事件产生的可变核苷酸序列，例如，其可以包括来自B细胞或T细胞(如激活的T细胞或激活的B细胞)的免疫球蛋白或T细胞受体(TCR)序列的V、J和/或D区。
术语“抗原结合结构域”是指能够特异性结合抗原或表位的ABP的部分。抗原结合结构域的一个实例是由ABP的抗体VH-VL二聚体形成的抗原结合结构域。抗原结合结构域的另一个实例是通过使来自阿德耐汀(Adnectin)的第十个纤连蛋白III型结构域的某些环的多样化而形成的抗原结合结构域。抗原结合结构域可以依次包含来自重链的抗体CDR1、CDR2和CDR3；和依次包含来自轻链的抗体CDR1、CDR2和CDR3。抗原结合结构域可包含TCRCDR，例如，αCDR1、αCDR2、αCDR3、βCDR1、βCDR2和βCDR3。本文描述了TCR CDR。
抗体的VH区和VL区可进一步细分为高变性的区域(“高变区(HVR)；也称为”互补决定区”(CDR))，其间散布着更为保守的区域。更保守的区域称为框架区(FR)。每个VH和VL通常包含三个抗体CDR和四个FR，它们按以下顺序排列(从N末端到C末端)：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。抗体CDR参与抗原结合，并影响抗原特异性和ABP的结合亲和力。参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest第5版(1991)PublicHealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD，其通过引用整体并入。
根据脊椎类动物的恒定结构域的序列，来自任何脊椎类动物的轻链可分为两种类型，分别称为卡帕(κ)和兰姆达(λ)。
任何脊椎类动物的重链可归为以下五种不同类别(或同种型)之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些类别也分别称为α、δ、ε、γ和μ。根据序列和功能的差异，IgG和IgA类进一步分为亚类。人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
本领域技术人员可以使用许多已知的编号方案中的任一种方案来确定抗体CDR的氨基酸序列边界，已知的编号方案包括以下文献中所述的编号方案：Kabat等人，见上文(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人，1997,J.Mol.Biol.,273:927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人，1996,J.Mol.Biol.262:732-745(“Contact”编号方案)；Lefran等人，Dev.Comp.Immunol.,2003,27:55-77(“IMGT”编号方案)和Honegge和Plückthun,J.Mol.Biol.,2001,309:657-70(“AHo”编号方案)；其各自均通过引用整体并入。
表20提供了通过Kabat和Chothia方案鉴定的抗体CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的位置。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia编号方案均提供了残基编号。
例如，可使用ABP编号软件(如Abnum)来分配抗体CDR，Abnum可从www.bioinf.org.uk/abs/abnum/网站上获得，并在Abhinandan和Martin，Immunology,2008,45:3832-3839(其通过引用整体并入)中进行了描述。
Figure BDA0002980945400000461
*当使用Kabat编号惯例进行编号时，CDR-H1的C末端根据CDR的长度在H32和H34之间变化。
当提到ABP重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号方案”(例如，如Kabat等人所报道，见上文)。除非另有说明，否则EU编号方案用于指本文所述的ABP重链恒定区中的残基。
本文所使用的术语“全长抗体”、“完整抗体”和“整个抗体”可互换，是指具有与天然存在的抗体结构基本相似的结构并且具有包含Fc区的重链的抗体。例如，当用于指代IgG分子时，“全长抗体”是包含两个重链和两个轻链的抗体。
本领域技术人员可以使用许多已知的编号方案中的任何一种方案来确定TCR CDR的氨基酸序列边界，这些编号方案包括但不限于以下文献中所述的IMGT独特编号：LeFranc,M.-P,Immunol Today.1997年11月；18(11):509；Lefranc,M.-P.,"IMGT Locus onFocus:A new section of Experimental andClinical Immunogenetics",Exp.Clin.Immunogenet.,15,1-7(1998)；Lefranc和Lefranc,The T Cell ReceptorFactsBook；以及M.-P.Lefranc/Developmental and Comparative Immunology 27(2003)55–77；所述所有文献均通过引用并入。
“ABP片段”包括完整ABP的一部分，如完整ABP的抗原结合或可变区。ABP片段包括：例如，Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、scFv((sFv))片段和scFv-Fc片段。ABP片段包括抗体片段。抗体片段可以包括Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、scFv(sFv)片段、scFv-Fc片段和TCR片段。
“Fv”片段包括一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的非共价连接的二聚体。
除重链可变结构域和轻链可变结构域外，“Fab”片段还包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域((CH1))。Fab片段，例如，可通过重组方法或通过全长ABP的木瓜蛋白酶消化来产生。
“F(ab')2”片段含有两个Fab'片段，它们在铰链区附近通过二硫键相连。F(ab')2片段可以，例如，通过重组方法或完整ABP的胃蛋白酶消化产生。F(ab')片段可例如，通过β-巯基乙醇处理来解离。
“单链Fv”或“sFv”或“scFv”片段在单个多肽链中包含VH结构域和VL结构域。VH和VL一般通过肽接头连接。参见PlückthunA.(1994)。可使用任何合适的接头。在一些实施方案中，接头是(GGGGS)n。在一些实施方案中，n＝1、2、3、4、5或6。参见源自大肠埃希氏菌的ABP。Rosenberg M.&MooreG.P.(编辑),The Pharmacology of Monoclonal ABPs第113卷(第269-315页)。Springer-Verlag,New York，其通过引用整体并入。
“scFv-Fc”片段包含连接至Fc结构域上的scFv。例如，Fc结构域可以连接至scFv的C末端上。根据scFv中可变结构域的方向(即，VH-VL或VL-VH)，Fc结构域可在VH或VL之后。可以使用本领域已知或本文所述的任何合适的Fc结构域。在一些情况下，Fc结构域包括IgG4Fc结构域。
术语“单结构域抗体”是指这样的分子，其中ABP的一个可变结构域特异性结合抗原而不存在另一个可变结构域。单结构域ABP和其片段描述于：Arabi Ghahroudi等人，FEBSLetters,1998,414:521-526和Muyldermans等人，Trends in Biochem.Sci.,2001,26:230-245，其各自均通过引用整体并入。单结构域ABP也称为sdAb或纳米抗体。
术语“Fc区”或“Fc”是指免疫球蛋白重链的C末端区，其在天然存在的抗体中与Fc受体和补体系统的某些蛋白质相互作用。各种免疫球蛋白的Fc区的结构和其中含有的糖基化位点是本领域已知的。参见Schroeder和Cavacini,J.Allergy Clin.Immunol.,2010,125:S41-52，其通过引用整体并入。Fc区可以是天然存在的Fc区，或如本领域或本公开中其它地方所述修饰的Fc区。
术语“替代支架”是指这样的分子，其中一个或多个区可被多样化以产生一个或多个与抗原或表位特异性结合的抗原结合结构域。在一些实施方案中，抗原结合结构域以类似于ABP的特异性和亲和力与抗原或表位结合。示例性的替代支架包括源自纤连蛋白(例如，AdnectinsTM)、β-夹心(例如，iMab)、脂质运载蛋白(例如，
Figure BDA0002980945400000491
)、EETI-II/AGRP、BPTI/LACI-D1/ITI-D2(例如，Kunitz结构域)、硫氧还蛋白肽适配体、蛋白A(例如，
Figure BDA0002980945400000492
)、锚蛋白重复序列(例如，DARPins)，γ-B-结晶蛋白/遍在蛋白(例如，Affilins)、CTLD3(例如，Tetranectins)、Fynomers和(LDLR-A模块)例如，Avimers)的那些。关于替代支架的另外的信息提供于下列文献中：Binz等人，Nat.Biotechnol.,200523:1257-1268；Skerra,Current Opin.in Biotech.,2007 18:295-304；和Silacci等人，J.Biol.Chem.,2014,289:14392-14398；其各自均通过引用整体并入。一种替代支架是一种类型的ABP。
“多特异性ABP”是包含两个或更多个不同的抗原结合结构域的ABP，所述两个或更多个不同的抗原结合结构域共同特异性地结合两个或更多个不同的表位。两个或更多个不同的表位可以是相同抗原(例如，由细胞表达的单个HLA-肽分子)上的表位或不同抗原(例如，同一细胞表达的不同HLA-肽分子，或HLA-肽分子和非HLA-肽分子)上的表位。在一些方面，多特异性ABP结合两个不同的表位(即“双特异性ABP”)。在一些方面，多特异性ABP结合三个不同的表位(即“三特异性ABP”)。
“单特异性ABP”是包含特异性结合单个表位的一个或多个结合位点的ABP。单特异性ABP的实例是天然存在的IgG分子，虽然IgG分子是二价的(即，具有两个抗原结合结构域)，但是它识别在两个抗原结合结构域的每个上的相同表位。结合特异性可以任何合适的化合价存在。
术语“单克隆抗体”是指来自大致均质的抗体群体的抗体。基本上均质的抗体群体包含大致相似且结合相同表位的抗体，除了通常可能在单克隆抗体产生过程中出现的变体之外。通常仅存在少量的这种变体。单克隆抗体通常由以下方法来获得，所述方法包括从多种抗体中选择单种抗体。例如，选择方法可以是从多种克隆中选择独特的克隆，如杂交瘤克隆、噬菌体克隆、酵母菌克隆、细菌克隆或其它重组DNA克隆的集合。可以进一步改变选定抗体，例如，以改善对靶标的亲和力(“亲和力成熟”)，使抗体人源化，改善其在细胞培养物中的产生和/或降低其在受试者中的免疫原性。
术语“嵌合抗体”是指其中重链和/或轻链的一部分源自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分源自不同来源或物种的抗体。
非人抗体的“人源化”形式含有源自非人抗体的最小序列的嵌合抗体。人源化抗体通常是其中一个或多个CDR的残基被非人抗体(供体抗体)的一个或多个CDR的残基替代的人抗体(受体抗体)。供体抗体可以是任何合适的非人抗体，如具有所需的特异性、亲和力或生物学效应的小鼠、大鼠、兔、鸡或非人灵长类抗体。在一些情况下，受体抗体的选定框架区残基被供体抗体的相应框架区残基替代。人源化抗体还可包含在受体抗体或供体抗体中均未发现的残基。可以进行这种修饰以进一步改善抗体功能。有关更多细节，请参见Jones等人，Nature,1986,321:522-525；Riechmann等人，Nature,1988,332:323-329；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,1992,2:593-596，所述文献中的每一篇均通过引用整体并入。
“人抗体”是具有与人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列相对应的氨基酸序列，或源自利用人抗体库或人抗体编码序列的非人来源的氨基酸序列(例如，从人来源获得或从头设计)的抗体。人抗体特异性地排除人源化抗体。
“亲和力”是指分子(例如，ABP)的单一结合位点与其结合伴侣(例如，抗原或表位)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则本文使用的“亲和力”是指固有结合亲和力，其反映了结合对的成员(例如，ABP和抗原或表位)之间的1:1相互作用。分子X对其伴侣Y的亲和力可以用解离平衡常数(KD)表示。下文将更详细地描述有关解离平衡常数的动力学要素。亲和力可以通过本领域已知的常规方法来测量，包括本文所述的方法，如表面等离子体共振(SPR)技术(例如，
Figure BDA0002980945400000501
)或生物层干涉测量(例如，
Figure BDA0002980945400000502
)。
关于ABP与靶标分子的结合，术语“结合特定抗原(例如，多肽靶标)或特定抗原上的表位”、“特异性结合特定抗原(例如，多肽靶标)或特定抗原上的表位”、“与特定抗原(例如，多肽靶标)或特定抗原上的表位特异性结合”、“对特定抗原(例如，多肽靶标)或特定抗原上的表位特异”、“选择性结合特定抗原(例如，多肽靶标)或特定抗原上的表位”和“对特定抗原(例如，多肽靶标)或特定抗原上的表位选择性的”是指明显不同于非特异性或非选择性相互作用(例如，与非靶标分子)的结合。特异性结合可以，例如，通过测量与靶标分子的结合并将其和与非靶标分子的结合进行比较来测量。特异性结合也可以通过与模拟靶标分子上识别的表位的对照分子竞争来确定。在那种情况下，如果对照分子竞争性地抑制ABP与靶标分子的结合，则表明是特异性结合。在一些方面，HLA-肽ABP对非靶标分子的亲和力比其对HLA-肽的亲和力小约50％。在一些方面，HLA-肽ABP对非靶标分子的亲和力比其对HLA-肽的亲和力小约40％。在一些方面，HLA-肽ABP对非靶标分子的亲和力比其对HLA-肽的亲和力小约30％。在一些方面，HLA-肽ABP对非靶标分子的亲和力比其对HLA-肽的亲和力小约20％。在一些方面，HLA-肽ABP对非靶标分子的亲和力比其对HLA-肽的亲和力小约10％。在一些方面，HLA-肽ABP对非靶标分子的亲和力比其对HLA-肽的亲和力小约1％。在一些方面，HLA-肽ABP对非靶标分子的亲和力比其对HLA-肽的亲和力小约0.1％。
本文所使用的术语“kd”(sec-1)是指特定ABP-抗原相互作用的解离速率常数。所述值又称为koff值。
本文所使用的术语“ka”(M-1×sec-1)是指特定ABP-抗原相互作用的缔合速率常数。这一值又称为kon值。
本文所使用的术语“KD”(M)是指特定ABP-抗原相互作用的解离平衡常数。KD＝kd/ka。在一些实施方案中，ABP的亲和力是根据针对这种ABP与其抗原之间的相互作用的KD描述的。为了清楚起见，如本领域中已知的，较小的KD值指示较高的亲和力相互作用，而较大的KD值指示较低的亲和力相互作用。
本文所使用的术语“KA”(M-1)是指特定ABP-抗原相互作用的缔合平衡常数。KA＝ka/kd。
“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子，如治疗剂(例如，细胞因子)或诊断剂，缀合的ABP。
“Fc效应功能”是指由具有Fc区的ABP的Fc区介导的生物活性，这些活性可因亚型而改变。ABP效应功能的实例包含C1q结合以激活补体依赖性细胞毒性(CDC)，Fc受体结合以激活ABP依赖性细胞毒性(ADCC)，以及ABP依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。
当在两个或更多个的ABP的语境中使用时，术语“与……竞争”或“与……交叉竞争”表示两个或更多个的ABP竞争与抗原(例如，HLA-肽)结合。在一个示例性测定中，将HLA-肽涂覆在表面并使其与第一HLA-肽ABP接触，然后，添加第二HLA-肽ABP。在另一个示例性测定中，将第一HLA-肽ABP涂覆在表面并使其与HLA-肽接触，然后添加第二HLA-肽ABP。如果在任一测定中，第一HLA-肽ABP的存在降低了第二HLA-肽ABP的结合，则ABP会彼此竞争。术语“与……竞争”还包括ABP的组合，其中一个ABP降低了另一ABP的结合，但是当以相反的顺序添加ABP时未观察到竞争。然而，在一些实施方案中，第一和第二ABP抑制彼此的结合，而与它们的添加顺序无关。在一些实施方案中，一个ABP使得另一个ABP与其抗原的结合降低至少25％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％。技术人员可以基于ABP对HLA-肽的亲和力和ABP的价数来选择用于竞争测定的ABP的浓度。在这一定义中描述的测定是说明性的，并且技术人员可以使用任何合适的测定来确定ABP是否彼此竞争。下列文献中描述了合适的测定：例如，Cox等人，2014年12月24日更新的AssayGuidance Manual[Internet]中的“Immunoassay Methods,”(www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK92434/；2015年9月29日访问)；Silman等人，Cytometry,2001,44:30-37；以及Finco等人，J.Pharm.Biomed.Anal.,2011,54:351-358；其各自均通过引用整体并入。
术语“表位”是指与ABP特异性结合的抗原的一部分。表位通常由表面可及的氨基酸残基和/或糖侧链组成，并且可能具有特定的三维结构特性以及特定的电荷特性。构象和非构象表位的区别在于：在变性溶剂的存在下，与前者的结合而不是与后者的结合可能会丢失。表位可包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其它氨基酸残基。可以采用确定表位的已知技术来确定与ABP结合的表位，如，例如，测试ABP与具有不同点突变的HLA-肽变体的结合或与嵌合HLA-肽变体的结合。
多肽序列和参考序列之间的“同一性”百分比被定义为在比对序列并引入间隙(若必要)以获得最大的序列同一性百分比之后，多肽序列中与参考序列相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以通过本领域技术范围内的各种方式来实现，例如，使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN、MEGALIGN(DNASTAR)、CLUSTALW、CLUSTAL OMEGA或MUSCLE软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
“保守性取代”或“保守性氨基酸取代”是指一种氨基酸被一种与其在化学上或功能上相似的氨基酸所取代。相似氨基酸的保守性取代表是本领域众所周知的。举例来说，在一些实施方案中，表21-23中提供的氨基酸组被认为是彼此的保守性取代。
表21.在某些实施方案中，被认为是彼此的保守性取代的所选氨基酸组。
酸性残基 D和E
碱性残基 K、R和H
亲水性不带电残基 S、T、N和Q
脂肪族不带电残基 G、A、V、L和I
非极性不带电残基 C、M和P
芳香族残基 F、Y和W
表22.在某些实施方案中，被认为是彼此的保守性取代的另外的选定氨基酸组。
组1 A、S和T
组2 D和E
组3 N和Q
组4 R和K
组5 I、L和M
组6 F、Y和W
表23.在某些实施方案中，被认为是彼此的保守性取代的进一步选定氨基酸组。
组A A和G
组B D和E
组C N和Q
组D R、K和H
组E I、L、M、V
组F F、Y和W
组G S和T
组H C和M
另外的保守性取代可见于，例如，Creighton,Proteins:StructuresandMolecular Properties第2版(1993)W.H.Freeman&Co.,New York,NY中。通过对亲本ABP中的氨基酸残基进行一个或多个保守性取代而产生的ABP被称为“保守性修饰的变体”。
术语“氨基酸”是指二十种常见的天然存在的氨基酸。天然存在的氨基酸包括丙氨酸(Ala；A)、精氨酸(Arg；R)、天冬酰胺(Asn；N)、天冬氨酸(Asp；D)、半胱氨酸(Cys；C)；谷氨酸(Glu；E)、谷氨酰胺(Gln；Q)、甘氨酸(Gly；G)；组氨酸(His；H)、异亮氨酸(Ile；I)、亮氨酸(Leu；L)、赖氨酸(Lys；K)、甲硫氨酸(Met；M)、苯丙氨酸(Phe；F)、脯氨酸(Pro；P)、丝氨酸(Ser；S)、苏氨酸((Thr；T))、色氨酸(Trp；W)、酪氨酸(Tyr；Y)以及缬氨酸(Val；V)。
本文使用的术语“载体”是指能够繁殖与其连接的另一核酸的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体，以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导与其可操作地连接的核酸的表达。这种载体在本文中称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已向其中引入外源核酸的细胞和此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化子”(或“转化的细胞”)和“转染子”(或“转染的细胞”)，它们各自包括初级转化或转染的细胞和其衍生的后代。这种后代在核酸含量上可能与亲代细胞不完全相同，并且可能含有突变。
术语“治疗(treating)”(和其变形，如“治疗”(treat)或“治疗”(treatment))是指试图改变有需要的受试者的疾病或病状的自然过程的临床干预。可以针对预防和在临床病理过程中进行治疗。理想的治疗效果包括预防疾病的发生或复发，减轻症状，减轻疾病的任何直接或间接病理后果，预防转移，降低疾病进展的速度，改善或减轻疾病的状态以及缓解或改善预后。
本文使用的术语“治疗有效量”或“有效量”是指向受试者施用时，可有效治疗疾病或病症的本文提供的ABP或药物组合物的量。
本文使用的术语“受试者”是指哺乳动物受试者。示例性受试者包括人、猴子、狗、猫、小鼠、大鼠、牛、马、骆驼、山羊、兔子和绵羊。在某些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者患有可以用本文提供的ABP治疗的疾病或病状。在一些方面，所述疾病或病状是癌症。在一些方面，所述疾病或病状是病毒感染。
术语“包装说明书”用于指通常包含在治疗或诊断产品(例如，试剂盒)的商业包装中的说明，其包含使用这种治疗或诊断产品的有关适应症、用法、用量、施用、联合治疗、禁忌和/或警告的信息。
术语“肿瘤”是指所有赘生性细胞(无论是恶性还是良性)的生长和增殖，以及所有癌前和癌细胞和组织。术语“癌症”、“癌的”、“细胞增生性病症”、“增生性病症”和“肿瘤”在本文中并不互相排斥。术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”是指与某种程度的异常细胞增殖相关的病症。在一些实施方案中，细胞增殖性病症是癌症。在某些方面，肿瘤是实体瘤。在某些方面，肿瘤是血液系统恶性肿瘤。
术语“药物组合物”是指一种制剂，其以允许其中所含有的活性成分的生物活性有效地治疗受试者的形式存在，并且不含药物组合物中提供的量的对受试者具有不可接受的毒性的另外的组分。
术语“调节(modulate)”和“调节(modulation)”是指减少或抑制，或替代地，激活或增加所列举的变量。
术语“增加”和“激活”是指所列举的变量增加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。
术语“减少”和“抑制”是指所列举的变量减少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。
术语“激动”是指激活受体信号传导以诱导与受体激活相关的生物学反应。“激动剂”是一种结合并激动受体的实体。
术语“拮抗”是指抑制受体信号传导以抑制与受体激活相关的生物学反应。“拮抗剂”是一种结合并拮抗受体的实体。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可包括但不限于基因或基因片段的编码区或非编码区，从连锁分析的角度定义的基因座、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、分离的DNA、分离的RNA、核酸探针以及引物。多核苷酸可包括经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。示例性的经修饰的核苷酸包括：例如，5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基肌苷、肌苷、N6-异戊烯腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-取代腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷、5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基N6-异戊烯腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶以及2,6-二氨基嘌呤。
分离的HLA-肽靶标
主要组织相容性复合物(MHC)是由一组连接的基因座编码的抗原的复合物，其在小鼠中统称为H-2，在人中统称为HLA。MHC抗原有两个主要的类别，即I类和II类，每个类别都包括一组细胞表面糖蛋白，它们在确定组织类型和移植相容性方面发挥作用。在移植反应中，细胞毒性T细胞(CTL)主要对I类糖蛋白作出反应，而辅助T细胞主要对II类糖蛋白作出反应。
人主要组织相容性复合物(MHC)I类分子(在本文中可互换地称为HLA I类分子)在几乎所有细胞的表面表达。这些分子的功能是通过与α-βT细胞受体相互作用，将主要来自内源合成蛋白的肽呈递给例如CD8+T细胞。MHC I类分子包含由46kDa的α链构成的异二聚体，其与12kDa的轻链β-2微球蛋白非共价缔合。α链通常包含α1和α2结构域，它们形成了呈递HLA限制性肽的沟；以及与T细胞的CD8共受体相互作用的α3跨质膜结构域。图1(现有技术)描绘了HLA I类分子的一般结构。一些TCR可以独立于CD8共受体结合MHC I类(参见，例如，Kerry SE,Buslepp J,Cramer LA等人Interplaybetween TCR Affinity andNecessity of Coreceptor Ligation:High-AffinityPeptide-MHC/TCR InteractionOvercomes Lack of CD8 Engagement.Journalof immunology(Baltimore,Md:1950).2003；171(9):4493-4503)。
I类MHC-限制性肽(在本文中也可互换地称为HLA-限制性抗原、HLA-限制性肽、MHC-限制性抗原、限制性肽或肽)一般通过约两个或三个锚定残基与重链ɑ1-ɑ2沟结合，所述锚定残基与MHC分子中相应的结合口袋相互作用。β-2微球蛋白链在MHC I类细胞内运输、肽结合和构象稳定性中起重要作用。对于大多数I类分子，MHC I类重链、肽(自身、非自身和/或抗原性)和β-2微球蛋白的异源三聚体复合物的形成导致蛋白质成熟并输出到细胞表面。
给定的HLA亚型与HLA-限制性肽的结合形成了具有独特且新颖的表面的复合物，所述复合物可以被ABP(如，例如T细胞上的TCR或其抗体或抗原结合片段)特异性识别。与HLA-限制性肽复合的HLA在本文中称为HLA-肽、pHLA或HLA-肽靶标。在一些情况下，限制性肽位于HLA分子的α1/α2沟中。在一些情况下，限制性肽通过约两个或三个锚定残基而与HLA分子的α1/α2沟结合，所述锚定残基与HLA分子中相应的结合口袋相互作用。
因此，本文提供了包含HLA-肽靶标的抗原。HLA-肽靶标可包含特定HLA-限制性肽，其具有与特定HLA亚型复合的明确的氨基酸序列。
本文鉴定的HLA-肽靶标可用于癌症免疫治疗。在一些实施方案中，本文鉴定的HLA-肽靶标存在于肿瘤细胞的表面上。本文鉴定的HLA-肽靶标可由人受试者中的肿瘤细胞表达。本文鉴定的HLA-肽靶标可由人受试者群体中的肿瘤细胞表达。例如，本文鉴定的HLA-肽靶标可以是共有抗原，其通常在患有癌症的人受试者群体中表达。
本文鉴定的HLA-肽靶标可随个体肿瘤类型具有不同的患病率。随个体肿瘤类型的患病率可能为约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。随个体肿瘤类型的患病率可为约0.1％至100％，0.2至50％，0.5至25％或1至10％。
优选地，HLA-肽靶标通常在大多数正常组织中不会表达。例如，在一些情况下，HLA-肽靶标可能不在基因型组织表达(GTEx)项目中的组织中表达，或者在一些情况下，可能仅在免疫特权组织或非必需组织中表达。示例性的免疫特权组织或非必需组织包括睾丸、小唾液腺、子宫颈内膜和甲状腺。在一些情况下，如果衍生限制性肽的基因在GTEx样品中的中位表达小于0.5RPKM(每百万映射读段(napped read)中每千碱基转录物的读段数)，如果基因在GTEX样品中的表达不超过10RPKM，如果在所有必需组织样品中不超过两个样品中基因以大于等于5RPKM表达，或其任意组合，则HLA-肽靶标可能被认为未在必需组织或非免疫特权组织上表达。
HLA-肽靶标的示例性HLA I类亚型
人中存在许多MHC单倍型(在本文中可互换地称为MHC亚型、HLA亚型、MHC类型和HLA类型)。示例性HLA亚型包括(仅以举例的方式)HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A11、HLA-A23、HLA-A24、HLA-A25、HLA-A26、HLA-A28、HLA-A29、HLA-A30、HLA-A31、HLA-A32、HLA-A33、HLA-A34、HLA-68、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B40、HLA-B44、HLA-B13、HLA-B15、HLA-B-18、HLA-B27、HLA-B35、HLA-B37、HLA-B38、HLA-B39、HLA-B45、HLA-B46、HLA-B49、HLA-B51、HLA-B54、HLA-B55、HLA-B56、HLA-B57、HLA-B58、HLA-C*01、HLA-C*02、HLA-C*03、HLA-C*04、HLA-C*05、HLA-C*06、HLA-C*07、HLA-C*12、HLA-C*14、HLA-C*16、HLA-Cw8、HLA-A*01:01、HLA-A*02:01、HLA-A*02:03、HLA-A*02:04、HLA-A*02:07、HLA-A*03:01、HLA-A*03:02、HLA-A*11:01、HLA-A*23:01、HLA-A*24:02、HLA-A*25:01、HLA-A*26:01、HLA-A*29:02、HLA-A*30:01、HLA-A*30:02、HLA-A*31:01、HLA-A*32:01、HLA-A*33:01、HLA-A*33:03、HLA-A*68:01、HLA-A*68:02、HLA-B*07:02、HLA-B*08:01、HLA-B*13:02、HLA-B*15:01、HLA-B*15:03、HLA-B*18:01、HLA-B*27:02、HLA-B*27:05、HLA-B*35:01、HLA-B*35:03、HLA-B*37:01、HLA-B*38:01、HLA-B*39:01、HLA-B*40:01、HLA-B*40:02、HLA-B*44:02、HLA-B*44:03、HLA-B*46:01、HLA-B*49:01、HLA-B*51:01、HLA-B*54:01、HLA-B*55:01、HLA-B*56:01、HLA-B*57:01、HLA-B*58:01、HLA-C*01:02、HLA-C*02:02、HLA-C*03:03、HLA-C*03:04、HLA-C*04:01、HLA-C*05:01、HLA-C*06:02、HLA-C*07:01、HLA-C*07:02、HLA-C*07:04、HLA-C*07:06、HLA-C*12:03、HLA-C*14:02、HLA-C*16:01、HLA-C*16:02、HLA-C*16:04以及其所有亚型，包括例如4位、6位和8位亚型。本领域技术人员已知，存在上述HLA类型的等位基因变体，本发明涵盖所有这些等位基因变体。HLA类等位基因的完整列表可见于http://hla.alleles.org/alleles/。例如，HLA I类等位基因的完整列表可见于http://hla.alleles.org/alleles/class1.html。
HLA-限制性肽
HLA-限制性肽(在本文中可互换地称为)“限制性肽”可以是肿瘤特异性基因(例如，癌症特异性基因)的肽片段。优选地，癌症特异性基因在癌症样品中表达。可以通过数据库鉴定在癌症样品中异常表达的基因。仅以列举的方式说明的示例性数据库包括：癌症基因组图谱(TCGA)研究网络：http://cancergenome.nih.gov/；国际癌症基因组协会：https://dcc.icgc.org/。在一些实施方案中，癌症特异性基因在来自TCGA数据库的至少5个样品中有至少10RPKM的观察到的表达。癌症特异性基因可能具有可观察到的双峰分布。
所述癌症特异性基因在至少一种TCGA肿瘤组织中可具有大于10、20、30、40、50、60、70、80、90或100个转录物/100万(TPM)的观察到的表达。在优选的实施方案中，癌症特异性基因在至少一种TCGA肿瘤组织中具有大于100TPM的观察到的表达。在一些情况下，癌症特异性基因在TCGA样品中具有观察到的双峰表达分布。在不希望受到理论约束的情况下，这种双峰表达模式与生物学模型一致，在所述生物学模型中，所有肿瘤样品中基线处的表达量最小，而经历了表观遗传调节异常的肿瘤的子集中的表达量较高。
优选地，癌症特异性基因通常在大多数正常组织中不会表达。例如，在一些情况下，癌症特异性基因可能不在基因型组织表达(GTEx)项目中的组织中表达，或者在一些情况下，可能在免疫特权组织或非必需组织中表达。示例性的免疫特权组织或非必需组织包括睾丸、小唾液腺、子宫颈内膜和甲状腺。在一些情况下，如果癌症特异性基因在GTEx样品中的中位表达小于0.5RPKM(每百万映射读段中每千碱基转录物的读段数)，如果基因在GTEX样品中的表达不超过10RPKM，如果在所有必需组织样品中有不超过两个样品中以大于等于5RPKM的基因表达，或其任意组合，则癌症特异性基因可能被认为未在必需组织或非免疫特权组织上表达。
在一些实施方案中，通过评估GTEx，癌症特异性基因满足以下标准：(1)脑、心脏或肺中的GTEx中位表达小于0.1转录本/百万(TPM)，没有一个样品超过5TPM；(2)其它必需器官(不包括睾丸、甲状腺、小唾液腺)的GTEx中位表达低于2TPM，没有一个样品超过10TPM。
在一些实施方案中，癌症特异性基因一般不太可能在免疫细胞中表达，例如，不是干扰素家族基因，不是与眼相关的基因，不是嗅觉或味觉受体基因，并且不是与昼夜节律周期(例如，不是CLOCK、PERIOD、CRY基因)相关的基因。
限制性肽优选可存在于肿瘤的表面上。
限制性肽的大小可为约5，约6，约7，约8，约9，约10，约11，约12，约13，约14或约15个氨基分子残基，以及可从中推导出的任何范围。在特定的实施方案中，限制性肽的大小为约8，约9，约10，约11或约12个氨基分子残基。限制性肽的长度可以是约5至15个氨基酸，优选地可以为约7至12个氨基酸，或更优选地可以为约8至11个氨基酸。
示例性HLA-肽靶标
示例性的HLA-肽靶标如表A、表A1和表A2所示。表A、表A1和表A2中的每一行显示了每种复合物的HLA等位基因和相应的HLA-限制性肽序列。所述肽序列可以由表A、表A1或表A2的任一行中所示的相应序列组成。替代地，所述肽序列可以包括表A、表A1或表A2的任一行中所示的相应序列。替代地，所述肽序列可以基本上由表A、表A1或表A2的任一行中所示的相应序列组成。
在一些实施方案中，HLA-肽靶标是表A、表A1或表A2中所示的靶标。
在一些实施方案中，HLA-肽靶标是表A、表A1或表A2中所示的靶标，条件是分离的HLA-肽靶标不是靶标编号6364-6369、6386-6389、6500、6521-6524或6578中的任一个，并且不是表B或表C中存在的HLA-肽靶标。
在一些实施方案中，HLA-限制性肽不是来自选自WT1或MART1的基因。
不与限制性肽配体缔合的HLA I类分子通常不稳定。因此，限制性肽与HLA分子的α1/α2沟的缔合可以使HLA亚型的β2-微球蛋白亚基与HLA亚型的α-亚基之间的非共价缔合稳定。
HLA亚型的β2-微球蛋白亚基与HLA亚型的α-亚基之间的非共价缔合的稳定性可以使用任何合适的方法来确定。例如，可以通过将HLA分子的不溶性聚集体溶解在高浓度的尿素(例如，约8M尿素)中，并且确定HLA分子在去除尿素(例如，通过透析去除尿素)时在限制性肽的存在下重折叠的能力来评估这种稳定性。这种重折叠方法描述于，例如Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第89卷，第3429-3433页，1992年4月，其由此通过引用并入。
对于其它实例，可以使用条件HLA I类配体来评估这种稳定性。将条件HLA I类配体通常设计成短的限制性肽，其可通过与HLA分子的α1/α2沟结合来使HLA I类分子的β2和α亚基之间的缔合稳定，并且含有一个或多个氨基酸修饰，使得限制性肽一旦暴露于条件刺激便会裂解。一旦条件配体裂解，HLA分子的β2和α-亚基就解离，除非这种条件配体被交换成与α1/α2沟结合并使HLA分子稳定的限制性肽。可以通过以下方法设计条件配体：在已知的HLA肽配体或预测的高亲和力HLA肽配体中引入氨基酸修饰。对于可获得结构信息的HLA等位基因，也可利用侧链的水可及性来选择引入氨基酸修饰的位置。通过允许批量制备稳定的HLA-肽复合物，使用条件HLA配体可能是有利的，所述复合物可用于以高通量方式查询测试的限制性肽。条件HLAI类配体和其产生方法描述于，例如，Proc Natl Acad Sci U SA.2008年3月11日；105(10):3831–3836；Proc Natl Acad Sci U S A.2008年3月11日；105(10):3825–3830；J Exp Med.2018May 7；215(5):1493–1504；Choo,J.A.L.等人Bioorthogonal cleavage and exchange of major histocompatibility complexligands by employing azobenzene-containing peptides.Angew Chem Int Ed Engl53,13390–13394(2014)；Amore,A.等人Development of a Hypersensitive Periodate-Cleavable Amino Acid that is Methionine-and Disulfide-Compatible and itsApplication in MHC Exchange Reagents for T Cell Characterisation.ChemBioChem14,123–131(2012)；Rodenko,B.等人Class I Major Histocompatibility ComplexesLoaded by a Periodate Trigger.J Am Chem Soc 131,12305–12313(2009)；以及Chang,C.X.L.等人Conditional ligands for Asian HLA variants facilitate thedefinition of CD8+T-cell responses in acute and chronic viral diseases.Eur JImmunol 43,1109–1120(2013)。这些参考文献通过引用整体并入。
因此，在一些实施方案中，通过进行条件配体介导的交换反应和HLA稳定性测定来评估本文所述的(例如表A、表A1或表A2中所描述的)HLA-限制性肽使HLA分子的β2-和α-亚基缔合稳定的能力。HLA稳定性可以使用任何合适的方法来测定，包括：例如质谱分析、免疫测定(例如，ELISA)、尺寸排阻色谱法和HLA多聚体染色，然后进行T细胞的流式细胞术评估。
评估HLA亚型的β2-微球蛋白亚基与HLA亚型的α-亚基之间的非共价缔合的稳定性的其它示例性方法包括使用二肽进行肽交换。使用二肽进行的肽交换描述于，例如ProcNatl Acad Sci U S A.2013年9月17日；110(38):15383-8；Proc Natl Acad Sci U SA.2015年1月6日；112(1):202-7，其通过引用并入。
本文提供了包含HLA-肽靶标的有用抗原。HLA-肽靶标可包含特定的HLA-限制性肽，其具有与特定的HLA亚型等位基因复合的明确的氨基酸序列。
HLA-肽靶标可以是分离的和/或为基本上纯的形式。例如，HLA-肽靶标可以与它们的自然环境分离，或者可以通过技术方法生产。在一些情况下，以基本上不含其它肽或蛋白质的形式提供HLA-肽靶标。
HLA-肽靶标可以可溶形式存在，并且任选地，可以是重组HLA-肽靶标复合物。技术人员可使用任何合适的方法来产生和纯化重组HLA-肽靶标。合适的方法包括，例如，使用大肠埃希氏菌表达系统、昆虫细胞等。其它方法包括合成产生，例如使用无细胞系统。WO2017089756描述了示例性的合适的无细胞系统，其由此通过引用整体并入。
本文还提供了包含HLA-肽靶标的组合物。
在一些情况下，所述组合物包含附接到固体支持物上的HLA-肽靶标。示例性的固体支持物包括但不限于珠、孔、膜、管、柱、板、琼脂糖凝胶、磁珠和碎片。示例性的固体载体描述于，例如Catalysts 2018,8,92；doi:10.3390/catal8020092，其由此通过引用整体并入。
可通过本领域已知的任何合适的方法将HLA-肽靶标附接到固体支持物上。在一些情况下，HLA-肽靶标共价地附接到固体支持物上。
在一些情况下，HLA-肽靶标通过亲和结合对附接到固体支持物上。亲和结合对通常涉及两个分子之间的特异性相互作用。对其结合伴侣分子具有亲和力的配体可以共价附接到固体支持物上，因此用作固定常见亲和结合对的诱饵，所述常见的亲和结合对包括：例如链霉亲和素和生物素、抗生物素蛋白和生物素；具有金属离子(如铜、镍、锌和钴)的多组氨酸标签等。
HLA-肽靶标可包含可检测的标记物。
包含HLA-肽靶标的药物组合物。
包含HLA-肽靶标的组合物可以是药物组合物。这种组合物可包含多种HLA-肽靶标。本文描述了示例性的药物组合物。所述组合物可能能够引发免疫应答。所述组合物可包含佐剂。合适的佐剂包括但不限于：1018ISS、明矾、铝盐、Amplivax、AS15、BCG、CP-870893、CpG7909、CyaA、dSLIM、GM-CSF、IC30、IC31、咪喹莫特、ImuFact IMP321、IS Patch、ISS、ISCOMATRIX、JuvImmune、LipoVac、MF59、单磷酰脂质A、Montanide IMS 1312、MontanideISA206、Montanide ISA 50V、Montanide ISA-51、OK-432、OM-174、OM-197-MP-EC、ONTAK、PepTel载体系统、PLG微粒、瑞喹莫德、SRL172、病毒颗粒和其它病毒样颗粒、YF-17D、VEGFtrap、R848、β-葡聚糖、Pam3Cys、源自皂苷的阿奎拉斯QS21刺激子(Aquila Biotech,Worcester,Mass.,USA)、分枝杆菌提取物和合成细菌细胞壁模拟物以及其它专有佐剂，如Ribi's Detox.Quil或Superfos。佐剂(如不完全弗氏或GM-CSF)是有用的。前面已经描述了几种对树突状细胞具有特异性的免疫佐剂(例如，MF59)和其制备(Dupuis M,等人，CellImmunol.1998；186(1):18-27；Allison A C；Dev Biol Stand.1998；92:3-11)。也可以使用细胞因子。几种细胞因子已经直接连接以影响树突状细胞向淋巴样组织的迁移(例如，TNF-α)，加速树突状细胞成熟为T淋巴细胞的有效抗原呈递细胞(例如，GM-CSF、IL-1和IL-4)(美国专利第5,849,589号，具体通过引用整体并入本文)并充当免疫佐剂(例如，IL-12)(Gabrilovich DI等人J Immunother Emphasis Tumor Immunol.1996(6):414-418)。HLA的表面表达和细胞内蛋白质加工成肽以呈现在HLA上也可以通过干扰素-γ(IFN-γ)来增强。参见，例如，York IA,Goldberg AL,Mo XY,Rock KL.Proteolysis andclass I majorhistocompatibility complex antigen presentation.Immunol Rev.1999；172:49-66；以及Rock KL,Goldberg AL.Degradation of cell proteinsand the generation of MHCclass I-presented peptides.Ann Rev Immunol.1999；17:12.739-779，其通过引用整体并入本文。
HLA-肽ABP
本文还提供了与本文公开的HLA-肽靶标特异性结合的ABP。
HLA-肽靶标可以在包括肿瘤细胞在内的任何合适的靶标细胞的表面上表达。
所述ABP可以特异性结合人白细胞抗原(HLA)-肽靶标，其中所述HLA-肽靶标包含与HLA I类分子复合的HLA-限制性肽，其中所述HLA-限制性肽位于HLA I类分子的α1/α2异二聚体部分的肽结合沟中。
在一些方面，在不存在HLA-限制性肽的情况下，ABP不结合HLA I类。在一些方面，在不存在人MHC I类的情况下，ABP不结合HLA-限制性肽。在一些方面，ABP结合呈递与HLA-限制性肽复合的人MHC I类的肿瘤细胞，任选地，其中HLA-限制性肽是表征癌症的肿瘤抗原。
ABP可以结合HLA-肽复合物(即，HLA和代表复合物每个部分的肽)的每个部分，当结合在一起时，它们形成新的靶标和蛋白质表面，用于与ABP相互作用并被ABP结合，这与单独的肽或单独的HLA亚型呈现的表面不同。一般地，在不存在HLA-肽复合物的每个部分的情况下，不存在通过HLA与肽结合而形成的新的靶标和蛋白质表面。
ABP能够特异性结合复合物，所述复合物包含HLA和HLA-限制性肽(HLA-肽)，例如源自肿瘤。在一些方面，在不存在源自肿瘤的HLA-限制性肽的情况下，ABP不结合HLA。在一些方面，在不存在HLA的情况下，ABP不结合源自肿瘤的HLA-限制性肽。在一些方面，当HLA-限制性肽天然存在于细胞(如肿瘤细胞)上时，ABP结合包含HLA和HLA-限制性肽的复合物。
在一些实施方案中，本文提供的ABP调节HLA-肽与HLA-肽的一种或多种配体的结合。
ABP可特异性地与表A、表A1或表A2中公开的任何一种HLA-肽靶标结合。在一些实施方案中，HLA-限制性肽不是来自选自WT1或MART1的基因。在一些实施方案中，所述ABP不与靶标编号6364-6369、6386-6389、6500、6521-6524或6578中的任一个特异性结合，并且不与表B或表C中存在的HLA-肽靶标特异性结合。
在更具体的实施方案中，ABP标特异性地结合HLA-肽靶，所述HLA-肽靶标选自以下中的任一个：与包含序列LLASSILCA的HLA-限制性肽复合的HLA亚型A*02:01、与包含序列EVDPIGHLY的HLA-限制性肽复合的HLA亚型*01:01、与包含序列GEMSSNSTAL的HLA-限制性肽复合的HLA亚型B*44:02、与包含序列GVYDGEEHSV的HLA-限制性肽复合的HLA亚型A*02:01、与包含序列EVDPIGHVY的HLA-限制性肽复合的HLA亚型*01:01、与包含序列NTDNNLAVY的HLA-限制性肽复合的HLA亚型HLA-A*01:01与包含序列EVDPIGHVY的HLA-限制性肽复合的HLA亚型B*35:01、与包含序列AIFPGAVPAA的HLA-限制性肽复合的HLA亚型HLA-A*02:01以及与包含序列ASSLPTTMNY的HLA-限制性肽复合的HLA亚型
Figure BDA0002980945400000661
在更具体的实施方案中，ABP特异性结合选自以下中的任一个的HLA-肽靶标：与基本上由序列LLASSILCA组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型A*02:01、与基本上由序列EVDPIGHLY组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型A*01:01、与含有基本上由序列GEMSSNSTAL组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型B*44:02、与基本上由序列GVYDGEEHSV组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型A*02:01、与基本上由序列EVDPIGHVY组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型*01:01、与基本上由序列NTDNNLAVY组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型HLA-A*01:01、与基本上由序列EVDPIGHVY组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型B*35:01、与基本上由序列AIFPGAVPAA组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型A*02:01和与基本上由序列ASSLPTTMNY组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型A*01:01中的任何一种的HLA-肽靶标。
在更具体的实施方案中，ABP特异性结合选自以下中的任一个的HLA-肽靶标：与由序列LLASSILCA组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型A*02:01、与由序列EVDPIGHLY组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型A*01:01、与由序列GEMSSNSTAL组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型B*44:02、与由序列GVYDGEEHSV组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型A*02:01、与由序列EVDPIGHVY组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型*01:01、与由序列NTDNNLAVY组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型HLA-A*01:01亚型、与由EVDPIGHVY序列组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型B*35:01、与由AIFPGAVPAA序列组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型A*02:01和与由序列ASSLPTTMNY组成的HLA-限制性肽复合的HLA亚型A*01:01中的任一种的HLA-肽靶。
在一些实施方案中，ABP是与本文提供的说明性ABP竞争的ABP。在一些方面，与本文提供的说明性ABP竞争的ABP和本文提供的说明性ABP结合相同的表位。
在一些实施方案中，本文所述的ABP在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，这种变体衍生自本文提供的序列，例如，通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域已知或本文所述的任何其它方法。在一些实施方案中，这种变体并非衍生自本文提供的序列，而是可以例如根据本文提供的用于获得ABP的方法从头分离。在一些实施方案中，变体衍生自本文提供的任何序列，其中进行一个或多个保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，变体衍生自本文提供的任何序列，其中进行一个或多个非保守性氨基酸取代。本文描述了保守性氨基酸取代。示例性的非保守性氨基酸取代包括以下文献中所述的那些：J Immunol.2008年5月1日；180(9):6116-31，其在此通过引用整体并入。在优选的实施方案中，非保守性氨基酸取代不干扰或抑制功能变体的生物学活性。在更优选的实施方案中，非保守性氨基酸取代增强了功能变体的生物学活性，从而相较于亲本ABP增强了功能变体的生物学活性。
包含抗体或其抗原结合片段的ABP
ABP可包含抗体或其抗原结合片段。
在一些实施方案中，本文提供的ABP包含轻链。在一些方面，轻链是κ轻链。在某些方面，轻链是λ轻链。
在一些实施方案中，本文提供的ABP包含重链。在一些方面，重链是IgA。在一些方面，重链是IgD。在一些方面，重链是IgE。在一些方面，重链是IgG。在一些方面，重链是IgM。在一些方面，重链是IgG1。在一些方面，重链是IgG2。在一些方面，重链是IgG3。在一些方面，重链是IgG4。在一些方面，重链是IgA1。在一些方面，重链是IgA2。
在一些实施方案中，本文提供的ABP包含抗体片段。在一些实施方案中，本文提供的ABP由抗体片段组成。在一些实施方案中，本文提供的ABP基本上由抗体片段组成。在一些方面，ABP片段是Fv片段。在一些方面，ABP片段是Fab片段。在一些方面，ABP片段是F(ab')2片段。在一些方面，ABP片段是Fab'片段。在一些方面，ABP片段是scFv(sFv)片段。在一些方面，ABP片段是scFv-Fc片段。在一些方面，ABP片段是单结构域ABP的片段。
在一些实施方案中，本文提供的ABP片段衍生自本文提供的说明性ABP。在一些实施方案中，本文提供的ABP片段并非衍生自本文提供的说明性ABP，而是可以例如根据本文提供的用于获得ABP片段的方法从头分离。
在一些实施方案中，本文提供的ABP片段保留与HLA-肽靶标结合的能力，如通过本文所述的一种或多种测定或生物学效应来测量。在一些实施方案中，本文提供的ABP片段保留防止HLA-肽与其一种或多种配体相互作用的能力，如本文所述。
在一些实施方案中，本文提供的ABP是单克隆ABP。在一些实施方案中，本文提供的ABP是多克隆ABP。
在一些实施方案中，本文提供的ABP包括嵌合ABP。在一些实施方案中，本文提供的ABP由嵌合ABP组成。在一些实施方案中，本文提供的ABP基本上由嵌合ABP组成。在一些实施方案中，本文提供的ABP包括人源化ABP。在一些实施方案中，本文提供的ABP由人源化ABP组成。在一些实施方案中，本文提供的ABP基本上由人源化ABP组成。在一些实施方案中，本文提供的ABP包括人ABP。在一些实施方案中，本文提供的ABP由人ABP组成。在一些实施方案中，本文提供的ABP基本上由人ABP组成。
在一些实施方案中，本文提供的ABP包含替代支架。在一些实施方案中，本文提供的ABP由替代支架组成。在一些实施方案中，本文提供的ABP基本上由替代支架组成。可使用任何合适的替代支架。在一些方面，替代支架选自：AdnectinTM、iMab、
Figure BDA0002980945400000691
EETI-II/AGRP、Kunitz结构域、硫氧还蛋白肽适体、
Figure BDA0002980945400000692
DARPin、Affilin、Tetranectin、Fynomer和Avimer。
本文还公开了分离的人源化的、人的或嵌合的ABP，其与本文所公开的ABP竞争结合HLA-肽。
本文还公开了分离的人源化的、人的或嵌合的ABP，其结合本文所述的ABP所结合的HLA-肽表位。
在某些方面，ABP包含人Fc区，其包含至少一种减少与人Fc受体结合的修饰。
已知当在细胞中表达ABP时，ABP在翻译后被修饰。翻译后修饰的实例包括：赖氨酸在羧肽酶的作用下在重链的C末端裂解；通过焦谷氨酰甲基化、糖基化、氧化、脱酰胺基以及糖化将重链和轻链的N末端的谷氨酰胺或谷氨酸修饰为焦谷氨酸，并且已知此类翻译后修饰发生在各种ABP中(参见Journal of Pharmaceutical Sciences，2008年，第97卷，第2426-2447页，其通过引用整体并入)。在一些实施方案中，ABP是经历翻译后修饰的ABP或其抗原结合片段。经历翻译后修饰的ABP或其抗原结合片段的实例包括：在重链可变区的N末端经历焦谷氨酰甲基化和/或在重链的C末端缺失赖氨酸的ABP或其抗原结合片段。本领域已知，由于N末端的焦谷氨酰甲基化和C末端的赖氨酸的缺失而导致的这种翻译后修饰对ABP或其片段的活性没有任何影响(Analytical Biochemistry,2006年，第348卷，第24-39页，其通过引用整体并入)。
单特异性和多特异性HLA-肽ABP
在一些实施方案中，本文提供的ABP是单特异性ABP。
在一些实施方案中，本文提供的ABP是多特异性ABP。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性ABP结合多于一种抗原。在一些实施方案中，多特异性ABP结合2种抗原。在一些实施方案中，多特异性ABP结合3种抗原。在一些实施方案中，多特异性ABP结合4种抗原。在一些实施方案中，多特异性ABP结合5种抗原。
在一些实施方案中，本文提供的多特异性ABP结合HLA-肽抗原上的不止一个表位。在一些实施方案中，多特异性ABP结合HLA-肽抗原上的2个表位。在一些实施方案中，多特异性ABP结合HLA-肽抗原上的3个表位。
许多多特异性ABP构建体是本领域已知的，并且本文提供的ABP可以任何合适的多特异性合适构建体的形式提供。
在一些实施方案中，多特异性ABP包含免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含至少两个不同的重链可变区，每个重链可变区与共同的轻链可变区(即“共同的轻链ABP”)配对。共同的轻链可变区与两个不同的重链可变区的每一个形成不同的抗原结合结构域。参见Merchant等人，Nature Biotechnol.,1998,16:677-681，其通过引用整体并入。
在一些实施方案中，多特异性ABP包含免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含与所述免疫球蛋白的重链或轻链的N末端或C末端的一个或多个连接的ABP或其片段。参见Coloma和Morrison,Nature Biotechnol.,1997,15:159-163，其通过引用整体并入。在一些方面，这种ABP包括四价双特异性ABP。
在一些实施方案中，多特异性ABP包含杂种免疫球蛋白，所述免疫球蛋白包含至少两个不同的重链可变区和至少两个不同的轻链可变区。参见Milstein和Cuello Nature，1983,305:537-540；和Staerz和Bevan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,83:1453-1457，其各自均通过引用整体并入。
在一些实施方案中，多特异性ABP包含具有变化的免疫球蛋白链，以减少不具有多特异性的副产物的形成。在一些方面，ABP包含一种或多种“杵-入-臼”的修饰，如美国专利第5,731,168号中所述，其通过引用整体并入。
在一些实施方案中，多特异性ABP包含具有一种或多种静电修饰以促进Fc异源多聚体装配的免疫球蛋白链。参见WO 2009/089004，其通过引用整体并入。
在一些实施方案中，多特异性ABP包含双特异性单链分子。参见Traunecker等人，EMBO J.,1991,10:3655-3659；和Gruber等人，J.Immunol.,1994,152:5368-5374，其各自通过引用整体并入。
在一些实施方案中，多特异性ABP包含经由多肽接头连接的重链可变结构域和轻链可变结构域，其中选择接头的长度以促进具有所需多特异性的多特异性ABP的装配。例如，当重链可变结构域和轻链可变结构域通过具有超过12个氨基酸残基的多肽接头连接时，通常形成单特异性scFv。参见美国专利第4,946,778和5,132,405号，均通过引用整体并入。在一些实施方案中，将多肽接头长度减少至小于12个氨基酸残基可防止同一多肽链上的重链和轻链可变结构域配对，从而使来自一条链的重链和轻链可变结构域与另一链上的互补结构域配对。因此，所得的ABP具有多特异性，每个结合位点的特异性由多于一个的多肽链贡献。包含由3至12个氨基酸残基的接头连接的重链和轻链可变结构域的多肽链主要形成二聚体(称为双抗体)。具有0至2个氨基酸残基的接头，即三聚体(称为三抗体)和四聚体(称为四抗体)是有利的。然而，除了接头的长度之外，寡聚化的确切类型似乎取决于氨基酸残基的组成和每个多肽链中可变结构域的顺序(例如，VH-接头-VL与VL-接头-VH)。技术人员可以基于所需的多特异性选择合适的接头长度。
Fc区及变体
在某些实施方案中，本文提供的ABP包含Fc区。Fc区可以是野生型或其变体。在某些实施方案中，与天然存在的Fc区相比，本文提供的ABP包含具有一个或多个氨基酸取代、插入或缺失的Fc区。在一些方面，这种取代、插入或缺失产生了具有改变的稳定性、糖基化或其它特征的ABP。在一些方面，这种取代、插入或缺失产生糖基化ABP。
“变体Fc区”或“工程改造的Fc区”包含由于至少一种氨基酸修饰，优选一个或多个氨基酸取代，而不同于天然序列Fc区的氨基酸序列。优选地，与天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区相比，变体Fc区具有至少一个氨基酸取代，例如，约一至约十个氨基酸取代，并且优选地，在天然序列Fc区或亲本多肽的Fc区中约一个至约五个氨基酸取代。本文的变体Fc区优选与天然序列Fc区和/或与亲本多肽的Fc区具有至少约80％的同源性，并且最优选地，与其具有至少约90％的同源性，更优选地，与其具有至少约95％的同源性。
术语“含Fc区的ABP”是指包含Fc区的ABP。可去除Fc区的C末端赖氨酸(残基447，根据EU编号系统)，例如，在纯化ABP期间或通过重组工程改造编码ABP的核酸。因此，具有Fc区的ABP可以包括含或不含K447的ABP。
在一些方面，本文提供的ABP的Fc区被修饰以产生对Fc受体具有改变的亲和力的ABP，或产生更免疫惰性的ABP。在一些实施方案中，本文提供的ABP变体具有一些但不是全部效应功能。例如，当ABP的半衰期在体内很重要时，但是当某些效应功能(例如，补体激活和ADCC)不必要时或有害时，这种ABP可能是有用的。
在一些实施方案中，本文提供的ABP的Fc区是人IgG4 Fc区，其包含一种或多种使铰链稳定化的突变S228P和L235E。参见Aalberse等人，Immunology,2002,105:9-19，其通过引用整体并入。在一些实施方案中，IgG4Fc区包含一种或多种下列突变：E233P、F234V和L235A。参见Armour等人，Mol.Immunol.,2003,40:585-593，其通过引用整体并入。在一些实施方案中，IgG4 Fc区包含G236位置的缺失。
在一些实施方案中，本文提供的ABP的Fc区是人IgG1 Fc区，其包含一种或多种减少Fc受体结合的突变。在一些方面，所述一种或多种突变在选自S228(例如，S228A)、L234(例如，L234A)、L235(例如，L235A)、D265(例如，D265A)和N297(例如，N297A)的残基中。在一些方面，ABP包含PVA236突变。PVA236是指IgG1的从氨基酸位置233至236的氨基酸序列ELLG或IgG4的EFLG被PVA取代。参见美国专利第9,150,641号，其通过引用整体并入。
在一些实施方案中，本文提供的ABP的Fc区被修饰，如下列文献所述：Armour等人，Eur.J.Immunol.,1999,29:2613-2624；WO 1999/058572；和/或英国专利申请第98099518号，其各自均通过引用整体并入。
在一些实施方案中，本文提供的ABP的Fc区是人IgG2 Fc区，其包含一个或多个突变A330S和P331S。
在一些实施方案中，本文提供的ABP的Fc区在选自以下一个或多个位置上具有氨基酸取代：238、265、269、270、297、327和329。参见美国专利第6,737,056号，其通过引用整体并入。这种Fc突变体包含在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或多个处具有取代的Fc突变体，包括所谓的“DANA”Fc突变体，其在残基265和297处被丙氨酸取代。参见美国专利第7,332,581号，其通过引用整体并入。在一些实施方案中，ABP包含氨基酸位置265处的丙氨酸。在一些实施方案中，ABP包含氨基酸位置297处的丙氨酸。
在某些实施方案中，本文提供的ABP包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸取代的Fc区，如在Fc区的位置298、333和334中的一个或多个位置上的取代。在一些实施方案中，本文提供的ABP包含在位置239、332和330上具有一个或多个氨基酸取代的Fc区，如以下文献所述：Lazar等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2006,103:4005-4010，其通过引用整体并入。
在一些实施方案中，本文提供的ABP包含改善或减少C1q结合和/或CDC的一个或多个改变。参见美国专利第6,194,551号；WO 99/51642；以及Idusogie等人，J.Immunol.，2000,164:4178-4184；均通过引用整体并入。
在一些实施方案中，本文提供的ABP包含一个或多个改变以增加半衰期。具有增加的半衰期和改善的与新生儿Fc受体(FcRn)的结合的ABP描述于，例如，Hinton等人，J.Immunol.,2006,176:346-356；和美国专利公开第2005/0014934号；均通过引用整体并入。这种Fc变体包括在IgG的以下一个或多个Fc区残基处具有取代的Fc变体：238、250、256、265、272、286、303、305、307、311、312、314、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424、428和434。在一些实施方案中，所述ABP包含一种或多种延长半衰期的非Fc修饰。延长半衰期的示例性非Fc修饰描述于例如US20170218078中，所述文献由此通过引用整体并入本文。
在一些实施方案中，本文提供的ABP包含一个或多个Fc区变体，如下列文献中所述：美国专利第7,371,826、5,648,260和5,624,821号；Duncan和Winter，Nature,1988,322:738-740；和WO 94/29351；其各自均通过引用整体并入。
对B＊35:01_EVDPIGHVY(HLA-肽靶标“G5”)具有特异性的抗体
在一些方面，本文提供了ABP，其包含特异性地结合HLA-肽靶标的抗体或其抗原结合片段，其中所述HLA-肽靶标的HLA I类分子是HLA亚型B*35:01，并且所述HLA-肽靶标的HLA-限制性肽包含序列EVDPIGHVY(“G5”)或由其组成或基本上由其组成。
CDR
对B*35:01_EVDPIGHVY具有特异性的ABP可包含一个或多个抗体互补决定区(CDR)序列，例如，可包含三个重链CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。
对B*35:01_EVDPIGHVY具有特异性的ABP可包含CDR-H3序列。CDR-H3序列可选自CARDGVRYYGMDVW、CARGVRGYDRSAGYW、CASHDYGDYGEYFQHW、CARVSWYCSSTSCGVNWFDPW、CAKVNWNDGPYFDYW、CATPTNSGYYGPYYYYGMDVW、CARDVMDVW、CAREGYGMDVW、CARDNGVGVDYW、CARGIADSGSYYGNGRDYYYGMDVW、CARGDYYFDYW、CARDGTRYYGMDVW、CARDVVANFDYW、CARGHSSGWYYYYGMDVW、CAKDLGSYGGYYW、CARSWFGGFNYHYYGMDVW、CARELPIGYGMDVW和CARGGSYYYYGMDVW。
对B*35:01_EVDPIGHVY具有特异性的ABP可包含CDR-L3序列。所述CDR-L3序列可选自CMQGLQTPITF、CMQALQTPPTF、CQQAISFPLTF、CQQANSFPLTF、CQQANSFPLTF、CQQSYSIPLTF、CQQTYMMPYTF、CQQSYITPWTF、CQQSYITPYTF、CQQYYTTPYTF、CQQSYSTPLTF、CMQALQTPLTF、CQQYGSWPRTF、CQQSYSTPVTF、CMQALQTPYTF、CQQANSFPFTF、CMQALQTPLTF和CQQSYSTPLTF。
对B*35:01_EVDPIGHVY具有特异性的ABP可能包含特定重链CDR3(CDR-H3)序列和特定轻链CDR3(CDR-L3)序列。在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的CDR-H3和CDR-L3，所述scFv被命名为G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07或G5R4-P4B01。表5中显示了已鉴定的特异性结合B*35:01_EVDPIGHVY的scFv的CDR序列。为了清楚起见，为每个已鉴定的scFv命名克隆名称，并且每行包含该特定克隆名称的CDR序列。例如，由克隆名称G5_P7_E7鉴定的
Figure BDA0002980945400000761
包含重链CDR3序列CARDGVRYYGMDVW和轻链CDR3序列CMQGLQTPITF。
对B*35:01_EVDPIGHVY具有特异性的ABP可包含来自scFv的所有6个CDR，所述scFv被命名为G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07或G5R4-P4B01。
VH
对B*35:01_EVDPIGHVY具有特异性的ABP可包含VH序列。所述VH序列可选自QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGIINPRSGSTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGVRYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSHDINWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGDTGYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGVRGYDRSAGYWGQGTLVIVSS、EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSSYWMSWVRQAPGKGLEWISYISGDSGYTNYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCASHDYGDYGEYFQHWGQGTLVTVSS、EVQLLQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSDMNWVRQAPGKGLEWVAYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSWYCSSTSCGVNWFDPWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSDMNWVRQAPGKGLEWVASISSSGGYINYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVNWNDGPYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNFGVSWLRQAPGQGLEWMGGIIPILGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPTNSGYYGPYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDVMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSGYLVSWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNTAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFRNYPMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDNGVGVDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNIGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGIADSGSYYGNGRDYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYGISWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGVTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGDTKYSQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGTRYYGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSYTNYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDVVANFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWMNPDSGSTGYAQRFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGHSSGWYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMHWVRQAPGKGLEWVSSITSFTNTMYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLGSYGGYYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSWFGGFNYHYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARELPIGYGMDVWGQGTTVTVSS和QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIVGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS。
VL
对B*35:01_EVDPIGHVY具有特异性的ABP可包含VL序列。所述VL序列可选自DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLQTPITFGQGTRLEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSSRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPPTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAISFPLTFGQSTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYMMPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYITPWTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYITPYTFGQGTKLEIK、DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKTSQSVLYRPNNENYLAWYQQKPGQPPKLLIYQASIREPGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRFLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRPQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSHRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK、EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYAASARASGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYGSWPRTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPVTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDISNHLNWYQQKPGKAPKLLIYDALSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGQGTKVEIK和DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
VH-VL组合
对B*35:01_EVDPIGHVY具有特异性的ABP可包含特定VH序列和特定VL序列。在一些实施方案中，对B*35:01_EVDPIGHVY具有特异性的ABP包含来自scFv的VH序列和VL序列，所述scFv被命名为G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07或G5R4-P4B01。表4中显示了特异性结合B*35:01_EVDPIGHVY的已鉴定的scFv的VH和VL序列。为了清楚起见，为每个已鉴定的scFv命中命名克隆名称，并且每行包含该特定克隆名称的VH和VL序列。例如，由克隆名称G5_P7_E7鉴定的scFv包含VH序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGIINPRSGSTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGVRYYGMDVWGQGTTVTVSS和VL序列DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLQTPITFGQGTRLEIK。
对A＊02:01_AIFPGAVPAA(HLA-肽靶标“G8”)具有特异性的抗体
在一些方面，本文提供了ABP，其包含特异性地结合HLA-肽靶标的抗体或其抗原结合片段，其中所述HLA-肽靶标的HLA I类分子是HLA亚型A*02:01，并且所述HLA-肽靶标的HLA-限制性肽包含序列AIFPGAVPAA(“G8”)，由其组成，或基本上由其组成。
CDR
对A*02:01_AIFPGAVPAA具有特异性的ABP可包含一个或多个抗体互补决定区(CDR)序列，例如可包含三个重链CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。
对A*02:01_AIFPGAVPAA具有特异性的ABP可包含CDR-H3序列。所述CDR-H3序列可选自CARDDYGDYVAYFQHW、CARDLSYYYGMDVW、CARVYDFWSVLSGFDIW、CARVEQGYDIYYYYYMDVW、CARSYDYGDYLNFDYW、CARASGSGYYYYYGMDVW、CAASTWIQPFDYW、CASNGNYYGSGSYYNYW、CARAVYYDFWSGPFDYW、CAKGGIYYGSGSYPSW、CARGLYYMDVW、CARGLYGDYFLYYGMDVW、CARGLLGFGEFLTYGMDVW、CARDRDSSWTYYYYGMDVW、CARGLYGDYFLYYGMDVW、CARGDYYDSSGYYFPVYFDYW和CAKDPFWSGHYYYYGMDVW。
对A*02:01_AIFPGAVPAA具有特异性的ABP可包含CDR-L3序列。所述CDR-L3序列可选自CQQNYNSVTF、CQQSYNTPWTF、CGQSYSTPPTF、CQQSYSAPYTF、CQQSYSIPPTF、CQQSYSAPYTF、CQQHNSYPPTF、CQQYSTYPITI、CQQANSFPWTF、CQQSHSTPQTF、CQQSYSTPLTF、CQQSYSTPLTF、CQQTYSTPWTF、CQQYGSSPYTF、CQQSHSTPLTF、CQQANGFPLTF和CQQSYSTPLTF。
对A*02:01_AIFPGAVPAA具有特异性的ABP可包含特定重链CDR3(CDR-H3)序列和特定轻链CDR3(CDR-L3)序列。在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的CDR-H3和CDR-L3，所述scFv被命名为G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01或G8-P2C11。表7中显示了特异性结合A*02:01_AIFPGAVPAA的已鉴定的scFv的CDR序列。为了清楚起见，为每个已鉴定的scFv命中命名克隆名称，并且每行包含该特定克隆名称的CDR序列。例如，由克隆名称G8-P1A03鉴定的scFv包含重链CDR3序列CARDDYGDYVAYFQHW和轻链CDR3序列CQQNYNSVTF。
对A*02:01_AIFPGAVPAA具有特异性的ABP可包含来自scFv的所有6个CDR，所述scFv被命名为G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01或G8-P2C11。
VH
对A*02:01_AIFPGAVPAA具有特异性的ABP可包含VH序列。所述VH序列可选自QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSRSAITWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGATNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDDYGDYVAYFQHWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFIGQYLHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGDSATYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDLSYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPIGGGTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVYDFWSVLSGFDIWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVEQGYDIYYYYYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTLSSYPINWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGHADYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYDYGDYLNFDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSSISGRGDNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARASGSGYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYFMHWVRQAPGQGLEWMGMVNPSGGSETFAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAASTWIQPFDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASNGNYYGSGSYYNYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTTYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAVYYDFWSGPFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGGIYYGSGSYPSWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYGVSWVRQAPGQGLEWMGWISPYSGNTDYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNMYLHWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGDTNYAQTFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYGDYFLYYGMDVWGQGTKVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLLGFGEFLTYGMDVWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSTTYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDRDSSWTYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSNYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYGDYFLYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSHAISWVRQAPGQGLEWMGVIIPSGGTSYTQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYDSSGYYFPVYFDYWGQGTLVTVSS和QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDPFWSGHYYYYGMDVWGQGTTVTVSS。
VL
A*02:01_AIFPGAVPAA具有特异性的ABP可包含VL序列。所述VL序列可选自DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSITSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNYNSVTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCWASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTPWTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAISNSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSYSTPPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPPTFGGGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNSYPPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPITIGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPWTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHSTPQTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSTPWTFGQGTKLEIK、EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGNSLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYGSSPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISGYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHSTPLTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYTYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANGFPLTFGGGTKVEIK和DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
VH-VL组合
对A*02:01_AIFPGAVPAA具有特异性的ABP可包含特定VH序列和特定VL序列。在一些实施方案中，对A*02:01_AIFPGAVPAA具有特异性的ABP可包含来自scFv的VH序列和VL序列，所述scFv被命名为G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01或G8-P2C11。表6中显示了特异性结合A*02:01_AIFPGAVPAA的已鉴定的scFv的VH和VL序列。为了清楚起见，为每个已鉴定的scFv命中命名克隆名称，并且每行包含该特定克隆名称的VH和VL序列。例如，由克隆名称G8-P1A03鉴定的scFv包含VH序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSRSAITWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGATNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDDYGDYVAYFQHWGQGTLVTVSS和VL序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSITSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNYNSVTFGQGTKLEIK。
对A＊01:01_ASSLPTTMNY(HLA-肽靶标“G10”)具有特异性的抗体
在一些方面，本文提供了包含特异性结合HLA-肽靶标的抗体或其抗原结合片段的ABP，其中所述HLA-肽靶标的HLA I类分子是HLA亚型A*01:01，并且所述HLA-肽靶标的HLA-限制性肽包含序列ASSLPTTMNY(“G10”)、由其组成或基本上由其)组成。
CDR
对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的ABP可包含一个或多个抗体互补决定区(CDR)序列，例如可包含3个重链CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和3个轻链CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。
对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的ABP可包含CDR-H3序列。所述CDR-H3序列可选自CARDQDTIFGVVITWFDPW、CARDKVYGDGFDPW、CAREDDSMDVW、CARDSSGLDPW、CARGVGNLDYW、CARDAHQYYDFWSGYYSGTYYYGMDVW、CAREQWPSYWYFDLW、CARDRGYSYGYFDYW、CARGSGDPNYYYYYGLDVW、CARDTGDHFDYW、CARAENGMDVW、CARDPGGYMDVW、CARDGDAFDIW、CARDMGDAFDIW、CAREEDGMDVW、CARDTGDHFDYW、CARGEYSSGFFFVGWFDLW和CARETGDDAFDIW。
对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的ABP可包含CDR-L3序列。所述CDR-L3序列可选自CQQYFTTPYTF、CQQAEAFPYTF、CQQSYSTPITF、CQQSYIIPYTF、CHQTYSTPLTF、CQQAYSFPWTF、CQQGYSTPLTF、CQQANSFPRTF、CQQANSLPYTF、CQQSYSTPFTF、CQQSYSTPFTF、CQQSYGVPTF、CQQSYSTPLTF、CQQSYSTPLTF、CQQYYSYPWTF、CQQSYSTPFTF、CMQTLKTPLSF和CQQSYSTPLTF。
对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的ABP可包含特定重链CDR3(CDR-H3)序列和特定轻链CDR3(CDR-L3)序列。在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的CDR-H3和CDR-L3，所述scFv被命名为R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08或R3G10-P5C08。表9中显示了特异性结合A*01:01_ASSLPTTMNY的已鉴定的scFv的CDR序列。为了清楚起见，为每个已鉴定的scFv命中命名克隆名称，并且每行包含该特定克隆名称的CDR序列。例如，由克隆名称R3G10-P1A07鉴定的scFv包含重链CDR3序列CARDQDTIFGVVITWFDPW和轻链CDR3序列CQQYFTTPYTF。
对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的ABP可包含来自scFv的所有6个CDR，所述scFv被命名为R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08或R3G10-P5C08。
VH
对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的ABP可包含VH序列。所述VH序列可选自EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGISARSGRTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDQDTIFGVVITWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIHPGGGTTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDKVYGDGFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDDSMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFIGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDSSGLDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVGNLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGVTFSTSAISWVRQAPGQGLEWMGWISPYNGNTDYAQMLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDAHQYYDFWSGYYSGTYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSNSIINWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREQWPSYWYFDLWGRGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSTHDINWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSAIYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDRGYSYGYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGNTFIGYYVHWVRQAPGQGLEWVGIINPNGGSISYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSGDPNYYYYYGLDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLSYYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTGTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGDHFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIGPSDGSTTYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAENGMDVWGQGTTVTVSS,QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYVHWVRQAPGQGLEWMGIIAPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGGYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYLHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGDAFDIWGQGTMVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGRISPSDGSTTYAPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDMGDAFDIWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEDGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLSYYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTGTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGDHFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNNFAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDATNYAQKFQGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGEYSSGFFFVGWFDLWGRGTQVTVSS和QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYNFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIAPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARETGDDAFDIWGQGTMVTVSS。
VL
对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的ABP可包含VL序列。所述VL序列可选自DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYFTTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIFDASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAEAFPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPITFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYIIPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQTYSTPLTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYSFPWTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYSTPLTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISRYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPRTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSLPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASKLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYGVPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPWTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQTLKTPLSFGGGTKVEIK和DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
VH-VL组合
对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的ABP可包含特定VH序列和特定VL序列。在一些实施方案中，对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的ABP包含来自scFv的VH序列和VL序列，所述scFv被命名为R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08或R3G10-P5C08。表8中显示了特异性结合A*01:01_ASSLPTTMNY的已鉴定的scFv的VH和VL序列。为了清楚起见，为每个已鉴定的scFv命中命名克隆名称，并且每行包含该特定克隆名称的VH和VL序列。例如，由克隆名称R3G10-P1A07鉴定的scFv包含VH序列EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGISARSGRTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDQDTIFGVVITWFDPWGQGTLVTVSS和VL序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYFTTPYTFGQGTKLEIK。
对A＊02:01_LLASSILCA(G7)具有特异性的抗体
在一些方面，本文提供了包含特异性结合HLA-肽靶标的抗体或其抗原结合片段的ABP，其中所述HLA-肽靶标的HLA I类分子是HLA亚型A*02:01，并且HLA-肽靶标的HLA-限制性肽包含序列LLASSILCA(“G7”)、由所述序列组成或基本由所述组成。
G7特异性抗体的序列
如进一步详细描述的，对A*02:01_LLASSILCA具有特异性的ABP可包含一个或多个序列。
CDR
对A*02:01_LLASSILCA具有特异性的ABP可包含一个或多个抗体互补决定区(CDR)序列，例如，可包含三个重链CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。
对A*02:01_LLASSILCA具有特异性的ABP可包含CDR-H3序列。所述CDR-H3序列可选自CARDGYDFWSGYTSDDYW、CASDYGDYR、CARDLMTTVVTPGDYGMDVW、CARQDGGAFAFDIW、CARELGYYYGMDVW、CARALIFGVPLLPYGMDVW、CAKDLATVGEPYYYYGMDVW和CARLWFGELHYYYYYGMDVW。
对A*02:01_LLASSILCA具有特异性的ABP可包含CDR-L3序列。所述CDR-L3序列可选自CHHYGRSHTF、CQQANAFPPTF、CQQYYSIPLTF、CQQSYSTPPTF、CQQSYSFPYTF、CMQALQTPLTF、CQQGNTFPLTF和CMQGSHWPPSF。
对A*02:01_LLASSILCA具有特异性的ABP可包含特定重链CDR3(CDR-H3)序列和特定轻链CDR3(CDR-L3)序列。在一些实施方案中，所述ABP包含来自scFv的CDR-H3和CDR-L3，所述scFv被命名为G7R3-P1C6、G7R3-P1G10、1-G7R3-P1B4、2-G7R4-P2C2、3-G7R4-P1A3、4-G7R4-B5-P2E9、5-G7R4-B10-P1F8或B7(G7R3-P3A9)。表36中显示了特异性结合A*02:01_LLASSILCA的已鉴定的scFv的CDR序列。为了清楚起见，为每个已鉴定的scFv命中命名克隆名称，并且每行包含该特定克隆名称的CDR序列。例如，由克隆名称G7R3-P1C6鉴定的scFv包含重链CDR3序列CARDGYDFWSGYTSDDYW和轻链CDR3序列CHHYGRSHTF。
对A*02:01_LLASSILCA具有特异性的ABP可包含来自scFv的所有六个CDR，所述scFv被命名为G7R3-P1C6、G7R3-P1G10、1-G7R3-P1B4、2-G7R4-P2C2、3-G7R4-P1A3、4-G7R4-B5-P2E9、5-G7R4-B10-P1F8或B7(G7R3-P3A9)。
VL
对*02:01_LLASSILCA具有特异性的ABP可包含VL序列。所述VL序列可选自EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCHHYGRSHTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANAFPPTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVFYSSNNKNQLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSIPLTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIFKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPYTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCSSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASNLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTFPLTFGQGTKVEIK和DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGSHWPPSFGQGTRLEIK。
VH
对*02:01_LLASSILCA具有特异性的ABP可包含VH序列。VH序列可选自QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSNYGISWVRQAPGQGLEWMGIINPGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYDFWSGYTSDDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASDYGDYRGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNYYIHWVRQAPGQGLEWMGWLNPNSGNTGYAQRFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDLMTTVVTPGDYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASMKVSCKASGYTFTTDGISWVRQAPGQGLEWMGRIYPHSGYTEYAKKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARQDGGAFAFDIWGQGTMVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSQYMHWVRQAPGQGLEWMGWISPNNGDTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARELGYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASRYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGRIIPMLNIANYAPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARALIFGVPLLPYGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSWMHWVRQAPGKGLEWVSFISTSSGYIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLATVGEPYYYYGMDVWGQGTTVTVSS和QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDTFNTYALSWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNAGYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLWFGELHYYYYYGMDVWGQGTMVTVSS。
VH-VL组合
对A*02:01_LLASSILCA具有特异性的ABP可包含特定的VH序列和特定的VL序列。在一些实施方案中，对A*02:01_LLASSILCA具有特异性的ABP包含来自scFv的VH序列和VL序列，所述scFv被命名为G7R3-P1C6、G7R3-P1G10、1-G7R3-P1B4、2-G7R4-P2C2、3-G7R4-P1A3、4-G7R4-B5-P2E9、5-G7R4-B10-P1F8或B7(G7R3-P3A9)的。表35中显示了特异性结合A*02:01_LLASSILCA的已鉴定的scFv的VH和VL序列。为了清楚起见，为每个鉴定的scFv命中命名克隆名称，并且每行包含该特定克隆名称的VH和VL序列。例如，由克隆名称G7R3-P1C6鉴定的scFv包含VH序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSNYGISWVRQAPGQGLEWMGIINPGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYDFWSGYTSDDYWGQGTLVTVSS和VL序列EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCHHYGRSHTFGQGTKVEIK。
对A＊01:01_NTDNNLAVY(G2)具有特异性的抗体
在一些方面，本文提供了包含特异性结合HLA-肽靶标的抗体或其抗原结合片段的ABP，其中所述HLA-肽靶标的HLA I类分子是HLA亚型A*01:01，并且所述HLA-肽靶标的HLA-限制性肽包含序列NTDNNLAVY(“G2”)、由所述序列组成或基本由所述序列组成。
G2特异性抗体的序列
如进一步详细描述的，对A*01:01_NTDNNLAVY具有特异性的ABP可包含一种或多种序列。
CDR
对A*01:01_NTDNNLAVY具有特异性的ABP可包含一个或多个抗体互补决定区(CDR)序列，例如，可包含三个重链CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和三个轻链CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。
对A*01:01_NTDNNLAVY具有特异性的ABP可包含CDR-H3序列。CDR-H3序列可选自CAATEWLGVW、CARANWLDYW、CARANWLDYW、CARDWVLDYW、CARGEWLDYW、CARGWELGYW、CARDFVGYDDW、CARDYGDLDYW、CARGSYGMDVW、CARDGYSGLDVW、CARDSGVGMDVW、CARDGVAVASDYW、CARGVNVDDFDYW、CARGDYTGNWYFDLW、CARANWLDYW、CARDQFYGGNSGGHDYW、CAREEDYW、CARGDWFDPW、CARGDWFDPW、CARGEWFDPW、CARSDWFDPW、CARDSGSYFDYW、CARDYGGYVDYW、CAREGPAALDVW、CARERRSGMDVW、CARVLQEGMDVW、CASERELPFDIW、CAKGGGGYGMDVW、CAAMGIAVAGGMDVW、CARNWNLDYW、CATYDDGMDVW、CARGGGGALDYW、CALSGNYYGMDVW、CARGNPWELRLDYW和CARDKNYYGMDVW。
对A*01:01_NTDNNLAVY具有特异性的ABP可包含CDR-L3序列。CDR-L3序列可选自CQQSYNTPYTF、CQQSYSTPYTF、CQQSYSTPYSF、CQQSYSTPFTF、CQQSYGVPYTF、CQQSYSAPYTF、CQQSYSAPYTF、CQQSYSAPYSF、CQQSYSTPYTF、CQQSYSVPYSF、CQQSYSAPYTF、CQQSYSVPYSF、CQQSYSTPQTF、CQQLDSYPFTF、CQQSYSSPYTF、CQQSYSTPLTF、CQQSYSTPYSF、CQQSYSTPYTF、CQQSYSTPYTF、CQQSYSTPFTF、CQQSYSTPTF、CQQTYAIPLTF、CQQSYSTPYTF、CQQSYIAPFTF、CQQSYSIPLTF、CQQSYSNPTF、CQQSYSTPYSF、CQQSYSDQWTF、CQQSYLPPYSF、CQQSYSSPYTF、CQQSYTTPWTF、CQQSYLPPYSF、CQEGITYTF、CQQYYSYPFTF和CQHYGYSPVTF。
对A*01:01_NTDNNLAVY具有特异性的ABP可包含特定的重链CDR3(CDR-H3)序列和特定的轻链CDR3(CDR-L3)序列。在一些实施方案中，ABP包含来自scFv的CDR-H3和CDR-L3，所述scFv被命名为G2-P2E07、G2-P2E03、G2-P2A11、G2-P2C06、G2-P1G01、G2-P1C02、G2-P1H01、G2-P1B12、G2-P1B06、G2-P2H10、G2-P1H10、G2-P2C11、G2-P1C09、G2-P1A10、G2-P1B10、G2-P1D07、G2-P1E05、G2-P1D03、G2-P1G12、G2-P2H11、G2-P1C03、G2-P1G07、G2-P1F12、G2-P1G03、G2-P2B08、G2-P2A10、G2-P2D04、G2-P1C06、G2-P2A09、G2-P1B08、G2-P1E03、G2-P2A03、G2-P2F01、G2-P1H11或G2-P1D06。特异性结合A*01:01_NTDNNLAVY的已鉴定的scFv的CDR序列见表34中。为了清楚起见，为每个已鉴定的scFv命中命名克隆名称，并且每行包含该特定克隆名称的CDR序列。例如，由克隆名称G2-P2E07鉴定的scFv包含重链CDR3序列CAATEWLGVW和轻链CDR3序列CQQSYNTPYTF。
对A*01:01_NTDNNLAVY具有特异性的ABP可包含来自scFv的所有6个CDR，所述scFv被命名为G2-P2E07、G2-P2E03、G2-P2A11、G2-P2C06、G2-P1G01、G2-P1C02、G2-P1H01、G2-P1B12、G2-P1B06、G2-P2H10、G2-P1H10、G2-P2C11、G2-P1C09、G2-P1A10、G2-P1B10、G2-P1D07、G2-P1E05、G2-P1D03、G2-P1G12、G2-P2H11、G2-P1C03、G2-P1G07、G2-P1F12、G2-P1G03、G2-P2B08、G2-P2A10、G2-P2D04、G2-P1C06、G2-P2A09、G2-P1B08、G2-P1E03、G2-P2A03、G2-P2F01、G2-P1H11或G2-P1D06。
VL
对A*01:01_NTDNNLAVY具有特异性的ABP包含VL序列。所述VL序列可选自DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTVQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYGVPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVGNWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIGNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSVPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISKWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSVPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIGRAVGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLDSYPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSSPYTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYSFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFAQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYAIPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYIAPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGVSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSNPTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWVAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSDQWTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYLPPYSFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTYFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSSPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPWTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYLPPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQEGITYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPFTFGPGTKVDIK和EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSRNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQHYGYSPVTFGQGTKLEIK。
VH
对A*01:01_NTDNNLAVY具有特异性的ABP可包含VH序列。所述VH序列可选自QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSATISWVRQAPGQGLEWMGWIYPNSGGTVYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAATEWLGVWGQGTTVTVSS、EVQLLQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTISAPNFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARANWLDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYDLAWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARANWLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYSFDSYVVNWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDWVLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGEWLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGWELGYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTINWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDFVGYDDWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGITWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDYGDLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSNYILSWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTRYNMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSGLDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWINPNNGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDSGVGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFNNYAFSWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGVAVASDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSSYNMHWVRQAPGQGLEWMGWINGNTGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVNVDDFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAFSWVRQAPGQGLEWMGWINPDTGYTRYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYTGNWYFDLWGRGTLVTVSS、EVQLLESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARANWLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGYTNYAQNLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDQFYGGNSGGHDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTINWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGANYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYLMHWVRQAPGQGLEWMGWISPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSDYYVHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGEWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSDWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSNYAINWVRQAPGQGLEWMGWISPYSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDSGSYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIYPNTGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDYGGYVDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGPAALDVWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSHLIHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARERRSGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYIVHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVLQEGMDVWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNFLINWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASERELPFDIWGQGTMVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYQMFWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGGGGYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAAMGIAVAGGMDVWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYHMHWVRQAPGQGLEWMGWIHPDSGGTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARNWNLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCATYDDGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTVNWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTKYAQNFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGGALDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGMINPRDDTTDYARDFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCALSGNYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGMINPSGGGTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGNPWELRLDYWGQGTLVTVSS和QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSQYMHWVRQAPGQGLEWMGRIIPLLGIVNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDKNYYGMDVWGQGTTVTVSS。
VH-VL组合
对A*01:01_NTDNNLAVY具有特异性的ABP包含特定VH序列和特定VL序列。在一些实施方案中，对A*01:01_NTDNNLAVY具有特异性的ABP包含来自scFv的VH序列和VL序列，所述scFv被命名为G2-P2E07、G2-P2E03、G2-P2A11、G2-P2C06、G2-P1G01、G2-P1C02、G2-P1H01、G2-P1B12、G2-P1B06、G2-P2H10、G2-P1H10、G2-P2C11、G2-P1C09、G2-P1A10、G2-P1B10、G2-P1D07、G2-P1E05、G2-P1D03、G2-P1G12、G2-P2H11、G2-P1C03、G2-P1G07、G2-P1F12、G2-P1G03、G2-P2B08、G2-P2A10、G2-P2D04、G2-P1C06、G2-P2A09、G2-P1B08、G2-P1E03、G2-P2A03、G2-P2F01、G2-P1H11或G2-P1D06。特异性结合A*01:01_NTDNNLAVY的已鉴定的scFv的VH和VL序列见于表33。为了清楚起见，为每个已鉴定的scFv命中命名克隆名称，并且每行包含该特定克隆名称的CDR序列。例如，由克隆名G2-P2E07鉴定的scFv包含VH序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSATISWVRQAPGQGLEWMGWIYPNSGGTVYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAATEWLGVWGQGTTVTVSSAS和VL序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTPYTFGQGTKLEIK。
受体
在提供的ABP中，例如HLA-肽ABP是受体。受体可以包括特异性结合本文所公开的HLA-肽靶标的抗原受体和其它嵌合受体。受体可为T细胞受体(TCR)。受体可为嵌合抗原受体(CAR)。
TCR可以是可溶的或膜结合的。抗原受体中有功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。还提供了表达受体的细胞和其在过继细胞疗法中的用途，所述过继细胞疗法如治疗与HLA-肽表达相关的疾病和病症，包括癌症。
示例性抗原受体(包括CAR)和将此类受体工程改造并引入细胞的方法包括在以下文献中描述的那些：例如，国际专利申请公开第WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061号；美国专利申请公开第US2002131960、US2013287748、US20130149337号；美国专利第6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118号；以及欧洲专利申请第EP2537416号，和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人，Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人，Curr.Opin.Immunol.，2012年10月；24(5):633-39；Wu等人，Cancer,2012年3月18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括美国专利第7,446,190号中描述的CAR，和国际专利申请公开第WO/2014055668A1号中描述的那些CAR。示例性CAR包括任一上述出版物中描述的CAR，如WO2014031687、美国专利第8,339,645号、美国专利第7,446,179号、US2013/0149337、美国专利第7,446,190号、美国专利第8,389,282号等，其中抗原结合部分(例如，scFv)被抗体(例如，本文提供的抗体)替代。
嵌合受体中有嵌合抗原受体(CAR)。嵌合受体，如CAR，一般包括胞外抗原结合结构域，其包括所提供的抗HLA-肽ABP(如抗-HLA-肽抗体)中的一种，为所提供的抗HLA-肽ABP(如抗-HLA-肽抗体)中的一种，或包含在所提供的抗HLA-肽ABP(如抗-HLA-肽抗体)中的一种中。因此，嵌合受体(例如，CAR)的胞外部分通常包含一个或多个HLA-肽-ABP，如一个或多个抗原结合片段、结构域或部分，或一个或多个抗体可变结构域，和/或抗体分子(如本文所述的那些)。在一些实施方案中，CAR包含HLA-肽-结合部分或ABP(例如，抗体)分子的部分，如抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如，scFv抗体片段。
TCR
在一方面，本文提供的ABP，例如特异性结合本文所公开的HLA-肽靶标的ABP，包含T细胞受体(TCR)。TCR可被分离和纯化。
在大多数T细胞中，TCR是具有分别由TRA和TRB编码的阿尔法(α)链和贝塔(β)链的异二聚体多肽。α链通常包含由TRAV编码的α可变区，由TRAJ编码的α连接区以及由TRAC编码的α恒定区。β链通常包含由TRBV编码的β可变区，由TRBD编码的β多样性区，由TRBJ编码的β连接区以及由TRBC编码的β恒定区。TCR-α链是通过VJ重组生成的，而β链受体是通过V(D)J重组生成的。TCR的另外的多样性源于连接多样性。在每个连接处均可缺失几个碱基并添加几个碱基(称为N和P核苷酸)。在大多数T细胞中，TCR包含γ链和δ链。TCRγ链是通过VJ重组产生的，而TCRδ链是通过V(D)J重组产生的(Kenneth Murphy,Paul Travers,and MarkWalport,Janeway's Immunology第7版，Garland Science,2007，其通过引用整体并入本文))。TCR的抗原结合位点通常包含六个互补决定区(CDR)。α链贡献三个CDR：αCDR1、αCDR2以及αCDR3。β链也提供三个CDR：βCDR1、βCDR2以及βCDR3。αCDR3和βCDR3是受V(D)J重组影响最大的区域，是TCR库中大多数变化的原因。
TCR可以特异性地识别HLA-肽靶标，如表A、表A1或表A2中公开的HLA-肽靶标；因此，TCR可以是特异性地结合HLA-肽的ABP。TCR可以是可溶的，例如类似于B细胞分泌的抗体。TCR也可以是膜结合的，例如结合到如T细胞或天然杀伤(NK)细胞的细胞上。因此，可以在对应于可溶性抗体和/或膜结合CAR的背景下使用TCR。
本文所公开的任何TCR均可包含α可变区、α连接区、任选地α恒定区、β可变区、任选地β多样性区、β连接区以及任选地β恒定区。
在一些实施方案中，TCR或CAR是重组TCR或CAR。重组TCR或CAR可包含本文鉴定的任何TCR，但是包含一个或多个修饰。本文描述了示例性修饰，例如氨基酸取代。本文所述的氨基酸取代可参考IMGT命名法和www.imgt.org网站上的氨基酸编号进行。
重组TCR或CAR可以是人TCR或CAR，其包含完整的人序列，例如天然人序列。重组TCR或CAR可以保留其天然的人可变结构域序列，但含有对α恒定区、β恒定区或α和β恒定区两者的修饰。对TCR恒定区的这种修饰可通过，例如，驱动外源TCR链的优先配对来改善TCR基因疗法的TCR装配和表达。
在一些实施方案中，通过用整个人恒定区序列代替小鼠恒定区序列来修饰α和β恒定区。这种“鼠源化的”TCR和其制备方法描述于Cancer Res.2006年9月1日；66(17):8878-86，其通过引用整体并入。
在一些实施方案中，通过在人TCRα恒定(TRAC)区、TCRβ恒定(TRBC)区或TRAC和TRAB区中进行一个或多个氨基酸取代，即把人残基换成鼠类残基((人→鼠类氨基酸交换))，从而修饰α和β恒定区。TRAC区中的一个或多个氨基酸取代可包含：在残基90处的Ser取代，在残基91处的Asp取代，在残基92处的Val取代，在残基93处的Pro取代或其任意组合。人TRBC区中的一个或多个氨基酸取代可包含：在残基18处的Lys取代，在残基22处的Ala取代，在残基133处的Ile取代，在残基139处的His取代或上述任意组合。这种靶向氨基酸取代描述于J Immunol 2010年6月1日,184(11)6223-6231其通过引用整体并入。
在一些实施方案中，人TRAC在残基210处含有Asp取代，而人TRBC在残基134处含有Lys取代。这种取代可以促进α链和β链之间的盐桥键的形成和TCR链间二硫键的形成。这些靶向取代描述于J Immunol 2010年6月1日；184(11)6232-6241，其通过引用整体并入。
在一些实施方案中，人TRAC区和人TRBC区被修饰以含有引入的半胱氨酸，其可通过形成另外的二硫键来改善外源TCR链的优先配对。例如，人TRAC可在残基48处含有Cys取代，而人TRBC可在残基57处含有Cys取代，如下述文献所述：《癌症研究》2007年4月15日；67(8):3898-903和《血液(Blood)》2007年3月15；109(6):2331-8；它们通过引用整体并入。
重组TCR或CAR可包含对α链和β链的其它修饰。
在一些实施方案中，通过将α链和β链的胞外结构域连接至完整的人CD3ζ((CD3-zeta))分子来修饰α链和β链。这种修饰描述于以下文献中：JImmunol 2008年6月1日,180(11)7736-7746；Gene Ther.2000年8月；7(16):1369-77；以及The Open Gene TherapyJournal,2011,4:11-22所述文献由此通过引用整体并入)。
在一些实施方案中，通过在α链的跨膜区中引入疏水性氨基酸取代来修饰α链，如JImmunol 2012年6月1日；188(11)5538-5546；Gene Ther.2000年8月；7(16):1369-77；以及The Open Gene Therapy Journal,2011,4:11-22(所述文献由此通过引用整体并入)所述。
可通过改变氨基酸序列中的任何一个N-糖基化位点来修饰α链或β链，如J ExpMed.2009年2月16日；206(2):463–475(其由此通过引用整体并入)所述。
α链和β链可各自包含一个二聚化结构域，例如异源二聚化结构域。本领域中已知，这种异源结构域可以是亮氨酸拉链(5H3结构域)或疏水性富含脯氨酸的反向结构域或其它类似的形式。在一个实例中，可通过将30聚体区段引入α和β胞外结构域的羧基末端来修饰α链和β链，其中所述区段选择性地缔合以形成稳定的亮氨酸拉链。这种修饰描述于：PNAS1994年11月22日,1994.91(24)11408-11412；https://doi.org/10.1073/pnas.91.24.11408；其通过引用整体并入。
可将本文中鉴定的TCR修饰为包含导致亲和力或半衰期增加的突变，如WO2012/013913中描述的突变，其通过引用整体并入。
重组TCR或CAR可以是单链TCR(scTCR)。这种scTCR可包含与TCRα链恒定区胞外序列的N末端融合的α链可变区序列，与TCRβ链恒定区胞外序列的N末端融合的TCRβ链可变区，以及连接α区段的C末端与β区段的N末端的接头序列，或者反之亦然。在一些实施方案中，scTCR的α区段和β区段的恒定区胞外序列通过二硫键连接。在一些实施方案中，接头序列的长度和二硫键的位置使得α区段和β区段的可变区序列基本上如天然αβT细胞受体那样相互定向。美国专利第7,569,664号中描述了示例性scTCR，其通过引用整体并入。
在一些情况下，scTCR的可变区可通过短肽接头进行共价连接，如Gene Therapy第7卷，第1369–1377页(2000)中所述。短肽接头可能是富含丝氨酸或富含甘氨酸的接头。例如，接头可以是(Gly4Ser)3，如CancerGene Therapy(2004)11,487–496(其通过引用整体并入)中所述。
重组TCR或其抗原结合片段可以表达为融合蛋白。例如，TCR或其抗原结合片段可与毒素融合。这种融合蛋白描述于Cancer Res.2002年3月15日；62(6):1757-60。TCR或其抗原结合片段可与抗体Fc区融合。此类融合蛋白描述于J Immunol，2017年5月1日，198((1增刊))120.9中。
在一些实施方案中，重组受体如TCR或CAR(如其抗体部分)还包含间隔子，其可以是或包含免疫球蛋白恒定区或其变体或修饰形式的至少一部分，如铰链区，例如IgG4铰链区和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG，如IgG4或IgG1。在一些方面，恒定区的一部分用作抗原识别组分(例如，scFv)和跨膜结构域之间的间隔区。与不存在间隔子的情况相比，间隔子的长度可以在抗原结合后，提供增加的细胞反应性。在一些实例中，间隔子的长度为或约12个氨基酸，或其长度不超过12个氨基酸。示例性的间隔子包含具有至少约10至229个氨基酸，约10至200个氨基酸，约10至175个氨基酸，约10至150个氨基酸，约10至125个氨基酸，约10至100个氨基酸，约10至75个氨基酸，约10至50个氨基酸，约10至40个氨基酸，约10至30个氨基酸，约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸，以及包含所列范围中任一范围的端点之间的任何整数的那些。在一些实施方案中，间隔区具有约12个或更少的氨基酸，约119个或更少的氨基酸或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔子包含单独的IgG4铰链、连接至CH2和CH3结构域的IgG4铰链或连接至CH3结构域的IgG4铰链。示例性间隔子包含但不限于下述文献中所述的那些：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153，或国际专利申请公开第WO2014031687号。在一些实施方案中，恒定区或部分是IgD。
受体(如TCR或CAR)的抗原识别结构域可以与一种或多种胞内信号传导组分连接，如在CAR的情况下，通过抗原受体复合物(如TCR复合物)模拟激活的信号传导组分，和/或通过另一个细胞表面受体的信号。因此，在一些实施方案中，HLA-肽-特异性结合组分(例如ABP，如抗体或TCR)与一个或多个跨膜和胞内信号传导结构域连接。在一些实施方案中，跨膜结构域与胞外结构域融合。在一个实施方案中，使用了与受体(例如，CAR)中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，跨膜结构域是通过氨基酸取代来选择或修饰的，以避免这种结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而使与受体复合物的其它成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域是天然的或合成的。如果是天然来源，则在一些方面，所述结构域源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包含源自T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和/或CD154的跨膜区(即至少包含这些的跨膜区)。替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成的跨膜结构域主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，在合成跨膜结构域的每个末端都有三联体苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸。在一些实施方案中，通过接头、间隔子和/或跨膜结构域进行连接。
胞内信号传导结构域含有模拟或近似于通过天然抗原受体的信号、通过这种受体与共刺激受体组合的信号和/或仅通过共刺激受体的信号的那些。在一些实施方案中，存在短的寡核苷酸或多肽接头，例如长度在2和10个氨基酸之间的接头，如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体，并在跨膜结构域和受体的细胞质信号传导结构域之间形成连接。
所述受体，例如TCR或CAR，可以包含至少一种或多种胞内信号传导组分。在一些实施方案中，受体包含TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，HLA-肽-结合ABP(例如，抗体)连接至一个或多个细胞信号传导模块。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包含CD3跨膜结构域、CD3胞内信号传导结构域和/或其它CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如，CAR)进一步包含一种或多种另外的分子的部分，如Fc受体-γ、CD8、CD4、CD25或CD16。例如，在一些方面，CAR包含在CD3-ζ或Fc受体-γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，一旦TCR或CAR连接后，受体的细胞质结构域或胞内信号传导结构域激活正常效应功能或免疫细胞(例如，表达受体的工程改造的T细胞)应答中的至少一者。例如，在一些情况下，受体诱导T细胞的功能，如溶细胞活性或T辅助活性，如细胞因子或其它因子的分泌。在一些实施方案中，例如，如果抗原受体组分的胞内信号传导结构域转导效应功能信号，则用抗原受体组分的胞内信号传导结构域的截短部分或共刺激分子代替完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，一个或多个胞内信号传导结构域包含T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括在天然环境下与这种受体协同作用以在抗原受体结合后引发信号转导的共受体的那些，和/或这种分子的任何衍生物或变体，和/或具有相同功能的任何合成序列。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅使用通过TCR的信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于产生次级信号或共刺激信号的组分也包含在受体中。在其它实施方案中，受体不包含用于产生共刺激信号的组分。在一些方面，另外的受体在同一细胞中表达，并提供用于产生次级信号或共刺激信号的组分。
在一些方面，T细胞激活被描述为由两类胞质信号传导序列介导：通过TCR(主要胞质信号传导序列)引发抗原依赖性初级激活的那些，和以抗原非依赖方式起作用来提供次级信号或共刺激信号(次级胞质信号传导序列)的那些。在一些方面，受体包含这种信号传导组分中的一个或两个。
在一些方面，受体包含调节TCR复合物的初级激活的主要胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的主要胞质信号传导序列可能含有信号传导基序，这些基序被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。含ITAM的主要胞质信号传导序列的实例包含衍生自TCR或CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的序列。在一些实施方案中，CAR中的胞质信号传导分子含有胞质信号传导结构域、其部分或源自CD3ζ的序列。
在一些实施方案中，受体包含共刺激受体的信号传导结构域和/或跨膜部分，如CD28、4-1BB、OX40、DAP10以及ICOS。在一些方面，同一受体既包含激活组分，又包含共刺激组分。
在一些实施方案中，激活结构域包含在一个受体内，而共刺激组分由识别另一种抗原的另一种受体提供。在一些实施方案中，受体包含均在同一细胞上表达的激活或刺激受体和共刺激受体(参见WO2014/055668)。在一些方面，靶向HLA-肽的受体是刺激受体或激活受体。在其它方面，它是共刺激受体。在一些实施方案中，细胞还包含抑制性受体(例如，iCAR，参见Fedorov等人，Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月))，如识别除HLA-肽以外的抗原的受体，从而通过抑制性受体与其配体的结合来减少或抑制经靶向HLA-肽的受体传递的激活信号，例如，以减少脱靶标效应。
在某些实施方案中，胞内信号传导结构域包括连接至CD3(例如，CD3-ζ)胞内结构域的CD28跨膜结构域和信号传导结构域。在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包括连接至CD3ζ胞内结构域的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，受体含一个或多个，例如两个或更多个，共刺激结构域和胞质部分中的激活结构域，例如，主要激活结构域。示例性受体包含CD3-ζ、CD28和4-1BB的胞内组分。
在一些实施方案中，CAR或其它抗原受体，如TCR，还包含标记物，如细胞表面标记物，其可用于确认细胞的转导或工程改造以表达受体，如细胞表面受体的截短形式，如截短的EGFR(tEGFR)。在一些方面，标记物包含CD34、神经生长因子受体(NGFR)或表皮生长因子受体(例如，tEGFR)的全部或部分(例如，截短形式)。在一些实施方案中，编码标记物的核酸与编码接头序列(如可裂解的接头序列或核糖体跳跃序列，如T2A)的多核苷酸可操作地连接。参见WO2014031687。在一些实施方案中，编码被T2A核糖体开关隔开的CAR和EGFRt的构建体的引入可以表达来自同一构建体的两种蛋白质，使得EGFRt可用作检测表达这种构建体的细胞的标记物。在一些实施方案中，标记和任选的连接序列可以是专利申请公开第WO2014031687号中公开的任何序列。例如，标记物可以是截短的EGFR((tEGFR))，其任选地连接至连接序列，如T2A核糖体跳跃序列。
在一些实施方案中，标记物是分子，例如细胞表面蛋白，并非是天然存在于T细胞上或天然存在于T细胞或其部分上。
在一些实施方案中，分子是非自身分子，例如非自身蛋白，即细胞过继转移至其中的宿主的免疫系统不识别为“自身”的分子。
在一些实施方案中，除了用作基因工程(例如，用于选择成功工程改造的细胞)的标记物外，标记物不具有治疗功能和/或不产生作用。在其它实施方案中，标记物可以是治疗分子或以其它方式发挥某些所需作用的分子，如体内所遇细胞的配体，如共刺激或免疫检查点分子，从而在细胞过继转移和遇到配体时增强和/或减弱细胞的应答。
TCR或CAR可以包含一种或修饰的合成氨基酸来代替一种或多种天然存在的氨基酸。示例性的修饰氨基酸包含但不限于：氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨甲基半胱氨酸、反式3-和反式4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯基丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、((3-苯基丝氨酸((3-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N'-苄基-N'-甲基赖氨酸、N,'N'-二苄基赖氨酸、6-羟基赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降冰片烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,γ-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合后仅提供CD3-链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供信号和共刺激信号的CAR，如包含来自共刺激受体(如CD28或CD137)的胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是包含不同共刺激受体的多个共刺激域的CAR。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含胞外部分，胞外部分含有本文所述的抗体或片段。在一些方面，嵌合抗原受体包含胞外部分和胞内信号传导结构域，其中胞外部分含有本文所述的抗体或片段。在一些实施方案中，抗体或片段包含scFv或单结构域VH抗体，并且胞内结构域含有ITAM。在一些方面，胞内信号传导结构域包含CD3的ζ链，即ζ(CD3)链，的信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包含连接胞外结构域和胞内信号传导结构域的跨膜结构域。
在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，胞外结构域和跨膜通过间隔子连接，如本文所述的任何间隔子。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的胞内结构域，如跨膜结构域和胞内信号传导结构域之间的胞内结构域。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域，以及含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域，以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的胞内信号传导结构域。在一些所述实施方案中，受体还包含间隔子，其含有Ig分子(如人Ig分子)的部分，如Ig铰链，例如IgG4铰链，如仅铰链间隔子。
在一些实施方案中，受体(例，如CAR)的跨膜结构域是人CD28或其变体的跨膜结构域，例如，人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸大小的跨膜结构域。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的胞内结构域。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包括人CD28或其功能变体或其部分的胞内共刺激信号传导结构域，如其41个氨基酸大小的结构域和/或在天然CD28蛋白的186-187位上具有LL至GG取代的结构域。在一些实施方案中，胞内结构域包括41BB的胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如人4-1BB(登录号：Q07011.1)的42个氨基酸大小的胞质结构域或其功能变体或部分。
在一些实施方案中，胞内信号传导结构域包括人CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的同种型3的112AA胞质结构域，或者美国专利第7,446,190号或美国专利第8,911,993号中描述的CD3ζ信号传导结构域。
在一些方面，间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链。在其它实施方案中，间隔子是连接至CH2和/或CH3结构域的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是仅连接至CH3结构域的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是或包含富含甘氨酸-丝氨酸的序列或其它柔性接头，如已知的柔性接头。
例如，在一些实施方案中，CAR包含抗体或其片段，如任何HLA-肽抗体，包含单链抗体(sdAb((,例如，仅包含VH区))和本文所述的scFv；间隔子，如含有间隔子的任何Ig-铰链；CD28跨膜结构域；CD28胞内信号传导结构域；以及CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包含抗体或片段，如任何HLA-肽抗体，包含sdAb和本文所述的scFv；间隔子，如含有间隔子的任何Ig-铰链；CD28跨膜结构域；CD28胞内信号传导结构域；以及CD3ζ信号传导结构域。
针对A＊01:01_ASSLPTTMNY[G10]的靶特异性TCR
在一些方面，本文提供了ABP，其包含特异性地结合HLA-肽靶标的TCR或其抗原结合片段，其中所述HLA-肽靶标的HLA I类分子是HLA亚型A*01:01，并且HLA-肽靶标的HLA-限制性肽包含序列ASSLPTTMNY(“G10”)。
对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的TCR可包含αCDR3序列。所述αCDR3序列可以是表15中的任一个αCDR3序列。参考2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793，其据此通过引用以其整体并入。表15中显示了已鉴定的TCR克隆型的α和βCDR3序列。
对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的TCR可包含βCDR3序列。所述βCDR3序列可以是表15中的任一个βCDR3序列。参考2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793，其据此通过引用以其整体并入。
对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的TCR可包含特定αCDR3序列和特定βCDR3序列。例如，对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的TCR可包含来自表15中已鉴定的任一个TCR的αCDR3序列和βCDR3序列。参考2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793，其据此通过引用以其整体并入。
对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的TCR可包含TRAV、TRAJ、TRBV、任选的TRBD和TRBJ氨基酸序列、任选的TRAC序列和任选的TRBC序列。例如，对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的TCR可包含来自表14中已鉴定的任一个TCR的TRAV、TRAJ、TRBV、TRBD、TRBJ氨基酸序列、TRAC序列和TRBC序列。参考2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793，其据此通过引用以其整体并入。为了清楚起见，每个已鉴定的TCR被赋予TCR ID号。例如，赋予TCR的TCR ID#1包含TRAV25序列、TRAJ37序列、TRAC序列、TRBV19序列、TRBD1序列、TRBJ1-5序列和TRBC1序列。
对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的TCR可包含αVJ序列。所述αVJ序列可以是表16中的任何一个αVJ序列。参考2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793，其据此通过引用以其整体并入。
对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的TCR可包含βV(D)J序列。所述βV(D)J序列可以是表16中的任一个βV(D)J序列。参考2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793，其据此通过引用以其整体并入。
对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的TCR可包含αVJ序列和βV(D)J序列。例如，对A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的TCR可包含来自表16中已鉴定的任一个TCR的αVJ序列和βV(D)J序列。参考2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793，其据此通过引用以其整体并入。表16显示了已鉴定的TCR克隆型的全长αV(J)和βV(D)J序列。参考2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793，其据此通过引用以其整体并入。。
针对A＊01:01_HSEVGLPVY的靶特异性TCR
在一些方面，本文提供了包含特异性结合HLA-肽靶标的TCR或其抗原结合片段的ABP，其中所述HLA-肽靶标的HLA I类分子是HLA亚型A*01:01，并且所述HLA-肽靶标的HLA-限制性肽包含序列HSEVGLPVY。
对A*01:01_HSEVGLPVY具有特异性的TCR可包含αCDR3序列。所述αCDR3序列可以是表18中的任一个αCDR3序列。参考2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793，其据此通过引用以其整体并入。表18中显示了已鉴定的TCR克隆型的α和βCDR3序列。
对A*01:01_HSEVGLPVY具有特异性的TCR可包含βCDR3序列。所述βCDR3序列可以是表18中的任一个βCDR3序列。参考2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793，其据此通过引用以其整体并入。
对A*01:01_HSEVGLPVY具有特异性的TCR可包含特定αCDR3序列和特定βCDR3序列。例如，对A*01:01_HSEVGLPVY具有特异性的TCR可包含来自表18中已鉴定的任一个TCR的αCDR3序列和βCDR3序列。参考2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793，其据此通过引用以其整体并入。
对A*01:01_HSEVGLPVY具有特异性的TCR可包含TRAV、TRAJ、TRBV、任选的TRBD和TRBJ氨基酸序列、任选的TRAC序列和任选的TRBC序列。例如，对A*01:01_HSEVGLPVY具有特异性的TCR可包含来自表17中鉴定的任一TCR的TRAV、TRAJ、TRBV、TRBD、TRBJ氨基酸序列、TRAC序列和TRBC序列。参考2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793，其据此通过引用以其整体并入。
对A*01:01_HSEVGLPVY具有特异性的TCR可包含αVJ序列。所述αVJ序列可以是表19中的任何一个αVJ序列。参考2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793，其据此通过引用以其整体并入。
对A*01:01_HSEVGLPVY具有特异性的TCR可包含βV(D)J序列。所述βV(D)J序列可以是表19中的任一个βV(D)J序列。参考2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793，其据此通过引用以其整体并入。
对A*01:01_HSEVGLPVY具有特异性的TCR可包含αVJ序列和βV(D)J序列。例如，对A*01:01_HSEVGLPVY具有特异性的TCR可包含来自表19中已鉴定的任一个TCR的αVJ序列和βV(D)J序列。参考2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793，其据此通过引用以其整体并入。
针对A＊02:01__LLASSILCA[G7]的靶特异性TCR
在一些方面，本文提供了包含特异性结合HLA-肽靶标的TCR或其抗原结合片段的ABP，其中所述HLA-肽靶标的HLA I类分子是HLA亚型A*02:01，并且所述HLA-肽靶标的HLA-限制性肽包含序列LLASSILCA。
对A*02:01__LLASSILCA具有特异性的TCR可包含αCDR3序列。参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的SEQ ID NO:4277、4278、4279、4280或4281，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*02:01__LLASSILCA具有特异性的TCR可包含βCDR3序列。参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的SEQ ID NOS 4291-4295，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*02:01__LLASSILCA具有特异性的TCR可包含特定αCDR3序列和特定βCDR3序列。对于αCDR3和βCDR3序列的特定组合，参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*02:01__LLASSILCA具有特异性的TCR可包含TRAV、TRAJ、TRBV、任选的TRBD和TRBJ氨基酸序列、任选的TRAC序列和任选的TRBC序列。对于TRAV、TRAJ、TRBV、任选的TRBD、TRBJ氨基酸序列、任选的TRAC序列和任选的TRBC序列的特定组合，参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*02:01__LLASSILCA具有特异性的TCR可包含αVJ序列。参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的SEQ ID NOS 4306-4310，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*02:01__LLASSILCA具有特异性的TCR可包含βV(D)J序列。参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的SEQ ID NOS 4321-4325，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*02:01__LLASSILCA特异的TCR可包含αVJ序列和βV(D)J序列。对于αVJ和βV(D)J序列的特定组合，参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997，所述申请通过引用以其整体并入。
针对A＊01:01_EVDPIGHLY的靶特异性TCR
在一些方面，本文提供了包含特异性结合HLA-肽靶标的TCR或其抗原结合片段的ABP，其中所述HLA-肽靶标的HLA I类分子是HLA亚型A*01:01，并且所述HLA-肽靶标的HLA-限制性肽包含序列EVDPIGHLY。
对A*01:01_EVDPIGHLY具有特异性的TCR可包含αCDR3序列。参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的SEQ ID NOS 3052-3350或4273-4276，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*01:01_EVDPIGHLY具有特异性的TCR可包含βCDR3序列。参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的SEQ ID NOS3351-3655或4287-4290，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*01:01_EVDPIGHLY具有特异性的TCR可包含特定αCDR3序列和特定βCDR3序列。对于αCDR3和βCDR3序列的特定组合，参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*01:01_EVDPIGHLY具有特异性的TCR可包含TRAV、TRAJ、TRBV、任选的TRBD和TRBJ氨基酸序列、任选的TRAC序列和任选的TRBC序列。对于TRAV、TRAJ、TRBV、任选的TRBD、TRBJ氨基酸序列、任选的TRAC序列和任选的TRBC序列的特定组合，参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*01:01_EVDPIGHLY具有特异性的TCR可包含αVJ序列。参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的SEQ ID NOS 3656-3961或4302-4305，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*01:01_EVDPIGHLY具有特异性的TCR可包含βV(D)J序列。参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的SEQ ID NOS 3962-4269或4317-4320，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*01:01_EVDPIGHLY具有特异性的TCR可包含αVJ序列和βV(D)J序列。对于αVJ和βV(D)J序列的特定组合，参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997，所述申请通过引用以其整体并入。
针对B＊44:02_GEMSSNSTAL的靶特异性TCR
在一些方面，本文提供了包含特异性结合HLA-肽靶标的TCR或其抗原结合片段的ABP，其中所述HLA-肽靶标的HLA I类分子是HLA亚型B*44:02，并且所述HLA-肽靶标的HLA-限制性肽包含序列GEMSSNSTAL。
对B*44:02_GEMSSNSTAL具有特异性的TCR可包含αCDR3序列。参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的SEQ ID NOS 4284-4286或3138，所述申请通过引用以其整体并入。
对B*44:02_GEMSSNSTAL具有特异性的TCR可包含βCDR3序列。参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的SEQ ID NOS 4298-4301，所述申请通过引用以其整体并入。
对B*44:02_GEMSSNSTAL具有特异性的TCR可包含特定αCDR3序列和特定βCDR3序列。对于αCDR3和βCDR3序列的特定组合，参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997，所述申请通过引用以其整体并入。
对B*44:02_GEMSSNSTAL具有特异性的TCR可包含TRAV、TRAJ、TRBV、任选的TRBD和TRBJ氨基酸序列、任选的TRAC序列和任选的TRBC序列。对于TRAV、TRAJ、TRBV、任选的TRBD、TRBJ氨基酸序列、任选的TRAC序列和任选的TRBC序列的特定组合，参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997，所述申请通过引用以其整体并入。
对B*44:02_GEMSSNSTAL具有特异性的TCR可包含αVJ序列。参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的SEQ ID NOS 4313-4316，所述申请通过引用以其整体并入。
对B*44:02_GEMSSNSTAL具有特异性的TCR可包含βV(D)J序列。参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的SEQ ID NOS 4328-4331，所述申请通过引用以其整体并入。
对B*44:02_GEMSSNSTAL具有特异性的TCR可包含αVJ序列和βV(D)J序列。对于αVJ和βV(D)J序列的特定组合，参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997，所述申请通过引用以其整体并入。
针对A＊02:01_GVYDGEEHSV的靶特异性TCR
在一些方面，本文提供了包含特异性结合HLA-肽靶标的TCR或其抗原结合片段的ABP，其中所述HLA-肽靶标的HLA I类分子是HLA亚型A*02:01，并且所述HLA-肽靶标的HLA-限制性肽包含序列GVYDGEEHSV。
对A*02:01_GVYDGEEHSV具有特异性的TCR可包含αCDR3序列。参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的SEQ ID NOS 4282-4283，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*02:01_GVYDGEEHSV具有特异性的TCR可包含βCDR3序列。参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的SEQ ID NOS 4296-4297，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*02:01_GVYDGEEHSV具有特异性的TCR可包含特定αCDR3序列和特定βCDR3序列。对于αCDR3和βCDR3序列的特定组合，参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*02:01_GVYDGEEHSV具有特异性的TCR可包含TRAV、TRAJ、TRBV、任选的TRBD和TRBJ氨基酸序列、任选的TRAC序列和任选的TRBC序列。对于TRAV、TRAJ、TRBV、任选的TRBD、TRBJ氨基酸序列、任选的TRAC序列和任选的TRBC序列的特定组合，参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*02:01_GVYDGEEHSV具有特异性的TCR可包含αVJ序列。参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的SEQ ID NOS 4311-4312，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*02:01_GVYDGEEHSV具有特异性的TCR可包含βV(D)J序列。参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的SEQ ID NOS 4326-4327，所述申请通过引用以其整体并入。
对A*02:01_GVYDGEEHSV具有特异性的TCR可包含αVJ序列和βV(D)J序列。对于αVJ和βV(D)J序列的特定组合，参考2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997，所述申请通过引用以其整体并入。
工程改造的细胞
还提供了细胞，如含有抗原受体的细胞，例如，含有本文所述的包含抗HLA-肽ABP的胞外结构域的抗原受体(例如，CAR或TCR)。还提供了这种细胞的群体和含有这种细胞的组合物。在一些实施方案中，组合物或群体富含这种细胞，如占所述组合物中所有细胞的至少百分之1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或大于99的表达HLA-肽ABP的细胞，或者某一类型的细胞(如T细胞或CD8+或CD4+细胞)。在一些实施方案中，组合物包含至少一种含有本文所公开的抗原受体的细胞。组合物中包括用于施用(如用于过继细胞疗法)的药物组合物和制剂。还提供了向受试者，例如患者，施用所述细胞和组合物的治疗方法。
因此，还提供了表达包含受体(例如，TCR或CAR)的ABP的基因工程改造的细胞。所述细胞一般是真核细胞，如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞源自于血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，所述细胞是免疫系统的细胞，如先天性或适应性免疫的细胞，例如髓样或淋巴样细胞，包含淋巴细胞，一般是T细胞和/或NK细胞。其它示例性的细胞包含干细胞，如多能和多潜能干细胞，包含诱导性多潜能干细胞(iPSC)。细胞一般是原代细胞，如直接从受试者中分离和/或从受试者中分离并冷冻的细胞。在一些实施方案中，细胞包含T细胞或其它细胞类型的一个或多个亚组，如全T细胞群体、CD4+细胞、CD8+细胞和其亚群，如由功能、激活状态、成熟度、分化潜力、扩增、再循环、定位和/或持续能力、抗原特异性、抗原受体的类型、在特定器官或区室中的存在、标记物或细胞因子的分泌概况和/或分化程度限定的那些。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。这些方法包括现成的方法。在一些方面，如对于现有技术，细胞是多潜能的和/或多能的，如干细胞，如诱导性多潜能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，方法包括如本文所述的从受试者分离细胞，对其进行制备、处理、培养和/或工程改造，并且在冷冻保存之前或之后将其再导入同一患者。
T细胞和/或CD4+和/或CD8+T细胞的亚型和亚群包括：原初T(TN)细胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞和其亚型，如干细胞记忆T(TSCM)细胞、中心记忆T(TCM)细胞、效应记忆T(TEM)细胞或终末分化的效应记忆T细胞、肿瘤-浸润性淋巴细胞(TIL)、不成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关的非变体T(MALT)细胞、天然存在的和过继性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞，如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞以及δ/γT细胞。
在一些实施方案中，细胞是自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，细胞是单核细胞或粒细胞，例如，骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞，和/或嗜碱性粒细胞。
可以对细胞进行基因修饰以减少表达或敲除内源性TCR。这种修饰描述于以下文献中：Mol Ther Nucleic Acids.2012年12月；1(12):e63；Blood.2011年8月11日；118(6):1495-503；Blood.2012年6月14日；119(24):5697–5705；Torikai,Hiroki等人"HLA and TCRKnockout by Zinc Finger Nucleases:Toward“off-the-Shelf”Allogeneic T-CellTherapy for CD19+Malignancies.."Blood 116.21(2010):3766；Blood.2018年1月18日；131(3):311-322.doi:10.1182/blood-2017-05-787598；以及WO2016069283，它们通过引用整体并入。
可以对细胞进行基因修饰以促进细胞因子的分泌。这种修饰描述于Hsu C,HughesMS,Zheng Z,Bray RB,Rosenberg SA,Morgan RA.Primary human T lymphocytesengineered with a codon-optimized IL-15gene resist cytokine withdrawal-induced apoptosis and persist long-term in the absence of exogenouscytokine.J Immunol.2005；175:7226–34；Quintarelli C,Vera JF,Savoldo B,GiordanoAttianese GM,Pule M,Foster AE,Co-expression of cytokine and suicide genes toenhance the activity and safety of tumor-specific cytotoxic Tlymphocytes.Blood.2007；110:2793–802；以及Hsu C,Jones SA,Cohen CJ,Zheng Z,Kerstann K,Zhou J,Cytokine-independent growth and clonal expansion of aprimary human CD8+T-cell clone following retroviral transduction with the IL-15gene.Blood.2007；109:5168–77中。
已经表明T细胞上的趋化因子受体与肿瘤分泌的趋化因子的错配是造成T细胞进入肿瘤微环境的次佳运输的原因。为了提高治疗效果，可对细胞进行基因修饰，以增加对肿瘤微环境中趋化因子的识别。此类修饰的实例描述于Moon等人，Expression of afunctional CCR2 receptor enhances tumor localization and tumor eradication byretargeted human T cells expressing a mesothelin-specific chimeric antibodyreceptor.Clin Cancer Res.2011；17:4719-4730(())；和Craddock等人，Enhanced tumortrafficking of GD2 chimeric antigen receptor T cells by expression of thechemokine receptor CCR2b.J Immunother.2010；33:780-788。
可对细胞进行基因修饰，以增强协同刺激/增强受体(如CD28和41BB)的表达。
T细胞疗法的不良反应可包含细胞因子释放综合征和持久的B细胞耗竭。在受体细胞中引入自杀/安全开关可改善细胞疗法的安全性。因此，可对细胞进行基因修饰以包含自杀/安全开关。自杀/安全开关可以是这样的基因，其在表达基因的细胞上赋予试剂(例如，药物)敏感性，并且当细胞与试剂接触或暴露于试剂时导致细胞死亡。示例性的自杀/安全开关描述于Protein Cell.2017年8月；8(8):573–589中。自杀/安全开关可以是HSV-TK。自杀/安全开关可以是胞嘧啶脱氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶或硝基还原酶。自杀/安全开关可以是RapaCIDeTM，描述于美国专利申请公开第US20170166877A1号中。自杀/安全开关系统可以是CD20/利妥昔单抗，描述于Haematologica.2009年9月；94(9):1316–1320中。这些参考文献通过引用整体并入。
TCR或CAR可作为分裂受体引入受体细胞，所述分裂受体仅在异二聚化小分子的存在下装配。这种系统描述于Science.2015年10月16日；350(6258):aab4077和美国专利第9,587,020号(所述文献和专利由此通过引用整体并入)中。
在一些实施方案中，细胞包含一种或多种核酸，例如，编码本文所公开的TCR或CAR的多核苷酸，其中所述多核苷酸通过基因工程引入，从而表达本文所公开的重组TCR或CAR或者基因工程TCR或CAR。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物体或细胞获得的样品，例如，在工程改造的细胞和/或衍生这种细胞的生物体中通常发现不了所述细胞。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的，如核酸不是自然界中发现的，包含一种含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。
核酸可包含密码子优化的核苷酸序列。不受特定理论或机制的约束，人们认为核苷酸序列的密码子优化增加了mRNA转录本的翻译效率。核苷酸序列的密码子优化可涉及用天然密码子替代编码相同氨基酸的另一个密码子，但是它可以通过在细胞内更容易获得的tRNA进行翻译，从而提高翻译效率。核苷酸序列的优化还可以减少会干扰翻译的mRNA二级结构，从而提高翻译效率。
可以使用构建体或载体将TCR或CAR引入受体细胞。本文描述了示例性构建体。编码TCR或CAR的α链和β链的多核苷酸可存在于单个构建体中或单独的构建体中。编码α链和β链的多核苷酸可操作地连接至启动子，例如异源启动子。异源启动子可以是强启动子，例如EF1α、CMV、PGK1、Ubc、β肌动蛋白、CAG启动子等。异源启动子可以是弱启动子。异源启动子可以是诱导型启动子。示例性的诱导型启动子包含但不限于TRE、NFAT、GAL4、LAC等。其它示例性的诱导型表达系统描述于美国专利第5,514,578、6,245,531、7,091,038号和欧洲专利第0517805号，它们通过引用整体并入。
用于将TCR或CAR引入受体细胞的构建体还可包含编码信号肽(信号肽元件)的多核苷酸。信号肽可以促进引入的TCR或CAR的表面运输。示例性的信号肽包含但不限于CD8信号肽、免疫球蛋白信号肽，其中具体实例包含GM-CSF和IgGκ。这种信号肽描述于TrendsBiochem Sci.2006年10月；31(10):563-71.Epub 2006年8月21日；和An等人“Constructionof a New Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor and the Anti-Leukemia FunctionStudy of the Transduced T Cells.”Oncotarget 7.9(2016):10638–10649.PMC.Web.2018年8月16日中；它们由此通过引用并入。
在一些情况下，例如从单个构建体或开放阅读框表达α链和β链的情况，或构建体中包含标记基因的情况，所述构建体可包含核糖体跳跃序列。核糖体跳跃序列可以是2A肽，例如P2A或T2A肽。示例性的P2A和T2A肽在描述于Scientific Reports第7卷，文章编号：2193(2017)(())(())中，其由此通过引用整体并入。在一些情况下，在2A元件的上游引入了FURIN/PACE裂解位点。例如，http://www.nuolan.net/substrates.html中描述了FURIN/PACE裂解位点。裂解肽也可以是因子Xa的裂解位点。在从单个构建体或开放阅读框表达α链和β链的情况下，所述构建体可包含内部核糖体进入位点((IRES))。
所述构建体可还包含一种或多种标记基因。示例性的标记基因包含但不限于GFP、荧光素酶、HA、lacZ。如本领域技术人员已知的，标记物可以是选择标记物，如抗生素抗性标记物、重金属抗性标记物或抗生物杀灭剂标记物。标记物可以是用于营养缺陷型宿主的互补标记物。示例性的互补标记物和营养缺陷型宿主描述于Gene.2001年1月24日；263(1-2):159-69中。这种标记物可以通过IRES、移码序列、2A肽接头、与TCR或CAR的融合体表达，或与单独的启动子分开表达。
用于将TCR或CAR引入受体细胞的示例性的载体或系统包含但不限于：腺伴随病毒、腺病毒、腺病毒+修饰的牛痘、安卡拉病毒(MVA)、腺病毒+逆转录病毒、腺病毒+仙台病毒、腺病毒+牛痘病毒、甲病毒(VEE)复制子疫苗、反义寡核苷酸、长双歧杆菌、CRISPR-Cas9、大肠埃希氏菌、黄病毒、基因枪、疱疹病毒、单核疱疹病毒、乳酸乳球菌、电穿孔、慢病毒、脂质体转染、单核细胞增多性李斯特菌、麻疹病毒、修饰的牛痘安卡拉病毒(MVA)、mRNA电穿孔、裸/质粒DNA、裸/质粒DNA+腺病毒、裸/质粒DNA+修饰的牛痘安卡拉病毒(MVA)、裸/质粒DNA+RNA转移、裸/质粒DNA+牛痘病毒、裸/质粒DNA+水泡性口炎病毒、新城疫病毒、非病毒载体、PiggyBacTM(PB)转座子、纳米粒子基系统、脊髓灰质炎病毒、痘病毒、痘病毒+牛痘病毒、逆转录病毒、RNA转移、RNA转移+裸/质粒DNA、RNA病毒、酿酒酵母、鼠伤寒沙门氏菌、塞姆利基森林病毒、仙台病毒、痢疾志贺氏菌、猿猴病毒、siRNA、睡美人转座子、变形链球菌、牛痘病毒、委内瑞拉马脑炎病毒复制子、水疱性口炎病毒以及霍乱弧菌。
在优选的实施方案中，TCR或CAR通过腺伴随病毒(AAV)、腺病毒、CRISPR-CAS9、疱疹病毒、慢病毒、脂质体转染、mRNA电穿孔、PiggyBacTM(PB)转座子、逆转录病毒、RNA转移或睡美人转座子引入受体细胞。
在一些实施方案中，用于将TCR或CAR引入受体细胞的载体是病毒载体。示例性病毒载体包含腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体等。本文描述了这种载体。
图2中显示了用于将TCR或CAR引入受体细胞的TCR构建体的示例性实施方案。在一些实施方案中，TCR构建体在5'-3'方向上包含以下多核苷酸序列：启动子序列、信号肽序列、TCRβ可变(TCRβv)序列、TCRβ恒定(TCRβc)序列、裂解肽(例如，P2A)、信号肽序列、TCRα可变(TCRαv)序列以及TCRα恒定(TCRαc)序列。在一些实施方案中，构建体的TCRβc和TCRαc序列包含一个或多个鼠源区(murine region)，例如，本文所述的完整鼠源恒定序列或人→鼠氨基酸交换。在一些实施方案中，所述构建体进一步包含TCRαc序列的3'、裂解肽序列(例如，T2A)和报告基因。在一个实施方案中，所述构建体在5'-3'方向上包含以下多核苷酸序列：启动子序列、信号肽序列、TCRβ可变((TCRβv))序列、含有一个或多个鼠源区的TCRβ恒定(TCRβc)序列、裂解肽(例如，P2A)、信号肽序列、TCRα可变(TCRαv)序列以及TCRα恒定(TCRαc)序列，所述TCRα恒定(TCRαc)序列含有一个或多个鼠源区、裂解肽(例如，T2A)和报告基因。
图3描绘了将TCR克隆到用于治疗开发的表达系统中的示例性构建体骨架序列。
图4描绘了将已鉴定的A*0201-LLASSILCA特异性TCR克隆到用于治疗开发的表达系统中的示例性构建体序列。
图5描绘了将已鉴定的A*0101_EVDPIGHLY特异性TCR克隆到用于治疗开发的表达系统中的示例性构建体序列。
核苷酸、载体、宿主细胞以及其相关方法
还提供了编码HLA-肽ABP的分离的核酸、包含所述核酸的载体以及包含所述载体和核酸的宿主细胞，和用于产生所述ABP的重组技术。
核酸可以是重组核酸。通过将天然或合成核酸片段连接至可在活细胞中复制的核酸分子或其复制产物，可在活细胞外部构建重组核酸。考虑到本文的目的，复制可以是体外复制或体内复制。
对于ABP的重组生产，可以分离编码ABP的核酸并将其插入可复制的载体中以进一步克隆(即DNA扩增)或表达。在一些方面，核酸可以通过同源重组产生，例如，如美国专利第5,204,244号中所述，其通过引用整体并入。
本领域已知有许多不同的载体。载体组分一般包含以下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标记基因、增强子元件、启动子和转录终止序列，例如，如美国专利第5,534,615号中所述，其通过引用整体并入。
适用于表达ABP(例如，TCR、CAR、抗体或其抗原结合片段)的示例性载体或构建体包含：例如，pUC系列(Fermentas Life Sciences)、pBluescript系列(Stratagene,LaJolla,CA)、pET系列(Novagen,Madison,WI)、pGEX系列(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)和pEX系列(Clontech,Palo Alto,CA)。噬菌体载体，如AGTlO、AGTl 1、AZapII(Stratagene)、AEMBL4和ANMl 149，也适合表达本文所述的ABP。
下文提供了合适的宿主细胞的说明性实例。这些宿主细胞并非限制性的，并且任何合适的宿主细胞均可用于产生本文提供的ABP。
合适的宿主细胞包含任何原核(例如，细菌)、低等真核(例如，酵母)或高等真核(例如，哺乳动物)细胞。合适的原核生物包含真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)(大肠埃希氏菌(E.coli))、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium))、沙雷氏菌属(Serratia)(粘质沙雷氏菌(S.marcescans))、志贺氏菌属(Shigella)、芽孢杆菌属(Bacilli)(枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、假单胞菌属(Pseudomonas)((铜绿假单胞菌(P.aeruginosa))和链霉菌属(Streptomyces)。一种有用的大肠埃希氏菌克隆宿主是大肠埃希氏菌294，尽管其它菌株如大肠埃希氏菌B、大肠埃希氏菌X1776和大肠埃希氏菌W3110也适用。
除原核生物外，真核微生物(如丝状真菌或酵母菌)也是用于编码HLA-肽ABP的载体的合适的克隆性或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或普通的面包酵母是一种常用的低等真核宿主微生物。但是，还有许多其它可用和有用的属、种和品系，如粟酒裂殖酵母属；克鲁维酵母属(乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、保加利亚克鲁维酵母、威克克鲁维酵、华氏克鲁维酵母、果蝇克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母)；耶氏酵母属；巴斯德毕赤酵母属；假丝酵母属(人白色念珠菌)；里氏木霉属；粗糙脉孢菌属；许旺酵母属(西方许旺酵母)；和丝状真菌类，如，例如青霉菌类、弯颈霉属和曲霉属(构巢曲霉和黑曲霉)。
有用的哺乳动物宿主细胞包含COS-7细胞、HEK293细胞；幼仓鼠肾(BHK)细胞；中国仓鼠卵巢(CHO)；小鼠睾丸支持细胞；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)等。
用于产生HLA-肽ABP的宿主细胞可以在多种培养基中培养。市售的培养基，如，例如Ham F10、最小必需培养基(MEM)、RPMI-1640和由杜氏改良的伊格尔氏最小必需培养基(DMEM)，都适用于培养宿主细胞。另外，描述于Ham等人，Meth.Enz.,1979,58:44；Barnes等人，Anal.Biochem.,1980,102:255；以及美国专利第4,767,704号、4,657,866号、4,927,762号、4,560,655号和5,122,469号；或WO 90/03430和WO 87/00195中的任何培养基均可使用，上述各参考文献均通过引用整体并入。
这些培养基中的任何一种均可根据需要补充激素和/或其它生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液((如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等效能源。也可以按照本领域技术人员已知的适当浓度包含其它必要的补充剂。
培养条件，如温度、pH等，是之前与用于表达的宿主细胞一起使用的那些条件，对于普通技术人员而言是显而易见的。
当使用重组技术时，ABP可以在细胞内、周质空间中产生，或直接分泌到培养基中。如果在细胞内产生ABP，则第一步是通过，例如，离心或超滤除去宿主细胞或细胞溶解片段的粒子碎片。例如，Carter等人(Bio/Technology,1992,10:163-167，通过引用整体并入)描述了分泌到大肠埃希氏菌周质空间中的ABP的分离方法。简言之，将细胞糊状物在乙酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下解冻约30分钟。可以通过离心法除去细胞碎片。
在一些实施方案中，ABP是在非细胞体系中产生的。在一些方面，非细胞体系是体外转录和翻译系统，如Yin等人mAbs,2012,4:217-225中所述，其通过引用整体并入。在一些方面，非细胞体系利用来自真核细胞或原核细胞的非细胞提取物。在一些方面，原核细胞是大肠埃希氏菌。ABP的无细胞表达可能在以下情况下是有用的，例如，ABP以不溶性聚集体形式在细胞中累积时或从周质表达中获得的产量较低时。
在ABP分泌到培养基中的情况下，一般先用市售的蛋白质浓缩过滤器(例如，
Figure BDA0002980945400001271
或
Figure BDA0002980945400001272
超滤单元)浓缩来自此类表达系统的上清液。可在上述任何步骤中包含蛋白酶抑制剂如PMSF，以抑制蛋白水解，并且可以包含抗生素以防止外来污染物的生长。
由细胞制备的ABP组合物可以使用，例如，羟基磷灰石色谱法、凝胶电泳法、渗析和亲和色谱法来纯化，其中亲和色谱法是特别有用的纯化技术。蛋白A作为亲和配体的适用性取决于ABP中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化包含人γ1、γ2或γ4重链的ABP(Lindmark等人，J.Immunol.Meth.,1983,62:1-13，其通过引用整体并入)。蛋白G可用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等人，EMBO J.,1986,5:1567-1575，其通过引用整体并入)。
亲和配体所连接的基质通常是琼脂糖，但也可以使用其它基质。机械稳定性基质(如受控孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯基)苯)比琼脂糖具有更快的流速和更短的处理时间。如果ABP包含CH3结构域，则可用
Figure BDA0002980945400001281
树脂进行纯化。
本领域技术人员也可使用其它的蛋白质纯化技术，如离子交换柱分馏法、乙醇沉淀法、反相高效液相色谱法(HPLC)、硅胶色谱法、肝素
Figure BDA0002980945400001282
色谱法、聚焦层析法、SDS-PAGE法和硫酸铵沉淀法等。
在任何初步纯化步骤之后，可以使用pH值介于约2.5至约4.5之间的洗脱缓冲液对包含目标ABP和污染物的混合物进行低pH疏水作用层析，一般在低盐浓度下(例如，约0至约0.25M的盐)进行。
制备HLA-肽ABP的方法
制备HLA-肽抗原
用于分离或产生本文所述的ABP的HLA-肽抗原可以是完整的HLA-肽或HLA-肽的片段。HLA-肽抗原可以是，例如，分离的蛋白质或在细胞表面表达的蛋白质的形式。
在一些实施方案中，HLA-肽抗原是HLA-肽的非天然存在的变体，如具有自然界中不存在的氨基酸序列或翻译后修饰的HLA-肽蛋白。
在一些实施方案中，通过去除例如细胞内序列或跨膜序列或信号序列来截短HLA-肽抗原。在一些实施方案中，HLA-肽抗原在其C末端与人IgG1 Fc结构域或多组氨酸标签融合。
鉴定ABP的方法
可以使用本领域已知的任何方法，例如噬菌体展示法或受试者的免疫法，来鉴定结合HLA-肽的ABP。
鉴定抗原结合蛋白的一种方法包括：提供至少一个HLA-肽靶标；将所述至少一个靶标与抗原结合蛋白结合，从而鉴定所述抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以存在于包含多种不同抗原结合蛋白的文库中。
在一些实施方案中，文库是噬菌体展示文库。可以开发噬菌体展示文库，使得其基本上不含非特异性结合HLA-肽靶标的HLA的抗原结合蛋白。抗原结合蛋白可以存在于包含多种不同抗原结合蛋白的酵母展示文库中。可以开发酵母展示文库，使得其基本上不含与HLA-肽靶标的HLA非特异性结合的抗原结合蛋白。
在一些实施方案中，文库是酵母展示文库。
在一些实施方案中，文库是TCR展示文库。示例性的TCR展示文库和其使用方法描述于：WO 98/39482；WO 01/62908；WO 2004/044004；WO2005116646、WO2014018863、WO2015136072和WO2017046198；和Helmut等人((2000))PNAS 97(26)14578-14583，所述文献均通过引用整体并入。
在一些方面，所述结合步骤执行多于一次，任选地至少三次，例如至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10次。
另外，所述方法还可以包含：使抗原结合蛋白与一种或多种不同于HLA-肽靶标的肽-HLA复合物接触，以确定抗原结合蛋白是否选择性地结合HLA-肽靶标。
鉴定抗原结合蛋白的另一种方法可以包含：获得至少一个HLA-肽靶标；向受试者(例如，小鼠、兔子或美洲驼)施用HLA-肽靶标(任选地与佐剂组合)；以及从所述受试者中分离抗原结合蛋白。分离抗原结合蛋白可以包含：筛选所述受试者的血清以鉴定抗原结合蛋白。所述方法还可以包含：使抗原结合蛋白与一种或多种不同于HLA-肽靶标的肽-HLA复合物接触，例如，以确定抗原结合蛋白是否选择性地与HLA-肽靶标结合。鉴定出的抗原结合蛋白可以被人源化。
在一些方面，分离抗原结合蛋白包括：从表达抗原结合蛋白的受试者中分离B细胞。所述B细胞可用于产生杂交瘤。所述B细胞也可用于克隆B细胞的一个或多个CDR。例如，通过EBV转化使所述B细胞永生。编码抗原结合蛋白的序列可以由永生的B细胞克隆或者可以直接由从免疫得受试者分离的B细胞克隆。还可以创建包含所述B细胞的抗原结合蛋白的文库，任选地，其中所述文库是噬菌体展示文库或酵母展示文库。
鉴定抗原结合蛋白的另一种方法可以包含：获得包含所述抗原结合蛋白的细胞；使所述细胞与包含至少一个HLA-肽靶标的HLA-多聚体(例如，四聚体)接触；以及通过所述HLA-多聚体与所述抗原结合蛋白之间的结合来鉴定抗原结合蛋白。
所述细胞可以是，例如，T细胞，任选地为细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或天然杀伤(NK)细胞。所述方法可以进一步包含：任选地使用流式细胞术、磁分离或单细胞分离来分离细胞。所述方法可以进一步包含对所述抗原结合蛋白进行测序。
鉴定抗原结合蛋白的另一种方法可以包含：获得包含抗原结合蛋白的一个或多个细胞；用在至少一种抗原呈递细胞(APC)上呈递的至少一种HLA-肽靶标激活所述一个或多个细胞；以及通过选择与至少一种HLA-肽靶标相互作用而激活的一个或多个细胞来鉴定抗原结合蛋白。
所述细胞可以是，例如，T细胞，任选地为CTL或NK细胞。所述方法可以进一步包含：任选地使用流式细胞术、磁分离或单细胞分离来分离细胞。所述方法可以进一步包含对所述抗原结合蛋白进行测序。
制备单克隆ABP的方法
单克隆ABP可以通过以下方法获得，例如，由Kohler等人，Nature,1975,256:495-497(通过引用整体并入)首次描述的杂交瘤方法，和/或重组DNA方法(参见，例如，美国专利第4,816,567号，通过引用整体并入)。单克隆ABP也可以，例如，使用噬菌体或酵母文库获得。参见，例如，美国专利第8,258,082和8,691,730号，其均通过引用整体并入。
在杂交瘤方法中，免疫小鼠或其它合适的宿主动物以引发产生或能够产生ABP的淋巴细胞，所述ABP特异性地结合用于免疫的蛋白质。或者，可在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂(如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞。参见Goding J.W.,Monoclonal ABPs:Principles and Practice第3版(((1986)AcademicPress,San Diego,CA))，其通过引用整体并入。
将杂交瘤细胞接种到合适的培养基中进行生长，所述培养基含有一种或多种抑制未融合的、亲代骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，如果亲代骨髓瘤细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，则杂交瘤的培养基通常会包含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(HAT培养基)，这些物质防止HGPRT缺陷型细胞的生长。
有用的骨髓瘤细胞是那些能够有效融合、支持由选择的产生ABP的细胞稳定地且高水平地产生ABP并且对培养基条件(如存在或不存在HAT培养基)敏感的骨髓瘤细胞。其中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠源骨髓瘤细胞系，如MOPC-21和MC-11小鼠肿瘤衍生的安歇(可从加利福尼亚州圣地亚哥的萨克生物研究学院的细胞分布中心获得)，以及SP-2或X63-Ag8-653细胞(可从马里兰州罗克维尔市的美国模式培养物集存库获得)。已经描述了人骨髓瘤和人鼠异源骨髓瘤细胞系用于生产人单克隆ABP。参见例如，Kozbor,J.Immunol.,1984,133:3001，其通过引用整体并入。
在确定杂交瘤细胞产生的ABP具有期望的特异性、亲和力和/或生物学活性之后，可以通过有限稀释法对选择的克隆进行亚克隆化，并通过标准方法使其生长。参见Goding，同上。适用于此目的的培养基包含，例如，D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可以作为腹水肿瘤在动物体内生长。
编码单克隆ABP的DNA可以通过使用常规方法容易地分离和测序(例如，通过使用能够与编码单克隆ABP的重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。因此，杂交瘤细胞可以用作DNA的有用来源，所述DNA编码具有所需特性的ABP。分离后，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染到宿主细胞如细菌(例如，大肠埃希氏菌)、酵母菌(例如，酿酒酵母或毕赤酵母)、COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其它不产生ABP的骨髓瘤细胞，从而产生单克隆ABP。
制备嵌合ABP的方法
制备嵌合ABP的示例性方法描述于例如，美国专利第4,816,567号；和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1984,81:6851-6855；其均通过引用整体并入。在一些实施方案中，通过重组技术结合非人可变区(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔子或非人灵长类动物(如猴子)来源的可变区))和人恒定区来制备嵌合ABP。
制备人源化ABP的方法
用相应的人ABP序列替换非人单克隆ABP的大部分或全部结构部分来产生人源化ABP。结果，产生了杂合分子，其中仅抗原特异性可变区或CDR由非人序列构成。获得人源化ABP的方法包括下列文献中描述的那些：例如，Winter和Milstein,Nature,1991,349:293-299；Rade等人，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,1998,95:8910-8915；Steinberger等人，J.Biol.Chem.,2000,275:36073-36078；Queen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1989,86:10029-10033；以及美国专利第5,585,089号、5,693,761号、5,693,762号和6,180,370号；其均通过引用整体并入。
制备人ABP的方法
可以通过本领域已知的多种技术产生人ABP，例如，使用基因改造的动物(例如，人源化小鼠)。参见，例如，Jakobovits等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1993,90:2551；Jakobovits等人，Nature,1993,362:255-258；Bruggermann等人，Year in Immuno.,1993,7:33；以及美国专利第5,591,669、5,589,369和5,545,807号；其均通过引用整体并入。人ABP也可以源自噬菌体展示文库(参见，例如，Hoogenboom等人)，J.Mol.Biol.,1991,227:381-388；Marks等人，J.Mol.Biol.,1991,222:581-597；以及美国专利第5,565,332和5,573,905号；其均通过引用整体并入。人ABP也可以由体外激活的B细胞产生(参见，例如，美国专利第5,567,610和5,229,275号，其均通过引用整体并入)。人ABP也可以源自酵母文库(参见，例如，美国专利号8,691,730，其通过引用整体并入)。
制备ABP片段的方法
本文提供的ABP片段可以通过任何合适的方法来制备，包含本文所述的说明性方法或本领域已知的方法。合适的方法包括重组技术和整个ABP的蛋白水解消化作用。制备ABP片段的说明性方法描述于，例如，Hudson等人，Nat.Med.,2003,9:129-134，其通过引用整体并入。制备scFv ABP的方法描述于，例如，Plückthun的The Pharmacology ofMonoclonal ABPs，第113卷，Rosenburg和Moore编著，Springer-Verlag,New York，第269-315页(1994)；WO 93/16185；以及美国专利第5,571,894和5,587,458号；其各自通过引用整体并入。
制备替代支架的方法
本文提供的替代支架可以通过任何合适的方法制备，包含本文所述的说明性方法或本领域已知的方法。例如，在Emanuel等人，mAbs,2011,3:38-48(其通过引用整体并入)中描述了AdnectinsTM制备的方法。美国专利公开第2003/0215914号中描述了iMab的制备方法，其通过引用整体并入。Vogt和Skerra，Chem.Biochem.,2004,5:191-199(其通过引用整体并入中描述了
Figure BDA0002980945400001331
制备方法。Wagner等人,Biochem.&Biophys.Res.Comm.,1992,186:118-1145(其通过引用整体并入)中描述了Kunitz结构域的制备方法。Geyer和Brent，Meth.Enzymol.,2000,328:171-208(其通过引用整体并入)中描述了硫氧还蛋白肽适配子的制备方法。Fernandez,Curr.Opinion in Biotech.,2004,15:364-373(其通过引用整体并入中提供了制备亲和体的方法。Zahnd等人，J.Mol.Biol.,2007,369:1015-1028(其通过引用整体并入)))中提供了DARPins的制备方法。(Ebersbach等人)，J.Mol.Biol.,2007,372:172-185(其通过引用整体并入)中提供了Affilins的制备方法。Graversen等人，J.Biol.Chem.,2000,275:37390-37396(其通过引用整体并入)中提供了Tetranectins的制备方法。Silverman等人，Nature Biotech.,2005,23:1556-1561(其通过引用整体并入)中提供了Avimers的制备方法。Silacci等人，J.Biol.Chem.,2014,289:14392-14398(其通过引用整体并入)中提供了Fynomers的制备方法。关于替代支架的更多信息，参见Binz等人，Nat.Biotechnol.,200523:1257-1268))；和Skerra,Current Opin.in Biotech.,2007 18:295-304，其各自均通过引用整体并入。
制备多特异性ABP的方法
本文提供的多特异性ABP可以通过任何合适的方法制备，包含本文所述的示例性方法或本领域已知的方法。Merchant等人，Nature Biotechnol.,1998,16:677-681(其通过引用整体并入)中描述了普通轻链ABP的制备方法。Coloma和Morrison,NatureBiotechnol.,1997,15:159-163(其通过引用整体并入)中描述了四价双特异性ABP的制备方法。Milstein和Cuello,Nature,1983,305:537-540以及Staerz和Bevan,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,83:1453-1457(其各自均通过引用整体并入)中描述了混合免疫球蛋白的制备方法。美国专利第5,731,168号(其通过引用整体并入)中描述了用杵-入-臼修饰制备免疫球蛋白的方法。WO 2009/089004(其通过引用整体并入)中提供了用静电修饰制备免疫球蛋白的方法。Traunecker等人，EMBO J.,1991,10:3655-3659以及Gruber等人，J.Immunol.,1994,152:5368-5374(其各自均通过引用整体并入中描述了双特异性单链ABP的制备方法。美国专利第4,946,778和5,132,405号(其各自均通过引用整体并入)中描述了制备单链ABP的方法，其中，所述ABP的接头长度可以改变。Hollinger等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:6444-6448(其通过引用整体并入)中描述了双抗体的制备方法。Todorovska等人J.Immunol.Methods,2001,248:47-66(其通过引用整体并入)中描述了三抗体和四抗体的制备方法。Tutt等人))J.Immunol.,1991,147:60-69(其通过引用整体并入)中描述了三特异性F(ab')3衍生物的制备方法。交联ABP的制备方法描述于：美国专利第4,676,980号；Brennan等人Science,1985,229:81-83))；Staerz等人Nature,1985,314:628-631；以及EP 0453082(其各自均通过引用整体并入)中。Kostelny等人J.Immunol.,1992,148:1547-1553(其通过引用整体并入)中描述了由亮氨酸拉链装配的抗原结合结构域的制备方法。美国专利第7,521,056；7,550,143；7,534,866和7,527,787号(其各自均通过引用整体并入)中描述了通过DNL方法制备ABP的方法。WO 93/08829(其通过引用整体并入)中描述了ABP和非ABP分子的杂化物的制备方法，例如此类ABP的制备方法。美国专利公开第2008/0069820号(其通过引用整体并入)中描述了DAF ABP的制备方法。Carlring等人PLoSOne,2011,6:e22533(其通过引用整体并入)))中描述了通过还原和氧化制备ABP的方法。美国专利第7,612,181号(其通过引用整体并入)中描述了DVD-IgsTM的制备方法。Moore等人))Blood,2011,117:454-451(其通过引用整体并入)中描述了DARTsTM的制备方法。
Figure BDA0002980945400001351
的制备方法描述于：Labrijn等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2013,110:5145-5150；Gramer等人mAbs,2013,5:962-972；以及Labrijn等人(())))NatureProtocols,2014,9:2450-2463；其各自均通过引用整体并入。Coloma和Morrison，NatureBiotechnol.,1997,15:159-163))(其通过引用整体并入)中描述了ABP的制备方法，其中所述ABP包含与IgG的CH3的C末端融合的scFv。Miler等人))，J.Immunol.,2003,170:4854-4861(其通过引用整体并入)中描述了ABP的制备方法，其中Fab分子连接至免疫球蛋白的恒定区。Doppalapudi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2010,107:22611-22616(其通过引用整体并入)中描述了CovX-Bodies的制备方法。Wozniak-Knopp等，Protein Eng.Des.Sel.,2010,23:289-297(其通过引用整体并入)中描述了Fcab ABP的制备方法。Kipriyanov等人，J.Mol.Biol.,1999,293:41-56和Zhukovsky等人，Blood,2013,122:5116(其各自均通过引用整体并入)中描述了
Figure BDA0002980945400001352
ABP的制备方法。WO 2015/103072(其通过引用整体并入)中描述了串联Fab的制备方法。LaFleur等人，mAbs,2013,5:208-218(其通过引用整体并入)中描述了ZybodiesTM的制备方法。
制备变体的方法
可以采用任何合适的方法将多样性引入到编码ABP的多核苷酸序列中，包含易错PCR、链改组和寡核苷酸定向诱变，如三核苷酸定向诱变(TRIM)。在一些方面，将几个CDR残基((例如，一次4至6个残基)随机化。可以，例如，使用丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定涉及抗原结合的CDR残基。特别地，经常靶向CDR-H3和CDR-L3用于突变。
在可变区和/或CDR中引入的多样性可用于产生次级文库。然后，筛选次级文库以鉴定具有改善的亲和力的ABP变体。例如，Hoogenboom等人，Methods in MolecularBiology,2001,178:1-37(其通过引用整体并入)中描述了通过次级文库的构建和再选择进行的亲和力成熟。
含ABP的细胞的工程改造方法
还提供了表达ABP(包括包含抗体的受体、CAR和TCR)以及产生表达这种ABP的基因工程改造的细胞的方法、核酸、组合物和试剂盒。基因工程一般涉及，例如，通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码重组或工程组分的核酸引入细胞。
在一些实施方案中，首先通过刺激细胞来实现基因转移，如将细胞与诱导如增殖、存活和/或激活等应答的刺激物结合，例如，由细胞因子或激活标记物的表达测得；然后转导激活的细胞，并在培养物中扩增至足够临床应用的数量。
在一些情况下，刺激因子(例如，淋巴因子或细胞因子)的过表达可能对受试者有毒。因此，在一些情况下，工程改造的细胞包含基因片段，这些基因片段使细胞易于在体内进行阴性选择，如施用于过继免疫疗法时。例如，在一些方面，对细胞进行工程改造，使得它们因施用有所述细胞的患者的体内病状变化而被消除。阴性选择表型由基因的插入造成，该基因赋予所施用试剂(例如，化合物)敏感性。阴性选择基因包含赋予更昔洛韦敏感性的I型单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人,Cell II:223,1977)、细胞亚黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因、细胞腺嘌呤磷酸核糖基转移酶((APRT))基因、细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992)。
在一些方面，细胞进一步工程改造以促进细胞因子或其它因子的表达。基因工程组分，例如抗原受体(例如，CAR)的各种引入方法是众所周知的，并且可与所述方法和组合物一起使用。示例性的方法包括用于转移编码受体的核酸的方法，包含通过病毒(例如，逆转录病毒或慢病毒)转导、转座子和电穿孔的方法。
在一些实施方案中，使用重组传染性病毒粒子将重组核酸转移到细胞中，所述粒子是，如，例如，猿猴病毒40((SV40))、腺病毒、腺伴随病毒((AAV))来源的载体。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体，如γ-逆转录病毒载体，将重组核酸转移到T细胞中((参见，例如，Koste等人，(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)MolTher Nucl Acids 2,e93；Park等人，Trends Biotechnol.2011年11月29(11):550-557。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长的末端重复序列((LTR))，例如，源自莫洛尼氏鼠白血病病毒((MoMLV))、骨髓增生性肉瘤病毒((MPSV))、鼠胚胎干细胞病毒((MESV))、鼠干细胞病毒((MSCV))、形成脾脏病灶的病毒((SFFV))或腺相关病毒((AAV))的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包含任何禽类或哺乳动物细胞来源的逆转录病毒。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包含人在内的几种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代了逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多示例性的逆转录病毒系统((例如，美国专利第5,219,740；6,207,453；5,219,740号；Miller和Rosman(1989)BioTechniques7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human GeneTherapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性的方法描述于，例如，Wang等人Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，重组核酸通过电穿孔转移到T细胞中((参见，例如，Chicaybam等人，(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437以及Roth等人(2018)Nature 559:405–409。在一些实施方案中，重组核酸通过倒位转移到T细胞中((参见，例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)MolecTher Nucl Acids 2,e74以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126。在免疫细胞中引入并表达遗传物质的其它方法包括磷酸钙转染((例如，如CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所描述的、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990)；以及磷酸锶DNA共沉淀((Brash等人，Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987)。
用于转移编码重组产物的核酸的其它方法和载体描述于，例如，国际专利申请公开第WO2014055668号和美国专利第7,446,190号。
另外的核酸，例如，用于引入的基因是如通过促进转移的细胞的活力和/或功能来提高治疗功效的那些；提供基因标记物以选择和/或评估细胞的基因，如评估体内存活率或定位；例如，使细胞易于在体内进行阴性选择来提高安全性的基因，如Lupton S.D.等人，Mol.和Cell Biol.,11:6(1991)以及Riddell等人，Human Gene Therapy 3:319-338(1992)中所述；还参见Lupton等人的出版物PCT/US91/08442和PCT/US94/05601，其中描述了通过将显性阳性选择标记物与阴性选择标记物融合得到的双功能选择融合基因的用途。参见，例如，Riddell等人，美国专利第6,040,177号，第14-17栏。
制备工程改造的细胞
在一些实施方案中，工程改造的细胞的制备包含一个或多个培养和/或制备步骤。可以从样品，如(从受试者中分离的或受试者来源的)生物样品中分离出用于引入HLA-肽-ABP的细胞，例如TCR或CAR。在一些实施方案中，从中分离出细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将对其进行细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，受试者是需要特定治疗干预的人，如过继细胞治疗，为此而对细胞进行分离、加工和/或工程改造。
因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如，原代人细胞。样品包含直接取自受试者的组织、液体和其它样品，以及经过一个或多个处理步骤(如分离、离心、基因工程(例如，病毒载体的转导)、洗涤和/或温育))产生的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或处理过的样品。生物样品包含但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊髓液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包含从中衍生的加工样品。
在一些方面，衍生或分离出细胞的样品是血液或血液来源的样品，或者是或源于清血法或白细胞去除术的产物。示例性的样品包含全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾、其它淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾脏、胰腺、乳房、骨骼、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其它器官，和/或由此衍生的细胞。在细胞治疗(例如过继细胞治疗)的情况下，样品包含自体和异体来源的样品。
在一些实施方案中，细胞衍生自细胞系，例如，T细胞系。在一些实施方案中，这些细胞是从异种来源获得的，例如，小鼠、大鼠、非人灵长类动物或猪。
在一些实施方案中，细胞的分离包含一个或多个制备和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些实例中，在一种或多种试剂的存在下，洗涤、离心和/或孵育细胞，例如，以去除不需要的组分，富集所需组分，裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些实例中，基于一种或多种性质，如密度、粘附性质、大小、敏感性和/或对特定组分的抗性来分离细胞。
在一些实例中，通过，例如，清血法或白细胞去除术从受试者的循环血液中获得细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞，包含T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面，含有除红细胞和血小板以外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如，以除去血浆级分并将细胞放置在适当的缓冲液或培养基中以用于后续的处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明，洗涤步骤是通过半自动“流通式”离心机((例如，百特公司的Cobe 2991细胞处理器))完成的。在一些方面，根据制造商的说明，通过切向流过滤(TFF)来完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，如，例如不含Ca++/Mg++的PBS。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分，并将细胞直接重悬浮在培养基中。
在一些实施方案中，这些方法包括：基于密度的细胞分离方法，如通过溶解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心法从外周血中制备白细胞。
在一些实施方案中，分离方法包括基于一种或多种特定分子在细胞中的表达或存在来分离不同细胞类型，所述特定分子是，如表面标记物，例如，表面蛋白、细胞内标记物或核酸。在一些实施方案中，可以使用任何基于这种标记物的已知分离方法。在一些实施方案中，分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，分离包含基于细胞的表达或一种或多种标记物(通常是细胞表面标记物)的表达水平，例如通过与这些标记物特异性结合的抗体或结合伴侣一起温育来分离细胞和细胞群体；接下来，通常是洗涤步骤，然后将与抗体或结合伴侣结合的细胞从未与抗体或结合伴侣结合的细胞中分离出来。
这种分离步骤可以基于阳性选择和/或阴性选择进行，其中，在阳性选择中，结合了试剂的细胞留存备用；在阴性选择中，保留未结合抗体或结合伴侣的抗体。在一些实例中，两种级分均保留以备进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性鉴定异源群体中的细胞类型的抗体的情况下，阴性选择可能特别有用，从而基于由所需群体以外的细胞表达的标记物来最好地进行分离。
分离不需要产生100％富集或去除特定细胞群体或表达特定标记物的细胞。例如，对特定类型的细胞(如表达标记物的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不必使不表达标记物的细胞完全不存在。同样，对特定类型的细胞(如表达标记物的那些)的阴性选择、去除或耗竭是指减少此类细胞的数量或百分比，但不必完全去除所有此类细胞。
在一些实例中，进行多轮分离步骤，其中将一个步骤中的阳性或阴性选择的级分进行另一分离步骤，如接下来的阳性或阴性选择。在一些实例中，单个分离步骤可以同时耗竭表达多个标记物的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合伴侣一起孵育，每种抗体或结合伴侣对靶向阴性选择的标记物具有特异性。同样，可以通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合伴侣一起孵育，对多种细胞类型同时进行阴性选择。
例如，在一些方面，T细胞的特定亚群，如阳性细胞或高表达水平的一种或多种表面标记物的细胞，例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+，通过阳性或阴性选择技术分离。
例如，可以使用CD3/CD28缀合的磁珠((例如，DYNABEADS.RTM.M-450CD3/CD28 TCell Expander))对CD3+、CD28+T细胞进行阳性选择。
在一些实施方案中，通过阳性选择富集特定细胞群体或通过阴性选择耗竭特定细胞群体来进行分离。在一些实施方案中，通过将细胞与一种或多种抗体或其它结合剂孵育来实现阳性或阴性选择，所述其它结合剂特异性地与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达((标记物+))或以相对较高的水平((标记物高))表达的一个或多个表面标记物结合。
在一些实施方案中，通过对在非T细胞((如B细胞、单核细胞或其它白细胞，如CD14))上表达的标记物进行阴性选择，从外周血单核细胞(PBMC)样品中分离出T细胞。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。可以通过对在一种或多种原初、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高的水平表达的标记物进行阳性选择或阴性选择，将这种CD4+和CD8+群体一步分类为亚群。
在一些实施方案中，如根据各自亚群相关的表面抗原进行阳性选择或阴性选择，使CD8+中进一步富集或耗竭原初细胞、干细胞、中央记忆干细胞、效应记忆干细胞核/或中央记忆干细胞。在一些实施方案中，富集中央记忆T((TCM))细胞以提高功效，如改善给药后的长期存活率、扩增和/或移植成活率，在一些方面，其在这种亚群中特别健壮。参见Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，将富含TCM的CD8+T细胞和CD4+T细胞结合起来会进一步提高疗效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-子集中。外周血单核细胞(PBMC)可以富含或耗竭CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分，如使用抗CD8抗体和抗CD62L抗体。
在一些实施方案中，中央记忆T((TCM))细胞的富集基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性表达或高水平表面表达；在一些方面，其基于对表达或高水平表达CD45RA和/或粒子酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过耗竭表达CD4、CD14、CD45RA的细胞以及对表达CD62L的细胞进行阳性选择或富集，来分离富含TCM细胞的CD8+群体。在一方面，从基于CD4表达而选择的细胞的阴性级分开始执行中央记忆T((TCM))细胞的富集，其基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择，并基于CD62L的表达进行阳性选择。在一些方面，这种选择是同时执行的，而在其它方面，则以任一顺序依次执行。在一些方面，制备CD8+细胞群体或亚群时使用的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+细胞群体或亚群，使得基于CD4分离产生的阳性和阴性级分保留并用于所述方法的后续步骤，任选地在一个或多个另外的阳性或阴性选择步骤之后进行。
在一个特定的实例中，对PBMC的样品或其它白细胞样品进行CD4+细胞的选择，其中阴性级分和阳性级分均保留。然后，基于CD14和CD45RA或ROR1的表达，对阴性级分进行阴性选择，并基于中央记忆T细胞((如CD62L或CCR7))的标记物特征对阳性级分进行阴性选择，其中阳性选择和阴性选择以任一顺序进行。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群体，将CD4+T辅助细胞分类为原初细胞、中央记忆细胞和效应细胞。CD4+淋巴细胞可以通过标准方法获得。在一些实施方案中，原初CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+、CD4+T细胞。在一些实施方案中，中央记忆CD4+细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+细胞是CD62L-和CD45RO-。
在一个实例中，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物((cocktail))通常包含针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，将抗体或结合伴侣与固体支持物或基质((如磁珠或顺磁珠))结合，以分离细胞，从而进行阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性((或亲和磁性))分离技术分开或分离细胞和细胞群体((综述于Methods in Molecular Medicine，第58卷：Metastasis ResearchProtocols，第2卷：Cell Behavior In Vitro and In Vivo，第17-25页，由：S.A.Brooks and U.Schumacher Humana Press Inc.,Totowa,N.J.编辑。
在一些方面，将待分离的样品或细胞组合物与可磁化的或磁响应的小物质，如磁响应的粒子或微粒，如顺磁珠(例如，如Dynabeads or MACS珠)一起培养。磁响应物质(例如，粒子)通常直接或间接连接至结合伴侣(例如，抗体)，该结合伴侣特异性地与需要分离(例如，需要阴性或阳性选择)的一个或多个细胞或细胞群体中存在的分子(例如，表面标记物)结合。
在一些实施方案中，磁性粒子或磁珠包括与特定结合成员(如抗体或其它结合伴侣)结合的磁响应物质。有许多众所周知的磁响应物质可用于磁分离方法。合适的磁性粒子包含在Molday的美国专利第4,452,773号和欧洲专利说明书EP 452342B中描述的磁性粒子，其通过引用并入。其它实例是胶体大小的粒子，如Owen的美国专利第4,795,698号和Liberti等人的美国专利第5,200,084号中描述的那些。
一般在下述条件下进行孵育，由此所述抗体或结合伴侣或分子，如特异性地与这种连接磁性粒子或磁珠的抗体或结合伴侣结合的二抗或其它试剂，特异性地与样品中的细胞上的细胞表面分子(如果存在)结合。
在一些方面，将所述样品置于磁场中，具有与其连接的磁响应粒子或可磁化粒子的细胞将被磁体吸引，并与未标记的细胞分离。对于阳性选择而言，保留被磁体吸引的细胞；对于阴性选择而言，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤中进行阳性和阴性选择的组合，其中，保留阳性和阴性级分，并进一步处理或执行进一步的分离步骤。
在某些实施方案中，磁响应粒子外包被一抗或其它结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素。在某些实施方案中，磁性粒子通过包被一抗连接细胞，所述一抗对一种或多种标记物具有特异性。在某些实施方案中，所述细胞，而非珠，用一抗或结合伴侣标记，然后，添加细胞类型特异性的二抗或其它结合伴侣(例如，链霉亲和素)包被的磁性粒子。在某些实施方案中，链霉亲和素包被的磁性粒子与生物素化一抗或二抗联用。
在一些实施方案中，留下磁响应粒子附着后续需要孵育、培养和/或工程改造的细胞；在一些方面，留下所述粒子附着用于施用于患者的细胞。在一些实施方案中，从所述细胞去除可磁化的或磁响应粒子。从细胞中去除可磁化粒子的方法是已知的，并且包含，例如，采用竞争性非标记的抗体、可磁化粒子或缀合至可裂解接头的抗体。在一些实施方案中，可磁化粒子是生物可降解的。
在一些实施方案中，所述基于亲和力的选择通过磁性激活细胞分选((MACS))(Miltenyi Biotech,Auburn,Calif.)来进行。磁性激活细胞分选((MACS))系统能够高纯度选择其上连接有磁化粒子的细胞。在某些实施方案中，MACS以如下模式操作：在施加外部磁场之后，依次洗脱非靶标和靶标物质。也就是说，使连接磁化粒子的细胞保持在原位，而洗脱未连接的物质。然后，在第一洗脱步骤完成后，将滞留在磁场中且防止被洗脱的物质以某种方式释放，使得它们可被洗脱和回收。在某些实施方案中，标记非靶细胞并将其从异质细胞群体中消除。
在某些实施方案中，分离(isolation)或分离(separation)采用系统、器械或设备来进行，它们实施所述方法的分离(isolation)、细胞制备、分离(separation)、处理、孵育、培养和/或配制步骤中的一个或多个步骤。在一些方面，系统用以在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个步骤，目的是，例如尽可能减少误差、用户操作和/或污染。在一个实例中，所述系统是国际专利申请公开第WO2009/072003号或美国专利申请公开第US20110003380A1号中描述的系统。
在一些实施方案中，所述系统或设备在集成或独立系统中，和/或以自动化的或可编程的形式，进行分离、处理、工程改造和配制步骤中的一个或多个(例如，全部)步骤。在一些方面，所述系统或设备包含与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户编程、控制、评估所述处理、分离、工程改造和配制步骤的结果，和/或调节所述处理、分离、工程改造和配制步骤的各方面。
在一些方面，使用CliniMACS系统(Miltenyi
Figure BDA0002980945400001451
)进行所述分离和/或其它步骤，例如，以供在封闭和无菌系统中进行临床级别水平的细胞的自动化分离。部件可包含集成微型计算机、磁性分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，集成计算机控制仪器的所有部件，并指示所述系统以标准化的顺序进行重复操作。在一些方面，磁性分离单元包含可移动的永久磁体和用于选择柱的支架。蠕动泵控制贯穿通过管组的流速，并且与夹管阀一起确保通过所述系统的缓冲液和连续细胞悬液的受控流速。
在一些方面，CliniMACS系统使用以无菌、无热源溶液的形式提供的抗体-偶联的可磁化粒子。在一些实施方案中，在用磁性粒子标记细胞之后，清洗细胞以去除过量的粒子。然后，将细胞制备袋与管组相连，接着，管组再连接含缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预组装的无菌管道(包含前置柱和分离柱)组成，并且仅限单次使用。在分离程序启动之后，系统自动将细胞样品上样到分离柱。带标记的细胞保留在柱中，而未标记细胞则经一系列清洗步骤去除。在一些实施方案中，用于本文所述方法的细胞群体是未标记的，不保留在柱中。在一些实施方案中，用于本文所述方法的细胞群体是经标记的，并且保留在柱中。在一些实施方案中，去除磁场之后，从柱上洗脱用于本文所述方法的细胞群体，并将其收集在细胞收集袋中。
在某些实施方案中，采用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其它步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统装配有细胞处理单元，所述细胞处理单元允许自动化清洗和离心分级分离细胞。CliniMACSProdigy系统还可包含内置相机和图像识别软件，通过辨别来源细胞产物的肉眼可见层来确定最优选细胞分级分离的端点。例如，外周血液被自动化地分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可包含集成化的细胞培育室，用来完成细胞培养测序，如，例如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌去除和补充培养基，并且细胞可采用整合显微镜来监测。参见例如，Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660，Terakura等人(2012)Blood.1:72-82以及Wang等人(2012)JImmunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，本文所述的细胞群体通过流式细胞术收集和富集(或消除)，其中针对多种表面标记物染色的细胞携载于流体流中。在一些实施方案中，本文所述的细胞群体通过制备型荧光激活细胞分选法(FACS)-收集和富集(或消除)。在某些实施方案中，通过微电机系统(MEMS)芯片与基于FACS的检测系统联合使用来收集和富集(或耗竭)本文所述的细胞群体(参见，例如，WO 2010/033140，Cho等人((2010)Lab Chip 10,1567-1573以及Godi等人(2008)J Biophoton.1(5):355-376)。在这两种情况中，细胞都可用多种标记物标记，以便分离出高纯度的、明确的T细胞亚组。
在一些实施方案中，抗体或结合伴侣用一种或多种可检测标记物标记，以利于阳性选择和/或阴性选择的分离。例如，分离可基于与荧光标记抗体的结合。在一些实例中，将基于对一种或多种细胞表面标记物具有特异性的抗体或其它结合伴侣的结合所进行的细胞分离携载于流体流中，如通过荧光激活的细胞分选(FACS)(其包含制备型(FACS)和/或微机电系统(MEMS)芯片)，例如与流式细胞术检测系统联合。这种方法允许同时进行基于多种标记物的阳性选择和阴性选择。
在一些实施方案中，所述制备方法包括在分离、孵育和/或工程改造之前或之后冷冻(例如，冻存)所述细胞的步骤。在一些实施方案中，所述冷冻和后续解冻步骤去除细胞群体中的粒细胞，并且在一定程度上去除细胞群体中的单核细胞。在一些实施方案中，将所述细胞悬浮于冷冻溶液中，例如在清洗去除血浆和血小板之后。可采用各种已知冷冻溶液和一些方面的参数。一个实例涉及用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HAS)的PBS，或是其它合适的细胞冷冻培养基。然后，用培养基1:1将其稀释，使得DMSO和HSA的终浓度分别是10％和4％。其它实例包含
Figure BDA0002980945400001471
CTL-CryoTMABC冷冻培养基等。然后，一般以1度/分钟的速率将细胞冷冻至-80℃，并贮存在液氮储罐的汽相中。
在一些实施方案中，所述方法包括培养(cultivation)、孵育、培养(culture)和/或基因工程步骤。例如，在一些实施方案中，提供了用于孵育和/或工程改造消除的细胞群体和培养启动组合物的方法。
因此，在一些实施方案中，将细胞群体在培养启动组合物中孵育。所述孵育和/或工程改造可以在培养容器中进行，如单元、腔室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或用于培养或培养细胞的其它容器。
在一些实施方案中，在基因工程改造之前或与基因工程改造一起孵育和/或培养细胞。所述孵育步骤包含培养(culture)、培养(cultivation)、刺激、激活和/或增殖。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂存在下孵育组合物或细胞。这种条件包含设计成实现以下目的的那些条件：诱导群中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原接触，和/或准备细胞以便基因改造，如导入重组抗原受体。
所述条件可包含如下一项或多项：特定培养基、温度、含氧量、二氧化碳含量、时间、试剂(例如，营养剂)、氨基酸、抗生素、离子，和/或刺激因子如细胞因子、趋化因子、抗原、结合伴侣、融合蛋白、重组可溶性受体，和设计用来激活细胞的任何其它物质。
在一些实施方案中，刺激条件或试剂包含能够激活TCR复合物的胞内信号传导结构域的一种或多种试剂，例如配体。在一些方面，所述试剂打开或启动T细胞中的TCR/CD3胞内信号传导级联。这种试剂可以包含抗体，如对TCR组分和/或共刺激受体具有特异性的抗体，例如，抗-CD3、抗-CD28，其例如与固体支持物(如珠和/或一种或多种细胞因子)结合。任选地，扩增方法还可包括如下步骤：向培养基(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)添加抗-CD3和/或抗CD-28抗体。在一些实施方案中，刺激剂包含IL-2和/或IL-15，例如，浓度为至少约10单位/mL mL的IL-2。
在一些方面中，根据以下文献中描述的技术进行孵育：如属于Riddell等人的美国专利第6,040,177号，Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660，Terakura等人(2012)Blood.1:72-82和/或Wang等人(2012)JImmunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，T细胞通过如下方式扩增：向培养启动组合物中添加饲养细胞，如非分裂型外周血单核细胞((PBMC))，((例如，使所得细胞群体中初始待扩增群体中的各T淋巴细胞含有至少约5、10、20或40或更多PBMC饲养细胞))；和孵育所述培养物((例如，孵育足以扩增所述数量的T细胞时间))。在一些方面，所述非分裂型饲养细胞可包括经γ-辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，所述PBMC用在约3000至3600拉德范围内的γ射线辐照，以防止细胞分裂。在一些实施方案中，用Mytomicin C灭活PBMC饲养细胞。在一些方面，在添加T细胞群之前将所述饲养细胞添加至培养基。
在一些实施方案中，刺激条件包含适于人T淋巴细胞生长的温度，例如，至少约25摄氏度，一般至少约30度，且一般是或约是37摄氏度。任选地，孵育还可包括添加非分裂型EBV-转化的类淋巴母细胞((LCL))作为饲养细胞。LCL可以用在约6000至10000拉德范围内的γ射线辐照。在一些方面，LCL饲养细胞以任何合适的量提供，如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率是至少约10:1。
在实施方案中，通过用抗原刺激原初或抗原特异性T淋巴细胞来获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+T细胞。例如，可如下产生对巨细胞病毒抗原的抗原特异性T细胞系或克隆：从感染的受试者中分离T细胞并采用相同的抗原体外刺激细胞。
测定
本领域已知的多种测定可用于鉴定和表征本文所述的HLA-肽ABP。
结合、竞争和表位作图测定
可使用任何合适的方法来评估本文所提供的ABP的特异性抗原结合活性，所述方法包括使用SPR、BLI、RIA和MSD-SET((如本公开其它部分所描述))。另外，可以通过ELISA测定、使用流式细胞术和/或蛋白质印记测定来评估抗原结合活性。
用于测量两个ABP或ABP与另一个分子((例如，HLA-肽的一个或多个配体，如TCR))之间的竞争的测定描述于本公开的其它部分和例如，Harlow和Lane，ABPs:A LaboratoryManual第14章，1988,Cold Spring HarborLaboratory,Cold Spring Harbor,N.Y，其通过引用整体并入。
对本文提供的ABP结合的表位作图的测定描述于，例如，Methods inMolecularBiology第66卷，1996,Humana Press,Totowa,N.J.中的Morris“Epitope MappingProtocols”中，其通过引用整体并入。在一些实施方案中，表位由肽竞争决定。在一些实施方案中，表位通过质谱法确定。在一些实施方案中，表位由诱变决定。在一些实施方案中，表位由晶体学确定。
效应功能测定
本文提供的ABP和/或细胞治疗后的效应功能可采用本领域已知的多种体外和体内测定来评估，包含下述文献中描述的方法：Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.,1991,9:457-492；美国专利第5,500,362号、第5,821,337号；Hellstrom等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA,1986,83:7059-7063；Hellstrom等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA,1985,82:1499-1502；Bruggemann等人，J.Exp.Med.,1987,166:1351-1361；Clynes等人，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA,1998,95:652-656；WO 2006/029879；WO 2005/100402；Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods,1996,202:163-171；Cragg等人，Blood,2003,101:1045-1052；Cragg等人，Blood,2004,103:2738-2743以及Petkova等人，Int’l.Immunol.,2006,18:1759-1769；其各自均通过引用整体并入。
药物组合物
本文提供的ABP、细胞或HLA-肽靶标可配制成任何合适的药物组合物，并通过任何适用的给药途径施用。合适的给药途径包含但不限于：动脉内、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、鼻内、肠胃外、肺部和皮下途径。
药物组合物可包含一种或多种药物赋形剂。可以使用任何合适的药物赋形剂，并且本领域普通技术人员能够选择合适的药物赋形剂。因此，以下提供的药物赋形剂仅是示例性的，而非限制性的。另外的药物赋形剂包含，例如，Handbook of PharmaceuticalExcipients,Rowe等人(编辑)第6版(2009)(其通过引用整体并入)中描述的药物赋形剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含消泡剂。可以使用任何合适的消泡剂。在一些方面，所述消泡剂选自醇、醚、油、蜡、硅酮、表面活性剂及其组合。在一些方面，所述消泡剂选自矿物油、植物油乙撑双硬脂酰胺、石蜡、酯蜡、脂肪醇蜡、长链脂肪醇、脂肪酸皂、脂肪酸酯、硅乙二醇、氟硅酮、聚乙二醇-聚丙二醇共聚物、聚二甲基硅氧烷-二氧化硅、醚、辛醇、癸醇、脱水山梨醇三油酸酯、乙醇、2-乙基己醇、二甲硅油、油醇、西甲硅油及其组合。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含助溶剂。助溶剂的说明性实例包含乙醇、聚((乙二醇))、丁二醇、二甲基乙酰胺、甘油、丙二醇及其组合。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含缓冲剂。缓冲剂的说明性实例包含乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、乳酸盐、苹果酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、氢氧化物、二乙醇胺、单乙醇胺、甘氨酸、蛋氨酸、瓜尔豆胶、谷氨酸钠及其组合。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含载体或填充剂。载体或填充剂的说明性实例包含乳糖、麦芽糖糊精、甘露醇、山梨糖醇、壳聚糖、硬脂酸、黄原胶、瓜尔胶及其组合。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含表面活性剂。表面活性剂的说明性实例包含：d-α生育酚、苯扎氯铵、苄索氯铵、溴棕三甲铵、氯化十六烷基吡啶、多库酯钠、甘油山嵛酸酯、单油酸甘油酯、月桂酸、聚乙二醇15羟基硬脂酸酯、肉豆蔻醇、磷脂、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚氧甘油酯、月桂基硫酸钠、山梨糖醇酯、维生素E聚乙烯((乙二醇))琥珀酸酯及其组合。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含抗结块剂。抗结块剂的说明性实例包含磷酸钙((三元酸))、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、氧化镁及其组合。
可与药物组合物一起使用的其它赋形剂包含，例如白蛋白、抗氧化剂、抗菌剂、抗真菌剂、生物可吸收的聚合物、螯合剂、控释剂、稀释剂、分散剂、溶解增强剂、乳化剂、胶凝剂、软膏基质、渗透促进剂、防腐剂、增溶剂、溶剂、稳定剂、糖及其组合。这些试剂的具体实例均描述于，例如Handbookof PharmaceuticalExcipients,Rowe等人(编辑)第6版(2009)(其通过引用整体并入)中。
在一些实施方案中，所述药物组合物包含溶剂。在一些方面，所述溶剂是盐溶液，如无菌等渗盐溶液或右旋糖溶液。在某一些方面，所述溶剂是注射用水。
在一些实施方案中，所述药物组合物为颗粒态，如微粒或纳米颗粒。微粒和纳米颗粒可以由任何合适的材料形成，如由聚合物或脂质。在一些方面，微粒或纳米颗粒是胶束、脂质体或聚合物囊泡。
由于水可以促进一些ABP的降解，因此本文还提供了包含ABP的无水药物组合物和剂型。
本文提供的无水药物组合物和剂型可以使用无水或含水量低的成分在低水分或低湿度条件下制备。如果预期在制造、包装和/或储存期间与水分和/或湿气大量接触，则包含乳糖和至少一种包括伯胺或仲胺的活性成分的药物组合物和剂型可以是无水的。
应制备和储存无水药物组合物，以保持其无水性质。因此，无水组合物可以使用已知的防止触水的材料包装，使得它们包含在合适的处方试剂盒中。合适的包装的实例包含但不限于气密的箔、塑料、单位剂量容器((例如，小瓶))、泡罩包装和条状包装。
在某些实施方案中，本文提供的ABP和/或细胞被配制成肠胃外剂型。肠胃外剂型可以通过多种途径给予受试者，包含但不限于皮下、静脉内((包含输注和推注))、肌内和动脉内。由于其给药途径通常绕过受试者对污染物的天然防御，因此肠胃外剂型通常是无菌的或能够在施用于受试者之前被灭菌。肠胃外剂型的实例包含但不限于注射用溶液、待溶解或悬浮在药学上可接受的注射媒介物中的干燥((例如，冻干))产品、注射用悬浮液和乳剂。
本领域技术人员熟知用于提供肠胃外剂型的合适的媒介物。实例包含但不限于：注射用水((见USP))；水性媒介物，如但不限于氯化钠注射液、林格氏注射液、右旋糖注射液、右旋糖和氯化钠注射液以及乳酸林格氏注射液；水溶性媒介物，如但不限于乙醇、聚乙二醇和聚丙二醇；以及无水媒介物，如但不限于玉米油、棉籽油、花生油、芝麻油、油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯和苯甲酸苄酯。
也可以在肠胃外剂型中掺入赋形剂，所述赋形剂增加本文公开的ABP和/或细胞中的一种或多种的溶解度。
在一些实施方案中，肠胃外剂型是冻干的。示例性的冻干制剂描述于例如，美国专利第6,267,958和6,171,586号；和WO 2006/044908；其均通过引用整体并入。
在人疗法中，医生会根据预防性或治疗性治疗并根据年龄、体重、病状和要治疗受试者的其它特定因素来确定他认为最合适的剂量。
在某些实施方案中，本文提供的组合物是药物组合物或单一单位剂型。本文提供的药物组合物和单一单位剂型包含预防或治疗有效量的一种或多种预防或治疗ABP。
有效预防或治疗病症或其一种或多种症状的ABP、细胞或组合物的用量会随病症或病状的性质和严重程度以及ABP和/或细胞的施用途径而改变。频率和剂量也会根据每个受试者的具体因素而有所不同，具体取决于所施用的特定疗法((例如，治疗剂或预防剂))，病症、疾病或病状的严重程度，给药途径以及受试者的年龄、身体、体重、反应和既往病史。有效剂量可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线推断出来。
本领域普通技术人员容易知晓，不同的治疗有效量可适用于不同的疾病和病状。类似地，本文提供的剂量和剂量频率方案也涵盖足以预防、控制、治疗或改善这种病症但不足以引起或足以减轻与本文提供的ABP和/或细胞相关的副作用的剂量。此外，向受试者施用多种剂量的本文提供的组合物时，并非所有剂量都要一样。例如，可以增加施用于受试者的剂量以改善组合物的预防或治疗效果，或者可以降低其给药剂量以减少特定受试者正在经历的一种或多种副作用。
在某些实施方案中，可以先用本文提供的ABP或组合物的一种或多种负荷剂量进行治疗或预防，然后再使用一种或多种维持剂量。
在某些实施方案中，施用本文提供的剂量的ABP、细胞或组合物以达到受试者的血液或血清中的ABP和/或细胞的稳态浓度。稳态浓度可以根据技术人员现有的技术通过测量来确定，或者可以基于受试者的身体特征如身高、体重和年龄来确定。
如本公开中其它部分更详细讨论，本文提供的ABP和/或细胞可以任选地与一种或多种用于预防或治疗疾病或病症的另外的试剂一起施用。这种另外的试剂的有效量取决于制剂中存在的ABP的量、病症或治疗类型以及本领域已知或本文所述的其它因素。
治疗用途
对于治疗用途，以药学上可接受的剂型((如本领域已知的剂型和上文所讨论的剂型))，向哺乳动物，通常为人，施用ABP和/或细胞。例如，可以在一段时间内通过肌肉、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内或肿瘤内途径，经静脉推注或连续输注向人静脉内施用ABP和/或细胞。还可以通过癌周、病灶内或病灶周围的途径适当地施用ABP，以发挥局部以及全身治疗作用。腹膜内途径，例如在卵巢肿瘤的治疗中，可能特别有用。
本文提供的ABP和/或细胞可用于治疗任何与HLA-肽相关的疾病或病状。在一些实施方案中，所述疾病或病状是受益于抗HLA-肽ABP和/或细胞治疗的疾病或病状。在一些实施方案中，所述疾病或病状是肿瘤。在一些实施方案中，所述疾病或病状是细胞增殖性病症。在一些实施方案中，所述疾病或病状是癌症。
在一些实施方案中，本文提供的ABP和/或细胞用作药物。在一些实施方案中，本文提供的ABP和/或细胞用于药物的生产或制备。在一些实施方案中，所述药物用于治疗可受益于抗HLA-肽ABP和/或细胞的疾病或病状。在一些实施方案中，所述疾病或病状是肿瘤。在一些实施方案中，所述疾病或病状是细胞增殖性病症。在一些实施方案中，所述疾病或病状是癌症。
在一些实施方案中，本文提供了向有需要的受试者施用有效量的本文提供的ABP和/或细胞来治疗所述受试者的疾病或病状的方法。在一些方面，所述疾病或病状是癌症。
在一些实施方案中，本文提供了向有需要的受试者施用有效量的本文提供的ABP和/或细胞来治疗所述受试者的疾病或病状的方法，其中所述疾病或病状是癌症，所述癌症选自实体瘤和血液肿瘤。
在一些实施方案中，本文提供了对有需要的受试者进行免疫应答调节的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的本文公开的ABP和/或细胞或药物组合物。
联合治疗
在一些实施方案中，本文提供的ABP和/或细胞与至少一种另外的治疗剂一起施用。任何合适的另外的治疗剂可以与本文提供的ABP和/或细胞一起施用。可以将另外的治疗剂与ABP融合。在一些方面，所述另外的治疗剂选自放射物、细胞毒性剂、毒素、化学治疗剂、细胞抑制剂、抗激素剂、EGFR抑制剂、免疫调节剂、抗血管生成剂及其组合。在一些实施方案中，另外的治疗剂是ABP。
诊断方法
还提供了用于预测和/或检测受试者的细胞上是否存在给定的HLA-肽的方法。这种方法可用于，例如，预测和评估对使用本文提供的ABP和/或细胞进行的治疗的反应性。
在一些实施方案中，从受试者获得血液或肿瘤样品，并确定表达HLA-肽的细胞的比例。在一些方面，确定由这种细胞表达的HLA-肽的相对量。可以通过任何合适的方法来确定表达HLA-肽的细胞的比例和由这种细胞表达的HLA-肽的相对量。在一些实施方案中，用流式细胞术进行这种测量。在一些实施方案中，用荧光辅助细胞分选(FACS)进行这种测量。关于评价外周血中HLA-肽的表达的方法，参见(Li等人J.Autoimmunity,2003,21:83-92)。
在一些实施方案中，采用免疫沉淀法和质谱法检测受试者细胞中是否存在给定的HLA-肽。这可以通过获得肿瘤样品((例如，冷冻的肿瘤样品))如原发性肿瘤样品并进行免疫沉淀法以分离一种或多种肽来进行。可以通过实验确定肿瘤样品的HLA等位基因或从第三方来源获得。对一种或多种肽进行质谱法(MS)以确定其序列。然后在数据库中搜索来自质谱法的谱。下面的“实例”部分提供了实例。
在一些实施方案中，使用基于计算机的模型来预测受试者细胞中是否存在应用于肽序列的给定的HLA-肽和/或包括所述肽序列((例如，RNA序列或RT-PCR或纳米链))的一个或多个基因的RNA测量值。所用模型如国际专利申请第PCT/US2016/067159号中所描述，出于所有目的，其通过引用整体并入。
试剂盒
还提供了包括本文提供的ABP和/或细胞的试剂盒。如本文所述，所述试剂盒可用于治疗、预防和/或诊断疾病或病症。
在一些实施方案中，所述试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或药品说明书。合适的容器包含例如瓶、小瓶、注射器和IV溶液袋。所述容器可以由多种材料构成，如玻璃或塑料。所述容器可容纳有效(本身或与其它组合物组合)治疗、预防和/或诊断疾病或病症的组合物。所述容器具有无菌入口。例如，如果所述容器是静脉内溶液袋或小瓶，则其可能具有可以被针头刺穿的端口。所述组合物中的至少一种活性剂是本文提供的ABP。所述标签或药品说明书指示所述组合物用于治疗选择的病状。
在一些实施方案中，所述试剂盒包括：(a)第一容器，其含有第一组合物，其中所述第一组合物包括本文提供的ABP和/或细胞；和(b)第二容器，其含有第二组合物，其中所述第二组合物包含其它治疗剂。这一实施方案中的试剂盒可还包含药品说明书，用于指示所述组合物可用于治疗特定病状，例如癌症。
替代地或另外地，所述试剂盒可还包括第二(或第三)容器，其包含药学上可接受的赋形剂。在一些方面，所述赋形剂是缓冲剂。所述试剂盒可进一步包含从商业和用户的角度来看满足需要的其它材料，包含过滤器、针头和注射器。
实施例
以下是用于实施本发明的具体实施例的实例。所提供的实例仅出于说明目的，而无意以任何方式限制本发明的范围。虽已尽力确保所用数字(例如，量、温度等)的准确性，但当然应允许一些实验误差和偏差。
除非另行说明，否则本发明将采用本领域技术范围内的蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学的常规方法来实施。文献中对这种技术进行了充分的说明。参见，例如，T.E.Creighton,Proteins:Structures and Molecular Properties(W.H.Freeman andCompany,1993)；A.L.Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers,Inc.，最新版)；Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版,1989)；Methods InEnzymology(S.Colowick和N.Kaplan编辑，Academic Press,Inc.)；Remington'sPharmaceutical Sciences，第18版(Easton,Pennsylvania:Mack Publishing Company,1990)；Carey和Sundberg Advanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)第A卷和第B卷(1992)。
实施例1：预测的HLA-肽复合物(表A)的鉴定
我们鉴定了两类癌症特异性HLA肽靶标：第一类(癌症睾丸抗原，CTA)在大多数正常组织中不表达或以最低水平表达，并在肿瘤样品中表达。第二类(肿瘤相关抗原，TAA)在肿瘤样品中高表达，并可在正常组织中低表达。
我们使用三个计算步骤鉴定了基因靶标：首先，我们使用可通过基因型-组织表达(GTEx)项目[1]获得的数据，鉴定了在大多数正常组织中低表达或无表达的基因。我们从基因型-组织表达(GTEx)项目(V7p2版)中获得了聚集的基因表达数据。该数据集包括来自714名个体和53种不同组织类型的11,688份死后样品。表达是用RNA-Seq测量的，并根据GTEx标准管道(https://www.gtexportal.org/home/documentationPage)进行计算处理。利用使用RSEM v1.2.22[2]计算的同种型表达的总和计算基因表达。
接下来，我们使用来自癌症基因组图谱(TCGA)研究网络：http://cancergenome.nih.gov/的数据，鉴定了那些基因中有哪些基因在癌症样品中异常表达。我们检测了11,093份可从TCGA(数据发布6.0(Data Release 6.0))获得的样品。因为GTEx和TCGA在它们的计算分析中使用了不同的人基因组注释，所有我们只包括了在两个数据集之间有编码映射的基因。
最后，在这些基因中，我们使用对通过串联质谱(MS/MS)测序的HLA呈递肽进行训练的深度学习模型，鉴定了哪些肽可能被MHC I类蛋白呈递为细胞表面抗原，如国际专利申请第PCT/US2016/067159号(出于所有目的，通过引用整体并入本文)所描述的。
下面给出这两类基因的具体标准。
CTA纳入标准
为了鉴定CTA，我们试图定义标准来排除在正常组织中表达的基因，所述标准足够严格以确保肿瘤特异性，但不能排除由潜在伪像(如读段错位)引起的非零测量值。如果基因符合以下标准，则其有资格作为CTA纳入：作为大脑、心脏或肺的一部分的每个器官中的中位GTEx表达值小于0.1个转录本/100万(TPM)，且没有一个样品超过5TPM。在其它重要器官中，中位GTEx表达值小于2TPM并且没有一个样品超过10个TPM。被归类为非必需的器官(睾丸、甲状腺和小唾液腺)的表达被忽略。如果基因在TCGA中的表达量上在至少30个样品中大于20TPM，则认为所述基因在肿瘤样品中表达。
然后，我们检查了TCGA样品中剩余基因的表达分布。当我们检查已知的(CTA)，例如MAGE基因家族时，我们观察到这些基因在对数空间中的表达通常具有双峰分布的特点。这一分布由在较低的表达值附近的左模式和在较高的表达水平的右模式((或粗尾巴))组成。这一表达模式与生物学模型一致，在所述生物学模型中，所有样品的基线处都检测到一些最小表达，而在表观遗传失调的肿瘤子集中观察到所述基因的更高表达水平。我们回顾了每个基因在TCGA样品中的表达分布，并丢弃了那些仅观察到单峰分布而没有明显右尾的样品。
TAA纳入标准
通过关注在肿瘤组织中比在正常组织中高得多的表达的基因来鉴定TAA：我们首先鉴定了在所有GTEx必需的正常组织中的中位TPM小于10的基因，然后选择在至少一个TCGA肿瘤组织中具有大于100TPM的表达的子集。然后，我们检查了这些基因中每一个的分布，并选择了那些具有表达双峰分布的基因，以及在一种或多种肿瘤类型中表达显著升高的额外证据。
对列表进行了进一步的审查，以排除已知在组织中表达但在GTEx中未充分表现或者可来源于肿瘤内的免疫细胞浸润的基因。这些步骤给我们留下了56个CTA和58个TAA基因的最终列表。
我们还添加了来自已知存在于癌症中的另外两种蛋白质的肽。我们添加了来自EGFR-SEPT14融合蛋白[3]的连接肽，并添加了来自KLK3(PSA)的肽。我们还添加了来自与PSA相同基因家族的两个基因：KLK2和KLK4的肽。
为了鉴定可能被MHC I类蛋白当作细胞表面抗原呈递的肽，我们使用了滑动窗将这些蛋白质中的每一个解析为其组成的8-11个氨基酸序列。我们使用HLA肽呈递深度学习模型处理这些肽和其侧翼序列，以计算在TCGA中针对该基因观察到的最高表达水平下的呈递的可能性。如果我们的模型计算出的肽的分位数归一化呈递概率大于0.001，我们认为该肽可能被呈递(即，候选靶标)。
结果示于表A中。该表包括在2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793中，其通过引用以其整体并入。
总之，所述实例提供了大量肿瘤特异性HLA-肽，可将其作为ABP开发的候选靶标。
参考文献
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实施例2：预测的HLA-肽复合物的验证
对已知对来自各HLA-肽复合物的每个给定的HLA等位基因呈阳性的肿瘤样品使用质谱法(MS)来确定来自表A、表A1和表A2的HLA-肽复合物的肽的存在。
在裂解和溶解组织样品后(1-4)，使用经典的免疫沉淀((IP))法分离HLA-肽分子。首先将新鲜的冷冻组织在液氮中冷冻并粉碎(CryoPrep；Covaris,Woburn,MA)。将1/10的样品等分用于基因测序工作，并加入裂解缓冲液(1％CHAPS、20mM Tris-HCl、150mM NaCl、蛋白酶和磷酸酶抑制剂，pH＝8)以溶解剩余的经冲击组织。将样品裂解物在4℃旋转2小时以沉淀碎屑。澄清的裂解物用于HLA特异性免疫沉淀。
使用偶联至珠子的抗体进行免疫沉淀，其中所述抗体对HLA分子具有特异性。对于全I类HLA免疫沉淀，使用抗体W6/32(5)，对于II类HLA-DR，使用抗体L243(6)。在过夜孵育期间，抗体共价结合至NHS-琼脂糖珠。共价结合后，将珠子洗涤并等分用于免疫沉淀。可以使用免疫沉淀的另外的方法，包含但不限于抗体的蛋白A/G捕获、磁珠分离或其它通常用于免疫沉淀的方法。
将裂解物添加至抗体珠，并在4℃旋转过夜以进行免疫沉淀。免疫沉淀后，将珠从裂解液中取出，并将裂解液储存起来用于另外的实验，包含另外的免疫沉淀。洗涤免疫沉淀后珠以除去非特异性结合，并用2N乙酸从珠上洗脱HLA/肽复合物。使用分子量旋转柱或C18清洁步骤去除肽中的蛋白组分。通过SpeedVac蒸发所得肽至干燥，在质谱分析之前可在-20℃下储存。
将干燥的肽在高效液相色谱法(HPLC)缓冲液A中重构，并加载到C-18微毛细管HPLC色谱柱上，以便在质谱仪中进行梯度洗脱。在180分钟内，使用0-40％B(溶剂A：0.1％甲酸，溶剂B：0.1％甲酸的80％乙腈溶液)梯度洗脱，将肽洗脱到Fusion Lumos质谱仪(Thermo)中。在Orbitrap检测器中以120,000的分辨率收集肽质量/电荷(m/z)的MS1质谱图，然后进行20次MS2扫描。使用数据相关的采集模式选择MS2离子，并且在选择MS2离子后动态排除30秒。MS1扫描的自动增益控制(AGC)设置为4×105，而MS2扫描的自动增益控制设置为1×104。对于HLA肽的测序，可以选择+1、+2和+3电荷状态用于MS2的片段化。或者，可使用质量靶向方法获得MS2谱，其中仅选择包含列表中列出的质量进行分离和片段化。这通常称为靶向质谱分析法，以定性方式或定量方式进行。定量方法要求待定量的每种肽采用重标记的氨基酸进行合成。(Doerr，2013)。
使用Comet(7-8)从蛋白质数据库中检索每次分析获得的MS2谱，并使用Percolator(9-11)或使用PEAKS的集成从头测序和数据库搜索算法对肽鉴定进行评分。使用Skyline(Lindsay K.Pino等人，2017)或其它方法分析来自靶向MS2实验的肽，以分析预测的片段离子。
对已知对来自各HLA-肽复合物的每个给定的HLA等位基因呈阳性的各种肿瘤样品使用质谱法(MS)来确定来自预测的HLA-肽复合物的多种肽的存在。
图51-63中显示了选定的HLA-限制性肽的代表性谱数据。每个谱包含肽片段信息以及与患者样品相关的信息，包括HLA类型。
氨基酸的自发修饰可以发生在许多氨基酸上。半胱氨酸特别容易受到这一修饰的影响，并且可以被游离半胱氨酸氧化或修饰。另外，N末端谷氨酰胺氨基酸可被转化为焦谷氨酸。由于这些修饰中的每一种都会导致质量变化，因此它们可以明确地分配在MS2谱中。为了在制备ABP时使用这些肽，所述肽可能需要含有与质谱仪中观看到的修饰相同的修饰。可以使用简单的实验室和肽合成方法(Lee等人，参考文献14)来产生这些修饰。
参考文献
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实施例3：鉴定结合HLA-肽靶标HLA-B＊35：01EVDPIGHVY、HLA-A＊02：01 AIFPGAVPAA和HLA-A＊01：01 ASSLPTTMNY的抗体或其抗原结合片段
概述
以下示例证明可以鉴定识别肿瘤特异性HLA-限制性肽的抗体(Ab)。这种抗体识别的总体表位一般包含肽以及呈递所述特定肽的HLA蛋白的复合表面。以肽特异性方式识别HLA复合物的抗体通常称为T细胞受体(TCR)样抗体或TCR-拟态抗体。源自肿瘤特异性基因产物MAGEA6、FOXE1、MAGE3/6的被选择用于抗体发现的HLA肽靶抗原分别是HLA-B*35:01_EVDPIGHVY(HLA-肽靶标“G5”)、HLA-A*02:01_AIFPGAVPAA(HLA-肽靶标“G8”)和HLA-A*01:01_ASSLPTTMNY(HLA-肽靶标“G10”)。如实施例2所述，通过对从肿瘤样品获得的HLA复合物的质谱分析，证实了这些HLA-肽靶标的细胞表面呈递。图25-27中描绘了代表性的曲线图。
HLA-肽靶复合物和反向筛选肽-HLA复合物
采用既定方法，使用HLA分子的条件配体重组生产HLA-肽靶标G5、G8、G10以及反向筛选阴性对照肽-HLA。总计，针对HLA-肽靶标中的每一个，生成了18个反向筛选HLA-肽。18个反向筛选HLA-肽被设计成使得(A)已知阴性对照肽由相同的HLA亚型(即HLA相关对照)呈现，或(B)已知阴性对照肽由不同的HLA亚型呈现。图3中显示了筛选1的靶标和阴性对照肽-HLA复合物的分组(详细的序列信息在表1中提供)，并且图4中显示了筛选2的靶标和阴性对照肽-HLA复合物的分组(详细的序列信息在表2中提供)。
Figure BDA0002980945400001641
Figure BDA0002980945400001651
Figure BDA0002980945400001652
HLA-肽靶标复合物和反向筛选肽-HLA复合物的产生及稳定性分析
图5中显示了G5反向筛选“微型集合”和G2靶标的结果。所有三种反向筛选肽和G5肽均解救了HLA复合物，使其免于解离。
图6中显示了额外的G5“完整”集合反向筛选肽的结果，表明它们也形成稳定的HLA-肽复合物。
图7中显示了反向筛选肽和G8靶标的结果。所有三种反向筛选肽和G8肽均解救了HLA复合物，使其免于解离。
图8中显示了G10反向筛选“微型集合”和G10靶标的结果。所有三种反向筛选肽和G10肽均解救了HLA复合物，使其免于解离。
图9中显示了额外的G8和G10“完整”集合反向筛选肽的结果，表明它们也形成稳定的HLA-肽复合物。
噬菌体文库筛选
来自Distributed Bio Inc的高度多样化的SuperHuman 2.0合成原初scFv文库被用作噬菌体展示的输入材料，其在超稳定和多样化的VH/VL支架上具有7.6x1010种总多样性。对于筛选1(见图3)和筛选2(见图4)，使用已建立的方案进行3至4轮基于珠粒的噬菌体淘选(利用靶pHLA复合物(如表3所示))以分别鉴定至pHLA G5、G8和G10的scFv结合剂。对于每一轮淘选，在与靶pHLA结合步骤之前，最初用18个合并的阴性pHLA复合物耗竭噬菌体文库。在每一轮淘选时测定噬菌体滴度，以确定非结合噬菌体的去除。还通过ELISA测试了输出噬菌体上清液的靶标结合，并表明G5-、G8和G10结合噬菌体的逐渐富集(见图10)。
Figure BDA0002980945400001661
随后在96孔板中使用良好建立的方案产生单个输出克隆的细菌周质提取物(PPE)。将PPE用于通过高通量PPE ELISA测试与靶pHLA抗原的结合。对阳性克隆进行测序并将其重新排列以选择序列独特的克隆。然后在二级ELISA中测试序列独特的克隆与靶pHLA对比一小组HLA匹配的阴性对照pHLA复合物的结合，从而建立靶标特异性。G8阴性对照HLA复合物(即，A*24:02)与G8靶标HLA复合物(即A*02:01)并非HLA-匹配。因此，在从scFv文库中检索到的TCR模拟Ab的进一步生化和功能表征测定中，将呈递来自G7的肽LLFGYPVYV、GILGFVFTL或FLLTRILTI的HLA-A*02:01复合物用作G8的HLA匹配的阴性对照微型集合。
scFv命中的分离
产生单个可溶性scFv蛋白片段，并纯化其的被发现在PPE中表达时具有选择性的scFv克隆。如通过scFv PPE ELISA所示的，与与阴性对照pHLA微型集合的结合相比，这些克隆表现出至少3倍的与靶pHLA的选择性结合。可溶性scFv的产生允许进一步的生物化学和功能表征。
表4中显示了结合靶标G5的scFv的所得VH和VL序列。为了阐明表4以及scFv序列的其它表的组织结构，在表4中为每个scFv赋予了克隆名称。对于所有克隆名称，克隆名称应注明最初从中挑选克隆的96孔板的靶标(例如，G5)、板号(例，板7)和孔号(例如，孔E7)。例如，克隆名称G5-P7E07、G5-7E7、G5(7E7)、G5(7E07)G5_P7_E7，都是指同一个scFv克隆。例如，表4指示来自克隆G5_P7_E7的scFv具有VH序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGIINPRSGSTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGVRYYGMDVWGQGTTVTVSSAS和VL序列DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLQTPITFGQGTRLEIK。
表5中显示了结合靶标G5的scFv的所得CDR序列。为了阐明表5的组织结构，在表5中为每个scFv赋予了克隆名称。例如，根据Kabat编号系统，来自克隆G5_P7_E7的scFv的HCDR1序列为YTFTSYDIN，并且HCDR2序列为GIINPRSGSTKYA，HCDR3序列为CARDGVRYYGMDVW，LCDR1序列为RSSQSLLHSNGYNYLD，LCDR2序列为LGSYRAS以及LCDR3序列为CMQGLQTPITF。
表6中显示了结合靶标G8的scFv的所得VH和VL序列。表6的组织类似于表4。
表7中显示了结合靶标G8的scFv的所得CDR序列。表7的组织类似于表5。
表8中显示了结合靶标G10的scFv的所得VH和VL序列。表8的组织类似于表4。
表9中显示了结合靶标G8的scFv的所得CDR序列。表9的组织类似于表5。
许多克隆被格式化为scFv、Fab和IgG，以促进生物化学、结构和功能的表征(见表10)。
Figure BDA0002980945400001681
图11描绘了描述抗体选择过程的流程图，所述过程包括scFv、Fab和IgG形式的标准和预期应用。简言之，基于序列多样性、结合亲和力、选择性和CDR3多样性，选择克隆用于进一步表征。
为了评估序列多样性，使用clustal软件生成系统树图。还考虑了基于VH类型的scFv序列的预测的3D结构。由平衡解离常数(KD)确定的结合亲和力使用Octet HTX(ForteBio)测量。与阴性对照pHLA复合物或单独的链霉亲和素的微型集合相比，通过纯化的scFv的ELISA滴定来确定特定肽-HLA复合物的选择性。基于针对每个组内的Fab获得的值的范围，确定每个靶标组的KD的截止值和选择性。基于序列家族和CDR3序列的多样性选择最终的克隆。
噬菌体文库筛选和scFv分离后的总命中数列于上表10。
材料和方法
HLA表达和纯化：
使用已建立的程序(Garboczi,Hung,&Wiley,1992)通过细菌表达获得重组蛋白。简言之，在BL21感受态大肠埃希氏菌细胞
Figure BDA0002980945400001692
中分别表达各种人白细胞抗原(HLA)的α-和β2微球蛋白链。自动诱导后，在
Figure BDA0002980945400001691
全能核酸酶蛋白提取试剂
Figure BDA0002980945400001693
中通过超声处理裂解细胞。洗涤所得包涵体，并在具有和不具有0.5％Triton X-100((50mM Tris、100mMNaCl、1mM EDTA))的洗涤缓冲液中进行超声处理。最后一次离心后，将包涵体颗粒溶于尿素溶液((8M尿素、25mM MES、10mM EDTA、0.1mM DTT，pH6.0))中。使用Bradford测定((Biorad))定量浓度，并将包涵体储存在-80℃。
pHLA的重折叠和纯化
HLA复合物是通过使用已建立的程序将重组产生的亚基和合成得到的肽重折叠而获得的(Garboczi等人，1992)。简言之，将纯化的α和β2微球蛋白链与靶标肽或可切割的配体在重折叠缓冲液((100mM Tris pH 8.0、400mM L-精氨酸HCl、2mM EDTA、50mM氧化型谷胱甘肽、5mM还原型谷胱甘肽、蛋白酶抑制剂片))中重折叠。用Vivaflow 50或50R crossflowcassette
Figure BDA0002980945400001695
Figure BDA0002980945400001696
浓缩重折叠溶液。在20mM Tris pH 8.0中进行三轮透析，每轮至少8小时。为了进行抗体筛选和功能测定，使用BirA生物素连接酶(Avidity)对重新折叠的HLA进行酶促生物素化。使用附接到
Figure BDA0002980945400001694
系统的HiPrep
Figure BDA0002980945400001697
尺寸排阻柱纯化重折叠的蛋白质复合物。在非还原条件下，通过将重折叠的蛋白质与过量的链霉亲和素在室温下孵育15分钟，然后进行SDS-PAGE，在链霉亲和素凝胶移位测定中确认了生物素化。将肽-HLA复合物等分并储存在-80℃。
肽交换：
HLA肽的稳定性通过条件配体肽交换和稳定性ELISA测定进行评估。简言之，在存在或不存在反向筛选或测试肽的情况下，对条件配体-HLA复合物进行±条件刺激。暴露于条件刺激下，从HLA复合物中裂解条件配体，导致HLA复合物解离。如果反向筛选或测试肽稳定地结合HLA复合物的α1/α2沟，则可以“解救”HLA复合物使其免于解离。简言之，将100μL的50μM的新肽(Genscript)和0.5μM重组产生的可裂解配体负载的HLA在20mM TrisHCl和50mMNaCl(pH 8)中的混合物置于冰上。混合物在装有365-nm紫外灯的紫外交联剂(CL-1000,UVP)中照射15分钟，照射距离约为10cm。
MHC稳定性测定：
使用已建立的程序进行MHC稳定性ELISA。(Chew等人，2011；Rodenko等人，2006)在384孔透明平底聚苯乙烯微孔板
Figure BDA0002980945400001701
上预涂
Figure BDA0002980945400001702
在PBS中浓度为2μg/mL的链霉亲和素
Figure BDA0002980945400001703
在37℃下孵育2小时后，用0.05％的于PBS中的Tween 20洗涤缓冲液洗涤孔(四次，50μL)，用50μl封闭缓冲液(2％的于PBS中的BSA)处理，并在室温下孵育30分钟。随后，将用20mM Tris HCl/50mM NaCl稀释300倍的25μl的肽交换样品按照一式四份添加。将样品在室温下孵育15分钟，用0.05％Tween洗涤缓冲液(4×50μL)洗涤，在室温下用25μL的缀合有HRP的抗β2m(PBS中的1μg/mL)处理15分钟，用0.05％Tween洗涤缓冲液(4×50μL)洗涤，并用25μL的ABTS溶液
Figure BDA0002980945400001704
显影10至15分钟。将通过添加12.5μL的终止缓冲液(0.1M柠檬酸中的0.01％叠氮化钠)以终止反应。随后使用分光光度计
Figure BDA0002980945400001705
Figure BDA0002980945400001706
在415nm下测量吸光度。
噬菌体淘选：
对于每一轮淘选，将等分的起始噬菌体放在一边以进行输入滴定，然后将剩余的噬菌体用Dynabead M-280链霉亲和素珠粒((Life Technologies))耗竭三次，然后用预先结合有100皮摩尔的汇集的阴性肽-HLA复合物耗竭链霉亲和素珠粒。对于第一轮淘选，将结合于链霉亲和素珠粒的100皮摩尔的肽-HLA复合物与耗竭的噬菌体在室温下旋转孵育2小时。用1×PBST((PBS+0.05％Tween-20))中的0.5％BSA洗涤三次，每次五分钟，然后用1×PBS中的0.5％BSA洗涤三次，每次五分钟，以去除未结合至肽-HLA复合物结合珠粒的任何噬菌体。为了从洗涤的珠上洗脱结合的噬菌体，加入1mL的0.1M TEA，并在室温下旋转孵育10分钟。从珠粒中收集洗脱的噬菌体，并用0.5mL的1M Tris-HCl pH7.5中和。然后将中和的噬菌体用于感染对数生长的TG-1细胞((OD600＝0.5))，并在37℃感染一小时后，将细胞涂铺至含有100μg/mL羧苄青霉素和2％葡萄糖((2YTCG))的琼脂板的2YT培养基上，用于输出滴定和用于后续淘选轮次的细菌生长。对于随后的淘选轮次，降低选择抗原浓度，同时增加洗涤次数和洗涤时长，如表3所示。
输入/输出噬菌体滴度:
将每轮输入滴度在2YT培养基中连续稀释至1010。用稀释的噬菌体滴度(107-1010)感染对数期TG-1细胞，并在不摇动的条件下在37℃下孵育30分钟，随后在温和摇动的条件下再孵育30分钟。将感染的细胞涂铺到2YTCG板上，并在30℃孵育过夜。计数单个菌落以确定输入滴度。洗脱的噬菌体感染TG-1细胞1小时后进行输出滴度测定。将1、0.1、0.01和0.001μL的感染细胞涂铺到2YTCG板上，并在30℃孵育过夜。计数单个菌落以确定输出滴度。
细菌周质提取物的选择性靶标结合：
对于scFv PPE ELISA，将96孔和/或384孔链霉亲和素包被的板((Pierce))用在HLA缓冲液中的2μg/mL肽-HLA复合物包被，并在4℃下孵育过夜。在每个步骤之间，用PBST(PBS+0.05％
Figure BDA0002980945400001711
)将板洗涤三次。在室温下，用PBS中的3％BSA((封闭缓冲液))封闭抗原包被的板1小时。洗涤后，将scFv PPE加入板，并在室温下孵育1小时。洗涤后，加入封闭缓冲液中的小鼠抗-v5抗体(Invitrogen)以检测scFv，并在室温下孵育1小时。洗涤后，加入HRP-山羊抗-小鼠抗体((Jackson ImmunoResearch))，并在室温下孵育1小时。然后将板用PBST洗涤三次，并用PBS洗涤3次，接着用TMB 1-组分微孔过氧化物酶底物((Seracare))检测HRP活性，并用2N硫酸中和。
对于阴性肽-HLA复合物反向筛选，除了包被抗原外，按上述方法进行scFv PPEELISA。即，使用HLA微型集合(参见表1和表2)，其由三种阴性肽-HLA复合物(各2μg/mL)组成，汇集并包被在链霉亲和素板上，以比较与它们特定的pHLA复合物的结合。或者，HLA完整集合由所有18种阴性肽-HLA复合物(各2μg/mL)组成，所述18种阴性肽-HLA复合物汇集在一起并被涂覆至链霉亲和素板上，以比较与它们特定的pHLA复合物的结合。
scFv蛋白片段的构建和产生：
将表达质粒转化到BL21(DE3)菌株中，并与周质分子伴侣在400mL的大肠埃希氏菌培养基中共表达。如下重构细胞聚合体：10mL/1g的生物质，其中包含((25mM HEPES、pH7.4、0.3M NaCl、10mM MgCl2、10％甘油、0.75％CHAPS、1mM DTT))加上溶菌酶，以及全能核酸酶和Lake Pharma蛋白酶抑制剂混合物。将细胞悬浮液在振荡平台上于室温孵育30分钟。通过在4℃，13,000×rpm下离心15分钟使裂解物澄清。将澄清的裂解物上样到在IMAC缓冲液A((20mM Tris-HCl，Ph7.5；300mM NaCl/10％甘油/1mM DTT))中预先平衡的5mL Ni NTA树脂上。用10倍柱体积(CV)的缓冲液A洗涤树脂((或直至达到稳定的基线))，然后用10CV的8％IMAC缓冲液B((20mM Tris-HCl，Ph7.5；300mM NaCl/10％甘油/1mM DTT/250咪唑))洗涤。将靶蛋白以20CV的梯度洗脱至100％IMAC缓冲液B。用5CV的100％IMAC B洗涤色谱柱，以确保完全去除蛋白。通过SDS-PAGE和蛋白质印记((抗-His))分析洗脱级分，并相应地合并。将集合用最终制剂缓冲液((20mM Tris-HCl，Ph7.5；300mMNaCl/10％甘油/1mM DTT))进行透析，浓缩至最终蛋白质浓度大于0.3mg/mL，等分分装到1mL的小瓶中，然后闪冻在液氮中。最终的质控步骤包含SDS-PAGE和测量A280吸光度。
Fab蛋白片段的构建和生产：
将选择的G5、G8和G10 Fab的构建体克隆到针对哺乳动物表达进行了优化的载体中。放大每种DNA构建体用于转染并确认序列。对于每种构建体，在HEK293细胞
Figure BDA0002980945400001732
均完成了100mL的瞬时产生。通过抗CH1纯化来纯化蛋白质，随后通过HiLoad 16/600 Superdex 200，利用尺寸排阻色谱法(SEC)纯化蛋白质。用于SEC-抛光的流动相为20mM Tris,50mM NaCl,pH 7。进行最终验证性CE-SDS分析。
IgG蛋白的构建和产生：
将G系列抗体的表达构建体克隆到针对哺乳动物表达优化的载体中。放大每种DNA构建体用于转染并确认序列。每种HEK293细胞(Tuna293TMProcess)均完成了10mL的瞬时生产。通过蛋白A纯化来纯化蛋白，并进行最终的CE-SDS分析。
实施例4：Fab克隆对它们各自的HLA-肽靶标的亲和力
Fab格式化的抗体能够准确评估单体与其各自的HLA-肽靶标的结合，同时避免与IgG抗体形式的二价相互作用的混淆效应。使用Octet Qke(ForteBio)通过生物层干涉测量(BLI)评估结合亲和力。简言之，以在使用最高浓度时能为每种Fab产生最佳nm位移应答(约0.6nm)的浓度，将动力学缓冲液中的生物素化的pHLA复合物加载到链霉亲和素传感器上，持续300秒。然后将载有配体的尖端在动力学缓冲液中平衡120秒。然后，使载有配体的生物传感器在滴定成2倍稀释液的Fab溶液中浸润200秒。Fab的起始浓度范围为100nM至
Figure BDA0002980945400001733
基于Fab的KD值进行反复优化。测量动力学缓冲液中的解离步骤200秒。利用ForteBio数据分析软件以1:1结合模型分析数据。
下表11中显示了HLA-肽靶标HLA-B*35:01_EVDPIGHY、HLA-A*02:01_AIFPGAVPAA和HLA-A*01:01_ASSLPTTMNY的结果。
Figure BDA0002980945400001731
Figure BDA0002980945400001741
图12A、图12B和图12C分别描绘了针对HLA-肽靶标B*35:01-EVDPIGHVY(12A)的Fab克隆G5-P7A05、针对HLA-肽靶标A*02:01-AIFPGAVPAA(12B,P2C10于左侧，并且P1C11于右侧)的Fab克隆R3G8-P2C10和G8-P1C11以及针对HLA-肽靶标A*01:01-ASSLPTTMNY(12C)的Fab克隆R3G10-P1B07的BLI结果。
图71A和图71B分别显示了G2靶标Fab克隆G2-P1H11和G7靶标Fab克隆G7R4-B5-P2E9的BLI结果。图90显示G2靶标Fab克隆G2-P2C06的BLI结果。
下表中显示了结果。
表43：Fab与其靶标肽-HLA复合物结合的优化的Octet BLI亲和力测量
Figure BDA0002980945400001742
图105显示了G8靶标Fab克隆G8-P4F05、G8-P1B03和G8-P5G08与HLA-肽靶A*02:01-AIFPGAVPAA的BLI结果；以及G5靶标Fab克隆G5-P1C12与HLA-肽靶B*35:01-EVDPIGHVY的BLI结果。
Fab格式化的抗体以高亲和力结合它们各自的HLA-肽靶标。
实施例5：G2、G5、G7、G8和G10限制性肽序列的位置扫描
进行G2、G5、G7、G8和G10限制性肽的位置扫描，以确定作为选择的Fab克隆的接触点的氨基酸残基或直接或间接影响HLA-肽靶与Fab相互作用的残基。
图13描绘了位置扫描实验的第一实验设计。产生了变体G2、G5、G7、G8和G10限制性肽的位置扫描文库，其限制性肽序列的单个位置具有氨基酸取代，扫描所有位置。给定位置上的氨基酸取代是丙氨酸(保守取代)、精氨酸(带正电荷)或天冬氨酸(带负电荷)。
如实施例3中所描述，产生肽-HLA复合物，其包含位置扫描文库成员和HLA亚型等位基因。使用实施例3中所描述的条件配体肽交换和稳定性ELISA测定所得复合物的稳定性。这种稳定性分析可鉴定限制性肽上对于结合和稳定HLA分子很重要的残基。如实施例4所述，通过BLI评估所选Fab克隆与变体肽-HLA复合物的结合亲和力。导致稳定的HLA复合体形成和减弱的Fab结合的位置变体可鉴定可能直接或间接参与确定肽-HLA复合物与Fab克隆相互作用的残基。例如，已鉴定的残基可以形成结合ABP的表位的一部分，或者可以影响表位的构象形状或呈现。
图14A描绘了G5位置变体-HLA的稳定性结果，表明大多数肽突变不影响那些肽与相关pHLA的结合。
图14B描绘了Fab克隆G5-P7A05与G5位置变体-HLA的结合亲和力，表明限制性肽的位置P2-P8可能直接或间接参与确定肽-HLA复合体与Fab克隆的相互作用。
图15A描绘了G8位置变体-HLA的稳定性结果，表明位置P2、P7和P10不适合用Arg-或Asp-残基取代，因此可能对肽结合HLA蛋白很重要。
图15B描绘了Fab克隆G8-P2C10与G8位置变体-HLA的结合亲和力，表明限制性肽的位置P1-P5可能直接或间接参与确定肽-HLA复合体与Fab克隆的相互作用。
图46描绘了Fab克隆G8-P1C11与G8位置变体-HLA的结合亲和力，表明限制性肽的P3-P6位置可能直接或间接参与确定肽-HLA复合体与Fab克隆的相互作用。
图16A描绘了G10位置变体-HLA的稳定性结果，表明位置2、5、8和10不适合氨基酸取代，因此可能对肽结合HLA蛋白很重要。
图16B描绘了Fab克隆G10-P1B07与G10位置变体-HLA的结合亲和力，表明限制性肽的位置P4、P6和P7可能直接或间接参与确定肽-HLA复合体与Fab克隆的相互作用。
图72中显示了G2和G7限制性肽的位置扫描实验的氨基酸取代图谱。星号表示缺少氨基酸取代。
图73A描绘了G2位置变体HLA的稳定性结果，表明位置2、3和9不适合氨基酸取代，因此可能对肽结合HLA蛋白很重要。
图73B描绘了Fab克隆G2-P1H11与G2位置变体-HLA的结合亲和力，表明限制性肽的位置3-9可能直接或间接参与确定肽-HLA复合物与Fab克隆的相互作用。
图91A描绘了G2位置变体-HLA的第二实验的稳定性结果，进一步证实了位置2、3和9不适合氨基酸取代，因此可能对肽结合HLA蛋白很重要。
图91B描绘了Fab克隆G2-P2C06与G2位置变体-HLA的结合亲和力，表明限制性肽的位置7-8可能直接或间接参与确定肽-HLA复合物与Fab克隆的相互作用。
图74A描绘了G7位置变体-HLA的稳定性结果，表明位置1、2、6和9不适合氨基酸取代，因此可能对肽结合HLA蛋白很重要。
图74B描述了Fab克隆G7R4-B5-P2E9与G7位置变体-HLA的结合亲和力，表明限制性肽的位置1-5可能直接或间接参与确定肽-HLA复合物与Fab克隆的相互作用。
在第二位置扫描实验中，生成了每种HLA-肽靶标的变体限制性肽的文库，其中每个变体与相应的HLA-肽靶标相异于1-3个氨基酸。如上所述，通过BLI评估所选Fab克隆与变体肽-HLA复合物的结合亲和力。减弱Fab结合的变体可鉴定可能直接或间接参与确定肽-HLA复合物与Fab克隆的相互作用的残基
来自第二位置扫描实验的评估G2P1H11 ABP与A*01:01_NTDNNLAVY变体文库的结合能力的数据，揭示在位置4-9处的几个单个或多个变体能够通过生物层干涉测量(BLI)消除可检测的结合(数据未显示)。这些数据与上述第一位置扫描实验基本一致。
来自第二位置扫描实验的评估G10P3E04 ABP与A*01:01_ASSLPTTMNY变体文库的结合能力的数据，揭示未能结合G10P3E04的变体肽在位置6-9处与靶标肽相比包含2个氨基酸差异。这些数据支持这样的观点，即肽位置6-9对于与该靶标的结合直接很重要或在构象上很重要。
实施例6：抗体结合呈递HLA-肽靶抗原HLA-B＊35:01_EVDPIGHVY、HLA-A＊02:01 AIFPGAVPAA和HLA-A＊01:01 ASSLPTTMNY的细胞。
为了验证所鉴定的TCR样抗体在其天然环境中(例如在抗原呈递细胞的表面上)结合其pHLA靶G5、G8和G10，将选择的克隆重新格式化为IgG，并用于利用表达同源HLA-肽靶标的K562细胞的结合实验。简言之，用针对G5靶标肽的HLA-B*35:01、针对G7和G8靶标肽的HLA-A*02:01或针对G2和G10靶标肽的HLA-A*01:01转导细胞。然后使用已建立的方法，利用例如表1和表2中指定的靶标肽或阴性对照肽对细胞进行外源性冲击，以在细胞表面产生相关的pHLA复合物。
材料和方法
逆转录病毒的产生
Phoenix-AMPHO细胞(
Figure BDA0002980945400001781
CRL-3213TM)在DMEM(CorningTM,17-205-CV)中培养，所述DMEM补充有10％FBS(Seradigm,97068-091)和Glutamax(GibcoTM,35050079)。将K-562细胞(
Figure BDA0002980945400001782
CRL-243TM)在补充有10％FBS的IMDM(GibcoTM,31980097)中培养。Lipofectamine LTXPLUS(Fisher Scientific，15338100)含有Lipofectamine试剂和PLUS试剂。Opti-MEM(GibcoTM,31985062)购自Fisher Scientific。
将Phoenix细胞以5x105个细胞/涂铺在6孔板中，并在37℃下孵育过夜。为了进行转染，将10μg质粒、10μL Plus试剂和100μl的Opti-MEM在室温下孵育15分钟。同时，将8μL的Lipofectamine与92μL的Opti-MEM在室温下孵育15分钟。合并这两个反应物并在室温下再次孵育15分钟，然后添加800μL的Opti-MEM。从Phoenix细胞中吸出培养基，并用5mL预热的Opti-MEM洗涤。从细胞中吸出Opti-MEM，并加入lipofectamine混合物。细胞在37℃下孵育3小时，并添加3mL的完全培养基。然后，将板在37℃下孵育过夜。用Phoenix培养基代替所述培养基，并将板在37℃下再孵育2天。
收集培养基，并通过45微米的过滤器过滤到干净的6孔培养皿中。将20μl的Plus试剂添加到每种病毒悬浮液中，并在室温下孵育15分钟，然后添加8μL/孔的Lipofectamine，再进行15分钟室温孵育。
K562细胞系的产生(用HLA进行逆转录病毒转导)
对K562细胞进行计数，并重新悬浮至5E6个细胞/mL，并将100μL加入每种病毒悬浮液中。将6孔板以700g离心30分钟，然后在37℃孵育5-6小时。然后将细胞和病毒悬浮液转移到T25烧瓶，并加入7mL K562培养基。然后将细胞孵育三天。然后将转导的K562细胞在补充有0.6μg/mL嘌呤霉素(Invivogen，ant-pr-1)的培养基中培养，并通过流式细胞术监测选择。
流式细胞术方法：
在前一天晚上，在6孔板中，用含1％FBS的IDMEM中的50μM的肽((Genscript))冲击触发HLA转导的K562细胞，并在标准组织培养条件下孵育。收获细胞，用PBS洗涤，并在室温下用eBioscience Fixable ViabilityDye eFluor 450染色15分钟。用PBS+1-2％FBS再次洗涤后，将细胞以不同浓度的IgG重悬。将细胞与抗体在4℃下孵育1小时。再次洗涤后，在4℃下以1:100至1:200的比例加入缀合有PE的山羊抗人IgG二抗(JacksonImmunoResearch)达30分钟。用PBS+1-2％FBS洗涤后，将细胞重悬于PBS+1-2％FBS中，并通过流式细胞术进行分析。使用Attune NxT软件在Attune NxT流式细胞仪(ThermoFisher)上进行流式细胞检测分析。使用FlowJo分析数据。
结果
图17A、图17B和图17C中显示了通过流式细胞术检测到的与G5-、G8-或G10-呈递K562细胞结合的抗体的四个代表性实例。抗体结合以剂量依赖的方式被观察到，所述抗体结合对相关的靶肽是有选择性的。
在另一个流式细胞术实验中，用50μM的靶标肽或对照肽(如表1中针对G5和表2中针对G8和G10所列的)对HLA转导的K562细胞进行冲击处理，并通过流式细胞术检测pHLA特异性抗体。用50μM的靶标肽或阴性对照肽对HLA转导的K562细胞进行冲击处理，并绘制了20μg/mL的G5-P7A05、30μg/mL的G8-2C10、30μg/mL的G10-P1B07和30μg/mL的G8-P1C11的抗体结合直方图。直方图描绘在图18和图47中。
图75和图76中显示结果。与用阴性对照肽冲击的HLA转导的细胞相比，G2-P1H11和G7R4-B5-P2E9都选择性地结合用靶标肽冲击的HLA转导的K562细胞。
在另一个流式细胞术实验中，用50μM的靶标肽EVDPIGHVY(“EVD”)或阴性对照肽IPSINVHHY(“IPS”)冲击HLA-B*35:01转导的K562细胞，并通过流式细胞术检测pHLA特异性抗体。图102中显示了G5抗体G5-7A05和G4-1C12的结果。在所有剂量下均以对靶标肽具有选择性的方式观察到抗体结合。
在另一个流式细胞术实验中，用50μM的靶标肽AIFPGAVPAA(“AIF”)或阴性对照肽FLLTRILTI(“FLL”)冲击HLA-A*02:01转导的K562细胞，并通过流式细胞术检测pHLA特异性抗体。图103中显示了G8特异性抗体G8-1B03、G8-5G08、G8-4F05、G81C11、G82C10和G82C11的结果。在所有剂量下均以对靶标肽具有选择性的方式观察到抗体结合。
在另一个流式细胞术实验中，用50μM的靶肽ASSLPTTMNY(“ASSL”)或阴性对照肽ATDALMTGY(“ATDA”)冲击HLA-A*01:01转导的K562细胞，并通过流式细胞术检测pHLA特异性抗体。图104中显示了G10特异性抗体G10-3E09和G10-1H01的结果。以对靶标肽具有选择性的方式，以剂量依赖的方式观察到抗体结合。
实施例7：抗体与表达靶基因和HLA亚型的肿瘤细胞系结合
基于HLA亚型和目标靶基因的表达(如通过公开共获得的数据库(TRONhttp://celllines.tron-mainz.de)评估的)选择肿瘤细胞系。用于细胞结合测定的肿瘤细胞系的选择如下表12所示。
Figure BDA0002980945400001801
将LN229、BV173和Colo829肿瘤细胞系在标准组织培养条件下繁殖。如实施例6所述进行流式细胞术。将细胞与30μg/mL或0μg/mL抗体一起孵育，然后与缀合有PE的抗人二级IgG一起孵育。
图19中描绘了结果。图A显示了G5-P7A05与胶质母细胞瘤系LN229结合的直方图。图B显示了G8-P2C10与白血病细胞系BV173结合的直方图。图C显示了G10-P1B07与CRC系Colo829结合的直方图。
实施例8：结合HLA-肽靶标HLA-A＊01:01 ASSLPTTMNY或HLA-肽靶标HLA-A＊01: 01_HSEVGLPVY的TCR的鉴定
通过处理来自健康供体的白细胞单采样品获得外周血单核细胞(PBMC)。将冷冻的PBMC解冻并与生物素化CD45RO、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD34、CD36、CD57、CD123、抗HLA-DR、CD235a((血型糖蛋白A))、CD244和CD4抗体的混合物一起孵育，然后用抗生物素微珠进行磁性标记，以便从PBMC群体中清除。用包含靶肽和合适的MHC分子的四聚体标记富集的原初CD8 T细胞，用活/死和谱系标记物染色，并通过流式细胞术细胞分选器进行分选。多克隆扩增后，可采用两条路径中的一条。如果很大一部分群体对HLA-肽靶标具有特异性，则可对T细胞群体进行整体测序。或者，可重新分选含有对HLA-肽靶标具有特异性的TCR的细胞，并且只有在重新分选后分离的细胞才使用10倍基因组学单细胞分辨率配对免疫TCR谱分析方法进行测序。
此处，如上所述对含有对HLA-肽靶标HLA-A*01:01ASSLPTTMNY具有特异性的TCR的细胞进行重新分选和测序。具体地，将两千至八千个活T细胞分配到单细胞乳剂中，用于随后的单细胞cDNA生成和全长TCR谱分析((通过恒定区的5'UTR——确保α和β配对))。该方法是在转录本的5'端使用分子条形码的模板转换寡核苷酸；替代方法是利用在3'端的带分子条形码的恒定区寡核苷酸；另一种替代方法是将RNA聚合酶启动子与TCR的5'或3'端偶联。所有这些方法都可以在单细胞水平上鉴定和解卷积α和βTCR对。生成的带条形码的cDNA转录本进行优化的酶促和文库构建工作流程，以减少偏差并确保细胞集合内克隆型的准确表征。使用(Illumina)的MiSeq或HiSeq4000仪器((双末端150个循环))对文库进行测序，靶标测序深度为每个细胞约五千至五万个读段。
通过提供的10倍的Cell Ranger软件处理测序读段。测序读段用铬细胞条形码和UMI标记，其用于逐个细胞组装V(D)J转录本。然后，通过将组装的重叠群作图到Ensemble87版V(D)J参考序列来注释每个细胞的组装的重叠群。克隆型被定义为独特的CDR3氨基酸序列的α、β链对。对于在2个细胞以上频率出现的单个α链对和单个β链对，对克隆型进行过滤，以产生特定供体中每个靶标肽的克隆型的最终列表。
在6次ASSLPTTMNY的实验和2次HSEVGLPVY靶标的实验中分析了两种不同的供体。图20A和图20B分别显示了每个实验分离的靶特异性T细胞的数量和每个实验鉴定的靶特异性独特克隆型的数量。每种颜色代表来自一个实验的数据。
表13描绘了所有实验中已鉴定的T细胞和独特TCR的累积数量，以及每300万个原初CD8 T细胞中靶特异性T细胞的平均数量。
Figure BDA0002980945400001821
表14中显示了对HLA-肽A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的已鉴定的TCR克隆型的注释序列。该表包括在2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793中，其通过引用以其整体并入。
表15中显示了对HLA-肽A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的已鉴定的TCR克隆型的αCDR3和βCDR3序列。为了清楚起见，如表14所示，每个已鉴定的TCR被赋予TCR ID号。例如，TCR ID#1包含αCDR3序列CAGPGNTGKLIF和βCDR3序列CASSNAGDQPQHF。
表16中显示了对HLA-肽A*01:01_ASSLPTTMNY具有特异性的已鉴定的TCR克隆型的全长αV(J)和βV(D)J序列。例如，TCR ID#1包含αV(J)序列MLLITSMLVLWMQLSQVNGQQVMQIPQYQHVQEGEDFTTYCNSSTTLSNIQWYKQRPGGHPVFLIQLVKSGEVKKQKRLTFQFGEAKKNSSLHITATQTTDVGTYFCAGPGNTGKLIFGQGTTLQVK和βV(D)J序列MSNQVLCCVVLCFLGANTVDGGITQSPKYLFRKEGQNVTLSCEQNLNHDAMYWYRQDPGQGLRLIYYSQIVNDFQKGDIAEGYSVSREKKESFPLTVTSAQKNPTAFYLCASSNAGDQPQHFGDGTRLSIL。
表17中显示了对HLA-肽A*01:01_HSEVGLPVY具有特异性的已鉴定的TCR克隆型的注释序列。该表包括在2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793中，其通过引用以其整体并入。
表18中显示了对HLA-肽A*01:01_HSEVGLPVY具有特异性的已鉴定的TCR克隆型的αCDR3和βCDR3序列。该表包括在2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793中，其通过引用以其整体并入。
表19中显示了对HLA-肽A*01:01_HSEVGLPVY具有特异性的已鉴定的TCR克隆型的全长αV(J)和βV(D)J序列。该表包括在2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793中，其通过引用以其整体并入。
实施例9：结合HLA肽复合物的抗体或其抗原结合片段的鉴定
靶向呈递肿瘤抗原的MHC I类分子的单链可变片段(scFv)抗体的鉴定
使用噬菌体展示来鉴定靶向呈递目标肿瘤抗原的人I类MHC分子的强效和选择性单链抗体。制备噬菌体文库以用于通过去除非特异性I类MHC结合剂来进行筛选。利用多种不同于靶pMHC的可溶性人肽-MHC(pMHC)分子来淘选预先存在的噬菌体文库，以去除非特异性结合I类MHC的scFv。为了鉴定选择性结合目标pMHC的scFv，将靶pMHC用于至少1-3轮利用制备的噬菌体文库进行的淘选。然后针对对照一组不相关的pMHC对筛选中鉴定的scFv命中进行评估，以鉴定选择性结合至靶pMHC的scFv先导序列。表征先导scFv以确定靶标结合特异性和亲和力。将表现出强效和选择性结合的先导scFv转化为全长IgG单克隆抗体(mAb)构建体。另外，将先导scFv整合到双特异性mAb构建体和嵌合抗原受体(CAR)构建体中，可用于产生CAR-T细胞。可以构建全长双特异性或基于scFv的双特异性。
证明体外靶向人肿瘤细胞
将免疫组织化学技术用于证明先导抗体与表达靶pMHC分子的人肿瘤细胞或细胞系的特异性结合。将用CAR-T构建体转染的T细胞系与人肿瘤细胞一起孵育，以证明在体外对肿瘤细胞的杀伤。或者，将表达靶标的肿瘤细胞与双特异性构建体(编码ABP和效应子结构域)和PBMC或T细胞一起孵育。
体内概念验证
体内评估先导抗体或CAR-T构建体，以证明在人源化小鼠肿瘤模型中的定向肿瘤杀伤。在植入了人肿瘤和PBMC的异种移植肿瘤模型中评估先导抗体或CAR-T构建体。测量抗肿瘤活性并将其与对照构建体进行比较以证明靶标特异性肿瘤杀伤。
使用兔B细胞克隆技术鉴定靶向呈递肿瘤抗原的MHC I类分子的单克隆抗体(mAb)
鉴定了靶向呈递目标肿瘤抗原的人I类MHC分子的强效和选择性mAb。将呈递人肿瘤抗原的可溶性人pMHC分子用于多次小鼠或兔免疫，随后筛选来自免疫动物的B细胞，以鉴定表达与靶标I类MHC分子结合的mAb的B细胞。将从分离的B细胞克隆编码从小鼠或兔筛选中鉴定的mAb的序列。然后将回收的mAb与一组不相关的pMHC进行比较，以鉴定选择性结合至靶pMHC的先导mAb。将充分表征先导mAb，以确定靶结合亲和力和选择性。使显示强效和选择性结合的先导mAb人源化以产生全长人IgG单克隆抗体(mAb)构建体。另外，将先导mAb整合到双特异性mAb构建体和嵌合抗原受体(CAR)构建体中，所述构建体可用于产生CAR T细胞。可以构建全长双特异性或基于scFV的双特异性。
证明体外靶向人肿瘤细胞
将免疫组织化学技术用于证明先导抗体与表达靶pMHC分子的人肿瘤细胞的特异性结合。将用CAR-T构建体转染的T细胞系与人肿瘤细胞一起孵育，以证明在体外对肿瘤细胞的杀伤。或者，将表达靶标的肿瘤细胞与双特异性构建体(编码ABP和效应子结构域)和PBMC或T细胞一起孵育。
体内概念验证
体内评估先导抗体或CAR-T构建体，以证明在人源化小鼠肿瘤模型中的定向肿瘤杀伤。在植入人PBMC的异种移植肿瘤模型中评估先导抗体或CAR-T构建体。测量抗肿瘤活性并将其与对照构建体进行比较，以证明靶标依赖性肿瘤杀伤。
将使用噬菌体展示或B细胞克隆技术来鉴定选择性靶向呈递肿瘤抗原的人I类MHC分子的强效和选择性ABP。ABP的效用将通过显示ABP在体外和体内被整合到抗体或CAR-T构建体中时介导的肿瘤细胞杀伤来证明。
实施例10：结合HLA肽复合物的TCR的鉴定
为了选择天然的高亲和力TCR、特异性识别共享抗原MHC/肽靶标(SAT)，采取以下实验步骤:
1.MHC/肽靶标反应性TCR的鉴定和分离
2.工程改造TCR T细胞的产生
3.TCR特异性的验证
MHC/肽靶标反应性TCR的鉴定
从患者的血液、淋巴结或肿瘤中分离出T细胞。患者是对于SAT是HLA-匹配的，并根据携带靶标的蛋白的表达进行选择。然后，通过例如分选SAT-MHC四聚体结合细胞或通过分选在T细胞和SAT-冲击的抗原呈递细胞的体外共培养中刺激的活化细胞来富集T细胞中的SAT-特异性T细胞。
通过对SAT特异性T细胞的TCR进行单细胞测序来鉴定与SAT相关的α-βTCR二聚体。或者，对SAT特异性T细胞进行大量TCR进行测序，并使用TCR配对方法确定具有高匹配概率的α-β对。
可替代地或另外地，通过体外引发来自健康供体的原初T细胞，可以获得SAT特异性T细胞。用经SAT-冲击的抗原呈递细胞反复刺激从PBMC、淋巴结或脐带血中获得的T细胞，以引发经历抗原的T细胞的分化。然后如上所述类似地鉴定来自患者的SAT特异性T细胞的TCR。
工程改造TCR T细胞的产生
将TCRα和β链序列克隆到合适的构建体中。用所述构建体转导TCR-自体或异源的大量T细胞，产生工程改造的TCR T细胞。将这些T细胞在抗CD3抗体和IL-2细胞因子存在的情况下扩增，用于随后的实验。在某些情况下，缺失天然TCR或修饰插入的TCR以增加适当的多聚化。
TCR特异性的体外验证
首先，使用表达适当MHC并用一种或多种适当的靶标进行冲击的抗原呈递细胞筛选携带工程改造TCR的T细胞的靶标识别。
然后对第一轮筛选中鉴定的TCR进行天然靶识别测试。基于对HLA匹配的原发性肿瘤和表达携带SAT的蛋白的肿瘤细胞系的特异性识别，推荐先导TCR。
为了确保特异性，根据脱靶识别剔除先导TCR。将它们针对一小组HLA匹配和错配的细胞系(涵盖多种组织和器官类型)并用一小组传染性疾病抗原冲击HLA匹配和错配的抗原呈递细胞进行筛选。剔除对自身抗原或常见的非自身抗原具有特异性和非特异性靶外识别的TCR。
实施例11：MHC/肽靶反应性TCR的鉴定
从患者的血液、淋巴结或肿瘤中分离出T细胞。患者对于SAT是HLA匹配的，并根据携带靶标的蛋白的表达进行选择。然后，通过例如分选SAT-MHC四聚体结合细胞或分选在T细胞和SAT-冲击的抗原呈递细胞的体外共培养中刺激的活化细胞来富集T细胞中的SAT-特异性T细胞。
通过对SAT特异性T细胞的TCR进行单细胞测序来鉴定与SAT相关的α-βTCR二聚体。或者，对SAT特异性T细胞进行大量TCR测序，并使用TCR配对方法确定具有高匹配概率的α-β对。
可选地或另外地，通过体外引发来自健康供体的原初T细胞，可以获得SAT特异性T细胞。用经SAT-冲击的抗原呈递细胞反复刺激从PBMC、淋巴结或脐带血中获得的T细胞，以引发经历抗原的T细胞的分化。然后如上所述类似地鉴定来自患者的SAT特异性T细胞的TCR。
实施例12：工程改造TCR T细胞的产生
将TCRα和β链序列克隆到合适的构建体中。用所述构建体转导TCR-自体或异源的大量T细胞，产生工程改造的TCR T细胞。将这些T细胞在抗CD3抗体和IL-2细胞因子存在的情况下扩增，用于随后的实验。在某些情况下，缺失天然TCR或修饰插入的TCR以增加适当的多聚化。
TCR特异性的体外验证
首先，使用表达适当MHC并用一种或多种适当的靶标进行冲击的抗原呈递细胞筛选携带工程改造TCR的T细胞的靶标识别。
然后对第一轮筛选中鉴定的TCR进行天然靶识别测试。基于对HLA匹配的原发性肿瘤和表达携带SAT的蛋白的肿瘤细胞系的特异性识别，推荐先导TCR。
为了确保特异性，根据脱靶识别剔除先导TCR。将它们针对一小组HLA匹配和错配的细胞系(涵盖多种组织和器官类型)并用一小组传染性疾病抗原冲击的HLA匹配和错配的抗原呈递细胞进行筛选。剔除对自身抗原或常见的非自身抗原具有特异性和非特异性靶外识别的TCR。
实施例13：使用兔B细胞克隆技术鉴定靶向呈递肿瘤抗原的MHC I类分子的单克隆 抗体(mAb)
鉴定了靶向呈递目标肿瘤抗原的人I类MHC分子的强效和选择性mAb。将呈递人肿瘤抗原的可溶性人pMHC分子用于多次小鼠或兔免疫，随后筛选来自免疫动物的B细胞，以鉴定表达与靶标I类MHC分子结合的mAb的B细胞。将从分离的B细胞克隆编码从小鼠或兔筛选中鉴定的mAb的序列。然后将回收的mAb与一组不相关的pMHC进行评估，以鉴定选择性结合至靶pMHC的先导mAb。将充分表征先导mAb，以确定靶结合亲和力和选择性。使显示强效和选择性结合的先导mAb人源化以产生全长人IgG单克隆抗体(mAb)构建体。另外，将先导mAb整合到双特异性mAb构建体和嵌合抗原受体(CAR)构建体中，所述构建体可用于产生CAR T细胞。可以构建全长双特异性或基于scFV的双特异性。
证明体外靶向人肿瘤细胞
将免疫组织化学技术用于证明先导抗体与表达靶pMHC分子的人肿瘤细胞的特异性结合。将用CAR-T构建体转染的T细胞系与人肿瘤细胞一起孵育，以证明在体外对肿瘤细胞的杀伤。或者，将表达靶标的肿瘤细胞与双特异性构建体(编码ABP和效应子结构域)和PBMC或T细胞一起孵育。
体内概念验证
体内评估先导抗体或CAR-T构建体，以证明在人源化小鼠肿瘤模型中的定向肿瘤杀伤。在植入人PBMC的异种移植肿瘤模型中评估先导抗体或CAR-T构建体。测量抗肿瘤活性并将其与对照构建体进行比较，以证明靶标依赖性肿瘤杀伤。
将使用噬菌体展示或B细胞克隆技术来鉴定选择性靶向呈递肿瘤抗原的人I类MHC分子的强效和选择性ABP。ABP的效用将通过显示ABP在体外和体内被整合到抗体或CAR-T构建体中时介导的肿瘤细胞杀伤来证明。
实施例14：通过氢/氘交换和质谱法评估scFv-pHLA或Fab-pHLA构建体
实验流程
氢/氘交换
将20μM HLA-肽与3倍摩尔过量的scFv或Fab格式化的蛋白质在室温(20至25℃)下孵育20分钟，以生成用于交换实验的复合物。对于Apo(未结合)对照，将HLA-肽与等体积的50mM NaCl、20mM Tris(pH8.0)一起孵育。通过由Chronos 4.8.0软件(Leap Technologies,Morrisville,NC)控制的自动HDX PAL系统在4℃下进行所有后续反应步骤。在指定的时间点内，将5μl的蛋白复合物稀释10倍至H2O或50mM NaCl,20mM Tris pH 8.0(在0分钟控制时间点)或利用D2O制备的相同缓冲液中，进行30秒，然后在0.8M盐酸胍、0.4％乙酸(v/v)和75mM三(2-羧乙基)膦中猝灭3分钟。将约50pmol的猝灭的蛋白复合物转移到固定的ProteinXIII/胃蛋白酶柱(NovaBioAssays,Woburn,MA)上，以进行集成的在线蛋白质消化。
液相色谱法，质谱法以及HDX分析
使用UltiMate 3000基础手动UHPLC系统(马萨诸塞州，沃尔瑟姆，赛默飞世尔科技公司)进行肽的层析分离，所述系统含有一个捕集阱C18柱(粒径为5μm，直径为2.1mm)和分析C18柱(粒径为1.9μm，直径为1mm)。将样品以40μl/分钟的流速用10％乙腈、0.05％的三氟乙酸或10％的乙腈、0.5％的甲酸脱盐2分钟，然后以40μl/分钟的流速用95％乙腈和三氟乙酸或甲酸的浓度递增梯度洗脱肽。使用Orbitrap Fusion Lumos质谱仪(ThermoFisher,Waltham,MA)进行质谱分析，将ESI源设置为3500-3800V的正离子电压。在进行氢-氘交换实验之前，先根据数据依赖型LC/MS/MS和采用PEAKSStudio(Bioinformatics SolutionsInc.,Waterloo,ON,Canada)检索的数据分析每种HLA-肽复合物的肽片段，其中肽前体的质量公差为20ppm，片段离子的质量公差为0.2Da。检索HLA、β2M和靶标肽的序列，并使用反相数据库策略确定误检率。通过LC/MS检测氢-氘实验所得的肽，并通过HDX工作台(OmicsInformatics,Honolulu,HI)进行分析，保留时间窗口大小为0.22分钟，误差耐受性为7.0ppm。使用荧蒽作为试剂阴离子，通过反应时间为200ms(G2)或100ms(G10)的电子转移解离(ETD)将肽片段化，获得了选定肽的高分辨率HD交换数据。肽片段用HDExaminer(SierraAnalytics)进行分析，其中保留时间窗口大小为18s，肽m/z耐受性为2Da。氘吸收差异的热图由微软的Excel生成，并使用Pymol(
Figure BDA0002980945400001901
Cambridge,MA)将其作图到相关的蛋白质晶体结构。
对于下面的结果，HLAα螺旋的氨基酸编号是基于成熟蛋白质的文字编号，基于以下方面：(1)信号肽的去除，和(2)细菌表达的N末端甲硫氨酸的添加。表38中提供了HLA亚型氨基酸参考序列和β-2微球蛋白氨基酸序列。
结果
图21A显示了当与scFv克隆G8-P1H08一起孵育时，G8 HLA-肽复合物的HLA部分的示例性热图，使用综合扰动视图将其整体可视化。
图98显示了来自绘制在HLA-B*35:01的晶体结构(5xos.pdb；https://www.rcsb.org/structure/5XOS)上的scFv克隆G5-P1C12的高分辨率数据的实例。
图21B中显示了来自绘制在晶体结构(1jf1.pdb，可在http://www.rcsb.org/structure/1JF1上获得)上的scFv G8-P1H08的数据的实例。
图101中显示了来自绘制在与HLA-肽靶标A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)复合的Fab克隆G8-P1C11的晶体结构上的scFv G8-P1H08的高分辨率HDX数据的实例。
图45A显示了当与scFv克隆G8-P1C11(图45B中显示的结构)一起孵育时，G8 HLA-肽复合物的HLA部分的示例性热图，使用综合扰动视图将其整体可视化。
图45B中显示了在实施例15中描述的晶体结构上作图的来自scFvG8-P1C11的数据的实例。
图23A显示了当与scFv克隆R3G10-P2G11一起孵育时G10 HLA-肽复合物的HLA部分的示例性热图，使用综合扰动视图将其整体可视化。
图23B中显示了作图在晶体结构PDB5bs0上的来自scFv R3G10-P2G11的数据的实例。描述了由α1和α2螺旋形成的HLA结合裂缝中的限制性肽的晶体结构可在URL https://www.rcsb.org/structure/5bs0(Raman等人)上找到。
图23C中显示了来自绘制在晶体结构5bs0.pdb上的scFv-G10-P5A08的第二轮HDX研究的数据的实例。晶体结构(描绘了在由α1和α2螺旋形成的HLA结合裂缝中的限制性肽)可以在URL https://www.rcsb.org/structure/5bs0(Raman等人)上找到。
为了更好地比较来自针对给定的HLA-肽靶标测试的ABP内的数据，输出每个ABP的数据，并在Excel中生成热图。图22A显示了针对HLA-肽靶标G8(HLA-A*02:01_AIFPGAVPAA)测试的所有ABP的HLAα1螺旋的来自第一轮HDX实验的所得热图。图22B显示了针对HLA-肽靶标G8(HLA-A*02:01_AIFPGAVPAA)测试的所有ABP的HLAα2螺旋内的所得热图。图22C显示了所有测试的ABP的限制性肽AIFPGAVPAA的所得热图。来自第一轮HDX数据的所述热图指示，HLA-肽靶标G8(HLA-A*02:01_AIFPGAVPAA)的HLA蛋白(在α1螺旋中)的位置45-60和81-84可能直接或间接参与确定HLA-肽靶标与基于G8特异性抗体的ABP之间的相互作用。
图99中显示了针对HLA-肽靶标G8(HLA-A*02:01_AIFPGAVPAA)测试的所有ABP的HLAα1螺旋、HLAα2螺旋和限制性肽AIFPGAVPAA内的高分辨率HDX实验的所得彩色热图。图100显示了图99的彩色热图的数字表示。第二轮HDX数据的热图指示，HLA蛋白的位置46、49、55、61、74、76、77、78、81和84(在α1螺旋中)可能直接或间接参与确定HLA-肽靶标与基于G8特异性抗体的ABP之间的相互作用。第二轮HDX数据的热图指示，HLA蛋白的位置137、138、145、147、152-157(在α2螺旋中)可能直接或间接参与确定HLA-肽靶标与基于G8特异性抗体的ABP之间的相互作用。第二轮HDX数据的热图指示，限制性肽AIFPGAVPAA的位置5和6可能直接或间接参与确定HLA-肽靶标与基于G8特异性抗体的ABP之间的相互作用。
图96显示了针对HLA-肽靶标G5(HLA-B*35:01_EVDPIGHVY)测试的所有ABP的HLAα1螺旋、HLAα2螺旋和限制性肽EVDPIGHVY内的高分辨率HDX实验的所得彩色热图。图97显示了图96的彩色热图的数字表示。这些热图指示HLA蛋白的位置50、54、55、57、61、62、74、81、82和85(在α1螺旋中)可能直接或间接参与确定HLA-肽靶标与基于G5特异性抗体的ABP之间的相互作用。这些热图指示HLA蛋白的位置147和148(在α2螺旋中)可能直接或间接参与确定HLA-肽靶标与基于G5特异性抗体的ABP之间的相互作用。
图24A显示了针对HLA-肽靶标G10(HLA-A*01:01_ASSLPTTMNY)测试的所有ABP的HLAα1螺旋内的第一轮HDX实验的所得热图。图24B显示了针对HLA-肽靶标G10(HLA-A*01:01_ASSLPTTMNY)所测试的所有ABP的HLAα2螺旋内的第一轮HDX实验的所得热图。图24C显示了所有测试的ABP的限制性肽ASSLPTTMNY内的第一轮HDX实验的所得热图。图92显示了所有测试的ABP的HLAα1螺旋、HLAα2螺旋和限制性肽ASSLPTTMNY内的第二轮HDX实验的所得热图。综上所述，热图指示HLA蛋白的位置49-56和/或59-66(在α1螺旋中)，以及HLA蛋白的α2螺旋的位置136-147和157-160，可能直接或间接参与确定HLA-肽靶标与基于G10特异性抗体的ABP之间的相互作用。特别地，所有测试的ABP都降低了HLAα1螺旋的位置52-54的溶剂可及性。
图77显示了来自绘制在晶体结构PDB 5bs0上的scFv G2-P1G07的数据的实例。所述晶体结构可在URL https://www.rcsb.org/structure/5bs0(Raman等人)上找到。MS数据未覆盖的区域以黑色显示，D交换减少最大的区域(表示ABP的结合位点)以圆圈表示。为了清楚起见，只显示了结合沟和螺旋。
图78中显示了使用综合扰动视图使scFv克隆G2-P1G07整体上可视化的示例性热图。
图94中显示了来自绘制在晶体结构PDB 5bs0上的scFv G2-P2C11的数据的实例。
图95中显示了绘制在晶体结构PDB 5bs0上的高分辨率HDX数据。如实验程序中所述，通过电子转移解离(ETD)将肽片段化，获得了与四种不同scFv结合的G2的数据。
为了更好地比较针对给定的HLA-肽靶标测试的ABP的数据，输出了每个ABP的数据，并在Excel中生成了热图。所得热图在图79中示出，图79显示了α1螺旋内(顶部)和α2螺旋内(底部)的热图。图80显示了针对A*01:01_NTDNNLAVY测试的所有ABP的限制性肽残基1-9内的热图。图93中显示了第二轮(更高分辨率)HDX数据的热图。综上所述，热图阐明了结合并显示靶标肽的HLAα亚基的溶剂可及性降低的区域。这些区域中有许多是由多个A*01:01_NTDNNLAVY特异性ABP共享的。最常表现出溶剂可及性降低的两个区域包括α1螺旋的A70-Y85和/或α2螺旋的位置A140-Y160，所有ABP都屏蔽了螺旋的R157-Y160。综上所述，热图还指示了HLA-肽/ABP的相互作用，所述相互作用降低了限制性肽的位置3-9内的溶剂可及性。所述效应朝向C末端方向越来越明显。这种模式在检查的15种抗体中的14种中是一致的，其中位置6-9总是被ABP的存在所屏蔽。除非另有说明，否则HDX热图中的所有克隆条目均为scFv形式。
G7(A*02:01_LLASSILCA)scFv克隆P2E09和P3A09根据上述方法通过HDX-MS进行评估。在对应于位置49-85的HLA-A*02:01α1螺旋的区域中，溶剂可及性降低，其中G57-K67重叠(数据未显示)。在从位置136至位置157的α2螺旋的区域，溶剂可及性也降低，其中在位置144与152之间重叠。综上所述，这些线索覆盖了HLA上的广泛足迹。
实施例15：通过晶体学评估Fab-pHLA结构
材料和方法
复合物的纯化和晶体筛选
在加入其相应的HLA-MHC(1:1的摩尔比)之前，将对应于例如HLA-肽靶标G8(A*02:01_AIFPGAVPAA)的Fab片段浓缩达到5mg/mL(100μM)，并在4℃孵育30分钟。然后将混合物注射到在1X PBS缓冲液中平衡的尺寸排阻色谱柱(S200 16/60)上，以进行复合物纯化。将同时含有Fab和HLA且洗脱体积与约94kDa的复合物一致的级分合并并浓缩至10-12mg/mL(1AU＝1mg/mL)。使用商业筛选：PEGIon(Hampton research)、JCSG+(MolecularDimensions)和JBS筛选3和4(Jena Biosciences)对每种纯化的复合物的结晶条件进行筛选。试剂盒的选择是由已知的HLA-Fab复合物的晶体条件的特征决定的，所述条件主要基于使用PEG3350或PEG4000作为沉淀剂。筛选后3-4周，在几个结晶条件下，出现适合HLA-Fab组合的衍射晶体(表24)。晶体的蛋白质性质通过紫外线检查。将晶体转移到冷冻保护剂溶液(补充有25％甘油的结晶溶液)中，并在液氮中快速冷冻。
数据收集和处理
衍射数据是在太阳同步加速器(Gif sur Yvette,France)的Proxima 2A光束线上收集的。使用XDS(1)进行数据处理和缩放。使用PDB 5E6I(针对HLA)(100％序列同一性)和5AZE(与VH具有90％的序列同一性)以及5I15(与VL具有97％的序列同一性)(针对Fab)作为进入模型，使用来自CCP4套件(2)的MolRep和Arp/Warp进行分子替换。使用Buster TNT(GlobalPhasing,Inc)和Coot(CCP4套件)中的手动模型修改进行细化。
复合物纯化
组合在单个蛋白质峰与形成的复合峰之间产生了良好的分离(图28A)。将孵育时间增加到16小时(过夜)不会改变形成的复合体的比率(约50％的蛋白质存在于复合体中，并且50％作为游离蛋白质存在)。在还原条件下通过SDSPAGE进行的峰分析显示，在混合级分中同时存在Fab链(30kDa)、HLA重链(约35kDa)和HLA轻链(BLM，<10kDa)(图28B)。
结晶和数据收集
将合并的复合物级分进行浓缩和筛选。3-4周后，一些HLA-Fab组合出现晶体。表24中概述了A*02:01_AIFPGAVPAA-G8-P1C11 Fab复合物和所得晶体形成的结晶条件的概述。
表24：结晶条件
Figure BDA0002980945400001951
在测试的条件中，有4个产生了晶体。两产生衍射良好的晶体(分辨率为1.7至
Figure BDA0002980945400001952
)，并被整合到P1空间群中(表24)。通过结合分子替换(MolRep)和使用Arp/Warp的软件自动建模，可以进行结构解析。
图29中显示了包含Fab克隆G8-P1C11与HLA-肽靶A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)的复合物的示例性晶体。使用商业筛选JCSG，使用25％(w/v)PEG 3350 100mM双Bis-Tris/盐酸pH 5.5生长这种晶体。将该晶体用于生成以下结构数据。
结构分析
图30中显示了通过Fab克隆G8-P1C11与HLA-肽靶A*02:01_AIFPGAVPAA(“G8”)结合形成的复合物的整体结构。单个蛋白质被表示为表面。HLA与VH和VL之间的界面面积分别为
Figure BDA0002980945400001961
和
Figure BDA0002980945400001962
在精修过程中，对应于肽的电子密度区域清晰可见，并允许肽侧链明确定位(图31)，所提供的10残基肽序列是AIFPGAVPAA。与相互作用界面相关的所有区域都得到精修；然而，在抗体恒定区中仍需要一些精修。
复合物中单体的编码在下面的表25中提供，该编码在下面的数据中提及。
表25：晶体分析中使用的单体编码
单体 单体代码(ID)
HLA重链(α1,α2,α3) A
HLAβ2微球蛋白(轻链) B
限制性肽 I
Fab重链(VH-CH1) C
Fab轻链(VL-CL) D
HLA-肽相互作用
限制性肽AIFPGAVPAA主要埋在HLA A*02:01结合口袋中，其中残基P4G5A6向Fab突出。肽与HLA之间的相互作用表面为
Figure BDA0002980945400001963
并占总肽溶剂可及表面
Figure BDA0002980945400001964
的76％。肽与HLA的结合牵涉9个氢键和范德华相互作用(图32)，并且产生的结合能为-16.4kcal/mol。
下表26中显示了氢相互作用列表。
表26：限制性肽与HLA之间的氢键相互作用。
肽 距离(埃) HLA
I:ALA 1[N] 2.72 A:TYR 172[OH]
I:ALA 1[N] 2.86 A:TYR 8[OH]
I:ILE 2[N] 2.81 A:GLU 64[OE1]
I:ILE 2[N] 3.71 A:TYR 8[OH]
I:PHE 3[N] 2.94 A:TYR 100[OH]
I:ALA 1[O] 2.67] A:TYR 160[OH
I:PRO 8[O] 2.93 A:ARG 98[NH2]
I:PRO 8[O] 2.89 A:ARG 98[NH1]
I:ALA 9[O] 2.71 A:TRP 148[NE1]
I:ALA 1[N] 2.72 A:TYR 172[OH]
图37中显示了HLA与限制性肽的完整界面概述。
图38中显示了来自限制性肽与HLA的相互作用残基的完整列表。
Fab-限制性肽相互作用
由于大部分肽被埋在HLA的结合口袋中，只有一部分可用于与Fab链的相互作用。这通过观察肽的76％的溶剂可及区域被其与HLA的相互作用所占据而得到证实。肽与Fab的重链和轻链的相互作用面积分别为114.3和
Figure BDA0002980945400001971
Figure BDA0002980945400001972
这相当于总肽溶剂可及面积的18％。PISA分析显示Fab与肽之间的相互作用仅涉及两个氢键：轻链的Tyr32的羟基与肽的Gly5的主链羰基相互作用，并且Tyr100A主链酰胺与肽的Pro4的主链羰基相互作用(关于氢相互作用列表，见下表27)。
表27：Fab/限制性肽氢键相互作用
肽 距离(A) Fab
I:PRO 4[O] 3.0 C:TYR 100A[OH](VH)
I:GLY 5[O] 3.7 D:TRY 32[OH](VL)
Fab对限制性肽的识别模式主要是通过疏水相互作用和涉及溶剂分子的氢键(图33和图34)。对于VH和VL链，Fab与限制性肽之间的相互作用的结合能分别为-2.0和-1.9千卡/摩尔。
图39中显示了Fab VH链与限制性肽的完整界面概述，以及来自Fab VH链和限制性肽的相互作用残基的完整列表。
图40中显示了Fab VL链与限制性肽的完整界面概述，以及来自Fab VL链和限制性肽的相互作用残基的完整列表。
Fab-HLA相互作用
Fab与HLA部分广泛相互作用，如通过HLA与Fab之间的界面面积(共有
Figure BDA0002980945400001981
)所显示的。HLA与VH链之间的相互作用由疏水相互作用、6个氢键和3个盐桥组成(图35，VH与HLA之间的相互作用；和图36，VL与HLA之间的相互作用)。这种相互作用代表了与
Figure BDA0002980945400001982
(总接触面积的72％)的主要相互作用。
下面显示了Fab的VH链与HLA蛋白之间的氢键接触表。
表28：VH与HLA之间的氢键接触。
Fab VH 距离 HLA
C:SER 31[OG] 2.71 A:THR 164[OG1]
C:TYR 100A[OH] 2.55 A:THR 164[OG1]
C:SER 31[N] 3.17 A:GLU 167[OE1]
C:SER 30[N] 2.86 A:GLU 167[OE2]
C:TYR 32[OH] 2.80 A:LYS 67[NZ]
C:TYR 98[O] 2.94 A:ARG 66[NH2]
C:ASP 100[OD1] 2.88 A:ARG 66[NH1]
下面显示了Fab的VH链与HLA蛋白之间的盐桥接触表。
表29：VH与HLA之间的盐桥接触。
Fab VH 距离 HLA
C:ASP 100[OD1] 2.88 A:ARG 66[NH1]
C:ASP 100[OD1] 3.39 A:ARG 66[NH2]
C:ASP 100[OD2] 3.40 A:ARG 66[NH1]
图41中显示了Fab VH链HLA蛋白的完整界面概述。
图42中显示了Fab VH链和HLA蛋白相互作用残基的完整列表。
下表30中显示了Fab的VL链和HLA蛋白之间的氢键接触的表。
表30：VL与HLA之间的氢键。
Fab VL 距离 HLA
D:ILE 94[N] 3.56 A:ALA 151[O]
D:SER 30[OG] 2.84 A:GLN 73[NE2]
D:ILE 94[O] 3.00 A:HIS 152[ND1]
图43中显示了Fab VL链HLA蛋白的完整界面概述。
图44中显示了来自Fab VL链和HLA蛋白的相互作用残基的完整列表。
实施例16：预测的HLA-肽复合物的鉴定
我们使用三个计算步骤鉴定了癌症特异性HLA肽靶标：首先，我们使用可通过基因型-组织表达(GTEx)项目[1]获得的数据，鉴定了在大多数正常组织中通常不表达的基因。然后，我们使用来自癌症基因组图谱(TCGA)研究网络的数据，鉴定了这些基因中哪些在癌症样品中异常表达：http://cancergenome.nih.gov/。在这些基因中，如国际专利申请第PCT/US2016/067159号(出于所有目标，通过引用以其整体并入本文)中所述，我们使用在由MS/MS测序的HLA呈递肽上训练的深度学习模型，鉴定了哪些肽可能被MHC I类蛋白呈递为细胞表面抗原。
为了鉴定通常在正常组织中不表达的基因，我们从基因型-组织表达(GTEx)项目(V6p版)中获得了聚集的基因表达数据。该数据集包括来自50多种组织类型的8,555份死后样品。表达是用RNA-Seq测量的，并根据GTEx标准管线(https://www.gtexportal.org/home/documentationPage)进行计算处理。出于该分析目的，如果发现基因不在GTEx的任何组织中表达，或仅在睾丸、小唾液腺和子宫颈(即，免疫特权或非必需组织)中的一种或多种中表达，则认为所述基因不在正常组织中表达。我们还限制了我们的搜索范围，只包括蛋白质编码基因。因为GTEx和TCGA在它们的计算分析中使用了人基因组的不同注释，我们排除了我们不能使用标准技术(诸如ENCODE映射)在两个数据集之间映射的基因。
我们试图限定标准来排除在正常组织中表达的基因，所述正常组织严格确保肿瘤特异性，但不会排除由偶发性、低水平转录或潜在伪影(诸如读段错位)引起的非零测量值。因此，如果基因在GTEx样品中的中位表达小于0.5RPKM(每百万映射读段每千碱基转录物的读段数)，并且其从未以大于10RPKM表达，并且其在所有必需组织样品中在不超过两个样品中以5RPKM表达，我们将所述基因指定为在非免疫特权或必需组织中不正常表达。为了排除使用GTEX分析管线可能表达但不能通过RNA-Seq测量的基因，我们还排除了在所有样品中以0RPKM测量的基因。这些标准给我们留下了一组在大多数正常组织中似乎没有表达的蛋白质编码基因。
我们接下来试图鉴定这些基因中有哪些在肿瘤中异常表达。我们检查了11,093份可从TCGA(数据发布6.0(Data Release 6.0))获得的样品。如果在至少5个样品中观察到至少5FPKM(每百万映射读段每千碱基转录物的读段数)的表达，我们认为所述基因表达。因为一个片段通常由两个映射的读段组成，所以5FPKM大致相当于10RPKM。
虽然GTEx数据涵盖了广泛的组织类型，但其并不包括人体中存在的所有细胞类型。因此，我们使用DAVID v 6.8[2]进一步检查了基因生物功能类别的列表，并使用该分析和文献综述进一步过滤基因列表。我们去除了可能在免疫细胞中表达的基因(例如，干扰素家族基因)、与眼睛相关的基因(例如，FANTOM5数据集http://www.proteinatlas.org中的视网膜)、在嘴和鼻中表达的基因(例如,嗅觉基因和味觉受体)以及与昼夜节律周期相关的基因。我们还排除了属于大基因家族的基因，包括组蛋白基因，因为由于序列同源性的原因，它们的表达很难用RNA测序准确评估。
然后，我们检查了TCGA样品中剩余基因的表达分布。当我们检查已知的癌症睾丸抗原(CTA)，例如MAGE基因家族时，我们观察到在TCGA中的所有样品中，这些基因在对数空间中的表达通常具有双峰分布的特点。这一分布包括在较低的表达值附近的左模式和在较高的表达水平的右模式(或粗尾)。这一表达模式与生物学模型一致，在所述生物学模型中，所有样品的基线处都检测到一些最小表达，而在经历表观遗传失调的肿瘤子集中观察到所述基因的更高表达水平。我们回顾了每个基因在TCGA样品中的表达分布，并丢弃了那些仅观察到单峰分布而没有明显右尾的样品，因为这种分布(作为一个非限制性实例)更有可能表征正常组织中低基线表达的基因。
这给我们留下了超过630个基因的剩余基因列表，所述列表高度富集了参与睾丸特异性生物过程和发育的基因。因为这些基因中的许多产生不同的同种型，使用UNIPROT映射服务将这些基因映射到超过1,200个蛋白质。除了符合我们严格计算标准的基因，我们还添加了几个以前在科学文献中被鉴定为癌症睾丸抗原的基因。
为了鉴定可能被MHC I类蛋白质当作细胞表面抗原呈递的肽，我们使用了滑动窗将这些蛋白质中的每一个解析为其组成的8-11个氨基酸序列。我们使用HLA肽呈递深度学习模型处理这些肽和其侧翼序列，以计算每种肽在5TPM(其大致对应于每细胞一个转录本[3]至200TPM(即，高表达水平)的表达水平下的呈递的可能性。如果在TCGA数据集中，在10名或更多患者中，通过我们的模型计算的肽呈递概率大于0.1，并且表达为5TPM或更高，则我们认为所述肽是假定的HLA-肽靶标。
结果如表A1所示。根据该实例，有超过1,800个跨约400个基因的HLA-肽靶标和25个分析的HLA等位基因。为了清楚起见，在表A1中为每个HLA-肽指定靶标号。例如，HLA-肽靶标1是HLA-A*01:01_EVDPIGHLY，HLA-肽靶标2是HLA-A*29:02_FVQENYLEY，依此类推。
总之，这份HLA-肽靶标列表有望对癌症特异性靶标的知识水平做出重大贡献。总之，所述实例提供了大量肿瘤特异性HLA-肽，可将其作为ABP研究和开发的候选靶标。
参考文献
1.Consortium，G.T.，The Genotype-Tissue Expression(GTEx)project.NatGenet，2013.45(6)：p.580-5.
2.Huang da，W.，B.T.Sherman，and R.A.Lempicki，Systematic and integrativeanalysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.Nat Protoc，2009.4(1)：p.44-57.
3.Shapiro，E.，T.Biezuner，and S.Linnarsson，Single-cell sequencing-basedtechnologies will revolutionize whole-organism science.Nat Rev Genet，2013.14(9)：p.618-30.
实施例17：预测的HLA-肽复合物的初步验证
作为验证上述方法产生的预测的HLA-肽靶标的初步评估，我们评估了公共数据库，并选择了以前通过各种测定技术(包括HLA结合亲和力测量、HLA肽质谱以及T细胞反应的测量)鉴定的这些靶标的报告文献。使用了两个包含HLA-肽对的测定结果注释的综合数据库：IEDB(Vita等人，2015)和Tantigen(Olsen等人，2017)。我们确定，先前在数据库中报告了19个(15个在基因当中是唯一的)计算预测的靶标，许多存在于长期以来一直是癌症免疫学的研究对象的基因(例如，癌症睾丸抗原)中。参见表B。
Figure BDA0002980945400002021
Figure BDA0002980945400002031
对上述公共数据库中未找到的肽进行了额外的有限文献综述。如表C所示，鉴定出以下肽：
Figure BDA0002980945400002032
表C中一个值得注意的实例是KKLC1 HLA-A*01:01_NTDNNLAVY。Kita-kyushu肺癌抗原-1(KK-LC-1；CT83)是癌症睾丸抗原(CTA)，其已被证明在许多不同的癌症类型中广泛表达。其最初是基于克隆到KK-LC-1肽76-84–RQKRILVNL的CTL发现的(Fukuyama等人，2006)。最近，
Figure BDA0002980945400002033
等人，2017揭示了另一种来自在宫颈癌患者中由CTL识别的KK-LC-1的肽，即预测的肽KK-LC-1 52-60 NTDNNLAVY。该CTL的相应TCR现已列于NIH网站https://www.ott.nih.gov/technology/e-153-2016/上，该肽列于WO2017/089756 A1(出于所有目的，通过引用以其整体并入本文)中。
该实例强调了表A中预测的HLA-肽靶标的期望值：虽然在预测中没有包含关于哪个CTA HLA-肽靶标先前是已知的信息，但分析产生了许多文献中描述的靶标，表明许多新型靶标同样可以通过实验验证，并最终作为一种或多种ABP的靶标。
参考文献
Fukuyama，T.，Hanagiri，T.，Takenoyama，M.，Ichiki，Y.，Mizukami，M.，So，T.，Sugaya，M.，So，T.，Sugio，K.，and Yasumoto，K.(2006).Identification of a newcancer/germline gene，KK-LC-1，encoding an antigen recognized by autologous CTLinduced on human lung adenocarcinoma.Cancer Res.66.4922-4928.
Olsen，L.R.，Tongchusak，S.，Lin，H.，Reinherz，E.L.，Brusic，V.，and Zhang，G.L.(2017).TANTIGEN：a comprehensive database of tumor T cell antigens.CancerImmunol.Immunother.CII 66，731-735.
Figure BDA0002980945400002041
S.，Pasetto，A.，Helman，S.R.，Gartner，J.J.，Prickett，T.D.，Howie，B.，Robins，H.S.，Robbins，P.F.，Klebanoff，C.A.，Rosenberg，S.A.，et al.(20l7).Landscape of immunogenic tumor antigens in successful immunotherapy ofvirally induced epithelial cancer.Science 356，200-205.
Vita，R.，Overton，J.A.，Greenbaum，J.A.，Ponomarenko，J.，Clark，J.D.，Cantrell，J.R.，Wheeler，D.K.，Gabbard，J.L.，Hix，D.，Sette，A.，et al.(2015).Theimmune epitope database(IEDB)3.0.Nucleic Acids Res.43，D405-412.
实施例18：预测的HLA-肽复合物的鉴定
接下来，鉴定了来自七个基因的蛋白质的HLA-肽靶标：AFP、KKLC-1、MAGE-A4、MAGE-A10、MART-1、NY-ESO-1和WT1。
为了鉴定可能被MHC I类蛋白当作细胞表面抗原呈递的肽，使用了滑动窗将这些蛋白质中的每一个解析为其组成的8-11个氨基酸序列。然后用HLA肽呈递深度学习模型(见上文的PCT/US2016/067159和实施例16)处理这些肽及其侧翼序列，以计算64种I类HLA类型中的每一种在100TPM(高表达)的表达水平下呈递每种肽的可能性。通过对每个HLA的模型评分进行分位数归一化，消除了由于训练数据偏差而可能给某些HLA带来更高评分的潜在建模假象，从而使每个HLA呈现来自相同分布的评分。在归一化中，包括7个靶基因以及50个随机选择的基因，以控制HLA等位基因序列偏好。如果模型归一化分数高于0.00075，则认为可能存在基因，所述分数是基于文献中已知存在的肽的呈递分数选择的。
结果如表A2所示。如实施例16所述，对每个HLA-肽靶标指定靶标号。
实施例19：结合HLA-肽复合物的抗体或其抗原结合片段的鉴定
概述
下面的范例表明，可鉴定识别肿瘤特异性HLA-限制性肽的抗体(Ab)。被此类Ab识别的全部表位通常包括肽和呈递该特定肽的HLA蛋白两者的复合表面。以肽特异性方式识别HLA复合物的Ab通常被称为T细胞受体(TCR)样Ab或TCR模拟Ab。选择用于抗体发现的HLA-肽靶抗原是HLA-A*01:01_NTDNNLAVY(表A1中的命名为“G2”的靶标33)和HLA-A*02:01_LLASSILCA(表A2中的命名为“G7”的靶标6427)。如实施例2所述，通过对从肿瘤样品获得的HLA复合物的质谱分析，证实了这些HLA-肽抗原的细胞表面呈递。
HLA-肽靶标复合物和反向筛选肽-HLA复合物的产生及稳定性分析
HLA-肽靶标G2和G7，以及反向筛选阴性对照肽-HLA，是利用已建立的方法使用HLA分子的条件配体重组产生的。总的来说，对于G2和G7靶标中的每一个产生18个反向筛选HLA-肽。
噬菌体文库筛选的总体设计
来自Distributed Bio Inc的高度多样化的SuperHuman 2.0合成原初scFv文库(在超稳定和多样化的VH/VL支架上具有7.6e10种总多样性)被用于噬菌体展示。最初用18个合并的阴性pHLA复合物(“完整集合”)耗竭噬菌体文库，然后使用已建立的方案，利用靶标pHLA复合物进行3-4轮基于珠粒的噬菌体淘选，分别鉴定至HLA-肽靶标G2和G7的scFv结合剂。在每一轮淘选时测定噬菌体滴度，以确定非结合噬菌体的去除。图70A和图70B中显示了噬菌体ELISA结果。在随后轮的淘选中，对于G2和G7靶标中的每一个都有结合噬菌体的富集。还通过ELISA测试了输出噬菌体上清液的靶标结合。
图64中显示了G2靶标的靶标筛选1的设计。类似地，图67中显示了G7靶标的靶标筛选2的设计。简言之，对于每个靶标，选择三种“微型集合”反向筛选肽的与靶标结合相同的HLA等位基因以及具有显著不同的面向ABP的特征(诸如电荷、体积、芳族或疏水残基)的能力。参见图65A(对于G2)和图69A(对于G7)。另外，产生了附加的反向筛选肽-HLA复合物，其特征在于不同的限制性肽序列和不同的HLA等位基因。15个附加的反向筛选HLA肽加上三个“微型集合”HLA肽形成了总共18个反向筛选HLA-肽复合物的“完整集合”。
肽-HLA复合物的产生
使用已建立的程序，在BL21感受态大肠杆菌(E.Coli)细胞(New EnglandBiolabs)中分别表达各种人白细胞抗原(HLA)的α-和β2微球蛋白链(Garboczi,Hung,&Wiley,1992)。自动诱导后，在
Figure BDA0002980945400002061
全能核酸酶蛋白提取试剂(Novagen)中通过超声处理裂解细胞。洗涤所得包涵体，并在具有和不具有0.5％Triton X-100((50mM Tris、100mM NaCl、1mM EDTA))的洗涤缓冲液中进行超声处理。最后一次离心后，将包涵体颗粒溶于尿素溶液(8M尿素、25mM MES、10mM EDTA、0.1mM DTT，pH6.0)中。使用Bradford测定(Biorad)定量浓度，并将包涵体储存在-80℃。
HLA复合物是通过使用已建立的程序将重组产生的亚基和合成得到的肽重折叠而获得的。(Garboczi et al.,1992)。简言之，将纯化的α和β2微球蛋白链与选择的限制性肽在重折叠缓冲液(100mM Tris pH 8.0、400mM L-精氨酸HCl、2mM EDTA、50mM氧化型谷胱甘肽、5mM还原型谷胱甘肽、蛋白酶抑制剂片)中重折叠。在一些实验中，选择的限制性肽是条件配体肽，其在暴露于条件刺激时是可裂解的。在一些实验中，选择的限制性肽是G2或G7靶标肽，或反向筛选肽。用Vivaflow 50或50R crossflow cassette(SartoriusStedim)浓缩重折叠溶液。在20mM Tris pH 8.0中进行三轮透析，每次至少8小时。为了进行抗体筛选和功能测定，使用BirA生物素连接酶(Avidity)对重新折叠的HLA进行酶促生物素化。使用附接到Akta FPLC系统的HiPrep(16/60Sephacryl S200)尺寸排阻柱纯化重折叠的蛋白质复合物。在非还原条件下，通过将重折叠的蛋白质与过量的链霉亲和素在室温下孵育15分钟，然后进行SDS-PAGE，在链霉亲和素凝胶移位测定中确认了生物素化。将所得肽-HLA复合物等分并储存在-80℃。
肽-HLA复合物的稳定性分析
通过条件配体肽交换和稳定性ELISA测定评估HLA肽的稳定性。简言之，在存在或不存在反向筛选肽或测试肽的情况下，对条件配体-HLA复合物进行±条件刺激。暴露于条件刺激下，从HLA复合物中裂解条件配体，导致HLA复合物解离。如果反向筛选肽或测试肽稳定地结合HLA复合物的α1/α2沟，则可以“解救”HLA复合物使其免于解离。
使用已建立的程序进行HLA稳定性ELISA。(Chew等人，2011；Rodenko等人，2006)在384孔透明平底聚苯乙烯微孔板(Corning)上预涂50μl在PBS中浓度为2μg mL-1的链霉亲和素(Invitrogen)。在37℃下孵育2小时后，用0.05％的于PBS中的Tween 20洗涤缓冲液洗涤孔(四次，50μL)，用50μl封闭缓冲液(2％的于PBS中的BSA)处理，并在室温下孵育30分钟。随后，将用20mM Tris HCl/50mM NaCl稀释300倍的25μl的肽交换样品按照一式四份添加。将样品在室温下孵育15分钟，用0.05％Tween洗涤缓冲液(4×50μL)洗涤，在室温下用25μL的缀合有HRP的抗β2m(PBS中的1μg mL-1)处理15分钟，用0.05％Tween洗涤缓冲液(4×50μL)洗涤，并用25μL的ABTS溶液(Invitrogen)显影10至15分钟，然后通过添加12.5μL的终止缓冲液(于0.1M柠檬酸中的0.01％叠氮化钠)来终止反应。随后使用分光光度计(SpectraMaxi3x；Molecular Devices)在415nm下测量吸光度。
图65B中显示了G2反向筛选“微型集合”和G2靶标的结果。所有三种反向筛选肽和G2肽均解救了HLA复合物，使其免于解离。
图66中显示了附加的G2“完整”集合反向筛选肽的结果，，表明它们也形成稳定的HLA-肽复合物。
图69B中显示了G7反向筛选“微型集合”和G7靶标的结果。所有三种反向筛选肽和G7肽均解救了HLA复合物，使其免于解离。
图68中显示了附加的G7“完整”集合反向筛选肽的结果，表明它们也形成稳定的HLA-肽复合物。
噬菌体文库筛选
根据上述总体筛选设计进行噬菌体文库筛选。进行三至四轮基于珠粒的淘选，以鉴定至每个肽-HLA复合物的scFv结合剂。对于每一轮淘选，留出一等分的起始噬菌体用于输入滴定，然后将剩余的噬菌体用Dynabead M-280链霉亲和素珠粒(Life Technologies)耗竭三次，然后用预先结合有100皮摩尔的合并的阴性肽-HLA复合物耗竭链霉亲和素珠粒。对于第一轮淘选，将结合于链霉亲和素珠粒的100皮摩尔的肽-HLA复合物与耗竭的噬菌体在室温下旋转孵育2小时。用1×PBST(PBS+0.05％Tween-20)中的0.5％BSA洗涤三次，每次五分钟，然后用1×PBS中的0.5％BSA洗涤三次，每次五分钟，以去除未结合至肽-HLA复合物结合珠粒的任何噬菌体。为了从洗涤的珠粒上洗脱结合的噬菌体，加入1mL的0.1M TEA，并在室温下旋转孵育10分钟。从珠粒中收集洗脱的噬菌体，并用0.5ml的1M Tris-HCl pH7.5中和。然后将中和的噬菌体用于感染对数生长的TG-1细胞(OD600＝0.5)，并在37℃感染一小时后，将细胞涂铺至含有100μg/ml羧苄青霉素和2％葡萄糖(2YTCG)的琼脂板的2YT培养基上，用于输出滴定和用于后续淘选轮次的细菌生长。对于随后的淘选轮次，降低选择抗原浓度，同时增加洗涤次数和洗涤时长，如
表31所示。
Figure BDA0002980945400002081
Figure BDA0002980945400002091
从噬菌体中克隆单个scFv，并通过DNA Sanger测序(“序列独特结合剂”)进行测序。单个scFv也在大肠杆菌中表达，并将含有单个粗scFv的大肠杆菌周质提取物(PPE)进行scFv ELISA
scFv周质提取物(PPE)ELISA
如下将从最后一轮淘选中获得的噬菌体克隆并在大肠杆菌中表达的单个scFv进行scFv PPE ELISA。
将96孔和/或384孔链霉亲和素包被的板(Pierce)用在HLA缓冲液中的2ug/ml肽-HLA复合物包被，并在4℃下孵育过夜。在每个步骤之间，用PBST(PBS+0.05％)将板洗涤三次。在室温下，用PBS中的3％BSA(封闭缓冲液)封闭抗原包被的板1小时。洗涤后，将scFvPPE加入板，并在室温下孵育1小时。洗涤后，加入封闭缓冲液中的小鼠抗-v5抗体(Invitrogen)以检测scFv，并在室温下孵育1小时。洗涤后，加入HRP-山羊抗小鼠抗体(Jackson ImmunoResearch)，并在室温下孵育1小时。然后将板用PBST洗涤三次，并用PBS洗涤3次，接着用TMB 1-组分微孔过氧化物酶底物(Seracare)检测HRP活性，并用2N硫酸中和。
对于阴性肽-HLA复合物反向筛选，除了包被抗原外，按上述方法进行scFv PPEELISA。HLA微型集合由各自2ug/ml的三种阴性肽-HLA复合物组成，所述三种阴性肽-HLA复合物汇集在一起并被涂覆至链霉亲和素板上，以比较与它们特定的肽-HLA复合物的结合。HLA大集合由各自2ug/ml的所有18种阴性肽-HLA复合物组成，所述18种阴性肽-HLA复合物汇集在一起并被涂覆至链霉亲和素板上，以比较与它们特定的肽-HLA复合物的结合。
分别表达和纯化那些通过scFv-ELISA(以粗PPE的形式)显示相较于阴性对照pHLA对靶标pHLA具有选择性的scFv。通过scFv ELISA滴定纯化的scFv，以用于确认相较于阴性对照pHLA仅结合靶标pHLA(“选择性结合剂”)。
将克隆制成IgG、Fab或scFv，以用于进一步的生化和功能分析。基于以下几个参数，选择了用于Fab生产(用于与其相应的pHLA复合物结晶)的ScFv克隆：序列多样性、结合亲和力、选择性和CDR3多样性。将clustal软件用于生成树状图和评估Fab克隆的序列多样性。在可能的情况下，还考虑了基于VH类型的scFv序列的典型3D结构。使用Octet HTX(ForteBio)测量结合亲和力(如由平衡解离常数(KD)确定的)。对特异性肽-HLA复合物的选择性通过纯化的scFv的ELISA滴定来确定，并将其与阴性肽或单独的链霉亲和素进行比较。基于针对每个组内的Fab获得的值的范围，确定每个靶标组的KD和选择性的截断值。然后选择最终的克隆以获得序列家族和CDR3中最高的多样性。
表32显示了上述筛选活动(screening campaign)的命中率。
Figure BDA0002980945400002101
表33显示了对HLA-肽靶标HLA-A*01:01_NTDNNLAVY具有选择性的G2 scFv选择性结合剂的VH和VL序列
表34显示了对HLA-肽靶标HLA-A*01:01_NTDNNLAVY具有选择性的G2选择性结合剂的CDR序列。CDR是根据Kabat编号系统确定的。
表35显示了对HLA-肽靶标HLA-A*02:01_LLASSILCA具有选择性的G7 scFv选择性结合剂的VH和VL序列。
表36显示了对HLA-肽靶标HLA-A*02:01_LLASSILCA具有选择性的G7选择性结合剂的CDR序列。CDR是根据Kabat编号系统确定的。
实施例20：特异性结合HLA-肽靶标的TCR的分离
图81描绘了实验工作流程，通过该流程可以分离出特异性结合HLA-肽靶标的TCR。简言之，通过流式细胞术分离与HLA-肽靶标结合的原初CD8+T细胞，并进行多克隆扩增。扩增后，通过流式细胞术测试细胞对HLA-肽靶标复合物的特异性。如果扩增群体中的大部分(>75％)对HLA-肽靶标具有特异性，则将所述群体作为整体进行测序，以鉴定TCR。或者，对特异性结合HLA-肽靶标的细胞进行重新分选，并且只对在重新分选后分离的细胞进行测序。将TCR序列克隆到表达载体中，并作为重组TCR引入受体T细胞。评估了TCR-重组T细胞对所评估的TCR的表达以及对同源HLA-肽靶复合物的结合。
CD8+T细胞很容易识别已鉴定的HLA肽靶标
如下磁性富集来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)的原初CD8+T细胞。通过处理来自健康供体的白细胞单采样品获得PBMC。将冷冻的PBMC解冻并与生物素化CD45RO、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD34、CD36、CD57、CD123、抗HLA-DR、CD235a(血型糖蛋白A)、CD244和CD4抗体的混合物一起孵育，然后用抗生物素微珠进行磁性标记，以便从PBMC群体中清除。将富集的原初CD8 T细胞用包含靶标肽和合适的HLA分子的四聚体标记，用活/死和谱系标记物染色，并根据图82描绘的设门程序通过流式细胞术分选。分离结合HLA-肽四聚体的细胞。多克隆扩增后，扩增的CD8+T细胞的特异性通过用HLA-肽进行标记或无四聚体对照进行重新评估。示例性HLA-肽靶标B*44:02_GEMSSNSTAL和A*01:01_EVDPIGHLY的流式细胞术结果示于图83中。HLA-肽靶标A*03:01_GVHGGILNK的流式细胞术结果示于图84中。
每个供体的每个HLA-肽靶标的分离的CD8+T细胞的数量和所有测试的供体的每个HLA-肽靶标的分离的CD8+T细胞频率的分布示于图85A(分离的CD8+T细胞数量)和图85B(频率)中。每个靶标的分离的原初CD8+T细胞总数在23至4181个抗原特异性细胞的范围内，这与对已知免疫原性病毒抗原具有特异性的T细胞的前体频率一致。这些细胞为测序和进一步表征提供了天然TCR的来源。
表37中显示了所有测试的供体中概述的每个靶标的分离的靶特异性T细胞的数量
表37：所有供体中概述的每个靶标的分离的靶特异性T细胞的数量
Figure BDA0002980945400002121
这些数据表明，已鉴定的HLA-肽靶标具有生物学相关性，因为HLA匹配的人血液中存在天然的CD8+T细胞，所述T细胞在预测的相关MHC分子的背景下结合/识别靶标肽。
CD8+T细胞产生了独特的结合HLA-肽靶标的TCR的多样性库
T细胞的测序标准
如果扩增群体中的大部分(>75％)对HLA-肽靶标具有特异性，则将所述群体作为整体进行测序，以鉴定TCR。然后，将从群体中选择的TCR序列克隆到表达载体中，并转染到受体T细胞中以用于确认特异性。或者，对特异性结合HLA-肽靶标的细胞进行重新分选，并且只对在重新分选后分离的细胞进行测序。
测序方案
使用10倍基因组学单细胞分辨率配对免疫TCR谱分析方法对如图82所述分离和扩增的T细胞进行测序。具体来说，将两千至八千个活T细胞分配到单细胞乳剂中，用于随后的单细胞cDNA生成和全长TCR谱分析(通过恒定区的5'UTR—确保α和β配对)。一种方法是在转录本的5'端使用带分子条形码的模板转换寡核苷酸，第二种方法是利用在3'端的带分子条形码的恒定区寡核苷酸，并且第三种方法是将RNA聚合酶启动子与TCR的5'或3'端偶联。所有这些方法都可以在单细胞水平上鉴定和解卷积α和βTCR对。生成的带条形码的cDNA转录本进行优化的酶促和文库构建工作流程，以减少偏差并确保细胞集合内克隆型的准确表征。在Illumina的MiSeq或HiSeq4000仪器上对文库进行测序(双末端150个循环)，靶标测序深度为每个细胞约五千至五万个读段。
通过提供的10倍的Cell Ranger软件处理测序读段。测序读段用铬细胞条形码和UMI标记，其用于逐个细胞组装V(D)J转录本。然后，通过将组装的重叠群作图到Ensembl 87版(http://www.ensembl.org/)的V(D)J参考序列来注释每个细胞的组装的重叠群。
克隆型被定义为独特的CDR3氨基酸序列的α、β链对。对于在2个细胞以上频率出现的单个α链对和单个β链对，对克隆型进行过滤，以产生特定供体中每个靶标肽的克隆型的最终列表。图86A描绘了每个测试的供体的每个HLA-肽靶标的独特TCR克隆型数量。图86B描绘了所有测试的供体中总计的每个HLA-肽靶标的独特的克隆型总数。
来自重新分选的细胞的独特克隆型的TCR序列
在2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的表9中显示了来自重新分选的细胞的对A*0101_EVDPHIGHLY具有特异性的TCR克隆型的注释变量、多样性、连接和恒定区，所述申请通过引用以其整体并入。
在2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的表10中显示了对A*0101_EVDPHIGHLY具有特异性的TCR克隆型的α和β链的V(D)J和CDR3序列，所述申请通过引用以其整体并入。
在2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的表11中显示了在受体T细胞中显示确认的特异性的TCR克隆型的注释变量、多样性、连接和恒定区，所述申请通过引用以其整体并入。
在2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的表12中显示了在受体T细胞中显示确认的特异性的TCR克隆型的α和β链的V(D)J和CDR3序列，所述申请通过引用以其整体并入。
2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997的表13中显示了注释的参考α可变(TRAV)、α连接(TRAJ)、α恒定(TRAC)、β可变(TRBV)、β多样性(TRBD)、β连接(TRBJ)和β恒定(TRBC)序列及其相应的Ensembl转录本(ENST)参考号的表格，所述申请通过引用以其整体并入。对于所公开的任何TCR，氨基酸序列与本文公开的注释参考序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或超过99％的同一性。
实施例21：用已鉴定的TCR瞬时转染的T细胞系特异性结合其靶标HLA-肽复合物， 但不结合阴性对照肽-HLA。
使用Nucleofector 4D电穿孔器用表达人CD8的质粒和表达具有GFP报告基因的TCRα和β链的质粒共转染Jurkat TIB-152T细胞系培养物。用于转染的质粒描述于图49和图50中。转染后24-48小时，分析JurkatT细胞的目标TCR表达。使用流式细胞术评估细胞的与HLA-肽复合物和基于传染病的对照肽四聚体的结合。在评估HLA-肽靶标四聚体的结合之前，将总群体以活的单一表达GFP的细胞进行设门。图87显示了表达A*0201_LLASSILCA-、A*0201_GVYDGEEHSV-、B*4402_GEMSSNSTAL-和A*0101_EVDPIGHLY特异性TCR的Jurkat细胞的实例，所述TCR与其各自的HLA-肽靶标结合，但不与对照肽四聚体结合。
实施例22：克隆到病毒载体中的TCR在原代人CD8+T细胞中稳定表达，并结合同源 肽靶标-MHC复合物
针对对HLA-肽靶标HLA-A*0201_LLASSILCA具有特异性的TCR产生慢病毒载体。作为模型载体系统，我们使用了商购可得的来自SystemBiosciences,Palo Alto,CA.的第三代慢病毒表达载体系统。参见图89。
分离原代人CD8+T细胞，并用重组TCR慢病毒以感染复数(MOI～10)进行转导。在通过四聚体染色评估CD8 T细胞上的TCR表达之前，使用快速扩增方案扩增T细胞1-2周。
图88描绘了设门策略和流动数据，所述数据表明转导的人CD8+细胞与HLA-肽靶标结合。
实施例23：体内概念验证
体内评估先导抗体或CAR-T构建体，以证明在人源化小鼠肿瘤模型中的定向肿瘤杀伤。在植入了人肿瘤和PBMC的异种移植肿瘤模型中评估先导抗体或CAR-T构建体。测量抗肿瘤活性并将其与对照构建体进行比较以证明靶标特异性肿瘤杀伤。
尽管已经参照优选实施例和各种替代实施例具体示出和描述了本发明，但是相关领域技术人员将理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以在形式和细节上对本发明进行各种改变。
出于所有目的，在本说明书的正文中引用的所有参考文献、已授权专利和专利申请均通过引用整体并入。
序列
表4：结合靶标G5的scFv命中的VH和VL序列
Figure BDA0002980945400002161
Figure BDA0002980945400002171
Figure BDA0002980945400002181
Figure BDA0002980945400002191
表5：针对G5的已鉴定的scFv的CDR序列，根据Kabat编号方案编号
Figure BDA0002980945400002192
Figure BDA0002980945400002201
Figure BDA0002980945400002211
表6：结合靶标G8的scFv命中的VH和VL序列
Figure BDA0002980945400002212
Figure BDA0002980945400002221
Figure BDA0002980945400002231
Figure BDA0002980945400002241
表7：针对G8的已鉴定的scFv的CDR序列，根据Kabat编号方案编号
Figure BDA0002980945400002242
Figure BDA0002980945400002251
Figure BDA0002980945400002261
表8：结合靶标G10的scFv命中的VH和VL序列
Figure BDA0002980945400002262
Figure BDA0002980945400002271
Figure BDA0002980945400002281
Figure BDA0002980945400002291
表9：针对G10的已鉴定的scFv的CDR序列，根据Kabat编号方案编号
Figure BDA0002980945400002301
Figure BDA0002980945400002311
表15(G10TCR的CDR3序列)
该表包括在2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793中，其通过引用以其整体并入。
表16:全长α和βTCR序列(G10)
该表包括在2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793中，其通过引用以其整体并入。
表18：对HLA肽A＊01:01_HSEVGLPVY具有特异性的TCR克隆型的CDR3序列
该表包括在2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793中，其通过引用以其整体并入。
表19：对HLA-肽A＊01:01_HSEVGLPVY具有特异性的已鉴定的TCR克隆型的全长αV (J)和βV(D)J序列
该表包括在2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793中，其通过引用以其整体并入。
表33：对HLA-肽靶标HLA-A＊01:01_NTDNNLAVY具有选择性的G2scFv选择性结合剂 的VH和VL序列。
Figure BDA0002980945400002321
Figure BDA0002980945400002331
Figure BDA0002980945400002341
Figure BDA0002980945400002351
Figure BDA0002980945400002361
表34:对HLA-肽靶标HHLA-A＊01:01_NTDNNLAVY具有选择性的G2选择性结合剂的 CDR序列(根据Kabat编号确定)
Figure BDA0002980945400002362
Figure BDA0002980945400002371
Figure BDA0002980945400002381
表35：对HLA-肽靶标HLA-A＊02：01_LLASSILCA具有选择性的scFv选择性结合剂的 VH和VL序列。
Figure BDA0002980945400002382
Figure BDA0002980945400002391
表36:对HLA-肽靶标HLA-A＊02:01_LLASSILCA具有选择性的G7选择性结合剂的 CDR序列
Figure BDA0002980945400002392
Figure BDA0002980945400002401
表38：选定的HLA亚型和B2MG(β-2微球蛋白)的氨基酸序列
A＊01:01
MGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQKMEPRAPWIEQEGPEYWDQETRNMKAHSQTDRANLGTLRGYYNQSEDGSHTIQIMYGCDVGPDGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAVHAAEQRRVYLEGRCVDGLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLR
A＊02:01
MGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLR
B＊35:01
MGSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRTEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQIFKTNTQTYRESLRNLRGYYNQSEAGSHIIQRMYGCDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLR
B2MG
MIQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSFSKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKIVKWDRDM
通过重新分选确认的TCR克隆型的CDR3和V(D)J序列
这些序列包括在2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997中，所述申请通过引用以其整体并入。
通过克隆确认的TCR克隆型的CDR3和V(D)J序列
这些序列包括在2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997中，所述申请通过引用以其整体并入。
表A
该表包括在2018年12月28日提交的PCT/US2018/06793中，所述申请通过引用以其整体并入。
表A1
该表包括在2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997中，所述申请通过引用以其整体并入。
表A2
该表包括在2018年8月17日提交的PCT/US2018/046997中，所述申请通过引用以其整体并入。

Claims (119)

1.一种分离的抗原结合蛋白(ABP)，其与人白细胞抗原(HLA)-肽靶标特异性结合，其中所述HLA-肽靶标包含与HLA I类分子复合的HLA-限制性肽，其中所述HLA-限制性肽位于所述HLA I类分子的α1/α2异二聚体部分的肽结合沟中，其中所述HLA I类分子为HLA亚型B*35:01(参考序列：MGSHSMRYFYTAMSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASPRTEPRAPWIEQEGPEYWDRNTQIFKTNTQTYRESLRNLRGYYNQSEAGSHIIQRMYGCDLGPDGRLLRGHDQSAYDGKDYIALNEDLSSWTAADTAAQITQRKWEAARVAEQLRAYLEGLCVEWLRRYLENGKETLQRADPPKTHVTHHPVSDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDRTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLR),并且所述HLA-限制性肽包含序列EVDPIGHVY，并且其中所述ABP与以下中的任一个或多个结合：
a.所述限制性肽EVDPIGHVY的氨基酸位置2-9中的任一个或多个；
b.HLA亚型B*35:01的α1螺旋的氨基酸位置50、54、55、57、61、62、74、81、82和85中的任一个或多个；和
c.HLA亚型B*35:01的α2螺旋的氨基酸位置147和148中的任一个或多个。
2.如权利要求1所述的分离的ABP，其中所述ABP与所述限制性肽EVDPIGHVY的氨基酸位置2-8中的任一个或多个结合。
3.如权利要求1所述的分离的ABP，其中所述ABP与所述限制性肽EVDPIGHVY的氨基酸位置5-9中的任一个或多个结合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的分离的ABP，其中所述HLA I类分子是HLA亚型B*35:01，并且所述HLA-限制性肽由序列EVDPIGHVY组成。
5.如权利要求1-4中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含CDR-H3，所述CDR-H3包含选自以下的序列：CARDGVRYYGMDVW、CARGVRGYDRSAGYW、CASHDYGDYGEYFQHW、CARVSWYCSSTSCGVNWFDPW、CAKVNWNDGPYFDYW、CATPTNSGYYGPYYYYGMDVW、CARDVMDVW、CAREGYGMDVW、CARDNGVGVDYW、CARGIADSGSYYGNGRDYYYGMDVW、CARGDYYFDYW、CARDGTRYYGMDVW、CARDVVANFDYW、CARGHSSGWYYYYGMDVW、CAKDLGSYGGYYW、CARSWFGGFNYHYYGMDVW、CARELPIGYGMDVW和CARGGSYYYYGMDVW。
6.如权利要求1-5中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含CDR-L3，所述CDR-L3包含选自以下的序列：CMQGLQTPITF、CMQALQTPPTF、CQQAISFPLTF、CQQANSFPLTF、CQQANSFPLTF、CQQSYSIPLTF、CQQTYMMPYTF、CQQSYITPWTF、CQQSYITPYTF、CQQYYTTPYTF、CQQSYSTPLTF、CMQALQTPLTF、CQQYGSWPRTF、CQQSYSTPVTF、CMQALQTPYTF、CQQANSFPFTF、CMQALQTPLTF和CQQSYSTPLTF。
7.如权利要求1-6中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自scFv的CDR-H3和CDR-L3，所述scFv被命名为G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07或G5R4-P4B01。
8.如权利要求1-7中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自scFv的所有3个重链CDR和所有3个轻链CDR，所述scFv被命名为G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07或G5R4-P4B01。
9.如权利要求1-8中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含VH序列，所述VH序列选自QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGIINPRSGSTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGVRYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSHDINWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGDTGYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGVRGYDRSAGYWGQGTLVIVSS、EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFSFSSYWMSWVRQAPGKGLEWISYISGDSGYTNYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCASHDYGDYGEYFQHWGQGTLVTVSS、EVQLLQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSDMNWVRQAPGKGLEWVAYISSGSSTIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVSWYCSSTSCGVNWFDPWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNSDMNWVRQAPGKGLEWVASISSSGGYINYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVNWNDGPYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNFGVSWLRQAPGQGLEWMGGIIPILGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCATPTNSGYYGPYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYNMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDVMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSGYLVSWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNTAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFRNYPMHWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDNGVGVDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNIGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGIADSGSYYGNGRDYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYGISWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGVTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGDTKYSQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGTRYYGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSYISSSSSYTNYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDVVANFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWMNPDSGSTGYAQRFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGHSSGWYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSYSMHWVRQAPGKGLEWVSSITSFTNTMYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLGSYGGYYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSWFGGFNYHYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARELPIGYGMDVWGQGTTVTVSS和QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIVGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGSYYYYGMDVWGQGTTVTVSS。
10.如权利要求1-9中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含VL序列，所述VL序列选自DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSYRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGLQTPITFGQGTRLEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSSRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPPTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAISFPLTFGQSTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYMMPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYITPWTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYITPYTFGQGTKLEIK、DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKTSQSVLYRPNNENYLAWYQQKPGQPPKLLIYQASIREPGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYTTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRFLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRPQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSHRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK、EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYAASARASGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYGSWPRTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPVTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDISNHLNWYQQKPGKAPKLLIYDALSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPFTFGPGTKVDIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGQGTKVEIK和DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
11.如权利要求1-10中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自scFv的VH序列和VL序列，所述scFv被命名为G5_P7_E7、G5_P7_B3、G5_P7_A5、G5_P7_F6、G5-P1B12、G5-P1C12、G5-P1-E05、G5-P3G01、G5-P3G08、G5-P4B02、G5-P4E04、G5R4-P1D06、G5R4-P1H11、G5R4-P2B10、G5R4-P2H8、G5R4-P3G05、G5R4-P4A07和G5R4-P4B01。
12.一种分离的抗原结合蛋白(ABP)，其与人白细胞抗原(HLA)-肽靶标特异性结合，其中所述HLA-肽靶标包含与HLA I类分子复合的HLA-限制性肽，其中所述HLA-限制性肽位于所述HLA I类分子的α1/α2异二聚体部分的肽结合沟中，所述HLA I类分子为HLA亚型A*01:01(参考序列：MGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQKMEPRAPWIEQEGPEYWDQETRNMKAHSQTDRANLGTLRGYYNQSEDGSHTIQIMYGCDVGPDGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAVHAAEQRRVYLEGRCVDGLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLR)，并且所述HLA-限制性肽包含序列NTDNNLAVY，并且其中所述ABP与以下中的任一个或多个结合：
a.所述限制性肽NTDNNLAVY的残基3-9中的任一个或多个，
b.HLA亚型等位基因A*01:01的α1螺旋的残基70-85中的任一个或多个，以及
c.HLA亚型等位基因A*01:01的α2螺旋的残基140-160中的任一个或多个。
13.如权利要求12所述的分离的ABP，其中所述ABP与所述限制性肽NTDNNLAVY的残基6-9中的任一个或多个结合。
14.如权利要求13所述的分离的ABP，其中所述ABP与所述限制性肽NTDNNLAVY的残基7-8中的任一个或多个结合。
15.如权利要求12-14中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP与HLA亚型等位基因A*01:01的所述α2螺旋的残基157-160中的任一个或多个结合。
16.如权利要求15所述的分离的ABP，其中所述ABP与所述限制性肽NTDNNLAVY的残基6-9中的任一个或多个以及所述HLA亚型等位基因A*01:01的所述α2螺旋的残基157-160中的任一个或多个结合。
17.如权利要求12-16中任一项所述的分离的ABP，其中所述HLA I类分子是HLA亚型A*01:01，并且所述HLA-限制性肽由序列NTDNNLAVY组成。
18.如权利要求12-17中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含CDR-H3，所述CDR-H3包含选自以下的序列：CAATEWLGVW、CARANWLDYW、CARANWLDYW、CARDWVLDYW、CARGEWLDYW、CARGWELGYW、CARDFVGYDDW、CARDYGDLDYW、CARGSYGMDVW、CARDGYSGLDVW、CARDSGVGMDVW、CARDGVAVASDYW、CARGVNVDDFDYW、CARGDYTGNWYFDLW、CARANWLDYW、CARDQFYGGNSGGHDYW、CAREEDYW、CARGDWFDPW、CARGDWFDPW、CARGEWFDPW、CARSDWFDPW、CARDSGSYFDYW、CARDYGGYVDYW、CAREGPAALDVW、CARERRSGMDVW、CARVLQEGMDVW、CASERELPFDIW、CAKGGGGYGMDVW、CAAMGIAVAGGMDVW、CARNWNLDYW、CATYDDGMDVW、CARGGGGALDYW、CALSGNYYGMDVW、CARGNPWELRLDYW和CARDKNYYGMDVW。
19.如权利要求12-18中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含CDR-L3，所述CDR-L3包含选自以下的序列：CQQSYNTPYTF、CQQSYSTPYTF、CQQSYSTPYSF、CQQSYSTPFTF、CQQSYGVPYTF、CQQSYSAPYTF、CQQSYSAPYTF、CQQSYSAPYSF、CQQSYSTPYTF、CQQSYSVPYSF、CQQSYSAPYTF、CQQSYSVPYSF、CQQSYSTPQTF、CQQLDSYPFTF、CQQSYSSPYTF、CQQSYSTPLTF、CQQSYSTPYSF、CQQSYSTPYTF、CQQSYSTPYTF、CQQSYSTPFTF、CQQSYSTPTF、CQQTYAIPLTF、CQQSYSTPYTF、CQQSYIAPFTF、CQQSYSIPLTF、CQQSYSNPTF、CQQSYSTPYSF、CQQSYSDQWTF、CQQSYLPPYSF、CQQSYSSPYTF、CQQSYTTPWTF、CQQSYLPPYSF、CQEGITYTF、CQQYYSYPFTF和CQHYGYSPVTF。
20.如权利要求12-19中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自scFv的CDR-H3和CDR-L3，所述scFv被命名为G2-P1H11、G2-P2E07、G2-P2E03、G2-P2A11、G2-P2C06、G2-P1G01、G2-P1C02、G2-P1H01、G2-P1B12、G2-P1B06、G2-P2H10、G2-P1H10、G2-P2C11、G2-P1C09、G2-P1A10、G2-P1B10、G2-P1D07、G2-P1E05、G2-P1D03、G2-P1G12、G2-P2H11、G2-P1C03、G2-P1G07、G2-P1F12、G2-P1G03、G2-P2B08、G2-P2A10、G2-P2D04、G2-P1C06、G2-P2A09、G2-P1B08、G2-P1E03、G2-P2A03、G2-P2F01或G2-P1D06。
21.如权利要求20所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自命名为G2-P1H11的scFv的CDR-H3和CDR-L3。
22.如权利要求12-21中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自scFv的所有3个重链CDR和所有3个轻链CDR，所述scFv被命名为G2-P1H11、G2-P2E07、G2-P2E03、G2-P2A11、G2-P2C06、G2-P1G01、G2-P1C02、G2-P1H01、G2-P1B12、G2-P1B06、G2-P2H10、G2-P1H10、G2-P2C11、G2-P1C09、G2-P1A10、G2-P1B10、G2-P1D07、G2-P1E05、G2-P1D03、G2-P1G12、G2-P2H11、G2-P1C03、G2-P1G07、G2-P1F12、G2-P1G03、G2-P2B08、G2-P2A10、G2-P2D04、G2-P1C06、G2-P2A09、G2-P1B08、G2-P1E03、G2-P2A03、G2-P2F01或G2-P1D06。
23.如权利要求22所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自命名为G2-P1H11的scFv的所有3个重链CDR和所有3个轻链CDR。
24.如权利要求12-23中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含VH序列，所述VH序列选自：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGMINPSGGGTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGNPWELRLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSATISWVRQAPGQGLEWMGWIYPNSGGTVYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAATEWLGVWGQGTTVTVSS、EVQLLQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTISAPNFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARANWLDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYDLAWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARANWLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYSFDSYVVNWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDWVLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGEWLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGWELGYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTINWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDFVGYDDWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGITWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDYGDLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSNYILSWVRQAPGQGLEWMGWINPDSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTRYNMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYSGLDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWINPNNGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDSGVGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFNNYAFSWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGVAVASDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSSYNMHWVRQAPGQGLEWMGWINGNTGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVNVDDFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAFSWVRQAPGQGLEWMGWINPDTGYTRYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYTGNWYFDLWGRGTLVTVSS、EVQLLESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARANWLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYGISWVRQAPGQGLEWMGWISAYNGYTNYAQNLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDQFYGGNSGGHDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARE-EDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTRYTINWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGANYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYLMHWVRQAPGQGLEWMGWISPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSDYYVHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGEWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSDWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSNYAINWVRQAPGQGLEWMGWISPYSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDSGSYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYYMHWVRQAPGQGLEWMGWIYPNTGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDYGGYVDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREGPAALDVWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTSHLIHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARERRSGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLESGAEVKKPGASVKVSCKASGYSFTDYIVHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTKYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVLQEGMDVWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNFLINWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCASERELPFDIWGQGTMVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYQMFWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGGGGYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAAMGIAVAGGMDVWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYHMHWVRQAPGQGLEWMGWIHPDSGGTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARNWNLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCATYDDGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYTVNWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTKYAQNFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGGALDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGMINPRDDTTDYARDFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCALSGNYYGMDVWGQGTTVTVSS和QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSQYMHWVRQAPGQGLEWMGRIIPLLGIVNYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDKNYYGMDVWGQGTTVTVSS。
25.如权利要求12-24中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含VL序列，所述VL序列选自：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTVQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLQAGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYGVPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVGNWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIGNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSVPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISKWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSVPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPQTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASRDIGRAVGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQLDSYPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSSPYTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIGRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYSFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFAQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSVSNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYAIPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIGSWLAWYQQKPGKAPKLLIYATSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQPGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYIAPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASRLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGVSSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSNPTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWVAWYQQKPGKAPKLLIYGASNLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSDQWTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYLPPYSFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTYFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSSPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISHYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTTPWTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYLPPYSFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQEGITYTFGQGTKVEIK和EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSRNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQHYGYSPVTFGQGTKLEIK。
26.如权利要求12-25中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自scFv的VH序列和VL序列，所述scFv被命名为G2-P1H11、G2-P2E07、G2-P2E03、G2-P2A11、G2-P2C06、G2-P1G01、G2-P1C02、G2-P1H01、G2-P1B12、G2-P1B06、G2-P2H10、G2-P1H10、G2-P2C11、G2-P1C09、G2-P1A10、G2-P1B10、G2-P1D07、G2-P1E05、G2-P1D03、G2-P1G12、G2-P2H11、G2-P1C03、G2-P1G07、G2-P1F12、G2-P1G03、G2-P2B08、G2-P2A10、G2-P2D04、G2-P1C06、G2-P2A09、G2-P1B08、G2-P1E03、G2-P2A03、G2-P2F01或G2-P1D06。
27.如权利要求26所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自命名为G2-P1H11的scFv的VH序列和VL序列。
28.一种分离的抗原结合蛋白(ABP)，其与人白细胞抗原(HLA)-肽靶标特异性结合，其中所述HLA-肽靶标包含与HLA I类分子复合的HLA-限制性肽，其中所述HLA-限制性肽位于所述HLA I类分子的α1/α2异二聚体部分的肽结合沟中，其中所述HLA I类分子为HLA亚型A*02:01(参考序列：MGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLR)，并且所述HLA-限制性肽包含序列AIFPGAVPAA，并且其中所述ABP与以下中的任一个或多个结合：
a.所述限制性肽AIFPGAVPAA的氨基酸位置1-6中的任一个或多个，
b.所述HLA亚型A*02:01的α1螺旋的氨基酸位置46、49、55、61、74、76、77、78、81和84中的任一个或多个，
c.所述HLA亚型A*02:01的α1螺旋的氨基酸位置45-60、66、67和73中的任一个或多个，
d.所述HLA亚型A*02:01的α2螺旋的氨基酸位置138、145、147、152-156、164、167中的任一个或多个，以及
e.所述HLA亚型A*02:01的氨基酸位置56、59、60、63、64、66、67、70、73、74、132、150-153、155、156、158-160、162-164、166-168、170和171中的任一个或多个。
29.如权利要求28所述的分离的ABP，其中所述ABP与所述限制性肽AIFPGAVPAA的氨基酸位置1-5中的任一个或多个结合。
30.如权利要求29所述的分离的ABP，其中所述ABP与所述限制性肽AIFPGAVPAA的氨基酸位置4和5之一或两者结合。
31.如权利要求28所述的分离的ABP，其中所述ABP与所述限制性肽AIFPGAVPAA的氨基酸位置5和6中之一或两者结合。
32.如权利要求28所述的分离的ABP，其中所述ABP与所述限制性肽AIFPGAVPAA的氨基酸位置6结合。
33.如权利要求28-32中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP与HLA亚型A*02:01的所述α1螺旋的氨基酸位置46、49、55、66、67和73中的任一个或多个结合。
34.如权利要求28-33中任一项所述的分离的ABP，所述ABP包含含有互补位的VH区，所述互补位包含如根据Kabat编号系统编号的序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTLSSYPINWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGHADYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYDYGDYLNFDYWGQGTLVTVSS所示的所述VH区的残基Tyr32、Gly99、Asp100和Tyr100A中的至少一个、两个、三个或四个残基。
35.如权利要求28-34中任一项所述的分离的ABP，所述ABP包含含有互补位的VH区，所述互补位包含如根据Kabat编号系统编号的序列QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTLSSYPINWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGHADYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYDYGDYLNFDYWGQGTLVTVSS所示的VH区的残基Thr28、Leu 29、Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Pro 33、Trp 47、Trp50、Ser 52、Tyr 53、Ser 54、His 56、Asp 58、Tyr 59、Gln 61、Gln 64、Asp 97、Tyr 98、Gly99、Asp100、Tyr100A、Leu100B和Asn100C中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个或22个残基。
36.如权利要求35所述的分离的ABP，其中所述互补位包含如根据Kabat编号系统编号的所述VH区的残基Ser 30、Ser 31、Tyr 32、Tyr 98、Gly 99、Asp 100和Tyr 100A中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个残基。
37.如权利要求28-36中任一项所述的分离的ABP，所述ABP包含含有互补位的VL区，所述互补位包含如根据Kabat编号系统编号的序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPPTFGGGTKVDIK所示的VL区的残基Tyr32、Ser 91和Tyr 92中的至少一个、两个或三个残基。
38.如权利要求28-37中任一项所述的分离的ABP，所述ABP包含含有互补位的VL区，所述互补位包含如根据Kabat编号系统编号的序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPPTFGGGTKVDIK所示的VL区的残基Asp1、Ser30、Asn31、Tyr32、Tyr49、Ala50、Ser53、Ser67、Ser91、Tyr92、Ser93、Ile94和Pro95中的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个或13个残基。
39.如权利要求38所述的分离的ABP，其中所述互补位包含如根据Kabat编号系统编号的VL区的残基Asp1、Asn31、Tyr32、Ser91、Tyr92和Ile94中的至少1个、2个、3个、4个、5个或6个残基。
40.如权利要求28-39中任一项所述的分离的ABP，其中所述HLA I类分子是HLA亚型A*02:01，并且所述HLA-限制性肽由序列AIFPGAVPAA组成。
41.如权利要求28-40中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含CDR-H3，所述CDR-H3包含选自以下的序列：CARDDYGDYVAYFQHW、CARDLSYYYGMDVW、CARVYDFWSVLSGFDIW、CARVEQGYDIYYYYYMDVW、CARSYDYGDYLNFDYW、CARASGSGYYYYYGMDVW、CAASTWIQPFDYW、CASNGNYYGSGSYYNYW、CARAVYYDFWSGPFDYW、CAKGGIYYGSGSYPSW、CARGLYYMDVW、CARGLYGDYFLYYGMDVW、CARGLLGFGEFLTYGMDVW、CARDRDSSWTYYYYGMDVW、CARGLYGDYFLYYGMDVW、CARGDYYDSSGYYFPVYFDYW和CAKDPFWSGHYYYYGMDVW。
42.如权利要求28-41中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含CDR-L3，所述CDR-L3包含选自以下的序列：CQQNYNSVTF、CQQSYNTPWTF、CGQSYSTPPTF、CQQSYSAPYTF、CQQSYSIPPTF、CQQSYSAPYTF、CQQHNSYPPTF、CQQYSTYPITI、CQQANSFPWTF、CQQSHSTPQTF、CQQSYSTPLTF、CQQSYSTPLTF、CQQTYSTPWTF、CQQYGSSPYTF、CQQSHSTPLTF、CQQANGFPLTF和CQQSYSTPLTF。
43.如权利要求28-42中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自scFv的CDR-H3和CDR-L3，所述scFv被命名为G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01或G8-P2C11。
44.如权利要求28-43中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自scFv的所有3个重链CDR和所有3个轻链CDR，所述scFv被命名为G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01或G8-P2C11。
45.如权利要求28-44中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含VH序列，所述VH序列选自：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSRSAITWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGATNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDDYGDYVAYFQHWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYPFIGQYLHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGDSATYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDLSYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTNYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPIGGGTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARVYDFWSVLSGFDIWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSGINWNGGSTGYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVEQGYDIYYYYYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTLSSYPINWVRQAPGQGLEWMGWISTYSGHADYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARSYDYGDYLNFDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSSISGRGDNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARASGSGYYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFGNYFMHWVRQAPGQGLEWMGMVNPSGGSETFAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAASTWIQPFDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFDFSIYSMNWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASNGNYYGSGSYYNYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLTTYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAVYYDFWSGPFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKGGIYYGSGSYPSWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYGVSWVRQAPGQGLEWMGWISPYSGNTDYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNMYLHWVRQAPGQGLEWMGWINPNTGDTNYAQTFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYGDYFLYYGMDVWGQGTKVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLLGFGEFLTYGMDVWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSTTYAQKLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDRDSSWTYYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSNYMHWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLYGDYFLYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSSHAISWVRQAPGQGLEWMGVIIPSGGTSYTQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGDYYDSSGYYFPVYFDYWGQGTLVTVSS和QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYAMNWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDPFWSGHYYYYGMDVWGQGTTVTVSS。
46.如权利要求28-45中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含VL序列，所述VL序列选自：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSITSYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQNYNSVTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCWASQGISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYNTPWTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQAISNSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCGQSYSTPPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSIPPTFGGGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGINSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHNSYPPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYSTYPITIGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNSLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPWTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHSTPQTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNWLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYSTPWTFGQGTKLEIK、EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVGNSLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYGSSPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISGYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSHSTPLTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNIYTYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANGFPLTFGGGTKVEIK和DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
47.如权利要求28-46中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自scFv的VH序列和VL序列，所述scFv被命名为G8-P1A03、G8-P1A04、G8-P1A06、G8-P1B03、G8-P1C11、G8-P1D02、G8-P1H08、G8-P2B05、G8-P2E06、R3G8-P2C10、R3G8-P2E04、R3G8-P4F05、R3G8-P5C03、R3G8-P5F02、R3G8-P5G08、G8-P1C01或G8-P2C11。
48.一种分离的抗原结合蛋白(ABP)，其与人白细胞抗原(HLA)-肽靶标特异性结合，其中所述HLA-肽靶标包含与HLA I类分子复合的HLA-限制性肽，其中所述HLA-限制性肽位于所述HLA I类分子的α1/α2异二聚体部分的肽结合沟中，其中所述HLA I类分子是HLA亚型A*01:01(参考序列：MGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQKMEPRAPWIEQEGPEYWDQETRNMKAHSQTDRANLGTLRGYYNQSEDGSHTIQIMYGCDVGPDGRFLRGYRQDAYDGKDYIALNEDLRSWTAADMAAQITKRKWEAVHAAEQRRVYLEGRCVDGLRRYLENGKETLQRTDPPKTHMTHHPISDHEATLRCWALGFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPKPLTLR)，并且所述HLA-限制性肽包含序列ASSLPTTMNY，并且其中所述ABP与以下中的任一个或多个结合：
a.所述限制性肽ASSLPTTMNY的氨基酸位置4、6、7、8和9中的任一个或多个，
b.HLA亚型A*01:01的氨基酸位置49-56中的任一个或多个，
c.HLA亚型A*01:01的氨基酸位置59-66中的任一个或多个，
d.HLA亚型A*01:01的氨基酸位置136-147中的任一个或多个，以及
e.HLA亚型A*01:01的氨基酸位置157-160中的任一个或多个。
49.如权利要求48所述的分离的ABP，其中所述ABP与所述限制性肽ASSLPTTMNY的氨基酸位置6-9中的任一个或多个结合。
50.如权利要求49所述的分离的ABP，其中所述ABP与所述限制性肽ASSLPTTMNY中的氨基酸6-7中的任一个或多个结合。
51.如权利要求49所述的分离的ABP，其中所述ABP与所述限制性肽ASSLPTTMNY中的氨基酸6结合。
52.如权利要求48-51中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP与以下结合：
a.HLA亚型A*01:01的氨基酸位置52-54中的任一个或多个，
b.HLA亚型A*01:01的氨基酸位置136-139中的任一个或多个，
c.HLA亚型A*01:01的氨基酸位置141-147中的任一个或多个，或者
d.HLA亚型A*01:01的氨基酸位置136-139中的任一个或多个以及HLA亚型A*01:01的氨基酸位置141-147中的任一个或多个。
53.如权利要求48-52中任一项所述的分离的ABP，其中所述HLA I类分子是HLA亚型A*01:01，并且所述HLA-限制性肽由序列ASSLPTTMNY组成。
54.如权利要求48-53中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含CDR-H3，所述CDR-H3包含选自以下的序列：CARDQDTIFGVVITWFDPW、CARDKVYGDGFDPW、CAREDDSMDVW、CARDSSGLDPW、CARGVGNLDYW、CARDAHQYYDFWSGYYSGTYYYGMDVW、CAREQWPSYWYFDLW、CARDRGYSYGYFDYW、CARGSGDPNYYYYYGLDVW、CARDTGDHFDYW、CARAENGMDVW、CARDPGGYMDVW、CARDGDAFDIW、CARDMGDAFDIW、CAREEDGMDVW、CARDTGDHFDYW、CARGEYSSGFFFVGWFDLW和CARETGDDAFDIW。
55.如权利要求48-54中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含CDR-L3，所述CDR-L3包含选自以下的序列：CQQYFTTPYTF、CQQAEAFPYTF、CQQSYSTPITF、CQQSYIIPYTF、CHQTYSTPLTF、CQQAYSFPWTF、CQQGYSTPLTF、CQQANSFPRTF、CQQANSLPYTF、CQQSYSTPFTF、CQQSYSTPFTF、CQQSYGVPTF、CQQSYSTPLTF、CQQSYSTPLTF、CQQYYSYPWTF、CQQSYSTPFTF、CMQTLKTPLSF和CQQSYSTPLTF。
56.如权利要求48-55中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自scFv的CDR-H3和CDR-L3，所述scFv被命名为R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08或R3G10-P5C08。
57.如权利要求48-56中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自scFv的所有3个重链CDR和所有3个轻链CDR，所述scFv被命名为R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08或R3G10-P5C08。
58.如权利要求48-57中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含VH序列，所述VH序列选自：EVQLLESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYWMSWVRQAPGKGLEWVSGISARSGRTYYADSVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARDQDTIFGVVITWFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIHPGGGTTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDKVYGDGFDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREDDSMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFIGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDSSGLDPWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGVGNLDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGVTFSTSAISWVRQAPGQGLEWMGWISPYNGNTDYAQMLQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDAHQYYDFWSGYYSGTYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSNSIINWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREQWPSYWYFDLWGRGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSTHDINWVRQAPGQGLEWMGVINPSGGSAIYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDRGYSYGYFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGNTFIGYYVHWVRQAPGQGLEWVGIINPNGGSISYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGSGDPNYYYYYGLDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLSYYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTGTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGDHFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIGPSDGSTTYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARAENGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYVHWVRQAPGQGLEWMGIIAPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDPGGYMDVWGKGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYLHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGDAFDIWGQGTMVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGRISPSDGSTTYAPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDMGDAFDIWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREEDGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTLSYYYMHWVRQAPGQGLEWMGMIGPSDGSTSYAQRFQGRVTMTRDTSTGTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDTGDHFDYWGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFNNFAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFDATNYAQKFQGRVTFTADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGEYSSGFFFVGWFDLWGRGTQVTVSS和QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYNFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGIIAPSDGSTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARETGDDAFDIWGQGTMVTVSS。
59.如权利要求48-58中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含VL序列，所述VL序列选自：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQGGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYFTTPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISRWLAWYQQKPGKAPKLLIFDASRLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAEAFPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPITFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYIIPYTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCHQTYSTPLTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAYSFPWTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQNISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYSTPLTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISRYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSFPRTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASNLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANSLPYTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQRISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASKLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYGVPTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISTYLAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYYSYPWTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQNGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPFTFGPGTKVDIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQTLKTPLSFGGGTKVEIK和DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIK。
60.如权利要求48-59中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自scFv的VH序列和VL序列，所述scFv被命名为：R3G10-P1A07、R3G10-P1B07、R3G10-P1E12、R3G10-P1F06、R3G10-P1H01、R3G10-P1H08、R3G10-P2C04、R3G10-P2G11、R3G10-P3E04、R3G10-P4A02、R3G10-P4C05、R3G10-P4D04、R3G10-P4D10、R3G10-P4E07、R3G10-P4E12、R3G10-P4G06、R3G10-P5A08或R3G10-P5C08。
61.一种分离的抗原结合蛋白(ABP)，其与人白细胞抗原(HLA)-肽靶标特异性结合，其中所述HLA-肽靶标包含与HLAI类分子复合的HLA-限制性肽，其中所述HLA-限制性肽位于所述HLA I类分子的α1/α2异二聚体部分的肽结合沟中，其中所述HLA I类分子是HLA亚型A*02:01(参考序列：MGSHSMRYFFTSVSRPGRGEPRFIAVGYVDDTQFVRFDSDAASQRMEPRAPWIEQEGPEYWDGETRKVKAHSQTHRVDLGTLRGYYNQSEAGSHTVQRMYGCDVGSDWRFLRGYHQYAYDGKDYIALKEDLRSWTAADMAAQTTKHKWEAAHVAEQLRAYLEGTCVEWLRRYLENGKETLQRTDAPKTHMTHHAVSDHEATLRCWALSFYPAEITLTWQRDGEDQTQDTELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGQEQRYTCHVQHEGLPKPLTLR)，并且所述HLA-限制性肽包含序列LLASSILCA，并且其中所述ABP与以下中的任一个或多个结合：
a.所述限制性肽LLASSILCA的残基1-5中的任一个或多个，
b.所述HLA-A*02:01α1螺旋的残基49-85中的任一个或多个，以及
c.所述HLA-A*02:01α1螺旋的残基57-67中的任一个或多个。
62.如权利要求61所述的分离的ABP，其中所述HLA I类分子是HLA亚型A*02:01，并且所述HLA-限制性肽由序列LLASSILCA组成。
63.如权利要求61或62所述的分离的ABP，其中所述ABP包含CDR-H3，所述CDR-H3包含选自以下的序列：CARDGYDFWSGYTSDDYW、CASDYGDYR、CARDLMTTVVTPGDYGMDVW、CARQDGGAFAFDIW、CARELGYYYGMDVW、CARALIFGVPLLPYGMDVW、CAKDLATVGEPYYYYGMDVW和CARLWFGELHYYYYYGMDVW。
64.如权利要求61-63中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含CDR-L3，所述CDR-L3包含选自以下的序列：CHHYGRSHTF、CQQANAFPPTF、CQQYYSIPLTF、CQQSYSTPPTF、CQQSYSFPYTF、CMQALQTPLTF、CQQGNTFPLTF和CMQGSHWPPSF。
65.如权利要求61-64中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自scFv的CDR-H3和CDR-L3，所述scFv被命名为G7R3-P1C6、G7R3-P1G10、1-G7R3-P1B4、2-G7R4-P2C2、3-G7R4-P1A3、4-G7R4-B5-P2E9、5-G7R4-B10-P1F8或B7(G7R3-P3A9)。
66.如权利要求61-65中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自scFv的所有三个重链CDR和所有三个轻链CDR，所述scFv被命名为G7R3-P1C6、G7R3-P1G10、1-G7R3-P1B4、2-G7R4-P2C2、3-G7R4-P1A3、4-G7R4-B5-P2E9、5-G7R4-B10-P1F8或B7(G7R3-P3A9)。
67.如权利要求61-66中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含选自以下的VH序列：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGGTFSNYGISWVRQAPGQGLEWMGIINPGGSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDGYDFWSGYTSDDYWGQGTLVTVSS、EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCASDYGDYRGQGTLVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFSNYYIHWVRQAPGQGLEWMGWLNPNSGNTGYAQRFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARDLMTTVVTPGDYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASMKVSCKASGYTFTTDGISWVRQAPGQGLEWMGRIYPHSGYTEYAKKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARQDGGAFAFDIWGQGTMVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSQYMHWVRQAPGQGLEWMGWISPNNGDTNYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARELGYYYGMDVWGQGTTVTVSS、QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASRYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWMGRIIPMLNIANYAPKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARALIFGVPLLPYGMDVWGQGTTVTVSS、EVQLLQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSSWMHWVRQAPGKGLEWVSFISTSSGYIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLATVGEPYYYYGMDVWGQGTTVTVSS和QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDTFNTYALSWVRQAPGQGLEWMGWMNPNSGNAGYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARLWFGELHYYYYYGMDVWGQGTMVTVSS。
68.如权利要求61-67中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含选自以下的VL序列：EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSSNLAWYQQKPGQAPRLLIYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCHHYGRSHTFGQGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQANAFPPTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKSSQSVFYSSNNKNQLAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQYYSIPLTFGQGTKLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDIFKYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGQGTRLEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISTWLAWYQQKPGKAPKLLIYYASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSFPYTFGQGTKVEIK、DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCSSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGGGTKVEIK、DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYSASNLRSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGNTFPLTFGQGTKVEIK和DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQGSHWPPSFGQGTRLEIK。
69.如权利要求61-68中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含来自scFv的VH序列和VL序列，所述scFv被命名为G7R3-P1C6、G7R3-P1G10、1-G7R3-P1B4、2-G7R4-P2C2、3-G7R4-P1A3、4-G7R4-B5-P2E9、5-G7R4-B10-P1F8或B7(G7R3-P3A9)。
70.如前述权利要求中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含抗体或其抗原结合片段。
71.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白连接至支架，任选地，其中所述支架包含血清白蛋白或Fc，任选地，其中Fc是人Fc且为IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgA(IgA1、IgA2)、IgD、IgE或IgM同种型Fc。
72.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白通过接头连接至支架，任选地，其中所述接头是肽接头，任选地，其中所述肽接头是人抗体的铰链区。
73.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含Fv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、scFv片段、scFv-Fc片段和/或单结构域抗体或其抗原结合片段。
74.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含scFv片段。
75.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含一个或多个抗体互补决定区(CDR)，任选地，六个抗体CDR。
76.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包括抗体。
77.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是单克隆抗体。
78.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是人源化抗体、人抗体或嵌合抗体。
79.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是多特异性的，任选地是双特异性的。
80.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白结合单一抗原上的多于一个抗原或多于一个表位。
81.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含选自IgG、IgA、IgD、IgE和IgM的类别的重链恒定区。
82.如上述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含类别人IgG和选自IgG1、IgG4、IgG2和IgG3的亚类的重链恒定区。
83.如上述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含延长半衰期的修饰。
84.如上述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含经饰修饰的Fc，任选地，其中所述经修饰的Fc包含延长半衰期的一个或多个突变，任选地，其中所述延长半衰期的一个或多个突变是YTE。
85.如前述权利要求中任一项所述的分离的ABP，其中所述ABP包含T细胞受体(TCR)或其抗原结合部分。
86.如权利要求85所述的抗原结合蛋白，其中所述TCR或其抗原结合部分包含TCR可变区。
87.如权利要求85或86所述的抗原结合蛋白，其中所述TCR或其抗原结合部分包含一个或多个TCR互补决定区(CDR)。
88.如权利要求85-87中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述TCR包含α链和β链。
89.如权利要求85-88中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述TCR包含γ链和δ链。
90.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白是嵌合抗原受体(CAR)的一部分，所述嵌合抗原受体包含：包含抗原结合蛋白的胞外部分；和胞内信号传导结构域。
91.如权利要求90所述的抗原结合蛋白，其中所述抗原结合蛋白包含scFv，并且所述胞内信号传导结构域包含ITAM。
92.如权利要求90或91所述的抗原结合蛋白，其中所述胞内信号传导结构域包含CD3-ζ(CD3)链的ζ链的信号传导结构域。
93.如权利要求90-92中任一项所述的抗原结合蛋白，其还包含连接所述胞外结构域和所述胞内信号传导结构域的跨膜结构域。
94.如权利要求93所述的抗原结合蛋白，其中所述跨膜结构域包含CD28的跨膜部分。
95.如权利要求90-94中任一项所述的抗原结合蛋白，其还包含T细胞共刺激分子的胞内信号传导结构域。
96.如权利要求95所述的抗原结合蛋白，其中所述T细胞共刺激分子是CD28、4-1BB、OX-40、ICOS或其任意组合。
97.一种分离的多核苷酸，其编码前述权利要求中任一项所述的分离的ABP。
98.如前述权利要求中任一项所述的ABP，其中所述抗原结合蛋白通过与所述HLAI类分子的接触点和通过与所述HLA-肽靶标的所述HLA-限制性肽的接触点来与所述HLA-肽靶标结合。
99.如前述权利要求中任一项所述的ABP，其中所述ABP与所述限制性肽或HLA亚型上的氨基酸位置或所述接触点的结合通过位置扫描、氢-氘交换或蛋白质结晶学来确定。
100.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其用作药物。
101.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其用于治疗癌症，任选地其中所述癌症表达或预计表达所述HLA-肽靶标。
102.如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，其用于治疗癌症，其中所述癌症选自实体瘤和血液肿瘤。
103.一种ABP，其是如前述权利要求中任一项所述的ABP的保守修饰的变体。
104.一种抗原结合蛋白(ABP)，其竞争与如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白的结合。
105.一种抗原结合蛋白(ABP)，其结合由如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白所结合的相同的HLA-肽表位。
106.一种工程改造的细胞，其表达包含前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白的受体。
107.如权利要求106所述的工程改造的细胞，其是T细胞，任选地是细胞毒性T细胞(CTL)。
108.如权利要求106或107所述的工程改造的细胞，其中所述抗原结合蛋白自异源启动子表达。
109.一种分离的多核苷酸或多核苷酸组，其编码如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，或其抗原结合部分。
110.一种载体或载体组，其包含如权利要求109所述的多核苷酸或多核苷酸组。
111.一种宿主细胞，其包含如前述权利要求中任一项所述的多核苷酸或多核苷酸组，或如权利要求110所述的载体或载体组，任选地其中所述宿主细胞是CHO或HEK293，或任选地其中所述宿主细胞是T细胞。
112.一种产生抗原结合蛋白的方法，其包括：用如权利要求111所述的宿主细胞表达所述抗原结合蛋白，和分离所表达的抗原结合蛋白。
113.一种药物组合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，和药学上可接受的赋形剂。
114.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，或如权利要求113所述的药物组合物，任选地其中所述癌症选自实体瘤和血液肿瘤。
115.如权利要求114所述的方法，其中所述癌症表达或预计表达所述HLA-肽靶标。
116.一种试剂盒，其包括如前述权利要求中任一项所述的抗原结合蛋白，或如权利要求113所述的药物组合物，和使用说明。
117.一种病毒，其包含如前述权利要求中任一项所述的分离的多核苷酸或多核苷酸组。
118.如权利要求117所述的病毒，其中所述病毒是丝状噬菌体。
119.一种酵母细胞，其包含如前述权利要求中任一项所述的分离的多核苷酸或多核苷酸组。
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