KR20200097253A - T 세포 조성물의 생산방법 - Google Patents

T 세포 조성물의 생산방법 Download PDF

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알차나 브라만담
루카스 제임스 톰슨
데보라 몰텐센
엘렌 필바로프
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주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드
셀진 코포레이션
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Abstract

제공된 본원은 예컨대, 세포 치료에 사용하기 위한, 재조합 수용체를 발현하는 조작된 T 세포의 생산방법이다. 일부 측면에서, 상기 제공된 방법은 자극 조건 하에 세포를 인큐베이션하는 단계, 형질도입 또는 형질감염을 통해 재조합 폴리펩타이드를 상기 세포에 도입하는 단계, 및/또는 증식 및/또는 팽창을 촉진하는 조건 하에 세포를 배양하는 단계 하나 이상을 포함하고, 상기 하나 이상의 단계는 라파마이신의 포유류 표적(mTOR) 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 수행된다. 일부 측면에서, 배양은 라파마이신의 포유류 표적(mTOR) 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 수행된다. 일부 측면에서, 상기 제공된 방법은 in vivo 개선된 지속성 및/또는 항-종양 활성을 갖는 유전적으로 조작된 T 세포를 생산한다.

Description

T 세포 조성물의 생산방법
본 출원은 2018년 7월 28일자로 출원된 미국 가출원 62/711,494호, 2018년 7월 17일자로 출원된 미국 가출원 62/699,709호, 2017년 11월 10일자로 출원된 미국 가출원 62/584,687호, 및 2017년 11월 1일자로 출원된 미국 가출원 62/580,435호의 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전문이 참조로 포함된다.
본 출원은 전자 형식의 서열목록과 함께 제출된다. 서열목록은 크기가 57,098bytes이며, 2018년 11월 1일에 생성된 735042013440SeqList.txt라는 파일로 제공된다. 서열 목록의 전자적 형식의 정보는 그 전체가 참조로 포함된다.
본 발명은, 예컨대, 세포 치료에 사용하기 위해 재조합 수용체를 발현하는 조작된 T 세포를 생성하는 방법을 제공한다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 자극 조건 하에서 세포를 인큐베이션하고, 형질도입 또는 형질감염을 통해 재조합 폴리펩타이드를 세포에 도입하고/하거나 증식 및/또는 팽창을 촉진하는 조건 하에서 세포를 배양하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 하나 이상의 단계는 라파마이신 활성의 포유 동물 표적(mTOR)을 억제하는 작용제의 존재 하에 수행된다. 일부 측면에서, 배양은 라파마이신 활성의 포유 동물 표적(mTOR)을 억제하는 작용제의 존재 하에 수행된다. 일부 측면에서, 제공된 방법은 in vivo에서 개선된 지속성 및/또는 항종양 활성을 갖는 유전자 조작된 T 세포를 생성한다.
질환 및 상태를 치료하기 위해 다양한 세포 치료가 이용 가능하다. 세포 치료 중에는 키메릭 항원 수용체와 같은 재조합 수용체로 유전적으로 조작된 면역 세포, 예컨대, T 세포를 포함하는 방법이 있다. 보다 효율적인 공정 및/또는 개선된 세포 조성 생성물을 제공하는 것을 포함하여, 이러한 세포 치료의 제조 및/또는 조작을 위한 개선된 방법이 필요하다.
조작된 세포의 생산방법, 조작된 세포, 조성물, 키트 및 제조 물품의 제조 방법 및 이러한 요구를 충족시키는 치료 방법이 제공된다.
mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 재조합 수용체로 조작된 세포를 포함하는 1차 인간 T 세포를 포함하는 조작된 세포 조성물을 배양하는 단계를 포함하는 조작된 세포의 조성물의 제조 방법이 본원에 제공되며, 상기 조성물은 배양되기 전에 작용제에 노출되지 않았으며, 상기 방법은 조작된 T 세포를 포함하는 출력 조성물을 생산하기 위해 조성물에서 세포의 증식 또는 팽창을 초래한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 1 차 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포이다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 조작된 T 세포 조성물은 농축된 CD4+ T 세포를 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 조작된 T 세포 조성물은 농축된 CD8+ T 세포를 포함한다.
제공된 본원은 조작된 세포의 조성물을 생산하는 방법으로서, mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에, 재조합 수용체로 조작된 T 세포를 포함하는 농축된 CD4+ 및/또는 농축된 CD8+ 1차 인간 T 세포를 포함하는 조작된 세포 조성물을 배양하는 단계를 포함하고, 상기 방법은 상기 조성물에서 세포의 증식 또는 팽창을 야기하여 조작된 농축된 CD4+ 및/또는 농축된 CD8+ T 세포를 포함하는 출력 조성물을 생산한다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 70% 또는 약 70% 초과, 75% 또는 약 75% 초과, 80% 또는 약 80% 초과, 85% 또는 약 85% 초과, 90% 또는 약 90% 초과, 95% 또는 약 95 % 초과 또는 98% 또는 약 98 % 초과의 CD4+ 1차 인간 T 세포를 포함하고, 및/또는 입력 조성물은 본질적으로 CD4+ 1 차 인간 T 세포로 구성된다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 70% 또는 약 70% 초과, 75% 또는 약 75% 초과, 80% 또는 약 80% 초과, 85% 또는 약 85% 초과, 90% 또는 약 90% 초과, 95% 또는 약 95 % 초과 또는 98% 또는 약 98 % 초과의 CD8+ 1차 인간 T 세포를 포함하고 및/또는 상기 입력 조성물은 본질적으로 CD8+ 1차 인간 T 세포로 구성된다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 70% 또는 약 70% 초과, 75% 또는 약 75% 초과, 80% 또는 약 80% 초과, 85% 또는 약 85% 초과, 90% 또는 약 90% 초과, 95% 또는 약 95 % 초과 또는 98% 또는 약 98 % 초과의 CD4+ 및 CD8+ 1차 인간 T 세포를 포함하고, 및/또는 입력 조성물은 본질적으로 CD4+ 및 CD8+ 1 차 인간 T 세포로 구성된다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 배양은 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 수행된다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-12, IL-15, G-CSF 및 GM-CSF 중 하나 이상을 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 배양 전에, (a) 자극 조건 하에, 1차 T 세포를 포함하는 입력 조성물을 인큐베이션하고, 상기 자극 조건은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극제의 존재를 포함하여 자극된 조성물을 생성하는 단계; 및 (b) 재조합 수용체를 상기 자극된 조성물 내로 도입하여 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물을 생성하는 단계를 포함한다.
제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 1차 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 농축된 CD4+ T 세포를 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 농축된 CD8+ T 세포를 포함한다.
제공된 본원은 조작된 세포의 조성물의 생산방법으로서, 상기 방법은 (a) 자극 조건 하에, CD4+ 또는 CD8+ 1차 인간 T 세포를 위해 농축된 T 세포를 포함하는 입력 조성물을 인큐베이션하고, 상기 자극 조건은 (i) TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극제 및 (ⅱ) mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재를 포함하는 단계; 및 (b) 재조합 수용체를 상기 자극된 조성물 내로 도입하여 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물을 생성하는 단계를 포함한다.
제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 70% 또는 약 70% 초과, 75% 또는 약 75% 초과, 80% 또는 약 80% 초과, 85% 또는 약 85% 초과, 90% 또는 약 90% 초과, 95% 또는 약 95 % 초과 또는 98% 또는 약 98 % 초과의 CD4+ 1차 인간 T 세포를 포함하고; 및/또는 상기 입력 조성물은 본질적으로 CD4+ 1차 인간 T 세포로 구성된다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 70% 또는 약 70% 초과, 75% 또는 약 75% 초과, 80% 또는 약 80% 초과, 85% 또는 약 85% 초과, 90% 또는 약 90% 초과, 95% 또는 약 95 % 초과 또는 98% 또는 약 98 % 초과의 CD8+ 1차 인간 T 세포를 포함하고; 및/또는 상기 입력 조성물은 본질적으로 CD8+ 1차 인간 T 세포로 구성된다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 70% 또는 약 70% 초과, 75% 또는 약 75% 초과, 80% 또는 약 80% 초과, 85% 또는 약 85% 초과, 90% 또는 약 90% 초과, 95% 또는 약 95 % 초과 또는 98% 또는 약 98 % 초과의 CD4+ 및 CD8+ 1차 인간 T 세포를 포함하고; 및/또는 상기 입력 조성물은 본질적으로 CD4+ 및 CD8+ 1차 인간 T 세포로 구성된다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 작은 분자, 작은 유기 분자, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 또는 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 작은 유기 분자이다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 및/또는 mTORC2 키나아제 활성을 억제한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 적어도 하나의 추가 키나아제의 활성을 억제한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 적어도 하나의 추가 키나아제는 PI3K이다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 BEZ235, BGT226, GDC0980, NVP-BEZ235, PF-04691502, PI-103, SAR245409, SF1126, VS5584 또는 XL765이다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 (i) PI3K 활성을 억제하지 않고; (ⅱ) mTOR 활성을 위한 IC50에서 PI3K 활성을 검출 가능하게 억제하지 않으며; 및/또는 (ⅲ) mTOR 활성을 검출 가능하게 억제하는 모든 농도에서 PI3K를 검출 가능하게 억제하지 않는다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 및 mTORC2 키나아제 활성을 억제한다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 피라졸로피리미딘(pyrazolopyrimidine), 토린 l(Torin l), 토르키닙(Torkinib), PP30, Ku-0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354(Wyeth), OSI-027, DS3078a 또는 AZD8055 이다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 활성을 선택적으로 억제한다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 (i) mTORC2 활성을 억제하지 않고; (ⅱ) mTORC1 활성을 위한 IC50에서 mTORC2 활성을 검출 가능하게 억제하지 않으며; 및/또는 (ⅲ) mTORC1 활성을 검출 가능하게 억제하는 모든 농도에서 mTORC2를 검출 가능하게 억제하지 않는다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 라파마이신(rapamycin), 템시로리무스(temsirolimus), 에베로리무스(everolimus), 데포로리무스(deforolimus) 또는 AZD8055이다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 작용제는 하기 화학식 1로 표시되는 화학식을 포함하고,
[화학식 1]
Figure pct00001
상기 R1은 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이고, R2는 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이며, R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 C1-8 알킬이다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 상기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이거나 이를 포함한다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 R1은 치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 예컨대, 치환된 페닐이다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 R2는 치환된 또는 비치환된 아릴, 및/또는 치환된 또는 비치환된 페닐이다. 일부 구현예에서, R2는 치환 또는 비치환된 아릴, 예컨대, 치환 또는 비치환된 페닐이다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 치환기는 하나 이상의 할로겐; C1-8 알킬; C2-8 알케닐; C2-8 알키닐; 하이드록시; C1-8 알콕시; 아미노; 나이트로; 티올; 티오에테르; 이민; 사이아노; 아마이도; 포스포나토; 포스핀; 카르복시; 티오카르보닐; 설포닐; 설폰아마이드; 케톤; 알데하이드; 에스테르; 카르보닐; 할로알킬; B(OH)2; 카르보사이클릭 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 모노사이클릭 또는 융합된 또는 비-융합된 폴리사이클릭 아릴 또는 헤테로아릴; 아미노; O-저급 알킬; O-아릴, 아릴; 아릴-저급 알킬; CO2CH3; CONH2; OCH2CONH2; NH2; SO2NH2; OCHF2; CF3; 또는 OCF3 기로 치환된다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 63이다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 2-(3-하이드록시페닐)-9-(2-이소프로필페닐)-8-옥소-8,9-디하이드로-7H-퓨린-6-카보사마이드[2-(3-hydroxyphenyl)-9-(2-isopropylphenyl)-8-oxo-8,9-dihydro-7H-purine-6-carboxamide] 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는
Figure pct00002
또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이거나 이를 포함한다.
제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 작용제는 하기 화학식 2로 표시되는 화학식을 포함하며,
[화학식 2]
Figure pct00003
상기 L는 직접 결합, NH 또는 O이고, Y는 N 또는 CR3이고, 상기 R1은 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 C2-8 알케닐, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이고, R2는 H, 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이고, R3는 H, 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, -NHR4　또는 -N(R4)2이며, R4는 각각의 경우 독립적으로 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 상기 화학식 2의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 상기 화학식 2의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이거나 이를 포함한다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 R1은 치환된 아릴, 및/또는 치환된 페닐이다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, R1은 치환된 페닐과 같은 치환된 아릴이다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, Y는 CH이다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, L은 직접 결합이다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 R1은 치환된 아릴이고, R2는 알콕시, 아미노, 하이드록시, 사이클로알킬, 또는 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 C1-8 알킬이다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, R2는 하나 이상의 헤테로사이클로알킬로 치환된 C1-8 알킬이다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 155이다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 6-(4-(2H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)-1-(2-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)에틸)-1H-이미다조[4,5b]피라진-2(3H)-온[6-(4-(2H-1,2,4-Triazol-3-yl)phenyl)-1-(2-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)ethyl)-1H -imidazo [4,5-b]pyrazine-2(3H)-one] 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이거나 이를 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는
Figure pct00004
또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이거나 이를 포함한다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 하기 화학식 3으로 표시되는 화학식을 포함하며,
[화학식 3]
Figure pct00005
상기 R1은 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이고, R2는 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭알킬, 치환된 또는 비치환된 아랄킬, 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬알킬이며, R3는 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬이다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 R1은 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴이다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 R1은 치환된 피리딜이다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화학식 3의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화학식 3의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이거나 이를 포함한다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 R1은 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 할로겐, 아미노카르보닐, 사이아노, 하이드록시알킬, -OR 및 -NR2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 피리딜이고, 상기 각각의 R은 독립적으로 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-4 알킬이다. 특정 구현예에서, R1은 1H-피롤로 [2,3-b]피리딜 또는 벤즈이미다졸릴이고, 선택적으로, 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 및 -NR2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되고, 상기 R은 독립적으로 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-4 알킬이다.
제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, R1은
Figure pct00006
이고, 여기서 R은 각각의 경우 독립적으로 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-4 알킬(예컨대, 메틸)이고; R1은 각각의 경우 독립적으로 치환된 또는 비치환된 C1-4 알킬, 할로겐, 사이아노, -OR, 또는 -NR2이고; m은 0-3이며; n은 0-3이다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, R2는 각각 선택적으로 치환된, H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로피라닐, (C1-4 알킬)-페닐, (C1-4 알킬)-사이클로프로필, (C1-4 알킬)-사이클로부틸, (C1-4 알킬)-사이클로펜틸, (C1-4 알킬)-사이클로헥실, (C1-4 알킬)-피롤리딜, (C1-4 알킬)-피페리딜, (C1-4 알킬)-피페라지닐, (C1-4 알킬)-모르폴린일, (C1-4 알킬)-테트라하이드로퓨라닐, 또는 (C1-4 알킬)-테트라하이드로피라닐이다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 R2는 H, C1-4 알킬, (C1-4 알킬)(OR),
Figure pct00007
이고, 상기 R은 각각의 경우 독립적으로 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬이고, R'은 각각의 경우 독립적으로 H, -OR, 사이아노, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬이며, p는 0-3이다.
제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 246이다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 7-(6-(2-하이드록시프로판-2-일)피리딘-3-일)-1-((1r,4r)-4-메톡시사이클로헥실)-3,4-디하이드로피라지노[2,3-b]피라진-2(1H)-온[7-(6-(2-hydroxypropan-2-yl)pyridin-3-yl)-1-((1r,4r)-4-methoxycyclohexyl)-3,4-dihydropyrazino[2,3-b]pyrazin-2(1H)-one] 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이거나 이를 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는
Figure pct00008
또는 그의 약학적으로 허용가능한 염이거나 이를 포함한다.
제공된 본원은 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에, 재조합 수용체로 조작된 T 세포를 포함하는 농축된 1차 인간 T 세포를 포함하는 조작된 세포 조성물을 배양하는 단계를 포함하고; 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 63, 화합물 155, 또는 화합물 246이며, 상기 방법은 상기 조성물에서 세포의 증식 또는 팽창을 야기하여 조작된 T 세포를 포함하는 출력 조성물을 생산하는 조작된 세포의 조성물의 생산방법이다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 조작된 세포 조성물은 화합물 63의 500 nM 내지 2 μM, 1 nM 내지 100 nM, 50 nM 내지 250 nM, 또는 100 nM 내지 500 nM의 존재 하에 배양된다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 조작된 세포 조성물은 화합물 155의 500 nM 내지 2 μM, 1 nM 내지 100 nM, 50 nM 내지 250 nM, 또는 100 nM 내지 500 nM 의 존재 하에 배양된다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 조작된 세포 조성물은 화합물 246의 500 nM 내지 2 μM, 1 nM 내지 100 nM, 50 nM 내지 250 nM, 또는 100 nM 내지 500 nM의 존재 하에 배양된다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 배양은 상기 배양 전에, (a) 자극 조건 하에, mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 1차 T 세포를 포함하는 입력 조성물을 인큐베이션하고; 상기 자극 조건은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극제의 존재를 포함하여 자극된 조성물을 생성하며; 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 63, 화합물 155, 또는 화합물 246인 단계; 및 (b) 재조합 수용체를 상기 자극된 조성물 내로 도입하여 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물을 생성하는 단계를 추가로 포함한다.
제공된 본원은 (a) 자극 조건 하에, 1차 인간 T 세포를 포함하는 입력 조성물을 인큐베이션하고, 상기 자극 조건은 (i) TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극제 및 (ⅱ) mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재를 포함하고, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 63, 화합물 155 또는 화합물 246인 단계; 및 (b) 재조합 수용체를 상기 자극된 조성물 내로 도입하여 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물을 생성하는 단계를 포함하는 조작된 세포의 조성물의 생산방법이다. 일부 구현예에서, 1 차 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포가 풍부하다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 자극제는 TCR 복합체의 구성원에 특이적으로 결합하는, 선택적으로, CD3에 특이적으로 결합하는 1차 작용제를 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 자극제는 T 세포 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 작용제를 추가로 포함하고, 선택적으로, 상기 공동자극 분자는 CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS로부터 선택된다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 1차 및/또는 2차 작용제는 항체를 포함하고, 선택적으로, 상기 자극제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 또는 그 항원-결합 단편과의 인큐베이션을 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 1차 작용제 및/또는 2차 작용제는 고체 지지체의 표면 상에 존재한다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 고체 지지체는 비드이거나 이를 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 비드는 3.5 ㎛ 또는 약 3.5 ㎛ 초과하나 약 9 ㎛ 이하 또는 약 8 ㎛ 이하 또는 약 7 ㎛ 이하 또는 약 6 μm 이하 또는 약 5 μm 이하의 직경을 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 비드는 4.5㎛ 또는 약 4.5㎛의 직경을 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 비드는 불활성이다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 비드는 폴리스티렌 표면이거나 이를 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 비드는 자성 또는 초상자성이다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 세포에 대한 비드의 비는 4:1 내지 0.25:1 또는 약 4:1 내지 0.25:1이다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 도입은 자극된 조성물의 세포를 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입시키는 것을 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터이다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 도입은 자극된 조성물의 세포를 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질감염시키는 것을 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 벡터는 전이인자(transposon), 선택적으로 슬리핑 뷰티(SB) 전이인자(transposon) 또는 피기백 전이인자(Piggybac transposon)이다.
제공된 방법의 일부 구현예에서, 상기 방법은 상기 배양 후, 상기 출력 조성물의 세포를 수집하는 단계를 추가로 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예는 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 부형제의 존재 하에, 냉동보존 및/또는 개체에 투여하기 위한 출력 조성물의 세포를 제형화하는 단계를 추가로 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 출력 조성물의 세포는 동결방지제의 존재 하에 제형화된다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 동결방지제는 DMSO를 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 출력 조성물의 세포는 용기, 선택적으로 바이알(vial) 또는 백(bag)에서 제형화된다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예는 상기 인큐베이션 전에, 생물학적 샘플로부터 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 분리는 선택적으로, 양성 또는 음성 선택에 의해 CD4 및/또는 CD8의 표면 발현에 기반하여 세포를 선택하는 것을 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 분리는 면역친화성-기반 선택을 수행하는 것을 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 생물학적 샘플은 개체로부터 획득된 1차 T 세포를 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 생물학적 샘플은 전혈 샘플, 버피 코트 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 미분획화된 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 혈액성분채집술(apheresis) 생성물, 또는 백혈구성분채집술(leukapheresis) 생성물이거나 이를 포함한다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 질환, 장애 또는 상태의 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인, 및/또는 상에 발현되는 표적 항원에 결합할 수 있다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 질환, 장애 또는 상태는 감염성 질환 또는 장애, 자가 면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암이다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 표적 항원은 종양 항원이다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 표적 항원은 5T4, 8H9, avb6 인터그린, B7-H6, B 세포 성숙 항원(BCMA), CA9, 암-고환 항원, 탄산탈수효소 9(CAIX), CCL-1, CD19, CD20, CD22, CEA, B형 간염 표면 항원, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 암태아성 항원(CEA), CE7, 사이클린, 사이클린 A2, c-Met, 이중 항원, EGFR, 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40(EPG-40), EPHa2, 에프린 B2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 다이머, EGFR vIII, 에스트로겐 수용체, 태아성 AchR, 폴레이트 수용체 알파, 폴레이트 결합 단백질(FBP), FCRL5, FCRH5, 태아성 아세틸콜린 수용체, G250/CAIX, GD2, GD3, G 단백질 결합된 수용체 5D(GPRC5D), gp100, Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erbB2), HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자(L1-CAM), 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MART-1, 메소텔린, 뮤린 CMV, 뮤신 1 (MUC1), MUC16, NCAM, NKG2D, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 종양태아성 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), PSCA, 프로게스테론 수용체, 서바이빈, ROR1, TAG72, tEGFR, VEGF 수용체, VEGF-R2, 윌름스 종양1(WT-1), 병소-특이 항원 및 유니버셜 태그로 연관된 항원으로부터 선택된다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 그의 항원-결합 단편이거나 이를 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 키메릭 항원 수용체(CAR)이다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 재조합 수용체는 항-CD19 CAR이다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 키메릭 항원 수용체는 항원-결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다.
제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 항원-결합 도메인은 항체 또는 그 항체 단편이거나 이를 포함하고, 이는 선택적으로 단일 사슬 단편이다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 단편은 플렉서블 링커에 의해 연결된 항체 가변 영역을 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 단편은 scFv를 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 키메릭 항원 수용체는 스페이서 및/또는 힌지 영역을 추가로 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 키메릭 항원 수용체는 세포내 신호 영역을 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 세포내 신호 영역은 세포내 신호 도메인을 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 세포내 신호 도메인은 1차 신호 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호 도메인, 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)을 포함하는 신호 도메인이거나 이를 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 CD3 사슬, 선택적으로, CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 신호 도메인 또는 그 신호 부분이거나 이를 포함한다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 키메릭 항원 수용체는 세포외 도메인 및 세포내 신호 영역 사이 배치된 막관통 도메인을 추가로 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 세포내 신호 영역은 공동자극 신호 영역을 추가로 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 공동자극 신호 영역은 T 세포 공동자극 분자의 세포내 신호 도메인 또는 그 신호 전달 부분을 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 공동자극 신호 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포내 신호 도메인 또는 그 신호 부분을 포함한다. 제공된 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 공동자극 신호 영역은 막관통 도메인 및 세포내 신호 영역 사이에 있다.
제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 1차 T 세포는 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 별도 조성물을 포함하고, 상기 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 별도로 배양된다. 제공된 방법 중 임의의 특정 구현예에서, 상기 1 차 T 세포는 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 별도 조성물을 포함하고, 상기 조성물은 농축된 CD4 + T 세포 및 농축된 CD8 + T 세포를 함께 배양하도록 혼합된다.
제공된 본원은 임의의 방법에 의해 생산된 조작된 세포를 포함하는 조성물이다. 특정 구현예에서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 동결 방지제, 선택적으로 DMSO를 포함한다.
제공된 본원은 임의의 조성물 및 상기 출력 조성물을 개체에게 투여하기 위한 지시를 포함하는 제조 물품이다. 특정 구현예에서, 상기 개체는 질환 또는 상태를 가지고, 선택적으로, 상기 재조합 수용체는 질환 또는 상태와 관련되거나, 이의 세포 상에 발현되거나 제시되는 항원을 특이적으로 인식하거나 특이적으로 결합한다. 특정 구현예에서, 상기 출력 조성물은 조작된 CD4 + T 세포의 조성물이다. 일부 구현예에서, 출력 조성물은 CD8+ T 세포의 조작된 조성물이다. 특정 구현예에서, 출력 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 조작된 조성물이다.
제공된 본원은 본원에 제공된 방법에 의해 제조된 조작된 CD4+ T 세포의 조성물, 본원에 제공된 방법에 의해 생산된 조작된 CD8+ T 세포의 조성물, 및 조작된 CD4+ T 세포 및 조작된 CD8+ T 세포를 개체에 투여하기 위한 지시를 포함하는 제조 물품이다. 특정 구현예에서, 상기 지시는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 개체에게 별도로 투여하는 것을 특정한다. 특정 구현예에서, 상기 지시는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 개체에게 원하는 비로 투여하는 것을 특정한다. 또한, 제공된 본원은 본원에 제공된 방법에 의해 생성된 조작된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 조성물, 및 조작된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 개체에게 투여하기위한 지시를 포함하는 제조 물품이다.
제공된 본원은 입력 조성물 중 세포에서 CAR-의존적 활성을 자극하는 조건 하에서, 입력 조성물을 10일 이상 동안 인큐베이션하고, 항원에 특이적으로 결합하거나 인식하는 세포외 항원-결합 도메인을 포함하는 키메릭 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 T 세포를 포함하는 입력조성물의 세포에서 CAR-의존적인 활성을 자극하는 조건 하에 출력 조성물을 생성하는 단계; 및 상기 출력 조성물의 하나 이상의 세포의 하나 이상의 표현형 또는 활성을 평가하는 단계를 포함하는, 세포 조성물을 평가하기 위한 장기 자극 방법이다.
장기 자극 방법 중 임의의 일부 구현예에서, CAR- 의존적 활성을 자극하는 조건은 CAR의 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 결합 분자의 존재를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 결합 분자는 지지체에 부착된다. 일부 구현예에서, 지지체는 고체 지지체이다. 일부 구현예에서, 고체 지지체는 마이크로 플레이트(microplate) 또는 비드의 웰(well)의 표면이다. 일부 구현예에서, 상기 고체 지지체는 결합 분자가 마이크로 플레이트에 부착된 마이크로 플레이트이고, 상기 인큐베이션은 마이크로 플레이트에서 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 고체 지지체는 결합 분자가 부착된 비드이고, 상기 인큐베이션은 복수의 비드 존재 하에 수행된다.
장기 자극 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 결합 분자는 항원 결합 도메인에 의해 인식되는 재조합 항원 또는 이의 일부이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 항원 또는 이의 일부는 BCMA이거나, 또는 항원-결합 도메인에 의해 인식되는 그의 일부이다. 일부 구현예에서, 상기 결합 분자는 항원-결합 도메인에 특이적으로 결합하는 항-이디토파이틱(anti-iditopytic) 항체 또는 이의 항원-결합 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항원 수용체의 항원-결합 도메인은 항체 SJ25C1 또는 이의 항원-결합 단편이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항원 수용체의 항원-결합 도메인은 항체 FMC63 또는 이의 항원-결합 단편이거나 이를 포함한다.
장기 자극 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 방법은 in vitro 또는 ex vivo에서 수행된다.
장기 자극 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 입력 조성물은 재조합 사이토 카인을 포함하지 않는 배지의 존재 하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 연속적으로 수행되거나 일정 시간 동안 중단되지 않는다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 동안, 세포는 재생되지 않고, 배지는 바뀌지 않으며 결합 분자는 첨가되지 않는다.
장기 자극 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 방법은 하나 이상의 출력 조성물의 세포의 활성화, 고갈 또는 분화 상태의 표현형을 평가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표현형은 고갈이며, 상기 평가는 CTLA-4, FOXP3, PD-1, TIGIT, LAB-3, 2B4, BTLA, TIM3, VISTA 또는 CD96로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현, 선택적으로, 표면 발현을 측정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표현형은 활성화이고, 상기 평가는 CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD71, CD154, CD40L, CD127, LAG3 또는 Ki67로부터 선택된 하나 이상의 마커의 발현, 선택적으로, 표면 발현을 측정하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 표현형은 분화 상태이며, 상기 평가는 (i) 하나 이상의 CD25, CD45RO, CD56, KLRG1, CD95 및 / 또는 (ii) 하나 이상의 CD45RA, CD27, CD28, CD62L 및 CCR7로부터 선택된 하나 이상의 마커를 측정하는 것을 포함하고, 선택적으로, 상기 하나 이상의 마커는 마커와 나이브-유사 T 세포와 양 또는 역으로 연관된다.
장기 자극 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 방법은 출력 조성물의 하나 이상의 세포의 하나 이상의 활성을 평가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 활성은 CAR-의존적 활성, 선택적으로, 항원-자극된 활성을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 하나 이상의 활성은 세포용해 활성 또는 사이토카인 생산을 포함한다.
장기 자극 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 기간은 적어도 11일, 12일, 13일, 14일 또는 15일 또는 적어도 약 11일, 12일, 13일, 14일 또는 15일이다. 일부 구현예에서, 기간은 11일, 12일, 13일, 14일 또는 15일 또는 약 11일, 12일, 13일, 14일 또는 15일이다.
장기 자극 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 입력 조성물은 인큐베이션 전에 시험제 또는 화합물과 노출되거나 접촉된 세포를 포함하며, 선택적으로, 상기 노출 또는 접촉은 CAR을 발현하는 T 세포를 포함하는 입력 조성물의 제조 방법의 하나 이상의 단계가 수행되는 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 방법은 복수의 입력 조성물에 대해 수행되며, 복수의 상기 입력 조성물 각각은 상이한 공정에 의해 제조된다.
장기 자극 방법 중 임의의 일부 구현예에서, 상기 방법은 출력 조성물의 표현형 또는 활성을 대조군 조성물의 표현형 또는 활성과 비교하는 단계를 추가로 포함하고, 선택적으로, 상기 대조군 조성물은 CAR-의존적 활성을 자극하기 위해 동일한 조건 하에서 10일 이상 동안 인큐베이션 T 세포 조성물로서, 상기 T 세포의 조성물은 시험제 또는 화합물의 존재 하에 생성되지 않거나 또는 입력 조성물과 비교되는 대체 공정에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 대조군 조성물과 비교하여 감소된 고갈, 감소된 활성화 또는 감소된 분화를 나타내는 출력 조성물을 확인하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 감소된 분화는 하나 이상의 나이브-유사 T 세포 마커의 증가된 발현을 포함한다.
도 1A-1D는 다양한 농도의 PI-103(도 1A), 화합물 155(도 1B), 화합물 246(도 1C), 화합물 246(도 1D)의 존재 하에서 항-CD3 및 항-CD28 항체 접합된 자기 비드와 함께 인큐베이션된 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 검출된 인산화된 S6의 수준을 나타내는 그래프이다.
도 2는 배지 단독 대조군 또는 DMSO, PI-103 또는 다양한 농도의 화합물 155, 화합물 63 또는 화합물 246 존재 하에 인큐베이션 후 존재하는 조작된 CD8+(상부 패널) 및 CD4+(하부 패널) T 세포에 대한 초기 세포 수의 백분율을 나타내는 그래프를 보여준다. 화살표는 유사한 수준의 CD8 및 CD4 T 세포 확장을 초래한 화합물 155, 화합물 63 및 화합물 246의 최고 허용 용량을 나타낸다. 점선 수평선은 배지 및 DMSO 컨트롤 평균값의 70%를 나타낸다.
도 3A-3C는 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물 중 CD8+ T 세포에서의 세포 당 분해 대사의 그래프를 보여준다. 도 3A는 배지 단독, DMSO, PI-103 또는 화합물 63의 존재 하에서 팽창에 의해 생성된 항 -CD19 CAR-T 세포 중 CD8 + CAR-T 세포의 실시간 세포외 산성화 속도 (ECAR)를 나타내는 그래프를 제공한다. 도 3b는 배지 단독 대조군에 대한 ECAR 속도(mpH/min)에 대해 계산된 곡선 아래 면적(AUC)을 표시한다. 도 3C는 배지만 대조군에 비해 최대 ECAR 당분해 버스트(burst) 비율을 보여준다.
도 4A-4B는 배지 단독, DMSO, PI-103 또는 화합물 63의 존재 하에서 팽창에 의해 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물에 대해 수행된 분석 결과를 나타내는 그래프를 제공한다. 도 4A는 CD19(조사된 K562-CD19 표적 세포) 및 항원에 노출되지 않은 세포(증기 없음)를 발현하도록 형질도입된 조사된 K-562 세포와의 공동 배양 후 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물의 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서의 포스포-S6 염색의 평균 형광 강도를 나타낸다. 상단 패널에는 별도의 세포 구성으로 측정된 개별 데이터 포인트가 표시된다. 하단 패널에는 평균값 +/- 표준 편차가 표시된다. 도 4B는 3:1 또는 1:1 이펙터 세포 대 표적 세포의 비로 K562-CD19 표적 세포와 공동 배양되고 생성된 CAR-T 세포 조성물의 세포 용해 활성을 나타내는 그래프를 제공한다. 생성된 CAR-T 세포 조성물 및 CD19 발현 K562 세포로부터의 측정이 대조군으로서 제공된다.
도 5는 조사된 K562-CD19 표적 세포와 공동 배양된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물의 TNF- 알파(왼쪽 패널), IFN-감마(중간 패널) 및 IL-2(오른쪽 패널) 분비를 나타내는 그래프를 제공한다. 배지에서만 팽창된 세포와 비교하여 PI-103, 화합물 63 또는 DMSO 비히클의 존재 하에서 팽창된 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 공동 배양 상청액에서 관찰된 사이토카인 생산의 배수 변화(fold-change)가 표시된다.
도 6A 및 6B는 조사된 K562-CD19 표적 세포와 공동 배양된 후 추가로 PMA/이오노마이신 (왼쪽 패널) 또는 골지 억제제(오른쪽 패널)를 인큐베이션하여 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 CD8+(도 6A) 및 CD4+(도 6B) T 세포의 다작용성 사이토카인 프로파일을 나타내는 그래프를 제공한다. PI-103, 화합물 63 또는 DMSO 비히클 존재 하에서 팽창되고 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물에서 CD107a, IFN- 감마(IFNg), IL-2, IL-17a 및 TNF- 알파 (TNFa)의 상이한 조합에 대해 양성 착색된 세포의 증가된 빈도는 배지에서만 팽창된 세포와 비교하여 표시된다.
도 7A-7D는 반복된 자극 후 배지 단독, DMSO, PI-103 또는 화합물 63의 존재 하에서 팽창된, 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 T 세포의 활성을 나타내는 그래프를 보여준다. 도 7A는 조사된 K562-CD19 표적 세포와 공동 배양된, 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 T 세포의 집단이 배가되었음 나타낸다. 4 회 재자극 후, 11 일째에 T 세포를 표적 세포 없이 재배양하였다. 도 7B는 배지 단독 대조군에 대한 모집단 배가에 대해 계산된 곡선 아래 면적(AUC)을 표시한다. 도 7C는 조사된 K562-CD19 표적 세포와 4 회의 반복된 자극 후, 조사된 K562-CD19 표적 세포와 16시간의 공동 배양과 함께 자극 후 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 T 세포에 의한 TNF- 알파(TNF), IFN- 감마(IFNg) 및 IL-2의 생성을 나타내는 그래프를 도시한다. 배지 단독 조건과 비교하여 세포외 TNF- 알파(TNF), IFN- 감마(IFNg) 및 IL-2의 배수 변화가 도시되어있다. 도 7D는 조사된 K562-CD19 표적 세포로 4 회의 재자극을 수행한, 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 CD8+ T 세포의 다작용성 사이토카인 프로파일을 나타내는 그래프를 도시한다.
도 8A-8D는 항-CD19 CAR에 특이적인 항-이디오타입 항체와 컨쥬게이트된 비드 표면으로 자극 후 배지 단독, DMSO, PI-103 또는 화합물 63의 존재 하에서 확장된, 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 T 세포의 활성을 나타내는 그래프를 보여준다. 도 8A는 항-이디오타입 항체와 컨쥬게이트된 비드 표면과 공동 배양된, 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 T 세포의 웰 당 총 살아있는 T 세포 수를 나타낸다. 도 8B는 배지 단독 대조군에 대한 상기 살아있는 T 세포 수에 대해 계산된 곡선 아래 면적 (AUC)을 표시한다. 도 8C는 항-이디오타입 항체에 컨쥬게이트된 비드 표면으로 15 일 인큐베이션한, 조사된 K562-CD19 표적 세포와 16 시간 공동 배양으로 자극 후 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 T 세포에 의한 TNF- 알파 (TNF), IFN- 감마 (IFNg) 및 IL-2의 생성을 나타내는 그래프를 도시한다. 배지 단독 조건과 비교하여 세포외 TNF-알파(TNF), IFN-감마(IFNg) 및 IL-2의 배수 변화가 도시되어있다. 도 8D는 항-이디오타입 항체와 컨쥬게이트된 비드와 15일 인큐베이션 후, 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 CD8 + T 세포의 다작용성 사이토카인 프로파일을 나타내는 그래프를 나타낸다.
도 9A 내지 9C는 배지 단독, DMSO, PI-103 또는 화합물 63의 존재 하에서 팽창된, 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 RNA-Seq 분석 결과를 나타내는 그래프를 도시한다. 도 9A는 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 CD4+ (왼쪽 패널), CD8+ (중간 패널), 및 조합된 CD4+ 및 CD8+ (오른쪽 패널) T 세포에 의해 차등적으로 발현된 유전자 발현을 묘사하는 화산 도표(volcano plot)를 도시한다. DMSO로 팽창된 T 세포와 비교하여 배지 단독(상단), PI-103(중간), 및 화합물 63 (하단)에서 팽창된 T 세포에 대한 차등 유전자 발현이 도시되어 있다. 도 9B는 DMSO의 존재 하에서 팽창된, 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터의 T 세포에서의 발현에 대한, PI-103 (X- 축) 및 화합물 63 (Y-축)의 존재 하에서 팽창된, 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 T 세포에서 측정된 차등적으로 발현된 유전자의 log2 배수 변화(Log2FC)를 나타내는 그래프를 도시한다. 도 9C는 예시적으로 확인된 유전자 온톨로지(GO) 카테고리 및 그들의 대응하는 Z- 점수를 도시한 표 및 그래프를 나타낸다.
도 10A 및 10B는 항-CD19 CAR-T 세포로 처리한 후 종양 보유 마우스에서 종양 부담 및 생존을 나타내는 그래프를 보여준다. 도 10A는 항-CD19 CAR-T 세포로 처리한 후 종양 보유 마우스에서 80 일까지의 종양 부담 및 생존을 나타내는 그래프를 보여준다. 도 10B는 항-CD19 CAR-T 세포로 처리한 후 종양 보유 마우스에서 100 일까지 생존을 나타내는 그래프를 보여준다. Nod scid gamma (NSG) 면역결핍 마우스에 파이어플라이 루시퍼라제를 발현하는 Raji 세포를 이식하고, DMSO 또는 PI-103의 존재 하에 팽창된 항-CD19 CAR-T 세포를 높은 (왼쪽 패널) 또는 낮은 (오른쪽 패널) 용량으로 처리하거나 처리하지 않았다. 생물 발광 (상부 패널)에 의해 측정된 개별 마우스의 종양 부담 및 처리 그룹(하부 패널)의 생존 곡선은 도 10A 및 10B에 표시된 시간과 같이 도시된다.
도 11A 및 11B는 항-CD19 CAR-T 세포로 처리한 후 종양 보유 마우스에서 종양 부담 및 생존을 나타내는 그래프를 보여준다. 도 11A는 항-CD19 CAR-T 세포로 처리한 후 종양 보유 마우스에서 80일까지의 종양 부담 및 생존을 나타내는 그래프를 보여준다. 도 10B는 항-CD19 CAR-T 세포로 처리한 후 종양 보유 마우스에서 100 일까지 생존을 나타내는 그래프를 보여준다. NSG 면역결핍 마우스에 파이어플라이 루시퍼라제를 발현하는 Raji 세포를 이식하고, DMSO 또는 화합물 63의 존재 하에서 팽창된 항-CD19 CAR-T 세포를 높은 (왼쪽 패널) 또는 낮은 (오른쪽 패널) 용량으로 처리하거나 처리하지 않았다. 생물 발광(상부 패널)에 의해 측정된 개별 마우스의 종양 부담 및 처리 그룹(하부 패널)의 생존 곡선은 도 11A 및 11B에 표시된 시간과 같이 도시된다.
도 12A 및 12B는 항-CD19 CAR + T 세포를 함유하는 T 세포 조성물의 활성을 나타내는 그래프를 제시한다. 활성을 평가하기 전에, 세포를 14일 동안 항-CD19 항체 항-ID 컨쥬게이트된 비드와 함께 인큐베이션하거나(14 일; 이차) 인큐베이션하지 않았다. CD19 발현 세포(도 12B)에 노출 후 세포 독성 분석(도 12A) 및 내부 사이토카인 염색(ICS) 분석의 결과가 도시되어있다.
도 13A-13C는 14일 동안 항-CD19 항체 항-ID 컨쥬게이트된 비드와 인큐베이션 동안 또는 그 후에 항-CD19 CAR+ T 세포를 포함하는 T 세포 조성물의 특성을 나타내는 그래프를 나타낸다. PI-103, 화합물 63, 또는 비히클의 존재 하에 생성된 T 세포 조성물의 결과가 도시되어있다. 도 13A 및 13B는 인큐베이션되지 않은(1 차) 또는 14일 동안 인큐베이션된(2 차) T 세포 조성물의 CD19 세포 노출에 대한 반응을 나타낸다. CD19 발현 세포에 노출된 후 ICS에 의한 다작용성 염색(도 13A) 및 세포 용해 활성(도 13B)의 결과가 도시되어있다. 도 13C는 20시간 동안 CD19 발현 세포와 1:1의 비로 인큐베이션된 항-CD19 CAR 발현 세포를 포함하는 세포 조성물의 상청액으로부터 분비된 사이토카인의 수준을 도시한다. IL2, TNF 및 IFN-감마의 양을 측정하고 3가지 사이토카인 모두에 대한 규모 점수의 평균을 나타낸다.
도 14는 DMSO 또는 화합물 63의 존재 하에 제조된, 해동된 CAR-T 세포에서의 전-세포사멸(pro-apoptotic) 세포내 카스파아제 3의 발현을 도시한다. FACS 플롯은 3 개의 상이한 공여체로부터 제조된, 생존 가능한 CD3+ CAR+ T 세포를 나타낸다.
도 15는 DMSO, PI103 또는 화합물 63의 존재 하에 제조된 CAR-T 세포의 시간에 따른 생존 세포 수를 나타내는 그래프를 나타낸다. 기호는 3개의 개별 공여자로부터의 배양 웰의 평균 및 SEM을 나타낸다.
도 16은 DMSO, PI103 또는 화합물 63의 존재 하에 제조된, 해동된 CAR-T 세포에 의한 표적 세포 사멸을 나타내는 그래프를 제시한다. 도 15에 기재된 해동 후(0 일) 또는 CAR 자극 배양 말기(14 일)에 사멸 분석을 직접 설정하였다. 기호는 3개의 개별 공여자로부터의 배양 웰의 평균 및 SEM을 나타낸다.
도 17A-17B에 나타난 그래프는 PI103 또는 화합물 63의 존재 하에 제조된 CAR-T 세포가 개선되고 지속된 이펙터 사이토카인 프로파일을 보였음을 나타낸다. 도 15(“2 차”, 하단 패널)에 도시된 바와 같이 CAR-T 세포를 해동 직후("1 차", 상부 패널) 또는 CAR 자극 배양의 말기에 항원 함유 표적 세포와 1:1(CAR-T:표적)로 혼합 하였다. T 세포 다작용성은 골지 억제제의 존재 하에 5 시간 동안 표적과 함께 인큐베이션된 CAR-T 세포로부터의 FACS에 의한 사이토카인 IL2, TNF 및 IFNg의 세포내 발현에 의해 평가되었다(도 17A). 20시간 동안 표적과 함께 인큐베이션된 CAR-T 세포로부터 배양 상청액으로의 사이토카인 분비가 또한 측정되었다(도 17B). 각 공여자 코호트 내에서의 피처 스케일링(feature scaling)에 의해 분석 값을 정규화하고 순위를 매겼다.
도 18은 도 15에 도시된 바와 같이 PI103 또는 화합물 63의 존재 하에서 생성된, 농축된 CD8+ 및 CD4+ CAR-T 세포에 대해 수행된 RNAseq의 차등 발현(DESeq2) 분석 결과를 나타낸다. PI103 대 DMSO 또는 화합물 63 대 DMSO에 대해 조정된 p-값(p-adj)<0.1 인 유전자의 차등 발현을 선택하고 log2 배수 변화 유전자 발현 값을 나타낸다. PI103-처리된 세포에서 유의하게 차등적으로 발현된 유전자는 사각형으로 표시된다. 화합물 63-처리된 세포에서 유의하게 차등적으로 발현된 유전자는 원으로 표시된다. T 세포 조성물 둘 다에서 발현된 유전자는 다이아몬드로 표시된다. 차등 발현 값은 그룹당 3 개 개별 공여자의 평균이다.
도 19A-19B는 항-CD19 CAR-T 세포로 처리한 후 종양 보유 마우스에서 종양 부담 및 생존을 나타내는 그래프를 보여준다. 도 19A는 고용량(1 x 106 CAR-T 세포/마우스) 또는 저용량 (2.5 x 105 CAR-T 세포/마우스)의 항-CD19 CAR-T 세포로 처리한 후 마우스에서 종양 부담을 나타내는 그래프를 보여준다. 도 19B는 고용량 또는 저용량의 항-CD19 CAR-T 세포로 처리한 후 종양 보유 마우스의 생존을 나타내는 그래프를 보여준다.
도 20A-20B는 항-CD19 CAR-T 세포로 처리한 후 종양 보유 마우스에서 종양 부담 및 생존을 나타내는 그래프를 보여준다. 도 20A는 고용량(1 x 106 CAR-T 세포/마우스) 또는 저용량(2.5 x 105 CAR-T 세포/마우스)의 항-CD19 CAR-T 세포로 처리한 후 마우스에서 종양 부담을 나타내는 그래프를 보여준다. 도 20B는 고용량 또는 저용량의 항-CD19 CAR-T 세포로 처리한 후 종양 보유 마우스의 생존을 나타내는 그래프를 보여준다.
도 21A-21B는 수령체 마우스의 혈액에서 시간에 따른 항-CD19 CAR-T 세포의 지속성을 나타내는 그래프를 보여준다. 도 21A는 DMSO(D), 화합물 63 (C) 또는 PI103 (P)의 존재하에 제조된 CAR-T 세포의 고용량(1 x 106 CAR-T 세포/마우스)을 투여받은 마우스에서 주사 후 18 일, 25 일 및 36 일째에 CD4+ 및 CD8+ T 세포 수를 나타낸다. 도 21B는 DMSO(D), 화합물 63(C) 또는 PI103(P)의 존재 하에 제조된 CAR-T 세포의 저용량(2.5 x 105 CAR-T 세포/마우스)을 투여받은 마우스에서 주사 후 18 일, 25 일 및 36 일째에 CD4+ 및 CD8+ T 세포 수를 나타낸다.
제공된 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 수행되는, 세포의 인큐베이션, 자극 및/또는 배양과 같은 공정의 하나 이상의 단계가 있는, 재조합 수용체를 발현하는 조작된 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포와 같은 조작된 세포의 조성물을 제조하는 방법이다. 특정 구현예에서, 조작된 세포 조성물은 재조합 수용체로 조작된 T 세포를 포함하는 농축된 CD4+ 또는 농축된 CD8+ 1 차 T 세포의 세포 조성물이다. 특정 구현예에서, T 세포는 인간 T 세포이다. 일부 측면에서, 세포의 팽창 및/또는 증식을 위해 세포를 배양하는 것은 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 조성물 내의 세포는 배양되기 전에 작용제와 접촉, 인큐베이션 및/또는 노출되지 않는다. 특정 구현예에서, 배양은 조작된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는 출력 조성물을 생성하기 위해 조성물 중 세포의 증식 또는 팽창을 초래한다.
세포 치료에 사용하기 위한 CAR-T 세포와 같은 유전자 조작된 T 세포의 제조는 세포의 격리, 세포의 활성화, 재조합 수용체에 의한 세포의 형질도입 또는 조작 및 임상 투여를 위한 T 세포의 팽창을 포함한다. 이 과정은 일부 경우에 말기 소진 상태로 구동되고/되거나 세포가 지속성이 없고/거나 최적의 효능을 나타내지 않는 세포를 포함 할 수 있는 조작된 T 세포 약물 제품의 일부를 초래할 수 있다. 경우에 따라, 다분화능 및 T 세포 복제 잠재력이 감소된다. 일부 측면에서, 소진된 세포를 함유하는 조작된 T 세포 약물 제품은 경우에 따라 T 세포 약물 제품의 잠재적 효능을 한정할 수 있다. 개체에게 투여될 때 소진되거나 지속력이 부족하고/거나 효능이 감소된 세포의 백분율 또는 수를 최소화하거나 감소시키는 조작된 세포 치료의 제조를 위한 대안적인 방법이 필요하다.
본원에 제공된 방법은 조작된 세포의 지속성, 고갈 부족 및/또는 효능, 예컨대, CAR-T 세포는 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 세포를 제조 또는 생산함으로써 개선된다는 관측에 기초한다. 일부 측면에서, 상기 작용제는 포유 동물, 예컨대, 인간, mTOR과 같은 포유 동물 대상인 라파마이신의 억제제다. 일부 구현예에서, 작용제는 mTOR에 특이적이고, 포스포이노시타이드 3-키나아제(PI3-키나아제) 패밀리의 키나아제와 같은 다른 관련 키나아제에 대한 표적 활성을 억제하거나 억제하지 않는다. mTOR는 포스포이노시타이드 3-키나아제(PI3-키나아제) 패밀리와 상당히 서열상 동족 관계를 갖는 진화적으로 보존된 키나아제이다. PI3K와 달리, mTOR는 지질 키나아제가 아니라 세린-트레오닌 단백질 키나아제이다. 포유 동물 세포에서, mTOR는 단백질 생성물이 2개의 별개의 복합체(mTORC1 및 mTORC2)를 통해 신호를 보내는 단일 유전자로 암호화된다. 일반적으로, mTOR는 세포 성장 및 증식을 포함한 다양한 세포 과정을 조절하는 것으로 생각된다. T 세포에서, mTOR는 사이토카인 수용체 및 T 세포 수용체의 활성화를 포함하는 다양한 자극에 의해 활성화될 수 있다.
일부 측면에서, 제공된 방법은 조작된 T 세포가 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 인큐베이션, 배양(cultivated 및/또는 cultured)되어, 일부 측면에서, 예컨대, 항 종양 활성과 같은, 세포의 팽창, 지속성 및/또는 효능을 개선하거나 농축할 수 있는 공정과 관련하여 사용된다. 일부 측면에서, mTORC1 및 mTORC2 키나아제 활성을 억제하는 작용제가 사용된다. 특정 구현예에서, 상기 작용제는 선택적 mTOR 억제제로서, 예컨대, PI3K와 같은 추가 키나아제를 억제하지 않는다. 일부 측면에서, 작용제는 화합물 63, 화합물 155 또는 화합물 246이다.
일부 측면에서, 제공된 방법은, 예컨대, 세포 치료에 사용하기 위해 재조합 수용체 ("조작된 세포")를 발현하도록 조작된 1 차 T 세포를 포함하는 세포의 조성물을 생성하며, 이는 더 적은 소진된 세포 및/또는, 예컨대, mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 수행되지 않는 대안적 방법에 의해 생성된 조작된 세포 조성물과 비교하여 소진과 관련된 마커 또는 표현형을 표시하는 더 적은 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 제공된 방법에 의해 제조된, 조작된 세포는, mTOR 활성을 억제하는 작용제, 예컨대, mTORC1 또는 mTORC2 키나아제 활성과 같은 키나아제 활성의 존재 하에 수행되지 않는 대안적인 방법에 의해 제조된, 조작된 세포 조성물로부터의 세포에 비해 증가된 백분율의 기억-유사 T 세포, 예컨대, 수명이 긴 기억 T 세포를 포함한다. 특정 측면에서, 제공된 방법에 의해 생산된 조작된 세포는, 대안적인 방법에 의해 생산된 조작된 세포보다 덜 분화된다. 일부 측면에서, 제공된 방법은, 예컨대, mTOR 활성을 억제하는 작용제 존재 하에 수행되지 않은 대안적 방법에 의해 생성된 조작된 세포와 비교하여 개선된 또는 농축된 팽창, 지속성 및/또는 항 종양 활성을 갖는 조작된 세포를 생성한다. 따라서, 일부 측면에서, 제공된 방법은, 대안적 방법, 예컨대, mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 수행되지 않는 대안적 방법에 의해 생성된 조작된 세포 조성물과 비교하여 개선된 치료 효능을 갖는 조작된 세포 조성물을 생성할 수 있다. 특정 구현예에서, 제공된 방법은, 대안적인 방법에 의해 생성된 조작된 세포 조성물과 비교하여 개선된 임상 반응 내구성을 갖는 조작된 세포의 조성물을 생성할 수 있다. 이러한 임의의 구현예에서, 대안적 공정과의 비교하면, 대안적 공정이 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 수행되지 않는다는 점에서만 상이한, 동일한 공정이다.
본 출원에서 언급된 특허 문서, 과학 논문 및 데이터베이스를 포함한 모든 출판물은 각각의 개별 출판물이 별도로 참조에 의해 통합된 것과 동일한 정도로 모든 목적을 위해 전체적으로 참고로 포함된다. 본원에 기재된 정의가 본원에 참조로 포함된 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 공개에 기재된 정의와 상반되거나 다른 정의와 일치하지 않는 경우, 본원에 기재된 정의는 본원에 참조로 포함된 정의보다 우선한다.
본원에 사용된 섹션의 제목은 단지 조직적 목적을 위한 것이며 기술된 주제를 한정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
Ⅰ. 선택적 세포 치료를 위한 세포 분리, 배양 및 공학 처리 과정
제공된 본원은 재조합 단백질, 예컨대, T 세포 수용체 (TCR) 또는 키메릭 항원 수용체 (CAR)와 같은 재조합 수용체를 발현하는 조작된 1차 CD4+ T 세포 및/또는 조작된 CD8+ T 세포와 같은 조작된 세포의 출력 조성물을 생성하는 방법이다. 일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 조작된 세포의 출력 조성물을 생성하기 위해 본원에 기재된 임의의 구현예와 같이 mTOR 활성을 억제하는 작용제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에 세포를 인큐베이션, 배양(cultivating 및/또는 culturing)하는 것을 포함하는 공정과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 조작된 세포의 출력 조성물을 생성하기 위하여 본원에 기재된 일부 구현예와 같이 mTOR 활성을 억제하는 작용제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서, 팽창 및/또는 증식을 촉진하는 조건 하에 조작된 세포의 조성물을 배양하는 것을 포함하는 공정과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 하나 이상의 추가 키나아제의 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, 작용제는 mTOR 활성을 선택적으로 및/또는 구체적으로 억제한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 섹션 Ⅱ에서와 같이 본원에 기재된 바와 같은 작용제이다. 일부 구현예에서, 작용제는 mTOR 키나아제 활성을 억제한다. 특정 구현예에서, 상기 작용제는 mTORC1 및/또는 mTORC2를 억제한다. 특정 구현예에서, 상기 작용제는 화합물 63, 화합물 155 또는 화합물 246이다. 특정 구현예에서, 상기 작용제는 화합물 63이다.
일부 구현예에서, 조작된 세포, 예컨대, 조작된 CD4+ T 세포 및/또는 조작된 CD8+ T 세포를 생성 또는 생성하는 방법은, 개체로부터 세포의 분리, 제조, 가공, 자극 조건 하에서의 인큐베이션, 및/또는 세포 조작(예컨대, 형질도입)하는 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 순서대로 수행되는 단계들, 1 차 세포와 같은 입력 세포들은 먼저 생물학적 샘플로부터 선택되거나 분리된 것과 같이 분리되고; 입력 세포는 자극 조건 하에서 인큐베이션되고, 벡터 입자, 예컨대, 바이러스 벡터 입자로 조작되어 재조합 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로, 예컨대, 형질도입 또는 형질감염에 의해 도입하고; 조작된 세포, 예컨대, 형질도입된 세포를 배양하여 세포를 확장하는 단계; 및 출력 조성물로 세포를 제형화하기 위해 세포의 전부 또는 일부로 용기를 수집, 수확 및/또는 충전하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 생성된 출력 조성물의 세포는 동결보존 전 또는 후에 동일한 대상으로 재도입된다. 일부 구현예에서, 조작된 세포의 출력 조성물은 요법, 예컨대, 자가 세포 치료에 사용하기에 적합하다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 단계 또는 단계는 본원에 기재된 일부 구현예와 같이 mTOR 활성을 억제하는 작용제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 세포 조성물 세포의 분리, 농축, 인큐베이션, 조작, 형질도입, 형질감염, 배양(cultivating, culturing), 수집, 제형화, 저장 및/또는 동결의 하나 이상의 단계는 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 수행된다. 특정 구현예에서, 세포는 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 배양된다.
일부 구현예에서, 조작된 세포는, 본원에 기재된 임의 구현예와 같이 mTOR 활성을 억제하는 작용제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에 배양되며, 특정 구현예에서, 세포는 배양 전에 mTOR 활성을 억제하는 작용제와 접촉, 인큐베이션 및/또는 노출되지 않는다. 일부 구현예에서, 입력 세포, 자극된 세포 및/또는 조작된 세포는 세포의 증식 또는 증식을 유도하거나 자극하기 위한 배양 전에 mTOR를 억제하는 작용제와 접촉, 노출 및/또는 인큐베이션되지 않는다. 특정 구현예에서, 분리, 농축, 하나 이상의 활성화 조건 하에서의 인큐베이션, 조작, 형질 전환, 형질감염, 제형화, 저장 및/또는 동결 단계는 mTOR 억제제의 존재 하에 수행되지 않는다.
특정 구현예에서, 제공된 방법은 세포의 초기 및/또는 입력 조성물로부터 재조합 수용체를 발현하는 세포의 출력 조성물을 생성하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 세포의 조성물은 농축된 T 세포, 농축된 CD4+ T 세포 및/또는 농축된 CD8+ T 세포의 조성물이다(이하, 각각은 농축된 T 세포의 조성물, 농축된 CD4+ T 세포의 조성물, 및 농축된 CD8+ T 세포의 조성물이라 한다). 특정 구현예에서, 농축된 T 세포, 농축된 CD4+ T 세포 또는 농축된 CD8 + T 세포의 조성물은 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에서 배양된다. 일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포의 조성물은 mTOR 활성을 억제하는 작용제, 본원에 기재된 임의 구현예와 같이 예컨대, 화합물 63의 존재 하에 배양된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 배양된다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 자극 조건 하에서 1차 T세포를 포함하는 입력 조성물을 인큐베이션하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 조건은 자극 시약의 존재에서 입력 조성물을 인큐베이션하는 것이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 자극 시약은 표면 컨쥬게이트된 항-CD3 및 항-CD28 항체를 갖는 비드, 예컨대, 상자성 비드이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 입력 조성물의 세포는 인큐베이션 전 또는 인큐베이션 동안 mTOR 활성을 억제하는 작용제에 노출되지 않는다. 일부 측면에서, 인큐베이션은 농축된 T세포, 예컨대, CD4+ 및 CD8+ 세포의 입력 조성물로 수행된다. 일부 구현예에서, 입력 조성물은 농축된 CD4+ T 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 입력 조성물은 농축된 CD8+ 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 예컨대, 동일한 생물학적 샘플로부터의 농축된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 별도 조성물은 별도로 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션의 자극 조건은 두 조성물 모두에 대해 동일할 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 자극 조건은 상이할 수 있다. 특정 구현예에서, 자극 조건 하에서 하나 이상의 입력 조성물의 인큐베이션은 하나 이상의 자극된 조성물을 생성한다.
특정 구현예에서, 재조합 수용체는 자극된 조성물의 세포내로 도입된다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체는 자극된 조성물을 바이러스 벡터로 형질도입함으로써 세포내로 도입된다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터이다. 특정 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 또는 감마레트로바이러스(gammaretroviral) 벡터이다. 일부 구현예에서, 자극된 조성물은 농축된 T 세포, 예컨대, CD4+ 및 CD8+ 세포를 포함하거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 자극된 조성물은 농축된 CD4+ T 세포이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극된 조성물은 농축된 CD8+ 세포이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 예컨대, 동일한 생물학적 샘플로부터의 농축된 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 별도 조성물은 별도로 조작된다. 특정 구현예에서, 재조합 수용체는 키메릭 항원 수용체(CAR)이다. 특정 구현예에서, CAR은 항-CD19 CAR이다.
일부 구현예에서, 조작된 세포, 예컨대, 재조합 수용체를 발현하도록 형질도입 또는 형질감염된 세포의 조성물은 본원에 기재된 임의 구현예와 같이 mTOR 활성을 억제하는 작용제, 예컨대, 화합물 63의 존재에서 배양된다. 특정 구현예에서, 배양은 조작된 T 세포를 함유하는 출력 조성물을 생성하는 것과 같이 조성물 중 세포의 증식 및/또는 팽창을 초래한다. 일부 측면에서, 상기 조성물의 세포는 배양 전에, 본원에 기재된 임의의 구현예 같이 mTOR 활성을 억제하는 작용제, 예컨대, 화합물 63에 노출되거나 접촉되거나 및/또는 인큐베이션되지 않는다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 이전에, 본원에 기재된 임의의 구현예와 같이 mTOR 억제제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에 인큐베이션, 배양, 자극, 조작, 형질도입 및/또는 형질감염되지 않는다.
특정 구현예에서, 조작된 세포 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 조작된 조성물이다. 특정 구현예에서, 조작된 조성물은 조작된 CD8+ T 세포의 조성물이다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 별개의 조작된 조성물을 본원에 기재된 임의 구현예와 같이 mTOR 활성을 억제하는 작용제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서 별도로 배양하는 것과 관련하여 사용된다.
일부 구현예에서, 상기 작용제는 mTOR와 관련된 하나 이상의 활성을 억제, 감축(reduce) 및/또는 감소(decrease)시킨다. 일부 구현예에서, 상기 활성은 키나아제 활성이다. 일부 구현예에서, 상기 활성은 mTORC1 및/또는 mTORC2 활성이다. 일부 구현예에서, 상기 작용제는 BEZ235, BGT226, GDC0980, NVP-BEZ235, PF-04691502, PI-103, SAR245409, SF1126, VS5584 또는 XL765, 피라졸로피리미딘(pyrazolopyrimidine), 토린 1(Torin 1), 토르키닙(Torkinib), PP30, Ku-0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth), OSI-027, DS3078a, AZD8055, 라파마이신(rapamycin), 템시로리무스(temsirolimus), 에베로리무스(everolimus), 데포로리무스(deforolimus) 또는 AZD8055로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 상기 작용제는 화합물 63, 화합물 155 또는 화합물 246이다. 일부 구현예에서, 상기 작용제는 화합물 63이다.
특정 구현예에서, 상기 세포의 조성물은 농축된 T 세포, 농축된 CD4+ T 세포 및/또는 농축된 CD8+ T 세포의 조성물(이하, 농축된 T 세포의 조성물, 농축된 CD4+ T 및 농축된 CD8+ T 세포의 조성물로 지칭됨)이다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포, 농축된 CD4+ T 세포 또는 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은, mTOR 활성을 억제하는 작용제, 본원에 기재된 임의 구현예와 같이 화합물 63의 존재 하의 자극 조건에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포, 농축된 CD4+ T 세포 또는 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은, mTOR 활성을 억제하는 작용제, 본원에 기재된 임의 구현예와 같이 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서 재조합 수용체를 발현시키기 위해 유전자 조작, 예컨대, 형질도입 또는 형질감염된다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 농축된 T 세포 단일 조성물의 분리(isolation, separation), 선택, 활성화 또는 자극, 형질도입, 세척, 현탁, 희석, 농축 및/또는 제형화와 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는 세포의 조성물이다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포의 조성물은 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.9% CD4+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포의 조성물은 100% CD4+ T 세포를 함유하거나 약 100% CD4+ T 세포를 함유한다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하거나 함유하고, 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하지 않고, 및/또는 CD8+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 상기 세포의 집단은 본질적으로 CD4+ T 세포로 구성된다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 농축된 CD8+ T 세포의 조성물이다. 특정 구현예에서, 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.9% CD8+ T 세포를 함유하거나, 또는 약 100% CD8+ T 세포를 함유하거나 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 포함하거나 함유하며, 및/또는 CD4+ T 세포를 함유하지 않고, 및/또는 CD4+ T 세포가 없거나 또는 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 상기 세포의 집단은 본질적으로 CD8+ T 세포로 구성된다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은 농축된 T 세포의 둘 이상의 분리된 출력 조성물을 생성하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 제공된 방법은 농축된 T 세포의 둘 이상의 별도 조성물에 대해 별도로 수행된다. 특정 구현예에서, 상기 방법은 농축된 T 세포의 둘 이상의 조성물을 별도로 활성화 및/또는 자극하는 것; 농축된 T 세포의 둘 이상의 조성물을 별도로 조작하는 것; 및/또는 농축된 T 세포의 둘 이상의 조성물을 별도로 배양하는 것과 관련하여 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 또한, 상기 방법은 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 분리된 조성물과 같은 농축된 T 세포의 분리된 입력 조성물을 생성하기 위해 생물학적 샘플로부터 상이한 세포를 분리 또는 선택하는 것과 관련하여 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 상기 제공된 방법은 T 세포가 인큐베이션, 활성화, 자극, 조작, 형질도입, 형질감염 및/또는 배양된 후 농축된 T 세포의 별도 조성물을 별도로 수거, 수집 및/또는 제형화하는 것과 관련하여 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 둘 이상의 별도 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 상기 둘 이상의 별도 조성물은 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 둘 이상의 별도 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 조성물 및 농축된 CD8+ T 세포의 조성물을 포함한다.
특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은, 재조합 수용체를 발현하는 농축된 T 세포의 출력 조성물을 생성하는 공정의 임의의 단계 또는 단계 전, 도중 또는 후에, 수집, 동결보존, 동결건조용으로 제형화되고/되거나 0℃ 이하, -20℃이하, 또는 -70℃ 또는 -80℃ 이하에서 저장될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 일 미만의 시간 동안 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 미만의 시간 동안 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 주의 시간 동안 또는 8주 초과의 시간 동안 저장될 수 있다. 저장 후, 상기 농축된 T 세포의 조성물을 해동시킬 수 있고 공정의 동일한 시점으로부터 처리가 재개될 수 있다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 입력 조성물은 동결건조되고 추가 처리, 예컨대, 인큐베이션 전에 저장된다. 특정 구현예에서, 배양 및/또는 제형화된, 농축된 T 세포 조성물은 동결건조되고, 예컨대, 자가 세포 치료로서 개체에 투여되기 전에 저장된다.
특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 개별 세포 조성물은 단일 조성물로 조합된다. 예컨대, 일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포의 조성물은 농축된 CD8+ T 세포의 조성물과 함께 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 단일 조성물로 조합된다. 특정 구현예에서, 상기 별도 조성물은, 단일 개체로부터 수득, 수집 및/또는 취한, 동일한 생물학적 샘플과 같은, 동일한 생물학적 샘플로부터 유래되며, 예컨대, 별도 조성물로부터 초기에 분리, 선택 및/또는 농축되었다. 일부 구현예에서, 상기 별도 조성물은 출력 조성물을 생성하기 위한 공정, 예컨대, 제공된 방법과 관련된 공정의 하나 이상의 단계 또는 과정에 대해 별도로 가공된다. 일부 구현예에서, 별도 조성물은 출력 조성물을 생성하기 위한 공정의 임의의 단계 또는 단계 이전, 동안 또는 후에 단일 조성물로 조합될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 별도로 입력, 자극, 조작, 배양, 제형화 및/또는 수거된, 동일한 생물학적 샘플로부터의 농축된 T 세포 조성물은 단일 조성물로 조합되고, 특정 구현예에서, 단일 조성물로서 추가로 처리된다. 특정 구현예에서, 상기 세포를 개체에게 투여하기 전에, 농축된 세포의 개별 출력 조성물을 단일 출력 조성물로 조합한다.
특정 구현예에서, 공정의 임의의 단계 또는 과정에서, 세포의 일부가 샘플링되거나 수집될 수 있으며, 예컨대, 조성물이 분리, 인큐베이션, 조작, 인큐베이션 및/또는 제형화되는 과정과 같이 폐쇄 시스템에 남아있는 동안, 농축된 T 세포의 조성물로부터 세포가 취해질 수 있다. 특정 구현예에서, 이러한 세포는 생존성, 세포사멸, 활성화, 자극, 성장 및/또는 고갈을 포함하지만 이에 한정되지 않는 마커, 특징 또는 특성에 대해 분석될 수 있으며, 일부 구현예에서, 상기 세포는, 농축된 T 세포의 조성물이 폐쇄 시스템에 남아있는 동안 자동화된 공정에 의해 샘플링되거나 수집된다. 일부 구현예에서, 샘플링되거나 수집된 세포의 분석은 자동화된다. 특정 구현예에서, 상기 분석은 멸균 조건 하에 폐쇄 시스템에서 수행된다.
또한, 방법을 수행하기 위한 약학 조성물 및 제형, 키트, 시스템 및 장치를 포함하는 방법에 의해 제조된 세포 및 조성물이 제공된다. 또한, 입양 세포 치료(adoptive cell therapy) 방법과 같은 치료 방법, 및 개체에게 투여하기 위한 약학 조성물을 포함하는, 상기 방법에 의해 제조된 세포 및 조성물의 사용 방법이 제공된다.
A. 샘플 및 세포의 준비
특정 구현예에서, 제공된 방법은 농축된 세포, 예컨대, T 세포의 하나 이상의 입력 조성물을 생성하기 위해, 생물학적 샘플로부터 세포를 분리, 선택 및/또는 농축시키는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서 제공된 방법에는, 특정 질환이나 상태를 가지고 있거나 세포 치료가 필요하거나 세포 치료를 시행할 대상과 같이 실험 대상으로부터 얻거나 파생된 것과 같은 생물학적 표본으로부터 세포 또는 조성물의 분리가 포함된다. 일부 측면에서, 상기 개체는, 세포가 분리, 가공 및/또는 조작되는 입양 세포 치료(adoptive cell therapy)과 같은 특정 치료적 개입이 필요한 환자인 개체와 같은 인간이다. 따라서, 일부 구현예에서 상기 세포는 1차 세포, 예컨대, 1차 인간 세포이다. 상기 시료에는 개체로부터 직접 채취한 조직, 체액 및 기타 시료가 포함된다. 상기 생물학적 샘플은 생물학적 공급원으로부터 직접 수득된 샘플 또는 가공된 샘플일 수 있다. 생물학적 샘플에는 체액, 예컨대, 혈액, 혈장, 혈청, 뇌척수액, 활액, 소변 및 땀, 조직 및 기관 샘플, 이로부터 유래된 가공된 샘플이 포함 되나, 이에 한정되지는 않는다.
일부 측면에서, 샘플은 혈액 또는 혈액 유래 샘플이거나, 성분채집술(apheresis) 또는 백혈구성분채집술(leukapheresis) 생성물이거나, 이로부터 유래된다. 예시적인 샘플에는 전혈, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 백혈구, 골수, 흉선, 조직 생검(tissue biopsy), 종양, 백혈병, 림프종, 림프절, 장 관련 림프 조직, 점막 관련 림프 조직, 비장, 기타 림프 조직, 간, 폐, 위, 내장, 결장, 신장, 췌장, 유방, 뼈, 전립선, 자궁 경부, 고환, 난소, 편도선 또는 기타 기관 및/또는 그로부터 유래된 세포가 포함된다. 샘플은 세포 치료, 예컨대, 입양 세포 치료(adoptive cell therapy)의 맥락에서, 자가 조직(autologous) 및 동종 이계(allogeneic) 공급원으로부터의 샘플을 포함한다.
일부 예시에서, 개체의 순환 혈액으로부터의 세포는 예컨대, 성분채집술(apheresis) 또는 백혈구성분채집술(leukapheresis)에 의해 수득된다. 일부 측면에서, 상기 샘플은 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 핵 형성 백혈구, 적혈구 및/또는 혈소판을 비롯한 림프구를 포함하고, 일부 측면에서 적혈구 및 혈소판 이외의 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 개체로부터 수집된 혈액 세포는, 예컨대, 혈장 분획을 제거하기 위하여, 후속 처리 단계를 위해 적절한 완충제 또는 배지에 세포를 위치시키기 위하여, 세척된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척된다. 일부 구현예에서, 상기 세척 용액은 칼슘 및/또는 마그네슘 및/또는 많은 또는 모든 2가 양이온이 부족하다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조자의 지시에 따라 반자동 "흐름-통과(flow-through)"원심 분리기 (예컨대, Cobe 2991 세포 처리기, Baxter)에 의해 수행된다. 일부 측면에서, 세척 단계는 제조자의 지시에 따라 접선 유동 여과(TFF)에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 상기 세포는 세척 후, 다양한 생체 적합성 완충제, 예컨대, Ca++/ Mg++ 프리 PBS에서 재현탁된다. 특정 구현예에서, 혈액 세포 샘플의 성분이 제거되고 세포는 배양 배지에 직접 재현탁된다.
일부 구현예에서, 상기 제조 방법은 형질도입 및 조작을 위한 분리, 선택 및/또는 농축 및/또는 인큐베이션의 전 또는 후, 및/또는 배양 및/또는 조작된 세포의 수거 후, 세포의 동결, 예컨대, 동결보존를 위한 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도의 단핵구를 제거한다. 일부 구현예에서, 세포는, 예컨대, 세척 단계 후에, 동결 용액에 현탁되어 혈장 및 혈소판을 제거한다. 일부 측면에서, 공지된 다양한 동결 용액 및 파라미터 중 임의의 것이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 최종 농도가 12.5%, 12.0%, 11.5%, 11.0%, 10.5%, 10.0%, 9.5%, 9.0%, 8.5%, 8.0%, 7.5%, 7.0%, 6.5%, 6.0%, 5.5 % 또는 5.0% 또는 약 12.5%, 12.0%, 11.5%, 11.0%, 10.5%, 10.0%, 9.5%, 9.0%, 8.5%, 8.0%, 7.5%, 7.0%, 6.5%, 6.0%, 5.5 % 또는 5.0%인 DMSO, 또는 1% 내지 15%, 6% 내지 12%, 5% 내지 10% 또는 6% 내지 8%인 DMSO와 배지 및/또는 용액에서 동결, 예컨대, 동결건조(cryofrozen) 또는 동결보존(cryopreserved)된다. 특정 구현예에서, 상기 세포는 최종 농도가 5.0%, 4.5%, 4.0%, 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.0%, 1.5%, 1.25%, 1.0%, 0.75%, 0.5% 또는 0.25 % 또는 약 5.0%, 4.5%, 4.0%, 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.0%, 1.5%, 1.25%, 1.0%, 0.75%, 0.5% 또는 0.25 %인 HSA, 또는 0.1% 내지 -5%, 0.25% 내지 4%, 0.5% 내지 2%, 또는 1% 내지 2%인 HAS와 배지 및/또는 용액에서 동결, 예컨대, 동결건조 또는 동결보존된다. 일 구현예에서, 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민(HSA) 또는 다른 적합한 세포 동결 배지를 함유하는 PBS를 사용하는 것을 포함한다. 이어서, 이를 DMSO 및 HSA의 최종 농도가 각각 10% 및 4%가 되도록 배지로 1:1로 희석시킨다. 이어서, 상기 세포는 일반적으로 분당 1°또는 약 1°의 속도로 -80℃ 또는 약 -80℃로 동결되고, 액체 질소 저장 탱크의 증기 상태로 저장된다.
일부 구현예에서, 세포 또는 집단의 분리는 하나 이상의 제조 및/또는 비친화성 기반 세포 분리 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 예컨대, 원치 않는 성분을 제거하고, 원하는 성분을 농축하고, 특정 시약에 민감한 세포를 용해 또는 제거하기 위해, 하나 이상의 시약의 존재 하에 세포를 세척, 원심 분리 및/또는 인큐베이션한다. 일부 구현예에서, 세포는 밀도, 부착 특성, 크기, 감도 및/또는 특정 성분에 대한 내성과 같은 하나 이상의 특성에 기초하여 분리된다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 밀도 기반 세포 분리 방법, 예컨대, 적혈구를 용해시켜 말초혈로부터 백혈구를 준비하는 것과 퍼콜(Percoll) 또는 피콜(Ficoll) 구배를 통한 원심 분리를 포함한다.
일부 구현예에서, 선택 단계의 적어도 일부는, 선택 시약과 함께 세포를 인큐베이션하는 것을 포함한다. 예컨대, 선택 방법의 일부로서, 선택 시약 또는 시약과의 인큐베이션은 하나 이상의 특정 분자, 예컨대, 표면 단백질, 세포내 마커 또는 핵산과 같은 표면 마커의 표현 또는 존재에 기초한, 하나 이상의 상이한 세포 유형의 선택을 위해 하나 이상의 선택 시약을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 시약 또는 시약을 사용하는 임의의 공지된 방법이 이러한 마커에 기초한 분리를 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 선택 시약 또는 시약들은 친화성 또는 면역 친화성-기반 분리인 분리를 초래한다. 예컨대, 상기 선택은 일부 측면에서, 하나 이상의 마커, 전형적으로 세포 표면 마커, 예컨대, 항체 또는 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 결합 파트너와의 인큐베이션에 의한 세포의 발현 또는 발현 수준에 기초하여 세포 및 세포 집단의 분리를 위한 시약 또는 시약과의 인큐베이션을 포함하고, 이어서 일반적으로 항체 또는 결합 파트너에 결합하지 않은 세포로부터 항체 또는 결합 파트너에 결합된 세포의 세척 단계 및 분리가 이어진다.
이러한 공정의 일부 측면에서, 다량의 세포를 원하는 양의 친화성-기반 선택 시약과 혼합한다. 면역 친화성-기반 선택은 분리되는 세포와 세포상의 마커에 특이적으로 결합하는 분자, 예컨대, 항체 또는 고체 표면의 다른 결합 파트너, 예컨대, 입자, 사이에 유리한 에너지 상호 작용을 야기하는 임의의 시스템 또는 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 방법은 비드, 예컨대, 세포의 마커에 특이적인 선택 작용제(예컨대, 항체)로 코팅된 자기 비드와 같은 입자를 사용하여 수행된다. 상기 입자(예컨대, 비드)는 에너지가 요구되는 상호작용의 촉진을 돕기 위해 일정한 세포 밀도 대 입자(예컨대, 비드)비로 흔들거나 혼합하면서 튜브 또는 백과 같은 용기에서 세포와 인큐베이션 또는 혼합될 수 있다. 다른 경우에, 상기 방법은 선택의 전부 또는 일부가 원심 챔버의 내부 공동(cavity)에서, 예컨대, 원심 회전 하에, 수행되는 세포의 선택을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역 친화성-기반 선택 시약과 같은 선택 시약과 함께하는 세포의 인큐베이션은 원심 챔버에서 수행된다. 특정 구현예에서, 분리(isolation, separation)는 국제 특허 출원, 공개 번호 WO2009/072003 또는 US20110003380 A1에 기재된 시스템, 장비(device) 또는 장치(apparatus)를 사용하여 수행된다. 일 구현예에서, 상기 시스템은 국제 공개 번호 WO2016/073602에 기술된 시스템이다.
일부 구현예에서, 원심 분리 챔버의 공동에서 이러한 선택 단계 또는 그의 일부(예컨대, 항체-코팅된 입자, 예컨대, 자기 비드와의 인큐베이션)를 수행함으로써, 사용자는 다양한 용액의 부피와 같은 특정 파라미터를 제어할 수 있고, 처리 및 그 타이밍 동안 용액의 첨가는 다른 이용 가능한 방법과 비교하여 이점을 제공할 수 있다. 예컨대, 인큐베이션 동안 공동 내 액체 부피를 감소시키는 능력은 공동의 총 세포 수에 영향을 미치지 않으면서, 선택에 사용된 입자(예컨대, 비드 시약)의 농도 및 용액의 화학적 총 전위를 증가시킬 수 있다. 이는 처리되는 세포와 선택에 사용되는 입자 사이의 쌍별 상호 작용(pairwise interactions)을 향상시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 예컨대, 본원에 기재된 바와 같은 시스템, 회로 및 제어와 관련될 때 챔버에서 인큐베이션 단계를 수행하는 것은 사용자가 인큐베이션 동안 원하는 시간(들)에 용액의 교반을 수행할 수 있게 하며, 이는 또한 상호 작용을 향상시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 선택 단계의 적어도 일부는 원심 분리 챔버에서 수행되며, 이는 선택 시약과 함께하는 세포의 인큐베이션을 포함한다. 이러한 공정의 일부 측면에서, 제조업체의 지침에 따르면, 일정 부피의 세포는 동일한 수의 세포 및/또는 세포 부피를 선택하기 위해, 튜브 또는 용기에서 유사한 선택을 수행할 때, 일반적으로 사용되는 것보다 훨씬 적은 양의 원하는 친화성-기반 선택 시약과 혼합된다. 일부 구현예에서, 동일한 수의 세포 및/또는 동일한 부피에 대한 튜브 또는 용기-기반 인큐베이션에서 세포의 선택에 사용되는 상기 동일한 선택 시약의 양의 5% 이하, 10% 이하, 15% 이하, 20% 이하, 25% 이하, 50% 이하, 60%이하, 70% 이하 또는 80% 이하인 선택 시약 또는 시약의 양이 제조자의 지시에 따라 사용된다.
일부 구현예에서, 선택, 예컨대, 세포의 면역 친화성-기반 선택을 위해, 세포는 선택 시약, 예컨대, 선택 완충제와 함께, 예컨대, CD4 및 CD8에 특이적인 단일 클론 항체에 커플링된 중합체 또는 표면, 예컨대, 비드, 예컨대, 자기 비드와 같은 스캐폴드에 임의로 결합된 항체와 같은 조성물의 다른 세포에는 존재하지 않고 농축 및/또는 고갈시키고자 하는 세포의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 분자와 같은 선택 시약을 포함하는 조성물로 챔버의 공동에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 기술된 바와 같이, 상기 선택 시약은, 동요(shaking) 또는 회전(rotation)과 함께 튜브에서 선택을 수행할 때의 동일한 수의 세포 또는 동일한 양의 세포의 선택과 거의 동일하거나 유사한 선택 효율을 달성하기 위해 일반적으로 사용되거나 필요한 선택 시약의 양과 비교하여, 실질적으로 (예컨대, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60 %, 70 % 또는 80 % 이하의 양) 미만의 양으로 챔버의 공동(cavity) 내의 세포에 첨가된다. 일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 세포 및 선택 시약에 선택 완충제를 첨가하여 수행되며, 예컨대, 10mL 내지 200mL의 시약, 적어도 10mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL, 100mL, 150mL 또는 200mL 또는 적어도 약 10mL, 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL, 100mL, 150mL 또는 200mL의 시약과 함께 인큐베이션하여 표적 부피를 달성한다. 일부 구현예에서, 선택 완충제 및 선택 시약은 세포에 첨가하기 전에 예비 혼합된다. 일부 구현예에서, 선택 완충제 및 선택 시약은 별도로 세포에 첨가된다. 일부 구현예에서, 선택 인큐베이션은 주기적으로 온화한 혼합 조건으로 수행되며, 이는 에너지적으로 선호되는 상호 작용을 촉진시키고, 이에 의해 높은 선택 효율을 달성하면서도 전체 선택 시약의 사용을 덜 허용할 수 있다.
일부 구현예에서, 선택 시약과의 인큐베이션의 총 지속 시간은 약 5분 내지 6시간, 예컨대, 30분 내지 3시간, 예컨대, 적어도 30분, 60분, 120분 또는 180분 또는 적어도 약 30분, 60분, 120분 또는 180분 이상이다.
일부 구현예에서, 상기 인큐베이션은 일반적으로 혼합 조건, 예컨대, 스피닝(spinning)의 존재 하에, 일반적으로 비교적 낮은 힘 또는 속도, 예컨대, 세포를 펠렛(pellet)화하기 위해 사용된 것보다 낮은 속도와 같은 혼합 조건 하에서 수행되며, 약 600rpm 내지 1700rpm(예컨대, 600rpm, 1000rpm, 또는 1500rpm 또는 1700rpm 또는 약 600rpm, 1000rpm, 또는 1500rpm 또는 1700rpm 또는 적어도 600rpm, 1000rpm, 또는 1500rpm 또는 1700rpm)으로부터, 예컨대, 80g 내지 100g 또는 약 80g 내지 100g(예컨대, 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g 또는 약 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g 또는 적어도 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g)으로부터의 챔버의 샘플 또는 벽(wall) 또는 다른 용기의 RCF에서와 같다. 일부 구현예에서, 상기 스핀은 이러한 저속에서 스핀의 반복된 간격을 사용하여 수행되고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 초 동안의 스핀(spin) 및/또는 휴식, 예컨대, 약 1 또는 2 초에서 스핀(spin) 후 약 5, 6, 7 또는 8 초 동안 휴식 기간이 수행된다.
일부 구현예에서, 이러한 프로세스는 챔버가 일체화된 완전 폐쇄 시스템 내에서 수행된다. 일부 구현예에서, 이 방법(및 일부 측면에서, 하나 이상의 추가 단계, 예컨대, 혈액성분채집술(apheresis) 샘플과 같은 세포를 포함하는 샘플을 세척하는 이전 세척 단계)은 세포가 다음과 같이 자동화된 방식으로 수행되며, 예컨대, 자동화된 프로그램을 사용하여 단일 폐쇄 시스템에서 세척 및 결합 단계를 완료하기 위해 시약 및 기타 성분을 적절한 시간에 챔버로 끌어당겨 빼내고 원심 분리한다.
일부 구현예에서, 세포 및 선택 시약 및/또는 시약의 인큐베이션 및/또는 혼합 후, 상기 인큐베이션된 세포는 특정 시약 또는 시약의 존재 또는 부재에 기초하여 세포를 선택하기 위해 분리된다. 일부 구현예에서, 상기 분리는 선택 시약과 함께 세포의 인큐베이션이 수행된 동일한 폐쇄 시스템에서 수행된다. 일부 구현예에서, 선택 시약과의 인큐베이션 후, 선택 시약이 결합된 세포를 포함하는 인큐베이션된 세포를, 세포의 면역 친화성-기반 분리를 위한 시스템으로 옮긴다. 일부 구현예에서, 상기 면역 친화성-기반 분리 시스템은 자기(magnetic) 분리 컬럼이거나 이를 포함한다.
이러한 분리 단계는, 세포가 시약에 결합한 세포, 예컨대, 항체 또는 결합 파트너는 추가 사용을 위해 보유되는 양성 선택, 및/또는, 시약에 결합하지 않은 세포, 예컨대, 항체 또는 결합 파트너가 보유되는 음성 선택에 기초할 수 있다. 일부 예에서, 두 분획은 추가 사용을 위해 보유된다. 일부 측면에서, 이종 집단에서 세포 유형을 특이적으로 식별하는 항체가 이용 가능하지 않은 경우, 음성 선택이 특히 유용할 수 있어서, 원하는 집단 이외의 세포에 의해 발현된 마커에 기초하여 분리가 가장 잘 수행된다.
일부 구현예에서, 공정 단계는 친화성 기반 선택을 수행할 수 있는 시스템 또는 장치를 사용하는 것과 같이 인큐베이션된 세포의 음성 및/또는 양성 선택을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 분리는, 양성 선택에 의한 특정 세포 집단에 대한 농축 또는 음성 선택에 의한 특정 세포 집단의 고갈에 의해 수행된다. 일부 구현예에서, 양성 또는 음성 선택은 양성 또는 음성적으로 선택된 세포의 상대적으로 더 높은 수준(markerhigh)으로 발현 또는 발현된(marker+) 하나 이상의 표면 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 다른 결합제와 함께 세포를 인큐베이션함으로써 달성된다.
상기 분리는 특정 세포 집단 또는 특정 마커를 발현하는 세포의 100 % 농축 또는 제거를 초래할 필요는 없다. 예컨대, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포에 대한 양성 선택 또는 농축은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 증가시키는 것을 지칭하지만, 마커를 발현하지 않는 세포가 완전히 부재할 필요는 없다. 마찬가지로, 마커를 발현하는 것과 같은 특정 유형의 세포의 음성 선택, 제거 또는 결핍은 그러한 세포의 수 또는 백분율을 감소시키는 것을 말하지만, 그러한 모든 세포를 완전히 제거할 필요는 없다.
일부 구현예에서, 하나의 단계로부터 양성 또는 음성으로 선택된 분획에 후속 양성 또는 음성 선택과 같은 다른 분리 단계가 수행되는, 수 회의 분리 단계가 수행된다. 일부 예에서, 단일 분리 단계는, 예컨대, 각각 음성 선택을 표적으로하는 마커에 특이적인 복수의 항체 또는 결합 파트너와 세포를 인큐베이션함으로써 다수의 마커를 동시에 발현하는 세포를 결핍시킬 수 있다. 마찬가지로, 다수의 세포 유형은 세포를 다양한 세포 유형에서 발현된 복수의 항체 또는 결합 파트너와 인큐베이션함으로써 동시에 양성적으로 선택될 수 있다.
예컨대, 일부 측면에서, 예컨대, CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ 및/또는 CD45RO+ T 세포와 같이 높은 수준의 하나 이상의 표면 마커를 양성 또는 발현하는 T 세포의 특이적 하위 집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 분리된다. 일부 구현예에서, 이러한 세포는 이러한 마커에 특이적으로 결합하는 하나 이상의 항체 또는 결합 파트너와의 인큐베이션에 의해 선택된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는, 자기(magnetic) 비드 또는 상자성(paramagnetic) 비드와 같은 선택을 수행하기 위해 고체 지지체 또는 매트릭스에 직접적으로 또는 간접적으로 컨쥬게이션 될 수 있다. 예컨대, CD3+, CD28+ T 세포는 CD3/CD28 컨쥬게이션된 자기(magnetic) 비드(예컨대, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T세포 확장기 및/또는 ExpACT® 비드)를 사용하여 양성으로 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, T 세포는, B 세포, 단핵구 또는 CD14와 같은 다른 백혈구와 같은 비-T 세포에서 발현된 마커의 음성 선택에 의해 PBMC 샘플로부터 분리된다. 일부 측면에서, CD4+ 또는 CD8+ 선택 단계는, CD4+ 헬퍼 및 CD8 + 세포 독성 T 세포를 분리하기 위해 사용된다. 이러한 CD4+ 및 CD8+ 집단은, 하나 이상의 나이브(naive), 기억 및/또는 이펙터(effector) T 세포 하위 집단에서 상대적으로 더 높은 정도로 발현되거나 발현된 마커에 대한 양성 또는 음성 선택에 의해 하위 집단으로 추가로 분류될 수 있다.
일부 구현예에서, CD8+ T 세포는, 예컨대, 각각의 하위 집단과 관련된 표면 항원에 기초한 양성 또는 음성 선택에 의해, 나이브(naive), 중앙 기억, 이펙터(effector) 기억 및/또는 중심 기억 줄기 세포가 추가로 농축되거나 고갈된다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 T(TCM) 세포의 농축은 투여 후 장기 생존, 팽창 및/또는 생착을 개선시키는 것과 같은 효능을 증가시키기 위해 수행되며, 이는 일부 측면에서 이러한 하위 집단에서 특히 강력하다. Terakura et al., (2012) Blood.1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701 을 참고한다. 일부 구현예에서, TCM-농축된 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 조합은 효능을 추가로 향상시킨다.
일 구현예에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 서브세트 둘 다에 존재한다. PBMC는, 예컨대, 항-CD8 및 항-CD62L 항체를 사용하는 것과 같이 CD62L-CD8 + 및/또는 CD62L+CD8+ 분획을 농축하거나 결핍시킬 수 있다.
일부 구현예에서, 중앙 기억 T (TCM) 세포에 대한 농축은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 및/또는 CD127의 양성 또는 높은 표면 발현에 기초하고; 일부 측면에서, 이는 CD45RA 및/또는 그랜자임(granzyme) B를 발현 또는 고발현하는 세포에 대한 음성 선택에 기초한다. 일부 측면에서, TCM 세포를 농축하는 CD8+ 집단의 분리는 CD4, CD14, CD45RA를 발현하는 세포의 고갈, 및 CD62L을 발현하는 세포에 대한 양성 선택 또는 농축에 의해 수행된다. 한 측면에서, 중앙 기억 T(TCM) 세포에 대한 농축은, CD14 및 CD45RA의 발현에 기초한 음성 선택 및 CD62L에 기초한 양성 선택이 적용된, CD4 발현에 기초하여 선택된 세포의 음성 부분(negative fraction)으로 시작하여 수행된다. 일부 측면에서 이러한 선택들은 동시에 수행되고 다른 측면에서는 임의의 순서로 순차적으로 수행된다. 일부 측면에서, CD8+ T 세포 집단 또는 하위 집단을 제조하는데 사용된 동일한 CD4 발현-기반 선택 단계는, CD4-기반 분리로부터의 양성 및 음성 분획이 선택적으로 하나 이상의 추가 양성 또는 음성 선택 단계 후에 방법의 후속 단계에서 유지되고 사용되는 것과 같이, CD4+ T 세포 집단 또는 하위 집단을 생성하는데 또한 사용된다. 일부 구현예에서, CD4+ T 세포 집단에 대한 선택 및 CD8+ T 세포 집단에 대한 선택은 동시에 수행된다. 일부 구현예에서, CD4+ T 세포 집단 및 CD8 + T 세포 집단에 대한 선택은 임의의 순서로 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 세포를 선택하기 위한 방법은 공개된 U.S. App. No. US20170037369에 기재된 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 선택된 CD4+ T 세포 집단 및 선택된 CD8+ T 세포 집단은 선택 후에 조합될 수 있다. 일부 양상에서, 선택된 CD4+ T 세포 집단 및 선택된 CD8+ T 세포 집단은 본원에 기재된 바와 같은 생물반응기 백(bag)에서 조합될 수 있다.
특정 구현예에서, 생물학적 샘플, 예컨대, PBMC 또는 다른 백혈구 샘플은 CD4+ T 세포의 선택에 적용되며, 여기서 음성 및 양성 분획이 모두 유지된다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포는 음성 분획으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 CD8+ T 세포의 선택에 적용되며, 여기서 음성 및 양성 분획 모두가 유지된다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 음성 분획으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, PBMC 샘플 또는 다른 백혈구 샘플은 CD4+ T 세포의 선택에 적용되며, 여기서 음성 및 양성 분획 모두가 유지된다. 그런 다음, 음성 분획은, CD14 및 CD45RA 또는 CD19의 발현에 기초하여 음성 선택, CD62L 또는 CCR7과 같은 중앙 기억 T 세포의 마커 특성에 기초하여 양성 선택이 적용되고, 여기서 양성 및 음성 선택은 임의의 순서로 수행된다.
CD4+ T 헬퍼(helper) 세포는 세포 표면 항원을 갖는 세포 집단을 식별함으로써 나이브(naive), 중앙 기억 및 이펙터(effector) 세포로 분류될 수 있다. CD4+ 림프구는 표준 방법으로 얻을 수 있다. 일부 구현예에서, 나이브(naive) CD4+ T 림프구는 CD45RO-, CD45RA+, CD62L+ 또는 CD4+ T 세포이다. 일부 구현예에서, 중앙 기억 CD4+ T 세포는 CD62L+ 및 CD45RO +이다. 일부 구현예에서, 이펙터(effector) CD4+ T 세포는 CD62L- 및 CD45RO-이다.
일 예시에서, 음성 선택에 의해 CD4+ T 세포를 농축하기 위해, 단일 클론(monoclonal) 항체 칵테일(cocktail)은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 결합 파트너는 자성 비드(magnetic bead) 또는 상자성 비드(paramagnetic bead)와 같은 고체 지지체 또는 매트릭스에 결합되어 양성 및/또는 음성 선택을 위한 세포의 분리를 허용한다. 예컨대, 일부 구현예에서, 세포 및 세포 집단은 면역자성(immunomagnetic)(또는 친화성(affinitymagnetic)) 분리 기술(Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher ⓒ Humana Press Inc., Totowa, NJ 참조)을 사용하여 분리된다(separated or isolated).
일부 측면에서, 분리될 인큐베이션된 샘플 또는 세포의 조성물은, 상자성 비드(예컨대, 다인비드(Dynalbead) 또는 MACS® 비드와 같은)와 같은, 자기적 반응 입자 또는 미세입자와 같이, 작은, 자화성(magnetizable) 또는 자기적(magnetically) 반응성 물질을 포함하는 선택 시약과 함께 인큐베이션된다. 상기 자기적(magnetically) 반응성 물질, 예컨대, 입자는, 일반적으로 결합 파트너, 예컨대, 항체에 직접 또는 간접적으로 부착되어 있으며, 이는 분자, 예컨대, 표면 마커에 결합하여 세포, 세포들 또는 세포 집단에 존재하며, 분리, 예컨대, 부정적으로 또는 긍정적으로 선택되는 것이 요구된다.
일부 구현예에서, 자성 입자 또는 비드는 항체 또는 다른 결합 파트너와 같은 특정 결합 부재에 결합된 자기(magnetically) 반응성 물질을 포함한다. 자기 분리 방법에 사용하기 위한 많은 잘 알려진 자기 반응성 물질은, 예컨대, Molday, 미국 특허 제 4,452,773호 및 유럽 특허 명세서 EP 452342 B에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참조로 포함된다. Owen 미국 특허 제 4,795,698 호 및 Liberti et al. 미국 특허 제 5,200,084호에 기재된 콜로이드 크기의 입자(Colloidal sized particles)도 사용될 수 있다.
상기 인큐베이션은 항체, 또는 결합 파트너, 일반적으로 자성 입자 또는 비드에 부착된 이러한 항체 또는 결합 파트너에 특이적으로 결합하는 2차 항체 또는 다른 시약과 같은 분자, 구체적으로 샘플 내 세포에 존재하는 경우 세포 표면 분자에 결합하는 조건 하에서 수행된다.
특정 구현예에서, 자기 반응성 입자는 1차 항체 또는 다른 결합 파트너, 2 차 항체, 렉틴(lectins), 효소 또는 스트렙타비딘(streptavidin)으로 코팅된다. 특정 구현예에서, 자성 입자는 하나 이상의 마커에 특이적인 1차 항체의 코팅을 통해 세포에 부착된다. 특정 구현예에서, 상기 비드보다는 상기 세포가 1차 항체 또는 결합 파트너로 표지된 후, 세포 유형 특이적 2 차 항체-또는 다른 결합 파트너(예컨대, 스트렙타비딘(streptavidin))-코팅 된 자성 입자가 첨가된다. 특정 구현예에서, 스트렙타비딘(streptavidin)-코팅된 자성 입자는 비오티닐화된(biotinylated) 1차 또는 2차 항체와 함께 사용된다.
일부 측면에서, 샘플이 자기장에 배치되는 절차에서 분리가 달성되고, 자기 응답성 또는 자화성 입자가 부착된 셀은 자석에 끌려 라벨링되지 않은 세포로부터 분리될 것이다. 양성 선택을 위해, 자석에 끌리는 세포는 유지되며; 음성 선택을 위해, 끌리지 않은 세포(라벨링되지 않은 세포)가 유지된다. 일부 측면에서, 양성 및 음성 선택의 조합은 동일한 선택 단계 동안 수행되며, 여기서 양성 및 음성 분획은 유지되고 추가로 처리되거나 추가 분리 단계를 거친다.
일부 구현예에서, 친화성-기반 선택은 자기 활성화 세포 분류(MACS)(Miltenyi Biotech, Auburn, CA)를 통한 것이다. Magnetic Activated Cell Sorting(MACS), 예컨대, CliniMACS 시스템은 자화된 입자가 부착된 셀을 고순도로 선택할 수 있다. 특정 구현예에서, MACS는 비-표적 및 표적 종(species)이 외부 자기장의 적용 후에 순차적으로 용리되는(eluted) 모드에서 작동한다. 즉, 자화 입자에 부착된 세포는 부착되지 않은 종(species)이 용리되는 동안 제자리에 유지된다. 이어서, 이 제1 용리 단계가 완료된 후, 자기장에 포획되고 용리되는 것이 방지된 종(species)은 이들이 용리 및 회수될 수 있도록 어떤 방식으로도 자유롭게된다. 특정 구현예에서, 비-표적-세포는 이종 세포 집단으로부터 표지되고 결핍된다.
일부 구현예에서, 상기 자기적으로 반응하는 입자는 후속 인큐베이션, 배양 및/또는 조작될 세포에 부착된 채로 남고; 일부 측면에서, 입자는 환자에게 투여하기 위해 세포에 부착된 채로 남는다. 일부 구현예에서, 자화성(magnetizable) 또는 자기 응답성 입자(magnetically responsive particles)는 세포로부터 제거된다. 세포로부터 자화성 입자를 제거하는 방법은 공지되어 있으며, 예컨대, 경쟁 비-표지 항체, 자화성 입자 또는 절단 가능한 링커에 컨쥬게이트된 항체 등의 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 자화성 입자는 생분해성(biodegradable)이다.
일부 구현예에서, 분리 및/또는 선택은 농축된 T 세포, 예컨대, CD3+ T 세포, CD4+ T 세포 및/또는 CD8+ T 세포의 하나 이상의 입력 조성물을 생성한다. 일부 구현예에서, 둘 이상의 분리된 입력 조성물은 단 하나의 생물학적 시료로부터 분리, 선택, 농축 또는 수득된다. 일부 구현예에서, 별도의 입력 조성물은 동일한 개체로부터 수집, 채취 및/또는 수득된 별도의 생물학적 샘플로부터 분리, 선택, 농축 및/또는 수득된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 입력 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD3+ T 세포를 포함하는 농축된 T 세포의 조성물이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 입력 조성물은 본질적으로 CD3+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 투입 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD4+ T 세포를 포함하는 농축된 CD4+ T 세포의 조성물이거나, 이를 포함한다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포의 입력 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/하거나 CD8+ T 세포를 함유하지 않으며/거나 CD8+ T 세포가 없거나 또는 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 본질적으로 CD4+ T 세포로 구성된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD8+ T 세포인 CD8+ T 세포의 조성물이거나, 이를 포함한다. 특정 구현예에서, CD8+ T 세포의 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만 CD4+ T 세포를 포함하고/하거나 CD4+ T 세포를 포함하지 않으며/거나 CD4+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 본질적으로 CD8+ T 세포로 구성된다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 하나 이상의 입력 조성물은 분리, 선택(selection) 및/또는 농축 후, 예컨대, 동결보존(cryopreserved) 및/또는 동결건조(cryofrozen)에 의해 동결된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 입력 조성물 세포의 동결은, 예컨대, 인큐베이션, 활성화, 자극, 조작, 형질 전환, 형질감염, 팽창, 배양, 수거 및/또는 제형화의 어느 단계 이전에 동결보존(cryopreserved) 및/또는 동결건조(cryofrozen)된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 동결건조된 입력 조성물은 예컨대, -80 ℃ 또는 약 -80 ℃에서 저장된다.
B. 세포의 활성화 및 자극
일부 구현예에서, 제공된 방법은 자극 조건 하에서 세포를 인큐베이션하는 것과 관련하여 사용된다. 일부 구현예에서, 상기 자극 조건은, TCR 및/또는 공동 수용체(coreceptor)로부터 발생된 신호와 같은, 세포, 예컨대, CD4 + T 세포의 신호를 활성화 또는 자극하고/거나 신호를 활성화 또는 자극할 수 있는 조건을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극 조건은 자극 시약, 예컨대, 세포의 신호를 활성화 또는 자극하는 시약, 및/또는 활성화 또는 자극할 수 있는 시약과 함께 및/또는 존재 하에 세포를 배양(culturing, cultivating), 인큐베이션, 활성화, 번식시키는 하나 이상의 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 자극 시약은 TCR 및/또는 공동 수용체(coreceptor)를 자극 및/또는 활성화시킨다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 섹션 I-B-1에 기재된 시약이다.
특정 구현예에서, 세포를 유전자 조작하기 전에, 예컨대, 섹션 I-C에 제공된 기술에 의해 세포를 형질감염 및/또는 형질도입하기 전에, 자극된 조건하에 농축된 T 세포의 하나 이상의 조성물을 인큐베이션한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 농축된 T 세포 조성물은 하나 이상의 조성물이 분리, 선택, 농축 또는 생물학적 샘플로부터 수득된 후 자극 조건 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 조성물은 입력 조성물이다. 특정 구현예에서, 상기 하나 이상의 입력 조성물은 이전에 동결건조(cryofrozen)되고 저장되고, 인큐베이션 전에 해동된다.
특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 하나 이상의 조성물은, 농축된 T 세포의 2개의 별개의 조성물, 예컨대, 별개의 입력 조성물이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 2개의 분리된 조성물, 예컨대, 동일한 생물학적 샘플로부터 선택, 분리 및/또는 농축된 2개의 분리된, 농축된 T 세포의 조성물은 자극 조건 하에서 별도로 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 조성물은 농축된 CD8+ T 세포의 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 2개의 별개의 조성물은 자극 조건 하에서 별도로 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 단일 조성물은 자극 조건 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 단일 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 조성물이다. 일부 구현예에서, 상기 단일 조성물은 인큐베이션 전에 별개의 조성물로부터 조합된 농축된 CD4+ 및 CD8 + T 세포의 조성물이다.
일부 구현예에서, 자극 조건 하에서 인큐베이션되는 농축된 CD4 + T 세포의 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD4+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건 하에서 인큐베이션되는 농축된 CD4+ T 세포의 조성물은 40 % 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 CD8 + T 세포를 포함하고/하거나 CD8 + T 세포를 포함하지 않으며/거나 CD8+ T 세포가 없거나 또는 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, 자극 조건 하에서 인큐베이션되는, 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD8 + T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건 하에서 인큐베이션되는, 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 포함하고/하거나 CD4+ T 세포를 포함하지 않으며/거나 CD4+ T 세포가 없거나 또는 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 별도 조성물은 단일 조성물로 조합되고 자극 조건 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션이 수행되고/되거나 완료된 후 농축된 CD4+ 및 농축된 CD8+ T 세포의 개별 자극된 조성물이 단일 조성물로 조합된다.
특정 구현예에서, 세포를 유전자 조작하기 전에, 예컨대, 섹션 I-C에 제공된 기술에 의해 세포를 형질감염 및/또는 형질도입하기 전, 자극된 조건 하에, 농축된 T 세포의 하나 이상의 조성물을 인큐베이션한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 농축된 T 세포 조성물은 하나 이상의 조성물이 분리, 선택, 농축 또는 생물학적 샘플로부터 수득된 후 자극 조건 하에서 배양된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 조성물은 입력 조성물이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 입력 조성물은 이전에 동결건조(cryofrozen)되고 저장되고, 인큐베이션 전에 해동된다.
일부 구현예에서, 자극 조건 하의 인큐베이션은, 배양(culture, cultivation), 자극, 활성화, 번식, 예컨대, 자극 조건의 존재 하에 인큐베이션, 예컨대, 증식, 팽창, 활성화 및/또는 집단에서 세포의 생존, 항원 노출 모방(mimic) 및/또는 유전자 조작, 예컨대, 재조합 항원 수용체의 도입을 위한 세포의 프라이밍(prime)을 유도하도록 설계된 조건을 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 자극 조건에는 하나 이상의 특정 매체, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 작용제, 예컨대, 영양, 아미노산, 항생제(antibiotics), 이온 및/또는 자극 요인(stimulatory factors) 예컨대, 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질(fusion proteins), 재조합 수용체 및 세포들을 활성화시키기 위해 설계된 기타 모든 작용제가 포함될 수 있다.
일부 측면에서, 자극 조건 하에서의 자극 및/또는 인큐베이션은 US Patent No. 6,040,1 77 to Riddell et al., Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakuraet al. (2012) Blood.1:72-82, and/or Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701에 기재된 것과 같은 기술에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 세포, 예컨대, T 세포, 세포 조성물 및/또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 또는 조성물과 같은 세포 집단 또는 그의 집단 또는 하위 집단은 비분할 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)와 같은 배양-개시 조성물 공급(feeder) 세포에 첨가(예컨대, 생성된 세포 집단이 팽창될 초기 집단의 각각의 T 림프구에 대해 적어도 약 5, 10, 20 또는 40 개 이상의 PBMC 공급(feeder) 세포를 포함하도록); 및 배양물을 인큐베이션(예컨대, T 세포의 수를 팽창시키기에 충분한 시간 동안)함으로써 팽창된다. 일부 측면에서, 비분할 공급(feeder) 세포는 감마 조사된 PBMC 공급(feeder) 세포를 포함 할 수 있다. 일부 구현예에서, PBMC에는 세포 분열을 방지하기 위해 약 3000 내지 3600 rad 범위의 감마선이 조사된다. 일부 측면에서, 공급(feeder) 세포는 T 세포 집단의 첨가 전에 배양 배지에 첨가된다.
일부 구현예에서, 자극 조건은 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예컨대, 약 25 ℃ 이상, 일반적으로 약 30 ℃ 이상, 및 일반적으로 약 37 ℃ 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 온도 변화는 배양 동안, 예컨대, 37 ℃ 내지 35 ℃에서 수행된다. 임의로, 인큐베이션은 비-분할 EBV-변형 림프모(lymphoblastoid)세포(LCL)를 공급(feeder) 세포로서 첨가하는 것을 추가로 포함할 수 있다. LCL은 약 6000 내지 10,000rad 범위의 감마선으로 조사될 수 있다. 일부 측면에서 LCL 공급(feeder) 세포는 임의의 적합한 양, 예컨대, LCL 공급(feeder) 세포 대 초기 T 림프구 적어도 약 10:1의 비와 같은 형태로 제공된다.
일 구현예에서, 항원 특이적인 CD4+ 및 CD8+의 집단은 나이브(naive) 또는 항원 특이적 T 림프구를 항원으로 자극함으로써 수득될 수 있다. 예컨대, 항원-특이적 T 세포주 또는 클론은 감염된 개체로부터 T 세포를 분리하고 동일한 항원으로 시험관내 세포를 자극함으로써 사이토메갈로 바이러스(cytomegalovirus) 항원에 생성될 수 있다. 나이브(naive) T 세포가 또한 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 자극 조건은 자극 시약으로 세포를 인큐베이션, 배양(culturing 및/또는 cultivating)하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 시약은 섹션 I-B-1에 기재된 시약이다. 특정 구현예에서, 자극제는 비드를 함유하거나 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건 하에서 세포의 인큐베이션, 배양(culturing 및/또는 cultivating) 시작 및/또는 개시는 세포가 자극제와 접촉 및/또는 인큐베이션될 때 발생한다. 특정 구현예에서, 세포는, 세포를 유전자 조작, 예컨대, 형질도입 또는 형질감염하는 것과 같이 재조합 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)를 세포내로 도입하기 전, 동안 및/또는 후에 인큐베이션한다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 자극 시약 및/또는 비드 대 세포의 비에서 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1 또는 0.2:1 또는 약 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.5:1, 1.25:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 0.9:1, 0.8:1, 0.75:1, 0.67:1, 0.5:1, 0.3:1 또는 0.2:1로 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 자극 시약 및/또는 비드 대 세포의 비는 2.5:1 내지 0.2:1, 2:1 내지 0.5:1, 1.5:1 내지 0.75:1, 1.25:1 내지 0.8: 1, 1.1:1 내지 0.9:1 이다. 특정 구현예에서, 자극 시약 대 세포의 비는 약 1:1 또는 1:1이다.
특정 구현예에서, 세포는, 자극 조건 하에서 전 및/또는 배양 동안 mTOR 활성을 억제하는 작용제, 예컨대, 섹션 Ⅱ에 기술된 작용제에 인큐베이션, 접촉 및/또는 노출되지 않는다.
특정 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 mTOR 활성을 억제하는 작용제, 예컨대, 섹션 Ⅱ에 기재된 작용제의 존재 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 모든 배양 및/또는 전체 인큐베이션은 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 수행된다.
특정 구현예에서, 세포는 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 자극제와 함께 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 섹션 Ⅱ에 기재된 작용제이다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 또한 추가 키나아제(kinase)의 활성을 억제한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 또한 포스포이노시톨-3 키나아제(phosphoinositiol-3 kinase)(PI3K) 활성을 억제한다. 특정 구현예에서, 작용제는 mTOR 활성을 억제하기에 충분한 농도에서 mTOR 활성을 선택적으로 억제, 예컨대, PI3K 활성을 검출 가능하게 억제하지 않거나, 및/또는 PI3K 활성을 mTOR 활성과 동일한 정도로 억제하지 않는다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 키나아제(kinase) 활성을 억제한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 및/또는 mTORC2 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 및 mTORC2 활성을 억제한다.
일부 구현예에서, 작용제는 PI-103, SF1126, BGT226, XL765, PF-04691502, NVP-BEZ235, 피라졸로피리미딘(pyrazolopyrimidine), 토린 1(Torin l), 토르키닙(Torkinib) (PP242), PP30, Ku-0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth), AZD8055, 라파마이신 (sirolimus), 템시로리무스 (CC1779), 에베로리무스 (RAD001), 데포로리무스(AP23573), AZD8055 (AstraZeneca), 및 OSI-027 (OSI)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 섹션 Ⅱ에 제공된 화학식, 예컨대, 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3을 포함하거나 포함한다. 일부 구현예에서, 작용제는 화합물 155, 화합물 246 또는 화합물 63이다.
특정 구현예에서, 세포는 mTOR 활성을 억제, 감소(reduces) 및/또는 감소(decreases)시키는 농도의 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mTOR의 하나 이상의 활성을 억제, 감소(reduces) 및/또는 감소(decreases)시키는 농도는 약 또는 적어도 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 또는 99.9%이다. 일부 구현예에서, 작용제의 농도는 1 차 T 세포의 증식 및/또는 팽창을 방지하지 못한다. 일부 구현예에서, 세포는 1nM 내지 1μM, 1nM 내지 100nM, 50nM 내지 200nM, 100nM 내지 250nM, 200nM 내지 500nM, 500nM 내지 1μM, 1μM 내지 10 μM, 또는 5 μM 내지 50 μM의 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에서 인큐베이션한다. 특정 구현예에서, 세포는 약 또는 적어도 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM, 또는 100 μM의 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 세포는 화합물 155의 존재 하에 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 1 nM 내지 1 μM, 1 nM 내지 100 nM, 50 nM 내지 200 nM, 100 nM 내지 250 nM, 200 nM 내지 500 nM의 화합물 155 존재 하에 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 또는 적어도 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 또는 500 nM의 화합물 155 존재 하에 인큐베이션된다.
특정 구현예에서, 세포는 화합물 246의 존재 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 1 nM 내지 1 μM, 1 nM 내지 100 nM, 50 nM 내지 200 nM, 100 nM 내지 250 nM, 또는 200 nM 내지 500 nM의 화합물 155의 존재 하에서 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 약 또는 적어도 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 또는 500 nM의 화합물 246의 존재 하에 인큐베이션된다.
특정 구현예에서, 세포는 화합물 63의 존재 하에서 인큐베이션양된다. 특정 구현예에서, 세포는 1 nM 내지 1 μM, 1 nM 내지 100 nM, 50 nM 내지 200 nM, 100 nM 내지 250 nM, 또는 200 nM 내지 500 nM 의 화합물 63의 존재 하에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 약 또는 적어도 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM 또는 500 nM의 화합물 63의 존재 하에서 인큐베이션된다.
일부 구현예에서, 조성물 또는 세포는 자극 조건 또는 자극 시약의 존재 하에서 인큐베이션된다. 이러한 조건은 집단에서 세포의 증식, 확장, 활성화 및/또는 생존을 유도하고, 항원 노출을 모방하고, 및/또는 유전자 조작을 위해 세포를 프라이밍하도록 설계된 조건, 예컨대, 재조합 항원 수용체의 도입을 포함한다. 예시적인 자극 시약이 아래에 기재되어있다.
일부 구현예에서, 자극 및/또는 활성화 조건은, 특정 배지(media), 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 작용제, 예컨대, 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대, 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체 및 세포를 활성화시키도록 설계된 임의의 다른 작용제 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 측면에서, 인큐베이션은 미국 특허 번호 6,040,177 내지 Riddell et al., Klebanoff et al.(2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82, 및/또는 Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701에 기술된 것과 같은 기술에 따라 수행된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 자극 조건 또는 자극 시약이 존재하는 경우의 인큐베이션의 적어도 일부는, 예컨대, 국제 공개 번호 WO2016/073602에 기술된 것과 같은 원심 회전 하에 원심 챔버의 내부 공동(cavity)에서 수행된다. 일부 구현예에서, 원심 챔버에서 수행되는 인큐베이션의 적어도 일부는 자극 및/또는 활성화를 유도하기 위해 시약 또는 시약들과 혼합하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 선택된 세포와 같은 세포는 원심 챔버에서 자극 조건 또는 자극 시약과 혼합된다. 이러한 과정의 일부 측면에서, 다량의 세포는, 세포 배양 플레이트(plate) 또는 다른 시스템에서 유사한 자극을 수행될 때 일반적으로 사용되는 것보다 훨씬 적은 양의 하나 이상의 자극 조건 또는 작용제와 혼합된다.
일부 구현예에서, 원심 챔버에서 혼합하지 않고 선택하는 경우 자극제는 실질적으로, 동일한 수 또는 동일한 부피의 세포의 선택의 대략 동일하거나 유사한 선택 효율을 달성하는데 필요한 자극제의 양과 비교하여 더 적은 양(예컨대, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70% 또는 80% 이하의 양)으로 챔버의 공동 내의 세포에 첨가되며, 예컨대, 주기적으로 흔들거나 회전하는 튜브 또는 백에 넣는다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은, 예컨대, 10 mL 내지 200 mL, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 또는 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 60 mL, 70 mL, 80 mL, 90 mL, 100 mL, 150 mL 또는 200 mL의 시약의 인큐베이션으로 표적 부피를 달성하기 위해, 세포 및 자극 시약에 인큐베이션 완충제를 첨가하여 수행된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 완충제 및 자극 시약은 세포에 첨가하기 전에 예비 혼합된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션 완충제 및 자극 시약은 세포에 별도로 첨가된다. 일부 구현예에서, 자극 인큐베이션은 주기적으로 온화한 혼합 조건으로 수행되며, 이는 에너지적으로 선호되는 상호 작용을 촉진시켜 세포의 자극 및 활성화를 달성하면서, 전반적으로 자극 시약을 덜 사용할 수 있다.
일부 구현예에서, 인큐베이션은 혼합 조건, 예컨대, 일반적으로 비교적 낮은 힘 또는 속도에서의 스피닝(spinning)의 존재 하에서, 예컨대, 세포를 펠렛(pellet)화하기 위해 사용된 것보다 낮은 속도에서, 예컨대, 약 600rpm 내지 1700rpm(예컨대, 600rpm 또는 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm 또는 약 또는 적어도 600rpm 또는 1000rpm 또는 1500rpm 또는 1700rpm)에서, 약 80g 내지 100g(예컨대, 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g 또는 약 또는 적어도 80g, 85g, 90g, 95g 또는 100g)의 챔버의 샘플 또는 벽(wall) 또는 다른 용기의 RCF에서, 일반적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 스핀(spin)은, 이러한 저속에서 스핀의 반복된 간격에 이어서, 1초, 2초, 3초, 4초, 5초, 6초, 7초, 8초, 9초 또는 10초에 대한 스핀 및/또는 휴식과 같은 휴식 기간을 사용하여 수행되며, 예컨대, 약 1초 또는 2초 회전 후 약 5초, 6초, 7초 또는 8초 동안 휴식하는 것과 같다.
일부 구현예에서, 예컨대, 자극제와 함께하는, 인큐베이션의 총 지속 시간은, 1시간 내지 96시간, 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간, 또는 12시간 내지 24시간 사이 또는 약 1시간 내지 96시간, 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간, 또는 12시간 내지 24시간 사이, 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간 또는 72시간이다. 일부 구현예에서, 추가 인큐베이션은 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간 사이 또는 약 1시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 8시간 내지 30시간 또는 12시간 내지 24시간 사이 시간 동안이다.
특정 구현예에서, 자극 조건은 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 및/또는 농축된 T세포의 조성물을 인큐베이션, 배양(culturing 및/또는 cultivating)하는 것을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 T세포에 의해 발현되고/되거나 내인성(endogenous) 수용체에 결합하고/하거나 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-헬릭스(4-alpha-helix bundle) 다발 패밀리의 구성원이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인의 4- 알파-헬릭스4-알파-헬릭스(4-alpha-helix bundle) 다발 패밀리의 구성원은 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨-9(IL-9), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 15(IL-15), 과립구 콜로니-자극 인자(G-CSF) 및 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 상기 자극은 예컨대, 형질도입(transduction) 전에 세포의 활성화 및/또는 증식을 초래한다.
1. 자극 시약
일부 구현예에서, 자극 조건 하에서 세포의 조성물, 예컨대, 입력 세포를 인큐베이션하는 것은, 농축된 세포의 조성물을 T 세포를 활성화 및/또는 팽창시킬 수 있는 자극 시약과 인큐베이션 및/또는 접촉시키는 것이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 세포에서 하나 이상의 신호를 자극 및/또는 활성화시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 신호는 수용체에 의해 매개된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 신호는, 신호 전달의 변화 및/또는 이차 메신저의 수준 또는 양, 예컨대, cAMP 및/또는 세포내 칼슘, 양의 변화, 세포 위치, 확인(confirmation), 하나 이상의 세포 단백질의 인산화, 유비퀴틴화(ubiquitination) 및/또는 절단(truncation) 및/또는 세포 활성의 변화, 예컨대, 전사, 번역, 단백질 분해, 세포 형태, 활성화 상태 및/또는 세포 분열이거나 이와 관련 있다. 특정 구현예에서, 자극 시약은, TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인 및/또는 하나 이상의 공동 자극(costimulatory) 분자의 하나 이상의 세포내 신호 전달 도메인을 활성화 및/또는 활성화시킬 수 있다.
특정 구현예에서, 자극 시약은 세포, 예컨대, T 세포를 활성화 및/또는 팽창시킬 수 있는 하나 이상의 작용제와 컨쥬게이트 또는 연결된 입자, 예컨대, 생체 분자, 예컨대, 비드를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 작용제는 비드에 결합된다. 일부 구현예에서, 비드는 생체 적합성(biocompatible), 즉 생물학적 용도에 적합한 물질로 구성된다. 일부 구현예에서, 비드는 배양된 세포, 예컨대, 배양된 T 세포에 비독성이다. 일부 구현예에서, 비드는 작용제와 세포 사이의 상호 작용을 허용하는 방식으로 작용제를 부착할 수 있는 임의의 입자일 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 시약은 비드, 예컨대, 비드의 표면에 결합되거나 달리 부착된 세포, 예컨대, T 세포를 활성화 및/또는 팽창시킬 수 있는 하나 이상의 작용제를 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 비-세포 입자이다. 특정 구현예에서, 비드는 콜로이드 입자(colloidal particle), 마이크로스피어(microsphere), 나노 입자, 자기 비드(magnetic bead) 등을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 비드는 아가로오스(agarose) 비드이다. 특정 구현예에서, 비드는 세파로오스(sepharose) 비드이다.
특정 구현예에서, 자극 시약은 단일 분산(monodisperse)된 비드를 포함한다. 특정 구현예에서, 단일 분산(monodisperse)된 비드는 서로 5% 미만의 직경 표준 편차를 갖는 크기 분산액을 포함한다.
일부 구현예에서, 비드는 하나 이상의 작용제, 예컨대, 비드의 표면에 (직접적으로 또는 간접적으로) 커플링, 컨쥬게이션(conjugated) 또는 연결되는 작용제를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 고려되는 작용제는 RNA, DNA, 단백질(예컨대, 효소), 항원, 폴리클로날(polyclonal) 항체, 모노클로날(monoclonal) 항체, 항체 단편, 탄수화물, 지질, 렉틴(lectins) 또는 원하는 표적에 대한 친화력을 갖는 임의의 다른 생체 분자를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 원하는 표적은 T 세포 수용체 및/또는 T 세포 수용체의 성분이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은 CD3이다. 특정 구현예에서, 원하는 표적은, T 세포 공동 자극(costimulatory) 분자, 예컨대, CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS이다. 하나 이상의 작용제는 당업계에 공지되고 이용 가능한 다양한 방법에 의해 비드에 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있다. 상기 부착은 공유, 비공유, 정전기(electrostatic) 또는 소수성(hydrophobic)일 수 있으며, 예컨대, 화학적 수단, 기계적 수단 또는 효소적 수단을 포함하는 다양한 부착 수단에 의해 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, 생체 분자(예컨대, 비오티닐화(biotinylated)된 항-CD3 항체)는 비드에 직접 부착된 다른 생체 분자(예컨대, 항-비오틴(anti-biotin) 항체)를 통해 비드에 간접적으로 부착될 수 있다.
일부 구현예에서, 자극 시약은, 비드 및 세포 표면의 거대 분자와 직접 상호 작용하는 하나 이상의 작용제를 포함한다. 특정 구현예에서, 비드(예컨대, 상자성 비드)는 세포상의 하나 이상의 거대 분자(예컨대, 하나 이상의 세포 표면 단백질)에 특이적인 하나 이상의 작용제(예컨대, 항체)를 통해 세포와 상호 작용한다. 특정 구현예에서, 비드(예컨대, 상자성 비드)는 본원에 기재된 제1 작용제, 예컨대, 1차 항체(예컨대, 항-비오틴 항체) 또는 다른 생체 분자로 표지된 다음, 제2 작용제, 예컨대, 2차 항체(예컨대, 비오티닐화된(biotinylated) 항-CD3 항체) 또는 다른 제2 생체 분자(예컨대, 스트렙타비딘(streptavidin))가 첨가됨으로써, 2차 항체 또는 다른 제2 생체 분자는 입자의 1차 항체 또는 다른 생체 분자와 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 자극 시약은, 비드(예컨대, 상자성 비드)에 부착되고, 세포상의 하나 이상의 하기 거대 분자(예컨대, T 세포): CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD25, CD27, CD28, CD29, CD31, CD44, CD45RA, CD45RO, CD54 (ICAM-1), CD127, MHCI, MHCII, CTLA-4, ICOS, PD-1, OX40, CD27L (CD70), 4-1BB (CD137), 4-1BBL, CD30L, LIGHT, IL-2R, IL-12R, IL-1R, IL-15R; IFN-gammaR, TNF-alphaR, IL-4R, IL- 10R, CD18/CDl la (LFA-1), CD62L (L-selectin), CD29/CD49d (VLA-4), Notch ligand (e.g. Delta-like 1/4, Jagged 1/2, etc.), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, 및 CXCR3 또는 이들 거대 분자 또는 이의 단편에 상응하는 리간드를 포함하는 이의 단편에 특이적으로 결합하는, 하나 이상의 작용제(예컨대, 항체)를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드에 부착된 작용제(예컨대, 항체)는 세포(예컨대, T 세포)에서 하나 이상의 하기 거대 분자: CD28, CD62L, CCR7, CD27, CD127, CD3, CD4, CD8, CD45RA, 및/또는 CD45RO 에 특이적으로 결합한다.
일부 구현예에서, 비드에 부착된 하나 이상의 작용제는 항체이다. 상기 항체는 폴리클로날(polyclonal) 항체, 모노클로날(monoclonal) 항체 (면역 글로불린 Fc 영역을 갖는 전장(full length) 항체 포함), 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 다중 특이적 항체 (예컨대, 이중 특이적 항체, 디아바디(diabodies) 및 단일-체인 분자뿐만 아니라 항체 단편(예컨대, Fab, F (ab') 2 및 Fv))를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항체 단편(항원-결합 단편 포함), 예컨대, Fab, Fab'-SH, Fv, scFv 또는 (Fab') 2 단편이다. IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 불변 영역을 포함하여 임의의 아이소타입(isotype)의 불변 영역이 본원에서 고려되는 항체에 사용될 수 있으며, 이러한 불변 영역은 임의의 인간 또는 동물 종 (예컨대, 쥐과 종)으로부터 수득될 수 있음을 이해할 것이다. 일부 구현예에서, 작용제는 T 세포 수용체의 하나 이상의 성분에 결합하고/하거나 이를 인식하는 항체이다. 특정 구현예에서, 작용제는 항-CD3 항체이다. 특정 구현예에서, 작용제는 공동-수용체(co-receptor)에 결합하고/하거나 이를 인식하는 항체이다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드는 약 0.001㎛ 초과, 약 0.01㎛ 초과, 약 0.1㎛ 초과, 약 1.0㎛ 초과, 약 10㎛ 초과, 약 50㎛ 초과, 약 100 ㎛ 초과, 또는 약 1000㎛ 초과 및 약 1500㎛ 이하의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 1.0㎛ 내지 약 500㎛, 약 1.0㎛ 내지 약 150㎛, 약 1.0㎛ 내지 약 30㎛, 약 1.0㎛ 내지 약 10㎛, 약 1.0㎛ 내지 약 5.0㎛, 약 2.0㎛ 내지 약 5.0㎛, 또는 약 3.0㎛ 내지 약 5.0㎛의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 3㎛ 내지 약 5㎛의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 적어도 또는 적어도 약 또는 약 0.001㎛, 0.01㎛, 0.1㎛, 0.5 ㎛, 1.0㎛, 1.5㎛, 2.0㎛, 2.5㎛, 3.0㎛, 3.5㎛, 4.0㎛, 4.5 ㎛, 5.0㎛, 5.5㎛, 6.0㎛, 6.5㎛, 7.0㎛, 7.5㎛, 8.0㎛, 8.5㎛, 9.0㎛, 9.5㎛, 10㎛, 12㎛, 14㎛, 16㎛, 18㎛ 또는 20㎛의 직경을 갖는다. 특정 구현예에서, 비드는 직경이 4.5㎛ 또는 약 4.5㎛이다. 특정 구현예에서, 비드는 직경이 2.8㎛ 또는 약 2.8㎛이다.
일부 구현예에서, 비드는 0.001 g/㎤ 초과, 0.01 g/㎤ 초과, 0.05 g/㎤ 초과, 0.1 g/㎤ 초과, 0.5 g/㎤ 초과, 0.6 g/㎤ 초과, 0.7 g/㎤ 초과, 0.8 g/㎤ 초과, 0.9 g/㎤ 초과, 1 g/㎤ 초과, 1.1 g/㎤ 초과, 1.2 g/㎤ 초과, 1.3 초과 g/㎤, 1.4 g/㎤ 초과, 1.5 g/㎤ 초과, 2 g/㎤ 초과, 3 g/㎤ 초과, 4 g/㎤ 초과, 또는 5g/㎤ 초과의 밀도를 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 0.001g/㎤ 내지 약 100g/㎤, 약 0.01g/㎤ 내지 약 50g/㎤, 약 0.1g/㎤ 내지 약 10 g/㎤, 약 0.1g/㎤ 내지 약 .5 g/㎤, 약 0.5 g/㎤ 내지 약 1 g/㎤, 약 0.5 g/㎤ 내지 약1.5 g/㎤, 약 1g/㎤ 내지 약 1.5g/㎤, 약 1g/㎤ 내지 약 2g/㎤, 또는 약 1g/㎤ 내지 약 5g/㎤의 밀도를 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 0.5g/㎤, 약 0.6g/㎤, 약 0.7g/㎤, 약 0.8g/㎤, 약 0.9g/㎤, 약 1.0g/㎤, 약 1.1g/㎤, 약 1.2g/㎤, 약 1.3g/㎤, 약 1.4g/㎤, 약 1.5g/㎤, 약 1.6g/㎤, 약 1.7g/㎤, 약 1.8g/㎤, 약 1.9g/㎤, 또는 약 2.0 g/㎤의 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 비드는 약 1.6 g/㎤의 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 비드 또는 입자는 약 1.5 g/㎤의 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 입자는 약 1.3 g/㎤의 밀도를 갖는다.
특정 구현예에서, 복수의 비드는 균일한 밀도를 갖는다. 특정 구현예에서, 균일한 밀도는 평균 비드 밀도의 10 % 미만, 5 % 미만 또는 1 % 미만의 밀도 표준 편차를 포함한다.
일부 구현예에서, 비드는 약 0.001 ㎡ 당 각 입자의 그램(㎡/g) 약 1,000 ㎡/g 까지, 약 010㎡/g 내지 약 100㎡/g, 약 0.1 ㎡/g 내지 약 10㎡/g, 약 0.1㎡/g 내지 약 1㎡/g, 약 1㎡/g 내지 약 10㎡/g, 약 10㎡/g 내지 약 100㎡/g, 약 0.5㎡/g 내지 약 20㎡/g, 약 0.5㎡/g 내지 약 5㎡/g, 또는 약 1㎡/g 내지 약 4㎡/g의 표면적을 갖는다. 일부 구현예에서, 입자 또는 비드는 약 1㎡/g 내지 약 4㎡/g의 표면적을 갖는다.
일부 구현예에서, 비드는 작용제에 결합, 연결 또는 컨쥬게이트될 수 있는 비드 표면에 또는 근처에 하나 이상의 물질을 함유한다. 일부 구현예에서, 비드는 표면 작용기화(functionalized), 즉 결합 분자, 예컨대, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 공유 결합을 형성할 수 있는 작용기를 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 표면-노출된 카르복실(carboxyl), 아미노(amino), 히드록실(hydroxyl), 토실(tosyl), 에폭시(epoxy) 및/또는 클로로메틸(chloromethyl)기를 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 표면 노출된 아가로오스(agarose) 및/또는 세파로오스(sepharose)를 포함한다. 특정 구현예에서, 비드 표면은 결합 분자에 결합하거나 부착할 수 있는 부착된 자극 시약을 포함한다. 특정 구현예에서, 생체 분자는 폴리펩타이드(polypeptides)이다. 일부 구현예에서, 비드는 표면 노출 단백질 A, 단백질 G 또는 비오틴(biotin)을 포함한다.
일부 구현예에서, 비드는 자기장에서 반응한다. 일부 구현예에서, 비드는 자기(magnetic) 비드이다. 일부 구현예에서, 자기(magnetic) 비드는 상자성이다. 특정 구현예에서, 자기(magnetic) 비드는 초상자성(superparamagnetic)이다. 특정 구현예에서, 비드는 이들이 자기장에 노출되지 않는 한 어떠한 자기 특성도 나타내지 않는다.
특정 구현예에서, 비드는 자기(magnetic) 코어, 상자성 코어 또는 초상 자성(superparamagnetic) 코어를 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 코어는 금속을 함유한다. 일부 구현예에서, 금속은 철, 니켈, 구리, 코발트, 가돌리늄(gadolinium), 망간, 탄탈륨 tantalum), 아연, 지르코늄 또는 이들의 임의의 조합일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정 구현예에서, 자기 코어는 금속 산화물 (예컨대, 산화철), 페라이트(ferrites) (예컨대, 망간 페라이트(manganese ferrites), 코발트 페라이트(cobalt ferrites), 니켈 페라이트(nickel ferrites) 등), 적철광(hematite) 및 금속 합금 (예컨대, CoTaZn)을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 코어는 페라이트, 금속, 금속 합금, 산화철 또는 이산화 크롬(chromium dioxide) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 코어는 철 원소(elemental iron) 또는 이의 화합물을 포함한다. 일부 구현예에서, 자기 코어는 마그네타이트(magnetite)(Fe3O4), 마그헤마이트(maghemite)(γFe2O3) 또는 그레이그라이트(greigite) (Fe3S4) 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 내부 코어는 산화철 (예컨대, Fe3O4)을 포함한다.
특정 구현예에서, 비드는 표면 기능화된 코트 또는 코팅으로 덮인 자기, 상자성 및/또는 초상 자성 코어를 포함한다. 일부 구현예에서, 코트는 중합체(polymer), 다당류(polysaccharide), 실리카, 지방산, 단백질, 탄소, 아가로스(agarose), 세파로오스(sepharose) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는 물질을 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 중합체(polymer)는 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 폴리(락트-코-글리콜산(lactic-co-glycolic acid)), 폴리 글루타르알데히드(polyglutaraldehyde), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리스티렌(polystyrene) 또는 폴리비닐 알코올(polyvinyl alcohol) 일 수 있다. 특정 구현예에서, 외부 코트 또는 코팅은 폴리스티렌(polystyrene)을 포함한다. 특정 구현예에서, 외부 코팅은 표면 기능화(functionalized)된다.
일부 구현예에서, 자극 시약은 금속 산화물 코어(예컨대, 산화철 코어) 및 코트를 포함하는 비드를 포함하고, 여기서 금속 산화물 코어는 하나 이상의 다당류(예컨대, 덱스 트란)를 포함하고, 여기서 코트는 하나 이상의 다당류(예컨대, 아미노 덱스트란), 하나 이상의 중합체(예컨대, 폴리 우레탄) 및 실리카를 포함한다. 일부 구현예에서, 금속 산화물 코어는 콜로이드성(colloidal) 산화철 코어이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 작용제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 작용제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-CD3 항체, 항-CD28 항체 및 항-비오틴 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 자극 시약은 항-비오틴(anti-biotin) 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 비드는 약 3㎛ 내지 약 10㎛의 직경을 갖는다. 일부 구현예에서, 비드는 약 3㎛ 내지 약 5㎛의 직경을 갖는다. 특정 구현예에서, 비드는 약 3.5㎛의 직경을 갖는다.
일부 구현예에서, 자극 시약은 금속 산화물 코어(예컨대, 산화철 내부 코어) 및 코트(예컨대, 보호 코트)를 포함하는 비드에 부착된 하나 이상의 시약을 포함하고, 여기서 코트는 폴리스티렌을 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 상자성(예컨대, 초상자성(superparamagnetic)) 철 코어, 예컨대, 마그네타이트 (Fe3O4) 및/또는 마그헤마이트(maghemite)(γFe2O3)c를 포함하는 코어 및 폴리스티렌(polystyrene) 코트 또는 코팅을 포함하는 단분산성(monodisperse), 상자성(paramagnetic) (예컨대, 초상 자성(superparamagnetic)) 비드이다. 일부 구현예에서, 비드는 비-다공성(non-porous)이다. 일부 구현예에서, 비드는 하나 이상의 작용제가 부착된 작용화된(functionalized) 표면을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 작용제는 표면에서 비드에 공유 결합된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 작용제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 작용제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 작용제는 항-CD3 항체 및/또는 항-CD28 항체, 및 표지된 항체 (예컨대, 비오티닐화(biotinylated) 항체), 예컨대, 표지된 항-CD3 또는 항-CD28 항체에 결합할 수 있는 항체 또는 그의 항원 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 비드는 약 1.5g/㎤의 밀도 및 약 1 ㎡/g 내지 약 4 ㎡/g 의 표면적을 갖는다. 특정 구현예에서; 비드는 직경이 약 4.5㎛이고 밀도가 약 1.5g/㎤인 단분산성(monodisperse) 초상자성(superparamagnetic) 비드이다. 일부 구현예에서, 비드 비드는 평균 직경이 약 2.8㎛이고 밀도가 약 1.3g/㎤인 단분산성(monodisperse) 초상자성(superparamagnetic) 비드이다.
C. 세포의 조작
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 T 세포의 하나 이상의 조성물을 조작하는 것과 관련하여 사용된다. 특정 구현예에서, 조작은 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide), 예컨대, 재조합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)의 도입이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 재조합 단백질은 섹션 Ⅱ에 기재된 것과 같은 재조합 수용체이다. 세포에서 재조합 단백질, 예컨대, 재조합 수용체를 암호화하는 핵산 분자의 도입은 다수의 공지된 벡터 중 임의의 것을 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 벡터에는 렌티바이러스(lentiviral) 및 감마레트로바이러스(gammaretroviral) 시스템을 비롯한 바이러스 및 비바이러스 시스템뿐만 아니라 PiggyBac 또는 Sleeping Beauty-기반 유전자 전달 시스템과 같은 전이인자(transposon)-기반 시스템이 포함된다. 예시적인 방법은 바이러스, 예컨대, 레트로바이러스(retroviral) 또는 렌티바이러스(lentiviral)를 통한 수용체를 암호화하는 핵산의 전달, 형질도입, 전이인자(transposons) 및 전기천공법(electroporation)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조작은 농축된 T 세포의 하나 이상의 조작된 조성물을 생성한다.
특정 구현예에서, T 세포의 하나 이상의 조성물은, 예컨대, 섹션 I-D에 제공된 방법에 의해, 예컨대, 증식 및/또는 팽창을 촉진하는 조건 하에서 세포를 배양하기 전에 조작, 예컨대, 형질도입 또는 형질감염된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 농축된 T 세포의 조성물은 하나 이상의 조성물이 자극 조건 하에서 자극, 활성화 및/또는 인큐베이션된 후에 조작된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 조성물은 자극된 조성물이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 자극된 조성물은 이전에 동결건조(cryofrozen)되고 저장되고, 조작 전에 해동된다.
특정 구현예에서, 자극된 T 세포의 하나 이상의 조성물은 농축된 T 세포의 2개의 별개의 자극된 조성물이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 2개의 분리된 조성물, 예컨대, 동일한 생물학적 샘플로부터 선택, 분리 및/또는 농축된, 농축된 T 세포의 2개의 분리된 조성물은 별도로 조작된다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 2개의 별개의 조성물은 농축된 CD8+ T 세포의 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 2 개의 별개의 조성물은 유전적으로 별도로 조작된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 단일 조성물은 유전자 조작된다. 특정 구현예에서, 단일 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 조성물이다. 일부 구현예에서, 단일 조성물은 조작 전에 별도의 조성물로부터 조합된, 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 조성물이다.
일부 구현예에서, 조작, 예컨대, 형질도입(transduced) 또는 형질감염(transfected)된, 농축된 CD4+ T 세포의 조성물은 적어도 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상, 또는 100% 또는 약 100%의 CD4+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된, 농축된 CD4+ T 세포의 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/하거나 CD8+ T 세포를 포함하지 않으며/거나 CD8+ T 세포가 없거나 또는 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 조작, 예컨대, 형질도입(transduced) 또는 형질감염(transfected)된 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상, 99.9% 이상, 또는 100% 또는 약 100%의 CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건 하에서 인큐베이션된 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01 % 미만의 CD4+ T 세포를 포함하고/하거나 CD4+ T 세포를 포함하지 않으며 /거나 CD4 + T 세포가 없거나 또는 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 별도 조성물은 단일 조성물로 조합되고, 유전자 조작, 예컨대, 형질도입(transduced) 또는 형질감염(transfected)된다. 특정 구현예에서, 유전자 조작이 수행 및/또는 완료된 후, 농축된 CD4+ 및 농축된 CD8+ T 세포의 개별 조작된 조성물이 단일 조성물로 조합된다.
일부 구현예에서, 유전자 전이는, 예컨대, 사이토카인 또는 활성화 마커의 발현에 의해 측정된 바와 같이 증식, 생존 및/또는 활성화와 같은 반응을 유도하는 자극과 조합하는 것과 같이, 세포를 먼저 자극하고, 이어서 활성화된 세포의 형질도입, 및 임상 적용에 충분한 수의 배양으로의 팽창함으로써 달성된다. 특정 구현예에서, 유전자 전이(gene transfer)는 자극 조건 하에서, 예컨대, I-B 섹션에 기재된 임의의 방법에 의해 세포를 먼저 인큐베이션함으로써 달성된다.
일부 구현예에서, 유전자 조작 방법은, 조성물의 하나 이상의 세포를, 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 예컨대, 재조합 수용체와 접촉함으로써 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 접촉은 원심 분리, 예컨대, 스피노큘레이션(pinoculation)(예컨대, 원심 접종(centrifugal inoculation))으로 수행될 수 있다. 이러한 방법은 국제 공개 번호 WO2016/073602에 기재된 바와 같은 방법을 포함한다. 예시적인 원심 챔버는, A-200/F 및 A-200 원심 챔버 및 그러한 시스템과 함께 사용하기위한 다양한 키트를 포함하여 Sepax® 및 Sepax®2 시스템과 함께 사용하기위한 것을 포함하여 Biosafe SA에 의해 생산되고 판매되는 것들을 포함한다. 예시적인 챔버, 시스템 및 처리기구 및 캐비닛은 예컨대, 미국 특허 번호 6,123,655호, 미국 특허 번호 6,733,433 및 공개된 미국 특허 출원, 공개 번호 US 2008/0171951 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/38762, 공개에 기재되어있으며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 이러한 시스템과 함께 사용하기위한 예시적인 키트는 BioSafe SA에 의해 판매되는 일회용 키트인 제품명 CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 또는 CS-900.2를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 세포는 조작 이전 및/또는 도중에, 본원, 예컨대, 섹션 Ⅱ에 기재된 작용제와 같은 mTOR 활성을 억제하는 작용제에 인큐베이션, 접촉 및/또는 노출되지 않는다.
특정 구현예에서, 조작의 적어도 일부는 mTOR 활성을 억제하는 작용제, 예컨대, 본원에 기재된 작용제, 예컨대, 섹션 Ⅱ에 기재된 작용제의 존재 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 모든 및/또는 조작 단계는 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 수행된다.
특정 구현예에서, 상기 세포는 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 조작, 예컨대, 형질도입(transduced) 또는 형질감염(transfected)된다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 본원, 예컨대, 섹션 Ⅱ에 기재된, 화합물 63와 같은 작용제이다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 또한 추가 키나아제(kinase)의 활성을 억제한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 또한, 포스포이노시톨-3 키나아제(phosphoinositiol-3 kinase) (PI3K) 활성을 억제한다. 특정 구현예에서, 작용제는 mTOR 활성을 억제하기에 충분한 농도에서 mTOR 활성을 선택적으로 억제, 예컨대, PI3K 활성을 측정 가능하게 억제하지 않으며/거나 mTOR 활성과 동일한 정도로 PI3K 활성을 억제하지 않는다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 키나아제(kinase) 활성을 억제한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 및/또는 mTORC2 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 및 mTORC2 활성을 억제한다.
일부 구현예에서, 작용제는 PI-103, SF1126, BGT226, XL765, PF-04691502, NVP-BEZ235, 피라졸로피리미딘(pyrazolopyrimidine), 토린 1(Torin l), 토르키닙(Torkinib) (PP242), PP30, Ku-0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth), AZD8055, 라파마이신 (sirolimus), 템시로리무스 (CC1779), 에베로리무스 (RAD001), 데포로리무스(AP23573), AZD8055 (AstraZeneca), 및 OSI-027 (OSI)를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 섹션 Ⅱ에 제공된 화학식, 예컨대, 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3을 함유하거나 포함한다. 일부 구현예에서, 작용제는 화합물 155, 화합물 246 또는 화합물 63이다. 일부 구현예에서, 작용제는 화합물 63이다.
특정 구현예에서, 상기 세포는 mTOR 활성을 억제, 감축(reduces) 및/또는 감소(decreases)시키는 농도의 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 조작된다. 일부 구현예에서, 농도는 mTOR의 하나 이상의 활성을 약 또는 적어도 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9%만큼 억제, 감축(reduced) 및/또는 감소(decreases)시킨다. 일부 구현예에서, 작용제의 농도는 1 차 T 세포의 증식 및/또는 팽창을 방지하지 못한다. 일부 구현예에서, 상기 세포는, 1nM 내지 1 μM, 1nM 내지 100nM, 50nM 내지 200nM, 100nM 내지 250nM, 200nM 내지 500nM, 500nM 내지 1 μM, 1 μM 내지 10 μM, 또는 5 μM 내지 50 μM 의 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 조작된다. 특정 구현예에서, 세포는 0.1nM, 0.5nM, 1nM, 5nM, 10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM, 500nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM 또는 100 μM, 약 또는 적어도 0.1nM, 0.5nM, 1nM, 5nM, 10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM, 500nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM 또는 100 μM의 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 조작된다.
일부 구현예에서, 세포는 화합물 155의 존재 하에 조작된다. 특정 구현예에서, 세포는 1nM 내지 1 μM, 1nM 내지 100nM, 50nM 내지 200nM, 100nM 내지 250nM, 또는 200nM 내지 500nM의 화합물 155의 존재 하에 조작된다. 특정 구현예에서, 세포는 10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM 또는 500nM, 약 또는 적어도 10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM 또는 500nM의 화합물 155의 존재 하에 조작된다.
특정 구현예에서, 세포는 화합물 246의 존재 하에 조작된다. 특정 구현예에서, 세포는 1nM 내지 1 μM, 1nM 내지 100nM, 50nM 내지 200nM, 100nM 내지 250nM, 또는 200nM 내지 500nM의 화합물 155 존재 하에 조작된다. 특정 구현예에서, 세포는 10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM 또는 500nM, 약 또는 적어도 10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM 또는 500nM의 화합물 246의 존재 하에 조작된다.
특정 구현예에서, 세포는 화합물 63의 존재 하에 조작된다. 특정 구현예에서, 세포는 1nM 내지 1 μM, 1nM 내지 100nM, 50nM 내지 200nM, 100nM 내지 250nM, 또는 200nM 내지 500nM의 화합물 63의 존재 하에 조작된다. 일부 구현예에서, 세포는 10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM 또는 500nM, 약 또는 적어도 10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM 또는 500nM의 화합물 63의 존재 하에 조작된다.
일부 구현예에서, 접촉은 원심 분리, 예컨대, 회전식 접종(spinoculation) (예컨대, 원심 접종(centrifugal inoculation))으로 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포, 바이러스 입자 및 시약을 함유하는 조성물은 일반적으로 약 600rpm 내지 1700rpm (예컨대, 600rpm, 1000rpm, 또는 1500rpm 또는 1700rpm 또는 약 또는 적어도 600rpm, 1000rpm, 또는 1500rpm 또는 1700rpm)으로 세포를 펠렛(pellet)화하기 위해 사용된 것보다 낮은 속도와 같은 비교적 낮은 힘 또는 속도로 회전될 수 있다. 일부 구현예에서, 회전은, 예컨대, 챔버 또는 캐비티의 내부 또는 외부 벽에서 측정될 때 약 100g 내지 3200g(예컨대, 100 g, 200 g, 300 g, 400g, 500g, 1000g, 1500g, 2000g, 2500g, 3000g 또는 3200g 또는 약 또는 적어도 100 g, 200 g, 300 g, 400g, 500g, 1000g, 1500g, 2000g, 2500g, 3000g 또는 3200g)의 힘, 예컨대, 상대 원심력으로 수행된다. "상대 원심력(relative centrifugal force)"또는 RCF라는 용어는 일반적으로, 회전축과 비교하여 공간의 특정 지점에서 지구의 중력과 관련하여, 물체 또는 물질 (예컨대, 세포, 샘플 또는 펠렛(pellet) 및/또는 챔버 또는 다른 용기의 회전 점)에 부여된 유효 힘으로 이해된다. 이 값은 중력, 회전 속도 및 회전 반경(회전축과 물체, 물질 또는 RCF가 측정되는 입자로부터의 거리)을 고려하여 공지된 공식을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 도입(introducing)은 조성물의 하나 이상의 세포를 재조합 단백질을 암호화하는 핵산 분자, 예컨대, 재조합 수용체와 접촉시킴으로써 수행된다. 일부 구현예에서, 접촉은 원심 분리, 예컨대, 회전식 접종(spinoculation)(예컨대, 원심 접종(centrifugal inoculation))으로 수행될 수 있다. 이러한 방법은 국제 공개 번호 WO 2016/073602에 기재된 바와 같은 방법을 포함한다. 예시적인 원심 챔버는 A-200/F 및 A-200 원심 챔버 및 그러한 시스템과 함께 사용하기위한 다양한 키트를 포함하여, Sepax® 및 Sepax®2 시스템과 함께 사용하기위한 것을 포함하여, Biosafe SA에 의해 생산되고 판매되는 것들을 포함한다. 예시적인 챔버, 시스템 및 처리기구 및 캐비닛은 예컨대, 미국 특허 번호 6,123,655호, 미국 특허 번호 6,733,433호 및 공개된 미국 특허 출원, 공개 번호: US 2008/0171951호, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO 00/38762호에 기재되어있으며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 그러한 시스템과 함께 사용하기 위한 예시적인 키트는 BioSafe SA에 의해 판매되는 제품명 CS-430.1, CS-490.1, CS-600.1 또는 CS-900.2의 일회용 키트를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 시스템은, 형질도입 단계의 측면을 조작, 자동화, 제어 및/또는 모니터링하기위한 기구 및 시스템에서 수행되는 하나 이상의 다양한 다른 처리 단계, 예를 들어. 본원 또는 국제 공개 번호 WO 2016/073602에 기재된 원심 챔버 시스템과 함께 또는 이와 관련하여 수행될 수 있는 하나 이상의 처리 단계를 포함하는 다른 기구에 포함되고/되거나 다른기구와 관련되어있다. 일부 구현예에서 상기 기구는 캐비닛 내에 포함된다. 일부 구현예에서, 상기 기구는 제어 회로를 포함하는 하우징(housing), 원심 분리기, 커버, 모터, 펌프, 센서, 디스플레이 및 사용자 인터페이스를 포함하는 캐비닛을 포함한다. 예시적인 장치는 미국 특허 번호 6,123,655호, 미국 특허 번호 6,733,433호 및 2008/0171951호에 기재되어있다.
일부 구현예에서, 시스템은 일련의 용기, 예컨대, 백(bags), 튜빙(tubing), 스톱콕(stopcocks), 클램프(clamps), 커넥터 및 원심 분리 챔버를 포함한다. 일부 구현예에서, 백과 같은 용기는 동일한 백 또는 별도의 백과 같은 동일한 용기 또는 별도의 용기에 형질도입될 세포 및 바이러스 벡터 입자를 함유하는 백과 같은 하나 이상의 용기를 포함한다. 일부 구현예에서, 시스템은 상기 방법 동안 희석제 및/또는 세척 용액과 같은 매체를 함유하는 백과 같은 하나 이상의 용기를 추가로 포함하며, 이는 챔버 및/또는 다른 성분으로 당겨져 성분 및/또는 조성물을 희석, 재현탁(resuspend) 및/또는 세척한다. 상기 용기는 입력 라인, 희석 라인, 세척 라인, 폐기물 라인 및/또는 출력 라인에 대응하는 위치와 같이 시스템에서 하나 이상의 위치에 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 챔버는 원심력과 관련되어 있으며, 이는 회전축 주변과 같은 챔버의 회전에 영향을 줄 수 있다. 세포의 형질도입과 관련하여 및/또는 하나 이상의 다른 처리 단계에서 인큐베이션 전, 동안 및/또는 후에 회전이 일어날 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 다양한 처리 단계 중 하나 이상이, 예컨대, 특정 힘에서 회전 하에 수행된다. 상기 챔버는 전형적으로, 수직 또는 일반적으로 수직 회전할 수 있어서, 원심 분리 동안 챔버가 수직으로 앉아 있고, 측벽 및 축은 수직 또는 일반적으로 수직이고, 단부 벽(들)은 수평 또는 일반적으로 수평이다.
일부 구현예에서, 세포, 벡터, 예컨대, 바이러스 입자 및 시약을 함유하는 조성물은 세포를 펠렛화하기 위해 사용된 것보다 낮은 속도, 예컨대, 또는 600 rpm 내지 1700 rpm 또는 약 600 rpm 내지 1700 rpm(예컨대, 600 rpm, 1000 rpm, 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm 또는 약 또는 적어도 600 rpm, 1000 rpm, 또는 1500 rpm 또는 1700 rpm)와 같이 비교적 낮은 힘 또는 속도로 회전될 수 있다. 일부 구현예에서, 회전은 챔버 또는 공동의 내부 또는 외부 벽에서 측정될 때, 100g 내지 3200g 또는 약 100g 내지 3200g(예컨대, 100 g, 200 g, 300 g, 400), g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g 또는 3200 g 또는 약 또는 적어도 또는 적어도 약 100 g, 200 g, 300 g, 400), g, 500 g, 1000 g, 1500 g, 2000 g, 2500 g, 3000 g 또는 3200 g)의 힘, 예컨대, 상대 원심력으로 수행된다. "상대 원심력"또는 RCF라는 용어는 일반적으로 지구의 중력과 관련하여 회전축에 비해 공간의 특정 지점에서 물체나 물질(예컨대, 세포, 샘플 또는 펠렛 및/또는 챔버 또는 다른 용기의 회전 점)에 부여된 유효력으로 이해된다. 이 값은 중력, 회전 속도 및 회전 반경(회전축과 물체, 물질 또는 RCF가 측정되는 입자로부터의 거리)을 고려하여 공지된 공식을 사용하여 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전적 조작의 적어도 일부 동안, 예컨대, 형질도입 및/또는 유전적 조작 이후 세포는, 상기 기술된 바와 같이 세포의 배양 또는 팽창과 같은 유전자 조작된 세포의 배양을 위해 생물 반응기 백 어셈블리(bioreactor bag assembly)로 옮겨진다.
재조합 수용체를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 핵산 분자), 이러한 수용체를 발현하기 위한 유전자 조작 세포용 벡터 및 조작된 세포의 제조 방법이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 벡터는 재조합 수용체를 암호화하는 핵산을 함유한다. 특정 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터이다. 일부 경우에, 벡터는 레트로바이러스 벡터(retroviral vector), 예컨대, 렌티바이러스 벡터(lentiviral vector) 또는 감마 레트로바이러스 벡터(gammaretroviral vector)와 같은 바이러스 벡터이다.
일부 구현예에서, 벡터는, 바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스(retroviral) 또는 렌티바이러스(lentiviral), 비-바이러스 벡터 또는 트랜스 포손, 예컨대, 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 전이인자(transposon) 시스템, 시미안 바이러스40(SV40)에서 유래된 벡터, 아데노바이러스(adenoviruses), 아데노-관련 바이러스(AAV), 렌티바이러스 벡터(lentiviral vectors) 또는 레트로바이러스 벡터(retroviral vectors), 예컨대, 감마-레트로바이러스 벡터(gamma-retroviral vectors), 몰로니 뮤린(Moloney murine) 백혈병 바이러스(MoMLV)에서 유래된 레트로바이러스 벡터, 골수 증식 육종(myeloproliferative sarcoma) 바이러스(MPSV), 쥐 배아 줄기 세포 바이러스(MESV), 쥐 줄기 세포 바이러스(MSCV), 비장 초점 형성 바이러스(SFFV) 또는 아데노-관련 바이러스(AAV)를 포함한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 DNA는 이종 재조합 단백질을 암호화하는 핵산을 포함한다. 일부 구현예에서, 이종 재조합 분자는 재조합 수용체, 예컨대, 항원 수용체, SB-전이인자, 예컨대, 유전자 침묵(gene silencing), 캡시드-봉입된 전이인자(capsid-enclosed transposons), 상동성 이중 가닥 핵산용, 예컨대, 게놈 재조합 또는 리포터 유전자용(예컨대, GFP와 같은 형광 단백질) 또는 루시퍼라아제(luciferase))이거나 이를 포함한다.
1. 바이러스 벡터 입자
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 감염성 바이러스 입자, 예컨대, 시미안 바이러스40(simian virus 40)(SV40), 아데노 바이러스, 아데노-관련 바이러스 (AAV)로부터 유래 된 벡터를 사용하여 세포내로 전달된다. 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 재조합 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터, 예컨대, 감마-레트로바이러스 벡터를 사용하여 T 세포 내로 전달된다(예컨대, Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557 참조).
일부 구현예에서, 상기 레트로바이러스 벡터는 긴 말단 반복 서열(LTR)를 가지며, 예컨대, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney murine leukemia virus) (MoMLV), 골수 증식 육종 바이러스(myeloproliferative sarcoma virus)(MPSV), 뮤린 배아 줄기 세포 바이러스(murine embryonic stem cell virus)(MESV), 쥐 줄기 세포 바이러스(MSCV), 비장 초점 형성 바이러스(spleen focus forming virus)(SFFV) 또는 아데노-관련 바이러스(adeno-associated virus)(AAV)로부터 유래된 레트로바이러스 벡터이다. 대부분의 레트로바이러스 벡터는 쥐 레트로바이러스(murine retroviruses)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스는 임의의 조류 또는 포유동물 세포 공급원으로부터 유래된 것들을 포함한다. 상기 레트로바이러스는 전형적으로 양쪽성(amphotropic)이며, 이는 인간을 포함하여 여러 종의 숙주 세포를 감염시킬 수 있음을 의미한다. 한 구현예에서, 발현될 유전자는 레트로바이러스 개그(retroviral gag), 폴(pol) 및/또는 env 서열을 대체한다. 다수의 예시적인 레트로바이러스 시스템이 기술되어있다(예컨대, U.S. Pat. Nos. 5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037; and Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109).
렌티바이러스(lentiviral) 형질도입 방법은 공지되어있다. 예시적인 방법은 예컨대, Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114; and Cavalieri et al. (2003) Blood.　 102(2): 497-505에 기재되어 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자는, 렌티바이러스 게놈 기반 벡터(lentiviral genome based vector)로부터 유래된 것과 같은, 레트로바이러스 게놈 기반 벡터(retroviral genome based vector)로부터 유래된 게놈을 함유한다. 제공된 바이러스 벡터의 일부 측면에서, CAR과 같은, 항원 수용체와 같은, 재조합 수용체를 암호화하는 이종(heterologous) 핵산은, 벡터 게놈의 5' LTR 및 3' LTR 서열 사이에 포함 및/또는 위치된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 게놈은 렌티바이러스(lentivirus) 게놈, 예컨대, HIV-1 게놈 또는 SIV 게놈이다. 예컨대, 렌티바이러스 벡터는 병독성 유전자(virulence genes)를 배로(multiply) 약화(attenuating)시킴으로써 생성되었으며, 예컨대, 유전자 env, vif, vpu 및 nef는 결실되어 치료 목적을 위해 벡터를 더 안전하게 만든다. 렌티바이러스 벡터가 알려져 있다. Naldini et al. (1996 및 1998); Zufferey et al. (1997); Dull et al., 1998, 미국 특허 제 6,013,516호; 및 5,994,136호 참조). 일부 구현예에서, 이들 바이러스 벡터는 플라스미드 기반 또는 바이러스 기반이며, 외래 핵산을 통합(incorporating)하고, 선택하고, 핵산을 숙주 세포내로 전달하기 위해 필수 서열을 보유하도록 구성된다. 공지의 렌티바이러스는 American Type Culture Collection ("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209)과 같은 보관소 또는 수집물로부터 쉽게 입수할 수 있거나, 일반적으로 이용 가능한 기술을 사용하여 알려진 공급원으로부터 분리할 수 있다.
렌티바이러스 벡터의 한정적인 예시는 렌티바이러스(lentivirus)에서 유래된 것을 포함하며, 예컨대, 인간 면역결핍 바이러스 1(HIV-1), HIV-2, 시미안(Simian) 면역결핍 바이러스 (SIV), 인간 T-림프구 바이러스 1(Human T-lymphotropic virus 1)(HTLV- 1), HTLV-2 또는 말 감염 빈혈 바이러스(equine infection anemia virus)(E1AV)이다. 예컨대, 렌티바이러스 벡터는 HIV 독성 유전자(virulence genes)를 배로(multiply) 약화(attenuating)시킴으로써 생성되었으며, 예컨대, 유전자 env, vif, vpr, vpu 및 nef는 결실되어 치료 목적으로 벡터를 더 안전하게 만든다. 렌티바이러스 벡터(Lentiviral vectors)는 당업계에 공지되어 있다. Naldini et al. (1996 및 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, 미국 특허 제 6,013,516 호; 및 5,994,136호 참조). 일부 구현예에서, 이들 바이러스 벡터는 플라스미드 기반 또는 바이러스 기반이며, 외래 핵산을 통합하고, 선택하고, 핵산을 숙주 세포 내로 전달하기 위해 필수 서열을 보유하도록 구성된다. 공지의 렌티바이러스는 American Type Culture Collection ("ATCC"; 10801 University Blvd., Manassas, VA. 20110-2209)과 같은 보관소 또는 수집물로부터 쉽게 입수할 수 있거나, 일반적으로 이용 가능한 기술을 사용하여 알려진 공급원으로부터 분리할 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 게놈 벡터는 렌티바이러스(lentivirus)와 같은 레트로바이러스(retrovirus)의 5' 및 3' LTRs의 서열을 함유할 수 있다. 일부 측면에서, 바이러스 게놈 구조는, 렌티바이러스(lentivirus)의 5' 및 3' LTRs로부터의 서열을 함유할 수 있고, 특히 렌티바이러스(lentivirus)의 5' LTR로부터의 R 및 U5 서열, 및 렌티바이러스(lentivirus)으로부터의 불활성화 또는 자가-불활성화 3' LTR을 포함할 수 있다. 상기 LTR 서열은 임의의 종(species)으로부터의 임의의 렌티바이러스(lentivirus)로부터의 LTR 서열일 수 있다. 예컨대, 이들은 HIV, SIV, FIV 또는 BIV의 LTR 서열일 수 있다. 전형적으로, LTR 서열은 HIV LTR 서열이다.
일부 구현예에서, HIV 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터의 핵산에는 추가적인 전사 단위(transcriptional units)가 결여되어 있다. 벡터 게놈은 불활성화 또는 자가-불활성화 3 'LTR을 포함할 수 있다(Zufferey et al. J Virol 72:9873, 1998; Miyoshi et al., J Virol 72:8150, 1998). 예컨대, 바이러스 벡터 RNA를 생성하는데 사용된 핵산의 3' LTR의 U3 영역에서의 결실은 자가-불활성화(SIN) 벡터를 생성하는데 사용될 수 있다. 이 결실은 역전사 동안 프로바이러스(proviral) DNA의 5' LTR로 전달될 수 있다. 자가-불활성화 벡터는 일반적으로 3' 긴 말단 반복(LTR)으로부터 인핸서(enhancer) 및 프로모터(promoter) 서열의 결실을 가지며, 이는 벡터 통합(integration) 동안 5'LTR로 복사된다. 일부 구현예에서, LTR의 전사 활성을 제거하기 위해 TATA 박스의 제거를 포함하여 충분한 서열이 제거될 수 있다. 이것은 형질도입된 세포에서 전장(full-length) 벡터 RNA의 생성을 방지할 수 있다. 일부 측면에서, 3'LTR의 U3 요소는 그의 인핸서(enhancer) 서열, TATA 박스, Sp1 및 NF-카파 B 부위(NF-kappa B sites)의 결실(deletion)을 포함한다. 자가-불활성화 3' LTR의 결과, 진입(entry) 및 역전사 후에 생성된 프로바이러스는 불활성화된 5' LTR을 함유한다. 이는 벡터 게놈의 동원(mobilization) 위험 및 근처의 세포 프로모터에 대한 LTR의 영향을 감소시킴으로써 안전성을 향상시킬 수 있다. 자가-불활성화 3' LTR은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 이것은 벡터 역가(titers) 또는 벡터의 in vitro 또는 in vivo 특성에 영향을 미치지 않는다.
선택적으로, 렌티바이러스 5' LTR로부터의 U3 서열은 이종성(heterologous) 프로모터 서열과 같은 바이러스 구축물(construct)에서 프로모터 서열로 대체될 수 있다. 이는 패키징(packaging) 세포주로부터 회수된(recovered) 바이러스의 역가(titer)를 증가시킬 수 있다. 인핸서 서열(enhancer)이 또한 포함될 수 있다. 패키징 세포주에서 바이러스 RNA 게놈의 발현을 증가시키는 임의의 인핸서(enhancer)/프로모터(promoter) 조합이 사용될 수 있다. 일 구현예에서, CMV 인핸서(enhancer)/프로모터(promoter) 서열이 사용된다(미국 특허 번호 5,385,839호 및 미국 특허 번호 5,168,062호).
특정 구현예에서, 삽입(insertional) 돌연변이 유발(mutagenesis)의 위험은 통합 결함이 되도록 렌티바이러스 벡터 게놈과 같은 레트로바이러스 벡터 게놈을 구축함으로써 최소화될 수 있다. 비-통합 벡터 게놈을 생성하기 위해 다양한 접근법이 추구될 수 있다. 일부 구현예에서, 돌연변이(들)는 pol 유전자의 인테그레이즈(integrase) 효소 성분으로 조작되어 불활성 인테그레이즈(integrase)를 갖는 단백질을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터 게놈 자체는 예컨대, 하나 또는 두 개의 부착 부위를 돌연변이 또는 결실 시키거나, 결실 또는 변형을 통해 3' LTR-근위 폴리푸린관(3' LTR-proximal polypurine tract)(PPT)을 기능하지 않게함으로써, 통합(integration)을 방지하도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 비-유전적 접근법이 이용 가능하다; 이들은 하나 이상의 통합(integrase) 기능을 억제하는 약리학적 제제를 포함한다. 이 접근법은 상호 배타적이지 않다; 즉, 한 번에 둘 이상을 사용할 수 있다. 예컨대, 통합 사이트와 부착 사이트가 모두 작동하지 않거나, 통합 사이트와 PPT 사이트가 작동하지 않거나, 부착 사이트와 PPT 사이트가 작동하지 않거나, 그들 모두가 작동하지 않을 수 있다. 이러한 방법 및 바이러스 벡터 게놈은 공지되어 있으며 이용 가능하다(Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483, 2007; Engelman et al. J Virol 69:2729, 1995; Brown et al J Virol 73:9011 (1999); WO 2009/076524; McWilliams et al., J Virol 77:11150, 2003; Powell and Levin J Virol 70:5288, 1996 참조).
일부 구현예에서, 벡터는, 원핵 생물 숙주 세포와 같은 숙주 세포에서의 증식(propagation)을 위한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터의 핵산은 박테리아 세포와 같은 원핵 세포에서 증식을 위한 하나 이상의 복제 기점을 포함한다. 일부 구현예에서, 원핵 생물 복제 기점을 포함하는 벡터는 또한 발현이 약물 내성과 같은 검출 가능하거나 선택 가능한 마커를 부여하는 유전자를 포함할 수 있다.
바이러스 벡터 게놈은 전형적으로 패키징 또는 생산자 세포주로 형질감염될 수 있는 플라스미드 형태로 구축된다. 게놈이 바이러스 벡터 게놈의 RNA 카피를 포함하는 레트로바이러스 입자를 생성하기 위해 임의의 공지된 다양한 방법을 사용할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스-기반 유전자 전달 시스템을 만드는데 적어도 두 가지 성분이 관여한다: 첫째, 바이러스성 벡터 입자를 생성하는데 필요한 효소뿐만 아니라 구조 단백질을 포괄(encompassing)하는 패키징 플라스미드(packaging plasmids), 둘째, 바이러스 벡터 자체, 즉, 전달될 유전 물질. 이러한 구성 요소 중 하나 또는 둘 다를 설계할 때 생물 안전 보호 장치를 도입할 수 있다.
일부 구현예에서, 패키징 플라스미드는, 외피 단백질(envelope proteins) 이외의 단백질인 HIV-1과 같은, 모든 레트로바이러스를 포함할 수 있다(Naldini et al., 1998). 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는, 독성과 관련된 추가적인 바이러스 유전자, 예컨대, vpr, vif, vpu 및 nef, 및/또는 HIV의 1 차 트랜스활성제(transactivator)인 Tat가 결여될 수 있다. 일부 구현예에서, HIV-기반 렌티바이러스 벡터와 같은, 렌티바이러스 벡터는, 모 바이러스의 3 가지 유전자로 구성된다: 이는 재조합을 통한 야생형 바이러스의 재구성 가능성을 감소시키거나 제거하는 gag, pol 및 rev.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 게놈은, 바이러스 벡터 게놈으로부터 전사된 바이러스 게놈 RNA를 바이러스 입자로 패키징하는데 필요한 모든 성분을 포함하는, 패키징(packaging) 세포주 내로 도입된다. 대안적으로, 바이러스 벡터 게놈은, 관심있는 하나 이상의 서열, 예컨대, 재조합 핵산 이외에 바이러스 성분을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 그러나 일부 측면에서, 표적 세포에서 게놈의 복제를 방지하기 위해, 복제에 필요한 내인성 바이러스 유전자가 제거되고, 패키징(packaging) 세포주에서 별도로 제공된다.
일부 구현예에서, 패키징(packaging) 세포주는 입자를 생성하는데 필요한 성분을 포함하는 하나 이상의 플라스미드 벡터로 형질감염된다. 일부 구현예에서, 패키징(packaging) LTR, 시스-작용(cis-acting) 패키징(packaging) 서열 및 관심 서열을 포함하는, 바이러스 벡터 게놈을 포함하는, 플라스미드, 즉 CAR과 같은 항원 수용체를 암호화하는 핵산; 및 바이러스 효소 및/또는 구조적 성분, 예컨대, Gag, pol 및/또는 rev를 암호화하는 하나 이상의 헬퍼(helper) 플라스미드로 형질감염된다. 일부 구현예에서, 레트로바이러스 벡터 입자를 생성하는 다양한 유전자 성분을 분리하기 위해 다수의 벡터가 이용된다. 이러한 일부 구현예에서, 패키징(packaging) 세포에 별도의 벡터를 제공하는 것은 달리 복제 능력있는(competent) 바이러스를 생성할 수 있는 재조합 사건의 가능성을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 모든 레트로바이러스 성분을 갖는 단일 플라스미드 벡터가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 입자와 같은 레트로바이러스(retroviral) 벡터 입자는 슈도타입화되어(pseudotyped) 숙주 세포의 형질도입 효율을 증가시킨다. 예컨대, 일부 구현예에서 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 입자와 같은 레트로바이러스(retroviral) 벡터 입자는, VSV-G 당단백질로 슈도타입화되어(pseudotyped), 형질도입 될 수 있는 세포 유형을 확장시키는 넓은 세포 숙주 범위를 제공한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는, 비-천연(non-native) 외피(envelope) 당단백질을 암호화하는 플라스미드 또는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대, 신드비스(Sindbis) 바이러스 외피(envelope), GALV 또는 VSV-G와 같은 제노트로픽(xenotropic), 다방성(polytropic) 또는 양쪽성(amphotropic) 외피(envelope)를 포함하도록 형질감염된다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는, 바이러스 게놈 RNA를 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 입자로 패키징(packaging)을 위해 운송(trans)에 필요한 바이러스 조절 및 구조 단백질을 포함하는 성분을 제공한다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는 렌티바이러스(lentiviral) 단백질을 발현하고 기능성 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 입자를 생성할 수 있는 임의의 세포주일 수 있다. 일부 측면에서, 적합한 패키징 세포주는 293 (ATCC CCL X), 293T, HeLA (ATCC CCL 2), D17 (ATCC CCL 183), MDCK (ATCC CCL 34), BHK (ATCC CCL-10) 및 Cf2Th (ATCC CRL 1430) 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 패키징 세포주는 바이러스 단백질(들)을 안정적으로 발현한다. 예컨대, 일부 측면에서, gag, pol, rev 및/또는 다른 구조적 유전자를 포함하지만 LTR 및 패키징 성분이 없는 패키징 세포주가 구축될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징 세포주는, 이종(heterologous) 단백질을 암호화하는 핵산 분자 및/또는 외피(envelope) 당단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 바이러스 벡터 게놈과 함께 하나 이상의 바이러스 단백질을 암호화하는 핵산 분자로 일시적으로 형질감염될 수 있다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 및 패키징(packaging) 및/또는 헬퍼(helper) 플라스미드는 형질감염 또는 감염을 통해 패키징(packaging) 세포주 내로 도입된다. 패키징(packaging) 세포주는 바이러스 벡터 게놈을 포함하는 바이러스 벡터 입자를 생성한다. 형질감염 또는 감염 방법은 잘 알려져 있다. 비제한적인 예에는 인산 칼슘(calcium phosphate), DEAE- 덱스트란(DEAE-dextran) 및 리포펙션(lipofection) 방법, 전기 천공법(electroporation) 및 미세주입법(microinjection)이 포함된다.
재조합 플라스미드 및 레트로바이러스 LTR 및 패키징(packaging) 서열이 특별한 세포주 (예컨대, 인산 칼슘 침전에 의해)에 도입될 때, 패키징(packaging) 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스 입자로 패키징(packaging)될 수 있게 하고, 이어서 배양 배지 내로 분비될 수 있다. 이어서 일부 구현예에서, 재조합 레트로바이러스를 포함하는 배지를 수집하고, 임의로 농축시키고, 유전자 전이에 사용한다. 예컨대, 일부 측면에서, 패키징(packaging) 플라스미드 및 전달(transfer) 벡터를 패키징(packaging) 세포주에 공동 형질감염(cotransfection)시킨 후, 바이러스 벡터 입자는 배양 배지로부터 회수되고, 당업자에 의해 사용되는 표준 방법에 의해 적정된다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스(lentiviral) 벡터와 같은 레트로(retroviral) 바이러스 벡터는 렌티바이러스(lentiviral) 입자의 생성을 허용하는 플라스미드의 도입에 의해 예시적인 HEK 293T 세포주와 같은 패키징(packaging) 세포주에서 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 패키징(packaging) 세포는 형질감염되고/되거나, gag 및 pol을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및 재조합 수용체, 예컨대, 항원 수용체, 예컨대, CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 일부 구현예에서, 패키징(packaging) 세포주는 선택적으로 및/또는 추가로 rev 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염되고/되거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 패키징(packaging) 세포주는 선택적으로 및/또는 추가로 VSV-G와 같은 비-천연(non-native) 외피(envelope) 당단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염되고/되거나 이를 포함한다. 이러한 일부 구현예에서, 세포, 예컨대, HEK 293T 세포의 형질감염 대략 2일 후, 세포 상청액(supernatant)은 재조합 렌티바이러스(lentiviral) 벡터를 포함하고, 이는 회수되고 적정될 수 있다.
회수 및/또는 생성된 레트로바이러스 벡터 입자는 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 표적 세포를 형질도입(transduce)하는데 사용될 수 있다. 일단 표적 세포에서, 바이러스 RNA는 역전사되고, 핵으로 유입(imported)되고, 숙주 게놈에 안정적으로 통합된다. 바이러스 RNA의 통합(integration) 후 1 일 또는 2 일 후에, 재조합 단백질, 예컨대, CAR과 같은 항원 수용체의 발현이 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은, 복수의 세포를 포함하는 세포 조성물을 바이러스 입자와 접촉, 예컨대, 인큐베이션함으로써 세포를 형질도입시키는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 형질감염 또는 형질도입될 세포는 개체로부터 수득된 1 차 세포, 예컨대, 개체에서 농축되고/거나 선택된 세포이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 조성물의 형질도입될 세포의 농도는 1.0 x 105 cells/mL 내지 1.0 x 108 cells/mL 또는 약 1.0 x 105 cells/mL 내지 1.0 x 108 cells/mL, 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 1.0 x 105 cells/mL, 5 x 105 cells/mL, 1 x 106 cells/mL, 5 x 106 cells/mL, 1 x 107 cells/mL, 5 x 107 cells/mL 또는 1 x 108 cells/mL 이다.
일부 구현예에서, 바이러스 입자는, 형질도입될 세포의 총 수(IU/cell)당 바이러스 벡터 입자 또는 그의 감염성 단위(IU)의 특정 비율의 카피(copies)로 제공된다. 예컨대, 일부 구현예에서, 바이러스 입자는, 세포 중 하나당 바이러스 벡터 입자의 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60IU 또는 약 또는 적어도 또는 적어도 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 또는 60IU에서 접촉하는 동안 존재한다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자의 역가(titer)는 1 x 106 IU/mL 및 1 x 108 IU/mL 사이 또는 약 1 x 106 IU/mL 및 1 x 108 IU/mL 사이이고, 예컨대, 5 x 106 IU/mL 내지 5 x 107 IU/mL 사이 또는 약 5 x 106 IU/mL 내지 5 x 107 IU/mL 사이, 예컨대, 적어도 6 x 106 IU/mL, 7 x 106 IU/mL, 8 x 106 IU/mL, 9 x 106 IU/mL, 1 x 107 IU/mL, 2 x 107 IU/mL, 3 x 107 IU/mL, 4 x 107 IU/mL 또는 5 x107IU/mL 이다.
일부 구현예에서, 형질도입은, 100 미만, 예컨대, 일반적으로 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5 이하의 감염다중도(MOI)에서 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법은 세포를 바이러스 입자와 접촉(contacting) 또는 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 접촉(contacting)은 30분 내지 72시간, 예컨대, 30분 내지 48시간, 30분 내지 24시간, 또는 1시간 내지 24시간, 예컨대, 적어도 또는 약 30분, 1시간, 2 시간, 6시간, 12시간, 24시간, 36시간 이상이다.
일부 구현예에서, 접촉(contacting)은 용액에서 수행된다. 일부 구현예에서, 세포 및 바이러스 입자는 0.5mL 내지 500mL 또는 약 0.5mL 내지 500mL, 예컨대, 0.5mL 내지 200mL, 0.5mL 내지 100mL, 0.5mL 내지 50mL, 0.5 mL 내지 10mL, 0.5mL 내지 5mL, 5mL 내지 500mL, 5mL 내지 200mL, 5mL 내지 100mL, 5mL 내지 50mL, 5mL 내지 10mL, 10mL 내지 500mL, 10mL 내지 200mL, 10mL 내지 100mL, 10mL 내지 50mL, 50mL 내지 500mL, 50mL 내지 200mL, 50mL 내지 100mL, 100mL 내지 500mL, 100mL 내지 200mL, 또는 200mL 내지 500mL 또는 약 0.5mL 내지 200mL, 0.5mL 내지 100mL, 0.5mL 내지 50mL, 0.5 mL 내지 10mL, 0.5mL 내지 5mL, 5mL 내지 500mL, 5mL 내지 200mL, 5mL 내지 100mL, 5mL 내지 50mL, 5mL 내지 10mL, 10mL 내지 500mL, 10mL 내지 200mL, 10mL 내지 100mL, 10mL 내지 50mL, 50mL 내지 500mL, 50mL 내지 200mL, 50mL 내지 100mL, 100mL 내지 500mL, 100mL 내지 200mL, 또는 200mL 내지 500mL의 부피로 접촉(contacting)된다.
특정 구현예에서, 입력 세포는, 바이러스 DNA에 의해 암호화되는 재조합 수용체에 결합하거나 이를 인식하는 결합 분자를 포함하는 입자로 처리(treat), 인큐베이션 또는 접촉된다.
일부 구현예에서, 바이러스 벡터 입자와 세포의 인큐베이션은, 바이러스 벡터 입자로 형질도입된 세포를 포함하는 출력 조성물을 생성하거나 초래한다.
2. 비-바이러스 벡터
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전기 천공법을 통해 T 세포로 전달된다(예컨대, Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 및 Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437 참조). 일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전위(transposition)를 통해 T 세포로 전달된다 (예컨대, Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; 및 Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126 참조). 면역 세포에서 유전 물질을 도입 및 발현시키는 다른 방법은, 인산 칼슘 형질감염(calcium phosphate transfection)(예컨대, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.에 기술된 바와 같은), 원형질체 융합(protoplast fusion), 양이온성 리포좀-매개 형질감염(cationic liposome-mediated transfection); 텅스텐 입자 촉진 미세 입자 충격(Johnston, Nature, 346:776-777 (1990)); 및 스트론튬 포스페이트 DNA 공동 침전(strontium phosphate DNA co-precipitation)(Brash et al., Mol. Cell Biol., 7:2031-2034 (1987))을 포함한다.
재조합 산물을 암호화하는 핵산의 전달을 위한, 다른 접근법 및 벡터는, 예컨대, 국제 특허 출원 번호 WO2014055668 및 미국 특허 번호 7,446,190호에 기재된 것들이다.
일부 구현예에서, 세포, 예컨대, T 세포는, 팽창 동안 또는 후에, 예컨대, T 세포 수용체(TCR) 또는 키메릭 항원 수용체(CAR)와 함께, 형질감염될 수 있다. 원하는 수용체의 유전자 도입을 위한 이러한 형질감염은, 예컨대, 임의의 적합한 레트로바이러스 벡터를 사용하여 수행될 수 있다. 이어서 유전자 변형된 세포 집단은 초기 자극(예컨대, CD3/CD28 자극)으로부터 유리(liberate)될 수 있고, 이어서 제2 유형의 자극으로(예컨대, de novo 도입 수용체를 통해) 자극될 수 있다. 이러한 제 2 유형의 자극은 펩타이드/MHC 분자 형태의 항원 자극, 유전자 도입 수용체의 동족(cognate)(가교) 리간드(예컨대, CAR의 천연 리간드) 또는 새로운 수용체의 골격 내에 직접 결합하는(예컨대, 수용체 내에서 불변 영역을 인식함으로써) 임의의 리간드(예: 항체)를 포함할 수 있다. 예컨대, Cheadle et al, "Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66 또는 Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)를 참조한다.
일부 경우에, 세포, 예컨대, T 세포가 활성화될 필요 없는 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 일부 경우에, 세포는 활성화 전에 선택 및/또는 형질도입될 수 있다. 따라서, 세포는, 세포의 배양 이전에 또는 이후에, 경우에 따라 배양의 적어도 일부와 동시에, 또는 일부 동안 조작될 수 있다.
일부 측면에서, 세포는 사이토카인 또는 다른 인자의 발현을 촉진하도록 추가로 조작된다. 추가의 핵산 중, 예컨대, 도입 유전자는, 전달된 세포의 생존력 및/또는 기능을 촉진하는 것과 같은 요법의 효능을 향상시키는 유전자; in vivo 생존 또는 국소화 (localization)의 평가(assess)와 같은, 세포의 선택 및/또는 평가를 위한 유전자 마커를 제공하는 유전자; 예컨대, Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); 및 Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)에서 설명한 바와 같이 세포가 in vivo 음의 선택(negative selection )에 취약하도록 함으로써 안전을 향상시키는 유전자;이며, 우성 양성 선택성 마커(dominant positive selectable marker)를 음성 선택성 마커(negative selectable marker)와 융합시키는 것으로부터 유래된 이기능성(bifunctional) 선택성 융합 유전자의 용도를 기술하는 Lupton 등의 PCT/US91/08442 및 PCT/US94/05601의 간행물도 참조한다. 예컨대, Riddell et al., US Patent No. 6,040,177호, 14-17 열을 참조한다.
일부 구현예에서, 재조합 핵산은 전이인자(transposon)을 통해 T 세포내로 전달된다. 전이인자(transposson)(전이성 인자)는, 게놈 내에서 한 곳에서 다른 곳으로 이동할 수 있는 DNA의 이동 분절(segment)이다. 이러한 요소는 보수적인(conservative) "잘라 내기 및 붙여넣기" 메커니즘을 통해 이동하며: 트랜스포사아제(transposase)는 전이인자(transposon)의 원래 위치에서 절제(excision)를 촉진하고 게놈의 다른 곳에서 재통합을 촉진한다. 트랜스포사아제(transposase)가 다른 트랜스포사아제(transposase) 유전자에 의해 제공된다면, 트랜스포사아제(transposase)-결핍 요소가 동원될 수 있다. 따라서, 전이인자(transposon)는, 바이러스 형질도입 시스템을 사용하지 않고 외래 DNA를 숙주 게놈 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 포유 동물 세포, 예컨대, 인간 1 차 백혈구와 함께 사용하기에 적합한 트랜스 포손의 예는 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty) 및 피기백(Piggybac)을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
전이인자(transposon)-기반 형질감염은 트랜스포사아제(transposase) 및 전이인자(transposon)로 구성된 2-성분 시스템이다. 일부 구현예에서, 상기 시스템은 전이인자(transposon)가 외래 DNA (본원에서 카고 DNA라고도 함), 예컨대, 재조합 수용체를 암호화하는 유전자를 포함하도록 조작된 전이인자(transposon)를 포함하며, 이는 동반되는 트랜스포사아제(transposase)에 의해 인식되는 역 반복/직접 반복 (IR/DR) 서열에 의해 측면에 위치한다. 일부 구현예에서, 비-바이러스성 플라스미드는 프로모터의 제어 하에 트랜스포사아제(transposase)를 암호화한다. 숙주 세포내로의 플라스미드의 형질감염은 트랜스포사아제(transposase)의 일시적 발현을 초래하므로, 형질감염 후 초기 기간 동안, 트랜스포사아제(transposase)는 게놈 DNA 내로 전이인자(transposon)를 통합시키기에 충분한 수준으로 발현된다. 일부 구현예에서, 트랜스포사아제(transposase) 자체는 게놈 DNA에 통합되지 않으므로, 트랜스포사아제(transposase)의 발현은 시간이 지남에 따라 감소한다. 일부 구현예에서, 트랜스포사아제(transposase) 발현은 상응하는 전이인자(transposon)를 통합하기에 충분한 수준으로 숙주 세포에 의해, 약 4시간 미만, 약 8시간 미만, 약 12시간 미만, 약 24시간 미만, 약 2일 미만, 약 3일 미만, 약 4일 미만, 약 5일 미만, 약 6일 미만, 약 7일 미만, 약 2주 미만, 약 3주 미만, 약 4주 미만, 약 5주 미만, 또는 약 8주 미만 동안 발현된다. 일부 구현예에서, 숙주 게놈으로 도입된 카고 DNA는, 적어도 숙주가 카고 DNA를 절제할 수 있는 내인성 트랜스포사아제(transposase)를 발현하지 않기 때문에, 숙주 게놈으로부터 후속적으로 제거되지 않는다.
슬리핑 뷰티(SB)는 연어류 게놈에 보유된 휴면 요소로부터 재구성된 전이인자(transposon)의 Tc/1- 마리너(Tc/1-mariner) 상과(superfamily)의 합성 구성원이다. SB 전이인자(transposon)-기반 형질감염은 트랜스포사아제(transposase) 및 역 반복(inverted repeat)/직접 반복(direct repeat) (IR/DR) 서열을 포함하는 전이인자(transposon)로 구성된 2-성분 시스템으로 TA 디뉴클레오타이드(dinucleotide)에 정확한 통합을 초래한다. 전이인자(transposon)는, IR/DR이 측면에 있는 관심있는 발현 카세트(cassette)로 설계된다. SB 트랜스포사아제(transposase)는 슬리핑 뷰티(Sleeping beauty) 전이인자(transposon)의 IR에 위치한 특정 결합 부위에 결합한다. SB 트랜스포사아제(transposase)는 전이인자(transposon)의 통합을 매개하는데, 이는 촉매 효소(SB)에 대한 결합 부위를 보유하는 역전된 말단 반복에 의해 양쪽에 측면에 있는 카고 서열을 암호화하는 이동 요소인 전이인자(transposon)의 통합을 매개한다. SB가 잘라내기-및-붙여넣기 메커니즘을 통해 TA 표적 디뉴클레오타이드(dinucleotide)에서 척추 동물 염색체에 유전자 서열을 삽입할 때 안정한 발현이 일어난다. 이 시스템은 1차 인간 말초 혈액 백혈구를 포함한 다양한 척추 동물 세포 유형을 조작하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, 세포는, 카고 유전자, 예컨대, SB IR 서열에 의해 측면에 위치한 재조합 수용체 또는 CAR을 암호화하는 유전자를 포함하는 SB 전이인자(transposon)와 접촉, 인큐베이션 및/또는 처리된다. 특정 구현예에서, 형질감염될 세포는, 카고 유전자, 예컨대, SB IR 서열에 의해 측면에 위치한 CAR을 암호화하는 유전자를 포함하는, SB 전이인자(transposon)를 포함하는 플라스미드와 접촉, 인큐베이션 및/또는 처리된다. 특정 구현예에서, 플라스미드는 SB IR 서열에 의해 측면에 위치하지 않은 SB 트랜스포사아제(transposase)를 암호화하는 유전자를 추가로 포함한다.
PiggyBac(PB)은 카고 DNA를 숙주, 예컨대, 인간의 게놈 DNA에 통합하는데 사용될 수 있는 또 다른 전이인자(transposon) 시스템이다. PB 트랜스포사아제(transposase)는 전이인자(transposon)의 양쪽 말단에 위치한 PB 전이인자(transposon)-특정 역 말단 반복 서열(ITR)을 인식하고, 원래 부위로부터 내용을 효율적으로 이동시키고 이를 TTAA 염색체 부위로 효율적으로 통합시킨다. PB 전이인자(transposon) 시스템은, PB 벡터에서 2 개의 ITR 사이에 관심있는 유전자가 표적 게놈으로 동원될 수 있게 한다. PB 시스템은 1차 인간 세포를 포함하여 다양한 척추 동물 세포 유형을 조작하는 데 사용되었다. 일부 구현예에서, 형질감염될 세포는, 카고 유전자, 예컨대, PB IR 서열에 의해 측면에 위치한 CAR을 암호화하는 유전자를 포함하는 PB 전이인자(transposon)와 접촉, 인큐베이션 및/또는 처리된다. 특정 구현예에서, 형질감염될 세포는, 카고 유전자, 예컨대, PB IR 서열에 의해 측면에 위치한 CAR을 암호화하는 유전자를 포함하는, PB 전이인자(transposon)를 포함하는 플라스미드와 접촉, 인큐베이션 및/또는 처리된다. 특정 구현예에서, 플라스미드는 PB IR 서열에 의해 측면에 위치하지 않은 SB 트랜스포사아제(transposase)를 암호화하는 유전자를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법, 예컨대, SB 또는 PB 벡터(들)에 사용된 전이인자(transposon)/트랜스포사아제(transposase)의 다양한 요소는 제한 효소 절단, 결찰(ligation) 및 분자 클로닝의 표준 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 벡터를 구성하기 위한 하나의 프로토콜은 다음 단계를 포함한다. 먼저, 원하는 성분 뉴클레오타이드 서열 및 외부 서열을 포함하는 정제된 핵산 단편은 초기 공급원, 예컨대, 트랜스포사아제(transposase) 유전자를 포함하는 벡터로부터 제한 효소(restriction endonucleases)로 절단된다. 이어서, 원하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 단편은 통상적인 분리 방법, 예컨대, 아가로오스 겔 전기 영동을 이용하여 상이한 크기의 원치 않는 단편으로부터 분리된다. 원하는 단편은 겔로부터 절제되고, 원하는 서열, 예컨대, 상기 기재된 바와 같은 개체 벡터의 다양한 요소에 상응하는 서열을 포함하는 원형 핵산 또는 플라스미드가 생성되도록 적절한 배열로 함께 결찰(ligation)된다. 원하는 경우, 이렇게 구성된 원형 분자는, 이어서 원핵 생물 숙주, 예컨대, 대장균에서 증폭된다. 이들 단계에 수반되는 절단, 플라스미드 구성, 세포 형질 전환 및 플라스미드 생산 절차는 당업자에게 널리 공지되어 있고 제한 및 결찰(ligation)에 필요한 효소는 상업적으로 이용 가능하다(예컨대, R. Wu, Ed., Methods in Enzymology, Vol. 68, Academic Press, N.Y. (1979); T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1982); Catalog 1982-83, New England Biolabs, Inc.; Catalog 1982-83, Bethesda Research Laboratories, Inc. 참조). 본 발명의 방법에 사용된 벡터를 구성하는 방법의 예는 하기 실험 섹션에 제공된다. 대표적인 슬리핑 뷰티(Sleeping　Beauty) 전이인자(transposon) 시스템의 제조는 또한, WO 98/40510 및 WO 99/25817에 개시되어 있다.
일부 구현예에서, 전이인자(transposon)에 의한 형질도입은, 트랜스포사아제(transposase) 유전자를 포함하는 플라스미드, 및 트랜스포사아제(transposase)에 의해 인식되는 역 반복/직접 반복(IR/DR) 서열에 의해 측면에 있는, 카고 DNA 서열을 포함하는, 전이인자(transposon)를 포함하는 플라스미드로 수행된다. 특정 구현예에서, 카고 DNA 서열은 이종 단백질, 예컨대, 재조합 T 세포 수용체 또는 CAR을 암호화한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 트랜스포사아제(transposase) 및 전이인자(transposon)을 포함한다. 일부 구현예에서, 트랜스포사아제(transposase)는 유비쿼터스 프로모터, 또는 표적 세포에서 트랜스포사아제(transposase)의 발현을 유도하기에 적합한 임의의 프로모터의 제어 하에 있다. 유비쿼터스 프로모터는 EF1a, CMB, SV40, PGK1, Ubc, 인간 β- 액틴, CAG, TRE, UAS, Ac5, CaMKIIa 및 U6을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 카고 DNA는, 카고 DNA가 게놈 DNA 내로 안정적으로 통합된 세포의 선택을 허용하는 선택 카세트(cassette)를 포함한다. 적합한 선택 카세트(cassette)는, 카나마이신(kanamycin) 저항성 유전자, 스펙티노마이신(spectinomycin) 저항성 유전자, 스트렙토마이신(streptomycin) 저항성 유전자, 암피실린(ampicillin) 저항성 유전자, 카베니실린(carbenicillin) 저항성 유전자, 히그로마이신(hygromycin) 저항성 유전자, 블레오마이신(bleomycin) 저항성 유전자, 에리스로마이신(erythromycin) 저항성 유전자 및 폴리믹신 B(polymyxin B) 저항성 유전자를 암호화하는 선택 카세트(cassette)를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 전이인자(transposon), 예컨대, SB 트랜스포사아제(transposase) 및 SB 전이인자(transposon)를 포함하는 플라스미드에 의한 형질도입을 위한 성분이 표적 세포내로 도입된다. 프로토콜이 표적 세포의 위치에 따라 표적 세포내로 시스템 성분의 in vitro 또는 in vivo 도입을 제공할 수 있는, 임의의 편리한 프로토콜이 사용될 수 있다. 예컨대, 표적 세포가 분리된 세포(isolated cell)인 경우, 시스템은, 예컨대, 표준 형질 전환 기술을 사용하여, 표적 세포의 생존성을 허용하는 세포 배양 조건 하에 세포로 직접 도입될 수 있다. 이러한 기술은 바이러스 감염, 형질 전환, 컨쥬게이션, 원형질체 융합, 전기 천공법, 입자 총 기술(particle gun technology), 인산 칼슘 침전, 직접 미세주사(direct microinjection), 바이러스 벡터 전달 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 방법의 선택은 일반적으로, 형질 전환되는 세포의 유형 및 형질 전환이 일어나는 환경(즉, in vitro, ex vivo 또는 in vivo)에 의존한다. 이들 방법에 대한 일반적인 논의는 Ausubel, et al, Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed., Wiley & Sons,1995에서 찾을 수 있다.
일부 구현예에서, SB 전이인자(transposon) 및 SB 트랜스포사아제(transposase) 공급원은, 전이인자(transposon)를 운반하는 벡터 운반체로부터 역 반복 측면화된(inverted repeat flanked) 핵산의 절제, 및 절제된 핵산의 표적 세포 게놈으로의 후속 통합에 충분한 조건 하에서, 다세포 유기체, 예컨대, 포유 동물 또는 인간의 표적 세포내로 도입된다. 일부 구현예는 필수 트랜스포사아제(transposase) 활성이, 도입된 전이인자(transposon)와 함께 표적 세포에 존재하는 것을 보장(ensuring)하는 단계를 추가로 포함한다. 전이인자(transposon) 벡터 자체의 구조, 즉 벡터가 트랜스포사아제(transposase) 활성을 갖는 생성물을 암호화하는 영역을 포함하는지 여부에 따라, 상기 방법은 필수 트랜스포사아제(transposase) 활성을 암호화하는 두번째 벡터를 표적 세포내로 도입하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 전이인자(transposon)을 포함하는 벡터 핵산의 양 및 세포내로 도입되는 트랜스포사아제(transposase)를 암호화하는 벡터 핵산의 양은 표적 세포 게놈 내로 전이인자(transposon) 핵산의 원하는 절제 및 삽입을 제공하기에 충분하다. 이와 같이, 도입된 벡터 핵산의 양은, 충분한 양의 트랜스포사아제(transposase) 활성 및 표적 세포내로 삽입되기를 원하는 충분한 양의 핵산을 제공해야한다. 표적 세포내로 도입되는 벡터 핵산의 양은 사용되는 특정 도입 프로토콜, 예컨대, 사용되는 특정 ex vivo 투여 프로토콜의 효율에 따라 변한다.
일단 벡터 DNA가 필수 트랜스포사아제(transposase)와 조합하여 표적 세포로 들어간 후, 역 반복(inverted repeats)에 의해 측면이 있는 벡터의 핵산 영역, 즉 슬리핑 뷰티(Sleeping　Beauty) 트랜스포사아제(transposase) 인지된 역 반복(inverted repeats) 사이에 위치된 벡터 핵산은, 제공된 트랜스포사아제(transposase)를 통해 벡터로부터 절제되고, 표적 세포의 게놈에 삽입된다. 이와 같이, 벡터 DNA의 표적 세포로의 도입은, 이어서 벡터에 의해 운반된 외인성(exogenous) 핵산의 표적화된 세포의 게놈 내로의 트랜스포사아제(transposase) 매개 절단 및 삽입이 뒤따른다. 특정 구현예에서, 벡터는, SB 전이인자(transposon) 및/또는 SB 트랜스포사아제(transposase)로 형질감염된 세포의 적어도 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 5% 이상, 6% 이상 7% 이상 8% 이상, 9% 이상, 10% 이상, 15% 이상 또는 20% 이상의 게놈에 통합된다. 일부 구현예에서, 표적 세포 게놈 내로의 핵산의 통합은 안정하다. 벡터 핵산은 일시적 기간(transient period) 이상 동안 표적 세포 게놈에 존재하며, 염색체 유전 물질의 일부에서 표적 세포의 자손으로 전달된다.
특정 구현예에서, 전이인자(transposon)는 다양한 크기의 핵산, 즉 폴리뉴클레오타이드(polynucleotides)를 표적 세포 게놈에 통합시키기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 표적 세포 게놈에 삽입되는 DNA의 크기는 약 0.1kb 내지 200kb, 약 0.5kb 내지 100kb, 약 1.0kb 내지 약 8.0kb, 약 1.0 내지 약 200kb, 약 1.0 내지 약 10kb, 약 10kb 내지 약 50kb, 약 50kb 내지 약 100kb, 또는 약 100kb 내지 약 200kb의 범위이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 표적 세포 게놈에 삽입되는 DNA의 크기는 약 1.0kb 내지 약 8.0kb의 범위이다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 표적 세포 게놈에 삽입되는 DNA의 크기는 약 1.0 내지 약 200kb의 범위이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 방법을 사용하여 표적 세포 게놈에 삽입되는 DNA의 크기는 약 1.0kb 내지 약 8.0kb의 범위이다.
D. 세포의 배양 및/또는 팽창
일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포를 배양하기 위한 하나 이상의 단계, 예컨대, 증식 및/또는 팽창을 촉진하는 조건 하에서 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는, 유전자 조작 단계, 예컨대, 형질도입 또는 형질감염에 의해 재조합 폴리펩타이드(polypeptide)를 세포에 도입하는 단계 후에, 증식 및/또는 확장을 촉진하는 조건 하에서 배양된다. 특정 구현예에서, 세포는, 자극 조건 하에서 세포가 배양되고 재조합 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide), 예컨대, 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)로 형질도입되거나 형질감염된 후 인큐베이션된다.
특정 구현예에서, 조작된 T 세포의 하나 이상의 조성물은 농축된 T 세포의 2 개의 별개의 조성물이거나, 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 2 개의 별개의 조성물, 예컨대, 동일한 생물학적 샘플로부터 선택, 분리 및/또는 농축된(enriched) 2 개의 별개의 농축된 T 세포의 조성물은 자극 조건 하에서 별도로 배양된다. 특정 구현예에서, 2 개의 별개의 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 2 개의 별개의 조성물은 농축된 CD8+ T 세포의 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 2 개의 별개의 조성물은 예컨대, 증식 및/또는 팽창을 촉진하는 조건 하에서 별도로 배양된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 단일 조성물이 배양된다. 특정 구현예에서, 단일 조성물은 농축된 CD4 + T 세포의 조성물이다. 일부 구현예에서, 단일 조성물은 배양 전에 별도의 조성물로부터 조합된, 농축된 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 조성물이다.
일부 구현예에서, 예컨대, 증식 및/또는 팽창을 촉진하는 조건 하에서 배양되는 농축된 CD4+ T 세포의 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD4 + T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은, 재조합 수용체를 발현하고/하거나 재조합 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)로 형질도입되거나 형질감염된 CD8+ T 세포를 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%로 포함한다. 특정 구현예에서, 인큐베이션되는, 농축된 CD4+ T 세포의 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/하거나 CD8+ T 세포를 포함하지 않으며/거나 CD8+ T 세포가 없거나 또는 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 예컨대, 증식 및/또는 팽창을 촉진시키는 조건 하에서 배양되는 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은, 재조합 수용체를 발현하고/하거나 재조합 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)로 형질도입 또는 형질감염된 CD8+ T 세포를 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%로 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건 하에서 인큐베이션된, 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 CD4 + T 세포를 포함하고/하거나 CD4+ T 세포를 포함하지 않으며/거나 CD4+ T 세포가 없거나 또는 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 별도 조성물은 단일 조성물로 조합되고, 예컨대, 증식 및/또는 팽창을 촉진시키는 조건 하에서 배양된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ 및 농축된 CD8+ T 세포의 개별 배양 조성물(separate cultivated compositions)은 배양이 수행되고/되거나 완료된 후 단일 조성물로 조합된다.
일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 증식 및/또는 팽창을 촉진하는 조건 하에서 배양된다. 일부 구현예에서, 이러한 조건은 집단에서 세포의 증식, 팽창, 활성화 및/또는 생존을 유도하도록 설계될 수 있다. 특정 구현예에서, 자극 조건은, 하나 이상의 특정 매질, 온도, 산소 함량, 이산화탄소 함량, 시간, 작용제, 예컨대, 영양소, 아미노산, 항생제, 이온 및/또는 자극 인자, 예컨대, 사이토카인, 케모카인(chemokines), 항원, 결합 파트너, 융합 단백질, 재조합 가용성 수용체, 및 세포의 성장, 분열 및/또는 팽창을 촉진하도록 설계된 임의의 다른 작용제를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 세포는 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 배양된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 인간 재조합 사이토카인이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 T 세포에 의해 발현되고/되거나 내인성(endogenous) 수용체에 결합하고/하거나 수용체에 결합할 수 있다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 사이토카인의 4-알파-헬릭스 다발 패밀리(4-alpha-helix bundle family)의 구성원이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인의 4-알파-헬릭스 다발 패밀리(4-alpha-helix bundle family)의 구성원은 인터루킨-2(IL-2), 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-7(IL-7), 인터루킨 -9 (IL-9), 인터루킨 12(IL-12), 인터루킨 15(IL-15), 과립구 집락(granulocyte colony)-자극 인자 (G-CSF) 및 과립구-대식세포 집락(granulocyte-macrophage colony) 자극 인자(GM-CSF)를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
특정 구현예에서, 세포는, 배양, 예컨대, 증식 및/또는 확장을 촉진하는 조건 하에서 배양하기 전에, 본원, 예컨대, 섹션 Ⅱ에 기재된 작용제와 같은 mTOR 활성을 억제하는 작용제에 인큐베이션, 접촉 및/또는 노출되지 않는다.
특정 구현예에서, 배양의 적어도 일부는 본원, 예컨대, 섹션 Ⅱ에 기재된 작용제와 같이 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 수행된다. 일부 구현예에서, 모든 및/또는 전체 배양은 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 수행된다.
특정 구현예에서, 세포는 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 배양된다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 섹션 Ⅱ에서와 같이 본원에 기재된 작용제이다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 또한 추가 키나아제(kinase)의 활성을 억제한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 또한 포스포이노시톨-3 키나아제(phosphoinositiol-3 kinase)(PI3K) 활성을 억제한다. 특정 구현예에서, 작용제는 mTOR 활성을 억제하기에 충분한 농도에서 mTOR 활성을 선택적으로 억제, 예컨대, PI3K 활성을 검출 가능하게 억제하지 않거나, 및/또는 PI3K 활성을 mTOR 활성과 동일한 정도로 억제하지 않는다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 키나아제(kinase) 활성을 억제한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 및/또는 mTORC2 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 및 mTORC2 키나아제(kinase) 활성을 억제한다.
일부 구현예에서, 세포는 PI-103, SF1126, BGT226, XL765, PF-04691502, NVP-BEZ235, 피라졸로피리미딘(pyrazolopyrimidine), 토린 1(Torin l), 토르키닙(Torkinib)(PP242), PP30, Ku-0063794, WAY-600 (Wyeth), WAY-687 (Wyeth), WAY-354 (Wyeth), AZD8055, 라파마이신(rapamycin) (sirolimus), 템시로리무스(temsirolimus)(CC1779), 에베로리무스(everolimus) (RAD001), 데포로리무스(deforolimus)(AP23573), AZD8055(AstraZeneca) 및 OSI-027(OSI)로부터 선택된 작용제와 배양(cultivated)된다. 일부 구현예에서, 세포는 섹션 Ⅱ에 제공된 화학식, 예컨대, 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3을 갖거나 포함하는 작용 제로 배양된다. 일부 구현예에서, 작용제는 화합물 155, 화합물 246 또는 화합물 63이다.
특정 구현예에서, 세포는 mTOR 활성을 억제, 감축(reduce) 및/또는 감소(decreases)시키는 농도에서 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 배양된다. 일부 구현예에서, 농도는 mTOR의 하나 이상의 활성을 약 또는 적어도 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 99.9%만큼 억제, 감축(reduce) 및/또는 감소(decreases)시킨다. 일부 구현예에서, 작용제의 농도는 1 차 T 세포의 증식 및/또는 팽창을 방지하지 못한다. 일부 구현예에서, 세포는 1nM 내지 1 μM, 1nM 내지 100nM, 50nM 내지 250nM, 100nM 내지 250nM, 200nM 내지 500nM, 50nM 내지 250nM, 100nM 내지 500nM, 500nM 내지 1 μM, 1 μM 내지 10 μM, 또는 5 μM 내지 50 μM의 mTOR 활성을 억제하는 작용제 존재 하에 배양된다. 특정 구현예에서, 세포는 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM 또는 100 μM, 약 또는 적어도 0.1 nM, 0.5 nM, 1 nM, 5 nM, 10 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM, 500 nM, 1 μM, 5 μM, 10 μM, 25 μM, 50 μM 또는 100 μM의 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 배양된다.
일부 구현예에서, 세포는 화합물 155의 존재 하에 배양된다. 특정 구현예에서, 세포는 1nM 내지 1 μM, 1nM 내지 100nM, 50nM 내지 200nM, 100nM 내지 250nM, 또는 200nM 내지 500nM의 화합물 155의 존재 하에 배양된다. 특정 구현예에서, 세포는 10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM 또는 500nM, 약 또는 적어도 10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM 또는 500nM의 화합물 155의 존재 하에 배양된다.
특정 구현예에서, 세포는 화합물 246의 존재 하에 배양된다. 특정 구현예에서, 세포는 1nM 내지 1 μM, 1nM 내지 100nM, 50nM 내지 200nM, 100nM 내지 250nM, 또는 200nM 내지 500nM의 화합물 155의 존재 하에서 배양된다. 특정 구현예에서, 세포는 10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM 또는 500nM, 약 또는 적어도 10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM 또는 500nM의 화합물 246의 존재 하에, 배양된다.
특정 구현예에서, 세포는 화합물 63의 존재 하에 배양된다. 특정 구현예에서, 세포는 1 nM 내지 1 μM, 1 nM 내지 100 nM, 50 nM 내지 200 nM, 100 nM 내지 250 nM 또는 200 nM 내지 500 nM의 화합물 63의 존재 하에 배양된다. 일부 구현예에서, 세포는 10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM 또는 500nM, 약 또는 적어도 10nM, 25nM, 50nM, 100nM, 150nM, 200nM, 250nM 또는 500nM의 화합물 63의 존재 하에서 배양된다.
일부 구현예에서, 배양은, 1차 면역 세포, 예컨대, 인간 T 림프구의 성장에 적합한 온도, 예컨대, 적어도 약 25℃ 이상, 일반적으로 적어도 약 30℃, 또는 일반적으로 37℃ 또는 약 37℃ 의 온도를 포함하는 조건에서 수행된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 30 내지 37℃와 같이, 25 내지 38℃, 예컨대, 37 ℃ ± 2 ℃ 또는 약 37 ℃ ± 2 ℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 배양은 예컨대, 배양될 때까지의 기간 동안 수행되며 예컨대, 배양 또는 팽창은, 원하는 또는 임계의, 밀도, 세포 수 또는 용량을 초래한다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일 이상 보다 큰 또는 약 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일 이상 보다 큰 또는 약 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일 이상 동안 또는 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 5 일, 6 일, 7 일, 8 일, 9 일 이상 동안이다.
특정 구현예에서, 배양은 폐쇄 시스템에서 수행된다. 특정 구현예에서, 배양은 멸균 조건 하에 폐쇄 시스템에서 수행된다. 특정 구현예에서, 배양은 제공된 시스템의 하나 이상의 단계와 동일한 폐쇄 시스템에서 수행된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 조성물은 폐쇄 시스템으로부터 제거되고 배양을 위한 생물 반응기(bioreactor)에 배치 및/또는 연결된다. 배양에 적합한 생물 반응기의 예시로 GE Xuri W25, GE Xuri W5, Sartorius BioSTAT RM 20 | 50, Finesse SmartRocker Bioreactor Systems, 및 Pall XRS Bioreactor Systems를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 구현예에서, 생물 반응기는 배양 단계의 적어도 일부 동안 세포를 관류(perfuse) 및/또는 혼합하는데 사용된다.
일부 구현예에서, 혼합은 요동(rocking) 및/또는 움직임(motioning)이거나 이를 포함한다. 일부 경우에, 생물 반응기는 움직임(motioning) 또는 요동(rocking)의 영향을 받을 수 있으며, 이는 일부 측면에서 산소 전달을 증가시킬 수 있다. 생물 반응기의 움직임(motioning)은, 수평축을 따라 회전하는 것, 수직축을 따라 회전하는 것, 생물 반응기의 기울어지거나 경사진 수평 축에 따른 요동(rocking) 움직임, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 인큐베이션의 적어도 일부는 요동(rocking)으로 수행된다. 요동(rocking) 속도 및 요동(rocking) 각도는 원하는 교반(agitation)을 달성하도록 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 요동(rocking) 각도는 20˚, 19˚, 18˚, 17˚, 16˚, 15˚, 14˚, 13˚, 12˚, 11˚, 10˚, 9˚, 8˚, 7˚, 6˚, 5˚, 4˚, 3˚, 2˚ 또는 1˚이다. 특정 구현예에서, 요동 각도는 6 내지 16˚이다. 다른 구현예에서, 요동 각도는 7 내지 16˚이다. 다른 구현예에서, 요동 각도는 8 내지 12˚이다. 일부 구현예에서, 요동 속도는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40 rpm 이다. 일부 구현예에서, 요동 속도는 4 내지 12 rpm, 예컨대, 4 내지 6 rpm이다.
일부 구현예에서, 생물 반응기는 0.01 L/min, 0.05 L/min, 0.1 L/min, 0.2 L/min, 0.3 L/min, 0.4 L/min, 0.5 L/min, 1.0 L/min, 1.5 L/min, 또는 2.0 L/min 또는 2.0 L/min이상, 약 또는 적어도 0.01 L/min, 0.05 L/min, 0.1 L/min, 0.2 L/min, 0.3 L/min, 0.4 L/min, 0.5 L/min, 1.0 L/min, 1.5 L/min, 또는 2.0 L/min 또는 2.0 L/min이상에서 일정한 공기 흐름으로, 37 ℃ 또는 그 근처의 온도 및 5 % 또는 그 근처의 CO2 수준을 유지한다. 특정 구현예에서, 배양의 적어도 일부는, 예컨대, 290 ml/day, 580 ml/day, 및/또는 1160 ml/day 의 속도로, 관류(perfusion)로 수행되며, 예컨대, 배양의 시작 및/또는 배양된 세포의 밀도와 관련된 타이밍에 의존한다. 일부 구현예에서, 세포 배양 팽창의 적어도 일부는 예컨대, 6 RMP 또는 10 RPM과 같은 5 내지 15 RPM의 일정한 요동 속도로, 6˚와 같이, 5˚ 내지 10˚의 각도의 요동(rocking) 움직임(motion)으로 수행된다.
E. 세포의 제형화
일부 구현예에서, 세포 치료 및/또는 조작된 세포를 제조, 생성 또는 생산하기 위한 제공된 방법은 세포의 제형화, 예컨대, 인큐베이션, 배양 및 조작 전 또는 후에 제공된 처리 단계 및/또는 기술된 바와 같은 하나 이상의 다른 처리 단계로부터 생성된 유전자 조작된 세포의 제형화를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 제형화와 관련된 제공된 방법은 폐쇄된 시스템에서 상기 처리 단계를 이용하여 형질도입 및/또는 팽창된 세포와 같은, 형질도입된 세포를 처리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 재조합 항원 수용체로 조작된 세포, 예컨대, CAR 또는 TCR를 포함하는 세포의 용량은, 약학적 조성물 또는 제형과 같은, 조성물 또는 제형으로서 제공된다. 이러한 조성물은, 제공된 방법, 예컨대, 질환, 상태 및 장애의 예방 또는 치료, 또는 검출, 진단 및 예후 방법에 따라 사용될 수 있다.
일부 경우에, 세포는, 세포 치료 및/또는 조작된 세포를 제조, 생성 또는 생산하기 위한 하나 이상의 단계 (예컨대, 원심 챔버 및/또는 폐쇄 시스템에서 수행)로 처리되며, 예컨대, 세포의 제형화, 예컨대, 배양 전 또는 후에 제공된 형질도입 처리 단계로부터 생성된 유전자 조작된 세포의 제형화, 예컨대, 배양 및 팽창, 및/또는 기술된 바와 같은 하나 이상의 다른 처리 단계를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 세포는 단일 단위 용량 투여(dosage administration) 또는 다중 용량 투여(dosage administration)와 같은 용량 투여량로 제형화 될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 제형화와 관련된 제공된 방법은, 형질 전환된 세포, 예컨대, 상기 기재된 처리 단계를 사용하여 형질도입 및/또는 팽창된 세포를 폐쇄 시스템에서 처리하는 것을 포함한다.
특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 하나 이상의 조성물이 제형화된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 농축된 T 세포의 조성물은 하나 이상의 조성물이 조작 및/또는 배양된 후에 제형화된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 조성물은 입력 조성물이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 입력 조성물은 이전에 동결건조(cryofrozen)되고 저장되고, 인큐베이션 전에 해동된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 처리 단계에 의해 생성된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포와 같은, T 세포가 제형화된다. 일부 측면에서, 복수의 조성물은 별도로 제조, 생산 또는 생성되며, 각각은 임의로 특정 시간 내에 별도로 또는 독립적으로 투여하기 위해 개체로부터 상이한 집단 및/또는 서브-타입(sub-types)의 세포를 포함한다. 예컨대, 상이한 집단 또는 아류형의 세포를 포함하는 조작된 세포의 개별 제형은 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포, 및/또는 CD8+- 및 CD4+-농축된 집단, 예컨대, 각각 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함할 수 있으며, 재조합 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 세포를 별도로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 조성물은 재조합 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 CD4+ T 세포를 포함하여 제형화된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 조성물은 재조합 수용체를 발현하도록 유전자 조작된 CD8+ T 세포로 제형화된다. 일부 구현예에서, 용량의 투여는 CD8+ T 세포 용량 또는 CD4+ T 세포 용량을 포함하는 제1 조성물의 투여, 및 다른 용량의 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포 용량을 포함하는 두번째 조성물의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, CD8+ T 세포 용량 또는 CD4+ T 세포 용량을 포함하는 제1 조성물은 다른 용량의 CD4+ T 세포 및 CD8 + T 세포를 포함하는 두번째 조성물 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 투여는 CD8+ T 세포 용량 및 CD4+ T 세포 용량 둘 다를 포함하는 조성물의 투여를 포함한다.
특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 하나 이상의 조성물은 농축된 T 세포의 2 개의 별개의 조성물, 예컨대, 별개의 조작된 및/또는 배양된 조성물이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 T 세포의 2 개의 별개의 조성물, 예컨대, 동일한 생물학적 샘플로부터 선택, 분리 및/또는 농축된, 농축된 T 세포의 2개의 별개의 조성물은, 별도로 제형화된다. 특정 구현예에서, 2 개의 별개의 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 2 개의 별개의 조성물은 농축된 CD8+ T 세포의 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 2 개의 별개의 조성물은 별도로 제형화된다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 단일 조성물은 제형화된다. 특정 구현예에서, 단일 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 조성물이다. 일부 구현예에서, 단일 조성물은, 제형화 전에 별개의 조성물로부터 조합된 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 조성물이다.
일부 구현예에서, 농축된 CD4 + 및 CD8 + T 세포의 분리된 조성물은 단일 조성물로 조합되어 제형화된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4 + 및 농축된 CD8 + T 세포의 별도의 제형화된 조성물은 제형이 수행 및/또는 완료된 후 단일 조성물로 조합된다.
일부 구현예에서, 제형화된, 농축된 CD4+ T 세포의 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은, 재조합 수용체를 발현하고/하거나 재조합 폴리 뉴클레오타이드(polynucleotide)로 형질도입되거나 형질감염된, CD4+ T 세포를 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%로 포함한다. 특정 구현예에서, 제형화된, 농축된 CD4+ T 세포의 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/하거나 CD8+ T 세포를 포함하지 않으며/거나 CD8+ T 세포가 없거나 또는 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 예컨대, 증식 및/또는 팽창을 촉진하는 조건 하에서 제형화된, 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은, 재조합 수용체를 발현하고/하거나 재조합 폴리 뉴클레오타이드(polynucleotide)로 형질도입되거나 형질감염된 CD8+ T 세포를 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%로 포함한다. 특정 구현예에서, 자극 조건 하에서 인큐베이션된, 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 포함하고/하거나 CD4+ T 세포를 포함하지 않으며/거나 CD4+ T 세포가 없거나 또는 실질적으로 없다.
특정 구현예에서, 제형화된 세포는 출력 세포이다. 일부 구현예에서, 농축된 T 세포의 제형화된 조성물은, 농축된 T 세포의 출력 조성물이다. 특정 구현예에서, 제형화된 CD4+ T 세포 및/또는 제형화된 CD8+ T 세포는 출력 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포이다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포의 제형화된 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 출력 조성물이다. 일부 구현예에서, 농축된 CD8+ T 세포의 제형화된 조성물은 농축된 CD8+ T 세포의 출력 조성물이다.
일부 구현예에서, 세포는 백(bag) 또는 바이알(vial)과 같은 용기로 제형화될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 약학적으로 허용가능한 완충제로 제형화되는데, 이는 일부 측면에서 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 처리(processing)는 배지를 개체에게 투여하기 위해 약학적으로 허용가능하거나 바람직한 배지 또는 제형 완충제로 배지를 교환하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 처리 단계는 하나 이상의 임의의 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함할 수 있는, 약학적으로 허용가능한 완충액에서 세포를 대체하기 위해 형질도입 및/또는 팽창된 세포를 세척하는 것을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는 이러한 약학적 형태의 예는 세포 및 조성물을 개체에게 투여하기에 적합한 형태와 관련하여 하기에 기술될 수 있다. 일부 구현예에서 약학 조성물은 질환 또는 상태를 치료 또는 예방하는데 효과적인 양, 예컨대, 치료적 유효 또는 예방적 유효량으로 세포를 포함한다.
"약학적으로 허용가능한 담체"는 활성 성분 이외의 약학적 제형의 성분을 나타내며, 이는 개체에게 무독성이다. 약학적으로 허용가능한 담체는 완충제, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
일부 측면에서, 담체의 선택은 특정 세포 및/또는 투여 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 다양한 적합한 제형이 존재한다. 예컨대, 약학 조성물은 보존제를 포함할 수 있다. 적합한 보존제는 예컨대, 메틸파라벤(methylparaben), 프로필파라벤(propylparaben), 벤조산나트륨 (sodium benzoate) 및 염화벤잘코늄(benzalkonium chloride)을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 둘 이상의 방부제의 혼합물이 사용된다. 보존제 또는 이들의 혼합물은 일반적으로 총 조성물의 중량을 기준으로 약 0.0001 % 내지 약 2 %의 양으로 존재한다. 담체는 예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에 기재되어 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 일반적으로 사용된 용량 및 농도에서 수용자에게 무독성이며 다음을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다: 포스페이트, 시트르산염(citrate) 및 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (옥타데실 디메틸벤질 암모늄 클로라이드(octadecyldimethylbenzyl ammonium chloride); 헥사메토늄 클로라이드(hexamethonium chloride);염화벤잘코늄(benzalkonium chloride); 벤제토늄 클로라이드(benzethonium chloride); 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀(resorcinol); 사이클로헥사놀(cyclohexanol); 3-펜탄올(3-pentanol); 및 m-크레졸); 저 분자량 (약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역 글로불린과 같은 단백질; 폴리 비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 단당류, 이당류 및 글루코스, 마노스(mannose) 또는 덱스트린을 포함하는 다른 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 수크로스(sucrose), 만니톨, 트레할로스(trehalose) 또는 소르비톨(sorbitol)과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대-이온(salt-forming counter-ions); 금속 착물 (예 : Zn- 단백질 착물); 및 / 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비이온성 계면 활성제.
일부 측면에서 완충제가 조성물에 포함된다. 적합한 완충제는 예컨대, 시트르산, 시트르산 나트륨, 인산, 인산 칼륨 및 다양한 다른 산 및 염을 포함한다. 일부 측면에서, 2 종 이상의 완충제의 혼합물이 사용된다. 완충제 또는 이의 혼합물은 일반적으로 총 조성물의 약 0.001 중량 % 내지 약 4 중량 %의 양으로 존재한다. 투여 가능한 약학 조성물의 제조 방법은 공지되어있다. 자세한 예시적인 방법은 예컨대, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)에 기재되어 있다.
제형은 수용액을 포함할 수 있다. 제형 또는 조성물은 또한, 세포로 치료되는 특정 징후(particular indication), 질환 또는 상태에 유용한 하나 이상의 활성 성분, 바람직하게는 세포에 상보적인 활성을 갖는 활성 성분을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 활성은 서로 악영향을 미치지 않는다. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 효과적인 양으로 조합하여 적합하게 존재한다. 따라서, 일부 구현예에서, 약학 조성물은, 화학치료제, 예컨대, 아스파라기나제(asparaginase), 부설판(busulfan), 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cisplatin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 플루오로유라실(fluorouracil), 젬시타빈(gemcitabine), 히드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 파클리탁셀(paclitaxel), 리툭시맙(rituximab), 빈블라스틴(vinblastine) 및/또는 빈크리스틴(vincristine)과 같은 다른 약학적 활성제 또는 약물을 추가로 포함한다.
일부 구현예에서 조성물은 멸균 액체 제제, 예컨대, 등장성 수용액, 현탁액, 유제, 분산액 또는 점성 조성물로서 제공되며, 이는 일부 측면에서 선택된 pH로 완충될 수 있다. 액체 조성물은, 예컨대, 물, 식염수(saline), 포스페이트 완충 식염수, 폴리올(polyol)(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 이들의 적합한 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있는 담체를 포함할 수 있다. 멸균 주사용 용액은 적절한 담체, 희석제 또는 부형제, 예컨대, 멸균수, 생리 식염수, 포도당, 덱스트로오스(dextrose) 등과의 혼합물과 같은 용매에 세포를 혼입시킴으로써 제조될 수 있다. 조성물은 투여 경로 및 원하는 제형에 따라, 습윤제, 분산제 또는 유화제(예컨대, 메틸셀룰로오스), pH 완충제, 겔화 또는 점도 향상 첨가제, 보존제, 향미제 및/또는 색소와 같은 보조 물질을 포함할 수 있다. 적절한 준비를 준비하기 위해 일부 측면에서 표준 텍스트를 참조할 수 있다.
항균 방부제, 항산화제, 킬레이트제 및 완충제를 포함하여 조성물의 안정성 및 무균 성을 향상시키는 다양한 첨가제가 첨가될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항균제 및 항진균제, 예컨대, 파라벤, 클로로 부탄올, 페놀 및 소르브산에 의해 보장될 수 있다. 주사 가능한 약학 형태의 흡수를 지속시키는 것은 흡수 지연제, 예컨대, 알루미늄 모노스테아레이트(aluminum monostearate) 및 젤라틴을 사용함으로써 야기될 수 있다.
일부 구현예에서, 제형 완충제는 동결보존제(cryopreservative)를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 1.0% 내지 30% DMSO 용액, 예컨대, 5% 내지 20% DMSO 용액 또는 5% 내지 10% DMSO 용액을 포함하는 동결보존 용액(cyropreservative solution)로 제형화된다. 일부 구현예에서, 동결보존 용액은, 예컨대, 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민 (HSA)을 함유하는 PBS, 또는 다른 적합한 세포 동결 배지이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 동결보존 용액은 예컨대, 적어도 7.5% DMSO이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 처리 단계(processing steps)는 동결보존 용액(cryopreservative solution)에서 세포를 대체하기 위해 형질도입된 및/또는 팽창된 세포를 세척하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 최종 농도가 12.5%, 12.0%, 11.5%, 11.0%, 10.5%, 10.0%, 9.5%, 9.0%, 8.5%, 8.0%, 7.5%, 7.0%, 6.5%, 6.0%, 5.5% 또는 5.0% 또는 약 12.5%, 12.0%, 11.5%, 11.0%, 10.5%, 10.0%, 9.5%, 9.0%, 8.5%, 8.0%, 7.5%, 7.0%, 6.5%, 6.0%, 5.5% 또는 5.0%인 DMSO 또는 1% 내지 15%, 6% 내지 12%, 5% 내지 10% 또는 6% 내지 8%인 DMSO 배지 및/또는 용액에서 동결, 예컨대, 동결, 예컨대, 동결건조(cryofrozen) 또는 동결보존(cryopreserved)된다. 특정 구현예에서, 최종 농도가 5.0%, 4.5%, 4.0%, 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.0%, 1.5%, 1.25%, 1.0%, 0.75%, 0.5% 또는 0.25% 또는 약 5.0%, 4.5%, 4.0%, 3.5%, 3.0%, 2.5%, 2.0%, 1.5%, 1.25%, 1.0%, 0.75%, 0.5% 또는 0.25%인 HSA, 또는 0.1% 내지 5%, 0.25% 내지 4%, 0.5% 내지 2%, 또는 1% 내지 2%인 HAS 배지 및/또는 용액으로 동결, 예컨대, 동결건조(cryofrozen) 또는 동결보존(cryopreserved)된다.
일부 구현예에서, 제형화는, 배양된 또는 팽창된 세포와 같은 세포의 세척, 희석 또는 농축을 포함하는 하나 이상의 처리 단계를 사용하여 수행된다. 일부 구현예에서, 처리(processing)는, 주어진 복용량 또는 이의 분획으로 투여하기위한 세포 수를 포함하는 단위 용량 형태 조성물과 같은, 원하는 농도 또는 수로 세포의 희석 또는 농도를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 처리 단계는 부피 감소를 포함하여 원하는 바에 따라 세포의 농도를 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 처리 단계는 부피-부가를 포함하여 원하는 바에 따라 세포의 농도를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 처리는 형질도입 및/또는 팽창된 세포에 다량의 제형 완충제를 첨가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형 완충제의 부피는 10mL 내지 1000mL 또는 약 10mL 내지 1000mL, 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 또는 약 또는 50mL, 100mL, 200mL, 300mL, 400mL, 500mL, 600 mL, 700 mL, 800 mL, 900 mL 또는 1000 mL이다.
일부 구현예에서, 세포 조성물을 제형화하기 위한 이러한 처리 단계는 폐쇄 시스템에서 수행된다. 이러한 처리 단계의 예시는, 세포 처리 시스템과 관련된 하나 이상의 시스템 또는 키트와 연계되어 원심 챔버를 사용하여 수행될 수 있으며, 예컨대, Sepax® 또는 Sepax 2® 세포 처리 시스템과 함께 사용하기위한 것을 포함하는, Biosafe SA에 의해 생산 및 판매되는 원심 챔버와 같다. 예시적인 시스템 및 프로세스는 국제 공개 번호 WO2016/073602에 기재되어있다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 원심 챔버의 내부 공동으로부터 제형화된 조성물을 발현시키는 단계를 포함하며, 이는 전술한 바와 같은 상기 구현예들 중 어느 하나에서, 약학적으로 허용되는 완충제와 같은, 제형화 완충제로 제형화된 세포의 결과 조성물이다. 일부 구현예에서, 제형화된 조성물의 발현은, 본원에 기재된 생물 의학 재료 용기의 바이알(vials)과 같은 용기에 대한 것이며, 이는 폐쇄 시스템의 일부로서 원심 챔버와 작동 가능하게 연결되어있다. 일부 구현예에서, 생체 의학 재료 용기는 하나 이상의 처리 단계를 수행하는 폐쇄 시스템 또는 장치에 통합 및/또는 작동 가능하게 연결 및/또는 통합된 또는 작동 가능하게 연결되도록 구성된다. 일부 구현예에서, 생체 의학 재료 용기는 출력 라인 또는 출력 위치에서 시스템에 연결된다. 일부 경우에, 폐쇄 시스템은 입구 튜브에서 생체 의학 용기의 바이알(vial)에 연결된다. 본원에 기술된 생체 의학 재료 용기와 함께 사용하기위한 예시적인 폐쇄 시스템은 Sepax® 및 Sepax® 2 시스템을 포함한다.
일부 구현예에서, 원심 챔버 또는 세포 처리 시스템과 관련된 폐쇄 시스템은, 튜빙 라인의 각 단부에, 제형화된 조성물의 발현을 위해 하나 또는 복수의 용기가 연결될 수 있는 포트로 연결된, 다방향 튜빙 매니폴드(multi-way tubing manifold)를 포함하는 다중 포트 출력 키트(multi-port output kit)를 포함한다. 일부 측면에서, 원하는 수 또는 복수의 바이알(vials)은 멀티-포트 출력(multi-port output)의 하나 이상, 일반적으로 2 개 이상, 예컨대, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8 개 이상의 포트(ports)에 멸균 연결될 수 있다. 예컨대, 일부 구현예에서, 하나 이상의 용기, 예컨대, 생체 의학 재료 용기는 포트 또는 모든 포트보다 적은 포트에 부착될 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 시스템은 출력 조성물의 생체 의학 용기의 복수의 바이알로의 발현에 영향을 줄 수 있다.
일부 측면에서, 세포는 단일 단위 용량 투여(single unit dosage administration) 또는 다중 용량 투여(multiple dosage administration)와 같은, 용량 투여량으로 복수의 출력 용기 중 하나 이상, 예컨대, 바이알(vials)에 발현될 수 있다. 예컨대, 일부 구현예에서, 바이알은 각각 주어진 용량 또는 이의 분획으로 투여하기위한 세포의 수를 포함할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 각각의 바이알은 투여를 위한 단일 단위 용량을 포함할 수 있고 또는 2 개 이상의 바이알과 같은 복수의 바이알 중 하나 이상, 또는 바이알의 3 개 이상이 되도록 원하는 용량의 분획을 포함할 수 있고, 함께 투여를 위한 용량을 구성한다.
따라서, 용기, 예컨대, 백 또는 바이알은 일반적으로 투여될 세포, 예컨대, 이의 하나 이상의 단위 용량을 포함한다. 단위 용량은 개체에게 투여될 세포의 양 또는 수, 또는 투여될 세포 수의 2 배(또는 그 이상)일 수 있다. 이것은 대상에게 투여될 세포의 최저 용량 또는 최저 가능 용량일 수 있다.
일부 구현예에서, 각각의 용기, 예컨대, 백(bags) 또는 바이알(vials)은 별도로 단위 용량의 세포를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 용기 각각은 동일하거나 대략 또는 실질적으로 동일한 수의 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 각각의 단위 용량은 적어도 또는 적어도 약 1 x 106, 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107또는 1 x 108 개의 조작된 세포, 총 세포, T 세포 또는 PBMCs를 함유한다. 일부 구현예에서, 각 용기, 예컨대, 백 또는 바이알에서 제형화된 세포 조성물의 부피는 10mL 내지 100mL, 예컨대, 적어도 또는 적어도 약 20mL, 30mL, 40mL, 50mL, 60mL, 70mL, 80mL, 90mL 또는 100mL이다. 일부 구현예에서, 용기, 예컨대, 백 또는 바이알 내의 세포는 동결보존(cryopreserved)할 수 있다. 일부 구현예에서, 용기, 예컨대, 바이알은 추가 사용까지 액체 질소에 저장될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 방법에 의해 생성된 이러한 세포 또는 이러한 세포를 포함하는 조성물은 질환 또는 상태를 치료하기 위해 개체에게 투여된다.
F. 출력 조성물의 예시적인 특징
특정 구현예에서, 제공된 방법은 하나 이상의 입력 조성물 및/또는 단일 생물학적 샘플로부터 농축된 T 세포의 하나 이상의 출력 조성물을 생산 또는 생성하는 공정과 관련하여 사용된다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 출력 조성물은 재조합 수용체, 예컨대, TCR 또는 CAR을 발현하는 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 공정은 예컨대, 본원에 기재된 임의의 것과 같이 mTOR 활성을 억제하는 작용제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서의 세포의 인큐베이션, 조작 및/또는 배양을 포함한다. 특정 구현예에서, 출력 조성물의 세포는 치료, 예컨대, 자가 세포 치료로서 개체에게 투여하기에 적합하다.
일부 구현예에서, 출력 조성물의 세포는 상기 기재된 바와 같이 본원에 제공된 방법에 의해 재조합 수용체를 발현하도록 조작된다. 특정 구현예에서, 출력 조성물의 세포는 키메릭 항원 수용체(CAR), 예컨대, 항 -CD19 CAR을 발현하도록 조작된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 출력 조성물은 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 조성물이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 출력 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 조성물을 포함한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 출력 조성물은 농축된 CD8+ T 세포의 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 출력 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 출력 조성물 및 농축된 CD8+ T 세포의 출력 조성물을 포함한다.
일부 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포의 출력 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD4+ T 세포 포함한다. 특정 구현예에서, 출력 조성물은, 재조합 수용체를 발현하고/하거나 재조합 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)로 형질도입되거나 형질감염된 CD4+ T 세포를 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%로 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포의 출력 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 CD8+ T 세포를 포함하고/하거나 CD8+ T 세포를 포함하지 않으며/거나 CD8+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 농축된 CD8 + T 세포의 출력 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%의 CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 실시에서, 조성물은, 재조합 수용체를 발현하고/하거나 재조합 폴리 뉴클레오타이드(polynucleotide)로 형질도입되거나 형질감염된 CD 8+ T 세포를 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100%로 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD8+ T 세포의 출력 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만 또는 0.01% 미만의 CD4+ T 세포를 포함하고/하거나 CD4+ T 세포를 포함하지 않으며/거나 CD4+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다.
특정 구현예에서, 제공된 방법과 관련된 공정은 예시적 및/또는 대안적인 공정과 비교된다. 일부 구현예에서, 대안적 및/또는 예시적인 공정은, 제공된 방법과 관련된 공정과 유사하거나 동일하지만, 예외적으로, 세포(예컨대, 농축된 CD4+ T 세포, 농축된 CD8+ T 세포 및/또는 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함하는 입력 세포, 자극된 세포 및/또는 조작된 세포)의 조성물은 mTOR 억제제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서 인큐베이션, 조작 및/또는 배양되지 않는다. 일부 구현예에서, 예시적인 대안적 공정의 출력 세포는, mTOR 활성을 억제하는 작용제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에, 예컨대, 조작된 T 세포를 팽창시키기 위해 미리 배양되지 않는다. 일부 구현예에서, 예시적인 대안적 방법에 의해 생성된 출력 세포는, 제공된 방법과 관련하여 생성된 조성물의 세포와 동일한 재조합 수용체를 발현하도록 조작된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자는, 예시적인 대안적 공정, 예컨대, mTOR 억제제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서 세포가 배양되지 않는 공정의 출력 세포에서의 발현과 비교하여 출력 조성물의 세포에 의해 차별적으로 발현된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 유전자는, 예시적인 대안적 공정에 의해 생성된 출력 세포와 비교하여 출력 조성물의 세포에서 하향 조절된다. 일부 구현예에서, 대사 스트레스 반응(metabolic stress response), T 세포 활성화, Th1 및 Th2 활성화 경로, 세포주기 정지(cell cycle arrest), 당질코르티코이드 생합성(glucocorticoid biosynthesis), 다 능성 줄기 세포로부터의 조혈(hematopoiesis from pluripotent stem cells), T 세포 활성화, 림프구 분화, 백혈구 이동, 시스테인-유형 엔도펩티다제(cysteine-type endopeptidase) 억제제 활성, 세포주기 진행, 영양 수준에 대한 반응(response to nutrient levels) 및 성장 인자 수용체 신호(growth factor receptor signaling)과 관련된 하나 이상의 유전자는 예시적인 대안적 공정에 의해 생성된 출력 세포와 비교하여 출력 조성물의 세포에서 하향 조절된다.
특정 구현예에서, 하나 이상의 유전자는, mTOR를 억제하는 작용제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에 수행되지 않는 공정과 같은, 예시적인 대안적 공정에 의해 생성된 출력 세포와 비교하여 출력 조성물의 세포에서 상향 조절된다. 일부 구현예에서, 성장 인자 수용체 시그널링(growth factor receptor signaling), 지방산 산화, 공통-감마 사이토카인 수용체 신호 전달 경로(common-gamma cytokine receptor signaling pathway), 단백질 탈당화, T 세포 활성화, 세포주기 진행 림프구 분화, Th1 및 Th2 활성화 경로, 스테롤 항상성(sterol homeostasis), 다능성 줄기 세포로부터의 조혈, 세포사멸적 과정(apoptotic process), T 세포 활성화, 및 RAR 활성화, 및 이온 매개 시그널링(ion-mediated signaling)과 관련된 하나 이상의 유전자는 예시적인 대안적 공정에 의해 생성된 출력 세포와 비교하여 출력 조성물의 세포에서 상향 조절된다.
일부 구현예에서, 출력 조성물은, 재조합 수용체를 발현하도록 조작된 세포, 예컨대, CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하며, 이는 항원, 예컨대, 항원에 의해 자극되는 것과 동일하거나 더 큰 반응을 갖고, 이는 예시적인 대안적 공정, 예컨대, mTOR 억제제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서 세포가 배양되지 않는 공정에 의해 생성된 출력 세포와 비교하여 재조합 수용체에 의해 결합 및/또는 인식된다. 일부 구현예에서, 출력 조성물의 세포는, 다음에 의한 자극에 반응하여 당분해 대사, mTOR 활성, 사이토카인 생성, 세포용해 활성(cytolytic activity), 팽창 및/또는 증식에서 동일하거나 더 큰 증가를 생성할 수 있고/있거나 동일하거나 더 크게 증가할 수 있다.
일부 구현예에서, 출력 세포는 예시적/대안적 공정 (예컨대, 세포가 mTOR 억제제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에 인큐베이션, 조작, 및 처리되지 않은 공정)에 의해 생성된 출력 세포와 파라미터, 속성 및/또는 활성과 관련하여 유사한 반응을 갖는다. 일부 구현예에서, 출력 세포의 유사한 반응의 측정은 예시적인 대안적 공정에 의해 생성 된 출력 세포에 의한 반응의 측정과 통계적으로 상이하지 않다. 일부 구현예에서, 출력 세포의 유사한 반응의 측정은, 예시적인 대안적 공정에 의해 생성된 출력 세포에 의한 반응 측정의 25%, 20%, 10%, 5% 또는 1% 이내이다.
특정 구현예에서, 세포 대사의 변화, 예컨대, 당분해 대사 속도는, 면역 세포 기능의 드라이버 및/또는 조절제로서 기능할 수 있다. 일부 구현예에서, 출력 조성물의 세포는 예시적인 대안적 공정(예컨대, 세포가 mTOR 억제제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서 배양되지 않는 공정)에 의해 생성된 출력 세포와 항원 자극에 의한 당분해 대사 속도에서 유사한 증가를 갖는다. 일부 구현예에서, 출력 조성물의 세포는 항원에 의한 자극에 반응하여 당분해 대사 속도가 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배 또는 5 배, 약 또는 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배 또는 5 배 증가한다. 특정 구현예에서, 항원 자극에 반응한 당분해 대사의 증가는, 예시적인 대안적 공정에 의해 생성된 출력 세포에서의 항원 자극에 의한 당분해 대사 대사 속도의 증가보다 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50% 또는 100% 더 크다. 특정 구현예에서, 당분해 대사는, 산소 소비 및 산 생성(ECAR)의 세포외 측정을 포함하는 임의의 공지된 수단에 의해 측정될 수 있다.
특정 구현예에서, 출력 조성물의 세포는 예시적인 대안적 공정(예컨대, 세포가 mTOR 억제제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서 배양되지 않는 공정)에 의해 생성된 출력 세포와 항원 자극에 의한 mTOR 활성의 유사한 증가를 갖는다. 일부 구현예에서, 출력 조성물의 세포는 항원에 의한 자극에 반응하여 mTOR 활성이 25%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배 또는 5 배, 약 또는 적어도 25%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150%, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배 또는 5 배 증가한다. 특정 구현예에서, 항원 자극에 반응하여 증가된 mTOR 활성은 예시적인 대안적 공정에 의해 생성된 출력 세포에서의 항원 자극에 의한 mTOR 활성의 증가보다 적어도 25%, 50%, 75% 또는 100% 더 크다.
특정 구현예에서, 출력 조성물의 세포는 항원-자극에 반응하여, 예시적인 대안적 공정(예컨대, 세포가 mTOR 억제제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에 배양되지 않는 공정)에 의해 생성된 출력 세포와 유사한 사이토카인 생산(cytokine production)을 갖는다. 일부 구현예에서, 출력 조성물의 세포는, 항원 자극에 반응하여, 예시적인 대안에 의해 생성된 출력 세포와 유사한 사이토카인, 예컨대, TNF- 알파, IFN- 감마 및/또는 IL-2 생산을 갖는다. 일부 구현예에서, 출력 조성물의 세포는, 항원에 의한 자극에 반응하여, mTOR를 억제하는 작용제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에 수행되지 않은 대안적인 공정과 비교하여, 하나 이상의 사이토카인의 생산에서 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배 또는 5 배, 약 또는 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배 또는 5 배 증가한다. 특정 구현예에서, 항원 자극에 반응하여 증가된 mTOR 활성은, 예시적인 대안적 공정에 의해 생성된 출력 세포에서 항원 자극 후 하나 이상의 사이토카인의 생산보다 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50% 또는 100% 더 크다. 일부 구현예에서, 사이토카인의 생산은 ELISA 및/또는 항체 기반 검출 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는 표준 공지 기술에 의해 측정 또는 평가될 수 있다.
특정 구현예에서, 출력 조성물의 세포는, 항원-자극에 반응하여, 예시적인 대안적 공정(예컨대, 세포가 mTOR 억제제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서 배양되지 않는 공정)에 의해 생성된 출력 세포의 하나 이상의 사이토카인을 생산하는 세포의 부분, 백분율 및/또는 양과 유사한 부분, 백분율 및/또는 양을 갖는다. 특정 구현예에서, 출력 조성물의 세포의 약 또는 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% 또는 100%는 하나 항원-자극에 반응하여, 하나 이상의 사이토카인, 예컨대, TNF- 알파, IFN- 감마 및/또는 IL-2를 생산한다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인을 생성하는 출력 조성물 세포의 부분, 백분율 및/또는 양은, 하나 이상의 사이토카인을 생성하는 예시적인 대안적 공정에 의해 생산된 출력세포의 부분, 백분율 및/또는 양보다 약 또는 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 75%, 100%, 125%, 150% 또는 1 배, 2 배, 3 배 더 크다. 특정 구현예에서, 사이토카인을 생성하는 세포의 부분, 백분율 및/또는 양은 세포내 사이토카인 염색(ICS) 분석법을 포함하는 임의의 공지된 또는 표준 기술에 의해 측정되거나 평가 될 수 있다.
특정 구현예에서, 출력 조성물의 세포는, 예시적인 대안적 공정(예컨대, 세포가 mTOR 억제제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서 인큐베이션, 조작 및/또는 배양되지 않는 공정)에 의해 생성된 출력 세포로서 재조합 수용체(예컨대, 표적 세포)에 의해 결합되고/되거나 재조합 수용체에 의해 인식되는 항원을 발현하는 세포에 대해 유사한 세포용해 활성(cytolytic activity)을 갖는다. 일부 구현예에서, 출력 조성물의 세포가 항원, 예컨대, 표적 세포를 발현하는 세포에 노출될 때, 출력 조성물의 세포는, 항원을 발현하는 세포의 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%, 약 또는 적어도 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%를 사멸시킨다. 특정 구현예에서, 출력 조성물의 세포는, 유사하거나 동일한 조건 하에 예시적인 대안적 공정에 의해 생성된 출력 세포보다, 항원, 예컨대, 표적 세포를 발현하는 세포를 적어도 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 또는 1 배, 2 배, 3 배, 4배, 또는 5배 더 많은 양 사멸시킨다.
특정 구현예에서, 예시적인 대안적 공정(예컨대, 세포가 mTOR 억제제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서 배양되지 않는 공정)에 의해 생성된 출력 세포의 부분, 백분율 및/또는 양과 비교하여, 출력 조성물의 세포는 하나 이상의 피로 마커(markers of exhaustion)를 발현하는 세포의 적은, 줄어든 및/또는 감소된 부분, 백분율 및/또는 양을 갖는다. 특정 구현예에서, 더 적은 또는 약 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 의 출력 조성물의 세포는 하나 이상의 피로 마커(markers of exhaustion)를 발현한다. 특정 구현예에서, 출력 조성물에서 하나 이상의 피로 마커(markers of exhaustion)를 발현하는 세포의 부분, 백분율 및/또는 양은, 예시적인 대안적 공정에 의해 생성된 출력 조성물에서 하나 이상의 마커를 발현하는 세포의 부분, 백분율 및/또는 양보다 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 또는 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 더 적다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 피로 마커(markers of exhaustion)는 CTLA-4, FOXP3, PD-1, TIGIT, LAB-3, 2B4, BTLA, TIM3, VISTA, 및/또는 CD96이거나 이를 포함한다.
다양한 구현예에서, 출력 조성물의 세포는, 예시적인 대안적인 공정 (예컨대, 세포가 mTOR 억제제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서 배양되지 않는 공정)에 의해 생성된 출력 세포의 부분, 백분율 및/또는 양과 비교하여, 분화되는 세포의 적은, 줄어든 및/또는 감소된 부분, 백분율 및/또는 양을 갖는다. 특정 구현예에서, 출력 조성물의 세포는 대안적인 방법에 의해 생성된 세포보다 덜 분화된다. 특정 구현예에서, 출력 조성물의 덜 분화된 세포는, 예시적인 대안적 공정에 의해 생성 된 더 분화된 세포보다 자극, 활성화, 팽창, 사이토카인 반응, 세포 용해 활성 또는 항-종양 활성에 대한 더 큰 용량을 갖거나 포함한다.
일부 구현예에서, 제공된 방법은, 기억-유사 T 세포(memory-like T cells)의 수 또는 백분율이 증가된 세포의 출력 조성물, 예컨대, 수명이 긴 기억 T 세포(long-lived memory T cells)와 같이, 덜 분화되고 수명이 긴 집단 T 세포(long-lived population T cells)를 생성한다. 일부 구현예에서, 이러한 기억 T 세포는 중앙 기억 T 세포 (TCM) 또는 T 기억 줄기 세포 (TSCM) 세포이다. 일부 구현예에서, 기억 T 세포는 TSCM 세포이다. 일부 구현예에서, 출력 조성물의 세포는, 기억-유사 표현형, 예컨대, 수명이 긴 기억 T 세포를 갖는 세포의 수 또는 백분율이 증가하거나 더 많을 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 중 장기 기억 T 세포 또는 기억 줄기 세포(TSCM)와 같은 기억 유사 T 세포의 수 또는 백분율은, 예시적인 대안적 공정(예컨대, 세포는 mTOR 억제제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서 배양되지 않는 공정)에 의해 생성된 상응하는 출력 세포 집단의 수 또는 백분율과 비교하여, 적어도 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 10 배 증가한다.
특정 구현예에서, 출력 조성물의 세포는 개체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 출력 조성물의 세포는 질환 또는 상태를 치료하기 위해 투여된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 상태는 암이다. 일부 구현예에서, 출력 조성물이 개체에게 투여되는 세포, 및 개체는 암 세포 및/또는 종양 부피의 감소를 경험한다. 일부 구현예에서, 개체는, 예컨대, 투여 전 개체에서 암 세포의 양 및/또는 종양 부피와 비교하여, 출력 조성물의 세포의 투여 후, 25%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 100%, 약 또는 적어도 25%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, 100%의 암 세포의 양 및/ 또는 종양 감소를 갖는다. 일부 구현예에서, 출력 조성물의 세포의 투여는, 예시적인 대안 공정(예컨대, 세포는 mTOR 억제제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서 배양되지 않는 공정)에 의해 생성된 출력 세포의 투여 후 개체에서의 종양 부피 및/또는 암 세포의 감소와 비교하여, 개체에서 종양 부피 및/또는 암 세포의 감소를 증가시킨다. 특정 구현예에서, 출력 조성물의 세포의 투여는, 예시적인 대안적 공정에 의해 생성된 출력 세포의 투여 후 개체에서의 종양 부피 및/또는 암 세포의 양의 감소와 비교하여, 개체에서 종양 부피 및/또는 암 세포 양의 감소를 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배, 약 또는 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 1 배, 2 배, 3 배, 4 배, 5 배 증가시킨다.
특정 구현예에서, 출력 조성물의 세포, 예컨대, 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포는, 개체, 예컨대, 투여 후 개체로부터 수득한 혈청 샘플과 같은 생물학적 샘플에서 검출될 수 있다. 특정 구현예에서, 출력 조성물의 세포는, 출력 조성물의 세포의 투여 후, 개체에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 주 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8 주 후, 또는 3, 6, 12, 18, 24, 30, 또는 36 개월 또는 적어도 3, 6, 12, 18, 24, 30, 또는 36 개월, 또는 1, 2, 3, 4, 5 년 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5 년 또는 그 이후에 검출 가능하다. 일부 구현예에서, 출력 조성물의 세포의 투여는, 예시적인 대안적 공정(예컨대, 세포는 mTOR 억제제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서 배양되지 않는 공정)에 의해 생성된 출력 세포와 비교하여, 투여 후 in vivo 지속성을 증가 또는 향상시킨다. 특정 구현예에서, 출력 조성물의 세포의 투여는 개체에서, 예시적인 대안 프로세스에 의해 생성된 출력 세포보다, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 주 동안, 약 또는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 주 동안, 또는 3, 6, 12, 18, 24, 30 또는 36 개월 동안, 약 또는 적어도 3, 6, 12, 18, 24, 30 또는 36 개월 동안, 또는 1, 2, 3 년 동안 또는 약 또는 적어도 1, 2, 3 년 동안 또는 그 이상의 더 긴 기간 동안 검출가능하다.
일부 구현예에서, 출력 조성물의 세포를 개체, 예컨대, 암과 같은 질환 또는 상태를 갖는 개체에게 투여하면 생존 가능성 및/또는 확률이 향상된다. 예컨대, 일부 구현예에서, 출력 조성물의 세포는 질환 또는 상태가 있는 개체에 투여되고, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월, 약 또는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개월, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 10 또는 10 년 이상 생존 가능성 및/또는 확률이 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%이다. 특정 구현예에서, 출력 조성물의 세포와의 투여는, 예시적인 대안적 공정(예컨대, 세포는 mTOR 억제제, 예컨대, 화합물 63의 존재 하에서 인큐베이션, 조작 및/또는 배양되지 않는 공정)의 출력 세포와의 투여와 비교하여, 적어도 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 125%, 150%, 또는 적어도 1 배, 2 배, 3 배, 4 배 또는 5 배 더 큰 생존 확률 및/또는 생존 가능성을 제공한다.
Ⅱ. MTOR 활성을 억제하는 작용제
일부 구현예에서, 제공된 방법의 하나 이상의 단계는 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 수행된다. mTOR은, 라파마이신(rapamycin)의 포유 동물 표적, 라파마이신(rapamycin)의 기계적 표적, FK506- 결합 단백질 12- 라파마이신 복합체 관련 단백질 1, FKBP12- 라파마이신 복합체 관련 단백질, 라파마이신 및 FKBP12 표적 1, 라파마이신 표적 단백질 1, FRAP, FRAP1, FRAP2, RAFT1, 및 RAPT1으로 알려져있다. 일부 구현예에서, 인간 mTOR 단백질은 Uniprot No.: P42345에 해당한다. 일부 구현예에서, 인간 mTOR 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 34에 제시되어 있다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는, mTOR의 하나 이상의 활성을 억제, 감축 및/또는 감소 하고/하거나 억제, 감축 및/또는 감소시킬 수 있다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTOR 키나아제 활성을 억제, 감축 및/또는 감소시키고/시키거나 억제, 감축 및/또는 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, mTOR은 보존된 트레오닌(threonine) 및 세린(serine) 단백질 키나아제(kinase)이고, 포스파티딜이노시톨-3-키나아제 관련 키나아제(phosphatidylinositol-3-kinase-related kinases) (PIKK)의 패밀리에 속한다. mTOR는 기질에서 트레오닌 및 세린 잔기를 인산화시키는 단백질 키나아제이다. 특정 측면에서, mTOR은 mTOR 복합체 1 (mTORC1) 및 복합체 2 (mTORC2)로 지칭되는 2 개의 다-단백질 복합체의 촉매 서브 유닛으로서 작용한다. 특정 측면에서, mTORC1 및 mTORC2가 포스포이노시톨-3 키나아제 (phosphoinositol-3 kinase) (PI3K) 및 Akt 신호 전달 경로에 관여한다는 사실에도 불구하고, mTORC1 및 mTORC2는 서로 독립적으로 기능한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 활성, 예컨대, mTORC1 키나아제 활성 및/또는 mTORC2 활성을 억제, 감축 및/또는 감소시키고/시키거나 억제, 감축 및/또는 감소시킬 수 있다.
일부 측면에서, mTORC1은 5 가지 성분을 갖는 단백질 복합체이다: 복합체의 촉매 서브 유닛인 mTOR; mTOR(Raptor)의 조절 관련 단백질; Sec13 단백질 8(mLST8, GβL로도 알려짐)에 의한 포유 동물 치사; 프롤린이 풍부한 AKT 기질 40 kDa (PRAS40); 및 DEP-도메인-포함 mTOR- 상호 작용 단백질(Deptor). 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 복합체의 형성을 방지 및/또는 불안정화시킨다.
특정 측면에서, mTORC2는 6 개의 상이한 단백질을 포함하고, 이들 중 몇몇은 mTORC1 및 mTORC2에 공통이다: mTOR; mTOR의 라파 마이신-민감성 동반자(Rictor); 포유 동물 스트레스 활성화 단백질 키나아제 상호 작용 단백질 (mSIN1); Rictor-1로 관찰 된 단백질(Protor-1); mLST8; 및 뎁터(Deptor). 특정 구현예에서, 활성을 억제하는 작용제는 mTORC2 복합체의 형성을 방지 및/또는 불안정화시킨다.
일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는, mTOR의 하나 이상의 활성을 억제, 감소, 예방하고/하거나 억제, 감소 또는 예방할 수 있는 화합물, 작은 분자, 예컨대, 작은 유기 분자, 폴리뉴클레오타이드(polynucleotide), 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), siRNA, 폴리펩타이드(polypeptide) 또는 단편, 이소형(isoform), 변이체(variant), 유사체(analog) 또는 이의 유도체이다. 일부 구현예에서, 작용제는 작은 분자다. 특정 구현예에서, 작용제는 10 kD 미만, 9 kD 미만, 8 kD 미만, 7 kD 미만, 6 kD 미만, 5 kD 미만, 4 kD 미만, 3kD 미만, 2kD 미만, 1kD 미만, 0.5kD 미만 또는 0.1kD 미만의 분자량을 갖는 작은 분자다. 일부 구현예에서, 작용제는 핵산, 펩타이드, 폴리펩타이드, 펩타이도미메틱(peptidomimetics), 펩토이드(peptoids), 탄수화물, 지질, 이의 성분 또는 다른 유기 또는 무기 분자이거나 이를 포함하는 작은 분자다. 곰팡이, 박테리아 또는 조류 추출물과 같은 화학적 및/또는 생물학적 혼합물의 라이브러리(Libraries)는 당업계에 공지되어 있으며 본 발명의 임의의 분석으로 스크리닝될 수 있다. 분자 라이브러리의 합성 방법의 예는 다음에서 찾을 수 있다: (Carell et al , 1994a; Carell et al , 1994b; Cho et al , 1993; DeWitt et al, 1993; Gallop et al, 1994; Zuckermann et al, 1994)
특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 하나 이상의 mTOR 활성을 특이적으로 및/또는 선택적으로 억제한다. 다양한 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTOR 단백질의 하나 이상의 활성, 예컨대, 그의 기질 중 적어도 하나 이상, 예컨대, p70S6 키나아제 1, 4E-BP1, Akt 및 eEF2 에서 세린/트레오닌 단백질 키나아제의 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORCl, mTORC2, 또는 mTORCl 및 mTORC2 둘 다에 직접 결합하여 이를 억제하고/하거나 직접 결합 및 억제할 수 있다. 일부 구현예에서, 작용제에 의한 mTOR 활성의 억제는 비가역적이다. 특정 구현예에서, 작용제에 의한 mTOR 활성의 억제는 가역적이다.
특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 500 μM 미만, 200 μM 미만, 100 μM 미만, 50 μM 미만, 10 μM 미만, 5 μM 미만, 1 μM 미만, 500 nM 미만, 200 nM 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 10 nM 미만, 5 nM 미만, 1 nM 미만 또는 500 pM 미만의 IC50을 갖는다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 1 nM 내지 500 μM, 1 nM 내지 500 nM, 1 μM 내지 500 μM, 10 μM 내지 100 μM, 100 nM 내지 1 μM, 250 nM 내지 750 nM, 50 nM 내지 200 nM, 또는 400 nM 내지 600 nM의 IC50을 갖는다. 일부 구현예에서, IC50의 결정(determinations)은 임의의 공지된 표준 및/또는 통상적인 기술을 사용하여 달성될 수 있다. 예컨대, 일부 구현예에서, IC50은 연구 중인 억제제의 농도 범위의 존재 하에 mTOR 활성을 측정함으로써 결정될 수 있다. 실험적으로 얻어진 효소 활성 값은 사용된 억제제 농도에 대해 표시된다. 50% 효소 활성을 나타내는 억제제의 농도 (임의의 억제제가 없는 경우의 활성과 비교하여)는 " IC50" 값으로 간주된다. 유사하게, 다른 억제 농도는 적절한 활성 측정을 통해 정의될 수 있다. 일부 구현예에서, IC50은 무세포 분석에서 측정된다. 특정 구현예에서, IC50은 세포 배양 분석(cell culture assay)에서 측정된다. 특정 구현예에서, 세포 배양은 T 세포 배양, 예컨대, 1 차 T 세포 배양이다.
일부 구현예에서, mTORCl 및/또는 mTORC2 활성의 억제는 mTORC1 및/또는 mTORC2의 하류(downstream)에서 신호 전달(signal transduction)의 감소에 의해 결정될 수 있다. 이러한 신호 경로의 출력의 감소를 확립하기 위해 다양한 판독이 이용될 수 있다. 예컨대, 일부 구현예에서, mTORC2 활성에 대한 비-제한적인 예시적 판독은 (1) S473 및 T308을 포함하나 이에 한정되지 않는 잔기에서 Akt의 인산화 감소 및/또는 (2) 입증된 바와 같이 Akt의 활성화 감소, 예컨대, Fox01 및 Fox03a T24/32, GSK3-베타 S21/9 및 TSC2 T1462를 포함하지만 이에 한정되지 않는 Akt 기질의 인산화의 감소에 의한 것을 포함한다. 특정 구현예에서, mTORC1 활성의 비제한적인 예시적인 판독은 리보솜 S6 S240/244, S6K1 T389 및 4EBP1 T37/46을 포함하지만 이에 한정되지 않는, mTORC1의 하류에 신호 전달 분자(signaling molecules)의 인산화 감소를 포함한다. 특정 구현예에서, mTORC1 및/또는 mTORC2 억제의 예시적인 판독은 암성 세포의 증식 억제이다.
위치-특이적 인산화를 이용한 단백질 측정, 검출 및/또는 평가는 항체 염색 기술 및 면역 분석, 효소 결합 면역 흡착 분석(enzyme-linked immunosorbent assay)(ELISA), 효소 면역 분석(EIA), 방사선 면역 분석(radioimmunoassay)(RIA), 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance)(SPR), 웨스턴 블롯 또는 단백질 분석을 포함하는 임의의 공지된 수단에 의해 수행될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 또한, mTOR와 구조적으로 유사하고 /하거나 mTOR(팬(pan)-억제제)와 동일하거나 실질적으로 유사한 활성을 갖는 키나아제(kinases)를 억제할 수 있다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 또한, 포스포이노시톨-3 키나아제(phosphoinositol-3 kinase) 활성(PI3K)을 억제한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 활성, mTORC2 활성 및 PI3K 활성을 억제한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1, mTORC2 및 PI3K의 키나아제(kinases) 활성을 억제한다. 특정 측면에서, PI3K 활성의 감소를 확립하기 위해 다양한 판독이 이용될 수 있다. 일부 구현예에서, 이러한 판독은 (1) S473 및 T308을 포함하나 이에 한정되지 않는 잔기에서 Akt의 인산화 감소, 및/또는 (2) 예컨대, Fox01 및 Fox03a T24/32, GSK3-beta S21/9 및 TSC2 T1462를 포함하지만 이에 한정되지 않는 Akt 기질의 인산화의 감소에 의해 입증된 바와 같이 Akt의 활성화의 감소, 및/또는 (3) 포스파티딜이노시톨 (3,4,5) 트리포스페이트(phosphatidylinositol (3,4,5) trisphosphates) (PIP3)의 양, 수준 또는 농도의 감소를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제, 예컨대, mTORC1 및/또는 mTORC2 키나아제(kinase) 활성은 또한 PI3K를 억제한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 500 μM 미만, 200 μM 미만, 100 μM 미만, 50 μM 미만, 10 μM 미만, 5 μM 미만, 1 μM 미만, 500nM 미만, 200nM 미만, 100nM 미만, 50nM 미만, 10nM 미만, 5nM 미만 1 nM 미만 또는 500 pM 미만의 IC50 (활동의 50%를 억제하는 농도)으로 PI3K, mTORCl 및 mTORC2의 활성을 억제한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 1 nM 내지 500 μM, 1 nM 내지 500 nM, 1 μM 내지 500 μM, 1 nM 내지 1 μM, 10 μM 내지 100 μM, 100 nM 내지 1 μM, 250 nM 내지 750 nM, 50 nM 내지 200 nM 또는 400 nM 내지 600 nM의 IC50으로 PI3K, mTORCl 및 mTORC2의 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, IC50은 무세포 분석에서 측정된다. 특정 구현예에서, IC50은 세포 배양 분석에서 측정된다. 특정 구현예에서, 세포 배양은 T 세포 배양, 예컨대, 1 차 T 세포 배양이다. 특정 구현예에서, 이러한 작용제는 PI-103, SF1126 (Semafore), BGT226 (Novartis), XL765 (Exelixis), PF-04691502, 및 NVP-BEZ235 (Novartis)를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 PI-103, SF1126, BGT226, XL765, PF-04691502, and NVP-BEZ235이다.
일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 PI3K 활성을 억제하지 않는다. 특정 실시 구현예에서, 작용제는 mTOR 활성에 대한 IC50에서 PI3K 활성을 검출 가능하게 감축, 억제 또는 감소시키지 않는다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 PI3K 활성에 대한 IC50이, mTOR 활성에 대해 IC50보다 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1 배, 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 적어도 5 배, 적어도 10 배, 적어도 50 배, 또는 적어도 100 배 더 크다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는, PI3K 활성에 비해, mTORC1 및 mTORC2 키나아제 활성을 억제, 예컨대, 선택적으로 억제한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성의 억제제는 피라졸로피리미딘(pyrazolopyrimidine), 토린 1(Torin l), 토르키닙(Torkinib)(PP242), PP30, Ku-0063794, WAY-600(Wyeth), WAY-687(Wyeth), WAY-354 (Wyeth) 또는 AZD8055이다.
특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 500 μM 미만, 200 μM 미만, 100 μM 미만, 50 μM 미만, 10 μM 미만, 5 μM 미만, 1 μM 미만, 500 nM 미만, 200 nM 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 10 nM 미만, 5 nM 미만, 1 nM 미만 또는 500 pM 미만의 IC50으로 mTORC1을 선택적으로 억제한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 1 nM 내지 500 μM, 1 nM 내지 500 nM, 1 μM 내지 500 μM, 10 μM 내지 100 μM, 100 nM 및 1 μM, 250 nM 내지 750 nM, 50 nM 내지 200 nM, 또는 400 nM 내지 600 nM의 IC50으로 mTORCl의 활성을 억제한다. 일부 구현예에서, IC50은 무세포 분석에서 측정된다. 특정 구현예에서, IC50은 세포 배양 분석에서 측정된다. 특정 구현예에서, 세포 배양은 T 세포 배양, 예컨대, 1차 T 세포 배양이다.
일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC2 및/또는 PI3K 활성에 비해 mTORC1 활성을 선택적으로 억제한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는, PI3K 활성에 대한 IC50이, mTORC1 활성에 대해 IC50보다 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 100%, 적어도 150%, 적어도 1 배, 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 적어도 5 배, 적어도 10 배, 적어도 50 배, 또는 적어도 100 배 더 크다. 일부 구현예에서, 작용제는 라파마이신(sirolimus)이다. 특정 구현예에서, 작용제는 라파로그(rapalog)이다.
특정 구현예에서, 라파로그(rapalog)는 mTOR FRB 도메인(FKBP 라파마이신 결합 도메인)에 결합하고/하거나 이에 결합할 수 있고, 라파마이신(rapamycin)과 구조적으로 관련되고/되거나 라파마이신의 mTORC1 억제 특성을 보유한다. 일부 구현예에서, 라파로그(rapalog)는 라파마이신의 에스테르(ester), 에테르(ether), 옥심(oxime), 히드라존(hydrazine) 및/또는 히드록실아민(hydroxylamine) 이고/거나, 라파마이신 코어 구조상의 작용기가 예컨대, 환원 또는 산화에 의해 변형된 화합물이다. 이러한 화합물의 약학적으로 허용가능한 염은 또한 라파마이신 유도체인 것으로 간주된다. 본원에서 고려되는 방법에 사용하기에 적합한 라파로그(rapalog)의 설명에 도움이되는 예시는 템시로리무스(temsirolimus)(CC1779), 에버로리무스(everolimus)(RAD001), 데포로리 무스(deforolimus)(AP23573), AZD8055(AstraZeneca) 및 OSI-027(OSI)을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
일부 구현예에서, 작용제는 PCT 공개 번호: WO2008/051493; WO2008/051494; 또는 WO2010 /062571; 및/또는 미국 특허 번호: 7,981,893; 8,372,976; 7,968,556; 8,383,634; 8,110,578; 또는 8,492,381에 기재되어 있으며, 이들 모두는 본원에 참고로 포함된다.
특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화학식 1에 제시된 화학식을 갖거나 포함한다:
[화학식 1]
Figure pct00009
상기 R1은 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이고,
R2는 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이며,
R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 C1-8 알킬이다.
일부 구현예에서, mTOR을 억제하는 작용제는 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR을 억제하는 작용제는 R1이 치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 헤테로아릴, 예컨대, 치환된 페닐인 화학식 1의 화합물이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화학식 1의 화합물이거나 이를 포함하고, 여기서 R2는 치환 또는 비치환된 아릴, 예컨대, 치환 또는 비치환된 페닐이다. 특정 구현예에서, mTOR을 억제하는 작용제는, 화학식 1의 화합물이거나 이를 포함하고, 여기서 치환된 그룹은 하나 이상의 할로겐; C1-8 알킬; C2-8 알케닐; C2-8 알키닐; 하이드록실; C1-8 알콕시; 아미노; 니트로; 티올(thiol); 티오에테르(thioether); 이민; 시아노; 아미도; 포스포 나토(phosphonato); 포스핀; 카르복실; 티오카르보닐(thiocarbonyl); 술포닐; 술폰아마이드; 케톤; 알데히드; 에스테르; 카르보닐; 할로알킬; B(OH)2; 카르보시클릭 사이클로알킬(carbocyclic cycloalkyl), 헤테로사이클로알킬(heterocycloalkyl), 모노시클릭(monocyclic) 또는 융합 또는 비-융합 폴리시클릭 아릴(polycyclic aryl) 또는 헤테로아릴(heteroaryl); 아미노; O- 저급 알킬; O- 아릴, 아릴; 아릴-저급 알킬; CO2CH3; CONH2; OCH2CONH2; NH2; SO2NH2; OCHF2; CF3; 또는 OCF3 그룹으로 치환되며, 여기서 이들 그룹 각각은 선택적으로 치환된다.
일부 구현예에서, 화학식 1에 제시된 화학식을 갖거나 포함하는 작용제는 화합물 63이다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 63이다. 일부 구현예에서, 화합물 63은 2-(3-하이드록시페닐)-9-(2-이소프로필페닐)-8-옥소-8,9-디하이드로-7H-퓨린-6-카보사마이드[2-(3-hydroxyphenyl)-9-(2-isopropylphenyl)-8-oxo-8,9-dihydro-7H-purine-6-carboxamide]이다. 일부 측면에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 2-(3-하이드록시페닐)-9-(2-이소프로필페닐)-8-옥소-8,9-디하이드로-7H-퓨린-6-카보사마이드[2-(3-hydroxyphenyl)-9-(2-isopropylphenyl)-8-oxo-8,9-dihydro-7H-purine-6-carboxamide] 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이다. 특정 측면에서, 화합물 63은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00010
(화합물63).
특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화학식 2에 제시된 화학식을 갖거나 포함한다:
[화학식 2]
Figure pct00011
상기 L는 직접 결합, NH 또는 O이고,
Y는 N 또는 CR3이고,
상기 R1은 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 C2-8 알케닐, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이다.
R2는 H, 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이다.
R3는 H, 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, -NHR4　또는 -N(R4)2이며,
R4는 각각의 경우 독립적으로 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이다.
일부 구현예에서, mTOR을 억제하는 작용제는 화학식 2의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 R1이 치환된 페닐, 예컨대, 치환된 페닐인 화학식 2에 기재된 화학식을 갖거나 포함한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 상기 Y가 CH인 화학식 2에 기재된 화학식을 갖거나 포함한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 상기 L은 직접 결합인 화학식 2에 기재된 화학식을 갖거나 포함한다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는, 상기 R1이 치환 또는 비치환된 아릴이고, R2가 알콕시, 아미노, 히드록시, 사이클로알킬 또는 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 C1-8 알킬인 화학식 2에 기재된 화학식을 갖거나 포함한다.
특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는, 치환될 때 "치환된 또는 비치환된" 기가 하나 이상의 임의의 치환기로 치환될 수 있는 화학식 2의 화학식을 갖거나 포함한다. 치환기의 예는, 본원에 개시된 예시적인 화합물 및 구현예뿐만 아니라, 할로 (예컨대, 클로로, 요오도, 브로모 또는 플루오로); C1-8 알킬; C2-8 알케닐; C2-8 알키닐; 하이드록실; C1-8 알콕시; 아미노; 니트로; 티올; 티오에테르; 이민; 시아노; 아미도; 포스포나토; 포스핀; 카르복실; 카바모일; 카바메이트; 아세탈; 요소; 티오카르보닐; 술포닐; 술폰아마이드; 설피닐; 케톤; 알데히드; 에스테르; 아세틸; 아세톡시; 산소(= O); 할로알킬 (예컨대, 트리플루오로 메틸); 치환된 아미노아실 및 아미노알킬; 모노시클릭 또는 융합 또는 비융합 폴리시클릭(polycyclic)일 수 있는 카르보시클릭 사이클로알킬 (예컨대, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸 또는 사이클로헥실), 또는 모노시클릭 또는 융합 또는 비융합 폴리시클릭 일 수 있는 헤테로사이클로알킬 (예컨대, 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 푸라닐 또는 티아지닐); 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭, 모노시클릭 또는 융합 또는 비융합 폴리시클릭 아릴 (예컨대, 페닐, 나프틸, 피롤릴, 인돌릴, 푸라닐, 티에닐, 이미다졸릴, 옥사졸릴, 이속사졸릴, 티아졸릴, 트리아졸릴, 테트라졸릴, 피라졸릴, 피리디닐, 퀴놀리닐, 이소 퀴놀리닐, 아크리디닐,피라지닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 벤즈이미다졸릴, 벤조티에닐 또는 벤조푸라닐); 아미노(1 차, 2 차 또는 3 차); -O-저급 알킬; -O-아릴; 아릴; 아릴-저급 알킬; CO2CH3; CONH2; OCH2CONH2; NH2; N(C1-4 알킬)2; NHC(O)C1-4 알킬; SO2NH2; SO2C1-4 알킬; OCHF2; CF3; OCF3; 및 이러한 잔기는 또한 융합-고리 구조 또는 브릿지, 예컨대, -OCH20- 또는 -0-저급 알킬렌-0-에 의해 임의로 치환될 수 있다. 이들 치환기는 임의로 상기 군으로부터 선택된 치환기로 추가로 치환될 수 있다.
특정 구현예에서, 화학식 2에 제시된 화학식을 갖거나 포함하는 작용제는 화합물 155이다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 155이다. 일부 측면에서, 화합물 155는 6-(4-(2H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)-1-(2-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)에틸)-1H-이미다조[4,5-b]피라진-2(3H)-온[6-(4-(2H-1,2,4-Triazol-3-yl)phenyl)-1-(2-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)ethyl)-1H-imidazo [4,5-b]pyrazine-2(3H)-one]이다. 일부 측면에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 6-(4-(2H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)-1-(2-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)에틸)-1H-이미다조[4,5-b]피라진-2(3H)-온[6-(4-(2H-1,2,4-Triazol-3-yl)phenyl)-1-(2-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)ethyl)-1H-imidazo [4,5-b]pyrazine-2(3H)-one] 또는 그의 약학상 허용가능한 염 또는 용매화물이다. 특정 측면에서, 화합물 155는 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00012
(화합물 155).
특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화학식 3에 기재된 화학식을 갖거나 포함한다:
[화학식 3]
Figure pct00013
상기 R1은 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이고,
R2는 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭알킬, 치환된 또는 비치환된 아랄킬, 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬알킬이며,
R3는 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬이다.
일부 구현예에서, mTOR을 억제하는 작용제는 화학식 3의 화합물 또는 그의 약학상 허용가능한 염 또는 용매화물이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화학식 3의 화학식을 갖거나 포함하며, 상기 R1은 치환 또는 비치환된 아릴(aryl) 또는 치환 또는 비치환된 헤테로아릴(heteroaryl), 예컨대, R1은 각각 임의로 치환 된 페닐, 피리딜, 피리미딜, 벤즈이미다졸릴, 1H-피롤로 [2,3-b]피리딜(1H-pyrrolo[2,3-b ]pyridyl), 인다졸릴, 인돌릴, 1H-이미다조[4,5-b]피리딜(lH-imidazo[4,5-b]pyridyl), 1H- 이미다조[4,5-b]피리딘-2(3H)-오닐(lH-imidazo[4,5-b]pyridin-2(3H)-only), 3H-이미다조[4,5-b] 피리딜(3H-imidazo[4,5-b]pyridyl) 또는 피라졸릴(pyrazolyl)이다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는, 화학식 3의 화학식을 갖거나 포함하며, 상기 R1은 치환 또는 비치환된 C1-8 알킬(예컨대, 메틸)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체로 치환된 페닐, 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴(예컨대, 치환 또는 비치환된 트리아졸릴 또는 피라졸릴), 아미노카르보닐, 할로겐(예컨대, 플루오린), 시아노, 히드록시알킬 및 히드록시이다. 다른 구현예에서, R1은 치환 또는 비치 환 된 C1-8 알킬 (예컨대, 메틸), 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴 (예컨대, 치환 또는 비치환된 트리아졸릴), 할로겐, 아미노카보닐, 시아노, 하이드록시알킬 (예컨대, 하이드록시프로필), -OR 및 -NR2으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체로 치환된 피리딜이며, 여기서 각 R은 독립적으로 H 또는 치환 또는 비치환된 C1-4 알킬이다. 일부 구현예에서, R1은 1H-피롤로[2,3-b]피리딜(1H-pyrrolo[2,3-b]pyridyl) 또는 벤즈이미다졸릴이며, 치환 또는 비치환된 C1-8 알킬 및 -NR2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되고, 여기서 R은 독립적으로 H, 또는 치환 또는 비치 환 된 C1-4 알킬이다.
일부 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화학식 3으로 표시되는 화학식을 갖거나 포함하며 상기 R1은 다음과 같다.
Figure pct00014
상기 R은 각 경우 독립적으로 H, 또는 치환 또는 비치환된 C1-4 알킬(예컨대, 메틸)이고; R1은 각 경우 독립적으로 치환 또는 비치환된 C1-4 알킬(예컨대, 메틸), 할로겐 (예컨대, 플루오로), 시아노, -OR 또는 -NR2이고; m은 0-3이고; n은 0-3이다. 치환기 R'중 임의의 것은 융합된 고리 시스템에서 임의의 고리의 임의의 적합한 원자에 부착될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
화학식 3의 화합물의 일부 구현예에서, R2는 H, 치환 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환 또는 비치환된 헤테로시클릴, 치환 또는 비치환된 C1-4 알킬-헤테로시클릴, 치환 또는 비치환된 C1-4 알킬-아릴, 또는 치환 또는 비치환된 C1-4 알킬-사이클로 알킬이다. 예컨대, R2는 각각 임의로 치환된 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로피라 닐, (C1-4 알킬)-페닐, (C1-4 알킬)-사이클로프로필, (C1-4알킬)-사이클로뷰틸, (C1-4알킬)-사이클로 펜틸, (C1-4 알킬)-사이클로헥실, (C1-4 알킬)-피롤리딜, (C1-4 알킬)-피페리딜, (C1-4알킬)-피페라 지닐, (C1-4 알킬)-모르폴리닐, (C1-4 알킬)-테트라히드로푸라닐 또는 (C1-4 알킬)-테트라히드로 피라닐이다.
특정 구현예에서, R2는 H, C1-4 알킬, (C1-4 알킬) (OR)이며,
Figure pct00015
여기서 R은 각 경우 독립적으로 H, 또는 치환 또는 비치환된 C1-8 알킬이고, R'는 각각의 경우 독립적으로 H, -OR, 시아노 또는 치환 또는 비치환된 C1-8 알킬이며, p는 0 내지 3이다.
특정 구현예에서, 화학식 3에 제시된 화학식을 갖거나 포함하는 작용제는 화합물 246이다. 특정 구현예에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 246이다. 일부 측면에서, 화합물 246은 7-(6-(2-하이드록시프로판-2-일)피리딘-3-일)-1-((1r,4r)-4-메톡시사이클로헥실)-3,4-디하이드로피라지노[2,3-b]피라진-2(1H)-온[7-(6-(2-hydroxypropan-2-yl)pyridin-3-yl)-1-((1r,4r)-4-methoxycyclohexyl)-3,4-dihydropyrazino[2,3-b]pyrazin-2(1H)-one]이다. 일부 측면에서, mTOR 활성을 억제하는 작용제는 7-(6-(2-하이드록시프로판-2-일)피리딘-3-일)-1-((1r,4r)-4-메톡시사이클로헥실)-3,4-디하이드로피라지노[2,3-b]피라진-2(1H)-온[7-(6-(2-hydroxypropan-2-yl)pyridin-3-yl)-1-((1r,4r)-4-methoxycyclohexyl)-3,4-dihydropyrazino[2,3-b]pyrazin-2(1H)-one], 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 용매화물이다. 특정 측면에서, 화합물 246은 하기 화학식을 갖는다:
Figure pct00016
(화합물 246)
Ⅲ. 장기 자극을 위한 방법
제공된 본원은 세포 조성물, 예컨대, 세포 조성물의 표현형, 특성 또는 활성을 평가하기 위해 유용한 장기 자극 방법(본원에서 장기 자극을 위한 방법이라고도 함)이다. 일부 구현예에서, 장기 자극 방법은 세포에서 재조합 수용체-의존적 활성(예컨대, CAR-의존적 활성)을 자극하기 위한 조건 하에, 세포 조성물, 예컨대, CAR과 같은 재조합 수용체를 발현하는 세포를 함유하는 입력 조성물이거나 이를 포함한다. 그러한 구현예에서, 재조합 수용체-의존적 활성은 항원 또는 재조합 수용체, 예컨대, CAR의 항원 결합 도메인에 의해 인식되는 다른 작용제의 존재를 통한 것과 같은, 재조합 수용체, 예컨대, CAR의 자극에 특이적인, 또는 재조합 수용체를 특이적으로 자극하는 활성이다. 일부 측면에서, 세포 조성물, 예컨대, 입력 조성물은 항원에 특이적으로 결합하거나 인식하는 세포외 항원-결합 도메인을 포함하는 재조합 수용체(예컨대, CAR)를 발현하는 T 세포를 함유한다. 일부 측면에서, 인큐베이션은 만성적으로 자극된 세포의 특성을 나타내는 세포를 포함하거나, 항원에 장기간 노출된 세포의 T 세포 조성물, 예컨대, 출력 조성물을 초래한다.
특정 구현예에서, 재조합 수용체 활성, 예컨대, CAR 의존성 활성을 자극하기 위한 조건은 세포 조성물, 예컨대, 입력 조성물을 재조합 수용체, 예컨대, CAR의 항원 결합 도메인에 결합하는, 예컨대, 특이적으로 결합하는 결합 분자와 같은, 결합 분자와 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 특정 구현예에서, 결합 분자는 지지체에 부착된다. 특정 구현예에서, 지지체는 세포 배양 플레이트 또는 디쉬의 표면, 마이크로 플레이트 내 웰, 또는 입자 또는 비드의 표면과 같은 고체 지지체이다. 일부 측면에서, 인큐베이션은 세포 배양 플레이트 또는 접시, 또는 표면 부착된 결합 분자를 가진 마이크로 플레이트에서 실시되거나 수행된다. 일부 측면에서, 인큐베이션은 결합 분자를 함유하는 복수의 입자 또는 비드의 존재 하에 실시되거나 수행된다. 특정 측면에서, 결합 분자는 비드 또는 입자에 표면 부착된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 in vitro 또는 ex vivo에서 실시되거나 수행된다.
다양한 구현예에서, 세포, 예컨대, 입력 조성물의 세포는 세포 분열, 성장, 팽창 또는 활성화를 촉진하는 추가 작용제 없이 배지의 존재 하에 결합 분자와 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 세포는 임의의 추가 조작, 예컨대, 배지 변화, 비드 교체, 또는 세포의 분리 또는 재플레이트 없이, 연장된 시간, 예컨대, 14일 동안 입자와 인큐베이션된다.
일부 측면에서, 장기 자극 방법은 입력 조성물, 예컨대, 재조합 수용체를 결합하거나 이를 인식하는 결합 분자의 존재 하에 재조합 수용체-발현 세포 조성물을 함유하는 세포 조성물을 인큐베이션하는 단계를 포함한다. 일부 측면에서, 인큐베이션을 위해 선택된 시간은 만성 자극된 세포 또는 조성물의 세포의 하나 이상의 기능 또는 활성이 인큐베이션의 종료 또는 말단에서 항원에 장기간 노출된 세포의 특징을 나타내는 시간이다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 재조합 수용체에 의해 결합되거나 인식되는 항원(재조합 항원 또는 그의 단편와 같은)이다. 특정 구현예에서, 결합 분자는 재조합 수용체에 결합하거나 이를 인식하는 항-ID이다. 일부 구현예에서, 그러한 특징은 감소된 생존성, 활성, 또는 지속성 또는 증가된 고갈 또는 분화의 증거를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본원에 제공된 장기 자극 방법은 특히, 유지되거나 연장된 지속성, 생존성 또는 활성과 같은, in vivo 투여시 원하는 특징을 가질 수 있는 세포 조성물을 확인하기 위해 유용하다. 일부 구현예에서, 분석은 향상되거나 연장된 지속성, 활성, 또는 생존성을 향상시키거나, 고갈 또는 분화를 감소시킬 수 있는 차이를 확인하기 위해 2개 이상 상이한 세포 조성물에 대해 수행된다. 일부 구현예에서, 그러한 차이는 조작된 공정의 하나 이상 단계 또는 절차 동안 작용제, 예컨대, mTOR 키나아제 활성을 억제하는 작용제의 존재와 같은, 제조 공정의 측면을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 장기 자극 방법은 생존성, 활성 또는 지속성을 증가 또는 유지하거나, 마커, 예컨대, 바이오 마커의 발현, 증가된 생존성의 지표, 활성, 또는 지속성을 증가 또는 유지하는 작용제를 확인하기 위한 2개 이상 세포 조성물에서 수행된다. 특정 구현예에서, 장기 자극 방법은 고갈 또는 분화(예컨대, 노화 상태로의 분화와 같은)를 감소 또는 예방하거나, 증가된 고갈 또는 분화의 마커 지표의 발현을 감소시키는 세포 조성물에서 분화를 확인하기 위한 2개 이상 세포 조성물에서 수행된다. 일부 구현예에서, 결합 분자는 세포 배양 플레이트 또는 디쉬의 표면과 같은, 고체 표면에 접합되거나 부착된다. 특정 구현예에서, 결합 분자는 입자, 예컨대, 비드에 접합 또는 부착된다.
특정 구현예에서, 장기 자극 방법은 결합 분자, 예컨대, 재조합 수용체에 결합하거나 이를 인식하는 결합 분자를 함유하는, 입자, 예컨대, 비드의 존재 하에 세포를 인큐베이션하는 단계이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 결합 분자는 항원, 예컨대, 재조합 수용체에 의해 인식되거나 결합된 그의 단편의 재조합 항원이다. 특정 구현예에서, 항원은 질환, 예컨대, 암과 관련된 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드의 일부이다. 일부 구현예에서, 항원은 질환, 예컨대, 암 세포 및/또는 종양 세포와 관련된 세포의 표면에서 발현되는 폴리펩타이드, 또는 폴리펩타이드의 변이체 또는 단편이다.
일부 구현예에서, 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산탈수효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250로 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로 공지됨), 암태아성 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5, 또한 Fc 수용체 유사 5 또는 FCRH5로 공지됨), 태아성 아세틸콜린 수용체(태아성 AchR), 폴레이트 결합 단백질(FBP), 폴레이트 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 5D(GPRC5D), Her2/neu (수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-멜라노마-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복 함유 8 패밀리 멤버 A(LRRC8A), 루이스 Y, 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 온코페탈 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 세포영양막 당단백(TPBG, 또한 5T4로 공지됨), 종양-연관 당단백 72(TAG72), 티로시나아제 연관 단백질 1(TRP1, 또한 TYRP1또는 gp75로 공지됨), 티로시나아제 연관 단백질 2(TRP2, 또한 도파크롬 토토머라아제, 도파크롬 델타-이소머라아제 또는 DCT로 공지됨), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2), 윌름스 종양 1(WT- 1), 병소-특이적 또는 병소-발현 항원, 또는 유니버설 태그로 연관된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병소에 의해 발현되는 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커의 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 연관된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 재조합 BCMA, CD19, CD22, 또는 ROR1이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항-ID는 재조합 수용체의 세포외 항원-결합 도메인의 일부인 표적 항체 또는 항원-결합 단편(예컨대, scFv)을 특이적으로 인식하는 항-이디오 타입 항체 또는 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 항원-결합 도메인은 질환 또는 상태, 예컨대, 암의 세포 또는 조직과 관련되거나 발현된 표적 항원과 같은, 표적 항원과 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편(예컨대, scFv)을 함유한다. 일부 구현예에서, 항-ID는 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산탈수효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250로 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로 공지됨), 암태아성 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5, 또한 Fc 수용체 유사 5 또는 FCRH5로 공지됨), 태아성 아세틸콜린 수용체(태아성 AchR), 폴레이트 결합 단백질(FBP), 폴레이트 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 5D(GPRC5D), Her2/neu (수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-멜라노마-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복 함유 8 패밀리 멤버 A(LRRC8A), 루이스 Y, 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 온코페탈 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 세포영양막 당단백(TPBG, 또한 5T4로 공지됨), 종양-연관 당단백 72(TAG72), 티로시나아제 연관 단백질 1(TRP1, 또한 TYRP1또는 gp75로 공지됨), 티로시나아제 연관 단백질 2(TRP2, 또한 도파크롬 토토머라아제, 도파크롬 델타-이소머라아제 또는 DCT로 공지됨), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2), 윌름스 종양 1(WT- 1), 병소-특이적 또는 병소-발현 항원, 또는 유니버설 태그로 연관된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병소에 의해 발현되는 분자를 결합하는 표적 항체 또는 항원-결합 단편을 특이적으로 인식하는 항-이디오타입 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화되는 항원은 공지된 임의의 다수의 B 세포 마커와 같은, B 세포 악성종양과 관련된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-ID는 항-CD19 CAR의 항원-결합 도메인에 결합한다.
일부 구현예에서, 입자(예컨대, 비드)는 자기장에서 반응한다. 일부 구현예에서, 입자는 자성 입자(예컨대, 자성 비드)이다. 일부 구현예에서, 자성 입자는 상자성이다. 특정 구현예에서, 자성 입자는 초상자성이다. 특정 구현예에서, 입자, 예컨대, 비드는 그들이 자기장에 노출되지 않는 한 어떠한 자기 특성도 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 입자 또는 비드는 1μm 내지 10μm 또는 약 1μm 내지 10μm의 직경을 가진다. 특정 구현예에서, 입자, 예컨대, 비드는 2.8㎛ 또는 약 2.8㎛ 의 평균 직경을 가진다. 일부 구현예에서, 입자, 예컨대, 비드는 4.8㎛ 또는 약 4.8㎛ 의 평균 직경을 가진다.
특정 구현예에서, 세포의 입력 조성물의 세포는 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 또는 21일 동안 또는 약 또는 적어도 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 또는 21일 동안 결합 분자, 예컨대, 결합 분자를 함유하는 입자 또는 비드와 함께 인큐베이션된다. 다양한 구현예에서, 세포 또는 세포의 조성물은 10일 내지 21일, 12일 내지 18일 또는 14일 및 16일 동안 또는 약 10일 내지 21일, 12일 내지 18일 또는 14일 및 16일 동안 결합 분자, 예컨대, 결합 분자를 함유하는 입자 또는 비드와 함께 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포는 14 일 동안, 또는 약 또는 적어도 14 일 동안 결합 분자, 예컨대, 결합 분자를 함유하는 입자 또는 비드와 함께 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 세포 조성물의 세포는 실온 보다 높은 온도에서, 결합 분자, 예컨대, 결합 분자를 함유하는 입자 또는 비드와 함께 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, 인큐베이션은 약 25℃ 보다 높은 온도, 예컨대, 일반적으로 32℃, 35℃ 또는 37℃ 초과 또는 약 32℃, 35℃ 또는 37℃ 초과의 온도에서 수행된다. 일부 구현예에서, 처리, 접촉 또는 인큐베이션은 37℃±2℃ 또는 약 37℃±2℃의 온도, 예컨대, 37℃ 또는 약 37℃의 온도에서 수행된다.
일부 구현예에서, 세포는 세포, 예컨대, T 세포, 분열, 성장, 팽창, 또는 활성화를 촉진하는 추가 작용제 없이, 배지의 존재 하에 결합 분자를 함유하는 결합 분자, 예컨대, 입자 또는 비드와 인큐베이션된다. 일구 구현예에서, 세포는 임의의 재조합 사이토카인 없이 결합 분자와 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 중단없이 연속적으로 수행된다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 정적 조건 하에 일어난다. 특정 구현예에서, 인큐베이션은 관류, 혼합, 요동 또는 진탕없이 일어난다. 일부 측면에서, 결합 분자는 인큐베이션의 전체 기간 동안 존재한다. 특정 구현예에서, 결합 분자는 인큐베이션 동안 변화되거나 대체되지 않는다. 특정 구현예는 일부 측면에서, 배지가 임의의 재조합 사이토카인을 함유하지 않았기 때문에, 인큐베이션 동안 배지에 존재하는 사이토카인은 예컨대, 세포의 재조합 수용체 및 입자의 결합 분자 사이의 상호 작용에 반응하여, 세포에 의해 생성되었을 것으로 생각된다.
일부 구현예에서, 결합 분자의 양, 예컨대, 결합 분자를 함유하는 입자 또는 비드의 양은 세포 당 1개 결합 분자 내지 1012개 결합 분자 또는 약 1개 결합 분자 내지 1012개 결합 분자, 예컨대, 102개 결합 분자 내지 1010 결합 분자, 103 결합 분자 내지 108 결합 분자, 104 결합 분자 내지 106 결합 분자, 1 결합 분자 내지 102 결합 분자, 102 결합 분자 내지 103 결합 분자, 103 결합 분자 내지 104 결합 분자, 104 결합 분자 내지 105 결합 분자, 105 결합 분자 내지 106 결합 분자, 105 결합 분자 내지 106 결합 분자, 106 결합 분자 내지 107 결합 분자, 107 결합 분자 내지 108 결합 분자, 또는 109 결합 분자 내지 1010 결합 분자, 또는 약 102개 결합 분자 내지 1010 결합 분자, 103 결합 분자 내지 108 결합 분자, 104 결합 분자 내지 106 결합 분자, 1 결합 분자 내지 102 결합 분자, 102 결합 분자 내지 103 결합 분자, 103 결합 분자 내지 104 결합 분자, 104 결합 분자 내지 105 결합 분자, 105 결합 분자 내지 106 결합 분자, 105 결합 분자 내지 106 결합 분자, 106 결합 분자 내지 107 결합 분자, 107 결합 분자 내지 108 결합 분자, 또는 109 결합 분자 내지 1010 결합 분자를 제공하기에 충분하다. 일부 구현예에서, 결합 분자의 양, 예컨대, 결합 분자를 함유하는 입자 또는 비드의 양은 각각의 세포에 대해 104 개 결합 분자 내지 약 106 개 결합 분자를 제공하기에 충분한 양이다. 일부 구현예에서, 입자, 예컨대, 비드의 양은 각 세포에 대해 약 105 개 결합 분자를 함유한다.
일부 구현예에서, 입력 조성물은 각각 10:1 내지 1:10, 5:1 내지 1:5, 3:1 내지 1:3, 또는 2:1 내지 1:2 또는 약 10:1 내지 1:10, 5:1 내지 1:5, 3:1 내지 1:3, 또는 2:1 내지 1:2로부터 입자, 예컨대, 비드에 대한 총 세포의 비로 결합 분자를 함유하는 입자, 예컨대, 비드와 인큐베이션된다. 특정 구현예에서, 비는 1:0.2 내지 1:5 또는 약 1:0.2 내지 1:5이다. 일부 구현예에서, 입자, 예컨대, 비드에 대한 입력 조성물의 총 세포의 비는 약 1:1이다.
일부 구현예에서, 제공된 분석은 상이한 세포 또는 세포 조성물을 비교하는데 사용될 수 있다. 예컨대, 일부 구현예에서, 동일한 재조합 수용체, 예컨대, 동일한 CAR을 발현하는 세포를 각각 함유하는 둘 이상의 세포 조성물은 세포를 재조합 수용체에 결합하거나 이를 인식하는 동일한 결합 분자, 예컨대, 동일한 결합을 함유하는 입자 또는 비드와 인큐베이션함으로써 비교될 수 있다. 특정 구현예에서, 둘 이상의 세포 조성물은 상이한 작용제, 예컨대, mTOR 키나아제 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 생성된다. 특정 구현예에서, 세포 조성물은 대조군 또는 기준 세포 조성물과 비교될 수 있다. 일부 측면에서, 대조군 또는 기준 세포 조성물은 임의의 인큐베이션을 거치지 않는 세포 조성물, 결합 분자를 함유하는 입자, 예컨대, 비드의 존재 하에 인큐베이션되지 않은 세포 조성물, 재조합 수용체를 발현하는 세포를 함유하지 않는 세포 조성물, 상이한 조작 공정으로부터 생성된 세포 조성물, 및/또는 비히클 또는 대조군 조성물의 존재 하에 조작된 세포 조성물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 상이한 재조합 수용체, 예컨대, 상이한 CAR을 발현하는 세포를 각각 함유하는 둘 이상의 세포 조성물은 세포를 상이한 재조합 수용체에 결합하거나 이를 인식하는 상이한 결합 분자를 함유하는 입자, 예컨대, 비드와 같은, 결합 분자와 인큐베이션함으로써 비교될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포는 인큐베이션 동안 상이한 시점에서 평가된다. 예컨대, 일부 측면에서, 하나 이상의 세포 조성물로부터 세포의 표현형, 특징 또는 활성은 중간 시점, 예컨대, 인큐베이션 완료 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%에서, 약 또는 적어도 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%에서 평가된다. 특정 구현예에서, 세포는 인큐베이션 동안 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회 또는 10회 이상 평가된다. 특정 구현예에서, 세포는 인큐베이션 동안 상이한 간격, 예컨대, 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 8일, 약 또는 적어도 6시간, 12시간, 18시간, 24시간, 36시간, 48시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 또는 8일의 간격 후에 평가된다. 일부 구현예에서, 세포는 매일 평가된다. 일부 구현예에서, 세포는 3일마다 평가된다. 특정 구현예에서, 세포는 7 일마다 평가된다.
특정 구현예에서, 세포, 예컨대, 출력 조성물의 세포는 활성, 예컨대, 항원 자극된 활성, 표현형, 또는 특징에 대해 평가된다. 일부 구현예에서, 항원 자극된 활성은 긴 자극을 위한 방법 동안 또는 후에, 예컨대, 결합 분자를 함유하는 입자, 예컨대, 비드와의 인큐베이션 동안 또는 후에, 세포 조성물의 세포에서 평가되었다. 특정 구현예에서, 평가의 결과는 상이한 세포 조성물, 예컨대, 대조군 또는 기준 세포 조성물로부터 세포에서 측정 된 동일하거나 유사한 활성의 평가와 비교된다.
일부 구현예에서, 활성은 항원-자극 활성이다. 특정 구현예는 재조합 수용체를 발현하는 T 세포와 같은, 세포의 항원-자극된 활성이 다수의 공지된 적합한 기술 중 하나에 의해 평가될 수 있음을 고려한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인의 생산은 세포내 사이토카인 염색에 의해 측정, 검출 및/또는 정량화된다. 일부 측면에서, 유세포 분석에 의한 세포내 사이토카인 염색(ICS)은 단일- 세포 수준에서 사이토카인 생산을 연구하기에 적합한 기술이다. 특정 측면에서, ICS는 항원을 발현하는 세포 또는 컨쥬게이션된 항원을 가진 입자, 예컨대, 비드 입자로와 같은 세포 자극 후 소포체 내 사이토카인의 생산 및 축적을 검출하기 위해 유용하고, 이는 특정 사이토카인의 생산에 양성 또는 음성인 세포 집단의 식별을 위해 또는 역치에 기반한 고생산 및 저생산 세포의 분리를 위해 허용된다. 또한, ICS는 세포의 특정 서브그룹에서 사이토카인 생산에 접근하기 위해 세포 표면 마커, 예컨대, CD4 또는 CD8을 사용하여 면역표현을 위한 다른 유세포 분석 프로토콜과 조합하여 사용될 수 있다. 사이토카인 생산을 측정 또는 검출하기 위한 다른 단일-세포 기술은 ELISPOT, 제한 희석 및 T 세포 클로닝을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 항원-자극된 활성은 하나 이상의 사이토카인의 생산이다. 항원 자극에 반응하여 생산될 수 있는 사이토카인은 IL-1, IL-1β, IL-2, sIL-2Ra, IL-3, IL-5, IL-6, IL-7을 포함 할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. , IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL 27, IL-33, IL-35, TNF, TNF 알파, CXCL2, CCL2, CCL3, CCL5, CCL17, CCL24, PGD2, LTB4, 인터페론 감마(IFN-γ), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 대식세포 염증성 단백질(MIP)-1a, MIP-1b, Flt-3L, 프락크탈킨(fracktalkine), 및/또는 IL-5을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 사이토카인은 하나 이상의 IL-2, IFN-감마, 또는 TNF- 알파이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 사이토카인 분비는 항원 발현 세포와 공동-배양 후 또는 부착된 항원 또는 항원 단편을 함유하는 입자, 예컨대, 비드의 인큐베이션 후 세포외 사이토카인의 양 또는 농도를 측정, 검출 또는 정량화함으로써 평가된다.
특정 구현예에서, 항원-자극된 활성은 세포용해(세포독성) 활성이다. 일부 구현예에서, 세포용해 활성은 조성물의 세포, 예컨대, 재조합 수용체를 발현하는 세포를 재조합 수용체에 의해 인식되는 항원 또는 에피토프를 발현하는 표적 세포에 노출, 인큐베이션 및/또는 접촉시킴으로써 평가된다. 세포용해 활성은 시간에 따라 표적 세포 수를 직접적으로 또는 간접적으로 측정함으로써 측정될 수 있다. 예컨대, 표적 세포는 표적 세포가 용해될 때 검출가능한 마커, 또는 생존가능한 표적 세포에서만 검출가능한 마커와 같은, 재조합 수용체 발현 세포와 인큐베이션되기 전에 검출가능한 마커와 함께 인큐베이션될 수 있다. 이들 판독 값은 표적 세포 수 및/또는 표적 세포 사멸의 직접 또는 간접을 제공하고, 분석 동안 상이한 시점에서 측정될 수 있다. 표적 세포 수의 감소 및/또는 표적 세포 사멸의 증가는 세포의 세포용해 활성을 나타낸다. 세포용해 분석을 수행하기 위한 적절한 방법은 당 업계에 공지되어 있으며, 크롬-51 방출 분석, 비-방사성 크롬 분석, 카르복시 플루오레세인 숙신 이미딜 에스테르(CFSE)와 같은 형광 염료를 사용하는 유세포 분석, PKH- 2 및 PKH-26을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 세포 조성물의 세포, 예컨대, 재조합 수용체를 발현하는 세포는 분석 동안 또는 후에, 예컨대, 결합 수용체를 함유하는 입자, 예컨대, 비드와의 인큐베이션 동안 또는 후에 하나 이상의 특징 또는 표현형에 대해 평가된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 특성 또는 표현형은 하나 이상의 활성화, 고갈 또는 분화이거나 이와 관한 것이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 표현형 또는 특성은 하나 이상의 마커, 예컨대, 바이오 마커의 존재, 부재, 양 또는 수준을 측정, 검출 또는 정량함으로써 평가된다.
일부 구현예에서, 마커, 예컨대, 활성화, 고갈, 또는 분화와 양성으로 또는 음성으로 관련된 마커의 발현은 샘플에서 마커의 수준, 양, 또는 농도의 평가, 측정, 결정, 및/또는 정량화이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 마커는 유전자 생성물, 예컨대, 유전자에 의해 암호화된 정보로 조립, 생성 및/또는 합성되는 임의의 생체분자이며, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 마커의 수준, 양 또는 농도는 형질전환(예컨대, 표준화)되거나 직접 분석(예컨대, 미가공)될 수 있다. 일부 구현예에서, 마커는 단백질이다. 특정 구현예에서, 마커는 유전자에 의해 암호화되는 폴리뉴클레타이드, 예컨대, mRNA 또는 단백질이다.
특정 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드인 마커의 양 또는 수준은 임의의 적합한 공지된 수단에 의해 평가, 측정, 결정 및/또는 정량화될 수 있다. 예컨대, 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오타이드 마커의 양 또는 수준은 역전사 효소(rt) PCR, 액적 디지털 PCR, 실시간 및 정량화 PCR 방법을 포함하는, 중합 효소 연쇄 반응(PCR)(예컨대, TAQMAN®, molecular beacon, LIGHTUP?, SCORPION?, SIMPLEPROBES® 포함; 예컨대, 미국 특허 번호 5,538,848; 5,925,517; 6,174,670; 6,329,144; 6,326,145 및 6,635,427 참고); 노던 블롯팅; 서던 블롯팅, 예컨대, 역전사 생성물 및 유도체의; 블롯팅 어레이, 마이크로어레이, 또는 in situ-합성 어레이를 포함한, 어레이 기반 방법; 및 시퀀싱, 예컨대, 합성에 의한 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 디데옥시 시퀀싱 또는 리게이션에 의한 시퀀싱, 또는 당 업계에 공지된 임의의 다른 방법에 의해 평가, 측정, 결정,및/또는 정량화되고, 예컨대, HELICOS®, ROCHE® 454, ILLUMINA®/SOLEXA®, ABI SOLiD®, 및 POLONATOR® 시퀀싱으로서 그러한 특정 플랫폼을 포함하는, Shendure et al., Nat. Rev. Genet. 5:335-44 (2004) 또는 Nowrousian, Euk. Cell 9(9): 1300-1310 (2010)에서 논의되었다. 특정 구현예에서, 핵산 유전자 생성물의 수준은 qRT-PCR에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, qRT-PCR은 각각의 유전자에 대해 3 개 핵산 세트를 사용하며, 여기서 3 개 핵산은 프라이머가 결합하는 표적 핵산의 영역들 사이에 결합하는 프로브와 함께 프라이머 쌍을 포함하고, 여기서 프라이머가 결합하며, TAQMAN® 분석으로서 상업적으로 공지된다.
특정 구현예에서, 2 개 이상 폴리뉴클레오타이드 마커의 발현은 동시에 측정 또는 평가된다. 특정 구현예에서, 다중 PCR, 예컨대, 다중 rt-PCR은 2 개 이상 유전자 생성물의 수준, 양 또는 농도를 평가, 측정, 결정 및/또는 정량화한다. 일부 구현예에서, 마이크로어레이(예컨대, AFFYMETRIX®, AGILENT® 및 ILLUMINA®-스타일 어레이)는 2 개 이상 유전자 생성물의 수준, 양 또는 농도를 평가, 측정, 결정 및/또는 정량화하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 마이크로어레이는 RNA 유전자 생성물로부터 유래된 cDNA 폴리뉴클레오타이드의 수준, 양 또는 농도를 평가, 측정, 결정 및/또는 정량화하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 폴리 뉴클레오타이드 마커의 발현은 마커 mRNA 또는 마커 mRNA로부터 유래된 cDNA 폴리뉴클레오타이드를 시퀀싱함으로써 결정된다. 일부 구현예에서, 시퀀싱은 비- Sanger 시퀀싱 방법 및/또는 차세대 시퀀싱(NGS) 기술에 의해 수행된다. 차세대 시퀀싱 기술의 예시는 Massallyly 평행 시그니쳐 시퀀싱(MPSS), 폴로니 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 가역적 염료-터미네이터 시퀀싱, SOLiD 시퀀싱, 이온 반도체 시퀀싱, DNA 나노볼 시퀀싱, 헬리오스코프 단일 분자 시퀀싱, 단일 분자 실시간(SMRT) 시퀀싱, 단일 분자 실시간(RNAP) 시퀀싱 및 Nanopore DNA 시퀀싱을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
특정 구현예에서, 마커는 단백질 또는 그의 단편이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 단백질 마커는 당업계에 공지된 임의의 적합한 수단에 의해 측정된다. 수준, 양 또는 농도 이상의 단백질 마커를 평가, 측정, 결정 및/또는 정량화하기에 적합한 방법은 면역분석, 핵산-기반 또는 단백질-기반 압타머 기술, HPLC(고정밀 액체 크로마토그래피), 펩타이드 시퀀싱(예컨대, Edman 분해 시퀀싱 또는 질량 분석법(예컨대, MS/MS), 선택적으로, HPLC에 커플링) 및 전술한 것 중의 마이크로어레이 적응(핵산, 항체 또는 단백질-단백질(즉, 비-항체) 어레이 포함)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 면역분석은 면역학적 반응에 기초하여, 예컨대, 유전자 생산물에 대한 항체 또는 항원 결합 항체 단편의 결합을 검출함으로써, 단백질을 검출하는 방법 또는 분석이거나 이를 포함한다. 면역분석은 정량적 면역세포화학 또는 면역 조직화학, ELISA(직접적, 간접적, 샌드위치, 경쟁적, 다중 및 휴대용 ELISA 포함(예컨대, 미국 특허 번호 7,510,687 참조)), 웨스턴 블롯팅(하나, 둘 이상의 차원 블롯팅 또는 다른 크로마토그래피 수단 포함, 선택적으로, 펩타이드 시퀀싱 포함 함), 효소 면역 분석(EIA), RIA(방사성 면역 분석) 및 SPR(표면 플라즈몬 공명)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 단백질 마커는 유세포 분석에 의해 측정, 검출 또는 정량화된다. 일부 측면에서, 유세포 분석은 유체의 흐름에서 세포를 현탁시키고 전자 검출 장치를 통해 그들을 통과시킴으로써 마커 검출에 채용되는 레이저- 또는 임피던스-기반의 생물물리학적 기술이다. 세포 상에 존재하는 마커는 유세포 분석에 의한 검출을 위해 형광 태그된 항체와 같이 표지될 수 있다. 일부 양상에서, 유세포 분석은 세포의 집단에 존재하는 마커의 존재, 부재, 양 또는 수준을 측정, 검출, 또는 정량화하기 위해 채용된다. 일부 측면에서, 세포의 집단은 세포 조성물또는 세포 조성물로부터 세포, 예컨대, 재조합 수용체, CD4+ T 세포, 또는 CD8+ T 세포에 대해 양성인 세포의 부분집합으로부터 총 또는 총 생존 세포일 수 있다.
특정 구현예에서, 마커는 활성화 또는 활성화-유사 상태와 양성으로 연관되거나 상관된다. 일부 구현예에서, 마커는 CD25, CD26, CD27, CD28, CD30, CD71, CD154, CD40L, CD127, LAG3, 또는 Ki67이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커는 소진 또는 소진과 관련된 상태와 양성으로 연관되거나 상관된다. 특정 구현예에서, 마커는 CTLA-4, FOXP3, PD-1, TIGIT, LAB-3, 2B4, BTLA, TIM3, VISTA, 또는 CD96의 하나 이상이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 T 세포의 분화와 연관된다. 특정 구현예에서, 마커는 CD25, CD45RO, CD56, KLRG1, CD95의 하나 이상 및/또는 CD45RA, CD27, CD28, CD62L 및 CCR7의 하나 이상이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포, 예컨대, 출력 조성물의 세포는 CD45RA, CD27, CD28, CD62L, 및 CCR7로 이루어진 군으로부터 선택된 T 세포 활성화 마커에 대해 표면 양성인; 및/또는 CD25, CD45RO, CD56, KLRG1로 이루어진 군으로부터 선택된 마커에 대해 표면 음성인; 및/또는 CD95의 낮은 발현을 가지는; 및/또는 IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10으로 이루어진 군으로부터 선택된 사이토카인의 세포내 발현에 대해 음성인 세포에 대해 평가된다. 일부에서, 출력 조성물은 CD45RA+, CD27+, CCR7+ 및/또는 CD45RO- 인 세포에 대해 평가된다.
일부 구현예에서, 출력 세포 조성물의 세포는 장기 자극 방법 후에, 예컨대, 결합 분자를 함유하는 입자, 예컨대, 비드와의 인큐베이션 후에, 연장된 또는 만성 자극을 겪은 세포의 특징을 나타낸다. 일부 구현예에서, 세포 조성물, 예컨대, 기준 또는 대조군 세포 조성물의 재조합 수용체를 발현하는 세포는 분석 후에, 예컨대, 결합 분자를 함유하는 입자, 예컨대, 비드와의 인큐베이션 후에, 연장된 또는 만성 자극을 겪은 세포의 특징을 나타낸다.
Ⅳ. 재조합 수용체
일부 구현예에서, 본원에 제공된 방법에 의해 처리, 가공, 조작 및/또는 생산된 세포는 재조합 수용체, 예컨대, 키메라 항원 수용체(CAR), 또는 T 세포 수용체(TCR)와 같은 재조합 단백질을 함유 또는 발현하거나, 함유 또는 발현하기 위해 조작된다. 특정 구현예에서, 본원에 제공된 방법은 재조합 단백질을 발현 또는 함유하기 위해 조작된 세포를 함유 및/또는 이에 대해 농축시킨 세포, 또는 집단 또는 조성물을 생산하는 및/또는 생산할 수 있다. 일부 구현예에서, CD4+ T 세포, 또는 CD4+ T 세포의 집단 또는 조성물은 처리, 가공, 조작 및/또는 생산된다.
일부 구현예에서, 세포는 유전 공학을 통해 도입된 하나 이상의 핵산을 포함함으로써, 그러한 핵산의 재조합 또는 유전적으로 조작된 생성물을 발현시킨다. 일부 구현예에서, 유전자 전이는 세포를 먼저 자극함으로써, 예컨대, 사이토카인 또는 활성화 마커의 발현에 의해 측정된 바와 같이, 증식, 생존 및/또는 활성화와 같은 반응을 유도하는 자극으로 세포를 조합함으로써와 같이 달성되고, 이어서 활성화된 세포의 형질도입 및 임상 적용에 충분한 수로 배양으로 팽창이다.
세포는 일반적으로 기능성 비-TCR 항원 수용체, 예컨대, 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함하는 항원 수용체, 및 트랜스제닉 T 세포 수용체(TCR)와 같은 다른 항원-결합 수용체와 같은 재조합 수용체를 발현한다. 또한, 수용체 중에 다른 키메릭 수용체가 있다.
A. 키메릭 항원 수용체
제공된 방법 및 용도의 일부 구현예에서, 키메릭 항원 수용체와 같은, 키메릭 수용체는 세포내 신호 도메인으로 원하는 항원(예컨대, 종양 항원)에 대한 특이성을 제공하는 리간드-결합 도메인(예컨대, 항체 또는 항체 단편)을 조합하는 하나 이상의 도메인을 함유한다.
일부 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 1차 활성화 신호를 제공하는 T 세포 활성화 도메인과 같은 활성화 세포내 도메인 부분이다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 이펙터 기능을 용이하게 하기 위해 공동자극 신호 도메인을 함유하거나 추가로 함유한다. 일부 구현예에서, 면역 세포 내로 유전적으로 조작될 때 키메라 수용체는 T 세포 활성을 조절할 수 있고, 일부 경우에, T 세포 분화 또는 항상성을 조절할 수 있어, 입양 세포 치료 방법에 사용하기 위한 것과 같은, in vivo 향상된 장수, 생존 및/또는 지속성을 가진 유전적으로 조작된 세포를 초래한다.
CAR를 포함하는 예시적인 항원 수용체 및 그러한 수용체를 세포 내로 조작 및 도입하기 위한 방법은 예컨대, 국제 특허 출원 공개 번호 WO2000/14257, WO2013/126726, WO2012/129514, WO2014/031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, 미국 특허 출원 공개 번호 US2002/131960, US2013/287748, US2013/0149337, 미국 특허 번호 US6,451,995, US7,446,190, US8,252,592, US8,339,645, US8,398,282, US7,446,179, US6,410,319, US7,070,995, US7,265,209, US7,354,762, US7,446,191, US8,324,353, US8,479,118, 및 유럽 특허 출원 번호 EP2537416에서 서술된 것 및/또는 Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75에서 서술된 것을 포함한다. 일부 측면에서, 항원 수용체는 미국 특허 번호 7,446,19에서 서술된 바와 같은 CAR, 및 국제 특허 출원 공개 번호 WO2014055668 A1에서 서술된 것을 포함한다. CAR의 예시는 상기 언급된 출판물, WO2014/031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US 2013/0149337, 미국 특허 번호 US7,446,190, 미국 특허 번호 US78,389,282, Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701; 및 Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)와 같은, 하나에서 서술된 바와 같은 CAR를 포함한다. WO2014/031687, US8,339,645, US 7,446,179, US2013/0149337, 미국 특허 번호 US7,446,190, 및 미국 특허 번호 US8,389,282, WO2014031687, US 8,339,645, US 7,446,179, US2013/0149337, 미국 특허 번호 US7,446,190, 및 미국 특허 번호 US8,389,282을 역시 참고한다.
CAR과 같은, 키메릭 수용체는 일반적으로 항체, 예컨대, scFv 항체 단편의 가변 중쇄(VH) 사슬 영역 및/또는 가변 경쇄(VL) 사슬 영역인, 항체 분자의 부분과 같은, 세포외 항원 결합 도메인을 일반적으로 포함한다.
일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 탄수화물 또는 다른 분자이다. 일부 구현예에서, 항원은 정상 또는 비-표적화 세포 또는 조직과 비교하여 질환 또는 상태의 세포, 예컨대, 종양 또는 병원성 세포에서 선택적으로 발현되거나 과발현된다. 다른 구현예에서, 항원은 정상 세포에서 발현되고 및/또는 조작된 세포에서 발현된다.
일부 구현에에서, 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원 (BCMA), B7-H3, B7-H6, 탄산탈수효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250로 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로 공지됨), 암태아성 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 4(CSPG4), 표피 성장 인자 단백질(EGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5, 또한 Fc 수용체 유사 5 또는 FCRH5로 공지됨), 태아성 아세틸콜린 수용체(태아성 AchR), 폴레이트 결합 단백질(FBP), 폴레이트 수용체 알파, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100(gp100), 글리피칸-3(GPC3), G 단백질 결합 수용체 5D(GPRC5D), Her2/neu (수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-멜라노마-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복 함유 8 패밀리 멤버 A(LRRC8A), 루이스 Y, 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A (MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 온코페탈 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원 (PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 세포영양막 당단백(TPBG, 또한 5T4로 공지됨), 종양-연관 당단백 72(TAG72), 티로시나아제 연관 단백질 1(TRP1, 또한 TYRP1또는 gp75로 공지됨), 티로시나아제 연관 단백질 2(TRP2, 또한 도파크롬 토토머라아제, 도파크롬 델타-이소머라아제 또는 DCT로 공지됨), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2), 윌름스 종양 1(WT- 1), 병소-특이적 또는 병소-발현 항원, 또는 유니버설 태그로 연관된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병소에 의해 발현되는 분자이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커의 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 연관된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b 또는 CD30이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 항원은 병소-특이적 또는 병소-발현된 항원이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스 항원(HIV, HCV, HBV 등으로부터 바이러스 항원과 같은), 박테리아 항원, 및/또는 기생충 항원이다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커 중 임의의 것과 같은, B 세포 악성 종양과 연관된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b 또는 CD30이다.
일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 CD19이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD19에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD19에 결합하는 항체 또는 항체 단편은 FMC63 및 SJ25C1과 같은 마우스 유래 항체이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항체 단편은 예컨대, 미국 특허 공개 번호 US2016/0152723에 서술된 바와 같은, 인간 항체이다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 온전한 항체 및 단편 항원 결합 (Fab) 단편, F (ab')2 단편, Fab' 단편, Fv 단편, 재조합 IgG (rIgG) 단편, 항원을 특이적으로 결합할 수 있는 중쇄 가변 (VH) 영역, 단일 사슬 가변 단편 (scFv)을 포함하는, 단일 사슬 항체 단편, 및 및 단일 도메인 항체(예컨대, sdAb, sdFv, 나노바디) 단편을 포함하는, 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 포함한다. 용어는 체내바디, 펩티바디, 키메릭 항체, 완전 인간 항체, 인간화 항체, 및 이종접합체 항체, 다중특이적(예컨대, 이중특이적 또는 삼중특이적), 항체, 디아바디, 트리아바디, 및 테트라바디, 탠덤 디-scFv, 탠덤 트리-scFv와 같은 면역글로불린의 유전적으로 조작된 및/또는 그렇지 않으면 변형된 형태를 포함한다.
"초가변 영역" 또는 "HVR"과 동의어인, 용어 "상보적인 결정 영역" 및 "CDR"은 당업계에 항체 가변 영역 내 아미노산의 비-연속적 서열을 지칭하는 것으로 공지되어 있고, 이는 항원 특이성 및/또는 결합 친화성을 지칭한다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역(CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)에 3 개 CDR이 있고, 각각의 경쇄 가변 영역(CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)에 3개 CDR이 있다. "프레임워크 영역" 및 "FR"은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역의 비-CDR 부분을 가르키는 것으로 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 각각의 전장 중쇄 가변 영역(FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4)에 4 개 FR이 있고, 각각의 전장 경쇄 가변 영역(FR-H1, FR-H2, FR-H3 및 FR-H4)에 4 개 FR이 있다.
주어진 CDR 또는 FR의 정확한 아미노산 서열 경계는 Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD ("Kabat" 번호 체계); Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273,927-948 ("Chothia" 번호 체계); MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), "Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745." ("Contact" 번호 체계); Lefranc MP et al., "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains," Dev Comp Immunol, 2003 Jan;27(1):55-77 ("IMGT" 번호 체계); Honegger A and Pluckthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool," J Mol Biol, 2001 Jun 8;309(3):657-70, ("Aho" 번호 체계); and Martin et al., "Modeling antibody hypervariable loops: a combined algorithm," PNAS, 1989, 86(23):9268-9272, ("AbM" 번호 체계)에 서술된 것들을 포함하는, 임의의 다수의 공지된 체계를 사용하여 쉽게 결정될 수 있다.
주어진 CDR 또는 FR의 경계는 식별을 위해 사용되는 방식에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, Kabat 체계는 구조적 정렬을 기반으로 하는 반면, Chothia 체계는 구조적 정보를 기반으로 한다. Kabat 및 Chothia 체계 모두에 대한 번호는 삽입 문자, 예컨대, "30a"에 의한 삽입 및 일부 항체에서 나타나는 결실을 가진, 가장 일반적인 항체 영역 서열 길이에 기반한다. 2개 체계는 다른 위치에서 특정 삽입 및 결실(“인델”)를 배치하여, 차등 번호를 매긴다. 접촉 체계는 복잡한 결정 구조의 분석을 기반으로 하고 많은 측면에서 Chothia 번호 체계와 유사하다. AbM 체계는 Oxford Molecular의 AbM 항체 모델링 소프트웨어에서 사용된 것에 기반한 Kabat 및 Chothia 정의 사이의 절충안이다.
하기 표 1은 각각 Kabat, Chothia, AbM 및 Contact 체계에 의해 확인된 바와 같은 CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3 및 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3의 예시적인 위치 경계를 나열한다. CDR-H1의 경우, Kabat 및 Chothia 번호 체계를 모두 사용하여 잔기 번호가 나열된다. FR은 예컨대, CDR-L1 앞에 위치한 FR-L1, CDR-L1과 CDR-L2 사이에 위치한 FR-L2, CDR-L2와 CDR-L3 사이에 위치한 FR-L3 등으로 CDR 사이에 위치한다. 도시된 Kabat 번호 체계가 H35A 및 H35B에 삽입되기 때문에, 도시된 Kabat 번호 관습을 이용하여 번호매길 때, Chothia CDR-H1 루프의 말단은 루프의 길이에 의존하여, H32 및 H34 사이에서 변한다.
표 1: 다양한 번호 체계에 따른 CDR의 경계
Figure pct00017
따라서, 달리 특정되지 않는 한, 그의 가변 영역과 같은, 주어진 항체 또는 그의 영역의 "CDR" 또는 "상보적인 결정 영역", 또는 개별적인 특정 CDR(예컨대, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3)은 상기 언급된 체계의 하나, 또는 다른 공지된 체계에 의해 정의된 바와 같은 (또는 특정) 상보적인 결정 영역을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 예컨대, 특정 CDR(예컨대, CDR-H3)이 주어진 VH 또는 VL 영역 아미노산 서열에서 상응하는 CDR의 아미노산 서열을 함유하는 것으로 언급된 경우, 그러한 CDR은 상기 전술된 체계의 하나, 또는 다른 공지의 체계에 의해 정의된 바와 같은, 가변 영역 내 상응하는 CDR(예컨대, CDR-H3)의 서열을 가지는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 특정 CDR 서열은 특정된다. 제공된 항체의 예시적인 CDR 서열은 다양한 번호 체계를 사용하여 서술되지만, 제공된 항체는 다른 상기 서술된 번호 체계의 하나 또는 당업자에게 공지된 다른 번호 체계에 따라 서술된 바와 같은, CDR을 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
마찬가지로, 달리 특정되지 않는 한, 주어진 항체 또는 그의 가변 영역과 같은 그의 영역의, FR 또는 개별적인 특정 FR(들)(예컨대, FR-H1, FR-H2, FR-H3, FR-H4)은 공지된 체계의 하나에 의해 정의된 바와 같은 (또는 특정) 프레임워크 영역을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 예시에서, 특정 CDR, FR, 또는 FR 또는 CDR의 식별을 위한 체계는 Kabat, Chothia, AbM 또는 Contact 방법 또는 다른 공지된 체계에 의해 정의된 바와 같은 CDR과 같이, 특정된다. 다른 경우에, CDR 또는 FR의 특정 아미노산 서열이 제공된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 가르킨다. 네이티브 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역(각각, VH 및 VL)은 4 개 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개 CDR을 포함하는 각각의 영역을 가진, 유사한 구조를 가진다(예컨대, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007) 참고). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 추가적으로, 특정 항원을 결합하는 항체는 각각 상보적인 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 항원을 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 분리될 수 있다(예컨대, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991) 참고).
제공된 CAR에 포함된 항체 중에는 항체 단편이 있다. "항체 단편" 또는 "항원-결합 단편"은 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 가르킨다. 항체 단편의 예시는 Fv, Fab, Fab ', Fab'-SH, F (ab')2; 디아바디; 선형 항체; 중쇄 가변(VH) 영역, scFv 및 VH 영역 만을 포함하는 단일-도메인 항체와 같은 단일-사슬 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 제공된 CAR에서 항원-결합 도메인은 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 영역을 포함하는 항체 단편이거나 이를 포함한다. 특정 구현예에서, 항체는 scFv와 같은, 중쇄 가변(VH) 영역 및/또는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함하는 단일-사슬 항체 단편이다.
일부 구현예에서, scFv는 FMC63으로부터 유래된다. FMC63은 일반적으로 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대해 생성된 마우스 단일클론 IgG1 항체를 가리킨다(Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typeing III. 302). 일부 구현예에서, FMC63 항체는 각각 서열번호 39 및 40에 제시된 CDR H1 및 H2, 및 서열번호 41 또는 55에 제시된 CDR H3 및 서열번호 36에 제시된 CDR L1 및 서열번호 37 또는 56에 제시된 CDR L2 및 서열번호 38 또는 35에 제시된 CDR L3를 포함한다. 일부 구현예에서, FMC63 항체는 서열번호 42의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 서열번호 36의 CDRL1 서열, 서열번호 37의 CDRL2 서열, 및 서열번호 38의 CDRL3 서열을 함유하는 가변 경쇄 및/또는 서열번호 39의 CDRH1 서열, 서열번호 40의 CDRH2 서열 및 서열번호 41의 CDRH3 서열을 함유하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 42에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열번호 43에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열번호 57에 제시되어 있다. 일부 구현예에서, scFv는 VH, 링커 및 VL을 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 VL, 링커 및 VH를 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 58에 제시된 뉴클레오타이드의 서열 또는 서열번호 58과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 44에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열번호 44와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 SJ25C1로부터 유래된다. SJ25C1은 인간 기원의 CD19를 발현하는 Nalm-1 및 -16 세포에 대해 생성된 마우스 단일 클론 IgG1 항체이다 (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typeing III. 302). 일부 구현예에서, SJ25C1 항체는 CDRH1, 각각 서열번호 48-50에 제시된 H2 및 H3, 및 CDRL1, 각각 서열번호 45-47에 제시된 L2 및 L3를 포함한다. 일부 구현예에서, SJ25C1 항체는 서열 번호 51의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
일부 구현예에서, scFv는 서열번호 45의 CDRL1 서열, 서열번호 46의 CDRL2 서열, 및 서열번호 47의 CDRL3 서열을 함유하는 가변 경쇄 및/또는 서열번호 48의 CDRH1 서열, 서열번호 49의 CDRH2 서열, 및 서열번호 50의 CDRH3 서열을 함유하는 가변 중쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 51에 제시된 가변 중쇄 영역 및 서열번호 52에 제시된 가변 경쇄 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 가변 중쇄 및 가변 경쇄는 링커에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 링커는 서열번호 53에 제시되어 있다. 일부 구현예에서, scFv는 VH, 링커 및 VL을 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 VL, 링커 및 VH를 순서대로 포함한다. 일부 구현예에서, scFv는 서열번호 54에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열번호 54과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 나타내는 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 BCMA이다. 일부 구현예에서, scFv는 BCMA에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, BCMA를 결합하는 항체 또는 항체 단편은 국제 특허 출원, 공개 번호 WO 2016/090327 및 WO 2016/090320에 제시된 항체 또는 항체 단편으로부터 VH 및 VL이거나 이를 함유한다.
일부 구현예에서, 항원 또는 항원 결합 도메인은 GPRC5D 이다. 일부 구현예에서, scFv는 GPRC5D 에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, GPRC5D 를 결합하는 항체 또는 항체 단편은 국제 특허 출원, 공개 번호 WO 2016/090329 및 WO 2016/090312에 제시된 항체 또는 항체 단편으로부터 VH 및 VL이거나 이를 함유한다.
일부 구현예에서, 항원은 CD20이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD20에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD20를 결합하는 항체 또는 항체 단편은 리툭시맙 scFv와 같은, 리툭시맙이거나 이로부터 유래된 항체이다.
일부 구현예에서, 항원은 CD22이다. 일부 구현예에서, scFv는 CD22에 특이적인 항체 또는 항체 단편으로부터 유래된 VH 및 VL을 함유한다. 일부 구현예에서, CD22를 결합하는 항체 또는 항체 단편은 m971 scFv와 같은, m971이거나 이로부터 유래된 항체이다.
일부 구현예에서, 키메릭 항원 수용체는 항체 또는 항체 단편을 함유하는 세포외 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 키메라 항원 수용체는 항체 또는 단편을 함유하는 세포외 부분 및 세포내 신호 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체 또는 단편은 scFv를 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예컨대, CAR의 항체 부분은 힌지 영역, 예컨대, IgG4 힌지 영역, 및/또는 CH1/CL 및/또는 Fc 영역과 같은 면역글로불린 불변 영역의 적어도 부분을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1와 같은, 인간 IgG의 것이다. 일부 측면에서, 불변 영역의 일부는 항원-인식 성분, 예컨대, scFv, 및 막관통 도메인 사이의 스페이서 영역으로서 작용한다. 스페이서는 스페이서가 없을 때와 비교하여, 항원 결합 후 세포의 반응성을 증가시키는 길이를 가질 수 있다. 예시적인 스페이서는 Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153, 국제 특허 출원 공개 WO2014031687, U.S. 특허 번호 8,822,647 또는 공개된 출원 번호 US2014/0271635에 서술된 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgG4 또는 IgG1와 같은, 인간 IgG의 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열 ESKYGPPCPPCP(서열 번호 1에 제시됨)를 가지고, 서열번호 2에 제시된 서열에 의해 암호화된다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열번호 3에 제시된 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열번호 4에 제시된 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 불변 영역 또는 부분은 IgD의 것이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열번호 5에 제시된 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 스페이서는 임의의 서열번호 1, 3, 4 또는 5와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 가진다. 일부 구현예에서, 스페이서는 임의의 서열번호 25-33과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 가진다.
일부 구현예에서, 항원 수용체는 세포외 도메인에 직접 또는 간접적으로 연결된 세포내 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 키메릭 항원 수용체는 세포외 도메인 및 세포내 신호 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 ITAM을 포함한다. 예컨대, 일부 측면에서, 항원 인식 도메인(예컨대, 세포외 도메인)은 CAR, 및/또는 다른 세포 표면 수용체를 통한 신호의 경우에, TCR 복합체와 같은, 항원 수용체 복합체를 통해 활성화를 모방하는 신호 성분과 같은, 하나 이상의 세포내 신호 성분에 일반적으로 연결된다. 일부 구현예에서, 키메릭 수용체는 세포외 도메인 (예컨대, scFv)과 세포내 신호 도메인 사이에 연결되거나 융합된 막관통 도메인을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 항원-결합 성분(예컨대, 항체)은 하나 이상의 막관통 및 세포내 신호 도메인에 연결된다.
일 구현예에서, 수용체, 예컨대, CAR에서 도메인 중 하나와 자연적으로 연관되는 막관통 도메인이 사용된다. 일부 경우에, 막관통 도메인은 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호 작용을 최소화하기 위해 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 막관통 도메인에 그러한 도메인의 결합을 피하기 위해 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형된다.
일부 구현예에서 막관통 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 각각 유래된다. 공급원이 천연인 경우, 일부 측면에서 도메인은 임의의 막-결합 또는 막관통 단백질로부터 유래된다. 막관통 영역은 T-세포 수용체, CD28, CD3 입실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22의 알파, 베타 또는 제타 사슬(즉, 적어도 이의 막관통 영역을 포함함)로부터 유래된 것들을 포함한다. 일부 측면에서, 합성 막관통 도메인은 주로 류신 및 발린과 같은 소수성 잔기를 포함한다. 일부 측면에서, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 트리플렛은 합성 막관통 도메인의 각각의 말단에서 발견될 것이다. 일부 구현예에서, 연결은 링커, 스페이서 및/또는 막관통 도메인(들)에 의한 것이다. 일부 측면에서, 막관통 도메인은 CD28의 막관통 부분을 함유한다.
일부 구현예에서, 세포외 도메인 및 막관통 도메인은 직접 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포외 도메인 및 막관통은 본원에 서술된 바와 같은, 스페이서에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 수용체는 CD28 세포외 부분과 같은, 막관통 도메인이 유래하는 분자의 세포외 부분을 함유한다.
세포내 신호 도메인 중에는 천연 항원 수용체를 통한 신호, 공동자극 수용체와 조합된 그러한 수용체를 통한 신호, 및/또는 공동자극 수용체 단독을 통한 신호가 모방되거나 근사되는 것들이 있다. 일부 구현예에서, 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커, 예컨대, 예컨대, 글라이신-세린 이중선, 글라이신 및 세린을 포함하는 것과 같은, 2개 및 10개 사이 아미노산 길이의 링커는 CAR의 막관통 도메인 및 세포질 신호 도메인 사이 연결을 존재하고 형성한다.
T 세포 활성화는 2개 클래스의 세포질 신호 서열: TCR를 통해 항원-의존적 1차 활성화를 개시하는 것(1차 세포질 신호 서열), 및 항원-비의존적 방식으로 작용하여 2차 또는 공동-자극 신호를 제공하는 것(2차 세포질 신호 서열)에 의해 매개되는 바와 같이 서술되는 일부 측면에 있다. 일부 측면에서, CAR은 그러한 신호 성분의 하나 또는 둘 모두를 포함한다.
수용체, 예컨대, CAR은 적어도 하나의 세포내 신호 성분 또는 성분들을 일반적으로 포함한다. 일부 측면에서, CAR은 TCR 복합체의 1차 활성화를 조절하는 1차 세포질 신호 서열을 포함한다. 자극 방식으로 작용하는 1차 세포질 신호 서열은 면역 수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM으로 공지된 신호 모티프를 함유할 수 있다. 1차 세포질 신호 서열을 함유하는 ITAM의 예시는 CD3 제타 사슬, FcR 감마, CD3 감마, CD3 델타 및 CD3 입실론으로부터 유도된 것들을 포함한다. 일부 구현예에서, CAR 내 세포질 신호 전달 분자(들)은 세포질 신호 도메인, 그의 부분, 또는 CD3 제타로부터 유래된 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 수용체는 T- 세포 활성화 및 세포독성, 예컨대, CD3 제타 사슬을 매개하는 TCR CD3 사슬과 같은, TCR 복합체의 세포내 성분을 포함한다. 따라서, 일부 측면에서, 항원-결합 부분은 하나 이상의 세포 신호 모듈에 연결된다. 일부 구현예에서, 세포 신호 모듈은 CD3 막관통 도메인, CD3 세포내 신호 도메인, 및/또는 다른 CD3 막관통 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체, 예컨대, CAR은 Fc 수용체 γ, CD8, CD4, CD25, 또는 CD16과 같은 하나 이상의 추가 분자의 일부를 추가로 포함한다. 예컨대, 일부 측면에서, CAR 또는 다른 키메릭 수용체는 CD3-제타(CD3-ζ) 또는 Fc 수용체 γ 및 CD8, CD4, CD25 또는 CD16 사이의 키메릭 분자를 포함한다.
일부 구현예에서, CAR 또는 다른 키메릭 수용체의 결찰시, 수용체의 세포질 도메인 또는 세포내 신호 도메인은 면역 세포, 예컨대, CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 정상 이펙터 기능 또는 반응 중 적어도 하나를 활성화시킨다. 예컨대, 일부 상황에서, CAR은 사이토카인 또는 다른 인자의 분비와 같은, 세포분해 활성 또는 T-헬퍼 활성과 같은 T 세포의 기능을 유도한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체 성분 또는 공동자극 분자의 세포내 신호 전달 도메인의 절단된 부분은, 예컨대, 그것이 이펙터 기능 신호를 형질도입하는 경우, 온전한 면역자극 사슬 대신에 사용된다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 도메인 또는 도메인들은 T 세포 수용체(TCR)의 세포질 서열을 포함하고, 일부 측면에서, 또한 자연 상황에서 항원 수용체 결합 후 신호 전달을 개시하기 위해 이러한 수용체와 협력하여 작용하는 공동- 수용체의 것들을 포함한다.
자연 TCR의 상황에서, 완전한 활성화는 일반적으로 TCR을 통한 신호뿐만 아니라 공동자극 신호를 필요로 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 또한, 완전한 활성화를 촉진하기 위해, 2차 또는 공동-자극 신호를 생성하기 위한 성분은 CAR에 포함된다. 다른 구현예에서, CAR은 공동자극 신호를 생성하기 위한 성분을 포함하지 않는다. 일부 측면에서, 추가 CAR은 동일한 세포에서 발현되고 2차 또는 공동자극 신호를 생성하기 위한 성분을 제공한다.
일부 구현예에서, 키메릭 항원 수용체는 T 세포 공동자극 분자의 세포내 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 및 ICOS와 같은, 공동자극 수용체의 신호 도메인 및/또는 막관통 부분을 포함한다. 일부 측면에서, 동일한 CAR은 활성화 및 보조자극 성분 모두를 포함한다. 일부 구현예에서, 키메릭 항원 수용체는 막관통 도메인 및 세포내 신호 도메인 사이와 같은, T 세포 공동자극 분자 또는 그의 기능적 변이체로부터 유래된 세포내 도메인을 함유한다. 일부 측면에서, T 세포 공동자극 분자는 CD28 또는 41BB이다.
일부 구현예에서, 활성화 도메인은 1개 CAR 내 포함되는 반면, 보조자극 성분은 다른 항원을 인식하는 다른 CAR에 의해 제공된다. 일부 구현예에서, CAR은 동일한 세포상에서 모두 발현된 활성화 또는 자극 CAR, 동시자극 CAR을 포함한다(WO 2014/055668 참고). 일부 측면에서, 세포는 하나 이상의 자극 또는 활성화 CAR 및/또는 공동자극 CAR을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포는 질환 또는 상태에와 관련 있는 및/또는 특이적인 것 이외의 항원을 인식하는 CAR과 같은, 억제성 CAR(iCARs, Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (December, 2013) 참고)을 추가로 포함하고, 이로 인해, 질환-표적 CAR를 통해 전달되는 활성화 신호는 억제성 CAR이 그의 리간드에 결합함으로써, 예컨대, 오프-표적 효과를 감소시키기 위해, 감소되거나 억제된다.
일부 구현예에서, 2개 수용체는 세포에 대한 활성화 및 억제성 신호를 각각 유도하여, 그의 항원에 대한 수용체 중 하나의 결찰이 세포를 활성화시키거나 반응을 유도하지만, 그의 항원에 대한 제2 억제성 수용체의 결찰이 반응을 억제하거나 약화시키는 신호를 유도한다. 예시는 활성화 CAR 및 억제성 CAR (iCAR)의 조합이다. 그러한 전략은, 예컨대, 활성화 CAR이 질환 또는 상태에서 발현되지만 정상 세포에서도 발현되는 상황에서 오프-표적 효과의 가능성을 감소시키기 위해 사용될 수 있고, 억제성 수용체는 질환 또는 상태의 세포가 아닌 정상 세포에서 발현되는 별도 항원에 결합한다.
일부 측면에서, 키메릭 수용체는 억제성 CAR (예컨대, iCAR)이거나 이를 포함하고, 세포에서 ITAM- 및/또는 공동자극-촉진 반응과 같은, 면역 반응을 약화시키거나 억제하는 세포내 성분을 포함한다. 그러한 세포내 신호 성분의 예시는 PD-1, CTLA4, LAG3, BTLA, OX2R, TIM-3, TIGIT, LAIR-1, PGE2 수용체, A2AR을 포함하는 EP2/4 아데노신 수용체를 포함하는 면역 체크포인트 분자에서 발견되는 것들이 있다. 일부 측면에서, 조작된 세포는 예컨대, 활성화 및/또는 공동자극 CAR에 의해 유도된, 세포의 반응을 약화시키는 역할을 하는, 그러한 억제성 분자의 또는 이로부터 유래된 신호 도메인을 포함하는 억제성 CAR를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 CD3(예컨대, CD3-제타) 세포내 도메인에 연결된 CD28 막관통 및 신호 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 CD3 제타 세포내 도메인에 연결된, 키메릭 CD28 및 CD137(4-1BB, TNFRSF9) 공동-자극 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, CAR은 세포질 부분에서 1개 이상, 예컨대, 2개 이상, 공동자극 도메인 및 활성화 도메인, 예컨대, 1차 활성화 도메인을 포함한다. 예시적인 CAR은 CD3-제타, CD28, 및 4-1BB의 세포내 성분을 포함한다
일부 구현예에서, 항원 수용체는 마커를 추가로 포함하고 및/또는 CAR 또는 다른 항원 수용체를 발현하는 세포는 세포 표면 마커와 같은, 대용 마커를 추가로 포함하며, 이는 수용체를 발현하기 위해 세포의 형질도입 또는 조작을 확인하는데 사용될 수 있다. 일부 측면에서, 마커는 그러한 세포 표면 수용체(예컨대, tEGFR)의 절단된 버전과 같은, CD34, NGFR, 또는 표피 성장 인자 수용체의 전부 또는 일부(예컨대, 절단된 형태)를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커를 암호화하는 핵산은 절단가능한 링커 서열, 예컨대, T2A와 같은 링커 서열을 암호화하는 폴리 뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된다. 예컨대, 마커 및 선택적인 링커 서열은 공개된 특허 출원 WO 2014031687에 개시된 바와 같은 것일 수 있다. 예컨대, 마커는 T2A 절단가능한 링커 서열과 같은, 링커 서열에 선택적으로 연결된, 절단된 EGFR(tEGFR)일 수 있다.
절단된 EGFR(예컨대, tEGFR)에 대한 예시적인 폴리펩타이드는 서열번호 7 또는 16에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열번호 7 또는 16과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함한다. 예시적인 T2A 링커 서열은 서열번호 6 또는 17에 제시된 아미노산의 서열 또는 서열번호 6 또는 17과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 마커는 T 세포에서 자연적으로 발견되지 않거나 T 세포의 표면에서 자연적으로 발견되지 않는 분자, 예컨대, 세포 표면 단백질, 또는 그의 일부이다. 일부 구현예에서, 분자는 비-자기 분자, 예컨대, 비-자기 단백질, 즉, 세포가 입양될 숙주의 면역계에 의해 "자기"로 인식되지 않는 것이다.
일부 구현예에서, 마커는 치료 기능을 제공하지 않고 및/또는 유전적 조작을 위한, 예컨대, 성공적으로 조작된 세포를 선택하기 위한 마커로서 사용되는 것 외에 다른 효과를 생산하지 않는다. 다른 구현예에서, 마커는 치료적 분자 또는 입양 전달 및 리간드와의 접촉시 세포의 반응을 향상시키고 및/또는 약화시키기 위해 공동자극 또는 면역 체크포인트 분자와 같은, 인비보에서 세포가 마주치는 리간드와 같은, 일부 원하는 효과를 달리 나타내는 분자일 수 있다.
일부 경우에, CAR은 1세대, 2세대 및/또는 3세대 CAR을 가리킨다. 일부 측면에서, 1세대 CAR은 항원 결합시 CD3-사슬 유도된 신호만을 제공하는 것이고; 일부 측면에서, 2세대 CAR은 CD28 또는 CD137과 같은 공동자극 수용체로부터의 세포내 신호 도메인을 포함하는 것과 같은, 신호 및 공동자극 신호를 제공하는 것이며; 일부 측면에서, 3세대 CAR은 상이한 공동자극 수용체의 다중 공동자극 도메인을 포함하는 것이다.
예컨대, 일부 구현예에서, CAR은 서술된 바와 같은 임의의 것을 포함하는 항원에 특이적인 항체, 예컨대, scFv와 같은 항체 단편, CD28 또는 그의 기능적 변이체의 막관통 부분이거나 이를 함유하는 막관통 도메인, 및 CD28 또는 그의 기능적 변이체의 신호 부분 및 CD3 제타 또는 그의 기능적 변이체의 신호 부분을 포함하는 세포내 신호 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, CAR은 서술된 바와 같은 임의의 것을 포함하는 항원에 특이적인 항체, 예컨대, scFv와 같은 항체 단편, CD28 또는 그의 기능적 변이체의 막관통 부분이거나 이를 함유하는 막관통 도메인, 및 4-1BB 또는 그의 기능적 변이체의 신호 부분 및 CD3 제타 또는 그의 기능적 변이체의 신호 부분을 포함하는 세포내 신호 도메인을 함유한다. 일부 그러한 구현예에서, 수용체는 힌지-전용 스페이서와 같은, Ig 힌지, 예컨대, IgG4 힌지와 같은, 인간 Ig 분자와 같은, Ig 분자의 일부를 함유하는 스페이서를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예컨대, CAR의 막관통 도메인은 서열 번호 8로 제시되는 아미노산 서열의 서열 또는 서열번호 8과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함하는 막관통 도메인과 같은, 인간 CD28(예컨대, 수탁번호 P01747.1) 또는 그의 변이체의 막관통 도메인이거나 이를 포함하고; 일부 구현예에서, 재조합 수용체의 부분을 함유하는 막관통-도메인은 서열 번호 9로 제시되는 아미노산 서열의 서열 또는 그와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 가지는 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예컨대, CAR의 세포내 신호 성분(들)은 네이티브 CD28 단백질의 위치 186-187에서 LL이 GG로 치환된 도메인과 같은, 인간 CD28의 세포내 공동자극 신호 도메인 또는 또는 그의 기능적 변이체 또는 부분을 함유한다. 예컨대, 세포내 신호 도메인은 서열번호 10 또는 11로 제시되는 아미노산의 서열 또는 서열번호 10 또는 11과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포내 도메인은 서열번호 12로 제시되는 아미노산의 서열 또는 서열번호 12와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열과 같은, 4-1BB(예컨대, 수탁번호 Q07011.1) 또는 그의 변이체의 세포내 공동자극 신호 도메인을 포함한다.
일부 구현예에서, 재조합 수용체, 예컨대, CAR의 세포내 신호 도메인은 미국 특허 번호7,446,190 또는 미국 특허 번호 8,911,993에 서술된 바와 같은 인간 CD3 ζ의 이소형 3의 112 AA 세포질 도메인(수탁 번호 P20963.2) 또는 CD3 제타 신호 도메인과 같은, 인간 CD 제타 자극 신호 도메인 또는 그의 기능적 변이체를 포함한다. 예컨대, 일부 구현예에서, 세포내 신호 도메인은 서열번호 13, 14 또는 15로 제시되는 아미노산의 서열 또는 서열번호 13, 14 또는 15와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 포함한다.
일부 측면에서, 스페이서는 서열번호 1에 제시된 힌지 전용 스페이서와 같은, IgG4 또는 IgG1의 힌지 전용과 같은, IgG의 힌지 영역만을 함유한다. 다른 구현예에서, 스페이서는 선택적으로 CH2 및/또는 CH3 도메인에 연결된, Ig 힌지, 예컨대, IgG4- 유래 힌지이거나 이를 함유한다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열번호 4에 제시된 바와 같은, CH2 및 CH3 도메인에 연결된, Ig 힌지, 예컨대, IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 서열번호 3에 제시된 바와 같은, 오직 CH3 도메인에 연결된, Ig 힌지, 예컨대 IgG4 힌지이다. 일부 구현예에서, 스페이서는 글라이신-세린 리치 서열 또는 공지된 플렉서블 링커와 같은 다른 다른 플렉서블 링커이거나 이를 포함한다.
예컨대, 일부 구현예에서, CAR은 scFvs, 스페이서, 예컨대, 면역글로불린 분자의 일부를 함유하는 스페이서, 예컨대, 힌지 영역 및/또는 하나 이상의 중쇄 분자의 불변 영역, 예컨대, Ig-힌지 함유 스페이서, CD28-유래 막관통 도메인의 전부 또는 일부를 함유하는 막관통 도메인, CD-28-유래 세포내 신호 도메인, 및 CD3 제타 신호도메인을 포함하는 항체 단편과 같은 항체를 포함한다. 일부 구현예에서, CAR은 scFv와 같은 항체 또는 단편, 임의의 Ig- 힌지 함유 스페이서와 같은 스페이서, CD28-유래 막관통 도메인, 4-1BB-유래 세포내 신호 도메인, 및 CD3 제타-유래 신호 도메인을 포함한다.
예시적인 대용 마커는 세포 표면 폴리펩타이드의 절단된 형태, 예컨대, 비-기능적이고 신호 또는 세포 표면 폴리펩타이드의 전장 형태에 의해 원래 형질도입된 신호를 형질도입하지 않거나 할 수 없고, 및/또는 내재화하지 않거나 할 수 없는 절단된 형태를 포함한다. 예시적인 절단된 세포 표면폴리펩타이드는 성장 인자 또는 다른 수용체, 예컨대, 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체 2(tHER2), 절단된 표피 성장 인자 수용체(tEGFR, 서열번호 7 또는 16에 제시된 예시적인 tEGFR 서열) 또는 전립선-특이적 막 항원(PSMA) 또는 그의 변형된 형태의 절단된 형태를 포함한다. tEGFR은 항체 세툭시맙(Erbitux®) 또는 다른 치료용 항-EGFR 항체 또는 결합 분자에 의해 인식되는 에피토프를 함유 할 수 있으며, 이는 tEGFR 구축 및 암호화된 외인성 단백질을 발현하고 및/또는 암호화된 외인성 단백질을 발현하는 세포를 제거 또는 분리하도록 조작되었던 세포를 확이 또는 선택하기 위해 사용될 수 있다. 미국 특허 번호 8,802,374 및 Liu et al., Nature Biotech. 2016 April; 34(4): 430-434 참고. 일부 측면에서, 마커, 예컨대, 대용 마커는 CD34, NGFR, CD19 또는 절단된 CD19, 예컨대, 절단된 비-인간 CD19, 또는 표피 성장 인자 수용체(예컨대, tEGFR)의 전부 또는 일부(예컨대, 절단 된 형태)를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커는 형광 단백질, 예컨대, 녹색 형광 단백질(GFP), 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 예컨대, 슈퍼-폴드 GFP (sfGFP), 적색 형광 단백질(RFP), 예컨대, tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed 또는 DsRed2, 시안 형광 단백질(CFP), 청록색 형광 단백질(BFP), 강화 청색 형광 단백질(EBFP), 및 황색 형광 단백질(YFP), 및 형광 단백질의 종 변이체, 단량체 변이체 및 코돈-최적화 및/또는 강화된 변이체를 포함하는 그의 변이체이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 마커는 루시퍼라아제, E. coli로부터 lacZ 유전자, 알칼리성 포스파타아제, 분비된 배아 알칼리성 포스파타아제(SEAP), 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT)와 같은, 효소이거나 이를 포함한다. 예시적인 발광 리포터 유전자는 루시퍼라아제(luc), β-갈락토시다아제, 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라아제(CAT), β-글루쿠로니다아제(GUS) 또는 그의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 마커는 선택 마커이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 외인성 제제 또는 약물에 내성을 부여하는 폴리펩티드이거나 이를 포함한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 내성 유전자이다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 항생제 내성 유전자이고, 포유동물 세포에 항생제 내성을 부여한다. 일부 구현예에서, 선택 마커는 퓨로마이신 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 블라스티시딘 내성 유전자, 네오마이신 내성 유전자, 제네티신 내성 유전자 또는 제오신 내성 유전자 또는 그의 변형된 형태이거나 이를 포함한다.
일부 구현예에서, 마커를 암호화하는 핵산은 절단가능한 링커 서열, 예컨대, T2A와 같은, 링커 서열을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결된다. 예컨대, 마커, 및 선택적인 링커 서열은 PCT 공개 번호 WO2014031687에 개시된 바와 같이 임의일 수 있다.
일부 구현예에서, 그러한 CAR 구조물을 암호화하는 핵산 분자는 T2A 리보솜 스킵 요소를 암호화하는 서열 및/또는 tEGFR 서열, 예컨대, CAR을 암호화하는 서열의 다운스트림을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 서열은 서열번호 6 또는 17에 제시된 T2A 리보솜 스킵 요소, 또는 서열번호 6 또는 17과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 암호화한다. 일부 구현예에서, 항원 수용체(예컨대, CAR)를 발현하는 T 세포는 비-면역원성 선택 에피토프로서 (예컨대, 동일한 구조물로부터 2개 단백질을 발현하기 위한 T2A 리보솜 스위치에 의해 분리된 CAR 및 EGFRt을 암호화하는 구조의 도입에 의해) 절단된 EGFR(EGFRt)을 발현하기 위해 생성될 수 있고, 그런 다음 그러한 세포를 검출하기 위한 마커로서 사용될 수 있다(미국 특허 번호 8,802,374 참고). 일부 구현예에서, 서열은 서열번호 7 또는 16에 제시된 tEGFR 서열, 또는 서열번호 7 또는 16과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 서열 동일성을 나타내는 아미노산의 서열을 암호화한다. 일부 경우에, T2A와 같은 펩타이드는 2A 요소의 C-말단에서 펩타이드 결합의 스킵(리보솜 스킵) 합성을 위한 리보솜을 야기할 수 있고, 2A 서열의 말단 및 다음 펩타이드 다운스트림 사이의 분리를 초래한다(예컨대, de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004) 및 deFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004) 참고). 많은 2A 요소가 공지되어 있다. 본원에 개시된 방법 및 핵산에 사용될 수 있는 2A 서열의 예시는 미국 특허 공개번호 20070116690에 서술된 바와 같이, 수족구 바이러스(F2A, 예컨대, 서열번호 21), 말 비염 A 바이러스(E2A, 예컨대, 서열번호 20), 토시 아시그나 바이러스(Thosea asigna　virus)(T2A, 예컨대, 서열번호 6 또는 17), 및 돼지 테스코바이러스-1(P2A, 예컨대, 서열번호 18 또는 19)로부터 2A 서열이나, 이에 한정되지 않는다.
일부 경우에, 재조합 수용체, 예컨대, 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산 서열은 신호 펩타이드를 암호화하는 신호 서열을 함유한다. 신호 펩타이드의 비-한정적인 예시는 예컨대, 서열 번호 62에 제시되고, 서열번호 61에 제시된 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 GMCSFR 알파 사슬 신호 펩타이드, 서열번호 60에 제시된 CD8 알파 신호 펩타이드, 서열번호 59에 제시된 CD33 신호 펩타이드를 포함한다.
개체에 투여된 세포에 의해 발현되는, CAR과 같은, 재조합 수용체는 치료되는 질환 또는 상태 또는 그의 세포에 발현된, 연관된 및/또는 특이적인 분자를 일반적으로 인식하거나 특이적으로 결합한다. 분자, 예컨대, 항원에 특이적으로 결합할 때, 수용체는 ITAM-형질도입된 신호와 같은, 면역자극 신호를 세포 내로 전달하여 질환 또는 상태를 표적하는 면역 반응을 촉진시킨다. 예컨대, 일부 구현예에서, 세포는 질환 또는 상태의 세포 또는 조직에 의해 발현되거나 질환 또는 상태와 관련된 항원에 특이적으로 결합하는 CAR을 발현한다.
B. TCRs
일부 구현예에서, 종양, 바이러스 또는 자가면역 단백질의 항원과 같은, 표적 폴리펩타이드의 펩타이드 에피토프 또는 T 세포 에피토프를 인식하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 그의 항원-결합 부분을 발현하는 T 세포와 같은, 조작된 세포가 제공된다.
일부 구현예에서, "T 세포 수용체" 또는 "TCR"은 가변 α 및 β 사슬(각각, TCRα 및 TCRβ로 공지됨) 또는 가변 γ 및 δ 사슬(각각, TCRα 및 TCRβ로 공지됨), 또는 그의 항원-결합 부분을 함유하고, MHC 분자에 결합된 펩타이드에 특이적으로 결합할 수 있는 분자이다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태로 있다. 전형적으로, αβ 및 γδ 형태로 존재하는 TCR은 일반적으로 구조적으로 유사하지만, 그들을 발현하는 T 세포는 별개 해부학적 위치 또는 기능을 가질 수 있다. TCR은 세포 표면 상에서 또는 가용성 형태로 발견될 수 있다. 일반적으로, TCR은 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 결합된 항원을 인식하는 것이 일반적인 T 세포(또는 T 림프구)의 표면에서 발견된다.
달리 언급되지 않는 한, 용어 "TCR"은 전체 TCR 뿐만 아니라 그의 항원-결합 부분 또는 그의 항원-결합 단편을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 일부 구현예에서, TCR은 αβ 형태 또는 γδ 형태에 있는 TCR을 포함하는, 온전한 또는 전장 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 전장 TCR 미만이지만 MHC-펩타이드 복합체에 결합된 것과 같은, MHC 분자에 결합된 특정 펩타이드에 결합된 항원-결합 부분이다. 일부 경우에, TCR의 항원-결합 부분 또는 단편은 전장 또는 온전한 TCR의 구조적 도메인의 일부만을 함유할 수 있지만, MHC-펩타이드 복합체와 같은, 펩타이드 에피토프에 결합하여 전체 TCR이 결합한다. 일부 경우에, 항원-결합 부분은 특정 MHC-펩타이드 복합체에 결합하기 위한 결합 부위를 형성하기에 충분한, TCR의 가변 α 사슬 및 가변 β 사슬과 같은, TCR의 가변 도메인을 함유한다. 일반적으로, TCR의 가변 사슬은 펩타이드, MHC 및/또는 MHC-펩타이드 복합체의 인식에 관여하는 상보성 결정 영역을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR의 가변 도메인은 초가변 루프, 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 함유하고, 이는 일반적으로 항원 인식 및 결합 능력 및 특이성에 대한 주요 기여자이다. 일부 구현예에서, TCR의 CDR 또는 그의 조합은 주어진 TCR 분자의 항원-결합 부위의 모두 또는 실질적으로 모두를 형성한다. TCR 사슬의 가변 영역 내에 다양한 CDR은 일반적으로 프레임 워크 영역(FR)에 의해 분리되고, 이는 일반적으로 CDR과 비교하여 TCR 분자 사이에서 덜 가변성을 나타낸다(예컨대, Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7:3745, 1988; see also Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003 참고). 일부 구현예에서, CDR3은 항원 결합 또는 특이성을 담당하는 주요 CDR이거나, 항원 인식, 및/또는 펩타이드-MHC 복합체의 가공된 펩타이드 부분과의 상호 작용을 위해 주어진 TCR 가변 영역 상에 3개 CDR 중에서 가장 중요하다. 일부 상황에서, 알파 사슬의 CDR1은 특정 항원성 펩타이드의 N-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일부 상황에서, 베타 사슬의 CDR1은 펩타이드의 C-말단 부분과 상호 작용할 수 있다. 일부 상황에서, CDR2는 MHC-펩타이드 복합체의 MHC 부분과의 상호 작용 또는 인식에 가장 크게 기여하거나 이를 담당하는 1차 CDR이다. 일부 구현예에서, β-사슬의 가변 영역은 추가적인 초가변 영역(CDR4 또는 HVR4)을 함유할 수 있고, 이는 일반적으로 항원 인식이 아닌 초항원 결합에 관여한다(Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426).
일부 구현예에서, 또한, TCR은 불변 도메인, 막관통 도메인 및/또는 짧은 세포질 테일을 함유할 수 있다(예컨대, Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997 참고). 일부 측면에서, TCR의 각 사슬은 1개 N-말단 면역글로불린 가변 도메인, 1개 면역글로불린 불변 도메인, 막관통 영역, 및 C-말단에서 짧은 세포질 테일을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 신호 전달의 매개에 관여하는 CD3 복합체의 불변 단백질과 관련된다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 하나 이상의 불변 도메인을 포함한다. 예컨대, 주어진 TCR 사슬의 세포외 부분(예컨대, α-사슬 또는 β-사슬)은 세포 막에 인접한 가변 영역(예컨대, Vα or Vβ; typically amino acids 1 to 116 based on Kabat numbering Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.) 및 불변 영역(예컨대, α-chain constant domain or Cα, typically positions 117 to 259 of the chain based on Kabat numbering or β chain constant domain or Cβ, typically positions 117 to 295 of the chain based on Kabat)과 같은, 2개 면역글로불린-유사 도메인을 함유할 수 있다. 예컨대, 일부 경우에, 2개 사슬에 의해 형성된 TCR의 세포외 부분은 2개 막-근위 불변 도메인, 및 2개 막-원위 가변 도메인을 함유하고, 가변 도메인은 CDR을 각각 함유한다. TCR의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하는 데에서 짧은 연결 서열을 함유할 수 있고, 이에 따라 TCR의 2개 사슬을 연결한다. 일부 구현예에서, TCR은 각각의 α 및 β 사슬에서 추가 시스테인 잔기를 가질 수 있어, TCR은 불변 도메인에서 2 개 이황화 결합을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR 사슬은 막관통 도메인을 함유한다. 일부 구현예에서, 막관통 도메인은 양으로 하전된다. 일부 경우에, TCR 사슬은 세포질 테일을 함유한다. 일부 경우에, 구조는 TCR이 CD3 및 그의 서브유닛과 같은 다른 분자와 결합되도록 한다. 예컨대, 막관통 영역을 갖는 불변 도메인을 함유하는 TCR은 세포 막에서 단백질을 고정시키고 CD3 신호 장치 또는 복합체의 불변 서브유닛과 결합될 수 있다. CD3 신호 서브유닛(예컨대, CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ 사슬)의 세포내 테일은 TCR 복합체의 신호 능력을 수반하는 하나 이상의 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 또는 ITAM을 함유한다.
일부 구현예에서, TCR은 2개 사슬 α 및 β(또는 선택적으로 γ 및 δ)의 헤테로다이머일 수 있거나 단일 사슬 TCR 구조일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 이황화 결합 또는 이황화 결합들에 의한 것과 같이, 연결된 2개 별도 사슬(α 및 β 사슬 또는 γ 및 δ 사슬)을 함유하는 헤테로다이머이다.
일부 구현예에서, TCR은 Vα,β 사슬의 서열과 같은, 공지된 TCR 서열(들)로부터 생성될 수 있고, 이는 실질적으로 전장 코딩 서열이 쉽게 이용가능하다. 세포 공급원으로부터, V 사슬 서열을 포함하는, 전장 TCR 서열을 획득하기 위한 방법은 잘 알려져 있다. 일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 핵산은 주어진 세포 내 또는 이로부터 분리된 TCR-코딩 핵산의 중합효소 연쇄 반응(PCR) 증폭, 또는 공개적으로 이용가능한 TCR DNA 서열의 합성과 같은, 다양한 공급원으로부터 획득될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 예컨대 T 세포(예컨대, 세포독성 T 세포), T-세포 하이 브리도마 또는 다른 공개적으로 이용가능한 공급원과 같은, 생물학적 공급원으로부터 획득된다. 일부 구현예에서, T-세포는 인비보(in vivo) 분리된 세포로부터 획득될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 티미칼리(thymically) 선택된 TCR이다. 일부 구현예에서, TCR은 네오에피토프-제한 TCR이다. 일부 구현예에서, T-세포는 배양된 T-세포 하이브리도마 또는 클론일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원-결합 부분 또는 이의 항원-결합 단편은 TCR의 서열에 대한 지식으로부터 합성적으로 생성될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR은 표적 폴리펩타이드 항원, 또는 그의 표적 T 세포 에피토프에 대한 후보 TCR의 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인되거나 선택된 TCR로부터 생성된다. TCR 라이브러리는 PBMC, 비장 또는 다른 림프 기관에 존재하는 세포를 포함하여, 개체로부터 분리된 T 세포로부터 Vα 및 Vβ의 레퍼토리의 증폭에 의해 생성될 수 있다. 일부 경우에, T 세포는 종양-침윤 림프구 (TIL)로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 CD4+ 또는 CD8+ T 세포로부터 생성될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 건강한 개체의 정상, 즉, 정상 TCR 라이브러리의 T 세포 공급원으로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 일부 구현예에서, TCR은 질환에 걸린 개체, 즉, 질환에 걸린 TCR 라이브러리의 T 세포 공급원으로부터 증폭될 수 있다. 일부 구현예에서, 변성 프라이머는 인간으로부터 획득된, T 세포와 같은, 샘플 내 RT-PCR에 의한 것과 같은, Vα 및 Vβ의 유전자 레퍼토리를 증폭시키는데 사용된다. 일부 구현예에서, scTv 라이브러리는 증폭된 생성물이 링커에 의해 분리되도록 클로닝되거나 조립되는 나이브 Vα 및 Vβ 라이브러리로부터 조립될 수 있다. 개체 및 세포의 공급원에 따라, 라이브러리는 HLA 대립유전자-특이적일 수있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, TCR 라이브러리는 모(parent) 또는 스캐 폴드 TCR 분자의 돌연변이유발 또는 다양화에 의해 생성될 수 있다. 일부 측면에서, TCR은 예컨대, α 또는 β 사슬의 돌연변이유발에 의한 것과 같은, 지시된 진화에 적용된다. 일부 측면에서, TCR의 CDR 내의 특정 잔기는 변경된다. 일부 구현예에서, 선택된 TCR은 친화성 성숙에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 항원-특이적 T 세포는 펩타이드에 대한 CTL 활성을 평가하기 위해 스크리닝함으로써와 같이, 선택될 수 있다. 일부 측면에서, TCR, 예컨대, 항원-특이적 T 세포 상에 존재하는 것은 결합 활성, 예컨대, 항원에 대한 특정 친화성 및 결합활성에 의한 것과 같이, 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원-결합 부분은 변형 또는 조작된 것이다. 일부 구현예에서, 유도 진화 방법은 특정 MHC-펩타이드 복합체에 대한 보다 높은 친화성을 가진 것과 같은, 변경된 특성을 가진 TCR을 생성하는데 사용된다. 일부 구현예에서, 유도 진화는 효모 디스플레이(Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A, 97, 5387-92), 파지 디스플레이(Li et al. (2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54), 또는 T 세포 디스플레이(Chervin et al. (2008) J Immunol Methods, 339, 175-84)를 포함하는 디스플레이 방법에 의해 획득되나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 디스플레이 접근은 공지된, 모(parent) 또는 기준 TCR을 엔지니어링 또는 변형하는 것을 포함한다. 예컨대, 일부 경우에, 야생형 TCR은 CDR의 하나 이상의 잔기가 돌연변이되는 돌연변이유도된 TCR을 생성하기 위한 템플릿으로서 사용될 수 있고, 원하는 표적 항원에 대한 보다 높은 친화성을 가지는 것과 같은, 원하는 변경된 물성을 가진 돌연변이체는 선택된다.
일부 구현예에서, 관심있는 TCR을 생산 또는 생성하는데 사용하기 위한 표적 폴리펩타이드의 펩타이드는 공지되어 있거나 쉽게 확인될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR 또는 항원-결합 부분을 생성하는데 사용하기에 적합한 펩타이드는 하기 서술된 표적 폴리펩타이드와 같은, 관심있는 표적 폴리펩타이드에서 HLA- 제한 모티프의 존재에 기초하여 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 펩타이드는 이용가능한 컴퓨터 예측 모델을 사용하여 확인된다. 일부 구현예에서, MHC 클래스 I 결합 부위를 예측하기 위해, 그러한 모델은 ProPred1(Singh and Raghava(2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237), 및 SYFPEITHI(Schuler et al. (2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007 참고)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, MHC-제한 에피토프는 HLA-A0201이고, 이는 모든 백인의 약 39-46%로 표현되므로, 적합한 TCR 또는 다른 MHC- 펩티드 결합 분자를 제조하는데 사용하기 위한 MHC 항원의 적절한 선택을 나타낸다.
컴퓨터 예측 모델을 사용하여 프로테아좀 및 면역-프로테아좀에 대한 HLA-A0201- 결합 모티프 및 절단 부위가 공지되어 있다. MHC 클래스 I 결합 부위를 예측하기 위해, 그러한 모델은 ProPred1(Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001에 보다 상세하게 서술됨), 및 SYFPEITHI(Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007 참고)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원 결합 부분은 결합 특성과 같은, 하나 이상의 특성이 변경된 재조합으로 생성된 천연 단백질 또는 그의 돌연변이된 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 인간, 마우스, 래트, 또는 다른 포유동물과 같은, 다양한 동물 종으로부터 유래될 수 있다. TCR은 세포-결합 또는 가용성 형태일 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법의 목적을 위해, TCR은 세포의 표면 상에 발현된 세포-결합 형태이다.
일부 구현예에서, TCR은 전장 TCR이다. 일부 실시 양태에서, TCR은 항원-결합 부분이다. 일부 구현예에서, TCR은 다이머 TCR(dTCR)이다. 일부 구현예에서, TCR은 단일-사슬 TCR(sc-TCR)이다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR은 WO 03/020763, WO 04/033685, WO2011/044186에 서술된 바와 같은 바와 같은 구조를 가진다.
일부 구현예에서, TCR은 막관통 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 세포질 서열에 상응하는 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, TCR은 CD3과 함께 TCR 복합체를 형성할 수 있다. 일부 구현예에서, dTCR 또는 scTCR을 포함하는, 임의의 TCR은 T 세포의 표면 상에 활성 TCR을 산출하는 신호 도메인에 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 세포의 표면 상에 발현된다.
일부 구현예에서, dTCR은 TCR α 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR α 사슬 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 서열의 N 말단에 융합된 제1 폴리펩타이드, 및 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 서열이 TCR β 사슬 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 서열의 융합된 제2 폴리펩타이드를 함유하고, 제1 및 제 2 폴리펩타이드는 이황화 결합에 의해 연결된다. 일부 구현예에서, 결합은 자연 다이머 αβ TCR에 존재하는 자연 사슬간 이황화 결합에 상응할 수 있다. 일부 구현예에서, 사슬간 이황화 결합은 천연 TCR에 존재하지 않는다. 예컨대, 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인은 dTCR 폴리펩티드 쌍의 불변 영역 세포외 서열 내로 혼입될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비-천연 이황화 결합 모두 바람직할 수 있다. 일부 구현예에서, TCR은 막에 고정하기 위한 막관통 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, dTCR은 가변 α 도메인, 불변 α 도메인 및 불변 α 도메인의 C- 말단에 부착된 제1 다이머화 모티프를 함유하는 TCR α 사슬, 및 가변 β 도메인, 불변 β 도메인 및 불변 β 도메인의 C- 말단에 부착된 제1 다이머화 모티프를 포함하는 TCR β 사슬을 함유하고, 상기 제1 및 제2 다이머화 모티프는 쉽게 상호 작용하여 TCR α 사슬 및 TCR β 사슬을 함께 연결하는 제1 다이머화 모티프에서 아미노산 및 제2 다이머화 모티프에서 아미노산 사이 공유 결합을 형성한다.
일부 구현에서, TCR은 scTCR이다. 전형적으로, scTCR은 공지된 방법을 사용하여 생성된다(예컨대, Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (USA) 89, 4759 (1992); Wulfing, C. and Pluckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al. PNAS (USA) 90 3830 (1993); International published PCT Nos. WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120, WO99/18129, WO 03/020763, WO2011/044186; 및 Schlueter, C. J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996) 참고). 일부 구현예에서, scTCR은 TCR 사슬의 결합을 용이하게 하기 위해 도입된 비-천연 이황화 사슬간 결합을 함유한다(예컨대, 국제공개 PCT 번호 WO 03/020763 참고). 일부 구현예에서, scTCR은 그의 C-말단에 융합된 이종 류신 지퍼가 사슬 결합을 용이하게 하는 비-이황화 연결된 절단 TCR이다(예컨대, 국제공개 PCT 번호 WO 99/60120 참고). 일부 구현예에서, scTCR은 펩타이드 링커를 통해 TCRβ 가변 도메인에 공유 결합된 TCRα 가변 도메인을 함유한다(예컨대, 국제공개 PCT 번호 WO 99/18129 참고).
일부 구현예에서, scTCR은 TCR α 사슬 가변 영역에 상응하는 아미노산 서열로 구성된 제 1 세그먼트, TCR β 사슬 불변 영역 세포외 서열에 상응하는 아미노산 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 가변 영역 서열에 상응하는 아미노산 서열로 구성된 제2 세그먼트, 및 제1 세그먼트의 C 말단을 제2 세그먼트의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 α 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 α 사슬 변이 영역 서열로 구성된 제1 세그먼트, 및 서열 β 사슬 세포외 불변 및 막관통 서열에 융합된 β 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제2 세그먼트, 및, 선택적으로, 제1 세그먼트의 C 말단을 제2 세그먼트의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, scTCR은 β 사슬 세포외 불변 도메인 서열의 N 말단에 융합된 TCR β 사슬 변이 영역 서열로 구성된 제1 세그먼트, 및 서열 α 사슬 세포외 불변 및 막관통 서열에 융합된 α 사슬 가변 영역 서열로 구성된 제2 세그먼트, 및, 선택적으로, 제1 세그먼트의 C 말단을 제2 세그먼트의 N 말단에 연결하는 링커 서열을 함유한다.
일부 구현예에서, 제1 및 제2 TCR 세그먼트를 연결하는 scTCR의 링커는 TCR 결합 특이성을 유지하면서 단일 폴리펩타이드 가닥을 형성할 수 있는 임의의 링커일 수있다. 일부 구현예에서, 예컨대, 링커 서열은 식 -P-AA-P-를 가질 수 있고, P는 프롤린이고 AA는 아미노산이 글라이신 및 세린인 아미노산 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 세그먼트는 그의 가변 영역 서열이 그러한 결합을 위해 배향되도록 쌍을 이룬다. 따라서, 일부 경우에, 링커는 제1 세그먼트의 C 말단 및 제2 세그먼트의 N 말단 사이 거리에 걸쳐서 충분한 길이를 갖거나, 반대로, 표적 리간드에 대한 scTCR의 결합을 차단하거나 감소시키기에는 너무 길지 않다. 일부 구현예에서, 링커는 10개 내지 30개 아미노산 또는 26개 내지 41개 아미노산과 같은, 10개 내지 45개 아미노산 또는 약 10개 내지 약 45개 아미노산, 예컨대, 29개, 30개, 31개 또는 32개 아미노산을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 링커는 식 -PGGG-(SGGGG)5-P-를 가지고, P는 프롤린이고, G는 글라이신이고, S는 세린이다(서열번호 28). 일부 구현예에서, 링커는 서열 GSADDAKKDAAKKDGKS를 가진다(서열 번호 29).
일부 구현예에서, scTCR은 α 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기를 β 사슬의 불변 도메인의 면역글로불린 영역의 잔기에 연결하는 공유 이황화 결합을 함유한다. 일부 구현예에서, 천연 TCR에서 사슬간 이황화 결합은 존재하지 않는다. 예컨대, 일부 구현예에서, 하나 이상의 시스테인은 scTCR 폴리펩타이드의 제1 및 제2 세그먼트의 불변 영역 세포외 서열에 통합될 수 있다. 일부 경우에, 천연 및 비-천연 이황화 결합 모두는 바람직할 수 있다.
도입된 사슬간 이황화 결합을 함유하는 dTCR 또는 scTCR의 일부 구현예에서, 천연 이황화 결합은 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 천연 사슬간 이황화 결합을 형성하는 하나 이상의 천연 시스테인은 세린 또는 알라닌과 같은 다른 잔기로 치환된다. 일부 구현예에서, 도입된 이황화 결합은 제1 및 제2 세그먼트 상에 비- 시스테인 잔기를 시스테인으로 돌연변이시킴으로써 형성될 수 있다. TCR의 예시적인 비-천연 이황화 결합은 공개된 국제 PCT 번호 WO2006/000830에서 서술된다.
일부 구현예에서, TCR 또는 그의 항원-결합 단편은 10-5 및 10-12M 사이 또는 약 10-5 및 10-12M 사이 및 그안에 모든 개별적인 값 및 범위의 표적 항원을 위한 평형 결합 상수를 가진 친화성을 나타낸다. 일부 구현예에서, 표적 항원은 MHC-펩타이드 복합체 또는 리간드이다.
일부 구현예에서, α 및 β 사슬과 같은, TCR을 암호화하는 핵산 또는 핵산들은 PCR, 클로닝 또는 다른 적절한 수단에 의해 증폭될 수 있고, 적합한 발현 벡터 또는 벡터들로 클로닝될 수 있다. 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있고, 임의의 적합한 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 적합한 벡터는 증식 및 팽창 또는 발현을 위해 설계된 것들 또는 플라스미드 및 바이러스와 같은, 둘다를 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 pUC series(Fermentas Life Sciences), pBluescript series(Stratagene, LaJolla, Calif.), pET series(Novagen, Madison, Wis.), pGEX series(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden), 또는 pEX series(Clontech, Palo Alto, Calif.)의 벡터일 수 있다. 일부 경우에, 또한, λG10, λGT11, λZapII(Stratagene), λEMBL4, 및 λNM1149와 같은, 박테리오파지 벡터는 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 식물 발현 벡터는 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(Clontech)를 사용하고 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 동물 발현 벡터는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(Clontech)를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터와 같은 것들이 사용된다.
일부 구현예에서, 재조합 발현 벡터는 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 전사 및 번역 개시 및 종결 코돈과 같은, 조절 서열을 함유할 수 있고, 이는 벡터가 DNA- 또는 RNA- 기반인지를 고려하여 적절한 바와 같이, 벡터가 도입되기 위한 숙주의 유형(예컨대, 박테리아, 곰팡이, 식물, 또는 동물)에 특이적이다. 일부 구현예에서, 벡터는 TCR 또는 항원-결합 부분(또는 다른 MHC- 펩타이드 결합 분자)을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된 비천연 프로모터를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 비-바이러스 프로모터 또는 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 및 뮤린 줄기 세포 바이러스의 장기 반복에서 발견되는 프로모터와 같은 바이러스 프로모터일 수 있다. 또한, 다른 공지된 프로모터도 고려된다.
일부 구현예에서, TCR을 암호화하는 벡터를 생성하기 위해, α 및 β 사슬은 관심있는 TCR을 발현하는 T 세포 클론으로부터 분리되고 발현 벡터로 클로닝된 총 cDNA로부터 PCR 증폭된다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 동일한 벡터 내로 클로닝된다. 일부 구현예에서, α 및 β 사슬은 상이한 벡터 내로 클로닝된다. 일부 구현예에서, 생성된 α 및 β 사슬은 레트로바이러스, 예컨대, 렌티바이러스 벡터 내로 통합된다.
Ⅴ. 조성물, 제형, 및 투여의 방법
일부 구현예에서, 섹션 I에 서술된 바와 같이, 본원에서 제공된 방법에 의해 생산된 농축된 T 세포의 출력 조성물은 세포 치료, 예컨대, 입양 세포 치료와 같이 투여된다. 특별한 구현예에서, 본원에서 서술된 하나 이상의 세포 조성물, 예컨대, 출력 세포 조성물은 세포 치료로서 투여된다. 일부 구현예에서, 입양 T 세포 치료 방법은 예컨대, US 특허 출원 공개 번호 2003/0170238 to Gruenberg et al; US 특허 번호 4,690,915 to Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85)에서 서술된다. Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338 참고.
특정 구현예에서, 본원에서 제공된 방법은 세포 치료로서 투여되는 단일 생물학적 샘플로부터 분리, 선택 및/또는 농축된 입력 세포로부터 농축된 T 세포의 단일 출력 조성물을 생산한다. 특별한 구현예에서, 단일 출력 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 조성물이다. 특정 구현예에서, 단일 출력 조성물은 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 조성물이다. 일부 구현예에서, 본원에서 제공된 방법은 단일 공급원, 예컨대, 생물학적 샘플로부터 분리, 선택, 또는 농축된 생물학적 샘플 및/또는 입력 조성물로부터 2개 이상 출력 조성물을 생산하고, 이는 개체에 투여된다. 일부 구현예에서, 2개 이상 출력 조성물은 개체에 별도로 투여된다. 특정 구현예에서, 2개 이상 출력 조성물은 단일 조성물 내로 조합되고 개체에게 투여된다. 특정 구현예에서, 2개 이상 출력 조성물은 농축된 CD4+ T 세포의 출력 조성물을 포함한다. 특별한 구현예에서, 2개 이상 출력 조성물은 농축된 CD8+ T 세포의 출력 조성물을 포함한다.
일부 구현예에서, 개체에 투여되는 농축된 CD4+ T 세포의 출력 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100% CD4+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 출력 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 및/또는 재조합 폴리뉴클레오타이드로 형질도입되거나 형질감염된 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100% CD4+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 개체에 투여되는 농축된 CD4+ T 세포의 출력 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만 CD8+ T 세포를 포함하고, 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하지 않고, 및/또는 CD8+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 개체에 투여되는 농축된 CD8+ T 세포의 출력 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100% CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 조성물은 재조합 수용체를 발현하고 및/또는 재조합 폴리뉴클레오타이드로 형질도입되거나 형질전환된 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100% CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 개체에 투여되는 농축된 CD8+ T 세포의 출력 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만 CD4+ T 세포를 포함하고, 및/또는 CD4+ T 세포를 포함하지 않고, 및/또는 CD4+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다.
치료되는 질환 또는 상태는 항원의 발현이 질환 상태 또는 장애의 병인과 관련되고 및/또는 이를 수반하고, 예컨대, 그러한 질환, 상태, 또는 장애를 일으키거나, 악화시키거나, 그렇지 않으면 수반한다. 예시적인 질환 및 상태는 세포의 악성종양 또는 형질전환(예컨대, 암), 자가 면역 또는 염증성 질환, 또는 감염성 질환과 연관된 질환 또는 상태를 포함할 수 있고, 예컨대, 박테리아, 바이러스, 또는 다른 병원체에 의해 발생한다. 치료될 수 있는 다양한 질환 및 상태와 관련된 항원을 포함하는 예시적인 항원은 앞서 서술된다. 특정 구현예에서, 키메릭 항원 수용체 또는 트랜스제닉 TCR은 질환 또는 상태와 관련된 항원에 특이적으로 결합한다.
질환 중에, 상태 및 장애는 고형 종양, 혈액 악성 종양 및 흑색종을 포함하는 종양 및 국소 및 전이성 종양을 포함하고, 전이성 종양, 바이러스 또는 다른 병원체, 예컨대, HIV, HCV, HBV, CMV, HPV, 및 기생충 질환으로 감염된 것과 같은 감염성 질환, 및 자가면역 및 염증성 질환을 포함하는 종양이다.
일부 구현예에서, 질환, 장애 또는 상태는 종양, 암, 악성 종양, 신생물, 또는 다른 증식성 질환 또는 장애이다. 그러한 질환은 백혈병, 림프종, 예컨대, 급성 골수(또는 골수성) 백혈병(AML), 만성 골수(또는 골수성) 백혈병(CML), 급성 림프구(또는 림프구성) 백혈병(ALL), 만성 림프구 백혈병(CLL), 털세포 백혈병(HCL), 작은 림프구 림프종(SLL), 맨틀 세포 림프종(MCL), 한계 영역 림프종, 버킷 림프종, 호지킨 림프종(HL), 비-호지킨 림프종(NHL), 퇴행성 거대세포 림프종(ALCL), 여포성 림프종, 불응성 여포성 림프종, 확산성 거대 B- 세포 림프종(DLBCL) 및 다발성 골수종(MM)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이에 제한되지는 않는다. 일부 구현예에서, 질환 또는 상태는 급성 림프모구 백혈병(ALL), 성인 ALL, 만성 림프모구 백혈병 (CLL), 비-호지킨 림프종(NHL) 및 확산성 거대 B-세포 림프종(DLBCL) 중에서 선택된 B 세포 악성 종양이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 상태는 NHL이고, NHL은 공격적인 NHL, 확산성 거대 B 세포 림프종(DLBCL), NOS(무통으로부터 de novo 및 형질전환된), 1차 종격동 거대 B 세포 림프종(PMBCL), T 세포/조직세포-농축 거대 B 세포 림프종(TCHRBCL), 버킷 림프종, 맨틀 세포 림프종(MCL) 및/또는 여포성 림프종(FL), 선택적으로, 여포성 림프종 3B(FL3B)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, CAR과 같은, 재조합 수용체는 질환 또는 상태와 관련된 항원에 특이적으로 결합하거나 B 세포 악성 종양과 관련된 병변 환경의 세포에서 발현된다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커 중 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 관련된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b 또는 CD30, 또는 그의 조합이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 상태는 다발성 골수종과 같은 골수종이다. 일부 측면에서, CAR과 같은 재조합 수용체는 질환 또는 상태와 관련된 항원에 특이적으로 결합하거나 다발성 골수종과 관련된 병변 환경의 세포에서 발현된다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다발성 골수종과 관련된 항원을 포함한다. 일부 측면에서, 항원, 예커대, 질환-특이적 항원 및/또는 관련 항원과 같은, 제2 또는 추가 항원은 다발성 골수종, 예컨대, B 세포 성숙 항원(BCMA), G 단백질-결합된 수용체 클래스 C 그룹 5멤버 D(GPRC5D), CD38(사이클릭 ADP 리보오스 가수분해효소), CD138(신 데칸-1, 신데칸, SYN-1), CS-1(CS1, CD2 서브세트 1, CRACC, SLAMF7, CD319 및 19A24), BAFF-R, TACI 및/또는 FcRH5 에서 발현된다. 다른 예시적인 다발성 골수종 항원은 CD56, TIM-3, CD33, CD123, CD44, CD20, CD40, CD74, CD200, EGFR, β2-마이크로글로불린, HM1.24, IGF-1R, IL-6R, TRAIL-R1, 및 액티빈 수용체 타입 IIA (ActRIIA)을 포함한다. Benson and Byrd, J. Clin. Oncol. (2012) 30(16): 2013-15; Tao and Anderson, Bone Marrow Research (2011):924058; Chu et al., Leukemia (2013) 28(4):917-27; Garfall et al., Discov Med. (2014) 17(91):37-46 참고. 일부 구현예에서, 항원은 림프구 종양, 골수종, AIDS-관련 림프종 및/또는 이식 후 림프증식, 예컨대, CD38에 존재하는 것들을 포함한다. 그러한 항원에 대한 항체 또는 항원-결합 단편은 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 번호 8,153,765; 8,603477, 8,008,450; 미국 공개 번호 US20120189622 또는 US20100260748; 및/또는 국제 PCT 공개 번호 WO2006099875, WO2009080829 또는 WO2012092612 또는 WO2014210064에서 서술된다. 일부 구현예에서, 그러한 항체 또는 그의 항원-결합 단편(예컨대, scFv)은 다중특이적 항체, 다중특이적 키메릭 수용체, 예컨대, 다중특이적 CAR, 및/또는 다중특이적 세포에 함유된다.
일부 구현예에서, 질환 또는 상태는 바이러스성, 레트로바이러스성, 박테리아성, 및 원생동물 감염, 면역 결핍, 사이토메갈로바이러스(CMV), 엡스타인-바 바이러스(EBV), 아데노바이러스, BK 폴리오마바이러스와 같은 감염성 질환 또는 상태이다. 일부 구현예에서, 질환 또는 상태는 자가 면역 또는 염증성 질환 또는 상태, 예컨대, 관절염, 예컨대, 류마티스 관절염(RA), 제1형 당뇨병, 전신성 홍반성 루푸스(SLE), 염증성 장 질환, 건선, 경피증, 자가면역 갑상선 질환, 그레이브병, 크론병, 다발성 경화증, 천식 및/또는 이식과 관련된 질환 또는 상태이다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애와 관련된 항원은 αvβ6 인테그린(avb6 인테그린), B 세포 성숙 항원(BCMA), B7-H6, 탄산탈수효소 9(CA9, 또한 CAIX 또는 G250로 공지됨), 암-고환 항원, 암/고환 항원 1B(CTAG, 또한 NY-ESO-1 및 LAGE-2로 공지됨), 암태아성 항원(CEA), 사이클린, 사이클린 A2, C-C 모티프 케모카인 리간드 1(CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 표피 성장 인자 단백질(EGFR), 절단된 표피 성장 인자 단백질(tEGFR), III형 표피 성장 인자 수용체 돌연변이(EGFR vIII), 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40(EPG-40), 에프린 B2, 에프린 수용체 A2(EPHa2), 에스트로겐 수용체, Fc 수용체 유사 5(FCRL5, 또한 Fc 수용체 유사 5 또는 FCRH5로 공지됨), 태아성 아세틸콜린 수용체(태아성 AchR), 폴레이트 결합 단백질(FBP), 폴레이트 수용체 알파, 폴레이트 아세틸콜린 수용체, 강글리오사이드 GD2, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 강글리오사이드 GD3, 당단백 100(gp100), Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erb-B2), Her3(erb-B3), Her4(erb-B4), erbB 이량체, 인간 고분자량-멜라노마-연관 항원(HMW-MAA), B형 간염 표면 항원, 인간 백혈구 항원 A1(HLA-A1), 인간 백혈구 항원 A2(HLA-A2), IL-22 수용체 알파(IL-22Rα), IL-13 수용체 알파 2(IL-13Rα2), 키나아제 삽입 도메인 수용체 (kdr), 카파 경쇄, L1 세포 접착 분자(L1-CAM), L1-CAM의 CE7 에피토프, 류신 리치 반복 함유 8 패밀리 멤버 A(LRRC8A), 루이스 Y, 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, 메소텔린(MSLN), c-Met, 뮤린 사이토메갈로바이러스 (CMV), 뮤신 1(MUC1), MUC16, 천연 킬러 그룹 2 구성원 D(NKG2D) 리간드, 멜란 A(MART-1), 신경 세포 부착 분자(NCAM), 온코페탈 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), 프로게스테론 수용체, 전립선 특이적 항원, 전립선 줄기 세포 항원(PSCA), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 수용체 티로신 키나아제 유사 희귀 수용체 1(ROR1), 서바이빈, 세포영양막 당단백(TPBG, 또한 5T4로 공지됨), 종양-연관 당단백 72(TAG72), 혈관 내피 성장 인자 수용체 (VEGFR), 혈관 내피 성장 인자 수용체 2 (VEGFR2), 윌름스 종양 1(WT- 1), 병소-특이적 항원, 또는 유니버설 태그로 연관된 항원, 및/또는 비오틴화 분자, 및/또는 HIV, HCV, HBV 또는 다른 병소에 의해 발현되는 분자 중에서 선택된다. 일부 구현예에서 수용체에 의해 표적화된 항원은 다수의 공지된 B 세포 마커의 하나와 같은 B 세포 악성 종양과 연관된 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 수용체에 의해 표적화된 항원은 CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b 또는 CD30이다. 일부 구현예에서, 항원은 병소-특이적 항원이다. 일부 구현예에서, 항원은 바이러스성 항원(예컨대, HIV, HCV, HBV 등으로부터 바이러스성 항원), 박테리아성 항원, 및/또는 기생충 항원이다.
일부 구현예에서, 세포 치료, 예컨대, 입양 T 세포 치료는 자가 전달에 의해 수행되고, 여기서 세포는 세포 치료를 받을 개체, 또는 그러한 개체로부터 유래된 샘플로부터 분리 및/또는 그렇지 않으면 준비된다. 따라서, 일부 측면에서, 세포는 치료를 필요로 하는 개체, 예컨대, 환자로부터 유래되고, 분리 및 처리 후 동일한 개체에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포 치료, 예컨대, 입양 T 세포 치료는 동종이계 전달에 의해 수행되고, 여기서 세포는 세포 치료를 받거나 궁극적으로 받을 개체, 예컨대, 제1 개체 이외의 개체로부터 분리 및/또는 그렇지 않으면 준비된다. 그러한 구현예에서, 그다음, 세포는 동일한 종의 다른 개체, 예컨대, 제2 개체에 투여된다. 일부 구현예에서, 제1 및 제2 개체는 유전적으로 유사하다. 일부 구현예에서, 제2 개체는 제2 개체와 동일한 HLA 클래스 또는 슈퍼타입을 발현한다.
섹션 I에 제공된 방법에 의해 생성된 세포, 예컨대, 조작된 세포는 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 2 개 이상의 별도 출력 조성물, 예컨대, 섹션 I에 서술된 방법에 의해 생성된 농축된 T 세포의 조성물로부터의 세포는 투여될 세포의 단일 조성물로 조합된다. 특정 구현예에서, 별도 출력 조성물로부터의 세포는 각각 개체에 별도로 투여된다. 특정 구현예에서, CD4+ T 세포는 CD8+ T 세포와 별도로 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 볼루스 주입, 주사, 예컨대, 정맥내 또는 피하 주사, 안구내 주사, 눈주위(periocular) 주사, 망막하 주사, 유리체내 주사, 트랜스-경막 주사, 공막하 주사, 맥락막내 주사, 전방내 주사, 결막하(subconjectval, subconjuntival) 주사, 서브-테논 주사, 안구후 주사, 안구주위(peribulbar) 주사, 또는 후배엽 전달에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 그들은 비경구, 폐내 및 비강 내, 및 국소 치료를 위해 필요한 경우, 병변내 투여에 의해 투여된다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 주어진 용량은 세포의 단일 일시 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 그것은 예컨대, 3 일 이하의 기간에 걸쳐 세포의 다중 일시 투여에 의해, 또는 세포의 연속 주입 투여에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 세포 용량의 투여 또는 임의의 추가 치료, 예컨대, 림프구 마비 치료, 중재 치료 및/또는 병용 치료는 외래 환자 전달을 통해 수행된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 적절한 투여량은 치료될 질환의 유형, 세포 또는 재조합 수용체의 타입, 질환의 중증도 및 과정, 세포가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 이전 치료, 개체의 임상 이력 및 세포에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 의존할 수 있다. 조성물 및 세포는 일부 구체 예에서 한번의 또는 일련의 치료에 걸쳐 개체에게 적합하게 투여된다.
일부 구현예에서, 세포는 조합 치료의 일부로서, 예컨대, 동시에 또는 순차적으로, 임의의 순서로, 다른 치료적 개입, 예컨대, 항체 또는 조작된 세포 또는 수용체 또는 작용제, 예컨대, 세포독성 또는 치료제가 투여된다. 일부 구현예에서 세포는 하나 이상의 추가 치료제와 함께 또는 다른 치료적 개입과 관련하여 동시에 또는 임의의 순서로 동시에 투여된다. 일부 상황에서, 세포는 세포 집단이 하나 이상의 추가 치료제의 효과를 향상시키도록 또는 그 반대의 시간에 충분히 근접한 다른 치료와 공동-투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 전에 투여된다. 일부 구현예에서, 세포는 하나 이상의 추가 치료제 후에 투여된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 작용제는 예컨대, 지속성을 향상시키기 위해, IL-2와 같은 사이토카인을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 화학요법 작용제의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 예컨대, 투여 전에 종양 부담을 감소시키기 위해, 화학요법 작용제, 예컨대, 처리 화학요법 작용제의 투여를 포함한다.
일부 측면에서 면역결핍(예컨대, 림프구결핍) 치료를 가진 전처리 개체는 입양 세포 치료(ACT)의 효과를 개선시킬 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 방법은 세포 치료의 개시 전에 개체에 전처리 작용제, 예컨대, 림프구 마비 또는 화학요법 작용제, 예컨대, 사이클로포스파마이드, 플루다라빈, 또는 그의 조합을 투여하는 단계를 포함한다. 예컨대, 개체는 세포 치료의의 개시 적어도 2일 전, 예컨대, 적어도 3, 4, 5, 6 또는 7 일 전 전처리 작용제를 투여받는다. 일부 구현예에서, 개체는 세포 치료의 개시 7 일 이하 전, 예컨대, 6, 5, 4, 3 또는 2일 이하 이전에 전처리 작용제를 투여받는다.
일부 구현예에서, 개체는 20 mg/kg 내지 100 mg/kg 또는 약 20 mg/kg 내지 100 mg/kg, 예컨대, 40 mg/kg 내지 80 mg/kg 또는 약 40 mg/kg 내지 80 mg/kg의 용량으로 사이클로포스파마이드로 전처리된다. 일부 측면에서, 개체는 60 mg/kg 또는 약 60 mg/kg의 사이클로포스파마이드로 전처리된다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 매일, 격일로 또는 3 일 마다 주어진 것과 같은 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 1일 또는 2일 동안 1일 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 림프구 마비 작용제가 사이클로포스파마이드를 포함하는 경우, 개체는 사이클로포스파마이드를 100 mg/m2내지 500 mg/m2또는 약 100 mg/m2내지 500 mg/m2, 예컨대, 200 mg/m2 내지 400 mg/m2 또는 250 mg/m2 내지 350 mg/m2 또는 약 200 mg/m2 내지 400 mg/m2 또는 약 250 mg/m2 내지 350 mg/m2의 용량으로 투여된다. 일부 예시에서, 개체는 약 300 mg/m2 의 사이클로포스파마이드로 투여된다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 매일, 격일로 또는 3 일 마다 주어진 것과 같은 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 사이클로포스파마이드는 1일 내지 5 일 동안, 예컨대, 3 일 내지 5 일 동안과 같이, 매일 투여된다. 일부 경우에, 개체는 세포 치료의 개시 전에 3 일 동안 매일 약 300 mg/m2의 사이클로포스파마이드를 투여받는다.
일부 구현예에서, 림프구 마비 작용제가 플루다라빈을 포함하는 경우, 개체는 1 mg/m2 내지 100 mg/m2 또는 약 1 mg/m2 and 100 mg/m2, 예컨대, 10 mg/m2 내지 75 mg/m2, 15 mg/m2 내지 50 mg/m2, 20 mg/m2 내지 40 mg/m2, 또는 24 mg/m2 내지 35 mg/m2, 또는 약 10 mg/m2 내지 75 mg/m2, 15 mg/m2 내지 50 mg/m2, 20 mg/m2 내지 40 mg/m2, 또는 24 mg/m2 내지 35 mg/m2의 용량으로 플루다라빈을 투여받는다. 일부 예시에서, 개체는 약 30 mg/m2의 플루다라빈을 투여받을 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 단일 용량으로 투여될 수 있거나, 매일, 격일로 또는 3 일 마다 주어진 것과 같은 복수의 용량으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 플루다라빈은 1일 내지 5 일 동안, 예컨대, 3 일 내지 5 일 동안과 같이, 매일 투여된다. 일부 경우에, 개체는 세포 치료의 개시 전에 3 일 동안 매일 약 30 mg/m2의 플루다라빈을 투여받는다.
일부 구현예에서, 림프구 마비 작용제는 작용제의 조합, 예컨대, 사이클로포스파마이드 및 플루다 라빈의 조합을 포함한다. 따라서, 작용제의 조합은 앞서 기재된 바와 같은 임의의 용량 또는 투여 스케쥴에서 사이클로포스파마이드 및 앞서 기재된 바와 같은 임의의 용량 또는 투여 스케쥴에서 플루다라빈을 포함할 수 있다. 예컨대, 일부 측면에서, 개체는 1차 또는 후속 용량 전에 60 mg/kg (~ 2 g/m2)의 사이클로포스파마이드 및 3회 내지 5 회 용량의 25 mg/m2 플루다라빈을 투여받는다.
세포의 투여 후, 일부 구현예에서 조작된 세포 집단의 생물학적 활성은 예컨대, 임의의 다수의 공지 된 방법에 의해 측정된다. 평가하는 파라미터는 in vivo, 예컨대, 영상화, 또는 ex vivo, 예컨대, ELISA 또는 유세포 분석에 의해 조작된 또는 천연 T 세포 또는 다른 면역 세포의 항원에 대한 특이 적 결합을 포함한다. 특정 구현예에서, 조작된 세포가 표적 세포를 파괴하는 능력은 예컨대, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009), 및 Herman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004) 에서 서술된 세포독성 분석과 같은 적합한 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 특정 구현예에서, 세포의 생물학적 활성은 CD107a, IFNγ, IL-2 및 TNF와 같은 하나 이상의 사이토카인의 발현 및/또는 분비를 분석함으로써 측정된다. 일부 측면에서, 생물학적 활성은 종양 부담 또는 부하 감소와 같은 임상 결과를 평가함으로써 측정된다.
특정 구현예에서, 조작된 세포는 임의의 수의 방식으로 추가로 변형되어, 그의 치료 또는 예방 효능이 증가된다. 예컨대, 집단에 의해 발현된 조작된 CAR 또는 TCR은 링커를 통해 표적 부분에 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이션될 수 있다. 표적 부분에 대한 적화합물, 예를 들어 CAR 또는 TCR을 컨쥬게이션시키는 관행은 공지되어 있다. 예컨대, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 1 1 1 (1995), 및 미국 특허 5,087,616 참고.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 제공된 방법, 및/또는 제조 또는 조성물의 제공된 물품에 따라 개체에 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 크기 또는 시기는 개체에서 특정 질환 또는 상태의 함수로서 결정된다. 일부 경우에, 제공된 설명의 관점에서 특정 질환에 대한 용량의 크기 또는 시기는 경험적으로 결정될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 2 x 105 cells/kg 내지 2 x 106 cells/kg 또는 약 2 x 105 cells/kg 내지 2 x 106 cells/kg, 예컨대, 4 x 105 cells/kg 내지 1 x 106 cells/kg 또는 약 4 x 105 cells/kg 내지 1 x 106 cells/kg 또는 6 x 105 cells/kg 내지 8 x 105 cells/kg 또는 약 6 x 105 cells/kg 내지 8 x 105 cells/kg를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 2 x 105 개체의 킬로그램 체중 당 세포(예컨대, 항원-발현, 예컨대, CAR- 발현 세포)(cells/kg) 이하, 예컨대, 3 x 105 cells/kg 또는 약 3 x 105 cells/kg 이하, 4 x 105 cells/kg 또는 약 4 x 105 cells/kg 이하, 5 x 105 cells/kg 또는 약 5 x 105 cells/kg 이하, 6 x 105 cells/kg 또는 약 6 x 105 cells/kg 이하, 7 x 105 cells/kg 또는 약 7 x 105 cells/kg 이하, 8 x 105 cells/kg 또는 약 8 x 105 cells/kg 이하, 9 x 105 cells/kg 또는 약 9 x 105 cells/kg 이하, 1 x 106 cells/kg 또는 약 1 x 106 cells/kg 이하, 또는 2 x 106 cells/kg 또는 약 2 x 106 cells/kg 이하를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 적어도 2 x 105 개체의 킬로그램 체중 당 세포(예컨대, 항원-발현, 예컨대, CAR- 발현 세포)(cells/kg) 또는 적어도 약 2 x 105 cells/kg 또는 2 x 105 cells/kg 또는 2 x 105 cells/kg, 예컨대, 적어도 3 x 105 cells/kg 또는 적어도 약 3 x 105 cells/kg 또는 3 x 105 cells/kg 또는 3 x 105 cells/kg, 적어도 4 x 105 cells/kg 또는 적어도 약 4 x 105 cells/kg 또는 4 x 105 cells/kg 또는 4 x 105 cells/kg, 적어도 5 x 105 cells/kg 또는 적어도 약 5 x 105 cells/kg 또는 5 x 105 cells/kg 또는 5 x 105 cells/kg, 적어도 6 x 105 cells/kg 또는 적어도 약 6 x 105 cells/kg 또는 6 x 105 cells/kg 또는 6 x 105 cells/kg, 적어도 7 x 105 cells/kg 또는 적어도 약 7 x 105 cells/kg 또는 7 x 105 cells/kg 또는 7 x 105 cells/kg, 적어도 8 x 105 cells/kg 또는 적어도 약 8 x 105 cells/kg 또는 8 x 105 cells/kg 또는 8 x 105 cells/kg, 적어도 9 x 105 cells/kg 또는 적어도 약 9 x 105 cells/kg 또는 9 x 105 cells/kg 또는 9 x 105 cells/kg, 적어도 1 x 106 cells/kg 또는 적어도 약 1 x 106 cells/kg 또는 1 x 106 cells/kg 또는 1 x 106 cells/kg, 또는 적어도 2 x 106 cells/kg 또는 적어도 약 2 x 106 cells/kg 또는 2 x 106 cells/kg 또는 2 x 106 cells/kg를 포함한다.
특정 구현예에서, 세포, 또는 세포의 서브-타입의 개별 집단은 약 100만 내지 약 1000억 세포의 범위 및/또는 체중의 킬로그램 당 세포의 양, 예컨대, 100억 내지 약 500억 세포(예컨대, 약 500 만 세포, 약 2500 만 세포, 약 5 억 세포, 약 10 억 세포, 약 50 억 세포, 약 200 억 세포, 약 300 억 세포, 약 400 억 세포, 또는 2개의 앞선 값 중 하나에 의해 정의된 범위), 예컨대, 약 1000만 내지 1000억 세포(예컨대, 약 2 000만 세포, 약 3000만 세포, 약 4000만 세포, 약 6000만 세포, 약 7000만 세포, 약 8000만 세포, 약 9000만 세포, 약 100 억 세포, 약 250 억 세포, 약 500억 세포, 약 750 억 개의 세포, 약 900 억 개의 세포, 또는 2개의 앞선 값 중 하나에 의해 정의된 범위), 및 일부 경우에, 약 1억 내지 약 500 억 세포(예컨대, 약 1 억 2000만 세포, 약 2 억 5000만 세포, 약 3 억 5000만 세포, 약 4 억 5000만 세포, 약 6 억 5000만 세포, 약 8 억 세포, 약 9 억 세포, 약 30 억 세포, 약 300 억 세포, 약 450억 세포, 또는 2개의 앞선 값 중 하나에 의해 정의된 범위) 또는 그들 범위 사이 및/또는 체중의 킬로그램 당에서 임의의 값으로 개체에 투여된다. 투여량은 질환 또는 장애 및/또는 환자 및/또는 다른 치료에 특이적인 속성에 의존하여 다양할 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 세포의 용량이 개체의 신체 표면적 또는 중량에 결속되지 않거나 이를 기반으로 하지 않도록 세포의 일정한 용량 또는 세포의 고정된 용량이다.
일부 구현예에서, 예컨대, 개체가 인간인 경우, 용량은 약 1 x 108 미만 총 재조합 수용체(예컨대, CAR)-발현 세포, T 세포, 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMs), 예컨대, 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107, 또는 1 x 108 또는 총 그러한 세포와 같은, 약 1 x 106 내지 1 x 108 그러한 세포의 범위, 또는 2개 앞선 값 중 임의의 사이 범위에서 포함한다. 일부 구현예에서, 개체가 인간인 경우, 용량은 약 1 x 106 내지 3 x 108총 재조합 수용체(예컨대, CAR)-발현 세포, 예컨대, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 또는 1.5 x 108 총 그러한 세포와 같은, 약 1 x 107 내지 2 x 108 그러한 세포의 범위, 또는 2개 앞선 값 중 임의의 사이 범위에서 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 다중 용량으로 투여되고, 각각의 용량 또는 총 용량은 앞선 값 중 임의의 범위 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 각각 포함하여, 1 x 105 내지 5 x 108 또는 약 1 x 105 내지 5 x 108 의 총 재조합 수용체-발현 T 세포 또는 총 T 세포, 1 x 105 내지 1 x 108 또는 약 1 x 105 내지 1 x 108 의 총 재조합 수용체-발현 T 세포 또는 총 T 세포, 5 x 105 내지 1 x 107 또는 약 5 x 105 내지 1 x 107 의 총 재조합 수용체-발현 T 세포 또는 총 T 세포, 또는 1 x 106 내지 1 x 107 또는 약 1 x 106 내지 1 x 107 의 총 재조합 수용체-발현 T 세포 또는 총 T 세포의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 용량의 T 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 또는 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 예컨대, 개체가 인간인 경우, 용량은 약 1 x 106 내지1 x 108 총 재조합 수용체(예컨대, CAR)-발현 CD8+ T 세포, 예컨대, 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 7.5 x 107 또는 1 x 108 총 그러한 세포와 같은, 약 5 x 106 내지 1 x 108 그러한 세포의 범위, 또는 2개 앞선 값 중 임의의 사이 범위에서 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 다중 용량으로 투여되고, 각각의 용량 또는 총 용량은 앞선 값 중 임의의 범위 내에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 각각 포함하여, 1 x 107 내지 0.75 x 108 또는 약 1 x 107 내지 0.75 x 108의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, 1 x 107 내지 2.5 x 107 또는 약 1 x 107 내지 2.5 x 107 의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포, 1 x 107 내지 0.75 x 108개 또는 약 1 x 107 내지 0.75 x 108의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107 7.5 x 107 또는 1 x 108 또는 약 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107 7.5 x 107 또는 1 x 108 의 총 재조합 수용체-발현 CD8+ T 세포의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포, 예컨대, 재조합 수용체-발현 T 세포의 용량은 단일 용량으로서 개체에 투여되거나 2주, 1달, 3달, 6달, 1년 이상의 기간 내에 오직 1회 투여된다.
입양 세포 치료의 경우, 주어진 "용량"의 투여는 단일 조성물로서 세포의 주어진 양 또는 수의 투여 및/또는 단일 중단없는 투여, 예컨대, 단일 주사 또는 연속 주입으로서를 포함하고, 또한, 특정된 기간, 예컨대, 3일 이하에 걸쳐, 다중 개별 조성물 또는 주입으로 제공된, 분할 용량 또는 복수의 조성물로서 세포의 주어진 양 또는 수의 투여를 포함한다. 따라서, 일부 상황에서, 용량은 단일 시점에서 제공되거나 개시되는 세포의 특정 수의 단일 또는 연속 투여이다. 그러나, 일부 상황에서, 용량은 3 일 이하, 예컨대, 3 일 동안 또는 2 일 동안 하루에 한번에 걸쳐 다중 주사 또는 주입으로, 또는 단일 기간에 걸쳐 다중 주입에 의해 투여된다.
따라서, 일부 측면에서, 용량의 세포는 단일 약학적 조성물에서 투여된다. 일부 구현예에서, 용량의 세포는 용량의 세포를 총괄적으로 함유하는, 복수의 조성물에서 투여된다.
일부 구현예에서, 용어 "분할 용량"은 1 일 초과에 걸쳐 투여되도록 분할된 용량을 가리킨다. 용량의 이러한 타입은 본 방법에 포함되고 단일 용량으로 간주된다.
따라서, 세포의 용량은 분할 용량, 예컨대, 시간에 걸쳐 투여되는 분할 용량으로서 투여될 수 있다. 예컨대, 일부 구현예에서, 용량은 2 일에 걸쳐 또는 3 일에 걸쳐 개체에 투여될 수있다. 분할 투여를 위한 예시적인 방법은 첫째날에 용량의 25%를 투여하고 둘째날에 용량의 나머지 75%를 투여하는 것을 포함한다. 다른 구현예에서, 용량의 33%는 첫째날에 투여될 수 있고 나머지 67%는 둘째날에 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 용량의 10%는 첫째날에 투여되고, 용량의 30%는 둘째 날에 투여되고, 용량의 60%는 셋째날에 투여된다. 일부 구현예에서, 분할 용량은 3 일 초과에 걸쳐 퍼지지 않는다.
일부 구현예에서, 용량의 세포는 용량의 일부 세포를 각각 함유하는, 선택적으로 보다 많은, 제1 및 제2와 같은, 복수의 조성물 또는 용액의 투여에 의해 투여될 수 있다. 일부 측면에서, 상이한 집단 및/또는 세포의 서브-타입을 각각 함유하는, 복수의 조성물은 선택적으로, 특정 기간 내에, 별도로 또는 독립적으로 투여된다. 예컨대, 세포의 집단 또는 서브-타입은 각각 CD8+ 및 CD4+ T 세포, 및/또는 각각 CD8+ 및 CD4+ 농축된 집단, 예컨대, 재조합 수용체를 발현시키기 위해 유전적으로 조작된 세포를 각각 개별적으로 포함하는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 용량의 투여는 CD8+ T 세포의 용량 또는 CD4+ T 세포의 용량을 포함하는 제1 조성물의 투여 및 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포의 다른 용량을 포함하는 제2 조성물의 투여를 포함한다.
일부 구현예에 있어서, 조성물 또는 용량의 투여, 예컨대, 복수의 세포 조성물의 투여는 별도로 세포 조성물의 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 조성물은 섹션 I에 서술된 방법에 의해 생산된 별도 출력 조성물이다. 일부 측면에서, 별도 투여는 임의의 순서로, 동시에, 또는 순차적으로 수행된다. 일부 구현예에서, 용량은 제1 조성물 및 제2 조성물을 포함하고, 제 1 조성물 및 제 2 조성물은 0 내지 12 시간 간격, 0 내지 6 시간 간격 또는 0 내지 2 시간 간격으로 투여된다. 일부 구현예에서, 제 1 조성물의 투여의 개시 및 제2 조성물의 투여의 개시는 2 시간 이하, 1 시간 이하, 또는 30 분 이하 간격, 15 분 이하, 10 분 이하 또는 5 분 이하 간격으로 수행된다. 일부 구현예에서, 제 1 조성물의 투여 개시 및/또는 완료 및 제2 조성물의 투여 완료 및/또는 개시는 2 시간 이하, 1 시간 이하, 또는 30 분 이하 간격, 15 분 이하, 10 분 이하 또는 5 분 이하 간격으로 수행된다.
일부 구현예에서, 제1 조성물, 예컨대, 용량의 제1 조성물은 CD4+ T 세포를 포함한다. 일부 조성물에서, 제1 조성물, 예컨대, 용량의 제1 조성물은 CD8+ T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 조성물은 제2 조성물 이전에 투여된다.
일부 구현예에서, 세포의 용량 또는 조성물은 재조합 수용체를 발현하는 CD4+ T 세포 대 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포 및/또는 CD4 + T 세포 대 CD8 + T 세포의 정의된 또는 표적 비를 포함하고, 이러한 비는 선택적으로, 약 1:1 또는 약 1:3 내지 약 3:1, 예컨대, 약 1:1이다. 일부 측면에서, 상이한 세포 집단의 표적 또는 원하는 비(예컨대, CD4+:CD8+ 비 또는 CAR+CD4+:CAR+CD8+ 비, 예컨대, 1:1)로 조성물 또는 용량의 투여는 하나의 집단을 함유하는 세포 조성물의 투여 후 다른 집단을 포함하는 별도 세포 조성물의 투여를 포함하고, 여기서, 투여는 표적 또는 원하는 비로 또는 약 표적 또는 원하는 비로 있다. 일부 측면에서, 한정된 비율로 세포의 용량 또는 조성물의 투여는 T 세포 치료의 확장, 지속성 및/또는 항종양 활성을 개선시킨다.
일부 구현예에서, 개체는 세포의 다중 용량, 예컨대, 2 회 이상 용량 또는 다중 연속 용량을 받는다. 일부 구현예에서, 2 가지 용량이 개체에 투여된다. 일부 구현예에서, 개체는 제1 용량 약 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21일 후 투여되는, 연속 용량, 예컨대, 제2 용량을 받는다. 일부 구현예에서, 다중 연속 용량은 추가 용량 또는 용량이 연속 용량의 투여 후 투여되도록, 제1 용량 후에 투여된다. 일부 측면에서, 추가 용량으로 개체에 투여되는 세포의 수는 제1 용량 및/또는 연속 용량과 동일하거나 유사하다. 일부 구현예에서, 추가 용량 또는 용량들은 이전 용량 보다 더 크다.
일부 측면에서, 제1 및/또는 연속 용량의 크기는 이전 치료, 예컨대, 화학요법에 대한 개체의 반응, 종양 부하, 벌크, 크기, 또는 정도, 범위, 또는 전이의 타입, 단계와 같은 개체에서 질환 부담, 및/또는 독성 결과를 발생시키는 개체의 가능성 또는 발생률, 예컨대, CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응과 같은, 하나 이상의 기준에 기반하여 결정된다.
일부 측면에서, 제1 용량의 투여 및 연속 용량의 투여 사이의 시간은 약 9 내지 약 35 일, 약 14 내지 약 28 일, 또는 15 내지 27 일이다. 일부 구현예에서, 연속 용량의 투여는 제1 용량의 투여 후 약 14 일 초과 및 약 28 일 미만의 시점에 있다. 일부 측면에서, 제1및 연속 용량 사이의 시간은 약 21일이다. 일부 구현예에서, 추가 용량 또는 용량들, 예컨대, 연속 용량은 연속 용량의 투여 후 투여된다. 일부 측면에서, 추가 연속 용량 또는 용량들은 이전 용량의 투여 후 적어도 약 14 일 및 약 28 일 미만에 투여된다. 일부 구현예에서, 추가 용량은 이전 용량 후 약 14 일 미만, 예컨대, 이전 용량 후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 13 일에 투여된다. 일부 구현예에서, 용량은 이전 용량 후 약 14 일 미만으로 투여되지 않고 및/또는 용량은 이전 용량 후 약 28 일 초과로 투여되지 않는다.
일부 구현예에서, 세포, 예컨대, 재조합 수용체-발현 세포의 용량은 T 세포의 제1 용량 및 T 세포의 연속 용량을 포함하는 2 가지 용량(예컨대, 이중 용량)을 포함하고, 여기서 제1 용량 및 제2 용량 중 하나 또는 둘다는 T 세포의 분할 용량의 투여를 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 용량은 질환 부담을 감소시키는데 효과적일 정도로 충분히 일반적으로 크다.
일부 구현예에서, 세포는 원하는 용량으로 투여되는데, 이는 일부 측면에서 세포 또는 세포 타입(들)의 원하는 용량 또는 수 세포 타입(들)의 원하는 비를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서 세포의 용량은 세포의 총 수(또는 체중 kg 당 수) 및 개별 집단 또는 서브-타입의 원하는 비, 예컨대, CD4+ 대 CD8+ 비를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 세포의 용량은 개별 집단 또는 개별 세포 타입에서 세포의 원하는 총 수(또는 체중 kg 당 수)를 기반으로 한다. 일부 구현예에서, 투여 량은 개별 집단에서 총 세포의 원하는 수, 원하는 비, 및 세포의 원하는 총 수와 같은, 그러한 특징의 조합에 기반한다.
일부 구현예에서, CD8+ 및 CD4+ T 세포와 같은 세포의 집단 또는 서브-타입은 T 세포의 원하는 용량과 같은, 총 세포의 원하는 용량의 허용된 차이로 또는 그의 내에 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 세포의 원하는 수 또는 세포가 투여되는 개체의 체중의 단위 당 세포의 원하는 수, 예컨대, cells/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 최소 세포 수 또는 체중의 단위 당 세포의 최소 수이거나 그 이상이다. 일부 측면에서, 원하는 용량으로 투여된 총 세포 중에서, 개별 집단 또는 서브-타입은 원하는 출력 비(예컨대, CD4+ 대 CD8+ 비), 예컨대, 그러한 비의 특정 허용된 차이 또는 오차 범위 내에 있거나 그 근처이다.
일부 구현예에서, 세포는 CD4+ T 세포의 원하는 용량 및/또는 CD8+ T 세포의 원하는 용량과 같은, 세포의 하나 이상의 개별 집단 또는 서브-타입의 원하는 용량의 허용된 차이에서 또는 그 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 서브-타입 또는 집단의 세포의 원하는 수, 또는 세포가 투여되는 개체의 체중의 단위당 그러한 세포의 원하는 수, 예컨대, cells/kg이다. 일부 측면에서, 원하는 용량은 집단 또는 서브-타입의 세포의 최소 수 또는 체중의 단위 당 집단 또는 서브-타입의 세포의 최소 수이거나 그 이상이다.
따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 총 세포의 원하는 고정된 용량 및 원하는 비에 기반하고, 및/또는 하나 이상, 예컨대, 개별 서브-타입 또는 서브-집단 각각의 원하는 고정된 용량에 기반한다. 따라서, 일부 구현예에서, 투여량은 T 세포의 원하는 고정된 또는 최소 투여 및 CD4+ 대 CD8+ T 세포의 원하는 비에 기반하고, 및/또는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 원하는 고정된 또는 최소 투여에 기반한다.
일부 구현예에서, 세포는 다수의 세포 집단 또는 서브-타입, 예컨대, CD4+ 및 CD8+ T 세포 또는 서브-타입의 원하는 출력 비의 허용 범위 내에서 또는 그 범위 내에서 투여된다. 일부 측면에서, 원하는 비는 특정 비일 수 있거나 비의 범위일 수 있다. 예컨대, 일부 구현예에서, 원하는 비(예컨대, CD4+ 대 CD8+ T 세포의 비)는 5:1 또는 약 5:1 또는 5:1 또는 약 5:1 사이(또는 약 1:5 초과 및 약 5:1 미만)이고, 또는 1:3 또는 약 1:3 또는 3:1 또는 약 3:1 사이(또는 약 1:3 초과 및 약 3:1 미만), 예컨대, 2:1 또는 약 2:1 또는 1:5 또는 약 1:5 사이(또는 약 1:5 초과 및 약 2:1 미만), 예컨대, 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5, 또는 약 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5이다. 일부 측면에서, 허용되는 차이는 원하는 비의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50% 이내이고, 이들 범위 사이의 임의의 값을 포함한다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 원하는 비로 조합되고 단일 세포 조성물로서 개체에 투여된다. 특정 구현예에서, 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 원하는 비로 별도의 조성물로서 투여된다.
특정 구현예에서, 세포의 수 및/또는 농도는 재조합 수용체(예컨대, CAR)-발현 세포의 수를 가리킨다. 다른 구현예에서, 세포의 수 및/또는 농도는 투여되는 모든 세포, T 세포 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 수 또는 농도를 가리킨다.
일부 측면에서, 용량의 크기는 이전 치료, 예컨대, 화학요법에 대한 개체의 반응, 종양 부하, 벌크, 크기, 또는 정도, 범위, 또는 전이의 타입, 단계와 같은 개체에서 질환 부담, 및/또는 독성 결과를 발생시키는 개체의 가능성 또는 발생률, 예컨대, CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응과 같은, 하나 이상의 기준에 기반하여 결정된다.
일부 구현예에서, 또한, 방법은 키메릭 항원 수용체(CAR) 및/또는 림프구 마비 치료를 발현하는 하나 이상의 추가 용량의 세포를 투여하는 단계를 포함하고 /하거나 상기 방법의 하나 이상의 단계가 반복된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량은 초기 용량과 동일하다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 용량은 초기 용량과 상이하며, 예컨대, 초기 용량에 비해 2 배, 3 배, 4배, 5배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 10 배 이상 보다 높은 것과 같이, 보다 높거나, 예컨대, 초기 용량에 비해, 2 배, 3 배, 4배, 5배, 6 배, 7 배, 8 배, 9 배 또는 10 배 이하 보다 낮은 것과 같이, 보다 낮다. 일부 실시 양태에서, 하나 이상의 추가 용량의 투여는 초기 치료 또는 임의이 이전 치료에 대한 개체의 반응, 종양 부하, 벌크, 크기, 또는 정도, 범위, 또는 전이의 타입, 단계와 같은 개체에서 질환 부담, 및/또는 독성 결과를 발생시키는 개체의 가능성 또는 발생률, 예컨대, CRS, 대식세포 활성화 증후군, 종양 용해 증후군, 신경독성 및/또는 투여되는 세포 및/또는 재조합 수용체에 대한 숙주 면역 반응에 기반하여 결정된다.
Ⅵ. 제조의 물품
또한, 섹션 I(예컨대, 세포의 출력 조성물)에서와 같은, 본원에 서술된 방법과 같은, 본원에서 제공된 방법, 및 섹션 Ⅲ에서와 같은, 본원에 서술된 방법에 의한 것과 같은, 사용을 위한 선택적인 지시(예컨대, 개체에 조작된 세포를 투여하기 위한 지시)에 의해 생성된 재조합 수용체를 발현하는 조작된 세포를 함유하는 제조의 물품 및 키트가 제공된다.
일부 구현예에서, 제공된 본원은 임의의 본원에 서술된 조작된 세포의 치료적인 유효량을 포함하는 조성물, 및 질환 또는 상태를 치료하기 위해 개체에 투여하기 위한 지시를 포함하는 제조의 물품 및/또는 키트이다. 일부 구현예에서, 지시는 본원에서 제공된 세포를 투여하기 위한 방법의 일부 또는 모든 요소를 *?*특정할 수 있다. 일부 구현예에서, 지시는 세포 치료를 위한 세포의 투여를 위한 특정 지시(예컨대, 투여를 위한 용량, 시기, 선택 및/또는 개체의 식별 및 투여를 위한 조건)을 특정한다. 일부 구현예에서, 제조의 물품 및/또는 키트는 림프구 마비 치료제를 추가로 포함하고, 림프구 마비 치료를 투여하기 위한 지시를 선택적으로 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 지시는 투여를 위한 조성물을 수반하는 라벨 또는 패키지 삽입물로서 포함될 수 있다.
일부 구현예에서, 제조의 물품은 재조합 수용체를 발현하는 농축된 CD4+ T 세포의 조성물을 함유하는 용기, 선택적으로 바이알을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 제조의 물품 또는 키트는 재조합 수용체를 발현하는 농축된 CD8+ T 세포의 조성물을 함유하는 제2 용기, 선택적으로 제2 바이알을 선택적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 동결방지제는 세포와 함께 포함된다. 일부 측면에서, 용기는 바이알 또는 백이다. 일부 구현예에서, 용기는 농축된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 조성물을 함유한다.
일부 구현예에서, 용기 내 농축된 CD4+ T 세포의 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100% CD4+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 용기의 조성물은 재조합 수용체를 발현하고 및/또는 재조합 폴리뉴클레오타이드로 형질도입되거나 형질감염된 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100% CD4+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 용기 내 농축된 CD4+ T 세포의 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만 CD8+ T 세포를 포함하고, 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하지 않고, 및/또는 CD8+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 용기 내 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100% CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 용기의 조성물은 재조합 수용체를 발현하고 및/또는 재조합 폴리뉴클레오타이드로 형질도입되거나 형질감염된 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.5%, 적어도 99.9%, 또는 100% 또는 약 100% CD8+ T 세포를 포함한다. 특정 구현예에서, 개체에 투여되는 농축된 CD8+ T 세포의 출력 조성물은 40% 미만, 35% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.1% 미만, 또는 0.01% 미만 CD4+ T 세포를 포함하고, 및/또는 CD4+ T 세포를 포함하지 않고, 및/또는 CD4+ T 세포가 없거나 실질적으로 없다.
일부 구현예에서, 지시는 투여되기 위한 세포의 용량을 특정한다. 예컨대, 지시에서 특정된 용량은 그러한 세포의 약 1 x 106 내지 3 x 108(예컨대, 총 그러한 세포의 1 x 107, 5 x 107, 1 x 108 또는1.5 x 108와 같은), 또는 2개 앞선 값 중 임의의 사이 범위의 총 재조합 수용체(예컨대, CAR)-발현 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 다중 용량으로 투여되고, 각각의 용량 또는 총 용량은 임의의 값 내에 있을 수 있다.
일부 구현예에서, 바이알과 같은 용기는 10 x 106 또는 10 x 106 초과의 T 세포 또는 재조합 수용체-발현 T 세포, 15 x 106또는 약 15 x 106 초과의 T 세포 또는 재조합 수용체-발현 T 세포, 25 x 106또는 약 25 x 106 초과의 T 세포 또는 재조합 수용체-발현 T 세포를 포함한다. 일부 측면에서, 바이알은 ml 당 약 1000 만 세포 내지 ml 당 약 7 000만 세포, ml 당 약 1000 만 세포 내지 ml 당 약 5000만 세포, ml 당 약 1000 만 세포 내지 약 2500만 세포, ml 당 약 1000 만 세포 내지 약 1500만 세포, ml 당 약 1500 만 세포 내지 약 7000만 세포, ml 당 약 1500 만 세포 내지 약 5000만 세포, ml 당 약 1500 만 세포 내지 약 2500만 세포, ml 당 약 2500 만 세포 내지 약 7000만 세포, ml 당 약 2500 만 세포 내지 약 5000만 세포, 및 ml 당 약 5000 만 세포 내지 약 7000만 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 투여용으로 특정된 복수의 바이알 또는 복수의 세포 또는 단위 용량의 세포는 각각 포함하여, 1 x 105 내지 5 x 108 또는 약 1 x 105 내지 5 x 108 의 총 재조합 수용체-발현 T 세포 또는 총 T 세포, 1 x 105 내지 1 x 108 또는 약 1 x 105 내지 1 x 108 의 총 재조합 수용체-발현 T 세포 또는 총 T 세포, 5 x 105 내지 1 x 107 또는 약 5 x 105 내지 1 x 107 의 총 재조합 수용체-발현 T 세포 또는 총 T 세포, 또는 1 x 106 내지 1 x 107 또는 약 1 x 106 내지 1 x 107 의 총 재조합 수용체-발현 T 세포 또는 총 T 세포를 포함하는 세포의 용량을 공통적으로 포함한다.
일부 측면에서, 물품은 CD4+ 및 CD8+ T 세포 또는 CD4+수용체+ T 세포 및 CD8+수용체+ T 세포의 하나 이상의 단위 용량을 포함하고, 상기 단위 용량은 1 x 107 내지 2 x 108 또는 약 1 x 107 내지 2 x 108 재조합 수용체-발현 T 세포, 5 x 107 내지 1.5 x 108 또는 약 5 x 107 내지 1.5 x 108 재조합 수용체-발현 T 세포, 5 x 107 또는 약 5 x 107 재조합 수용체-발현 T 세포, 1 x 108 또는 약 1 x 108 재조합 수용체-발현 T 세포, 또는 1.5 x 108 또는 약 1.5 x 108 재조합 수용체-발현 T 세포를 포함하고, 선택적으로, 상기 물품 내 정보는 하나 또는 복수의 단위 용량 및/또는 하나 또는 복수의 단위 용량에 대응하는 부피의 투여를 특정한다. 일부 구현예에서, 물품은 CD8+ T 세포의 하나 이상의 단위 용량을 포함하고, 상기 용량은 5 x 106 및 1 x 108 또는 약 5 x 106 및 1 x 108 재조합 수용체-발현 CD8+ 세포를 포함하고, 용량은 1 x 107 및 0.75 x 108 또는 약1 x 107 및 0.75 x 108 재조합 수용체-발현 CD8+ 세포를 포함하고, 용량은 2.5 x 107 또는 약 2.5 x 107 재조합 수용체-발현 CD8+ 세포를 포함하고, 또는 용량은 5 x 107 또는 약 5 x 107 재조합 수용체-발현 CD8+ 세포를 포함하고, 또는 용량은0.75 x 108 또는 약 0.75 x 108 재조합 수용체-발현 CD8+ 세포를 포함하고, 선택적으로, 상기 물품 내 정보는 하나 또는 복수의 단위 용량 및/또는 하나 또는 복수의 단위 용량에 대응하는 부피의 투여를 특정한다. 일부 구현예에서, 물품 내 세포는 1 x 108 이하 총 재조합 수용체-발현 T 세포 또는 총 T 세포, 1 x 107 이하 총 재조합 수용체-발현 T 세포 또는 총 T 세포, 0.5 x 107 이하 총 재조합 수용체-발현 T 세포 또는 총 T 세포, 1 x 106 이하 총 재조합 수용체-발현 T 세포 또는 총 T 세포, 0.5 x 106 이하 총 재조합 수용체-발현 T 세포 또는 총 T 세포를 포함하는 세포의 용량을 공통적으로 포함한다.
일부 구현예에서, 지시는 용량 요법 및 투여의 시기를 특정할 수 있다. 예컨대, 일부 구현예에서, 지기는 개체에게 세포의 다중 용량, 예컨대, 2 회 이상의 용량을 투여하는 것을 특정할 수있다. 일부 구현예에서, 지시는 다중 용량의 시기, 예컨대, 제1 용량 후 대략 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 21 일 후 투여되는 제2 용량; 및/또는 각 용량의 투여량을 특정한다.
일부 구현예에서, 제조 물품 또는 키트는 재조합 수용체를 발현하는 농축된 CD4+ T 세포의 조성물, 및 질환 또는 상태를 가지는 개체에게 농축된 CD4+ T 세포의 조성물의 전부 또는 일부를 투여하고, 재조합 수용체를 발현하는 CD8+ T 세포를 추가로 투여하기 위한 지시를 포함한다. 일부 구현예에서, 지시는 CD8+ T 세포를 투여하기 전에 CD4+ T 세포를 투여하는 것을 특정한다. 일부 경우에, 지시는 CD4+ T 세포를 투여하기 전에 CD8+ T 세포를 투여하는 것을 특정한다. 일부 실시 양태에서, 제조 물품 또는 키트는 재조합 수용체를 발현하는 복수의 CD8+ T 세포, 및 질환 또는 상태를 가지는 개체에게 재조합 수용체를 발현하는 복수의 CD8+ T 세포 및 CD4+ T세포의 전부 또는 일부를 투여하기 위한 지시를 포함한다. 일부 구현예에서, 지시는 세포의 용량 요법 및 투여의 시기를 특정한다.
일부 측면에서, 지시는 CD4+ T 세포의 전부 또는 일부 및 CD8+ T 세포의 전부 또는 일부를 0 내지 12 시간 간격으로, 0 내지 6 시간 간격으로 또는 0 내지 2 시간 간격으로 투여하는 것을 특정한다. 일부 경우에, 지시는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포를 2 시간 이하, 1 시간 이하, 30 분 이하, 15 분 이하, 15 분 이하, 10 분 이하 또는 이하 5 분 이하 간격으로 투여하는 것을 특정한다.
일부 구현예에서, 지시는 세포 또는 세포 타입(들)의 용량 또는 수 및/또는 CD4+ 대 CD8+ 비와 같은 세포 타입, 예컨대, 개별 집단 또는 서브-타입의 비를 특정한다. 일부 구현예에서, CD8+ 및 CD4+ T 세포와 같은, 세포의 집단 또는 서브-타입이다. 예컨대, 일부 구현예에서, 지시는 세포가 5:1 내지 5:1 또는 약 5:1 내지 5:1(또는 약 1:5 초과 및 5:1 미만), 또는 1:3 내지 3:1 또는 약 1:3 내지 3:1(또는 약 1:3 초과 및 3:1 미만), 예컨대, 2:1 내지 1:5 또는 약 2:1 내지 1:5(또는 약 1:5 초과 및 약 2:1 미만), 예컨대, 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5 또는 약 5:1, 4.5:1, 4:1, 3.5:1, 3:1, 2.5:1, 2:1, 1.9:1, 1.8:1, 1.7:1, 1.6:1, 1.5:1, 1.4:1, 1.3:1, 1.2:1, 1.1:1, 1:1, 1:1.1, 1:1.2, 1:1.3, 1:1.4, 1:1.5, 1:1.6, 1:1.7, 1:1.8, 1:1.9: 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 또는 1:5 의 CD4+ 및 CD8+ T 세포 또는 서브-타입과 같은, 다중 세포 집단 또는 서브-타입의 출력 비의 허용된 범위에서 또는 내에서 투여됨을 특정한다. 특정 구현예에서, 지시는 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 조성물이 원하는 비로 조합되고 단일 세포 조성물로서 개체에게 투여됨을 특정한다. 특정 구현예에서, 설명서는 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 조성물이 원하는 비로 별도의 조성물로서 투여됨을 특정한다. 일부 측면에서, 허용되는 차이는 이들 범위 사이의 임의의 값을 포함하여 원하는 비율의 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50% 이내이다.
Ⅶ. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술의 용어, 표기법 및 다른 기술 및 과학 용어 또는 전문용어는 청구된 주제가 속하는 기술 분야에서 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지는 것으로 의도된다. 일부 경우에, 공통적으로 이해되는 의미를 가진 용어는 명확성 및/또는 준비된 참조를 위해 본원에서 정의되며, 본원에서 그러한 정의의 포함은 기술 분야에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적으로 차이가 있는 것으로 반드시 해석되는 것은 아니다.
용어 "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 가르키기 위해 상호교환적으로 사용되며, 최소 길이로 한정되지 않는다. 제공된 수용체 및 다른 폴리펩타이드, 예컨대, 링커 또는 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드는 천연 및/또는 비-천연 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 또한, 용어는 폴리펩타이드의 발현 후 변형, 예컨대, 글리코실화, 시알 릴화, 아세틸화 및 인산화를 포함한다. 일부 측면에서, 폴리펩타이드는 단백질이 원하는 활성을 유지하는 한, 네이티브 또는 천연 서열에 대한 변형을 함유할 수 있다. 이들 변형은 부위-지정 돌연변이 유발을 통해 고의적일 수 있거나, 단백질을 생성하는 숙주의 돌연변이 또는 PCR 증폭으로 인한 오차를 통해 우발적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, "개체"는 인간 또는 다른 동물과 같은, 포유 동물이고, 전형적으로 인간이다. 일부 구현예에서, 작용제 또는 작용제들, 세포, 세포 집단, 또는 조성물이 투여되는 개체, 예컨대, 환자는 포유 동물, 전형적으로 인간과 같은, 영장류이다. 일부 구현예에서, 영장류는 원숭이 또는 유인원이다. 개체는 남성 또는 여성일 수 있고, 유아, 소아, 청소년, 성인 및 노인 개체를 포함한 임의의 적합한 연령일 수 있다. 일부 구현예에서, 개체는 설치류와 같은, 비-원시 포유 동물이다.
본원에 사용된 바와 같은, "치료"(및 "치료하다" 또는 "치료하는"과 같은, 그의 문법적 변형)는 질환 또는 상태 또는 장애의 완전한 또는 부분적 개선 또는 감소, 또는 증상, 효과 또는 결과의 부작용, 또는 관련된 표현형을 가리킨다. 치료의 바람직한 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질환의 임의의 직접 또는 간접 병리학적 결과의 감소, 전이 예방, 질병 진행률 감소, 질환 상태의 개선 또는 일시적 완화, 및 차도 및 개선된 예후를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 용어는 질환의 완전한 치료 또는 모든 증상이나 결과에 대한 임의의 증상 또는 효과(들)의 완전한 제거를 의미하지 않는다.
본원에 사용된 "질환의 발달 지연"은 질환(암과 같은)의 발달을 지연, 방해, 지연, 지연, 안정화, 억제 및/또는 연기하는 것을 의미한다. 이러한 지연은 질병의 이력 및/또는 치료되는 개체에 따라 다양한 시간이 될 수 있다. 일부 구현예에서, 개체가 질환을 발병하지 않는다는 점에서 충분하거나 유의미한 지연은 사실상 예방을 포함할 수 있다. 예컨대, 전이의 발달과 같은 말기 암은 지연될 수 있다.
본원에 사용된 "예방"은 질환에 걸리기 쉽지만 아직 질환으로 진단되지 않은 개체에서 질환의 발생 또는 재발에 대한 예방을 제공하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 세포 및 조성물은 질환의 발달을 지연시키거나 질환의 진행을 늦추기 위해 사용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 기능 또는 활성을 "억제"하는 것은 관심있는 조건 또는 파라미터를 제외하고 동일한 조건과 비교되거나, 또는 대안적으로, 다른 조건과 비교될 때, 기능 또는 활성을 감소시키는 것이다. 예컨대, 종양 성장을 억제하는 세포는 세포의 부재시 종양의 성장 속도와 비교하여 종양의 성장 속도를 감소시킨다.
투여의 경우, 작용제, 예컨대, 약학적 제형, 세포 또는 조성물의 "유효량"은 치료 또는 예방 결과와 같은 원하는 결과를 달성하기 위해, 용량/양 및 필요 기간 동안, 효과적인 양을 가리킨다.
작용제, 예컨대, 약학적 제형 또는 세포의 "치료 유효량"은 질환, 상태, 또는 장애와 같은 치료를 위한 것과 같은, 원하는 치료 결과, 및/또는 치료의 약동학적 또는 약력학적 효과를 달성하기 위해, 용량 및 필요 기간 동안, 효과적인 양을 의미한다. 치료 유효량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별, 및 체중, 및 투여된 세포의 집단과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 방법은 세포 및/또는 조성물을 유효량, 예컨대, 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함한다.
"예방 유효량"은 원하는 예방 결과를 달성하기 위해 투여량 및 필요한 시간 동안 효과적인 양을 가리킨다. 전형적으로, 반드시는 아니지만, 예방 용량이 질환의 이전 또는 초기 단계의 개체에서 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 것이다. 낮은 종양 부담과 관련하여, 일부 측면에서 예방 유효량은 치료 유효량보다 더 높을 것이다.
본원에 사용된 용어 "약"은 이 기술 분야의 당업자에게 쉽게 알려진 각각의 값에 대한 일반적인 오차 범위를 가리킨다. 본원에서 "약"의 값 또는 파라미터에 대한 언급은 그 값 또는 파라미터 자체에 관한 실시 형태를 포함하고 설명한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥 상 명백하게 다르게 지시되지 않는 한 복수의 지시 대상을 포함한다. 예컨대, 단수 형태는 "적어도 하나"또는 "하나 이상"을 의미한다.
본 개시 전반에 걸쳐, 청구된 주제의 다양한 측면은 범위 포맷으로 제시된다. 범위 포맷의 설명은 단지 편의 및 간결성을 위한 것이며 청구된 주제의 범위에 대한 융통성있는 한정으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 설명은 모든 가능한 서브-범위 및 그 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예컨대, 값의 범위가 제공되는 경우, 그 범위의 상한 및 하한과 언급된 범위의 임의의 다른 언급되거나 개재된 값 사이의 각각의 개재 값은 청구된 주제 내에 포함되는 것으로 이해된다. 이들 보다 작은 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 보다 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 언급된 범위에서 임의의 구체적으로 배제된 한계에 따라 청구된 주제 내에 포함된다. 언급된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계 중 하나 또는 둘 다를 제외한 범위가 또한 청구된 주제에 포함된다. 이는 범위의 폭에 관계 없이 적용된다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 세포를 포함하여, 둘 이상의 생성물, 물질 또는 화합물의 임의의 혼합물을 가르킨다. 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비-수성 또는 그들의 임의의 조합일 수있다.
본원에 사용된 바와 같이, 하나 이상의 특정 세포 타입 또는 세포 집단을 언급할 때, "농축"은, 집단 또는 세포에 의해 발현된 마커에 기반한 양성 선택에 의한, 또는 결핍될 세포 집단 또는 세포 상에 존재하지 않는 마커에 기반한 음성 선택에 의한 것과 같은, 예컨대, 조성물 내 총 세포의 수 또는 부피와 비교하여 또는 다른 세포 타입에 대하여, 세포 타입 또는 집단의 수 또는 퍼센트를 증가시키는 것을 가리킨다. 용어는 조성물로부터 다른 세포, 세포 타입, 또는 집단의 완전한 제거를 요구하지 않으며, 그렇게 농축된 세포가 농축된 조성물에서 100% 또는 심지어 100 % 근처에 존재할 것을 요구하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "양성"이라는 진술은 특정 마커, 전형적으로, 표면 마커의 세포 상에서 또는 세포 내에 실질적으로 검출가능한 존재를 가리킨다. 표면 마커를 언급할 때, 용어는 예컨대, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써, 유세포 분석에 의해 검출된 바와 같은 표면 발현의 존재를 가리키며, 상기 염색은 달리 동일한 조건 하에 이소타입-매칭 대조군 또는 형광-마이너스 원(FMO) 게이팅 대조군으로 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 높은 수준에서, 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 공지된 세포에 비해 실질적으로 유사한 수준에서, 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 비해 실질적으로 높은 수준에서 유세포 분석에 의해 검출가능하다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 또는 세포 집단이 특정 마커에 대해 "음성"이라는 진술은 특정 마커, 전형적으로, 표면 마커의 세포 상에서 또는 세포 내에 실질적으로 검출가능한 존재의 부재를 가리킨다. 표면 마커를 언급할 때, 용어는 예컨대, 마커에 특이적으로 결합하는 항체로 염색하고 상기 항체를 검출함으로써, 유세포 분석에 의해 검출된 바와 같은 표면 발현의 부재를 가리키며, 상기 염색은 달리 동일한 조건 하에 이소타입-매칭 대조군 또는 형광-마이너스 원(FMO) 게이팅 대조군으로 동일한 절차를 수행하여 검출된 염색보다 실질적으로 높은 수준에서, 및/또는 마커에 대해 양성인 것으로 공지된 세포에 비해 실질적으로 낮은 수준에서, 및/또는 마커에 대해 음성인 것으로 알려진 세포에 비해 실질적으로 유사한 수준에서 유세포 분석에 의해 검출되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "벡터"는 그것이 연결된 다른 핵산을 전파할 수 있는 핵산 분자를 가리킨다. 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 및 그것이 도입된 숙주 세포의 게놈에 포함된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그들이 작동 가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 그러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
Ⅷ. 예시적인 구현예
제공된 구현예 중에서:
1. mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에, 재조합 수용체로 조작된 세포를 포함하는 1차 인간 T 세포를 포함하는 조작된 세포 조성물을 배양하는 단계를 포함하고, 상기 조성물에서 세포는 배양되기 전에 상기 작용제에 노출되지 않았으며; 상기 방법은 상기 조성물에서 세포의 증식 또는 팽창을 야기하여 조작된 T 세포를 포함하는 출력 조성물을 생산하는, 조작된 세포의 조성물의 생산방법.
2. 제 1 구현예에 있어서, 상기 1차 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포인, 방법.
3. 제1 또는 제2 구현예에 있어서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는, 방법.
4. 제1 또는 제2 구현예에 있어서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 농축된 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
5. mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에, 재조합 수용체로 조작된 T 세포를 포함하는 농축된 CD4+ 또는 농축된 CD8+ 1차 인간 T 세포를 포함하는 조작된 세포 조성물을 배양하는 단계를 포함하고; 상기 방법은 상기 조성물에서 세포의 증식 또는 팽창을 야기하여 조작된 농축된 CD4+ 또는 농축된 CD8+ T 세포를 포함하는 출력 조성물을 생산하는, 조작된 세포의 조성물의 생산방법.
6. 제2, 제3, 또는 제5 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 70% 초과 또는 약 70% 초과, 75% 초과 또는 약 75% 초과, 80% 초과 또는 약 80% 초과, 85% 초과 또는 약 85% 초과, 90% 초과 또는 약 90% 초과, 95 % 초과 또는 약 95 % 초과 또는 98 % 초과 또는 약 98 % 초과의 CD4+ 1차 인간 T 세포를 포함하고; 및/또는 상기 입력 조성물은 본질적으로 CD4+ 1차 인간 T 세포로 구성되는, 방법.
7. 제2, 제4, 또는 제5 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 70% 초과 또는 약 70% 초과, 75% 초과 또는 약 75% 초과, 80% 초과 또는 약 80% 초과, 85% 초과 또는 약 85% 초과, 90% 초과 또는 약 90% 초과, 95 % 초과 또는 약 95 % 초과 또는 98 % 초과 또는 약 98 % 초과의 CD8+ 1차 인간 T 세포를 포함하고; 및/또는 상기 입력 조성물은 본질적으로 CD8+ 1차 인간 T 세포로 구성되는, 방법.
8. 제2 내지 제5 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 70% 초과 또는 약 70% 초과, 75% 초과 또는 약 75% 초과, 80% 초과 또는 약 80% 초과, 85% 초과 또는 약 85% 초과, 90% 초과 또는 약 90% 초과, 95 % 초과 또는 약 95 % 초과 또는 98 % 초과 또는 약 98 % 초과의 CD4+ 및 CD8+ 1차 인간 T 세포를 포함하고; 및/또는 상기 입력 조성물은 본질적으로 CD4+ 및 CD8+ 1차 인간 T 세포로 구성되는, 방법.
9. 제1 내지 제8 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양은 하나 이상의 사이토카인의 존재 하에 수행되고, 선택적으로, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-12, IL-15, G-CSF, 및 GM-CSF의 하나 이상을 포함하고, 선택적으로, 상기 하나 이상의 사이토카인은 IL-2, IL-7 또는 IL-15를 포함하는, 방법.
10. 제9 구현예에 있어서, 상기 하나 이상의 사이토카인은 재조합 사이토카인인, 방법.
11. 제1 내지 제10 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 전에, (a) 자극 조건 하에, 1차 T 세포를 포함하는 입력 조성물을 인큐베이션하고, 상기 자극 조건은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극제의 존재를 포함하여 자극된 조성물을 생성하는 단계; 및 (b) 재조합 수용체를 상기 자극된 조성물 내로 도입하여 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
12. 제11 구현예에 있어서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 1차 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
13. 제11 또는 제12 구현예에 있어서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는, 방법.
14. 제11 또는 제12 구현예에 있어서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 농축된 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
15. (a) 자극 조건 하에, CD4+ 또는 CD8+ 1차 인간 T 세포를 위해 농축된 T 세포를 포함하는 입력 조성물을 인큐베이션하고, 상기 자극 조건은 (i) TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극제 및 (ⅱ) mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재를 포함하는 단계; 및 (b) 재조합 수용체를 상기 자극된 조성물 내로 도입하여 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물을 생성하는 단계를 포함하는, 조작된 세포의 조성물의 생산방법.
16. 제12, 제13, 및 제15 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 70% 초과 또는 약 70% 초과, 75% 초과 또는 약 75% 초과, 80% 초과 또는 약 80% 초과, 85% 초과 또는 약 85% 초과, 90% 초과 또는 약 90% 초과, 95 % 초과 또는 약 95 % 초과 또는 98 % 초과 또는 약 98 % 초과의 CD4+ 1차 인간 T 세포를 포함하고; 및/또는 상기 입력 조성물은 본질적으로 CD4+ 1차 인간 T 세포로 구성되는, 방법.
17. 제12, 제14, 또는 제15 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 70% 초과 또는 약 70% 초과, 75% 초과 또는 약 75% 초과, 80% 초과 또는 약 80% 초과, 85% 초과 또는 약 85% 초과, 90% 초과 또는 약 90% 초과, 95 % 초과 또는 약 95 % 초과 또는 98 % 초과 또는 약 98 % 초과의 CD8+ 1차 인간 T 세포를 포함하고; 및/또는 상기 입력 조성물은 본질적으로 CD8+ 1차 인간 T 세포로 구성되는, 방법.
18. 제12 내지 제15 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 70% 초과 또는 약 70% 초과, 75% 초과 또는 약 75% 초과, 80% 초과 또는 약 80% 초과, 85% 초과 또는 약 85% 초과, 90% 초과 또는 약 90% 초과, 95 % 초과 또는 약 95 % 초과 또는 98 % 초과 또는 약 98 % 초과의 CD4+ 및 CD8+ 1차 인간 T 세포를 포함하고; 및/또는 상기 입력 조성물은 본질적으로 CD4+ 및 CD8+ 1차 인간 T 세포로 구성되는, 방법.
19. 제1 내지 제18 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 작은 분자, 작은 유기 분자, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 또는 폴리펩타이드이고, 선택적으로, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 작은 유기 분자인, 방법.
20. 제1 내지 제19 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 및/또는 mTORC2 키나아제 활성을 억제하는, 방법.
21. 제1 내지 제19 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 적어도 하나의 추가 키나아제의 활성을 억제하고, 선택적으로, 상기 적어도 하나의 추가 키나아제는 PI3K인, 방법.
22. 제19 내지 제21 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 BEZ235, BGT226, GDC0980, NVP-BEZ235, PF-04691502, PI-103, SAR245409, SF1126, VS5584, 또는 XL765인, 방법.
23. 제1 내지 제19 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는: (i) PI3K 활성을 억제하지 않고; (ⅱ) mTOR 활성을 위한 IC50에서 PI3K 활성을 검출가능하게 억제하지 않으며; 및/또는 (ⅲ) mTOR 활성을 검출가능하게 억제하는 모든 농도에서 PI3K를 검출가능하게 억제하지 않는, 방법.
24. 제1 내지 제19 또는 제23 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 및/또는 mTORC2 키나아제 활성을 억제하는, 방법.
25. 제1 내지 제19, 제23, 또는 제24 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 피라졸로피리미딘(pyrazolopyrimidine), 토린 l(Torin l), 토르키닙(Torkinib), PP30, Ku-0063794, WAY-600(Wyeth), WAY-687(Wyeth), WAY-354 (Wyeth), OSI-027, DS3078a 또는 AZD8055인, 방법.
26. 제1 내지 제19 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 활성을 선택적으로 억제하는, 방법.
27. 제26 구현예에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는: (i) mTORC2 활성을 억제하지 않고; (ⅱ) mTORC1 활성을 위한 IC50에서 mTORC2 활성을 검출가능하게 억제하지 않으며; 및/또는 (ⅲ) mTORC1 활성을 검출가능하게 억제하는 모든 농도에서 mTORC2를 검출가능하게 억제하지 않는, 방법.
28. 제26 또는 제27 구현예에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 라파마이신(rapamycin), 템시로리무스(temsirolimus), 에베로리무스(everolimus), 데포로리무스(deforolimus), 또는 AZD8055인, 방법.
29. 제1 내지 제19, 제23, 또는 제24 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 작용제는 하기 화학식 1로 표시되는 화학식을 포함하는, 방법:
[화학식 1]
Figure pct00018
상기 R1은 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이고, R2는 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이며, R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 C1-8 알킬이다.
30. 제29 구현예에 있어서, 상기 R1은 치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 예컨대, 치환된 페닐인, 방법.
31. 제29 또는 제30 구현예에 있어서, 상기 R2는 치환된 또는 비치환된 아릴, 및/또는 치환된 또는 비치환된 페닐인, 방법.
32. 제29 내지 제31 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 치환된 기는 하나 이상의 할로겐; C1-8 알킬; C2-8 알케닐; C2-8 알키닐; 하이드록시; C1-8 알콕시; 아미노; 나이트로; 티올; 티오에테르; 이민; 사이아노; 아마이도; 포스포나토; 포스핀; 카르복시; 티오카르보닐; 설포닐; 설폰아마이드; 케톤; 알데하이드; 에스테르; 카르보닐; 할로알킬; B(OH)2; 카르보사이클릭 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 모노사이클릭 또는 융합된 또는 비-융합된 폴리사이클릭 아릴 또는 헤테로아릴; 아미노; O-저급 알킬; O-아릴, 아릴; 아릴-저급 알킬; CO2CH3; CONH2; OCH2CONH2; NH2; SO2NH2; OCHF2; CF3; 또는 OCF3 기로 치환된, 방법.
33. 제1 내지 제19, 제23, 제24, 또는 제29 내지 제32 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 63인, 방법,
34. 제1 내지 제19, 제23, 또는 제24 구현예 중 어느 하나 에 있어서, 상기 작용제는 하기 화학식 2로 표시되는 화학식을 포함하는, 방법:
[화학식 2]
Figure pct00019
상기 L는 직접 결합, NH 또는 O이고, Y는 N 또는 CR3이고, 상기 R1은 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 C2-8 알케닐, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이고, R2는 H, 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이고, R3는 H, 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, -NHR4　또는 -N(R4)2이며, R4는 각각의 경우 독립적으로 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이다.
35. 제34 구현예에 있어서, 상기 R1은 치환된 아릴, 및/또는 치환된 페닐인, 방법.
36. 제34 또는 제35 구현예에 있어서, 상기 Y는 CH인, 방법.
37. 제34 내지 제36 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 L은 직접 결합인, 방법.
38. 제34 내지 제37 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 R1은 치환된 아릴이고, R2는 알콕시, 아미노, 하이드록시, 사이클로알킬, 또는 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 C1-8 알킬인, 방법.
39. 제38 구현예에 있어서, 상기 R2는 헤테로사이클로알킬로 치환된 C1-8 알킬인, 방법.
40. 제1 내지 제19, 제23, 제24, 또는 제34 내지 제39 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 155인, 방법.
41. 제1 내지 제19, 제23, 또는 제24 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 작용제는 하기 화학식 3으로 표시되는 화학식을 포함하는, 방법:
[화학식 3]
Figure pct00020
상기 R1은 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이고, R2는 H, 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭알킬, 치환된 또는 비치환된 아랄킬, 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬알킬이며, R3는 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬이다.
42. 제41 구현예에 있어서, 상기 R1은 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴인, 방법.
43. 제41 또는 제42 구현예에 있어서, 상기 R1은 치환된 피리딜인, 방법.
44. 제41 내지 제43 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 R1은 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 할로겐, 아미노카르보닐, 사이아노, 하이드록시알킬, -OR 및 -NR2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 피리딜이고, 상기 각각의 R은 독립적으로 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-4 알킬인, 방법. 일부 구현예에서, R1은 1H-피롤로 [2,3-b]피리딜 또는 벤즈이미다졸릴이고, 선택적으로, 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 및 -NR2로 이루어진 군으로부터 독림적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되고, 상기 R은 독립적으로 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-4 알킬이다.
45. 제41 내지 제44 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 R1은
Figure pct00021
이고,
상기 R은 각각의 경우 독립적으로 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-4 알킬(예컨대, 메틸)이고; R1은 각각의 경우 독립적으로 치환된 또는 비치환된 C1-4 알킬, 할로겐, 사이아노, -OR, 또는 -NR2이고; m은 0-3이며; n은 0-3인, 방법.
46. 제41 내지 제45 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 R2는 각각 선택적으로 치환된 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로피라닐, (C1-4 알킬)-페닐, (C1-4 알킬)-사이클로프로필, (C1-4 알킬)-사이클로부틸, (C1-4 알킬)-사이클로펜틸, (C1-4 알킬)-사이클로헥실, (C1-4 알킬)-피롤리딜, (C1-4 알킬)-피페리딜, (C1-4 알킬)-피페라지닐, (C1-4 알킬)-모르폴린일, (C1-4 알킬)-테트라하이드로퓨라닐, 또는 (C1-4 알킬)-테트라하이드로피라닐인, 방법.
47. 제41 내지 제46 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 R2는 H, C1-4 알킬, (C1-4 알킬)(OR),
Figure pct00022
이고,
상기 R은 각각의 경우 독립적으로 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬이고, R'은 각각의 경우 독립적으로 H, -OR, 사이아노, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬이며, p는 0-3인, 방법.
48. 제1 내지 제19, 제23, 제24, 또는 제41 내지 제47 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 246인, 방법.
49. mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에, 재조합 수용체로 조작된 T 세포를 포함하는 농축된 1차 인간 T 세포를 포함하는 조작된 세포 조성물을 배양하는 단계를 포함하고; 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 63, 화합물 155, 또는 화합물 246이며; 상기 방법은 상기 조성물에서 세포의 증식 또는 팽창을 야기하여 조작된 T 세포를 포함하는 출력 조성물을 생산하는, 조작된 세포의 조성물의 생산방법.
50. 제33 또는 제49 구현예에 있어서, 상기 조작된 세포 조성물은 화합물 63의 500 nM 내지 2 μM, 1 nM 내지 100 nM, 50 nM 내지 250 nM, 또는 100 nM 내지 500 nM 의 존재 하에 배양되는, 방법.
51. 제40 또는 제49 구현예에 있어서, 상기 조작된 세포 조성물은 화합물 155의 500 nM 내지 2 μM, 1 nM 내지 100 nM, 50 nM 내지 250 nM, 또는 100 nM 내지 500 nM 의 존재 하에 배양되는, 방법.
52. 제48 또는 제49 구현예에 있어서, 상기 조작된 세포 조성물은 화합물 246의 500 nM 내지 2 μM, 1 nM 내지 100 nM, 50 nM 내지 250 nM, 또는 100 nM 내지 500 nM 의 존재 하에 배양되는, 방법.
53. 제49 구현예에 있어서, 상기 배양 전에, (a) 자극 조건 하에, mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 1차 T 세포를 포함하는 입력 조성물을 인큐베이션하고; 상기 자극 조건은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극제의 존재를 포함하여 자극된 조성물을 생성하며; 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 63, 화합물 155, 또는 화합물 246인 단계; 및 (b) 재조합 수용체를 상기 자극된 조성물 내로 도입하여 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물을 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
54. (a) 자극 조건 하에, 1차 인간 T 세포를 포함하는 입력 조성물을 인큐베이션하고, 상기 자극 조건은 (i) TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극제 및 (ⅱ) mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재를 포함하고, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 63, 화합물 155, 또는 화합물 246인 단계; 및 (b) 재조합 수용체를 상기 자극된 조성물 내로 도입하여 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물을 생성하는 단계를 포함하는, 조작된 세포의 조성물의 생산방법.
55. 제53 또는 제54 구현예에 있어서, 상기 1차 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포에서 농축된 것인, 방법.
56. 제11 내지 제48, 제53, 제54 또는 제55 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 자극제는 TCR 복합체의 구성원에 특이적으로 결합하는, 선택적으로, CD3에 특이적으로 결합하는 1차 작용제; 및 선택적으로, T 세포 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 작용제를 포함하고, 선택적으로, 상기 공동자극 분자는 CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS로부터 선택되는, 방법.
57. 제55 또는 제56 구현예에 잇어서, 상기 1차 및/또는 2차 작용제는 항체를 포함하고, 선택적으로, 상기 자극제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 또는 그의 항원-결합 단편과의 인큐베이션을 포함하는, 방법.
58. 제55 내지 제57 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 1차 작용제 및/또는 2차 작용제는 고체 지지체의 표면 상에 존재하는, 방법.
59. 제58 구현예에 있어서, 상기 고체 지지체는 비드이거나 이를 포함하는, 방법.
60. 제59 구현예에 있어서, 상기 비드는 3.5 ㎛ 또는 약 3.5 ㎛ 초과하나 약 9 ㎛ 이하 또는 약 8 ㎛ 이하 또는 약 7 ㎛ 이하 또는 약 6 μm 이하 또는 약 5 μm 이하의 직경을 포함하는, 방법.
61. 제60 또는 제61 구현예에 있어서, 상기 비드는 4.5㎛ 또는 약 4.5㎛의 직경을 포함하는, 방법.
62. 제59 내지 제61 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 비드는 불활성인, 방법.
63. 제59 내지 제62 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 비드는 폴리스티렌 표면이거나 이를 포함하는, 방법.
64. 제59 내지 제63 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 비드는 자성 또는 초상자성인, 방법.
65. 제59 내지 제64 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포에 대한 비드의 비는 4:1 내지 0.25:1 또는 약 4:1 내지 0.25:1 인, 방법.
66. 제11 내지 제48 또는 제53 내지 제65 구현에 중 어느 하나에 있어서, 상기 도입은 자극된 조성물의 세포를 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입시키는 것을 포함하는, 방법.
67. 제66 구현예에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인, 방법.
68. 제66 또는 제67 구현예에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인, 방법.
69. 제11 내지 제48 또는 제53 내지 제65 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 도입은 자극된 조성물의 세포를 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질도입시키는 것을 포함하는, 방법.
70. 제69 구현예에 있어서, 상기 벡터는 전이인자(transposon), 선택적으로 슬리핑 뷰티(SB) 전이인자(transposon) 또는 피기백 전이인자(Piggybac transposon)인, 방법.
71. 제1 내지 제14, 제16 내지 제53, 또는 제55 내지 제70 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 이후, 상기 방법은 상기 출력 조성물의 세포를 수집하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
72. 제1 내지 제14, 제16 내지 제53, 또는 제55 내지 제71 구현예 중 어느 하나에 있어서, 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 부형제의 존재 하에, 냉동보존 및/또는 개체에 투여하기 위한 출력 조성물의 세포를 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
73. 제72 구현예에 있어서, 상기 출력 조성물의 세포는 동결방지제의 존재 하에 제형화되는, 방법.
74. 제73 구현예에 있어서, 상기 동결방지제는 DMSO를 포함하는, 방법.
75. 제72 내지 제74 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 출력 조성물의 세포는 용기, 선택적으로 바이알 또는 백에서 제형화되는, 방법.
76. 제11 내지 제48 또는 제53 내지 75 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 인큐베이션 전에, 생물학적 샘플로부터 상기 CD4+ 및/또는 상기 CD8+ T 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
77. 제76 구현예에 있어서, 상기 분리는 선택적으로, 양성 또는 음성 선택에 의해, CD4 및/또는 CD8의 표면 발현에 기반한 세포 선택을 포함하는, 방법.
78. 제76 또는 제77 구현예에 있어서, 상기 분리는 면역친화성-기반 선택 수행을 포함하는, 방법.
79. 제76 내지 제78 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 개체로부터 획득된 1차 T 세포를 포함하는, 방법.
80. 제76 내지 제79 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 전혈 샘플, 버피 코트 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 미분획화된 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 혈액성분채집술(apheresis) 생성물, 또는 백혈구성분채집술(leukapheresis) 생성물이거나 이를 포함하는, 방법.
81. 제1 내지 제80 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 수용체는 질환, 장애 또는 상태의 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인, 및/또는 상에 발현된 표적 항원에 결합할 수 있는, 방법.
82. 제81 구현예에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 상태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암인, 방법.
83. 제81 또는 제82 구현예에 있어서, 상기 표적 항원은 종양 항원인, 방법.
84. 제81 내지 제83 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 항원은 5T4, 8H9, avb6 인터그린, B7-H6, B 세포 성숙 항원(BCMA), CA9, 암-고환 항원, 탄산탈수효소 9(CAIX), CCL-1, CD19, CD20, CD22, CEA, B형 간염 표면 항원, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 암태아성 항원(CEA), CE7, 사이클린, 사이클린 A2, c-Met, 이중 항원, EGFR, 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40(EPG-40), EPHa2, 에프린 B2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 다이머, EGFR vIII, 에스트로겐 수용체, 태아성 AchR, 폴레이트 수용체 알파, 폴레이트 결합 단백질(FBP), FCRL5, FCRH5, 태아성 아세틸콜린 수용체, G250/CAIX, GD2, GD3, G 단백질 결합된 수용체 5D(GPRC5D), gp100, Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erbB2), HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자(L1-CAM), 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MART-1, 메소텔린, 뮤린 CMV, 뮤신 1 (MUC1), MUC16, NCAM, NKG2D, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 종양태아성 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), PSCA, 프로게스테론 수용체, 서바이빈, ROR1, TAG72, tEGFR, VEGF 수용체, VEGF-R2, 윌름스 종양1(WT-1), 병소-특이적 항원 및 유니버셜 태그로 연관된 항원으로부터 선택된, 방법.
85. 제1 내지 제84 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 그의 항원-결합 단편이거나 이를 포함하는, 방법.
86. 제1 내지 제85 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 수용체는 키메릭 항원 수용체(CAR)인, 방법.
87. 제1 내지 제86 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 수용체는 항- CD19 CAR인, 방법.
88. 제87 구현예에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 항원-결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는, 방법.
89. 제88 구현예에 있어서, 상기 항원-결합 도메인은 항체 또는 그의 항체 단편이거나 이를 포함하고, 이는 선택적으로 단일 사슬 단편인, 방법.
90. 제89 구현예에 있어서, 상기 단편은 플렉서블 링커에 의해 연결된 항체 가변 영역을 포함하는, 방법.
91. 제89 또는 제90 구현예에 있어서, 상기 단편은 scFv를 포함하는, 방법.
92. 제90 내지 제91 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 스페이서 및/또는 힌지 영역을 추가로 포함하는, 방법.
93. 제90 내지 제92 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 세포내 신호 영역을 포함하는, 방법.
94. 제93 구현예에 있어서, 상기 세포내 신호 영역은 세포내 신호 도메인을 포함하는, 방법.
95. 제94 구현예에 있어서, 상기 세포내 신호 도메인은 1차 신호 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호 도메인, 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)을 포함하는 신호 도메인이거나 이를 포함하는, 방법.
96. 제95 구현예에 있어서, 상기 세포내 신호 도메인은 CD3 사슬, 선택적으로, CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 신호 도메인 또는 그의 신호 부분이거나 이를 포함하는, 방법.
97. 제94 내지 제96 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 세포외 도메인 및 세포내 신호 영역 사이 막관통 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
98. 제94 내지 제97 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포내 신호 영역은 공동자극 신호 영역을 추가로 포함하는, 방법.
99. 제98 구현예에 있어서, 상기 공동자극 신호 영역은 T 세포 공동자극 분자의 세포내 신호 도메인 또는 그의 신호 부분을 포함하는, 방법.
100. 제98 또는 제99 구현예에 있어서, 상기 공동자극 신호 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포내 신호 도메인 또는 그의 신호 부분을 포함하는, 방법.
101. 제99 또는 제100 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 공동자극 신호 영역은 막관통 도메인 및 세포내 신호 영역 사이인, 방법.
102. 제1 내지 제14, 제16 내지 제53, 또는 제55 내지 제100 구현예 중 어느 하나에 있어서, (ⅰ) 상기 1차 T 세포는 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 별도 조성물을 포함하고, 상기 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 별도로 배양되거나; (ⅱ) 상기 1차 T 세포는 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 별도 조성물을 포함하고, 상기 조성물은 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포를 함께 배양하기 위해 혼합되는, 방법.
103. 제1 내지 제102 구현예 중 어느 하나의 방법에 의해 생산된 조작된 세포를 포함하는 조성물.
104. 제103 구현예에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
105. 제103 또는 제104 구현예에 있어서, 동결방지제, 선택적으로 DMSO를 포함하는, 조성물.
106. 제103 내지 제105 구현예 중 어느 하나의 조성물, 및 상기 출력 조성물을 개체에 투여하기 위한 지시를 포함하는, 제조 물품.
107. 제106 구현예에 있어서, 상기 개체는 질환 또는 상태를 가지고, 선택적으로, 상기 재조합 수용체는 질환 또는 상태와 관련되거나, 이의 세포 상에 발현되거나 제시되는 항원을 특이적으로 인식하거나 특이적으로 결합하는, 제조 물품.
108. 제106 또는 제107 구현예에 있어서, 상기 출력 조성물은 CD4+ T 세포의 조작된 조성물인, 제조 물품.
109. 제107 또는 제108 구현예에 있어서, 상기 출력 조성물은 CD8+ T 세포의 조작된 조성물인, 제조 물품.
110. 제2 내지 제3, 제5 내지 제6, 제9 내지 제14, 제16 내지 제17, 제19 내지 제49, 제51 내지 제53, 또는 제56 내지 제109 구현예 중 어느 하나의 방법으로 생산된 조작된 CD4+ T 세포의 조성물, 제2, 제4, 제5, 제7, 제9 내지 제13, 제15, 제16, 제18 내지 제49, 제51 내지 제53, 또는 제56 내지 제109 구현예 중 어느 하나의 방법으로 생산된 조작된 CD8+ T 세포의 조성물, 상기 조작된 CD4+ T 세포 및 조작된 CD8+ T 세포를 개체에 투여하기 위한 지시를 포함하는, 제조 물품.
111. 제110 구현예에 있어서, 상기 지시는 상기 조작된 CD4+ T 세포 및 조작된 CD8+ T 세포를 개체에 별도로 투여하는 것으로 특정된, 제조 물품.
112. 제110 또는 제111 구현예에 있어서, 상기 지시는 원하는 비로 상기 조작된 CD4+ T 세포 및 조작된 CD8+ T 세포를 개체에 별도로 투여하는 것으로 특정된, 제조 물품.
Ⅸ. 실시예
다음 실시예는 오직 예시적인 목적으로 포함되고 본 발명의 범위를 한정하기 위한 의도는 아니다. 은 아니다.
실시예 1: 1차 인간 T 세포의 배양을 위한 mTOR 키나아제 억제제의 용량 결정
리보솜 단백질 S6의 억제를 모니터링함으로써 1차 인간 T 세포에서 예시적인 mTOR 키나아제 억제제의 용량 효과를 평가하였다.
CD4+ 및 CD8+ T 세포를 인간 공여체 개체로부터 백혈구성분채집술(leukapheresis) 샘플로부터 면역친화성-기반 농축에 의해 분리하였다. 분리된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 1:1로 혼합하였고, mTOR 키나아제 억제제, PI-103, 화합물 155, 화합물 63, 또는 화합물 246의 증가하는 농도의 존재 하에 항-CD3/항-CD28 자성 비드로 자극하였다. T 세포 배양물을 37℃에서 밤새(약 16 시간) 인큐베이션하였다. PI-103, 화합물 155, 화합물 63, 또는 화합물 246의 존재하에 인큐베이션 후, T 세포를 유세포 분석에 의해, 세포내 S6 인산화에 대해 평가하였고 CD4 또는 CD8의 표면 발현을 위해 공동-염색하였다.
결과는 도 1 A-D에 나타내었다. 모든 평가된 mTOR 키나아제 억제제는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 모두에서 S6 인산화를 억제하였다. PI-103, 화합물 155, 화합물 63, 및 화합물 246에 의한 T 세포에서 S6 인산화의 억제에 대한 IC50은 각각 약 100 nM, 100 nM, 500 nM 및 500 nM였다. CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 IC50은 표 E1에 나타내었다.
Figure pct00023
실시예 2: mTOR 키나아제 억제제의 존재 하에 인큐베이션 후 T 세포 팽창의 평가
CD4+ 및 CD8+ 세포의 별도 조성물을 면역친화성-기반 농축 및 동결건조에 의해 인간 백혈구성분채집술(leukapheresis) 샘플로부터 분리하였다. 이어서, 조성물의 CD4+ 및 CD8+ 세포를
약 20시간 동안 항-CD3/항-CD28 자성 비드 및 재조합 IL-2, IL-7 및/또는 IL-15의 존재하에 자극 조건 하에 세포를 별도로 배양함으로써 해동시켰고 활성화시켰다. 그 다음, 세포를 항-CD19 키메릭 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 형질도입 후, CD4+ 및 CD8+ 세포를 다양한 농도에서, mTOR 키나아제 억제제, 화합물 155, 화합물 63 또는 화합물 246의 존재 하에 별도로 인큐베이션하였다. 대조군의 경우, 세포를 배지 단독만, DMSO 비히클 또는 200 nM PI-103과 함께 인큐베이션하였다. 1개 배지 변화로 해동 후 약 8 일 동안 37℃에서 인큐베이션을 수행하였고, 이 시점에서 화합물을 동일한 농도로 배양 배지에 다시 첨가하였다.
형질도입 후 배양을 위해 시딩된 세포의 양과 비교하여 공정 종료시 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 백분율을 도 2에 나타내었다. 배지 및 DMSO 대조군의 평균 값의 70 %로 허용 용량을 선택하기 위한 컷오프를 설정하였다. 비히클 대조군에서 관찰된 바와 같이 CD8 및 CD4 T 세포 팽창의 유사한 수준을 초래한 화합물 155, 화합물 63, 및 화합물 246의 최고 허용 용량은 각각 100 nM, 1 μM, 및 100 nM이었다.
실시예 3: mTOR 키나아제 억제제의 존재하에 팽창된 키메라 항원 수용체(CAR)-형질도입된 T 세포 (CAR T 세포)의 기능 평가
CD4+ 및 CD8+ 세포의 별도 조성물을 3 명 인간 공여체로부터 분리하였고, 실시예 2에 실질적으로 기재된 바와 같이 항-CD19 CAR을 암호화하는 바이러스 벡터로 활성화 및 형질도입시켰다. 형질도입 후, 각각의 공여체로부터 유래된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 200 nM PI-103, 1μM 화합물 63의 존재 또는 DMSO 비히클 또는 배지 단독 대조군을 제외하고는, 실시예 2에 서술된 바와 같이 실질적으로 T 세포를 팽창시키기 위해 mTOR 키나아제 억제제의 존재 하에 8 일 동안 개별적으로 인큐베이션하였다.
이어서, 각각의 공여체로부터 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 별도로 수거하고, 제형화하고, 동결건조시켰다. 동결건조된 조작된CD4+ 및 CD8+ T 세포를 해동시키고, 세척하여 화합물을 제거하였으며, 동일한 공여체로부터의 세포를 생존 CD8+/CAR+ T 세포에 대한 생존 CD4+/CAR+의 1:1 비로 조합하여 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 함유하는 팽창된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물을 생성하였다. 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물의 기능 활성을 평가하였다.
당분해 물질대사
CD4+ T 세포와 결합하기 전에 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 CD8+ CAR-T 세포에서 T 세포 수용체(TCR) 자극에 반응하는 세포 당분해 물질대사에서 변화를 측정하였다. 세포외 플럭스 바이오분석기(Seahorse Bioanalyzer, Agilent Technologies)를 사용하여 실시간으로 CD8+ CAR-T 세포에서 세포외 산성화 속도(ECAR)를 측정함으로써 당분해 물질대사를 평가하였다. 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 배양된 CD8+ CAR-T 세포로부터 기준선 ECAR 측정을 수행하였다. 세번째 ECAR 측정(분석 내로 약 20 분) 후, 항-CD3/항-CD28 자성 비드를 배양물에 첨가하였다. 분석의 0 내지 76 분의 ECAR 속도(mpH / 분)에 대한 곡선 아래 면적(AUC) 및 배지 대조군(n = 3 공여체)에 대한 최대 ECAR 당분해 버스트 비를 측정하였다.
도 3A에 나타난 바와 같이. 항-CD3/항 -CD28 비드로 자극은 모든 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물 중에 CD8+ CAR-T 세포에서 ECAR을 증가시켰다. 화합물 63의 존재 하에서 팽창에 의해 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 중에서 CD8+ CAR-T의 TCR 자극시 향상된 당분해 버스트 경향은 3 명 공여체 각각에서 배지 대조군에 대한 ECAR AUC(도 3B) 또는 ECAR 비(도 3C)에 의해 관찰되었다.
팽창된 CAR-T 세포에서 CAR 신호
포스포-S6의 활성화를 모니터링함으로써 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물 중 CAR-T 세포의 항원-의존적 신호를 평가하였다. 배지 단독, DMSO 비히클, PI-103 또는 화합물 63의 존재 하에 팽창된, 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 세포를 1:1의 비율로 CD19(K562-CD19 표적 세포)를 발현시키기 위해 형질도입된 조사된 K562 세포와 공동-배양하였다. 20 시간 후, 세포내 S6 인산화에 대해 세포를 평가하고, 유세포 분석에 의해 CD4 또는 CD8의 표면 발현에 대해 세포를 공동-염색시켰다.
도 4A에 나타난 바와 같이, 항원-발현 세포로 자극 후, 항원으로 자극되지 않은 세포와 비교하여 각각의 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물 중 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 보다 높은 수준의 포스포-S6가 관찰되었다. 포스포-S6 염색은 DMSO 비히클 또는 배지 단독으로 팽창된 대조군 조성물 중과 비교하여 PI-103 또는 화합물 63의 존재 하에 확정된 조성물 중 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 유사 하였다. 이러한 결과는 mTOR 키나아제 억제제의 존재 하에 팽창된 세포가 억제제의 세척 후 정상 mTOR 키나아제 신호 활성을 유지한다는 발견과 일치한다.
세포용해 활성
세포용해 활성을 평가하기 위해, 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물을 표적 세포에 대한 이펙터 세포 3:1 또는 1:1 중 하나의 비로 K562-CD19 표적 세포와 공동-배양하였다. 표적 세포를 NucLight Red(NLR)로 표지하여 형광 현미경으로 추적할 수 있도록 하였다. 음성 대조군으로서, K562-CD19 표적 세포를 단독으로 배양하거나 항-CD19 CAR을 발현하지 않았던 CD4+ 및 CD8+ T 세포와 공동-배양하였다. 적색 형광 신호에 의해 측정된 바와 같이(INCUCYTE® Live Cell Analysis System, Essen Bioscience을 사용하여), 80 시간 후 생존가능한 표적 세포의 손실을 측정함으로써 사멸 활성을 평가하였다. 시간에 따른 생존가능한 표적 세포의 양의 함수로서 곡선 아래 면적의 역으로 세포 사멸을 정량화하였다.
도 4B에 나타난 바와 같이, PI-103 또는 화합물 63의 존재 하에 팽창되었던 세포는 DMSO 비히클 또는 배지 단독으로 팽창되었던 대조군 세포에 대한 유사한 세포용해 활성을 나타내었다. 이들 결과는 표적 세포 사멸 기능이 mTOR 키나아제 억제제의 존재 하에 팽창되었던 T 세포에서 유지되었음을 나타낸다.
사이토카인 측정
항원 자극 후 사이토카인을 측정하기 위해, 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 세포를 1:1의 이펙터: 표적 세포 비율로 조사된 K562-CD19 표적 세포 또는 K562 모(parental) 표적 세포와 공동-배양하였다. 밤새(~ 16 시간) 배양 후, 세포 배양 상청액을 수거하고 TNF-알파, IFN-감마 및 IL-2 사이토카인 생산을 Luminex Multiplex Assay를 사용하여 측정하였다. 배지 단독에서 팽창된 세포와 비교하여 PI-103, 화합물 63, 또는 DMSO 비히클의 존재 하에 팽창된 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 공동-배양 상청액에서 관찰된 사이토카인 생산의 배수-변화를 결정하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 항원-발현 세포와 공동-배양된 T 세포로부터 TNF-알파, IFN-감마, 및 IL-2의 생산을 검출하였다. PI-103 또는 화합물 63의 존재 하에 팽창되었던 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터의 세포는 특히, IFN- 감마의 생산과 관련하여 대조군 세포와 비교하여 사이토 카인 생산에서 개선을 나타내었고, 이는 PI-103 또는 화합물 63 중으로 팽창된 세포에서 개선되었다.
세포내 사이토카인, CD107a, IFN- 감마(IFNγ), IL-2, IL-17a, 및 TNF-알파(TNFα)를 2개 그룹으로 분할되고 PMA/이오노마이신 및 골지 억제제 또는 골지 억제제 단독으로 5시간 동안 추가 인큐베이션된 공동-배양된 T 세포에서 평가하였다. 배지 단독 대조군으로부터 사이토카인 양성 세포의 빈도의 배수 변화로서 세포내 사이토카인 축적을 표현하였다. PI-103 또는 화합물 63으로 팽창된 CD8+ T 세포(도 6A) 및 CD4+ T 세포(도 6B)를 대조군 세포(도 6A 및 6B의 박스형 프로파일)와 비교하여 특정 다작용성 사이토카인 프로파일의 증가된 빈도를 나타내었다. 특히, CD8+ T 세포는 PMA/이오 노마이신 및 골지 억제제로 재-자극 후 CD107a+IFNγ+TNFα+ 양성 세포의 증가된 다작용성 프로파일 및 골지 억제제 단독으로 인큐베이션 후 CD107a+IFNγ+IL-2+ 세포의 증가된 다작용성 프로파일을 나타내었다(도 6A). CD4+ 세포에서, PMA/이오노마이신 및 골지 억제제 또는 골지 억제제 단독으로 처리한 후 CD107a+IFNγ+IL-2+TNFα+ 세포의 증가된 다작용성 프로파일을 관찰한 반면, PMA/이오노마이신 및 골지 억제제로 재자극 후 CD107a+IFNγ+IL-2+TNFα+ 세포의 다작용성 프로파일이 증가되었고, 골지 억제제 단독으로 인큐베이션 후 CD107a+IFNγ+ 세포의 다작용성 프로파일이 증가되었다(도 6B).
연속 자극
일부 측면에서 반복된 자극 후 세포가 ex vivo 팽창하기 위한 능력은 CAR-T 세포의 능력이 지속될 수 있고(예컨대, 초기 활성화 후) 및/또는 in vivo 기능을 나타내는 것일 수 있다(Zhao et al. (2015) Cancer Cell, 28:415-28). 연속 자극 분석에서 세포의 기능을 평가하기 위해, 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물을 조사된 K562-CD19 표적 세포와 함께 인큐베이션하였다. 3-4 일마다, T 세포를 수거하고, 계수하고, 각각의 라운드에 대해 초기 시드 밀도로 세포 수를 재설정한 후 동일한 배양 조건을 사용하여 새로운 표적 세포로 재자극시켰다. 4 라운드의 재자극 후, 표적 세포로 추가 재 자극 없이 추가 4 일 동안 T 세포를 재-배양하였다. 집단 배가(도 7A) 및 배지 단독으로 팽창된 세포의 AUC 대비 시간에 따른 집단 배가의 함수로서 곡선 아래 면적(AUC)(도 7B)을 결정하였다.
도 7A에 나타난 바와 같이, 항-CD19 CAR- 발현 T 세포의 수는 CD19-발현 세포의 존재 하에 증식시키기 위한 이들 세포의 증식 능력과 일치하는, 이러한 분석에서 증가하였다. 집단 배가의 AUC의 배수-변화로부터 나타난 바와 같이, 화합물 63으로 팽창되었던 생성된 항-CD19 CAR T 세포 조성물로부터의 T 세포는 PI-103 또는 DMSO 비히클로 팽창된 T 세포와 비교하여 보다 큰 평균 AUC를 가졌다(도 7B). 이러한 관찰은 CAR-T 세포의 팽창 동안 화합물 63의 존재가 반복된 항원 자극 후에도 T 세포의 지속적인 팽창 및 생존을 지원한다는 것을 나타낸다.
추가 2차 자극시 활성을 평가하기 위해, CAR-T 세포를 연속 재-자극 후 11 일째 수거하고, 약 16 시간 동안 1:1의 이펙터: 표적비에서 조사된 K562-CD19 표적 세포로 자극하였다. 상청액을 수집하고 실질적으로 상기 기재된 바와 같이 Luminex Multiplex Assay를 사용하여 TNF-알파, IFN- 감마 및 IL-2 사이토카인 생성을 측정하였다. 배지 단독에서 팽창된 세포와 비교하여 PI-103, 화합물 63, 또는 DMSO 비히클의 존재 하에 팽창된 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 공동- 배양 상청액에서 관찰된 사이토카인 생성의 배수-변화를 결정하였고, 도 7C에 나타내었다. 실질적으로 상기 기재된 바와 같이 4시간 동안 골지 억제제로 인큐베이션 후, 11일째 세포의 다작용성 사이토카인 프로파일의 평가는 CD107a+IFNγ+ 세포의 증가된 CD8+ 다작용성 사이토카인 프로파일을 나타내었다(도 7D).
지속적인 항원 노출을 통한 개선된 사이토카인 용량 및 생존을 유지하기 위해 mTOR 억제제의 존재 하에 팽창되었던 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물의 능력은 기능적 소진에 대한 내성과 일치한다.
CAR-특이적 팽창
항-CD19 CAR에 특이적인 항-이디오타입 항체와 표면 접합된 비드와 함께 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물의 세포를 인큐베이션함으로써 CAR의 자극 후 세포가 팽창하기 위한 능력을 평가하였다.
항-이디오타입 항체 접합 비드를 15일 동안 24-웰 G-rex 팽창 용기(Argos Technologies)의 웰에서 1:1 비드:셀 비로 세포와 인큐베이션하였다. 5 일마다 배양물에서 세포를 계수하여 웰당 총 살아있는 T 세포를 결정하였다(도 8A). 시간에 따른 T 세포 수의 함수로서 곡선 아래 평균 면적(AUC)을 배지 단독으로 팽창된 세포의 AUC에 대해 계산하였다 (도 8B).
도 8A에 나타난 바와 같이, 항-이디오타입 항체 접합 비드로 세포의 자극은 초기 팽창으로 이어졌고, 이어서 세포 수의 감소를 초래하였다. 화합물 63 또는 PI-103으로 이전에 팽창되었던 생성된 항-CD19 CAR T 세포 조성물로부터 T 세포는 DMSO 비히클로 이전에 팽창된 T 세포와 비교하여 보다 큰 평균 AUC를 가졌다(도 8B). 결과는 팽창하는 동안 mTOR 키나아제 억제제의 존재가 단일 CAR-특정 자극 후 향상된 팽창 및 생존을 지원을 나타낸다.
항-이디오타입 항체 접합 비드로 팽창한 후 11 일째 수거된 CAR-T 세포에서 항원-발현 세포로 자극 후 2차 사이토카인 반응을 평가하였다. 항-이디오타입 항체 자극된 세포를 약 16시간 동안 1:1의 이펙터:표적 비로 조사된 K562-CD19 표적 세포로 인큐베이션하였다. 상청액을 수집하고 실질적으로 상기 기재된 바와 같이 Luminex Multiplex Assay를 사용하여 TNF-알파, IFN- 감마 및 IL-2 사이토카인 생성을 측정하였다. 배지 단독에서 팽창된 세포와 비교하여 PI-103, 화합물 63, 또는 DMSO 비히클의 존재 하에 팽창된 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 공동-배양 상청액에서 관찰된 사이토카인 생성의 배수-변화를 결정하였다. 도 8C에 나타난 바와 같이, 화합물 63 또는 PI-103로 이전에 팽창되었던 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 T 세포는 항원으로 후속 자극 후 개선된 2차 사이토카인 생성을 나타내었다. 또한, 화합물 63으로 조작되고 팽창된 일부 공여체-유래 세포는 실질적으로 상기 서술한 바와 같이 4시간 동안 골지 억제제로 인큐베이션 후 세포내 사이토카인 염색에 의해 결정된 바와 같이, 11일째 CD107a+IFNγ+ 세포였던 CD8+ T 세포의 증가된 빈도를 나타내었다(도 8D).
실시예 4: mTOR 키나아제 억제제의 존재 하에서 팽창된 조작 된 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 유전자 발현 분석
PI-103, 화합물 63, DMSO 비히클 또는 배지 단독의 존재하에 세포를 팽창시킴으로써 생성된, 실시 예 2에서 서술된 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물의 세포 중 유전자 발현을 RNA 시퀀싱(RNA-Seq)에 의해 평가하였다. 각각의 팽창 조건 하에 3 개 공여체로부터 생성된 조성물로부터 RNA를 추출하고, RNA-Seq에 의해 전체-전사체의 평가를 수행하였다. FPKM 및 FPKQ 값을 결정하였고; FPKQ 값을 로그-변환하였다(log2). DMSO 비히클로 팽창된 세포와 비교하여 배지 단독, PI-103 또는 화합물 63의 존재 하에 팽창 되었던 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물의 세포 중에 CD4+, CD8+ 또는 조합된 CD4+/CD8+ 세포의 발현 프로파일을 비교함으로써 유전자 발현을 결정하였다. 2개 조건 사이에 FDR < 10%의 컷오프를 부과함으로써 볼케이노 플롯의 분석에 기반하여 각각의 그룹 중 상이한 유전자 생성물을 식별하였다.
도 9A에서 볼케이노 플롯에 나타난 바와 같이, 각 플롯의 중간점("0")의 좌측에 도시된 하향조절된 유전자 및 중간점의 우측에 도시된 상향조절된 유전자를 가지고, 상당히 변경된 유전자 발현은 PI-103 또는 화합물 63의 존재 하에 팽창된 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 중에 식별되었다.
PI-103 또는 화합물 63으로 팽창된 세포에서 각각의 차등적으로 발현된 유전자의 발현을 DMSO로 팽창된 세포에서 발현과 비교하여 Log2 폴드-변화로서 플롯팅하였다. 도 9B에 나타난 바와 같이, PI-103 또는 화합물 63으로 팽창된 세포에서 차별적으로 발현된 유전자의 발현 사이의 선형 관계를 확인하였고, PI-103으로 팽창된 세포에서 차별적으로 발현된 유전자의 발현 및 화합물 63으로 팽창 된 세포 사이의 강한 양의 상관 관계를 나타낸다(R2 = 0.9).
차등적으로 발현된 유전자에 대한 온톨로지 농축 분석을 수행하여 DMSO 비히클로 팽창된 세포에서의 발현과 비교하여 활성화되거나 억제된 차등적으로 발현된 유전자의 전사 조절 인자를 기반으로, 유전자 온톨로지(GO) 카테고리를 확인하였다. PI-103 또는 화합물 63으로 팽창된 세포에서 관찰된 전사 효과에 대한 각 조절 네트워크에서 예상된 전사 효과 방향의 일치성을 기반으로 전사 조절제의 TZ-점수를 계산하였다. 도 9C는 그들의 대응하는 Z- 점수에 대한, 각 클러스터의 조절 멤버에 의해 정의된, 예시적인 식별된 GO 카테고리를 열거한다.
실시예 5: mTOR 키나아제 억제제의 존재 하에 팽창된 CAR-T 세포의 투여 후 종양 이종이식 모델에서 종양 부담 및 생존의 평가
실시예 2에 서술된 바와 같이, PI-103, 화합물 63 또는 배지 단독의 존재하에 팽창시킴으로써 생성 된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물의 항-종양 효과를 평가하였다. 종양 이종이식 마우스 모델은 0.5 x106 Raji 세포(CD19를 발현하는 불사화된 인간 B 림프구 종양 세포주)로 NSG(nod scid gamma) 면역 결핍 마우스를 이식함으로써 생성되었고, 이를 주입시켰다. Raji 세포를 반딧불이 루시퍼라아제로 형질감염시켜 바이오발광 이미징에 의한 검출을 용이하게 하였다. 7일 후, 마우스는 무처리, DMSO 비히클, 또는 생성된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물의 CAR+ T 세포의 저용량(0.25x106) 또는 고용량(1.0x106) 중에 받았다. 매주 또는 10 일 마다 바이오발광에 의해 종양 부담을 평가하였다.
CAR-T 세포의 낮은 또는 고용량 중 하나로 종양 보유 마우스의 처리는 무처리 또는 DMSO 비히클과 비교하여 종양 부담 및 생존을 개선시켰다. PI-103(도 10A, 상부 패널) 또는 화합물 63(도 11A, 하부 패널)의 존재 하에 팽창되었던 항-CD19 CAR-T 세포 조성물로부터 CAR-T 세포의 낮은 또는 고용량의 투여 후 감소된 종양 부담이 관찰되었다. 또한, PI-103 또는 화합물 63의 존재 하에 이전에 팽창되었던 CAR-T 세포의 낮은 또는 고용량을 투여한 종양 보유 마우스는 DMSO 비히클로 팽창된 CAR-T 세포가 투여된 종양 보유 마우스와 비교하여 실질적으로 개선된 생존을 나타내었다(도 10A 및 11A, 하부 패널). 화합물 63의 존재 하에 팽창된 CAR-T 세포의 고용량을 투여한 종양 보유 마우스는 종양 세포 이식 후 적어도 80일 동안 100% 생존을 나타내었다. 도 10B 및 11B는 각각 PI-103 또는 화합물 63의 존재 하에 팽창된 CAR-T 세포로 처리한 후 종양 세포 이식 후 100 일 시점에서 종양 보유 마우스의 생존에 대한 결과를 나타내고; 결과는 화합물 63의 존재 하에 생산된 세포의 효과와 일치하여 투여된 CAR-T 세포의 성능을 개선시켰다. 결과는 화합물 63과 같은, mTOR 키나아제 억제제의 존재 하에 생산된 CAR-T 세포 조성물이 in vivo 분석에서 개선된 성능을 나타내는 것을 가리킨다. in vivo 모델에서 개선된 종양 제거 및 생존은 CAR-T 세포 생성 동안 mTOR 신호의 억제를 통해 달성된 CAR-T 세포의 상태 및/또는 기능의 질적 개선과 일치한다.
실시예 6: 항-이디오타입 컨쥬게이트 비드를 사용하는 CAR+ T 세포의 만성 자극에 대한 in vitro 분석
CD4+ 및 CD8+ 세포의 별도 조성물을 인간 공여체로부터 분리하고, 항-CD3/항-CD28 자성 비드로 활성화시켜 자극하며, FMC63으로부터 유래된 scFv를 가진 항-CD19 CAR을 암호화하는 바이러스 벡터로 형질도입시켰다. 세포를 팽창시키기 위한 조건 하에 배양한 후, 각각의 공여체로부터 조작 된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 함유하는 T 세포 조성물을 개별적으로 수거하고, 제형화하고, 동결건조시켰다. 동결건조된 조작된 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 해동시키고 동일한 공여체로부터 CD1+ 및 CD8+ T 세포의 1:1 비로 제형화하여 CAR+ T 세포를 함유하는 T 세포 조성물을 생성하였다. 항-CD19 CAR에 대한 항-이디오타입(ID) 항체 접합 비드를 14일 동안 1:1 비드:세포 비로 세포와 함께 인큐베이션하였다.
1:1(사이토카인 수준을 평가하기 위해) 또는 3:1(세포용해 활성을 평가하기 위해)의 표적에 대한 이펙터의 비로 K562-CD19 항원-발현 표적 세포로 자극한 후, 항-ID 접합 비드로 CAR-특이적 자극 후 14 일째 수거된 CAR-T 세포의 2차 반응(14일; 2차)을 평가하였다. 또한, 항-ID 접합 비드로 인큐베이션되지 않았던 T 세포 조성물로부터 T 세포의 1차 반응은 항원-발현 세포와의 유사한 자극에 의해 결정되었다(0일; "1차"). 세포용해 활성을 평가하기 위해, 형광 현미경으로 추적할 수 있도록 표적 세포를 NucLight Red(NLR)로 표지하였다. 키네틱 형광 현미경(INCUCYTE® Live Cell Analysis System, Essen Bioscience 사용)에 의해 시간에 따른 형광 신호의 손실에 의해 결정되는 바와 같이, 72 시간에 걸쳐 생존가능한 표적 세포의 손실을 측정함으로써 사멸 활성을 평가하였다. 시간에 따른 표적 형광에 대한 곡선 아래 면적(AUC)의 역수로서 사멸 지수를 결정하였다. 골지 억제제의 존재 하에 인큐베이션 후 공동-배양된 T 세포에서 유세포 분석에 의해, IL-2 및 TNF-알파의 세포내 사이토카인 수준을 평가하였다.
도 12A에 나타난 바와 같이, 항-ID 접합 비드로 14일 동안 CAR- 특이적 자극 후 수집된 CAR+ T 세포를 함유하는 T 세포 조성물에 의한 표적 세포 사멸은 이전 CAR- 특이적 자극을 받지 않은 CAR+ T 세포의 세포용해 활성과 비교하여 감소하였다. IL-2 및 TNF-알파의 세포내 사이토카인 수준은 항-ID 컨쥬게이트 비드로 장기간 CAR-특이적 자극을 받은 CAR+ T 세포에서도 감소되었다(도 12B). 이러한 결과는 14 일 동안 항-ID 컨쥬게이트 비드로 인큐베이션에 의한 것과 같은, 장기간 CAR-특이적 자극이 CAR의 만성 자극 및 지속된 기능의 손실을 초래한다는 관찰과 일치한다.
상기 서술된 만성 자극 분석을 사용하여 장기간 자극 후 CAR+ T 세포 기능 개선에 대한 PI-103 또는 화합물 63의 효과를 평가하였다. 자극의 개시로부터 시작하는 PI-103, 화합물 63 또는 비히클 대조군의 존재를 제외하고, 항-CD19 CAR+ T 세포 조성물을 상기 서술한 바와 같이 생성하였다. 각각의 생성된 CAR-T 세포 조성물로부터 세포를 14 일 동안 1:1 비드 대 세포 비로 항-ID 컨쥬게이트 상자성 비드로 인큐베이션하였다.
항원-발현 세포로 자극 후, 해동시 CAR-T 세포 조성물의 1 차 반응(항-ID 컨쥬게이트 비드로 자극 없음) 또는 CAR-자극 CAR-T 조성물의 2 차 반응(항-ID 컨쥬게이트 비드로 14일 CAR-특이적 자극 후)을 평가하였다. 골지 억제제의 존재 하에 CAR-T 세포 조성물을 K562-CD19 항원-발현 세포와 1:1 배양하였고, IL-2, IFN- 감마 및 TNF-알파에 대한 세포내 사이토카인 염색 후 유세포 분석에 의해 다작용성 사이토카인 생산을 평가하였다. 공여체 코호트 내에서 스케일링함으로써 데이터를 표준화한 후, CD8+ 세포에서 측정된 바와 같이, 사이토카인의 누적 수준으로부터 다작용성 점수를 결정하였다(도 13A). 표적 세포로 인큐베이션의 20시간 후 공동-배양의 세포 배양 상청액으로부터 총 분비된 IL-2, TNF 및 IFN-감마 사이토카인을 측정하고, 3개의 모든 사이토카인에 대한 스케일링된 점수의 평균을 도 13A에 나타난 바와 같이 계산하였다. 도 13A에 나타난 바와 같이. PI-103 또는 화합물 63은 CAR-T 세포 조성물의 사이토카인 생성 능력에 기반하여 개선된 1차 또는 2차 반응을 초래하였다. 또한, 상기 서술한 바와 같이 3:1 이펙터:표적 세포 비에서 표적 세포로 공동-배양 후, 1차 또는 2차 세포용해 반응의 개선은 PI-103 또는 화합물 63의 존재 하에 생산된 T 세포 조성물 중에 관찰되었다(도 13B 및 13C).
이들 결과는 장기 생존을 나타내기 위한 그들의 능력에 대한, 상이한 조건 하에 또는 PI-103 또는 화합물 63 또는 다른 작용제의 존재하에 생산된 상이한 CAR-T 세포 조성물을 포함하는, CAR-T 세포 조성물을 평가하기 위한 만성 자극 분석의 유용성 및/또는 in vivo 장기간 노출 후 발생할 수 있는 것과 같은, 만성 CAR-T 세포 자극 후 지속 기능을 입증한다.
실시예 7: mTOR 키나아제 억제제의 존재 하에 제조된 키메릭 항원 수용체(CAR)-형질유도된 T 세포 (CAR T 세포)의 기능 평가
CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단이 개별적으로 농축된 후 단일 조성물로 함께 혼합 및 처리되는 T 세포를 조작하는 과정에서 세포 생산 동안 mTOR 키나아제 억제제의 존재의 영향을 추가로 평가하였다. 처리 단계는 자극, 키메릭 항원 수용체를 암호화하는 벡터로 형질도입, 및 팽창을 위한 것을 포함한다.
면역친화성 기반 선택에 의해 동일한 인간 공여체로부터 백혈구성분채집술(leukapheresis) 샘플로부터 분리된 PBMC로부터 CD4+ 및 CD8+ 세포의 별도 조성물을 선택하고, 선택된 세포 조성물을 동결건조시켰다. 이어서, CD4+ 및 CD8+ T 세포의 별도 조성물을 해동시키고 생존 CD8+ T 세포에 대한 생존 CD4+ T 세포의 1:1의 비로 혼합하였다. 본 발명에서, 자극의 개시를 시작하는 화합물 63, PI103 또는 무 억제제(DMSO 비히클 대조군)의 존재 하에 혼합된 CD4+ 및 CD8+ 세포 집단을 인큐베이션하였다. 보다 상세하게, 18 내지 30 시간 동안 항-CD3 및 항-CD28 항체가 부착된 상자성 폴리스티렌-코팅된 비드의 존재 하에 (표시된 바와 같이, 억제제의 존재 또는 부재 하에) 혼합된 CD4+ 및 CD8+ T 세포 조성물을 자극한 다음, 항-CD19 CAR을 암호화하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입하였다. CAR은 CD19(FMC63으로부터 유래됨), CD28 막관통 영역, 4-1BB 공동자극 신호 영역 및 CD3-제타 유래 세포내 신호 도메인에 특이적인 scFv 항원-결합 도메인을 함유하였다. 이어서, 세포를 전형적으로 약 6-7 일 동안 사이토카인의 존재 하에 팽창시켰다. 자극으로 시작하고 공정 동안, 배지는 DMSO(비히클 대조군), 2 μM PI103 또는 1 μM 화합물 63을 함유하였다. 비히클 대조군은 mTOR 억제제-처리된 샘플에서의 것과 일치하는 부피로 DMSO를 함유하였다. 팽창된 세포를 동결보존시켰다. 평가를 위해, 동결보존된 CAR-T 세포를 지지 사이토카인 없이 및 억제제 또는 비히클 없이 분석 배지에서 평가 전에 해동시키고 세척하였다.
세포 표면 마커 수준 및 프로-아토포시스 마커, 세포내 카스파아제 3의 수준에 대한 유세포 분석에 의해 세포를 평가하였다. 3 개 공여체로부터 대표적인 유세포 분석 플롯을 도 14에 나타내었다. 나타난 바와 같이, 화합물 63의 존재하에 제조된 CAR-T 세포는 프로-아토포시스 마커, 세포내 카스파아제 3의 수준이 감소된 것으로 관찰되었다.
비드에 컨쥬게이트된 생성된 CAR-T 세포 항체의 인큐베이션에 의해 연속 자극 분석에서 생성된 CAR-T 세포의 기능 특성을 평가하였다. 항-CAR 항체는 CAR의 FMC63-유래 scFv를 인식하는 항-이디오타입 항체였다. 해동된 CAR-T 세포를 CAR-특이적 비드와 혼합하고, 도금하고, 14 일 동안 인큐베이션하였다. 3-4 일마다, T 세포를 계수하였다. 도 15에 나타난 바와 같이. PI103 또는 화합물 63의 존재 하에 제조된 생성된 CAR-T 세포는 재자극 후 개선된 팽창을 나타내었다.
3:1 표적에 대한 이펙터에서 CD19-발현 표적 세포와 함께, 새로 해동되거나 또는 상기로부터 재자극의 14일째 중 하나인, 생성된 CAR-T 세포를 배양함으로써 생성된 CAR-T 세포의 세포용해 활성을 평가하였다. 시간이 지남에 따라 표적 세포 사멸을 정량화하였다. 각각의 농도에 대해 시간에 따른 신호 의 곡선 아래 종양 세포 성장 면적(AUC)을 측정하였다. 종양 세포 성장 곡선 아래 면적의 역(1/AUC)으로 사멸 지수를 계산하였다. PI103 또는 화합물 63의 존재 하에 공정에서 생성되었던 CAR-T 세포는 DMSO 존재 하에서 제조된 CAR-T 세포와 비교하여 개선된 표적 세포 사멸을 나타내었다(도 16).
세포내 사이토카인 수준을 새로 해동*?*된 생성된 CAR-T 세포 또는 CD19-발현 표적 세포로 2차 재자극 후 CAR-T 세포와 함께 인큐베이션된 공동-배양의 세포에서 세포내 사이토카인 수준을 모니터링하였다. CAR-T 세포를 5시간 동안 골지 억제제의 존재 하에 표적-발현 세포와 함께 인큐베이션하였다. IL-2, TNF-알파 및 IFN-감마의 세포내 발현을 측정하고, IL-2 및 IFN-감마 및 TNF- 알파의 임의의 조합에 대해 양성인 누적 CAR-T 세포를 게이팅함으로써 다작용성 점수를 계산하였다. 도 17A에 나타난 바와 같이, PI103 또는 화합물 63의 존재 하에 제조된 CAR-T 세포는 DMSO의 존재 하에 제조된 CAR-T 세포와 비교하여 1차 또는 2차 자극 모두 후 CD8+ 및 CD4+ 서브세트 모두에서 개선된 다작용성 이펙터 사이토카인 프로파일을 나타내었다(도 17A). 또한, 생성된 CAR-T 세포를 20 시간 동안 CD19-항원 발현 세포와 함께 배양하고, IL-2, TNF-알파 및 IFN-감마의 수준을 ELISA에 의해 세포 배양 상청액에서 평가하였다. PI103 또는 화합물 63으로 생성된 CAR-T 세포는 상청액에서 증가된 수준의 분비된 사이토카인을 나타내었다(도 17B).
함께, 이들 결과는 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 혼합 집단으로부터 CAR-T 세포를 생산하기 위한 공정 동안 PI103 및 화합물 63의 존재가 CAR-T 세포 기능 및 활성을 개선한다는 관찰과 일치한다.
실시예 8: mTOR 키나아제 억제제의 존재 하에 제조된 CAR-T 세포의 유전자 발현 분석
RNA-Seq의 차등 발현(DESeq2) 분석에 의해 항-CD19 CAR-T 세포(실시예 7에 서술된 바와 같이 DMSO, PI-103 또는 화합물 63의 존재 하에 제조 됨)를 함유하는 조성물의 세포들 중 유전자 발현을 평가 하였다. CAR-T 세포로부터 분리된 RNA로부터 제조된 상보적인 DNA(cDNA) 샘플에 대해 RNA-seq를 수행하였다. DESeq2-정규화된 카운트로부터 생성된, RNA-seq 데이터 세트에 대해 주요 성분 분석(PCA)을 수행하였다. 공여체를 제어하면서, 화합물 처리된 샘플을 DMSO 대조군과 비교함으로써 DESeq2 패키지(버전 1.16.1)를 사용하여 R(버전 3.4)에서 유전자 수준 차등 발현 분석을 수행하였다. 차등 발현 분석 전에, 모든 샘플에서 0 카운트를 가진 유전자를 배제하기 위해 유전자 세트를 여과 하였다. 차등적으로 발현된(DE) 유전자는 0.5의 log2 폴드 변화 컷오프 및 0.1의 Benjamini-Hochberg 조정된 FHD(False Discovery Rate) 컷오프를 부과함으로써 확인되었다. PI103 또는 화합물 63의 존재 하에 제조된 CAR-T 세포를 함유하는 조성물에서 중첩 및 비-중첩 유전자 발현 프로파일 모두가 관찰되었다(도 18).
실시예 9: mTOR 키나아제 억제제의 존재하에 제조된 CAR-T 세포의 투여 후 종양 이종이식 모델에서 종양 부담 및 생존의 평가
실시예 7에 서술된 바와 같이, DMSO, PI-103 또는 화합물 63의 존재하에 제조된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물의 항-종양 효과를 in vivo 에서 평가하였다. 종양 이종이식 마우스 모델은 0.5 x 106 Raji 세포 (CD19를 발현하는 불사화된 인간 B 림프구 종양 세포주)로 NSG(nod scid gamma) 면역결핍 마우스를 이식함으로써 생성되었고, 이를 주입시켰다. Raji 세포를 반딧불이 루시퍼라아제로 형질감염시켜 바이오발광 이미징에 의한 검출을 용이하게 하였다. 7일 후, 마우스는 무처리, 또는 DMSO(비히클) 또는 DMSO 및 mTOR 키나아제의 존재 하에 제조된 항-CD19 CAR+ T 세포의 저용량(0.25x106) 또는 고용량(1.0x106)로 처리 중 하나를 받았다. 매주마다 종양 부담 및 사망률을 평가하였다.
DMSO의 존재를 포함하는 공정에서, 3개 상이한 인간 공여체의 세포로부터 별도로 제조된 항-CD19 CAR-T 세포 조성물은 감소된 사망률을 나타내는 처리된 동물과 함께, 비-처리된 동물과 비교하여 본 발명에서 동물에 대해 입증가능한 항 종양 효과를 갖는 것으로 관찰되었다. 매치된 공여체로부터 제조된 세포로부터 결과는 도 19A-B 및 20A-20B에 나타내었다. CAR-T 세포를 생성하기 위해 사용되는 공정에서 mTOR 키나아제 억제제 화합물 63 (억제제, 즉, DMSO 비히클의 부재와 비교하여)의 포함은 본 발명에서 동물에서 in vivo 항-종양 반응의 개선을 초래하는 것으로 관찰되었다. 예시적인 결과는 도 20A 및 20B에 나타내었다. 다른 공여체로부터 생성된 CAR-T 세포에서 실질적으로 유사한 결과가 나타났다. 억제제 PI103의 존재 또는 부재에서 생성된 CAR-T 세포를 비교한 결과는 도 19A 및 19B에 나타내었다. 다른 공여체로부터 생성된 CAR-T 세포의 경우, PI103의 존재 하에 생성된 세포 및 억제제(DMSO 비히클)의 부재 하에 생성된 세포에 대해 비교가능한 항-종양 효과가 관찰되었다.
실시예 10: in vivo CAR-T 세포 지속성의 평가
동물에게 실시예 7에 서술된 바와 같이, PI-103, 화합물 63, 또는 무 억제제의 존재 하에 제조되었던 세포를 함유하는 조성물의 투여 후 동물의 혈액에서 항-CD19 CAR-T 세포의 존재 및 수를 평가하였다. 실시예 9에 서술된 Raji Burkitt의 CD19+ 림프종 종양 이종이식 모델을 사용하였다. 마우스는 무 처리, 또는 각각의 항-CD19 CAR+ T 세포 조성물의 저용량(0.25 x 106) 또는 고용량(1.0 x 106)으로 처리 중 하나를 받았다. 7-10 일마다 종양 부담 및 사망률을 평가하였다.
주입 후 18, 25 및 36 일에 마우스를 채혈하고, 말초 혈액에서 순환하는 CAR+ CD4+ T 세포 또는 CAR+ CD8+ T 세포의 존재를 유세포 분석에 의해 평가하였다. 실시예 10에 서술된 것과 동일한 일치 된 공여체로부터 CAR-T 세포를 제조하는 동안 화합물 63 또는 PI103 중 하나를 포함시키는 것은 시간이 지남에 따라 증가된 수의 CAR+ T 세포를 초래하는 것으로 관찰되었고, 이는 세포 조성물의 생산 동안 억제제의 사용이 이러한 동물 종량 모델에서 투여한 후, in vivo 세포의 증가된 팽창 또는 지속성으로 인한 것과 같은, 증가된 노출을 초래하였다는 해석과 일치한다(도 21A 및 21B). 실질적으로 유사한 결과가 제2 공여체로부터 생성된 CAR-T 세포에서 관찰되었다.
본 발명은 특정 개시된 구현예로 범위가 한정되도록 의도되지 않고, 이는 예컨대, 본 발명의 다양한 측면을 예시하기 위해 제공된다. 조성물 및 방법에 대한 다양한 변형은 본원의 설명 및 교시로부터 명백해질 것이다. 그러한 변형은 본 개시의 진정한 범위 및 사상을 벗어나지 않고 실시 될 수 있으며 본 개시의 범위 내에 속하도록 의도된다.
서열
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
SEQUENCE LISTING <110> Juno Therapeutics, Inc. Celgene Corporation Brahmandam, Archana Thompson, Lucas James Mortensen, Deborah Filvaroff, Ellen <120> PROCESS FOR PRODUCING A T CELL COMPOSITION <130> 735042013440 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 62/580,435 <151> 2017-11-01 <150> US 62/584,687 <151> 2017-11-10 <150> US 62/699,709 <151> 2018-07-17 <150> US 62/711,494 <151> 2018-07-28 <160> 62 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Spacer (IgG4hinge) (aa) <400> 1 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Spacer (IgG4hinge) (nt) <400> 2 gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36 <210> 3 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Hinge-CH3 spacer <400> 3 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg 1 5 10 15 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 20 25 30 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 35 40 45 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 50 55 60 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 65 70 75 80 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 85 90 95 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 100 105 110 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 115 <210> 4 <211> 229 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Hinge-CH2-CH3 spacer <400> 4 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe 1 5 10 15 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 20 25 30 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 35 40 45 Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 50 55 60 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 85 90 95 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser 100 105 110 Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 115 120 125 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 130 135 140 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 145 150 155 160 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 165 170 175 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 195 200 205 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 210 215 220 Leu Ser Leu Gly Lys 225 <210> 5 <211> 282 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> IgD-hinge-Fc <400> 5 Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala 1 5 10 15 Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala 20 25 30 Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys 35 40 45 Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro 50 55 60 Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln 65 70 75 80 Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly 85 90 95 Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val 100 105 110 Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly 115 120 125 Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn 130 135 140 Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro 145 150 155 160 Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys 165 170 175 Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser 180 185 190 Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu 195 200 205 Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro 210 215 220 Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser 225 230 235 240 Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr 245 250 255 Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg 260 265 270 Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His 275 280 <210> 6 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A <400> 6 Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp 1 5 10 15 Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg 20 <210> 7 <211> 357 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tEGFR <400> 7 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly 20 25 30 Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe 35 40 45 Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala 50 55 60 Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu 65 70 75 80 Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile 85 90 95 Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu 100 105 110 Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala 115 120 125 Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu 130 135 140 Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr 145 150 155 160 Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys 165 170 175 Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly 180 185 190 Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu 195 200 205 Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys 210 215 220 Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu 225 230 235 240 Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met 245 250 255 Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala 260 265 270 His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val 275 280 285 Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His 290 295 300 Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro 305 310 315 320 Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala 325 330 335 Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly 340 345 350 Ile Gly Leu Phe Met 355 <210> 8 <211> 27 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD28 (amino acids 153-179 of Accession No. P10747) <400> 8 Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu 1 5 10 15 Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val 20 25 <210> 9 <211> 66 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD28 (amino acids 114-179 of Accession No. P10747) <400> 9 Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn 1 5 10 15 Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu 20 25 30 Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly 35 40 45 Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe 50 55 60 Trp Val 65 <210> 10 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD28 (amino acids 180-220 of P10747) <400> 10 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 11 <211> 41 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD28 (LL to GG) <400> 11 Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr 1 5 10 15 Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro 20 25 30 Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser 35 40 <210> 12 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 4-1BB (amino acids 214-255 of Q07011.1) <400> 12 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 1 5 10 15 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 20 25 30 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 35 40 <210> 13 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD3 zeta <400> 13 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 14 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD3 zeta <400> 14 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 15 <211> 112 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> CD3 zeta <400> 15 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly 1 5 10 15 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 20 25 30 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 35 40 45 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 16 <211> 335 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tEGFR <400> 16 Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu 1 5 10 15 Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile 20 25 30 Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe 35 40 45 Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr 50 55 60 Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn 65 70 75 80 Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg 85 90 95 Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile 100 105 110 Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val 115 120 125 Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp 130 135 140 Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn 145 150 155 160 Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu 165 170 175 Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser 180 185 190 Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu 195 200 205 Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln 210 215 220 Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly 225 230 235 240 Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro 245 250 255 His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr 260 265 270 Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His 275 280 285 Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro 290 295 300 Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala 305 310 315 320 Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met 325 330 335 <210> 17 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> T2A <400> 17 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 18 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A <400> 18 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 19 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A <400> 19 Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn 1 5 10 15 Pro Gly Pro <210> 20 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> E2A <400> 20 Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser 1 5 10 15 Asn Pro Gly Pro 20 <210> 21 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> F2A <400> 21 Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary linker <220> <221> REPEAT <222> (5)...(9) <223> SGGGG is repeated 5 times <400> 22 Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro 1 5 10 <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary Linker <400> 23 Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys 1 5 10 15 Ser <210> 24 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary Linker <400> 24 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 25 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary IgG Hinge <400> 25 Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary IgG Hinge <220> <221> VARIANT <222> (1)...(1) <223> Xaa is glycine, cysteine or arginine <220> <221> VARIANT <222> (4)...(4) <223> Xaa is cysteine or threonine <400> 26 Xaa Pro Pro Xaa Pro 1 5 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary IgG Hinge <400> 27 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 15 <210> 28 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary IgG Hinge <400> 28 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 29 <211> 61 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary IgG Hinge <400> 29 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro 1 5 10 15 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 20 25 30 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro 35 40 45 Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 50 55 60 <210> 30 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary IgG Hinge <400> 30 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro 1 5 10 <210> 31 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary IgG Hinge <400> 31 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary IgG Hinge <400> 32 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 <210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Exemplary IgG Hinge <400> 33 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro 1 5 10 <210> 34 <211> 2549 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Human mTOR protein <400> 34 Met Leu Gly Thr Gly Pro Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ser 1 5 10 15 Ser Asn Val Ser Val Leu Gln Gln Phe Ala Ser Gly Leu Lys Ser Arg 20 25 30 Asn Glu Glu Thr Arg Ala Lys Ala Ala Lys Glu Leu Gln His Tyr Val 35 40 45 Thr Met Glu Leu Arg Glu Met Ser Gln Glu Glu Ser Thr Arg Phe Tyr 50 55 60 Asp Gln Leu Asn His His Ile Phe Glu Leu Val Ser Ser Ser Asp Ala 65 70 75 80 Asn Glu Arg Lys Gly Gly Ile Leu Ala Ile Ala Ser Leu Ile Gly Val 85 90 95 Glu Gly Gly Asn Ala Thr Arg Ile Gly Arg Phe Ala Asn Tyr Leu Arg 100 105 110 Asn Leu Leu Pro Ser Asn Asp Pro Val Val Met Glu Met Ala Ser Lys 115 120 125 Ala Ile Gly Arg Leu Ala Met Ala Gly Asp Thr Phe Thr Ala Glu Tyr 130 135 140 Val Glu Phe Glu Val Lys Arg Ala Leu Glu Trp Leu Gly Ala Asp Arg 145 150 155 160 Asn Glu Gly Arg Arg His Ala Ala Val Leu Val Leu Arg Glu Leu Ala 165 170 175 Ile Ser Val Pro Thr Phe Phe Phe Gln Gln Val Gln Pro Phe Phe Asp 180 185 190 Asn Ile Phe Val Ala Val Trp Asp Pro Lys Gln Ala Ile Arg Glu Gly 195 200 205 Ala Val Ala Ala Leu Arg Ala Cys Leu Ile Leu Thr Thr Gln Arg Glu 210 215 220 Pro Lys Glu Met Gln Lys Pro Gln Trp Tyr Arg His Thr Phe Glu Glu 225 230 235 240 Ala Glu Lys Gly Phe Asp Glu Thr Leu Ala Lys Glu Lys Gly Met Asn 245 250 255 Arg Asp Asp Arg Ile His Gly Ala Leu Leu Ile Leu Asn Glu Leu Val 260 265 270 Arg Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu Arg Leu Arg Glu Glu Met Glu Glu 275 280 285 Ile Thr Gln Gln Gln Leu Val His Asp Lys Tyr Cys Lys Asp Leu Met 290 295 300 Gly Phe Gly Thr Lys Pro Arg His Ile Thr Pro Phe Thr Ser Phe Gln 305 310 315 320 Ala Val Gln Pro Gln Gln Ser Asn Ala Leu Val Gly Leu Leu Gly Tyr 325 330 335 Ser Ser His Gln Gly Leu Met Gly Phe Gly Thr Ser Pro Ser Pro Ala 340 345 350 Lys Ser Thr Leu Val Glu Ser Arg Cys Cys Arg Asp Leu Met Glu Glu 355 360 365 Lys Phe Asp Gln Val Cys Gln Trp Val Leu Lys Cys Arg Asn Ser Lys 370 375 380 Asn Ser Leu Ile Gln Met Thr Ile Leu Asn Leu Leu Pro Arg Leu Ala 385 390 395 400 Ala Phe Arg Pro Ser Ala Phe Thr Asp Thr Gln 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Leu Met Arg Glu 1025 1030 1035 1040 Phe Trp Val Met Asn Thr Ser Ile Gln Ser Thr Ile Ile Leu Leu Ile 1045 1050 1055 Glu Gln Ile Val Val Ala Leu Gly Gly Glu Phe Lys Leu Tyr Leu Pro 1060 1065 1070 Gln Leu Ile Pro His Met Leu Arg Val Phe Met His Asp Asn Ser Pro 1075 1080 1085 Gly Arg Ile Val Ser Ile Lys Leu Leu Ala Ala Ile Gln Leu Phe Gly 1090 1095 1100 Ala Asn Leu Asp Asp Tyr Leu His Leu Leu Leu Pro Pro Ile Val Lys 1105 1110 1115 1120 Leu Phe Asp Ala Pro Glu Ala Pro Leu Pro Ser Arg Lys Ala Ala Leu 1125 1130 1135 Glu Thr Val Asp Arg Leu Thr Glu Ser Leu Asp Phe Thr Asp Tyr Ala 1140 1145 1150 Ser Arg Ile Ile His Pro Ile Val Arg Thr Leu Asp Gln Ser Pro Glu 1155 1160 1165 Leu Arg Ser Thr Ala Met Asp Thr Leu Ser Ser Leu Val Phe Gln Leu 1170 1175 1180 Gly Lys Lys Tyr Gln Ile Phe Ile Pro Met Val Asn Lys Val Leu Val 1185 1190 1195 1200 Arg His Arg Ile Asn His Gln Arg Tyr Asp Val Leu Ile Cys Arg Ile 1205 1210 1215 Val Lys Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Glu Glu Glu Asp Pro Leu Ile Tyr 1220 1225 1230 Gln 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Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 43 <211> 107 <212> PRT <213> Arificial <220> <223> VL <400> 43 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr 100 105 <210> 44 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv <400> 44 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly 100 105 110 Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys 115 120 125 Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser 130 135 140 Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser 145 150 155 160 Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile 165 170 175 Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu 180 185 190 Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn 195 200 205 Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr 210 215 220 Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser 225 230 235 240 Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L1 <400> 45 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 46 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L2 <400> 46 Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser 1 5 <210> 47 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L3 <400> 47 Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 48 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H1 <400> 48 Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 49 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H2 <400> 49 Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 50 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H3 <400> 50 Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 51 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 51 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 52 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 52 Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser 65 70 75 80 Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 53 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 53 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 54 <211> 245 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scFv <400> 54 Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser 130 135 140 Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys 145 150 155 160 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys 165 170 175 Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn 180 185 190 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 195 200 205 Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe 210 215 220 Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys 225 230 235 240 Leu Glu Ile Lys Arg 245 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR H3 <400> 55 His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR L2 <400> 56 His Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 57 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 57 Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr 1 5 10 15 Lys Gly <210> 58 <211> 735 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence encoding scFv <400> 58 gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60 atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120 gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180 cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240 gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300 ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360 ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420 cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480 tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540 accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600 agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660 gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720 gtgaccgtga gcagc 735 <210> 59 <211> 16 <212> PRT <213> Hmo sapiens <220> <223> CD33 signal peptide <400> 59 Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 <210> 60 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8 alpha signal peptide <400> 60 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala <210> 61 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GMCSFR alpha chain signal sequence <400> 61 atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60 atccca 66 <210> 62 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GMCSFR alpha chain signal sequence <400> 62 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro 20

Claims (111)

  1. (a) 자극 조건 하에, 1차 인간 T 세포를 포함하는 입력 조성물을 인큐베이션하고, 상기 자극 조건은 (i) TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극제 및 (ⅱ) mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재를 포함하고, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 2-(3-하이드록시페닐)-9-(2-이소프로필페닐)-8-옥소-8,9-디하이드로-7H-퓨린-6-카보사마이드[2-(3-hydroxyphenyl)-9-(2-isopropylphenyl)-8-oxo-8,9-dihydro-7H-purine-6-carboxamide](화합물 63), 6-(4-(2H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)-1-(2-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)에틸)-1H-이미다조[4,5-b]피라진-2(3H)-온[6-(4-(2H-1,2,4-Triazol-3-yl)phenyl)-1-(2-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)ethyl)-1H-imidazo [4,5-b]pyrazine-2(3H)-one] (화합물 155), 또는 7-(6-(2-하이드록시프로판-2-일)피리딘-3-일)-1-((1r,4r)-4-메톡시사이클로헥실)-3,4-디하이드로피라지노[2,3-b]피라진-2(1H)-온[7-(6-(2-hydroxypropan-2-yl)pyridin-3-yl)-1-((1r,4r)-4-methoxycyclohexyl)-3,4-dihydropyrazino[2,3-b]pyrazin-2(1H)-one](화합물 246)로부터 선택되는 단계; 및
    (b) 재조합 수용체를 상기 자극된 조성물 내로 도입하여 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물을 생성하는 단계를 포함하는, 조작된 세포의 조성물의 생산방법.
  2. 제1항에 있어서, 조작된 세포를 추가 인큐베이션하는 단계를 포함하고, 상기 인큐베이션은 mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재를 포함하여 출력 조성물을 생산하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 추가 인큐베이션은 하나 이상의 재조합 사이토카인이 존재 하에 수행되는, 방법.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 추가 인큐베이션은 상기 조성물에서 세포의 증식 또는 팽창을 야기하기 위한 조건 하에 배양을 포함하는, 방법.
  5. mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에, 재조합 수용체로 조작된 T 세포를 포함하는 농축된 1차 인간 T 세포를 포함하는 조작된 세포 조성물을 배양하는 단계를 포함하고;
    상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 2-(3-하이드록시페닐)-9-(2-이소프로필페닐)-8-옥소-8,9-디하이드로-7H-퓨린-6-카보사마이드[2-(3-hydroxyphenyl)-9-(2-isopropylphenyl)-8-oxo-8,9-dihydro-7H-purine-6-carboxamide](화합물 63), 6-(4-(2H-1,2,4-트리아졸-3-일)페닐)-1-(2-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)에틸)-1H-이미다조[4,5-b]피라진-2(3H)-온[6-(4-(2H-1,2,4-Triazol-3-yl)phenyl)-1-(2-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)ethyl)-1H-imidazo [4,5-b]pyrazine-2(3H)-one] (화합물 155), 또는 7-(6-(2-하이드록시프로판-2-일)피리딘-3-일)-1-((1r,4r)-4-메톡시사이클로헥실)-3,4-디하이드로피라지노[2,3-b]피라진-2(1H)-온[7-(6-(2-hydroxypropan-2-yl)pyridin-3-yl)-1-((1r,4r)-4-methoxycyclohexyl)-3,4-dihydropyrazino[2,3-b]pyrazin-2(1H)-one](화합물 246)로부터 선택된 것이며;
    상기 방법은 상기 조성물에서 세포의 증식 또는 팽창을 야기하여 조작된 T 세포를 포함하는 출력 조성물을 생산하는, 조작된 세포의 조성물의 생산방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 배양 전에,
    (a) 자극 조건 하에, mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에 1차 T 세포를 포함하는 입력 조성물을 인큐베이션하고; 상기 자극 조건은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극제의 존재를 포함하여 자극된 조성물을 생성하며; 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 63, 화합물 155, 또는 화합물 246인 단계; 및
    (b) 재조합 수용체를 상기 자극된 조성물 내로 도입하여 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물을 생성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  7. mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에, 재조합 수용체로 조작된 세포를 포함하는 1차 인간 T 세포를 포함하는 조작된 세포 조성물을 배양하는 단계를 포함하고, 상기 조성물에서 세포는 배양되기 전에 상기 작용제에 노출되지 않았으며;
    상기 방법은 상기 조성물에서 세포의 증식 또는 팽창을 야기하여 조작된 T 세포를 포함하는 출력 조성물을 생산하는, 조작된 세포의 조성물의 생산방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 T 세포는 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포인, 방법.
  9. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는, 방법.
  10. 제5항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 농축된 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
  11. mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재 하에, 재조합 수용체로 조작된 T 세포를 포함하는 농축된 CD4+ 또는 농축된 CD8+ 1차 인간 T 세포를 포함하는 조작된 세포 조성물을 배양하는 단계를 포함하고;
    상기 방법은 상기 조성물에서 세포의 증식 또는 팽창을 야기하여 조작된 농축된 CD4+ 또는 농축된 CD8+ T 세포를 포함하는 출력 조성물을 생산하는, 조작된 세포의 조성물의 생산방법.
  12. 제5항 내지 제9항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 70% 초과 또는 약 70% 초과, 75% 초과 또는 약 75% 초과, 80% 초과 또는 약 80% 초과, 85% 초과 또는 약 85% 초과, 90% 초과 또는 약 90% 초과, 95% 초과 또는 약 95% 초과 또는 98% 초과 또는 약 98% 초과의 CD4+ 1차 인간 T 세포를 포함하고; 및/또는
    상기 입력 조성물은 본질적으로 CD4+ 1차 인간 T 세포로 구성되는, 방법.
  13. 제5항 내지 제8항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 T 세포 조성물은 70% 초과 또는 약 70% 초과, 75% 초과 또는 약 75% 초과, 80% 초과 또는 약 80% 초과, 85% 초과 또는 약 85% 초과, 90% 초과 또는 약 90% 초과, 95% 초과 또는 약 95% 초과 또는 98% 초과 또는 약 98% 초과의 CD8+ 1차 인간 T 세포를 포함하고; 및/또는
    상기 입력 조성물은 본질적으로 CD8+ 1차 인간 T 세포로 구성되는, 방법.
  14. 제5항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양은 하나 이상의 재조합 사이토카인의 존재 하에 수행되는, 방법.
  15. 제3항, 제4항 또는 제8항에 있어서, 상기 하나 이상의 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-12, IL-15, G-CSF, 및 GM-CSF의 하나 이상을 포함하고, 선택적으로, 상기 하나 이상의 재조합 사이토카인은 IL-2, IL-7 또는 IL-15의 하나 이상을 포함하는, 방법.
  16. 제5항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양 전에,
    (a) 자극 조건 하에, 1차 T 세포를 포함하는 입력 조성물을 인큐베이션하고, 상기 자극 조건은 TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극제의 존재를 포함하여 자극된 조성물을 생성하는 단계; 및
    (b) 재조합 수용체를 상기 자극된 조성물 내로 도입하여 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제1항 내지 제4항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 1차 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
  18. 제1항 내지 제4항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 농축된 CD4+ T 세포를 포함하는, 방법.
  19. 제1항 내지 제4항, 제16항 및 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 농축된 CD8+ T 세포를 포함하는, 방법.
  20. (a) 자극 조건 하에, CD4+ 또는 CD8+ 1차 인간 T 세포를 위해 농축된 T 세포를 포함하는 입력 조성물을 인큐베이션하고, 상기 자극 조건은 (i) TCR 복합체의 하나 이상의 성분의 하나 이상의 세포내 신호 도메인 및/또는 하나 이상의 공동자극 분자의 하나 이상의 세포내 신호 도메인을 활성화시킬 수 있는 자극제 및 (ⅱ) mTOR 활성을 억제하는 작용제의 존재를 포함하는 단계; 및
    (b) 재조합 수용체를 상기 자극된 조성물 내로 도입하여 조작된 T 세포를 포함하는 조작된 조성물을 생성하는 단계를 포함하는, 조작된 세포의 조성물의 생산방법.
  21. 제1항 내지 제4항, 제16항 내지 제18항 및 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 70% 초과 또는 약 70% 초과, 75% 초과 또는 약 75% 초과, 80% 초과 또는 약 80% 초과, 85% 초과 또는 약 85% 초과, 90% 초과 또는 약 90% 초과, 95% 초과 또는 약 95% 초과 또는 98% 초과 또는 약 98% 초과의 CD4+ 1차 인간 T 세포를 포함하고; 및/또는
    상기 입력 조성물은 본질적으로 CD4+ 1차 인간 T 세포로 구성되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제4항, 제16항 및 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입력 조성물, 상기 자극된 조성물, 및/또는 상기 조작된 조성물은 70% 초과 또는 약 70% 초과, 75% 초과 또는 약 75% 초과, 80% 초과 또는 약 80% 초과, 85% 초과 또는 약 85% 초과, 90% 초과 또는 약 90% 초과, 95% 초과 또는 약 95% 초과 또는 98% 초과 또는 약 98% 초과의 CD8+ 1차 인간 T 세포를 포함하고; 및/또는
    상기 입력 조성물은 본질적으로 CD8+ 1차 인간 T 세포로 구성되는, 방법.
  23. 제7항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물, 작은 분자, 작은 유기 분자, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, siRNA, 또는 폴리펩타이드인, 방법.
  24. 제7항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 및/또는 mTORC2 키나아제 활성을 억제하는, 방법.
  25. 제7항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 적어도 하나의 추가 키나아제의 활성을 억제하는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가 키나아제는 PI3K인, 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 BEZ235, BGT226, GDC0980, NVP-BEZ235, PF-04691502, PI-103, SAR245409, SF1126, VS5584, 또는 XL765인, 방법.
  28. 제7항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는:
    (i) PI3K 활성을 억제하지 않고;
    (ⅱ) mTOR 활성을 위한 IC50에서 PI3K 활성을 검출가능하게 억제하지 않으며; 및/또는
    (ⅲ) mTOR 활성을 검출가능하게 억제하는 모든 농도에서 PI3K를 검출가능하게 억제하지 않는, 방법.
  29. 제7항 내지 제27항 또는 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 및/또는 mTORC2 키나아제 활성을 억제하는, 방법.
  30. 제7항 내지 제27항, 제28항 또는 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 피라졸로피리미딘(pyrazolopyrimidine), 토린 l(Torin l), 토르키닙(Torkinib), PP30, Ku-0063794, WAY-600(Wyeth), WAY-687(Wyeth), WAY-354 (Wyeth), OSI-027, DS3078a, AZD8055인, 방법.
  31. 제7항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 mTORC1 활성을 선택적으로 억제하는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는:
    (i) mTORC2 활성을 억제하지 않고;
    (ⅱ) mTORC1 활성을 위한 IC50에서 mTORC2 활성을 검출가능하게 억제하지 않으며; 및/또는
    (ⅲ) mTORC1 활성을 검출가능하게 억제하는 모든 농도에서 mTORC2를 검출가능하게 억제하지 않는, 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 라파마이신(rapamycin), 템시로리무스(temsirolimus), 에베로리무스(everolimus), 데포로리무스(deforolimus), 또는 AZD8055인, 방법.
  34. 제7항 내지 제24항, 제28항 또는 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 하기 화학식 1로 표시되는 화학식을 포함하는, 방법:
    [화학식 1]
    Figure pct00028

    상기 R1은 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이고,
    R2는 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이며,
    R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 C1-8 알킬이다.
  35. 제34항에 있어서, 상기 R1은 치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 예컨대, 치환된 페닐인, 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 R2는 치환된 또는 비치환된 아릴, 및/또는 치환된 또는 비치환된 페닐인, 방법.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치환된 기는 하나 이상의 할로겐; C1-8 알킬; C2-8 알케닐; C2-8 알키닐; 하이드록시; C1-8 알콕시; 아미노; 나이트로; 티올; 티오에테르; 이민; 사이아노; 아마이도; 포스포나토; 포스핀; 카르복시; 티오카르보닐; 설포닐; 설폰아마이드; 케톤; 알데하이드; 에스테르; 카르보닐; 할로알킬; B(OH)2; 카르보사이클릭 사이클로알킬, 헤테로사이클로알킬, 모노사이클릭 또는 융합된 또는 비-융합된 폴리사이클릭 아릴 또는 헤테로아릴; 아미노; O-저급 알킬; O-아릴, 아릴; 아릴-저급 알킬; CO2CH3; CONH2; OCH2CONH2; NH2; SO2NH2; OCHF2; CF3; 또는 OCF3 기로 치환된, 방법.
  38. 제7항 내지 제24항, 제28항 또는 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 2-(3-하이드록시페닐)-9-(2-이소프로필페닐)-8-옥소-8,9-디하이드로-7H-퓨린-6-카보사마이드[2-(3-hydroxyphenyl)-9-(2-isopropylphenyl)-8-oxo-8,9-dihydro-7H-purine-6-carboxamide](화합물 63)인, 방법,
  39. 제7항 내지 제24항, 제28항 또는 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 하기 화학식 2로 표시되는 화학식을 포함하는, 방법:
    [화학식 2]
    Figure pct00029

    상기 L는 직접 결합, NH 또는 O이고,
    Y는 N 또는 CR3이고,
    상기 R1은 H, 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 C2-8 알케닐, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이고,
    R2는 H, 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이고,
    R3는 H, 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬, -NHR4　또는 -N(R4)2이며,
    R4는 각각의 경우 독립적으로 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이다.
  40. 제39항에 있어서, 상기 R1은 치환된 아릴, 및/또는 치환된 페닐인, 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 Y는 CH인, 방법.
  42. 제39항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 L은 직접 결합인, 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R1은 치환된 아릴이고, R2는 알콕시, 아미노, 하이드록시, 사이클로알킬, 또는 헤테로사이클로알킬로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 C1-8 알킬인, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 R2는 헤테로사이클로알킬로 치환된 C1-8 알킬인, 방법.
  45. 제1항 내지 제19항, 제23항, 제24항, 또는 제34항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 155인, 방법.
  46. 제7항 내지 제24항, 제28항, 또는 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 작용제는 하기 화학식 3으로 표시되는 화학식을 포함하는, 방법:
    [화학식 3]
    Figure pct00030

    상기 R1은 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 아릴, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭, 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클로알킬이고,
    R2는 H, 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릭알킬, 치환된 또는 비치환된 아랄킬, 또는 치환된 또는 비치환된 사이클로알킬알킬이며,
    R3는 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬이다.
  47. 제46항에 있어서, 상기 R1은 치환된 또는 비치환된 아릴 또는 치환된 또는 비치환된 헤테로아릴인, 방법.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 R1은 치환된 피리딜인, 방법.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느한 항에 있어서, 상기 R1은 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 치환된 또는 비치환된 헤테로사이클릴, 할로겐, 아미노카르보닐, 사이아노, 하이드록시알킬, -OR 및 -NR2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 치환된 피리딜이고, 상기 각각의 R은 독립적으로 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-4 알킬인, 방법. 일부 구현예에서, R1은 1H-피롤로[2,3-b]피리딜 또는 벤즈이미다졸릴이고, 선택적으로, 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬, 및 -NR2로 이루어진 군으로부터 독림적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 치환되고, 상기 R은 독립적으로 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-4 알킬이다.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R1은
    Figure pct00031
    이고,
    상기 R은 각각의 경우 독립적으로 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-4 알킬(예컨대, 메틸)이고; R1은 각각의 경우 독립적으로 치환된 또는 비치환된 C1-4 알킬, 할로겐, 사이아노, -OR, 또는 -NR2이고; m은 0-3이며; n은 0-3이다.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R2는 각각 선택적으로 치환된 H, 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, n-펜틸, 이소펜틸, 사이클로펜틸, 사이클로헥실, 테트라하이드로퓨라닐, 테트라하이드로피라닐, (C1-4 알킬)-페닐, (C1-4 알킬)-사이클로프로필, (C1-4 알킬)-사이클로부틸, (C1-4 알킬)-사이클로펜틸, (C1-4 알킬)-사이클로헥실, (C1-4 알킬)-피롤리딜, (C1-4 알킬)-피페리딜, (C1-4 알킬)-피페라지닐, (C1-4 알킬)-모르폴린일, (C1-4 알킬)-테트라하이드로퓨라닐, 또는 (C1-4 알킬)-테트라하이드로피라닐인, 방법.
  52. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 R2는 H, C1-4 알킬, (C1-4 알킬)(OR),
    Figure pct00032
    이고,
    상기 R은 각각의 경우 독립적으로 H, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬이고, R'은 각각의 경우 독립적으로 H, -OR, 사이아노, 또는 치환된 또는 비치환된 C1-8 알킬이며, p는 0-3이다.
  53. 제7항 내지 제24항, 제28항, 또는 제29항, 또는 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 7-(6-(2-하이드록시프로판-2-일)피리딘-3-일)-1-((1r,4r)-4-메톡시사이클로헥실)-3,4-디하이드로피라지노[2,3-b]피라진-2(1H)-온[7-(6-(2-hydroxypropan-2-yl)pyridin-3-yl)-1-((1r,4r)-4-methoxycyclohexyl)-3,4-dihydropyrazino[2,3-b]pyrazin-2(1H)-one](화합물 246)인, 방법.
  54. 제5항 내지 제6항 및 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 63이고, 상기 조작된 세포 조성물은 화합물 63의 500 nM 내지 2 μM, 1 nM 내지 100 nM, 50 nM 내지 250 nM, 또는 100 nM 내지 500 nM 의 존재 하에 배양되는, 방법.
  55. 제1항 내지 제4항 및 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 63이고, 상기 조작된 세포 조성물은 화합물 63의 500 nM 내지 2 μM, 1 nM 내지 100 nM, 50 nM 내지 250 nM, 또는 100 nM 내지 500 nM 의 존재 하에 인큐베이션되는, 방법.
  56. 제1항 내지 제4항 및 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 155이고, 상기 조작된 세포 조성물은 화합물 155의 500 nM 내지 2 μM, 1 nM 내지 100 nM, 50 nM 내지 250 nM, 또는 100 nM 내지 500 nM 의 존재 하에 인큐베이션되는, 방법.
  57. 제5항 내지 제6항 및 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 155이고, 상기 조작된 세포 조성물은 화합물 155의 500 nM 내지 2 μM, 1 nM 내지 100 nM, 50 nM 내지 250 nM, 또는 100 nM 내지 500 nM 의 존재 하에 배양되는, 방법.
  58. 제1항 내지 제4항 및 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 246이고, 상기 조작된 세포 조성물은 화합물 246의 500 nM 내지 2 μM, 1 nM 내지 100 nM, 50 nM 내지 250 nM, 또는 100 nM 내지 500 nM 의 존재 하에 인큐베이션되는, 방법.
  59. 제5항 내지 제6항 및 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mTOR 활성을 억제하는 작용제는 화합물 246이고, 상기 조작된 세포 조성물은 화합물 246의 500 nM 내지 2 μM, 1 nM 내지 100 nM, 50 nM 내지 250 nM, 또는 100 nM 내지 500 nM 의 존재 하에 배양되는, 방법.
  60. 제1항 내지 제4항 및 제16항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 자극제는 TCR 복합체의 구성원에 특이적으로 결합하는, 선택적으로, CD3에 특이적으로 결합하는 1차 작용제를 포함하는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 자극제는 T 세포 공동자극 분자에 특이적으로 결합하는 2차 작용제를 추가로 포함하고, 선택적으로, 상기 공동자극 분자는 CD28, CD137(4-1-BB), OX40 또는 ICOS로부터 선택되는, 방법.
  62. 제60항 또는 제61항에 있어서, 상기 1차 및/또는 2차 작용제는 항체를 포함하고, 선택적으로, 상기 자극제는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 또는 그의 항원-결합 단편과의 인큐베이션을 포함하는, 방법.
  63. 제59항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 작용제 및/또는 2차 작용제는 고체 지지체의 표면 상에 존재하고, 선택적으로, 상기 고체 지지체는 비드이거나 이를 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 비드는 3.5 ㎛ 또는 약 3.5 ㎛ 초과하나 약 9 ㎛ 이하 또는 약 8 ㎛ 이하 또는 약 7 ㎛ 이하 또는 약 6 μm 이하 또는 약 5 μm 이하의 직경을 포함하는, 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, 상기 비드는 4.5㎛ 또는 약 4.5㎛의 직경을 포함하는, 방법.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비드는 불활성인, 방법.
  67. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비드는 폴리스티렌 표면이거나 이를 포함하는, 방법.
  68. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비드는 자성 또는 초상자성인, 방법.
  69. 제63항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포에 대한 비드의 비는 4:1 내지 0.25:1 또는 약 4:1 내지 0.25:1인, 방법.
  70. 제1항 내지 제4항 및 제16항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 도입은 자극된 조성물의 세포를 재조합 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 바이러스 벡터로 형질도입시키는 것을 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터인, 방법.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터 또는 감마레트로바이러스 벡터인, 방법.
  73. 제2항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 출력 조성물의 세포를 수집하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  74. 제2항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적으로, 약학적으로 허용가능한 부형제의 존재 하에, 냉동보존 및/또는 개체에 투여하기 위한 출력 조성물의 세포를 제형화하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  75. 제74항에 있어서, 상기 출력 조성물의 세포는 동결방지제의 존재 하에 제형화되는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 상기 동결방지제는 DMSO를 포함하는, 방법.
  77. 제74항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 출력 조성물의 세포는 용기, 선택적으로 바이알 또는 백에서 제형화되는, 방법.
  78. 제1항 내지 제4항 및 제16항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인큐베이션 전에, 생물학적 샘플로부터 상기 CD4+ 및/또는 상기 CD8+ T 세포를 분리하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 분리는 선택적으로, 양성 또는 음성 선택에 의해, CD4 및/또는 CD8의 표면 발현에 기반한 세포 선택을 포함하는, 방법.
  80. 제78항 또는 제79항에 있어서, 상기 분리는 면역친화성-기반 선택 수행을 포함하는, 방법.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 개체로부터 획득된 1차 T 세포를 포함하는, 방법.
  82. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 전혈 샘플, 버피 코트 샘플, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 샘플, 미분획화된 T 세포 샘플, 림프구 샘플, 백혈구 샘플, 혈액성분채집술(apheresis) 생성물, 또는 백혈구성분채집술(leukapheresis) 생성물이거나 이를 포함하는, 방법.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 수용체는 질환, 장애 또는 상태의 세포 또는 조직과 관련된, 이에 특이적인, 및/또는 상에 발현된 표적 항원에 결합할 수 있는, 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 질환, 장애 또는 상태는 감염성 질환 또는 장애, 자가면역 질환, 염증성 질환 또는 종양 또는 암인, 방법.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, 상기 표적 항원은 종양 항원인, 방법.
  86. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 항원은 5T4, 8H9, avb6 인터그린, B7-H6, B 세포 성숙 항원(BCMA), CA9, 암-고환 항원, 탄산탈수효소 9(CAIX), CCL-1, CD19, CD20, CD22, CEA, B형 간염 표면 항원, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD138, CD171, 암태아성 항원(CEA), CE7, 사이클린, 사이클린 A2, c-Met, 이중 항원, EGFR, 상피 당단백 2 (EPG-2), 상피 당단백 40(EPG-40), EPHa2, 에프린 B2, erb-B2, erb-B3, erb-B4, erbB 다이머, EGFR vIII, 에스트로겐 수용체, 태아성 AchR, 폴레이트 수용체 알파, 폴레이트 결합 단백질(FBP), FCRL5, FCRH5, 태아성 아세틸콜린 수용체, G250/CAIX, GD2, GD3, G 단백질 결합된 수용체 5D(GPRC5D), gp100, Her2/neu(수용체 티로신 키나아제 erbB2), HMW-MAA, IL-22R-알파, IL-13 수용체 알파 2 (IL-13Ra2), 키나아제 삽입 도메인 수용체(kdr), 카파 경쇄, 루이스 Y, L1-세포 부착 분자(L1-CAM), 멜라노마-연관 항원(MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MART-1, 메소텔린, 뮤린 CMV, 뮤신 1 (MUC1), MUC16, NCAM, NKG2D, NKG2D 리간드, NY-ESO-1, O-아세틸화된 GD2(OGD2), 종양태아성 항원, 멜라노마의 우선 발현된 항원(PRAME), PSCA, 프로게스테론 수용체, 서바이빈, ROR1, TAG72, tEGFR, VEGF 수용체, VEGF-R2, 윌름스 종양1(WT-1), 병소-특이적 항원 및 유니버셜 태그로 연관된 항원으로부터 선택된, 방법.
  87. 제1항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 수용체는 기능성 비-TCR 항원 수용체 또는 TCR 또는 그의 항원-결합 단편이거나 이를 포함하는, 방법.
  88. 제1항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 수용체는 키메릭 항원 수용체(CAR)인, 방법.
  89. 제1항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 수용체는 항- CD19 CAR인, 방법.
  90. 제89항에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 항원-결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인 및 세포내 신호 도메인을 포함하는 세포내 신호 영역을 포함하는, 방법.
  91. 제90항에 있어서, 상기 항원-결합 도메인은 항체 또는 그의 항체 단편이거나 이를 포함하고, 이는 선택적으로 단일 사슬 단편인, 방법.
  92. 제91항에 있어서, 상기 단편은 플렉서블 링커에 의해 연결된 항체 가변 영역을 포함하는, 방법.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 상기 단편은 scFv를 포함하는, 방법.
  94. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 세포외 도메인 및 세포내 신호 영역 사이 막관통 도메인을 추가로 포함하는, 방법.
  95. 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체는 항원-결합 도메인 및 막관통 도메인 사이에 스페이서를 추가로 포함하고, 선택적으로, 상기 스페이서는 면역글로불린 불변 영역의 부분이고, 선택적으로, 상기 부분은 힌지 영역이거나 이를 포함하는, 방법.
  96. 제90항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호 도메인은 1차 신호 도메인, T 세포에서 1차 활성화 신호를 유도할 수 있는 신호 도메인, T 세포 수용체(TCR) 성분의 신호 도메인, 및/또는 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프(ITAM)을 포함하는 신호 도메인이거나 이를 포함하는, 방법.
  97. 제96항에 있어서, 상기 세포내 신호 도메인은 CD3 사슬, 선택적으로, CD3-제타(CD3ζ) 사슬의 세포내 신호 도메인 또는 그의 신호 부분이거나 이를 포함하는, 방법.
  98. 제90항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포내 신호 영역은 공동자극 신호 영역을 추가로 포함하는, 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 공동자극 신호 영역은 T 세포 공동자극 분자의 세포내 신호 도메인 또는 그의 신호 부분을 포함하는, 방법.
  100. 제98항 또는 제99항에 있어서, 상기 공동자극 신호 영역은 CD28, 4-1BB 또는 ICOS의 세포내 신호 도메인 또는 그의 신호 부분을 포함하는, 방법.
  101. 제98항 내지 제100항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 공동자극 신호 영역은 막관통 도메인 및 세포내 신호 영역 사이인, 방법.
  102. 제1항 내지 제4항 및 제15항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 T 세포는 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 별도 조성물을 포함하고, 상기 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 별도로 인큐베이션되는, 방법.
  103. 제5항 내지 제16항 및 제23항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1차 T 세포는 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 별도 조성물을 포함하고, 상기 농축된 CD4+ T 세포 및 농축된 CD8+ T 세포의 조성물은 별도로 배양되는, 방법.
  104. 제1항 내지 제103항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 조작된 세포를 포함하는 조성물.
  105. 제104항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 조성물.
  106. 제104 항 또는 제105항에 있어서, 동결방지제, 선택적으로 DMSO를 포함하는, 조성물.
  107. 제104 항 내지 제106항 중 어느 한 항의 조성물, 및 상기 출력 조성물을 개체에 투여하기 위한 지시를 포함하는, 제조 물품.
  108. 제107 항에 있어서, 상기 개체는 질환 또는 상태를 가지고, 선택적으로, 상기 재조합 수용체는 질환 또는 상태와 관련되거나, 이의 세포 상에 발현되거나 제시되는 항원을 특이적으로 인식하거나 특이적으로 결합하는, 제조 물품.
  109. 제107항 또는 제108항에 있어서, 상기 출력 조성물은 CD4+ T 세포의 조작된 조성물인, 제조 물품.
  110. 제107항 또는 제108항에 있어서, 상기 출력 조성물은 CD8+ T 세포의 조작된 조성물인, 제조 물품.
  111. 제107항 또는 제108항에 있어서, 상기 출력 조성물은 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 조작된 조성물인, 제조 물품.
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