JP2021501607A - Ｔ細胞組成物を作製するための方法 - Google Patents

Ｔ細胞組成物を作製するための方法 Download PDF

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Abstract

例えば細胞療法において使用するための、組換え受容体を発現する操作されたT細胞を作製するための方法が本明細書において提供される。いくつかの局面において、提供される方法は、刺激条件下で細胞をインキュベートするための、形質導入もしくはトランスフェクションを通じて組換えポリペプチドを細胞に導入するための、ならびに/または増殖および/もしくは拡大を促進する条件下で細胞を培養するための1つまたは複数の工程を含み、この方法において、1つまたは複数の工程は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（mTOR）活性を阻害する作用物質の存在下で実施される。いくつかの局面において、培養は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（mTOR）活性を阻害する作用物質の存在下で行われる。いくつかの局面において、提供される方法は、インビボで改善された持続能力および/または抗腫瘍活性を有する遺伝子操作されたT細胞を作製する。

Description

関連出願の相互参照
本願は、2018年7月28日に出願された米国仮特許出願第62/711,494号、2018年7月17日に出願された米国仮特許出願第62/699,709号、2017年11月10日に出願された米国仮特許出願第62/584,687号および2017年11月1日に出願された米国仮特許出願第62/580,435号に基づく優先権を主張し、それらの内容の全体を参照により組み入れる。
配列表の参照による組み入れ
本願は電子形式の配列表とともに出願される。配列表は、2018年11月1日に作成された735042013440SeqList.txtという名称のファイルとして提供され、そのサイズは57,098バイトである。電子形式の配列表内の情報は、その全体が参照により組み入れられる。
分野
本開示は、例えば細胞療法において使用するための、組換え受容体を発現する操作されたT細胞を作製するための方法を提供する。いくつかの局面において、提供される方法は、刺激条件下で細胞をインキュベートするための、形質導入もしくはトランスフェクションを通じて組換えポリペプチドを細胞に導入するための、ならびに/または増殖および/もしくは拡大（expansion）を促進する条件下で細胞を培養するための1つまたは複数の工程を含み、1つまたは複数の工程は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（mTOR）活性を阻害する作用物質の存在下で実施される。いくつかの局面において、培養は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（mTOR）活性を阻害する作用物質の存在下で行われる。いくつかの局面において、提供される方法は、インビボで改善された持続能力および/または抗腫瘍活性を有する遺伝子操作されたT細胞を作製する。
背景
疾患および病態を処置するために、様々な細胞療法が利用可能である。細胞療法に属するのは、キメラ抗原受容体などの組換え受容体で遺伝子操作されたT細胞などの免疫細胞を伴う方法である。より効率的なプロセスおよび/または改善された細胞組成物生成物を供与するなどのために、このような細胞療法を製造および/または操作するための改善された方法が必要とされている。このような要望を満たす、操作された細胞を作製するための方法、操作された細胞、組成物、キットおよび製造品ならびに処置方法が提供される。
概要
操作された細胞の組成物を作製するための方法であって、組換え受容体を用いて操作された細胞を含む初代ヒトT細胞を含む操作された細胞の組成物を、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で培養する工程であって、前記組成物中の細胞が、培養される前に、前記作用物質に曝露されていない前記工程を含み、かつ、操作されたT細胞を含むアウトプット組成物を作製するために、前記組成物中の細胞の増殖または拡大をもたらす、前記方法が本明細書において提供される。提供される方法のいずれかの特定の態様において、初代T細胞は、CD4＋および/またはCD8＋T細胞である。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、操作されたT細胞の組成物は、濃縮されたCD4＋T細胞を含む。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、操作されたT細胞の組成物は、濃縮されたCD8＋T細胞を含む。
操作された細胞の組成物を作製するための方法が、本明細書において提供され、この方法は、組換え受容体を用いて操作されたT細胞を含む濃縮されたCD4＋および/または濃縮されたCD8＋初代ヒトT細胞を含む操作された細胞の組成物を、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で培養する工程を含み、操作された、濃縮されたCD4＋および/または濃縮されたCD8＋T細胞を含むアウトプット組成物を作製するために、前記組成物中の細胞の増殖または拡大をもたらす。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、操作されたT細胞の組成物は、70％を上回るもしくは約70％を上回る、75％を上回るもしくは約75％を上回る、80％を上回るもしくは約80％を上回る、85％を上回るもしくは約85％を上回る、90％を上回るもしくは約90％を上回る、95％を上回るもしくは約95％を上回る、もしくは98％を上回るもしくは約98％を上回るCD4＋初代ヒトT細胞を含み、かつ/またはインプット組成物は、CD4＋初代ヒトT細胞から本質的になる。提供される方法のいずれかの特定の態様において、操作されたT細胞の組成物は、70％を上回るもしくは約70％を上回る、75％を上回るもしくは約75％を上回る、80％を上回るもしくは約80％を上回る、85％を上回るもしくは約85％を上回る、90％を上回るもしくは約90％を上回る、95％を上回るもしくは約95％を上回る、もしくは98％を上回るもしくは約98％を上回るCD8＋初代ヒトT細胞を含み、かつ/またはインプット組成物は、CD8＋初代ヒトT細胞から本質的になる。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、操作されたT細胞の組成物は、70％を上回るもしくは約70％を上回る、75％を上回るもしくは約75％を上回る、80％を上回るもしくは約80％を上回る、85％を上回るもしくは約85％を上回る、90％を上回るもしくは約90％を上回る、95％を上回るもしくは約95％を上回る、もしくは98％を上回るもしくは約98％を上回るCD4＋およびCD8＋初代ヒトT細胞を含み、ならびに/またはインプット組成物は、CD4＋およびCD8＋初代ヒトT細胞から本質的になる。
提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、培養することは、1種または複数種のサイトカインの存在下で実施される。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、1種または複数種のサイトカインは、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、G-CSFおよびGM-CSFの1種または複数種を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様において、1種または複数種のサイトカインは、組換えサイトカインである。
提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、培養する工程の前に、該方法は、（a）刺激条件下で、初代T細胞を含むインプット組成物をインキュベートする工程であって、前記刺激条件が、TCR複合体の1種もしくは複数種の成分の1種もしくは複数種の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/または1種もしくは複数種の共刺激分子の1種もしくは複数種の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能な刺激性試薬の存在を含み、これにより、刺激された組成物を生成する、前記工程、ならびに（b）前記刺激された組成物中に組換え受容体を導入し、これにより、操作されたT細胞を含む操作された組成物を生成する工程、をさらに含む。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、インプット組成物、刺激された組成物および/または操作された組成物は、初代CD4＋および/またはCD8＋T細胞を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様において、インプット組成物、刺激された組成物および/または操作された組成物は濃縮されたCD4＋T細胞を含む。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、インプット組成物、刺激された組成物および/または操作された組成物は濃縮されたCD8＋T細胞を含む。
操作された細胞の組成物を作製するための方法であって、以下の工程を含む方法が、本明細書において提供される：（a）CD4＋および/またはCD8＋初代ヒトT細胞に関して濃縮されたT細胞を含むインプット組成物を、刺激条件下でインキュベートする工程であって、前記刺激条件が、（i）TCR複合体の1種もしくは複数種の成分の1種もしくは複数種の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/または1種もしくは複数種の共刺激分子の1種もしくは複数種の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能な刺激性試薬ならびに（ii）mTOR活性を阻害する作用物質の存在を含む、前記工程、ならびに（b）前記刺激された組成物中に組換え受容体を導入し、これにより、操作されたT細胞を含む操作された組成物を生成する工程。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、インプット組成物、刺激された組成物および/または操作された組成物は、70％を上回るもしくは約70％を上回る、75％を上回るもしくは約75％を上回る、80％を上回るもしくは約80％を上回る、85％を上回るもしくは約85％を上回る、90％を上回るもしくは約90％を上回る、95％を上回るもしくは約95％を上回る、もしくは98％を上回るもしくは約98％を上回るCD4＋初代ヒトT細胞を含み、かつ/またはインプット組成物は、CD4＋初代ヒトT細胞から本質的になる。提供される方法のいずれかの特定の態様において、インプット組成物、刺激された組成物および/または操作された組成物は、70％を上回るもしくは約70％を上回る、75％を上回るもしくは約75％を上回る、80％を上回るもしくは約80％を上回る、85％を上回るもしくは約85％を上回る、90％を上回るもしくは約90％を上回る、95％を上回るもしくは約95％を上回る、もしくは98％を上回るもしくは約98％を上回るCD8＋初代ヒトT細胞を含み、かつ/またはインプット組成物は、CD8＋初代ヒトT細胞から本質的になる。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、インプット組成物、刺激された組成物および/または操作された組成物は、70％を上回るもしくは約70％を上回る、75％を上回るもしくは約75％を上回る、80％を上回るもしくは約80％を上回る、85％を上回るもしくは約85％を上回る、90％を上回るもしくは約90％を上回る、95％を上回るもしくは約95％を上回る、もしくは98％を上回るもしくは約98％を上回るCD4＋およびCD8＋初代ヒトT細胞を含み、ならびに/またはインプット組成物は、CD4＋およびCD8＋初代ヒトT細胞から本質的になる。
提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、小分子、小有機分子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、siRNAまたはポリペプチドである。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は小有機分子である。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1および/またはmTORC2キナーゼ活性を阻害する。提供される方法のいずれかの特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、少なくとも1つのさらなるキナーゼの活性を阻害する。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、少なくとも1つのさらなるキナーゼはPI3Kである。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、BEZ235、BGT226、GDC0980、NVP-BEZ235、PF-04691502、PI-103、SAR245409、SF1126、VS5584またはXL765である。
提供される方法のいずれかの特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、（i）PI3K活性を阻害しない、（ii）mTOR活性に対するIC50において、PI3K活性を検出可能に阻害しない、かつ/または（iii）mTOR活性を検出可能に阻害する全ての濃度において、PI3Kを検出可能に阻害しない。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1およびmTORC2キナーゼ活性を阻害する。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、ピラゾロピリミジン、トリンl、トルキニブ、PP30、Ku-0063794、WAY-600（Wyeth）、WAY-687（Wyeth）、WAY-354（Wyeth）、OSI-027、DS3078aまたはAZD8055である。提供される方法のいずれかの特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1活性を選択的に阻害する。
提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、（i）mTORC2活性を阻害しない、（ii）mTORC1活性に対するIC50において、mTORC2活性を検出可能に阻害しない、かつ/または（iii）mTORC1活性を検出可能に阻害する全ての濃度において、mTORC2を検出可能に阻害しない。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、デフォロリムスまたはAZD8055である。
提供される方法のいずれかの特定の態様において、作用物質は、式I
Figure 2021501607
に記載されている式を含み、
式中、R1は、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルであり、R2は、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルであり、かつR3およびR4は、独立に、HまたはC1〜8アルキルである。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、式（I）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物であり、または式（I）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を含む。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、式（I）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩であり、または式（I）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩を含む。
提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、R1は、置換されたアリール、置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、例えば置換されたフェニルである。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、R2は、置換されたもしくは置換されていないアリールおよび/または置換されたもしくは置換されていないフェニルである。いくつかの態様において、R2は、置換されたまたは置換されていないフェニルなどの、置換されたまたは置換されていないアリールである。提供される方法のいずれかの特定の態様において、置換されている基は、1つまたは複数の、ハロゲン;C1〜8アルキル;C2〜8アルケニル;C2〜8アルキニル;ヒドロキシル;C1〜8アルコキシル;アミノ;ニトロ;チオール;チオエーテル;イミン;シアノ;アミド;ホスホナート;ホスフィン;カルボキシル;チオカルボニル;スルホニル;スルホンアミド;ケトン;アルデヒド;エステル;カルボニル;ハロアルキル;B（OH）2;炭素環式シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、単環式もしくは縮合もしくは非縮合多環式アリールもしくはヘテロアリール;アミノ;O-低級アルキル;O-アリール、アリール;アリール-低級アルキル;CO2CH3;CONH2;OCH2CONH2;NH2;SO2NH2;OCHF2;CF3;またはOCF3基で置換されている。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は化合物63である。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、2-（3-ヒドロキシフェニル）-9-（2-イソプロピルフェニル）-8-オキソ-8,9-ジヒドロ-7H-プリン-6-カルボキサミドもしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物であり、または2-（3-ヒドロキシフェニル）-9-（2-イソプロピルフェニル）-8-オキソ-8,9-ジヒドロ-7H-プリン-6-カルボキサミドもしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、
Figure 2021501607
もしくは薬学的に許容されるその塩であるか、またはこれらを含む。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、作用物質は、式（II）
Figure 2021501607
に記載されている式を含み、
式中、Lは、直接の結合、NHまたはOであり、Yは、NまたはCR3であり、式中、R1は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないC2〜8アルケニル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルであり、R2は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルであり、R3は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキル、-NHR4または-N（R4）2であり、かつR4は、それぞれの出現において独立に、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルである。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、式（II）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物であり、または式（II）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を含む。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、式（II）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩であり、または式（II）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩を含む。
提供される方法のいずれかの特定の態様において、R1は、置換されたアリールおよび/または置換されたフェニルである。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、R1は、置換されたアリール、例えば置換されたフェニルである。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、YはCHである。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、Lは直接の結合である。提供される方法のいずれかの特定の態様において、R1は、置換されたアリールであり、R2は、アルコキシ、アミノ、ヒドロキシ、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換されたC1〜8アルキルである。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、R2は、ヘテロシクロアルキルの1つまたは複数で置換されたC1〜8アルキルである。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は化合物155である。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、6-（4-（2H-1,2,4-トリアゾル-3-イル）フェニル）-1-（2-（テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル）エチル）-1H-イミダゾ［4,5-b］ピラジン-2（3H）-オンもしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物であり、または6-（4-（2H-1,2,4-トリアゾル-3-イル）フェニル）-1-（2-（テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル）エチル）-1H-イミダゾ［4,5-b］ピラジン-2（3H）-オンもしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、
Figure 2021501607
もしくは薬学的に許容されるその塩であるか、またはこれらを含む。
提供される方法のいずれかの特定の態様において、作用物質は、式III
Figure 2021501607
に記載されている式を含み、
式中、R1は、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリルアルキルであり、R2は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリルアルキル、置換されたもしくは置換されていないアラルキル、または置換されたもしくは置換されていないシクロアルキルアルキルであり、かつR3は、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキルである。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、R1は、置換されたもしくは置換されていないアリール、または置換されたもしくは置換されていないヘテロアリールである。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、R1は、置換されたピリジルである。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、式（III）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物であり、または式（III）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を含む。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、式（III）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩であり、または式（III）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩を含む。
提供される方法のいずれかの特定の態様において、R1は、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリル（ハロゲン、アミノカルボニル、シアノ、ヒドロキシアルキル、-ORおよび-NR2からなる群より独立に選択される1つまたは複数の置換基で置換されたピリジルであり、ここで、各Rは、独立に、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキルである。一部の特定の態様において、R1は、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキルおよび-NR2からなる群より独立に選択される1つまたは複数の置換基で任意に置換された、1H-ピロロ［2,3-b］ピリジルまたはベンゾイミダゾリルであり、ここで、Rは、独立に、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキルである。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、R1は、
Figure 2021501607
であり、
式中、Rは、各出現において、独立に、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキル（例えば、メチル）であり;R1は、各出現において、独立に、置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキル、ハロゲン、シアノ、-ORまたは-NR2であり;mは0〜3であり;かつnは、0〜3である。
提供される方法のいずれかの特定の態様において、R2は、H、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、（C1〜4アルキル）-フェニル、（C1〜4アルキル）-シクロプロピル、（C1〜4アルキル）-シクロブチル、（C1〜4アルキル）-シクロペンチル、（C1〜4アルキル）-シクロヘキシル、（C1〜4アルキル）-ピロリジル、（C1〜4アルキル）-ピペリジル、（C1〜4アルキル）-ピペラジニル、（C1〜4アルキル）-モルホリニル、（C1〜4アルキル）-テトラヒドロフラニル、または（C1〜4アルキル）-テトラヒドロピラニルであり、それぞれが任意に置換されている。
提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、R2は、H、C1〜4アルキル、（C1〜4アルキル）（OR）、
Figure 2021501607
であり、
式中、Rは、各出現において、独立に、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキルであり;R'は、各出現において、独立に、H、-OR、シアノ、または置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキルであり、かつpは、0〜3である。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は化合物246である。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、7-（6-（2-ヒドロキシプロパン-2-イル）ピリジン-3-イル）-1-（（1r,4r）-4-メトキシシクロヘキシル）-3,4-ジヒドロピラジノ［2,3-b］ピラジン-2（1H）-オンもしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物であり、または7-（6-（2-ヒドロキシプロパン-2-イル）ピリジン-3-イル）-1-（（1r,4r）-4-メトキシシクロヘキシル）-3,4-ジヒドロピラジノ［2,3-b］ピラジン-2（1H）-オンもしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、
Figure 2021501607
もしくは薬学的に許容されるその塩であるか、またはこれらを含む。
操作された細胞の組成物を作製するための方法が、本明細書において提供され、この方法は、組換え受容体を用いて操作されたT細胞を含む濃縮された初代ヒトT細胞を含む操作された細胞の組成物を、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で培養する工程であって、mTOR活性を阻害する作用物質が化合物63、化合物155または化合物246である前記工程を含み、かつ、操作されたT細胞を含むアウトプット組成物を作製するために、前記組成物中の細胞の増殖または拡大をもたらす。
提供される方法のいずれかの特定の態様において、操作された細胞の組成物は、500nM〜2μM、1nM〜100nM、50nM〜250nMまたは100nM〜500nMの化合物63の存在下で培養される。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、操作された細胞の組成物は、500nM〜2μM、1nM〜100nM、50nM〜250nMまたは100nM〜500nMの化合物155の存在下で培養される。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、操作された細胞の組成物は、500nM〜2μM、1nM〜100nM、50nM〜250nMまたは100nM〜500nMの化合物246の存在下で培養される。
提供される方法のいずれかの特定の態様において、培養する工程の前に、前記方法は、以下の工程をさらに含む：（a）刺激条件下で、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下において初代T細胞を含むインプット組成物をインキュベートする工程であって、前記刺激条件が、TCR複合体の1つもしくは複数の成分の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン、および/または1つもしくは複数の共刺激分子の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能な刺激性試薬の存在を含み、これにより刺激された組成物を生成し、ならびにmTOR活性を阻害する作用物質が、化合物63、化合物155または化合物246である、前記工程、ならびに（b）前記刺激された組成物中に組換え受容体を導入し、これにより、操作されたT細胞を含む操作された組成物を生成する工程。
操作された細胞の組成物を作製するための方法が本明細書において提供され、この方法は、（a）初代ヒトT細胞を含むインプット組成物を、刺激条件下でインキュベートする工程であって、前記刺激条件が、（i）TCR複合体の1つもしくは複数の成分の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン、および/または1つもしくは複数の共刺激分子の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能な刺激性試薬、ならびに（ii）mTOR活性を阻害する作用物質、の存在を含み、mTOR活性を阻害する作用物質が化合物63、化合物155または化合物246である、前記工程、ならびに（b）前記刺激された組成物中に組換え受容体を導入し、これにより、操作されたT細胞を含む操作された組成物を生成する工程、を含む。いくつかの態様において、初代T細胞は、CD4＋および/またはCD8＋T細胞が濃縮されている。
提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、刺激性試薬は、TCR複合体の一員に特異的に結合し、任意に、CD3に特異的に結合する一次作用物質を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、刺激性試薬は、T細胞共刺激分子に特異的に結合する二次作用物質をさらに含み、任意に、共刺激分子は、CD28、CD137（4-1-BB）、OX40またはICOSから選択される。提供される方法のいずれかの特定の態様において、一次および/または二次作用物質は抗体を含み、任意に、刺激性試薬は、抗CD3抗体および抗CD28抗体またはこれらの抗原結合断片とのインキュベーションを含む。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、一次作用物質および/または二次作用物質は固体支持体の表面上に存在する。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、固体支持体はビーズであるかまたはビーズを含む。提供される方法のいずれかの特定の態様において、ビーズは、3.5μmを上回るまたは約3.5μmを上回るが、約9μm以下または約8μm以下または約7μm以下または約6μm以下または約5μm以下の直径を含む。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、ビーズは4.5μmの直径または約4.5μmの直径を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、ビーズは不活性である。提供される方法のいずれかの特定の態様において、ビーズは、ポリスチレン表面であるかまたはポリスチレン表面を含む。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、ビーズは磁性または超常磁性である。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、ビーズ対細胞の比は、4:1〜0.25:1または約4:1〜約0.25:1である。
提供される方法のいずれかの特定の態様において、導入は、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクター用いて、刺激された組成物の細胞に形質導入することを含む。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである。提供される方法のいずれかの特定の態様において、導入することは、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで、刺激された組成物の細胞をトランスフェクトすることを含む。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、ベクターは、トランスポゾンであり、任意に、眠れる美女（SB（Sleeping Beauty））トランスポゾンまたはピギーバック（Piggybac）トランスポゾンである。
提供される方法のいくつかの態様において、培養に引き続き、前記方法は、アウトプット組成物の細胞を収集する工程をさらに含む。提供される方法のいずれかの特定の態様は、凍結保存および/または対象への投与のために、任意に、薬学的に許容される賦形剤の存在下で、アウトプット組成物の細胞を製剤化することをさらに含む。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、凍結保護物質の存在下で製剤化される。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、凍結保護物質はDMSOを含む。提供される方法のいずれかの特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、容器、任意にバイアルまたはバッグ中に製剤化される。
提供される方法の一部の特定の態様は、インキュベートする工程の前に、CD4＋および/またはCD8＋T細胞を生物学的試料から単離する工程をさらに含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、単離することは、任意で陽性選択または陰性選択によって、CD4および/またはCD8の表面発現に基づいて細胞を選択することを含む。提供される方法のいずれかの特定の態様において、単離することは、免疫親和性ベースの選択を実施することを含む。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、生物学的試料は対象から得られた初代T細胞を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、生物学的試料は、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核球（PBMC）試料、未分画T細胞試料、リンパ球試料、白血球試料、アフェレーシス産物もしくは白血球アフェレーシス産物であるか、またはそれを含む。
提供される方法のいずれかの特定の態様において、組換え受容体は、疾患、障害もしくは病態の細胞もしくは組織に関連する、疾患、障害もしくは病態の細胞もしくは組織に特異的である、かつ/または疾患、障害もしくは病態の細胞もしくは組織上に発現される標的抗原に結合することが可能である。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、疾患、障害または病態は、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、標的抗原は腫瘍抗原である。
提供される方法のいずれかの特定の態様において、標的抗原は、5T4、8H9、avb6インテグリン、B7-H6、B細胞成熟抗原（BCMA）、CA9、がん精巣抗原、炭酸脱水酵素9（CAIX）、CCL-1、CD19、CD20、CD22、CEA、B型肝炎表面抗原、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、がん胎児性抗原（CEA）、CE7、サイクリン、サイクリンA2、c-Met、二重抗原、EGFR、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、EPHa2、エフリンB2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二量体、EGFR vIII、エストロゲン受容体、胎児AchR、葉酸受容体アルファ、葉酸結合タンパク質（FBP）、FCRL5、FCRH5、胎児アセチルコリン受容体、G250/CAIX、GD2、GD3、Gタンパク質共役受容体5D（GPRC5D）、gp100、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerbB2）、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13受容体α2（IL-13Ra2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、ルイスY、L1-細胞接着分子（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1、メソテリン、マウスCMV、ムチン1（MUC1）、MUC16、NCAM、NKG2D、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、O-アセチル化GD2（OGD2）、腫瘍胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、PSCA、プロゲステロン受容体、サバイビン、ROR1、TAG72、tEGFR、VEGF受容体、VEGF-R2、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的抗原およびユニバーサルタグに関連する抗原の中から選択される。
提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、組換え受容体は、機能性の非TCR抗原受容体もしくはTCRもしくはこれらの抗原結合断片であるか、または機能性の非TCR抗原受容体もしくはTCRもしくはこれらの抗原結合断片を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、組換え受容体はキメラ抗原受容体（CAR）である。提供される方法のいずれかの特定の態様において、組換え受容体は抗CD19CARである。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、キメラ抗原受容体は、抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む。
提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、抗原結合ドメインは、抗体もしくは任意に一本鎖断片であるその抗体断片であるか、または抗体もしくは任意に一本鎖断片であるその抗体断片を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様において、断片は、フレキシブルリンカーによって連結された抗体可変領域を含む。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、断片はscFvを含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、スペーサーおよび/またはヒンジ領域をさらに含む。提供される方法のいずれかの特定の態様において、キメラ抗原受容体は細胞内シグナル伝達領域を含む。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、細胞内シグナル伝達領域は細胞内シグナル伝達ドメインを含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、T細胞中で一次活性化シグナルを誘導することが可能なシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメイン、および/もしくは免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む。提供される方法のいずれかの特定の態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3鎖、任意にCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメインもしくはそのシグナル伝達部分であるか、またはCD3鎖、任意にCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメインもしくはそのシグナル伝達部分を含む。
提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達領域の間に配置された膜貫通ドメインをさらに含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、共刺激シグナル伝達領域をさらに含む。提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、共刺激シグナル伝達領域は、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含む。提供される方法のいずれかの特定の態様において、共刺激シグナル伝達領域は、CD28、4-1BBもしくはICOSの細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含む。提供される方法のいずれかのいくつかの態様において、共刺激シグナル伝達領域は、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達領域との間にある。
提供される方法のいずれかの一部の特定の態様において、初代T細胞は、濃縮されたCD4＋T細胞および濃縮されたCD8＋T細胞の別個の組成物を含み、濃縮されたCD4＋T細胞および濃縮されたCD8＋T細胞の組成物は、別々に培養される。提供される方法のいずれかの特定の態様において、初代T細胞は、濃縮されたCD4＋T細胞および濃縮されたCD8＋T細胞の別個の組成物を含み、該組成物は、濃縮されたCD4＋T細胞および濃縮されたCD8＋T細胞を一緒に培養するために混合される。
本明細書で提供されるいずれかの方法によって作製された操作された細胞を含む組成物が、本明細書において提供される。特定の態様において、組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの態様において、組成物は、凍結保護物質、任意にDMSOを含む。
本明細書において提供されるいずれかの組成物と、アウトプット組成物を対象に投与するための指示書とを含む製造品が、本明細書において提供される。一部の特定の態様において、対象は疾患または病態を有し、任意に、組換え受容体は、前記疾患もしくは病態に関連するまたは前記疾患もしくは病態の細胞上に発現されもしくは存在する抗原を特異的に認識し、または該抗原に特異的に結合する。特定の態様において、アウトプット組成物は、操作されたCD4＋T細胞の組成物である。いくつかの態様において、アウトプット組成物は、CD8＋T細胞の操作された組成物である。一部の特定の態様において、アウトプット組成物は、CD4＋およびCD8＋T細胞の操作された組成物である。
本明細書において提供される方法によって作製された操作されたCD4＋T細胞の組成物と、本明細書において提供される方法によって作製された操作されたCD8＋T細胞の組成物と、操作されたCD4＋T細胞および操作されたCD8＋T細胞を対象に投与するための指示書とを含む製造品が本明細書において提供される。一部の特定の態様において、指示書は、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を対象に別々に投与することを指定する。一部の特定の態様において、指示書は、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を対象に所望される比率で投与することを指定する。本明細書において提供される方法によって作製された操作されたCD4＋およびCD8＋T細胞の組成物と、操作されたCD4＋およびCD8＋T細胞を対象に投与するための指示書とを含む製造品も本明細書において提供される。
細胞組成物を評価するための長期刺激方法であって、以下の工程を含む前記方法が本明細書において提供される：インプット組成物中の細胞中のCAR依存性活性を刺激するための条件下で、少なくとも10日の期間、インプット組成物をインキュベートする工程であって、前記インプット組成物が、抗原を特異的に結合しまたは認識する細胞外抗原結合ドメインを含有するキメラ抗原受容体（CAR）を発現するT細胞を含有し、これにより、アウトプット組成物を作製する、前記工程;およびアウトプット組成物の1つまたは複数の細胞の1つまたは複数の表現型または活性を評価する工程。
長期刺激方法の態様のいずれかのいくつかにおいて、CAR依存性活性を刺激するための条件は、CARの抗原結合ドメインに特異的に結合する結合分子の存在を含む。いくつかの態様において、結合分子は支持体に付着される。いくつかの態様において、支持体は固体支持体である。いくつかの態様において、固体支持体は、マイクロプレートのウェルまたはビーズの表面である。いくつかの態様において、固体支持体は、マイクロプレートに付着された結合分子を有するマイクロプレートであり、インキュベーションはマイクロプレート中で実施される。いくつかの態様において、固体支持体は、結合分子が付着されたビーズであり、インキュベーションは複数のビーズの存在下で実施される。
長期刺激方法の態様のいずれかのいくつかにおいて、結合分子は、組換え抗原もしくは抗原結合ドメインによって認識されるその一部であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、組換え抗原またはその一部はBCMAであるか、または抗原結合ドメインによって認識されるBCMAの一部である。いくつかの態様において、結合分子は、抗イディオタイプ抗体もしくは抗原結合ドメインに特異的に結合するその抗原結合断片であり、または抗イディオタイプ抗体もしくは抗原結合ドメインに特異的に結合するその抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、抗原受容体の抗原結合ドメインは、抗体SJ25C1もしくはその抗原結合断片であるか、または抗体SJ25C1もしくはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、抗原受容体の抗原結合ドメインは、抗体FMC63もしくはその抗原結合断片であるか、または抗体FMC63もしくはその抗原結合断片を含む。
長期刺激方法の態様のいずれかのいくつかにおいて、該方法はインビトロまたはエキソビボで実施される。
長期刺激方法の態様のいずれかのいくつかにおいて、インプット組成物は、組換えサイトカインを含まない培地の存在下でインキュベートされる。いくつかの態様において、インキュベーションは連続的に実施される、すなわち、その期間中断されない。いくつかの態様において、インキュベーションの間、細胞は再播種されず、培地は交換されず、結合分子は添加されない。
長期刺激方法の態様のいずれかのいくつかにおいて、該方法は、アウトプット組成物の1つまたは複数の細胞の活性化、消耗または分化状態の1つまたは複数の表現型を評価することを含む。いくつかの態様において、表現型は消耗であり、評価することは、CTLA-4、FOXP3、PD-1、TIGIT、LAB-3、2B4、BTLA、TIM3、VISTAまたはCD96から選択される1種または複数種のマーカーの発現、任意に表面発現を測定することを含む。いくつかの態様において、表現型は活性化であり、評価することは、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD71、CD154、CD40L、CD127、LAG3またはKi67から選択される1種または複数種のマーカーの発現、任意に表面発現を測定することを含む。いくつかの態様において、表現型は分化状態であり、評価することは、（i）CD25、CD45RO、CD56、KLRG1、CD95のうちの1つもしくは複数ならびに/または（ii）CD45RA、CD27、CD28、CD62LおよびCCR7のうちの1つもしくはから選択される1種もしくは複数種のマーカーを測定することを含み、任意に、1種または複数種のマーカーはナイーブ様T細胞と正にまたは逆に関連するマーカーである。
長期刺激方法の態様のいずれかのいくつかにおいて、該方法は、アウトプット組成物の1種または複数種の細胞の1種または複数種の活性を評価することを含む。いくつかの態様において、1種または複数種の活性はCAR依存性活性、任意に抗原刺激された活性を含む。いくつかの態様において、1種または複数種の活性は、細胞溶解活性またはサイトカイン産生を含む。
長期刺激方法の態様のいずれかのいくつかにおいて、期間は少なくとも11日もしくは少なくとも約11日、少なくとも12日もしくは少なくとも約12日、少なくとも13日もしくは少なくとも約13日、少なくとも14日もしくは少なくとも約14日または少なくとも15日もしくは少なくとも約15日である。いくつかの態様において、期間は、11日もしくは約11日、12日もしくは約12日、13日もしくは約13日、14日もしくは約14日または15日もしくは約15日である。
長期刺激方法の態様のいずれかのいくつかにおいて、インプット組成物は、インキュベーションの前に、試験作用物質または化合物に曝露されまたは接触されている細胞を含有し、任意で、曝露または接触は、CARを発現するT細胞を含むインプット組成物を作製するためのプロセスの1つまたは複数の工程の間に実施される。いくつかの態様において、該方法は、複数のインプット組成物に対して実施され、複数の前記インプット組成物のそれぞれは、異なるプロセスによって作製される。
長期刺激方法の態様のいずれかのいくつかにおいて、該方法は、アウトプット組成物の表現型または活性を対照組成物の表現型または活性と比較することをさらに含み、任意で、対照組成物は、CAR依存性活性を刺激するために同じ条件下で、少なくとも10日間インキュベートされたT細胞の組成物であり、前記T細胞の組成物は、試験作用物質もしくは化合物の存在下で作製されず、またはインプット組成物と比較して別のプロセスによって作製されている。いくつかの態様において、前記方法は、例えば対照組成物と比較して、低下した消耗、低下した活性化または減少した分化を呈するアウトプット組成物を同定することをさらに含む。いくつかの態様において、減少した分化は、1種または複数種のナイーブ様T細胞マーカーの増加した発現を含む。
図1A〜1Dは、変動する濃度のPI-103（図1A）、化合物155（図1B）、化合物246（図1C）または化合物63（図1D）の存在下で、抗CD3および抗CD28抗体がコンジュゲートされた磁気ビーズとともにインキュベートされたCD4＋およびCD8＋T細胞中で検出されたリン酸化されたS6レベルを示すグラフを示す。 図2は、培地のみ対照中での、またはDMSO、PI-103もしくは変動する濃度の化合物155、化合物63もしくは化合物246の存在下でのインキュベーション後に存在する操作されたCD8＋（上のパネル）およびCD4＋（下のパネル）T細胞に対する最初の細胞数に対するパーセントを示すグラフを示す。矢印は、同様のレベルのCD8およびCD4T細胞拡大をもたらした化合物155、化合物63および化合物246の最高の耐容される用量を示す。点の横線は、培地およびDMSO対照の平均値の70％を示す。 図3A〜3Cは、生成された抗CD19CAR-T細胞組成物の中のCD8＋T細胞中での細胞性解糖代謝のグラフを示す。図3Aは、培地のみ、DMSO、PI-103または化合物63の存在下での拡大によって生成された抗CD19CAR-T細胞の中のCD8＋CAR-T細胞のリアルタイムでの細胞外酸性化速度（ECAR）を示すグラフを提供する。図3Bは、培地のみ対照と比較した、ECAR速度（mpH/分）に対して計算された曲線下面積（AUC）を示す。図3Cは、培地のみ対照と比較した最大ECAR解糖バーストの比率を示す。 図4A〜4Bは、培地のみ、DMSO、PI-103または化合物63の存在下での拡大によって生成された抗CD19CAR-T細胞組成物に対して行われたアッセイの結果を示すグラフを与える。図4Aは、CD19を発現するために形質導入された照射されたK-562細胞（照射されたK562-CD19標的細胞）および抗原に曝露されなかった細胞（刺激なし）との共培養に引き続く、生成された抗CD19CAR-T細胞組成物のCD8＋およびCD4＋T細胞中でのホスホ-S6染色の平均蛍光強度を示す。上のパネルは、別個の細胞組成物から測定された各データ点を示す。下のパネルは、平均値＋/-標準偏差を示す。図4Bは、3:1または1:1のエフェクター細胞対標的細胞の比率で、K562-CD19標的細胞とともに共培養された生成されたCAR-T細胞組成物の細胞溶解活性を示すグラフを提供する。生成されたCAR-T細胞組成物およびCD19を発現するK562細胞からの測定が対照として提供されている。 図5は、照射されたK562-CD19標的細胞とともに共培養された抗CD19CAR-T細胞組成物のTNF-アルファ（左パネル）、IFN-ガンマ（中央パネル）およびIL-2（右パネル）の分泌を示すグラフを提供する。培地のみの中で拡大された細胞と比較した、PI-103、化合物63またはDMSOビヒクルの存在下で拡大された生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から得られる共培養上清中で観察されたサイトカイン産生の倍数変化が示されている。 図6Aおよび6Bは、照射されたK562-CD19標的細胞とともに共培養され、次いで、PMA/イオノマイシン（左パネル）またはゴルジ阻害剤（右パネル）をさらにインキュベートした生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から得られるCD8＋（図6A）およびCD4＋（図6B）T細胞の多機能性サイトカインプロファイルを表すグラフを示す。培地のみの中で拡大された細胞と比較した、PI-103、化合物63またはDMSOビヒクルの存在下で拡大された生成された抗CD19CAR-T細胞組成物中での、CD107a、IFN-ガンマ（IFNg）、IL-2、IL-17aおよびTNF-アルファ（TNFa）の異なる組み合わせに対して陽性に染色された細胞の増加した頻度が表されている。 図7A〜7Dは、反復された刺激後に培地のみ、DMSO、PI-103または化合物63の存在下で拡大された生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から得られるT細胞の活性を表すグラフを示している。図7Aは、照射されたK562-CD19標的細胞と共培養された生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から得られるT細胞の集団倍加を示している。4巡の再刺激の後、11日目に標的細胞なしでT細胞を再培養した。図7Bは、培地のみ対照と比較した、集団倍加に対して計算された曲線下面積（AUC）を示す。図7Cは、照射されたK562-CD19標的細胞による4巡の反復された刺激に続く、照射されたK562-CD19標的細胞との16時間の共培養による刺激後の、生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から得られるT細胞によるTNF-アルファ（TNF）、IFN-ガンマ（IFNg）およびIL-2の産生を表すグラフを示す。培地のみ条件と比較された、細胞外TNF-アルファ（TNF）、IFN-ガンマ（IFNg）およびIL-2の倍数変化が示されている。図7Dは、照射されたK562-CD19標的細胞による4巡の再刺激を経た生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から得られるCD8＋T細胞の多機能性サイトカインプロファイルを図示するグラフを示す。 図8A〜8Dは、抗CD19CARに特異的な抗イディオタイプ抗体がコンジュゲートされたビーズ表面での刺激後に、培地のみ、DMSO、PI-103または化合物63の存在下で拡大された生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から得られるT細胞の活性を表すグラフを示している。図8Aは、抗イディオタイプ抗体がコンジュゲートされたビーズ表面とともに共培養された生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から得られるT細胞のウェル当たりの生きた総T細胞数を示す。図8Bは、培地のみ対照と比較した、生きたT細胞数に対して計算された曲線下面積（AUC）を示す。図8Cは、抗イディオタイプ抗体にコンジュゲートされたビーズ表面との15日のインキュベーションを経た照射されたK562-CD19標的細胞との16時間の共培養での刺激後の生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から得られるT細胞によるTNF-アルファ（TNF）、IFN-ガンマ（IFNg）およびIL-2の産生を表すグラフを示す。培地のみ条件と比較された、細胞外TNF-アルファ（TNF）、IFN-ガンマ（IFNg）およびIL-2の倍数変化が示されている。図8Dは、抗イディオタイプ抗体がコンジュゲートされたビーズとの15日のインキュベーションを経た生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から得られるCD8＋T細胞の多機能性サイトカインプロファイルを図示するグラフを示す。 図9A〜9Cは、培地のみ、DMSO、PI-103または化合物63の存在下で拡大された生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から得られるCD4＋およびCD8＋T細胞のRNA-Seq分析の結果を表すグラフを示す。図9Aは、生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から得られるCD4＋（左パネル）、CD8＋（中央パネル）ならびに組み合わされたCD4＋およびCD8＋（右パネル）T細胞による差次的に発現された遺伝子発現を図示するボルケーノプロットを示す。DMSOを用いて拡大されたT細胞と比較した、培地のみ（上の列）、PI-103（中央の列）および化合物63（下の列）中で拡大されたT細胞に対する差次的遺伝子発現が示されている。図9Bは、DMSOの存在下で拡大された生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から得たT細胞中での発現と比較した、PI-103（X軸）および化合物63（Y軸）の存在下で拡大された生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から得たT細胞中で測定された差次的に発現された遺伝子のlog2倍数変化（Log2FC）を図示するグラフを示す。図9Cは、例示的な同定された遺伝子オントロジー（GO）カテゴリーおよびその対応するZスコアを図示する表およびグラフを示す。 図10Aおよび10Bは、抗CD19CAR-T細胞での処置後の担腫瘍マウスにおける腫瘍量および生存を表すグラフを示す。図10Aは、抗CD19CAR-T細胞での処置後の担腫瘍マウスにおける80日までの腫瘍量および生存を表すグラフを示す。図10Bは、抗CD19CAR-T細胞での処置後の担腫瘍マウスにおける100日までの生存を表すグラフを示す。非肥満糖尿病重症複合免疫不全ガンマ（NSG（Nod scid gamma））免疫不全マウスに、ホタルルシフェラーゼを発現するラージ細胞を移植し、処置を受けないか、またはDMSOもしくはPI-103の存在下で拡大された高（左パネル）もしくは低（右パネル）用量の抗CD19CAR-T細胞での処置を受けた。生物発光によって測定された各マウスの腫瘍量（上パネル）および処置群の生存曲線（下パネル）が、図10Aおよび10Bに示されているように、表記された時間において示されている。 図11Aおよび11Bは、抗CD19CAR-T細胞での処置後の担腫瘍マウスにおける腫瘍量および生存を表すグラフを示す。図11Aは、抗CD19CAR-T細胞での処置後の担腫瘍マウスにおける80日までの腫瘍量および生存を表すグラフを示す。図10Bは、抗CD19CAR-T細胞での処置後の担腫瘍マウスにおける100日までの生存を表すグラフを示す。NSG免疫不全マウスに、ホタルルシフェラーゼを発現するラージ細胞を移植し、処置を受けないか、またはDMSOもしくは化合物63の存在下で拡大された高（左パネル）もしくは低（右パネル）用量の抗CD19CAR-T細胞での処置を受けた。生物発光によって測定された各マウスの腫瘍量（上パネル）および処置群の生存曲線（下パネル）が、図11Aおよび11Bに示されているように、表記された時間において示されている。 図12Aおよび12Bは、抗CD19CAR＋T細胞を含有するT細胞組成物の活性を示すグラフを提示する。細胞は、活性を評価する前に、抗CD19抗体抗IDコンジュゲートされたビーズとともに14日間インキュベートされるか（14日;二次）、またはインキュベートされないかのいずれかであった。細胞傷害性アッセイ（図12A）およびCD19発現細胞への曝露後の内部サイトカイン染色（ICS）アッセイ（図12B）から得られた結果が示されている。 図13A〜13Cは、抗CD19抗体抗IDコンジュゲートされたビーズとの14日間のインキュベーションの間または後における、抗CD19CAR＋T細胞を含有するT細胞組成物の特徴を示すグラフを提示する。PI-103、化合物63またはビヒクルの存在下で生成されたT細胞組成物から得られた結果が示されている。図13Aおよび13Bは、インキュベートされなかった（一次）または14日間インキュベートされた（二次）T細胞組成物のCD19細胞への曝露に応答した活性を示している。ICSによる多機能染色（図13A）およびCD19発現細胞への曝露後の細胞溶解活性（図13B）の結果が示されている。図13Cは、1:1の比率で、CD19発現細胞とともに20時間インキュベートされた抗CD19CAR発現細胞を含有する細胞組成物の上清からの分泌されたサイトカインのレベルを図示する。IL2、TNFおよびIFN-ガンマの量が測定され、全ての3つのサイトカインに対する尺度付けされたスコアの平均が示されている。 図14は、DMSOまたは化合物63の存在下で調製された融解されたCAR-T細胞上でのアポトーシス促進性細胞内カスパーゼ3の発現を図示する。FACSプロットは、3人の異なるドナーから調製された生きたCD3＋CAR＋T細胞を示す。 図15は、DMSO、PI103または化合物63の存在下で調製されたCAR-T細胞の経時的な生きた細胞数を示すグラフを提示する。記号は、3人の各ドナーから得られた培養ウェルの平均および平均値の標準誤差を表す。 図16は、DMSO、PI103または化合物63の存在下で調製された融解されたCAR-T細胞による標的細胞の死滅を示すグラフを表す。融解直後（0日）または図15に記載されているCAR刺激培養の終了時（14日）に、死滅アッセイを設定した。記号は、3人の各ドナーから得られた培養ウェルの平均および平均値の標準誤差を表す。 図17A〜17Bは、PI103または化合物63の存在下で調製されたCAR-T細胞は改善されたおよび持続されたエフェクターサイトカインプロファイルを有することを示すグラフを提示する。融解直後に（「一次」、上パネル）または図15に記載されているCAR刺激培養の終了時（「二次」、下パネル）に、抗原を有する標的細胞と、1:1で（CAR-T:標的）、CAR-T細胞を混合した。T細胞の多機能性は、ゴルジ阻害剤の存在下で5時間、標的とともにインキュベートされたCAR-T細胞から、FACSによって、サイトカインIL2、TNFおよびIFNgの細胞内発現によって評価した（図17A）。標的とともに20時間インキュベートされたCAR-T細胞からの培養上清中へのサイトカイン分泌も測定した（図17B）。アッセイ値は正規化し、各ドナーコホート内でのフィーチャースケーリングによって、ランクスコア化した。 図18は、図15に記載されているように、PI103または化合物63の存在下で生成された濃縮されたCD8＋およびCD4＋CAR-T細胞に対して行われたRNAseqの差次的発現（DESeq2）分析の結果を提示する。PI103対DMSOまたは化合物63対DMSOに対して0.1より小さい調整されたp値（p-adj）を有する遺伝子の差次的発現を選択し、log2倍数変化遺伝子発現値が示されている。PI103で処理された細胞中でのみ有意に差次的に発現された遺伝子が、四角とともに示されている。化合物63で処理された細胞中でのみ有意に差次的に発現された遺伝子が、丸とともに示されている。両方のT細胞組成物中で発現された遺伝子がひし形とともに示されている。差次的発現値は、群当たり3人の各ドナーの平均である。 図19A〜19Bは、抗CD19CAR-T細胞での処置後の担腫瘍マウスにおける腫瘍量および生存を表すグラフを示す。図19Aは、高用量（1×106CAR-T細胞/マウス）または低用量（2.5×105CAR-T細胞/マウス）のいずれかの抗CD19CAR-T細胞での処置後における、マウス中の腫瘍量を表すグラフを示す。図19Bは、高用量または低用量の抗CD19CAR-T細胞での処置後における、担腫瘍マウスの生存を表すグラフを示す。 図20A〜20Bは、抗CD19CAR-T細胞での処置後の担腫瘍マウスにおける腫瘍量および生存を表すグラフを示す。図20Aは、高用量（1×106CAR-T細胞/マウス）または低用量（2.5×105CAR-T細胞/マウス）のいずれかの抗CD19CAR-T細胞での処置後における、マウス中の腫瘍量を表すグラフを示す。図20Bは、高用量または低用量のいずれかの抗CD19CAR-T細胞での処置後の担腫瘍マウスの生存を表すグラフを示す。 図21A〜21Bは、レシピエントマウスの血中での、抗CD19CAR-T細胞の経時的な持続能力を示すグラフを示す。図21Aは、DMSO（D）、化合物63（C）またはPI103（P）の存在下で調製された高用量（1×106CAR-T細胞/マウス）のCAR-T細胞を受けたマウス中での、注射から18日後、25日後および36日後でのCD4＋およびCD8＋T細胞の数を示す。図21Bは、DMSO（D）、化合物63（C）またはPI103（P）の存在下で調製された低用量（2.5×105CAR-T細胞/マウス）のCAR-T細胞を受けたマウス中での、注射から18日後、25日後および36日後でのCD4＋およびCD8＋T細胞の数を示す。
詳細な説明
細胞をインキュベートする、刺激するおよび/または培養するなどの、プロセスの1つまたは複数の工程がmTOR活性を阻害する作用物質の存在下で実施される、組換え受容体を発現する操作された細胞、例えば操作されたCD4＋および/またはCD8＋細胞の組成物を作製する方法が本明細書において提供される。一部の特定の態様において、操作された細胞の組成物は、組換え受容体で操作されたT細胞を含む濃縮されたCD4＋または濃縮されたCD8＋初代T細胞の細胞組成物である。一部の特定の態様において、T細胞はヒトT細胞である。いくつかの局面において、例えば細胞の拡大および/または増殖のために細胞を培養することは、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で実施される。いくつかの態様において、組成物中の細胞は、培養される前に、作用物質と接触されていない、作用物質とともにインキュベートされていない、および/または作用物質に曝露されていない。一部の特定の態様において、培養は、操作されたCD4＋および/またはCD8＋T細胞を含むアウトプット組成物を作製するために、組成物中の細胞の増殖または拡大をもたらす。
細胞治療において使用するための遺伝子操作されたT細胞、例えばCAR-T細胞の製造は、細胞の単離、細胞の活性化、組換え受容体での細胞の形質導入または操作および臨床的投薬のためのT細胞の拡大を含む。このプロセスは、一部の状況において、最終的な消耗状態に誘導された細胞を含み得る、ならびに/または細胞が持続能力を欠きおよび/もしくは最適な有効性を示さない一部の操作されたT細胞薬物製品をもたらし得る。一部の状況において、多分化能およびT細胞複製能が減弱される。いくつかの局面において、消耗された細胞を含有する操作されたT細胞薬物製品は、一部の状況において、T細胞薬物製品の潜在的有効性を制約し得る。対象に投与されたときに、消耗状態になり、持続能力を欠き、および/もしくは減少した有効性を有する、またはその可能性がある細胞のパーセンテージまたは数を最小化しまたは低減する操作された細胞治療薬の代替的製造方法が必要とされている。
本明細書において提供される方法は、操作された細胞、例えばCAR-T細胞の持続能力、消耗の欠如および/または有効性が、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で細胞を製造または作製することによって改善されるという観察に基づいている。いくつかの局面において、該作用物質は、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（mTOR）、例えば、哺乳類の、例えば、ヒトのmTORの阻害剤である。いくつかの態様において、該作用物質は、mTORに対して特異的であり、ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3-キナーゼ）ファミリーのキナーゼなどの他の関連するキナーゼを阻害せずまたはこれらに対する標的活性を有さない。mTORは、ホスホイノシチド3-キナーゼ（PI3-キナーゼ）ファミリーとかなりの配列相同性を有する進化的に保存されたキナーゼである。PI3Kと異なり、mTORは脂質キナーゼではなく、むしろ、セリン-スレオニンタンパク質キナーゼである。哺乳動物細胞において、mTORは、そのタンパク質生成物が2つの異なる複合体（mTORC1およびmTORC2）を介してシグナル伝達する単一の遺伝子としてコードされている。一般に、mTORは、細胞増殖および増殖を含む様々な細胞プロセスを制御すると考えられている。T細胞では、mTORは、サイトカイン受容体およびT細胞受容体の活性化を含む様々な刺激によって活性化され得る。
いくつかの局面において、提供される方法は、操作されたT細胞が、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下でインキュベートされ、培養（cultivated）され、および/または培養（cultured）されるプロセスと関連して使用され、これは、いくつかの局面において、細胞の拡大、持続能力および/または有効性、例えば、抗腫瘍活性を改善しまたは増強し得る。いくつかの局面において、mTORC1およびmTORC2キナーゼ活性を阻害する作用物質が使用される。一部の特定の態様において、該作用物質は選択的mTOR阻害剤である、例えば、さらなるキナーゼ、例えばPI3Kを阻害しない。いくつかの局面において、該作用物質は、化合物63、化合物155または化合物246である。
いくつかの局面において、提供される方法は、例えば、細胞治療において使用するための、組換え受容体を発現するように操作された初代T細胞（「操作された細胞」）を含み、別の方法、例えば、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で実施されない別の方法によって作製された操作された細胞の組成物と比べて、より少ない消耗された細胞および/またはより少ない、消耗と関連するマーカーまたは表現型を示す細胞を含有する細胞の組成物を作製する。特定の態様において、提供される方法によって作製される操作された細胞は、別のプロセス、例えば、mTOR活性、例えばmTORC1またはmTORC2キナーゼ活性などのキナーゼ活性を阻害する作用物質の存在下で実施されない方法によって作製された操作された細胞の組成物からの細胞と比べて、増加したパーセンテージのメモリー様T細胞、例えば長寿命メモリーT細胞を含有する。一部の特定の局面において、提供される方法によって作製された操作された細胞は、別の方法によって作製された操作された細胞より分化の程度がより低い。いくつかの局面において、提供される方法は、別の方法、例えば、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で実施されない別の方法によって生成された操作された細胞と比べて、改善されたまたは増強された、拡大、持続能力および/または抗腫瘍活性を有する操作された細胞を作製する。このため、いくつかの局面において、提供される方法は、別の方法、例えば、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で実施されない別の方法によって作製された操作された細胞の組成物と比べて、改善された治療上の有効性を有する操作された細胞の組成物を生成し得る。一部の特定の態様において、提供される方法は、別の方法によって作製された操作された細胞の組成物と比べて、応答の改善された臨床的耐久性を有する操作された細胞の組成物を生成し得る。いずれのこのような態様のいくつかにおいて、別のプロセスに対する比較は、別のプロセスがmTOR活性を阻害する作用物質の存在下で実施されないという点のみが異なる同じプロセスに対する。
特許文書、科学論文およびデータベースを含めて、本出願において参照される全ての刊行物は、あたかもそれぞれの個々の刊行物が個々に参照により組み入れられているかのように、全ての目的のためにその全体が参照により組み入れられる。本明細書において示される定義が、参照により本明細書に組み入れられる特許、特許出願、公開特許出願および他の刊行物において示される定義と相反するかまたは他の形で矛盾する場合は、本明細書において示される定義が、参照により本明細書に組み入れられる定義に優先する。
本明細書において使用するセクション見出しは構成上の目的のためだけであり、記載される主題を限定するものとして解釈してはならない。
I.養子細胞治療のための細胞を単離し、培養し、操作するためのプロセス
組換えタンパク質、例えば、T細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）などの組換え受容体を発現する、操作された細胞、例えば操作された初代CD4＋T細胞および/または操作されたCD8＋T細胞のアウトプット組成物を生成するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、操作された細胞のアウトプット組成物を生成するために、mTOR活性を阻害する作用物質、例えば本明細書に記載されている任意のもの、例えば化合物63の存在下で、細胞をインキュベートすること、培養すること、および/または培養すること（culturing）を含むプロセスと関連して使用される。いくつかの態様において、該方法は、操作された細胞のアウトプット組成物を生成するために、mTOR活性を阻害する作用物質、例えば本明細書に記載されている任意のもの、例えば化合物63の存在下で、拡大および/または増殖を促進する条件下などで、操作された細胞の組成物を培養することを含むプロセスと関連して使用される。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、1種または複数種のさらなるキナーゼの活性を阻害する。いくつかの態様において、該作用物質は、mTOR活性を選択的におよび/または特異的に阻害する。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、本明細書、例えばセクションIIに記載されている作用物質である。いくつかの態様において、該作用物質はmTORキナーゼ活性を阻害する。一部の特定の態様において、該作用物質はmTORC1および/またはmTORC2を阻害する。特定の態様において、該作用物質は、化合物63、化合物155または化合物246である。一部の特定の態様において、該作用物質は化合物63である。
いくつかの態様において、操作された細胞、例えば操作されたCD4＋T細胞および/または操作されたCD8＋T細胞を生成または作製する方法は、対象から細胞を単離すること、細胞を調製すること、加工すること、刺激条件下でインキュベートすること、および/または操作すること（例えば、形質導入すること）の1つまたは複数を含む。いくつかの態様において、該方法は、まず、インプット細胞、例えば初代細胞が生物学的試料から単離され、例えば選択されもしくは分離され;例えば、形質導入もしくはトランスフェクションによって、組換えポリヌクレオチドを細胞中に導入するために、インプット細胞が、刺激条件下でインキュベートされ、ベクター粒子、例えばウイルスベクター粒子で操作され;例えば細胞を拡大するために、操作された細胞、例えば形質導入された細胞を培養すること;ならびにアウトプット組成物中の細胞を製剤化するために、細胞の全部もしくは一部を収集し、採集し、および/または容器を細胞の全部もしくは一部で満たすことが順番に実施される処理工程を含む。いくつかの態様において、生成されたアウトプット組成物の細胞は、凍結保存前または後に、同じ対象中に再導入される。いくつかの態様において、操作された細胞のアウトプット組成物は、治療、例えば、自己細胞治療において使用するのに適している。
いくつかの態様において、1つまたは複数の工程または段階は、mTOR活性を阻害する作用物質、例えば本明細書に記載されている任意のもの、例えば化合物63の存在下で行われる。いくつかの態様において、細胞組成物の細胞を単離し、濃縮し、インキュベートし、操作し、形質導入し、トランスフェクトし、培養し（cultivating）、培養し（culturing）、収集し、製剤化し、保存し、および/または凍結冷凍（cryofreezing）することの1つまたは複数の工程が、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で行われる。一部の特定の態様において、細胞はmTOR活性を阻害する作用物質の存在下で培養される。
いくつかの態様において、操作された細胞は、mTOR活性を阻害する作用物質、例えば本明細書に記載されている任意のもの、例えば化合物63の存在下で培養され、一部の特定の態様において、細胞は、培養前に、mTOR活性を阻害する作用物質と接触されていない、mTOR活性を阻害する作用物質とともにインキュベートされていない、および/またはmTOR活性を阻害する作用物質に曝露されていない。いくつかの態様において、インプット細胞、刺激された細胞および/または操作された細胞は、細胞の拡大または増殖を誘導しまたは刺激するために細胞を培養する前に、mTOR活性を阻害する作用物質と接触されていない、曝露されていない、および/またはインキュベートされていない。一部の特定の態様において、単離する工程、濃縮する工程、1つもしくは複数の活性化条件下でインキュベートする工程、操作する工程、形質導入する工程、トランスフェクトする工程、製剤化する工程、保存する工程および/または凍結冷凍する工程は、mTOR阻害剤の存在下で行われない。
特定の態様において、提供される方法は、細胞の当初組成物および/またはインプット組成物から、組換え受容体を発現する細胞のアウトプット組成物を生成することに関連して使用される。いくつかの態様において、細胞の組成物は、濃縮されたT細胞、濃縮されたCD4＋T細胞および/または濃縮されたCD8＋T細胞の組成物である（以下、本明細書において、それぞれ、濃縮されたT細胞の組成物、濃縮されたCD4＋T細胞の組成物および濃縮されたCD8＋T細胞の組成物とも称される。）。一部の特定の態様において、濃縮されたT細胞、濃縮されたCD4＋T細胞または濃縮されたCD8＋T細胞の組成物は、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で培養される。いくつかの態様において、濃縮されたCD4＋T細胞の組成物は、mTOR活性を阻害する作用物質、例えば本明細書に記載されている任意のもの、例えば化合物63の存在下で培養される。一部の特定の態様において、濃縮されたCD8＋T細胞の組成物は、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で培養される。
いくつかの態様において、提供される方法は、刺激性条件下で、初代T細胞を含むインプット組成物をインキュベートすることと関連して使用される。いくつかの態様において、刺激性条件は、刺激性試薬の存在下でインプット組成物をインキュベートすることである、または刺激性試薬の存在下でインプット組成物をインキュベートすることを含む。一部の特定の態様において、刺激性試薬は、抗CD3および抗CD28抗体コンジュゲートされた表面を有するビーズ、例えば、常磁性ビーズであり、またはこれを含む。特定の態様において、インプット組成物の細胞は、インキュベーションの前または間に、mTOR活性を阻害する作用物質に曝露されない。いくつかの局面において、インキュベーションは、濃縮されたT細胞、例えばCD4＋およびCD8＋細胞のインプット組成物とともに行われる。いくつかの態様において、インプット組成物は、濃縮されたCD4＋T細胞であり、または濃縮されたCD4＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、インプット組成物は、濃縮されたCD8＋細胞であり、または濃縮されたCD8＋細胞を含む。いくつかの態様において、例えば同じ生物学的試料由来の濃縮されたCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞の別個の組成物が、別々にインキュベートされる。いくつかの態様において、インキュベーションの刺激性条件は、両組成物に対して同一であり得る。一部の特定の態様において、刺激性条件は異なり得る。一部の特定の態様において、刺激性条件下での1つまたは複数のインプット組成物のインキュベーションは、1つまたは複数の刺激された組成物を生成する。
一部の特定の態様において、組換え受容体は、刺激された組成物の細胞中に導入される。一部の特定の態様において、組換え受容体は、刺激された組成物をウイルスベクターで形質導入することによって細胞中に導入される。一部の特定の態様において、ウイルスベクターは、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドであり、または組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。一部の特定の態様において、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである。いくつかの態様において、刺激された組成物は、濃縮されたT細胞、例えばCD4＋およびCD8＋細胞を含みまたは含有する。いくつかの態様において、刺激された組成物は、濃縮されたCD4＋T細胞であり、または濃縮されたCD4＋T細胞を含む。特定の態様において、刺激された組成物は、濃縮されたCD8＋細胞であり、または濃縮されたCD8＋細胞を含む。いくつかの態様において、例えば同じ生物学的試料由来の濃縮されたCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞の別個の組成物は、別々に操作される。特定の態様において、組換え受容体はキメラ抗原受容体（CAR）である。特定の態様において、CARは抗CD19CARである。
いくつかの態様において、操作された細胞、例えば、組換え受容体を発現するように形質導入されたまたはトランスフェクトされた細胞の組成物は、mTOR活性を阻害する作用物質、例えば本明細書に記載されている任意のもの、例えば化合物63の存在下で培養される。一部の特定の態様において、培養は、例えば、操作されたT細胞を含有するアウトプット組成物を作製するために、組成物中の細胞の増殖および/または拡大をもたらす。いくつかの局面において、組成物の細胞は、培養の前に、mTOR活性を阻害する作用物質、例えば本明細書に記載されている任意のもの、例えば化合物63に曝露されていない、接触されていない、および/またはそれとともにインキュベートされていない。一部の特定の態様において、細胞は、mTOR阻害剤、例えば本明細書に記載されている任意のもの、例えば化合物63の存在下で、以前にインキュベートされず、培養されず、刺激されず、操作されず、形質導入されずおよび/またはトランスフェクトされなかった。
一部の特定の態様において、細胞の操作された組成物は濃縮されたCD4＋T細胞の操作された組成物である。特定の態様において、操作された組成物は操作されたCD8＋T細胞の組成物である。いくつかの態様において、提供される方法は、mTOR活性を阻害する作用物質、例えば本明細書に記載されている任意のもの、例えば化合物63の存在下で、濃縮されたCD4＋T細胞および濃縮されたCD8＋T細胞の別個の操作された組成物を別々に培養することに関連して使用される。
いくつかの態様において、該作用物質は、mTORと関連する1種または複数種の活性を阻害し、低減し、および/または減少させる。いくつかの態様において、活性はキナーゼ活性である。いくつかの態様において、活性は、mTORC1および/またはmTORC2活性である。いくつかの態様において、作用物質は、BEZ235、BGT226、GDC0980、NVP-BEZ235、PF-04691502、PI-103、SAR245409、SF1126、VS5584またはXL765、ピラゾロピリミジン、トリンl、トルキニブ、PP30、Ku-0063794、WAY-600（Wyeth）、WAY-687（Wyeth）、WAY-354（Wyeth）、OSI-027、DS3078a、AZD8055、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、デフォロリムスまたはAZD8055からなる群より選択される。一部の特定の態様において、該作用物質は、化合物63、化合物155または化合物246である。いくつかの態様において、作用物質は化合物63である。
一部の特定の態様において、細胞の組成物は、濃縮されたT細胞、濃縮されたCD4＋T細胞および/または濃縮されたCD8＋T細胞の組成物である（以下、本明細書において、それぞれ、濃縮されたT細胞の組成物、濃縮されたCD4＋T細胞の組成物および濃縮されたCD8＋T細胞の組成物とも称される。）。一部の特定の態様において、濃縮されたT細胞、濃縮されたCD4＋T細胞または濃縮されたCD8＋T細胞の組成物は、mTOR活性を阻害する作用物質、例えば本明細書に記載されている任意のもの、例えば化合物63の存在下で、刺激性条件下でインキュベートされる。いくつかの態様において、濃縮されたT細胞、濃縮されたCD4＋T細胞または濃縮されたCD8＋T細胞の組成物は、mTOR活性を阻害する作用物質、例えば本明細書に記載されている任意のもの、例えば化合物63の存在下で組換え受容体を発現するように遺伝子操作されている、例えば、形質導入されまたはトランスフェクトされている。
いくつかの態様において、提供される方法は、濃縮されたT細胞の単一の組成物の単離、分離、選択、活性化もしくは刺激、形質導入、洗浄、懸濁、希釈、濃縮および/または製剤化と共同して使用される。いくつかの態様において、濃縮されたT細胞の組成物は、濃縮されたCD4＋T細胞を含む細胞の組成物である。一部の特定の態様において、濃縮されたCD4＋T細胞の組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％または少なくとも99.9％のCD4＋T細胞を含有する。特定の態様において、濃縮されたCD4＋T細胞の組成物は、100％のCD4＋T細胞を含有し、または約100％のCD4＋T細胞を含有する。一部の特定の態様において、濃縮されたT細胞の組成物は、20％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満もしくは0.01％未満のCD8＋T細胞を含みもしくは含有し、および/またはCD8＋T細胞を含有せず、および/またはCD8＋T細胞が存在しないもしくは実質的に存在しない。いくつかの態様において、細胞の集団は、CD4＋T細胞から本質的になる。
いくつかの態様において、濃縮されたT細胞の組成物は、濃縮されたCD8＋T細胞の組成物である。一部の特定の態様において、濃縮されたCD8＋T細胞の組成物は、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくは少なくとも99.9％のCD8＋T細胞を含有し、または100％のCD8＋T細胞を含有しもしくは約100％のCD8＋T細胞を含有する。一部の特定の態様において、濃縮されたCD8＋T細胞の組成物は、20％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満もしくは0.01％未満のCD4＋T細胞を含みもしくは含有し、および/またはCD4＋T細胞を含有せず、および/またはCD4＋T細胞が存在しないもしくは実質的に存在しない。いくつかの態様において、細胞の集団は、CD8＋T細胞から本質的になる。
いくつかの態様において、提供される方法は、濃縮T細胞の2つまたはそれより多くの別個のアウトプット組成物を生成することに関連して使用される。いくつかの態様において、提供される方法は、濃縮T細胞の2つまたはそれより多くの別個の組成物について別々に行われる。一部の特定の態様において、方法は、濃縮T細胞の2つもしくはそれより多くの組成物を別々に活性化および/もしくは刺激すること;濃縮T細胞の2つもしくはそれより多くの組成物を別々に操作すること;ならびに/または濃縮T細胞の2つもしくはそれより多くの組成物を別々に培養することに関連して使用され得る。一部の特定の態様において、この方法はまた、生物学的試料から異なる細胞を単離または選択して、濃縮CD4＋T細胞および濃縮CD8＋T細胞の別個の組成物などの濃縮T細胞の別個のインプット組成物を生成することに関連して使用され得る。特定の態様において、提供される方法は、T細胞がインキュベート、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクト、および/または培養された後に、濃縮T細胞の別個の組成物を別々に採取、収集、および/または製剤化することに関連して使用され得る。いくつかの態様において、濃縮T細胞の2つまたはそれより多くの別個の組成物は、濃縮CD4＋T細胞の組成物を含む。一部の特定の態様において、2つまたはそれより多くの別個の組成物は、CD8＋T細胞を含む。いくつかの態様において、2つまたはそれより多くの別個の組成物は、濃縮CD4＋T細胞の組成物および濃縮CD8＋T細胞の組成物を含む。
特定の態様において、濃縮T細胞の組成物は、組換え受容体を発現する濃縮T細胞のアウトプット組成物を生成するためのプロセスの任意の段階または工程の前、その間、またはその後に収集され、凍結保護のために製剤化され、クライオ凍結され、および/または0℃未満、-20℃未満、または-70℃もしくは‐70℃未満または-80℃もしくは‐80℃未満で保存され得る。いくつかの態様において、細胞は、1日未満、2日未満、3日未満、4日未満、5日未満、6日未満、7日未満、8日未満、9日未満、もしくは10日未満の期間、または1週間未満、2週間未満、3週間未満、4週間未満、5週間未満、6週間未満、7週間未満、8週間未満の期間、または少なくとも1週間、少なくとも2週間、少なくとも3週間、少なくとも4週間、少なくとも5週間、少なくとも6週間、少なくとも7週間、もしくは少なくとも8週間の期間、または8週間を超える期間、保存され得る。保存後、濃縮T細胞の組成物は解凍され得、プロセスの同じ時点から加工処理を再開され得る。いくつかの態様において、濃縮T細胞のインプット組成物は、さらなる加工処理、例えば刺激条件下でのインキュベーションの前にクライオ凍結され、保存される。特定の態様において、濃縮T細胞の培養および/または製剤化された組成物は、例えば自己細胞療法として対象に投与される前にクライオ凍結され、保存される。
一部の特定の態様において、濃縮T細胞の別個の細胞組成物は、単一の組成物に組み合わされる。例えば、いくつかの態様において、濃縮CD4＋T細胞の組成物は、濃縮CD8＋T細胞の組成物と組み合わされて、濃縮CD4＋およびCD8＋T細胞の単一の組成物になる。一部の特定の態様において、創製された別個の組成物は、例えば、単一の対象から取得、収集、および/または採取された同じ生物学的試料などの、同じ生物学的試料から最初に単離、選択および/または濃縮された。いくつかの態様において、別個の組成物は、アウトプット組成物を生成するためのプロセス、例えば提供される方法に関連するプロセスの1つまたは複数の工程または段階のために別々に加工処理される。いくつかの態様において、別個の組成物は、アウトプット組成物を生成するためのプロセスの任意の工程または段階の前、その間、またはその後に、単一の組成物に組み合わされ得る。したがって、いくつかの態様において、同じ生物学的試料からの濃縮T細胞の別個のインプット、刺激、操作、培養、製剤化、および/または採取された組成物が単一の組成物に組み合わされ、一部の特定の態様では、単一の組成物としてさらに加工処理される。一部の特定の態様において、濃縮細胞の別個のアウトプット組成物は、細胞を対象に投与する前に単一のアウトプット組成物に組み合わされる。
一部の特定の態様において、プロセスの任意の段階または工程で、細胞の一部をサンプリングまたは収集してもよく、例えば単離、インキュベーション、操作、培養、および/または製剤化の間などの組成物が閉鎖系に留まっている間に、細胞を濃縮T細胞の組成物から採取し得る。一部の特定の態様において、かかる細胞は、生存能力、アポトーシス、活性化、刺激、成長、および/または消耗を含むがこれらに限定されるわけではないマーカー、特徴、または特性について分析され得る。いくつかの態様において、細胞は、濃縮T細胞の組成物が閉鎖系に留まっている間に、自動化プロセスによってサンプリングまたは収集される。いくつかの態様において、サンプリングまたは収集された細胞の分析は自動化されている。特定の態様において、分析は、無菌条件下で、閉鎖系で行われる。
薬学的組成物および製剤を含む方法によって調製された細胞および組成物、ならびに方法を実施するためのキット、システム、およびデバイスも提供される。また、養子細胞療法のための方法などの治療法を含む、細胞の使用のための方法および該方法によって調製される組成物、ならびに対象への投与のための薬学的組成物も提供される。
A.試料および細胞の調製
特定の態様において、提供される方法は、濃縮された細胞、例えばT細胞の1つまたは複数のインプット組成物を生成するために生物学的試料から細胞を単離、選択、および/または濃縮することに関連して使用される。いくつかの態様において、提供される方法は、特定の疾患もしくは病態を有する対象、または細胞療法を必要とするもしくは細胞療法が投与される対象などの対象から得られるまたは由来するものなどの、生物学的試料からの細胞またはその組成物の単離を含む。いくつかの局面において、対象は、細胞が単離、加工処理、および/または操作されている養子細胞療法などの特定の治療的介入を必要とする患者である対象などのヒトである。したがって、いくつかの態様における細胞は初代細胞、例えば初代ヒト細胞である。試料は、対象から直接採取された組織、体液、および他の試料を含む。生物学的試料は、生物学的供給源から直接得られた試料または加工処理される試料であり得る。生物学的試料は、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗などの体液、組織および器官試料に由来する加工処理された試料を含む組織および器官試料を含むが、これらに限定されるわけではない。
いくつかの局面において、試料は、血液もしくは血液由来の試料であるか、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシス産物であるかもしくはそれに由来する。例示的な試料としては、全血、末梢血単核細胞（PBMC）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸、精巣、卵巣、扁桃腺、もしくは他の器官、および/またはそれに由来する細胞が挙げられる。試料は、細胞療法、例えば養子細胞療法の状況において、自己由来および同種異系供給源由来の試料を含む。
いくつかの例では、対象の循環血液由来の細胞は、例えばアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。試料は、いくつかの局面において、T細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、および/または血小板を含み、いくつかの局面において、赤血球および血小板以外の細胞を含む。
いくつかの態様において、対象から収集された血球は、例えば血漿画分を除去し、その後の加工処理工程のために細胞を適切な緩衝液または培地に入れるために洗浄される。いくつかの態様において、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄される。いくつかの態様において、洗浄溶液は、カルシウムおよび/またはマグネシウムおよび/または多くのもしくはすべての二価カチオンを含まない。いくつかの局面において、洗浄工程は、製造者の指示に従って半自動「フロースルー」遠心分離機（例えばCobe 2991細胞プロセッサー、Baxter）によって達成される。いくつかの局面において、洗浄工程は、製造者の指示に従って接線流濾過（TFF）によって達成される。いくつかの態様において、細胞は、洗浄後に、例えばCa＋＋/Mg＋＋を含まないPBSなどの様々な生体適合性緩衝液に再懸濁される。一部の特定の態様において、血球試料の成分は除去され、細胞は直接培養培地に再懸濁される。
いくつかの態様において、調製方法は、形質導入および操作のための単離、選択および/もしくは濃縮および/もしくはインキュベーションの前もしくは後に、ならびに/または操作された細胞の培養および/もしくは採取後に、細胞を凍結する、例えば凍結保存するための工程を含む。いくつかの態様において、凍結およびその後の解凍工程は、細胞集団中の顆粒球および、ある程度まで、単球を除去する。いくつかの態様において、細胞は、例えば血漿および血小板を除去するための洗浄工程の後に、凍結溶液中に懸濁される。いくつかの局面では様々な公知の凍結溶液およびパラメータのいずれかを使用し得る。いくつかの態様において、細胞は、例えば、最終濃度が12.5％もしくは約12.5％、12.0％もしくは約12.0％、11.5％もしくは約11.5％、11.0％もしくは約11.0％、10.5％もしくは約10.5％、10.0％もしくは約10.0％、9.5％もしくは約9.5％、9.0％もしくは約9.0％、8.5％もしくは約8.5％、8.0％もしくは約8.0％、7.5％もしくは約7.5％、7.0％もしくは約7.0％、6.5％もしくは約6.5％、6.0％もしくは約6.0％、5.5％もしくは約5.5％、または5.0％もしくは約5.0％DMSO、あるいは1％〜15％、6％〜12％、5％〜10％、または6％〜8％DMSOである培地および/または溶液中で凍結、例えばクライオ凍結または凍結保存される。特定の態様において、細胞は、例えば、最終濃度が5.0％もしくは約5.0％、4.5％もしくは約4.5％、4.0％もしくは約4.0％、3.5％もしくは約3.5％、3.0％もしくは約3.0％、2.5％もしくは約2.5％、2.0％もしくは約2.0％、1.5％もしくは約1.5％、1.25％もしくは約1.25％、1.0％もしくは約1.0％、0.75％もしくは約0.75％、0.5％もしくは約0.5％、または0.25％もしくは約0.25％HSA、あるいは0.1％〜-5％、0.25％〜4％、0.5％〜2％、または1％〜2％HSAである培地および/または溶液中で凍結、例えばクライオ凍結または凍結保存される。一例は、20％DMSOおよび8％ヒト血清アルブミン（HSA）を含有するPBS、または他の適切な細胞凍結培地を使用することを含む。次にこれを培地で1:1に希釈して、DMSOおよびHSAの最終濃度がそれぞれ10％および4％になるようにする。次いで細胞を一般に毎分1°または約1°の速度で-80℃または約-80℃に凍結し、液体窒素貯蔵タンクの蒸気相で保存する。
いくつかの態様において、細胞または集団の単離は、1つまたは複数の調製および/または非親和性ベースの細胞分離工程を含む。いくつかの例では、細胞は、例えば不要な成分を除去する、所望の成分を濃縮する、特定の試薬に感受性の細胞を溶解または除去するために、洗浄、遠心分離、および/または1つもしくは複数の試薬の存在下でインキュベートされる。いくつかの例では、細胞は、密度、付着特性、サイズ、感受性、および/または特定の成分に対する耐性などの1つまたは複数の特性に基づいて分離される。いくつかの態様において、方法は、密度に基づく細胞分離方法、例えば赤血球を溶解することによる末梢血からの白血球の調製、およびパーコールまたはフィコール勾配による遠心分離を含む。
いくつかの態様において、選択工程の少なくとも一部は、細胞と選択試薬とのインキュベーションを含む。例えば、表面マーカー、例えば表面タンパク質、細胞内マーカー、または核酸などの1つまたは複数の特定の分子の細胞内または細胞上の発現または存在に基づいて1つまたは複数の異なる細胞型を選択するために、1つまたは複数の選択試薬を使用して行われ得る選択方法の一部としての、1つまたは複数の選択試薬とのインキュベーション。いくつかの態様において、かかるマーカーに基づく分離のための1つまたは複数の選択試薬を使用する任意の公知の方法を使用し得る。いくつかの態様において、1つまたは複数の選択試薬は、親和性または免疫親和性に基づく分離である分離をもたらす。例えば、いくつかの局面における選択は、細胞の発現または1つもしくは複数のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの発現レベルに基づく細胞および細胞集団の分離のための1つまたは複数の試薬とのインキュベーション、例えばかかるマーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーとのインキュベーション、続いて一般に、洗浄工程および抗体または結合パートナーに結合していない細胞からの抗体または結合パートナーに結合した細胞の分離によるものを含む。
かかるプロセスのいくつかの局面において、一定の体積の細胞が一定の量の所望の親和性に基づく選択試薬と混合される。免疫親和性に基づく選択は、分離される細胞と細胞上のマーカーに特異的に結合する分子、例えば固体表面、例えば粒子上の抗体または他の結合パートナーとの間に有利なエネルギー相互作用をもたらす任意のシステムまたは方法を使用して実施することができる。いくつかの態様において、方法は、細胞のマーカーに特異的な選択剤（例えば抗体）で被覆されたビーズ、例えば磁気ビーズなどの粒子を使用して行われる。粒子（例えばビーズ）は、エネルギー的に有利な相互作用を促進するのに役立つ一定な細胞密度対粒子（例えばビーズ）比で、振とうまたは混合しながら、チューブまたはバッグなどの容器内で細胞とインキュベートまたは混合され得る。他の場合には、方法は、選択のすべてまたは一部が遠心チャンバーの内部キャビティで、例えば遠心回転下で行われる細胞の選択を含む。いくつかの態様において、免疫親和性に基づく選択試薬などの選択試薬との細胞のインキュベーションは、遠心チャンバー内で行われる。一部の特定の態様において、単離または分離は、国際公開公報第2009/072003号、または米国特許出願第20110003380A1号に記載されているシステム、デバイス、または装置を使用して実施される。一例では、システムは、国際公開公報第2016/073602号に記載されているシステムである。
いくつかの態様において、遠心チャンバーのキャビティでかかる選択工程またはその一部（例えば抗体被覆粒子、例えば磁気ビーズとのインキュベーション）を行うことにより、ユーザは、様々な溶液の容量、加工処理中の溶液の添加およびそのタイミングなどの特定のパラメータを制御することができ、これは他の利用可能な方法と比較して利点を提供し得る。例えば、インキュベーション中にキャビティ内の液体容量を減少させる能力は、選択に使用される粒子（例えばビーズ試薬）の濃度を高めることができ、したがってキャビティ内の総細胞数に影響を及ぼすことなく溶液の化学的潜在能を高めることができる。これは次に、加工処理されている細胞と選択に使用される粒子間の対相互作用を増強することができる。いくつかの態様において、例えば本明細書に記載のシステム、回路、および制御に関連する場合、チャンバー内でインキュベーション工程を実施することは、インキュベーション中にユーザが所望の時間（1つまたは複数）に溶液の撹拌を実施することを可能にし、これも相互作用を改善することができる。
いくつかの態様において、細胞を選択試薬とともにインキュベートすることを含む、選択工程の少なくとも一部は、遠心チャンバー内で行われる。かかるプロセスのいくつかの局面において、一定の体積の細胞は、製造者の指示に従って同じ数の細胞および/または同じ体積の細胞の選択のためにチューブまたは容器において同様の選択を行う場合に通常使用されるよりもはるかに少ない量の、所望の親和性に基づく選択試薬と混合される。いくつかの態様において、製造者の指示に従った同じ数の細胞および/または同じ体積の細胞のチューブまたは容器ベースのインキュベーションにおいて細胞の選択に使用される同じ選択試薬（1つまたは複数）の量の5％以下、10％以下、15％以下、20％以下、25％以下、50％以下、60％以下、70％以下、または80％以下の1つまたは複数の選択試薬の量が使用される。
いくつかの態様において、細胞の選択、例えば免疫親和性に基づく選択のために、細胞は、抗体などの、任意でポリマーまたは表面などの足場、例えばビーズ、例えば磁気ビーズ、例えばCD4およびCD8に特異的なモノクローナル抗体に結合した磁気ビーズに結合した、濃縮するおよび/または枯渇させることを所望する細胞上の表面マーカーに特異的に結合するが、組成物中の他の細胞上の表面マーカーには特異的に結合しない分子などの、選択試薬とともに選択緩衝液も含む組成物中で、チャンバーのキャビティ内でインキュベートされる。いくつかの態様において、記載されているように、選択試薬は、振とうまたは回転しながらチューブ内で選択を行う場合に、同じ数の細胞または同じ体積の細胞の選択についてほぼ同じまたは同様の効率を達成するために典型的に使用されるまたは必要となる選択試薬の量と比較して、実質的により少ない量（例えば5％以下、10％以下、20％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下または80％以下の量）でチャンバーのキャビティ内の細胞に添加される。いくつかの態様において、インキュベーションは、細胞および選択試薬への選択緩衝液の添加を用いて行われ、例えば10mL〜200mL、例えば少なくとも10mLもしくは少なくとも約10mL、少なくとも20mLもしくは少なくとも約20mL、少なくとも30mLもしくは少なくとも約30mL、少なくとも40mLもしくは少なくとも約40mL、少なくとも50mLもしくは少なくとも約50mL、少なくとも60mLもしくは少なくとも約60mL、少なくとも70mLもしくは少なくとも約70mL、少なくとも80mLもしくは少なくとも約80mL、少なくとも90mLもしくは少なくとも約90mL、少なくとも100mLもしくは少なくとも約100mL、少なくとも150mLもしくは少なくとも約150mL、または少なくとも200mLもしくは少なくとも約200mLの試薬のインキュベーションで標的体積を達成する。いくつかの態様において、選択緩衝液および選択試薬は、細胞に添加する前にあらかじめ混合される。いくつかの態様において、選択緩衝液および選択試薬は、細胞に別々に添加される。いくつかの態様において、選択インキュベーションは、周期的な穏やかな混合条件で行われ、これは、エネルギー的に有利な相互作用を促進するのに役立ち、それにより、高い選択効率を達成しながらより少ない全体的な選択試薬の使用を可能にすることができる。
いくつかの態様において、選択試薬とのインキュベーションの総持続時間は、5分〜6時間または約5分から約6時間、例えば30分〜3時間、例えば少なくとも30分もしくは少なくとも約30分、少なくとも60分もしくは少なくとも約60分、少なくとも120分もしくは少なくとも約120分、または少なくとも180分もしくは少なくとも約180分である。
いくつかの態様において、インキュベーションは一般に、混合条件下で、例えば一般に比較的低い力または速度、例えば細胞をペレット化するために使用される速度よりも低い速度、例えば600rpm〜1700rpmまたは約600rpm〜約1700rpm（例えば600rpmもしくは約600rpmもしくは少なくとも600rpm、1000rpmもしくは約1000rpmもしくは少なくとも1000rpm、または1500rpmもしくは約1500rpmもしくは少なくとも1500rpm、または1700rpmもしくは約1700rpmもしくは少なくとも1700rpm）、例えば80g〜100gまたは約80g〜約100g（例えば80gもしくは約80gもしくは少なくとも80g、85gもしくは約85gもしくは少なくとも85g、90gもしくは約90gもしくは少なくとも90g、95gもしくは約95gもしくは少なくとも95g、または100gもしくは約100gもしくは少なくとも100g）のチャンバーまたは他の容器の試料または壁におけるRCFでのスピンの存在下で行われる。いくつかの態様において、スピンは、かかる低い速度でのスピンとそれに続く休止期間、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10秒間のスピンおよび/または休止、例えば約1または2秒間のスピンとそれに続く約5、約6、約7、または約8秒間の休止という間隔の繰り返しを用いて行われる。
いくつかの態様において、かかるプロセスは、チャンバーが一体化されている完全に閉鎖されたシステム内で実施される。いくつかの態様において、このプロセス（およびいくつかの局面では、アフェレーシス試料などの細胞を含有する試料を洗浄する先の洗浄工程などの1つまたは複数の追加の工程も）は、自動化されたプログラムを使用して単一の閉鎖系内で洗浄および結合工程を完了するために、細胞、試薬、および他の構成要素が適切な時間にチャンバーに引き込まれ、チャンバーから押し出され、遠心分離が行われるように、自動化された方式で実施される。
いくつかの態様において、細胞と1つおよび/または複数の選択試薬のインキュベーションおよび/または混合の後、インキュベートされた細胞は、特定の1つまたは複数の試薬の存在の有無に基づいて細胞を選択するために分離に供される。いくつかの態様において、分離は、選択試薬との細胞のインキュベーションが行われたのと同じ閉鎖系内で行われる。いくつかの態様において、選択試薬とのインキュベーション後、選択試薬が結合した細胞を含むインキュベートされた細胞は、細胞の免疫親和性に基づく分離のためのシステムに移される。いくつかの態様において、免疫親和性に基づく分離のためのシステムは、磁気分離カラムであるか、または磁気分離カラムを含む。
かかる分離工程は、試薬、例えば抗体もしくは結合パートナーに結合した細胞がさらなる使用のために保持される陽性選択、および/または試薬、例えば抗体もしくは結合パートナーに結合していない細胞が保持される陰性選択に基づき得る。いくつかの例では、両方の画分がさらなる使用のために保持される。いくつかの局面において、陰性選択は、不均一集団において細胞型を特異的に同定する抗体が利用可能でない場合に特に有用であり得、そのため分離は、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づいて最も良好に行われる。
いくつかの態様において、プロセス工程は、親和性に基づく選択を実施することができるシステムまたは装置を使用することなどの、インキュベートされた細胞の陰性および/または陽性選択をさらに含む。いくつかの態様において、単離は、陽性選択による特定の細胞集団の濃縮、または陰性選択による特定の細胞集団の枯渇によって行われる。いくつかの態様において、陽性または陰性選択は、それぞれ陽性または陰性選択された細胞上に発現される（マーカー＋）または比較的高いレベルで発現される（マーカー高）1つまたは複数の表面マーカーに特異的に結合する1つまたは複数の抗体または他の結合剤とともに細胞をインキュベートすることによって達成される。
分離は、特定の細胞集団または特定のマーカーを発現する細胞の100％の濃縮または除去をもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現する細胞などの特定の種類の細胞の陽性選択または濃縮は、かかる細胞の数またはパーセンテージを増加させることを指すが、マーカーを発現しない細胞の完全な非存在をもたらす必要はない。同様に、マーカーを発現する細胞などの特定の種類の細胞の陰性選択、除去、または枯渇は、かかる細胞の数またはパーセンテージを減少させることを指すが、かかる細胞すべての完全な除去をもたらす必要はない。
いくつかの例では、1回の工程から陽性または陰性選択された画分が、その後の陽性または陰性選択などの別の分離工程に供される場合、複数回の分離工程が行われる。いくつかの例では、それぞれが陰性選択の標的となるマーカーに特異的な複数の抗体または結合パートナーとともに細胞をインキュベートすることなどによって、複数のマーカーを同時に発現する細胞を単一の分離工程で枯渇させることができる。同様に、様々な細胞型上に発現された複数の抗体または結合パートナーとともに細胞をインキュベートすることによって、複数の細胞型が同時に陽性選択され得る。
例えば、いくつかの局面において、T細胞の特定の亜集団、例えば1つまたは複数の表面マーカーに陽性であるかまたはそれを高レベルに発現する細胞、例えばCD28＋、CD62L＋、CCR7＋、CD27＋、CD127＋、CD4＋、CD8＋、CD45RA＋、および/またはCD45RO＋T細胞は、陽性または陰性選択技術によって単離される。いくつかの態様において、かかる細胞は、かかるマーカーに特異的に結合する1つまたは複数の抗体または結合パートナーとのインキュベーションによって選択される。いくつかの態様において、抗体または結合パートナーを、選択を実施するための固体支持体またはマトリックス、例えば磁気ビーズまたは常磁性ビーズに、例えば直接的または間接的にコンジュゲートさせることができる。例えば、CD3＋、CD28＋T細胞は、CD3/CD28結合磁気ビーズ（例えばDYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expander、および/またはExpACT（登録商標）ビーズ）を使用して陽性選択することができる。
いくつかの態様において、T細胞は、B細胞、単球、または他の白血球などの非T細胞上に発現されるマーカー、例えばCD14の陰性選択によってPBMC試料から分離される。いくつかの局面において、CD4＋またはCD8＋選択工程を使用してCD4＋ヘルパーT細胞およびCD8＋細胞傷害性T細胞を分離する。かかるCD4＋およびCD8＋集団は、1つまたは複数のナイーブT細胞、メモリーT細胞、および/またはエフェクターT細胞亜集団上に発現されるまたは比較的高い程度に発現されるマーカーについての陽性または陰性選択によって、亜集団にさらに分類することができる。
いくつかの態様において、CD8＋T細胞は、それぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づく陽性または陰性選択などによって、ナイーブ、中央メモリー、エフェクターメモリー、および/または中央メモリー幹細胞がさらに濃縮または枯渇される。いくつかの態様において、中央メモリーT（TCM）細胞の濃縮は、有効性を高めるため、例えば長期生存、拡大、および/または投与後の生着を改善するために行われ、これは、いくつかの局面ではかかる亜集団において特に堅固である。Terakura et al.,（2012）Blood.1:72-82;Wang et al.（2012）J Immunother.35（9）:689-701参照。いくつかの態様において、TCMが濃縮されたCD8＋T細胞とCD4＋T細胞を組み合わせることは、有効性をさらに増強する。
態様において、メモリーT細胞は、CD8＋末梢血リンパ球のCD62L＋およびCD62L-サブセットの両方に存在する。PBMCは、抗CD8抗体および抗CD62L抗体などを使用して、CD62L-CD8＋および/またはCD62L＋CD8＋画分を濃縮または枯渇させることができる。
いくつかの態様において、中央メモリーT（TCM）細胞の濃縮は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、および/またはCD127の陽性または高い表面発現に基づく;いくつかの局面では、CD45RAおよび/またはグランザイムBを発現または高発現する細胞の陰性選択に基づく。いくつかの局面において、TCM細胞が濃縮されたCD8＋集団の単離は、CD4、CD14、CD45RAを発現する細胞の枯渇、およびCD62Lを発現する細胞の陽性選択または濃縮によって行われる。一局面において、中央メモリーT（TCM）細胞の濃縮は、CD4発現に基づいて選択された細胞の陰性画分から出発して、これをCD14およびCD45RAの発現に基づく陰性選択、ならびにCD62Lに基づく陽性選択に供して行われる。いくつかの局面ではかかる選択は同時に行われ、他の局面ではいずれかの順序で連続的に行われる。いくつかの局面において、CD8＋T細胞集団または亜集団を調製するのに使用されるのと同じCD4発現に基づく選択工程が、CD4＋T細胞集団または亜集団を生成するためにも使用され、そのためCD4に基づく分離からの陽性および陰性画分の両方が保持され、方法のその後の工程で使用され、任意で1つまたは複数のさらなる陽性または陰性選択工程が続く。いくつかの態様において、CD4＋T細胞集団の選択およびCD8＋T細胞集団の選択は同時に行われる。いくつかの態様において、CD4＋T細胞集団およびCD8＋T細胞集団の選択は、いずれかの順序で連続的に行われる。いくつかの態様において、細胞を選択するための方法は、米国特許出願公開第20170037369号に記載されているものを含み得る。いくつかの態様において、選択後に、選択されたCD4＋T細胞集団および選択されたCD8＋T細胞集団を組み合わせてもよい。いくつかの局面において、選択されたCD4＋T細胞集団および選択されたCD8＋T細胞集団は、本明細書に記載されるようにバイオリアクターバッグ内で組み合わされてもよい。
特定の態様において、生物学的試料、例えばPBMCまたは他の白血球の試料は、陰性画分および陽性画分の両方が保持されるCD4＋T細胞の選択に供される。一部の特定の態様において、CD8＋T細胞は陰性画分から選択される。いくつかの態様において、生物学的試料は、陰性画分および陽性画分の両方が保持されるCD8＋T細胞の選択に供される。一部の特定の態様において、CD4＋T細胞は陰性画分から選択される。
特定の例では、PBMCの試料または他の白血球試料は、陰性画分および陽性画分の両方が保持されるCD4＋T細胞の選択に供される。次いで、陰性画分は、CD14およびCD45RAまたはCD19の発現に基づく陰性選択、ならびにCD62LまたはCCR7などの中央メモリーT細胞に特徴的なマーカーに基づく陽性選択に供され、ここで陽性選択と陰性選択はいずれの順序でも行われる。
CD4＋Tヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、ナイーブ細胞、中央メモリー細胞、およびエフェクター細胞に分類され得る。CD4＋リンパ球は標準的な方法によって得ることができる。いくつかの態様において、ナイーブCD4＋Tリンパ球は、CD45RO-、CD45RA＋、CD62L＋、またはCD4＋T細胞である。いくつかの態様において、中央メモリーCD4＋T細胞は、CD62L＋およびCD45RO＋である。いくつかの態様において、エフェクターCD4＋T細胞は、CD62L-およびCD45RO-である。
一例では、陰性選択によってCD4＋T細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的にはCD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。いくつかの態様において、抗体または結合パートナーは、陽性および/または陰性選択のための細胞の分離を可能にする、磁気ビーズまたは常磁性ビーズなどの固体支持体またはマトリックスに結合される。例えば、いくつかの態様において、細胞および細胞集団は、免疫磁気（または親和性磁気）分離技術（Methods in Molecular Medicine,vol.58:Metastasis Research Protocols,Vol.2:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,p 17-25 Edited by:S.A.Brooks and U.Schumacher（著作権）Humana Press Inc.,Totowa,NJに総説されている）を用いて分離または単離される。
いくつかの局面において、分離される細胞のインキュベートされた試料または組成物は、小型の磁化可能または磁気応答性材料、例えば磁気応答性粒子または微粒子、例えば常磁性ビーズ（例えばDynalbeadsまたはMACS（登録商標）ビーズなど）を含有する選択試薬とともにインキュベートされる。磁気応答性材料、例えば粒子は、一般に、分離することを所望する、例えば陰性または陽性選択することを所望する1つまたは複数の細胞、または細胞集団上に存在する分子、例えば表面マーカーに特異的に結合する結合パートナー、例えば抗体に直接的または間接的に結合される。
いくつかの態様において、磁性粒子またはビーズは、抗体または他の結合パートナーなどの特異的結合メンバーに結合した磁気応答性材料を含む。磁気分離法で使用するための多くの周知の磁気応答性材料、例えば参照により本明細書に組み入れられる、Moldayの米国特許第4,452,773号、および欧州特許第452342B号に記載されているものが知られている。Owenの米国特許第4,795,698号およびLibertiらの米国特許第5,200,084号に記載されているものなどのコロイドサイズの粒子も使用され得る。
インキュベーションは、一般に、抗体もしくは結合パートナー、または磁性粒子もしくはビーズに付着している、かかる抗体もしくは結合パートナーに特異的に結合する分子、例えば二次抗体もしくは他の試薬が、試料中の細胞上に存在する場合は細胞表面分子に特異的に結合する条件下で行われる。
一部の特定の態様において、磁気応答性粒子は、一次抗体もしくは他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素、またはストレプトアビジンで被覆される。一部の特定の態様において、磁性粒子は、1つまたは複数のマーカーに特異的な一次抗体のコーティングを介して細胞に付着される。一部の特定の態様において、ビーズではなく細胞が一次抗体または結合パートナーで標識され、次いで細胞型特異的二次抗体または他の結合パートナー（例えばストレプトアビジン）で被覆された磁性粒子が添加される。一部の特定の態様において、ストレプトアビジン被覆磁性粒子が、ビオチン化一次抗体または二次抗体と組み合わせて使用される。
いくつかの局面において、分離は、試料を磁場に置き、磁気応答性または磁化可能粒子が付着している細胞を磁石に引き付け、非標識細胞から分離する手順で達成される。陽性選択の場合は、磁石に引き付けられる細胞が保持され、陰性選択の場合は、引き付けられない細胞（非標識細胞）が保持される。いくつかの局面において、陽性選択と陰性選択の組合せは同じ選択工程中に行われ、その場合は陽性画分と陰性画分が保持され、さらに加工処理されるかまたはさらなる分離工程に供される。
いくつかの態様において、親和性に基づく選択は、磁気活性化細胞選別（MACS）（Miltenyi Biotech,Auburn,CA）による。磁気活性化細胞選別（MACS）、例えばCliniMACSシステムは、磁化された粒子が付着した細胞の高純度の選択が可能である。一部の特定の態様において、MACSは、外部磁場の印加後に非標的種と標的種が連続的に溶出されるモードで動作する。すなわち、磁化粒子に付着した細胞は、付着していない種が溶出される間、適所に保持される。次に、この最初の溶出工程が完了した後、磁場に捕捉されて溶出が妨げられていた種は、それらが溶出され、回収され得るように何らかの方法で遊離される。一部の特定の態様において、非標的細胞は標識され、細胞の不均一な集団から除去される。
いくつかの態様において、磁気応答性粒子は、その後インキュベート、培養および/または操作されることになる細胞に付着したままであり、いくつかの局面において、粒子は、患者に投与するための細胞に付着したままである。いくつかの態様において、磁化可能粒子または磁気応答性粒子は細胞から除去される。細胞から磁化可能粒子を除去する方法は公知であり、例えば競合する非標識抗体、磁化可能粒子または切断可能なリンカーにコンジュゲートされた抗体などの使用を含む。いくつかの態様において、磁化可能粒子は生分解性である。
いくつかの態様において、単離および/または選択は、濃縮されたT細胞、例えばCD3＋T細胞、CD4＋T細胞、および/またはCD8＋T細胞の1つまたは複数のインプット組成物をもたらす。いくつかの態様において、2つまたはそれより多くの別個のインプット組成物が、単一の生物学的試料から単離、選択、濃縮、または取得される。いくつかの態様において、別々のインプット組成物は、同じ対象から収集、採取、および/または取得された別々の生物学的試料から単離、選択、濃縮、および/または取得される。
一部の特定の態様において、1つまたは複数のインプット組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、もしくは100％もしくは約100％のCD3＋T細胞を含む濃縮T細胞の組成物であるか、またはそれを含む。特定の態様において、濃縮T細胞のインプット組成物は、本質的にCD3＋T細胞からなる。
一部の特定の態様において、1つまたは複数のインプット組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、もしくは100％もしくは約100％のCD4＋T細胞を含む濃縮CD4＋T細胞の組成物であるか、またはそれを含む。一部の特定の態様において、CD4＋T細胞のインプット組成物は、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、もしくは0.01％未満のCD8＋T細胞を含む、および/またはCD8＋T細胞を含まない、および/またはCD8＋T細胞不含であるかもしくは実質的に不含である。いくつかの態様において、濃縮T細胞の組成物は、本質的にCD4＋T細胞からなる。
一部の特定の態様において、1つまたは複数の組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、もしくは100％もしくは約100％のCD8＋T細胞であるかまたはそれを含む、CD8＋T細胞の組成物であるか、またはそれを含む。一部の特定の態様において、CD8＋T細胞の組成物は、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、または0.01％未満のCD4＋T細胞を含む、および/またはCD4＋T細胞を含まない、および/またはCD4＋T細胞不含であるかもしくは実質的に不含である。いくつかの態様において、濃縮されたT細胞の組成物は、本質的にCD8＋T細胞からなる。
いくつかの態様において、濃縮T細胞の1つまたは複数のインプット組成物は、単離、選択、および/または濃縮後に、凍結、例えば凍結保存および/またはクライオ凍結される。いくつかの態様において、1つまたは複数のインプット組成物は、細胞の組成物のインキュベーション、活性化、刺激、操作、形質導入、トランスフェクション、培養、拡大、採取、および/または製剤化のいずれかの工程の前に、凍結、例えば凍結保存および/またはクライオ凍結される。特定の態様において、1つまたは複数のクライオ凍結されたインプット組成物は、例えば-80℃または約-80℃で保存される。
B.細胞の活性化および刺激
いくつかの態様において、提供される方法は、刺激条件下で細胞をインキュベートすることに関連して使用される。いくつかの態様において、刺激条件は、細胞、例えばCD4＋T細胞におけるシグナル、例えばTCRおよび/または共受容体から生成されるシグナルを活性化もしくは刺激する、および/または活性化もしくは刺激することができる条件を含む。いくつかの態様において、刺激条件は、刺激試薬、例えば細胞におけるシグナルを活性化もしくは刺激する、および/または活性化もしくは刺激することができる試薬とともにおよび/またはその存在下で細胞を培養（culturing）、培養（cultivating）、インキュベート、活性化、増殖する1つまたは複数の工程を含む。いくつかの態様において、刺激試薬は、TCRおよび/または共受容体を刺激および/または活性化する。特定の態様において、刺激試薬は、セクションI-B-1に記載されている試薬である。
一部の特定の態様において、濃縮されたT細胞の1つまたは複数の組成物は、例えばセクションI-Cに提供されている技術によって、細胞を遺伝子操作する前に、例えば、細胞をトランスフェクトしおよび/または形質導入する前に、刺激条件下でインキュベートされる。特定の態様において、濃縮されたT細胞の1つまたは複数の組成物は、1つまたは複数の組成物が、生物学的試料から単離され、選択され、濃縮され、または取得された後に、刺激条件下でインキュベートされる。特定の態様において、1つまたは複数の組成物はインプット組成物である。特定の態様において、1つまたは複数のインプット組成物は、以前に凍結冷凍および保存されており、インキュベーションの前に融解される。
一部の特定の態様において、濃縮T細胞の1つまたは複数の組成物は、濃縮T細胞の2つの別個の組成物、例えば別個のインプット組成物であるか、またはそれを含む。特定の態様において、濃縮T細胞の2つの別個の組成物、例えば同じ生物学的試料から選択、単離、および/または濃縮された濃縮T細胞の2つの別個の組成物は、刺激条件下で別々にインキュベートされる。一部の特定の態様において、2つの別個の組成物は、濃縮CD4＋T細胞の組成物を含む。特定の態様において、2つの別個の組成物は、濃縮CD8＋T細胞の組成物を含む。いくつかの態様において、濃縮CD4＋T細胞および濃縮CD8＋T細胞の2つの別個の組成物は、刺激条件下で別々にインキュベートされる。いくつかの態様において、濃縮T細胞の単一の組成物が刺激条件下でインキュベートされる。一部の特定の態様において、単一の組成物は、濃縮CD4＋T細胞の組成物である。いくつかの態様において、単一の組成物は、インキュベーションの前に別個の組成物から組み合わされた濃縮CD4＋およびCD8＋T細胞の組成物である。
いくつかの態様において、刺激条件下でインキュベートされる濃縮CD4＋T細胞の組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD4＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、刺激条件下でインキュベートされる濃縮CD4＋T細胞の組成物は、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、または0.01％未満のCD8＋T細胞を含む、および/またはCD8＋T細胞を含まない、および/またはCD8＋T細胞不含であるかもしくは実質的に不含である。
いくつかの態様において、刺激条件下でインキュベートされる濃縮CD8＋T細胞の組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD8＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、刺激条件下でインキュベートされる濃縮CD8＋T細胞の組成物は、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、または0.01％未満のCD4＋T細胞を含む、および/またはCD4＋T細胞を含まない、および/またはCD4＋T細胞不含であるかもしくは実質的に不含である。
いくつかの態様において、濃縮CD4＋およびCD8＋T細胞の別個の組成物は、単一の組成物に組み合わされ、刺激条件下でインキュベートされる。一部の特定の態様において、濃縮CD4＋および濃縮CD8＋T細胞の別個の刺激された組成物は、インキュベーションが行われたおよび/または完了した後に単一の組成物に組み合わされる。
一部の特定の態様において、濃縮されたT細胞の1つまたは複数の組成物は、例えばセクションI-Cに提供されている技術によって、細胞を遺伝子操作する前に、例えば、細胞をトランスフェクトしおよび/または形質導入する前に、刺激条件下でインキュベートされる。特定の態様において、濃縮されたT細胞の1つまたは複数の組成物は、1つまたは複数の組成物が、生物学的試料から単離され、選択され、濃縮され、または取得された後に、刺激条件下でインキュベートされる。特定の態様において、1つまたは複数の組成物はインプット組成物である。いくつかの態様において、1つまたは複数のインプット組成物は、以前に凍結冷凍および保存されており、インキュベーションの前に融解される。
いくつかの態様において、刺激条件下でのインキュベーションは、刺激条件、例えば集団における細胞の増殖、拡大、活性化、および/もしくは生存を誘導する、抗原曝露を模倣する、ならびに/または組換え抗原受容体の導入などの遺伝子操作のために細胞をプライミングするように設計された条件の存在下でのインキュベーションによるものを含む、培養(culture)、培養(cultivation)、刺激、活性化、増殖を含み得る。特定の態様において、刺激条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、作用物質、例えば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および/または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化するように設計された他の任意の剤の1つまたは複数を含み得る。
いくつかの局面において、刺激条件下での刺激および/またはインキュベーションは、Riddellらの米国特許第6,040,177号、Klebanoff et al.（2012）J Immunother.35（9）:651-660、Terakura et al.（2012）Blood.1:72-82、および/またはWang et al.（2012）J Immunother.35（9）:689-701に記載されているような技術に従って行われる。
いくつかの態様において、細胞、例えばT細胞、細胞の組成物、ならびに/あるいはCD4＋およびCD8＋T細胞またはその組成物、集団、もしくは亜集団などの細胞集団は、培養開始組成物に非分裂末梢血単核細胞（PBMC）などのフィーダ細胞を添加すること（例えば、得られる細胞の集団が、拡大される初期集団中の各Tリンパ球につき少なくとも約5、少なくとも約10、少なくとも約20、または少なくとも約40またはそれより多くのPBMCフィーダ細胞を含むように）、および培養物をインキュベートすること（例えばT細胞の数を拡大するのに十分な時間）によって拡大される。いくつかの局面において、非分裂フィーダ細胞は、γ線照射PBMCフィーダ細胞を含み得る。いくつかの態様において、PBMCは、細胞分裂を防ぐために約3000〜3600ラドの範囲のγ線を照射される。いくつかの局面において、フィーダ細胞は、T細胞集団の添加の前に培地に添加される。
いくつかの態様において、刺激条件は、ヒトTリンパ球の増殖に適した温度、例えば少なくとも約25℃、一般に少なくとも約30℃、一般に37℃または約37℃を含む。いくつかの態様において、培養中に、温度シフト、例えば37℃から35℃への温度シフトが行われる。任意で、インキュベーションは、非分裂EBV形質転換リンパ芽球様細胞（LCL）をフィーダ細胞として添加することをさらに含み得る。LCLは、約6000〜10,000ラドの範囲のγ線で照射することができる。いくつかの局面におけるLCLフィーダ細胞は、少なくとも約10:1のLCLフィーダ細胞対初期Tリンパ球比などの、任意の適切な量で提供される。
態様において、抗原特異的であるCD4＋およびCD8＋の集団は、ナイーブまたは抗原特異的Tリンパ球を抗原で刺激することによって得ることができる。例えば、サイトメガロウイルス抗原に対する抗原特異的T細胞株またはクローンは、感染した対象からT細胞を単離し、同じ抗原で細胞をインビトロで刺激することによって生成することができる。ナイーブT細胞も使用し得る。
特定の態様において、刺激条件は、細胞を刺激試薬とともにインキュベート、培養(culturing)、および/または培養(cultivating)することを含む。特定の態様において、刺激試薬は、セクションI-B-1に記載されている試薬である。一部の特定の態様において、刺激試薬はビーズを含むかまたは含有する。一部の特定の態様において、刺激条件下での細胞のインキュベーション、培養(culturing)、および/または培養(cultivating)の出発および/または開始は、細胞が刺激試薬と接触するときおよび/または刺激試薬とともにインキュベートされるときに起こる。特定の態様において、細胞は、細胞を遺伝子操作する、例えば形質導入またはトランスフェクションなどによって組換えポリヌクレオチドを細胞に導入する前、その間、および/またはその後にインキュベートされる。
いくつかの態様において、濃縮T細胞の組成物は、刺激試薬および/またはビーズ対細胞の3:1もしくは約3:1、2.5:1もしくは約2.5:1、2:1もしくは約2:1、1.5:1もしくは約1.5:1、1.25:1もしくは約1.25:1、1.2:1もしくは約1.2:1、1.1:1もしくは約1.1:1、1:1もしくは約1:1、0.9:1もしくは約0.9:1、0.8:1もしくは約0.8:1、0.75:1もしくは約0.75:1、0.67:1もしくは約0.67:1、0.5:1もしくは約0.5:1、0.3:1もしくは約0.3:1、または0.2:1もしくは約0.2:1の比率でインキュベートされる。特定の態様において、刺激試薬および/またはビーズ対細胞の比率は、2.5:1〜0.2:1、2:1〜0.5:1、1.5:1〜0.75:1、1.25:1〜0.8:1、1.1:1〜0.9:1である。特定の態様において、刺激試薬対細胞の比率は、約1:1または1:1である。
特定の態様において、細胞は、刺激性条件下でのインキュベーションの前および/または間に、mTOR活性を阻害する作用物質、例えばセクションIIに記載された作用物質とインキュベートされず、接触されず、および/または曝露されない。
一部の特定の態様において、インキュベーションの少なくとも一部は、mTOR活性を阻害する作用物質、例えば、セクションIIに記載されている作用物質の存在下で行われる。いくつかの態様において、インキュベーションの全部および/または全体は、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で行われる。
特定の態様において、細胞は、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で、刺激性試薬とともにインキュベートされる。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、セクションIIに記載されている作用物質である。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、さらなるキナーゼの活性も阻害する。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、ホスホイノシトール-3キナーゼ（PI3K）活性も阻害する。一部の特定の態様において、作用物質は、mTOR活性を選択的に阻害する、例えば、mTOR活性を阻害するのに十分な濃度において、PI3K活性を検出可能に阻害せず、および/またはmTOR活性と同じ程度までPI3K活性を阻害しない。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質はキナーゼ活性を阻害する。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1および/またはmTORC2活性を阻害する。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質はmTORC1およびmTORC2活性を阻害する。
いくつかの態様において、作用物質としては、PI-103、SF1126、BGT226、XL765、PF-04691502、NVP-BEZ235、ピラゾロピリミジン、トリンl、トルキニブ（PP242）、PP30、Ku-0063794、WAY-600（Wyeth）、WAY-687（Wyeth）、WAY-354（Wyeth）、AZD8055、ラパマイシン（シロリムス）、テムシロリムス（CC1779）、エベロリムス（RAD001）、デフォロリムス（AP23573）、AZD8055（AstraZeneca）およびOSI-027（OSI）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、セクションIIに挙げられている式、例えば式（I）、式（II）または式（III）を有しまたは含む。いくつかの態様において、該作用物質は化合物155、化合物246または化合物63である。
一部の特定の態様において、細胞は、mTOR活性を阻害し、低減し、および/または減少させる濃度での、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下でインキュベートされる。いくつかの態様において、濃度は、mTORの1種または複数種の活性を、約25％もしくは少なくとも25％、約30％もしくは少なくとも30％、約40％もしくは少なくとも40％、約50％もしくは少なくとも50％、約60％もしくは少なくとも60％、約70％もしくは少なくとも70％、約80％もしくは少なくとも80％、約85％もしくは少なくとも85％、約90％もしくは少なくとも90％、約95％もしくは少なくとも95％、約97％もしくは少なくとも97％、約98％もしくは少なくとも98％、約99％もしくは少なくとも99％または約99.9％もしくは少なくとも99.9％、阻害し、低減し、および/または減少させる。いくつかの態様において、作用物質の濃度は、初代T細胞が増殖および/または拡大することを抑制しない。いくつかの態様において、細胞は、1nM〜1μM、1nM〜100nM、50nM〜200nM、100nM〜250nM、200nM〜500nM、500nM〜1μM、1μM〜10μMまたは5μM〜50μMのmTOR活性を阻害する作用物質の存在下でインキュベートされる。一部の特定の態様において、細胞は、0.1nM、約0.1nMもしくは少なくとも0.1nM、0.5nM、約0.5nMもしくは少なくとも0.5nM、1nM、約1nMもしくは少なくとも1nM、5nM、約5nMもしくは少なくとも5nM、10nM、約10nMもしくは少なくとも10nM、25nM、約25nMもしくは少なくとも25nM、50nM、約50nMもしくは少なくとも50nM、100nM、約100nMもしくは少なくとも100nM、150nM、約150nMもしくは少なくとも150nM、200nM、約200nMもしくは少なくとも200nM、250nM、約250nMもしくは少なくとも250nM、500nM、約500nMもしくは少なくとも500nM、1μM、約1μMもしくは少なくとも1μM、5μM、約5μMもしくは少なくとも5μM、10μM、約10μMもしくは少なくとも10μM、25μM、約25μMもしくは少なくとも25μM、50μM、約50μMもしくは少なくとも50μMまたは100μM、約100μMもしくは少なくとも100μMのmTOR活性を阻害する作用物質の存在下で、インキュベートされる。
いくつかの態様において、細胞は化合物155の存在下でインキュベートされる。一部の特定の態様において、細胞は、1nM〜1μM、1nM〜100nM、50nM〜200nM、100nM〜250nMまたは200nM〜500nMの化合物155の存在下でインキュベートされる。特定の態様において、細胞は、10nM、約10nMもしくは少なくとも10nM、25nM、約25nMもしくは少なくとも25nM、50nM、約50nMもしくは少なくとも50nM、100nM、約100nMもしくは少なくとも100nM、150nM、約150nMもしくは少なくとも150nM、200nM、約200nMもしくは少なくとも200nM、250nM、約250nMもしくは少なくとも250nMまたは500nM、約500nMもしくは少なくとも500nMの化合物155の存在下でインキュベートされる。
一部の特定の態様において、細胞は化合物246の存在下でインキュベートされる。一部の特定の態様において、細胞は、1nM〜1μM、1nM〜100nM、50nM〜200nM、100nM〜250nMまたは200nM〜500nMの化合物155の存在下でインキュベートされる。一部の特定の態様において、細胞は、10nM、約10nMもしくは少なくとも10nM、25nM、約25nMもしくは少なくとも25nM、50nM、約50nMもしくは少なくとも50nM、100nM、約100nMもしくは少なくとも100nM、150nM、約150nMもしくは少なくとも150nM、200nM、約200nMもしくは少なくとも200nM、250nM、約250nMもしくは少なくとも250nMまたは500nM、約500nMもしくは少なくとも500nMの化合物246の存在下でインキュベートされる。
特定の態様において、細胞は化合物63の存在下でインキュベートされる。一部の特定の態様において、細胞は、1nM〜1μM、1nM〜100nM、50nM〜200nM、100nM〜250nMまたは200nM〜500nMの化合物63の存在下でインキュベートされる。いくつかの態様において、細胞は、10nM、約10nMもしくは少なくとも10nM、25nM、約25nMもしくは少なくとも25nM、50nM、約50nMもしくは少なくとも50nM、100nM、約100nMもしくは少なくとも100nM、150nM、約150nMもしくは少なくとも150nM、200nM、約200nMもしくは少なくとも200nM、250nM、約250nMもしくは少なくとも250nMまたは500nM、約500nMもしくは少なくとも500nMの化合物63の存在下でインキュベートされる。
いくつかの態様において、組成物または細胞は、刺激条件または刺激性作用物質の存在下でインキュベートされる。このような条件には、抗原曝露を模倣するために、および/または、遺伝子操作のために、例えば組換え抗原受容体の導入のために細胞を刺激する（prime）ために、集団中の細胞の増殖、拡大、活性化および/または生存を誘導するように設計された条件が含まれる。例示的な刺激性試薬は、以下に記載されている。
いくつかの態様において、刺激および/または活性化のための条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、作用物質、例えば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および/または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化するように設計された他の任意の剤の1つまたは複数を含み得る。
いくつかの局面において、インキュベーションは、Riddellらの米国特許第6,040,177号、Klebanoff et al.（2012）J Immunother.35（9）:651-660、Terakura et al.（2012）Blood.1:72-82、および/またはWang et al.（2012）J Immunother.35（9）:689-701に記載されているような技術に従って行われる。
いくつかの態様において、1つまたは複数の刺激条件または刺激剤の存在下でのインキュベーションの少なくとも一部は、例えば国際公開公報第2016/073602号に記載されているような遠心回転下で、遠心チャンバーの内部キャビティで行われる。いくつかの態様において、遠心チャンバーで行われるインキュベーションの少なくとも一部は、刺激および/または活性化を誘導するための1つまたは複数の試薬と混合することを含む。いくつかの態様において、選択された細胞などの細胞は、遠心チャンバー内で刺激条件または刺激剤と混合される。かかるプロセスのいくつかの局面において、一定の体積の細胞は、細胞培養プレートまたは他のシステムで同様の刺激を行う場合に通常使用されるよりもはるかに少ない量の1つまたは複数の刺激条件または刺激剤と混合される。
いくつかの態様において、刺激剤は、選択が、周期的に振とうまたは回転しながら遠心チャンバー内、例えばチューブまたはバッグ内で混合することなく行われる場合に、同じ数の細胞または同じ体積の細胞の選択についてほぼ同じまたは同様の効率を達成するために典型的に使用されるまたは必要となる刺激剤の量と比較して、実質的により少ない量（例えば5％以下、10％以下、20％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下または80％以下の量）でチャンバーのキャビティ内の細胞に添加される。いくつかの態様において、インキュベーションは、細胞および刺激剤へのインキュベーション緩衝液の添加を用いて行われ、例えば10mL〜200mL、例えば少なくとも10mLもしくは少なくとも約10mLもしくは約10mL、少なくとも20mLもしくは少なくとも約20mLもしくは約20mL、少なくとも30mLもしくは少なくとも約30mLもしくは約30mL、少なくとも40mLもしくは少なくとも約40mLもしくは約40mL、少なくとも50mLもしくは少なくとも約50mLもしくは約50mL、少なくとも60mLもしくは少なくとも約60mLもしくは約60mL、少なくとも70mLもしくは少なくとも約70mLもしくは約70mL、少なくとも80mLもしくは少なくとも約80mLもしくは約80mL、少なくとも90mLもしくは少なくとも約90mLもしくは約90mL、少なくとも100mLもしくは少なくとも約100mLもしくは約100mL、少なくとも150mLもしくは少なくとも約150mLもしくは約150mL、または少なくとも200mLもしくは少なくとも約200mLもしくは約200mLの試薬のインキュベーションで標的体積を達成する。いくつかの態様において、インキュベーション緩衝液および刺激剤は、細胞に添加する前にあらかじめ混合される。いくつかの態様において、インキュベーション緩衝液および刺激剤は、細胞に別々に添加される。いくつかの態様において、刺激インキュベーションは、周期的な穏やかな混合条件で行われ、これはエネルギー的に有利な相互作用を促進するのに役立ち、それにより、細胞の刺激および活性化を達成しながら、より少ない全体的な刺激剤の使用を可能にすることができる。
いくつかの態様において、インキュベーションは一般に、混合条件下で、例えば一般に比較的低い力または速度、例えば細胞をペレット化するために使用される速度よりも低い速度、例えば600rpm〜1700rpmまたは約600rpm〜約1700rpm（例えば600rpmもしくは約600rpmもしくは少なくとも600rpm、1000rpmもしくは約1000rpmもしくは少なくとも1000rpm、または1500rpmもしくは約1500rpmもしくは少なくとも1500rpm、または1700rpmもしくは約1700rpmもしくは少なくとも1700rpm）、例えば80g〜100gまたは約80g〜約100g（例えば80gもしくは約80gもしくは少なくとも80g、85gもしくは約85gもしくは少なくとも85g、90gもしくは約90gもしくは少なくとも90g、95gもしくは約95gもしくは少なくとも95g、または100gもしくは約100gもしくは少なくとも100g）のチャンバーまたは他の容器の試料または壁におけるRCFでのスピンの存在下で行われる。いくつかの態様において、スピンは、かかる低い速度でのスピンとそれに続く休止期間、例えば1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10秒間のスピンおよび/または休止、例えば約1または2秒間のスピンとそれに続く約5、約6、約7、または約8秒間の休止という間隔の繰り返しを用いて行われる。
いくつかの態様において、例えば刺激剤とのインキュベーションの総持続時間は、1時間〜96時間もしくは約1時間〜約96時間、1時間〜72時間もしくは約1時間〜約72時間、1時間〜48時間もしくは約1時間〜約48時間、4時間〜36時間もしくは約4時間〜約36時間、8時間〜30時間もしくは約8時間〜約30時間、または12時間〜24時間もしくは約12時間〜約24時間、例えば少なくとも6時間もしくは少なくとも約6時間、少なくとも12時間もしくは少なくとも約12時間、少なくとも18時間もしくは少なくとも約18時間、少なくとも24時間もしくは少なくとも約24時間、少なくとも36時間もしくは少なくとも約36時間、または少なくとも72時間もしくは少なくとも約72時間である。いくつかの態様において、さらなるインキュベーションは、両端の値を含む、1時間〜48時間もしくは約1時間〜約48時間、4時間〜36時間もしくは約4時間〜約36時間、8時間〜30時間もしくは約8時間〜約30時間、または12時間〜24時間もしくは約12時間〜約24時間である。
特定の態様において、刺激条件としては、1種もしくは複数種のサイトカインとともに、および/または1種もしくは複数種のサイトカインの存在下で、濃縮されたT細胞の組成物をインキュベートすること、培養すること（culturing）および/または培養すること（cultivating）が挙げられる。特定の態様において、1種または複数種のサイトカインは組換えサイトカインである。いくつかの態様において、1種または複数種のサイトカインはヒト組換えサイトカインである。一部の特定の態様において、1種または複数種のサイトカインは、T細胞によって発現されるおよび/またはT細胞に内在する受容体に結合しおよび/または結合することができる。特定の態様において、1種または複数種のサイトカインは、サイトカインの4αヘリックスバンドルファミリーの一員であり、またはサイトカインの4αヘリックスバンドルファミリーの一員を含む。いくつかの態様において、サイトカインの4αヘリックスバンドルファミリーの一員としては、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン15（IL-15）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、刺激は、例えば、形質導入の前に、細胞の活性化および/または増殖をもたらす。
1.刺激試薬
いくつかの態様において、刺激条件下で細胞、例えばインプット細胞の組成物をインキュベートすることは、濃縮細胞の組成物を、T細胞を活性化および/または拡大することができる刺激試薬とインキュベートするおよび/もしくは接触させることであるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、刺激試薬は、細胞内の1つまたは複数のシグナルを刺激および/または活性化することができる。いくつかの態様において、1つまたは複数のシグナルは、受容体によって媒介される。特定の態様において、1つまたは複数のシグナルは、シグナル伝達ならびに/または二次メッセンジャー、例えばcAMPおよび/もしくは細胞内カルシウムのレベルもしくは量の変化、1つもしくは複数の細胞タンパク質の量、細胞局在、確認、リン酸化、ユビキチン化、および/もしくはトランケーションの変化、ならびに/または細胞活性、例えば転写、翻訳、タンパク質分解、細胞形態、活性化状態、および/もしくは細胞分裂の変化であるか、またはそれに関連する。特定の態様において、刺激試薬は、TCR複合体の1つもしくは複数の成分の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインおよび/または1つもしくは複数の共刺激分子の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化するおよび/または活性化することができる。
一部の特定の態様において、刺激試薬は、細胞、例えばT細胞を活性化および/または拡大することができる1つまたは複数の剤、例えば生体分子にコンジュゲートまたは連結される粒子、例えばビーズを含む。いくつかの態様において、1つまたは複数の剤はビーズに結合される。いくつかの態様において、ビーズは生体適合性である、すなわち生物学的使用に適した材料で構成される。いくつかの態様において、ビーズは、培養細胞、例えば培養T細胞に対して非毒性である。いくつかの態様において、ビーズは、剤と細胞との間の相互作用を可能にする方法で剤を付着させることができる任意の粒子であり得る。
いくつかの態様において、刺激試薬は、ビーズ、例えばビーズの表面に結合しているまたはさもなければ付着している細胞、例えばT細胞を活性化および/または拡大することができる1つまたは複数の剤を含む。一部の特定の態様において、ビーズは非細胞粒子である。特定の態様において、ビーズは、コロイド粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、磁性ビーズなどを含み得る。いくつかの態様において、ビーズはアガロースビーズである。一部の特定の態様において、ビーズはセファロースビーズである。
特定の態様において、刺激試薬は、単分散であるビーズを含む。一部の特定の態様において、単分散であるビーズは、互いから5％未満の直径標準偏差を有するサイズ分散を含む。
いくつかの態様において、ビーズは、ビーズの表面に（直接的または間接的に）共役、コンジュゲート、または連結された剤などの1つまたは複数の剤を含む。いくつかの態様において、本明細書で企図される剤は、RNA、DNA、タンパク質（例えば酵素）、抗原、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、炭水化物、脂質、レクチン、または所望の標的に親和性を有する他の任意の生体分子を含み得るが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、所望の標的は、T細胞受容体および/またはT細胞受容体の成分である。一部の特定の態様において、所望の標的はCD3である。一部の特定の態様において、所望の標的は、T細胞共刺激分子、例えばCD28、CD137（4-1-BB）、OX40、またはICOSである。1つまたは複数の剤は、当技術分野で公知であり、利用可能な様々な方法によって、ビーズに直接的または間接的に付着させ得る。付着は、共有結合、非共有結合、静電的、または疎水性であり得、例えば化学的手段、機械的手段、または酵素的手段を含む様々な付着手段によって達成され得る。いくつかの態様において、生体分子（例えばビオチン化抗CD3抗体）は、ビーズに直接付着している別の生体分子（例えば抗ビオチン抗体）を介して間接的にビーズに付着させ得る。
いくつかの態様において、刺激試薬は、ビーズおよび細胞の表面上の高分子と直接相互作用する1つまたは複数の剤を含む。一部の特定の態様において、ビーズ（例えば常磁性ビーズ）は、細胞上の1つまたは複数の高分子（例えば1つまたは複数の細胞表面タンパク質）に特異的な1つまたは複数の剤（例えば抗体）を介して細胞と相互作用する。一部の特定の態様において、ビーズ（例えば常磁性ビーズ）は、一次抗体（例えば抗ビオチン抗体）または他の生体分子などの本明細書に記載の第1の剤で標識され、次に、二次抗体（例えばビオチン化抗CD3抗体）または他の二次生体分子（例えばストレプトアビジン）などの第2の剤が添加され、それにより二次抗体または他の二次生体分子が粒子上のかかる一次抗体または他の生体分子に特異的に結合する。
いくつかの態様において、刺激試薬は、ビーズ（例えば常磁性ビーズ）に付着し、細胞（例えばT細胞）上の以下の高分子:CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54（ICAM-1）、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L（CD70）、4-1BB（CD137）、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、IL-1R、IL-15R;IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、CD18/CDl la（LFA-1）、CD62L（L-セレクチン）、CD29/CD49d（VLA-4）、Notchリガンド（例えばデルタ様1/4、Jagged 1/2など）、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7、およびCXCR3、またはこれらの高分子もしくはその断片に対応するリガンドを含むその断片の1つまたは複数に特異的に結合する1つまたは複数の剤（例えば抗体）を含む。いくつかの態様において、ビーズに付着した剤（例えば抗体）は、細胞（例えばT細胞）上の以下の高分子:CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、CD45RA、および/またはCD45ROの1つまたは複数に特異的に結合する。
いくつかの態様において、ビーズに付着した剤の1つまたは複数は抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（免疫グロブリンFc領域を有する完全長抗体を含む）、ポリエピトープ特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、および単鎖分子、ならびに抗体断片（例えばFab、F（ab’）2、およびFv）を含み得る。いくつかの態様において、刺激試薬は、抗体断片（抗原結合断片を含む）、例えばFab、Fab’-SH、Fv、scFv、または（Fab’）2断片である。IgG、IgM、IgA、IgD、およびIgE定常領域を含む、任意のアイソタイプの定常領域が本明細書で企図される抗体に使用でき、かかる定常領域は任意のヒトまたは動物種（例えばマウス種）から入手できることが理解されるであろう。いくつかの態様において、剤は、T細胞受容体の1つまたは複数の成分に結合するおよび/またはそれを認識する抗体である。特定の態様において、剤は抗CD3抗体である。一部の特定の態様において、剤は、共受容体に結合するおよび/または共受容体を認識する抗体である。いくつかの態様において、刺激試薬は抗CD28抗体を含む。いくつかの態様において、ビーズは、約0.001μm超、約0.01μm超、約0.1μm超、約1.0μm超、約10μm超、約50μm超、約100μm超、または約1000μm超、および約1500μm以下の直径を有する。いくつかの態様において、ビーズは、約1.0μm〜約500μm、約1.0μm〜約150μm、約1.0μm〜約30μm、約1.0μm〜約10μm、約1.0μm〜約5.0μm、約2.0μm〜約5.0μm、または約3.0μm〜約5.0μmの直径を有する。いくつかの態様において、ビーズは、約3μm〜約5μmの直径を有する。いくつかの態様において、ビーズは、少なくとも0.001μmもしくは少なくとも約0.001μmもしくは約0.001μm、少なくとも0.01μmもしくは少なくとも約0.01μmもしくは約0.01μm、少なくとも0.1μmもしくは少なくとも約0.1μmもしくは約0.1μm、少なくとも0.5μmもしくは少なくとも約0.5μmもしくは約0.5μm、少なくとも1.0μmもしくは少なくとも約1.0μmもしくは約1.0μm、少なくとも1.5μmもしくは少なくとも約1.5μmもしくは約1.5μm、少なくとも2.0μmもしくは少なくとも約2.0μmもしくは約2.0μm、少なくとも2.5μmもしくは少なくとも約2.5μmもしくは約2.5μm、少なくとも3.0μmもしくは少なくとも約3.0μmもしくは約3.0μm、少なくとも3.5μmもしくは少なくとも約3.5μmもしくは約3.5μm、少なくとも4.0μmもしくは少なくとも約4.0μmもしくは約4.0μm、少なくとも4.5μmもしくは少なくとも約4.5μmもしくは約4.5μm、少なくとも5.0μmもしくは少なくとも約5.0μmもしくは約5.0μm、少なくとも5.5μmもしくは少なくとも約5.5μmもしくは約5.5μm、少なくとも6.0μmもしくは少なくとも約6.0μmもしくは約6.0μm、少なくとも6.5μmもしくは少なくとも約6.5μmもしくは約6.5μm、少なくとも7.0μmもしくは少なくとも約7.0μmもしくは約7.0μm、少なくとも7.5μmもしくは少なくとも約7.5μmもしくは約7.5μm、少なくとも8.0μmもしくは少なくとも約8.0μmもしくは約8.0μm、少なくとも8.5μmもしくは少なくとも約8.5μmもしくは約8.5μm、少なくとも9.0μmもしくは少なくとも約9.0μmもしくは約9.0μm、少なくとも9.5μmもしくは少なくとも約9.5μmもしくは約9.5μm、少なくとも10μmもしくは少なくとも約10μmもしくは約10μm、少なくとも12μmもしくは少なくとも約12μmもしくは約12μm、少なくとも14μmもしくは少なくとも約14μmもしくは約14μm、少なくとも16μmもしくは少なくとも約16μmもしくは約16μm、少なくとも18μmもしくは少なくとも約18μmもしくは約18μmまたは少なくとも20μmもしくは少なくとも約20μmもしくは約20μmの直径を有する。一部の特定の態様において、ビーズは、4.5μmまたは約4.5μmの直径を有する。一部の特定の態様において、ビーズは、2.8μmまたは約2.8μmの直径を有する。
いくつかの態様において、ビーズは、0.001g/cm3超、0.01g/cm3超、0.05g/cm3超、0.1g/cm3超、0.5g/cm3超、0.6g/cm3超、0.7g/cm3超、0.8g/cm3超、0.9g/cm3超、1g/cm3超、1.1g/cm3超、1.2g/cm3超、1.3g/cm3超、1.4g/cm3超、1.5g/cm3超、2g/cm3超、3g/cm3超、4g/cm3超、または5g/cm3超の密度を有する。いくつかの態様において、ビーズは、約0.001g/cm3〜約100g/cm3、約0.01g/cm3〜約50g/cm3、約0.1g/cm3〜約10g/cm3、約0.1g/cm3〜約.5g/cm3、約0.5g/cm3〜約1g/cm3、約0.5g/cm3〜約1.5g/cm3、約1g/cm3〜約1.5g/cm3、約1g/cm3〜約2g/cm3、または約1g/cm3〜約5g/cm3の密度を有する。いくつかの態様において、ビーズは、約0.5g/cm3、約0.6g/cm3、約0.7g/cm3、約0.8g/cm3、約0.9g/cm3、約1.0g/cm3、約1.1g/cm3、約1.2g/cm3、約1.3g/cm3、約1.4g/cm3、約1.5g/cm3、約1.6g/cm3、約1.7g/cm3、約1.8g/cm3、約1.9g/cm3、または約2.0g/cm3の密度を有する。一部の特定の態様において、ビーズは、約1.6g/cm3の密度を有する。特定の態様において、ビーズまたは粒子は、約1.5g/cm3の密度を有する。一部の特定の態様において、粒子は、約1.3g/cm3の密度を有する。
一部の特定の態様において、複数のビーズは均一な密度を有する。一部の特定の態様において、均一な密度は、平均ビーズ密度の10％未満、5％未満、または1％未満の密度標準偏差を含む。
いくつかの態様において、ビーズは、粒子の各グラムあたり（m2/g）約0.001m2〜約1,000m2/g、約.010m2/g〜約100m2/g、約0.1m2/g〜約10m2/g、約0.1m2/g〜約1m2/g、約1m2/g〜約10m2/g、約10m2/g〜約100m2/g、約0.5m2/g〜約20m2/g、約0.5m2/g〜約5m2/g、または約1m2/g〜約4m2/gの表面積を有する。いくつかの態様において、粒子またはビーズは、約1m2/g〜約4m2/gの表面積を有する。
いくつかの態様において、ビーズは、剤に共役、連結、またはコンジュゲートすることができる少なくとも1つの材料をビーズ表面またはその近くに含む。いくつかの態様において、ビーズは表面官能化されている、すなわち結合分子、例えばポリヌクレオチドまたはポリペプチドと共有結合を形成することができる官能基を含む。特定の態様において、ビーズは、表面に露出されたカルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、トシル、エポキシ、および/またはクロロメチル基を含む。特定の態様において、ビーズは、表面に露出されたアガロースおよび/またはセファロースを含む。一部の特定の態様において、ビーズ表面は、結合分子に結合または付着することができる付着刺激試薬を含む。特定の態様において、生体分子はポリペプチドである。いくつかの態様において、ビーズは、表面に露出されたプロテインA、プロテインG、またはビオチンを含む。
いくつかの態様において、ビーズは磁場中で反応する。いくつかの態様において、ビーズは磁気ビーズである。いくつかの態様において、磁気ビーズは常磁性である。特定の態様において、磁気ビーズは超常磁性である。一部の特定の態様において、ビーズは、磁場に曝露されない限り、いかなる磁気特性も示さない。
特定の態様において、ビーズは、磁気コア、常磁性コア、または超常磁性コアを含む。いくつかの態様において、磁気コアは金属を含む。いくつかの態様において、金属は、鉄、ニッケル、銅、コバルト、ガドリニウム、マンガン、タンタル、亜鉛、ジルコニウム、またはそれらの任意の組合せであり得るが、これらに限定されるわけではない。一部の特定の態様において、磁気コアは、金属酸化物（例えば酸化鉄）、フェライト（例えばマンガンフェライト、コバルトフェライト、ニッケルフェライトなど）、ヘマタイトおよび金属合金（例えばCoTaZn）を含む。いくつかの態様において、磁気コアは、フェライト、金属、金属合金、酸化鉄、または二酸化クロムのうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様において、磁気コアは元素鉄またはその化合物を含む。いくつかの態様において、磁気コアは、マグネタイト（Fe3O4）、マグヘマイト（γFe2O3）、またはグレイジャイト（Fe3S4）のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様において、内部コアは酸化鉄（例えばFe3O4）を含む。
一部の特定の態様において、ビーズは、表面官能化コートまたはコーティングで覆われた磁性、常磁性、および/または超常磁性コアを含む。いくつかの態様において、コートは、ポリマー、多糖、シリカ、脂肪酸、タンパク質、炭素、アガロース、セファロース、またはそれらの組合せを含み得るが、これらに限定されるわけではない材料を含むことができる。いくつかの態様において、ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリ（乳酸-コ-グリコール酸）、ポリグルタルアルデヒド、ポリウレタン、ポリスチレン、またはポリビニルアルコールであり得る。一部の特定の態様において、外側コートまたはコーティングはポリスチレンを含む。特定の態様において、外側コーティングは表面官能化されている。
いくつかの態様において、刺激試薬は、金属酸化物コア（例えば酸化鉄コア）およびコートを含有するビーズを含み、金属酸化物コアは、少なくとも1つの多糖（例えばデキストラン）を含み、コートは、少なくとも1つの多糖（例えばアミノデキストラン）、少なくとも1つのポリマー（例えばポリウレタン）およびシリカを含む。いくつかの態様において、金属酸化物コアはコロイド状酸化鉄コアである。一部の特定の態様において、1つまたは複数の剤は、抗体またはその抗原結合断片を含む。特定の態様において、1つまたは複数の剤は、抗CD3抗体および抗CD28抗体を含む。いくつかの態様において、刺激試薬は、抗CD3抗体、抗CD28抗体、および抗ビオチン抗体を含む。いくつかの態様において、刺激試薬は抗ビオチン抗体を含む。いくつかの態様において、ビーズは、約3μm〜約10μmの直径を有する。いくつかの態様において、ビーズは、約3μm〜約5μmの直径を有する。一部の特定の態様において、ビーズは約3.5μmの直径を有する。
いくつかの態様において、刺激試薬は、金属酸化物コア（例えば酸化鉄内部コア）およびコート（例えば保護コート）を含有するビーズに付着する1つまたは複数の剤を含み、コートはポリスチレンを含む。一部の特定の態様において、ビーズは、常磁性（例えば超常磁性）鉄コア、例えばマグネタイト（Fe3O4）および/またはマグヘマイト（γFe2O3）cおよびポリスチレンコートまたはコーティングを含有するコアを含む単分散常磁性（例えば超常磁性）ビーズである。いくつかの態様において、ビーズは非多孔性である。いくつかの態様において、ビーズは、1つまたは複数の剤が付着する官能化表面を含む。一部の特定の態様において、1つまたは複数の剤は、表面でビーズに共有結合される。いくつかの態様において、1つまたは複数の剤は、抗体またはその抗原結合断片を含む。いくつかの態様において、1つまたは複数の剤は、抗CD3抗体および抗CD28抗体を含む。いくつかの態様において、1つまたは複数の剤は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体、ならびに標識抗CD3または抗CD28抗体などの標識抗体（例えばビオチン化抗体）に結合することができる抗体またはその抗原断片を含む。一部の特定の態様において、ビーズは、約1.5g/cm3の密度および約1m2/g〜約4m2/gの表面積を有する。特定の態様において、ビーズは、約4.5μmの直径および約1.5g/cm3の密度を有する単分散超常磁性ビーズである。いくつかの態様において、ビーズは、約2.8μmの平均直径および約1.3g/cm3の密度を有する単分散超常磁性ビーズである。
C.細胞の操作
いくつかの態様において、本明細書で提供される方法は、T細胞の1つまたは複数の組成物を操作することに関連して使用される。一部の特定の態様において、操作は、ポリヌクレオチド、例えば組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドの導入であるか、またはそれを含む。特定の態様において、組換えタンパク質は、セクションIIに記載されているものなどの組換え受容体である。組換え受容体などの組換えタンパク質をコードする核酸分子の細胞への導入は、いくつかの公知のベクターのいずれかを使用して実施され得る。かかるベクターは、レンチウイルスおよびガンマレトロウイルス系を含むウイルスおよび非ウイルス系、ならびにPiggyBacまたはSleeping Beautyベースの遺伝子導入システムなどのトランスポゾンベースのシステムを含む。例示的な方法は、ウイルス、例えばレトロウイルスまたはレンチウイルス、形質導入、トランスポゾン、およびエレクトロポレーションを介することを含む、受容体をコードする核酸の移入のための方法を含む。いくつかの態様において、操作は、濃縮T細胞の1つまたは複数の操作された組成物を作製する。
一部の特定の態様において、T細胞の1つまたは複数の組成物は、例えば、セクションI-Dで提供される方法などによって、増殖および/または拡大を促進する条件下で細胞を培養する前に、操作、例えば形質導入またはトランスフェクトされる。特定の態様において、濃縮T細胞の1つまたは複数の組成物は、該1つまたは複数の組成物が刺激条件下で刺激、活性化、および/またはインキュベートされた後に操作される。特定の態様において、1つまたは複数の組成物は刺激された組成物である。特定の態様において、1つまたは複数の刺激された組成物は、あらかじめクライオ凍結され、保存されており、操作の前に解凍される。
一部の特定の態様において、刺激されたT細胞の1つまたは複数の組成物は、濃縮T細胞の2つの別個の刺激された組成物であるか、またはそれを含む。特定の態様において、濃縮T細胞の2つの別個の組成物、例えば同じ生物学的試料から選択、単離、および/または濃縮された濃縮T細胞の2つの別個の組成物は、別々に操作される。一部の特定の態様において、2つの別個の組成物は、濃縮CD4＋T細胞の組成物を含む。特定の態様において、2つの別個の組成物は、濃縮CD8＋T細胞の組成物を含む。いくつかの態様において、濃縮CD4＋T細胞および濃縮CD8＋T細胞の2つの別個の組成物は、別々に遺伝子操作される。いくつかの態様において、濃縮T細胞の単一の組成物が遺伝子操作される。一部の特定の態様において、単一の組成物は、濃縮CD4＋T細胞の組成物である。いくつかの態様において、単一の組成物は、操作の前に別個の組成物から組み合わされた濃縮CD4＋およびCD8＋T細胞の組成物である。
いくつかの態様において、操作される、例えば形質導入またはトランスフェクトされる、濃縮CD4＋T細胞の組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD4＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、操作される、濃縮CD4＋T細胞の組成物は、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、もしくは0.01％未満のCD8＋T細胞を含む、および/またはCD8＋T細胞を含まない、および/またはCD8＋T細胞不含であるかもしくは実質的に不含である。
いくつかの態様において、操作される、例えば形質導入またはトランスフェクトされる、濃縮CD8＋T細胞の組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD8＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、刺激条件下でインキュベートされる、濃縮CD8＋T細胞の組成物は、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、もしくは0.01％未満のCD4＋T細胞を含む、および/またはCD4＋T細胞を含まない、および/またはCD4＋T細胞不含であるかもしくは実質的に不含である。
いくつかの態様において、濃縮CD4＋およびCD8＋T細胞の別個の組成物は、単一の組成物に組み合わされ、遺伝子操作、例えば形質導入またはトランスフェクトされる。一部の特定の態様において、濃縮CD4＋および濃縮CD8＋T細胞の別個の操作された組成物は、遺伝子操作が行われたおよび/または完了した後に単一の組成物に組み合わされる。
いくつかの態様において、遺伝子導入は、例えばサイトカインまたは活性化マーカーの発現によって測定されるように、細胞を増殖、生存、および/または活性化などの応答を誘導する刺激と組み合わせることなどによって最初に細胞を刺激すること、続いて活性化した細胞に形質導入すること、ならびに培養下で臨床適用に十分な数まで拡大させることによって達成される。一部の特定の態様において、遺伝子導入は、セクションI-Bに記載されている方法のいずれかなどにより、最初に刺激条件下で細胞をインキュベートすることによって達成される。
いくつかの態様において、遺伝子操作のための方法は、組成物の1つまたは複数の細胞を、組換えタンパク質、例えば組換え受容体をコードする核酸分子と接触させることによって行われる。いくつかの態様において、接触は、スピノキュレーション（例えば遠心接種）などの遠心分離を用いて行うことができる。かかる方法は、国際公開公報第2016/073602号に記載されている方法のいずれかを含む。例示的な遠心チャンバーとしては、A-200/FおよびA-200遠心チャンバーを含むSepax（登録商標）およびSepax（登録商標）2システムで使用するためのもの、およびかかるシステムで使用するための様々なキットを含む、Biosafe SAによって製造および販売されたものが挙げられる。例示的なチャンバー、システム、および加工処理機器およびキャビネットは、例えば米国特許第6,123,655号、米国特許第6,733,433号および米国特許出願公開第2008/0171951号、ならびに国際公開公報第00/38762号に記載されており、これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。かかるシステムで使用するための例示的なキットとしては、BioSafe SAからCS-430.1、CS-490.1、CS-600.1またはCS-900.2の製品名で販売されている単回使用キットが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、細胞は、操作の前および/または間に、本明細書に、例えばセクションIIに記載されている作用物質などのmTOR活性を阻害する作用物質とインキュベートされず、接触されず、および/または曝露されない。
特定の態様において、操作の少なくとも一部は、本明細書に記載されている作用物質、例えばセクションIIに記載されている作用物質などの、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で行われる。いくつかの態様において、操作工程の全部および/またはは、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で行われる。
特定の態様において、細胞は、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で、操作される、例えば、形質導入されまたはトランスフェクトされる。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、セクションIIなどの本明細書に記載されている作用物質、例えば、化合物63である。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、さらなるキナーゼの活性も阻害する。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、ホスホイノシトール-3キナーゼ（PI3K）活性も阻害する。一部の特定の態様において、作用物質は、mTOR活性を選択的に阻害する、例えば、mTOR活性を阻害するのに十分な濃度において、PI3K活性を測定可能に阻害せず、および/またはmTOR活性と同じ程度までPI3K活性を阻害しない。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質はキナーゼ活性を阻害する。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1および/またはmTORC2活性を阻害する。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質はmTORC1およびmTORC2活性を阻害する。
いくつかの態様において、作用物質としては、PI-103、SF1126、BGT226、XL765、PF-04691502、NVP-BEZ235、ピラゾロピリミジン、トリンl、トルキニブ（PP242）、PP30、Ku-0063794、WAY-600（Wyeth）、WAY-687（Wyeth）、WAY-354（Wyeth）、AZD8055、ラパマイシン（シロリムス）、テムシロリムス（CC1779）、エベロリムス（RAD001）、デフォロリムス（AP23573）、AZD8055（AstraZeneca）およびOSI-027（OSI）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、セクションIIに挙げられている式、例えば式（I）、式（II）または式（III）を有しまたは含む。いくつかの態様において、作用物質は化合物155、化合物246または化合物63である。いくつかの態様において、作用物質は化合物63である。
一部の特定の態様において、細胞は、mTOR活性を阻害し、低減し、および/または減少させる濃度での、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で操作される。いくつかの態様において、濃度は、mTORの1種または複数種の活性を、約25％もしくは少なくとも25％、約30％もしくは少なくとも30％、約40％もしくは少なくとも40％、約50％もしくは少なくとも50％、約60％もしくは少なくとも60％、約70％もしくは少なくとも70％、約80％もしくは少なくとも80％、約85％もしくは少なくとも85％、約90％もしくは少なくとも90％、約95％もしくは少なくとも95％、約97％もしくは少なくとも97％、約98％もしくは少なくとも98％、約99％もしくは少なくとも99％または約99.9％もしくは少なくとも99.9％、阻害し、低減し、および/または減少させる。いくつかの態様において、作用物質の濃度は、初代T細胞が増殖および/または拡大することを抑制しない。いくつかの態様において、細胞は、1nM〜1μM、1nM〜100nM、50nM〜200nM、100nM〜250nM、200nM〜500nM、500nM〜1μM、1μM〜10μMまたは5μM〜50μMのmTOR活性を阻害する作用物質の存在下で操作される。一部の特定の態様において、細胞は、0.1nM、約0.1nMもしくは少なくとも0.1nM、0.5nM、約0.5nMもしくは少なくとも0.5nM、1nM、約1nMもしくは少なくとも1nM、5nM、約5nMもしくは少なくとも5nM、10nM、約10nMもしくは少なくとも10nM、25nM、約25nMもしくは少なくとも25nM、50nM、約50nMもしくは少なくとも50nM、100nM、約100nMもしくは少なくとも100nM、150nM、約150nMもしくは少なくとも150nM、200nM、約200nMもしくは少なくとも200nM、250nM、約250nMもしくは少なくとも250nM、500nM、約500nMもしくは少なくとも500nM、1μM、約1μMもしくは少なくとも1μM、5μM、約5μMもしくは少なくとも5μM、10μM、約10μMもしくは少なくとも10μM、25μM、約25μMもしくは少なくとも25μM、50μM、約50μMもしくは少なくとも50μMまたは100μM、約100μMもしくは少なくとも100μMのmTOR活性を阻害する作用物質の存在下で操作される。
いくつかの態様において、細胞は化合物155の存在下で操作される。一部の特定の態様において、細胞は、1nM〜1μM、1nM〜100nM、50nM〜200nM、100nM〜250nMまたは200nM〜500nMの化合物155の存在下で操作される。特定の態様において、細胞は、10nM、約10nMもしくは少なくとも10nM、25nM、約25nMもしくは少なくとも25nM、50nM、約50nMもしくは少なくとも50nM、100nM、約100nMもしくは少なくとも100nM、150nM、約150nMもしくは少なくとも150nM、200nM、約200nMもしくは少なくとも200nM、250nM、約250nMもしくは少なくとも250nMまたは500nM、約500nMもしくは少なくとも500nMの化合物155の存在下で操作される。
一部の特定の態様において、細胞は化合物246の存在下で操作される。一部の特定の態様において、細胞は、1nM〜1μM、1nM〜100nM、50nM〜200nM、100nM〜250nMまたは200nM〜500nMの化合物155の存在下で操作される。一部の特定の態様において、細胞は、10nM、約10nMもしくは少なくとも10nM、25nM、約25nMもしくは少なくとも25nM、50nM、約50nMもしくは少なくとも50nM、100nM、約100nMもしくは少なくとも100nM、150nM、約150nMもしくは少なくとも150nM、200nM、約200nMもしくは少なくとも200nM、250nM、約250nMもしくは少なくとも250nMまたは500nM、約500nMもしくは少なくとも500nMの化合物246の存在下で操作される。
特定の態様において、細胞は化合物63の存在下で操作される。一部の特定の態様において、細胞は、1nM〜1μM、1nM〜100nM、50nM〜200nM、100nM〜250nMまたは200nM〜500nMの化合物63の存在下で操作される。いくつかの態様において、細胞は、10nM、約10nMもしくは少なくとも10nM、25nM、約25nMもしくは少なくとも25nM、50nM、約50nMもしくは少なくとも50nM、100nM、約100nMもしくは少なくとも100nM、150nM、約150nMもしくは少なくとも150nM、200nM、約200nMもしくは少なくとも200nM、250nM、約250nMもしくは少なくとも250nMまたは500nM、約500nMもしくは少なくとも500nMの化合物63の存在下で操作される。
いくつかの態様において、接触させることは、スピノキュレーション（例えば、遠心的播種）などの遠心を用いて達成することができる。いくつかの態様において、細胞、ウイルス粒子および試薬を含有する組成物は、一般的には相対的に低い力または速度で、例えば、細胞を沈渣とするために使用される速度より低い速度で、例えば600rpm〜1700rpmまたは約600rpm〜約1700rpm（例えば、600rpm、約600rpmもしくは少なくとも600rpm、1000rpm、約1000rpmもしくは少なくとも1000rpm、または1500rpm、約1500rpmもしくは少なくとも1500rpm、または1700rpm、約1700rpmもしくは少なくとも1700rpmで）で回転させることができる。いくつかの態様において、回転は、例えば、チャンバーまたは空洞の内壁または外壁で測定された場合に、100g〜3200gまたは約100g〜約3200g（100gもしくは約100gもしくは少なくとも100gもしくは少なくとも約100g、200gもしくは約200gもしくは少なくとも200gもしくは少なくとも約200g、300gもしくは約300gもしくは少なくとも300gもしくは少なくとも約300g、400gもしくは約400gもしくは少なくとも400gもしくは少なくとも約400g、500gもしくは約500gもしくは少なくとも500gもしくは少なくとも約500g、1000gもしくは約1000gもしくは少なくとも1000gもしくは少なくとも約1000g、1500gもしくは約1500gもしくは少なくとも1500gもしくは少なくとも約1500g、2000gもしくは約2000gもしくは少なくとも2000gもしくは少なくとも約2000g、2500gもしくは約2500gもしくは少なくとも2500gもしくは少なくとも約2500g、3000gもしくは約3000gもしくは少なくとも3000gもしくは少なくとも約3000gまたは3200gもしくは約3200gもしくは少なくとも3200gもしくは少なくとも約3200g）の力、例えば、相対遠心力で運ばれる。「相対遠心力」またはRCFという用語は、回転の軸と比べて空間中の特定の点で、地球の重力に対して、物体または物質（細胞、試料もしくは沈渣および/または回転されているチャンバーもしくはその他の容器中の点など）に対して与えられる有効力であると一般的に理解される。値は、重力、回転速度および回転の半径（回転の軸と物体、物質またはRCFが測定されている粒子からの距離）を考慮に入れて、周知の式を用いて決定され得る。
いくつかの態様において、導入することは、組成物の1つまたは複数の細胞を、組換えタンパク質、例えば組換え受容体をコードする核酸分子と接触させることによって実施される。いくつかの態様において、接触させることは、スピノキュレーション（例えば、遠心的播種）などの遠心を用いて達成することができる。このような方法としては、国際特許出願公開WO2016/073602号に記載されているもののいずれもが挙げられる。例示的な遠心チャンバーとしては、A-200/FおよびA-200遠心チャンバーおよびこのようなシステムとともに使用するための様々なキットを含むSepax（登録商標）およびSepax（登録商標）2システムとともに使用するためのものなどの、Biosafe SAによって製造および販売されているものが挙げられる。例示的なチャンバー、システムならびに処理機器類およびキャビネットは、例えば、米国特許第6,123,655号、米国特許第6,733,433号および米国特許出願公開第2008/0171951号および国際特許出願公開WO00/38762号に記載されており、これらの各々の内容の全体が、参照により、本明細書に組み入れられる。このようなシステムとともに使用するための例示的なキットとしては、CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1またはCS-900.2の製品名でBioSafe SAによって販売されている使い捨てキットが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、システムは、形質導入工程ならびにシステムで実施される1つまたは複数の様々な他の加工処理工程、例えば本明細書または国際公開公報第2016/073602号に記載されている遠心チャンバーシステムとともにまたはそれと関連して実施され得る1つまたは複数の加工処理工程の局面を操作、自動化、制御および/またはモニターする機器を含む他の機器とともに含まれるおよび/または他の機器に関連して配置される。いくつかの態様におけるこの機器は、キャビネット内に含まれている。いくつかの態様において、機器は、制御回路を含有するハウジング、遠心分離機、カバー、モーター、ポンプ、センサー、ディスプレイ、およびユーザインターフェースを含むキャビネットを含む。例示的なデバイスは、米国特許第6,123,655号、米国特許第6,733,433号および米国特許出願第2008/0171951号に記載されている。
いくつかの態様において、システムは、一連の容器、例えばバッグ、チューブ類、停止コック、クランプ、コネクタ、および遠心チャンバーを含む。いくつかの態様において、バッグなどの容器は、同じ容器または別個の容器中に、例えば同じバッグまたは別個のバッグ中に、形質導入される細胞およびウイルスベクター粒子を含む1つまたは複数の容器、例えばバッグを含む。いくつかの態様において、システムは、1つまたは複数の容器、例えばチャンバーに引き込まれる希釈剤および/もしくは洗浄溶液などの媒体、ならびに/または方法の間に構成要素および/もしくは組成物を希釈、再懸濁、および/もしくは洗浄するための他の構成要素を含有するバッグをさらに含む。容器は、システム内の1つまたは複数の位置、例えばインプットライン、希釈剤ライン、洗浄ライン、廃棄物ラインおよび/またはアウトプットラインに対応する位置に接続することができる。
いくつかの態様において、チャンバーは、その回転軸の周りなどの、チャンバーの回転をもたらすことができる遠心分離機と結合される。回転は、細胞の形質導入に関連するインキュベーションの前、インキュベーション中、および/もしくはインキュベーション後に、ならびに/または他の加工処理工程の1つもしくは複数において行われ得る。したがって、いくつかの態様において、様々な加工処理工程の1つまたは複数は、回転下で、例えば特定の力で実施される。チャンバーは、遠心分離中チャンバーが垂直に位置し、側壁と軸が垂直または概ね垂直であり、端壁（1つまたは複数）が水平または概ね水平であるように、典型的には垂直または概ね垂直の回転が可能である。
いくつかの態様において、細胞、ベクター、例えばウイルス粒子、および試薬を含む組成物は、一般に比較的低い力または速度で、例えば細胞をペレット化するために使用される速度よりも低い速度、例えば600rpm〜1700rpmまたは約600rpm〜約1700rpm（例えば600rpmもしくは約600rpmもしくは少なくとも600rpm、1000rpmもしくは約1000rpmもしくは少なくとも1000rpm、または1500rpmもしくは約1500rpmもしくは少なくとも1500rpm、または1700rpmもしくは約1700rpmもしくは少なくとも1700rpm）の速度で回転させることができる。いくつかの態様において、回転は例えばチャンバーまたはキャビティの内壁または外壁で測定される、100g〜3200gまたは約100g〜約3200g（例えば100gもしくは約100gもしくは少なくとも100gもしくは少なくとも約100g、200gもしくは約200gもしくは少なくとも200gもしくは少なくとも約200g、300gもしくは約300gもしくは少なくとも300gもしくは少なくとも約300g、400gもしくは約400gもしくは少なくとも400gもしくは少なくとも約400g、500gもしくは約500gもしくは少なくとも500gもしくは少なくとも約500g、1000gもしくは1000gもしくは少なくとも1000gもしくは少なくとも約1000g、1500gもしくは約1500gもしくは少なくとも1500gもしくは少なくとも約1500g、2000gもしくは約2000gもしくは少なくとも2000gもしくは少なくとも約2000g、2500gもしくは約2500gもしくは少なくとも2500gもしくは少なくとも約2500g、3000gもしくは約3000gもしくは少なくとも3000gもしくは少なくとも約3000g、または3200gもしくは約3200gもしくは少なくとも3200gもしくは少なくとも約3200g）の力、例えば相対遠心力で行われる。「相対遠心力」またはRCFという用語は、回転軸と比較して空間内の特定の点における地球の重力に対する、物体または物質（細胞、試料、もしくはペレット、および/または回転しているチャンバーもしくは他の容器内の点など）に与えられる有効力と一般的に理解される。この値は、重力、回転速度および回転半径（回転軸と、RCFが測定されている物体、物質、または粒子からの距離）を考慮に入れて、周知の式を使用して決定され得る。
いくつかの態様において、遺伝子操作の少なくとも一部、例えば形質導入の間、および/または遺伝子操作に続いて、細胞は、上記のように細胞の培養または拡大などの遺伝子操作された細胞の培養のためにバイオリアクターバッグアセンブリに移される。
組換え受容体をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド（例えば核酸分子）、かかる受容体を発現するように細胞を遺伝子操作するためのベクター、および遺伝子操作された細胞を作製するための方法も提供される。いくつかの態様において、ベクターは、組換え受容体をコードする核酸を含む。特定の態様において、ベクターは、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである。いくつかの場合において、ベクターは、レトロウイルスベクターなどのウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである。
いくつかの態様において、ベクターは、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスまたはレンチウイルスベクター、非ウイルスベクターまたはトランスポゾン、例えばSleeping Beautyトランスポゾンシステム、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するベクター、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えばガンマレトロウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）、マウス胚性幹細胞ウイルス（MESV）、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）、脾臓フォーカス形成ウイルス（SFFV）またはアデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するレトロウイルスベクターを含む。
いくつかの態様において、ウイルスベクターまたは非ウイルスDNAは、異種組換えタンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの態様において、異種組換え分子は、組換え受容体、例えば抗原受容体、例えば遺伝子サイレンシングのためのSBトランスポゾン、キャプシド封入トランスポゾン、例えばゲノム組換えもしくはレポーター遺伝子（例えばGFP）もしくはルシフェラーゼなどの蛍光タンパク質）のための相同二本鎖核酸であるか、またはそれを含む。
1.ウイルスベクター粒子
いくつかの態様において、組換え核酸は、例えばシミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するベクターなどの組換え感染性ウイルス粒子を使用して細胞に移入される。いくつかの態様において、組換え核酸は、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えばガンマレトロウイルスベクターを使用してT細胞に移入される（例えば、Koste et al.（2014）Gene Therapy 2014 Apr 3.doi:10.1038/gt.2014.25;Carlens et al.（2000）Exp Hematol 28（10）:1137-46;Alonso-Camino et al.（2013）Mol Ther Nucl Acids 2,e93;Park et al., Trends Biotechnol.2011 November 29（11）:550-557参照。
いくつかの態様において、レトロウイルスベクター、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）、マウス胚性幹細胞ウイルス（MESV）、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）、脾臓フォーカス形成ウイルス（SFFV）、またはアデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するレトロウイルスベクターは、長い末端反復配列（LTR）を有する。ほとんどのレトロウイルスベクターはマウスレトロウイルスに由来する。いくつかの態様において、レトロウイルスは、任意の鳥類または哺乳動物細胞供給源に由来するものを含む。レトロウイルスは、典型的には両向性であり、ヒトを含むいくつかの種の宿主細胞に感染できることを意味する。一態様において、発現される遺伝子は、レトロウイルスのgag、polおよび/またはenv配列を置き換える。多くの例示的なレトロウイルス系が記載されている（例えば米国特許第5,219,740号、同第6,207,453号、同第5,219,740号;Miller and Rosman（1989）BioTechniques 7:980-990;Miller,A.D.（1990）Human Gene Therapy 1:5-14;Scarpa et al.（1991）Virology 180:849-852;Burns et al.（1993）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037;およびBoris-Lawrie and Temin（1993）Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109参照。
レンチウイルス形質導入の方法は公知である。例示的な方法は、例えばWang et al.（2012）J.Immunother.35（9）:689-701;Cooper et al.（2003）Blood.101:1637-1644;Verhoeyen et al.（2009）Methods Mol Biol.506:97-114;およびCavalieri et al.（2003）Blood.102（2）:497-505に記載されている。
いくつかの態様において、ウイルスベクター粒子は、レトロウイルスゲノムに基づくベクターに由来する、例えばレンチウイルスゲノムに基づくベクターに由来するゲノムを含む。提供されるウイルスベクターのいくつかの局面において、CARなどの抗原受容体などの組換え受容体をコードする異種核酸は、ベクターゲノムの5’LTR配列と3’LTR配列の間に含まれるおよび/または位置する。
いくつかの態様において、ウイルスベクターゲノムは、HIV-1ゲノムまたはSIVゲノムなどのレンチウイルスゲノムである。例えば、レンチウイルスベクターは、ビルレンス遺伝子を多重弱毒化することによって生成されており、例えば遺伝子env、vif、vpu、およびnefを欠失させて、ベクターを治療目的のためにより安全にすることができる。レンチウイルスベクターは公知である。Naldini et al.,（1996 and 1998）;Zufferey et al.,（1997）;Dull et al.,1998、米国特許第6,013,516号;および同第5,994,136号参照）。いくつかの態様において、これらのウイルスベクターは、プラスミドベースまたはウイルスベースであり、外来核酸の組み込みのため、選択のため、および宿主細胞への核酸の移入のために必須の配列を運ぶように構成される。公知のレンチウイルスは、American Type Culture Collection（「ATCC」;10801 University Blvd.,Manassas,Va.20110-2209）などの寄託機関またはコレクションから容易に入手できるか、または一般に利用可能な技術を使用して公知の供給源から単離することができる。
レンチウイルスベクターの非限定的な例としては、ヒト免疫不全ウイルス1（HIV-1）、HIV-2、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒトTリンパ球向性ウイルス1（HTLV-1）、HTLV-2またはウマ感染性貧血ウイルス（E1AV）などのレンチウイルスに由来するものが挙げられる。例えば、レンチウイルスベクターは、HIVビルレンス遺伝子を多重弱毒化することによって生成されており、例えば遺伝子env、vif、vpr、vpu、およびnefを欠失させて、ベクターを治療目的のためにより安全にすることができる。レンチウイルスベクターは当技術分野で公知であり、Naldini et al.,（1996 and 1998）;Zufferey et al.,（1997）;Dull et al.,1998、米国特許第6,013,516号;および同第5,994,136号参照）。いくつかの態様において、これらのウイルスベクターは、プラスミドベースまたはウイルスベースであり、外来核酸の組み込みのため、選択のため、および宿主細胞への核酸の移入のために必須の配列を運ぶように構成される。公知のレンチウイルスは、American Type Culture Collection（「ATCC」;10801 University Blvd.,Manassas,Va.20110-2209）などの寄託機関またはコレクションから容易に入手できるか、または一般に利用可能な技術を使用して公知の供給源から単離することができる。
いくつかの態様において、ウイルスゲノムベクターは、レンチウイルスなどのレトロウイルスの5’LTRおよび3’LTRの配列を含み得る。いくつかの局面において、ウイルスゲノム構築物は、レンチウイルスの5’LTRおよび3’LTRからの配列を含み得、特に、レンチウイルスの5’LTRからのRおよびU5配列ならびにレンチウイルスからの不活性化または自己不活性化3’LTRを含み得る。LTR配列は、任意の種由来の任意のレンチウイルスからのLTR配列であり得る。例えば、それらはHIV、SIV、FIVまたはBIVからのLTR配列であり得る。典型的には、LTR配列はHIV LTR配列である。
いくつかの態様において、HIVウイルスベクターなどのウイルスベクターの核酸は、追加の転写単位を欠く。ベクターゲノムは、不活性化または自己不活性化3’LTRを含み得る（Zufferey et al.J Virol 72:9873,1998;Miyoshi et al.,J Virol 72:8150,1998）。例えば、ウイルスベクターRNAを作製するために使用される核酸の3’LTRのU3領域における欠失は、自己不活性化（SIN）ベクターを生成するために使用することができる。次に、この欠失を逆転写中にプロウイルスDNAの5’LTRに移入することができる。自己不活性化ベクターは一般に、3’側の長い末端反復配列（LTR）からのエンハンサーおよびプロモーター配列の欠失を有し、これはベクターの組み込み中に5’LTRにコピーされる。いくつかの態様において、LTRの転写活性を無効にするために、TATAボックスの除去を含む十分な配列を排除することができる。これは、形質導入された細胞における完全長ベクターRNAの産生を防止することができる。いくつかの局面において、3’LTRのU3エレメントは、そのエンハンサー配列、TATAボックス、Sp1、およびNF-κ B部位の欠失を含む。自己不活性化3’LTRの結果として、進入および逆転写の後に生成されるプロウイルスは、不活性化5’LTRを含むこれは、ベクターゲノムの動員のリスク、および近傍の細胞プロモーターへのLTRの影響を低減することによって安全性を改善することができる。自己不活性化3’LTRは、当技術分野で公知の任意の方法によって構築することができる。一部の態様において、これは、ベクター力価またはベクターのインビトロもしくはインビボ特性に影響を及ぼさない。
任意で、レンチウイルス5’LTRからのU3配列は、異種プロモーター配列などのウイルス構築物中のプロモーター配列で置き換えることができる。これは、パッケージング細胞株から回収されたウイルスの力価を高めることができる。エンハンサー配列も含めることができる。パッケージング細胞株におけるウイルスRNAゲノムの発現を増加させる任意のエンハンサー/プロモーターの組合せを使用し得る。一例では、CMVエンハンサー/プロモーター配列が使用される（米国特許第5,385,839号および米国特許第5,168,062号）。
一部の特定の態様において、レンチウイルスベクターゲノムなどのレトロウイルスベクターゲノムを組み込み欠損になるように構築することによって、挿入変異誘発のリスクを最小限に抑えることができる。非組み込みベクターゲノムを作製するために、様々なアプローチを追求することができる。いくつかの態様において、変異（1つまたは複数）は、それが不活性なインテグラーゼを有するタンパク質をコードするように、pol遺伝子のインテグラーゼ酵素成分に操作することができる。いくつかの態様において、ベクターゲノム自体を修飾して、例えば一方もしくは両方の付着部位を変異もしくは欠失させることによって、または欠失もしくは修飾を介して3’LTR近位ポリプリントラクト（PPT）を非機能性にすることによって、組み込みを防止することができる。いくつかの態様において、非遺伝的アプローチが利用可能であり、これらは、インテグラーゼの1つまたは複数の機能を阻害する薬理学的剤を含む。これらのアプローチは相互排他的ではなく、すなわちそれらの複数を一度に使用することができる。例えば、インテグラーゼと付着部位の両方が非機能性であり得るか、またはインテグラーゼとPPT部位が非機能性であり得るか、または付着部位とPPT部位が非機能性であり得るか、またはそれらのすべてが非機能性であり得る。かかる方法およびウイルスベクターゲノムは公知であり、利用可能である（Philpott and Thrasher, Human Gene Therapy 18:483,2007;Engelman et al.J Virol 69:2729,1995;Brown et al.J Virol 73:9011（1999）;国際公開公報第2009/076524号;McWilliams et al., J Virol 77:11150,2003;Powell and Levin J Virol 70:5288,1996参照）。
いくつかの態様において、ベクターは、原核生物宿主細胞などの宿主細胞における増殖のための配列を含む。いくつかの態様において、ウイルスベクターの核酸は、細菌細胞などの原核細胞における増殖のための1つまたは複数の複製起点を含む。いくつかの態様において、原核生物の複製起点を含むベクターはまた、その発現が薬剤耐性などの検出可能または選択可能なマーカーを与える遺伝子を含み得る。
ウイルスベクターゲノムは、典型的にはパッケージングまたはプロデューサー細胞株にトランスフェクトすることができるプラスミドの形態で構築される。ゲノムがウイルスベクターゲノムのRNAコピーを含むレトロウイルス粒子を作製するために、様々な公知の方法のいずれかを使用することができる。いくつかの態様において、少なくとも2つの成分がウイルスベースの遺伝子送達システムの作製に関与する:第1に、構造タンパク質およびウイルスベクター粒子を生成するために必要な酵素を包含するパッケージングプラスミド、ならびに、第2に、ウイルスベクター自体、すなわち移入される遺伝物質。バイオセーフティセーフガードが、これらの成分の一方または両方の設計に導入できる。
いくつかの態様において、パッケージングプラスミドは、エンベロープタンパク質以外のすべてのレトロウイルスタンパク質、例えばHIV-1タンパク質を含むことができる（Naldini et al.,1998）。他の態様において、ウイルスベクターは、ビルレンスに関連するもの、例えばvpr、vif、vpuおよびnef、ならびに/またはHIVの主要なトランス活性化因子であるTatなどの追加のウイルス遺伝子を欠いていてもよい。いくつかの態様において、HIVベースのレンチウイルスベクターなどのレンチウイルスベクターは、親ウイルスの3つの遺伝子:gag、polおよびrevのみを含み、これは、組換えによる野生型ウイルスの再構成の可能性を低減または排除する。
いくつかの態様において、ウイルスベクターゲノムは、ウイルスベクターゲノムから転写されたウイルスゲノムRNAをウイルス粒子にパッケージングするために必要なすべての成分を含むパッケージング細胞株に導入される。あるいは、ウイルスベクターゲノムは、関心対象の1つまたは複数の配列、例えば組換え核酸に加えて、ウイルス成分をコードする1つまたは複数の遺伝子を含み得る。いくつかの局面において、しかしながら、標的細胞におけるゲノムの複製を防ぐために、複製に必要な内因性ウイルス遺伝子が除去され、パッケージング細胞株中で別途に提供される。
いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、粒子を生成するために必要な成分を含む1つまたは複数のプラスミドベクターでトランスフェクトされる。いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、LTR、シス作用性パッケージング配列および関心対象の配列、すなわちCARなどの抗原受容体をコードする核酸を含むウイルスベクターゲノムを含有するプラスミド、ならびにGag、polおよび/またはrevなどのウイルスの酵素成分および/または構造成分をコードする1つまたは複数のヘルパープラスミドでトランスフェクトされる。いくつかの態様において、レトロウイルスベクター粒子を生成する様々な遺伝的成分を分離するために複数のベクターが利用される。いくつかのかかる態様において、パッケージング細胞に別個のベクターを提供することは、さもなければ複製能を有するウイルスを生成し得る組換え事象の可能性を低減する。いくつかの態様において、レトロウイルス成分のすべてを有する単一のプラスミドベクターを使用することができる。
いくつかの態様において、レンチウイルスベクター粒子などのレトロウイルスベクター粒子は、宿主細胞の形質導入効率を高めるために偽型化される。例えば、レンチウイルスベクター粒子などのレトロウイルスベクター粒子は、いくつかの態様において、VSV-G糖タンパク質で偽型化され、これは、形質導入され得る細胞型を拡大する幅広い細胞宿主範囲を提供する。いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、例えばシンドビスウイルスエンベロープ、GALVまたはVSV-Gなどの異栄養性、多栄養性または両栄養性エンベロープを含むように、非天然エンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドまたはポリヌクレオチドでトランスフェクトされる。
いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、ウイルスゲノムRNAをレンチウイルスベクター粒子にパッケージングするためにトランスで必要とされるウイルス調節タンパク質および構造タンパク質を含む成分を提供する。いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、レンチウイルスタンパク質を発現し、機能性レンチウイルスベクター粒子を産生することができる任意の細胞株であり得る。いくつかの態様において、適切なパッケージング細胞株としては、293（ATCC CCL X）、293T、HeLA（ATCC CCL 2）、D17（ATCC CCL 183）、MDCK（ATCC CCL 34）、BHK（ATCC CCL-10）およびCf2Th（ATCC CRL 1430）細胞が挙げられる。
いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、ウイルスタンパク質（1つまたは複数）を安定して発現する。例えば、いくつかの局面において、gag、pol、rev、および/または他の構造遺伝子を含むが、LTRおよびパッケージング成分を含まないパッケージング細胞株を構築することができる。いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、異種タンパク質をコードする核酸分子、および/またはエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸を含むウイルスベクターゲノムとともに、1つまたは複数のウイルスタンパク質をコードする核酸分子で一過性にトランスフェクトされ得る。
いくつかの態様において、ウイルスベクターならびにパッケージングおよび/またはヘルパープラスミドは、トランスフェクションまたは感染を介してパッケージング細胞株に導入される。パッケージング細胞株は、ウイルスベクターゲノムを含むウイルスベクター粒子を産生する。トランスフェクションまたは感染の方法は周知である。非限定的な例としては、リン酸カルシウム、DEAE-デキストランおよびリポフェクション法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションが挙げられる。
組換えプラスミドとレトロウイルスLTRおよびパッケージング配列が特別な細胞株に導入された場合（例えばリン酸カルシウム沈殿などによって）、パッケージング配列は、組換えプラスミドのRNA転写物がウイルス粒子にパッケージングされることを可能にし、ウイルス粒子はその後培養培地に分泌され得る。次に、いくつかの態様では組換えレトロウイルスを含む培地を収集し、任意で濃縮し、遺伝子導入に使用する。例えば、いくつかの局面において、パッケージングプラスミドと導入ベクターのパッケージング細胞株への同時トランスフェクション後、ウイルスベクター粒子は培養培地から回収され、当業者によって使用される標準的な方法によって力価測定される。
いくつかの態様において、レンチウイルスベクターなどのレトロウイルスベクターは、レンチウイルス粒子の生成を可能にするプラスミドの導入により、例示的なHEK 293T細胞株などのパッケージング細胞株において作製することができる。いくつかの態様において、パッケージング細胞は、gagおよびpolをコードするポリヌクレオチド、ならびに抗原受容体、例えばCARなどの組換え受容体をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされるおよび/またはそれを含む。いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、任意でおよび/またはさらに、revタンパク質をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされるおよび/またはそれを含む。いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、任意でおよび/またはさらに、VSV-Gなどの非天然エンベロープ糖タンパク質をコードするポリヌクレオチドでトランスフェクトされるおよび/またはそれを含む。いくつかのかかる態様において、細胞、例えばHEK 293T細胞のトランスフェクションの約2日後、細胞上清は組換えレンチウイルスベクターを含み、これを回収し、力価測定することができる。
回収および/または作製されたレトロウイルスベクター粒子は、記載されている方法を使用して標的細胞に形質導入するために使用することができる。標的細胞に入ると、ウイルスRNAは逆転写され、核内に輸送され、宿主ゲノムに安定に組み込まれる。ウイルスRNAの組み込みの1日または2日後、組換えタンパク質、例えばCARなどの抗原受容体の発現を検出することができる。
いくつかの態様において、提供される方法は、複数の細胞を含む細胞組成物をウイルス粒子と接触させる、例えばインキュベートすることによって細胞に形質導入する方法を含む。いくつかの態様において、トランスフェクトまたは形質導入される細胞は、対象から濃縮および/または選択された細胞などの、対象から得られた初代細胞であるか、またはそれを含む。
いくつかの態様において、組成物の形質導入される細胞の濃度は、1.0×105細胞/mL〜1.0×108細胞/mLまたは約1.0×105細胞/mL〜約1.0×108細胞/mL、例えば少なくとも1.0×105細胞/mLもしくは少なくとも約1.0×105細胞/mLもしくは約1.0×105細胞/mL、少なくとも5×105細胞/mLもしくは少なくとも約5×105細胞/mLもしくは約5×105細胞/mL、少なくとも1×106細胞/mLもしくは少なくとも約1×106細胞/mLもしくは約1×106細胞/mL、少なくとも5×106細胞/mLもしくは少なくとも約5×106細胞/mLもしくは約5×106細胞/mL、少なくとも1×107細胞/mLもしくは少なくとも約1×107細胞/mLもしくは約1×107細胞/mL、少なくとも5×107細胞/mLもしくは少なくとも約5×107細胞/mLもしくは約5×107細胞/mL、または少なくとも1×108細胞/mLもしくは少なくとも約1×108細胞/mLもしくは約1×108細胞/mLである。
いくつかの態様において、ウイルス粒子は、形質導入される細胞の総数あたり、ウイルスベクター粒子のコピーまたはその感染単位（IU）の特定の比率（IU/細胞）で提供される。例えば、いくつかの態様において、ウイルス粒子は、接触中、細胞1個あたり0.5IUもしくは約0.5IUもしくは少なくとも0.5IUもしくは少なくとも約0.5IU、1IUもしくは約1IUもしくは少なくとも1IUもしくは少なくとも約1IU、2IUもしくは約2IUもしくは少なくとも2IUもしくは少なくとも約2IU、3IUもしくは約3IUもしくは少なくとも3IUもしくは少なくとも約3IU、4IUもしくは約4IUもしくは少なくとも4IUもしくは少なくとも約4IU、5IUもしくは約5IUもしくは少なくとも5IUもしくは少なくとも約5IU、10IUもしくは約10IUもしくは少なくとも10IUもしくは少なくとも約10IU、15IUもしくは約15IUもしくは少なくとも15IUもしくは少なくとも約15IU、20IUもしくは約20IUもしくは少なくとも20IUもしくは少なくとも約20IU、30IUもしくは約30IUもしくは少なくとも30IUもしくは少なくとも約30IU、40IUもしくは約40IUもしくは少なくとも40IUもしくは少なくとも約40IU、50IUもしくは約50IUもしくは少なくとも50IUもしくは少なくとも約50IU、または60IUもしくは約60IUもしくは少なくとも60IUもしくは少なくとも約60IUのウイルスベクター粒子で存在する。
いくつかの態様において、ウイルスベクター粒子の力価は、1×106IU/mL〜1×108IU/mまたは約1×106IU/mL〜約1×108IU/mL、例えば5×106IU/mL〜5×107IU/mLまたは約5×106IU/mL〜約5×107IU/mL、例えば少なくとも6×106IU/mL、少なくとも7×106IU/mL、少なくとも8×106IU/mL、少なくとも9×106IU/mL、少なくとも1×107IU/mL、少なくとも2×107IU/mL、少なくとも3×107IU/mL、少なくとも4×107IU/mL、または少なくとも5×107IU/mLである。
いくつかの態様において、形質導入は、100未満、例えば一般に60未満、50未満、40未満、30未満、20未満、10未満、5未満またはより低い感染多重度（MOI）で達成することができる。
いくつかの態様において、方法は、細胞をウイルス粒子と接触させるまたはインキュベートすることを含む。いくつかの態様において、接触は、30分間〜72時間、例えば30分間〜48時間、30分間〜24時間、または1時間〜24時間、例えば少なくとも30分間もしくは少なくとも約30分間、少なくとも1時間もしくは少なくとも約1時間、少なくとも2時間もしくは少なくとも約2時間、少なくとも6時間もしくは少なくとも約6時間、少なくとも12時間もしくは少なくとも約12時間、少なくとも24時間もしくは少なくとも約24時間、または少なくとも36時間もしくは少なくとも約36時間またはそれより長い間である。
いくつかの態様において、接触は溶液中で行われる。いくつかの態様において、細胞とウイルス粒子は、0.5mL〜500mLまたは約0.5mL〜約500mL、例えば0.5mL〜200mLもしくは約0.5mL〜約200mL、0.5mL〜100mLもしくは約0.5mL〜約100mL、0.5mL〜50mLもしくは約0.5mL〜約50mL、0.5mL〜10mLもしくは約0.5mL〜約10mL、0.5mL〜5mLもしくは約0.5mL〜約5mL、5mL〜500mLもしくは約5mL〜約500mL、5mL〜200mLもしくは約5mL〜約200mL、5mL〜100mLもしくは約5mL〜約100mL、5mL〜50mLもしくは約5mL〜約50mL、5mL〜10mLもしくは約5mL〜約10mL、10mL〜500mLもしくは約10mL〜約500mL、10mL〜200mLもしくは約10mL〜約200mL、10mL〜100mLもしくは約10mL〜約100mL、10mL〜50mLもしくは約10mL〜約50mL、50mL〜500mLもしくは約50mL〜約500mL、50mL〜200mLもしくは約50mL〜約200mL、50mL〜100mLもしくは約50mL〜約100mL、100mL〜500mLもしくは約100mL〜約500mL、100mL〜200mLもしくは約100mL〜約200mL、または200mL〜500mLもしくは約200mL〜約500mLの体積で接触される。
一部の特定の態様において、インプット細胞は、ウイルスDNAによってコードされる組換え受容体に結合するまたはそれを認識する結合分子を含む粒子で処理されるか、該粒子とインキュベートまたは接触される。
いくつかの態様において、ウイルスベクター粒子との細胞のインキュベーションは、ウイルスベクター粒子で形質導入された細胞を含むアウトプット組成物をもたらすかまたは作製する。
2.非ウイルスベクター
いくつかの態様において、組換え核酸はエレクトロポレーションを介してT細胞に移入される（例えばChicaybam et al,（2013）PLoS ONE 8（3）:e60298およびVan Tedeloo et al.（2000）Gene Therapy 7（16）:1431-1437参照）。いくつかの態様において、組換え核酸は転位を介してT細胞に移入される（例えばManuri et al.（2010）Hum Gene Ther 21（4）:427-437;Sharma et al.（2013）Molec Ther Nucl Acids 2,e74;およびHuang et al.（2009）Methods Mol Biol 506:115-126参照）。免疫細胞において遺伝物質を導入および発現させる他の方法としては、リン酸カルシウムトランスフェクション（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology,John Wiley＆Sons,New York.N.Y.に記載されている）、プロトプラスト融合、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、タングステン粒子促進微粒子銃（Johnston,Nature,346:776-777（1990））;およびリン酸ストロンチウムDNA共沈（Brash et al.,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034（1987））が挙げられる。
組換え産物をコードする核酸の移入のための他のアプローチおよびベクターは、例えば国際公開公報第2014055668号、および米国特許第7,446,190号に記載されているものである。
いくつかの態様において、細胞、例えば、T細胞は、拡大の間または後に、例えば、T細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）でトランスフェクトされ得る。所望の受容体の遺伝子の導入のためのこのトランスフェクションは、例えば、あらゆる適切なレトロウイルスベクターを用いて実施することができる。次いで、遺伝子修飾された細胞集団は、最初の刺激（例えば、CD3/CD28刺激）から解放され、続いて、例えば、新規に導入された受容体を介して）、第二の種類の刺激で刺激することができる。この第二の種類の刺激としては、ペプチド/MHC分子、遺伝子導入された受容体の同族（架橋結合する）リガンド（例えば、CARの天然のリガンド）または（例えば、受容体内の定常領域を認識することによって）新たな受容体のフレームワーク内に直接結合するあらゆるリガンド（抗体など）の形態での抗原性刺激が挙げられ得る。例えば、Cheadle et al.,“Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012;907:645-66またはBarrett et al.,Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol.65:333-347（2014）を参照されたい。
一部の状況において、細胞、例えばT細胞が活性化されることを必要としないベクターが使用され得る。いくつかのこのような事例では、細胞は、活性化の前に選択されおよび/または形質導入され得る。したがって、細胞は、細胞の培養前にまたは後に、一部の状況においては、培養の少なくとも一部と同時にまたはその間に、操作され得る。
いくつかの局面において、細胞は、サイトカインまたはその他の因子の発現を促進するようにさらに操作される。さらなる核酸、例えば、導入のための遺伝子に属するのは、例えば、導入された細胞の生存性および/または機能を促進することによって、治療の有効性を改善させるためのもの;例えば、インビボでの生存また局在化を評価するために、細胞の選択および/または評価のための遺伝マーカーを提供するための遺伝子;Lupton S.D.et al.,Mol.and Cell Biol.,11:6（1991）;およびRiddell et al.,Human Gene Therapy 3:319-338（1992）によって記載されているように、例えば、細胞をインビボで陰性選択を受けやすいようにすることによって、安全性を改善するための遺伝子であり、ドミナントポジティブの選択可能なマーカーを陰性選択可能なマーカーと融合することによって得られる二機能性の選択可能な融合遺伝子の使用を記載するLupton et al.によるPCT/US91/08442号およびPCT/US94/05601号の刊行物も参照されたい。例えば、Riddell et al.,米国特許第6,040,177号のカラム14〜17を参照されたい。
いくつかの態様において、組換え核酸はトランスポゾンを介してT細胞に移入される。トランスポゾン（転位可能なエレメント）は、ゲノム内のある遺伝子座から別の遺伝子座に移動することができるDNAの可動セグメントである。これらのエレメントは、保存的な「カットアンドペースト」機構を介して移動する:トランスポザーゼは、トランスポゾンの元の場所からの切り出しを触媒し、ゲノムの他の場所での再組み込みを促進する。トランスポザーゼ欠損エレメントは、トランスポザーゼが別のトランスポザーゼ遺伝子によって提供される場合、動員され得る。したがって、トランスポゾンを利用して、ウイルス形質導入系を使用せずに外来DNAを宿主ゲノムに組み込むことができる。哺乳動物細胞、例えばヒト初代白血球での使用に適したトランスポゾンの例としては、Sleeping BeautyおよびPiggybacが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
トランスポゾンベースのトランスフェクションは、トランスポザーゼとトランスポゾンからなる2成分系である。いくつかの態様において、系は、外来DNA（本明細書ではカーゴDNAとも称される）、例えば付随するトランスポザーゼによって認識される逆方向反復/直列反復（IR/DR）配列が隣接する組換え受容体をコードする遺伝子を含むように操作されたトランスポゾンを含む。いくつかの態様において、非ウイルスプラスミドは、プロモーターの制御下でトランスポザーゼをコードする。プラスミドの宿主細胞へのトランスフェクションは、トランスポザーゼの一過性の発現をもたらし、したがって、トランスフェクション後の初期には、トランスポザーゼはトランスポゾンをゲノムDNAに組み込むのに十分なレベルで発現される。いくつかの態様において、トランスポザーゼ自体はゲノムDNAに組み込まれないため、トランスポザーゼの発現は経時的に減少する。いくつかの態様において、トランスポザーゼ発現は、対応するトランスポゾンを約4時間未満、約8時間未満、約12時間未満、約24時間未満、約2日間未満、約3日間未満、約4日間未満、約5日間未満、約6日間未満、約7日間未満、約2週間未満、約3週間未満、約4週間未満、約数週間未満、または約8週間未満の間、対応するトランスポゾンを組み込むのに十分なレベルで宿主細胞によって発現される。いくつかの態様において、宿主ゲノムに導入されたカーゴDNAは、少なくとも宿主がカーゴDNAを切り出すことができる内因性トランスポザーゼを発現しないため、その後宿主のゲノムから除去されない。
Sleeping Beauty（SB）は、サケ科魚類ゲノムに保有される休眠エレメントから再構築された、トランスポゾンのTc/1-マリナースーパーファミリーの合成メンバーである。SBトランスポゾンベースのトランスフェクションは、トランスポザーゼと、TAジヌクレオチドへの正確な組み込みをもたらす逆方向反復/直列反復（IR/DR）配列を含むトランスポゾンからなる2成分系である。トランスポゾンは、IR/DRが隣接する関心対象の発現カセットを用いて設計される。SBトランスポザーゼは、Sleeping beautyトランスポゾンのIRに位置する特異的結合部位に結合する。SBトランスポザーゼは、触媒酵素（SB）の結合部位を保有する逆方向末端反復配列で両側を挟まれたカーゴ配列をコードする可動性エレメントである、トランスポゾンの組み込みを媒介する。SBがカットアンドペースト機構を介してTA標的ジヌクレオチドで脊椎動物染色体に遺伝子配列を挿入すると、安定な発現が生じる。このシステムは、初代ヒト末梢血白血球を含む、様々な脊椎動物の細胞型を操作するために使用されてきた。いくつかの態様において、細胞は、カーゴ遺伝子、例えばSB IR配列が隣接する組換え受容体またはCARをコードする遺伝子を含むSBトランスポゾンと接触され、インキュベートされ、および/または該SBトランスポゾンで処理される。特定の態様において、トランスフェクトされる細胞は、SB IR配列が隣接するカーゴ遺伝子、例えばCARをコードする遺伝子を含むSBトランスポゾンを含むプラスミドと接触され、インキュベートされ、および/または該プラスミドで処理される。一部の特定の態様において、プラスミドは、SB IR配列が隣接していないSBトランスポザーゼをコードする遺伝子をさらに含む。
PiggyBac（PB）は、カーゴDNAを宿主の、例えばヒトのゲノムDNAに組み込むために使用できる別のトランスポゾンシステムである。PBトランスポザーゼは、トランスポゾンの両端に位置するPBトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ITR）を認識し、内容物を元の部位から効率的に移動させ、それらをTTAA染色体部位に効率的に組み込む。PBトランスポゾンシステムは、PBベクター内の2つのITRの間の関心対象の遺伝子が標的ゲノムに動員されることを可能にする。PBシステムは、初代ヒト細胞を含む様々な脊椎動物の細胞型を操作するために使用されてきた。いくつかの態様において、トランスフェクトされる細胞は、PB IR配列が隣接するカーゴ遺伝子、例えばCARをコードする遺伝子を含むPBトランスポゾンと接触され、インキュベートされ、および/または該PBトランスポゾンで処理される。特定の態様において、トランスフェクトされる細胞は、PB IR配列が隣接するカーゴ遺伝子、例えばCARをコードする遺伝子を含むPBトランスポゾンを含むプラスミドと接触、インキュベートされ、および/または該プラスミドで処理される。一部の特定の態様において、プラスミドは、PB IR配列が隣接していないSBトランスポザーゼをコードする遺伝子をさらに含む。
いくつかの態様において、本発明の方法で使用されるトランスポゾン/トランスポザーゼの様々なエレメント、例えばSBまたはPBベクター（1つまたは複数）は、制限酵素切断、ライゲーションおよび分子クローニングの標準的な方法によって作製され得る。本発明のベクターを構築するための1つのプロトコルは、以下の工程を含む。第1に、所望の成分のヌクレオチド配列および外来配列を含む精製された核酸断片は、最初の供給源、例えばトランスポザーゼ遺伝子を含むベクターからの制限エンドヌクレアーゼで切断される。次に、所望のヌクレオチド配列を含む断片は、従来の分離方法を使用して、例えばアガロースゲル電気泳動によって、異なるサイズの不要な断片から分離される。所望の断片をゲルから切り出し、適切な立体配置で一緒に連結して、所望の配列、例えば上記のような本発明のベクターの様々なエレメントに対応する配列を含む環状核酸またはプラスミドを作製する。所望する場合は、そのように構築された環状分子を、その後、原核生物宿主、例えば大腸菌（E.coli）において増幅する。これらの工程に含まれる切断、プラスミド構築、細胞形質転換およびプラスミド作製の手順は当業者に周知であり、制限およびライゲーションに必要な酵素は市販されている。（例えば、R.Wu,Ed.,Methods in Enzymology,Vol.68,Academic Press,N.Y.（1979）;T.Maniatis,E.F.Fritsch and J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.（1982）;Catalog 1982-83,New England Biolabs,Inc.;Catalog 1982-83,Bethesda Research Laboratories,Inc.参照。本発明の方法で使用されるベクターを構築する方法の一例が以下の実験のセクションで提供される。代表的なSleeping Beautyトランスポゾンシステムの調製は、国際公開公報第98/40510号および国際公開公報第99/25817にも開示されている）。
いくつかの態様において、トランスポゾンによる形質導入は、トランスポザーゼ遺伝子を含むプラスミド、およびトランスポザーゼによって認識される逆方向反復/直列反復（IR/DR）配列が隣接するカーゴDNA配列を含むトランスポゾンを含むプラスミドを用いて行われる。一部の特定の態様において、カーゴDNA配列は、異種タンパク質、例えば組換えT細胞受容体またはCARをコードする。いくつかの態様では、プラスミドは、トランスポザーゼおよびトランスポゾンを含む。いくつかの態様において、トランスポザーゼは、ユビキタスプロモーター、または標的細胞におけるトランスポザーゼの発現を駆動するのに適した任意のプロモーターの制御下にある。ユビキタスプロモーターとしては、EF1a、CMB、SV40、PGK1、Ubc、ヒトβ-アクチン、CAG、TRE、UAS、Ac5、CaMKIIa、およびU6が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、カーゴDNAは、カーゴDNAのゲノムDNAへの安定な組み込みを伴う細胞の選択を可能にする選択カセットを含む。適切な選択カセットとしては、カナマイシン耐性遺伝子、スペクチノマイシン耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、カルベニシリン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブレオマイシン耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、およびポリミキシンB耐性遺伝子をコードする選択カセットが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、トランスポゾンによる形質導入のための成分、例えば、SBトランスポザーゼおよびSBトランスポゾンを含むプラスミドが、標的細胞に導入される。標的細胞の位置に応じて、標的細胞へのシステム成分のインビトロまたはインビボ導入を提供し得る、任意の好都合なプロトコルを使用し得る。例えば、標的細胞が単離された細胞である場合、システムは、例えば標準的な形質転換技術を使用することによって、標的細胞の生存能力を許容する細胞培養条件下で細胞に直接導入され得る。かかる技術としては、ウイルス感染、形質転換、接合、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、パーティクルガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ウイルスベクター送達などが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるわけではない。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞の種類および形質転換が行われている状況（つまりインビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に依存する。これらの方法の一般的な考察は、Ausubel,et al,Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed.,Wiley＆Sons,1995に記載されている。
いくつかの態様において、SBトランスポゾンおよびSBトランスポザーゼ供給源は、トランスポゾンを運ぶベクターからの逆方向反復隣接核酸の切り出し、および切り出された核酸の標的細胞のゲノムへのその後の組み込みに十分な条件下で、多細胞生物、例えば哺乳動物またはヒトの標的細胞に導入される。いくつかの態様は、必要なトランスポザーゼ活性が導入されたトランスポゾンとともに標的細胞中に存在することを確実にする工程をさらに含む。トランスポゾンベクター自体の構造、すなわちベクターがトランスポザーゼ活性を有する産物をコードする領域を含むかどうかに依存して、方法は、必要なトランスポザーゼ活性をコードする第2のベクターを標的細胞に導入することをさらに含み得る。
いくつかの態様において、トランスポゾンを含むベクター核酸の量および細胞に導入されるトランスポザーゼをコードするベクター核酸の量は、トランスポゾン核酸の所望の切り出しおよび標的細胞ゲノムへの挿入を提供するのに十分である。そのため、導入されるベクター核酸の量は、十分な量のトランスポザーゼ活性および標的細胞に挿入されることを所望する核酸の十分なコピー数を提供するべきである。標的細胞に導入されるベクター核酸の量は、使用される特定の導入プロトコル、例えば使用される特定のエクスビボ投与プロトコルの効率に依存して異なる。
ベクターDNAが必要なトランスポザーゼとともにターゲット細胞に入れば、逆方向反復配列が隣接するベクターの核酸領域、すなわちSleeping Beautyトランスポザーゼと認識される逆方向反復配列の間に位置するベクター核酸が、提供されたトランスポザーゼを介してベクターから切り出され、標的細胞のゲノムに挿入される。そのため、標的細胞へのベクターDNAの導入の後に、ベクターによって運ばれる外因性核酸の、トランスポザーゼを介した切り出しおよび標的細胞のゲノムへの挿入が続く。特定の態様において、ベクターは、SBトランスポゾンおよび/またはSBトランスポザーゼでトランスフェクトされた細胞の少なくとも1％、少なくとも2％、少なくとも3％、少なくとも4％、少なくとも5％、少なくとも6％、少なくとも7％、少なくとも8％、少なくとも9％、少なくとも10％、少なくとも15％、または少なくとも20％のゲノムに組み込まれる。いくつかの態様において、標的細胞ゲノムへの核酸の組み込みは安定である、すなわちベクター核酸は、一過性の期間を超えて標的細胞ゲノムに存在し続け、染色体遺伝物質の一部として標的細胞の子孫に伝えられる。
一部の特定の態様において、トランスポゾンは、様々なサイズの核酸、すなわちポリヌクレオチドを標的細胞ゲノムに組み込むために使用される。いくつかの態様において、本発明の方法を使用して標的細胞ゲノムに挿入されるDNAのサイズは、約0.1kb〜200kb、約0.5kb〜100kb、約1.0kb〜約8.0kb、約1.0〜約200kb、約1.0〜約10kb、約10kb〜約50kb、約50kb〜約100kb、または約100kb〜約200kbの範囲である。いくつかの態様において、本発明の方法を使用して標的細胞ゲノムに挿入されるDNAのサイズは、約1.0kb〜約8.0kbの範囲である。いくつかの態様において、本発明の方法を使用して標的細胞ゲノムに挿入されるDNAのサイズは、約1.0〜約200kbの範囲である。特定の態様において、本発明の方法を使用して標的細胞ゲノムに挿入されるDNAのサイズは、約1.0kb〜約8.0kbの範囲である。
D.細胞の培養および/または拡大
いくつかの態様において、提供される方法は、細胞を培養する、例えば増殖および/または拡大を促進する条件下で細胞を培養するための1つまたは複数の工程を含む。いくつかの態様において、細胞は、遺伝子操作、例えば形質導入またはトランスフェクションによって組換えポリペプチドを細胞に導入する工程の後に、増殖および/または拡大を促進する条件下で培養される。特定の態様において、細胞は、刺激条件下でインキュベートされ、組換えポリヌクレオチド、例えば組換え受容体をコードするポリヌクレオチドで形質導入またはトランスフェクトされた後に培養される。
一部の特定の態様において、操作されたT細胞の1つまたは複数の組成物は、濃縮T細胞の2つの別個の組成物であるか、またはそれを含む。特定の態様において、濃縮T細胞の2つの別個の組成物、例えば同じ生物学的試料から選択、単離、および/または濃縮された濃縮T細胞の2つの別個の組成物は、刺激条件下で別々に培養される。一部の特定の態様において、2つの別個の組成物は、濃縮CD4＋T細胞の組成物を含む。特定の態様において、2つの別個の組成物は、濃縮CD8＋T細胞の組成物を含む。いくつかの態様において、濃縮CD4＋T細胞および濃縮CD8＋T細胞の2つの別個の組成物は、例えば増殖および/または拡大を促進する条件下で別々に培養される。いくつかの態様において、濃縮T細胞の単一の組成物が培養される。一部の特定の態様において、単一の組成物は、濃縮CD4＋T細胞の組成物である。いくつかの態様において、単一の組成物は、培養の前に別個の組成物から組み合わされた濃縮CD4＋およびCD8＋T細胞の組成物である。
いくつかの態様において、例えば増殖および/または拡大を促進する条件下で培養される、濃縮CD4＋T細胞の組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD4＋T細胞を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％の、組換え受容体を発現し、および/または組換えポリヌクレオチドで形質導入もしくはトランスフェクトされたCD8＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、培養される濃縮CD4＋T細胞の組成物は、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、または0.01％未満のCD8＋T細胞を含む、および/またはCD8＋T細胞を含まない、および/またはCD8＋T細胞不含であるかもしくは実質的に不含である。
いくつかの態様において、例えば増殖および/または拡大を促進する条件下で培養される、濃縮CD8＋T細胞の組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD8＋T細胞を含む。特定の態様において、組成物は、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％の、組換え受容体を発現する、および/または組換えポリヌクレオチドで形質導入もしくはトランスフェクトされたCD8＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、刺激条件下でインキュベートされる濃縮CD8＋T細胞の組成物は、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、または0.01％未満のCD4＋T細胞を含む、および/またはCD4＋T細胞を含まない、および/またはCD4＋T細胞不含であるかもしくは実質的に不含である。
いくつかの態様において、濃縮CD4＋およびCD8＋T細胞の別個の組成物は、単一の組成物に組み合わされ、例えば増殖および/または拡大を促進する条件下で培養される。一部の特定の態様において、濃縮CD4＋および濃縮CD8＋T細胞の別個の培養された組成物は、培養が行われたおよび/または完了した後に単一の組成物に組み合わされる。
いくつかの態様において、濃縮T細胞の組成物は、増殖および/または拡大を促進する条件下で培養される。いくつかの態様において、かかる条件は、集団中の細胞の増殖、拡大、活性化、および/または生存を誘導するように設計され得る。特定の態様において、刺激条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、作用物質、例えば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および/または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞の成長、分裂、および/または拡大を促進するように設計された他の任意の剤の1つまたは複数を含み得る。
特定の態様において、細胞は1種または複数種のサイトカインの存在下で培養される。特定の態様において、1種または複数種のサイトカインは組換えサイトカインである。いくつかの態様において、1種または複数種のサイトカインはヒト組換えサイトカインである。一部の特定の態様において、1種または複数種のサイトカインは、T細胞によって発現されるおよび/またはT細胞に内在する受容体に結合しおよび/または結合することができる。特定の態様において、1種または複数種のサイトカインは、サイトカインの4αヘリックスバンドルファミリーの一員であり、またはサイトカインの4αヘリックスバンドルファミリーの一員を含む。いくつかの態様において、サイトカインの4αヘリックスバンドルファミリーの一員としては、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン15（IL-15）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）が挙げられるが、これらに限定されない。
特定の態様において、細胞は、培養、例えば、増殖および/または拡大を促進する条件下での培養の前に、本明細書に、例えばセクションIIに記載されている作用物質などのmTOR活性を阻害する作用物質とインキュベートされず、接触されず、および/または曝露されない。
一部の特定の態様において、培養の少なくとも一部は、mTOR活性を阻害する作用物質、例えば、本明細書、例えばセクションIIに記載されている作用物質の存在下で行われる。いくつかの態様において、培養の全部および/または全体は、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で行われる。
特定の態様において、細胞はmTOR活性を阻害する作用物質の存在下で培養される。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、本明細書、例えばセクションIIに記載されている作用物質である。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、さらなるキナーゼの活性も阻害する。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、ホスホイノシトール-3キナーゼ（PI3K）活性も阻害する。一部の特定の態様において、作用物質は、mTOR活性を選択的に阻害する、例えば、mTOR活性を阻害するのに十分な濃度において、PI3K活性を検出可能に阻害せず、および/またはmTOR活性と同じ程度までPI3K活性を阻害しない。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質はキナーゼ活性を阻害する。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1および/またはmTORC2活性を阻害する。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質はmTORC1およびmTORC2キナーゼ活性を阻害する。
いくつかの態様において、細胞は、PI-103、SF1126、BGT226、XL765、PF-04691502、NVP-BEZ235、ピラゾロピリミジン、トリンl、トルキニブ（PP242）、PP30、Ku-0063794、WAY-600（Wyeth）、WAY-687（Wyeth）、WAY-354（Wyeth）、AZD8055、ラパマイシン（シロリムス）、テムシロリムス（CC1779）、エベロリムス（RAD001）、デフォロリムス（AP23573）、AZD8055（AstraZeneca）およびOSI-027（OSI）から選択される作用物質とともに培養される。いくつかの態様において、細胞は、セクションIIに挙げられている式、例えば式（I）、式（II）または式（III）を有するかまたはそれを含む作用物質とともに培養される。いくつかの態様において、作用物質は化合物155、化合物246または化合物63である。
一部の特定の態様において、細胞は、mTOR活性を阻害し、低減し、および/または減少させる濃度での、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で培養される。いくつかの態様において、濃度は、mTORの1種または複数種の活性を、約25％もしくは少なくとも25％、約30％もしくは少なくとも30％、約40％もしくは少なくとも40％、約50％もしくは少なくとも50％、約60％もしくは少なくとも60％、約70％もしくは少なくとも70％、約80％もしくは少なくとも80％、約85％もしくは少なくとも85％、約90％もしくは少なくとも90％、約95％もしくは少なくとも95％、約97％もしくは少なくとも97％、約98％もしくは少なくとも98％、約99％もしくは少なくとも99％または約99.9％もしくは少なくとも99.9％、阻害し、低減し、および/または減少させる。いくつかの態様において、作用物質の濃度は、初代T細胞が増殖および/または拡大することを抑制しない。いくつかの態様において、細胞は、1nM〜1μM、1nM〜100nM、50nM〜250nM、100nM〜250nM、200nM〜500nM、50nM〜250nM、100nM〜500nM、500nM〜1μM、1μM〜10μMまたは5μM〜50μMのmTOR活性を阻害する作用物質の存在下で培養される。一部の特定の態様において、細胞は、0.1nM、約0.1nMもしくは少なくとも0.1nM、0.5nM、約0.5nMもしくは少なくとも0.5nM、1nM、約1nMもしくは少なくとも1nM、5nM、約5nMもしくは少なくとも5nM、10nM、約10nMもしくは少なくとも10nM、25nM、約25nMもしくは少なくとも25nM、50nM、約50nMもしくは少なくとも50nM、100nM、約100nMもしくは少なくとも100nM、150nM、約150nMもしくは少なくとも150nM、200nM、約200nMもしくは少なくとも200nM、250nM、約250nMもしくは少なくとも250nM、500nM、約500nMもしくは少なくとも500nM、1μM、約1μMもしくは少なくとも1μM、5μM、約5μMもしくは少なくとも5μM、10μM、約10μMもしくは少なくとも10μM、25μM、約25μMもしくは少なくとも25μM、50μM、約50μMもしくは少なくとも50μMまたは100μM、約100μMもしくは少なくとも100μMのmTOR活性を阻害する作用物質の存在下で培養される。
いくつかの態様において、細胞は化合物155の存在下で培養される。一部の特定の態様において、細胞は、1nM〜1μM、1nM〜100nM、50nM〜200nM、100nM〜250nMまたは200nM〜500nMの化合物155の存在下で培養される。特定の態様において、細胞は、10nM、約10nMもしくは少なくとも10nM、25nM、約25nMもしくは少なくとも25nM、50nM、約50nMもしくは少なくとも50nM、100nM、約100nMもしくは少なくとも100nM、150nM、約150nMもしくは少なくとも150nM、200nM、約200nMもしくは少なくとも200nM、250nM、約250nMもしくは少なくとも250nMまたは500nM、約500nMもしくは少なくとも500nMの化合物155の存在下で培養される。
一部の特定の態様において、細胞は化合物246の存在下で培養される。一部の特定の態様において、細胞は、1nM〜1μM、1nM〜100nM、50nM〜200nM、100nM〜250nMまたは200nM〜500nMの化合物155の存在下で培養される。一部の特定の態様において、細胞は、10nM、約10nMもしくは少なくとも10nM、25nM、約25nMもしくは少なくとも25nM、50nM、約50nMもしくは少なくとも50nM、100nM、約100nMもしくは少なくとも100nM、150nM、約150nMもしくは少なくとも150nM、200nM、約200nMもしくは少なくとも200nM、250nM、約250nMもしくは少なくとも250nMまたは500nM、約500nMもしくは少なくとも500nMの化合物246の存在下で培養される。
特定の態様において、細胞は化合物63の存在下で培養される。一部の特定の態様において、細胞は、1nM〜1μM、1nM〜100nM、50nM〜200nM、100nM〜250nMまたは200nM〜500nMの化合物63の存在下で培養される。いくつかの態様において、細胞は、10nM、約10nMもしくは少なくとも10nM、25nM、約25nMもしくは少なくとも25nM、50nM、約50nMもしくは少なくとも50nM、100nM、約100nMもしくは少なくとも100nM、150nM、約150nMもしくは少なくとも150nM、200nM、約200nMもしくは少なくとも200nM、250nM、約250nMもしくは少なくとも250nMまたは500nM、約500nMもしくは少なくとも500nMの化合物63の存在下で培養される。
いくつかの態様において、培養は、ヒトTリンパ球などの初代免疫細胞の成長に適した温度、例えば少なくとも約25℃、一般に少なくとも約30℃、および一般に37℃または約37℃を含む。いくつかの態様において、濃縮T細胞の組成物は、25〜38℃、例えば30〜37℃、例えば37℃±2℃または約37℃±2℃の温度でインキュベートされる。いくつかの態様において、インキュベーションは、培養(culture)、例えば、培養(cultivation)または拡大が細胞の所望のまたは閾値の密度、数または用量をもたらすまでの期間行われる。いくつかの態様において、インキュベーションは、24時間超もしくは約24時間超または約24時間もしくは24時間、48時間超もしくは約48時間超または約48時間もしくは48時間、72時間超もしくは約72時間超または約72時間もしくは72時間、96時間超もしくは約96時間超または約96時間もしくは96時間、5日間超もしくは約5日間超または約5日間もしくは5日間、6日間超もしくは約6日間超または約6日間もしくは6日間、7日間超もしくは約7日間超または約7日間もしくは7日間、8日間超もしくは約8日間超または約8日間もしくは8日間、9日間超もしくは約9日間超または約9日間もしくは9日間であるか、あるいはそれを上回る。
特定の態様において、培養は閉鎖系で行われる。一部の特定の態様において、培養は、無菌条件下で、閉鎖系で行われる。特定の態様において、培養は、提供される系の1つまたは複数の工程と同じ閉鎖系で行われる。いくつかの態様において、濃縮T細胞の組成物は、閉鎖系から取り出され、培養のためにバイオリアクターに配置および/または接続される。培養に適したバイオリアクターの例としては、GE Xuri W25、GE Xuri W5、Sartorius BioSTAT RM 20/50、Finesse SmartRocker Bioreactor Systems、およびPall XRS Bioreactor Systemsが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、バイオリアクターは、培養工程の少なくとも一部の間に細胞を灌流および/または混合するために使用される。
いくつかの態様において、混合は、揺動および/もしくは運動であるか、または揺動および/もしくは運動を含む。いくつかの場合において、バイオリアクターは、運動または揺動に供することができ、これは、いくつかの局面では、酸素移動を増加させ得る。バイオリアクターを動かすことは、水平軸に沿って回転すること、垂直軸に沿って回転すること、バイオリアクターの傾いたまたは傾斜した水平軸に沿った揺動運動、またはそれらの任意の組合せを含み得るが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、インキュベーションの少なくとも一部は、揺動しながら行われる。揺動速度および揺動角度は、所望の撹拌を達成するように調整され得る。いくつかの態様において、揺動角度は、20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、または1°である。一部の特定の態様において、揺動角度は6〜16°である。他の態様において、揺動角度は7〜16°である。他の態様において、揺動角度は8〜12°である。いくつかの態様において、揺動速度は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、1 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40rpmである。いくつかの態様において、揺動速度は、両端の値を含む、4〜12rpm、例えば4〜6rpmである。
いくつかの態様において、バイオリアクターは、0.01L/分もしくは約0.01L/分もしくは少なくとも0.01L/分、0.05L/分もしくは約0.05L/分もしくは少なくとも0.05L/分、0.1L/分もしくは約0.1L/分もしくは少なくとも0.1L/分、0.2L/分もしくは約0.2L/分もしくは少なくとも0.2L/分、0.3L/分もしくは約0.3L/分もしくは少なくとも0.3L/分、0.4L/分もしくは約0.4L/分もしくは少なくとも0.4L/分、0.5L/分もしくは約0.5L/分もしくは少なくとも0.5L/分、1.0L/分もしくは約1.0L/分もしくは少なくとも1.0L/分、1.5L/分もしくは約1.5L/分もしくは少なくとも1.5L/分、または2.0L/分もしくは約2.0L/分もしくは少なくとも2.0L/分、または2.0L/分を超える一定な空気流で、37°Cまたはその付近の温度および約5％またはその近くのCO2レベルを維持する。一部の特定の態様において、培養の少なくとも一部は、例えば培養の開始および/または培養される細胞の密度に関するタイミングに依存して、例えば290ml/日、580ml/日、および/または1160ml/日の速度での灌流で行われる。いくつかの態様において、細胞培養物拡大の少なくとも一部は、例えば5°〜10°、例えば6°の角度、例えば5〜15RPM、例えば6RMPまたは10RPMの速度などの一定な揺動速度で揺動運動しながら行われる。
E.細胞の製剤化
いくつかの態様において、細胞療法および/または操作された細胞を製造、生成または作製するための提供される方法は、インキュベーション、操作、および培養、ならびに/または記載されるような1つもしくは複数の他の加工処理工程の前または後に、提供される加工処理工程から生じる遺伝子操作された細胞の製剤化などの細胞の製剤化を含み得る。いくつかの態様において、細胞の製剤化に関連する提供される方法は、閉鎖系で、上記の加工処理工程を使用して形質導入および/または拡大された細胞などの形質導入細胞を加工処理することを含む。いくつかの態様において、組換え抗原受容体、例えばCARまたはTCRで操作された細胞を含む細胞の用量は、薬学的組成物または製剤などの組成物または製剤として提供される。かかる組成物は、提供される方法に従って、例えば疾患、病態、および障害の予防もしくは処置において、または検出、診断、および予後判定方法において使用することができる。
いくつかの場合において、細胞は、細胞療法を製造、生成または作製するための1つもしくは複数の工程（例えば遠心チャンバーおよび/もしくは閉鎖系で行われる）で加工処理され、ならびに/または操作された細胞は、培養(culturing)、例えば培養(cultivation)および拡大、および/または記載されるような1つもしくは複数の他の加工処理工程の前または後に、提供される形質導入処理工程から生じる遺伝子操作された細胞の製剤化などの細胞の製剤化を含み得る。いくつかの場合において、細胞は、単回単位用量投与または複数回用量投与などの投薬のための量で製剤化され得る。いくつかの態様において、細胞の製剤化に関連する提供される方法は、閉鎖系で、上記の加工処理工程を使用して形質導入および/または拡大された細胞などの形質導入細胞を加工処理することを含む。
一部の特定の態様において、濃縮T細胞の1つまたは複数の組成物が製剤化される。特定の態様において、濃縮T細胞の1つまたは複数の組成物は、1つまたは複数の組成物が操作および/または培養された後に製剤化される。特定の態様において、1つまたは複数の組成物はインプット組成物である。いくつかの態様において、1つまたは複数のインプット組成物は、あらかじめクライオ凍結され、保存されており、インキュベーションの前に解凍される。
いくつかの態様において、処理工程の1つまたは複数によって生成されたCD4＋および/またはCD8＋T細胞などのT細胞は、製剤化される。いくつかの局面において、複数の組成物は、別々に、製造され、作製され、または生成され、例えば、任意にある一定の期間内に、別々にまたは独立に投与するために、それぞれが、対象から得た細胞の異なる集団および/またはサブタイプを含有する。例えば、細胞の異なる集団またはサブタイプを含有する操作された細胞の別々の製剤は、それぞれCD8＋およびCD4＋T細胞、ならびに/または、それぞれCD8＋濃縮された集団およびCD4＋濃縮された集団、例えば、組換え受容体を発現するように遺伝子操作された細胞をそれぞれが個々に含むCD4＋および/またはCD8＋T細胞を含むことができる。いくつかの態様において、少なくとも1つの組成物が、組換え受容体を発現するように遺伝子操作されたCD4＋T細胞を用いて製剤化される。いくつかの態様において、少なくとも1つの組成物は、組換え受容体を発現するように遺伝子操作されたCD8＋T細胞を用いて製剤化される。いくつかの態様において、用量の投与は、CD8＋T細胞の用量またはCD4＋T細胞の用量を含む第一の組成物の投与と、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞の別の用量を含む第二の組成物の投与とを含む。いくつかの態様において、CD8＋T細胞の用量またはCD4＋T細胞の用量を含む第一の組成物は、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞の別の用量を含む第二の組成物の前に投与される。いくつかの態様において、用量の投与は、CD8＋T細胞の用量とCD4＋T細胞の用量の両方を含む組成物の投与を含む。
一部の特定の態様において、濃縮されたT細胞の1つまたは複数の組成物は、2つの別個の組成物、例えば、濃縮されたT細胞の別個の操作されたおよび/もしくは培養された組成物であり、またはこれらの組成物を含む。特定の態様において、濃縮されたT細胞の2つの別個の組成物、例えば、同じ生物学的試料から選択され、単離されおよび/または濃縮された、濃縮されたT細胞の2つの別個の組成物は、別々に製剤化される。一部の特定の態様において、2つの別個の組成物は、濃縮されたCD4＋T細胞の組成物を含む。特定の態様において、2つの別個の組成物は、濃縮されたCD8＋T細胞の組成物を含む。いくつかの態様において、濃縮されたCD4＋T細胞と濃縮されたCD8＋T細胞の2つの別個の組成物は別々に製剤化される。いくつかの態様において、濃縮されたT細胞の単一の組成物が製剤化される。一部の特定の態様において、単一の組成物は、濃縮されたCD4＋T細胞の組成物である。いくつかの態様において、単一の組成物は、製剤化の前に、別個の組成物から組み合わされた、濃縮されたCD4＋およびCD8＋T細胞の組成物である。
いくつかの態様において、濃縮されたCD4＋およびCD8＋T細胞の別個の組成物は単一の組成物へと組み合わされ、製剤化される。一部の特定の態様において、濃縮されたCD4＋と濃縮されたCD8＋T細胞の別個の製剤化された組成物は、製剤化が実施および/または完了した後に単一の組成物へと組み合わされる。
いくつかの態様において、製剤化される、濃縮CD4＋T細胞の組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD4＋T細胞を含む。いくつかの態様において、組成物は、組換え受容体を発現し、および/または組換えポリヌクレオチドで形質導入もしくはトランスフェクトされた、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD4＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、製剤化される、濃縮CD4＋T細胞の組成物は、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、または0.01％未満のCD8＋T細胞を含む、および/またはCD8＋T細胞を含まない、および/またはCD8＋T細胞不含であるかもしくは実質的に不含である。
いくつかの態様において、例えば増殖および/または拡大を促進する条件下で製剤化される、濃縮CD8＋T細胞の組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD8＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、組成物は、組換え受容体を発現し、および/または組換えポリヌクレオチドで形質導入もしくはトランスフェクトされた、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD8＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、刺激条件下でインキュベートされる、濃縮CD8＋T細胞の組成物は、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、または0.01％未満のCD4＋T細胞を含む、および/またはCD4＋T細胞を含まない、および/またはCD4＋T細胞不含であるかもしくは実質的に不含である。
一部の特定の態様において、製剤化された細胞はアウトプット細胞である。いくつかの態様において、濃縮T細胞の製剤化された組成物は、濃縮T細胞のアウトプット組成物である。特定の態様において、製剤化されたCD4＋T細胞および/または製剤化されたCD8＋T細胞は、アウトプットCD4＋および/またはアウトプットCD8＋T細胞である。特定の態様において、濃縮CD4＋T細胞の製剤化された組成物は、濃縮CD4＋T細胞のアウトプット組成物である。いくつかの態様において、濃縮CD8＋T細胞の製剤化された組成物は、濃縮CD8＋T細胞のアウトプット組成物である。
いくつかの態様において、細胞は、バッグまたはバイアルなどの容器中に、製剤化することができる。
いくつかの態様において、いくつかの局面では薬学的に許容される担体または賦形剤を含有し得る、薬学的に許容される緩衝液中で、細胞は製剤化される。いくつかの態様において、加工処理は、対象への投与のために薬学的に許容されるまたは所望の培地または製剤化緩衝液への培地の交換を含む。いくつかの態様において、加工処理工程は、形質導入および/または拡大された細胞を洗浄して、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体または賦形剤を含有し得る薬学的に許容される緩衝液中の細胞を置き換えることを含み得る。薬学的に許容される担体または賦形剤を含むかかる薬学的形態の例は、細胞および組成物を対象に投与するために許容される形態と併せて、以下に記載される任意のものであり得る。いくつかの態様における薬学的組成物は、治療上有効な量または予防上有効な量などの、疾患または病態を処置または予防するために有効な量の細胞を含有する。
「薬学的に許容される担体」は、対象に対して非毒性である、活性成分以外の薬学的製剤における成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または防腐剤が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
いくつかの局面において、担体の選択は、一部には特定の細胞によっておよび/または投与方法によって決定される。したがって、種々の適切な製剤が存在する。例えば、薬学的組成物は防腐剤を含み得る。適切な防腐剤には、例えばメチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムが含まれ得る。いくつかの局面において、2つまたはそれより多くの防腐剤の混合物が使用される。防腐剤またはその混合物は、典型的には全組成物の約0.0001重量％〜約2重量％の量で存在する。担体は、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.（1980）に記載されている。薬学的に許容される担体は一般に、用いられる投与量および濃度でレシピエントに非毒性であり、以下のものを含むが、これらに限定されるわけではない:リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤;アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤;防腐剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール、メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノールおよびm-クレゾールなど）;低分子量（約10残基未満）ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質;ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリジンなどのアミノ酸;単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む他の炭水化物;EDTAなどのキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなどの糖類;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体（例えばZn-タンパク質錯体）;ならびに/またはポリエチレングリコール（PEG）などの非イオン界面活性剤。
いくつかの局面では、緩衝剤が組成物に含まれる。適切な緩衝剤は、例えばクエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに他の様々な酸および塩を含む。いくつかの局面では、2つまたはそれより多くの緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤またはその混合物は、典型的には全組成物の約0.001重量％〜約4重量％の量で存在する。投与可能な薬学的組成物を調製するための方法は公知である。例示的な方法は、例えばRemington:The Science and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams＆Wilkins;21st ed.（May 1,2005）により詳細に記載されている。
製剤は水溶液を含み得る。製剤または組成物はまた、それぞれの活性が互いに悪影響を及ぼさない場合、細胞で処置される特定の適応症、疾患、または病態に有用な複数の活性成分、好ましくは細胞に相補的な活性を有するものを含み得る。かかる活性成分は、意図される目的のために有効な量で組み合わせて適切に存在する。したがって、いくつかの態様において、薬学的組成物は、他の薬学的に活性な剤または薬物、例えば化学療法剤、例えばアスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、および/またはビンクリスチンをさらに含む。
いくつかの態様における組成物は、いくつかの局面では選択されたpHに緩衝され得る、滅菌液体調製物、例えば等張水溶液、懸濁液、エマルジョン、分散液、または粘性組成物として提供される。液体組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る。滅菌注射溶液は、適切な担体、希釈剤、または賦形剤、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどと混合して溶媒中に細胞を組み込むことによって調製することができる。組成物は、所望される投与経路および調製物に応じて、湿潤剤、分散剤または乳化剤（例えばメチルセルロース）、pH緩衝剤、ゲル化または増粘添加剤、防腐剤、香味剤、および/または着色剤などの補助物質を含有し得る。いくつかの局面において、標準的なテキストを参考にして適切な調製物が調製され得る。
抗菌防腐剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝剤を含む、組成物の安定性および無菌性を高める様々な添加剤を添加することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸によって確実にすることができる。注射用薬学的形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。
一部の態様において、製剤化緩衝液は凍結保存剤を含む。いくつかの態様において、細胞は、1.0％〜30％のDMSO溶液、例えば5％〜20％のDMSO溶液または5％〜10％のDMSO溶液を含む凍結保存溶液で製剤化される。いくつかの態様において、凍結保存溶液は、例えば、20％のDMSOおよび8％のヒト血清アルブミン（HSA）を含有するPBS、もしくは他の適切な細胞凍結培地であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、凍結保存溶液は、例えば少なくとも7.5％もしくは約7.5％のDMSOであるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、加工処理工程は、形質導入および/または拡大された細胞を洗浄して、凍結保存溶液中の細胞を置き換えることを含み得る。いくつかの態様において、細胞は、例えば、最終濃度が12.5％もしくは約12.5％、12.0％もしくは約12.0％、11.5％もしくは約11.5％、11.0％もしくは約11.0％、10.5％もしくは約10.5％、10.0％もしくは約10.0％、9.5％もしくは約9.5％、9.0％もしくは約9.0％、8.5％もしくは約8.5％、8.0％もしくは約8.0％、7.5％もしくは約7.5％、7.0％もしくは約7.0％、6.5％もしくは約6.5％、6.0％もしくは約6.0％、5.5％もしくは約5.5％、または5.0％もしくは約5.0％DMSO、あるいは1％〜15％、6％〜12％、5％〜10％、または6％〜8％DMSOである培地および/または溶液中で凍結、例えばクライオ凍結または凍結保存される。特定の態様において、細胞は、例えば、最終濃度が5.0％もしくは約5.0％、4.5％もしくは約4.5％、4.0％もしくは約4.0％、3.5％もしくは約3.5％、3.0％もしくは約3.0％、2.5％もしくは約2.5％、2.0％もしくは約2.0％、1.5％もしくは約1.5％、1.25％もしくは約1.25％、1.0％もしくは約1.0％、0.75％もしくは約0.75％、0.5％もしくは約0.5％、または0.25％もしくは約0.25％HSA、あるいは0.1％〜-5％、0.25％〜4％、0.5％〜2％、または1％〜2％HSAである培地および/または溶液中で凍結、例えばクライオ凍結または凍結保存される。
いくつかの態様において、製剤化は、培養または拡大された細胞などの細胞の洗浄、希釈または濃縮を含む1つまたは複数の加工処理工程を使用して行われる。いくつかの態様において、加工処理は、所与の用量またはその分画での投与のための細胞の数を含む単位用量形態組成物などの、所望の濃度または数への細胞の希釈または濃縮を含み得る。いくつかの態様において、加工処理工程は容量減少を含み、それにより所望に応じて細胞の濃度を増加させることができる。いくつかの態様において、加工処理工程は容量追加を含み、それにより所望に応じて細胞の濃度を減少させることができる。いくつかの態様において、加工処理は、形質導入および/または拡大された細胞に一定量の製剤化緩衝液を添加することを含む。いくつかの態様において、製剤化緩衝液の容量は、10mL〜1000mLまたは約10mL〜約1000mL、例えば少なくとも50mLもしくは少なくとも約50mLもしくは約50mL、少なくとも100mLもしくは少なくとも約100mLもしくは約100mL、少なくとも200mLもしくは少なくとも約200mLもしくは約200mL、少なくとも300mLもしくは少なくとも約300mLもしくは約300mL、少なくとも400mLもしくは少なくとも約400mLもしくは約400mL、少なくとも500mLもしくは少なくとも約500mLもしくは約500mL、少なくとも600mLもしくは少なくとも約600mLもしくは約600mL、少なくとも700mLもしくは少なくとも約700mLもしくは約700mL、少なくとも800mLもしくは少なくとも約800mLもしくは約800mL、少なくとも900mLもしくは少なくとも約900mLもしくは約900mL、または少なくとも1000mLもしくは少なくとも約1000mLもしくは約1000mLである。
いくつかの態様において、細胞組成物を製剤化するためのかかる加工処理工程は、閉鎖系で行われる。かかる加工処理工程の例は、Sepax（登録商標）またはSepax 2（登録商標）細胞処理システムで使用するためのものを含む、Biosafe SAによって生産および販売されている遠心チャンバーなどの細胞処理システムに関連する1つまたは複数のシステムまたはキットとともに遠心チャンバーを使用して実施され得る。例示的なシステムおよびプロセスは、国際公開公報第2016/073602号に記載されている。いくつかの態様において、方法は、遠心チャンバーの内部キャビティから製剤化された組成物を圧出させることを含み、これは、記載されている上記の態様のいずれかにおいて、薬学的に許容される緩衝液などの製剤化緩衝液中で製剤化された、得られる細胞の組成物である。いくつかの態様において、製剤化された組成物の圧出は、閉鎖系の一部として遠心チャンバーと機能的に連結された、本明細書に記載の生物医学材料容器のバイアルなどの容器に対してである。いくつかの態様において、生物医学材料容器は、1つもしくは複数の加工処理工程を実施する閉鎖系もしくはデバイスへの組み込みおよび/もしくは機能的な接続用に構成されており、ならびに/または前記閉鎖系もしくはデバイスに組み込まれるかもしくは機能的に接続されている。いくつかの態様において、生物医学材料容器は、アウトプットラインまたはアウトプット位置でシステムに接続されている。いくつかの場合において、閉鎖系は、入口管で生物医学材料容器のバイアルに接続されている。本明細書に記載される生物医学材料の容器とともに使用するための例示的な閉鎖系は、Sepax（登録商標）およびSepax（登録商標）2システムを含む。
いくつかの態様において、遠心チャンバーまたは細胞処理システムに連結されたものなどの閉鎖系は、製剤化された組成物の圧出のために1つまたは複数の容器が接続され得るポートとチューブラインの各端部で連結された多方向チューブマニホールドを含むマルチポートアウトプットキットを含む。いくつかの局面において、所望の数または複数のバイアルを、マルチポートアウトプットのポートの1つまたは複数、一般に2つまたはそれより多く、例えば少なくとも3、少なくとも4、少なくとも5、少なくとも6、少なくとも7、少なくとも8またはそれより多くに無菌的に接続することができる。例えば、いくつかの態様では、1つまたは複数の容器、例えば生物医学材料の容器をポートに、またはすべてよりは少ない数のポートに取り付けることができる。したがって、いくつかの態様において、系は、生物医学材料容器の複数のバイアルへのアウトプット組成物の圧出をもたらすことができる。
いくつかの局面において、細胞は、複数のアウトプット容器の1つまたは複数、例えばバイアルに、単回単位用量投与または複数回用量投与などの投与のための量で圧出され得る。例えば、いくつかの態様において、バイアルはそれぞれ、所与の用量またはその分画で投与するための細胞の数を含み得る。したがって、各バイアルは、いくつかの局面では、投与のための単回単位用量を含み得るか、または複数のバイアルのうちの1つより多く、例えばバイアルのうちの2つまたは3つが一緒になって投与量を構成するように、所望の用量の分画を含んでもよい。
したがって、容器、例えばバッグまたはバイアルは、一般に、投与される細胞、例えばその1つまたは複数の単位用量を含む。単位用量は、対象に投与される細胞の量または数、または投与される細胞の数の2倍（またはそれより多く）であり得る。それは、対象に投与される細胞の最低用量または最低可能用量であり得る。
いくつかの態様において、容器のそれぞれ、例えばバッグまたはバイアルは、単位用量の細胞を個別に含む。したがって、いくつかの態様において、各容器は、同じまたはほぼまたは実質的に同じ数の細胞を含む。いくつかの態様において、各単位用量は、少なくとも1×106もしくは少なくとも約1×106、少なくとも2×106もしくは少なくとも約2×106、少なくとも5×106もしくは少なくとも約5×106、少なくとも1×107もしくは少なくとも約1×107、少なくとも5×107もしくは少なくとも約5×107、または少なくとも1×108もしくは少なくとも約1×108個の操作された細胞、全細胞、T細胞、またはPBMCを含む。いくつかの態様において、各容器、例えばバッグまたはバイアル中の製剤化された細胞組成物の容量は、10mL〜100mL、例えば少なくとも20mLもしくは少なくとも約20mL、少なくとも30mLもしくは少なくとも約30mL、少なくとも40mLもしくは少なくとも約40mL、少なくとも50mLもしくは少なくとも約50mL、少なくとも60mLもしくは少なくとも約60mL、少なくとも70mLもしくは少なくとも約70mL、少なくとも80mLもしくは少なくとも約80mL、少なくとも90mLもしくは少なくとも約90mL、または少なくとも100mLもしくは少なくとも約100mLである。いくつかの態様において、容器、例えばバッグまたはバイアル中の細胞は凍結保存することができる。いくつかの態様において、容器、例えばバイアルは、さらに使用するまで液体窒素中で保存することができる。
いくつかの態様において、方法によって作製されるかかる細胞、またはかかる細胞を含む組成物は、疾患または病態を処置するために対象に投与される。
F.アウトプット組成物の例示的な特徴
特定の態様において、提供される方法は、1つもしくは複数のインプット組成物からおよび/または単一の生物学的試料から、濃縮されたT細胞の1つまたは複数のアウトプット組成物を作製するまたは生成するプロセスと関連して使用される。一部の特定の態様において、該1つまたは複数のアウトプット組成物は、組換え受容体、例えばTCRまたはCARを発現する細胞を含有する。いくつかの態様において、該プロセスは、mTOR活性を阻害する作用物質、例えば記載されているいずれか、例えば化合物63の存在下での、細胞のインキュベーション、操作および/または培養を含む。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、治療、例えば、自己細胞治療として、対象に投与するのに適している。
いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、上記されているような、本明細書に提供されている方法によって組換え受容体を発現するように操作されている。一部の特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、キメラ抗原受容体（CAR）、例えば抗CD19CARを発現するように操作されている。
いくつかの態様において、1つまたは複数のアウトプット組成物は、濃縮CD4＋およびCD8＋T細胞の組成物である。一部の特定の態様において、1つまたは複数のアウトプット組成物は、濃縮CD4＋T細胞の組成物を含む。特定の態様において、1つまたは複数のアウトプット組成物は、濃縮CD8＋T細胞の組成物を含む。いくつかの態様において、1つまたは複数のアウトプット組成物は、濃縮CD4＋T細胞のアウトプット組成物および濃縮CD8＋T細胞のアウトプット組成物を含む。
いくつかの態様において、濃縮CD4＋T細胞のアウトプット組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD4＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、アウトプット組成物は、組換え受容体を発現する、および/または組換えポリヌクレオチドで形質導入もしくはトランスフェクトされた、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD4＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、濃縮CD4＋T細胞のアウトプット組成物は、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、もしくは0.01％未満のCD8＋T細胞を含む、および/またはCD8＋T細胞を含まない、および/またはCD8＋T細胞不含であるかもしくは実質的に不含である。
いくつかの態様において、濃縮CD8＋T細胞のアウトプット組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD8＋T細胞を含む。特定の態様において、組成物は、組換え受容体を発現する、および/または組換えポリヌクレオチドで形質導入もしくはトランスフェクトされた、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD8＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、濃縮CD8＋T細胞のアウトプット組成物は、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、もしくは0.01％未満のCD4＋T細胞を含む、および/またはCD4＋T細胞を含まない、および/またはCD4＋T細胞不含であるかもしくは実質的に不含である。
一部の特定の態様において、提供される方法と関連するプロセスは、例示的なおよび/または別のプロセスと比較される。いくつかの態様において、別のおよび/または例示的なプロセスは、細胞（例えば、濃縮されたCD4＋T細胞、濃縮されたCD8＋T細胞ならびに/または濃縮されたCD4＋およびCD8＋T細胞を含む、インプット細胞、刺激された細胞および/または操作された細胞）の組成物が、mTOR阻害剤、例えば化合物63の存在下でインキュベートされていない、操作されていない、および/または培養されていないことを除いて、提供された方法と関連するプロセスと類似する、または同一である。いくつかの態様において、例示的な別のプロセスのアウトプット細胞は、例えば、操作されたT細胞を拡大するために、mTOR活性を阻害する作用物質、例えば化合物63の存在下で、以前に培養されていない。いくつかの態様において、例示的な別のプロセスによって作製されるアウトプット細胞は、提供される方法と関連して作製されたアウトプット組成物の細胞と同じ組換え受容体を発現するように操作されている。
いくつかの態様において、例示的な別のプロセス、例えば、細胞が、mTOR阻害剤、例えば化合物63の存在下で培養されないプロセスのアウトプット細胞中での発現と比較して、1つまたは複数の遺伝子がアウトプット組成物の細胞によって差次的に発現される。いくつかの態様において、例示的な別のプロセスによって作製されたアウトプット細胞と比較して、1つまたは複数の遺伝子がアウトプット組成物の細胞中で下方制御される。いくつかの態様において、代謝ストレス応答、T細胞活性化、Th1およびTh2活性化経路、細胞周期停止、グルココルチコイド生合成、多能性幹細胞からの造血、T細胞活性化、リンパ球分化、白血球遊走、システイン型エンドペプチダーゼ阻害剤活性、細胞周期進行、栄養素レベルへの応答ならびに増殖因子受容体シグナル伝達と関連する1つまたは複数の遺伝子が、例示的な別のプロセスによって作製されたアウトプット細胞と比較して、アウトプット組成物からの細胞中において下方制御される。
一部の特定の態様において、例えば、mTORを阻害する作用物質、例えば化合物63の存在下で実施されないプロセスなどの例示的な別のプロセスによって作製されたアウトプット細胞と比較して、1つまたは複数の遺伝子がアウトプット組成物の細胞中において上方制御される。いくつかの態様において、増殖因子受容体シグナル伝達、脂肪酸酸化、共通γサイトカイン受容体シグナル伝達経路、タンパク質脱グリコシル化、T細胞活性化、細胞周期進行リンパ球分化、Th1およびTh2活性化経路、ステロール恒常性、多能性幹細胞からの造血、アポトーシスプロセス、T細胞活性化およびRAR活性化およびイオン媒介性シグナル伝達と関連する1つまたは複数の遺伝子が、例示的な別のプロセスによって作製されたアウトプット細胞と比較して、アウトプット組成物からの細胞中において上方制御される。
いくつかの態様において、例示的な別のプロセス、例えば、mTOR阻害剤、例えば化合物63の存在下で細胞が培養されないプロセスによって作製されたアウトプット細胞と比較して、アウトプット組成物は、抗原、例えば、組換え受容体によって結合されおよび/または認識される抗原による刺激に対して同一のまたはより大きな応答を有する細胞、例えば、組換え受容体を発現するように操作されたCD4＋および/またはCD8＋T細胞を含有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、例示的な別のプロセスによって作製されたアウトプット細胞と比較して、抗原による刺激に応答して、解糖代謝、mTOR活性、サイトカイン産生、細胞溶解活性、拡大および/または増殖の同一のもしくはより大きな増加を有し、および/または同一のもしくはより大きな増加を生成することができる。
いくつかの態様において、アウトプット細胞は、例示的な/別のプロセス（例えば、細胞が、mTOR阻害剤、例えば化合物63の存在下でインキュベートされない、操作されない、および/または培養されないプロセス）によって作製されたアウトプット細胞と、パラメータ、特性および/または活性に関して類似の応答を有する。いくつかの態様において、アウトプット細胞の類似の応答の測定値は、例示的な別のプロセスによって作製されたアウトプット細胞による応答の測定値と統計学的に異ならない。いくつかの態様において、アウトプット細胞の類似の応答の測定値は、例示的な別のプロセスによって作製されたアウトプット細胞による応答の測定値から25％、20％、10％、5％または1％の範囲内である。
一部の特定の態様において、細胞代謝、例えば、解糖代謝速度の変化は、免疫細胞機能の駆動因子および/または制御因子として機能し得る。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、抗原刺激による解糖代謝の速度において、例示的な別のプロセス（例えば、細胞が、mTOR阻害剤、例えば化合物63の存在下で培養されないプロセス）によって作製されたアウトプット細胞と類似の増加を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、抗原による刺激に応答して、解糖代謝の速度の10％、約10％もしくは少なくとも10％、20％、約20％もしくは少なくとも20％、25％、約25％もしくは少なくとも25％、30％、約30％もしくは少なくとも30％、40％、約40％もしくは少なくとも40％、50％、約50％もしくは少なくとも50％、60％、約60％もしくは少なくとも60％、70％、約70％もしくは少なくとも70％、75％、約75％もしくは少なくとも75％、80％、約80％もしくは少なくとも80％、90％、約90％もしくは少なくとも90％、100％、約100％もしくは少なくとも100％、125％、約125％もしくは少なくとも125％、150％、約150％もしくは少なくとも150％、1倍、約1倍もしくは少なくとも1倍、2倍、約2倍もしくは少なくとも2倍、3倍、約3倍もしくは少なくとも3倍、4倍、約4倍もしくは少なくとも4倍または5倍、約5倍もしくは少なくとも5倍の増加を有する。一部の特定の態様において、抗原刺激に応答した解糖代謝の増加は、例示的な別のプロセスによって作製されたアウトプット細胞中での、抗原刺激による解糖代謝の速度の増加より、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも50％または少なくとも100％大きい。一部の特定の態様において、解糖代謝は、酸素消費および酸産生の細胞外測定（ECAR（extracellular measurement of oxygen consumption and acid production））によるなど、任意の公知の手段によって測定され得る。
特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、例示的な別のプロセス（例えば、細胞が、mTOR阻害剤、例えば化合物63の存在下で培養されないプロセス）によって作製されたアウトプット細胞と類似の、抗原刺激によるmTOR活性の増加を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、抗原による刺激に応答して、mTOR活性の25％、約25％もしくは少なくとも25％、50％、約50％もしくは少なくとも50％、75％、約75％もしくは少なくとも75％、100％、約100％もしくは少なくとも100％、125％、約125％もしくは少なくとも125％、150％、約150％もしくは少なくとも150％、1倍、約1倍もしくは少なくとも1倍、2倍、約2倍もしくは少なくとも2倍、3倍、約3倍もしくは少なくとも3倍、4倍、約4倍もしくは少なくとも4倍または5倍、約5倍もしくは少なくとも5倍の増加を有する。一部の特定の態様において、抗原刺激に応答した増加したmTOR活性は、例示的な別のプロセスによって作製されたアウトプット細胞中での、抗原刺激によるmTOR活性の増加より、少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも75％または少なくとも100％大きい。
一部の特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、例示的な別のプロセス（例えば、細胞が、mTOR阻害剤、例えば化合物63の存在下で培養されないプロセス）によって作製されたアウトプット細胞と類似の、抗原刺激に応答したサイトカイン産生を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、例示的な別のプロセスによって作製されるアウトプット細胞と類似の、抗原刺激に応答したサイトカイン、例えば、TNF-アルファ、IFN-ガンマおよび/またはIL-2の産生を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、mTORを阻害する作用物質、例えば化合物63の存在下で実施されない別のプロセスと比較して、抗原による刺激に応答した1種または複数種のサイトカインの産生の50％、約50％もしくは少なくとも50％、60％、約60％もしくは少なくとも60％、70％、約70％もしくは少なくとも70％、75％、約75％もしくは少なくとも75％、80％、約80％もしくは少なくとも80％、90％、約90％もしくは少なくとも90％、100％、約100％もしくは少なくとも100％、125％、約125％もしくは少なくとも125％、150％、約150％もしくは少なくとも150％、1倍、約1倍もしくは少なくとも1倍、2倍、約2倍もしくは少なくとも2倍、3倍、約3倍もしくは少なくとも3倍、4倍、約4倍もしくは少なくとも4倍または5倍、約5倍もしくは少なくとも5倍の増加を有する。一部の特定の態様において、抗原刺激に応答した増加したmTOR活性は、例示的な別のプロセスによって作製されたアウトプット細胞中での抗原刺激後の1種または複数種のサイトカインの産生より、少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも50％または少なくとも100％大きい。いくつかの態様において、サイトカインの産生は、ELISAおよび/または抗体ベースの検出方法を含むがこれらに限定されない標準的な公知の技術によって、測定または評価され得る。
特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、例示的な別のプロセス（例えば、細胞が、mTOR阻害剤、例えば化合物63の存在下で培養されないプロセス）によって作製されたアウトプット細胞の割合、パーセンテージおよび/または量と類似した割合、パーセンテージおよび/または量の、抗原刺激に応答した1種または複数種のサイトカインを産生する細胞を有する。一部の特定の態様において、アウトプット組成物の細胞の約10％もしくは少なくとも10％、約20％もしくは少なくとも20％、約25％もしくは少なくとも25％、約30％もしくは少なくとも30％、約40％もしくは少なくとも40％、約50％もしくは少なくとも50％、約60％もしくは少なくとも60％、約70％もしくは少なくとも70％、約75％もしくは少なくとも75％、約80％もしくは少なくとも80％、約90％もしくは少なくとも90％、約95％もしくは少なくとも95％または約100％もしくは少なくとも100％が、抗原刺激に応答して、1種または複数種のサイトカイン、例えば、TNF-アルファ、IFN-ガンマおよび/またはIL-2を産生する。特定の態様において、1種または複数種のサイトカインを産生するアウトプット組成物の細胞の割合、パーセンテージおよび/または量は、1種または複数種のサイトカインを産生する例示的な別のプロセスによって作製されるアウトプット細胞の割合、パーセンテージおよび/または量より、約5％もしくは少なくとも5％、約10％もしくは少なくとも10％、約15％もしくは少なくとも15％、約20％もしくは少なくとも20％、約25％もしくは少なくとも25％、約30％もしくは少なくとも30％、約35％もしくは少なくとも35％、約40％もしくは少なくとも40％、約45％もしくは少なくとも45％、約50％もしくは少なくとも50％、約75％もしくは少なくとも75％、約100％もしくは少なくとも100％、約125％もしくは少なくとも125％、約150％もしくは少なくとも150％または約1倍もしくは少なくとも1倍、約2倍もしくは少なくとも2倍、約3倍もしくは少なくとも3倍大きい。一部の特定の態様において、サイトカインを産生する細胞の割合、パーセンテージおよび/または量は、細胞内サイトカイン染色（ICS）アッセイを含むあらゆる公知のまたは標準的な技術によって測定または評価され得る。
特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、例示的な別のプロセス（例えば、細胞が、mTOR阻害剤、例えば化合物63の存在下でインキュベートされず、操作されずおよび/または培養されないプロセス）によって作製されたアウトプット細胞と類似した、組換え受容体によって結合および/または認識される抗原を発現する細胞（例えば、標的細胞）に対する細胞溶解活性を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞が、抗原を発現する細胞、例えば標的細胞に曝露されると、アウトプット組成物の細胞は、抗原を発現する細胞の25％、約25％もしくは少なくとも25％、30％、約30％もしくは少なくとも30％、35％、約35％もしくは少なくとも35％、40％、約40％もしくは少なくとも40％、45％、約45％もしくは少なくとも45％、50％、約50％もしくは少なくとも50％、55％、約55％もしくは少なくとも55％、60％、約60％もしくは少なくとも60％、70％、約70％もしくは少なくとも70％、75％、約75％もしくは少なくとも75％、80％、約80％もしくは少なくとも80％、85％、約85％もしくは少なくとも85％、90％、約90％もしくは少なくとも90％、95％、約95％もしくは少なくとも95％または100％、約100％もしくは少なくとも100％を死滅させる。一部の特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、類似のまたは同一の条件下で、例示的な別のプロセスによって作製されたアウトプット細胞より少なくとも25％、少なくとも50％、少なくとも75％、少なくとも100％、少なくとも150％または少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍もしくは少なくとも5倍多い量の、抗原を発現する細胞、例えば標的細胞を死滅させる。
特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、例示的な別のプロセス（例えば、細胞が、mTOR阻害剤、例えば化合物63の存在下で培養されないプロセス）によって作製されたアウトプット細胞の割合、パーセンテージおよび/または量と比較してより低い、低減したおよび/または減少した割合、パーセンテージおよび/または量の、消耗の1種または複数種のマーカーを発現する細胞を有する。一部の特定の態様において、アウトプット組成物の細胞の40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満もしくは0.1％未満または約40％、約35％、約30％、約25％、約20％、約15％、約10％、約5％、約1％もしくは約0.1％が、消耗の1種または複数種のマーカーを発現する。一部の特定の態様において、アウトプット組成物中の、消耗の1種または複数種のマーカーを発現する細胞の割合、パーセンテージおよび/または量は、例示的な別のプロセスによって作製されたアウトプット組成物中の、1種または複数種のマーカーを発現する細胞の割合、パーセンテージおよび/または量より、10％もしくは少なくとも10％、20％もしくは少なくとも20％、30％もしくは少なくとも30％、40％もしくは少なくとも40％、50％もしくは少なくとも50％、60％もしくは少なくとも60％、70％もしくは少なくとも70％、80％もしくは少なくとも80％または90％もしくは少なくとも90％少ない。特定の態様において、消耗の1種または複数種のマーカーは、CTLA-4、FOXP3、PD-1、TIGIT、LAB-3、2B4、BTLA、TIM3、VISTAおよび/もしくはCD96であり、またはCTLA-4、FOXP3、PD-1、TIGIT、LAB-3、2B4、BTLA、TIM3、VISTAおよび/もしくはCD96を含む。
様々な態様において、アウトプット組成物の細胞は、例示的な別のプロセス（例えば、細胞が、mTOR阻害剤、例えば化合物63の存在下で培養されないプロセス）によって作製されたアウトプット細胞の割合、パーセンテージおよび/または量と比較してより低い、低減したおよび/または減少した割合、パーセンテージおよび/または量の、分化された細胞を有する。一部の特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、別の方法によって作製された細胞より低分化である。特定の態様において、アウトプット組成物のより低分化の細胞は、例示的な別のプロセスによって作製されたより分化した細胞より、刺激、活性化、拡大、サイトカイン応答、細胞溶解活性または抗腫瘍活性に関して、より大きな潜在能力を有しまたは含む。
いくつかの態様において、提供される方法は、メモリー様T細胞、例えば、より低分化の長寿命集団T細胞、例えば長寿命メモリーT細胞の数またはパーセンテージが増加した細胞のアウトプット組成物を作製する。いくつかの態様において、このようなメモリーT細胞は、セントラルメモリーT細胞（TCM）またはTメモリー幹細胞（TSCM）細胞である。いくつかの態様において、メモリーT細胞はTSCM細胞である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、増加したまたはより多い数またはパーセンテージの、メモリー様表現型を有する細胞、例えば長寿命メモリーT細胞を有する。いくつかの態様において、組成物中のメモリー様T細胞、例えば長寿命メモリーT細胞またはメモリー幹細胞（TSCM）の数またはパーセンテージは、例示的な別のプロセス（例えば、細胞が、mTOR阻害剤、例えば化合物63の存在下で培養されないプロセス）によって作製されたアウトプット細胞の対応する集団の数またはパーセンテージと比較して、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍または少なくとも10倍増加される。
一部の特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は対象に投与される。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は疾患または病態を処置するために投与される。いくつかの態様において、疾患または病態はがんである。いくつかの態様において、細胞アウトプット組成物は対象に投与され、対象はがん細胞および/または腫瘍体積の低下を経験する。いくつかの態様において、対象は、例えば、投与前における対象中のがん細胞の量および/または腫瘍体積と比較して、アウトプット組成物の細胞の投与後に、がん細胞の量および/または腫瘍低下の25％、約25％または少なくとも25％、50％、約50％または少なくとも50％、60％、約60％または少なくとも60％、70％、約70％または少なくとも70％、75％、約75％または少なくとも75％、80％、約80％または少なくとも80％、85％、約85％または少なくとも85％、90％、約90％または少なくとも90％、95％、約95％または少なくとも95％、97％、約97％または少なくとも97％、98％、約98％または少なくとも98％、99％、約99％または少なくとも99％、100％、約100％または少なくとも100％の低下を有する。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の投与は、例示的な別のプロセス（例えば、細胞が、mTOR阻害剤、例えば化合物63の存在下で培養されないプロセス）によって作製されたアウトプット細胞の投与後における対象中の腫瘍体積および/またはがん細胞の量の低下と比較して、対象中の腫瘍体積および/またはがん細胞の量の増加した低下をもたらす。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞の投与は、例示的な別のプロセスによって作製されたアウトプット細胞の投与後における対象中の腫瘍体積および/またはがん細胞の量の低下と比べて、5％、約5％もしくは少なくとも5％、10％、約10％もしくは少なくとも10％、20％、約20％もしくは少なくとも20％、30％、約30％もしくは少なくとも30％、40％、約40％もしくは少なくとも40％、50％、約50％もしくは少なくとも50％、60％、約60％もしくは少なくとも60％、70％、約70％もしくは少なくとも70％、80％、約80％もしくは少なくとも80％、90％、約90％もしくは少なくとも90％、100％、約100％もしくは少なくとも100％、125％、約125％もしくは少なくとも125％、150％、約150％もしくは少なくとも150％、1倍、約1倍もしくは少なくとも1倍、2倍、約2倍もしくは少なくとも2倍、3倍、約3倍もしくは少なくとも3倍、4倍、約4倍もしくは少なくとも4倍または5倍、約5倍もしくは少なくとも5倍の、対象中の腫瘍体積および/またはがん細胞の量の低下の増加をもたらす。
特定の態様において、アウトプット組成物の細胞、例えば、組換え受容体を発現する操作された細胞は、投与後に、対象中において検出可能である、例えば、対象から得られた血清試料などの生物学的試料中において検出可能である。一部の特定の態様において、アウトプット組成物の細胞は、アウトプット組成物の細胞の投与の1週もしくは少なくとも1週、2週もしくは少なくとも2週、3週もしくは少なくとも3週、4週もしくは少なくとも4週、5週もしくは少なくとも5週、6週もしくは少なくとも6週、7週もしくは少なくとも7週、もしくは8週もしくは少なくとも8週後に、または3ヶ月もしくは少なくとも3ヶ月、6ヶ月もしくは少なくとも6ヶ月、12ヶ月もしくは少なくとも12ヶ月、18ヶ月もしくは少なくとも18ヶ月、24ヶ月もしくは少なくとも24ヶ月、30ヶ月もしくは少なくとも30ヶ月、もしくは36ヶ月もしくは少なくとも36ヶ月後に、または1年もしくは少なくとも1年、2年もしくは少なくとも2年、3年もしくは少なくとも3年、4年もしくは少なくとも4年、5年もしくは少なくとも5年もしくはそれを超える年の後に、対象中において検出可能である。いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞の投与は、例示的な別のプロセス（例えば、細胞が、mTOR阻害剤、例えば化合物63の存在下で培養されないプロセス）によって作製されたアウトプット細胞と比較して、投与後に、インビボでの増大されたまたは増強された持続能力をもたらす。特定の態様において、アウトプット組成物の細胞の投与は、例示的な別のプロセスによって作製されたアウトプット細胞より、1週間、約1週間もしくは少なくとも1週間、2週間、約2週間もしくは少なくとも2週間、3週間、約3週間もしくは少なくとも3週間、4週間、約4週間もしくは少なくとも4週間、5週間、約5週間もしくは少なくとも5週間、6週間、約6週間もしくは少なくとも6週間、7週間、約7週間もしくは少なくとも7週間、もしくは8週間、約8週間もしくは少なくとも8週間、または3ヶ月間、約3ヶ月間もしくは少なくとも3ヶ月間、6ヶ月間、約6ヶ月間もしくは少なくとも6ヶ月間、12ヶ月間、約12ヶ月間もしくは少なくとも12ヶ月間、18ヶ月間、約18ヶ月間もしくは少なくとも18ヶ月間、24ヶ月間、約24ヶ月間もしくは少なくとも24ヶ月間、30ヶ月間、約30ヶ月間もしくは少なくとも30ヶ月間、もしくは36ヶ月間、約36ヶ月間もしくは少なくとも36ヶ月間、または1年間、約1年間もしくは少なくとも1年間、2年間、約2年間もしくは少なくとも2年間、3年間、約3年間もしくは少なくとも3年間もしくはそれより長い年の間、対象中において検出可能である。
いくつかの態様において、対象、例えばがんなどの疾患または病態を有する対象にアウトプット組成物の細胞を投与することは、生存の確率および/または可能性を改善する。例えば、いくつかの態様において、アウトプット組成物の細胞は、疾患または病態を有する対象に投与され、2ヶ月、約2ヶ月もしくは少なくとも2ヶ月、3ヶ月、約3ヶ月もしくは少なくとも3ヶ月、4ヶ月、約4ヶ月もしくは少なくとも4ヶ月、5ヶ月、約5ヶ月もしくは少なくとも5ヶ月、6ヶ月、約6ヶ月もしくは少なくとも6ヶ月、7ヶ月、約7ヶ月もしくは少なくとも7ヶ月、8ヶ月、約8ヶ月もしくは少なくとも8ヶ月、9ヶ月、約9ヶ月もしくは少なくとも9ヶ月、10ヶ月、約10ヶ月もしくは少なくとも10ヶ月、11ヶ月、約11ヶ月もしくは少なくとも11ヶ月、もしくは12ヶ月、約12ヶ月もしくは少なくとも12ヶ月にわたる、または1年、2年、3年、4年、5年、10年もしくは10年より長くにわたる生存の確率および/または可能性は少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％または少なくとも100％である。一部の特定の態様において、アウトプット組成物の細胞との投与は、例示的な別のプロセス（例えば、細胞が、mTOR阻害剤、例えば化合物63の存在下でインキュベートされず、操作されず、および/または培養されないプロセス）のアウトプット細胞との投与より、少なくとも10％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも125％、少なくとも150％または少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍もしくは少なくとも5倍大きな生存の確率および/または可能性を与える。
II.mTOR活性を阻害する作用物質
いくつかの態様において、提供される方法の1つまたは複数の工程は、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で実施される。mTORは、哺乳類ラパマイシン標的タンパク質、ラパマイシン標的タンパク質、FK506結合タンパク質12-ラパマイシン複合体関連タンパク質1、FKBP12-ラパマイシン複合体関連タンパク質、ラパマイシンおよびFKBP12標的1、ラパマイシン標的タンパク質1、FRAP、FRAP1、FRAP2、RAFT1ならびにRAPT1としても知られる。いくつかの局面において、ヒトmTORタンパク質は、Uniprot番号P42345に対応する。いくつかの態様において、ヒトmTORタンパク質のアミノ酸配列は、SEQ ID NO:34に記載されている。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORの少なくとも1つの活性を阻害し、低減し、および/もしくは減少させ、ならびに/または阻害し、低減し、および/もしくは減少させることができる。特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORキナーゼ活性を阻害し、低減し、および/もしくは減少させ、ならびに/または阻害し、低減し、および/もしくは減少させることができる。
いくつかの局面において、mTORは保存されたスレオニンおよびセリンタンパク質キナーゼであり、ホスファチジルイノシトール-3-キナーゼ関連キナーゼ（PIKKs）のファミリーに属する。mTORは、その基質中のスレオニンおよびセリン残基をリン酸化するタンパク質キナーゼである。一部の特定の局面において、mTORは、mTOR複合体1（mTORC1）および複合体2（mTORC2）と名づけられた2つの多タンパク質複合体の触媒サブユニットとしての役割を果たす。一部の特定の局面において、特定の局面において、mTORC1およびmTORC2の両方がホスホイノシトール-3キナーゼ（PI3K）およびAktシグナル伝達経路に関与しているという事実にかかわらず、mTORC1およびmTORC2は互いに独立に機能する。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1活性、例えばmTORC1キナーゼ活性、および/またはmTORC2活性を阻害する、低減する、および/もしくは減少させる、ならびに/または阻害する、低減する、および/もしくは減少させることができる。
いくつかの局面において、mTORC1は、複合体の触媒サブユニットであるmTOR;mTORの制御関連タンパク質（Raptor）;哺乳動物致死性Sec13タンパク質8（mLST8（mammalian lethal with Sec13 protein 8）、GβLとしても知られる）;プロリンリッチAKT基質40kDa（PRAS40）;およびDEPドメイン含有mTOR相互作用タンパク質（Deptor）という5つの構成要素を有するタンパク質複合体である。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1複合体の形成を抑制する、および/またはmTORC1複合体を不安定化させる。
一部の特定の局面において、mTORC2は、mTOR;ラパマイシン非感受性mTORコンパニオン（Rictor）;哺乳類ストレス活性化プロテインキナーゼ相互作用タンパク質（mSIN1）;Rictor-1とともに観察されるタンパク質（Protor-1（protein observed with Rictor-1））;mLST8;およびDeptorという6つの異なるタンパク質を含み、そのうちいくつかはmTORC1およびmTORC2と共通である。特定の態様において、活性を阻害する作用物質は、mTORC2複合体の形成を抑制する、および/またはmTORC2複合体を不安定化させる。
いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORの1種または複数種の活性を阻害する、低減する、抑制する、および/または阻害する、低減する、もしくは抑制することができる、化合物、小分子、例えば小有機分子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、siRNA、ポリペプチドまたはこれらの断片、アイソフォーム、変異体、アナログもしくは誘導体である。いくつかの態様において、作用物質は小分子である。特定の態様において、作用物質は、10kD未満、9kD未満、8kD未満、7kD未満、6kD未満、5kD未満、4kD未満、3kD未満、2kD未満、1kD未満、0.5kD未満または0.1kD未満の分子量を有する小分子である。いくつかの態様において、作用物質は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣薬、ペプトイド、炭水化物、脂質、これらの成分またはその他の有機もしくは無機分子でありまたはこれらを含有する小分子である。真菌、細菌または藻類の抽出物などの、化学的および/または生物学的混合物のライブラリーが当技術分野において公知であり、本発明のアッセイのいずれかを用いてスクリーニングすることができる。分子ライブラリーを合成するための方法の例は、（Carell et al,1994a;Carell et al,1994b;Cho et al,1993;DeWitt et al,1993;Gallop et al,1994;Zuckermann et al,1994）に見出すことができる。
特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、少なくとも1種のmTOR活性を特異的におよび/または選択的に阻害する。様々な態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、例えば、その基質の少なくとも1つ、例えばp70S6キナーゼ1、4E-BP1、AktおよびeEF2に対するセリン/スレオニンタンパク質キナーゼ活性など、mTORタンパク質の少なくとも1種の活性を阻害する。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1、mTORC2またはmTORC1およびmTORC2の両方に直接結合し、および阻害し、ならびに/または直接結合し、および阻害することができる。いくつかの態様において、作用物質によるmTOR活性の阻害は不可逆的である。一部の特定の態様において、作用物質によるmTOR活性の阻害は可逆的である。
一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、500μM未満、200μM未満、100μM未満、50μM未満、10μM未満、5μM未満、1μM未満、500nM未満、200nM未満、100nM未満、50nM未満、10nM未満、5nM未満、1nM未満または500pM未満のIC50を有する。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、1nM〜500μM、1nM〜500nM、1μM〜500μM、10μM〜100μM、100nM〜1μM、250nM〜750nM、50nM〜200nMまたは400nM〜600nMのIC50を有する。いくつかの態様において、IC50の決定は、あらゆる公知の標準的なおよび/または従来の技術を用いて達成することができる。例えば、いくつかの態様において、IC50は、広範な濃度の研究対象の阻害剤の存在下で、mTOR活性を測定することによって決定することができる。次いで、実験的に得られた酵素活性の値が、使用された阻害剤濃度に対してプロットされる。（一切の阻害剤の不存在下での活性と比較して）50％酵素活性を示す阻害剤の濃度が、「IC50」値とみなされる。同様にして、活性の適切な決定を通じて、他の阻害濃度を定義することができる。いくつかの態様において、IC50は無細胞アッセイにおいて測定される。特定の態様において、IC50は細胞培養アッセイにおいて測定される。一部の特定の態様において、細胞培養物は、T細胞培養物、例えば、初代T細胞培養物である。
いくつかの態様において、mTORC1および/またはmTORC2活性の阻害は、mTORC1および/またはmTORC2の下流のシグナル伝達の低下によって決定することができる。このようなシグナル伝達経路のアウトプットの低下を確定するために、幅広い読み出し情報を使用することができる。例えば、いくつかの態様において、非限定的な例示的読み出し情報としては、mTORC2活性に関しては、（1）S473およびT308を含むがこれらに限定されない残基でのAktのリン酸化の減少ならびに/または（2）例えば、Fox01およびFox03a T24/32、GSK3-ベータS21/9ならびにTSC2 T1462を含むがこれらに限定されないAkt基質のリン酸化の低下によって証明されるAktの活性化の減少が挙げられる。一部の特定の態様において、mTORC1活性の非限定的な例示的読み出し情報としては、リボソームのS6 S240/244、S6K1 T389および4EBP1 T37/46を含むがこれらに限定されない、mTORC1の下流のシグナル伝達分子のリン酸化の減少が挙げられる。一部の特定の態様において、mTORC1および/またはmTORC2阻害の例示的な読み出し情報は、がん性細胞の増殖の阻害である。
部位特異的なリン酸化を有するタンパク質を測定すること、検出することおよび/または評価することは、抗体染色技術およびイムノアッセイ、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、エンザイムイムノアッセイ（EIA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）、表面プラズモン共鳴（SPR）、ウェスタンブロットまたはプロテインアレイを含むがこれらに限定されない、あらゆる公知の手段によって実行することができる。
いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORと構造的に類似するキナーゼも阻害し得、および/またはmTORと同一または実質的に類似した活性を有し得る（汎阻害剤）。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、ホスホイノシトール-3キナーゼ活性（PI3K）も阻害する。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1活性、mTORC2活性およびPI3K活性を阻害する。特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1、mTORC2およびPI3Kのキナーゼ活性を阻害する。特定の局面において、PI3K活性の低下を確定するために、幅広い読み出し情報を使用することができる。いくつかの態様において、このような読み出し情報としては、（1）S473およびT308を含むがこれらに限定されない残基でのAktのリン酸化の減少ならびに/または（2）例えば、Fox01およびFox03a T24/32、GSK3-ベータS21/9およびTSC2 T1462を含むがこれらに限定されないAkt基質のリン酸化の低下によって証明されるAktの活性化の減少、ならびに/または（3）ホスファチジルイノシトール（3、4、5）三リン酸（PIP3）の量、レベルもしくは濃度の低下が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、mTOR活性、例えばmTORC1および/またはmTORC2キナーゼ活性を阻害する作用物質はPI3Kも阻害する。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、500μM未満、200μM未満、100μM未満、50μM未満、10μM未満、5μM未満、1μM未満、500nM未満、200nM未満、100nM未満、50nM未満、10nM未満、5nM未満、1nM未満または500pM未満のIC50（活性の50％を阻害する濃度）で、PI3K、mTORC1およびmTORC2の活性を阻害する。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、1nM〜500μM、1nM〜500nM、1μM〜500μM、1nM〜1μM、10μM〜100μM、100nM〜1μM、250nM〜750nM、50nM〜200nMまたは400nM〜600nMのIC50で、PI3K、mTORC1およびmTORC2の活性を阻害する。いくつかの態様において、IC50は無細胞アッセイにおいて測定される。特定の態様において、IC50は細胞培養アッセイにおいて測定される。一部の特定の態様において、細胞培養物は、T細胞培養物、例えば、初代T細胞培養物である。一部の特定の態様において、このような作用物質としては、PI-103、SF1126（Semafore）、BGT226（Novartis）、XL765（Exelixis）、PF-04691502およびNVP-BEZ235（Novartis）が挙げられるが、これらに限定されない。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、PI-103、SF1126、BGT226、XL765、PF-04691502およびNVP-BEZ235である。
いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質はPI3K活性を阻害しない。一部の特定の態様において、作用物質は、mTOR活性に対するIC50で、PI3K活性を検出可能に低下、阻害または減少させない。特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTOR活性に対するIC50より、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも150％、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍または少なくとも100倍大きな、PI3K活性に対するIC50を有する。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、PI3K活性と比べて、mTORC1およびmTORC2キナーゼ活性を阻害する、例えば選択的に阻害する。一部の特定の態様において、mTOR活性の阻害剤は、ピラゾロピリミジン、トリンl、トルキニブ（PP242）、PP30、Ku-0063794、WAY-600（Wyeth）、WAY-687（Wyeth）、WAY-354（Wyeth）またはAZD8055である。
特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、500μM未満、200μM未満、100μM未満、50μM未満、10μM未満、5μM未満、1μM未満、500nM未満、200nM未満、100nM未満、50nM未満、10nM未満、5nM未満、1nM未満または500pM未満のIC50で、mTORC1を選択的に阻害する。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、1nM〜500μM、1nM〜500nM、1μM〜500μM、10μM〜100μM、100nM〜1μM、250nM〜750nM、50nM〜200nMまたは400nM〜600nMのIC50で、mTORC1の活性を阻害する。いくつかの態様において、IC50は無細胞アッセイにおいて測定される。特定の態様において、IC50は細胞培養アッセイにおいて測定される。一部の特定の態様において、細胞培養物は、T細胞培養物、例えば、初代T細胞培養物である。
いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC2および/またはPI3K活性と比べて、mTORC1活性を選択的に阻害する。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、mTORC1活性に対するIC50より、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも100％、少なくとも150％、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも50倍または少なくとも100倍大きな、PI3K活性に対するIC50を有する。いくつかの態様において、作用物質はラパマイシン（シロリムス）である。特定の態様において、作用物質は、ラパログ（rapalog）である。
一部の特定の態様において、ラパログは、mTOR FRBドメイン（FKBPラパマイシン結合ドメイン）に結合しおよび/もしくは結合することができ、ラパマイシンに構造的に関連し、ならびに/またはラパマイシンのmTORC1阻害特性を保持している。いくつかの態様において、ラパログは、ラパマイシンのエステル、エーテル、オキシム、ヒドラゾンおよび/もしくはヒドロキシルアミンであり、かつ/またはラパマイシンコア構造上の官能基が、例えば還元または酸化によって修飾されている化合物である。このような化合物の薬学的に許容される塩も、ラパマイシン誘導体であると考えられる。本明細書に想定されている方法において使用するのに適したラパログの例示的な例としては、テムシロリムス（CC1779）、エベロリムス（RAD001）、デフォロリムス（AP23573）AZD8055（AstraZeneca）およびOSI-027（OSI）が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、作用物質は、国際特許公開WO2008/051493号;WO2008/051494号;もしくはWO2010/062571号;および/または米国特許第7,981,893号;同第8,372,976号;同第7,968,556号;同第8,383,634号;同第8,110,578号;もしくは同第8,492,381号に記載されている分子であり、これらの全てが、参照により本明細書に組み入れられる。
一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、式（I）:
Figure 2021501607
に記載されている式を有するかまたはそれを含み、
式中、R1は、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルであり、
R2は、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルであり、かつ
R3およびR4は、独立に、HまたはC1〜8アルキルである。
いくつかの態様において、mTORを阻害する作用物質は、式（I）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物であり、または式（I）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を含有する。いくつかの態様において、mTORを阻害する作用物質は、R1が、置換されたアリール、置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、例えば置換されたフェニルである式（I）の化合物であるかまたはこれを含有する。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、R2が、置換されたまたは置換されていないフェニルなどの、置換されたまたは置換されていないアリールである式（I）の化合物であるかまたはこれを含有する。特定の態様において、mTORを阻害する作用物質は、置換されている基が、1つまたは複数の、ハロゲン;C1〜8アルキル;C2〜8アルケニル;C2〜8アルキニル;ヒドロキシル;C1〜8アルコキシル;アミノ;ニトロ;チオール;チオエーテル;イミン;シアノ;アミド;ホスホナート;ホスフィン;カルボキシル;チオカルボニル;スルホニル;スルホンアミド;ケトン;アルデヒド;エステル;カルボニル;ハロアルキル;B（OH）2;炭素環式シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、単環式もしくは縮合もしくは非縮合多環式アリールもしくはヘテロアリール;アミノ;O-低級アルキル;O-アリール、アリール;アリール-低級アルキル;CO2CH3;CONH2;OCH2CONH2;NH2;SO2NH2;OCHF2;CF3;またはOCF3基で置換されており、これらの基の各々が任意に置換されている式（I）の化合物であるかまたはこれを含有する。
いくつかの態様において、式（I）に記載されている式を有するかまたはそれを含む作用物質は、化合物63である。特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は化合物63である。いくつかの局面において、化合物63は、2-（3-ヒドロキシフェニル）-9-（2-イソプロピルフェニル）-8-オキソ-8,9-ジヒドロ-7H-プリン-6-カルボキサミドである。いくつかの局面において、mTOR活性を阻害する作用物質は、2-（3-ヒドロキシフェニル）-9-（2-イソプロピルフェニル）-8-オキソ-8,9-ジヒドロ-7H-プリン-6-カルボキサミドまたは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物である。特定の局面において、化合物63は、式:
Figure 2021501607
を有する。
特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、式（II）:
Figure 2021501607
に記載されている式を有するかまたはそれを含み、
式中、Lは直接の結合、NHまたはOであり、
YはNまたはCR3であり、
式中、R1は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないC2〜8アルケニル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルであり、
R2は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルであり、
R3は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキル、-NHR4またはーN（R4）2であり、かつ
R4は、各出現において独立に、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルである。
いくつかの態様において、mTORを阻害する作用物質は、式（II）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物であり、または式（II）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を含有する。一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、R1が、置換されたアリール、例えば置換されたフェニルである式（II）に記載された式を有するかまたはそれを含む。特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、YがCHである式（II）に記載された式を有するかまたはそれを含む。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、Lが直接の結合である式（II）に記載された式を有するかまたはそれを含む。特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、R1が、置換されたまたは置換されていないアリールであり、かつR2が、アルコキシ、アミノ、ヒドロキシ、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換されたC1〜8アルキルである式（II）に記載された式を有するかまたはそれを含む。
一部の特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、「置換されたまたは置換されていない」基が、置換されている場合、任意の置換基の1つまたは複数で置換され得る、式（II）に記載されている式を有するかまたはそれを含む。置換基の例は、例示的な化合物および本明細書に開示されている態様中に見出される置換基ならびにハロ（例えば、クロロ、ヨード、ブロモまたはフルオロ）;C1〜8アルキル;C2〜8アルケニル;C2〜8アルキニル;ヒドロキシル;C1〜8アルコキシル;アミノ;ニトロ;チオール;チオエーテル;イミン;シアノ;アミド;ホスホナート;ホスフィン;カルボキシル;カルバモイル;カルバメート;アセタール;尿素;チオカルボニル;スルホニル;スルホンアミド;スルフィニル;ケトン;アルデヒド;エステル;アセチル;アセトキシ;酸素（＝O）;ハロアルキル（例えば、トリフルオロメチル）;置換された、アミノアシルおよびアミノアルキル;単環式もしくは縮合もしくは非縮合多環式であり得る炭素環式シクロアルキル（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチルまたはシクロヘキシル）、または単環式もしくは縮合もしくは非縮合多環式であり得るヘテロシクロアルキル（例えば、ピロリジニル、ピペリジニル;ピペラジニル;モルホリニル;フラニルまたはチアジニル）;炭素環式または複素環式の、単環式または縮合もしくは非縮合多環式アリール（例えば、フェニル、ナフチル、ピロリル、インドリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、ピリジニル、キノリニル、イソキノリニル、アクリジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾチエニルまたはベンゾフラニル）;アミノ（一級、二級または三級）;-O-低級アルキル;-O-アリール;アリール;アリール-低級アルキル;CO2CH3;CONH2;OCH2CONH2;NH2;N（C1〜4アルキル）2;NHC（O）C1〜4アルキル;SO2NH2;SO2C1〜4アルキル;OCHF2;CF3;OCF3であり、このような部分も、縮合環構造または架橋、例えば、-OCH2O-または-O-低級アルキレン-O-によって、任意に置換され得る。これらの置換基は、このような基から選択される置換基で、任意にさらに置換され得る。
特定の態様において、式（II）に記載されている式を有するかまたはそれを含む作用物質は、化合物155である。特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は化合物155である。いくつかの局面において、化合物155は、6-（4-（2H-1,2,4-トリアゾル-3-イル）フェニル）-1-（2-（テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル）エチル）-1H-イミダゾ［4,5-b］ピラジン-2（3H）-オンである。いくつかの局面において、mTOR活性を阻害する作用物質は、6-（4-（2H-1,2,4-トリアゾル-3-イル）フェニル）-1-（2-（テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル）エチル）-1H-イミダゾ［4,5-b］ピラジン-2（3H）-オンまたはその薬学的に許容される塩または溶媒和物である。特定の局面において、化合物155は、式:
Figure 2021501607
を有する。
特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、式（III）
Figure 2021501607
に記載されている式を有するかまたはそれを含み、
式中、R1は、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリルアルキルであり、
R2は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリルアルキル、置換されたもしくは置換されていないアラルキル、または置換されたもしくは置換されていないシクロアルキルアルキルであり、かつ
R3は、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキルである。
いくつかの態様において、mTORを阻害する作用物質は、式（III）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物であり、または式（III）の化合物もしくは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物を含有する。いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、R1が置換されたもしくは置換されていないアリール、または置換されたもしくは置換されていないヘテロアリールであり、例えば、R1が、それぞれ任意に置換された、フェニル、ピリジル、ピリミジル、ベンゾイミダゾリル、1H-ピロロ［2,3-b］ピリジル、インダゾリル、インドリル、1H-イミダゾ［4,5-b］ピリジル、1H-イミダゾ［4,5-b］ピリジン-2（3H）-オニル、3H-イミダゾ［4,5-b］ピリジルまたはピラゾリルである、式（III）に記載された式を有するかまたはそれを含む。特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、R1が、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル（例えば、メチル）、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリル（例えば、置換されたまたは置換されていないトリアゾリルまたはピラゾリル）、アミノカルボニル、ハロゲン（例えば、フッ素）、シアノ、ヒドロキシアルキルおよびヒドロキシからなる群より独立に選択される1つまたは複数の置換基で置換されたフェニルである、式（III）に記載された式を有するかまたはそれを含む。他の態様において、R1は、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル（例えば、メチル）、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリル（例えば、置換されたまたは置換されていないトリアゾリル）、ハロゲン、アミノカルボニル、シアノ、ヒドロキシアルキル（例えば、ヒドロキシプロピル）、-ORおよび-NR2からなる群より独立に選択される1つまたは複数の置換基で置換されたピリジルであり、ここで、各Rは、独立に、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキルである。いくつかの態様において、R1は、置換されたまたは置換されていないC1〜8アルキルおよび-NR2からなる群より独立に選択される1つまたは複数の置換基で任意に置換された、1H-ピロロ［2,3-b］ピリジルまたはベンゾイミダゾリルであり、ここで、Rは独立に、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキルである。
いくつかの態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は、式中、R1が、
Figure 2021501607
であり、式中、Rは、各出現において、独立に、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキル（例えば、メチル）であり;R1は、各出現において、独立に、置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキル（例えば、メチル）、ハロゲン（例えば、フルオロ）、シアノ、-ORまたは-NR2であり;mは0〜3であり;かつnは、0〜3である、
式（III）に記載される式を有するかまたはそれを含む。置換基R'のいずれもが、縮合環系中の環のいずれかのいずれの適切な原子に結合され得ることが理解されるであろう。
式（III）の化合物のいくつかの態様において、R2は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリル、置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキル-ヘテロシクリル、置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキル-アリール、または置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキル-シクロアルキルである。例えば、R2は、H、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、（C1〜4アルキル）-フェニル、（C1〜4アルキル）-シクロプロピル、（C1〜4アルキル）-シクロブチル、（C1〜4アルキル）-シクロペンチル、（C1〜4アルキル）-シクロヘキシル、（C1〜4アルキル）-ピロリジル、（C1〜4アルキル）-ピペリジル、（C1〜4アルキル）-ピペラジニル、（C1〜4アルキル）-モルホリニル、（C1〜4アルキル）-テトラヒドロフラニル、または（C1〜4アルキル）-テトラヒドロピラニルであり、それぞれは任意に置換されている。
一部の特定の態様において、R2は、H、C1〜4アルキル、（C1〜4アルキル）（OR）、
Figure 2021501607
であり、
式中、Rは、各出現において、独立に、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキルであり;R'は、各出現において、独立に、H、-OR、シアノ、または置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキルであり、かつpは、0〜3である。
特定の態様において、式（III）に記載されている式を有するかまたはそれを含む作用物質は、化合物246である。特定の態様において、mTOR活性を阻害する作用物質は化合物246である。いくつかの局面において、化合物246は、7-（6-（2-ヒドロキシプロパン-2-イル）ピリジン-3-イル）-1-（（1r,4r）-4-メトキシシクロヘキシル）-3,4-ジヒドロピラジノ［2,3-b］ピラジン-2（1H）-オンである。いくつかの局面において、mTOR活性を阻害する作用物質は、7-（6-（2-ヒドロキシプロパン-2-イル）ピリジン-3-イル）-1-（（1r,4r）-4-メトキシシクロヘキシル）-3,4-ジヒドロピラジノ［2,3-b］ピラジン-2（1H）-オンまたは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物である。特定の局面において、化合物246は、式:
Figure 2021501607
を有する。
III.長期刺激のための方法
とりわけ、細胞組成物、例えば細胞組成物の表現型、特徴または活性を評価するのに有用である長期刺激方法（本明細書において、長期刺激のための方法とも称される。）が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、長期刺激方法は、細胞中の組換え受容体依存性活性（例えば、CAR依存性活性）を刺激するための条件下で、細胞組成物、例えば、CARなどの組換え受容体を発現する細胞を含有するインプット組成物をインキュベートすることであるか、または該インキュベートすることを含む。このような態様において、組換え受容体依存性活性は、例えば、組換え受容体、例えばCARの抗原結合ドメインによって認識されるまたは組換え受容体を特異的に刺激する抗原またはその他の作用物質の存在を介して、組換え受容体、例えばCARの刺激に対して特異的である活性である。いくつかの局面において、細胞組成物、例えばインプット組成物は、抗原を特異的に結合または認識する細胞外抗原結合ドメインを含む組換え受容体（例えば、CAR）を発現するT細胞を含有する。いくつかの局面において、インキュベーションは、慢性的に刺激された細胞のまたは抗原に長期間曝露された細胞の特徴を示す細胞を含有するT細胞組成物、例えばアウトプット組成物をもたらす。
一部の特定の態様において、組換え受容体活性、例えば、CAR依存性活性を刺激するための条件は、組換え受容体、例えばCARの抗原結合ドメインに結合する、例えば特異的に結合する結合分子などの結合分子とともに、細胞組成物、例えばインプット組成物をインキュベートすることを含む。一部の特定の態様において、結合分子は、支持体に付着されている。特定の態様において、支持体は、固体支持体、例えば、細胞培養プレートもしくは皿の表面、マイクロプレート中のウェルまたは粒子もしくはビーズの表面である。いくつかの局面において、インキュベーションは、マイクロプレート細胞培養プレートもしくは皿、または表面付着された結合分子を有するマイクロプレート中のウェル中で行われ、または実施される。いくつかの局面において、インキュベーションは、結合分子を含有する複数の粒子またはビーズの存在下で行われ、または実施される。一部の特定の局面において、結合分子は、ビーズまたは粒子に付着された表面である。いくつかの態様において、インキュベーションは、インビトロまたはエクスビボで行われ、または実施される。
様々な態様において、細胞、例えば、インプット組成物の細胞は、細胞分裂、増殖、拡大または活性化を促進するさらなる作用物質なしの培地の存在下で、結合分子とともにインキュベートされる。いくつかの態様において、細胞は、任意のさらなる操作、例えば、培地交換、ビーズ交換または細胞の分割もしくは再播種なしに、伸長された期間、例えば14日間、粒子とともにインキュベートされる。一部の特定の局面において、
いくつかの局面において、長期刺激方法は、組換え受容体を結合または認識する結合分子の存在下で、インプット組成物、例えば、組換え受容体を発現している細胞組成物を含有する細胞組成物をインキュベートすることを含む。いくつかの局面において、インキュベーションのために選択される時間の長さは、組成物の細胞の1種または複数種の機能または活性が、慢性的に刺激された細胞またはインキュベーションの終結もしくは終了時に抗原に長期曝露された細胞の特徴を呈する時間である。いくつかの態様において、結合分子は、組換え受容体によって結合されまたは認識される抗原（組換え抗原またはその断片など）である。一部の特定の態様において、結合分子は、組換え受容体に結合しまたは組換え受容体を認識する抗IDである。いくつかの態様において、このような特徴としては、減少した生存能、活性もしくは持続能力または増加した消耗もしくは分化の証拠が挙げられ得る。
一部の特定の態様において、本明細書に提供されている長期刺激方法は、とりわけ、インビボで投与されたときに望ましい特徴、例えば、維持されたまたは延長された持続能力、生存能または活性を有し得る細胞組成物を同定するために有用である。いくつかの態様において、持続能力、活性もしくは生存能を増強もしくは延長させ得、または消耗もしくは分化を減少させ得る差を特定するために、アッセイは、2つまたはそれより多くの異なる細胞組成物に対して行われる。いくつかの態様において、このような差には、操作プロセスの1つまたは複数の工程または手法中の作用物質、例えば、mTORキナーゼ活性を阻害する作用物質の存在など、製造プロセスの局面が含まれ得るが、これらに限定されない。
特定の態様において、長期刺激方法は、生存能、活性もしくは持続能力を増加させもしくは維持する、または増加した生存能、活性もしくは持続能力の指標となるマーカー、例えば、バイオマーカーの発現を増加させもしくは維持する作用物質を特定するために、2つまたはそれより多くの細胞組成物中で行われる。一部の特定の態様において、長期刺激方法は、消耗もしくは分化（例えば、老化状態への分化など）を減少もしくは抑制し、または増加した消耗もしくは分化の指標となるマーカーの発現を減少させる細胞組成物中の差を特定するために、2つまたはそれより多くの細胞組成物中で行われる。いくつかの態様において、結合分子は、細胞培養プレートもしくは皿の表面などの固体表面にコンジュゲートされまたは付着されている。特定の態様において、結合分子は、粒子、例えばビーズにコンジュゲートされまたは付着されている。
一部の特定の態様において、長期刺激のための方法は、結合分子、例えば組換え受容体に結合しまたは組換え受容体を認識する結合分子を含有する粒子、例えばビーズの存在下で、細胞をインキュベートするための工程であり、またはかかる工程を含む。
いくつかの態様において、結合分子は抗原であり、例えば、組換え受容体によって認識されまたは結合される組換え抗原またはその断片である。一部の特定の態様において、抗原は、疾患、例えば、がんと関連するポリペプチドまたはポリペプチドの一部である。いくつかの態様において、抗原は、疾患と関連する細胞、例えば、がん細胞および/または腫瘍細胞の表面上に発現されているポリペプチドまたはポリペプチドの変異体もしくは断片である。
いくつかの態様において、抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、CAIXまたはG250としても知られる）、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても知られる）、がん胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮増殖因子タンパク質（EGFR）、III型上皮増殖因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5;Fc受容体ホモログ5またはFCRH5としても知られる）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体5D（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球型抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球型抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、腫瘍胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（5T4としても知られるTPBG）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1、TYRP1またはgp75としても知られる）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2、ドーパクロムトートメラーゼ、ドーパクロムデルターイソメラーゼまたはDCTとしても知られる）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的なもしくは病原体発現される抗原またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化された分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくはその他の病原体によって発現される分子であり、あるいはこれらを含む。いくつかの態様において受容体によって標的とされる抗原としては、多数の公知のB細胞マーカーのいずれもなど、B細胞悪性病変と関連する抗原が挙げられる。いくつかの態様において、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igカッパ、Igラムダ、CD79a、CD79bもしくはCD30であり、またはこれらを含む。いくつかの態様において、抗原は、組換えBCMA、CD19、CD22もしくはROR1であり、または組換えBCMA、CD19、CD22もしくはROR1を含む。
いくつかの態様において、抗IDは、組換え受容体の細胞外抗原結合ドメインの一部である、標的抗体または抗原結合断片（例えば、scFv）を特異的に認識する、抗イディオタイプ抗体または抗原結合断片である。いくつかの態様において、組換え受容体の抗原結合ドメインは、疾患または病態、例えばがんの細胞または組織と関連しまたはその上で発現されている標的抗原などの標的抗原に結合する、抗体または抗原結合断片（例えば、scFv）を含有する。いくつかの態様において、抗IDは、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、CAIXまたはG250としても知られる）、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても知られる）、がん胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮増殖因子タンパク質（EGFR）、III型上皮増殖因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5;Fc受容体ホモログ5またはFCRH5としても知られる）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体5D（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球型抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球型抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、腫瘍胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（5T4としても知られるTPBG）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1、TYRP1またはgp75としても知られる）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2、ドーパクロムトートメラーゼ、ドーパクロムデルターイソメラーゼまたはDCTとしても知られる）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的なもしくは病原体発現される抗原またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化された分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくはその他の病原体によって発現される分子を結合する、標的抗体または抗原結合断片を特異的に認識する、抗イディオタイプ抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様において受容体によって標的とされる抗原としては、多数の公知のB細胞マーカーのいずれもなど、B細胞悪性病変と関連する抗原が挙げられる。いくつかの態様において、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igカッパ、Igラムダ、CD79a、CD79bもしくはCD30であり、またはこれらを含む。いくつかの態様において、抗IDは、抗CD19CARの抗原結合ドメインに結合する。
いくつかの態様において、粒子（例えば、ビーズ）は、磁場の中で反応する。いくつかの態様において、粒子は磁気粒子（例えば、磁気ビーズ）である。いくつかの態様において、磁気粒子は常磁性である。特定の態様において、磁気粒子は超常磁性である。一部の特定の態様において、粒子、例えばビーズは、磁場に曝露されなければ、一切の磁気特性を表さない。いくつかの態様において、粒子またはビーズは、1μm〜10μmまたは約1μm〜約10μm（両端を含む）の直径を有する。特定の態様において、粒子、例えばビーズは、2.8μmのまたは約2.8μmの平均直径を有する。いくつかの態様において、粒子、例えばビーズは、4.8μmのまたは約4.8μmの直径を有する。
特定の態様において、細胞のインプット組成物の細胞は、10日間、約10日間もしくは少なくとも10日間、11日間、約11日間もしくは少なくとも11日間、12日間、約12日間もしくは少なくとも12日間、13日間、約13日間もしくは少なくとも13日間、14日間、約14日間もしくは少なくとも14日間、15日間、約15日間もしくは少なくとも15日間、16日間、約16日間もしくは少なくとも16日間、17日間、約17日間もしくは少なくとも17日間、18日間、約18日間もしくは少なくとも18日間、19日間、約19日間もしくは少なくとも19日間、20日間、約20日間もしくは少なくとも20日間または21日間、約21日間もしくは少なくとも21日間、結合分子、例えば結合分子を含有する粒子またはビーズとともにインキュベートされる。様々な態様において、細胞または細胞の組成物は、10日間〜21日間もしくは約10日間〜約21日間、12日間〜18日間もしくは約12日間〜約18日間または14日間〜16日間もしくは約14日間〜約16日間（両端を含む）、結合分子、例えば、結合分子を含有する粒子またはビーズとともにインキュベートされる。一部の特定の態様において、細胞は、14日間、約14日間または少なくとも14日間、結合分子、例えば結合分子を含有する粒子またはビーズとともにインキュベートされる。特定の態様において、細胞組成物の細胞は、室温より高い温度で、結合分子、例えば結合分子を含有する粒子またはビーズとともにインキュベートされる。いくつかの態様において、インキュベーションは、約25℃より高い、例えば一般的には32℃より高いもしくは約32℃より高い、35℃より高いもしくは約35℃より高いまたは37℃より高いもしくは約37℃より高い温度で行われる。いくつかの態様において、処置、接触またはインキュベーションは、37℃または約37℃の温度など、37℃±2℃または約37℃±2℃の温度で行われる。
いくつかの態様において、細胞は、細胞、例えばT細胞の、分裂、増殖、拡大または活性化を促進するさらなる作用物質なしの培地の存在下で、結合分子とともに、例えば結合分子を含有する粒子またはビーズとともにインキュベートされる。いくつかの態様において、細胞は、あらゆる組換えサイトカインの不存在下で、結合分子とともにインキュベートされる。一部の特定の態様において、インキュベーションは、中断なしに連続的に行われる。一部の特定の態様において、インキュベーションは、静的な条件下で行われる。特定の態様において、インキュベーションは、一切の灌流、混合、揺動または振盪なしに行われる。いくつかの局面において、結合分子は、インキュベーションの全期間にわたって存在する。一部の特定の態様において、結合分子は、インキュベーションの間に、変更または交替されない。特定の態様は、いくつかの局面において、培地が一切の組換えサイトカインを含有しないので、インキュベーションの間に培地中に存在するサイトカインは、例えば、細胞の組換え受容体と粒子の結合分子の間の相互作用に応答して、細胞によって産生されることを想定する。
いくつかの態様において、結合分子の量、例えば結合分子を含有する粒子またはビーズの量は、細胞当たり1個の結合分子〜1012個の結合分子または細胞当たり約1個の結合分子〜約1012個の結合分子、例えば102個の結合分子〜1010個の結合分子もしくは約102個の結合分子〜約1010個の結合分子、103個の結合分子〜108個の結合分子もしくは約103個の結合分子〜約108個の結合分子、104個の結合分子〜106個の結合分子もしくは約104個の結合分子〜約106個の結合分子、1個の結合分子〜102個の結合分子もしくは約1個の結合分子〜約102個の結合分子、102個の結合分子〜103個の結合分子もしくは約102個の結合分子〜約103個の結合分子、103個の結合分子〜104個の結合分子もしくは約103個の結合分子〜約104個の結合分子、104個の結合分子〜105個の結合分子もしくは約104個の結合分子〜約105個の結合分子、105個の結合分子〜106個の結合分子もしくは約105個の結合分子〜約106個の結合分子、105個の結合分子〜106個の結合分子もしくは約105個の結合分子〜約106個の結合分子、106個の結合分子〜107個の結合分子もしくは約106個の結合分子〜約107個の結合分子、107個の結合分子〜108個の結合分子もしくは約107個の結合分子〜約108個の結合分子または109個の結合分子〜1010個の結合分子もしくは約109個の結合分子〜約1010個の結合分子（両端を含む）を与えるのに十分である。いくつかの態様において、結合分子、例えば結合分子を含有する粒子またはビーズの量は、各細胞に対して、104個の結合分子〜約106個の結合分子（両端を含む）を提供するのに十分な量である。いくつかの態様において、粒子、例えばビーズの量は、各細胞に対して約105個の結合分子を含有する。
いくつかの態様において、インプット組成物は、10:1〜1:10もしくは約10:1〜約1:10、5:1〜1:5もしくは約5:1〜約1:5、3:1〜1:3もしくは約3:1〜約1:3または2:1〜1:2もしくは約2:1〜約1:2（それぞれ両端を含む）の、全細胞:粒子、例えばビーズの比で、結合分子を含有する粒子、例えばビーズとともにインキュベートされる。特定の態様において、比は、1:0.2および1:5であり、または1:0.2〜1:5であり、または約1:0.2〜約1:5（両端を含む）である。いくつかの態様において、インプット組成物の全細胞対粒子、例えばビーズの比は、約1:1である。
いくつかの態様において、提供されるアッセイは、異なる細胞または細胞組成物を比較するために使用され得る。例えば、いくつかの態様において、それぞれが同一の組換え受容体、例えば同一のCARを発現する細胞を含有する2つまたはそれより多くの細胞組成物は、同一の結合分子、例えば組換え受容体に結合しまたは組換え受容体を認識する同一の結合分子を含有する粒子またはビーズとともに、細胞をインキュベートすることによって比較され得る。一部の特定の態様において、2つまたはそれより多くの細胞組成物は、異なる作用物質、例えばmTORキナーゼ活性を阻害する作用物質の存在下で生成される。特定の態様において、細胞組成物は、対照または参照細胞組成物と比較され得る。いくつかの局面において、対照または参照細胞組成物としては、一切インキュベーションを経ていない細胞組成物、結合分子を含有する粒子、例えばビーズの存在下でインキュベートされない細胞組成物、組換え受容体を発現する細胞を含有しない細胞組成物、異なる操作プロセスから生成される細胞組成物および/またはビヒクルもしくは対照化合物の存在下で操作される細胞組成物を挙げ得るが、これらに限定されない。
特定の態様において、それぞれが異なる組換え受容体、例えば異なるCARを発現する細胞を含有する2つまたはそれより多くの細胞組成物は、異なる組換え受容体に結合しまたは異なる組換え受容体を認識する異なる結合分子を含有する、粒子、例えばビーズなどの結合分子とともに細胞をインキュベートすることによって比較され得る。
いくつかの態様において、細胞は、インキュベーションの間の異なる時点で評価される。例えば、いくつかの局面において、1つまたは複数の細胞組成物からの細胞の表現型、特徴または活性は、中間の時点で、例えばインキュベーションの完了の5％、約5％または少なくとも5％、10％、約10％または少なくとも10％、20％、約20％または少なくとも20％、25％、約25％または少なくとも25％、30％、約30％または少なくとも30％、40％、約40％または少なくとも40％、50％、約50％または少なくとも50％、60％、約60％または少なくとも60％、70％、約70％または少なくとも70％、75％、約75％または少なくとも75％、80％、約80％または少なくとも80％、90％、約90％または少なくとも90％で起こる時点で評価される。一部の特定の態様において、細胞は、インキュベーションの間に、1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回または10回より多く評価される。一部の特定の態様において、細胞は、インキュベーション中に異なる間隔、例えば6時間、約6時間もしくは少なくとも6時間、12時間、約12時間もしくは少なくとも12時間、18時間、約18時間もしくは少なくとも18時間、24時間、約24時間もしくは少なくとも24時間、36時間、約36時間もしくは少なくとも36時間、48時間、約48時間もしくは少なくとも48時間、1日、約1日もしくは少なくとも1日、2日、約2日もしくは少なくとも2日、3日、約3日もしくは少なくとも3日、4日、約4日もしくは少なくとも4日、5日、約5日もしくは少なくとも5日、6日、約6日もしくは少なくとも6日、7日、約7日もしくは少なくとも7日または8日、約8日もしくは少なくとも8日の間隔後に評価される。いくつかの態様において、細胞は毎日評価される。いくつかの態様において、細胞は3日ごとに評価される。一部の特定の態様において、細胞は7日ごとに評価される。
一部の特定の態様において、細胞、例えばアウトプット組成物の細胞は、活性、例えば抗原シミュレートされた活性、表現型または特徴に関して評価される。いくつかの態様において、抗原刺激された活性は、長い刺激のための方法の間または後に、例えば、結合分子を含有する粒子、例えばビーズとのインキュベーションの間または後に、細胞組成物の細胞中で評価される。特定の態様において、評価の結果は、異なる細胞組成物、例えば対照または参照細胞組成物からの細胞中で測定された同一または類似の活性の評価と比較される。
いくつかの態様において、活性は抗原刺激された活性である。特定の態様は、細胞、例えば組換え受容体を発現するT細胞の抗原刺激された活性が、多数の公知の適切な技術のいずれによっても評価され得ることを想定する。いくつかの態様において、1種または複数種のサイトカインの産生は、細胞内サイトカイン染色によって、測定され、検出されおよび/または定量される。いくつかの局面において、フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン染色（ICS）は、単一細胞レベルでサイトカイン産生を研究するのに極めて適した技術である。一部の特定の局面において、ICSは、例えば、抗原を発現する細胞またはコンジュゲートされた抗原を有する粒子、例えばビーズ粒子での細胞刺激後における小胞体内のサイトカインの産生および蓄積を検出するのに有用であり、特定のサイトカインの産生に関して陽性もしくは陰性である細胞集団の同定または閾値に基づく高産生細胞と低産生細胞の分離を可能にする。ICSは、細胞の特定のサブグループ中でのサイトカイン産生にアクセスする（access）ために、細胞表面マーカー、例えばCD4またはCD8を用いる免疫表現型決定のための他のフローサイトメトリープロトコールと組み合わせて使用することもできる。サイトカイン産生を測定または検出するための他の単一細胞技術としては、ELISPOT、限界希釈およびT細胞クローニングが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの態様において、抗原刺激された活性は、1種または複数種のサイトカインの産生である。抗原刺激に応答して産生され得るサイトカインとしては、IL-1、IL-1β、IL-2、sIL-2Ra、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL27、IL-33、IL-35、TNF、TNFアルファ、CXCL2、CCL2、CCL3、CCL5、CCL17、CCL24、PGD2、LTB4、インターフェロンガンマ（IFN-γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、マクロファージ炎症性タンパク質（MIP）-1a、MIP-1b、Flt-3L、フラクタルカインおよび/またはIL-5を挙げ得るが、これらに限定されない。いくつかの態様において、1種または複数種のサイトカインは、IL-2、IFN-ガンマもしくはTNF-アルファのうちの1つもしくは複数であり、またはIL-2、IFN-ガンマもしくはTNF-アルファのうちの1つもしくは複数を含む。いくつかの態様において、サイトカイン分泌は、抗原発現細胞との共培養後にまたは付着された抗原もしくは抗原断片を含有する粒子、例えばビーズのインキュベーション後に、細胞外サイトカインの量または濃度を測定し、検出しまたは定量することによって評価される。
特定の態様において、抗原刺激された活性は細胞溶解（細胞傷害性）活性である。いくつかの態様において、細胞溶解活性は、組成物の細胞、例えば、組換え受容体を発現する細胞を、組換え受容体によって認識される抗原またはエピトープを発現する標的細胞とともに曝露し、インキュベートし、および/または接触させることによって評価される。細胞溶解活性は、経時的に、標的細胞数を直接または間接的に測定することによって測定することができる。例えば、標的細胞は、組換え受容体を発現する細胞とともにインキュベートされる前に、検出可能なマーカーとともにインキュベートされ得、このようなマーカーは、標的細胞が溶解されるときに検出可能であり、または生きた標的細胞中でのみ検出可能である検出可能なマーカーである。これらの読み出し情報は、直接または間接の標的細胞数および/または標的細胞死を提供し、アッセイの間に異なる時点で測定することができる。標的細胞数の低下および/または標的細胞死の増加は、細胞の細胞溶解活性を示す。細胞溶解アッセイを実施するための適切な方法は当技術分野において公知であり、クロム-51放出アッセイ、非放射性クロムアッセイ、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）、PKH-2およびPKH-26などの蛍光性色素を使用するフローサイトメトリーアッセイが挙げられるが、これらに限定されない。
一部の特定の態様において、細胞組成物の細胞、例えば、組換え受容体を発現している細胞は、アッセイの間または後に、例えば、結合受容体を含有する粒子、例えばビーズとのインキュベーションの間または後に1種または複数種の特徴または表現型に関して評価される。いくつかの態様において、1種または複数種の特徴または表現型は、活性化、消耗もしくは分化のうちの1つもしくは複数であり、または活性化、消耗もしくは分化のうちの1つもしくは複数と関係する。一部の特定の態様において、1種または複数種の表現型または特徴は、1種または複数種のマーカー、例えばバイオマーカーの存在、不存在、量またはレベルを測定し、検出し、または定量することによって評価される。
いくつかの態様において、マーカー、例えば活性化、消耗または分化と正にまたは負に関連するマーカーの発現は、試料中のマーカーのレベル、量もしくは濃度を評価、測定、判定および/もしくは定量することであり、またはこれらを含む。一部の特定の態様において、マーカーは、遺伝子産物、例えば、遺伝子によってコードされる情報を用いて組み立てられる、生成される、および/または合成されるあらゆる生体分子であり、ポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドを含み得る。一部の特定の態様において、マーカーのレベル、量または濃度は、変換され得（例えば、正規化され）または直接分析され得る（例えば、生）。いくつかの態様において、マーカーはタンパク質である。一部の特定の態様において、マーカーは、遺伝子によってコードされるポリヌクレオチド、例えば、mRNAまたはタンパク質である。
特定の態様において、ポリヌクレオチドであるマーカーの量またはレベルは、任意の適切な公知の手段によって、評価され、測定され、決定され、および/または定量され得る。例えば、いくつかの態様において、ポリヌクレオチドマーカーの量またはレベルは、逆転写酵素（rt）PCR、ドロップレットデジタルPCR、リアルタイムおよび定量的PCR法（例えば、TAQMAN（登録商標）、分子ビーコン、LIGHTUP（商標）、SCORPION（商標）、SIMPLEPROBES（登録商標）を含む;例えば、米国特許第5,538,848号;同第5,925,517号;同第6,174,670号;同第6,329,144号;同第6,326,145号および同第6,635,427号参照）を含むポリメラーゼ連鎖反応（PCR）;ノーザンブロッティング;例えば逆転写産物および誘導体のサザンブロッティング;ブロット化（blotted）アレイ、マイクロアレイまたはインサイチュ合成アレイを含む、アレイベースの方法;ならびにシーケンシング、例えば、合成によるシーケンシング、パイロシーケンシング、ジデオキシシーケンシング、またはライゲーションによるシーケンシング、あるいは当技術分野において公知の、例えばShendure et al.,Nat.Rev.Genet.5:335-44（2004）またはNowrousian,Euk.Cell 9（9）:1300-1310（2010）に論考された任意の他の方法、例えば、HELICOS（登録商標）、ROCHE（登録商標）454、ILLUMINA（登録商標）/SOLEXA（登録商標）、ABI SOLiD（登録商標）およびPOLONATOR（登録商標）シーケンシングなどの具体的なプラットフォームなどによって、評価され、測定され、決定されおよび/または定量され得る。特定の態様において、核酸遺伝子産物のレベルは、qRT-PCRによって測定される。いくつかの態様において、qRT-PCRは、各遺伝子に対して3つの核酸の組を使用し、該3つの核酸は、プライマーが結合する、標的核酸の領域の間に結合するプローブとともにプライマー対を含む-TAQMAN（登録商標）アッセイとして商業的に知られている。
特定の態様において、2つまたはそれより多くのポリヌクレオチドマーカーの発現は、同時に測定または評価される。一部の特定の態様において、2種類またはそれより多くの遺伝子産物のレベル、量または濃度を評価、測定、判定および/または定量するマルチプレックスPCR、例えば、マルチプレックスrt-PCR。いくつかの態様において、2種類またはそれより多くの遺伝子産物のレベル、量または濃度を評価、測定、判定および/または定量するために、マイクロアレイ（例えば、AFFYMETRIX（登録商標）、AGILENT（登録商標）およびILLUMINA（登録商標）様式のアレイ）が使用される。いくつかの態様において、マイクロアレイは、RNA遺伝子産物から誘導されたcDNAポリヌクレオチドのレベル、量または濃度を評価、測定、判定および/または定量するために使用される。
いくつかの態様において、1種または複数種のポリヌクレオチドマーカーの発現は、マーカーmRNAまたはマーカーmRNAから誘導されたcDNAポリヌクレオチドを配列決定することによって判定される。いくつかの態様において、シーケンシングは、非サンガーシーケンシング法および/または次世代シーケンシング（NGS）技術によって行われる。次世代シーケンシング技術の例としては、大規模並列シグネチャーシーケンシング（MPSS）、ポロニー（Polony）シーケンシング、パイロシーケンシング、可逆ダイターミネーターシーケンシング、SOLiDシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、DNAナノボールシーケンシング、ヘリオスコープ一分子シーケンシング（Helioscope single molecule sequencing）、一分子リアルタイム（SMRT）シーケンシング、一分子リアルタイム（RNAP）およびナノポアDNAシーケンシングが挙げられるが、これらに限定されない。
特定の態様において、マーカーはタンパク質またはその断片である。一部の特定の態様において、1種または複数種のタンパク質マーカーは、当技術分野において公知のあらゆる適切な手段によって測定される。1種または複数種のタンパク質マーカーのレベル、量または濃度を評価、測定、判定および/または定量するための適切な方法としては、イムノアッセイを用いた検出、核酸ベースまたはタンパク質ベースのアプタマー手法、HPLC（高精密液体クロマトグラフィー）、ペプチドシーケンシング（例えば、エドマン分解シーケンシングまたは質量分析（例えば、MS/MS）、任意でHPLCと対にする）、ならびに上記のいずれかのもののマイクロアレイ適合型（例えば、核酸、抗体またはタンパク質-タンパク質（すなわち非抗体）アレイ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、イムノアッセイは、免疫学的反応に基づいて、例えば、遺伝子産物への抗体もしくは抗原結合抗体断片の結合を検出することによって、タンパク質を検出する方法もしくはアッセイであり、かかる方法もしくはアッセイを含む。イムノアッセイとしては、限定するわけではないが、定量的免疫細胞化学または免疫組織化学、ELISA（直接、間接、サンドイッチ、競合的、多重および携帯型ELISAなど（例えば、米国特許第7,510,687号参照）、ウエスタンブロッティング（例えば、1次元、2次元もしくはそれより高次元のブロッティングまたは他のクロマトグラフィー手段、任意で例えば、ペプチドシーケンシング）、エンザイムイムノアッセイ（EIA）、RIA（ラジオイムノアッセイ）およびSPR（表面プラズモン共鳴）が挙げられる。
いくつかの態様において、タンパク質マーカーは、フローサイトメトリーによって、測定され、検出され、または定量される。いくつかの局面において、フローサイトメトリーは、流体の流れの中に細胞を懸濁し、電子的検出装置に細胞を通過させることによって、マーカー検出において使用される、レーザーまたはインピーダンスベースの生物物理学的技術である。細胞上に存在するマーカーは、例えば、フローサイトメトリーによる検出のための蛍光タグが付加された抗体で標識され得る。いくつかの局面において、フローサイトメトリーは、細胞の集団中に存在するマーカーの存在、不存在、量またはレベルを測定、検出または定量するために使用される。いくつかの局面において、細胞の集団は、細胞組成物の全部の細胞もしくは全部の生きた細胞であり得、または細胞組成物からの細胞のサブセット、例えば、組換え受容体に対して陽性の細胞、CD4＋T細胞またはCD8＋T細胞に由来し得る。
特定の態様において、マーカーは、活性化または活性化様状態と正に関連または相関する。いくつかの態様において、マーカーは、CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD71、CD154、CD40L、CD127、LAG3もしくはKi67であり、またはこれらを含む。いくつかの態様において、マーカーは、消耗または消耗と関連する病態と正に関連または相関する。特定の態様において、マーカーは、CTLA-4、FOXP3、PD-1、TIGIT、LAB-3、2B4、BTLA、TIM3、VISTAもしくはCD96のうちの1つまたは複数であり、またはCTLA-4、FOXP3、PD-1、TIGIT、LAB-3、2B4、BTLA、TIM3、VISTAもしくはCD96のうちの1つまたは複数を含む。いくつかの態様において、バイオマーカーは、T細胞の分化と関連する。特定の態様において、マーカーは、CD25、CD45RO、CD56、KLRG1、CD95のうちの1つもしくは複数ならびに/もしくはCD45RA、CD27、CD28、CD62LおよびCCR7のうちの1つもしくは複数であり、またはこれらを含む。いくつかの態様において、細胞、例えば、アウトプット組成物の細胞は、CD45RA、CD27、CD28、CD62LおよびCCR7からなる群より選択されるT細胞活性化マーカーに関して表面陽性である;ならびに/またはCD25、CD45RO、CD56、KLRG1からなる群より選択されるマーカーに関して表面陰性である;ならびに/またはCD95の低発現を有する;ならびに/またはIL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10からなる群より選択されるサイトカインの細胞内発現に関して陰性である細胞に対して評価される。いくつかにおいて、アウトプット組成物は、CD45RA＋、CD27＋、CCR7＋および/またはCD45RO-である細胞に対して評価される。
いくつかの態様において、アウトプット細胞組成物の細胞は、長期刺激方法の後に、例えば、結合分子を含有する粒子、例えばビーズとのインキュベーションの後に、長期または慢性の刺激を経た細胞の特徴を示す。いくつかの態様において、細胞組成物、例えば、参照または対照細胞組成物の組換え受容体を発現する細胞は、アッセイの後に、例えば、結合分子を含有する粒子、例えばビーズとのインキュベーションの後に、長期または慢性の刺激を経た細胞の特徴を示す。
IV.組換え受容体
いくつかの態様において、本明細書で提供される方法によって処置、加工処理、操作、および/または作製される細胞は、組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）、またはT細胞受容体（TCR）などの組換えタンパク質を含有もしくは発現するか、または含有もしくは発現するように操作される。一部の特定の態様において、本明細書で提供される方法は、組換えタンパク質を発現もしくは含有するように操作される細胞、または該細胞を含有するおよび/もしくは該細胞が濃縮された集団もしくは組成物を作製するおよび/または作製することができる。いくつかの態様において、CD4＋T細胞、またはCD4＋T細胞の集団または組成物が、処置、加工処理、操作、および/または作製される。
いくつかの態様において、細胞は、遺伝子操作によって導入された1つまたは複数の核酸を含み、それによりかかる核酸の組換え産物または遺伝子操作された産物を発現する。いくつかの態様において、遺伝子導入は、例えばサイトカインまたは活性化マーカーの発現によって測定されるように、細胞の増殖、生存、および/または活性化などの応答を誘導する刺激と組み合わせることなどによって、最初に細胞を刺激し、続いて活性化した細胞に形質導入し、培養下で臨床適用に十分な数まで拡大することによって達成される。
細胞は一般に、組換え受容体、例えば機能的非TCR抗原受容体を含む抗原受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）、およびトランスジェニックT細胞受容体（TCR）などの他の抗原結合受容体を発現する。また、受容体の中には他のキメラ受容体もある。
A.キメラ抗原受容体
提供される方法および使用のいくつかの態様において、キメラ抗原受容体などのキメラ受容体は、所望の抗原（例えば腫瘍抗原）に対する特異性を提供するリガンド結合ドメイン（例えば抗体または抗体断片）を細胞内シグナル伝達ドメインと組み合わせる1つまたは複数のドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞活性化ドメインなどの活性化細胞内ドメイン部分であり、一次活性化シグナルを提供する。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、エフェクター機能を促進するための共刺激シグナル伝達ドメインを含むか、または付加的に含む。いくつかの態様において、免疫細胞に遺伝子操作された場合のキメラ受容体はT細胞活性を調節することができ、いくつかの場合には、T細胞分化またはホメオスタシスを調節することができ、それにより、養子細胞治療法での使用などのために、インビボでの寿命、生存および/または持続性が改善された、遺伝子操作された細胞をもたらす。
CARを含む例示的な抗原受容体、およびかかる受容体を操作して細胞に導入するための方法は、例えば国際公開公報第200014257号、同第2013126726号、同第2012/129514号、同第2014031687号、同第2013/166321号、同第2013/071154号、同第2013/123061号、米国特許出願公開第2002131960号、同第2013287748号、同第20130149337号、米国特許第6,451,995号、同第7,446,190号、同第8,252,592号、同第8,339,645号、同第8,398,282号、同第7,446,179号、同第6,410,319号、同第7,070,995号、同第7,265,209号、同第7,354,762号、同第7,446,191号、同第8,324,353号、および同第8,479,118号、および欧州特許出願第2537416号に記載されているもの、ならびに/またはSadelain et al.,Cancer Discov.2013 April;3（4）:388-398;Davila et al.（2013）PLoS ONE 8（4）:e61338;Turtle et al.,Curr.Opin.Immunol.,2012 October;24（5）:633-39;Wu et al.,Cancer,2012 March 18（2）:160-75によって記載されているものを含む。いくつかの局面において、抗原受容体は、米国特許第7,446,190号に記載されているCAR、および国際公開公報第2014055668A1号に記載されているものを含む。CARの例としては、国際公開公報第2014031687号、米国特許第8,339,645号、同第7,446,179号、米国特許出願公開第2013/0149337号、米国特許第7,446,190号、同第8,389,282号、Kochenderfer et al.,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276（2013）;Wang et al.（2012）J.Immunother.35（9）:689-701;およびBrentjens et al.,Sci Transl Med.2013 5（177）などの前述の刊行物のいずれかに開示されているCARが挙げられる。国際公開公報第2014031687号、米国特許第8,339,645号、同第7,446,179号、米国特許出願公開第2013/0149337号、米国特許第7,446,190号、および米国特許第8,389,282号も参照のこと。
CARなどのキメラ受容体は、一般に、抗体分子の一部などの細胞外抗原結合ドメイン、一般に抗体の可変重（VH）鎖領域および/または可変軽（VL）鎖領域、例えばscFv抗体断片を含む。
いくつかの態様において、受容体が標的とする抗原は、ポリペプチドである。いくつかの態様において、抗原は炭水化物または他の分子である。いくつかの態様において、抗原は、正常または非標的細胞または組織と比較して、疾患または病態の細胞、例えば腫瘍または病原性細胞上に選択的に発現されるかまたは過剰発現される。他の態様において、抗原は正常細胞上に発現され、および/または操作された細胞上に発現される。
いくつかの態様において、抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸アンヒドラーゼ9（CA9、CAIXまたはG250として知られる）、がん-精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても知られる）、がん胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、III型上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5;Fc受容体ホモログ5もしくはFCRH5としても知られる）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体α、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン3（GPC3）、Gタンパク質共役型受容体5D（GPRC5D）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体α（IL-22Rα）、IL-13受容体α2（IL-13Rα2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、κ軽鎖、L1細胞接着分子（L1ーCAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、がん胎児性抗原、メラノーマの優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養芽層糖タンパク質（TPBG、5T4としても知られる）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシン関連タンパク質1（TRP1、TYRP1もしくはgp75としても知られる）、チロシン関連タンパク質2（TRP2、ドーパクロムトートメラーゼ、ドーパクロムδイソメラーゼもしくはDCTとしても知られる）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくは他の病原体によって発現される分子であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において受容体によって標的とされる抗原は、いくつかの公知のB細胞マーカーのいずれかなどの、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原を含む。いくつかの態様において、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79bもしくはCD30であるか、またはそれを含む。
いくつかの態様において、抗原は、病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原であるか、または病原体特異的抗原もしくは病原体発現抗原を含む。いくつかの態様において、抗原は、ウイルス抗原（例えばHIV、HCV、HBVなどからのウイルス抗原）、細菌抗原、および/または寄生虫抗原である。いくつかの態様において受容体によって標的とされる抗原は、いくつかの公知のB細胞マーカーのいずれかなどの、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原を含む。いくつかの態様において、受容体によって標的とされる抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79bまたはCD30である。
いくつかの態様において、抗原または抗原結合ドメインはCD19である。いくつかの態様において、scFvは、CD19に特異的な抗体または抗体断片に由来するVHおよびVLを含む。いくつかの態様において、CD19に結合する抗体または抗体断片は、FMC63およびSJ25C1などのマウス由来の抗体である。いくつかの態様において、抗体または抗体断片は、例えば米国特許出願公開第2016/0152723号に記載されているヒト抗体である。
本明細書における「抗体」という用語は最も広い意味で使用され、無傷の抗体、ならびに断片抗原結合（Fab）断片、F（ab’）2断片、Fab’断片、Fv断片、組換えIgG（rIgG）断片、抗原に特異的に結合することができる重鎖可変（VH）領域、単鎖可変断片（scFv）を含む単鎖抗体断片、および単一ドメイン抗体（例えばsdAb、sdFv、ナノボディ）断片を含む機能的（抗原結合）抗体断片を含む、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む。この用語は、遺伝子操作されたおよび/またはさもなければ修飾形態の免疫グロブリン、例えばイントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性抗体、例えば二重特異性もしくは三重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデムdi-scFv、タンデムtri-scFvを包含する。特に明記されない限り、「抗体」という用語は、本明細書では「抗原結合断片」とも称されるその機能的抗体断片を包含すると理解されるべきである。この用語はまた、IgGおよびそのサブクラス、IgM、IgE、IgA、およびIgDを含む任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含む、無傷または完全長抗体を包含する。
「超可変領域」または「HVR」と同義である、「相補性決定領域」および「CDR」という用語は、抗原特異性および/または結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の不連続配列を指すことが当技術分野において公知である。一般に、各重鎖可変領域に3つのCDR（CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3）があり、各軽鎖可変領域に3つのCDR（CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3）がある。「フレームワーク領域」および「FR」は、重鎖および軽鎖の可変領域の非CDR部分を指すことが当技術分野において公知である。一般に、各完全長重鎖可変領域に4つのFR（FR-H1、FR-H2、FR-H3、およびFR-H4）があり、各完全長軽鎖可変領域に4つのFR（FR-L1、FR-L2、FR-L3、およびFR-L4）がある。
所与のCDRまたはFRの正確なアミノ酸配列の境界は、Kabat et al.（1991）,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD（「Kabat」番号付けスキーム）;Al-Lazikani et al.,（1997）JMB 273,927-948（「Chothia」番号付けスキーム）;MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745（1996）,“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745”（「Contact」番号付けスキーム）;Lefranc MP et al.,“IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003 Jan;27（1）:55-77（「IMGT」番号付けスキーム）;Honegger A and Pluckthun A,“Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”J Mol Biol,2001 Jun 8;309（3）:657-70（「Aho」番号付けスキーム）;Martin et al.,“Modeling antibody hypervariable loops:a combined algorithm,”PNAS,1989,86（23）:9268-9272（「AbM」番号付けスキーム）によって記載されているものを含む、いくつかの周知のスキームのいずれかを使用して容易に決定することができる。
所与のCDRまたはFRの境界は、同定のために使用されるスキームによって異なり得る。例えば、Kabatスキームは構造アラインメントに基づいており、一方Chothiaスキームは構造情報に基づく。KabatスキームとChothiaスキームの両方の番号付けは、最も一般的な抗体領域の配列の長さに基づいており、挿入には挿入文字、例えば「30a」によって対応し、一部の抗体では欠失が出現する。2つのスキームは、特定の挿入と欠失（「インデル」）を異なる位置に配置するため、結果として異なる番号付けになる。Contactスキームは、複雑な結晶構造の分析に基づいており、多くの点でChothia番号付けスキームに類似する。AbMスキームは、Oxford MolecularのAbM抗体モデリングソフトウェアで使用されているものに基づく、KabatとChothiaの定義の妥協案である。
以下の表1は、それぞれKabat、Chothia、AbM、およびContactスキームによって同定されるCDR-L1、CDR-L2、CDR-L3およびCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3の例示的な位置境界を列挙する。CDR-H1については、KabatとChothiaの両方の番号付けスキームを使用した残基番号付けが列挙されている。FRはCDRの間に位置し、例えばFR-L1はCDR-L1の前に位置し、FR-L2はCDR-L1とCDR-L2の間に位置し、FR-L3はCDR-L2とCDR-L3の間に位置する、などである。示されているKabat番号付けスキームではH35AとH35Bに挿入を配置するため、示されているKabat番号付け規則を使用して番号付けした場合のChothia CDR-H1ループの末端は、ループの長さに依存してH32とH34の間で異なることが注目される。
（表1）様々な番号付けスキームによるCDRの境界
Figure 2021501607
1-Kabat et al.（1991）,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD
2-Al-Lazikani et al.,（1997）JMB 273,927-948
したがって、特に指定されない限り、所与の抗体またはその領域、例えばその可変領域の「CDR」または「相補性決定領域」または個々の指定されるCDR（例えばCDR-H1、CDR-H2、CDR-H3）は、前述のスキームのいずれかまたは他の公知のスキームによって定義される、（または特定の）相補性決定領域を包含すると理解されるべきである。例えば、特定のCDR（例えばCDR-H3）が、所与のVHまたはVL領域のアミノ酸配列内の対応するCDRのアミノ酸配列を含むと述べられている場合、かかるCDRは、前述のスキームのいずれかまたは他の公知のスキームによって定義される、可変領域内の対応するCDR（例えばCDR-H3）の配列を有すると理解される。いくつかの態様において、特定のCDR配列が指定される。提供される抗体の例示的なCDR配列は、様々な番号付けスキームを使用して表されるが、提供される抗体は、他の前述の番号付けスキームのいずれかまたは当業者に公知の他の番号付けスキームに従って表されるCDRを含み得ることが理解される。
同様に、特に指定されない限り、所与の抗体またはその領域、例えばその可変領域のFRまたは個々の指定されるFR（1つまたは複数）（例えばFR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4）は、公知のスキームのいずれかによって定義される、（または特定の）フレームワーク領域を包含すると理解されるべきである。いくつかの場合には、Kabat、Chothia、AbMまたはContact法、または他の公知のスキームによって定義されるCDRなどの、特定のCDR（1つもしくは複数）またはFR（1つもしくは複数）を同定するためのスキームが指定される。他の場合には、CDRまたはFRの特定のアミノ酸配列が与えられる。
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する、抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変領域（それぞれVHおよびVL）は、一般に類似の構造を有し、各ドメインは4つの保存されたフレームワーク領域（FR）および3つのCDRを含む。（例えば、Kindt et al.Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91（2007）参照。単一のVHまたはVLドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、抗原に結合する抗体からのVHまたはVLドメインを用いて単離して、それぞれ相補的VLまたはVHドメインのライブラリーをスクリーニングし得る。例えば、Portolano et al.,J.Immunol.150:880-887（1993）;Clarkson et al.,Nature 352:624-628（1991）参照。
提供されるCARに含まれる抗体の中には、抗体断片がある。「抗体断片」または「抗原結合断片」とは、無傷の抗体が結合する抗原に結合する無傷の抗体の一部を含む、無傷の抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F（ab’）2;ダイアボディ;直鎖抗体;重鎖可変（VH）領域、scFvおよびVH領域だけを含む単一ドメイン抗体などの単鎖抗体分子;ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、提供されるCARの抗原結合ドメインは、可変重鎖（VH）および可変軽鎖（VL）領域を含む抗体断片であるか、または該抗体断片を含む。特定の態様において、抗体は、scFvなどの、重鎖可変（VH）領域および/または軽鎖可変（VL）領域を含む単鎖抗体断片である。
いくつかの態様において、scFvはFMC63に由来する。FMC63は一般に、ヒト起源のCD19を発現するNalm-1およびNalm-16細胞に対して惹起されるマウスモノクローナルIgG1抗体を指す（Ling,N.R.,et al.（1987）Leucocyte typing III.302）。いくつかの態様において、FMC63抗体は、それぞれSEQ ID NO:39および40に示されるCDRH1およびCDRH2、SEQ ID NO:41または55に示されるCDRH3、ならびにSEQ ID NO:36に示されるCDRL1、SEQ ID NO:37または56に示されるCDRL2、およびSEQ ID NO:38または35に示されるCDRL3を含む。FMC63抗体は、SEQ ID NO:42のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）およびSEQ ID NO:43のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む。
いくつかの態様において、scFvは、SEQ ID NO:36のCDRL1配列、SEQ ID NO:37のCDRL2配列、およびSEQ ID NO:38のCDRL3配列を含む可変軽鎖、ならびに/またはSEQ ID NO:39のCDRH1配列、SEQ ID NO:40のCDRH2配列、およびSEQ ID NO:41のCDRH3配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの態様において、scFvは、SEQ ID NO:42に示される可変重鎖領域およびSEQ ID NO:43に示される可変軽鎖領域を含む。いくつかの態様において、可変重鎖と可変軽鎖はリンカーによって接続されている。いくつかの態様において、リンカーはSEQ ID NO:57に示されている。いくつかの態様において、scFvは、順にVH、リンカー、およびVLを含む。いくつかの態様において、scFvは、順にVL、リンカー、およびVHを含む。いくつかの態様において、svFcは、SEQ ID NO:58に示されるヌクレオチドの配列、またはSEQ ID NO:58と少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を示す配列によってコードされる。いくつかの態様において、scFvは、SEQ ID NO:44に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:44と少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を示す配列を含む。
いくつかの態様において、scFvはSJ25C1に由来する。SJ25C1は、ヒト起源のCD19を発現するNalm-1およびNalm-16細胞に対して惹起されるマウスモノクローナルIgG1抗体である（Ling,N.R.,et al.（1987）Leucocyte typing III.302）。いくつかの態様において、SJ25C1抗体は、それぞれSEQ ID NO:48〜50に示されるCDRH1、CDRH2およびCDRH3、ならびにそれぞれSEQ ID NO:45〜47に示されるCDRL1、CDRL2およびCDRL3配列を含む。SJ25C1抗体は、SEQ ID NO:51のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域（VH）およびSEQ ID NO:52のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域（VL）を含む。
いくつかの態様において、scFvは、SEQ ID NO:45のCDRL1配列、SEQ ID NO:46のCDRL2配列、およびSEQ ID NO:47のCDRL3配列を含む可変軽鎖、ならびに/またはSEQ ID NO:48のCDRH1配列、SEQ ID NO:49のCDRH2配列、およびSEQ ID NO:50のCDRH3配列を含む可変重鎖を含む。いくつかの態様において、scFvは、SEQ ID NO:51に示される可変重鎖領域およびSEQ ID NO:52に示される可変軽鎖領域を含む。いくつかの態様において、可変重鎖と可変軽鎖はリンカーによって接続されている。いくつかの態様において、リンカーはSEQ ID NO:53に示されている。いくつかの態様において、scFvは、順にVH、リンカー、およびVLを含む。いくつかの態様において、scFvは、順にVL、リンカー、およびVHを含む。いくつかの態様において、scFvは、SEQ ID NO:54に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:53と少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99％の配列同一性を示す配列を含む。
いくつかの態様において、抗原または抗原結合ドメインはBCMAである。いくつかの態様において、scFvは、BCMAに特異的な抗体または抗体断片に由来するVHおよびVLを含む。いくつかの態様において、BCMAに結合する抗体または抗体断片は、国際公開公報第2016/090327号および国際公開公報第2016/090320号に記載されている抗体または抗体断片由来のVHおよびVLであるか、または該VHおよびVLを含む。
いくつかの態様において、抗原または抗原結合ドメインはGPRC5Dである。いくつかの態様において、scFvは、GPRC5Dに特異的な抗体または抗体断片に由来するVHおよびVLを含む。いくつかの態様において、GPRC5Dに結合する抗体または抗体断片は、国際公開公報第2016/090329号および国際公開公報第2016/090312号に記載されている抗体または抗体断片由来のVHおよびVLであるか、または該VHおよびVLを含む。
いくつかの態様において、抗原はCD20である。いくつかの態様において、scFvは、CD20に特異的な抗体または抗体断片に由来するVHおよびVLを含む。いくつかの態様において、CD20に結合する抗体または抗体断片は、リツキシマブscFvなどの、リツキシマブであるかまたはリツキシマブに由来する抗体である。
いくつかの態様において、抗原はCD22である。いくつかの態様において、scFvは、CD22に特異的な抗体または抗体断片に由来するVHおよびVLを含む。いくつかの態様において、CD22に結合する抗体または抗体断片は、m971 scFvなどの、m971であるかまたはm971に由来する抗体である。
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、抗体または抗体断片を含む細胞外部分を含む。いくつかの局面において、キメラ抗原受容体は、抗体または断片を含む細胞外部分および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、抗体または断片はscFvを含む。
いくつかの態様において、組換え受容体、例えばCARの抗体部分は、免疫グロブリン定常領域の少なくとも一部、例えばヒンジ領域、例えばIgG4ヒンジ領域、ならびに/またはCH1/CLおよび/もしくはFc領域をさらに含む。いくつかの態様において、定常領域またはその部分は、IgG4またはIgG1などのヒトIgGのものである。いくつかの局面において、定常領域の一部は、抗原認識成分、例えばscFvと膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域として機能する。スペーサーは、スペーサーが存在しない場合と比較して、抗原結合後の細胞の応答性の増大をもたらす長さのものであり得る。例示的なスペーサーとしては、Hudecek et al.（2013）Clin.Cancer Res.,19:3153、国際公開公報第2014031687号、米国特許第8,822,647号、または米国特許出願公開第2014/0271635号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、定常領域またはその部分は、IgG4またはIgG1などのヒトIgGのものである。いくつかの態様において、スペーサーは、配列ESKYGPPCPPCP（SEQ ID NO:1に示す）を有し、SEQ ID NO:2に示される配列によってコードされる。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:3に示される配列を有する。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:4に示される配列を有する。いくつかの態様において、定常領域またはその部分はIgDのものである。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:5に示される配列を有する。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:1、3、4または5のいずれかと少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸配列を有する。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:25〜33に示される配列を有する。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:25〜33のいずれかと少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸配列を有する。
いくつかの態様において、抗原受容体は、細胞外ドメインに直接または間接的に連結された細胞内ドメインを含む。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを連結する膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインはITAMを含む。例えば、いくつかの局面において、抗原認識ドメイン（例えば細胞外ドメイン）は一般に、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分、例えばCARの場合には、TCR複合体などの抗原受容体複合体を介して活性化を模倣し、および/または別の細胞表面受容体を介してシグナル伝達するシグナル伝達成分に連結されている。いくつかの態様において、キメラ受容体は、細胞外ドメイン（例えばscFv）と細胞内シグナル伝達ドメインとの間に連結または融合された膜貫通ドメインを含む。したがって、いくつかの態様において、抗原結合成分（例えば抗体）は、1つまたは複数の膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインに連結されている。
一態様において、受容体、例えばCAR中のドメインの1つと天然に関連する膜貫通ドメインが使用される。いくつかの場合には、膜貫通ドメインは、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへのかかるドメインの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限に抑えるように選択されるかまたはアミノ酸置換によって改変される。
いくつかの態様における膜貫通ドメインは、天然の供給源または合成供給源のいずれかに由来する。供給源が天然である場合、いくつかの局面におけるドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、T細胞受容体、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154のα鎖、β鎖またはζ鎖に由来する（すなわち少なくともその膜貫通領域（1つまたは複数）を含む）ものを含む。あるいは、いくつかの態様における膜貫通ドメインは合成である。いくつかの局面において、合成膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を主に含む。いくつかの局面において、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各末端にみられる。いくつかの態様において、結合は、リンカー、スペーサー、および/または膜貫通ドメイン（1つまたは複数）による。いくつかの局面において、膜貫通ドメインはCD28の膜貫通部分を含む。
いくつかの態様において、細胞外ドメインと膜貫通ドメインは直接または間接的に連結され得る。いくつかの態様において、細胞外ドメインと膜貫通ドメインは、本明細書に記載されるものなどのスペーサーによって連結されている。いくつかの態様において、受容体は、膜貫通ドメインが由来する分子の細胞外部分、例えばCD28細胞外部分を含む。
細胞内シグナル伝達ドメインの中には、天然の抗原受容体を介するシグナル、共刺激受容体と組み合わせたかかる受容体を介するシグナル、および/または共刺激受容体のみを介するシグナルを模倣するまたはそれらに近似するものがある。いくつかの態様において、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、例えばグリシンおよびセリンを含むもの、例えばグリシン-セリンダブレットなどの2〜10アミノ酸長のリンカーが存在し、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間の結合を形成する。
T細胞活性化は、いくつかの局面において、2つのクラスの細胞質シグナル伝達配列:TCRを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）、および抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルを提供するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると説明される。いくつかの局面において、CARは、かかるシグナル伝達成分の一方または両方を含む。
受容体、例えばCARは、一般に少なくとも1つの細胞内シグナル伝達成分を含む。いくつかの局面において、CARは、TCR複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激性に作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはITAMとして公知のシグナル伝達モチーフを含み得る。一次細胞質シグナル伝達配列を含むITAMの例としては、CD3ζ鎖、FcRγ、CD3γ、CD3δおよびCD3εに由来するものが挙げられる。いくつかの態様において、CAR中の細胞質シグナル伝達分子（1つまたは複数）は、細胞質シグナル伝達ドメイン、その一部、またはCD3ζに由来する配列を含む。
いくつかの態様において、受容体は、T細胞活性化および細胞毒性を媒介するTCR CD3鎖、例えばCD3ζ鎖などの、TCR複合体の細胞内成分を含む。したがって、いくつかの局面において、抗原結合部分は1つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結されている。いくつかの態様において、細胞シグナル伝達モジュールは、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナル伝達ドメイン、および/または他のCD3膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、受容体、例えばCARは、Fc受容体γ、CD8、CD4、CD25、またはCD16などの1つまたは複数の追加の分子の一部をさらに含む。例えば、いくつかの局面において、CARまたは他のキメラ受容体は、CD3ゼータ（CD3ζ）またはFc受容体γとCD8、CD4、CD25またはCD16との間のキメラ分子を含む。
いくつかの態様において、CARまたは他のキメラ受容体の連結時に、受容体の細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞、例えばCARを発現するように操作されたT細胞の正常なエフェクター機能または応答の少なくとも1つを活性化する。例えば、いくつかの状況において、CARは、T細胞の機能、例えば細胞溶解活性またはTヘルパー活性、例えばサイトカインまたは他の因子の分泌を誘導する。いくつかの態様において、抗原受容体成分または共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分は、例えばそれがエフェクター機能シグナルを伝達する場合、無傷の免疫刺激鎖の代わりに使用される。いくつかの態様において、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞受容体（TCR）の細胞質配列、およびいくつかの局面において、天然の状況でかかる受容体と協調的に作用して、抗原受容体係合後にシグナル伝達を開始する共受容体のものも含む。
天然のTCRの状況では、完全な活性化は一般に、TCRを介したシグナル伝達だけでなく、共刺激シグナルも必要とする。したがって、いくつかの態様において、完全な活性化を促進するために、二次シグナルまたは共刺激シグナルを生成するための成分もCARに含まれる。他の態様では、CARは、共刺激シグナルを生成するための成分を含まない。いくつかの局面において、追加のCARが同じ細胞中で発現され、二次シグナルまたは共刺激シグナルを生成するための成分を提供する。
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、T細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含む。いくつかの態様において、CARは、CD28、4-1BB、OX40、DAP10、およびICOSなどの共刺激受容体のシグナル伝達ドメインおよび/または膜貫通部分を含む。いくつかの局面において、同じCARが活性化成分と共刺激成分の両方を含む。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、T細胞共刺激分子またはその機能性の変異体に由来する細胞内ドメインを、例えば膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に含む。いくつかの局面において、T細胞共刺激分子はCD28または41BBである。
いくつかの態様において、活性化ドメインは1つのCAR内に含まれ、一方共刺激成分は、別の抗原を認識する別のCARによって提供される。いくつかの態様において、CARは、ともに同じ細胞上に発現される、活性化または刺激性CAR、共刺激性CARを含む（国際公開公報第2014/055668号参照）。いくつかの局面において、細胞は、1つまたは複数の刺激性または活性化CARおよび/または共刺激CARを含む。いくつかの態様において、細胞は、阻害性CAR（iCAR、Fedorov et al.,Sci.Transl.Medicine,5（215）（December,2013）参照、例えば疾患もしくは病態に関連するおよび/または疾患もしくは病態に特異的な抗原以外の抗原を認識するCARをさらに含み、それにより、疾患標的指向CARを介して送達される活性化シグナルが、阻害性CARのそのリガンドへの結合によって減少または阻害されて、例えばオフターゲット効果が低減される。
いくつかの態様において、2つの受容体はそれぞれ、細胞への活性化シグナルおよび阻害性シグナルを誘導し、その結果、一方の受容体によるその抗原への結合は、細胞を活性化するまたは応答を誘導するが、第2の阻害性受容体によるその抗原への結合は、その応答を抑制または減弱させるシグナルを誘導する。例は、活性化CARと阻害性CAR（iCAR）の組合せである。かかる戦略は、例えば、活性化CARが、疾患または病態において発現されるが正常細胞上でも発現される抗原に結合し、阻害性受容体が、正常細胞上で発現されるが疾患または病態の細胞上では発現されない別の抗原に結合する状況で、オフターゲット効果の可能性を低減するために使用され得る。
いくつかの局面において、キメラ受容体は、阻害性CAR（例えばiCAR）であるか、または阻害性CAR（例えばiCAR）を含み、ならびに細胞内のITAMおよび/または共刺激促進応答などの免疫応答を減弱または抑制する細胞内成分を含む。かかる細胞内シグナル伝達成分の例は、PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受容体、A2ARを含むEP2/4アデノシン受容体を含む、免疫チェックポイント分子上にみられるものである。いくつかの局面において、操作された細胞は、かかる阻害分子のシグナル伝達ドメインまたはかかる阻害分子に由来するシグナル伝達ドメインを含む阻害性CARを含み、その結果、例えば活性化および/または共刺激CARによって誘導される細胞の応答を減弱させる働きをする。
一部の特定の態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3（例えばCD3ζ）細胞内ドメインに連結されたCD28膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ζ細胞内ドメインに連結された、キメラCD28およびCD137（4-1BB、TNFRSF9）共刺激ドメインを含む。
いくつかの態様において、CARは、細胞質部分に1つまたは複数、例えば2つまたはそれより多くの共刺激ドメインおよび活性化ドメイン、例えば一次活性化ドメインを包含する。例示的なCARは、CD3ζ、CD28、および4-1BBの細胞内成分を含む。
いくつかの態様において、抗原受容体は、CARまたは他の抗原受容体を発現するマーカーおよび/または細胞をさらに含み、受容体を発現するための細胞の形質導入または操作を確認するために使用され得る、細胞表面マーカーなどの代理マーカーをさらに含む。いくつかの局面において、マーカーは、CD34、NGFR、または上皮成長因子受容体の全部または一部（例えば短縮型）、例えばかかる細胞表面受容体の短縮型バージョン（例えばtEGFR）を含む。いくつかの態様において、マーカーをコードする核酸は、切断可能なリンカー配列、例えばT2Aなどのリンカー配列をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結される。例えば、マーカー、および任意でリンカー配列は、国際公開公報第2014031687号に開示されている任意のものであり得る。例えば、マーカーは、任意でリンカー配列、例えばT2A切断可能リンカー配列に連結された短縮型EGFR（tEGFR）であり得る。
短縮型EGFR（例えばtEGFR）の例示的なポリペプチドは、SEQ ID NO:7もしくは16に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:7もしくは16と少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。例示的なT2Aリンカー配列は、SEQ ID NO:6もしくは17に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:6もしくは17と少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、マーカーは、T細胞上に天然ではみられない、もしくはT細胞の表面上に天然ではみられない分子、例えば細胞表面タンパク質、またはその一部分である。いくつかの態様において、分子は非自己分子、例えば非自己タンパク質、すなわち細胞が養子移入される宿主の免疫系によって「自己」として認識されないものである。
いくつかの態様において、マーカーは、治療機能を果たさない、および/または例えば、成功裏に操作された細胞を選択するための遺伝子操作のマーカーとして使用されること以外の効果はもたらさない。他の態様において、マーカーは、治療用分子または何らかの所望の効果を奏する分子、例えば細胞がインビボで遭遇するリガンド、例えば養子移入時またはリガンドとの遭遇時に細胞の応答を増強するおよび/または減弱させる共刺激分子または免疫チェックポイント分子であり得る。
いくつかの場合には、CARは、第1、第2、および/または第3世代のCARと称される。いくつかの局面において、第1世代のCARは、抗原結合するとCD3鎖誘導シグナルのみを提供するものである;いくつかの局面において、第2世代のCARは、かかるシグナルと共刺激シグナルを提供するもの、例えばCD28またはCD137などの共刺激受容体由来の細胞内シグナル伝達ドメインを含むものである;いくつかの局面において、第3世代のCARは、異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むものである。
例えば、いくつかの態様において、CARは、記載されているいずれかを含む抗原に特異的な抗体、例えばscFvなどの抗体断片、CD28の膜貫通部分またはその機能性の変異体であるかまたはそれを含む膜貫通ドメイン、ならびにCD28のシグナル伝達部分またはその機能性の変異体およびCD3ζのシグナル伝達部分またはその機能性の変異体を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。いくつかの態様において、CARは、記載されているいずれかを含む抗原に特異的な抗体、例えばscFvなどの抗体断片、CD28の膜貫通部分またはその機能性の変異体であるかまたはそれを含む膜貫通ドメイン、ならびに4-1BBのシグナル伝達部分またはその機能性の変異体およびCD3ζのシグナル伝達部分またはその機能性の変異体を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含有する。いくつかのかかる態様において、受容体は、ヒトIg分子などのIg分子の一部、例えばIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジを含有するスペーサー、例えばヒンジのみのスペーサーをさらに含む。
いくつかの態様において、組換え受容体、例えばCARの膜貫通ドメインは、ヒトCD28の膜貫通ドメイン（例えばアクセッション番号P01747.1）またはその変異体、例えばSEQ ID NO:8に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:8と少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインであるか、またはそれを含む;いくつかの態様において、組換え受容体の膜貫通ドメイン含有部分は、SEQ ID NO:9に示されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも85％もしくは約85％、少なくとも86％もしくは約86％、少なくとも87％もしくは約87％、少なくとも88％もしくは約88％、少なくとも89％もしくは約89％、少なくとも90％もしくは約90％、少なくとも91％もしくは約91％、少なくとも92％もしくは約92％、少なくとも93％もしくは約93％、少なくとも94％もしくは約94％、少なくとも95％もしくは約95％、少なくとも96％もしくは約96％、少なくとも97％もしくは約97％、少なくとも98％もしくは約98％、少なくとも99％もしく約99％、もしくはそれより高い配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、組換え受容体、例えばCARの細胞内シグナル伝達成分（1つまたは複数）は、ヒトCD28の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性の変異体もしくは部分、例えば天然CD28タンパク質の186〜187位にLLからGGへの置換を有するドメインを含む。例えば、細胞内シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:10もしくは11に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:10もしくは11と少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸配列を含み得る。いくつかの態様において、細胞内ドメインは、4-1BB（例えばアクセッション番号Q07011.1）の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性の変異体もしくは部分、例えばSEQ ID NO:12に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:12と少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、組換え受容体、例えばCARの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ζ刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能性の変異体、例えばヒトCD3ζのアイソフォーム3（アクセッション番号P20963.2）の112AA細胞質ドメイン、または米国特許第7,446,190号もしくは米国特許第8,911,993号に記載されているCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。例えば、いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、SEQ ID NO:13、14もしくは15に示されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:13、14もしくは15と少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの局面において、スペーサーは、IgGのヒンジ領域のみ、例えばIgG4またはIgG1のヒンジのみ、例えばSEQ ID NO:1に示されるヒンジのみのスペーサーを含む。他の態様において、スペーサーは、任意でCH2および/またはCH3ドメインに連結されたIgヒンジ、例えばIgG4由来のヒンジであるか、または該ヒンジを含む。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:4に示されるような、CH2およびCH3ドメインに連結されたIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジである。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:3に示されるような、CH3ドメインのみに連結されたIgヒンジ、例えばIgG4ヒンジである。いくつかの態様において、スペーサーは、グリシン-セリンリッチ配列または他のフレキシブルリンカー、例えば公知のフレキシブルリンカーであるか、またはそれを含む。
例えば、いくつかの態様において、CARは、scFvを含む抗体断片などの抗体、スペーサー、例えば重鎖分子のヒンジ領域および/または1つもしくは複数の定常領域などの免疫グロブリン分子の一部を含有するスペーサー、例えばIgヒンジ含有スペーサー、CD28由来の膜貫通ドメインの全部または一部を含有する膜貫通ドメイン、CD28由来の細胞内シグナル伝達ドメイン、ならびにCD3ζシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、CARは、抗体またはscFvなどの断片、任意のIgヒンジ含有スペーサーなどのスペーサー、CD28由来の膜貫通ドメイン、4-1BB由来の細胞内シグナル伝達ドメイン、およびCD3ζ由来のシグナル伝達ドメインを含む。
例示的な代理マーカーは、短縮型の細胞表面ポリペプチド、例えば、非機能性であり、シグナルもしくは完全長型の細胞表面ポリペプチドによって通常形質導入されるシグナルを形質導入しないかもしくは形質導入することができない、ならびに/またはインターナライズしないかもしくはインターナライズすることができない短縮型を含み得る。短縮型の成長因子または他の受容体、例えば短縮型ヒト上皮成長因子受容体2（tHER2）、短縮型上皮成長因子受容体（tEGFR、7もしくは16に示される例示的なtEGFR配列）、または前立腺特異的膜抗原（PSMA）もしくはその修飾形態を含む例示的な短縮型表面ポリペプチド。tEGFRは、抗体セツキシマブ（Erbitux（登録商標））または他の治療用抗EGFR抗体または結合分子によって認識されるエピトープを含んでもよく、これは、tEGFR構築物およびコードされる外因性タンパク質を発現するように、ならびに/またはコードされる外因性タンパク質を発現する細胞を排除または分離するように、操作された細胞を同定または選択するために使用できる。米国特許第8,802,374号およびLiu et al.,Nature Biotech.2016 April;34（4）:430-434参照）。いくつかの局面において、マーカー、例えば代理マーカーは、CD34、NGFR、CD19または短縮型CD19、例えば短縮型非ヒトCD19、または上皮成長因子受容体（例えばtEGFR）の全部または一部（例えば短縮型）を含む。いくつかの態様において、マーカーは、蛍光タンパク質、例えば緑色蛍光タンパク質（GFP）、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）、例えばスーパーフォールドGFP（sfGFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、例えばtdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRedまたはDsRed2、シアン蛍光タンパク質（CFP）、青緑色蛍光タンパク質（BFP）、高感度青色蛍光タンパク質（EBFP）、および黄色蛍光タンパク質（YFP）、ならびに蛍光タンパク質の種変異体、単量体変異体、およびコドン最適化および/または高感度変異体を含むその変異体であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、マーカーは、酵素、例えばルシフェラーゼ、大腸菌（E.coli）由来のlacZ遺伝子、アルカリホスファターゼ、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（SEAP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）であるか、またはそれを含む。例示的な発光レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ（luc）、β-ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β-グルクロニダーゼ（GUS）またはその変異体が挙げられる。
いくつかの態様において、マーカーは選択マーカーである。いくつかの態様において、選択マーカーは、外因性作用物質または薬物に対する耐性を付与するポリペプチドであるか、または該ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの態様において、選択マーカーは、哺乳動物細胞に抗生物質耐性を付与する抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの態様において、選択マーカーは、ピューロマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ブラスチシジン耐性遺伝子、ネオマイシン耐性遺伝子、ジェネティシン耐性遺伝子もしくはゼオシン耐性遺伝子もしくはその修飾形態であるか、またはそれを含む。
いくつかの態様において、マーカーをコードする核酸は、切断可能なリンカー配列、例えばT2Aなどのリンカー配列をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結されている。例えば、マーカー、および任意でリンカー配列は、国際公開公報第2014031687号に開示されている任意のものであり得る。
いくつかの態様において、かかるCAR構築物をコードする核酸分子は、T2Aリボソームスキップエレメントおよび/またはtEGFR配列をコードする配列を、例えばCARをコードする配列の下流にさらに含む。いくつかの態様では、配列は、SEQ ID NO:6もしくは17に示されるT2Aリボソームスキップエレメント、またはSEQ ID NO:6もしくは17と少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸配列をコードする。いくつかの態様において、抗原受容体（例えばCAR）を発現するT細胞はまた、短縮型EGFR（EGFRt）を非免疫原性選択エピトープとして発現するように生成することもでき（例えば同じ構築物から2つのタンパク質を発現するためにT2Aリボソームスイッチによって隔てられたCARとEGFRtをコードする構築物の導入によって）、これはその後、かかる細胞を検出するためのマーカーとして使用することができる（例えば米国特許第8,802,374号参照）。いくつかの態様において、配列は、SEQ ID NO:7もしくは16に示されるtEGFR配列、またはSEQ ID NO:7もしくは16と少なくとも85％、少なくとも86％、少なくとも87％、少なくとも88％、少なくとも89％、少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％もしくはそれより高い配列同一性を示すアミノ酸配列をコードする。いくつかの場合において、T2Aなどのペプチドは、リボソームに2AエレメントのC末端におけるペプチド結合の合成をスキップさせることができ（リボソームスキップ機構）、2A配列の末端と下流の次のペプチドとの間の分離をもたらす（例えばde Felipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13（2004）およびdeFelipe et al.Traffic 5:616-626（2004）参照）。多くの2Aエレメントが公知である。本明細書で開示される方法および核酸において使用できる2A配列の例としては、限定されることなく、米国特許出願公開第20070116690号に記載されている口蹄疫ウイルス（F2A、例えばSEQ ID NO:21）、ウマ鼻炎Aウイルス（E2A、例えばSEQ ID NO:20）、トセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（T2A、例えばSEQ ID NO:6または17）、およびブタテスコウイルス1（P2A、例えばSEQ ID NO:18または19）からの2A配列。
一部の状況において、組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸配列は、シグナルペプチドをコードするシグナル配列を含有する。シグナルペプチドの非限定的な例示的な例としては、例えば、SEQ ID NO;62に記載されており、およびSEQ ID NO:61に記載されているヌクレオチド配列によってコードされるGMCSFRα鎖シグナルペプチド、SEQ ID NO:60に記載されているCD8αシグナルペプチドまたはSEQ ID NO:59に記載されているCD33シグナルペプチドが挙げられる。
対象に投与される細胞によって発現されるCARなどの組換え受容体は、一般に、処置される疾患もしくは病態またはその細胞において発現される、処置される疾患もしくは病態またはその細胞に関連する、および/または処置される疾患もしくは病態またはその細胞に特異的な分子を認識するまたは該分子に特異的に結合する。分子、例えば抗原に特異的に結合すると、受容体は一般に、ITAM形質導入シグナルなどの免疫刺激シグナルを細胞内に送達し、それにより、疾患または病態を標的とする免疫応答を促進する。例えば、いくつかの態様において、細胞は、疾患もしくは病態の細胞もしくは組織によって発現されるか、または疾患もしくは病態に関連する抗原に特異的に結合するCARを発現する。
B.TCR
いくつかの態様において、腫瘍の抗原、ウイルスまたは自己免疫タンパク質などの標的ポリペプチドのペプチドエピトープまたはT細胞エピトープを認識するT細胞受容体（TCR）またはその抗原結合部分を発現する、T細胞などの操作された細胞が提供される。
いくつかの態様において、「T細胞受容体」または「TCR」は、可変α鎖およびβ鎖（それぞれTCRαおよびTCRβとしても知られる）または可変γ鎖およびδ鎖（それぞれTCRαおよびTCRβとしても知られる）またはそれらの抗原結合部分を含み、MHC分子に結合したペプチドに特異的に結合することができる分子である。いくつかの態様において、TCRはαβ形態である。典型的には、αβおよびγδ形態で存在するTCRは、一般に構造的に類似するが、それらを発現するT細胞は異なる解剖学的位置または機能を有し得る。TCRは、細胞の表面上にまたは可溶性形態で認められ得る。一般に、TCRは、それが一般に主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子に結合した抗原を認識することに関与する場合、T細胞（またはTリンパ球）の表面上にみられる。
特に明記されない限り、「TCR」という用語は、完全なTCR、ならびにその抗原結合部分または抗原結合断片を包含すると理解されるべきである。いくつかの態様において、TCRは、αβ形態またはγδ形態のTCRを含む、無傷または完全長のTCRである。いくつかの態様において、TCRは、完全長未満のTCRであるが、MHC分子に結合した特定のペプチドに結合する、例えばMHC-ペプチド複合体に結合する抗原結合部分である。いくつかの場合において、TCRの抗原結合部分または断片は、完全長または無傷のTCRの構造ドメインの一部のみを含み得るが、それでもなお、完全なTCRが結合するペプチドエピトープ、例えばMHC-ペプチド複合体に結合することができる。いくつかの場合において、抗原結合部分は、特定のMHC-ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分なTCRの可変ドメイン、例えばTCRの可変α鎖および可変β鎖を含む。一般に、TCRの可変鎖は、ペプチド、MHCおよび/またはMHC-ペプチド複合体の認識に関与する相補性決定領域を含む。
いくつかの態様において、TCRの可変ドメインは、一般に抗原認識ならびに結合能力および特異性に対する主な寄与因子である、超可変ループまたは相補性決定領域（CDR）を含む。いくつかの態様において、TCRのCDRまたはそれらの組合せは、所与のTCR分子の抗原結合部位の全部または実質的に全部を形成する。TCR鎖の可変領域内の様々なCDRは、一般に、CDRと比較してTCR分子間で一般により少ない変動性を示すフレームワーク領域（FR）によって隔てられている（例えばJores et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990;Chothia et al.,EMBO J.7:3745,1988参照;またLefranc et al.,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003も参照のこと）。いくつかの態様において、CDR3は、抗原結合もしくは特異性に関与する主なCDRであるか、または抗原認識および/もしくはペプチド-MHC複合体のプロセシングされたペプチド部分との相互作用のために、所与のTCR可変領域上の3つのCDRのうちで最も重要である。いくつかの状況では、α鎖のCDR1は、特定の抗原ペプチドのN末端部分と相互作用することができる。いくつかの状況では、β鎖のCDR1は、ペプチドのC末端部分と相互作用することができる。いくつかの状況では、CDR2は、MHC-ペプチド複合体のMHC部分との相互作用またはMHC部分の認識に最も強く寄与するか、または関与する主要なCDRである。いくつかの態様において、β鎖の可変領域は、一般にスーパー抗原結合に関与し、抗原認識には関与しないさらなる超可変領域（CDR4またはHVR4）を含み得る（Kotb（1995）Clinical Microbiology Reviews,8:411-426）。
いくつかの態様において、TCRはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメインおよび/または短い細胞質尾部を含み得る（例えば、Janeway et al.,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,3rd Ed.,Current Biology Publications,p.4:33,1997参照）。いくつかの局面において、TCRの各々の鎖は、1つのN末端免疫グロブリン可変ドメイン、1つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびC末端の短い細胞質尾部を有し得る。いくつかの態様において、TCRは、シグナル伝達の媒介に関与するCD3複合体の不変タンパク質と会合する。
いくつかの態様において、TCR鎖は、1つまたは複数の定常ドメインを含む。例えば、所与のTCR鎖（例えばα鎖またはβ鎖）の細胞外部分は、2つの免疫グロブリン様ドメイン、例えば可変ドメイン（例えばVαまたはVβ;典型的にはKabat番号付けに基づき鎖のアミノ酸1〜116、Kabat et al.,“Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,Public Health Service National Institutes of Health,1991,5th ed.）、および細胞膜に隣接する定常ドメイン（例えばα鎖定常ドメインもしくはCα、典型的にはKabat番号付けに基づき鎖の117〜259位、またはβ鎖定常ドメインもしくはCβ、典型的にはKabatに基づき鎖の117〜295位）を含み得る。例えば、いくつかの場合において、2本の鎖によって形成されるTCRの細胞外部分は、2つの膜近位定常ドメイン、および2つの膜遠位可変ドメインを含み、これらの可変ドメインはそれぞれCDRを含む。TCRの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、それにより、TCRの2本の鎖を連結する短い接続配列を含み得る。いくつかの態様において、TCRは、定常ドメイン内に2つのジスルフィド結合を含むように、α鎖およびβ鎖のそれぞれに追加のシステイン残基を有し得る。
いくつかの態様において、TCR鎖は膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは正に帯電している。いくつかの場合において、TCR鎖は細胞質尾部を含む。いくつかの場合において、該構造は、TCRがCD3およびそのサブユニットのような他の分子と会合することを可能にする。例えば、膜貫通領域を有する定常ドメインを含むTCRは、タンパク質を細胞膜に固定し、CD3シグナル伝達装置または複合体の不変サブユニットと会合し得る。CD3シグナル伝達サブユニット（例えばCD3γ、CD3δ、CD3εおよびCD3ζ鎖）の細胞内尾部は、TCR複合体のシグナル伝達能力に関与する1つまたは複数の免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフまたはITAMを含む。
いくつかの態様において、TCRは、2本の鎖αおよびβ（または任意でγおよびδ）のヘテロ二量体であり得るか、または単鎖TCR構築物であり得る。いくつかの態様において、TCRは、1つまたは複数のジスルフィド結合などによって連結されている2本の別々の鎖（α鎖とβ鎖またはγ鎖とδ鎖）を含むヘテロ二量体である。
いくつかの態様において、TCRは、実質的に完全長のコード配列が容易に利用可能であるVα,β鎖の配列などの公知のTCR配列（1つまたは複数）から生成することができる。細胞供給源から、V鎖配列を含む完全長TCR配列を得るための方法は周知である。いくつかの態様において、TCRをコードする核酸は、所与の1つまたは複数の細胞内のもしくは細胞から単離されたTCRコード核酸のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅、または公的に入手可能なTCR DNA配列の合成などによって、様々な供給源から得ることができる。
いくつかの態様において、TCRは、生物学的供給源から、例えばT細胞（例えば細胞傷害性T細胞）などの細胞、T細胞ハイブリドーマ、または他の公的に入手可能な供給源から得られる。いくつかの態様において、T細胞は、インビボで単離された細胞から得ることができる。いくつかの態様において、TCRは胸腺から選択されたTCRである。いくつかの態様において、TCRはネオエピトープ拘束性TCRである。いくつかの態様において、T細胞は、培養されたT細胞ハイブリドーマまたはクローンであり得る。いくつかの態様において、TCRまたはその抗原結合部分またはその抗原結合断片は、TCRの配列の知識から合成的に生成することができる。
いくつかの態様において、TCRは、その標的ポリペプチド抗原または標的T細胞エピトープに対して候補TCRのライブラリーをスクリーニングすることから同定または選択されたTCRから生成される。TCRライブラリーは、PBMC、脾臓または他のリンパ系器官に存在する細胞を含む、対象から単離されたT細胞からのVαおよびVβのレパートリーの増幅によって生成することができる。いくつかの場合において、T細胞は腫瘍浸潤リンパ球（TIL）から増幅することができる。いくつかの態様において、TCRライブラリーは、CD4＋またはCD8＋細胞から生成することができる。いくつかの態様において、TCRは、正常なまたは健康な対象のT細胞供給源、すなわち正常なTCRライブラリーから増幅することができる。いくつかの態様において、TCRは、罹患対象のT細胞供給源、すなわち罹患TCRライブラリーから増幅することができる。いくつかの態様において、縮重プライマーを使用して、ヒトから得られたT細胞などの試料におけるRT-PCRなどによって、VαおよびVβの遺伝子レパートリーを増幅する。いくつかの態様において、scTvライブラリーは、増幅産物がクローニングされるかまたはリンカーによって隔てられるように構築されるナイーブVαおよびVβライブラリーから構築することができる。対象および細胞の供給源に依存して、ライブラリーはHLA対立遺伝子特異的であり得る。あるいは、いくつかの態様において、TCRライブラリーは、親または骨格TCR分子の突然変異誘発または多様化によって生成することができる。いくつかの局面において、TCRは、例えばα鎖またはβ鎖の突然変異誘発などによる指向性進化に供される。いくつかの局面では、TCRのCDR内の特定の残基が改変されている。いくつかの態様において、選択されたTCRを親和性成熟によって改変することができる。いくつかの態様において、ペプチドに対するCTL活性を評価するためのスクリーニングなどによって、抗原特異的T細胞を選択し得る。いくつかの局面において、TCR、例えば抗原特異的T細胞上に存在するTCRは、結合活性、例えば抗原に対する特定の親和性またはアビディティなどによって選択し得る。
いくつかの態様において、TCRまたはその抗原結合部分は、修飾または操作されているものである。いくつかの態様において、指向性進化法を使用して、特定のMHC-ペプチド複合体に対するより高い親和性などの変化した特性を有するTCRを生成する。いくつかの態様において、指向性進化は、酵母ディスプレイ（Holler et al.（2003）Nat Immunol,4,55-62;Holler et al.,（2000）Proc Natl Acad Sci USA,97,5387-92）、ファージディスプレイ（Li et al.（2005）Nat Biotechnol,23,349-54）、またはT細胞ディスプレイ（Chervin et al.（2008）J Immunol Methods,339,175-84）を含むがこれらに限定されるわけではないディスプレイ法によって達成される。いくつかの態様において、ディスプレイアプローチは、公知のTCR、親TCR、または参照TCRを操作するまたは修飾することを含む。例えば、いくつかの場合において、野生型TCRを、CDRの1つまたは複数の残基が変異している変異誘発されたTCRを生成するための鋳型として使用することができ、所望の標的抗原に対するより高い親和性などの所望の改変された特性を有する変異体を選択する。
いくつかの態様において、関心対象のTCRを作製または生成する際に使用するための標的ポリペプチドのペプチドは、公知であるかまたは容易に同定することができる。いくつかの態様において、TCRまたは抗原結合部分を生成する際に使用するのに適したペプチドは、関心対象の標的ポリペプチド、例えば下記の標的ポリペプチド中のHLA拘束性モチーフの存在に基づいて決定することができる。いくつかの態様において、ペプチドは、利用可能なコンピュータ予測モデルを使用して同定される。いくつかの態様において、MHCクラスI結合部位を予測するために、かかるモデルとしては、ProPred1（Singh and Raghava（2001）Bioinformatics 17（12）:1236-1237）、およびSYFPEITHI（Schuler et al.（2007）Immunoinformatics Methods in Molecular Biology,409（1）:75-93 2007）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、MHC拘束性エピトープは、全白人の約39〜46％で発現されるHLA-A0201であり、したがって、TCRまたは他のMHC-ペプチド結合分子を調製するのに使用するためのMHC抗原の適切な選択である。
コンピュータ予測モデルを用いたHLA-A0201結合モチーフならびにプロテアソームおよび免疫プロテアソームの切断部位は公知である。MHCクラスI結合部位を予測するために、かかるモデルとしては、ProPred1（Singh and Raghava,ProPred:prediction of HLA-DR binding sites.BIOINFORMATICS 17（12）:1236-1237 2001により詳細に記載されている）、およびSYFPEITHI（Schuler et al.SYFPEITHI,Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction.in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology,vol 409（1）:75-93 2007参照）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
いくつかの態様において、TCRまたはその抗原結合部分は、結合特性などの1つまたは複数の特性が改変されている、組換え生産された天然タンパク質またはその変異形態であり得る。いくつかの態様において、TCRは、ヒト、マウス、ラット、または他の哺乳動物などの様々な動物種の1つに由来し得る。TCRは細胞結合形態でも可溶性形態でもよい。いくつかの態様において、提供される方法の目的のために、TCRは、細胞の表面上に発現される細胞結合形態である。
いくつかの態様において、TCRは完全長TCRである。いくつかの態様において、TCRは抗原結合部分である。いくつかの態様において、TCRは二量体TCR（dTCR）である。いくつかの態様において、TCRは単鎖TCR（sc-TCR）である。いくつかの態様において、dTCRまたはscTCRは、国際公開公報第03/020763号、国際公開公報第04/033685号、国際公開公報第2011/044186号に記載されている構造を有する。
いくつかの態様において、TCRは膜貫通配列に対応する配列を含む。いくつかの態様において、TCRは細胞質配列に対応する配列を含む。いくつかの態様において、TCRは、CD3とTCR複合体を形成することができる。いくつかの態様において、dTCRまたはscTCRを含む任意のTCRは、T細胞の表面上に活性TCRを生じるシグナル伝達ドメインに連結され得る。いくつかの態様において、TCRは細胞の表面上に発現される。
いくつかの態様において、dTCRは、TCR α鎖可変領域配列に対応する配列がTCR α鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のN末端に融合している第1のポリペプチド、およびTCR β鎖可変領域配列に対応する配列がTCR β鎖定常領域細胞外配列に対応する配列のN末端に融合している第2のポリペプチドを含み、第1のポリペプチドと第2のポリペプチドはジスルフィド結合によって連結されている。いくつかの態様において、結合は、天然の二量体αβTCR中に存在する天然の鎖間ジスルフィド結合に対応し得る。いくつかの態様において、鎖間ジスルフィド結合は、天然のTCRには存在しない。例えば、いくつかの態様において、1つまたは複数のシステインをdTCRポリペプチド対の定常領域細胞外配列に組み込むことができる。いくつかの場合において、天然および非天然の両方のジスルフィド結合が望ましいことがあり得る。いくつかの態様において、TCRは、膜に固定するための膜貫通配列を含む。
いくつかの態様において、dTCRは、可変αドメイン、定常αドメイン、および定常αドメインのC末端に結合した第1の二量体化モチーフを含むTCR α鎖、ならびに可変βドメイン、定常βドメイン、および定常βドメインのC末端に結合した第1の二量体化モチーフを含むTCR β鎖を含み、ここで、第1と第2の二量体化モチーフは容易に相互作用して、第1の二量体化モチーフ中のアミノ酸と第2の二量体化モチーフ中のアミノ酸との間に共有結合を形成し、TCR α鎖とTCR β鎖を一緒に連結する。
いくつかの態様において、TCRはscTCRである。典型的には、scTCRは公知の方法を使用して生成することができる。例えば、Soo Hoo,W.F.et al.PNAS（USA）89,4759（1992）;Wulfing,C.and Pluckthun,A.,J.Mol.Biol.242,655（1994）;Kurucz,I.et al.PNAS（USA）90 3830（1993）;国際公開公報第96/13593号、同第96/18105号、同第99/60120号、同第99/18129号、同第03/020763号、同第2011/044186号;およびSchlueter,C.J.et al.,J.Mol.Biol.256,859（1996）参照。いくつかの態様において、scTCRは、TCR鎖の会合を促進するために導入された非天然ジスルフィド鎖間結合を含む（例えば国際公開公報第03/020763号参照）。いくつかの態様において、scTCRは、そのC末端に融合した異種ロイシンジッパーが鎖の会合を促進する、非ジスルフィド結合短縮型TCRである（例えば国際公開公報第99/60120号参照）。いくつかの態様において、scTCRは、ペプチドリンカーを介してTCR β可変ドメインに共有結合したTCR α可変ドメインを含む（例えば国際公開公報第99/18129号参照）。
いくつかの態様において、scTCRは、TCR α鎖可変領域に対応するアミノ酸配列によって構成される第1のセグメント、TCR β鎖定常ドメイン細胞外配列に対応するアミノ酸配列のN末端に融合したTCR β鎖可変領域配列に対応するアミノ酸配列によって構成される第2のセグメント、および第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列を含む。
いくつかの態様において、scTCRは、α鎖細胞外定常ドメイン配列のN末端に融合したα鎖可変領域配列によって構成される第1のセグメント、およびβ鎖細胞外定常配列および膜貫通配列のN末端に融合したβ鎖可変領域配列によって構成される第2のセグメント、および任意で、第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列を含む。
いくつかの態様において、scTCRは、β鎖細胞外定常ドメイン配列のN末端に融合したTCR β鎖可変領域配列によって構成される第1のセグメント、およびα鎖細胞外定常配列および膜貫通配列のN末端に融合されたα鎖可変領域配列によって構成される第2のセグメント、および任意で、第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列を含む。
いくつかの態様において、第1および第2のTCRセグメントを連結するscTCRのリンカーは、TCRの結合特異性を保持しながら、単一のポリペプチド鎖を形成することができる任意のリンカーであり得る。いくつかの態様において、リンカー配列は、例えば式-P-AA-P-を有してよく、式中、Pはプロリンであり、AAはアミノ酸配列を表し、アミノ酸はグリシンおよびセリンである。いくつかの態様において、第1および第2のセグメントは、その可変領域配列がかかる結合のために配向されるように対合される。したがって、いくつかの場合において、リンカーは、第1のセグメントのC末端と第2のセグメントのN末端との間、またはその逆の間の距離を橋渡しするのに十分な長さを有するが、scTCRの標的リガンドへの結合を遮断または低減するほどには長くない。いくつかの態様において、リンカーは、10〜45個のアミノ酸または約10〜約45個のアミノ酸、例えば10〜30個のアミノ酸または26〜41個のアミノ酸残基、例えば29、30、31もしくは32個のアミノ酸を含み得る。いくつかの態様において、リンカーは、式-PGGG-（SGGGG）5-P-を有し、式中、Pはプロリンであり、Gはグリシンであり、およびSはセリンである（SEQ ID NO:28）。いくつかの態様において、リンカーは、配列GSADDAKKDAAKKDGKS（SEQ ID NO:29）を有する。
いくつかの態様において、scTCRは、α鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基をβ鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基に連結する共有ジスルフィド結合を含む。いくつかの態様において、天然TCR中の鎖間ジスルフィド結合は存在しない。例えば、いくつかの態様において、1つまたは複数のシステインを、scTCRポリペプチドの第1および第2のセグメントの定常領域細胞外配列に組み込むことができる。いくつかの場合において、天然および非天然の両方のジスルフィド結合が望ましいことがあり得る。
導入された鎖間ジスルフィド結合を含むdTCRまたはscTCRのいくつかの態様において、天然のジスルフィド結合は存在しない。いくつかの態様において、天然の鎖間ジスルフィド結合を形成する天然のシステインの1つまたは複数は、セリンまたはアラニンなどの別の残基に置換されている。いくつかの態様において、導入されるジスルフィド結合は、第1および第2のセグメント上の非システイン残基をシステインに変異させることによって形成することができる。TCRの例示的な非天然ジスルフィド結合は、国際公開公報第2006/000830号に記載されている。
いくつかの態様において、TCRまたはその抗原結合断片は、10-5〜10-12Mまたは約10-5〜10-12Mならびにその中のすべての個々の値および範囲の、標的抗原に対する平衡結合定数の親和性を示す。いくつかの態様において、標的抗原はMHC-ペプチド複合体またはリガンドである。
いくつかの態様において、α鎖およびβ鎖などのTCRをコードする1つまたは複数の核酸は、PCR、クローニングまたは他の適切な手段によって増幅され得、適切な1つまたは複数の発現ベクターにクローニングされ得る。発現ベクターは、任意の適切な組換え発現ベクターであり得、任意の適切な宿主を形質転換またはトランスフェクトするために使用することができる。適切なベクターは、増殖および拡大のため、または発現のため、またはその両方のために設計されたもの、例えばプラスミドおよびウイルスを含む。
いくつかの態様において、ベクターは、pUCシリーズ（Fermentas Life Sciences）、pBluescriptシリーズ（Stratagene,LaJolla,Calif.）、pETシリーズ（Novagen,Madison,Wis.）、pGEXシリーズ（Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden）、またはpEXシリーズ（Clontech,Palo Alto,Calif.）のベクターであり得る。いくつかの場合において、バクテリオファージベクター、例えばλG10、λGT11、λZapII（Stratagene）、λEMBL4、およびλNM1149も使用することができる。いくつかの態様において、植物発現ベクターを使用することができ、これは、pBI01、pBI101.2、pBI101.3、pBI121およびpBIN19（Clontech）を含む。いくつかの態様において、動物発現ベクターは、pEUK-Cl、pMAMおよびpMAMneo（Clontech）を含む。いくつかの態様において、ウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターが使用される。
いくつかの態様において、組換え発現ベクターは、標準的な組換えDNA技術を用いて調製することができる。いくつかの態様において、ベクターは、適宜、該ベクターがDNAベースであるかRNAベースであるかを考慮に入れて、該ベクターが導入される宿主の種類（例えば細菌、真菌、植物、または動物）に特異的な転写および翻訳開始および終止コドンなどの調節配列を含み得る。いくつかの態様において、ベクターは、TCRまたは抗原結合部分（または他のMHC-ペプチド結合分子）をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結された非天然プロモーターを含み得る。いくつかの態様において、プロモーターは、非ウイルスプロモーターまたはウイルスプロモーター、例えばサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、SV40プロモーター、RSVプロモーター、およびマウス幹細胞ウイルスの長い末端反復配列中にみられるプロモーターであり得る。他の公知のプロモーターも企図される。
いくつかの態様において、TCRをコードするベクターを作製するために、α鎖およびβ鎖を、関心対象のTCRを発現するT細胞クローンから単離された全cDNAからPCR増幅し、発現ベクターにクローニングする。いくつかの態様において、α鎖とβ鎖は同じベクターにクローニングされる。いくつかの態様において、α鎖とβ鎖は異なるベクターにクローニングされる。いくつかの態様において、生成されたα鎖およびβ鎖は、レトロウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターに組み込まれる。
V.組成物、製剤、および投与方法
いくつかの態様において、セクションIで記載されるような、本明細書に提供される方法によって作製される濃縮T細胞のアウトプット組成物は、細胞療法、例えば養子細胞療法として投与される。特定の態様において、1つまたは複数の細胞組成物、例えば本明細書に記載のアウトプット細胞組成物は、細胞療法として投与される。いくつかの態様において、養子T細胞療法の方法は、例えばGruenbergらの米国特許出願公開第2003/0170238号;Rosenbergの米国特許第4,690,915号;Rosenberg（2011）Nat Rev Clin Oncol.8（10）:577-85）に記載されている。例えば、Themeli et al.（2013）Nat Biotechnol.31（10）:928-933;Tsukahara et al.（2013）Biochem Biophys Res Commun 438（1）:84-9;Davila et al.（2013）PLoS ONE 8（4）:e61338参照。
一部の特定の態様において、本明細書で提供される方法は、細胞療法として投与される単一の生物学的試料から単離、選択および/または濃縮されたインプット細胞から、濃縮T細胞の単一のアウトプット組成物を作製する。特定の態様において、単一のアウトプット組成物は、濃縮CD4＋T細胞の組成物である。一部の特定の態様において、単一のアウトプット組成物は、濃縮CD4＋およびCD8＋T細胞の組成物である。いくつかの態様において、本明細書で提供される方法は、単一の供給源、例えば生物学的試料および/または生物学的試料から単離、選択、もしくは濃縮されたインプット組成物から、対象に投与される2つまたはそれより多くのアウトプット組成物を作製する。いくつかの態様において、2つまたはそれより多くのアウトプット組成物は、対象に別々に投与される。一部の特定の態様において、2つまたはそれより多くのアウトプット組成物は、単一の組成物に組み合わされ、対象に投与される。一部の特定の態様において、2つまたはそれより多くのアウトプット組成物は、濃縮CD4＋T細胞のアウトプット組成物を含む。特定の態様において、2つまたはそれより多くのアウトプット組成物は、濃縮CD8＋T細胞のアウトプット組成物を含む。
いくつかの態様において、対象に投与される濃縮CD4＋T細胞のアウトプット組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD4＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、アウトプット組成物は、組換え受容体を発現する、および/または組換えポリヌクレオチドで形質導入もしくはトランスフェクトされた、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD4＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、対象に投与される濃縮CD4＋T細胞のアウトプット組成物は、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、もしくは0.01％未満のCD8＋T細胞を含む、および/またはCD8＋T細胞を含まない、および/またはCD8＋T細胞不含であるかもしくは実質的に不含である。
いくつかの態様において、対象に投与される濃縮CD8＋T細胞のアウトプット組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD8＋T細胞を含む。特定の態様において、組成物は、組換え受容体を発現する、および/または組換えポリヌクレオチドで形質導入もしくはトランスフェクトされた、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD8＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、対象に投与される濃縮CD8＋T細胞のアウトプット組成物は、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、もしくは0.01％未満のCD4＋T細胞を含む、および/またはCD4＋T細胞を含まない、および/またはCD4＋T細胞不含であるかもしくは実質的に不含である。いくつかの態様において、抗原は病原体特異的抗原である。
処置される疾患または病態は、抗原の発現が疾患、病態、もしくは障害の病因と関連する、および/または疾患、病態、もしくは障害の病因に関与する、例えば、そのような疾患、病態、または障害を引き起こす、悪化させる、あるいは別の様式で関与する任意のものであり得る。例示的な疾患および病態としては、悪性腫瘍もしくは細胞の形質転換と関連する疾患もしくは病態（例えば、がん）、自己免疫疾患もしくは炎症性疾患、または例えば細菌病原体、ウイルス病原体もしくは他の病原体によって引き起こされる感染性疾患が挙げられ得る。処置され得る種々の疾患および病態に関連する抗原を含む例示的な抗原は以前に記載している。特定の態様において、キメラ抗原受容体または遺伝子導入TCRは、当該疾患または病態に関連する抗原に特異的に結合する。
当該疾患、病態、および障害の中には、腫瘍、例えば充実性腫瘍、造血器悪性腫瘍、およびメラノーマ、ならびに例えば、限局性および転移性の腫瘍、感染性疾患、例えばウイルスもしくは他の病原体、例えばHIV、HCV、HBV、CMV、HPVによる感染、ならびに寄生虫症、ならびに自己免疫疾患および炎症性疾患がある。いくつかの態様において、疾患、障害または病態は腫瘍、がん、悪性腫瘍、新生物または他の増殖性の疾患もしくは障害である。そのような疾患としては、限定するわけではないが、白血病、リンパ腫、例えば、急性骨髄性（myeloid）（または骨髄性（myelogenous））白血病（AML）、慢性骨髄性（myeloid）（または骨髄性（myelogenous））白血病（CML）、急性リンパ球性（またはリンパ芽球性）白血病（ALL）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、ヘアリー細胞白血病（HCL）、小リンパ球性リンパ腫（SLL）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、辺縁帯リンパ腫、バーキット リンパ腫、ホジキンリンパ腫（HL）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、未分化大細胞型リンパ腫（ALCL）、濾胞性リンパ腫、難治性濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）および多発性骨髄腫（MM）が挙げられる。いくつかの態様において、疾患または病態は、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、成人ALL、慢性リンパ芽球性白血病（CLL）、非ホジキンリンパ腫（NHL）およびびまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）の中から選択されるB細胞悪性腫瘍である。いくつかの態様において、当該疾患または病態はNHLであり、NHLは、アグレッシブNHL、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）、NOS（デノボおよびインドレントからの形質転換型）、原発性縦隔大細胞型B細胞リンパ腫（PMBCL）、T細胞/組織球豊富型大細胞型B細胞リンパ腫（TCHRBCL）、バーキットリンパ腫、マントル細胞リンパ腫（MCL）、および/または濾胞性リンパ腫（FL）、任意で濾胞性リンパ腫グレード3B（FL3B）からなる群より選択される。いくつかの局面において、CARなどの組換え受容体は、疾患または病態に関連する、またはB細胞悪性腫瘍に関連する病変の環境の細胞で発現される抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において受容体によって標的とされる抗原は、いくつかの公知のB細胞マーカーのいずれかなどの、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原を含む。いくつかの態様において、受容体によって標的とされる抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79bまたはCD30、またはそれらの組合せである。
いくつかの態様において、疾患または病態は、多発性骨髄腫などの骨髄腫である。いくつかの局面において、CARなどの組換え受容体は、疾患または病態に関連する、または多発性骨髄腫に関連する病変の環境の細胞で発現される抗原に特異的に結合する。いくつかの態様における受容体によって標的とされる抗原は、多発性骨髄腫に関連する抗原を含む。いくつかの局面において、抗原、例えば二次抗原または追加の抗原、例えば疾患特異的抗原および/または関連抗原は、多発性骨髄腫、例えばB細胞成熟抗原（BCMA）、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、CD38（環状ADPリボースヒドロラーゼ）、CD138（シンデカン-1、シンデカン、SYN-1）、CS-1（CS1、CD2サブセット1、CRACC、SLAMF7、CD319、および19A24）、BAFF-R、TACI、および/またはFcRH5で発現される。他の例示的な多発性骨髄腫抗原としては、CD56、TIM-3、CD33、CD123、CD44、CD20、CD40、CD74、CD200、EGFR、β2-ミクログロブリン、HM1.24、IGF-1R、IL-6R、TRAIL-R1、およびアクチビン受容体IIA型（ActRIIA）が挙げられる。Benson and Byrd,J.Clin.Oncol.（2012）30（16）:2013-15;Tao and Anderson,Bone Marrow Research（2011）:924058;Chu et al.,Leukemia（2013）28（4）:917-27;Garfall et al.,Discov Med.（2014）17（91）:37-46参照。いくつかの態様において、抗原は、リンパ系腫瘍、骨髄腫、エイズ関連リンパ腫、および/または移植後リンパ球増殖に存在するもの、例えばCD38を含む。かかる抗原に対する抗体または抗原結合断片は公知であり、例えば、米国特許第8,153,765号、同第8,603,477号、同第8,008,450号;米国特許出願公開第20120189622号もしくは同第20100260748号;および/または国際公開公報第2006099875号、同第2009080829号もしくは同第2012092612号もしくは同第2014210064号に記載されているものを含む。いくつかの態様において、かかる抗体またはその抗原結合断片（例えばscFv）は、多重特異性抗体、多重特異性キメラ受容体、例えば多重特異性CAR、および/または多重特異性細胞に含まれる。
いくつかの態様において、該疾患または病態は、感染性疾患または病態、例えば限定するわけではないが、ウイルス感染、レトロウイルス感染、細菌感染および原虫感染、免疫不全、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタイン・バーウイルス（EBV）、アデノウイルス、BKポリオーマウイルスである。いくつかの態様において、該疾患または病態は、自己免疫性または炎症性の疾患または病態、例えば関節炎、例えば、関節リウマチ（RA）、I型糖尿病、全身性エリテマトーデス（SLE）、炎症性腸疾患、乾癬、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病、クローン病、多発性硬化症、喘息および/または移植と関連している疾患もしくは病態である。
いくつかの態様において、該疾患または病態と関連している抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、CAIXまたはG250としても知られる）、がん精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2としても知られる）、がん胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、上皮増殖因子タンパク質（EGFR）、短縮型上皮増殖因子タンパク質（tEGFR）、III型上皮増殖因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5;Fc受容体ホモログ5またはFCRH5としても知られる）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、胎児アセチルコリン受容体、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerbB2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球型抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球型抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Ra）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、メソテリン、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、腫瘍胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（5T4としても知られるTPBG）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的抗原またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化された分子、および/またはHIV、HCV、HBVもしくはその他の病原体によって発現される分子の中から選択される。いくつかの態様において受容体によって標的とされる抗原としては、多数の公知のB細胞マーカーのいずれもなど、B細胞悪性病変と関連する抗原が挙げられる。いくつかの態様において、受容体によって標的とされる抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igカッパ、Igラムダ、CD79a、CD79bまたはCD30である。いくつかの態様において、抗原は病原体特異的抗原である。いくつかの態様において、抗原は、ウイルス抗原（例えば、HIV、HCV、HBVなどに由来するウイルス抗原）、細菌抗原および/または寄生虫抗原である。
いくつかの態様において、細胞療法、例えば養子T細胞療法は、細胞が、細胞療法を受けることになっている対象からまたはかかる対象に由来する試料から単離されるおよび/またはさもなければ調製される、自己移植によって行われる。したがって、いくつかの局面において、細胞は、処置を必要とする対象、例えば患者に由来し、単離および加工処理後に同じ対象に投与される。
いくつかの態様において、細胞療法、例えば養子T細胞療法は、細胞が、細胞療法を受けることになっているまたは最終的に細胞療法を受ける対象、例えば第1の対象以外の対象から単離されるおよび/またはさもなければ調製される、同種異系移植によって行われる。かかる態様において、細胞は、次いで、同じ種の異なる対象、例えば第2の対象に投与される。いくつかの態様において、第1および第2の対象は遺伝的に同一である。いくつかの態様において、第1および第2の対象は遺伝的に類似する。いくつかの態様において、第2の対象は、第1の対象と同じHLAクラスまたはスーパータイプを発現する。
細胞、例えば、セクションIに提供される方法によって生成された操作された細胞は、任意の適切な手段によって投与され得る。特定の態様において、2つまたはそれより多くの別個のアウトプット組成物、例えば、セクションIに記載される方法によって作製された濃縮T細胞の組成物からの細胞は、細胞の単一の組成物に組み合わされて投与される。一部の特定の態様において、別個のアウトプット組成物からの細胞は、それぞれ別々に対象に投与される。一部の特定の態様において、CD4＋T細胞は、CD8＋T細胞とは別に投与される。
いくつかの態様において、細胞は、いずれかの適切な手段によって、例えばボーラス輸注によって、注射、例えば、静脈内もしくは皮下注射、眼内注射、眼球周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、嚢内投与注射、サブコンジェクトバル（subconjectval）注射、サブコンジュンティバル（subconjuntival）注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、球周囲注射または後強膜近傍（posterior juxtascleral）送達によって投与され得る。いくつかの態様において、細胞は、非経口、肺内および鼻腔内ならびに、局所処置が所望される場合は病巣内投与によって投与される。非経口輸注としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内または皮下投与が挙げられる。いくつかの態様において、所与の用量は該細胞の単回ボーラス投与によって投与される。いくつかの態様において、当該用量は、例えば3日以下の期間にわたる該細胞の反復ボーラス投与によって、または該細胞の連続輸注投与によって投与される。いくつかの態様において、当該細胞用量またはいずれかの追加の治療、例えばリンパ球除去療法、介入治療および/または併用療法の施行は外来患者の通院によって行われる。
疾患の予防または処置のためには、適切な投与量は、処置される疾患の型、細胞または組換え受容体の型、細胞の投与が予防目的であれ治療目的であれ、疾患の重症度および経過、前の治療、対象の病歴および該細胞に対する奏効、ならびに担当医の裁量に依存し得る。組成物および細胞はいくつかの態様において、対象に1回で、または一連の処置で適切に投与される。
いくつかの態様において、細胞は、併用治療の一部として、例えば別の治療的介入、例えば抗体または操作された細胞または受容体または剤、例えば細胞傷害性薬剤もしくは治療薬と同時にまたは任意の順序で連続的に投与される。いくつかの態様における細胞は、1つまたは複数の追加の治療薬とともに、または別の治療的介入と組み合わせて、同時にまたは任意の順序で連続的に共投与される。いくつかの状況では、細胞は、細胞集団が1つもしくは複数の追加の治療薬の効果を増強するように、またはその逆も同様であるように、時間的に十分に近い別の療法と共投与される。いくつかの態様において、細胞は、1つまたは複数の追加の治療薬の前に投与される。いくつかの態様において、細胞は、1つまたは複数の追加の治療薬の後に投与される。いくつかの態様において、1つまたは複数の追加の剤は、例えば持続性を高めるための、IL-2などのサイトカインを含む。いくつかの態様において、方法は、化学療法剤の投与を含む。
いくつかの態様において、方法は、例えば、当該投与の前に腫瘍負荷を低減させるための化学療法剤、例えば前処置化学療法剤の投与を含む。
免疫除去（例えば、リンパ球除去）治療での対象の前処置により、いくつかの局面において養子細胞療法（ACT）の効果が改善され得る。
したがって、いくつかの態様において、方法は、前処置剤、例えばリンパ球除去剤または化学療法剤、例えばシクロホスファミド、フルダラビン、またはそれらの組合せを、細胞療法の開始前に対象に投与することを含む。例えば、細胞療法の開始の少なくとも2日前、例えば少なくとも3日前、少なくとも4日前、少なくとも5日前、少なくとも6日前、または少なくとも7日前に、前処置剤が対象に投与され得る。いくつかの態様において、細胞療法の開始前7日以内、例えば6日以内、5日以内、4日以内、3日以内、または2日以内に、前処置剤が対象に投与される。
いくつかの態様において、対象は、20 mg/kgまたは約20 mg/kg〜100 mg/kg、例えば40 mg/kgまたは約40 mg/kg〜80 mg/kgまたは約80 mg/kgの用量のシクロホスファミドで前処置される。いくつかの局面において、対象は、60 mg/kgまたは約60 mg/kgのシクロホスファミドで前処置される。いくつかの態様において、シクロホスファミドは、単回用量で投与され得るか、または複数回の用量で投与され得る、例えば毎日、1日おき、もしくは3日毎に投与される。いくつかの態様において、シクロホスファミドは、1日または2日間にわたって1日1回、投与される。いくつかの態様において、リンパ球除去剤がシクロホスファミドを含む場合、シクロホスファミドは、100または約100 mg/m2〜500または約500 mg/m2、例えば、200もしくは約200 mg/m2〜400もしくは約400 mg/m2、または250もしくは約250 mg/m2〜350もしくは約350 mg/m2の用量（両端の値を含む）で対象に投与される。いくつかの場合において、対象に約300 mg/m2のシクロホスファミドが投与される。いくつかの態様において、シクロホスファミドは、単回用量で投与され得るか、または複数回の用量で投与され得る、例えば毎日、1日おき、もしくは3日毎に投与され得る。いくつかの態様において、シクロホスファミドは、例えば1〜5日間、例えば3〜5日間にわたって、毎日、投与される。いくつかの場合において、細胞療法の開始前に約300 mg/m2のシクロホスファミドが3日間にわたって毎日、対象に投与される。
いくつかの態様において、リンパ球除去剤がフルダラビンを含む場合、フルダラビンは、1または約1 mg/m2〜100または約100 mg/m2、例えば、10もしくは約10 mg/m2〜75もしくは約75 mg/m2、15もしくは約15 mg/m2〜50もしくは約50 mg/m2、20もしくは約20 mg/m2〜40もしくは約40 mg/m2、または24もしくは約24 mg/m2〜35もしくは約35 mg/m2の用量（両端の値を含む）で対象に投与される。いくつかの場合において、約30 mg/m2のフルダラビンが対象に投与される。いくつかの態様において、フルダラビンは、単回用量で投与され得るか、または複数回の用量で投与され得る、例えば、毎日、1日おき、もしくは3日毎に投与され得る。いくつかの態様において、フルダラビンは、例えば1〜5日間、例えば3〜5日間にわたって、毎日、投与される。いくつかの場合において、細胞療法の開始前に約30 mg/m2のフルダラビンが3日間にわたって毎日、対象に投与される。
いくつかの態様において、リンパ球除去剤は、剤の組合せ、例えばシクロホスファミドとフルダラビンの組合せを含む。したがって、剤の組合せは、任意の用量または投与スケジュール、例えば前記のもののシクロホスファミドと、任意の用量または投与スケジュール、例えば前記のもののフルダラビンを含み得る。例えば、いくつかの局面において、初回用量または後続用量の前に、60 mg/kg（約2 g/m2）のシクロホスファミドと3〜5回用量の25 mg/m2のフルダラビンが対象に投与される。
当該細胞の投与後、いくつかの態様における操作された細胞集団の生物学的活性が、例えば、いくつかの公知の方法のいずれかによって測定される。評価するパラメータとしては、例えば画像診断によるインビボまたは例えばELISAもしくはフローサイトメトリーによるエキソビボでの、操作されたT細胞もしくは天然のT細胞または他の免疫細胞の抗原に対する特異的結合が挙げられる。特定の態様において、操作された細胞が標的細胞を破壊する能力は、例えば、Kochenderfer et al., J.Immunotherapy, 32（7）:689-702（2009）およびHerman et al.J.Immunological Methods, 285（1）:25-40（2004）に記載の細胞毒性アッセイなどのいずれかの適切な公知の方法を用いて測定され得る。特定の態様において、細胞の生物学的活性は、1つまたは複数のサイトカイン（例えば、CD107a、IFNγ、IL-2、およびTNF）の発現および/または分泌をアッセイすることにより測定される。いくつかの局面において、生物学的活性は、臨床転帰、例えば腫瘍負荷または腫瘍細胞量の低減を評価することにより測定される。
特定の態様において、操作された細胞は、任意の数の方法で、その治療有効性または予防有効性が高まるようにさらに修飾される。例えば、当該集団によって発現される操作されたCARまたはTCRは、直接またはリンカーを介して間接的のいずれかで標的指向部分にコンジュゲートされ得る。化合物、例えばCARまたはTCRを標的指向部分にコンジュゲートさせる実務は公知である。例えば、Wadwa et al., J.Drug Targeting 3:1 1 1（1995）および米国特許5,087,616を参照のこと。
いくつかの態様において、ある用量の細胞が、提供される方法に従って、および/または提供される製造物品もしくは組成物で、対象に投与される。いくつかの態様において、用量のサイズまたはタイミングは、対象の具体的な疾患または病態の関数として決定される。いくつかの場合において、提供される説明に鑑みた具体的な疾患のための用量のサイズまたはタイミングは経験的に決定され得る。
いくつかの態様において、当該用量の細胞は、2×105または約2×105個/kg〜2×106または約2×106個/kg、例えば4×105もしくは約4×105個/kg〜1×106もしくは約1×106個/kg、または6×105もしくは約6×105個/kg〜8×105もしくは約8×105個/kgの細胞を含む。いくつかの態様において、当該用量の細胞は、対象の体重1キログラムあたり2×105個（個/kg）以下の細胞（例えば、抗原提示細胞、例えばCAR発現細胞）、例えば3×105もしくは約3×105個/kg以下の細胞、4×105もしくは約4×105個/kg以下の細胞、5×105もしくは約5×105個/kg以下の細胞、6×105もしくは約6×105個/kg以下の細胞、7×105もしくは約7×105個/kg以下の細胞、8×105もしくは約8×105個/kg以下の細胞、9×105もしくは約9×105個/kg以下の細胞、1×106もしくは約1×106個/kg以下の細胞、または2×106もしくは約2×106個/kg以下の細胞を含む。いくつかの態様において、当該用量の細胞は、対象の体重1キログラムあたり少なくとも2×105または少なくとも約2×105または2×105または約2×105個（個/kg）の細胞（例えば、抗原提示細胞、例えばCAR発現細胞）、例えば少なくとも3×105もしくは少なくとも約3×105もしくは3×105もしくは約3×105個/kgの細胞、少なくとも4×105もしくは少なくとも約4×105もしくは4×105もしくは約4×105個/kgの細胞、少なくとも5×105もしくは少なくとも約5×105もしくは5×105もしくは約5×105個/kgの細胞、少なくとも6×105もしくは少なくとも約6×105もしくは6×105もしくは約6×105個/kgの細胞、少なくとも7×105もしくは少なくとも約7×105もしくは7×105もしくは約7×105個/kgの細胞、少なくとも8×105もしくは少なくとも約8×105もしくは8×105もしくは約8×105個/kgの細胞、少なくとも9×105もしくは少なくとも約9×105もしくは9×105もしくは約9×105個/kgの細胞、少なくとも1×106もしくは少なくとも約1×106もしくは1×106もしくは約1×106個/kgの細胞、または少なくとも2×106もしくは少なくとも約2×106もしくは2×106もしくは約2×106個/kgの細胞を含む。
特定の態様において、細胞または個々のサブタイプの細胞集団は、約100万〜約1000億個の範囲の細胞および/または体重1キログラムあたり前記量の細胞、例えば、100万〜約500億個（例えば、約500万個、約2500万個、約5億個、約10億個、約50億個、約200億個、約300億個、約400億個、あるいは前述の値のいずれか2つによって規定される範囲）の細胞、例えば約1000万〜約1000億個（例えば、約2000万個、約3000万個、約4000万個、約6000万個、約7000万個、約8000万個、約9000万個、約100億個、約250億個、約500億個、約750億個、約900億個、あるいは前述の値のいずれか2つによって規定される範囲）の細胞、ならびにいくつかの場合において、約1億個〜約500億個（例えば、約1億2000万個、約2億5000万個、約3億5000万個、約4億5000万個、約6億5000万個、約8億個、約9億個、約30億個、約300億個、約450億個）の細胞、あるいはこれらの範囲の間のいずれかの値、および/または体重1キログラムあたり前記値の細胞で、対象に投与される。投与量は、疾患もしくは障害および/または患者および/または他の処置に特定の属性に応じて異なり得る。
いくつかの態様において、当該用量の細胞は、細胞用量が対象の体表面積もしくは体重に関係しない、または対象の体表面積もしくは体重を基準にしないような、一律用量の細胞または固定用量の細胞である。
いくつかの態様において、例えば対象がヒトである場合、用量は、約1×108未満の全組換え受容体（例えばCAR）発現細胞、T細胞、または末梢血単核細胞（PBMC）、例えば約1×106〜1×108の範囲のかかる細胞、例えば2×106、5×106、1×107、5×107、もしくは1×108のかかる細胞もしくはかかる全細胞、または前記値のいずれか2つの間の範囲のかかる細胞を含む。いくつかの態様において、対象がヒトである場合、用量は、約1×106〜3×108の全組換え受容体（例えばCAR）発現細胞、例えば約1×107〜2×108の範囲のかかる細胞、例えば1×107、5×107、1×108もしくは1.5×108のかかる全細胞、または前記値のいずれか2つの間の範囲のかかる細胞を含む。いくつかの態様において、患者は複数回用量を投与され、それぞれの用量または総用量は、前記値のいずれかの範囲内であり得る。いくつかの態様において、細胞の用量は、それぞれ両端の値を含む、1×105〜5×108もしくは約1×105〜約5×108の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、1×105〜1×108もしくは約1×105〜約1×108の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、5×105〜1×107もしくは約5×105〜約1×107の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、または1×106〜1×107もしくは約1×106〜約1×107の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞の投与を含む。
いくつかの態様において、用量のT細胞は、CD4＋T細胞、CD8＋T細胞、またはCD4＋およびCD8＋T細胞を含む。
いくつかの態様において、例えば対象がヒトである場合、CD4＋およびCD8＋T細胞を含む用量を含む、用量のCD8＋T細胞は、約1×106〜1×108の全組換え受容体（例えばCAR）発現CD8＋細胞、例えば約5×106〜1×108の範囲のかかる細胞、例えば1×107、2.5×107、5×107、7.5×107、もしくは1×108のかかる全細胞、または前記の値のいずれか2つの間の範囲のかかる細胞を含む。いくつかの態様において、患者は複数回用量を投与され、それぞれの用量または総用量は、前記値のいずれかの範囲内であり得る。いくつかの態様において、細胞の用量は、それぞれ両端の値を含む、1×107〜0.75×108または約1×107〜約0.75×108の全組換え受容体発現CD8＋T細胞、1×107〜2.5×107または約1×107〜約2.5×107の全組換え受容体発現CD8＋T細胞、1×107〜0.75×108または約1×107〜約0.75×108の全組換え受容体発現CD8＋T細胞の投与を含む。いくつかの態様において、細胞の用量は、1×107もしくは約1×107、2.5×107もしくは約2.5×107、5×107もしくは約5×107、7.5×107もしくは約7.5×107、または1×108もしくは約1×108の全組換え受容体発現CD8＋T細胞の投与を含む。
いくつかの態様において、当該用量の細胞（例えば組換え受容体発現T細胞）は、対象に単回用量として投与されるか、または2週間、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、1年、もしくはそれより長い期間内に1回だけ投与される。
養子細胞療法の文脈において、所与の「用量」の投与は、所与の量もしくは数の細胞の単一の組成物としての投与および/または単一の中断されない投与、例えば単回の注射もしくは連続輸注を包含し、また、複数の個々の組成物または輸注で提供される所与の量または数の細胞の分割用量としての、または複数の組成物としての指定された期間（例えば3日以下）にわたる投与も包含する。したがって、いくつかの状況において、当該用量は、単一の時間点に施行または開始される指定された数の細胞の単回投与または連続投与である。しかしながら、いくつかの状況において、当該用量は、3日以下の期間にわたる、複数回注射もしくは複数回輸注（例えば、1日1回を3日間もしくは2日間）で、または1日間にわたる複数回輸注によって投与される。
したがって、いくつかの局面において、当該用量の細胞は単一の薬学的組成物で投与される。いくつかの態様において、当該用量の細胞は、合わせて該用量の細胞を含む複数の組成物で投与される。
いくつかの態様において、用語「分割用量」は、1日より長くにわたって投与されるように分割された用量を示す。この型の投与は本方法に包含され、単回用量であるとみなす。
したがって、当該用量の細胞は、分割用量、例えば経時的に投与される分割用量として投与され得る。例えば、いくつかの態様において、当該用量は対象に2日間にわたって、または3日間にわたって投与され得る。分割投与のための例示的な方法は、当該用量の25％を初日に投与し、当該用量の残りの75％を2日目に投与することを含む。他の態様において、当該用量の33％が初日に投与され得、残りの67％が2日目に投与され得る。いくつかの局面において、当該用量10％が初日に投与され、当該用量の30％が2日目に投与され、当該用量の60％が3日目投与される。いくつかの態様において、分割用量は3日より長くにわたって延長されない。
いくつかの態様において、当該用量の細胞は、各々が該用量のうちのいくらかの細胞を含む複数の、例えば第1および第2、任意でそれより多くの組成物または溶液の投与によって投与され得る。いくつかの局面において、各々が異なる集団および/またはサブタイプの細胞を含む該複数の組成物は別々に、または独立して、任意で一定期間内に投与される。例えば、当該集団またはサブタイプの細胞は、それぞれCD8＋およびCD4＋T細胞および/またはそれぞれCD8＋濃縮集団およびCD4＋濃縮集団を含み得、例えば、CD4＋および/またはCD8＋T細胞は各々が個々に、組換え受容体を発現するように遺伝子操作された細胞を含み得る。いくつかの態様において、当該用量の投与は、ある用量のCD8＋T細胞またはある用量のCD4＋T細胞を含む第1の組成物の投与と、当該用量のCD4＋T細胞とCD8＋T細胞の他方を含む第2の組成物の投与を含む。
いくつかの態様において、当該組成物または用量の投与、例えば複数の細胞組成物の投与は、当該細胞組成物の別々の投与を伴う。いくつかの態様において、細胞組成物は、セクションIで説明される方法によって作製される別々のアウトプット組成物である。いくつかの局面において、別々の投与は、同時に、または任意の順序で逐次的に行われる。いくつかの態様において、当該用量は第1の組成物と第2の組成物を含み、第1の組成物と第2の組成物は、0〜12時間あけて、0〜6時間あけて、または0〜2時間あけて投与される。いくつかの態様において、第1の組成物の投与の開始と第2の組成物の投与の開始は、2時間以下、1時間以下、もしくは30分以下あけて、15分以下、10分以下、または5分以下あけて行われる。いくつかの態様において、第1の組成物の投与の開始および/または終了と第2の組成物の投与の終了および/または開始は、2時間以下、1時間以下、もしくは30分以下あけて、15分以下、10分以下、または5分以下あけて行われる。
いくつかの組成物において、第1の組成物、例えば当該用量の第1の組成物はCD4＋T細胞を含む。いくつかの組成物において、第1の組成物、例えば当該用量の第1の組成物はCD8＋T細胞を含む。いくつかの態様において、第1の組成物は第2の組成物の前に投与される。
いくつかの態様において、当該用量または組成の細胞は、規定の比もしくは目標の比の、組換え受容体を発現するCD4＋T細胞と組換え受容体を発現するCD8＋T細胞、および/または規定の比もしくは目標の比のCD4＋T細胞とCD8＋T細胞を含み、当該比は任意で約1:1であるか、または約1:3〜約3:1であり、例えば約1:1である。いくつかの局面において、目標の比または所望の比（例えば、CD4＋:CD8＋比またはCAR＋CD4＋:CAR＋CD8＋比、例えば1:1）の異なる細胞集団を有する組成物または用量の投与は、当該集団の一方を含む細胞組成物の投与、次いで、当該集団の他方を含む別個の細胞組成物の投与を伴い、ここで、当該投与は、目標の比もしくは所望の比または概ね目標の比もしくは所望の比での投与である。いくつかの局面において、規定の比でのある用量または組成の細胞の投与により、T細胞療法の拡大増殖、持続性、および/または抗腫瘍活性の改善がもたらされる。
いくつかの態様において、対象は、反復用量、例えば、2回以上の用量または複数回の後続用量での該細胞の投与を受ける。いくつかの態様において、2回用量が対象に投与される。いくつかの態様において、対象は後続用量の投与を受け、例えば、2回目の用量が初回用量の約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18, 19、20または21日後に投与される。いくつかの態様において、初回用量後、後続用量の投与後に追加の用量が投与されるような複数の後続用量が投与される。いくつかの局面において、追加の用量で対象に投与される細胞数が初回用量および/または後続用量と同じか、または同様である。いくつかの態様において、追加の用量は前回用量より多い。
いくつかの局面において、初回用量サイズおよび/または後続用量サイズは、1つまたは複数の基準、例えば以前の処置、例えば化学療法に対する対象の奏効、対象の疾病負荷、例えば腫瘍細胞量、腫瘍の大きさ、腫瘍サイズ、または転移の度合、程度もしくは型、病期、および/または対象が中毒性転帰、例えば、CRS、マクロファージ活性化症候群、腫瘍崩壊症候群、神経毒性を発現する可能性もしくは発生率および/または投与される細胞および/または組換え受容体に対する宿主の免疫応答に基づいて決定される。
いくつかの局面において、初回用量の投与と後続用量の投与間の時間は約9〜約35日、約14〜約28日または15〜27日である。いくつかの態様において、後続用量の投与は、初回用量の投与後、約14日より後であって約28日より前の時点である。いくつかの局面において、初回用量と後続用量間の時間は約21日である。いくつかの態様において、追加の用量、例えば後続用量は、後続用量の投与後に投与される。いくつかの局面において、追加の後続用量は、前回用量の投与後、少なくとも約14日であって約28日より前に投与される。いくつかの態様において、追加の用量は、前回用量後、約14日より前、例えば、前回用量の4、5、6、7、8、9、10、11、12、または13日後に投与される。いくつかの態様において、前回用量後、約14日より前に用量の投与は行われず、かつ/または前回用量後、約28日より後に用量の投与は行われない。
いくつかの態様において、細胞、例えば組換え受容体発現細胞の該用量は、T細胞の第1の用量およびT細胞の後続用量を含む2回用量（例えば、二重用量）を含み、ここで、第1の用量および第2の用量の一方または両方は、T細胞の分割用量の投与を構成する。
いくつかの態様において、細胞の該用量は一般的に、疾病負荷の低減に有効であるのに充分に大きい。
いくつかの態様において、細胞は、いくつかの局面において所望の用量または数の細胞あるいは細胞型および/または所望の比の細胞型を含む所望の投与量で投与される。したがって、いくつかの態様における細胞の投与量は、細胞の総数（または体重1kgあたりの数）および個々の集団またはサブタイプの所望の比、例えばCD8＋に対するCD4＋の比に基づく。いくつかの態様において、細胞の投与量は、個々の集団内または個々の細胞型の細胞の所望の総数（または体重1kgあたりの数）に基づく。いくつかの態様において、投与量は、個々の集団における全細胞の所望数、所望の比および所望の細胞総数などのそのような特徴の組合せに基づく。
いくつかの態様において、集団またはサブタイプの細胞、例えばCD8＋およびCD4＋T細胞は、全細胞の所望の用量、例えばT細胞の所望の用量の許容差で、または全細胞の所望の用量、例えばT細胞の所望の用量の許容差の範囲内で投与される。いくつかの局面において、所望の用量は、所望の細胞数または細胞が投与される対象の単位体重あたりの所望の細胞数、例えば細胞/kgである。いくつかの局面において、所望の用量は、最小細胞数もしくは単位体重あたりの最小細胞数または最小細胞数もしくは単位体重あたりの最小細胞数より上である。いくつかの局面において、全細胞のうち、所望の用量で投与される個々の集団または個々のサブタイプは、所望のアウトプット比（例えば、CD8＋に対するCD4＋の比）またはほぼ所望のアウトプット比（例えば、CD8＋に対するCD4＋の比）、例えば、そのような比の特定の許容差または許容誤差の範囲内で存在させる。
いくつかの態様において、細胞は、個々の集団またはサブタイプの細胞の1つまたは複数の所望の用量、例えばCD4＋T細胞の所望の用量および/またはCD8＋T細胞の所望の用量で、あるいは個々の集団またはサブタイプの細胞の1つまたは複数の所望の用量、例えばCD4＋T細胞の所望の用量および/またはCD8＋T細胞の所望の用量の許容差の範囲内で投与される。いくつかの局面において、所望の用量は、サブタイプもしくは集団の所望の細胞数、または細胞が投与される対象の単位体重あたりのそのような細胞の所望数、例えば細胞/kgである。いくつかの局面において、所望の用量は、集団もしくはサブタイプの最小細胞数または単位体重あたりの集団もしくはサブタイプの最小細胞数あるいは集団もしくはサブタイプの最小細胞数または単位体重あたりの集団もしくはサブタイプの最小細胞数より上である。
したがって、いくつかの態様において、投与量は、全細胞の所望の固定用量および所望の比に基づく、および/または個々のサブタイプもしくは亜集団の1つもしくは複数、例えば各々の所望の固定用量に基づく。したがって、いくつかの態様において、投与量は、T細胞の所望の固定用量もしくは所望の最小用量およびCD8＋T細胞に対するCD4＋T細胞の所望の比に基づく、および/またはCD4＋Tおよび/またはCD8＋T細胞の所望の固定用量もしくは所望の最小用量に基づく。
いくつかの態様において、細胞は、複数の細胞集団もしくはサブタイプ、例えばCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞もしくはサブタイプの所望のアウトプット比で、またはその許容範囲内で投与される。いくつかの局面において、所望の比は特定の比であり得るか、またはある範囲の比であり得る。例えば、いくつかの態様において、所望の比（例えば、CD4＋T細胞：CD8＋T細胞の比）は、5:1もしくは約5:1〜5:1もしくは約5:1（あるいは約1:5より大きく約5:1より小さい）、または1:3もしくは約1:3〜3:1もしくは約3:1（あるいは約1:3より大きく約3:1より小さい）、例えば2:1もしくは約2:1〜1:5もしくは約1:5（あるいは約1:5より大きく2:1より小さい）、例えば、5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9:1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、もしくは1:5、または概ねこれらの比である。いくつかの局面において、許容差は、所望の比の約1％、約2％、約3％、約4％、約5％、約10％、約15％、約20％、約25％、約30％、約35％、約40％、約45％、約50％の範囲内であり、これらの範囲間のいずれかの値を含む。ある態様において、濃縮されたCD4+T細胞および濃縮されたCD8+T細胞の組成物は、所望の比で組み合わされており、対象に対して1種類の細胞組成物として投与される。特定の態様において、濃縮されたCD4+T細胞および濃縮されたCD8+T細胞の組成物は、所望の比での別々の組成物として投与される。
特定の態様において、細胞の数および/または濃度は、組換え受容体（例えば、CAR）発現細胞の数を示す。他の態様において、細胞の数および/または濃度は、投与されるすべての細胞、T細胞または末梢血単核球（PBMC）の数または濃度を示す。
いくつかの局面において、用量サイズは、1つまたは複数の基準、例えば以前の処置、例えば化学療法に対する対象の奏効、対象の疾病負荷、例えば腫瘍細胞量、腫瘍の大きさ、腫瘍サイズ、または転移の度合、程度もしくは型、病期、および/または対象が中毒性転帰、例えば、CRS、マクロファージ活性化症候群、腫瘍崩壊症候群、神経毒性を発現する可能性もしくは発生率および/または投与される細胞および/または組換え受容体に対する宿主の免疫応答に基づいて決定される。
いくつかの態様において、方法は、キメラ抗原受容体（CAR）を発現する細胞および/またはリンパ球除去療法を1回または複数回の追加の用量で適用する工程も含み、かつ/または当該方法の1つまたは複数の工程が繰り返される。いくつかの態様において、当該1つまたは複数の追加の用量は、初期用量と同じである。いくつかの態様において、当該1つまたは複数の追加の用量は、初期用量と異なる、例えば、初期用量より例えば2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、もしくは10倍、またはそれより大幅に多いか、あるいは例えば、初期用量より例えば2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、もしくは10倍、またはそれより大幅に少ない。いくつかの態様において、1回または複数回の追加の用量の投与は、初期の処置もしくはいずれかの以前の処置に対する対象の奏効、対象の疾病負荷、例えば腫瘍細胞量、腫瘍の大きさ、腫瘍サイズ、または転移の度合、程度、もしくは型、病期、および/または対象が中毒性転帰、例えば、CRS、マクロファージ活性化症候群、腫瘍崩壊症候群、神経毒性を発現する可能性もしくは発生率および/または投与される細胞および/または組換え受容体に対する宿主の免疫応答に基づいて決定される。
VI.製造品
また、本明細書、例えばセクションIに記載される方法などの本明細書で提供される方法によって作製される組換え受容体を発現する操作された細胞、例えば細胞のアウトプット組成物、ならびに任意で使用のための説明書、例えばセクションIIIなど本明細書に記載される方法などによって操作された細胞を対象に投与するための説明書を含む製造品およびキットも提供される。
いくつかの態様において、本明細書に記載の操作された細胞のいずれかの治療有効量を含有する組成物、および疾患または病態を処置するために対象に投与するための説明書を含む製造品および/またはキットが本明細書で提供される。いくつかの態様において、説明書は、本明細書で提供される細胞を投与するための方法の要素のいくつかまたはすべてを指定することができる。いくつかの態様において、説明書は、細胞療法のための細胞の投与のための詳細な指示、例えば投与のための用量、タイミング、対象の選択および/または同定ならびに投与のための条件を指定する。いくつかの態様において、製造品および/またはキットは、リンパ球除去療法のための剤をさらに含み、任意でリンパ球除去療法を投与するための説明書をさらに含む。いくつかの態様において、説明書は、投与のための組成物に付随するラベルまたは添付文書として含まれ得る。
いくつかの態様において、製造品は、組換え受容体を発現する濃縮CD4＋T細胞の組成物を含む容器、任意でバイアルを有し得る。いくつかの態様において、製造品またはキットは、任意で、組換え受容体を発現する濃縮CD8＋T細胞の組成物を含む第2の容器、任意で第2のバイアルを含む。いくつかの態様において、凍結保護剤が細胞とともに含まれる。いくつかの局面において、容器はバイアルまたはバッグである。いくつかの態様において、容器は、濃縮CD4＋およびCD8＋T細胞の組成物を含む。
いくつかの態様において、容器内の濃縮CD4＋T細胞の組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD4＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、容器の組成物は、組換え受容体を発現する、および/または組換えポリヌクレオチドで形質導入もしくはトランスフェクトされた、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD4＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、容器内の濃縮CD4＋T細胞の組成物は、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、または0.01％未満のCD8＋T細胞を含む、および/またはCD8＋T細胞を含まない、および/またはCD8＋T細胞不含であるかもしくは実質的に不含である。
いくつかの態様において、容器内の濃縮CD8＋T細胞の組成物は、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD8＋T細胞を含む。特定の態様において、容器を有する組成物は、組換え受容体を発現する、および/または組換えポリヌクレオチドで形質導入またはトランスフェクトされた、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、少なくとも99.5％、少なくとも99.9％、または100％もしくは約100％のCD8＋T細胞を含む。一部の特定の態様において、対象に投与される濃縮CD8＋T細胞のアウトプット組成物は、40％未満、35％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、もしくは0.01％未満のCD4＋T細胞を含む、および/またはCD4＋T細胞を含まない、および/またはCD4＋T細胞不含であるかもしくは実質的に不含である。
いくつかの態様において、説明書は、投与されるべき細胞用量を指定する。例えば、いくつかの態様において、説明書が指定する用量としては、約1×106〜約3×108個の全組換え受容体（例えば、CAR）発現細胞、例えば、約1×107〜約2×108個の範囲の当該細胞、例えば1×107、5×107、1×108、もしくは1.5×108個の当該全細胞、または前述の値のいずれか2つの間の範囲が挙げられる。いくつかの態様において、患者は反復用量を投与され、当該用量の各々または総用量は、前記の値のいずれかの範囲内であり得る。
いくつかの態様において、容器（例えばバイアル）は、10×106または約10×106個より多くの、15×106または約15×106個より多くの、25×106または約25×106個より多くのT細胞または組換え受容体発現T細胞を含む。いくつかの局面において、バイアルは、約1000万個/ml〜約7000万個/ml、約1000万個/ml〜約5000万個/ml、約1000万個/ml〜約2500万個/ml、約1000万個/ml〜約1500万個/ml、1500万個/ml〜約7000万個/ml、約1500万個/ml〜約5000万個/ml、約1500万個/ml〜約2500万個/ml、約2500万個/ml〜約7000万個/ml、約2500万個/ml〜約5000万個/ml、および約5000万個/ml〜約7000万個/mlの細胞を含む。
いくつかの態様において、投与のための指定された該複数のバイアルまたは該複数の細胞もしくは単位用量の細胞は合わせて、1×105〜5×108個の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、または約1×105〜約5×108個の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、1×105〜1×108個の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、または約1×105〜約1×108個の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、5×105〜1×107個の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、または約5×105〜約1×107個の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、あるいは、1×106〜1×107個の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、または約1×106〜1×107個の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞を含む、ある用量の細胞を含み、各々は両端の値を含む。いくつかの局面において、当該物品は、1つまたは複数の単位用量のCD4＋T細胞およびCD8＋T細胞またはCD4＋受容体＋T細胞およびCD8＋受容体＋T細胞を備え、ここで、当該単位用量は、1×107もしくは約1×107〜2×108もしくは約2×108個の組換え受容体発現T細胞、5×107もしくは約5×107〜1.5×108もしくは約1.5×108個の組換え受容体発現T細胞、5×107もしくは約5×107個の組換え受容体発現T細胞、1×108もしくは約1×108個の組換え受容体発現T細胞、または1.5×108もしくは約1.5×108個の組換え受容体発現T細胞を含み、ここで任意で、当該物品の該情報には、1つもしくは複数の単位用量および/またはそのような1つもしくは複数の単位用量に相当する体積の投与が指定されている。いくつかの場合において、当該物品は1つまたは複数の単位用量のCD8＋T細胞を備え、当該用量が、5×106もしくは約5×106〜1×108もしくは約1×108個の組換え受容体発現CD8＋T細胞を含むか、当該用量が、1×107もしくは約1×107〜0.75×108もしくは約0.75×108個の組換え受容体発現CD8＋T細胞を含むか、当該用量が、2.5×107もしくは約2.5×107個の組換え受容体発現CD8＋T細胞を含むか、または該用量が、5×107もしくは約5×107個の組換え受容体発現CD8＋T細胞を含むか、または該用量が、0.75×108もしくは約0.75×108個の組換え受容体発現CD8＋T細胞を含み、ここで任意で、当該物品の該情報には、1つもしくは複数の単位用量および/またはそのような1つもしくは複数の単位用量に相当する体積の投与が指定されている。いくつかの態様において、当該物品内の細胞が、合わせて、1×108個以下の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、1×107個以下の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、0.5×107個以下の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、1×106個以下の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、0.5×106個以下の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞を含む、ある用量の細胞を含む。
いくつかの態様において、説明書に、投与の投与レジメンおよびタイミングが指定され得る。例えば、いくつかの態様において、説明書に、当該対象に反復用量、例えば、2回またはそれより多くの用量の細胞を投与することが指定され得る。いくつかの態様において、説明書に、反復用量のタイミング、例えば、第2の用量は第1の用量の約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18, 19、20もしくは21日後に投与されること；および/または各用量の投与量の量が指定されている。
いくつかの態様において、製造品またはキットは、組換え受容体を発現する濃縮CD4＋T細胞の組成物、ならびに疾患または病態を有する対象に、濃縮CD4＋T細胞の組成物の全部または一部を投与するため、および組換え受容体を発現するCD8＋T細胞をさらに投与するための説明書を含む。いくつかの態様において、説明書は、CD8＋T細胞を投与する前にCD4＋T細胞を投与することを指定する。いくつかの場合において、説明書は、CD4＋T細胞を投与する前にCD8＋T細胞を投与することを指定する。いくつかの態様において、製造品またはキットは、組換え受容体を発現する複数のCD8＋T細胞、ならびに疾患または病態を有する対象に、組換え受容体を発現する複数のCD8＋T細胞およびCD4＋T細胞の全部または一部を投与するための説明書を含む。いくつかの態様において、説明書は、細胞の投与の投薬レジメンおよびタイミングを指定する。
いくつかの局面において、説明書は、CD4＋T細胞の全部または一部およびCD8＋T細胞の全部または一部を0〜12時間間隔、0〜6時間間隔または0〜2時間間隔で投与することを指定する。いくつかの場合において、説明書は、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を2時間以内、1時間以内、30分以内、15分以内、10分以内、または5分以内の間隔で投与することを指定する。
いくつかの態様において、説明書は、細胞の用量もしくは数または細胞型（1つもしくは複数）および/もしくは細胞型の比率、例えばCD4＋対CD8＋比などの個々の集団もしくはサブタイプを指定する。いくつかの態様において、CD8＋およびCD4＋T細胞などの細胞の集団またはサブタイプ。例えば、いくつかの態様において、説明書は、細胞が、5:1もしくは約5:1〜5:1もしくは約5:1（または約1:5超〜約5:1未満）、または1:3もしくは約1:3〜3:1もしくは約3:1（または約1:3超〜約3:1未満）、例えば2:1もしくは約2:1〜1:5もしくは約1:5（または約1:5超〜約2:1未満、例えば5:1もしくは約5:1、4.5:1もしくは約4.5:1、4:1もしくは約4:1、3.5:1もしくは約3.5:1、3:1もしくは約3:1、2.5:1もしくは約2.5:1、2:1もしくは約2:1、1.9:1もしくは約1.9:1、1.8:1もしくは約1.8:1、1.7:1もしくは約1.7:1、1.6:1もしくは約1.6:1、1.5:1もしくは約1.5:1、1.4:1もしくは約1.4:1、1.3:1もしくは約1.3:1、1.2:1もしくは約1.2:1、1.1:1もしくは約1.1:1、1:1もしくは約1:1、1:1.1もしくは約1:1.1、1:1.2もしくは約1:1.2、1:1.3もしくは約1:1.3、1:1.4もしくは約1:1.4、1:1.5もしくは約1:1.5、1:1.6もしくは約1:1.6、1:1.7もしくは約1:1.7、1:1.8もしくは約1:1.8、1:1.9:1:2もしくは約1:1.9:1:2、1:2.5もしくは約1:2.5、1:3もしくは約1:3、1:3.5もしくは約1:3.5、1:4もしくは約1:4、1:4.5もしくは約1:4.5、または1:5もしくは約1:5の、CD4＋およびCD8＋T細胞またはサブタイプなどの複数の細胞集団またはサブタイプのアウトプット比の許容範囲でまたは許容範囲内で投与されることを指定する。一部の特定の態様において、説明書は、濃縮CD4＋T細胞および濃縮CD8＋T細胞の組成物が所望の比率で組み合わされ、単一細胞組成物として対象に投与されることを指定する。特定の態様において、説明書は、濃縮CD4＋T細胞および濃縮CD8＋T細胞の組成物が、所望の比率で別個の組成物として投与されることを指定する。いくつかの局面において、許容差は、所望の比率の約1％以内、約2％以内、約3％以内、約4％以内、約5％以内、約10％以内、約15％以内、約20％以内、約25％以内、約30％以内、約35％以内、約40％以内、約45％以内、約50％以内であり、これらの範囲の間の任意の値を含む。
VII.定義
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記法ならびに他の技術および科学用語または専門用語は、特許請求される主題が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有することが意図されている。いくつかの場合において、一般的に理解される意味を有する用語は、明確化および/または参照を容易にするために本明細書で定義され、本明細書にかかる定義を含むことは、必ずしも当技術分野で一般的に理解されているものに対する実質的な相違を表すと解釈されるべきではない。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを示すために互換的に使用され、最小限の長さに限定はない。ポリペプチド、例えば提供される受容体および他のポリペプチド、例えばリンカーまたはペプチドは、天然および/または非天然のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基を含み得る。この用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えばグリコシル化、シアリル化、アセチル化およびリン酸化もまた包含している。いくつかの局面において、ポリペプチドは、そのタンパク質が所望の活性を維持している限り、天然状態の配列または天然の配列に対する修飾を含み得る。このような修飾は、部位特異的変異誘発によるような意図的なものであってもよく、例えばPCR増幅によるタンパク質またはエラーをもたらす宿主の変異による偶発的なものであってもよい。
本明細書において使用する場合、「対象」は哺乳動物、例えばヒトまたは他の動物であり、典型的にはヒトである。いくつかの態様において、作用物質（1つもしくは複数）、細胞、細胞集団または組成物が投与される対象、例えば患者は哺乳動物、典型的には霊長類、例えばヒトである。いくつかの態様において、霊長類はサルまたは類人猿である。対象は男性/雄または女性/雌であり得、任意の適切な年齢、例えば幼児/幼獣、年少、青年期、成人/成獣および老齢期の対象であり得る。いくつかの態様において、対象は非霊長類哺乳動物、例えば齧歯類である。
本明細書において使用する場合、「処置」（およびその文法的語尾変化形、例えば「処置する」または「処置すること」）は、疾患もしくは病態もしくは障害または症状、有害効果もしくは転帰またはこれらに関連する表現型の完全軽快もしくは一部軽快または低減を示す。望ましい処置効果としては、限定するわけではないが、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患のいずれかの直接または間接的な病理学的帰結の減衰、転移の予防、疾患進行の減速、疾患状態の軽快または待期、および寛解または予後の改善が挙げられる。この用語は、疾患の完全な治癒あるいはいずれかの症状またはすべての症状もしくは転帰に対する効果（1つもしくは複数）の完全な消去を示唆するものではない。
本明細書において使用する場合、「疾患の発病を遅延させる」とは、疾患（例えば、がん）の発病を延ばす、妨害する、遅滞させる、遅らせる、安定させる、抑制する、および/または延期することを意味する。この遅延は、処置対象の疾患および/または個体の病歴に応じていろいろな長さの時間であり得る。いくつかの態様において、充分または有意な遅延には、事実上、個体が疾患を発病しないという点で予防が包含され得る。例えば、末期がん、例えば転移の発生が遅延され得る。
「予防する」とは、本明細書において使用する場合、疾患に対して素因があるかもしれないが、まだ該疾患と診断されていない対象において、疾患の発生または再発に関して予防をもたらすことを包含している。いくつかの態様において、提供される細胞および組成物は、疾患の発病を遅延させるため、または疾患の進行を遅滞させるために使用される。
本明細書において使用する場合、機能または活性を「抑制する」とは、関心対象の条件もしくはパラメータ以外、その他は同じ条件と比べた場合、または代替的に、別の条件と比べて該機能または活性を低下させることである。例えば、腫瘍の成長を抑制する細胞は、腫瘍の成長速度を、該細胞の非存在下での腫瘍の成長速度と比べて低下させる。
投与の状況における作用物質、例えば薬学的製剤、細胞または組成物の「有効な量」は、必要な投与量/量および期間で、所望の結果、例えば治療結果または予防結果が得られるのに有効な量を示す。
作用物質、例えば薬学的製剤または細胞の「治療上有効な量」は、必要な投与量および期間で、例えば疾患、病態、もしくは障害の処置および/または処置の薬物動態的もしくは薬力学的効果のための所望の治療結果が得られるのに有効な量を示す。治療上有効な量は、対象の疾患状態、年齢、性別および体重ならびに投与される細胞集団などの要素に応じて異なり得る。いくつかの態様において、提供される方法は、細胞および/または組成物を有効な量、例えば治療上有効な量で投与することを伴う。
「予防上有効な量」は、必要な投与量および期間で、所望の予防結果が得られるのに有効な量を示す。典型的には、必ずしもそうではないが、予防用量は疾患前または疾患の初期の対象に使用されるため、予防上有効な量は治療上有効な量より少ない。低腫瘍負荷の状況では、いくつかの局面における予防上有効な量は治療上有効な量より高い。
用語「約」は、本明細書において使用する場合、この技術分野における当業者には容易に理解されるそれぞれの値についての通常の誤差範囲を示す。「約」を伴って値またはパラメータが本明細書において示される場合、その値またはパラメータそのものに向けられる態様が含まれる（記載される）。
本明細書において使用する場合、単数形である「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈がそうではないことを明確に示す場合を除き、複数形の言及物を包含する。例えば、「1つの（a）」または「1つの（an）」は、「少なくとも1つ」または「1つまたは複数」を意味する。
本開示の全体を通して、請求項に記載されている主題のさまざまな局面が範囲形式で示される。範囲形式での記載は単に便宜および簡潔性のためであり、請求項に記載されている主題の範囲に関して柔軟性のない限定として解釈してはならないことを理解しなければならない。したがって、範囲の記載は、可能な部分範囲、同様にまた、その範囲に含まれる個々の数値をすべて具体的に開示しているとみなされなければならない。例えば、値の範囲が与えられる場合、その範囲の上限と、下限との間におけるそれぞれの中間の値、およびその指定された範囲における任意の他の指定された値または中間の値が、請求項に記載されている主題の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限がこれらのより小さい範囲に独立して含まれてもよく、これらもまた、指定された範囲における任意の具体的に除外された限界点に従うことを条件にして、請求項に記載されている主題の範囲内に包含される。指定された範囲が限界点の一方または両方を含む場合、そのような含まれる限界点のどちらかまたは両方を除外する範囲もまた、請求項に記載されている主題の範囲内に含まれる。このことは、範囲の広さにかかわらず、当てはまる。
本明細書において使用する場合、組成物は、細胞を含めて、2つ以上の製造物、物質または化合物の混合物をどのようなものであっても示す。組成物は、溶液、懸濁物、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらの任意の組合せであり得る。
本明細書において使用する場合、「濃縮する」とは、1つまたは複数の特定の細胞型または細胞集団に言及している場合、細胞型または細胞集団の数または割合（％）を、例えば、組成物中の細胞総数もしくは容量と比べて、または他の細胞型と比べて、例えば該集団もしくは細胞により発現されるマーカーに基づいた陽性選択によって、または枯渇させる該細胞集団もしくは細胞上に存在するマーカーがないことに基づいた陰性選択によって増大させることを示す。この用語は、組成物からの他の細胞、細胞型または集団の完全な除去を必要とするものではなく、そのように濃縮された細胞が、濃縮された組成物中に100％またはさらにはほぼ100％で存在することを必要とするものではない。
本明細書において使用する場合、細胞または細胞の集団が特定のマーカーについて「陽性」であると述べられることは、特定のマーカー（典型的には表面マーカー）が細胞表面または細胞において検出可能に存在していることを示す。表面マーカーが言及されるとき、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体を用いて染色し、前記抗体を検出することによって検出されるような表面発現の存在を示し、この場合、染色が、イソタイプの一致する対照または蛍光数-1の（FMO）ゲーティングコントロールを、それ以外の点では同一の条件のもとで用いる、同じ手順を行って検出される染色を実質的に超えるレベルでフローサイトメトリーによって検出可能であり、かつ/またはマーカーについて陽性であることが知られている細胞についてのレベルと実質的に類似するレベルであり、かつ/またはマーカーについて陰性であることが知られている細胞についてのレベルよりも実質的に高いレベルである。
本明細書において使用する場合、細胞または細胞の集団が特定のマーカーについて「陰性」であると述べられることは、特定のマーカー（典型的には表面マーカー）が細胞表面または細胞において実質的に検出可能に存在していることが認められないことを示す。表面マーカーが言及されるとき、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体を用いて染色し、前記抗体を検出することによって検出されるような表面発現の非存在を示し、この場合、染色が、イソタイプの一致する対照または蛍光数-1の（FMO）ゲーティングコントロールを、それ以外の点では同一の条件のもとで用いる、同じ手順を行って検出される染色を実質的に超えるレベルでフローサイトメトリーによって検出されず、かつ/またはマーカーについて陽性であることが知られている細胞についてのレベルよりも実質的に低いレベルであり、かつ/またはマーカーについて陰性であることが知られている細胞についてのレベルと比較して実質的に類似するレベルである。
用語「ベクター」は、本明細書において使用する場合、連結される別の核酸を増やすことができる核酸分子を示す。この用語には、自己複製する核酸構造物としてのベクター、同様にまた、導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターが含まれる。ある種のベクターは、機能的に連結される核酸の発現を導くことができる。そのようなベクターは本明細書において「発現ベクター」として示される。
VIII.例示的態様
以下の態様が提供される：
1．操作された細胞の組成物を作製するための方法であって、
組換え受容体を用いて操作された細胞を含む初代ヒトT細胞を含む操作された細胞の組成物を、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で培養する工程であって、前記組成物中の細胞が、培養される前に、前記作用物質へ曝露されていない、前記工程
を含み、かつ
操作されたT細胞を含むアウトプット組成物を作製するために、前記組成物中の前記細胞の増殖または拡大をもたらす、
前記方法。
2．初代T細胞がCD4＋および/またはCD8＋T細胞である、態様1の方法。
3．操作されたT細胞の組成物が、濃縮されたCD4＋T細胞を含む、態様1または態様2の方法。
4．操作されたT細胞の組成物が、濃縮されたCD8＋T細胞を含む、態様1または態様2の方法。
5．操作された細胞の組成物を作製するための方法であって、
組換え受容体を用いて操作されたT細胞を含む濃縮されたCD4＋および/または濃縮されたCD8＋初代ヒトT細胞を含む操作された細胞の組成物を、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で培養する工程
を含み、
操作された、濃縮されたCD4＋または濃縮されたCD8＋T細胞を含むアウトプット組成物を作製するために、前記組成物中の細胞の増殖または拡大をもたらす、
前記方法。
6．操作されたT細胞の組成物が、70％を上回るもしくは約70％を上回る、75％を上回るもしくは約75％を上回る、80％を上回るもしくは約80％を上回る、85％を上回るもしくは約85％を上回る、90％を上回るもしくは約90％を上回る、95％を上回るもしくは約95％を上回る、もしくは98％を上回るもしくは約98％を上回るCD4＋初代ヒトT細胞を含み、かつ/または
インプット組成物が、CD4＋初代ヒトT細胞から本質的になる、態様2、態様3または態様5のいずれかの方法。
7．操作されたT細胞の組成物が、70％を上回るもしくは約70％を上回る、75％を上回るもしくは約75％を上回る、80％を上回るもしくは約80％を上回る、85％を上回るもしくは約85％を上回る、90％を上回るもしくは約90％を上回る、95％を上回るもしくは約95％を上回る、または98％を上回るもしくは約98％を上回るCD8＋初代ヒトT細胞を含み;および/または
インプット組成物が、CD8＋初代ヒトT細胞から本質的になる、態様2、態様4または態様5のいずれかの方法。
8．操作されたT細胞の組成物が、70％を上回るもしくは約70％を上回る、75％を上回るもしくは約75％を上回る、80％を上回るもしくは約80％を上回る、85％を上回るもしくは約85％を上回る、90％を上回るもしくは約90％を上回る、95％を上回るもしくは約95％を上回る、または98％を上回るもしくは約98％を上回るCD4＋およびCD8＋初代ヒトT細胞を含み、ならびに/または
インプット組成物が、CD4＋およびCD8＋初代ヒトT細胞から本質的になる、態様2〜5のいずれかの方法。
9．培養する工程が、1種または複数種のサイトカインの存在下で実施され、任意で、前記1種または複数種のサイトカインが、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、G-CSFおよびGM-CSFのうちの1つまたは複数を含み、任意で、前記1種または複数種のサイトカインがIL-2、IL-7またはIL-15を含む、態様1〜8のいずれか1つの方法。
10．1種または複数種のサイトカインが組換えサイトカインである、態様9の方法。
11．培養する工程の前に、
（a）刺激条件下で、初代T細胞を含むインプット組成物をインキュベートする工程であって、前記刺激条件が、TCR複合体の1つもしくは複数の成分の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン、および/または1つもしくは複数の共刺激分子の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能な刺激性試薬の存在を含み、これにより、刺激された組成物を生成する、前記工程、ならびに
（b）前記刺激された組成物中に組換え受容体を導入し、これにより、操作されたT細胞を含む操作された組成物を生成する工程
をさらに含む、態様1〜10のいずれかの方法。
12．インプット組成物、刺激された組成物および/または操作された組成物が、初代CD4＋および/またはCD8＋T細胞を含む、態様11の方法。
13．インプット組成物、刺激された組成物および/または操作された組成物が、濃縮されたCD4＋T細胞を含む、態様11または態様12の方法。
14．インプット組成物、刺激された組成物および/または操作された組成物が、濃縮されたCD8＋T細胞を含む、態様11または態様12の方法。
15．操作された細胞の組成物を作製するための方法であって、
（a）CD4＋および/またはCD8＋初代ヒトT細胞に関して濃縮されたT細胞を含むインプット組成物を、刺激条件下でインキュベートする工程であって、前記刺激条件が、
（i）TCR複合体の1つもしくは複数の成分の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン、および/または1つもしくは複数の共刺激分子の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能な刺激性試薬、ならびに
（ii）mTOR活性を阻害する作用物質
の存在を含む、前記工程、ならびに
（b）前記刺激された組成物中に組換え受容体を導入し、これにより、操作されたT細胞を含む操作された組成物を生成する工程
を含む、前記方法。
16．インプット組成物、刺激された組成物および/または操作された組成物が、70％を上回るもしくは約70％を上回る、75％を上回るもしくは約75％を回る、80％を上回るもしくは約80％を上回る、85％を上回るもしくは約85％を上回る、90％を上回るもしくは約90％を上回る、95％を上回るもしくは約95％を上回る、もしくは98％を上回るもしくは約98％を上回るCD4＋初代ヒトT細胞を含み、かつ/または
インプット組成物が、CD4＋初代ヒトT細胞から本質的になる、
態様12、態様13および態様15のいずれかの方法。
17．インプット組成物、刺激された組成物および/または操作された組成物が、70％を上回るもしくは約70％を上回る、75％を上回るもしくは約75％を上回る、80％を上回るもしくは約80％を上回る、85％を上回るもしくは約85％を上回る、90％を上回るもしくは約90％を上回る、95％を上回るもしくは約95％を上回る、もしくは98％を上回るもしくは約98％を上回るCD8＋初代ヒトT細胞を含み、かつ/または
インプット組成物が、CD8＋初代ヒトT細胞から本質的になる、
態様12、態様14または態様15のいずれかの方法。
18．インプット組成物、刺激された組成物および/または操作された組成物が、70％を上回るもしくは約70％を上回る、75％を上回るもしくは約75％を回る、80％を上回るもしくは約80％を上回る、85％を上回るもしくは約85％を上回る、90％を上回るもしくは約90％を上回る、95％を上回るもしくは約95％を上回る、もしくは98％を上回る、もしくは約98％を上回るCD4＋およびCD8＋初代ヒトT細胞を含み、ならびに/または
インプット組成物が、CD4＋およびCD8＋初代ヒトT細胞から本質的になる、態様12〜15のいずれかの方法。
19．mTOR活性を阻害する作用物質が、小分子、小有機分子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、siRNAまたはポリペプチドであり、任意で、mTOR活性を阻害する作用物質が小有機分子である、態様1〜18のいずれか1つの方法。
20．mTOR活性を阻害する作用物質が、mTORC1および/またはmTORC2キナーゼ活性を阻害する、態様1〜19のいずれかの方法。
21．mTOR活性を阻害する作用物質が、少なくとも1つのさらなるキナーゼの活性を阻害し、任意で、前記少なくとも1つのさらなるキナーゼがPI3Kである、態様1〜19のいずれかの方法。
22．mTOR活性を阻害する作用物質がBEZ235、BGT226、GDC0980、NVP-BEZ235、PF-04691502、PI-103、SAR245409、SF1126、VS5584またはXL765である、態様19〜21のいずれかの方法。
23．mTOR活性を阻害する作用物質が、
（i）PI3K活性を阻害しない、
（ii）mTOR活性に対するIC50において、PI3K活性を検出可能に阻害しない、かつ/または
（iii）mTOR活性を検出可能に阻害する全ての濃度において、PI3Kを検出可能に阻害しない、
態様1〜19のいずれかの方法。
24．mTOR活性を阻害する作用物質が、mTORC1およびmTORC2キナーゼ活性を阻害する、態様1〜19または態様23のいずれかの方法。
25．mTOR活性を阻害する作用物質が、ピラゾロピリミジン、トリンl、トルキニブ、PP30、Ku-0063794、WAY-600（Wyeth）、WAY-687（Wyeth）、WAY-354（Wyeth）、OSI-027、DS3078aまたはAZD8055である、態様1〜19、態様23または態様24のいずれかの方法。
26．mTOR活性を阻害する作用物質が、mTORC1活性を選択的に阻害する、態様1〜19のいずれかの方法。
27．mTOR活性を阻害する作用物質が、
（i）mTORC2活性を阻害しない、
（ii）mTORC1活性に対するIC50において、mTORC2活性を検出可能に阻害しない、かつ/または
（iii）mTORC1活性を検出可能に阻害する全ての濃度において、mTORC2を検出可能に阻害しない、
26の方法。
28．mTOR活性を阻害する作用物質が、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、デフォロリムスまたはAZD8055である、態様26または態様27の方法。
29．前記作用物質が、式I
Figure 2021501607
に記載されている式を含み、
式中、R1は、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルであり、
R2は、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルであり、かつ
R3およびR4は、独立に、HまたはC1〜8アルキルである、
態様1〜19、態様23または態様24のいずれかの方法。
30．R1が、置換されたアリール、置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、例えば置換されたフェニルである、態様29の方法。
31．R2が、置換されたもしくは置換されていないアリールおよび/または置換されたもしくは置換されていないフェニルである、態様29または態様30の方法。
32．置換されている基が、1つまたは複数の、ハロゲン;C1〜8アルキル;C2〜8アルケニル;C2〜8アルキニル;ヒドロキシル;C1〜8アルコキシル;アミノ;ニトロ;チオール;チオエーテル;イミン;シアノ;アミド;ホスホナート;ホスフィン;カルボキシル;チオカルボニル;スルホニル;スルホンアミド;ケトン;アルデヒド;エステル;カルボニル;ハロアルキル;B（OH）2;炭素環式シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、単環式もしくは縮合もしくは非縮合多環式アリールもしくはヘテロアリール;アミノ;O-低級アルキル;O-アリール、アリール;アリール-低級アルキル;CO2CH3;CONH2;OCH2CONH2;NH2;SO2NH2;OCHF2;CF3;またはOCF3基で置換されている、態様29〜31のいずれかの方法。
33．mTOR活性を阻害する作用物質が化合物63である、態様1〜19、態様23、態様24または態様29〜32のいずれかの方法。
34．前記作用物質が、式（II）
Figure 2021501607
に記載されている式を含み、
式中、Lは、直接の結合、NHまたはOであり、
Yは、NまたはCR3であり、
R1は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないC2〜8アルケニル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルであり、
R2は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルであり、
R3は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキル、-NHR4または-N（R4）2であり、かつ
R4は、各出現において、独立に、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルである、
態様1〜19、態様23または態様24のいずれかの方法。
35．R1が、置換されたアリールおよび/または置換されたフェニルである、態様34の方法。
36．YがCHである、態様34または態様35の方法。
37．Lが直接の結合である、態様34〜36のいずれかの方法。
38．R1が置換されたアリールであり、かつR2が、アルコキシ、アミノ、ヒドロキシ、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換されたC1〜8アルキルである、態様34〜37のいずれの方法。
39．R2が、ヘテロシクロアルキルで置換されたC1〜8アルキルである、態様38の方法。
40．mTOR活性を阻害する作用物質が化合物155である、態様1〜19、態様23、態様24または態様34〜39のいずれかの方法。
41．前記作用物質が、式III
Figure 2021501607
に記載されている式を含み、
式中、R1は、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリルアルキルであり、
R2は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリルアルキル、置換されたもしくは置換されていないアラルキル、または置換されたもしくは置換されていないシクロアルキルアルキルであり、かつ
R3は、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキルである、
態様1〜19、態様23または態様24のいずれかの方法。
42．R1が、置換されたもしくは置換されていないアリールまたは置換されたもしくは置換されていないヘテロアリールである、態様41の方法。
43．R1が、置換されたピリジルである、態様41または態様42の方法。
44．R1が、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリル、ハロゲン、アミノカルボニル、シアノ、ヒドロキシアルキル、-ORおよび-NR2からなる群より独立に選択される1つまたは複数の置換基で置換されたピリジルであり、ここで、各Rは、独立に、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキルである、態様41〜43のいずれかの方法。いくつかの態様において、R1は、置換されたまたは置換されていないC1〜8アルキルおよび-NR2からなる群より独立に選択される1つまたは複数の置換基で任意に置換された、1H-ピロロ［2,3-b］ピリジルまたはベンゾイミダゾリルであり、ここで、Rは独立に、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキルである。
45．R1が、
Figure 2021501607
であり、
式中、Rは、各出現において、独立に、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキル（例えば、メチル）であり;R1は、各出現において、独立に、置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキル、ハロゲン、シアノ、-ORまたは-NR2であり;mは0〜3であり;かつnは、0〜3である、
態様41〜44のいずれかの方法。
46．R2が、H、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、（C1〜4アルキル）-フェニル、（C1〜4アルキル）-シクロプロピル、（C1〜4アルキル）-シクロブチル、（C1〜4アルキル）-シクロペンチル、（C1〜4アルキル）-シクロヘキシル、（C1〜4アルキル）-ピロリジル、（C1〜4アルキル）-ピペリジル、（C1〜4アルキル）-ピペラジニル、（C1〜4アルキル）-モルホリニル、（C1〜4アルキル）-テトラヒドロフラニル、または（C1〜4アルキル）-テトラヒドロピラニルであり、それぞれが任意に置換されている、態様41〜45のいずれかの方法。
47．R2が、H、C1〜4アルキル、（C1〜4アルキル）（OR）、
Figure 2021501607
であり、
式中、Rは、各出現において、独立に、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキルであり;R'は、各出現において、独立に、H、-OR、シアノ、または置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキルであり、かつpは、0〜3である、態様41〜46のいずれかの方法。
48．mTOR活性を阻害する作用物質が化合物246である、態様1〜19、態様23、態様24または態様41〜47のいずれかの方法。
49．組換え受容体を用いて操作されたT細胞を含む濃縮された初代ヒトT細胞を含む操作された細胞の組成物を、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で培養する工程を含む、操作された細胞の組成物を作製するための方法であって、
mTOR活性を阻害する作用物質が、化合物63、化合物155または化合物246であり;
前記方法が、操作されたT細胞を含むアウトプット組成物を作製するために、前記組成物中の細胞の増殖または拡大をもたらす、
前記方法。
50．操作された細胞の組成物が、500nM〜2μM、1nM〜100nM、50nM〜250nMまたは100nM〜500nMの化合物63の存在下で培養される、態様33または態様49の方法。
51．操作された細胞の組成物が、500nM〜2μM、1nM〜100nM、50nM〜250nMまたは100nM〜500nMの化合物155の存在下で培養される、態様40または態様49の方法。
52．操作された細胞の組成物が、500nM〜2μM、1nM〜100nM、50nM〜250nMまたは100nM〜500nMの化合物246の存在下で培養される、態様48または態様49の方法。
53．培養する工程の前に、
（a）刺激条件下で、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下において、初代T細胞を含むインプット組成物をインキュベートする工程であって、前記刺激条件が、TCR複合体の1つもしくは複数の成分の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン、および/または1つもしくは複数の共刺激分子の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能な刺激性試薬の存在を含み、これにより、刺激された組成物を生成し、ならびにmTOR活性を阻害する作用物質が、化合物63、化合物155または化合物246である、前記工程、ならびに
（b）前記刺激された組成物中に組換え受容体を導入し、これにより、操作されたT細胞を含む操作された組成物を生成する工程
をさらに含む、態様49の方法。
54．操作された細胞の組成物を作製するための方法であって、
（a）初代ヒトT細胞を含むインプット組成物を、刺激条件下でインキュベートする工程であって、前記刺激条件が、
（i）TCR複合体の1つもしくは複数の成分の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン、および/または1つもしくは複数の共刺激分子の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能な刺激性試薬、ならびに
（ii）mTOR活性を阻害する作用物質
の存在を含み、mTOR活性を阻害する作用物質が化合物63、化合物155または化合物246である、前記工程、ならびに
（b）前記刺激された組成物中に組換え受容体を導入し、これにより、操作されたT細胞を含む操作された組成物を生成する工程
を含む、前記方法。
55．初代T細胞が、CD4＋T細胞および/またはCD8＋T細胞において濃縮されている、態様53または態様54の方法。
56．刺激性試薬が、
TCR複合体の一員に特異的に結合し、任意に、CD3に特異的に結合する一次作用物質と;
任意で、T細胞共刺激分子に特異的に結合する二次作用物質であって、任意で、CD28、CD137（4-1-BB）、OX40またICOSから選択される、前記共刺激分子と
を含む、態様11〜48、態様53、態様54または態様55のいずれかの方法。
57．一次および/または二次作用物質が抗体を含み、任意に、刺激性試薬が、抗CD3抗体および抗CD28抗体またはこれらの抗原結合断片とのインキュベーションを含む、態様55または態様56の方法。
58．一次作用物質および/または二次作用物質が固体支持体の表面上に存在する、態様55〜57のいずれかの方法。
59．固体支持体がビーズであるかまたはビーズを含む、態様58の方法。
60．ビーズが、3.5μmを上回るまたは約3.5μmを上回るが、約9μm以下または約8μm以下または約7μm以下または約6μm以下または約5μm以下の直径を含む、態様59の方法。
61．ビーズが4.5μmの直径または約4.5μmの直径を含む、態様60または態様61の方法。
62．ビーズが不活性である、態様59〜61のいずれかの方法。
63．ビーズがポリスチレン表面であるかまたはポリスチレン表面を含む、態様59〜62のいずれかの方法。
64．ビーズが磁性または超常磁性である、態様59〜63のいずれかの方法。
65．ビーズ対細胞の比が、4:1〜0.25:1または約4:1〜約0.25:1である、態様59〜64のいずれかの方法。
66．前記導入が、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを用いて、刺激された組成物の細胞に形質導入することを含む、態様11〜48または態様53〜65のいずれかの方法。
67．ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、態様66の方法。
68．ウイルスベクターがレンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、態様66または態様67の方法。
69．前記導入が、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで、刺激された組成物の細胞をトランスフェクトすることを含む、態様11〜48または態様53〜65のいずれかの方法。
70．ベクターがトランスポゾンであり、任意に、眠れる美女（SB（Sleeping Beauty））トランスポゾンまたはピギーバック（Piggybac）トランスポゾンである、態様69の方法。
71．培養に引き続き、前記方法が、アウトプット組成物の細胞を収集する工程をさらに含む、態様1〜14、態様16〜53または態様55〜70のいずれかの方法。
72．凍結保存および/または対象への投与のために、任意に薬学的に許容される賦形剤の存在下で、アウトプット組成物の細胞を製剤化することをさらに含む、態様1〜14、態様16〜53または態様55〜71のいずれかの方法。
73．アウトプット組成物の細胞が、凍結保護物質の存在下で製剤化される、態様72の方法。
74．凍結保護物質がDMSOを含む態様73の方法。
75．アウトプット組成物の細胞が、容器、任意にバイアルまたはバッグ中に製剤化される、態様72〜74のいずれかの方法。
76．インキュベートする工程の前に、CD4＋および/またはCD8＋T細胞を生物学的試料から単離する工程をさらに含む、態様11〜48または態様53〜75のいずれかの方法。
77．前記単離する工程が、任意で陽性または陰性選択によって、CD4および/またはCD8の表面発現に基づいて細胞を選択することを含む、態様76の方法。
78．前記単離する工程が、免疫親和性ベースの選択を実施することを含む、態様76または態様77の方法。
79．生物学的試料が対象から得られた初代T細胞を含む、態様76〜78のいずれかの方法。
80．生物学的試料が、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核球（PBMC）試料、未分画T細胞試料、リンパ球試料、白血球試料、アフェレーシス産物もしくは白血球アフェレーシス産物であるか、またはそれを含む、態様76〜79のいずれかの方法。
81．組換え受容体が、疾患、障害もしくは病態の細胞もしくは組織に関連する、疾患、障害もしくは病態の細胞もしくは組織に特異的である、かつ/または疾患、障害もしくは病態の細胞もしくは組織上に発現される標的抗原に結合することが可能である、態様1〜80のいずれかの方法。
82．疾患、障害または病態が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである、態様81の方法。
83．標的抗原が腫瘍抗原である、態様81または態様82の方法。
84．標的抗原が、5T4、8H9、avb6インテグリン、B7-H6、B細胞成熟抗原（BCMA）、CA9、がん精巣抗原、炭酸脱水酵素9（CAIX）、CCL-1、CD19、CD20、CD22、CEA、B型肝炎表面抗原、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、がん胎児性抗原（CEA）、CE7、サイクリン、サイクリンA2、c-Met、二重抗原、EGFR、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、EPHa2、エフリンB2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二量体、EGFR vIII、エストロゲン受容体、胎児AchR、葉酸受容体アルファ、葉酸結合タンパク質（FBP）、FCRL5、FCRH5、胎児アセチルコリン受容体、G250/CAIX、GD2、GD3、Gタンパク質共役受容体5D（GPRC5D）、gp100、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerbB2）、HMW-MAA、IL-22R-アルファ、IL-13受容体アルファ2（IL-13Ra2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、ルイスY、L1-細胞接着分子（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1、メソテリン、マウスCMV、ムチン1（MUC1）、MUC16、NCAM、NKG2D、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、O-アセチル化GD2（OGD2）、腫瘍胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、PSCA、プロゲステロン受容体、サバイビン、ROR1、TAG72、tEGFR、VEGF受容体、VEGF-R2、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的抗原およびユニバーサルタグに関連する抗原の中から選択される、態様81〜83のいずれかの方法。
85．組換え受容体が、機能性の非TCR抗原受容体もしくはTCRもしくはこれらの抗原結合断片であるか、または機能性の非TCR抗原受容体もしくはTCRもしくはこれらの抗原結合断片を含む、態様1〜84のいずれかの方法。
86．組換え受容体がキメラ抗原受容体（CAR）である、態様1〜85のいずれかの方法。
87．組換え受容体が抗CD19CARである、態様1〜86のいずれかの方法。
88．キメラ抗原受容体が抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む、態様87の方法。
89．抗原結合ドメインが、抗体もしくは任意で一本鎖断片であるその抗体断片であるか、または抗体もしくは任意で一本鎖断片であるその抗体断片を含む、態様88の方法。
90．断片がフレキシブルリンカーによって連結された抗体可変領域を含む、態様89の方法。
91．断片がscFvを含む、態様89または態様90の方法。
92．キメラ抗原受容体が、スペーサーおよび/またはヒンジ領域をさらに含む、態様90〜91のいずれかの方法。
93．キメラ抗原受容体が細胞内シグナル伝達領域を含む、態様90〜92のいずれかの方法。
94．細胞内シグナル伝達領域が細胞内シグナル伝達ドメインを含む、態様93の方法。
95．細胞内シグナル伝達ドメインが、一次シグナル伝達ドメイン、T細胞中で一次活性化シグナルを誘導することが可能なシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメイン、および/もしくは免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む、態様94の方法。
96．細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3鎖の、任意にCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメインもしくはそのシグナル伝達部分であるか、またはCD3鎖の、任意にCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメインもしくはそのシグナル伝達部分を含む、態様95の方法。
97．キメラ抗原受容体が、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達領域の間に配置された膜貫通ドメインをさらに含む、態様94〜96のいずれかの方法。
98．細胞内シグナル伝達領域が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、態様94〜97のいずれかの方法。
99．共刺激シグナル伝達領域が、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含む、態様98の方法。
100．共刺激シグナル伝達領域が、CD28、4-1BBもしくはICOSの細胞内シグナル伝達ドメインまたはこれらのシグナル伝達部分を含む、態様98または態様99の方法。
101．共刺激シグナル伝達領域が、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達領域との間にある、態様99〜100のいずれかの方法。
102．
（i）初代T細胞が、濃縮されたCD4＋T細胞および濃縮されたCD8＋T細胞の別個の組成物を含み、かつ濃縮されたCD4＋T細胞および濃縮されたCD8＋T細胞の組成物が、別々に培養され、または
（ii）初代T細胞が、濃縮されたCD4＋T細胞および濃縮されたCD8＋T細胞の別個の組成物を含み、該組成物が、濃縮されたCD4＋T細胞および濃縮されたCD8＋T細胞を一緒に培養するために混合される、
態様1〜14、態様16〜53または態様55〜100のいずれかの方法。
103．態様1〜102のいずれかの方法によって作製された、操作された細胞を含む組成物。
104．薬学的に許容される担体をさらに含む、態様103の組成物。
105．凍結保護物質、任意にDMSOを含む、態様103または態様104の組成物。
106．態様103〜105のいずれかの組成物と、アウトプット組成物を対象に投与するための指示書とを含む、製造品。
107．対象が疾患または病態を有し、任意で、組換え受容体が、前記疾患もしくは病態に関連する抗原または前記疾患もしくは病態の細胞上に発現されるかもしくは存在する抗原を特異的に認識するか、または前記抗原に特異的に結合する、態様106の製造品。
108．アウトプット組成物が、操作されたCD4＋T細胞の組成物である、態様106または態様107の製造品。
109．アウトプット組成物が、CD8＋T細胞の操作された組成物である、態様107または態様108の製造品。
110．態様2〜3、態様5〜6、態様9〜14、態様16〜17、態様19〜49、態様51〜53または態様56〜109のいずれかの方法によって作製された操作されたCD4＋T細胞の組成物と、態様2、態様4、態様5、態様7、態様9〜13、態様15、態様16、態様18〜49、態様51〜53または態様56〜109のいずれかの方法によって作製された操作されたCD8＋T細胞の組成物と、ならびに操作されたCD4＋T細胞および操作されたCD8＋T細胞を対象に投与するための指示書とを含む、製造品。
111．指示書が、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を対象に別々に投与することを指定する、態様110の製造品。
112．指示書が、CD4＋T細胞およびCD8＋T細胞を対象に所望される比率で投与することを指定する、態様110または態様111の製造品。
IX.実施例
以下の実施例は、例示を目的として含まれるにすぎず、本発明の範囲を限定することは意図されていない。
実施例1:初代ヒトT細胞の培養のためのmTORキナーゼ阻害剤の用量決定
リボソームタンパク質S6の阻害をモニタリングすることによって、初代ヒトT細胞中での例示的なmTORキナーゼ阻害剤の用量効果を評価した。
ヒトドナー対象から得た白血球除去試料からの免疫親和性ベースの濃縮によって、CD4＋およびCD8＋T細胞を単離した。単離されたCD4＋およびCD8＋T細胞を1:1混合し、mTORキナーゼ阻害剤、PI-103、化合物155、化合物63または化合物246の漸増濃度の存在下で抗CD3/抗CD28磁気ビーズで刺激した。T細胞培養物を、37℃で一晩（およそ16時間）インキュベートした。PI-103、化合物155、化合物63または化合物246の存在下でのインキュベーション後に、T細胞を細胞内S6リン酸化に関して評価し、フローサイトメトリーによって、CD4またはCD8の表面発現に対して共染色した。
結果が、図1A〜Dに示されている。全て、CD4＋およびCD8＋T細胞の両方でのmTORキナーゼ阻害剤によって阻害されたS6リン酸化を評価した。PI-103、化合物155、化合物63および化合物246によるT細胞中でのS6リン酸化の阻害に対するIC50は、それぞれ、およそ、100nM、100nM、500nMおよび500nMであった。CD4＋およびCD8＋T細胞中でのIC50が、表E1に示されている。
（表１）Ribo-S6リン酸化の阻害に対するIC50
Figure 2021501607
実施例2:mTORキナーゼ阻害剤の存在下でのインキュベーション後のT細胞拡大の評価
免疫親和性ベースの濃縮によって、ヒト白血球除去試料からCD4＋およびCD8＋細胞の別個の組成物を単離し、凍結冷凍した。続いて、組成物のCD4＋およびCD8＋細胞を融解し、およそ20時間、抗CD3/抗CD28磁気ビーズおよび組換えIL-2、IL-7および/またはIL-15の存在下での刺激条件下で、細胞を別々に培養することによって活性化した。次いで、抗CD19キメラ抗原受容体（CAR）をコードするウイルスベクターを用いて細胞に形質導入した。形質導入後に、様々な濃度の、化合物155、化合物63または化合物246のいずれかのmTORキナーゼ阻害剤の存在下で、CD4＋およびCD8＋細胞を別々にインキュベートした。対照として、培地のみ、DMSOビヒクルとともに、または200nMPI-103とともに、細胞をインキュベートした。37℃で、融解後およそ8日間、培地を1回交換して、インキュベーションを実施し、培地交換の時点で、化合物を同じ濃度で培地に再添加した。
形質導入後に培養のために播種された細胞の量と比較した、前記プロセスの終了時でのCD8＋およびCD4＋T細胞のパーセントが図2に示されている。耐容された用量を選択するためのカットオフは、培地およびDMSO対照の平均値の70％に設定した。ビヒクル対照群において観察されたものと類似のレベルのCD8およびCD4T細胞拡大をもたらした、化合物155、化合物63および化合物246の最高耐容用量は、それぞれ、100nM、1μMおよび100nMであった。
実施例3:mTORキナーゼ阻害剤の存在下で拡大されたキメラ抗原受容体（CAR）形質導入T細胞（CAR T細胞）の機能性の評価
3人のヒトドナーから、CD4＋およびCD8＋細胞の別々の組成物を単離し、活性化し、実質的に実施例2に記載されているとおりに、抗CD19CARをコードするウイルスベクターで形質導入した。形質導入後、200nMPI-103、1μM化合物63の存在下またはDMSOビヒクルもしくは培地のみ対照を用いたことを除き、実質的に実施例2に記載されているとおりに、T細胞を拡大させるためにmTORキナーゼ阻害剤の存在下で、8日間、各ドナーに由来するCD4＋およびCD8＋T細胞を別々にインキュベートした。次いで、各ドナーから得たCD4＋およびCD8＋T細胞を別々に採集し、製剤化し、凍結冷凍した。凍結冷凍された操作されたCD4＋およびCD8＋T細胞を融解し、化合物を除去するために洗浄し、次いで、CD4＋およびCD8＋T細胞を含有する拡大された抗CD19CAR-T細胞組成物を作製するために、1:1の生きたCD4＋/CAR＋T細胞対生きたCD8＋/CAR＋T細胞の比率で、同じドナーから得た細胞を合わせた。生成された抗CD19CAR-T細胞組成物の機能性の活性を評価した。
解糖代謝
CD4＋T細胞と合わせる前に、生成された抗CD19CAR-T細胞組成物由来のCD8＋CAR-T細胞中で、T細胞受容体（TCR）刺激に応答した細胞の解糖代謝の変化を測定した。細胞外流動生物分析装置（Seahorse Bioanalyzer、Agilent Technologies）を用いてリアルタイムで、CD8＋CAR-T細胞中での細胞外酸性化速度（ECAR）を測定することによって、解糖代謝を評価した。ベースラインECAR測定値は、生成された抗CD19CAR-T細胞組成物由来の培養されたCD8＋CAR-T細胞から取得した。三回目のECAR測定（アッセイに入っておよそ20分）後に、抗CD3/抗CD28磁気ビーズを培養物に添加した。アッセイの0から76分までの、ECAR速度（mpH/分）に対する曲線下面積（AUC）および培地対照と比較した最大ECAR解糖バースト比（n＝3のドナー）を決定した。
図3Aに示されているように、抗CD3/抗CD28ビーズでの刺激は、全ての生成された抗CD19CAR-T細胞組成物のうち、CD8＋CAR-T細胞中のECARを増加させた。化合物63の存在下での拡大によって生成された抗CD19CAR-T細胞のうち、CD8＋CAR-TのTCR刺激の際に解糖バーストが増強される傾向が、3人のドナーの各々において、ECAR AUC（図3B）または培地対照と比較したECAR比（図3C）によって観察された。
拡大されたCAR-T細胞中でのCARシグナル伝達
ホスホ-S6の活性化をモニタリングすることによって、生成された抗CD19CAR-T細胞組成物のうちCAR-T細胞の抗原依存性シグナル伝達を評価した。培地のみ、DMSOビヒクル、PI-103または化合物63の存在下で拡大された、生成された抗CD19CAR-T細胞組成物由来の細胞を、CD19を発現するように形質導入された照射されたK562細胞（K562-CD19標的細胞）とともに、1:1の比で共培養した。20時間後に、細胞内S6リン酸化に関して細胞を評価し、フローサイトメトリーによって、CD4またはCD8の表面発現に対して共染色した。
図4Aに示されているように、抗原で刺激されなかった細胞と比較して、生成された抗CD19CAR-T細胞組成物の各々のうちCD4＋およびCD8＋T細胞において、抗原発現細胞での刺激後に、より高いレベルのホスホ-S6が観察された。DMSOビヒクルまたは培地のみとともに拡大された対照組成物と比較して、PI-103または化合物63の存在下で拡大された組成物のうちCD4＋およびCD8＋T細胞において、ホスホ-S6染色が類似していた。これらの結果は、mTORキナーゼ阻害剤の存在下で拡大された細胞が、阻害剤の洗い流し後に、正常なmTORキナーゼシグナル伝達活性を保持するという知見と合致する。
細胞溶解活性
細胞溶解活性を評価するために、3:1または1:1のいずれかのエフェクター細胞対標的細胞の比率で、K562-CD19標的細胞とともに、生成された抗CD19CAR-T細胞組成物を共培養した。蛍光顕微鏡による追跡を可能にするために、標的細胞をNucLight Red（NLR）で標識した。陰性対照として、K562-CD19標的細胞を単独で培養し、または抗CD19CARを発現していないCD4＋およびCD8＋T細胞とともに共培養した。（INCUCYTE（登録商標）Live Cell Analysis System、Essen Bioscienceを用いて）赤色蛍光シグナルによって判定して、80時間後の生きた標的細胞の喪失を測定することによって殺活性を評価した。細胞死滅は、経時的な生きた標的細胞の量の関数としての曲線下面積の逆数として定量した。
図4Bに示されているように、PI-103または化合物63の存在下で拡大された細胞は、DMSOビヒクルまたは培地のみで拡大された対照細胞と類似の細胞溶解活性を示した。これらの結果は、標的細胞死滅機能がmTORキナーゼ阻害剤の存在下で拡大されたT細胞中で保持されたことを示す。
サイトカイン測定
抗原刺激後にサイトカインを測定するために、1:1のエフェクター:標的細胞比で、照射されたK562-CD19標的細胞またはK562親標的細胞とともに、生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から得た細胞を共培養した。一晩（約16時間）の培養後に、細胞培養上清を採集し、Luminex Multiplex Assayを用いて、TNF-アルファ、IFN-ガンマおよびIL-2サイトカイン産生を測定した。培地のみの中で拡大された細胞と比較した、PI-103、化合物63またはDMSOビヒクルの存在下で拡大された生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から、共培養上清中に観察されたサイトカイン産生の倍数変化を決定した。
図5に示されているように、抗原発現細胞とともに共培養されたT細胞から、TNF-アルファ、IFN-ガンマおよびIL-2の産生が検出された。PI-103または化合物63の存在下で拡大された生成された抗CD19CAR-T細胞組成物由来の細胞は、対照細胞と比較して、特に、PI-103または化合物63のいずれかで拡大された細胞において改善されたIFN-ガンマ産生に関して、サイトカイン産生の改善を示した。
2つの群に分割され、PMA/イオノマイシンとゴルジ阻害剤またはゴルジ阻害剤のみとともに5時間さらにインキュベートされた共培養T細胞中において、細胞内サイトカイン、CD107a、IFN-ガンマ（IFNγ）、IL-2、IL-17aおよびTNF-アルファ（TNFα）を評価した。培地のみ対照由来のサイトカイン陽性細胞の頻度の倍数変化として、細胞内サイトカイン蓄積を表した。PI-103または化合物63を用いて拡大されたCD8＋T細胞（図6A）およびCD4＋T細胞（図6B）は、対照細胞と比較して、いくつかの特定の多機能性サイトカインプロファイルの増加した頻度を示した（図6Aおよび6B中の枠に囲まれたプロファイル）。特に、CD8＋T細胞は、PMA/イオノマイシンとゴルジ阻害剤での再刺激後にCD107a＋IFNγ＋TNFα＋陽性細胞の増加した多機能性プロファイルを示し、ゴルジ阻害剤のみとのインキュベーション後にCD107a＋IFNγ＋IL-2＋細胞の増加した多機能性プロファイルを示した（図6A）。CD4＋細胞では、CD107a＋IFNγ＋TNFα＋細胞の増加した多機能性プロファイルが、PMA/イオノマイシンとゴルジ阻害剤またはゴルジ阻害剤のみでの処理後に、観察されたのに対して、CD107a＋IFNγ＋IL-2＋TNFα＋細胞の多機能性プロファイルはPMA/イオノマイシンとゴルジ阻害剤での再刺激後に増加し、CD107a＋IFNγ＋細胞の多機能性プロファイルは、ゴルジ阻害剤のみとのインキュベーション後に増加した（図6B）。
連続刺激
いくつかの局面において反復された刺激後にエキソビボで細胞が拡大する能力は、CAR-T細胞が（例えば、最初の活性化後に）持続する能力を示すことができ、および/またはインビボでの機能の指標である（Zhao et al.（2015）Cancer Cell、28:415-28）。連続刺激アッセイにおける細胞の機能を評価するために、照射されたK562-CD19標的細胞とともに、生成された抗CD19CAR-T細胞組成物をインキュベートした。3〜4日ごとに、T細胞を採集し、計数し、各ラウンドに対して細胞数を最初の播種密度までリセットした後に、同じ培養条件を用いて、新たな標的細胞で再刺激した。4ラウンドの再刺激後に、標的細胞でのさらなる再刺激なしに、さらに4日間、T細胞を再培養した。集団の倍加（図7A）および培地のみで拡大された細胞のAUCと比較した経時的集団倍加の関数としての曲線下面積（AUC）（図7B）を決定した。
図7Aに示されているように、抗CD19CAR発現T細胞の数は、このアッセイにおいて増加し、CD19発現細胞の存在下で増殖するこれらの細胞の能力と合致していた。集団倍加のAUCの倍数変化から示されるように、化合物63を用いて拡大された生成された抗CD19CART細胞組成物由来のT細胞は、PI-103またはDMSOビヒクルを用いて拡大されたT細胞と比較して、より大きな平均AUCを有していた（図7B）。この観察は、CAR-T細胞の拡大の間における化合物63の存在が、反復された抗原刺激後でさえ、T細胞の持続的拡大および生存を支えることを示している。
さらなる二次刺激に際しての活性を評価するために、連続再刺激後11日に、CAR-T細胞を採集し、およそ16時間、1:1のエフェクター:標的比で、照射されたK562-CD19標的細胞で刺激した。上清を集め、実質的に上記されているとおりに、Luminex Multiplex Assayを用いて、TNF-アルファ、IFN-ガンマおよびIL-2サイトカイン産生を測定した。培地のみの中で拡大された細胞と比較した、PI-103、化合物63またはDMSOビヒクルの存在下で拡大された生成された抗CD19CAR-T細胞組成物からの共培養上清中に観察されたサイトカイン産生の倍数変化が決定され、図7Cに示されている。実質的に上記されているとおりに、ゴルジ阻害剤とともに4時間インキュベーションした後の、11日での細胞の多機能性サイトカインプロファイルの評価は、CD107a＋IFNγ＋細胞の増加したCD8＋多機能性サイトカインプロファイルを示した（図7D）。
mTOR阻害剤の存在下で拡大された生成された抗CD19CAR-T細胞組成物が、持続的抗原曝露を通じて、改善されたサイトカイン能力と生存を保持する能力は、機能性消耗に対する抵抗性と合致している。
CAR特異的拡大
抗CD19CARに対して特異的な抗イディオタイプ抗体がコンジュゲートされたビーズ表面とともに、生成された抗CD19CAR-T細胞組成物の細胞をインキュベートすることによって、CARの刺激後に細胞が拡大する能力を評価した。抗イディオタイプ抗体がコンジュゲートされたビーズを、1:1のビーズ:細胞比で、24ウェルG-rex拡大容器（Argos Technologies）のウェル中において15日間、細胞とともにインキュベートした。5日ごとに、培養物中の細胞を計数することによって、ウェル当たりの生きたT細胞の総数を決定した（図8A）。経時的なT細胞数の関数としての平均曲線下面積（AUC）を、培地のみで拡大された細胞のAUCと比較して計算した（図8B）。
図8Aに示されているように、抗イディオタイプ抗体がコンジュゲートされたビーズでの細胞の刺激は、初期拡大をもたらしたが、その後、細胞数は減少した。化合物63またはPI-103を用いて事前に拡大された生成された抗CD19CART細胞組成物由来のT細胞は、DMSOビヒクルを用いて事前に拡大されたT細胞と比較して、より大きな平均AUCを有していた（図8B）。結果は、拡大の間でのmTORキナーゼ阻害剤の存在は、単回のCAR特異的刺激後に、増強された拡大および生存を支えることを示している。
抗イディオタイプ抗体がコンジュゲートされたビーズとの拡大後11日目に採集されたCAR-T細胞上で、抗原発現細胞での刺激後の二次的サイトカイン応答を評価した。照射されたK562-CD19標的細胞とともに、1:1のエフェクター:標的比でおよそ16時間、抗イディオタイプ抗体刺激された細胞をインキュベートした。上清を集め、実質的に上記されているとおりに、Luminex Multiplex Assayを用いて、TNF-アルファ、IFN-ガンマおよびIL-2サイトカイン産生を測定した。培地のみの中で拡大された細胞と比較した、PI-103、化合物63またはDMSOビヒクルの存在下で拡大された生成された抗CD19CAR-T細胞組成物から、共培養上清中に観察されたサイトカイン産生の倍数変化を決定した。図8Cに示されているように、化合物63またはPI-103とともに事前に拡大された生成された抗CD19CART細胞組成物から得たT細胞は、抗原でのその後の刺激後に、改善された二次的サイトカイン産生を示した。さらに、化合物63で操作されおよび拡大されたいくつかのドナー由来の細胞は、実質的に上記されているとおりに、ゴルジ阻害剤とともに4時間インキュベーションした後に細胞内サイトカイン染色によって判定したところ、11日にCD107a＋IFNγ＋細胞であったCD8＋T細胞の増加した頻度を示した（図8D）。
実施例4:mTORキナーゼ阻害剤の存在下で拡大された操作されたCD4＋およびCD8＋T細胞の遺伝子発現分析
PI-103、化合物63、DMSOビヒクルまたは培地のみの存在下で細胞を拡大させることによって生成された、実施例2に記載されている生成された抗CD19CAR-T細胞組成物の細胞の間での遺伝子発現を、RNAシーケンシング（RNA-Seq）によって評価した。各拡大条件下で3人のドナーから生成された組成物からRNAを抽出し、RNA-Seqによって、トランスクリプトーム全体の評価を行った。FPKMおよびFPKQ値を測定し、FPKQ値を対数変換した（log2）。培地のみ、PI-103または化合物63の存在下で拡大された生成された抗CD19CAR-T細胞組成物の細胞の間で、CD4＋、CD8＋または組み合わされたCD4＋/CD8＋細胞の発現プロファイルを比較することによって、DMSOビヒクルで拡大された細胞と比較して、遺伝子発現を決定した。2つの条件間でFDRが10％以下というカットオフを課すことによって、ボルケーノプロットの分析に基づいて、各群の間で異なる遺伝子産物を同定した。
図9A中のボルケーノプロットに示されているように、PI-103または化合物63の存在下で拡大されたCD4＋および/またはCD8＋T細胞の間で著しく変化した遺伝子発現が同定され、下方制御された遺伝子は各プロットの中央の点（「0」）の左に図示されており、上方制御された遺伝子は中央の点の右に図示されている。
PI-103または化合物63を用いて拡大された細胞中の各差次的に発現された遺伝子の発現を、DMSOを用いて拡大された細胞中での発現と比較して、Log2倍数変化としてプロットした。図9Bに示されているように、PI-103または化合物63を用いて拡大された細胞中の差次的に発現された遺伝子の発現間における線形関係が特定され、PI-103を用いて拡大された細胞中でおよび化合物63を用いて拡大された細胞中で、差次的に発現された遺伝子の発現間での強い正の相関を示している（R2＝0.9）。
DMSOビヒクルを用いて拡大された細胞中での発現と比較して活性化または阻害された差次的に発現された遺伝子の転写制御因子に基づいて、遺伝子オントロジー（GO）カテゴリーを特定するために、差次的に発現された遺伝子に対する存在論的エンリッチメント分析を実施した。PI-103または化合物63を用いて拡大された細胞中での観察された転写効果と比較した、各制御ネットワーク中の予測される転写効果の方向の一致に基づいて、転写制御因子のTZスコアを計算した。図9Cは、各クラスターの制御メンバーによって定義される、その対応するZスコアに対する例示的な同定されたGOカテゴリーを列記する。
実施例5:mTORキナーゼ阻害剤の存在下で拡大されたCAR-T細胞の投与後の腫瘍異種移植モデル中の腫瘍量および生存の評価
実施例2に記載されているように、PI-103、化合物63または培地のみの存在下での拡大によって生成された、生成された抗CD19CAR-T細胞組成物の抗腫瘍効果を評価した。非肥満糖尿病重症複合型免疫不全ガンマ（NSG）免疫不全マウスに0.5×106のラージ細胞（CD19を発現する不死化されたヒトBリンパ球腫瘍細胞株）を移植し、これを生着させることにより、腫瘍異種移植マウスモデルを生成した。生物発光画像法による検出を容易にするために、ラージ細胞にホタルルシフェラーゼをトランスフェクトした。7日後に、マウスは、処置を受けないか、DMSOビヒクルまたは低用量（0.25×106）もしくは高用量（1.0×106）の生成された抗CD19CAR-T細胞組成物のCAR＋T細胞のいずれかを受けた。毎週または10日ごとに、生物発光によって腫瘍量を評価した。
低用量または高用量のCAR-T細胞での担腫瘍マウスの処置は、処置なしまたはDMSOビヒクルと比較して、腫瘍量および生存を改善した。PI-103（図10A、上パネル）または化合物63（図11A、上パネル）の存在下で拡大された、低用量または高用量の抗CD19CAR-T細胞組成物由来CAR-T細胞の投与後に、DMSOビヒクルと比較して、低下した腫瘍量が観察された。PI-103または化合物63の存在下で事前に拡大された低用量または高用量のCAR-T細胞を投与された担腫瘍マウスも、DMSOビヒクルを用いて拡大されたCAR-T細胞を投与された担腫瘍マウスと比べて、大幅に改善された生存を示した（図10Aおよび11A、下パネル）。化合物63の存在下で拡大された高用量のCAR-T細胞を投与された担腫瘍マウスは、腫瘍細胞移植後少なくとも80日間、100％の生存を示した。図10Bおよび11Bは、それぞれPI-103または化合物63の存在下で拡大されたCAR-T細胞での処置後の腫瘍細胞移植後、最長100日までのその後の時点での担腫瘍マウスの生存の結果を示す;この結果は、投与されたCAR-T細胞の改善された成績をもたらす化合物63の存在下で作製された細胞の効果と合致した。これらの結果は、化合物63などのmTORキナーゼ阻害剤の存在下で作製されたCAR-T細胞組成物がインビボアッセイで改善された成績を示すことを示している。インビボモデルでの改善された腫瘍除去および生存は、CAR-T細胞生成の間のmTORシグナル伝達の阻害を通じて達成されたCAR-T細胞の状態および/または機能の質的改善と合致する。
実施例6:抗イディオタイプコンジュゲートされたビーズを用いたCAR＋T細胞の慢性刺激に対するインビトロアッセイ
ヒトドナーから、CD4＋およびCD8＋細胞の別々の組成物を単離し、抗CD3/抗CD28磁気ビーズでの活性化によって刺激し、FMC63由来のscFvを有する抗CD19CARをコードするウイルスベクターで形質導入した。細胞を拡大させるための条件下での培養に続き、次いで、各ドナーから得た、操作されたCD4＋およびCD8＋T細胞を含有するT細胞組成物を別々に採集し、製剤化し、凍結冷凍した。凍結冷凍された操作されたCD4＋およびCD8＋T細胞を融解し、CAR＋T細胞を含有するT細胞組成物を生成するために、同じドナーから得たCD4＋およびCD8＋T細胞の比率1:1で製剤化した。抗CD19CARに対する抗イディオタイプ（ID）抗体がコンジュゲートされたビーズを、1:1のビーズ:細胞比で14日間、細胞とともにインキュベートした。
（サイトカインレベルを評価するために）1:1または（細胞溶解活性を評価するために）3:1のエフェクター:標的比で、K562-CD19抗原を発現する標的細胞での刺激後に、抗IDがコンジュゲートされたビーズでのCAR特異的刺激後14日に採集されたCAR-T細胞の二次応答（14日;二次）を評価した。抗IDコンジュゲートされたビーズとともにインキュベートされなかったT細胞組成物からのT細胞の一次応答も、抗原を発現する細胞での同様の刺激によって判定した（0日;「一次」）。細胞溶解活性を評価するために、蛍光顕微鏡検査による追跡を可能にするためのNucLight Red（NLR）で標的細胞を標識した。（INCUCYTE（登録商標）Live Cell Analysis System、Essen Bioscienceを用いた）動態蛍光顕微鏡検査による経時的な蛍光標識の喪失によって判定される、生きた標的細胞の喪失を72時間にわたって測定することによって、殺活性を評価した。経時的な標的蛍光に対する曲線下面積（AUC）の逆数として、死滅指数を決定した。ゴルジ阻害剤の存在下でのインキュベーション後の、共培養されたT細胞中でのフローサイトメトリーによって、IL-2およびTNF-アルファの細胞内サイトカインレベルを評価した。
図12Aに示されているように、抗IDコンジュゲートされたビーズでの14日間のCAR特異的刺激後に集められた、CAR＋T細胞を含有するT細胞組成物による標的細胞の死滅は、事前のCAR特異的刺激を経なかったCAR＋T細胞の細胞溶解活性と比べて低下した。抗IDコンジュゲートされたビーズでのCAR特異的長期刺激を受けたCAR＋T細胞中では、IL-2およびTNF-アルファの細胞内サイトカインレベルも低下した（図12B）。これらの結果は、長期のCAR特異的刺激、例えば、抗IDコンジュゲートされたビーズとの14日間のインキュベーションがCARの慢性刺激および持続的機能の喪失をもたらすという観察と合致する。
長期刺激後にCAR＋T細胞機能を向上させることに対するPI-103または化合物63の効果を評価するために、上記慢性刺激アッセイを使用した。刺激の開始から始まるPI-103、化合物63またはビヒクル対照の存在下であったことを除き、抗CD19CAR＋T細胞組成物を上記のように生成した。1:1のビーズ:細胞比で14日間、抗IDコンジュゲートされた常磁性ビーズとともに、各生成されたCAR-T細胞組成物からの細胞をインキュベートした。
融解時のCAR-T細胞組成物の一次応答（抗IDコンジュゲートされたビーズでの刺激なし）またはCAR刺激されたCAR-T組成物の二次応答（抗IDコンジュゲートされたビーズでの14日のCAR特異的刺激後）を、抗原発現細胞での刺激後に評価した。ゴルジ阻害剤の存在下で、K562-CD19抗原発現細胞とともに1:1で、CAR-T細胞組成物を培養し、IL-2、IFN-ガンマおよびTNF-アルファに対する細胞内サイトカイン染色後のフローサイトメトリーによって、多機能性サイトカイン産生を評価した。ドナーコホート内でのスケーリングによってデータを正規化した後にCD8＋細胞中で決定されたとおりに、サイトカインの累積的レベルから多機能性スコアを求めた（図13A）。標的細胞と20時間インキュベーションした後の共培養物の細胞培養上清由来の分泌された総IL-2、TNFおよびIFN-ガンマサイトカインを測定し、図13Aに示されているように、3つのサイトカイン全てに対するスケーリングしたスコアの平均を計算した。図13Aに示されているように、PI-103または化合物63は、CAR-T細胞組成物のサイトカインを産生する能力に基づいて、改善された一次または二次応答をもたらした。上述のように、3:1のエフェクター:標的細胞比で、標的細胞と共培養した後の一次または二次細胞溶解応答の改善も、PI-103または化合物63の存在下で作製されたT細胞組成物の間で観察された（図13Bおよび13C）。
これらの結果は、異なる条件下でまたはPI-103もしくは化合物63もしくはその他の作用物質の存在下で作製された異なるCAR-T細胞組成物などのCAR-T細胞組成物が、例えばインビボでの抗原への長期曝露後に起こり得る、慢性的CAR-T細胞刺激後に長期生存を呈する能力および/または機能を維持する能力に関して、CAR-T細胞組成物を評価するための慢性刺激アッセイの有用性を実証する。
実施例7:mTORキナーゼ阻害剤の存在下で調製されたキメラ抗原受容体（CAR）形質導入T細胞（CAR T細胞）の機能性の評価
CD4＋およびCD8＋T細胞集団が別々に濃縮され、次いで、混合され、単一の組成物中で一緒に処理されるT細胞を操作するためのプロセスにおいて、細胞作製の間におけるmTORキナーゼ阻害剤の存在の影響をさらに評価した。処理工程は、刺激、キメラ抗原受容体をコードするベクターでの形質導入、および拡大のための工程を含む。
免疫親和性ベースの選択によって、同じヒトドナーから得たヒト白血球除去試料からの単離されたPBMCから、CD4＋およびCD8＋細胞の別々の組成物を選択し、選択された細胞組成物を凍結冷凍した。続いて、CD4＋およびCD8＋T細胞の別々の組成物を融解し、1:1の生きたCD4＋T細胞:生きたCD8＋T細胞の比率で混合した。本研究では、刺激の開始時に始まる化合物63、PI103または阻害剤なし（DMSOビヒクル対照）の存在下で、この混合されたCD4＋およびCD8＋細胞集団をインキュベートした。さらに詳しくは、抗CD3および抗CD28抗体が付着された常磁性ポリスチレン被覆されたビーズの存在下で、18〜30時間、（表記のとおり、阻害剤の存在下または不存在下で）混合されたCD4＋およびCD8＋T細胞組成物を刺激し、次いで、抗CD19CARをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。CARは、CD19（FMC63に由来）に対して特異的なscFv抗原結合ドメイン、CD28膜貫通領域、4-1BB共刺激シグナル伝達領域およびCD3-ゼータ由来細胞内シグナル伝達ドメインを含有した。次いで、通例およそ6〜7日間、サイトカインの存在下で細胞を拡大させた。刺激から始まり、プロセスの間にわたって、培地はDMSO（ビヒクル対照）、2μMPI103または1μM化合物63を含有した。ビヒクル対照は、mTOR阻害剤処理された試料中の容量に合致する容量で、DMSOを含有した。拡大された細胞を冷凍保存した。評価のために、冷凍保存されたCAR-T細胞を融解し、支持するサイトカインなしおよび阻害剤もしくはビヒクルなしのアッセイ培地中で、評価前に洗浄した。
細胞表面マーカーのレベル、およびアポトーシス促進性マーカーである細胞内カスパーゼ3のレベルに関して、細胞をフローサイトメトリーによって評価した。3人のドナーからの代表的フローサイトメトリープロットが図14に示されている。図示されているように、化合物63の存在下で調製されたCAR-T細胞が、アポトーシス促進性マーカーである細胞内カスパーゼ3の減少したレベルを有することが観察された。
ビーズにコンジュゲートされた生成されたCAR-T細胞抗体のインキュベーションによる連続刺激アッセイにおいて、生成されたCAR-T細胞の機能性特性を評価した。抗CAR抗体は、CARのFMC63由来scFvを認識する抗イディオタイプ抗体であった。融解したCAR-T細胞をCAR特異的ビーズと混合し、皿に播き、14日間インキュベートした。3〜4日ごとに、T細胞を計数した。図15に示されているように、PI103または化合物63の存在下で調製された生成されたCAR-T細胞は、再刺激後に改善された拡大を示した。
新たに融解したまたは上記から再刺激の14日に、3:1のエフェクター対標的比で、生成されたCAR-T細胞をCD19発現標的細胞とともに培養することによって、生成されたCAR-T細胞の細胞溶解活性を評価した。標的細胞死を経時的に定量した。各濃度に対する経時的なシグナルの腫瘍細胞増殖曲線下面積（AUC）を決定した。腫瘍細胞増殖曲線下面積の逆数（1/AUC）として、死滅指数を計算した。PI103または化合物63の存在下でのプロセスにおいて生成されたCAR-T細胞は、DMSOの存在下で調製されたCAR-T細胞と比較して、改善された標的細胞死滅を示した（図16）。
新たに融解した生成されたCAR-T細胞またはCD19発現標的細胞での二次再刺激後のCAR-T細胞とともにインキュベートされた共培養物の細胞中で、細胞内サイトカインレベルをモニターした。ゴルジ阻害剤の存在下で5時間、CAR-T細胞を標的発現細胞とともにインキュベートした。IL-2、TNF-アルファおよびIFN-ガンマの細胞内発現を決定し、IL-2に関して陽性の累積的CAR-T細胞ならびにIFN-ガンマおよびTNF-アルファのあらゆる組み合わせに対してゲーティングすることによって、多機能性スコアを計算した。図17Aに示されているように、PI103または化合物63の存在下で調製されたCAR-T細胞は、DMSOの存在下で調製されたCAR-T細胞と比較して、一次または二次刺激後の両方で、CD8＋およびCD4＋サブセットのいずれにおいても、改善された多機能性エフェクターサイトカインプロファイルを示した（図17A）。生成されたCAR-T細胞は、20時間、CD19抗原発現細胞とも培養され、ELISAによって、細胞培養上清中のIL-2、TNF-アルファおよびIFN-ガンマのレベルを評価した。PI103または化合物63を用いて生成されたCAR-T細胞は、上清中に増加したレベルの分泌されたサイトカインを示した（図17B）。
総合すると、これらの結果は、CD4＋とCD8＋T細胞の混合された集団からCAR-T細胞を作製するためのプロセスの間、PI103および化合物63の存在がCAR-T細胞の機能と活性を改善するという観察と合致する。
実施例8:mTORキナーゼ阻害剤の存在下で調製されたCAR-T細胞の遺伝子発現分析
RNA-Seqの差次的発現（DESeq2）分析によって、（実施例7に記載されているようにDMSO、PI-103または化合物63の存在下で調製された）抗CD19CAR-T細胞を含有する組成物の細胞間での遺伝子発現を評価した。CAR-T細胞から単離されたRNAから調製された相補的DNA（cDNA）試料に対して、RNA-Seqを行った。DESeq2正規化されたカウントから作成されたRNA-Seqデータの組に対して主成分分析（PCA）を行った。ドナーに対して調整して、化合物処理された試料をDMSO対照に対して比較することにより、DESeq2パッケージ（バージョン1.16.1）を用いてR（バージョン3.4）で、遺伝子レベル差次的発現分析を行った。差次的発現分析の前に、全ての試料にわたって、ゼロカウントを有する遺伝子を除外するために、遺伝子セットをフィルターにかけた。0.5のlog2倍数変化カットオフおよび0.1のベンジャミーニ・ホッホベルグ調整された偽発見率（FDR）カットオフを課すことによって、差次的に発現された（DE）遺伝子を同定した。PI103または化合物63の存在下で調製されたCAR-T細胞を含有する組成物において、重複する遺伝子発現プロファイルと重複しない遺伝子発現プロファイルの両方が観察された（図18）。
実施例9:mTORキナーゼ阻害剤の存在下で調製されたCAR-T細胞の投与後の腫瘍異種移植モデル中の腫瘍量および生存の評価
実施例7に記載されているように、DMSO、PI-103または化合物63の存在下で調製された抗CD19CAR-T細胞組成物の抗腫瘍効果をインビボで評価した。非肥満糖尿病重症複合型免疫不全ガンマ（NSG）免疫不全マウスに0.5×106のラージ細胞（CD19を発現する不死化されたヒトBリンパ球腫瘍細胞株）を移植し、これを生着させることにより、腫瘍異種移植マウスモデルを生成した。生物発光画像法による腫瘍量の測定を容易にするために、ラージ細胞にホタルルシフェラーゼをトランスフェクトした。7日後に、マウスは、処置を受けないか、またはDMSO（ビヒクル）もしくはDMSOとmTORキナーゼ阻害剤の存在下で調製された低用量（0.25×106）もしくは高用量（1.0×106）の抗CD19CAR＋T細胞での処置を受けた。腫瘍量および死亡率を毎週評価した。
DMSOの存在を含むプロセスにおいて、3人の異なるヒトドナーの細胞から別々に調製された抗CD19CAR-T細胞組成物は、非処置動物と比較して、本研究において実証可能な抗腫瘍効果を動物に対して有することが観察され、処置された動物は減少した死亡率を示した。対応させたドナーから調製された細胞からの結果が、図19A〜Bおよび20A〜20Bに示されている。CAR-T細胞を生成するために使用されるプロセス中に（阻害剤の不存在、すなわち、DMSOビヒクルと比較して）mTORキナーゼ阻害剤である化合物63を含めることは、本研究において、動物中の抗腫瘍応答をインビボで改善することをもたらすことが観察された。例示的な結果は、図20Aおよび20Bに示されている。別のドナーから生成されたCAR-T細胞でも、実質的に同様の結果が見られた。阻害剤PI103の存在下または不存在下で生成されたCAR-T細胞を比較する結果が、（図19Aおよび19B）に示されている。別のドナーから生成されたCAR-T細胞についても、同様の抗腫瘍効果が、PI103の存在下で作製された細胞に対しておよび阻害剤の不存在下で（DMSOビヒクル）作製された細胞に対して観察された。
実施例10:インビボでのCAR-T細胞持続能力の評価
実施例7）に記載されているように、PI-103、化合物63の存在下でまたは阻害剤なしで調製された細胞を含有する組成物の動物への投与後に、動物の血液中で、抗CD19CAR-T細胞の存在と数を評価した。実施例9に記載されているラージバーキットのCD19＋リンパ腫腫瘍異種移植モデルを使用した。マウスは、処置を受けないか、または低用量（0.25×106）もしくは高用量（1.0×106）のそれぞれの抗CD19CAR＋T細胞組成物での処置を受けた。腫瘍量および死亡率を7〜10日ごとに評価した。
注入後18日、25日および36日に、マウスを採血し、末梢血中の循環するCAR＋CD4＋T細胞またはCAR＋CD8＋T細胞の存在をフローサイトメトリーによって評価した。実施例10に記載されているように同じマッチングされたドナーからCAR-T細胞を調製する間に、化合物63またはPI103を含めると、時間とともに、CAR＋T細胞の増加した数をもたらすことが観察され、細胞組成物の作製の間に阻害剤を使用することは、例えば、増加した拡大または持続能力のために、この動物腫瘍モデルでの投与後に、インビボで細胞の増加した曝露をもたらしたという解釈と合致する（図21Aおよび21B）。第二のドナーから生成されたCAR-T細胞でも、実質的に同様の結果が見られた。
本発明は、例えば、本発明の種々の局面を例示するために提供される特定の開示された態様に範囲が限定されることは意図されない。記載される組成物および方法に対する種々の改変が本明細書における説明および教示から明らかになるであろう。かかる変形は、本開示の真の範囲および精神から逸脱することなく実施されてよく、本開示の範囲内に含まれることが意図される。
配列
Figure 2021501607
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Claims (111)

  1. 操作された細胞の組成物を作製するための方法であって、
    （a）刺激条件下で、初代ヒトT細胞を含むインプット組成物をインキュベートする工程であって、前記刺激条件が、
    （i）TCR複合体の1つもしくは複数の成分の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン、および/または1つもしくは複数の共刺激分子の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能な刺激性試薬、ならびに
    （ii）2-（3-ヒドロキシフェニル）-9-（2-イソプロピルフェニル）-8-オキソ-8,9-ジヒドロ-7H-プリン-6-カルボキサミド（化合物63）、6-（4-（2H-1,2,4-トリアゾル-3-イル）フェニル）-1-（2-（テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル）エチル）-1H-イミダゾ［4,5-b］ピラジン-2（3H）-オン（化合物155）または7-（6-（2-ヒドロキシプロパン-2-イル）ピリジン-3-イル）-1-（（1r,4r）-4-メトキシシクロヘキシル）-3,4-ジヒドロピラジノ［2,3-b］ピラジン-2（1H）-オン（化合物246）から選択される、mTOR活性を阻害する作用物質
    の存在を含む、前記工程、ならびに
    （b）刺激された組成物中に組換え受容体を導入し、これにより、操作されたT細胞を含む操作された組成物を生成する工程
    を含む、前記方法。
  2. 操作された細胞をさらにインキュベートする工程であって、mTOR活性を阻害する作用物質の存在を含み、これにより、アウトプット組成物を作製する、前記工程
    を含む、請求項1記載の方法。
  3. さらにインキュベートする工程が、1種または複数種の組換えサイトカインの存在下で実施される、請求項2記載の方法。
  4. さらにインキュベートする工程が、前記組成物中の細胞の増殖または拡大（expansion）をもたらすための条件下での培養を含む、請求項2または3記載の方法。
  5. 操作された細胞の組成物を作製するための方法であって、前記方法が、組換え受容体を用いて操作されたT細胞を含む濃縮された初代ヒトT細胞を含む操作された細胞の組成物を、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で培養する工程を含み、
    mTOR活性を阻害する作用物質が、2-（3-ヒドロキシフェニル）-9-（2-イソプロピルフェニル）-8-オキソ-8,9-ジヒドロ-7H-プリン-6-カルボキサミド（化合物63）、6-（4-（2H-1,2,4-トリアゾル-3-イル）フェニル）-1-（2-（テトラヒドロ-2H-ピラン-4-イル）エチル）-1H-イミダゾ［4,5-b］ピラジン-2（3H）-オン（化合物155）または7-（6-（2-ヒドロキシプロパン-2-イル）ピリジン-3-イル）-1-（（1r,4r）-4-メトキシシクロヘキシル）-3,4-ジヒドロピラジノ［2,3-b］ピラジン-2（1H）-オン（化合物246）から選択され、かつ
    前記方法が、操作されたT細胞を含むアウトプット組成物を作製するために、前記組成物中の細胞の増殖または拡大をもたらす、
    前記方法。
  6. 前記培養する工程の前に、
    （a）刺激条件下で、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下において、初代T細胞を含むインプット組成物をインキュベートする工程であって、前記刺激条件が、TCR複合体の1つもしくは複数の成分の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン、および/または1つもしくは複数の共刺激分子の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能な刺激性試薬の存在を含み、これにより、刺激された組成物を生成し、ならびにmTOR活性を阻害する作用物質が、化合物63、化合物155または化合物246である、前記工程、ならびに
    （b）前記刺激された組成物中に組換え受容体を導入し、これにより、操作されたT細胞を含む操作された組成物を生成する工程
    をさらに含む、請求項5記載の方法。
  7. 操作された細胞の組成物を作製するための方法であって、
    組換え受容体を用いて操作された細胞を含む初代ヒトT細胞を含む操作された細胞の組成物を、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で培養する工程であって、前記組成物中の細胞が、培養される前に前記作用物質へ曝露されていない、前記工程
    を含み、かつ
    操作されたT細胞を含むアウトプット組成物を作製するために、前記組成物中の前記細胞の増殖または拡大をもたらす、
    前記方法。
  8. 初代T細胞がCD4＋および/またはCD8＋T細胞である、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
  9. 操作されたT細胞の組成物が、濃縮されたCD4＋T細胞を含む、請求項5〜8のいずれか一項記載の方法。
  10. 操作されたT細胞の組成物が、濃縮されたCD8＋T細胞を含む、請求項5〜8のいずれか一項記載の方法。
  11. 操作された細胞の組成物を作製するための方法であって、
    組換え受容体を用いて操作されたT細胞を含む濃縮されたCD4＋または濃縮されたCD8＋初代ヒトT細胞を含む操作された細胞の組成物を、mTOR活性を阻害する作用物質の存在下で培養する工程
    を含み、
    操作された、濃縮されたCD4＋または濃縮されたCD8＋T細胞を含むアウトプット組成物を作製するために、前記組成物中の細胞の増殖または拡大をもたらす、
    前記方法。
  12. 操作されたT細胞の組成物が、70％を上回るもしくは約70％を上回る、75％を上回るもしくは約75％を回る、80％を上回るもしくは約80％を上回る、85％を上回るもしくは約85％を上回る、90％を上回るもしくは約90％を上回る、95％を上回るもしくは約95％を上回る、もしくは98％を上回るもしくは約98％を上回るCD4＋初代ヒトT細胞を含み、かつ/または
    前記インプット組成物が、CD4＋初代ヒトT細胞から本質的になる、
    請求項5〜9および請求項11のいずれか一項記載の方法。
  13. 操作されたT細胞の組成物が、70％を上回るもしくは約70％を上回る、75％を上回るもしくは約75％を上回る、80％を上回るもしくは約80％を上回る、85％を上回るもしくは約85％を上回る、90％を上回るもしくは約90％を上回る、95％を上回るもしくは約95％を上回る、もしくは98％を上回るもしくは約98％を上回るCD8＋初代ヒトT細胞を含み、かつ/または
    前記インプット組成物が、CD8＋初代ヒトT細胞から本質的になる、
    請求項5〜8および請求項10のいずれか一項記載の方法。
  14. 前記培養する工程が、1種または複数種の組換えサイトカインの存在下で実施される、請求項5〜12のいずれか一項記載の方法。
  15. 1種または複数種の組換えサイトカインが、IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、G-CSFおよびGM-CSFのうちの1つまたは複数を含み、任意で、前記1種または複数種の組換えサイトカインが、IL-2、IL-7またはIL-15のうちの1つまたは複数を含む、請求項3、請求項4または請求項8記載の方法。
  16. 前記培養する工程の前に、
    （a）刺激条件下で、初代T細胞を含むインプット組成物をインキュベートする工程であって、前記刺激条件が、TCR複合体の1つもしくは複数の成分の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン、および/または1つもしくは複数の共刺激分子の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能な刺激性試薬の存在を含み、これにより、刺激された組成物を生成する、前記工程、ならびに
    （b）前記刺激された組成物中に組換え受容体を導入し、これにより、操作されたT細胞を含む操作された組成物を生成する工程
    をさらに含む、請求項5〜15のいずれか一項記載の方法。
  17. 前記インプット組成物、前記刺激された組成物および/または前記操作された組成物が、初代CD4＋および/またはCD8＋T細胞を含む、請求項1〜4および請求項16のいずれか一項記載の方法。
  18. 前記インプット組成物、前記刺激された組成物および/または前記操作された組成物が、濃縮されたCD4＋T細胞を含む、請求項1〜4、請求項16および請求項17のいずれか一項記載の方法。
  19. 前記インプット組成物、前記刺激された組成物および/または前記操作された組成物が、濃縮されたCD8＋T細胞を含む、請求項1〜4、請求項16および請求項17のいずれか一項記載の方法。
  20. 操作された細胞の組成物を作製するための方法であって、
    （a）CD4＋またはCD8＋初代ヒトT細胞に関して濃縮されたT細胞を含むインプット組成物を、刺激条件下でインキュベートする工程であって、前記刺激条件が、
    （i）TCR複合体の1つもしくは複数の成分の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメイン、および/または1つもしくは複数の共刺激分子の1つもしくは複数の細胞内シグナル伝達ドメインを活性化することが可能な刺激性試薬、ならびに
    （ii）mTOR活性を阻害する作用物質
    の存在を含む、前記工程、ならびに
    （b）刺激された組成物中に組換え受容体を導入し、これにより、操作されたT細胞を含む操作された組成物を生成する工程
    を含む、前記方法。
  21. 前記インプット組成物、前記刺激された組成物および/または前記操作された組成物が、70％を上回るもしくは約70％を上回る、75％を上回るもしくは約75％を上回る、80％を上回るもしくは約80％を上回る、85％を上回るもしくは約85％を上回る、90％を上回るもしくは約90％を上回る、95％を上回るもしくは約95％を上回る、もしくは98％を上回るもしくは約98％を上回るCD4＋初代ヒトT細胞を含み、かつ/または
    前記インプット組成物が、CD4＋初代ヒトT細胞から本質的になる、
    請求項1〜4、請求項16〜18および請求項20のいずれか一項記載の方法。
  22. 前記インプット組成物、前記刺激された組成物および/または前記操作された組成物が、70％を上回るもしくは約70％を上回る、75％を上回るもしくは約75％を上回る、80％を上回るもしくは約80％を上回る、85％を上回るもしくは約85％を上回る、90％を上回るもしくは約90％を上回る、95％を上回るもしくは約95％を上回る、もしくは98％を上回るもしくは約98％を上回るCD8＋初代ヒトT細胞を含み、かつ/または
    前記インプット組成物が、CD8＋初代ヒトT細胞から本質的になる、
    請求項1〜4、請求項16および請求項18〜20のいずれか一項記載の方法。
  23. mTOR活性を阻害する作用物質が、化合物、小分子、小有機分子、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、siRNAまたはポリペプチドである、請求項7〜22のいずれか一項記載の方法。
  24. mTOR活性を阻害する作用物質が、mTORC1および/またはmTORC2キナーゼ活性を阻害する、請求項7〜23のいずれか一項記載の方法。
  25. mTOR活性を阻害する作用物質が、少なくとも1つのさらなるキナーゼの活性を阻害する、請求項7〜24のいずれか一項記載の方法。
  26. 少なくとも1つのさらなるキナーゼがPI3Kである、請求項25記載の方法。
  27. mTOR活性を阻害する作用物質がBEZ235、BGT226、GDC0980、NVP-BEZ235、PF-04691502、PI-103、SAR245409、SF1126、VS5584またはXL765である、請求項24〜26のいずれか一項記載の方法。
  28. mTOR活性を阻害する作用物質が、
    （i）PI3K活性を阻害しない、
    （ii）mTOR活性に対するIC50において、PI3K活性を検出可能に阻害しない、かつ/または
    （iii）mTOR活性を検出可能に阻害する全ての濃度において、PI3Kを検出可能に阻害しない、
    請求項7〜27のいずれか一項記載の方法。
  29. mTOR活性を阻害する作用物質が、mTORC1およびmTORC2キナーゼ活性を阻害する、請求項7〜27または請求項28のいずれか一項記載の方法。
  30. mTOR活性を阻害する作用物質が、ピラゾロピリミジン、トリン1、トルキニブ、PP30、Ku-0063794、WAY-600（ワイス）、WAY-687（ワイス）、WAY-354（ワイス）、OSI-027、DS3078a、AZD8055である、請求項7〜27、請求項28または請求項29のいずれか一項記載の方法。
  31. mTOR活性を阻害する作用物質が、mTORC1活性を選択的に阻害する、請求項7〜30のいずれか一項記載の方法。
  32. mTOR活性を阻害する作用物質が、
    （i）mTORC2活性を阻害しない、
    （ii）mTORC1活性に対するIC50において、mTORC2活性を検出可能に阻害しない、かつ/または
    （iii）mTORC1活性を検出可能に阻害する全ての濃度において、mTORC2を検出可能に阻害しない、
    請求項31記載の方法。
  33. mTOR活性を阻害する作用物質が、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、デフォロリムスまたはAZD8055である、請求項31または請求項32記載の方法。
  34. 前記作用物質が、式I
    Figure 2021501607
    に記載されている式を含み、
    式中、R1は、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルであり、
    R2は、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルであり、かつ
    R3およびR4は、独立に、HまたはC1〜8アルキルである、
    請求項7〜24、請求項28または請求項29のいずれか一項記載の方法。
  35. R1が、置換されたアリール、置換されたまたは置換されていないヘテロアリール、例えば置換されたフェニルである、請求項34記載の方法。
  36. R2が、置換されたもしくは置換されていないアリールおよび/または置換されたもしくは置換されていないフェニルである、請求項34または請求項35記載の方法。
  37. 置換されている基が、1つまたは複数の、ハロゲン;C1〜8アルキル;C2〜8アルケニル;C2〜8アルキニル;ヒドロキシル;C1〜8アルコキシル;アミノ;ニトロ;チオール;チオエーテル;イミン;シアノ;アミド;ホスホナート;ホスフィン;カルボキシル;チオカルボニル;スルホニル;スルホンアミド;ケトン;アルデヒド;エステル;カルボニル;ハロアルキル;B（OH）2;炭素環式シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、単環式もしくは縮合もしくは非縮合多環式アリールもしくはヘテロアリール;アミノ;O-低級アルキル;O-アリール、アリール;アリール-低級アルキル;CO2CH3;CONH2;OCH2CONH2;NH2;SO2NH2;OCHF2;CF3;またはOCF3基で置換されている、請求項34〜36のいずれか一項記載の方法。
  38. mTOR活性を阻害する作用物質が、2-（3-ヒドロキシフェニル）-9-（2-イソプロピルフェニル）-8-オキソ-8,9-ジヒドロ-7H-プリン-6-カルボキサミド（化合物63）である、請求項7〜24、請求項28または請求項29のいずれか一項記載の方法。
  39. 前記作用物質が、式II
    Figure 2021501607
    に記載されている式を含み、
    式中、Lは、直接の結合、NHまたはOであり、
    Yは、NまたはCR3であり、
    R1は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないC2〜8アルケニル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルであり、
    R2は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルであり、
    R3は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキル、-NHR4または-N（R4）2であり、かつ
    R4は、それぞれの出現において独立に、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないヘテロアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクロアルキルである、
    請求項7〜24、請求項28または請求項29のいずれか一項記載の方法。
  40. R1が、置換されたアリールおよび/または置換されたフェニルである、請求項39記載の方法。
  41. YがCHである、請求項39または請求項40記載の方法。
  42. Lが直接の結合である、請求項39〜41のいずれか一項記載の方法。
  43. R1が置換されたアリールであり、かつR2が、アルコキシ、アミノ、ヒドロキシ、シクロアルキルまたはヘテロシクロアルキルから選択される1つまたは複数の置換基で置換されたC1〜8アルキルである、請求項39〜42のいずれか一項記載の方法。
  44. R2が、ヘテロシクロアルキルで置換されたC1〜8アルキルである、請求項43記載の方法。
  45. mTOR活性を阻害する作用物質が化合物155である、請求項1〜19、請求項23、請求項24または請求項34〜39のいずれか一項記載の方法。
  46. 前記作用物質が、式III
    Figure 2021501607
    に記載されている式を含み、
    式中、R1は、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないアリール、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリル、または置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリルアルキルであり、
    R2は、H、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないシクロアルキル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリルアルキル、置換されたもしくは置換されていないアラルキル、または置換されたもしくは置換されていないシクロアルキルアルキルであり、かつ
    R3は、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキルである、
    請求項7〜24、請求項28または請求項29のいずれか一項記載の方法。
  47. R1が、置換されたもしくは置換されていないアリールまたは置換されたもしくは置換されていないヘテロアリールである、請求項46記載の方法。
  48. R1が、置換されたピリジルである、請求項46または請求項4742記載の方法。
  49. R1が、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキル、置換されたもしくは置換されていないヘテロシクリル、ハロゲン、アミノカルボニル、シアノ、ヒドロキシアルキル、-ORおよび-NR2からなる群から独立に選択される1つまたは複数の置換基で置換されたピリジルであり、ここで、各Rは、独立に、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキルである、請求項46〜48のいずれか一項記載の方法。いくつかの実施形態において、R1は、置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキルおよび-NR2からなる群から独立に選択される1つまたは複数の置換基で置換されていてもよい、1H-ピロロ［2,3-b］ピリジルまたはベンゾイミダゾリルであり、ここで、Rは独立に、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキルである。
  50. R1が、
    Figure 2021501607
    であり、
    式中、Rは、各出現において、独立に、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキル（例えば、メチル）であり;R1は、各出現において、独立に、置換されたもしくは置換されていないC1〜4アルキル、ハロゲン、シアノ、-ORまたは-NR2であり;mは0〜3であり;かつnは、0〜3である、
    請求項46〜49のいずれか一項記載の方法。
  51. R2が、H、メチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、sec-ブチル、イソブチル、tert-ブチル、n-ペンチル、イソペンチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、（C1〜4アルキル）-フェニル、（C1〜4アルキル）-シクロプロピル、（C1〜4アルキル）-シクロブチル、（C1〜4アルキル）-シクロペンチル、（C1〜4アルキル）-シクロヘキシル、（C1〜4アルキル）-ピロリジル、（C1〜4アルキル）-ピペリジル、（C1〜4アルキル）-ピペラジニル、（C1〜4アルキル）-モルホリニル、（C1〜4アルキル）-テトラヒドロフラニル、または（C1〜4アルキル）-テトラヒドロピラニルであり、それぞれが置換されていてもよい、請求項46〜50のいずれか一項記載の方法。
  52. R2が、H、C1〜4アルキル、（C1〜4アルキル）（OR）、
    Figure 2021501607
    であり、
    式中、Rは、各出現において、独立に、H、または置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキルであり;R'は、各出現において、独立に、H、-OR、シアノ、または置換されたもしくは置換されていないC1〜8アルキルであり、かつpは、0〜3である、請求項46〜50のいずれか一項記載の方法。
  53. mTOR活性を阻害する作用物質が、7-（6-（2-ヒドロキシプロパン-2-イル）ピリジン-3-イル）-1-（（1r,4r）-4-メトキシシクロヘキシル）-3,4-ジヒドロピラジノ［2,3-b］ピラジン-2（1H）-オン（化合物246）である、請求項7〜24、請求項28または請求項29または請求項46〜52のいずれか一項記載の方法。
  54. mTOR活性を阻害する作用物質が化合物63であり、かつ、操作された細胞の組成物が、500nM〜2μM、1nM〜100nM、50nM〜250nMまたは100nM〜500nMの化合物63の存在下で培養される、請求項5〜6および請求項38のいずれか一項記載の方法。
  55. mTOR活性を阻害する作用物質が化合物63であり、かつ、操作された細胞の組成物が、500nM〜2μM、1nM〜100nM、50nM〜250nMまたは100nM〜500nMの化合物63の存在下でインキュベートされる、請求項1〜4および請求項38のいずれか一項記載の方法。
  56. mTOR活性を阻害する作用物質が化合物155であり、かつ、操作された細胞の組成物が、500nM〜2μM、1nM〜100nM、50nM〜250nMまたは100nM〜500nMの化合物155の存在下でインキュベートされる、請求項1〜4および請求項45のいずれか一項記載の方法。
  57. mTOR活性を阻害する作用物質が化合物155であり、かつ、操作された細胞の組成物が、500nM〜2μM、1nM〜100nM、50nM〜250nMまたは100nM〜500nMの化合物155の存在下で培養される、請求項5〜6および請求項38のいずれか一項記載の方法。
  58. mTOR活性を阻害する作用物質が化合物246であり、かつ、操作された細胞の組成物が、500nM〜2μM、1nM〜100nM、50nM〜250nMまたは100nM〜500nMの化合物246の存在下でインキュベートされる、請求項1〜4および請求項53のいずれか一項記載の方法。
  59. mTOR活性を阻害する作用物質が化合物246であり、かつ、操作された細胞の組成物が、500nM〜2μM、1nM〜100nM、50nM〜250nMまたは100nM〜500nMの化合物246の存在下で培養される、請求項5〜6および請求項53のいずれか一項記載の方法。
  60. 前記刺激性試薬が、TCR複合体の一員に特異的に結合し、任意でCD3に特異的に結合する一次作用物質を含む、請求項1〜4および請求項16〜58のいずれか一項記載の方法。
  61. 前記刺激性試薬が、T細胞共刺激分子に特異的に結合する二次作用物質をさらに含み、任意で、共刺激分子がCD28、CD137（4-1-BB）、OX40またはICOSから選択される、請求項60記載の方法。
  62. 一次および/または二次作用物質が抗体を含み、任意で、前記刺激性試薬が、抗CD3抗体および抗CD28抗体またはこれらの抗原結合断片とのインキュベーションを含む、請求項60または請求項61記載の方法。
  63. 一次作用物質および/または二次作用物質が固体支持体の表面上に存在し、任意で、固体支持体がビーズであるかまたはビーズを含む、請求項59〜61のいずれか一項記載の方法。
  64. ビーズが、3.5μmを上回るまたは約3.5μmを上回るが、約9μm以下または約8μm以下または約7μm以下または約6μm以下または約5μm以下の直径を含む、請求項63記載の方法。
  65. ビーズが4.5μmの直径または約4.5μmの直径を含む、請求項63または請求項64記載の方法。
  66. ビーズが不活性である、請求項63〜65のいずれか一項記載の方法。
  67. ビーズがポリスチレン表面であるかまたはポリスチレン表面を含む、請求項63〜66のいずれか一項記載の方法。
  68. ビーズが磁性または超常磁性である、請求項63〜67のいずれか一項記載の方法。
  69. ビーズ対細胞の比が、4:1〜0.25:1または約4:1〜0.25:1である、請求項63〜68のいずれか一項記載の方法。
  70. 前記導入が、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターを用いて、刺激された組成物の細胞に形質導入することを含む、請求項1〜4および請求項16〜69のいずれか一項記載の方法。
  71. 前記ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、請求項70記載の方法。
  72. ウイルスベクターがレンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである、請求項70または請求項71記載の方法。
  73. アウトプット組成物の細胞を収集する工程をさらに含む、請求項2〜72のいずれか一項記載の方法。
  74. 凍結保存および/または対象への投与のために、任意で薬学的に許容される賦形剤の存在下で、アウトプット組成物の細胞を製剤化することをさらに含む、請求項2〜73のいずれか一項記載の方法。
  75. アウトプット組成物の細胞が、凍結保護物質の存在下で製剤化される、請求項74記載の方法。
  76. 凍結保護物質がDMSOを含む、請求項75記載の方法。
  77. アウトプット組成物の細胞が、容器、任意でバイアルまたはバッグ中に製剤化される、請求項74〜76のいずれか一項記載の方法。
  78. インキュベートする工程の前に、CD4＋および/またはCD8＋T細胞を生物学的試料から単離する工程をさらに含む、1〜4および16〜77のいずれか一項記載の方法。
  79. 前記単離する工程が、任意で陽性または陰性選択によって、CD4および/またはCD8の表面発現に基づいて細胞を選択することを含む、請求項78記載の方法。
  80. 前記単離する工程が、免疫親和性に基づく選択を実施することを含む、請求項78または請求項79記載の方法。
  81. 生物学的試料が対象から得られた初代T細胞を含む、請求項78〜80のいずれか一項記載の方法。
  82. 生物学的試料が、全血試料、バフィーコート試料、末梢血単核球（PBMC）試料、未分画T細胞試料、リンパ球試料、白血球試料、アフェレーシス産物もしくは白血球アフェレーシス産物であるか、またはそれを含む、請求項78〜81のいずれか一項記載の方法。
  83. 組換え受容体が、疾患、障害もしくは病態の細胞もしくは組織に関連する、疾患、障害もしくは病態の細胞もしくは組織に特異的である、かつ/または疾患、障害もしくは病態の細胞もしくは組織上に発現される標的抗原に結合することが可能である、請求項1〜82のいずれか一項記載の方法。
  84. 疾患、障害または病態が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくはがんである、請求項83記載の方法。
  85. 前記標的抗原が腫瘍抗原である、請求項83または請求項84記載の方法。
  86. 前記標的抗原が、5T4、8H9、avb6インテグリン、B7-H6、B細胞成熟抗原（BCMA）、CA9、がん精巣抗原、炭酸脱水酵素9（CAIX）、CCL-1、CD19、CD20、CD22、CEA、B型肝炎表面抗原、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、がん胎児性抗原（CEA）、CE7、サイクリン、サイクリンA2、c-Met、二重抗原、EGFR、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、EPHa2、エフリンB2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二量体、EGFR vIII、エストロゲン受容体、胎児AchR、葉酸受容体α、葉酸結合タンパク質（FBP）、FCRL5、FCRH5、胎児アセチルコリン受容体、G250/CAIX、GD2、GD3、Gタンパク質共役受容体5D（GPRC5D）、gp100、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerbB2）、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13受容体α2（IL-13Ra2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、ルイスY、L1-細胞接着分子（L1-CAM）、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1、メソテリン、マウスCMV、ムチン1（MUC1）、MUC16、NCAM、NKG2D、NKG2Dリガンド、NY-ESO-1、O-アセチル化GD2（OGD2）、がん胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、PSCA、プロゲステロン受容体、サバイビン、ROR1、TAG72、tEGFR、VEGF受容体、VEGF-R2、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的抗原およびユニバーサルタグに関連する抗原の中から選択される、請求項83〜85のいずれか一項記載の方法。
  87. 組換え受容体が、機能性の非TCR抗原受容体もしくはTCRもしくはこれらの抗原結合断片であるか、または機能性の非TCR抗原受容体もしくはTCRもしくはこれらの抗原結合断片を含む、請求項1〜86のいずれか一項記載の方法。
  88. 組換え受容体がキメラ抗原受容体（CAR）である、請求項1〜87のいずれか一項記載の方法。
  89. 組換え受容体が抗CD19CARである、請求項1〜88のいずれか一項記載の方法。
  90. キメラ抗原受容体が、抗原結合ドメインを含む細胞外ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達領域とを含む、請求項89記載の方法。
  91. 抗原結合ドメインが、抗体もしくは任意で一本鎖断片であるその抗体断片であるか、または抗体もしくは任意で一本鎖断片であるその抗体断片を含む、請求項90記載の方法。
  92. 前記断片が、フレキシブルリンカーによって連結された抗体可変領域を含む、請求項91記載の方法。
  93. 前記断片がscFvを含む、請求項91または請求項92記載の方法。
  94. キメラ抗原受容体が、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達領域の間に膜貫通ドメインをさらに含む、請求項91〜93のいずれか一項記載の方法。
  95. キメラ抗原受容体が、抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にスペーサーをさらに含み、任意で、前記スペーサーが免疫グロブリン定常領域の一部であり、任意で、前記一部がヒンジ領域であるかまたはヒンジ領域を含む、請求項91〜94のいずれか一項記載の方法。
  96. 細胞内シグナル伝達ドメインが、一次シグナル伝達ドメイン、T細胞中で一次活性化シグナルを誘導することが可能なシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）成分のシグナル伝達ドメイン、および/もしくは免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む、請求項90〜95のいずれか一項記載の方法。
  97. 細胞内シグナル伝達ドメインが、CD3鎖の、任意でCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメインもしくはそのシグナル伝達部分であるか、またはCD3鎖の、任意でCD3-ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナル伝達ドメインもしくはそのシグナル伝達部分を含む、請求項96記載の方法。
  98. 細胞内シグナル伝達領域が、共刺激シグナル伝達領域をさらに含む、請求項90〜97のいずれか一項記載の方法。
  99. 共刺激シグナル伝達領域が、T細胞共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインまたはそのシグナル伝達部分を含む、請求項98記載の方法。
  100. 共刺激シグナル伝達領域が、CD28、4-1BBもしくはICOSの細胞内シグナル伝達ドメインまたはこれらのシグナル伝達部分を含む、請求項98または請求項99記載の方法。
  101. 共刺激シグナル伝達領域が、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達領域との間にある、請求項98〜100のいずれか一項記載の方法。
  102. 初代T細胞が、濃縮されたCD4＋T細胞および濃縮されたCD8＋T細胞の別個の組成物を含み、かつ濃縮されたCD4＋T細胞および濃縮されたCD8＋T細胞の組成物が、別々にインキュベートされる、請求項1〜4および請求項15〜101のいずれか一項記載の方法。
  103. 初代T細胞が、濃縮されたCD4＋T細胞および濃縮されたCD8＋T細胞の別個の組成物を含み、かつ濃縮されたCD4＋T細胞および濃縮されたCD8＋T細胞の組成物が、別々に培養される、請求項5〜16および請求項23〜101のいずれか一項記載の方法。
  104. 請求項1〜103のいずれか一項記載の方法によって作製された操作された細胞を含む組成物。
  105. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項104記載の組成物。
  106. 凍結保護物質、任意でDMSOを含む、請求項104または請求項105記載の組成物。
  107. 請求項104〜106のいずれか一項記載の組成物と、アウトプット組成物を対象に投与するための指示書とを含む、製造品。
  108. 対象が疾患または病態を有し、任意で、組換え受容体が、前記疾患もしくは病態に関連する抗原または前記疾患もしくは病態の細胞上に発現されるかもしくは存在する抗原を特異的に認識するか、または前記抗原に特異的に結合する、請求項107記載の製造品。
  109. アウトプット組成物が、操作されたCD4＋T細胞の組成物である、請求項107または請求項108記載の製造品。
  110. アウトプット組成物が、CD8＋T細胞の操作された組成物である、請求項107または請求項108記載の製造品。
  111. アウトプット組成物が、CD4＋およびCD8＋T細胞の操作された組成物である、請求項107または請求項108記載の製造品。
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