CN111615556A - 产生t细胞组合物的方法 - Google Patents

产生t细胞组合物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111615556A
CN111615556A CN201880084187.4A CN201880084187A CN111615556A CN 111615556 A CN111615556 A CN 111615556A CN 201880084187 A CN201880084187 A CN 201880084187A CN 111615556 A CN111615556 A CN 111615556A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cells
composition
substituted
cell
agent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201880084187.4A
Other languages
English (en)
Inventor
A·布拉曼丹
L·G·汤普森
D·莫滕森
E·费瓦洛夫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Celgene Corp
Juno Therapeutics Inc
Original Assignee
Celgene Corp
Juno Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Celgene Corp, Juno Therapeutics Inc filed Critical Celgene Corp
Publication of CN111615556A publication Critical patent/CN111615556A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/04—Immunosuppressors, e.g. cyclosporin, tacrolimus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2307—Interleukin-7 (IL-7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2315—Interleukin-15 (IL-15)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/505—CD4; CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本文提供了用于产生如用于在细胞疗法中使用的表达重组受体的工程化T细胞的方法。在一些方面，所提供的方法包括在刺激条件下孵育所述细胞、通过转导或转染将重组多肽引入所述细胞和/或在促进增殖和/或扩增的条件下培育所述细胞的一个或多个步骤，其中一个或多个步骤在抑制哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)活性的药剂存在下进行。在一些方面，在抑制哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)活性的药剂存在下进行培育。在一些方面，所提供的方法产生在体内具有改善的持久性和/或抗肿瘤活性的基因工程化T细胞。

Description

产生T细胞组合物的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求以下的优先权：2018年7月28日提交的美国临时专利申请 62/711,494、2018年7月17日提交的美国临时专利申请62/699,709、2017年11 月10日提交的美国临时专利申请62/584,687、和2017年11月1日提交的美国临时专利申请62/580,435，将所述临时专利申请的内容通过引用以其整体并入。
通过引用并入序列表
本申请是与电子格式的序列表一起提交的。所述序列表作为2018年11月 1日创建的标题为735042013440SeqList.txt的文件提供，其大小为57,098字节。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本提供了用于产生如用于在细胞疗法中使用的表达重组受体的工程化T细胞的方法。在一些方面，所提供的方法包括在刺激条件下孵育所述细胞、通过转导或转染将重组多肽引入所述细胞和/或在促进增殖和/或扩增的条件下培育所述细胞的一个或多个步骤，其中一个或多个步骤在抑制哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)活性的药剂存在下进行。在一些方面，在抑制哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR)活性的药剂存在下进行培育。在一些方面，所提供的方法产生在体内具有改善的持久性和/或抗肿瘤活性的基因工程化T细胞。
背景技术
多种细胞疗法方法可用于治疗疾病和病症。细胞疗法方法是涉及用重组受体(如嵌合抗原受体)基因工程化的免疫细胞(如T细胞)的方法。需要用于制造和/或工程化此类细胞疗法的改进方法，包括提供更有效的方法和/ 或改进的细胞组合物产品。提供了满足此类需要的用于产生工程化细胞的方法、工程化细胞、组合物、试剂盒和制品以及治疗方法。
发明内容
本文提供了用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括在抑制 mTOR活性的药剂存在下培育包含包括用重组受体工程化的细胞的原代人T 细胞的工程化细胞组合物，其中所述组合物中的细胞在培育之前尚未暴露于所述药剂；并且其中所述方法导致所述组合物中的所述细胞的增殖或扩增以产生包含工程化T细胞的输出组合物。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述原代T细胞是CD4+和/或CD8+T细胞。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述工程化T细胞组合物包含经富集CD4+T细胞。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述工程化T细胞组合物包含经富集CD8+T细胞。
本文提供了用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括在抑制 mTOR活性的药剂存在下培育包含包括用重组受体工程化的T细胞的经富集 CD4+和/或经富集CD8+原代人T细胞的工程化细胞组合物；其中所述方法导致所述组合物中细胞的增殖或扩增以产生包含工程化的经富集CD4+和/或经富集CD8+T细胞的输出组合物。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述工程化T细胞组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述工程化T细胞组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％ CD8+原代人T细胞；和/或所述输入组合物基本上由CD8+原代人T细胞组成。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述工程化T细胞组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+和CD8+原代人T细胞；和/或所述输入组合物基本上由CD4+和CD8+原代人T细胞组成。
在任何所提供方法的某些实施方案中，所述培育是在一种或多种细胞因子存在下进行。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、G-CSF和GM-CSF中的一种或多种。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。
在任何所提供方法的某些实施方案中，在所述培育之前，所述方法进一步包括：(a)在刺激条件下孵育包含原代T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括存在能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂，从而生成经刺激组合物；以及(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而生成包含工程化T细胞的工程化组合物。
在任何所提供方法的一些实施方案中，所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含原代CD4+和/或CD8+T细胞。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含经富集CD4+T细胞。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含经富集 CD8+T细胞。
本文提供了用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)在刺激条件下孵育包含针对CD4+和/或CD8+原代人T细胞进行富集的T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)抑制mTOR活性的药剂；以及(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而生成包含工程化T细胞的工程化组合物。
在任何所提供方法的一些实施方案中，所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或所述输入组合物基本上由 CD4+原代人T细胞组成。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD8+原代人T细胞；和/或所述输入组合物基本上由CD8+原代人T细胞组成。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+和CD8+原代人T细胞；和/或所述输入组合物基本上由CD4+和CD8+原代人T细胞组成。
在任何所提供方法的某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是小分子、小有机分子、多核苷酸、寡核苷酸、siRNA或多肽。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是小有机分子。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂抑制mTORC1和/或mTORC2激酶活性。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂抑制至少一种另外的激酶的活性。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述至少一种另外的激酶是PI3K。在任何所提供方法的一些实施方案中，其中所述抑制mTOR活性的药剂是BEZ235、BGT226、GDC0980、NVP-BEZ235、 PF-04691502、PI-103、SAR245409、SF1126、VS5584或XL765。
在任何所提供方法的特定实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂：(i) 不抑制PI3K活性；(ii)在对mTOR活性的IC50下不可检测地抑制PI3K活性；和/或(iii)在所有可检测地抑制mTOR活性的浓度下均不可检测地抑制 PI3K。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂抑制mTORC1和mTORC2激酶活性。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是吡唑并嘧啶、Torin l、Torkinib、PP30、Ku-0063794、WAY-600(Wyeth)、WAY-687(Wyeth)、WAY-354(Wyeth)、OSI-027、DS3078a 或AZD8055。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂选择性地抑制mTORC1活性。
在任何所提供方法的某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂：(i) 不抑制mTORC2活性；(ii)在针对mTORC1活性的IC50下不可检测地抑制 mTORC2活性；和/或(iii)在所有可检测地抑制mTORC1活性的浓度下均不可检测地抑制mTORC2。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述抑制 mTOR活性的药剂是雷帕霉素、替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司 (everolimus)、地弗莫司(deforolimus)或AZD8055。
在任何所提供方法的特定实施方案中，所述药剂包括式I中所示的式，
Figure BDA0002556467450000041
Figure BDA0002556467450000051
其中R1是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，R2是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，并且R3和R4独立地是H或C1-8烷基。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是或包括式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，所述抑制mTOR 活性的药剂是或包括式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐。
在任何所提供方法的某些实施方案中，R1是取代的芳基、取代或未取代的杂芳基，如取代的苯基。在任何所提供方法的一些实施方案中，R2是取代或未取代的芳基和/或取代或未取代的苯基。在一些实施方案中，R2是取代或未取代的芳基，如取代或未取代的苯基。在任何所提供方法的特定实施方案中，取代的基团是被一个或多个如下基团取代：卤素；C1-8烷基；C2-8烯基； C2-8炔基；羟基；C1-8烷氧基；氨基；硝基；硫醇；硫醚；亚胺；氰基；酰胺基；膦酸基；膦；羧基；硫代羰基；磺酰基；磺酰胺；酮；醛；酯；羰基；卤代烷基；B(OH)2；碳环环烷基；杂环烷基；单环或稠合或非稠合多环芳基或杂芳基；氨基；O-低级烷基；O-芳基；芳基；芳基-低级烷基；CO2CH3； CONH2；OCH2CONH2；NH2；SO2NH2；OCHF2；CF3；或OCF3基团。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是化合物63。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是或包括 2-(3-羟基苯基)-9-(2-异丙基苯基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-甲酰胺、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是或包括
Figure BDA0002556467450000052
或其药学上可接受的盐。
在任何所提供方法的一些实施方案中，所述药剂包括式(II)中所示的式，
Figure BDA0002556467450000061
其中L是直接键、NH或O，Y是N或CR3，其中R1是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的C2-8烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，R2是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，R3是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、-NHR4或-N(R4)2，并且R4在每次出现时独立地是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是或包括式(II)的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是或包括式 (II)的化合物、或其药学上可接受的盐。
在任何所提供方法的特定实施方案中，R1是取代的芳基和/或取代的苯基。在任何所提供方法的一些实施方案中，R1是取代的芳基，如取代的苯基。在任何所提供方法的某些实施方案中，Y是CH。在任何所提供方法的一些实施方案中，L是直接键。在任何所提供方法的特定实施方案中，R1是取代的芳基并且R2是被一个或多个选自以下的取代基取代的C1-8烷基：烷氧基、氨基、羟基、环烷基或杂环烷基。在任何所提供方法的某些实施方案中，R2是被一个或多个杂环烷基取代的C1-8烷基。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是化合物155。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是或包括6-(4-(2H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)-1-(2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪-2(3H)-酮、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是或包括
Figure BDA0002556467450000071
或其药学上可接受的盐。
在任何所提供方法的特定实施方案中，所述药剂包括式III中所示的式
Figure BDA0002556467450000072
其中R1是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基或取代或未取代的杂环基烷基，R2是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环基烷基、取代或未取代的芳烷基或取代或未取代的环烷基烷基，并且R3是H，或取代或未取代的C1-8烷基。在任何所提供方法的某些实施方案中，R1是取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。在任何所提供方法的一些实施方案中，R1是取代的吡啶基。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是或包括式(III)的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是或包括式(III) 的化合物、或其药学上可接受的盐。
在任何所提供方法的特定实施方案中，R1是被一个或多个独立地选自以下的取代基取代的吡啶基：取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的杂环基、卤素、氨基羰基、氰基、羟基烷基、-OR和-NR2，其中每个R独立地是 H，或取代或未取代的C1-4烷基。在某些实施方案中，R1是1H-吡咯并[2,3-b] 吡啶基或苯并咪唑基，任选地被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：取代或未取代的C1-8烷基和-NR2，其中R独立地是H，或取代或未取代的C1-4烷基。
在任何所提供方法的一些实施方案中，R1是
Figure BDA0002556467450000081
其中R在每次出现时独立地是H、或取代或未取代的C1-4烷基(例如，甲基)； R1在每次出现时独立地是取代或未取代的C1-4烷基、卤素、氰基、-OR或-NR2； m是0-3；并且n是0-3。
在任何所提供方法的特定实施方案中，R2是H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、环戊基、环己基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、(C1-4烷基)-苯基、(C1-4烷基)-环丙基、(C1-4烷基)-环丁基、(C1-4烷基)-环戊基、(C1-4烷基)-环己基、(C1-4烷基)-吡咯烷基、 (C1-4烷基)-哌啶基、(C1-4烷基)-哌嗪基、(C1-4烷基)-吗啉基、(C1-4烷基)-四氢呋喃基或(C1-4烷基)-四氢吡喃基，各自任选地被取代。
在任何所提供方法的某些实施方案中，R2是H、C1-4烷基、(C1-4烷基)(OR)、
Figure BDA0002556467450000082
其中R在每次出现时独立地是H、或取代或未取代的C1-8烷基，R'在每次出现时独立地是H、-OR、氰基或取代或未取代的C1-8烷基，并且p是0-3。
在任何所提供方法的一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是化合物246。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是或包括7-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-3-基)-1-((1r,4r)-4-甲氧基环己基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是或包括
Figure BDA0002556467450000091
或其药学上可接受的盐。
本文提供了用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括在抑制 mTOR活性的药剂存在下培育包含包括用重组受体工程化的T细胞的经富集原代人T细胞的工程化细胞组合物；其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物63、化合物155或化合物246；并且其中所述方法导致所述组合物中细胞的增殖或扩增以产生包含工程化T细胞的输出组合物。
在任何所提供方法的特定实施方案中，在500nM与2μM之间、在1nM 与100nM之间、在50nM与250nM之间或在100nM与500nM之间的化合物63 存在下培育所述工程化细胞组合物。在任何所提供方法的某些实施方案中，在500nM与2μM之间、在1nM与100nM之间、在50nM与250nM之间或在 100nM与500nM之间的化合物155存在下培育所述工程化细胞组合物。在任何所提供方法的一些实施方案中，在500nM与2μM之间、在1nM与100nM 之间、在50nM与250nM之间或在100nM与500nM之间的化合物246存在下培育所述工程化细胞组合物。
在任何所提供方法的特定实施方案中，在所述培育之前，所述方法进一步包括：(a)在刺激条件下、在抑制mTOR活性的药剂存在下孵育包含原代T 细胞的输入组合物，其中所述刺激条件包括存在能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂，从而生成经刺激组合物；并且其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物63、化合物155或化合物 246；以及(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而生成包含工程化T 细胞的工程化组合物。
本文提供了用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括：(a)在刺激条件下孵育包含原代人T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)抑制mTOR活性的药剂，其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物63、化合物155或化合物246；以及(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而生成包含工程化T细胞的工程化组合物。在一些实施方案中，所述原代T细胞富含CD4+和/或CD8+T细胞。
在任何所提供方法的某些实施方案中，所述刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性地结合、任选地与CD3特异性地结合的一级药剂。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述刺激试剂进一步包含与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137 (4-1-BB)、OX40或ICOS。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述一级和/或二级药剂包括抗体，任选地其中所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述一级药剂和/或二级药剂存在于固体支持物的表面上。在任何所提供方法的一些实施方案中，固体支持物是或包括珠。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述珠的直径大于或大于约3.5μm，但是不大于约9μm或不大于约8μm或不大于约7μm或不大于约6μm或不大于约5μm。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述珠的直径为或为约4.5μm。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述珠是惰性的。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述珠是或包括聚苯乙烯表面。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述珠是磁性或超顺磁性的。在任何所提供方法的一些实施方案中，珠与细胞的比率为从或从约4:1至0.25:1。
在任何所提供方法的特定实施方案中，所述引入包括用包含编码所述重组受体的多核苷酸的病毒载体转导所述经刺激组合物的细胞。在任何所提供的方法的某些实施方案中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在任何所提供的方法的一些实施方案中，所述病毒载体是逆转录病毒载体或γ逆转录病毒载体。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述引入包括用包含编码所述重组受体的多核苷酸的载体转染所述经刺激组合物的所述细胞。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述载体是转座子，任选地Sleeping Beauty(SB) 转座子或Piggybac转座子。
在所提供方法的一些实施方案中，在所述培育之后，所述方法进一步包括收集所述输出组合物的细胞。任何所提供方法的特定实施方案进一步包括任选地在药学上可接受的赋形剂存在下配制所述输出组合物的细胞以用于低温保存和/或给予至受试者。在任何所提供方法的某些实施方案中，在低温保护剂存在下配制所述输出组合物的所述细胞。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述低温保护剂包括DMSO。在任何所提供方法的特定实施方案中，将所述输出组合物的所述细胞配制于容器，任选地小瓶或袋中。
所提供方法的某些实施方案进一步包括在所述孵育之前将所述CD4+和/ 或所述CD8+T细胞从生物样品中分离。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述分离包括基于CD4和/或CD8的表面表达来选择细胞，任选地通过阳性或阴性选择。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述分离包括进行基于免疫亲和力的选择。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述生物样品包括从受试者获得的原代T细胞。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述生物样品是或包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC) 样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
在任何所提供方法的特定实施方案中，所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和 /或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病、或肿瘤或癌症。在任何所提供的方法的一些实施方案中，所述靶抗原是肿瘤抗原。
在任何所提供的方法的特定实施方案中，所述靶抗原选自5T4、8H9、avb6 整合素、B7-H6、B细胞成熟抗原(BCMA)、CA9、癌症-睾丸抗原、碳酸酐酶9(CAIX)、CCL-1、CD19、CD20、CD22、CEA、乙型肝炎表面抗原、 CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、癌胚抗原(CEA)、CE7、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、 c-Met、双重抗原、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、 EPHa2、肝配蛋白B2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、雌激素受体、胎儿AchR、叶酸受体α、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、G250/CAIX、GD2、GD3、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、gp100、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13 受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、 MAGE-A6、MART-1、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、NCAM、NKG2D、NKG2D配体、NY-ESO-1、O-乙酰化GD2(OGD2)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、PSCA、孕酮受体、存活蛋白、ROR1、 TAG72、tEGFR、VEGF受体、VEGF-R2、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原和与通用标签相关的抗原。
在任何所提供方法的某些实施方案中，所述重组受体是或包括功能性非 TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述重组受体是抗CD19 CAR。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述嵌合抗原受体包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域。
在任何所提供方法的一些实施方案中，所述抗原结合结构域是或包括抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述片段包括通过柔性接头连接的抗体可变区。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述片段包括scFv。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述嵌合抗原受体进一步包含间隔子和/或铰链区。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述嵌合抗原受体包含细胞内信号传导区域。在任何所提供方法的某些实施方案中，细胞内信号传导区域包括细胞内信号传导结构域。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包括初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是或包括CD3链(任选地CD3-zeta (CD3ζ)链)的细胞内信号传导结构域、或其信号传导部分。
在任何所提供方法的某些实施方案中，其中所述嵌合抗原受体进一步包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域进一步包括共刺激信号传导区域。在任何所提供方法的某些实施方案中，所述共刺激信号传导区域包括T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述共刺激信号传导区域包括 CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。在任何所提供方法的一些实施方案中，所述共刺激信号传导区域位于跨膜结构域与细胞内信号传导区域之间。
在任何所提供方法的某些实施方案中，所述原代T细胞包括经富集CD4+ T细胞和经富集CD8+T细胞的单独组合物，并且其中分别培育所述经富集 CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的组合物。在任何所提供方法的特定实施方案中，所述原代T细胞包括经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的单独组合物，并且其中将所述组合物混合以便一起培育所述经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞。
本文提供了通过本文所提供的任何方法产生的包含工程化细胞的组合物。在特定实施方案中，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述组合物包含低温保护剂，任选地DMSO。
本文提供了制品，所述制品包括本文提供的任何组合物和用于将所述输出组合物给予至受试者的说明书。在某些实施方案中，所述受试者患有疾病或病症，任选地其中所述重组受体特异性地识别或特异性地结合至与所述疾病或病症相关或在所述疾病或病症的细胞上表达或存在的抗原。在特定实施方案中，所述输出组合物是工程化CD4+T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述输出组合物是CD8+T细胞的工程化组合物。在某些实施方案中，所述输出组合物是CD4+和CD8+T细胞的工程化组合物。
本文提供了制品，所述制品包括通过本文提供的方法产生的工程化 CD4+T细胞的组合物、通过本文提供的方法产生的工程化CD8+T细胞的组合物；和用于将所述工程化CD4+T细胞和所述工程化CD8+T细胞给予至受试者的说明书。在某些实施方案中，所述说明书规定将所述CD4+T细胞和 CD8+T细胞分开给予至所述受试者。在某些实施方案中，所述说明书规定将所述CD4+T细胞和所述CD8+T细胞以所需比率给予至所述受试者。本文还提供了制品，所述制品包括通过本文提供的方法产生的工程化CD4+和CD8+ T细胞的组合物；和用于将所述工程化CD4+和CD8+T细胞给予至受试者的说明书。
本文提供了用于评估细胞组合物的长期刺激方法，所述方法包括将输入组合物在刺激输入组合物中的细胞的CAR依赖性活性的条件下孵育至少10 天的时间段从而产生输出组合物，所述输入组合物含有表达嵌合抗原受体 (CAR)的T细胞，所述嵌合抗原受体含有特异性地结合或识别抗原的细胞外抗原结合结构域；并且评估输出组合物的一种或多种细胞的一种或多种表型或活性。
在长期刺激方法的任何实施方案的一些中，刺激CAR依赖性活性的条件包括存在与CAR的抗原结合结构域特异性地结合的结合分子。在一些实施方案中，将结合分子附接至支持物。在一些实施方案中，支持物是固体支持物。在一些实施方案中，固体支持物是微板的孔的表面或珠的表面。在一些实施方案中，固体支持物是微板，所述微板具有与微板附接的结合分子，并且在微板中进行孵育。在一些实施方案中，固体支持物是已经附接有结合分子的珠，并且在多个所述珠存在下进行孵育。
在长期刺激方法的任何实施方案的一些中，结合分子是或包含由抗原结合结构域识别的重组抗原或其部分。在一些实施方案中，重组抗原或其部分是BCMA，或者是其由抗原结合结构域识别的部分。在一些实施方案中，结合分子是或包括与抗原结合结构域特异性地结合的抗独特型抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原受体的抗原结合结构域是或包含抗体 SJ25C1或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗原受体的抗原结合结构域是或包括抗体FMC63或其抗原结合片段。
在长期刺激方法的任何实施方案的一些中，所述方法在体外或离体进行。
在长期刺激方法的任何实施方案的一些中，在不包含重组细胞因子的培养基存在下孵育输入组合物。在一些实施方案中，所述孵育在所述时间段中连续地进行或不中断。在一些实施方案中，在孵育期间，不对细胞进行再铺板、不更换培养基并且不添加结合分子。
在长期刺激方法的任何实施方案的一些中，所述方法包括评估输出组合物的一种或多种细胞的激活、消耗或分化状态的一种或多种表型。在一些实施方案中，表型是消耗，并且所述评估包括测量选自以下的一种或多种标记的表达(任选地表面表达)：CTLA-4、FOXP3、PD-1、TIGIT、LAB-3、2B4、 BTLA、TIM3、VISTA、或CD96。在一些实施方案中，表型是激活，并且所述评估包括测量选自以下的一种或多种标记的表达(任选地表面表达)：CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD71、CD154、CD40L、CD127、LAG3、或Ki67。在一些实施方案中，表型是分化状态，并且所述评估包括测量选自以下的一种或多种标记：(i)CD25、CD45RO、CD56、KLRG1、CD95中的一种或多种和/或(ii)CD45RA、CD27、CD28、CD62L和CCR7中的一种或多种，任选地其中所述一种或多种标记是与幼稚样T细胞正相关或反相关的标记。
在长期刺激方法的任何实施方案的一些中，所述方法包括评估输出组合物的一种或多种细胞的一种或多种活性。在一些实施方案中，所述一种或多种活性包括CAR依赖性活性，任选地抗原刺激活性。在一些实施方案中，所述一种或多种活性包括细胞溶解活性或细胞因子产生。
在长期刺激方法的一些任何实施方案中，所述时间段为至少或至少约11 天、12天、13天、14天或15天。在一些实施方案中，所述时间段为或为约11 天、12天、13天、14天或15天。
在长期刺激方法的任何实施方案的一些中，输入组合物含有在所述孵育之前已经暴露于或接触测试药剂或化合物的细胞，任选地其中所述暴露或所述接触是在如下过程的一个或多个步骤期间进行，所述过程用于产生包含表达CAR的T细胞的输入组合物。在一些实施方案中，所述方法是对多种输入组合物进行，所述多种中的所述输入组合物中的每一种是通过不同的过程产生的。
在长期刺激方法的任何实施方案的一些中，所述方法还包括将输出组合物的表型或活性与对照组合物的表型或活性进行比较，任选地其中所述对照组合物是T细胞组合物，所述T细胞已在刺激CAR依赖性活性的相同条件下被孵育至少10天，所述T细胞组合物尚未在测试药剂或化合物存在下产生，或者已经通过与输入组合物相比的替代性过程产生。在一些实施方案中，所述方法进一步包括鉴定展现出例如与对照组合物相比消耗减少、激活减少或分化减少的输出组合物。在一些实施方案中，所述分化减少包括一种或多种幼稚样T细胞标记的表达增加。
附图说明
图1A-图1D示出了显示在CD4+和CD8+T细胞中检测的磷酸化S6水平的图，所述T细胞在各种浓度的PI-103(图1A)、化合物155(图1B)、化合物246 (图1C)或化合物63(图1D)存在下与抗CD3和抗CD28抗体缀合的磁珠一起孵育。
图2示出了显示在仅培养基对照中、或在DMSO、PI-103或各种浓度的化合物155、化合物63或化合物246存在下孵育之后存在的工程化CD8+(顶图) 和CD4+(底图)T细胞的初始细胞数的百分比的图。箭头指示导致类似水平的CD8和CD4 T细胞扩增的化合物155、化合物63和化合物246的最高耐受剂量。虚水平线指示培养基和DMSO对照的平均值的70％。
图3A-图3C示出了在生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物之间CD8+T细胞中的细胞糖酵解代谢的图。图3A提供了显示在通过在仅培养基、DMSO、 PI-103或化合物63存在下扩增而生成的抗CD19 CAR-T细胞之间，CD8+ CAR-T细胞的实时细胞外酸化速率(ECAR)的图。图3B显示了相对于仅培养基对照，针对ECAR速率(mpH/min)计算的曲线下面积(AUC)。图3C 示出了相对于仅培养基对照的最大ECAR糖酵解爆发(glycolytic burst)比率。
图4A-图4B提供了显示对抗CD19 CAR-T细胞组合物进行的测定的结果的图，所述抗CD19 CAR-T细胞组合物通过在仅培养基、DMSO、PI-103或化合物63存在下扩增而生成。图4A示出了在与经转导以表达CD19的经辐照 K-562细胞(经辐照K562-CD19靶细胞)和未暴露于抗原的细胞(无刺激(no stim))共培养后，生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的CD8+和CD4+T细胞中磷酸-S6染色的平均荧光强度。顶图显示从单独的细胞组合物测量的单独数据点。底图显示平均值+/-标准差。图4B提供了显示生成的CAR-T细胞组合物的细胞溶解活性的图，所述CAR-T细胞组合物与K562-CD19靶细胞以 3:1或1:1效应细胞与靶细胞的比率共培养。将来自生成的CAR-T细胞组合物和表达CD19的K562细胞的测量提供为对照。
图5提供了显示与经辐照K562-CD19靶细胞共培养的抗CD19 CAR-T细胞组合物的TNF-α(左图)、IFN-γ(中图)和IL-2(右图)的分泌的图。显示了与在仅培养基中扩增的细胞相比，在来自在PI-103、化合物63或DMSO 媒介物存在下扩增的生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的共培养上清液中观察到的细胞因子产生的倍数变化。
图6A和图6B示出了显示来自生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的CD8+ (图6A)和CD4+(图6B)T细胞的多功能细胞因子谱的图，所述抗CD19 CAR-T细胞组合物与经辐照K562-CD19靶细胞共培养并且然后进一步与PMA/离子霉素(左图)或高尔基体抑制剂(右图)一起孵育。显示了与在仅培养基中扩增的细胞相比，在PI-103、化合物63或DMSO媒介物存在下扩增的生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物中，针对CD107a、IFN-γ(IFNg)、IL-2、 IL-17a和TNF-α(TNFa)的不同组合阳性染色的细胞的增加频率。
图7A-图7D示出了显示来自生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的T细胞的活性的图，所述抗CD19 CAR-T细胞组合物是在重复刺激后在仅培养基、 DMSO、PI-103或化合物63存在下扩增的。图7A示出了来自与经辐照 K562-CD19靶细胞共培养的生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的T细胞的群体倍增数。在4轮再刺激之后，在第11天时在没有靶细胞的情况下再培养T细胞。图7B显示了相对于仅培养基对照，针对群体倍增数计算的曲线下面积 (AUC)。图7C示出了显示在用经辐照K562-CD19靶细胞进行4轮重复刺激后，在通过与经辐照K562-CD19靶细胞共培养16小时刺激后，来自生成的抗 CD19 CAR-T细胞组合物的T细胞的TNF-α(TNF)、IFN-γ(IFNg)和IL-2产生的图。示出了与仅培养基条件相比，细胞外TNF-α(TNF)、IFN-γ(IFNg) 和IL-2的倍数变化。图7D示出了描绘在用经辐照K562-CD19靶细胞进行4轮再刺激后，来自生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的CD8+T细胞的多功能细胞因子谱的图。
图8A-图8D示出了显示来自生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的T细胞的活性的图，所述抗CD19 CAR-T细胞组合物是在用表面缀合有对于抗CD19 CAR具有特异性的抗独特型抗体的珠刺激后，在仅培养基、DMSO、PI-103 或化合物63存在下扩增的。图8A示出了来自生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的T细胞的每孔总活T细胞计数，所述抗CD19 CAR-T细胞组合物是与表面缀合有抗独特型抗体的珠共培养的。图8B显示了相对于仅培养基对照，针对活T细胞计数计算的曲线下面积(AUC)。图8C示出了显示在与表面缀合有抗独特型抗体的珠一起孵育15天后，在通过与经辐射K562-CD19靶细胞共培养16小时刺激后，来自生成的抗CD19CAR-T细胞组合物的T细胞的TNF-α (TNF)、IFN-γ(IFNg)和IL-2产生的图。示出了与仅培养基条件相比，细胞外TNF-α(TNF)、IFN-γ(IFNg)和IL-2的倍数变化。图8D示出了描绘在与缀合有抗独特型抗体的珠一起孵育15天后，来自生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的CD8+T细胞的多功能细胞因子谱的图。
图9A-图9C示出了显示来自生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的CD4+ 和CD8+T细胞的RNA-Seq分析的结果的图，所述抗CD19 CAR-T细胞组合物是在仅培养基、DMSO、PI-103或化合物63存在下扩增的。图9A示出了描绘来自生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的CD4+(左图)、CD8+(中图)和组合的CD4+和CD8+(右图)T细胞的差异表达的基因表达的火山图。示出了与仅用DMSO扩增的T细胞相比，在仅培养基(顶行)、PI-103(中行)和化合物63(底行)中扩增的T细胞的差异基因表达。图9B示出了描绘相对于来自在DMSO存在下扩增的生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的T细胞中的表达，在来自在PI-103(X轴)和化合物63(Y-轴)存在下扩增的生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的T细胞中测量的差异表达基因的log2倍数变化(Log2FC) 的图。图9C示出了描绘示例性鉴定的基因本体论(GO)类别及其相应的Z 得分的表和图。
图10A和图10B示出了显示在用抗CD19 CAR-T细胞治疗后携带肿瘤的小鼠中的肿瘤负荷和存活率的图。图10A示出了显示在用抗CD19 CAR-T细胞治疗后携带肿瘤的小鼠至第80天的肿瘤负荷和存活率的图。图10B示出了显示在用抗CD19 CAR-T细胞治疗后携带肿瘤的小鼠至第100天的存活率的图。向Nod scidγ(NSG)免疫缺陷小鼠植入表达萤火虫萤光素酶的Raji细胞，并且所述小鼠未接受治疗，或者接受用高剂量(左图)或低剂量(右图)的在DMSO或PI-103存在下扩增的抗CD19 CAR-T细胞的治疗。如图10A和图 10B中所示，在所指示的时间示出如通过生物发光测量的单独小鼠的肿瘤负荷(顶图)和治疗组的存活曲线(底图)。
图11A和图11B示出了显示在用抗CD19 CAR-T细胞治疗后携带肿瘤的小鼠的肿瘤负荷和存活率的图。图11A示出了显示在用抗CD19 CAR-T细胞治疗后携带肿瘤的小鼠至第80天的肿瘤负荷和存活率的图。图10B示出了显示在用抗CD19 CAR-T细胞治疗后携带肿瘤的小鼠至第100天的存活率的图。向NSG免疫缺陷小鼠植入表达萤火虫萤光素酶的Raji细胞，并且所述小鼠未接受治疗，或者接受用高剂量(左图)或低剂量(右图)的在DMSO或化合物63存在下扩增的抗CD19 CAR-T细胞的治疗。如图11A和图11B中所示，在所指示的时间示出如通过生物发光测量的单独小鼠的肿瘤负荷(顶图)和治疗组的存活曲线(底图)。
图12A和图12B呈现了显示含有抗CD19 CAR+T细胞的T细胞组合物的活性的图。将细胞与抗CD19抗体抗ID缀合的珠一起孵育14天(第14天；次级)，或者在评估活性之前不孵育。示出了在暴露于表达CD19的细胞后的细胞毒性测定(图12A)和内部细胞因子染色(ICS)测定(图12B)的结果。
图13A-图13C呈现了显示在与抗CD19抗体抗ID缀合的珠一起孵育14天期间或之后含有抗CD19 CAR+T细胞的T细胞组合物的特征的图。示出了在 PI-103、化合物63或媒介物存在下生成的T细胞组合物的结果。图13A和图13B 示出了未孵育(初级)或孵育14天(次级)的T细胞组合物响应于暴露于CD19 细胞的活性。示出了在暴露于表达CD19的细胞后通过ICS进行的多功能染色 (polyfunctional staining)(图13A)和细胞溶解活性(图13B)的结果。图13C 描绘了从含有抗CD19 CAR表达细胞的细胞组合物的上清液中分泌的细胞因子的水平，所述抗CD19 CAR表达细胞与表达CD19的细胞以1:1的比率孵育 20小时。测量了IL2、TNF和IFN-γ的量，并且示出了所有三种细胞因子的量表得分的平均值。
图14描绘了在DMSO或化合物63存在下制备的解冻的CAR-T细胞上促凋亡细胞内半胱天冬酶3的表达。FACS绘图示出了由三种不同供体制备的活的CD3+CAR+T细胞。
图15呈现了显示在DMSO、PI103或化合物63存在下制备的CAR-T细胞的随时间推移的活细胞数的图。符号表示来自三名单独供体的培养孔的平均值和SEM。
图16呈现了显示在DMSO、PI103或化合物63存在下制备的解冻的CAR-T 细胞的靶细胞杀伤的图。在解冻后(第0天)立即建立杀伤测定，或在图15 中所述的CAR刺激培养结束时(第14天)建立杀伤测定。符号表示来自三名单独供体的培养孔的平均值和SEM。
图17A-图17B呈现了显示在PI103或化合物63存在下制备的CAR-T细胞具有改善和持续的效应细胞因子谱的图。在解冻后立即将CAR-T细胞与携带抗原的靶细胞1:1(CAR-T:靶标)混合(“初级”，顶图)，或在图15中所述的CAR刺激培养结束时进行所述混合(“次级”，底图)。通过来自在高尔基体抑制剂存在下与靶标一起孵育5小时的CAR-T细胞的FACS，依据细胞因子IL2、TNF和IFNg的细胞内表达来评估T细胞多功能性(图17A)。还测量了来自与靶标一起孵育20小时的CAR-T细胞的培养上清液中的细胞因子分泌(图 17B)。在每个供体群组内通过特征缩放对测定值进行归一化和等级评分。
图18呈现了对如图15中所述在PI103或化合物63存在下生成的经富集CD8+和CD4+CAR-T细胞进行的RNAseq的差异表达(DESeq2)分析的结果。选择对于PI103相对于DMSO或化合物63相对于DMSO具有经调整p值(p-adj) <0.1的差异基因表达，并且示出了log2倍数变化基因表达值。以正方形示出了仅在PI103处理的细胞中显著差异表达的基因。以圆圈示出了仅在化合物 63处理的细胞中显著差异表达的基因。以菱形示出了在两种T细胞组合物中表达的基因。差异表达值是每组的三名单独供体的平均值。
图19A-图19B示出了显示在用抗CD19 CAR-T细胞治疗后携带肿瘤的小鼠中的肿瘤负荷和存活率的图。图19A示出了显示在用高剂量(1x 106个 CAR-T细胞/小鼠)或低剂量(2.5x 105个CAR-T细胞/小鼠)的抗CD19 CAR-T 细胞治疗后小鼠中的肿瘤负荷的图。图19B示出了显示在用高剂量或低剂量的抗CD19 CAR-T细胞治疗后携带肿瘤的小鼠的存活率的图。
图20A-图20B示出了显示在用抗CD19 CAR-T细胞治疗后携带肿瘤的小鼠中的肿瘤负荷和存活率的图。图20A示出了显示在用高剂量(1x 106个 CAR-T细胞/小鼠)或低剂量(2.5x 105个CAR-T细胞/小鼠)的抗CD19 CAR-T 细胞治疗后小鼠中的肿瘤负荷的图。图20B示出了显示在用高剂量或低剂量的抗CD19 CAR-T细胞治疗后携带肿瘤的小鼠的存活率的图。
图21A-图21B示出了展示在接受者小鼠的血液中抗CD19 CAR-T细胞随时间的持久性的图。图21A示出了在接受高剂量(1x 106个CAR-T细胞/小鼠) 的在DMSO(D)、化合物63(C)或PI103(P)存在下制备的CAR-T细胞的小鼠中，在注射后第18天、第25天和第36天的CD4+和CD8+T细胞计数。图 21B示出了在接受低剂量(2.5x 105个CAR-T细胞/小鼠)的在DMSO(D)、化合物63(C)或PI103(P)存在下制备的CAR-T细胞的小鼠中，在注射后第18天、第25天和第36天的CD4+和CD8+T细胞计数。
具体实施方式
本文提供了产生表达重组受体的工程化细胞(如工程化CD4+和/或CD8+ 细胞)的组合物的方法，其中在抑制mTOR活性的药剂存在下进行所述过程的一个或多个步骤(如孵育、刺激和/或培育所述细胞)。在某些实施方案中，所述工程化细胞组合物是包括用重组受体工程化的T细胞的经富集CD4+或经富集CD8+原代T细胞的细胞组合物。在某些实施方案中，所述T细胞是人T 细胞。在一些方面，在抑制mTOR活性的药剂存在下进行培育所述细胞，如用于扩增和/或增殖所述细胞。在一些实施方案中，在培育之前，所述组合物中的所述细胞尚未与所述药剂接触、与所述药剂一起孵育和/或暴露于所述药剂。在某些实施方案中，所述培育导致所述组合物中所述细胞的增殖或扩增以产生包含工程化CD4+和/或CD8+T细胞的输出组合物。
生产用于在细胞疗法中使用的基因工程化T细胞(如CAR-T细胞)包括分离细胞、激活细胞、用重组受体转导或工程化细胞以及扩增T细胞以用于临床给药。该过程可能导致工程化T细胞药物产品的一部分在一些情况下可能包括已被驱动至终末消耗状态的细胞和/或其中细胞缺乏持久性和/或未展现出最佳功效。在一些情况下，多能性和T细胞复制潜能降低。在一些方面，含有消耗细胞的工程化T细胞药物产品在一些情况下可能限制T细胞药物产品的潜在功效。需要用于生产工程化细胞疗法的替代性方法，所述替代性方法最小化或减少当被给予至受试者时已被消耗或可能被消耗、缺乏持久性和 /或具有降低的功效的细胞的百分比或数量。
本文提供的方法是基于以下观察结果：工程化细胞(例如CAR-T细胞) 的持久性、消耗缺乏和/或功效通过在抑制mTOR活性的药剂存在下生产或产生细胞而得到改善。在一些方面，所述药剂是哺乳动物雷帕霉素靶标(mTOR) (如哺乳动物(例如人)mTOR)的抑制剂。在一些实施方案中，所述药剂对mTOR具有特异性，并且不抑制其他相关激酶(如磷酸肌醇3-激酶(PI3- 激酶)家族的激酶)或不具有针对所述其他相关激酶的靶活性。mTOR是一种进化保守的激酶，与磷酸肌醇3激酶(PI3激酶)家族具有基本序列同源性。与PI3K不同，mTOR不是脂质激酶，而是丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶。在哺乳动物细胞中，mTOR被编码为单个基因，其蛋白质产物经由两种不同的复合物 (mTORC1和mTORC2)进行信号传导。通常，认为mTOR调节包括细胞生长和增殖的各种细胞过程。在T细胞中，mTOR可以通过各种刺激物来激活，所述刺激物包括细胞因子受体和T细胞受体的激活。
在一些方面，所提供的方法与如下过程结合使用，其中在抑制mTOR活性的药剂存在下孵育、培育和/或培养工程化T细胞，这在一些方面可以改善或增强所述细胞的扩增、持久性和/或功效，例如抗肿瘤活性。在一些方面，使用抑制mTORC1和mTORC2激酶活性的药剂。在某些实施方案中，所述药剂是选择性mTOR抑制剂，例如，它不抑制另外的激酶，例如PI3K。在一些方面，所述药剂是化合物63、化合物155或化合物246。
在一些方面，所提供的方法产生细胞组合物，其包含经工程化以表达重组受体的原代T细胞(“工程化细胞”)，如用于在细胞疗法中使用，与通过替代性方法(如未在抑制mTOR活性的药剂存在下进行的替代性方法)产生的工程化细胞的组合物相比，含有更少的消耗细胞和/或更少的显示与消耗相关的标记或表型的细胞。在特定实施方案中，与来自通过替代性过程(如未在抑制mTOR活性(例如激酶活性，如mTORC1或mTORC2激酶活性)的药剂存在下进行的替代性方法)产生的工程化细胞的组合物的细胞相比，通过所提供的方法产生的工程化细胞含有增加的记忆样T细胞(如长寿命的记忆T 细胞)的百分比。在某些方面，与通过替代性方法产生的工程化细胞相比，通过所提供的方法产生的工程化细胞分化较少。在一些方面，与通过替代性方法(如未在抑制mTOR活性的药剂存在下进行的替代性方法)生成的工程化细胞相比，所提供的方法产生了具有改善或增强的扩增、持久性和/或抗肿瘤活性的工程化细胞。因此，在一些方面，与通过替代性方法(如未在抑制 mTOR活性的药剂存在下进行的替代性方法)产生的工程化细胞组合物相比，所提供的方法可以生成具有改善的治疗功效的工程化细胞的组合物。在某些实施方案中，与通过替代性方法产生的工程化细胞组合物相比，所提供的方法可以生成具有改善的临床应答持久性的工程化细胞的组合物。在任何此类实施方案中的一些中，与替代性过程的比较是与相同过程比较，不同之处仅在于所述替代性过程未在抑制mTOR活性的药剂存在下进行。
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，并入程度上如同每个单独的出版物通过引用单独并入一般。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中所述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.用于分离、培育和工程化细胞以用于过继细胞疗法的过程
本文提供了用于生成工程化细胞，如工程化原代CD4+T细胞和/或工程化CD8+T细胞的输出组合物的方法，所述工程化细胞表达重组蛋白，例如重组受体如T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，本文提供的方法与如下过程结合使用，所述过程包括在抑制mTOR活性的药剂(如本文所述的任一种，例如化合物63)存在下孵育、培育和/或培养细胞，以生成所述工程化细胞的输出组合物。在一些实施方案中，所述方法与如下过程结合使用，所述过程包括在抑制mTOR活性的药剂(如本文所述的任一种，例如化合物63)存在下，如在促进扩增和/或增值的条件下培育工程化细胞的组合物，以生成所述工程化细胞的输出组合物。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂抑制一种或多种另外的激酶的活性。在一些实施方案中，所述药剂选择性地和/或特异性地抑制mTOR活性。在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是如本文(如在章节II中)所述的药剂。在一些实施方案中，所述药剂抑制mTOR激酶抑制剂。在某些实施方案中，所述药剂抑制mTORC1和/或mTORC2。在特定实施方案中，所述药剂是化合物63、化合物155或化合物246。在某些实施方案中，所述药剂是化合物63。
在一些实施方案中，所述生成或产生工程化细胞，例如工程化CD4+T 细胞和/或工程化CD8+T细胞的方法包括以下中的一个或多个：从受试者分离细胞、制备细胞、处理细胞、在刺激条件下孵育细胞和/或工程化(例如转导)细胞。在一些实施方案中，所述方法包括以如下顺序进行的处理步骤：首先从生物样品中分离，如选择或分开输入细胞，例如原代细胞；在刺激条件下，孵育输入细胞，用载体颗粒，例如病毒载体颗粒对所述输入细胞进行工程化，以例如通过转导或转染将重组多核苷酸引入所述细胞中；培育所述工程化细胞(例如转导的细胞)，如以扩增所述细胞；以及收集、收获所述细胞的全部或一部分，和/或用其填充容器，以将所述细胞配制为输出组合物。在一些实施方案中，在低温保存之前或之后将所产生的输出组合物的细胞重新引入同一受试者中。在一些实施方案中，所述工程化细胞的输出组合物适合于在疗法，例如自体细胞疗法中使用。
在一些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂(如本文所述的任一种，例如化合物63)存在下进行一个或多个步骤或阶段。在一些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂存在下进行以下中的一个或多个步骤：所述细胞组合物的细胞的分离、富集、孵育、工程化、转导、转染、培育、培养、收集、配制、储存和/或低温冷冻。在某些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂存在下培育所述细胞。
在一些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂(如本文所述的任一种，例如化合物63)存在下培育工程化细胞，并且在某些实施方案中，在所述培育之前所述细胞尚未与抑制mTOR活性的药剂接触、与所述药剂一起孵育和/ 或暴露于所述药剂。在一些实施方案中，在培育所述细胞以诱导或刺激其扩增或增殖之前，未将所述输入细胞、所述经刺激细胞和/或所述工程化细胞与抑制mTOR活性的药剂接触、暴露于所述药剂和/或与所述药剂一起孵育。在某些实施方案中，不在mTOR抑制剂存在下进行以下步骤：分离、富集、在一种或多种激活条件下孵育、工程化、转导、转染、配制、储存和/或低温冷冻。
在特定实施方案中，所提供的方法与从初始和/或输入细胞组合物生成表达重组受体的细胞的输出组合物结合使用。在一些实施方案中，所述细胞的组合物是经富集T细胞、经富集CD4+T细胞和/或经富集CD8+T细胞的组合物(在下文也分别称为经富集T细胞的组合物、经富集CD4+T细胞的组合物和经富集CD8+T细胞的组合物)。在某些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂存在下培育经富集T细胞、经富集CD4+T细胞或经富集CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂(如本文所述的任一种，例如化合物63)存在下培育经富集CD4+T细胞的组合物。在某些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂存在下培育经富集CD8+T细胞的组合物。
在一些实施方案中，所提供的方法与在刺激条件下孵育包含原代T细胞的输入组合物结合使用。在一些实施方案中，所述刺激条件是或包括在刺激试剂存在下孵育所述输入组合物。在某些实施方案中，所述刺激试剂是或包括具有表面缀合的抗CD3和抗CD28抗体的珠(例如顺磁珠)。在特定实施方案中，在孵育之前或期间，未将所述输入组合物的所述细胞暴露于所述抑制 mTOR活性的药剂。在一些方面，孵育是用经富集T细胞(例如，CD4+和CD8+ 细胞)的输入组合物进行。在一些实施方案中，所述输入组合物是或包括经富集CD4+T细胞。在某些实施方案中，所述输入组合物是或包括经富集CD8+ T细胞。在一些实施方案中，将例如来自相同生物样品的经富集CD4+T细胞和CD8+T细胞的单独组合物分别孵育。在一些实施方案中，所述孵育的刺激条件对于两种组合物可以是相同的。在某些实施方案中，所述刺激条件可以是不同的。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育一种或多种输入组合物生成一种或多种经刺激组合物。
在某些实施方案中，将重组受体引入到所述经刺激组合物的所述细胞中。在某些实施方案中，通过用病毒载体转导所述经刺激组合物来将所述重组受体引入到所述细胞中。在某些实施方案中，所述病毒载体是或包括编码所述重组受体的多核苷酸。在一些实施方案中，所述病毒载体是逆转录病毒载体。在某些实施方案中，所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。在一些实施方案中，所述经刺激组合物包含或含有经富集T细胞，例如CD4+ 和CD8+细胞。在一些实施方案中，所述经刺激组合物是或包括经富集CD4+ T细胞。在特定实施方案中，所述经刺激组合物是或包括经富集CD8+T细胞。在一些实施方案中，将例如来自相同生物样品的经富集CD4+T细胞和CD8+ T细胞的单独组合物分别工程化。在特定实施方案中，所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。在特定实施方案中，所述CAR是抗CD19CAR。
在一些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂(如本文所述的任一种，例如化合物63)存在下培育工程化细胞(例如，经转导或转染以表达重组受体的细胞)的组合物。在某些实施方案中，所述培育导致所述组合物中所述细胞的增殖和/或扩增，如以产生含有工程化T细胞的输出组合物。在一些方面，在培育之前，所述组合物的所述细胞尚未暴露于所述抑制mTOR活性的药剂(如本文所述的任一种，例如化合物63)、与所述药剂接触和/或与所述药剂一起孵育。在某些实施方案中，所述细胞先前未在所述mTOR抑制剂药剂(如本文所述的任一种，例如化合物63)存在下进行孵育、培养、刺激、工程化、转导和/或转染。
在某些实施方案中，所述细胞的工程化组合物是经富集CD4+T细胞的工程化组合物。在特定实施方案中，所述工程化组合物是工程化CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，所提供的方法与在抑制mTOR活性的药剂(如本文所述的任一种，例如化合物63)存在下分别培育经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的单独工程化组合物结合使用。
在一些实施方案中，所述药剂抑制、减少和/或降低与mTOR相关的一种或多种活性。在一些实施方案中，所述活性是激酶活性。在一些实施方案中，所述活性是mTORC1和/或mTORC2活性。在一些实施方案中，所述药剂选自 BEZ235、BGT226、GDC0980、NVP-BEZ235、PF-04691502、PI-103、 SAR245409、SF1126、VS5584或XL765、吡唑并嘧啶、Torin l、Torkinib、PP30、 Ku-0063794、WAY-600(Wyeth)、WAY-687(Wyeth)、WAY-354(Wyeth)、 OSI-027、DS3078a、AZD8055、雷帕霉素、替西罗莫司、依维莫司、地弗莫司或AZD8055。在某些实施方案中，所述药剂是化合物63、化合物155或化合物246。在一些实施方案中，所述药剂是化合物63。
在某些实施方案中，所述细胞的组合物是经富集T细胞、经富集CD4+T 细胞和/或经富集CD8+T细胞的组合物(在下文也分别称为经富集T细胞的组合物、经富集CD4+T细胞的组合物和经富集CD8+T细胞的组合物)。在某些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂(如本文所述的任一种，例如化合物 63)存在下在刺激条件下孵育经富集T细胞、经富集CD4+T细胞或经富集 CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂(如本文所述的任一种，例如化合物63)存在下基因工程化，例如转导或转染经富集T细胞、经富集CD4+T细胞或经富集CD8+T细胞的组合物以表达重组受体。
在一些实施方案中，所提供的方法与经富集T细胞的单一组合物的分离、分开、选择、激活或刺激、转导、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制结合使用。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是包含经富集CD4+T细胞的细胞组合物。在某些实施方案中，所述经富集CD4+T细胞的组合物含有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％ CD4+T细胞。在特定实施方案中，所述经富集CD4+T细胞的组合物含有至100％CD4+T细胞或含有约100％CD4+T细胞。在某些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物包含或含有少于20％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞群基本上由CD4+T细胞组成。
在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物是经富集CD8+T细胞的组合物。在某些实施方案中，所述经富集CD8+T细胞的组合物含有至少75％、 80％、85％、90％、95％、98％、99％或99.9％CD8+T细胞，或者含有或含有约100％CD8+T细胞。在某些实施方案中，所述经富集CD8+T细胞的组合物包含或含有少于20％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T细胞，并且/或不含有CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T 细胞。在一些实施方案中，细胞群基本上由CD8+T细胞组成。
在一些实施方案中，所提供的方法与产生经富集T细胞的两种或更多种单独的输出组合物结合使用。在一些实施方案中，对经富集T细胞的两种或更多种单独组合物分别进行所提供的方法。在某些实施方案中，所述方法可以与以下结合使用：分别激活和/或刺激经富集T细胞的两种或更多种组合物；分别工程化经富集T细胞的两种或更多种组合物；和/或分别培育经富集 T细胞的两种或更多种组合物。在某些实施方案中，所述方法还可以与以下结合使用：从生物样品中分离或选择不同细胞以产生经富集T细胞的单独的输入组合物，如经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的单独组合物。在特定实施方案中，所提供的方法可以与以下结合使用：在已经将T细胞孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染和/或培育之后，分别收获、收集和/或配制经富集T细胞的单独组合物。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的两种或更多种单独组合物包括经富集CD4+T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述两种或更多种单独组合物包括CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述两种或更多种单独组合物包括经富集CD4+T细胞的组合物和经富集CD8+T细胞的组合物。
在特定实施方案中，可以在用于产生表达重组受体的经富集T细胞的输出组合物的过程的任何阶段或步骤之前、期间或之后，将所述经富集T细胞的组合物收集、配制用于冷冻保护、低温冷冻和/或储存在0℃以下、-20℃以下、或-70℃或-80℃或-70℃或-80℃以下。在一些实施方案中，可以将细胞储存少于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天的时间量，或少于1、2、3、4、5、 6、7、8周的时间量，或至少1、2、3、4、5、6、7或8周的时间量，或超过8 周。储存后，可以将经富集T细胞的组合物解冻，并且可以从所述过程中的同一点恢复处理。在一些实施方案中，在进一步处理之前，例如在刺激条件下孵育之前，将经富集T细胞的输入组合物低温冷冻并且储存。在特定实施方案中，在例如作为自体细胞疗法给予至受试者之前，将经富集T细胞的培育和/或配制组合物低温冷冻并且储存。
在某些实施方案中，将经富集T细胞的单独细胞组合物合并为单一组合物。例如，在一些实施方案中，将经富集CD4+T细胞的组合物与经富集CD8+ T细胞的组合物合并为经富集CD4+和CD8+T细胞的单一组合物。在某些实施方案中，所述单独组合物源自相同生物样品，如从单一受试者获得、收集和/或获取的相同生物样品，例如最初从所述生物样品分离、选择和/或富集。在一些实施方案中，在用于产生输出组合物的过程，例如与所提供的方法结合的过程的一个或多个步骤或阶段中，将所述单独组合物分别处理。在一些实施方案中，可以在用于产生输出组合物的过程的任何步骤或阶段之前、期间或之后，将所述单独组合物合并为单一组合物。因此，在一些实施方案中，将来自相同生物样品的经富集T细胞的单独的输入、刺激、工程化、培育、配制和/或收获的组合物合并为单一组合物，并且在某些实施方案中，作为单一组合物进一步处理。在某些实施方案中，在将细胞给予至受试者之前，将经富集细胞的单独的输出组合物合并为单个输出组合物。
在某些实施方案中，在所述过程中的任何阶段或步骤，可以对细胞的一部分进行采样或收集，例如，可以在所述组合物保持在封闭系统中的同时，如在分离、孵育、工程化、培育和/或配制期间，从经富集T细胞的组合物获取细胞。在某些实施方案中，可以分析此类细胞的标记、特征或特性，包括但不限于活力、细胞凋亡、激活、刺激、生长和/或消耗。在一些实施方案中，在经富集T细胞的组合物保持在封闭系统中的同时，通过自动化过程对细胞进行采样或收集。在一些实施方案中，对采样或收集的细胞的分析是自动化的。在特定实施方案中，所述分析是在无菌条件下在封闭系统中进行。
还提供了通过所述方法制备的细胞和组合物(包括药物组合物和配制品)，以及用于进行所述方法的试剂盒、系统和装置。还提供了使用通过所述方法制备的细胞和组合物的方法(包括治疗方法，如用于过继细胞疗法的方法)，以及用于给予受试者的药物组合物。
A.样品和细胞制剂
在特定实施方案中，所提供的方法与以下结合使用：从生物样品中分离、选择和/或富集细胞，以产生经富集细胞例如T细胞的一种或多种输入组合物。在一些实施方案中，所提供的方法包括从生物样品中分离细胞或其组合物，所述生物样品如获自或源自受试者的那些，所述受试者如患有特定疾病或病症或需要细胞疗法或将被给予细胞疗法的受试者。在一些方面，所述受试者是人，如作为需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，分离、处理和/ 或工程化细胞以用于所述过继细胞疗法)的患者的受试者。因此，在一些实施方案中，所述细胞是原代细胞，例如原代人细胞。所述样品包括组织、流体和直接取自受试者的其他样品。所述生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经处理的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括源自它们的处理样品。
在一些方面，所述样品是血液或源自血液的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾脏、胰腺、乳房、骨、前列腺、宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或源自它们的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的情况下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，所述样品含有淋巴细胞(包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于后续处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通式”离心机(例如，Cobe 2991细胞加工器，Baxter) 完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将所述细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、选择和/或富集和/或用于转导和工程化的孵育之前或之后，和/或在培育和/或收获所述工程化细胞之后，冷冻(例如低温保存)所述细胞的步骤。在一些实施方案中，冷冻和后续解冻步骤去除所述细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如，在洗涤步骤去除血浆和血小板之后，使所述细胞悬浮于冷冻溶液中。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。在一些实施方案中，将所述细胞冷冻，例如低温冷冻或低温保存在介质和/或溶液中，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约12.5％、12.0％、 11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、 6.5％、6.0％、5.5％或5.0％的DMSO，或在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间、或在6％与8％之间的DMSO。在特定实施方案中，将所述细胞冷冻，例如低温冷冻或低温保存在介质和/或溶液中，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、 1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％或0.25％的HSA，或在0.1％与-5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间、或在1％与2％之间的HSA。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻介质。然后用介质将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以为或为约1°/分钟的速率冷冻-80℃或约 -80℃，并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，所述细胞或群体的分离包括一个或多个制备和/或不基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，在一种或多种试剂存在下洗涤、离心和/或孵育细胞，例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、大小、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，选择步骤的至少一部分包括将细胞与选择试剂一起孵育。例如作为选择方法的一部分的与一种或多种选择试剂一起孵育可以使用一种或多种选择试剂进行，以基于一种或多种特定分子(如表面标记(例如表面蛋白)、细胞内标记或核酸)在细胞中或细胞上的表达或存在，选择一种或多种不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的方法，使用一种或多种选择试剂，基于此类标记进行分离。在一些实施方案中，一种或多种选择试剂导致分离，所述分离是基于亲和力或基于免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，选择包括与一种或多种试剂一起孵育，用于基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的细胞表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过与特异性地结合至此类标记的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并分离已结合所述抗体或结合配偶体的细胞与未结合至所述抗体或结合配偶体的那些细胞。
在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的所需的基于亲和力的选择试剂混合。基于免疫亲和力的选择可以使用任何系统或方法进行，所述系统或方法使得在分离的细胞与特异性地结合至细胞上的标记的分子 (例如，固体表面(例如颗粒)上的抗体或其他结合配偶体)之间产生有利的能量相互作用。在一些实施方案中，方法是使用颗粒诸如珠，例如磁珠进行，所述颗粒包被有对细胞的标记具有特异性的选择剂(例如抗体)。可以将颗粒(例如珠)与细胞在容器(如管或袋)一起孵育或混合，同时振荡或混合，其中细胞密度与颗粒(例如，珠)的比率是恒定的，以帮助促进能量上有利的相互作用。在其他情况下，所述方法包括选择细胞，其中所述选择的全部或一部分是在离心室的内部空腔中进行，例如在离心旋转下进行。在一些实施方案中，将细胞与选择试剂(例如基于免疫亲和力的选择试剂)一起孵育是在离心室中进行。在某些实施方案中，所述分离或分开是使用国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统、装置或设备进行。在一个例子中，所述系统是如国际公开号WO2016/073602中所述的系统。
在一些实施方案中，通过在离心室的空腔中进行此类选择步骤或其部分 (例如，与抗体包被的颗粒(例如磁珠)一起孵育)，用户能够控制某些参数，如各种溶液的体积、在处理期间溶液的添加及其时间安排，与其他可用方法相比，这可以提供多种优势。例如，在孵育期间减少空腔中液体体积的能力可以增加选择中使用的颗粒(例如珠试剂)的浓度，并由此增加溶液的化学势，而不影响空腔中的细胞总数。这又可以增强正在处理的细胞与用于选择的颗粒之间的成对相互作用。在一些实施方案中，例如，在与如本文所述的系统、电路和控制相关联时，在室中进行孵育步骤允许用户在孵育期间的一个或多个所需时间实现对溶液的搅动，这也可以改善相互作用。
在一些实施方案中，至少一部分选择步骤是在离心室中进行，所述部分包括将细胞与选择试剂一起孵育。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量所需的基于亲和力的选择试剂混合，所述量显著少于根据制造商的说明书针对相同数量的细胞和/或相同体积的细胞的选择在管或容器中进行类似选择时通常所用的量。在一些实施方案中，所采用的一种或多种选择试剂的量为根据制造商的说明针对相同数量的细胞和/或相同体积的细胞在基于管或容器的孵育中用于选择细胞的相同的一种或多种选择试剂的量的不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过50％、不超过60％、不超过70％或不超过80％。
在一些实施方案中，对于细胞的选择，例如基于免疫亲和力的选择，将细胞在室空腔中在组合物中孵育，所述组合物还含有具有选择试剂的选择缓冲液，所述选择试剂例如特异性地结合至希望富集和/或耗尽的细胞上(而不是组合物中其他细胞上)的表面标记的分子，例如抗体，所述分子任选地偶联到支架(例如聚合物或表面，例如珠，例如磁珠，例如与对CD4和CD8具有特异性的单克隆抗体偶联的磁珠)。在一些实施方案中，如所描述的，将选择试剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与在振荡或旋转的管中进行选择时，对相同数量的细胞或相同体积的细胞实现大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的选择试剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、 10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和选择试剂添加选择缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如10mL至 200mL，诸如至少或约至少10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL试剂的孵育的目标体积。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂在添加至细胞之前预先混合。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂单独添加至细胞。在一些实施方案中，选择孵育是在周期性温和混合条件下进行的，这可有助于促进能量上有利的相互作用，从而允许在实现高选择效率的同时使用较少的总选择试剂。
在一些实施方案中，与选择试剂一起孵育的总持续时间为或为约5分钟至6小时，例如30分钟至3小时，例如至少或约至少30分钟、60分钟、120分钟或180分钟。
在一些实施方案中，孵育通常在混合条件下进行，例如在旋转存在下，通常以相对低的力或速度旋转，例如速度低于用于使细胞沉淀的速度，例如为或为约600rpm至1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或 1500rpm或1700rpm)，例如在室或其他容器的样品或壁处的一定RCF下，所述RCF为或为约80g至100g(例如，为或为约或至少80g、85g、90g、95g 或100g)。在一些实施方案中，旋转是使用以这种低速旋转和之后的停歇时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或停歇1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10秒，例如旋转大约1或2秒，然后停歇大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，这个过程是在集成有所述室的完全封闭的系统内进行的。在一些实施方案中，这个过程(并且在一些方面还有一个或多个另外的步骤，例如洗涤含有细胞的样品，例如单采术样品的预先洗涤步骤)以自动化方式进行，使得将细胞、试剂和其他组分在适当时间吸入和推出所述室并进行离心，以便使用自动化程序在单一封闭系统中完成洗涤和结合步骤。
在一些实施方案中，在孵育和/或混合细胞和一种和/或多种选择试剂后，将所孵育的细胞进行分离，以基于一种或多种特定试剂的存在或不存在来选择细胞。在一些实施方案中，在同一封闭系统中进行分离，其中将细胞与选择试剂一起进行孵育。在一些实施方案中，在与选择试剂一起孵育后，将所孵育的细胞(包括其中已经结合选择试剂的细胞)转移到用于基于免疫亲和力来分离细胞的系统中。在一些实施方案中，用于基于免疫亲和力的分离的系统是或含有磁分离柱。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已结合所述试剂(例如抗体或结合配偶体)的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留尚未结合至试剂(例如，抗体或结合配偶体)的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在无法获得专门鉴定异质性群体中的细胞类型的抗体，使得最好基于除所需群体之外的细胞表达的标记来进行分离的情况下，阴性选择可以特别有用。
在一些实施方案中，所述处理步骤进一步包括对所孵育的细胞进行阴性和/或阳性选择，如使用可以进行基于亲和力的选择的系统或设备。在一些实施方案中，通过经由阳性选择富集特定细胞群，或经由阴性选择耗尽特定细胞群来进行分离。在一些实施方案中，阳性或阴性选择是通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记+)或以相对较高水平表达 (标记高)的一种或多种表面标记特异性地结合。
分离不需要导致特定细胞群体或表达特定标记的细胞的100％富集或去除。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样，特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致所有此类细胞的完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经历另一分离步骤，如后续阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记具有特异性)一起孵育。同样，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择多种细胞类型。
例如，在一些方面，T细胞的特定亚群，如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、 CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞)通过阳性或阴性选择技术来分离。在一些实施方案中，通过与特异性地结合至此类标记的一种或多种抗体或结合配偶体一起孵育来选择此类细胞。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体可以如直接或间接缀合至用于实现选择的固体支持物或基质，如磁珠或顺磁珠。例如，CD3+、CD28+T细胞可以使用CD3/CD28缀合的磁珠(例如，
Figure BDA0002556467450000341
M-450CD3/CD28T细胞扩增器和/或
Figure BDA0002556467450000342
珠)进行阳性选择。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标记(如CD14)，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助T细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记进行阳性或阴性选择，可以将此类CD4+和CD8+群体进一步分类成亚群。
在一些实施方案中，如通过基于与相应亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8+细胞针对幼稚、中枢记忆、效应子记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善给予后的长期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人,(2012)Blood.1:72–82； Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含 TCM的CD8+T细胞与CD4+T细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和 CD62L-两个子集中。可以例如使用抗CD8和抗CD62L抗体将PBMC针对 CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽。
在一些实施方案中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、C D62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于对表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过表达CD4、CD14、CD45RA的细胞的耗尽和表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行富含TCM细胞的CD8+群体的分离。在一个方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达所选择阴性细胞级分开始进行，对所述阴性细胞级分进行基于CD14和CD45RA的表达的阴性选择以及基于CD62L的阳性选择。在一些方面，此类选择是同时进行的，并且在其他方面，是以任何顺序依次进行的。在一些方面，用于制备CD8+T细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+T细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。在一些实施方案中，对CD4+T细胞群的选择和对CD8+T细胞群的选择同时进行。在一些实施方案中，CD4+T细胞群和对CD8+T细胞群的选择以任一顺序依次进行。在一些实施方案中，用于选择细胞的方法可以包括公开的美国申请号US201 70037369中所述的那些。在一些实施方案中，可以在选择之后将经选择CD4 +T细胞群和经选择CD8+T细胞群合并。在一些方面，可以将经选择CD4+ T细胞群和经选择CD8+T细胞群合并在如本文所述的生物反应器袋中。
在特定实施方案中，使生物样品，例如PBMC或其他白细胞样品经历 CD4+T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。在某些实施方案中，CD8+ T细胞选自阴性级分。在一些实施方案中，使生物样品经历CD8+T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。在某些实施方案中，CD4+T细胞选自阴性级分。
在特定例子中，PBMC样品或其他白细胞样品进行CD4+T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。然后使阴性级分经历基于CD14和CD45RA或 CD19的表达的阴性选择，以及基于中枢记忆T细胞特有的标记(如CD62L或 CCR7)的阳性选择，其中阳性和阴性选择是以任一顺序来进行。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，可以将CD4+T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+或CD4+T 细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+T细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+T细胞是CD62L-和CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+T细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)结合，以允许细胞分离以用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离细胞和细胞群(综述于Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis ResearchProtocols, 第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑
Figure BDA0002556467450000361
Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦(Totowa,NJ))。
在一些方面，将待分离的细胞的孵育样品或组合物与含有选择试剂的小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如像Dynalbeads 或
Figure BDA0002556467450000362
珠))一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附接至结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体特异性地结合至需要分离 (例如，需要进行阴性或阳性选择)的一种细胞、多种细胞或细胞群上存在的分子(例如，表面标记)。
在一些实施方案中，磁粒或磁珠包含结合至特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)的磁响应材料。许多熟知的用于磁分离方法中的磁响应材料是已知的，例如Molday,美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342 B中所述的那些，所述专利通过引用特此并入。也可以使用胶体尺寸的颗粒，如Owen美国专利号4,795,698；和Liberti等人的美国专利号5,200,084中所述的那些。
孵育通常在这样的条件下进行，由此抗体或结合配偶体或者与附接至磁粒或磁珠的此类抗体或结合配偶体特异性地结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果存在于样品内的细胞上的话)特异性地结合。
在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合配偶体、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，磁粒通过对一种或多种标记具有特异性的一抗的包被而附接至细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记所述细胞而不是珠，并且然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性颗粒。在某些实施方案中，链霉亲和素包被的磁粒是与生物素化的一抗或二抗结合使用的。
在一些方面，分离以如下程序实现，其中将样品置于磁场中，并且附接有磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引至磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁体吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性与阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或使其经历进一步的分离步骤。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活的细胞分选 (MACS)(Miltenyi Biotech，加利福尼亚州奥本)进行的。磁激活细胞分选 (MACS)，例如CliniMACS系统能够高纯度选择附接有磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后依次洗脱非靶种类和靶种类。也就是说，附接至磁化颗粒的细胞被保持在适当的位置，而未附接的种类被洗脱。然后，在完成这个第一洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，标记非靶细胞并将其从异质性细胞群耗尽。
在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附接至细胞，所述细胞随后被孵育、培养和/或工程化；在一些方面，所述颗粒保持附接至用于给予患者的细胞。在一些实施方案中，从细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。用于从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体、可磁化颗粒或与可切割接头缀合的抗体等。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
在一些实施方案中，所述分离和/或选择产生经富集T细胞，例如CD3+T 细胞、CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的一种或多种输入组合物。在一些实施方案中，从单一生物样品中分离、选择、富集或获得两种或更多种单独的输入组合物。在一些实施方案中，从单独的生物样品中分离、选择、富集和/ 或获得单独的输入组合物，所述单独的生物样品从同一受试者收集、获取和 /或获得。
在某些实施方案中，所述一种或多种输入组合物是或包括经富集T细胞的组合物，所述组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD3+T细胞。在特定实施方案中，所述经富集 T细胞的输入组合物基本上由CD3+T细胞组成。
在某些实施方案中，所述一种或多种输入组合物是或包括经富集CD4+T 细胞的组合物，所述组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+T细胞。在某些实施方案中，所述CD4+T 细胞的输入组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T 细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物基本上由CD4+T细胞组成。
在某些实施方案中，所述一种或多种组合物是或包括CD8+T细胞的组合物，所述组合物是或包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少 80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+T细胞。在某些实施方案中，所述CD8+T 细胞的组合物含有少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含有CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物基本上由CD8+T细胞组成。
在一些实施方案中，在分离、选择和/或富集之后将所述经富集T细胞的一种或多种输入组合物冷冻，例如低温保存和/或低温冷冻。在一些实施方案中，在孵育、激活、刺激、工程化、转导、转染、培育、扩增、收获和/或配制所述细胞的组合物的任何步骤之前冷冻，例如低温保存和/或低温冷冻所述一种或多种输入组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种低温冷冻的输入组合物例如储存在-80℃或约-80℃下。
B.细胞的激活和刺激
在一些实施方案中，所提供的方法与在刺激条件下孵育细胞结合使用。在一些实施方案中，所述刺激条件包括激活或刺激，和/或能够激活或刺激细胞(例如，CD4+T细胞)中的信号，如从TCR和/或共受体生成的信号的条件。在一些实施方案中，所述刺激条件包括用刺激试剂(例如，激活或刺激，和/或能够激活或刺激细胞中的信号的试剂)和/或在所述刺激试剂存在下培养、培育、孵育、激活、繁殖细胞中的一个或多个步骤。在一些实施方案中，所述刺激试剂刺激和/或激活TCR和/或共受体。在特定实施方案中，所述刺激性试剂是在章节I-B-1中所述的试剂。
在某些实施方案中，在基因工程化细胞，例如通过章节I-C中提供的技术转染和/或转导细胞之前，在刺激条件下孵育经富集T细胞的一种或多种组合物。在特定实施方案中，在已从生物样品中分离、选择、富集或获得经富集T细胞的一种或多种组合物之后，在刺激条件下孵育所述一种或多种组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种组合物是输入组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种输入组合物先前已进行低温冷冻和储存，并在孵育之前解冻。
在某些实施方案中，所述经富集T细胞的一种或多种组合物是或包括经富集T细胞的两种单独组合物，例如单独的输入组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的两种单独组合物，例如，从相同生物样品中选择、分离和/ 或富集的经富集T细胞的两种单独组合物分别在刺激条件下孵育。在某些实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD4+T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的两种单独组合物分别在刺激条件下孵育。在一些实施方案中，将经富集T细胞的单一组合物在刺激条件下孵育。在某些实施方案中，所述单一组合物是经富集CD4+T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述单一组合物是在孵育之前已从单独组合物合并的经富集的CD4+和CD8+T细胞的组合物。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD4+T细胞的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的 CD4+T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD4+T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD8+T细胞的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的 CD8+T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD8+T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含有CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。
在一些实施方案中，将经富集CD4+和CD8+T细胞的单独组合物合并为单一组合物并且在刺激条件下孵育。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成孵育之后将经富集CD4+和经富集CD8+T细胞的单独经刺激组合物合并为单一组合物。
在某些实施方案中，在基因工程化细胞，例如通过章节I-C中提供的技术转染和/或转导细胞之前，在刺激条件下孵育经富集T细胞的一种或多种组合物。在特定实施方案中，在已从生物样品中分离、选择、富集或获得经富集T细胞的一种或多种组合物之后，在刺激条件下孵育所述一种或多种组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种组合物是输入组合物。在一些实施方案中，所述一种或多种输入组合物先前已进行低温冷冻和储存，并在孵育之前解冻。
在一些实施方案中，所述在刺激条件下的孵育可以包括培养、培育、刺激、激活、繁殖，包括通过在刺激条件存在下进行孵育，所述刺激条件例如设计用于以下的条件：诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活以模拟抗原暴露，和/或引发细胞用于基因工程化，如用于引入重组抗原受体。在特定实施方案中，所述刺激条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他经设计以激活细胞的药剂))。
在一些方面，在刺激条件下的刺激和/或孵育是根据多种技术来进行，所述多种技术如以下文献中所述的那些技术：Riddell等人的美国专利号6,040,1 77；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660；Terakura等人(2012) Blood.1:72-82；和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，通过以下方法扩增细胞(例如T细胞)、细胞组合物和/或细胞群(如CD4+和CD8+T细胞或其组合物、群体或亚群)：向培养起始组合物中添加饲养细胞(如非分裂外周血单核细胞(PBMC))(例如，使得所得细胞群对于待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞含有至少约5、10、20 或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增所述T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ辐照的PBMC 饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线辐照 PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群之前将饲养细胞添加至培养基中。
在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常为或为约37摄氏度。在一些实施方案中，在培养期间实现温度转变，如从37摄氏度至35摄氏度。任选地，孵育可以进一步包括添加非分裂的EBV转化的类淋巴母细胞(LCL) 作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线辐照LCL。在一些方面，LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。
在实施方案中，可以通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞来获得抗原特异性的CD4+和CD8+的群体。例如，可以通过从被感染的受试者分离T细胞并在体外用相同抗原刺激所述细胞，产生针对巨细胞病毒抗原的抗原特异性T细胞系或克隆。也可以使用幼稚T细胞。
在特定实施方案中，所述刺激条件包括用刺激试剂孵育、培养和/或培育细胞。在特定实施方案中，所述刺激性试剂是在章节I-B-1中所述的试剂。在某些实施方案中，所述刺激试剂含有或包括珠。在某些实施方案中，当将细胞与刺激试剂接触和/或与刺激试剂一起孵育时，在刺激条件下开始和/或起始孵育、培养和/或培育细胞。在特定实施方案中，在基因工程化细胞(例如，如通过转染或转导将重组多核苷酸引入细胞中)之前、期间和/或之后，孵育细胞。
在一些实施方案中，以为或为约3:1、2.5:1、2:1、1.5:1、1.25:1、 1.2:1、1.1:1、1:1、0.9:1、0.8:1、0.75:1、0.67:1、0.5:1、0.3:1或0.2: 1的刺激试剂和/或珠与细胞的比率孵育所述经富集T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述刺激试剂和/或珠与细胞的比率在2.5:1与0.2:1之间、在2: 1与0.5:1之间、在1.5:1与0.75:1之间、在1.25:1与0.8:1之间、在1.1:1与 0.9:1之间。在特定实施方案中，所述刺激试剂与细胞的比率为约1:1或为1: 1。
在特定实施方案中，在刺激条件下孵育之前和/或期间，所述细胞未与抑制mTOR活性的药剂(例如，章节II中所述的药剂)一起孵育、接触和/或暴露。
在某些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂(例如，章节II中所述的药剂)存在下进行所述孵育的至少一部分。在一些实施方案中，在抑制mTOR 活性的药剂存在下进行所有和/或整个孵育。
在特定实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂存在下将所述细胞与所述刺激试剂一起孵育。在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是章节II中所述的药剂。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂还抑制另外的激酶的活性。在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂还抑制磷酸肌醇-3激酶(PI3K)活性。在某些实施方案中，所述药剂在足以抑制mTOR 活性的浓度下选择性抑制mTOR活性，例如不可检测地抑制PI3K活性，和/ 或不以与mTOR活性相同的程度抑制PI3K活性。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂抑制激酶活性。在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂抑制mTORC1和/或mTORC2活性。在一些实施方案中，所述抑制 mTOR活性的药剂抑制mTORC1和mTORC2活性。
在一些实施方案中，所述药剂包括但不限于PI-103、SF1126、BGT226、 XL765、PF-04691502、NVP-BEZ235、吡唑并嘧啶、Torin l、Torkinib(PP242)、 PP30、Ku-0063794、WAY-600(Wyeth)、WAY-687(Wyeth)、WAY-354(Wyeth)、 AZD8055、雷帕霉素(西罗莫司)、替西罗莫司(CC1779)、依维莫司 (RAD001)、地弗莫司(AP23573)、AZD8055(AstraZeneca)和OSI-027(OSI)。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂具有或包括章节II中提供的式，例如式(I)、式(II)或式(III)。在一些实施方案中，所述药剂是化合物 155、化合物246或化合物63。
在某些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂存在下孵育所述细胞，所述药剂的浓度抑制、减少和/或降低mTOR活性。在一些实施方案中，浓度将 mTOR的一种或多种活性抑制、减少和/或降低约或至少25％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.9％。在一些实施方案中，所述药剂的浓度不阻止原代T细胞增殖和/或扩增。在一些实施方案中，在1nM与1μM之间、在1nM与100nM之间、在50nM与200nM 之间、在100nM与250nM之间、在200nM与500nM之间、在500nM与1μM 之间、在1μM与10μM之间或在5μM与50μM之间的所述抑制mTOR活性的药剂存在下孵育所述细胞。在某些实施方案中，在为、为约或为至少0.1nM、 0.5nM、1nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、150nM、200nM、 250nM、500nM、1μM、5μM、10μM、25μM、50μM或100μM的所述抑制mTOR活性的药剂存在下孵育所述细胞。
在一些实施方案中，在化合物155存在下孵育所述细胞。在某些实施方案中，在1nM与1μM之间、在1nM与100μM之间、在50nM与200nM之间、在100nM与250nM之间或在200nM与500nM之间的化合物155存在下孵育所述细胞。在特定实施方案中，在为、为约或为至少10nM、25nM、50nM、 100nM、150nM、200nM、250nM或500nM的化合物155存在下孵育所述细胞。
在某些实施方案中，在化合物246存在下孵育所述细胞。在某些实施方案中，在1nM与1μM之间、在1nM与100μM之间、在50nM与200nM之间、在100nM与250nM之间或在200nM与500nM之间的化合物155存在下孵育所述细胞。在某些实施方案中，在为、为约或为至少10nM、25nM、50nM、 100nM、150nM、200nM、250nM或500nM的化合物246存在下孵育所述细胞。
在特定实施方案中，在化合物63存在下孵育所述细胞。在某些实施方案中，在1nM与1μM之间、在1nM与100μM之间、在50nM与200nM之间、在100nM与250nM之间或在200nM与500nM之间的化合物63存在下孵育所述细胞。在一些实施方案中，在为、为约或为至少10nM、25nM、50nM、 100nM、150nM、200nM、250nM或500nM的化合物63存在下孵育所述细胞。
在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂存在下孵育组合物或细胞。此类条件包括设计用于以下的那些条件：诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活，模拟抗原暴露，和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)。示例性刺激试剂如下所述。
在一些实施方案中，用于刺激和/或激活的条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他经设计以激活细胞的药剂))。
在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，例如以下文献中所述的那些技术：Riddell等人的美国专利号6,040,1 77；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651–660；Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和/或Wang 等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，在一种或多种刺激条件或刺激剂存在下进行的孵育的至少一部分是在离心室的内部空腔中进行，例如在离心旋转下进行，如国际公开号WO2016/073602中所述的。在一些实施方案中，在离心室中进行的孵育的至少一部分包括与一种或多种试剂混合以诱导刺激和/或激活。在一些实施方案中，将细胞(如经选择细胞)与刺激条件或刺激剂在离心室中混合。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的一种或多种刺激条件或刺激剂混合，所述量远小于在细胞培养板或其他系统中进行类似刺激时通常使用的量。
在一些实施方案中，将刺激剂添加至室空腔中的细胞，所添加的量与例如在周期性振荡或旋转的管或袋中进行选择而不在离心室中混合时，对相同数量的细胞或相同体积的细胞实现大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的刺激剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、 30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和刺激剂中添加孵育缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如10mL至200mL(如至少或约至少或为约或为10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、 70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL)试剂的孵育的目标体积。在一些实施方案中，在添加至细胞之前预先混合孵育缓冲液和刺激剂。在一些实施方案中，将孵育缓冲液和刺激剂单独添加至细胞中。在一些实施方案中，在周期性温和混合条件下进行刺激孵育，这可能有助于促进能量上有利的相互作用，并且从而允许在实现细胞的刺激和激活的同时使用较少的总体刺激剂。
在一些实施方案中，孵育通常在混合条件下进行，例如在旋转存在下，通常以相对低的力或速度旋转，例如速度低于用于使细胞沉淀的速度，例如为或为约600rpm至1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm或 1500rpm或1700rpm)，例如在室或其他容器的样品或壁处的一定RCF下，所述RCF为或为约80g至100g(例如，为或为约或至少80g、85g、90g、95g 或100g)。在一些实施方案中，旋转是使用以这种低速旋转和之后的停歇时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或停歇1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10秒，例如旋转大约1或2秒，然后停歇大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，例如与刺激剂一起孵育的总持续时间在或在约1小时与96小时之间、1小时与72小时之间、1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间，例如至少或约至少6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些实施方案中，进一步孵育进行在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30 小时之间或12小时与24小时之间并包括端值的时间。
在特定实施方案中，所述刺激条件包括用一种或多种细胞因子和/或在一种或多种细胞因子存在下孵育、培养和/或培育经富集T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括4-α-螺旋束细胞因子家族的成员。在一些实施方案中，4-α-螺旋束细胞因子家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在一些实施方案中，例如在转导之前，所述刺激导致所述细胞的激活和 /或增殖。
1.刺激试剂
在一些实施方案中，在刺激条件下孵育细胞(例如输入细胞)的组合物是或包括将经富集细胞的组合物与能够激活和/或扩增T细胞的刺激试剂一起孵育和/或与其接触。在一些实施方案中，刺激试剂能够刺激和/或激活所述细胞中的一个或多个信号。在一些实施方案中，所述一个或多个信号由受体介导。在特定实施方案中，所述一个或多个信号是信号转导和/或第二信使 (例如，cAMP和/或细胞内钙)的水平或量的变化，一种或多种细胞蛋白的量、细胞定位、构象、磷酸化、泛素化和/或截短的变化，和/或细胞活性(例如转录、翻译、蛋白降解、细胞形态、激活状态和/或细胞分裂)的变化或与所述变化相关。在特定实施方案中，刺激试剂激活和/或能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。
在某些实施方案中，刺激试剂含有与能够激活和/或扩增细胞(例如T细胞)的一种或多种药剂(例如生物分子)缀合或连接的颗粒(例如珠)。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂与珠结合。在一些实施方案中，珠是生物相容的，即由适合于生物学用途的材料构成。在一些实施方案中，珠对所培养的细胞(例如，所培养的T细胞)是无毒的。在一些实施方案中，珠可以是能够以允许药剂与细胞之间相互作用的方式附接药剂的任何颗粒。
在一些实施方案中，刺激试剂含有能够激活和/或扩增细胞(例如T细胞) 的一种或多种药剂，所述一种或多种药剂结合至或以其他方式附接至珠，例如结合至或附接至珠的表面。在某些实施方案中，珠是非细胞颗粒。在特定实施方案中，珠可以包括胶体颗粒、微球体、纳米颗粒、磁珠等。在一些实施方案中，珠是琼脂糖珠。在某些实施方案中，珠是琼脂糖凝胶珠。
在特定实施方案中，刺激试剂含有单分散的珠。在某些实施方案中，单分散的珠包含彼此的直径标准差小于5％的尺寸分散体。
在一些实施方案中，珠含有一种或多种药剂，如与珠的表面偶联、缀合或连接(直接或间接)的药剂。在一些实施方案中，如本文设想的药剂可以包括但不限于RNA、DNA、蛋白质(例如，酶)、抗原、多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段、碳水化合物、脂质、凝集素或对所希望的靶标具有亲和力的任何其他生物分子。在一些实施方案中，所希望的靶标是T细胞受体和/ 或T细胞受体的组分。在某些实施方案中，所希望的靶标是CD3。在某些实施方案中，所希望的靶标是T细胞共刺激分子，例如CD28、CD137(4-1-BB)、 OX40或ICOS。所述一种或多种药剂可以通过在本领域中已知和可用的各种方法直接或间接附接至珠上。所述附接可以是共价的、非共价的、静电的或疏水的，并且可以通过各种附接手段(包括例如化学手段、机械手段或酶促手段)来实现。在一些实施方案中，生物分子(例如，生物素化的抗CD3抗体)可以经由直接附接至珠的另一种生物分子(例如，抗生物素抗体)间接附接至珠上。
在一些实施方案中，刺激试剂含有珠和一种或多种直接与细胞表面上的大分子相互作用的药剂。在某些实施方案中，珠(例如顺磁珠)经由对细胞上的一种或多种大分子(例如一种或多种细胞表面蛋白)具有特异性的一种或多种药剂(例如抗体)与所述细胞相互作用。在某些实施方案中，将珠(例如顺磁珠)用本文所述的第一药剂(如一抗(例如抗生物素抗体)或其他生物分子)标记，并且然后添加第二药剂(如二抗(例如生物素化的抗CD3抗体)或其他第二生物分子(例如链霉亲和素))，由此所述二抗或其他第二生物分子与颗粒上的此类一抗或其他生物分子特异性地结合。
在一些实施方案中，刺激试剂含有一种或多种药剂(例如抗体)，所述一种或多种药剂附接至珠(例如顺磁珠)并且与细胞(例如T细胞)上的以下大分子中的一种或多种特异性地结合：CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、 CD25、CD27、CD28、CD29、CD31、CD44、CD45RA、CD45RO、CD54 (ICAM-1)、CD127、MHCI、MHCII、CTLA-4、ICOS、PD-1、OX40、CD27L (CD70)、4-1BB(CD137)、4-1BBL、CD30L、LIGHT、IL-2R、IL-12R、 IL-1R、IL-15R；IFN-γR、TNF-αR、IL-4R、IL-10R、CD18/CDl la(LFA-1)、 CD62L(L-选择素)、CD29/CD49d(VLA-4)、Notch配体(例如，δ样1/4、锯齿状1/2等)、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR7和CXCR3或其片段，包括这些大分子的相应配体或其片段。在一些实施方案中，附接至珠的药剂(例如抗体)与细胞(例如T细胞)上的以下大分子中的一种或多种特异性地结合：CD28、CD62L、CCR7、CD27、CD127、CD3、CD4、CD8、 CD45RA和/或CD45RO。
在一些实施方案中，附接至珠的一种或多种药剂是抗体。所述抗体可以包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双抗体和单链分子)、以及抗体片段(例如，Fab、F(ab')2和Fv)。在一些实施方案中，刺激试剂是抗体片段(包括抗原结合片段)，例如Fab、Fab'-SH、Fv、 scFv或(Fab')2片段。应当理解，任何同种型的恒定区都可以用于本文设想的抗体，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，并且此类恒定区可以从任何人或动物物种(例如，鼠类物种)获得。在一些实施方案中，所述药剂是结合和/或识别T细胞受体的一种或多种组分的抗体。在特定实施方案中，所述药剂是抗CD3抗体。在某些实施方案中，所述药剂是结合和/或识别共受体的抗体。在一些实施方案中，刺激试剂包含抗CD28抗体。在一些实施方案中，珠的直径大于约0.001μm、大于约0.01μm、大于约0.1μm、大于约1.0μm、大于约10μm、大于约50μm、大于约100μm或大于约1000μm且不超过约 1500μm。在一些实施方案中，珠的直径为约1.0μm至约500μm、约1.0μm至约150μm、约1.0μm至约30μm、约1.0μm至约10μm、约1.0μm至约5.0μm、约2.0μm至约5.0μm、或约3.0μm至约5.0μm。在一些实施方案中，珠的直径为约3μm至约5μm。在一些实施方案中，珠的直径为至少或至少约或约 0.001μm、0.01μm、0.1μm、0.5μm、1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、 3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、 7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm、9.5μm、10μm、12μm、14μm、16μm、18μm或20μm。在某些实施方案中，珠的直径为或为约4.5μm。在某些实施方案中，珠的直径为或为约2.8μm。
在一些实施方案中，所述珠的密度大于0.001g/cm3、大于0.01g/cm3、大于0.05g/cm3、大于0.1g/cm3、大于0.5g/cm3、大于0.6g/cm3、大于0.7g/cm3、大于0.8g/cm3、大于0.9g/cm3、大于1g/cm3、大于1.1g/cm3、大于1.2g/cm3、大于1.3g/cm3、大于1.4g/cm3、大于1.5g/cm3、大于2g/cm3、大于3g/cm3、大于4g/cm3或大于5g/cm3。在一些实施方案中，所述珠的密度在约0.001g/cm3与约100g/cm3、约0.01g/cm3与约50g/cm3、约0.1g/cm3与约10g/cm3、约0.1g/cm3与约.5g/cm3、约0.5g/cm3与约1g/cm3、约0.5g/cm3与约1.5g/cm3、约1 g/cm3与约1.5g/cm3、约1g/cm3与约2g/cm3或约1g/cm3与约5g/cm3之间。在一些实施方案中，所述珠的密度为约0.5g/cm3、约0.6g/cm3、约0.7g/cm3、约0.8g/cm3、约0.9g/cm3、约1.0g/cm3、约1.1g/cm3、约1.2g/cm3、约1.3g/cm3、约1.4g/cm3、约1.5g/cm3、约1.6g/cm3、约1.7g/cm3、约1.8g/cm3、约1.9g/cm3或约2.0g/cm3。在某些实施方案中，珠的密度为约1.6g/cm3。在特定实施方案中，珠或颗粒的密度为约1.5g/cm3。在某些实施方案中，颗粒的密度为约 1.3g/cm3。
在某些实施方案中，多个珠具有均匀的密度。在某些实施方案中，均匀的密度包含平均珠密度的小于10％、小于5％或小于1％的密度标准差。
在一些实施方案中，珠的表面积在约0.001m2/每克颗粒(m2/g)至约1,000 m2/g、约.010m2/g至约100m2/g、约0.1m2/g至约10m2/g、约0.1m2/g至约1 m2/g、约1m2/g至约10m2/g、约10m2/g至约100m2/g、约0.5m2/g至约20m2/g、约0.5m2/g至约5m2/g或约1m2/g至约4m2/g之间。在一些实施方案中，颗粒或珠的表面积为约1m2/g至约4m2/g。
在一些实施方案中，珠在珠表面处或附近含有可以与药剂偶联、连接或缀合的至少一种材料。在一些实施方案中，珠是表面官能化的，即包含能够与结合分子(例如，多核苷酸或多肽)形成共价键的官能团。在特定实施方案中，珠包含表面暴露的羧基、氨基、羟基、甲苯磺酰基、环氧基和/或氯甲基。在特定实施方案中，珠包含表面暴露的琼脂糖和/或琼脂糖凝胶。在某些实施方案中，珠表面包含附接的刺激试剂，其可以结合或附接结合分子。在特定实施方案中，生物分子是多肽。在一些实施方案中，珠包含表面暴露的蛋白质A、蛋白质G或生物素。
在一些实施方案中，珠在磁场中起反应。在一些实施方案中，珠是磁珠。在一些实施方案中，磁珠是顺磁性的。在特定实施方案中，磁珠是超顺磁性的。在某些实施方案中，珠不显示任何磁性特性，除非它们暴露于磁场。
在特定实施方案中，珠包含磁核、顺磁核或超顺磁核。在一些实施方案中，磁核含有金属。在一些实施方案中，金属可以是但不限于铁、镍、铜、钴、钆、锰、钽、锌、锆或其任何组合。在某些实施方案中，磁核包含金属氧化物(例如，氧化铁)、铁氧体(例如，锰铁氧体、钴铁氧体、镍铁氧体等)、赤铁矿和金属合金(例如，CoTaZn)。在一些实施方案中，磁核包含铁氧体、金属、金属合金、氧化铁或二氧化铬中的一种或多种。在一些实施方案中，磁核包含元素铁或其化合物。在一些实施方案中，磁核包含磁铁矿 (Fe3O4)、磁赤铁矿(γFe2O3)或硫复铁矿(Fe3S4)中的一种或多种。在一些实施方案中，内核包含氧化铁(例如，Fe3O4)。
在某些实施方案中，珠含有被表面官能化包衣(coat或coating)覆盖的磁核、顺磁核和/或超顺磁核。在一些实施方案中，包衣可以含有这样的材料，所述材料可以包括但不限于聚合物、多糖、二氧化硅、脂肪酸、蛋白质、碳、琼脂糖、琼脂糖凝胶或其组合。在一些实施方案中，聚合物可以是聚乙二醇、聚(乳酸-共-乙醇酸)、聚戊二醛、聚氨酯、聚苯乙烯或聚乙烯醇。在某些实施方案中，外包衣(coat或coating)包含聚苯乙烯。在特定实施方案中，外包衣是表面官能化的。
在一些实施方案中，刺激试剂包含珠，其含有金属氧化物核(例如，氧化铁核)和包衣，其中所述金属氧化物核包含至少一种多糖(例如，葡聚糖)，并且其中所述包衣包含至少一种多糖(例如，氨基葡聚糖)、至少一种聚合物(例如，聚氨酯)和二氧化硅。在一些实施方案中，金属氧化物核是胶体氧化铁核。在某些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗体或其抗原结合片段。在特定实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗CD3抗体和抗CD28 抗体。在一些实施方案中，刺激试剂包含抗CD3抗体、抗CD28抗体和抗生物素抗体。在一些实施方案中，刺激试剂包含抗生物素抗体。在一些实施方案中，珠的直径为约3μm至约10μm。在一些实施方案中，珠的直径为约3μm 至约5μm。在某些实施方案中，珠的直径为约3.5μm。
在一些实施方案中，刺激试剂包含附接至珠的一种或多种药剂，所述珠包含金属氧化物核(例如，氧化铁内核)和包衣(例如，保护包衣)，其中所述包衣包含聚苯乙烯。在某些实施方案中，珠是单分散的顺磁性(例如，超顺磁性)珠，其包含顺磁性(例如，超顺磁性)铁核(例如，包含磁铁矿 (Fe3O4)和/或磁赤铁矿(γFe2O3)的核)和聚苯乙烯包衣(coat或coating)。在一些实施方案中，珠是无孔的。在一些实施方案中，珠含有所述一种或多种药剂附接的官能化表面。在某些实施方案中，所述一种或多种药剂与珠在表面上共价结合。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗CD3抗体和抗 CD28抗体。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂包括抗CD3抗体和/或抗CD28抗体，以及能够与标记的抗体(例如，生物素化的抗体)(如标记的抗CD3或抗CD28抗体)结合的抗体或其片段。在某些实施方案中，珠具有约 1.5g/cm3的密度和约1m2/g至约4m2/g的表面积。在特定实施方案中；珠是单分散的超顺磁珠，其具有约4.5μm的直径和约1.5g/cm3的密度。在一些实施方案中，珠是具有约2.8μm的平均直径和约1.3g/cm3的密度的单分散的超顺磁珠。
C.工程化细胞
在一些实施方案中，本文所提供的方法与工程化T细胞的一种或多种组合物结合使用。在某些实施方案中，工程化是或包括引入多核苷酸，例如编码重组蛋白的多核苷酸。在特定实施方案中，重组蛋白是重组受体，如章节 II中描述的任何受体。将编码重组受体(如重组受体)的核酸分子引入细胞中可以使用许多已知载体中的任何一种进行。此类载体包括病毒和非病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统，以及基于转座子的系统，如基于PiggyBac或Sleeping Beauty的基因转移系统。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔。在一些实施方案中，工程化产生经富集T细胞的一种或多种工程化组合物。
在某些实施方案中，在如通过章节I-D中提供的方法例如在促进增殖和/ 或扩增的条件下培育细胞之前，将T细胞的一种或多种组合物工程化例如转导或转染。在特定实施方案中，在所述一种或多种组合物已经在刺激条件下被刺激、激活和/或孵育之后，将经富集T细胞的一种或多种组合物工程化。在特定实施方案中，所述一种或多种组合物是经刺激组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种经刺激组合物先前已进行低温冷冻和储存，并在工程化之前解冻。
在某些实施方案中，所述经刺激T细胞的一种或多种组合物是或包括经富集T细胞的两种单独的经刺激组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的两种单独组合物，例如，已从相同生物样品中选择、分离和/或富集的经富集T细胞的两种单独组合物分别工程化。在某些实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD4+T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+ T细胞和经富集CD8+T细胞的两种单独组合物分别基因工程化。在一些实施方案中，将经富集T细胞的单一组合物基因工程化。在某些实施方案中，所述单一组合物是经富集CD4+T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述单一组合物是在工程化之前已从单独组合物合并的经富集的CD4+和CD8+T细胞的组合物。
在一些实施方案中，经工程化，例如经转导或转染的经富集CD4+T细胞的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+T细胞。在某些实施方案中，经工程化的经富集CD4+T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于 15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。
在一些实施方案中，经工程化，例如经转导或转染的经富集CD8+T细胞的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集 CD8+T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于 20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+ T细胞，和/或不含有CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。
在一些实施方案中，将经富集CD4+和CD8+T细胞的单独组合物合并为单一组合物并且进行基因工程化，例如转导或转染。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成基因工程化之后将经富集CD4+和经富集CD8+T细胞的单独工程化组合物合并为单一组合物。
在一些实施方案中，通过如下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将其与诱导应答(如增殖、存活和/或激活，例如如通过细胞因子或激活标记的表达测量的)的刺激物组合，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。在某些实施方案中，通过如下方式完成基因转移：首先将细胞在刺激条件下孵育，如通过章节I-B中所述的方法中的任一种。
在一些实施方案中，用于基因工程化的方法通过使组合物的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如，重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，所述接触可以通过离心如旋转接种(例如离心接种)来实现。所述方法包括如国际公开号WO2016/073602中所述的任何方法。示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于
Figure BDA0002556467450000521
和
Figure BDA0002556467450000522
2系统的那些，包括A-200/F和A-200离心室以及用于此类系统的各种试剂盒。示例性室、系统和处理仪器和机柜描述于例如以下文献中：美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和公开的美国专利申请公开号US 2008/0171951，以及公开的国际专利申请公开号WO 00/38762，将其各自的内容通过引用以其整体并入本文。用于此类系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioSafe SA以产品名 CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2销售的一次性试剂盒。
在一些实施方案中，在工程化之前和/或期间，所述细胞未与抑制mTOR 活性的药剂(如本文例如在章节II中所述的药剂)一起孵育、接触和/或暴露。
在特定实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂(如本文所述的药剂，例如章节II中所述的药剂)存在下进行所述工程化的至少一部分。在一些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂存在下进行所述工程化步骤的全部和/或所述工程化步骤。
在特定实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂存在下将所述细胞工程化，例如转导或转染。在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是本文如在章节II中所述的药剂，例如化合物63。在一些实施方案中，所述抑制mTOR 活性的药剂还抑制另外的激酶的活性。在某些实施方案中，所述抑制mTOR 活性的药剂还抑制磷酸肌醇-3激酶(PI3K)活性。在某些实施方案中，所述药剂在足以抑制mTOR活性的浓度下选择性抑制mTOR活性，例如不可测量地抑制PI3K活性，和/或不以与mTOR活性相同的程度抑制PI3K活性。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂抑制激酶活性。在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂抑制mTORC1和/或mTORC2活性。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂抑制mTORC1和mTORC2活性。
在一些实施方案中，所述药剂包括但不限于PI-103、SF1126、BGT226、 XL765、PF-04691502、NVP-BEZ235、吡唑并嘧啶、Torin l、Torkinib(PP242)、 PP30、Ku-0063794、WAY-600(Wyeth)、WAY-687(Wyeth)、WAY-354(Wyeth)、 AZD8055、雷帕霉素(西罗莫司)、替西罗莫司(CC1779)、依维莫司 (RAD001)、地弗莫司(AP23573)、AZD8055(AstraZeneca)和OSI-027(OSI)。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂具有或包括章节II中提供的式，例如式(I)、式(II)或式(III)。在一些实施方案中，所述药剂是化合物 155、化合物246或化合物63。在一些实施方案中，所述药剂是化合物63。
在某些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂存在下工程化所述细胞，所述药剂的浓度抑制、减少和/或降低mTOR活性。在一些实施方案中，浓度将mTOR的一种或多种活性抑制、减少和/或降低约或至少25％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.9％。在一些实施方案中，所述药剂的浓度不阻止原代T细胞增殖和/或扩增。在一些实施方案中，在1nM与1μM之间、在1nM与100nM之间、在50nM与200nM 之间、在100nM与250nM之间、在200nM与500nM之间、在500nM与1μM 之间、在1μM与10μM之间或在5μM与50μM之间的所述抑制mTOR活性的药剂存在下工程化所述细胞。在某些实施方案中，在为、为约或为至少0.1 nM、0.5nM、1nM、5nM、10nM、25nM、50nM、100nM、150nM、200 nM、250nM、500nM、1μM、5μM、10μM、25μM、50μM或100μM的所述抑制mTOR活性的药剂存在下工程化所述细胞。
在一些实施方案中，在化合物155存在下工程化所述细胞。在某些实施方案中，在1nM与1μM之间、在1nM与100μM之间、在50nM与200nM之间、在100nM与250nM之间或在200nM与500nM之间的化合物155存在下工程化所述细胞。在特定实施方案中，在为、为约或为至少10nM、25nM、50 nM、100nM、150nM、200nM、250nM或500nM的化合物155存在下工程化所述细胞。
在某些实施方案中，在化合物246存在下工程化所述细胞。在某些实施方案中，在1nM与1μM之间、在1nM与100μM之间、在50nM与200nM之间、在100nM与250nM之间或在200nM与500nM之间的化合物155存在下工程化所述细胞。在某些实施方案中，在为、为约或为至少10nM、25nM、50 nM、100nM、150nM、200nM、250nM或500nM的化合物246存在下工程化所述细胞。
在特定实施方案中，在化合物63存在下工程化所述细胞。在某些实施方案中，在1nM与1μM之间、在1nM与100μM之间、在50nM与200nM之间、在100nM与250nM之间或在200nM与500nM之间的化合物63存在下工程化所述细胞。在一些实施方案中，在为、为约或为至少10nM、25nM、50nM、 100nM、150nM、200nM、250nM或500nM的化合物63存在下工程化所述细胞。
在一些实施方案中，接触可以通过离心如旋转接种(例如，离心接种) 来实现。在一些实施方案中，可以使含有细胞、病毒颗粒和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，例如速度低于用于沉淀细胞的速度，例如为或为约600rpm至1700rpm(例如，为或为约或至少600rpm、1000rpm 或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转是以为或为约100g至3200 g(例如，为或为约或至少或至少约100g、200g、300g、400g、500g、1000 g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如，相对离心力)来进行，如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF 通常被理解为如与旋转轴相比在空间中的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点) 上的有效力。所述值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(旋转轴与被测量RCF的物体、物质或颗粒的距离)。
在一些实施方案中，所述引入通过使组合物的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如，重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，所述接触可以通过离心如旋转接种(例如离心接种)来实现。所述方法包括如国际公开号WO2016/073602中所述的任何方法。示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于
Figure BDA0002556467450000541
和
Figure BDA0002556467450000542
2系统的那些，包括 A-200/F和A-200离心室以及用于此类系统的各种试剂盒。示例性室、系统和处理仪器和机柜描述于例如以下文献中：美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和公开的美国专利申请公开号US 2008/0171951，以及公开的国际专利申请公开号WO00/38762，将其各自的内容通过引用以其整体并入本文。用于此类系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioSafe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2销售的一次性试剂盒。
在一些实施方案中，将系统与其他仪器一起包括和/或置于与其他仪器相关联，所述其他仪器包括用于操作、自动化、控制和/或监测转导步骤以及在系统中执行的一个或多个各种其他处理步骤(例如，可以使用或结合如本文或在国际公开号WO2016/073602中描述的离心室系统进行的一个或多个处理步骤)的方面的仪器。在一些实施方案中，这种仪器容纳于机柜中。在一些实施方案中，所述仪器包括机柜，所述机柜包括外壳，所述外壳含有控制电路、离心机、罩、电机、泵、传感器、显示器和用户界面。示例性装置描述于美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和US 2008/0171951中。
在一些实施方案中，所述系统包含一系列容器，例如袋、管路、旋塞、夹子、连接器和离心室。在一些实施方案中，容器(如袋)包括一个或多个容器(如袋)，其在同一容器或单独的容器(如同一袋或单独的袋)中含有待转导的细胞和病毒载体颗粒。在一些实施方案中，所述系统进一步包括一个或多个容器(如袋)，所述容器含有介质，如稀释剂和/或洗涤溶液，在所述方法期间将所述介质抽入室和/或其他部件中以稀释、重悬和/或洗涤组分和/或组合物。所述容器可以连接在系统中的一个或多个位置，例如连接在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废液管线和/或输出管线的位置。
在一些实施方案中，所述室与离心机相关联，离心机能够实现所述室的旋转，例如围绕其旋转轴旋转。旋转可以在与细胞的转导相关的孵育之前、期间和/或之后进行，和/或在一个或多个其他处理步骤中进行。因此，在一些实施方案中，各个处理步骤中的一个或多个在旋转下(例如在特定的力下) 进行。所述室通常能够竖直或大致竖直地旋转，使得所述室在离心期间竖直放置，并且侧壁和轴是竖直或大致竖直的，且一个或多个端壁是水平或大致水平的。
在一些实施方案中，可以使含有细胞、载体(例如病毒颗粒)和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，如速度低于用于沉淀细胞的速度，如从或从约600rpm至1700rpm(例如为或为约或至少600rpm、1000 rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转是以为或为约100g 至3200g(例如，为或为约或至少或至少约100g、200g、300g、400g、500 g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如，相对离心力)来进行，如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为如与旋转轴相比在空间中的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。所述值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(旋转轴与被测量RCF的物体、物质或颗粒的距离)。
在一些实施方案中，在基因工程化(例如转导)的至少一部分期间，和 /或在基因工程化之后，将细胞转移到生物反应器袋组件，以用于培养经基因工程化的细胞，如用于培育或扩增细胞，如上所述。
还提供了编码重组受体的一种或多种多核苷酸(例如，核酸分子)、用于将细胞基因工程化以表达此类受体的载体以及用于产生所述工程化细胞的方法。在一些实施方案中，载体含有编码重组受体的核酸。在特定实施方案中，载体是病毒载体、非病毒载体。在一些情况下，载体是病毒载体，如逆转录病毒载体，例如慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，载体包括病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒、非病毒载体或转座子，例如Sleeping Beauty转座子系统；源自猿猴病毒40 (SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体；慢病毒载体或逆转录病毒载体，如γ-逆转录病毒载体，源自莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，病毒载体或非病毒DNA含有编码异源重组蛋白的核酸。在一些实施方案中，异源重组分子是或包括重组受体(例如抗原受体)、 SB转座子(例如用于基因沉默)、衣壳包封的转座子、同源双链核酸(例如用于基因组重组)或报告基因(例如荧光蛋白，如GFP)或萤光素酶。
1.病毒载体颗粒
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如像源自猿猴病毒40 (SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见，例如，Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol 28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther NuclAcids 2, e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29(11):550-557)。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如，源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV) 或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因置换逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已描述许多示例性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740、6,207,453、5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTe chniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)HumanGene Therapy 1:5-14；Sc arpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Devel op.3:102-109。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下文献中：Wan g等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:16 37–1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavali eri等人(2003)Blood.102(2):497-505。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒含有源自基于逆转录病毒基因组的载体(例如源自基于慢病毒基因组的载体)的基因组。在所提供的病毒载体的一些方面，编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的异源核酸含于和/ 或位于载体基因组的5'LTR与3'LTR序列之间。
在一些实施方案中，病毒载体基因组是慢病毒基因组，如HIV-1基因组或SIV基因组。例如，已经通过多次减弱毒力基因生成慢病毒载体，例如，可以使基因env、vif、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是已知的。参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等,(1997)；Dull 等人,1998,美国专利号号6,013,516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸，用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中的必需序列。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801UniversityBlvd.，马纳萨斯，维吉尼亚州20110-2209)获得，或使用常用技术从已知来源分离。
慢病毒载体的非限制性例子包括源自慢病毒的那些，例如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人嗜T淋巴细胞病毒1 (HTLV-1)、HTLV-2或马感染贫血病毒(E1AV)。例如，已经通过多次减弱 HIV毒力基因生成慢病毒载体，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini 等人，(1996和1998)；Zufferey等人，(1997)；Dull等人，1998，美国专利号 6,013,516；以及5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸，用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中的必需序列。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801 University Blvd.，马纳萨斯，维吉尼亚州20110-2209)获得，或使用常用技术从已知来源分离。
在一些实施方案中，病毒基因组载体可以含有逆转录病毒(例如慢病毒) 的5'和3'LTR的序列。在一些方面，病毒基因组构建体可含有来自慢病毒的5' 和3'LTR的序列，并且具体而言可以含有来自慢病毒的5'LTR的R和U5序列以及来自慢病毒的失活或自失活3'LTR。LTR序列可以是来自任何物种的任何慢病毒的LTR序列。例如，它们可以是来自HIV、SIV、FIV或BIV的LTR序列。通常，LTR序列是HIV LTR序列。
在一些实施方案中，病毒载体(例如HIV病毒载体)的核酸缺乏另外的转录单元。载体基因组可以含有失活或自失活的3'LTR(Zufferey等人J Virol 72：9873,1998；Miyoshi等人,J Virol 72:8150,1998)。例如，用于产生病毒载体RNA的核酸的3'LTR的U3区中的缺失可用于产生自失活(SIN)载体。然后可以在逆转录期间将这种缺失转移至原病毒DNA的5'LTR。自失活载体通常具有从3'长末端重复序列(LTR)的增强子和启动子序列缺失，所述缺失在载体整合期间被复制到5'LTR中。在一些实施方案中，可以消除足够的序列，包括去除TATA盒，以消除LTR的转录活性。这可以防止在转导的细胞中产生全长载体RNA。在一些方面，3'LTR的U3元件含有其增强子序列、TATA 盒、Sp1和NF-κB位点的缺失。由于自失活3'LTR，在进入和逆转录后生成的原病毒含有失活的5'LTR。这可以通过降低动员载体基因组的风险和LTR对附近细胞启动子的影响来提高安全性。可以通过本领域已知的任何方法来构建自失活3'LTR。在一些实施方案中，这不会影响载体滴度或载体的体外或体内特性。
任选地，来自慢病毒5'LTR的U3序列可以在病毒构建体中用启动子序列 (例如异源启动子序列)置换。这可以增加从包装细胞系回收的病毒的滴度。还可以包含增强子序列。可以使用增加包装细胞系中病毒RNA基因组表达的任何增强子/启动子组合。在一个例子中，使用CMV增强子/启动子序列(美国专利号5,385,839和美国专利号5,168,062)。
在某些实施方案中，可以通过将逆转录病毒载体基因组(例如慢病毒载体基因组)构建为整合缺陷性来使插入诱变的风险降至最低。可以采用多种途径来产生非整合的载体基因组。在一些实施方案中，可以将一种或多种突变工程化至pol基因的整合酶组分中，使得其编码具有无活性整合酶的蛋白质。在一些实施方案中，可以修饰载体基因组本身来防止整合，例如通过使一个或两个附接位点突变或缺失，或通过缺失或修饰使3'LTR近端多嘌呤束 (PPT)没有功能。在一些实施方案中，可以使用非遗传方法；这些方法包括抑制整合酶的一种或多种功能的药理学药剂。这些方法并不相互排斥；也就是说，可以一次使用多于一种所述方法。例如，整合酶和附接位点二者可以都没有功能，或者整合酶和PPT位点可以没有功能，或者附接位点和PPT 位点可以没有功能，或者它们全部都可以没有功能。此类方法和病毒载体基因组是已知的并且是可获得的(参见Philpott和Thrasher,Human GeneTherapy 18:483,2007；Engelman等人J Virol 69:2729,1995；Brown等人J Virol 73:9011(1999)；WO 2009/076524；McWilliams等人,J Virol 77:11150,2003；Powell 和Levin JVirol 70:5288,1996)。
在一些实施方案中，载体含有用于在宿主细胞(例如原核宿主细胞)中繁殖的序列。在一些实施方案中，病毒载体的核酸含有用于在原核细胞(如细菌细胞)中繁殖的一个或多个复制起点。在一些实施方案中，包括原核复制起点的载体也可含有如下基因，所述基因的表达赋予可检测或可选择的标记，例如抗药性。
病毒载体基因组通常以质粒形式构建，其可以转染到包装细胞系或生产细胞系中。可以使用多种已知方法中的任何一种来产生逆转录病毒颗粒，其基因组含有病毒载体基因组的RNA拷贝。在一些实施方案中，至少两种组分参与制备基于病毒的基因传递系统：第一，包装质粒，包括结构蛋白以及生成病毒载体颗粒所必需的酶，第二，病毒载体本身，即，要转移的遗传物质。可以在设计这些组分中的一个或两个时引入生物安全保护措施。
在一些实施方案中，包装质粒可以含有除了包膜蛋白以外的所有逆转录病毒(如HIV-1)蛋白(Naldini等人，1998)。在其他实施方案中，病毒载体可能缺乏另外的病毒基因(例如与毒力有关的那些，例如vpr、vif、vpu和nef) 和/或Tat(HIV的主要反式激活因子)。在一些实施方案中，慢病毒载体(例如基于HIV的慢病毒载体)仅包含亲本病毒的三个基因：gag、pol和rev，这减少或消除了野生型病毒通过重组而重构的可能性。
在一些实施方案中，将病毒载体基因组引入包装细胞系中，所述细胞系含有将从病毒载体基因组转录的病毒基因组RNA包装至病毒颗粒中所需的所有组分。可替代地，除了一种或多种目的序列(例如重组核酸)以外，病毒载体基因组可包含一种或多种编码病毒组分的基因。然而，在一些方面，为了防止基因组在靶细胞中复制，将复制所需的内源病毒基因去除，并在包装细胞系中单独提供。
在一些实施方案中，用一种或多种含有生成所述颗粒所需组分的质粒载体转染包装细胞系。在一些实施方案中，用含有病毒载体基因组(包括LTR、顺式作用包装序列和目的序列，即编码抗原受体(例如CAR)的核酸)的质粒；以及编码病毒酶和/或结构组分(例如Gag、pol和/或rev)的一种或多种辅助质粒转染包装细胞系。在一些实施方案中，利用多种载体分离生成逆转录病毒载体颗粒的各种遗传组分。在一些此类实施方案中，向包装细胞提供单独的载体减少了原本可能产生有复制能力的病毒的重组事件的机会。在一些实施方案中，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单个质粒载体。
在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)用VSV-G糖蛋白假型化，其提供宽细胞宿主范围，从而扩展可以转导的细胞类型。在一些实施方案中，用编码非天然包膜糖蛋白的质粒或多核苷酸转染包装细胞系，以例如包括嗜异性，多嗜性或双嗜性包膜，例如辛德毕斯病毒(Sindbis virus)包膜、GALV或VSV-G。
在一些实施方案中，包装细胞系提供将病毒基因组RNA包装至慢病毒载体颗粒中反式需要的组分，包括病毒调节蛋白和结构蛋白。在一些实施方案中，包装细胞系可以是能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体颗粒的任何细胞系。在一些方面，合适的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、293T、 HeLA(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCCCCL 34)、 BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。
在一些实施方案中，包装细胞系稳定地表达一种或多种病毒蛋白质。例如，在一些方面，可以构建含有gag、pol、rev和/或其他结构基因但不含LTR 和包装组分的包装细胞系。在一些实施方案中，可以用编码一种或多种病毒蛋白的核酸分子以及含有编码异源蛋白的核酸分子的病毒载体基因组和/或编码包膜糖蛋白的核酸对包装细胞系进行瞬时转染。
在一些实施方案中，将病毒载体和包装质粒和/或辅助质粒通过转染或感染引入包装细胞系中。包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体颗粒。用于转染或感染的方法是熟知的。非限制性例子包括磷酸钙、DEAE- 葡聚糖和脂质转染方法、电穿孔和显微注射。
在将重组质粒和逆转录病毒LTR和包装序列引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)中时，包装序列可以允许将重组质粒的RNA转录物包装至病毒颗粒中，然后所述病毒颗粒可能会被分泌到培养基中。在一些实施方案中，然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地将其浓缩，并用于基因转移。例如，在一些方面，在将包装质粒和转移载体共转染至包装细胞系后，从培养基回收病毒载体颗粒，并通过本领域技术人员使用的标准方法进行滴定。
在一些实施方案中，可以通过引入质粒以允许产生慢病毒颗粒，而在包装细胞系(如示例性HEK 293T细胞系)中产生逆转录病毒载体，如慢病毒载体。在一些实施方案中，包装细胞被转染和/或含有编码gag和pol的多核苷酸，以及编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码rev蛋白的多核苷酸转染和/ 或含有所述多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码非天然包膜糖蛋白(例如VSV-G)的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些此类实施方案中，在转染细胞(例如，HEK 293T细胞)后大约两天，细胞上清液含有重组慢病毒载体，可以回收并滴定所述重组慢病毒载体。
所回收和/或产生的逆转录病毒载体颗粒可以用于使用如所述的方法转导靶细胞。一旦进入靶细胞中，病毒RNA就被逆转录，进入细胞核中并稳定整合到宿主基因组中。在病毒RNA整合后一天或两天，可以检测到重组蛋白 (例如抗原受体，例如CAR)的表达。
在一些实施方案中，所提供的方法涉及通过使包含多个细胞的细胞组合物与病毒颗粒接触(例如孵育)来转导细胞的方法。在一些实施方案中，待转染或转导的细胞是或包含从受试者获得的原代细胞，例如从受试者富集和 /或选择的细胞。
在一些实施方案中，组合物中待转导的细胞的浓度为从或从约1.0x 105个细胞/mL至1.0x 108个细胞/mL，例如至少或约至少或约1.0x 105个细胞 /mL、5x 105个细胞/mL、1x 106个细胞/mL、5x 106个细胞/mL、1x 107个细胞/mL、5x 107个细胞/mL或1x 108个细胞/mL。
在一些实施方案中，病毒颗粒是以病毒载体颗粒拷贝或其感染单位(IU) 与待转导的细胞总数的某一比率(IU/细胞)来提供。例如，在一些实施方案中，病毒颗粒在接触期间是以为或为约或至少或至少约每个细胞0.5、1、2、 3、4、5、10、15、20、30、40、50或60IU的病毒载体颗粒存在。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒的滴度在或在约1x 106IU/mL与1x 108IU/mL之间，如在或在约5x 10 6IU/mL与5x 107IU/mL之间，如至少6x 106IU/mL、7x 106IU/mL、8x106IU/mL、9x 106IU/mL、1x 107IU/mL、2 x 107IU/mL、3x 107IU/mL、4x 107IU/mL或5x107IU/mL。
在一些实施方案中，可以按小于100、例如通常小于60、50、40、30、 20、10、5或更小的感染复数(MOI)来实现转导。
在一些实施方案中，所述方法涉及使细胞与病毒颗粒接触或一起孵育。在一些实施方案中，接触进行30分钟至72小时，例如30分钟至48小时、30分钟至24小时或1小时至24小时，例如至少或约至少30分钟、1小时、2小时、6 小时、12小时、24小时、36小时或更长时间。
在一些实施方案中，接触是在溶液中进行。在一些实施方案中，使细胞和病毒颗粒以为或为约0.5mL至500mL的体积接触，所述体积例如为或为约 0.5mL至200mL、0.5mL至100mL、0.5mL至50mL、0.5mL至10mL、0.5mL 至5mL、5mL至500mL、5mL至200mL、5mL至100mL、5mL至50mL、5 mL至10mL、10mL至500mL、10mL至200mL、10mL至100mL、10mL至 50mL、50mL至500mL、50mL至200mL、50mL至100mL、100mL至500mL、 100mL至200mL或200mL至500mL。
在某些实施方案中，用包含结合分子的颗粒对输入细胞进行处理、孵育或接触，所述结合分子结合至或识别由病毒DNA编码的重组受体。
在一些实施方案中，细胞与病毒载体颗粒的孵育导致或产生包含用病毒载体颗粒转导的细胞的输出组合物。
2.非病毒载体
在一些实施方案中，经由电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见，例如，Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298和Van Tedeloo等人(2000) Gene Therapy7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，经由转座将重组核酸转移到T细胞中(参见，例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4): 427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther NuclAcids 2,e74；以及Huang等人 (2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley&Sons,纽约.纽约州中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨颗粒促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；和磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中描述的那些。
在一些实施方案中，细胞(例如，T细胞)可以在扩增期间或之后例如用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)进行转染。例如，这种用于引入所需受体的基因的转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使基因修饰的细胞群摆脱初始刺激物(例如CD3/CD28刺激物)，并随后用第二种类型的刺激物例如经由从头引入的受体进行刺激。所述第二种类型的刺激物可以包括肽/MHC分子形式的抗原刺激物、基因引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人, “Chimeric antigen receptors forT-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012； 907:645-66或Barrett等人,ChimericAntigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。
在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些此类情形中，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后将细胞工程化，并且在一些情况下在培养的至少一部分的同时或期间将细胞工程化。
在一些方面，细胞被进一步工程化以促进细胞因子或其他因子的表达。另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括：用于改善治疗功效的那些，如通过促进所转移细胞的活力和/或功能；用于提供用于选择和/或评价细胞(如用于评估体内存活或定位)的遗传标记的基因；用于改善安全性的基因，例如通过使细胞在体内对阴性选择敏感，如以下文献中所述：Lupton S.D.等人, Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human GeneTherapy 3:319-338(1992)；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601 的公开，所述文献描述了使用通过将显性阳性选择性标记与阴性选择性标记融合而衍生的双功能选择性融合基因。参见例如，Riddell等人,美国专利号 6,040,177,第14-17栏。
在一些实施方案中，将重组核酸经由转座子转移到T细胞中。转座子(转座元件)是可以从基因组内的一个基因座移动到另一个基因座的DNA可移动区段。这些元件经由保守的“剪切粘贴”机制移动：转座酶催化转座子从其原始位置切除，并促进其在基因组中的其他位置的重新整合。如果转座酶是由另一个转座酶基因提供，则可以动员缺乏转座酶的元件。因此，可以将转座子用于将外来DNA掺入宿主基因组中而无需使用病毒转导系统。适合于与哺乳动物细胞(例如人原代白细胞)一起使用的转座子的例子包括但不限于 SleepingBeauty和Piggybac。
基于转座子的转染是由转座酶和转座子组成的两组分系统。在一些实施方案中，所述系统包含转座子，所述转座子被工程化以包含外来DNA(本文也称为货物DNA)(例如编码重组受体的基因)，其侧翼为由伴随的转座酶识别的反向重复/正向重复(IR/DR)序列。在一些实施方案中，非病毒质粒编码在启动子的控制下的转座酶。将质粒转染到宿主细胞中导致转座酶的瞬时表达，因此对于转染后的初始时期，转座酶以足以将转座子整合到基因组 DNA中的水平表达。在一些实施方案中，转座酶本身不整合到基因组DNA 中，并且因此转座酶的表达随时间推移降低。在一些实施方案中，转座酶表达由宿主细胞以足以使对应转座子整合的水平表达，持续以下时间：少于约 4小时、少于约8小时、少于约12小时、少于约24小时、少于约2天、少于约3 天、少于约4天、少于约5天、少于约6天、少于约7天、少于约2周、少于约3 周、少于约4周、少于约5周、或少于约8周。在一些实施方案中，引入宿主基因组中的货物DNA随后不会从宿主基因组中除去，至少是因为宿主不表达能够切除货物DNA的内源转座酶。
Sleeping Beauty(SB)是转座子的Tc/1-水手超家族的合成成员，是由鲑科鱼基因组中具有的休眠元件重新构建的。基于SB转座子的转染是一个由转座酶和转座子组成的两组分系统，所述转座子含有导致精确整合到TA二核苷酸中的反向重复/正向重复(IR/DR)序列。将转座子设计成具有侧翼为IR/DR 的目的表达盒。SB转座酶结合位于Sleeping beauty转座子IR上的特异性结合位点。SB转座酶介导转座子的整合，所述转座子是编码货物序列的可移动元件，在所述货物序列的两侧都侧接着具有催化性酶(SB)结合位点的反向末端重复序列。当SB通过剪切粘贴机制将基因序列在TA靶二核苷酸处插入脊椎动物染色体中时，获得稳定的表达。已将此系统用于工程化各种脊椎动物细胞类型，包括人原代外周血白细胞。在一些实施方案中，将细胞与SB转座子接触、与SB转座子一起孵育和/或用SB转座子处理，所述SB转座子包含货物基因(例如编码重组受体或CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为SB IR序列。在特定实施方案中，将待转染的细胞与包含SB转座子的质粒接触、与包含SB转座子的质粒一起孵育、和/或用包含SB转座子的质粒处理，所述SB转座子包含货物基因(例如编码CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为SB IR序列。在某些实施方案中，所述质粒还包含侧翼没有SB IR序列的编码SB转座酶的基因。
PiggyBac(PB)是可以用于将货物DNA整合到宿主(例如人)的基因组 DNA中的另一种转座子系统。PB转座酶识别位于转座子两个末端的PB转座子特异性反向末端重复序列(ITR)，并且高效地将内容物从原始位点移出并将所述内容物高效地整合到TTAA染色体位点中。PB转座子系统使得能够将 PB载体中两个ITR之间的目的基因动员到靶基因组中。已将PB系统用于工程化各种脊椎动物细胞类型，包括人原代细胞。在一些实施方案中，将待转染的细胞与PB转座子接触、与PB转座子一起孵育、和/或用PB转座子处理，所述PB转座子包含货物基因(例如编码CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为 PB IR序列。在特定实施方案中，将待转染的细胞与包含PB转座子的质粒接触、与包含PB转座子的质粒一起孵育、和/或用包含PB转座子的质粒处理，所述PB转座子包含货物基因(例如编码CAR的基因)，所述货物基因的侧翼为PB IR序列。在某些实施方案中，所述质粒还包含侧翼没有PB IR序列的编码SB转座酶的基因。
在一些实施方案中，可以通过限制酶切割、连接和分子克隆的标准方法来产生用于主题方法中的转座子/转座酶的各种元件，例如一种或多种SB或 PB载体。用于构建主题载体的一种方案包括以下步骤。首先，用限制性核酸内切酶从初始来源(例如包含转座酶基因的载体)切割经纯化的核酸片段，所述核酸片段含有所需组分核苷酸序列以及外来序列。然后使用常规分离方法(例如通过琼脂糖凝胶电泳)将含有所需核苷酸序列的片段与不同大小的不需要片段分离。将所需片段从凝胶上切下，并以适当的构型连接在一起，从而产生含有所需序列(例如如上所述的与主题载体的各种元件对应的序列)的环状核酸或质粒。然后，在需要的情况下，在原核宿主(例如大肠杆菌(E.coli))中扩增如此构建的环状分子。这些步骤中涉及的切割、质粒构建、细胞转化和质粒产生的程序对本领域技术人员而言是熟知的，并且限制性酶切和连接所需的酶可商购获得。(参见，例如R.Wu,编辑,Methods inEnzymology,第68卷,Academic Press,纽约(1979)；T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,纽约(1982)；目录号1982-83,New EnglandBiolabs,Inc.；目录号1982-83,Bethesda Research Laboratories,Inc。如何构建主题方法中采用的载体的例子提供于下文的实验章节中。在WO 98/40510和WO 99/25817中也披露了代表性Sleeping Beauty转座子系统的制备)。
在一些实施方案中，用转座子转导是用包含转座酶基因的质粒和包含转座子的质粒进行，所述转座子含有侧翼为由转座酶识别的反向重复/正向重复 (IR/DR)序列的货物DNA序列。在某些实施方案中，货物DNA序列编码异源蛋白，例如重组T细胞受体或CAR。在一些实施方案中，质粒包含转座酶和转座子。在一些实施方案中，转座酶在遍在启动子或适合于驱动转座酶在靶细胞中表达的任何启动子的控制下。遍在启动子包括但不限于EF1a、CMB、SV40、PGK1、Ubc、人β-肌动蛋白、CAG、TRE、UAS、Ac5、CaMKIIa 和U6。在一些实施方案中，货物DNA包含选择盒，所述选择盒允许选择将货物DNA稳定整合到基因组DNA中的细胞。合适的选择盒包括但不限于编码以下的选择盒：卡那霉素抗性基因、壮观霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、羧苄青霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、博来霉素抗性基因、红霉素抗性基因和多粘菌素B抗性基因。
在一些实施方案中，将用于用转座子转导的组分(例如包含SB转座酶和 SB转座子的质粒)引入靶细胞中。可以采用任何方便的方案，其中取决于靶细胞的位置，所述方案可以将系统组分体外或体内引入靶细胞中。例如，在靶细胞是分离的细胞的情况下，可以例如通过使用标准转化技术，在容许靶细胞活力的细胞培养条件下将所述系统直接引入所述细胞中。此类技术包括但不必限于：病毒感染、转化、缀合、原生质体融合、电穿孔、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、病毒载体递送等。方法的选择通常取决于待转化的细胞的类型和发生转化的环境(即体外、离体或体内)。这些方法的一般性讨论可以在Ausubel等人,Short Protocols in Molecular Biology,第3版, Wiley&Sons,1995中找到。
在一些实施方案中，在足以从携带转座子的载体上切下侧翼为反向重复序列的核酸并且随后将切下的核酸整合到靶细胞的基因组中的条件下，将SB 转座子和SB转座酶来源引入多细胞生物体(例如哺乳动物或人)的靶细胞中。一些实施方案还包括确保靶细胞中存在必需的转座酶活性以及引入的转座子的步骤。取决于转座子载体本身的结构，即载体是否包括编码具有转座酶活性的产物的区域，所述方法还可以包括将编码必需转座酶活性的第二载体引入靶细胞中。
在一些实施方案中，引入细胞中的包含转座子的载体核酸的量和编码转座酶的载体核酸的量足以提供所需的将转座子核酸切下并插入靶细胞基因组中。这样，引入的载体核酸的量应提供足够量的转座酶活性和足够拷贝数的期望插入靶细胞中的核酸。引入靶细胞中的载体核酸的量取决于所采用的特定引入方案(例如所采用的特定离体给予方案)的效率而变化。
一旦载体DNA与必需的转座酶组合进入了靶细胞，就经由所提供的转座酶从载体上切下侧翼为反向重复序列的载体核酸区域(即位于Sleeping Beauty转座酶识别的反向重复序列之间的载体核酸)并将其插入靶细胞的基因组中。这样，将载体DNA引入靶细胞中之后，随后进行转座酶介导的切除载体携带的外来核酸以及将所述核酸插入靶细胞的基因组中。在特定实施方案中，载体整合到至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％至少7％至少8％、至少9％、至少10％、至少15％、或至少20％的用SB转座子和/或SB转座酶转染的细胞的基因组中。在一些实施方案中，核酸整合到靶细胞基因组中是稳定的，即，载体核酸保持存在于靶细胞基因组中持续超过瞬时时间段，并且在一部分染色体遗传物质上传代至靶细胞的后代。
在某些实施方案中，转座子用于将各种大小的核酸(即多核苷酸)整合到靶细胞基因组中。在一些实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约0.1kb至200kb、从约0.5kb至100kb、从约1.0kb 至约8.0kb、从约1.0至约200kb、从约1.0至约10kb、从约10kb至约50kb、从约50kb至约100kb、或从约100kb至约200kb。在一些实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约1.0kb至约8.0kb。在一些实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约1.0kb至约200kb。在特定实施方案中，使用主题方法插入靶细胞基因组中的DNA大小的范围为从约1.0kb至约8.0kb。
D.细胞的培育和/或扩增
在一些实施方案中，所提供的方法包括用于培育细胞(例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞)的一个或多个步骤。在一些实施方案中，在基因工程化的步骤(例如通过转导或转染将重组多肽引入细胞)之后，在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞。在特定实施方案中，在刺激条件下孵育细胞并用重组多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)转导或转染细胞之后，培育所述细胞。
在某些实施方案中，所述工程化T细胞的一种或多种组合物是或包括经富集T细胞的两种单独组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的两种单独组合物，例如，从相同生物样品中选择、分离和/或富集的经富集T细胞的两种单独组合物分别在刺激条件下培育。在某些实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD4+T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+ T细胞和经富集CD8+T细胞的两种单独组合物分别例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育。在一些实施方案中，培育经富集T细胞的单一组合物。在某些实施方案中，所述单一组合物是经富集CD4+T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述单一组合物是在培育之前已从单独组合物合并的经富集的 CD4+和CD8+T细胞的组合物。
在一些实施方案中，例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育的经富集 CD4+T细胞的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少 80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少 90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约 100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD8+T细胞。在某些实施方案中，经培育的经富集CD4+T细胞的组合物包含少于40％、少于 35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和 /或不含或基本上不含CD8+T细胞。
在一些实施方案中，例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育的经富集 CD8+T细胞的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少 80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+T细胞。在特定实施方案中，所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少 90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约 100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD8+T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD8+T细胞的组合物包含少于 40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含有CD4+T 细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。
在一些实施方案中，将经富集CD4+和经CD8+T细胞的单独组合物合并为单一组合物并且例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成培育之后将经富集CD4+和经富集CD8+T细胞的单独经培育组合物合并为单一组合物。
在一些实施方案中，在促进增殖和/或扩增的条件下培育经富集T细胞的组合物。在一些实施方案中，此类条件可以经设计以诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活。在特定实施方案中，所述刺激条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂 (例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他经设计以促进细胞生长、分裂和/或扩增的药剂))。
在特定实施方案中，在一种或多种细胞因子存在下培育所述细胞。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括4-α-螺旋束细胞因子家族的成员。在一些实施方案中，4-α-螺旋束细胞因子家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子 (G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
在特定实施方案中，在培育，例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育之前，所述细胞未与抑制mTOR活性的药剂(如本文例如在章节II中所述的药剂)一起孵育、接触和/或暴露。
在某些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂(如本文例如在章节II中所述的药剂)存在下进行所述培育的至少一部分。在一些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂存在下进行所有和/或整个培育。
在特定实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂存在下培育所述细胞。在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是本文如在章节II中所述的药剂。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂还抑制另外的激酶的活性。在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂还抑制磷酸肌醇-3激酶 (PI3K)活性。在某些实施方案中，所述药剂在足以抑制mTOR活性的浓度下选择性抑制mTOR活性，例如不可检测地抑制PI3K活性，和/或不以与 mTOR活性相同的程度抑制PI3K活性。在一些实施方案中，所述抑制mTOR 活性的药剂抑制激酶活性。在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂抑制mTORC1和/或mTORC2活性。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂抑制mTORC1和mTORC2激酶活性。
在一些实施方案中，用选自以下的药剂培育所述细胞：PI-103、SF1126、 BGT226、XL765、PF-04691502、NVP-BEZ235、吡唑并嘧啶、Torin l、Torkinib (PP242)、PP30、Ku-0063794、WAY-600(Wyeth)、WAY-687(Wyeth)、 WAY-354(Wyeth)、AZD8055、雷帕霉素(西罗莫司)、替西罗莫司(CC1779)、依维莫司(RAD001)、地弗莫司(AP23573)、AZD8055(AstraZeneca)和 OSI-027(OSI)。在一些实施方案中，用具有或包括章节II中提供的式，例如式(I)、式(II)或式(III)的药剂培育所述细胞。在一些实施方案中，所述药剂是化合物155、化合物246或化合物63。
在某些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂存在下培育所述细胞，所述药剂的浓度抑制、减少和/或降低mTOR活性。在一些实施方案中，浓度将 mTOR的一种或多种活性抑制、减少和/或降低约或至少25％、30％、40％、 50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.9％。在一些实施方案中，所述药剂的浓度不阻止原代T细胞增殖和/或扩增。在一些实施方案中，在1nM与1μM之间、在1nM与100nM之间、在50nM与250nM 之间、在100nM与250nM之间、在200nM与500nM之间、在50nM与250nM 之间、在100nM与500nM之间、在500nM与1μM之间、在1μM与10μM之间或在5μM与50μM之间的所述抑制mTOR活性的药剂存在下培育所述细胞。在某些实施方案中，在为、为约或为至少0.1nM、0.5nM、1nM、5nM、 10nM、25nM、50nM、100nM、150nM、200nM、250nM、500nM、1μM、 5μM、10μM、25μM、50μM或100μM的所述抑制mTOR活性的药剂存在下培育所述细胞。
在一些实施方案中，在化合物155存在下培育所述细胞。在某些实施方案中，在1nM与1μM之间、在1nM与100μM之间、在50nM与200nM之间、在100nM与250nM之间或在200nM与500nM之间的化合物155存在下培育所述细胞。在特定实施方案中，在为、为约或为至少10nM、25nM、50nM、 100nM、150nM、200nM、250nM或500nM的化合物155存在下培育所述细胞。
在某些实施方案中，在化合物246存在下培育所述细胞。在某些实施方案中，在1nM与1μM之间、在1nM与100μM之间、在50nM与200nM之间、在100nM与250nM之间或在200nM与500nM之间的化合物155存在下培育所述细胞。在某些实施方案中，在为、为约或为至少10nM、25nM、50nM、 100nM、150nM、200nM、250nM或500nM的化合物246存在下培育所述细胞。
在特定实施方案中，在化合物63存在下培育所述细胞。在某些实施方案中，在1nM与1μM之间、在1nM与100μM之间、在50nM与200nM之间、在100nM与250nM之间或在200nM与500nM之间的化合物63存在下培育所述细胞。在一些实施方案中，在为、为约或为至少10nM、25nM、50nM、 100nM、150nM、200nM、250nM或500nM的化合物63存在下培育所述细胞。
在一些实施方案中，培育是在如下条件下进行，所述条件通常包括适合于原代免疫细胞(如人T淋巴细胞)生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常为或为约37摄氏度。在一些实施方案中，所述经富集T细胞的组合物在25℃至38℃，如30℃至37℃，例如为或为约37℃± 2℃的温度下孵育。在一些实施方案中，将孵育进行一段时间直至培养(例如培育或扩增)产生所希望的或阈值密度、数量或剂量的细胞。在一些实施方案中，孵育进行如下时间：大于或大于约或为约或为24小时、48小时、72 小时、96小时、5天、6天、7天、8天、9天或更长时间。
在特定实施方案中，所述培育是在封闭系统中进行。在某些实施方案中，所述培育是在无菌条件下在封闭系统中进行。在特定实施方案中，所述培育在与所提供的系统的一个或多个步骤相同的封闭系统中进行。在一些实施方案中，将所述经富集T细胞的组合物从封闭系统中移取出并且放置于生物反应器中和/或连接至生物反应器以用于培育。适合于所述培育的生物反应器的例子包括但不限于GE Xuri W25、GE Xuri W5、SartoriusBioSTAT RM 20|50、 Finesse SmartRocker生物反应器系统和XRS生物反应器系统。在一些实施方案中，在培育步骤的至少一部分期间使用生物反应器灌注和/或混合细胞。
在一些实施方案中，所述混合是或包括摇摆/或运动。在一些情况下，生物反应器可以经历运动或摇摆，这在一些方面可以增加氧气传递。使生物反应器运动可以包括但不限于沿着水平轴线旋转、沿着竖直轴线旋转、沿着生物反应器的倾斜(tilted或inclined)的水平轴线的摇摆运动、或其任何组合。在一些实施方案中，在摇摆的情况下进行孵育的至少一部分。可以调整摇摆速度和摇摆角度以实现所希望的搅动。在一些实施方案中，摇摆角度为20°、 19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、 3°、2°或1°。在某些实施方案中，摇摆角度在6-16°之间。在其他实施方案中，摇摆角度在7-16°之间。在其他实施方案中，摇摆角度在8-12°之间。在一些实施方案中，摇摆速率为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40rpm。在一些实施方案中，摇摆速率在4rpm与12rpm之间，例如在4rpm与6rpm之间并包括端值。
在一些实施方案中，使生物反应器保持等于或接近37℃的温度和等于或接近5％的CO2水平，具有如下稳定空气流量：为、为约或至少0.01L/min、 0.05L/min、0.1L/min、0.2L/min、0.3L/min、0.4L/min、0.5L/min、1.0L/min、 1.5L/min、或2.0L/min或大于2.0L/min。在某些实施方案中，在灌注的情况下，如以290ml/天、580ml/天和/或1160ml/天的速率(例如，这取决于与培育起始相关的时间安排和/或经培育细胞的密度)进行培育的至少一部分。在一些实施方案中，在摇摆运动(如以在5°与10°之间(如6°)的角度，以恒定摇摆速度(如在5RPM与15RPM之间(如6RMP或10RPM)的速度))的情况下进行细胞培养物扩增的至少一部分。
E.配制细胞
在一些实施方案中，所提供的用于制造、生成或产生细胞疗法和/或工程化细胞的方法可以包括在孵育、工程化和培育、和/或一种或多种如所述的其他处理步骤之前或之后，配制细胞，如配制由所提供的处理步骤产生的基因工程化细胞。在一些实施方案中，与配制所述细胞相关的所提供的方法包括在封闭系统中处理经转导细胞，如使用上文所述的处理步骤转导和/或扩增的细胞。在一些实施方案中，包含用重组抗原受体(例如，CAR或TCR)工程化的细胞的细胞剂量是作为组合物或配制品，如药物组合物或配制品来提供。此类组合物可以根据所提供的方法使用，如用于预防或治疗疾病、病症和障碍，或用于检测、诊断和预后方法中。
在一些情况下，将细胞在用于制造、生成或产生细胞疗法和/或工程化细胞的一个或多个步骤(例如在离心室和/或封闭系统中进行)中处理可以包括在培养(例如培育和扩增)和/或一个或多个如所述的其他处理步骤之前或之后配制细胞，如配制由所提供的转导处理步骤产生的基因工程化细胞。在一些情况下，所述细胞可以以用于剂量给予，如用于单一单位剂量给予或多剂量给予的量配制。在一些实施方案中，与配制所述细胞相关的所提供的方法包括在封闭系统中处理经转导细胞，如使用上文所述的处理步骤转导和/或扩增的细胞。
在某些实施方案中，对经富集T细胞的一种或多种组合物进行配制。在特定实施方案中，在已经工程化和/或培育所述一种或多种组合物之后配制经富集T细胞的一种或多种组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种组合物是输入组合物。在一些实施方案中，所述一种或多种输入组合物先前已进行低温冷冻和储存，并在孵育之前解冻。
在一些实施方案中，配制通过一个或多个所述处理步骤生成的T细胞(如 CD4+和/或CD8+T细胞)。在一些方面，分别制造、产生或生成多种组合物，每种组合物含有来自受试者的不同细胞群和/或细胞亚型，如用于任选地在一定时间段内分开地或独立地给予。例如，含有不同细胞群或细胞亚型的工程化细胞的单独配制品可以分别包含CD8+和CD4+T细胞，和/或分别包含富集 CD8+和CD4+的群体，例如，CD4+和/或CD8+T细胞，其各自单独地包括经基因工程化以表达重组受体的细胞。在一些实施方案中，至少一种组合物经配制具有经基因工程化以表达重组受体的CD4+T细胞。在一些实施方案中，至少一种组合物经配制具有经基因工程化以表达重组受体的CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述剂量的给予包括给予第一组合物，所述第一组合物包含一定剂量的CD8+T细胞或一定剂量的CD4+T细胞，以及给予第二组合物，所述第二组合物包含CD4+T细胞和CD8+T细胞的剂量中的另一者。在一些实施方案中，包含一定剂量的CD8+T细胞或一定剂量的CD4+T细胞的第一组合物在包含CD4+T细胞和CD8+T细胞的剂量中的另一者的第二组合物之前给予。在一些实施方案中，所述剂量的给予包括给予包含一定剂量的CD8+ T细胞和一定剂量的CD4+T细胞两者的组合物。
在某些实施方案中，所述经富集T细胞的一种或多种组合物是或包括经富集T细胞的两种单独组合物，例如单独的工程化和/或经培育组合物。在特定实施方案中，将经富集T细胞的两种单独组合物，例如，已从相同生物样品中选择、分离和/或富集的经富集T细胞的两种单独组合物分别配制。在某些实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD4+T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述两种单独组合物包括经富集CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，将经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的两种单独组合物分别配制。在一些实施方案中，对经富集T细胞的单一组合物进行配制。在某些实施方案中，所述单一组合物是经富集CD4+T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述单一组合物是在配制之前已从单独组合物合并的经富集的 CD4+和CD8+T细胞的组合物。
在一些实施方案中，将经富集CD4+和CD8+T细胞的单独组合物合并为单一组合物并且对其进行配制。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成配制之后将经富集CD4+和经富集CD8+T细胞的单独经配制组合物合并为单一组合物。
在一些实施方案中，经配制的经富集CD4+T细胞的组合物包含至少 60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD4+T细胞。在某些实施方案中，经配制的经富集CD4+T 细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。
在一些实施方案中，例如在促进增殖和/或扩增的条件下配制的经富集 CD8+T细胞的组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少 80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+T细胞。在某些实施方案中，所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少 90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约 100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD8+T细胞。在某些实施方案中，在刺激条件下孵育的经富集CD8+T细胞的组合物包含少于 40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含有CD4+T 细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。
在某些实施方案中，经配制细胞是输出细胞。在一些实施方案中，经富集T细胞的经配制组合物是经富集T细胞的输出组合物。在特定实施方案中，经配制CD4+T细胞和/或经配制CD8+T细胞是输出CD4+和/或CD8+T细胞。在特定实施方案中，经富集CD4+T细胞的经配制组合物是经富集CD4+T细胞的输出组合物。在一些实施方案中，经富集CD8+T细胞的经配制组合物是经富集CD8+T细胞的输出组合物。
在一些实施方案中，细胞可以配制到容器(如袋或小瓶)中。
在一些实施方案中，将细胞配制于药学上可接受的缓冲液中，所述药学上可接受的缓冲液在一些方面可以包含药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，所述处理包括将介质交换成药学上可接受或给予至受试者所需的介质或配制缓冲液。在一些实施方案中，所述处理步骤可以包括洗涤经转导和/或扩增的细胞以更换药学上可接受的缓冲液中的所述细胞，所述药学上可接受的缓冲液可以包含一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。此类药物形式(包含药学上可接受的载体或赋形剂)的例子可以在下文所述与用于将细胞和组合物给予至受试者的形式结合的任何形式。在一些实施方案中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量(例如治疗有效量或预防有效量)的细胞。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或给予方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如 Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)中。药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy, Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中。
配制品可以包括水溶液。所述配制品或组合物还可含有可用于用细胞治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种活性成分，优选具有与所述细胞互补的活性的那些成分，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量合适地组合存在。因此，在一些实施方案中，所述药物组合物还包括其他药物活性药剂或药物，如化学治疗剂，例如，天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/或长春新碱。
在一些实施方案中，组合物被提供为无菌液体制剂(例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物)，其在一些方面可以被缓冲至选择的 pH。液体组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)掺合。组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或颜料，这取决于给予途径和所需的制剂。在一些方面，可以查阅标准文本来制备合适的制剂。
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保对微生物作用的防止。可以通过使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)实现可注射药物形式的延长吸收。
在一些实施方案中，所述配制缓冲液含有低温保存剂。在一些实施方案中，用含有1.0％至30％DMSO溶液，如5％至20％DMSO溶液或5％至10％ DMSO溶液的低温保存溶液配制细胞。在一些实施方案中，低温保存溶液为或含有例如含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻介质。在一些实施方案中，低温保存溶液为或含有例如至少或至少约7.5％DMSO。在一些实施方案中，所述处理步骤可以涉及洗涤经转导和 /或扩增的细胞以置换低温保存溶液中的细胞。在一些实施方案中，将所述细胞冷冻，例如低温冷冻或低温保存在介质和/或溶液中，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、 9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％的DMSO，或在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间、或在6％与8％之间的 DMSO。在特定实施方案中，将所述细胞冷冻，例如低温冷冻或低温保存在介质和/或溶液中，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％或0.25％的HSA，或在0.1％与5％之间在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间或在1％与 2％之间的HSA。
在一些实施方案中，使用一个或多个处理步骤进行配制，所述一个或多个处理步骤包括洗涤、稀释或浓缩细胞(如经培养或扩增细胞)。在一些实施方案中，所述处理可以包括将细胞稀释或浓缩至所需浓度或数量，如包括用于以给定剂量或其部分给予的细胞数量的单位剂型组合物。在一些实施方案中，所述处理步骤可以包括减少体积从而根据需要增加细胞浓度。在一些实施方案中，所述处理步骤可以包括增加体积从而根据需要减小细胞浓度。在一些实施方案中，所述处理包括添加一定体积的配制缓冲液至经转导和/ 或扩增细胞。在一些实施方案中，配制缓冲液的体积为从或从约10mL至1000 mL，如至少或约至少或为约或为50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、 500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。
在一些实施方案中，此类用于配制细胞组合物的处理步骤是在封闭系统中进行。此类处理步骤的示例可以使用与一个或多个与细胞处理系统相关联的系统或试剂盒结合的离心室来进行，如由Biosafe SA生产及出售的离心室，包括与
Figure BDA0002556467450000781
或
Figure BDA0002556467450000782
细胞处理系统一起使用的离心室。示例性系统和方法描述于国际公开号WO2016/073602中。在一些实施方案中，所述方法包括实现自离心室的内部空腔压出经配制组合物，所述经配制组合物是在如所述的任何以上实施方案中，在配制缓冲液(如药学上可接受的缓冲液)中配制的所得细胞组合物。在一些实施方案中，将经配制组合物压出至作为封闭系统的一部分与离心室可操作地连接的容器(如本文所述的生物医学材料器皿的小瓶)。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿被配置用于整合至和或可操作连接至并且/或者被整合至或可操作地连接至进行一个或多个处理步骤的封闭系统或装置。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿在输出管线或输出位置处连接至系统。在一些情况下，所述封闭系统在入口管处连接至生物医学材料器皿的小瓶。与本文所述的生物医学材料器皿一起使用的示例性封闭系统包括
Figure BDA0002556467450000791
和
Figure BDA0002556467450000792
2系统。
在一些实施方案中，如与离心室或细胞处理系统相关联的封闭系统包括多端口输出试剂盒，所述试剂盒含有在管线各末端与端口相关联的多路管歧管，所述端口可以连接至一个或多个容器以供经配制组合物压出。在一些方面，所需数量或多个小瓶可以无菌连接至多端口输出中的一个或多个，通常两个或更多个，如至少3、4、5、6、7、8个或更多个端口。例如，在一些实施方案中，一个或多个容器(例如生物医学材料器皿)可以附接至所述端口或少于全部的所述端口。因此，在一些实施方案中，所述系统可以实现将输出组合物压出至生物医学材料器皿的多个小瓶中。
在一些方面，细胞可以以用于剂量给予(如用于单一单位剂量给予或多剂量给予)的量压出至多个输出容器(例如，小瓶)中的一个或多个。例如，在一些实施方案中，小瓶可以各自含有以给定剂量或其部分给予的细胞数量。因此，在一些方面，每个小瓶可以含有用于给予的单一单位剂量，或者可以含有所需剂量的一部分，使得多个小瓶中的多于一个，如两个小瓶或3 个小瓶一起构成用于给予的剂量。
因此，所述容器(例如袋或小瓶)通常含有待给予的细胞，例如，其一个或多个单位剂量。单位剂量可以是待给予至受试者的细胞的量或数量，或者是待给予的细胞的两倍数量(或更多数量)。它可以是将向受试者给予的细胞的最低剂量或最低可能剂量。
在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)单独地包含单位剂量的细胞。因此，在一些实施方案中，每个容器包含相同或大致或基本上相同数量的细胞。在一些实施方案中，每个单位剂量含有至少或约至少1x 106、2x 106、5x 106、1x 107、5x 107或1x 108个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，每个容器(例如袋或小瓶)中的经配制细胞组合物的体积为10mL至100mL，如至少或约至少20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL。在一些实施方案中，容器(例如袋或小瓶) 中的细胞可以是低温保存的。在一些实施方案中，容器(例如小瓶)可以储存在液氮中，直到进一步使用。
在一些实施方案中，将通过所述方法产生的此类细胞或包含此类细胞的组合物给予至受试者以治疗疾病或病症。
F.输出组合物的示例性特征
在特定实施方案中，所提供的方法与从一种或多种输入组合物和/或从单一生物样品产生或生成经富集T细胞的一种或多种输出组合物的过程结合使用。在某些实施方案中，所述一种或多种输出组合物含有表达重组受体(例如TCR或CAR)的细胞。在一些实施方案中，所述过程包括在抑制mTOR活性的药剂(如所述的任一种，例如化合物63)存在下孵育、工程化和/或培育细胞。在特定实施方案中，所述输出组合物的细胞适合于作为疗法，例如自体细胞疗法给予至受试者。
在一些实施方案中，通过本文所述(如上文所述)的方法将所述输出组合物的所述细胞工程化以表达重组受体。在某些实施方案中，将所述输出组合物的所述细胞工程化以表达嵌合抗原受体(CAR)，例如抗CD19 CAR。
在一些实施方案中，所述一种或多种输出组合物是经富集CD4+和CD8+ T细胞的组合物。在某些实施方案中，所述一种或多种输出组合物包括经富集CD4+T细胞的组合物。在特定实施方案中，所述一种或多种输出组合物包括经富集CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述一种或多种输出组合物包括经富集CD4+T细胞的输出组合物和经富集CD8+T细胞的输出组合物。
在一些实施方案中，经富集CD4+T细胞的输出组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+T细胞。在某些实施方案中，所述输出组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD4+T细胞。在某些实施方案中，所述经富集CD4+T细胞的输出组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T 细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。
在一些实施方案中，经富集CD8+T细胞的输出组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+T细胞。在特定实施方案中，所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD8+T细胞。在某些实施方案中，所述经富集CD8+T细胞的输出组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T 细胞，和/或不含有CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。
在某些实施方案中，将与所提供方法相关的过程与示例性和/或替代性过程进行比较。在一些实施方案中，替代性和/或示例性过程和与所提供方法相关的过程相似或相同，不同之处在于：细胞(例如，包括经富集CD4+T细胞、经富集CD8+T细胞和/或经富集CD4+和CD8+T细胞的输入细胞、经刺激细胞和/或工程化细胞)的组合物未在mTOR抑制剂(例如化合物63)存在下孵育、工程化和/或培育。在一些实施方案中，示例性替代性过程的输出细胞先前未在抑制mTOR活性的药剂(例如化合物63)存在下培育，例如以扩增工程化T细胞。在一些实施方案中，通过示例性、替代性过程产生的输出细胞被工程化以表达与结合所提供的方法产生的输出组合物的细胞相同的重组受体。
在一些实施方案中，与示例性替代性过程(例如其中未在mTOR抑制剂 (例如化合物63)存在下培育细胞的过程)的输出细胞中的表达相比，所述输出组合物的所述细胞差异表达一种或多种基因。在一些实施方案中，与通过示例性替代性过程产生的输出细胞相比，一个或多个基因在所述输出组合物的细胞中被下调。在一些实施方案中，与通过示例性替代性过程产生的输出细胞相比，与以下相关的一个或多个基因在来自所述输出组合物的细胞中被下调：代谢应激反应、T细胞激活、Th1和Th2激活途径、细胞周期停滞、糖皮质激素生物合成、来自多能干细胞的造血作用、T细胞激活、淋巴细胞分化、白细胞迁移、半胱氨酸型肽链内切酶抑制剂活性、细胞周期进程、对营养水平的反应和生长因子受体信号传导。
在某些实施方案中，与通过示例性替代性过程(如未在抑制mTOR的药剂(例如化合物63)存在下进行的过程)产生的输出细胞相比，一个或多个基因在所述输出组合物的细胞中被上调。在一些实施方案中，与通过示例性替代性过程产生的输出细胞相比，与以下相关的一个或多个基因在来自所述输出组合物的细胞中被上调：生长因子受体信号传导、脂肪酸氧化、共有γ细胞因子受体信号传导途径、蛋白质去糖基化、T细胞激活、细胞周期进程、淋巴细胞分化、Th1和Th2激活途径、固醇稳态、来自多能干细胞的造血作用、细胞凋亡过程、T细胞激活、和RAR激活，以及离子介导的信号传导。
在一些实施方案中，所述输出组合物含有经工程化以表达重组受体的细胞(例如CD4+和/或CD8+T细胞)，与通过示例性、替代性过程(例如其中未在mTOR抑制剂(例如化合物63)存在下培育细胞的过程)产生的输出细胞相比，所述细胞对抗原(例如由所述重组受体结合和/或识别的抗原)的刺激具有相同或更大的应答。在一些实施方案中，与通过示例性、替代性过程产生的输出细胞相比，响应于抗原的刺激，所述输出组合物的细胞具有相同或更大的和/或能够产生相同或更大的以下的增加：糖酵解代谢、mTOR活性、细胞因子产生、细胞溶解活性、扩增和/或增殖。
在一些实施方案中，所述输出细胞关于参数、属性和/或活性具有与通过示例性/替代性过程(例如，其中未在mTOR抑制剂(例如化合物63)存在下孵育、工程化和/或培育细胞的过程)产生的输出细胞相似的应答。在一些实施方案中，所述输出细胞的相似应答的测量与通过示例性、替代性过程产生的输出细胞的所述应答的测量在统计学上没有差异。在一些实施方案中，所述输出细胞的相似应答的测量在通过示例性、替代性过程产生的输出细胞的所述应答的测量的25％、20％、10％、5％或1％内。
在某些实施方案中，细胞代谢(例如糖酵解代谢速率)的改变可以充当免疫细胞功能的驱动者和/或调节者。在一些实施方案中，所述输出组合物的所述细胞具有与通过示例性、替代性过程(例如，其中未在mTOR抑制剂(例如化合物63)存在下培育细胞的过程)产生的输出细胞相似的由抗原刺激引起的糖酵解代谢速率增加。在一些实施方案中，所述输出组合物的所述细胞具有、具有约或具有至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、100％、125％、150％、1倍、2倍、3倍、4倍或5倍的响应于抗原刺激的糖酵解代谢速率增加。在某些实施方案中，所述响应于抗原刺激的糖酵解代谢速率增加比通过示例性、替代性过程产生的输出细胞中的由抗原刺激引起的糖酵解代谢速率增加大至少5％、10％、15％、20％、25％、 50％或100％。在某些实施方案中，糖酵解代谢可以通过任何已知手段(包括通过细胞外测量耗氧量和酸产生量(ECAR))测量。
在特定实施方案中，所述输出组合物的所述细胞具有与通过示例性、替代性过程(例如，其中未在mTOR抑制剂(例如化合物63)存在下培育细胞的过程)产生的输出细胞相似的由抗原刺激引起的mTOR活性增加。在一些实施方案中，所述输出组合物的所述细胞具有、具有约或具有至少25％、50％、 75％、100％、125％、150％、1倍、2倍、3倍、4倍或5倍的响应于抗原刺激的mTOR活性增加。在某些实施方案中，所述响应于抗原刺激增加的mTOR 活性比通过示例性、替代性过程产生的输出细胞中的由抗原刺激引起的 mTOR活性增加大至少25％、50％、75％或100％。
在某些实施方案中，所述输出组合物的所述细胞具有与通过示例性、替代性过程(例如，其中未在mTOR抑制剂(例如化合物63)存在下培育细胞的过程)产生的输出细胞相似的响应于抗原刺激的细胞因子产生。在一些实施方案中，所述输出组合物的所述细胞具有与通过示例性、替代性过程产生的输出细胞相似的响应于抗原刺激的细胞因子(例如，TNF-α、IFN-γ和/或 IL-2)产生。在一些实施方案中，与未在抑制mTOR的药剂(例如化合物63)存在下进行的替代性过程相比，所述输出组合物的所述细胞具有、具有约或具有至少50％、60％、70％、75％、80％、90％、100％、125％、150％、1倍、 2倍、3倍、4倍或5倍的响应于抗原刺激的一种或多种细胞因子产生增加。在某些实施方案中，所述响应于抗原刺激增加的mTOR活性比通过示例性、替代性过程产生的输出细胞中在抗原刺激后所述一种或多种细胞因子的产生大至少5％、10％、15％、20％、25％、50％或100％。在一些实施方案中，细胞因子的产生可以通过标准已知技术(包括但不限于ELISA和/或基于抗体的检测方法)测量或评估。
在特定实施方案中，所述输出组合物的所述细胞具有与通过示例性、替代性过程(例如，其中未在mTOR抑制剂(例如化合物63)存在下培育细胞的过程)产生的输出细胞中响应于抗原刺激产生一种或多种细胞因子的细胞的部分、百分比和/或量相似的所述部分、百分比和/或量。在某些实施方案中，所述输出组合物的约或至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、 70％、75％、80％、90％、95％或100％的所述细胞响应于抗原刺激产生所述一种或多种细胞因子，例如TNF-α、IFN-γ和/或IL-2。在特定实施方案中，所述输出组合物中产生所述一种或多种细胞因子的细胞的部分、百分比和/或量比通过示例性、替代性过程产生的产生所述一种或多种细胞因子的输出细胞的部分、百分比和/或量高约或至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、 40％、45％、50％、75％、100％、125％、150％或1倍、2倍、3倍。在某些实施方案中，产生细胞因子的细胞的部分、百分比和/或量可以通过任何已知或标准技术(包括细胞内细胞因子染色(ICS)测定)来测量或评估。
在特定实施方案中，所述输出组合物的所述细胞具有与通过示例性、替代性过程(例如，其中未在mTOR抑制剂(例如化合物63)存在下孵育、工程化和/或培育细胞的过程)产生的输出细胞相似的针对表达由所述重组受体结合和/或识别的抗原的细胞(例如，靶细胞)的细胞溶解活性。在一些实施方案中，当所述输出组合物的所述细胞暴露于表达所述抗原的细胞(例如，靶细胞)时，所述输出组合物的所述细胞杀伤、杀伤约或杀伤至少25％、30％、 35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的表达所述抗原的细胞。在某些实施方案中，与在相似或相同条件下通过示例性替代性过程产生的输出细胞相比，所述输出组合物的所述细胞杀伤大至少25％、50％、75％、100％、150％或1倍、2倍、3倍、4倍或5倍的量的表达所述抗原的细胞(例如，靶细胞)。
在特定实施方案中，与通过示例性、替代性过程(例如，其中未在mTOR 抑制剂(例如化合物63)存在下培育细胞的过程)产生的输出细胞中表达一种或多种消耗标记的细胞的部分、百分比和/或量相比，所述输出组合物的所述细胞具有更低、减少和/或降低的所述部分、百分比和/或量。在某些实施方案中，所述输出组合物的少于或约40％、35％、30％、25％、20％、15％、 10％、5％、1％或0.1％的所述细胞表达一种或多种消耗标记。在某些实施方案中，所述输出组合物中表达一种或多种消耗标记的细胞的部分、百分比和 /或量比通过示例性、替代性过程产生的输出组合物中表达所述一种或多种标记的细胞的部分、百分比和/或量少或少至少10％、20％、30％、40％、50％、 60％、70％、80％或90％。在特定实施方案中，所述一种或多种消耗标记是或包括CTLA-4、FOXP3、PD-1、TIGIT、LAB-3、2B4、BTLA、TIM3、VISTA 和/或CD96。
在各种实施方案中，与通过示例性、替代性过程(例如，其中未在mTOR 抑制剂(例如化合物63)存在下培育细胞的过程)产生的输出细胞中分化的细胞的部分、百分比和/或量相比，所述输出组合物的所述细胞具有更低、减少和/或降低的所述部分、百分比和/或量。在某些实施方案中，与通过替代性方法产生的细胞相比，所述输出组合物的所述细胞分化程度较低。在特定实施方案中，与通过示例性、替代性过程产生的分化程度更高的细胞相比，所述输出组合物的分化程度更低的细胞具有或包括更大的刺激、激活、扩增、细胞因子应答、细胞溶解活性或抗肿瘤活性的能力。
在一些实施方案中，所提供的方法产生细胞的输出组合物，所述输出组合物中记忆样T细胞(如分化程度较低、长寿命的群体T细胞，如长寿命的记忆T细胞)的数量或百分比增加。在一些实施方案中，此类记忆T细胞是中枢记忆T细胞(TCM)或T记忆干细胞(TSCM)。在一些实施方案中，所述记忆T 细胞是TSCM细胞。在一些实施方案中，所述输出组合物的所述细胞具有增加或更大的具有记忆样表型的细胞(如长寿命的记忆T细胞)的数量或百分比。在一些实施方案中，与通过示例性、替代性过程(例如，其中未在mTOR抑制剂(例如化合物63)存在下培育细胞的过程)产生的输出细胞中记忆样T 细胞(如长寿命的记忆T细胞或记忆干细胞(TSCM))的数量或百分比相比，所述组合物中相应群体的数量或百分比增加至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、 7倍、8倍、9倍或10倍。
在某些实施方案中，将所述输出组合物的细胞给予至受试者。在一些实施方案中，给予所述输出组合物的细胞以治疗疾病或病症。在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症。在一些实施方案中，将所述输出组合物的细胞给予至受试者并且所述受试者经历癌细胞和/或肿瘤体积的减少。在一些实施方案中，例如，与给予之前的受试者中肿瘤细胞量和/或肿瘤体积相比，在给予所述输出组合物的细胞之后，所述受试者具有、具有约、具有至少25％、 50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％的癌细胞量减少和/或肿瘤减少。在一些实施方案中，与在给予通过示例性替代性过程(例如，其中未在mTOR抑制剂(例如化合物63)存在下培育细胞的过程)产生的输出细胞之后受试者中肿瘤体积和/或癌细胞量的减少相比，给予所述输出组合物的细胞导致受试者中肿瘤体积和/或癌细胞量的减少增加。在特定实施方案中，与在给予通过示例性替代性过程产生的输出细胞之后受试者中肿瘤体积和/或癌细胞量的减少相比，给予所述输出组合物的细胞导致受试者中肿瘤体积和/或癌细胞量的减少的如下增加：为、为约、或为至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、125％、 150％、1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。
在特定实施方案中，在给予后，所述输出组合物的所述细胞(例如表达重组受体的工程化细胞)在受试者中是可检测的，例如在从受试者获得的生物样品(如血清样品)中是可检测的。在某些实施方案中，在给予所述输出组合物的所述细胞后在或在至少1、2、3、4、5、6、7或8周时，或者在或在至少3、6、12、18、24、30或36个月时，或者在或在至少1、2、3、4、5年或更多年时，所述输出组合物的所述细胞在受试者中是可检测的。在一些实施方案中，与通过示例性替代性过程(例如，其中未在mTOR抑制剂(例如化合物63)存在下培育细胞的过程)产生的输出细胞相比，给予所述输出组合物的所述细胞导致给予后体内持久性增加或增强。在特定实施方案中，所述输出组合物的细胞的给予在受试者中可检测的时间比通过示例性替代性过程产生的输出细胞长、长约或长至少1、2、3、4、5、6、7或8周，或者长、长约或长至少3、6、12、18、24、30或36个月，或者长、长约或长至少1、2、 3年或更多年。
在一些实施方案中，将所述输出组合物的所述细胞给予至受试者(例如，患有疾病或病症(如癌症)的受试者)改善存活的概率和/或可能性。例如，在一些实施方案中，将所述输出组合物的所述细胞给予至患有疾病或病症的受试者，存活期超过、超过约或超过至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 或12个月，或者超过1、2、3、4、5、10年或多于10年的概率和/或可能性是至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在某些实施方案中，与给予示例性替代性过程(例如，其中未在mTOR抑制剂(例如化合物63) 存在下孵育、工程化和/或培育细胞的过程)的输出细胞相比，给予所述输出组合物的所述细胞提供了大至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、 70％、80％、90％、100％、125％、150％或至少1倍、2倍、3倍、4倍或5倍的存活的概率和/或可能性。
II.抑制MTOR活性的药剂
在一些实施方案中，在抑制mTOR活性的药剂存在下进行所提供的方法的一个或多个步骤。mTOR还被称为哺乳动物雷帕霉素靶标、雷帕霉素的机制靶标、FK506结合蛋白12-雷帕霉素复合物相关蛋白1、FKBP12-雷帕霉素复合物相关蛋白、雷帕霉素和FKBP12靶标1、雷帕霉素靶蛋白1、FRAP、 FRAP1、FRAP2、RAFT1和RAPT1。在一些方面，人mTOR蛋白对应于Uniprot 号：P42345。在一些实施方案中，人mTOR蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 34中所示。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂抑制、减少和/或降低，和/或能够抑制、减少和/或降低mTOR的至少一种活性。在特定实施方案中，抑制mTOR活性的药剂抑制、减少和/或降低，和/或能够抑制、减少和/或降低mTOR激酶活性。
在一些方面，mTOR是一种保守的苏氨酸和丝氨酸蛋白激酶，并且属于磷脂酰肌醇-3-激酶相关激酶(PIKK)家族。mTOR是一种蛋白激酶，其磷酸化其底物中的苏氨酸和丝氨酸残基。在某些方面，mTOR充当被称为mTOR 复合物1(mTORC1)和复合物2(mTORC2)的两种多蛋白复合物的催化亚基。在特定方面，尽管如下事实：在某些方面，mTORC1和mTORC2两者均参与磷酸肌醇-3激酶(PI3K)和Akt信号传导途径，但mTORC1和mTORC2 的功能彼此独立。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂抑制、减少和/ 或降低，和/或能够抑制、减少和/或降低mTORC1活性(例如mTORC1激酶活性)和/或mTORC2活性。
在一些方面，mTORC1是具有五种组分的蛋白质复合物：mTOR，它是复合物的催化亚基；mTOR的调节相关蛋白(Raptor)；哺乳动物致死Sec13 蛋白8(mLST8，也称为GβL)；富含脯氨酸的AKT底物40kDa(PRAS40)；以及含有DEP结构域的mTOR相互作用蛋白(Deptor)。在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂防止mTORC1复合物的形成和/或使mTORC1复合物不稳定。
在某些方面，mTORC2包含六种不同的蛋白质，其中几种是mTORC1和 mTORC2所共有的：mTOR；mTOR的雷帕霉素不敏感性伴随物(Rictor)；哺乳动物应激激活的蛋白激酶相互作用蛋白(mSIN1)；用Rictor-1观察到的蛋白质(Protor-1)；mLST8；和Deptor。在特定实施方案中，抑制活性的药剂防止mTORC2复合物的形成和/或使mTORC2复合物不稳定。
在一些实施方案中，抑制mTOR活性的药剂是抑制、减少、预防，和/ 或能够抑制、减少或预防mTOR的一种或多种活性的化合物、小分子(例如小有机分子)、多核苷酸、寡核苷酸、siRNA、多肽或其片段、亚型、变体、类似物或衍生物。在一些实施方案中，所述药剂是小分子。在特定实施方案中，所述药剂是分子量小于10kD、小于9kD、小于8kD、小于7kD、小于6kD、小于5kD、小于4kD、小于3kD、小于2kD、小于1kD、小于0.5kD或小于0.1kD的小分子。在一些实施方案中，所述药剂是小分子，所述小分子是或含有核酸、肽、多肽、拟肽、类肽、碳水化合物、脂质、其组分或其他有机或无机分子。化学和/或生物混合物(如真菌、细菌或藻类提取物)的文库在本领域中是已知的，并且可以用本发明的任何测定进行筛选。合成分子文库的方法的例子可见于：(Carell等人,1994a；Carell等人,1994b；Cho等人, 1993；DeWitt等人,1993；Gallop等人,1994；Zuckermann等人,1994)。
在特定实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂特异性地和/或选择性地抑制至少一种mTOR活性。在各种实施方案中，抑制mTOR活性的该药剂抑制mTOR蛋白的至少一种活性，例如像丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶对至少一种其底物(例如p70S6激酶1、4E-BP1、Akt和eEF2)的活性。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂直接结合至并抑制，和/或能够直接结合至并抑制 mTORC1、mTORC2，或mTORC1和mTORC2两者。在一些实施方案中，所述药剂对mTOR活性的抑制是不可逆的。在某些实施方案中，所述药剂对 mTOR活性的抑制是可逆的。
在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂的IC50小于500μM、小于200μM、小于100μM、小于50μM、小于10μM、小于5μM、小于1μM、小于500nM、小于200nM、小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM或小于500pM。在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂的 IC50在1nM与500μM之间、在1nM与500nM之间、在1μM与500μM之间、在10μM与100μM之间、在100nM与1μM之间、在250nM与750nM之间、在50nM与200nM之间、或在400nM与600nM之间。在一些实施方案中，IC50确定可以使用任何已知标准和/或常规技术完成。例如，在一些实施方案中， IC50可以通过在所研究的一系列浓度的抑制剂存在下测量mTOR活性来确定。然后将实验获得的酶活性值针对所使用的抑制剂浓度来绘图。将显示 50％酶活性的抑制剂浓度(与不存在任何抑制剂的情况下的活性相比)作为“IC50”值。类似地，其他抑制浓度可以通过活性的适当确定来定义。在一些实施方案中，在无细胞测定中测量IC50。在特定实施方案中，在细胞培养测定中测量IC50。在某些实施方案中，细胞培养是T细胞培养，例如原代T细胞培养。
在一些实施方案中，可以通过mTORC1和/或mTORC2下游的信号转导的减少来确定对mTORC1和/或mTORC2活性的抑制。可以利用多种读数来建立这种信号传导途径的输出的减少。例如，在一些实施方案中，对于mTORC2 活性的非限制性示例性读数包括(1)Akt在残基(包括但不限于S473和T308) 处的磷酸化的降低，和/或(2)Akt激活的降低，如例如通过Akt底物的磷酸化的降低来证明的，所述Akt底物包括但不限于Fox01和Fox03a T24/32、GSK3-β S21/9和TSC2 T1462。在某些实施方案中，mTORC1活性的非限制性示例性读数包括mTORC1下游的信号传导分子的磷酸化的降低，所述信号传导分子包括但不限于核糖体S6S240/244、S6K1 T389和4EBP1 T37/46。在某些实施方案中，mTORC1和/或mTORC2抑制的示例性读数是对癌细胞增殖的抑制。
可以通过任何已知的手段进行对具有位点特异性磷酸化的蛋白质的测量、检测和/或评估，所述手段包括但不限于抗体染色技术和免疫测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、表面等离子体共振(SPR)、蛋白质印迹或蛋白质阵列。
在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂还可以抑制与mTOR在结构上相似和/或具有与mTOR相同或基本上相似的活性的激酶(泛抑制剂)。在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂还抑制磷酸肌醇-3激酶 (PI3K)活性。在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂抑制mTORC1 活性、mTORC2活性和PI3K活性。在特定实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂抑制mTORC1、mTORC2和PI3K的激酶活性。在特定方面，可以利用多种读数来确立PI3K活性的减少。在一些实施方案中，此类读数包括但不限于(1)Akt在残基(包括但不限于S473和T308)处的磷酸化的降低，和/或(2) Akt激活的降低，如例如通过Akt底物的磷酸化的降低来证明的，所述Akt底物包括但不限于Fox01和Fox03a T24/32、GSK3-βS21/9和TSC2T1462，和/ 或(3)磷脂酰肌醇(3,4,5)三磷酸(PIP3)的量、水平或浓度的减少。
在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性(例如，mTORC1和/或mTORC2 激酶活性)的药剂还抑制PI3K。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂抑制PI3K、mTORCl和mTORC2的活性，其IC50(抑制50％活性的浓度) 小于500μM、小于200μM、小于100μM、小于50μM、小于10μM、小于5μM、小于1μM、小于500nM、小于200nM、小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM或小于500pM。在某些实施方案中，所述抑制mTOR 活性的药剂抑制PI3K、mTORCl和mTORC2的活性，其IC50在1nM与500μM 之间、在1nM与500nM之间、在1μM与500μM之间、在1nM与1μM之间、在10μM与100μM之间、在100nM与1μM之间、在250nM与750nM之间、在50nM与200nM之间、或在400nM与600nM之间。在一些实施方案中，在无细胞测定中测量IC50。在特定实施方案中，在细胞培养测定中测量IC50。在某些实施方案中，细胞培养是T细胞培养，例如原代T细胞培养。在某些实施方案中，此类药剂包括但不限于PI-103、SF1126(Semafore)、BGT226(Novartis)、XL765(Exelixis)、PF-04691502和NVP-BEZ235(Novartis)。在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是PI-103、SF1126、BGT226、 XL765、PF-04691502和NVP-BEZ235。
在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂不抑制PI3K活性。在某些实施方案中，所述药剂在针对mTOR活性的IC50下不可检测地减少、抑制或降低PI3K活性。在特定实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂具有的针对PI3K活性的IC50比针对mTOR活性的IC50大至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少150％、至少1 倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍或至少100 倍。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂相对于PI3K活性抑制，例如选择性地抑制mTORC1和mTORC2激酶活性。在某些实施方案中，mTOR 活性的抑制剂是吡唑并嘧啶、Torinl、Torkinib(PP242)、PP30、Ku-0063794、 WAY-600(Wyeth)、WAY-687(Wyeth)、WAY-354(Wyeth)或AZD8055。
在特定实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂选择性地抑制mTORC1，其IC50小于500μM、小于200μM、小于100μM、小于50μM、小于10μM、小于5μM、小于1μM、小于500nM、小于200nM、小于100nM、小于50nM、小于10nM、小于5nM、小于1nM或小于500pM。在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂抑制mTORC1的活性，其IC50在1nM与500μM之间、在1nM与500nM之间、在1μM与500μM之间、在10μM与100μM之间、在 100nM与1μM之间、在250nM与750nM之间、在50nM与200nM之间、或在400nM与600nM之间。在一些实施方案中，在无细胞测定中测量IC50。在特定实施方案中，在细胞培养测定中测量IC50。在某些实施方案中，细胞培养是T细胞培养，例如原代T细胞培养。
在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂相对于mTORC2和/或 PI3K活性选择性地抑制mTORC1活性。在某些实施方案中，所述抑制mTOR 活性的药剂具有的针对PI3K活性的IC50比针对mTORC1活性的IC50大至少 50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少50倍或至少100倍。在一些实施方案中，所述药剂是雷帕霉素 (西罗莫司)。在特定实施方案中，所述药剂是雷帕霉素类似物(rapalog)。
在某些实施方案中，雷帕霉素类似物结合至和/或能够结合至mTOR FRB 结构域(FKBP雷帕霉素结合结构域)，在结构上与雷帕霉素相关，和/或保留雷帕霉素的mTORC1抑制特性。在一些实施方案中，雷帕霉素类似物是雷帕霉素的酯、醚、肟和/或羟胺，和/或是雷帕霉素核心结构上的官能团已经例如通过还原或氧化被修饰的化合物。此类化合物的药学上可接受的盐也被认为是雷帕霉素衍生物。适合于在本文设想的方法中使用的雷帕霉素类似物的例示性例子包括但不限于替西罗莫司(CC1779)、依维莫司(RAD001)、地弗莫司(AP23573)、AZD8055(AstraZeneca)和OSI-027(OSI)。
在一些实施方案中，所述药剂是描述于以下专利中的分子：PCT公开号： WO2008/051493；WO2008/051494；或WO2010/062571；和/或美国专利号： 7,981,893；8,372,976；7,968,556；8,383,634；8,110,578；或8,492,381，所有所述专利通过引用并入本文。
在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂具有或包括式(I)中所示的式：
Figure BDA0002556467450000911
其中R1是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，R2是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，并且 R3和R4独立地是H或C1-8烷基。
在一些实施方案中，所述抑制mTOR的药剂是或包括式(I)的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，所述抑制mTOR的药剂是或包括式(I)的化合物，其中R1是取代的芳基、取代或未取代的杂芳基，如取代的苯基。在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是或包括式(I)的化合物，其中R2是取代或未取代的芳基，如取代或未取代的苯基。在特定实施方案中，所述抑制mTOR的药剂是或包括式(I)的化合物，其中取代的基团是被一个或多个如下基团取代：卤素；C1-8烷基；C2-8烯基；C2-8炔基；羟基；C1-8烷氧基；氨基；硝基；硫醇；硫醚；亚胺；氰基；酰胺基；膦酸基；膦；羧基；硫代羰基；磺酰基；磺酰胺；酮；醛；酯；羰基；卤代烷基；B(OH)2；碳环环烷基；杂环烷基；单环或稠合或非稠合多环芳基或杂芳基；氨基；O-低级烷基；O-芳基；芳基；芳基-低级烷基；CO2CH3；CONH2； OCH2CONH2；NH2；SO2NH2；OCHF2；CF3；或OCF3基团，其中这些基团中的每一个是任选取代的。
在一些实施方案中，所述具有或包括式(I)中所示的式的药剂是化合物 63。在特定实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是化合物63。在一些方面，化合物63是2-(3-羟基苯基)-9-(2-异丙基苯基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6- 甲酰胺。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是2-(3-羟基苯基)-9-(2-异丙基苯基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-甲酰胺、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在特定方面，化合物63具有式：
Figure BDA0002556467450000921
在特定实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂具有或包括式(II)中所示的式：
Figure BDA0002556467450000931
其中L是直接键、NH或O，
Y是N或CR3，
其中R1是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的C2-8烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，
R2是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，
R3是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、-NHR4或 -N(R4)2，并且
R4在每次出现时独立地是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基。
在一些实施方案中，所述抑制mTOR的药剂是或包括式(II)的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂具有或包括式(II)中所示的式，其中R1是取代的芳基，如取代的苯基。在特定实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂具有或包括式(II)中所示的式，其中Y是CH。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂具有或包括式(II)中所示的式，其中L是直接键。在特定实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂具有或包括式(II)中所示的式，其中R1是取代或未取代的芳基并且R2是被一个或多个选自以下的取代基取代的C1-8烷基：烷氧基、氨基、羟基、环烷基或杂环烷基。
在某些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂具有或包括式(II)中所示的式，其中基团是“取代或未取代的”，当取代时，它们可以被一个或多个任何取代基取代。取代基的例子是在本文公开的示例性化合物和实施方案中发现的那些，以及卤代(例如，氯、碘、溴或氟)；C1-8烷基；C2-8烯基；C2-8炔基；羟基；C1-8烷氧基；氨基；硝基；硫醇；硫醚；亚胺；氰基；酰胺基；膦酸基；膦；羧基；氨基甲酰基；氨基甲酸酯；乙缩醛；脲；硫代羰基；磺酰基；磺酰胺；亚磺酰基；酮；醛；酯；乙酰基；乙酰氧基；氧(＝O)；卤代烷基(例如三氟甲基)；取代的氨基酰基和氨基烷基；碳环环烷基，其可以是单环或稠合或非稠合多环(例如，环丙基、环丁基、环戊基或环己基)；或杂环烷基，其可以是单环或稠合或非稠合多环(例如，吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、呋喃基或噻嗪基)；碳环或杂环、单环或稠合或非稠合多环芳基(例如、苯基、萘基、吡咯基、吲哚基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、噻唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基、吖啶基、吡嗪基、哒嗪基、嘧啶基、苯并咪唑基、苯并噻吩基或苯并呋喃基)；氨基(伯氨基、仲氨基或叔氨基)；-O-低级烷基；-O-芳基；芳基；芳基-低级烷基；CO2CH3；CONH2；OCH2CONH2；NH2；N(C1-4烷基)2； NHC(O)C1-4烷基；SO2NH2；SO2C1-4烷基；OCHF2；CF3；OCF3；并且此类部分也可以任选地被稠环结构或桥(例如-OCH2O-或-O-低级亚烷基-O-)取代。这些取代基可以任选地被选自此类基团的取代基进一步取代。
在特定实施方案中，所述具有或包括式(II)中所示的式的药剂是化合物155。在特定实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是化合物155。在一些方面，化合物155是6-(4-(2H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)-1-(2-(四氢-2H-吡喃-4- 基)乙基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪-2(3H)-酮。在一些方面，所述抑制mTOR活性的药剂是6-(4-(2H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)-1-(2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)-1H- 咪唑并[4,5-b]吡嗪-2(3H)-酮、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在特定方面，化合物155具有式：
Figure BDA0002556467450000941
在特定实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂具有或包括式(III)中所示的式：
Figure BDA0002556467450000951
其中R1是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基或取代或未取代的杂环基烷基， R2是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳烷基或取代或未取代的环烷基烷基，并且
R3是H，或取代或未取代的C1-8烷基。
在一些实施方案中，所述抑制mTOR的药剂是或包括式(III)的化合物、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂具有或包括式(III)中所示的式，其中R1是取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基，例如像，R1是苯基、吡啶基、嘧啶基、苯并咪唑基、 1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基、吲唑基、吲哚基、1H-咪唑并[4,5-b]吡啶基、1H- 咪唑并[4,5-b]吡啶-2(3H)-酮基、3H-咪唑并[4,5-b]吡啶基或吡唑基，各自任选地被取代。在特定实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂具有或包括式(III) 中所示的式，其中R1是被一个或多个独立地选自以下的取代基取代的苯基：取代或未取代的C1-8烷基(例如，甲基)、取代或未取代的杂环基(例如，取代或未取代的三唑基或吡唑基)、氨基羰基、卤素(例如，氟)、氰基、羟烷基和羟基。在其他实施方案中，R1是被一个或多个独立地选自以下的取代基取代的吡啶基：取代或未取代的C1-8烷基(例如，甲基)、取代或未取代的杂环基(例如，取代或未取代的三唑基)、卤素、氨基羰基、氰基、羟基烷基 (例如，羟基丙基)、-OR和-NR2，其中每个R独立地是H，或取代或未取代的C1-4烷基。在一些实施方案中，R1是1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基或苯并咪唑基，任选地被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：取代或未取代的C1-8烷基和-NR2，其中R独立地是H，或取代或未取代的C1-4烷基。
在一些实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂具有或包括式(III)中所示的式，其中R1是
Figure BDA0002556467450000961
其中R在每次出现时独立地是H、或取代或未取代的C1-4烷基(例如，甲基)； R1在每次出现时独立地是取代或未取代的C1-4烷基(例如，甲基)、卤素(例如，氟)、氰基、-OR或-NR2；m是0-3；并且n是0-3。应理解，任何取代基 R'可以附接至稠环体系中任何环的任何合适原子。
在式(III)的化合物的一些实施方案中，R2是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的C1-4烷基-杂环基、取代或未取代的C1-4烷基-芳基或取代或未取代的C1-4烷基-环烷基。例如，R2是H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、环戊基、环己基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、 (C1-4烷基)-苯基、(C1-4烷基)-环丙基、(C1-4烷基)-环丁基、(C1-4烷基)-环戊基、 (C1-4烷基)-环己基、(C1-4烷基)-吡咯烷基、(C1-4烷基)-哌啶基、(C1-4烷基)-哌嗪基、(C1-4烷基)-吗啉基、(C1-4烷基)-四氢呋喃基或(C1-4烷基)-四氢吡喃基，各自任选地被取代。
在某些实施方案中，R2是H、C1-4烷基、(C1-4烷基)(OR)、
Figure BDA0002556467450000962
其中R在每次出现时独立地是H、或取代或未取代的C1-8烷基，R'在每次出现时独立地是H、-OR、氰基或取代或未取代的C1-8烷基，并且p是0-3。
在特定实施方案中，所述具有或包括式(III)中所示的式的药剂是化合物246。在特定实施方案中，所述抑制mTOR活性的药剂是化合物246。在一些方面，化合物246是7-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-3-基)-1-((1r,4r)-4-甲氧基环己基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮。在一些方面，所述抑制mTOR活性的药剂是7-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-3-基)-1-((1r,4r)-4-甲氧基环己基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。在特定方面，化合物246具有式：
Figure BDA0002556467450000971
III.用于长期刺激的方法
本文提供了长期刺激方法(本文也称为用于长期刺激的方法)，所述长期刺激方法尤其可用于评估细胞组合物(例如一种细胞组合物)的表型、特征或活性。在一些实施方案中，长期刺激方法是或包括在刺激细胞中的重组受体依赖性活性(例如CAR依赖性活性)的条件下孵育含有表达重组受体(如 CAR)的细胞的细胞组合物，例如输入组合物。在此类实施方案中，重组受体依赖性活性是对重组受体(例如CAR)的刺激(如通过由重组受体(例如CAR)的抗原结合结构域识别的抗原或其他药剂的存在)具有特异性或者特异性地刺激重组受体的活性。在一些方面，细胞组合物(例如输入组合物) 含有表达重组受体(例如CAR)的T细胞，所述重组受体包含特异性地结合或识别抗原的细胞外抗原结合结构域。在一些方面，所述孵育产生T细胞组合物(例如输出组合物)，其含有展现出长期刺激细胞的特征或具有延长抗原暴露的细胞的特征的细胞。
在某些实施方案中，刺激重组受体活性(例如CAR依赖性活性)的条件包括将细胞组合物(例如输入组合物)与结合分子(例如，与重组受体(例如CAR)的抗原结合结构域结合，例如特异性结合的结合分子)一起孵育。在某些实施方案中，将结合分子附接至支持物。在特定实施方案中，支持物是固体支持物，如细胞培养板或培养皿的表面、微板中的孔或颗粒或珠的表面。在一些方面，所述孵育在表面附接结合分子的微板、细胞培养板或培养皿中，或者在微板中的孔中发生或进行。在一些方面，所述孵育在含有结合分子的多个颗粒或珠存在下发生或进行。在某些方面，结合分子表面附接至珠或颗粒。在一些实施方案中，孵育是在体外或离体执行或进行的。
在各种实施方案中，在不含促进细胞分裂、生长、扩增或激活的另外的药剂的培养基存在下，将细胞(例如，输入组合物的细胞)与结合分子一起孵育。在一些实施方案中，在没有任何另外的操作(例如培养基更换、珠替换、或分割或再铺板细胞)的情况下，将细胞与颗粒一起孵育延长的时间量 (例如14天)。在某些方面，
在一些方面，所述长期刺激方法包括在结合或识别重组受体的结合分子存在下孵育输入组合物，例如含有重组受体表达细胞组合物的细胞组合物。在一些方面，为孵育选择的时间长度是在孵育终止或结束时组合物细胞的一种或多种功能或活性展现出长期刺激的细胞的特征或具有延长的抗原暴露的细胞的特征的时间。在一些实施方案中，结合分子是由重组受体结合或识别的抗原(例如重组抗原或其片段)。在某些实施方案中，结合分子是结合至或识别重组受体的抗ID。在一些实施方案中，此类特征可以包括活力、活性或持久性降低或者消耗或分化增加的证据。
在某些实施方案中，本文提供的长期刺激方法尤其可用于鉴定当在体内给予时可能具有期望的特征(如维持或延长的持久性、活力或活性)的细胞组合物。在一些实施方案中，对两种或更多种不同的细胞组合物进行所述测定，以鉴定可以增强或延长持久性、活性或活力、或者减少消耗或分化的差异。在一些实施方案中，此类差异可以包括但不限于生产过程的各个方面，如在工程化过程的一个或多个步骤或程序期间药剂(例如抑制mTOR激酶活性的药剂)的存在。
在特定实施方案中，在两种或更多种细胞组合物中进行所述长期刺激方法，以鉴定增加或维持活力、活性或持久性或者增加或维持指示活力、活性或持久性增加的标记(例如生物标记)表达的药剂。在某些实施方案中，在两种或更多种细胞组合物中进行所述长期刺激方法，以鉴定在细胞组合物中的减少或阻止消耗或分化(例如，分化成衰老状态)或者减少指示消耗或分化增加的标记的表达的差异。在一些实施方案中，将结合分子缀合或附接至固体表面，如细胞培养板或培养皿的表面。在特定实施方案中，将结合分子缀合或附接至颗粒(例如珠)。
在某些实施方案中，所述用于长期刺激的方法是或包括在含有结合分子 (例如结合至或识别重组受体的结合分子)的颗粒(例如珠)存在下孵育细胞的步骤。
在一些实施方案中，结合分子是由重组受体识别或结合的抗原(例如重组抗原或其片段)。在某些实施方案中，抗原是与疾病(例如癌症)相关的多肽或多肽的部分。在一些实施方案中，抗原是在与疾病相关的细胞(例如癌细胞和/或肿瘤细胞)的表面上表达的多肽或多肽的变体或片段。
在一些实施方案中，抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、 CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III 型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿 AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2 (OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、 Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM 的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、 MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2 (TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms 肿瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，所述抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、 CD79a、CD79b或CD30。在一些实施方案中，抗原是或包括重组BCMA、 CD19、CD22或ROR1。
在一些实施方案中，抗ID是特异性地识别作为重组受体的细胞外抗原结合结构域的一部分的靶抗体或抗原结合片段(例如scFv)的抗独特型抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，重组受体的抗原结合结构域含有与靶抗原结合的抗体或抗原结合片段(例如scFv)，所述靶抗原如与疾病或病症(例如癌症)相关或在所述疾病或病症的细胞或组织上表达的靶抗原。在一些实施方案中，抗ID是特异性地识别结合以下的靶抗体或抗原结合片段的抗独特型抗体或其抗原结合片段：αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原 (BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1 (CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、 CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III 型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5 (FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿 AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2 (OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、 Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM 的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、 MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原 (PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms 肿瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，所述抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、 CD79a、CD79b或CD30。在一些实施方案中，抗ID与抗CD19 CAR的抗原结合结构域结合。
在一些实施方案中，颗粒(例如，珠)在磁场中反应。在一些实施方案中，颗粒是磁性颗粒(例如，磁珠)。在一些实施方案中，磁性颗粒是顺磁性的。在特定实施方案中，磁性颗粒是超顺磁性的。在某些实施方案中，颗粒(例如珠)不显示任何磁特性，除非它们暴露于磁场。在一些实施方案中，颗粒或珠的直径在或在约1μm与10μm之间并包括端值。在特定实施方案中，颗粒(例如珠)具有为或约2.8μm的平均直径。在一些实施方案中，颗粒(例如珠)具有为或约4.8μm的直径。
在特定实施方案中，将细胞或细胞的输入组合物与结合分子(例如，含有结合分子的颗粒或珠)一起孵育以下时间：为、为约、或为至少10天、11 天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天。在各种实施方案中，将细胞或细胞的组合物与结合分子(例如含有结合分子的颗粒或珠)一起孵育以下时间：在或在约10天与21天之间、12天与18天之间、或14天与16天之间并包括端值。在某些实施方案中，将细胞与结合分子(例如含有结合分子的颗粒或珠)一起孵育以下时间：为、为约或为至少14天。在特定实施方案中，在高于室温的温度下将细胞组合物的细胞与结合分子 (例如含有结合分子的颗粒或珠)一起孵育。在一些实施方案中，所述孵育是在高于约25℃(例如通常高于或高于约32℃、35℃或37℃)的温度下进行。在一些实施方案中，所述处理、孵育或接触是在为或为约37℃±2℃的温度下，例如在为或为约37℃的温度下进行。
在一些实施方案中，在不含促进细胞(例如T细胞)分裂、生长、扩增或激活的另外的药剂的培养基存在下，将细胞与结合分子一起(例如，与含有结合分子的颗粒或珠一起)孵育。在一些实施方案中，在不存在任何重组细胞因子的情况下，将细胞与结合分子一起孵育。在某些实施方案中，所述孵育在没有中断的情况下连续地进行。在某些实施方案中，所述孵育在静态条件下发生。在特定实施方案中，所述孵育在没有任何灌注、混合、摇摆或摇动的情况下发生。在一些方面，在整个孵育期间存在结合分子。在某些实施方案中，在孵育期间不更换或替换结合分子。特定的实施方案设想，因为在一些方面，培养基不含有任何重组细胞因子，并且因此在孵育期间存在于培养基中的细胞因子是由细胞例如响应于细胞的重组受体与颗粒的结合分子之间的相互作用而产生的。
在一些实施方案中，结合分子的量(例如，含有结合分子的颗粒或珠的量)足以提供每细胞在或在约1个与1012个之间的结合分子，如在或在约102个与1010个之间的结合分子、103个与108个之间的结合分子、104个与106个之间的结合分子、1个至102个之间的结合分子、在102个与103个之间的结合分子、103个与104个之间的结合分子、104个与105个之间的结合分子、105个与 106个之间的结合分子、105个与106个之间的结合分子、106个与107个之间的结合分子、107个与108个之间的结合分子、或109个与1010个之间的结合分子，并包括端值。在一些实施方案中，结合分子的量(例如，含有结合分子的颗粒或珠的量)是足以提供对于每个细胞而言在104个与约106个之间并包括端值的结合分子的量。在一些实施方案中，颗粒(例如珠)的量含有对于每个细胞而言约105个结合分子。
在一些实施方案中，将输入组合物与含有结合分子的颗粒(例如珠)以如下总细胞与颗粒(例如珠)的比率一起孵育：在或在约10:1与1:10、5: 1与1:5、3:1与1:3、或2:1与1:2之间，每一个均包括端值。在特定实施方案中，所述比率是或是在或在约1:0.2与1:5之间并包括端值。在一些实施方案中，输入组合物的总细胞与颗粒(例如珠)的比率为约1:1。
在一些实施方案中，可以将所提供的测定用于比较不同的细胞或细胞组合物。例如，在一些实施方案中，可以通过将细胞与结合或识别重组受体的相同结合分子(例如含有相同结合分子的颗粒或珠)一起孵育来比较各自含有表达相同重组受体(例如相同CAR)的细胞的两种或更多种细胞组合物。在某些实施方案中，在不同的药剂(例如抑制mTOR激酶活性的药剂)存在下生成两种或更多种细胞组合物。在特定实施方案中，可以将细胞组合物与对照或参考细胞组合物进行比较。在一些方面，对照或参考细胞组合物可以包括但不限于不经历任何孵育的细胞组合物、未在含有结合分子的颗粒(例如珠)存在下孵育的细胞组合物、不含有表达重组受体的细胞的细胞组合物、由不同的工程化过程生成的细胞组合物、和/或在媒介物或对照化合物存在下工程化的细胞组合物。
在特定实施方案中，可以通过将细胞与结合或识别不同重组受体的结合分子一起(例如与含有不同结合分子的颗粒(例如珠)一起)孵育来比较各自含有表达不同重组受体(例如不同CAR)的细胞的两种或更多种细胞组合物。
在一些实施方案中，在孵育期间的不同时间点评估细胞。例如，在一些方面，在中间时间点(例如在孵育的为、为约或至少5％、10％、20％、25％、 30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％完成发生的时间点)评估来自一种或多种细胞组合物的细胞的表型、特征或活性。在某些实施方案中，在孵育期间对细胞评估一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或超过十次。在某些实施方案中，在孵育期间按不同间隔(例如为、为约或为至少6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、48小时、1天、 2天、3天、4天、5天、6天、7天、或8天的间隔)评估细胞。在一些实施方案中，每天对细胞进行评估。在一些实施方案中，每三天对细胞进行评估。在某些实施方案中，每7天对细胞进行评估。
在某些实施方案中，评估细胞(例如，输出组合物的细胞)的活性(例如抗原模拟活性)、表型或特征。在一些实施方案中，在所述用于长期刺激的方法期间或之后(例如在与含有结合分子的颗粒(例如珠)一起孵育期间或之后)评估细胞组合物的细胞中的抗原刺激活性。在特定实施方案中，将评估结果与在来自不同细胞组合物(例如对照或参考细胞组合物)的细胞中测量的相同或相似活性的评估进行比较。
在一些实施方案中，活性是抗原刺激活性。特定的实施方案设想可以通过许多已知合适技术中的任何一种来评估细胞(如表达重组受体的T细胞) 的抗原刺激活性。在一些实施方案中，通过细胞内细胞因子染色来测量、检测和/或定量一种或多种细胞因子的产生。在一些方面，通过流式细胞术的细胞内细胞因子染色(ICS)是非常适合于在单细胞水平上研究细胞因子产生的一种技术。在某些方面，ICS可用于检测在细胞刺激(例如用抗原表达细胞或具有缀合的抗原的颗粒(例如珠颗粒))后细胞因子在内质网内的产生和累积，从而允许鉴定对于特定细胞因子的产生呈阳性或阴性的细胞群，或者允许基于阈值分离高产细胞与低产细胞。ICS还可以与其他流式细胞术方案结合用于使用细胞表面标记(例如CD4或CD8)进行免疫表型分析，以获得特定细胞亚组中的细胞因子产生。用于测量或检测细胞因子产生的其他单细胞技术包括但不限于ELISPOT、有限稀释和T细胞克隆。
在一些实施方案中，抗原刺激活性是一种或多种细胞因子的产生。可以响应于抗原刺激而产生的细胞因子可以包括但不限于IL-1、IL-1β、IL-2、 sIL-2Ra、IL-3、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL 27、IL-33、 IL-35、TNF、TNFα、CXCL2、CCL2、CCL3、CCL5、CCL17、CCL24、PGD2、 LTB4、干扰素γ(IFN-γ)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1a、MIP-1b、Flt-3L、分形趋化因子和/或IL-5。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-2、IFN-γ或TNF-α中的一种或多种。在一些实施方案中，在与抗原表达细胞共培养之后或在孵育含有附接的抗原或抗原片段的颗粒(例如珠)之后，通过测量、检测或定量细胞外细胞因子的量或浓度来评估细胞因子分泌。
在特定实施方案中，抗原刺激活性是细胞溶解(细胞毒性)活性。在一些实施方案中，通过使组合物的细胞(例如表达重组受体的细胞)与表达由重组受体识别的抗原或表位的靶细胞暴露、一起孵育和/或接触来评估细胞溶解活性。可以通过直接或间接测量随时间的靶细胞数量来测量细胞溶解活性。例如，可以在与重组受体表达细胞一起孵育之前将靶细胞与可检测标记 (当靶细胞被裂解时可检测的这样的标记、或仅在存活的靶细胞中可检测的可检测标记)一起孵育。这些读数提供直接或间接的靶细胞数量和/或靶细胞死亡，并且可以在测定期间的不同时间点进行测量。靶细胞数量的减少和/ 或靶细胞死亡的增加指示细胞的细胞溶解活性。用于进行细胞溶解测定的合适的方法在本领域中是已知的，并且包括但不限于铬-51释放测定、非放射性铬测定、使用荧光染料(如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)、PKH-2和 PKH-26)的流式细胞术测定。
在某些实施方案中，在测定期间或之后(例如在与含有结合受体的颗粒 (例如珠)一起孵育期间或之后)，评估细胞组合物的细胞(例如表达重组受体的细胞)的一种或多种特征或表型。在一些实施方案中，所述一种或多种特征或表型是激活、消耗或分化中的一种或多种，或者与激活、消耗或分化中的一种或多种有关。在某些实施方案中，通过测量、检测或定量一种或多种标记(例如生物标记)的存在、不存在、量或水平来评估所述一种或多种表型或特征。
在一些实施方案中，标记(例如与激活、消耗或分化正相关或负相关的标记)的表达是或包括评估、测量、确定和/或定量标记在样品中的水平、量或浓度。在某些实施方案中，标记是基因产物，例如使用由基因编码的信息组装、生成和/或合成的任何生物分子，并且可以包括多核苷酸和/或多肽。在某些实施方案中，标记的水平、量或浓度可以转换(例如，归一化)或直接分析(例如，原始的)。在一些实施方案中，标记是蛋白质。在某些实施方案中，标记是由基因编码的多核苷酸(例如mRNA)或蛋白质。
在特定实施方案中，可以通过任何合适的已知手段来评估、测量、确定和/或定量作为多核苷酸的标记的量或水平。例如，在一些实施方案中，可以通过如下方法来评估、测量、确定和/或定量多核苷酸标记的量或水平：聚合酶链反应(PCR)，包括逆转录酶(rt)PCR、微滴数字PCR、实时和定量PCR 方法(包括，例如
Figure BDA0002556467450001051
分子信标、LIGHTUPTM、SCORPIONTM、
Figure BDA0002556467450001052
参见，例如美国专利号5,538,848；5,925,517；6,174,670； 6,329,144；6,326,145和6,635,427)；RNA印迹；例如逆转录产物和衍生物的DNA印迹；基于阵列的方法，包括印迹阵列、微阵列或原位合成阵列；以及测序，例如合成测序、焦磷酸测序、双脱氧测序或连接测序；或本领域中已知的任何其他方法，如Shendure等人,Nat.Rev.Genet.5:335-44(2004)或 Nowrousian,Euk.Cell 9(9):1300-1310(2010)中讨论的，包括如
Figure BDA0002556467450001061
Figure BDA0002556467450001062
454、
Figure BDA0002556467450001063
和
Figure BDA0002556467450001064
测序的特定平台。在特定实施方案中，核酸基因产物的水平通过qRT-PCR来测量。在一些实施方案中，qRT-PCR针对每个基因使用三个核酸组，其中所述三个核酸包含一个引物对连同在所述引物结合的靶核酸区域之间结合的探针—商业上称为
Figure BDA0002556467450001065
测定。
在特定实施方案中，同时测量或评估两种或更多种多核苷酸标记的表达。在某些实施方案中，多重PCR(例如多重rt-PCR)评估、测量、确定和/ 或定量两种或更多种基因产物的水平、量或浓度。在一些实施方案中，将微阵列(例如，
Figure BDA0002556467450001066
和
Figure BDA0002556467450001067
式阵列)用于评估、测量、确定和/或定量两种或更多种基因产物的水平、量或浓度。在一些实施方案中，将微阵列用于评估、测量、确定和/或定量源自RNA基因产物的cDNA多核苷酸的水平、量或浓度。
在一些实施方案中，通过对标记mRNA或源自标记mRNA的cDNA多核苷酸进行测序来确定一种或多种多核苷酸标记的表达。在一些实施方案中，通过非Sanger测序方法和/或下一代测序(NGS)技术进行测序。下一代测序技术的例子包括但不限于大规模平行标记测序(MPSS)、Polony测序、焦磷酸测序、可逆染料终止子测序、SOLiD测序、离子半导体测序、DNA纳米球测序、Helioscope单分子测序、单分子实时(SMRT)测序、单分子实时(RNAP) 测序和纳米孔DNA测序。
在特定实施方案中，标记是蛋白质或其片段。在某些实施方案中，通过本领域已知的任何合适手段来测量一种或多种蛋白质标记。评估、测量、确定和/或定量一种或多种蛋白质标记的水平、量或浓度的合适方法包括但不限于用免疫测定进行检测、基于核酸或基于蛋白质的适体技术、HPLC(高精度液相色谱)、肽测序(例如Edman降解测序或质谱(如MS/MS)，任选地与 HPLC偶联)、以及任何前述项的微阵列适应(包括核酸、抗体或蛋白质-蛋白质(即非抗体)阵列)。在一些实施方案中，免疫测定是或包括基于免疫学反应例如通过检测抗体或抗原结合抗体片段与基因产物的结合来检测蛋白质的方法或测定。免疫测定包括但不限于定量免疫细胞化学或免疫组织化学、ELISA(包括直接、间接、夹心、竞争性、多重和便携式ELISA(参见例如美国专利号7,510,687))、蛋白质印迹(包括一维、两维或更高维印迹或其他色谱手段，任选地包括肽测序)、酶免疫测定(EIA)、RIA(放射性免疫测定)和SPR(表面等离子体共振)。
在一些实施方案中，通过流式细胞术测量、检测或定量蛋白质标记。在一些方面，流式细胞术是通过将细胞悬浮在流体流中并使其通过电子检测设备而用于标记检测的基于激光或基于阻抗的生物物理学技术。可以将存在于细胞上的标记进行标记，例如用荧光标记的抗体标记，以通过流式细胞术进行检测。在一些方面，采用流式细胞术来测量、检测或定量细胞群中存在的标记的存在、不存在、量或水平。在一些方面，细胞群可以是细胞组合物的全部细胞或全部活细胞，或者来自细胞组合物的细胞子集(例如对重组受体呈阳性的细胞，即CD4+T细胞或CD8+T细胞)。
在特定实施方案中，标记与激活或激活样状态呈正相关或正相关性。在一些实施方案中，标记是或包括CD25、CD26、CD27、CD28、CD30、CD71、 CD154、CD40L、CD127、LAG3或Ki67。在一些实施方案中，标记与消耗或消耗相关病症呈正相关或正相关性。在特定实施方案中，标记是或包括 CTLA-4、FOXP3、PD-1、TIGIT、LAB-3、2B4、BTLA、TIM3、VISTA、或CD96中的一种或多种。在一些实施方案中，生物标记与T细胞的分化相关。在特定实施方案中，标记是或包括CD25、CD45RO、CD56、KLRG1、CD95 中的一种或多种和/或CD45RA、CD27、CD28、CD62L和CCR7中的一种或多种。在一些实施方案中，评估细胞(例如输出组合物的细胞)中的如下细胞：对选自CD45RA、CD27、CD28、CD62L和CCR7的T细胞激活标记呈表面阳性；和/或对选自CD25、CD45RO、CD56、KLRG1的标记呈表面阴性；和/或具有低CD95表达；和/或对选自IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10的细胞因子的细胞内表达呈阴性。在一些中，评估输出组合物中呈CD45RA+、CD27+、 CCR7+和/或CD45RO-的细胞。
在一些实施方案中，输出细胞组合物的细胞显示出在长期刺激方法后 (例如，在与含有结合分子的颗粒(例如珠)一起孵育后)经历了延长或长期刺激的细胞的特征。在一些实施方案中，细胞组合物(例如参考或对照细胞组合物)的表达重组受体的细胞显示出在测定后(例如在与含有结合分子的颗粒(例如珠)一起孵育后)经历了延长或长期刺激的细胞的特征。
IV.重组受体
在一些实施方案中，通过本文提供的方法处理、加工、工程化和/或产生的细胞含有或表达，或经工程化以含有或表达重组蛋白，如重组受体(例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR))。在某些实施方案中，本文提供的方法产生和/或能够产生经工程化以表达或含有重组蛋白的细胞或含有和/或富集所述细胞的群体或组合物。在一些实施方案中，处理、加工、工程化和/或产生CD4+T细胞，或CD4+T细胞的群体或组合物。
在一些实施方案中，细胞包括通过基因工程化引入的一种或多种核酸，并且由此表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，通过如下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将所述细胞与诱导应答(如增殖、存活和/或激活，例如如通过细胞因子或激活标记的表达所测量的)的刺激物组合，然后转导被激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。
所述细胞通常表达重组受体，如抗原受体(包括功能性非TCR抗原受体，例如嵌合抗原受体(CAR))和其他抗原结合受体(如转基因T细胞受体 (TCR))。所述受体还包括其他嵌合受体。
A.嵌合抗原受体
在所提供的方法和用途的一些实施方案中，嵌合受体(如嵌合抗原受体) 含有一个或多个结构域，所述一个或多个结构域将提供针对所期望抗原(例如肿瘤抗原)的特异性的配体结合结构域(例如抗体或抗体片段)与细胞内信号传导结构域组合。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是激活性细胞内结构域部分，如T细胞激活结构域，从而提供初级激活信号。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域含有或另外含有共刺激信号传导结构域以促进效应子功能。在一些实施方案中，嵌合受体在被基因工程化至免疫细胞中时，可以调节T细胞活性，并且在一些情况下可以调节T细胞分化或稳态，由此产生在体内具有改善的寿命、存活和/或持久性的基因工程化细胞，如用于过继细胞治疗方法。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类受体工程化并引入细胞的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO200014257、WO 2013126726、WO2012/129514、WO 2014031687、WO2013/166321、 WO2013/071154、WO2013/123061；美国专利申请公开号US2002131960、 US2013287748、US20130149337；美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、 8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118；以及欧洲专利申请号EP2537416；和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388–398； Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol., 2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中描述的那些。CAR的例子包括如在任何前述出版物中披露的CAR，所述出版物如WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282； Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276 (2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、 US 2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282。
所述嵌合受体(如CAR)通常包括细胞外抗原结合结构域，如抗体分子的一部分，通常是抗体的可变重(VH)链区和/或可变轻(VL)链区，例如 scFv抗体片段。
在一些实施方案中，所述受体所靶向的抗原是多肽。在一些实施方案中，它是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶向细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或致病细胞)上选择性地表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。
在一些实施方案中，抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、 CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III 型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿 AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2 (OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3 (GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、 Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM 的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、 MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原 (PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2 (TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms 肿瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达的抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，所述抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、 CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、 CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是CD19。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD19具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合CD19的抗体或抗体片段是小鼠来源的抗体，如FMC63和 SJ25C1。在一些实施方案中，抗体或抗体片段是人抗体，例如如美国专利公开号US 2016/0152723中所述。
本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合 (Fab)片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的重链可变(VH)区、单链抗体片段(包括单链可变片段 (scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体(peptibody)、嵌合抗体、全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体 (heteroconjugateantibody)、多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应理解为涵盖其功能性抗体片段(在本文中也称为“抗原结合片段”)。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG 及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。
术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，在本领域中是已知的，指代抗体可变区内的氨基酸的非连续序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、 CDR-H2、CDR-H3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、 CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”在本领域中是已知的，指代重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区中有四个FR (FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个 FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。
给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，包括以下文献中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,贝塞斯达,马里兰州D(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani 等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J. Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745”。(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A和Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”JMol Biol,2001年6月8 号；309(3):657-70(“Aho”编号方案)；以及Martin等人,“Modelingantibody hypervariable loops:a combined algorithm,”PNAS,1989,86(23):9268-9272(“AbM”编号方案)。
给定CDR或FR的边界可能取决于用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat 方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号都是基于最常见的抗体区域序列长度，其中通过插入字母提供插入 (例如“30a”)并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失 (“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact 方案是基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。AbM方案是Kabat定义与Chothia定义之间的折衷，基于此由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用的方案。
下表1列出了分别通过Kabat、Chothia、AbM和Contact方案鉴定的 CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia两种编号方案列出了残基编号。 FR位于CDR之间，例如其中FR-L1位于CDR-L1之前，FR-L2位于CDR-L1与 CDR-L2之间，FR-L3位于CDR-L2与CDR-L3之间等。应注意，因为所示的Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入，所以当使用所示的Kabat编号惯例进行编号时，Chothia CDR-H1环的末端取决于环的长度而在H32与H34之间变化。
表1.根据各种编号方案的CDR边界。
Figure BDA0002556467450001121
Figure BDA0002556467450001131
1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5 版Public Health Service,National Institutes of Health,贝塞斯达,马里兰州2-Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948
因此，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区) 的“CDR”或“互补决定区”或单个指定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、 CDR-H3)涵盖如由任何前述方案或其他已知方案所定义的一个(或特定的) 互补决定区。例如，在声明特定的CDR(例如，CDR-H3)含有给定VH或VL氨基酸序列中的相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，这种CDR具有在可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列，如由任何前述方案或其他已知方案所定义的。在一些实施方案中，规定了特定的CDR序列。使用各种编号方案描述了所提供的抗体的示例性CDR序列，但应理解，所提供的抗体可以包含根据任何其他前述编号方案或技术人员已知的其他编号方案所述的CDR。
同样，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区) 的FR或单独指定的一个或多个FR(例如，FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4) 涵盖如由任何已知方案所定义的一个(或特定的)框架区。在一些情形中，规定了用于鉴定一个或多个特定的CDR或FR的方案，如通过Kabat、Chothia、 AbM或Contact方法或其他方案定义的CDR。在其他情况下，给出了CDR或 FR的特定氨基酸序列。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个 CDR。(参见，例如，Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co., 第91页(2007)。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的VH或VL结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的VL或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人,J. Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
包括在所提供的CAR中的抗体包括抗体片段。“抗体片段”或“抗原结合片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、 F(ab')2；双抗体；线性抗体；重链可变(VH)区、单链抗体分子(如scFv) 和仅含有VH区的单结构域抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些实施方案中，所提供的CAR中的抗原结合结构域是或包括含有可变重链(VH) 区和可变轻链(VL)区的抗体片段。在特定实施方案中，抗体是包含重链可变(VH)区和/或轻链可变(VL)区的单链抗体片段(例如scFv)。
在一些实施方案中，scFv源自FMC63。FMC63通常是指针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocytetyping III.302)。在一些实施方案中，FMC63抗体包含分别在SEQ ID NO:39和40中所示的CDRH1和H2，以及在SEQ ID NO:41或55 中所示的CDRH3、和在SEQ ID NO:36中所示的CDRL1、和在SEQ ID NO:37 或56中所示的CDR L2、和在SEQ ID NO:38或35中所示的CDR L3。在一些实施方案中，FMC63抗体包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的重链可变区 (VH)和含有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:36的CDRL1序列、SEQ ID NO:37的CDRL2序列和SEQ ID NO:38的CDRL3序列的可变轻链和/或含有 SEQ ID NO:39的CDRH1序列、SEQ ID NO:40的CDRH2序列和SEQ ID NO: 41的CDRH3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:42 中所示的可变重链区和SEQ ID NO:43中所示的可变轻链区。在一些实施方案中，所述可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如 SEQID NO:57中所示。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv 由SEQ ID NO:58中所示的核苷酸序列或展现出与SEQ ID NO:58至少85％、 86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或99％序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO: 44中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:44至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，scFv源自SJ25C1。SJ25C1是针对人来源的表达CD19 的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocyte typingIII.302)。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含SEQ ID NO:48-50中分别所示的CDRH1、H2和H3，以及SEQ ID NO:45-47中分别所示的CDRL1、L2和L3序列。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的重链可变区(VH)和含有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的轻链可变区(VL)。
在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:45的CDRL1序列、SEQ ID NO:46的CDRL2序列和SEQ ID NO:47的CDRL3序列的可变轻链和/或含有 SEQ ID NO:48的CDRH1序列、SEQ ID NO:49的CDRH2序列和SEQ ID NO: 50的CDRH3序列的可变重链。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:51 中所示的可变重链区和SEQ ID NO:52中所示的可变轻链区。在一些实施方案中，所述可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如 SEQID NO:53中所示。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VH、接头和VL。在一些实施方案中，scFv按顺序包含VL、接头和VH。在一些实施方案中，scFv 包含SEQ ID NO:54中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:54至少 85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％或99％序列同一性的序列。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是BCMA。在一些实施方案中，scFv含有源自对BCMA具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合BCMA的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090327和WO 2016/090320中阐述的抗体或抗体片段的VH和 VL。
在一些实施方案中，抗原或抗原结合结构域是GPRC5D。在一些实施方案中，scFv含有源自对GPRC5D具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，结合GPRC5D的抗体或抗体片段是或含有来自国际专利申请公开号WO 2016/090329和WO 2016/090312中阐述的抗体或抗体片段的 VH和VL。
在一些实施方案中，所述抗原是CD20。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD20具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，所述结合CD20的抗体或抗体片段是作为或源自利妥昔单抗的抗体，如是利妥昔单抗scFv。
在一些实施方案中，所述抗原是CD22。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD22具有特异性的抗体或抗体片段的VH和VL。在一些实施方案中，所述结合CD22的抗体或抗体片段是作为或源自m971的抗体，如是m971 scFv。
在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括含有抗体或抗体片段的细胞外部分。在一些方面，所述嵌合抗原受体包括含有抗体或片段的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述抗体或片段包括scFv。
在一些实施方案中，重组受体(例如CAR)的抗体部分进一步包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分，如铰链区(例如IgG4铰链区)和/或CH1/CL和/ 或Fc区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的。在一些方面，恒定区的所述部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况相比，间隔子的长度可以提供在抗原结合后增加的细胞应答性。示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153；国际专利申请公开号WO2014031687、美国专利号8,822,647或公开的申请号US2014/0271635。
在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的。在一些实施方案中，所述间隔子具有序列ESKYGPPCPPCP(示于SEQ ID NO:1 中)，并且由SEQ ID NO:2所示的序列编码。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:3中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有 SEQ ID NO:4中所示的序列。在一些实施方案中，所述恒定区或部分是IgD 的。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:5中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有展现出与SEQ ID NO:1、3、4或5中的任一者至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有SEQ ID NO:25-33中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有展现出与SEQ ID NO:25-33中任一个至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗原受体包含与细胞外结构域直接或间接连接的细胞内结构域。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体包括将细胞外结构域与细胞内信号传导结构域连接的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含ITAM。例如，在一些方面，所述抗原识别结构域 (例如细胞外结构域)通常与一种或多种细胞内信号传导组分(如模拟在CAR的情况下通过抗原受体复合物(如TCR复合物)进行激活和/或通过另一种细胞表面受体传导信号的信号传导组分)连接。在一些实施方案中，所述嵌合受体包含在细胞外结构域(例如，scFv)与细胞内信号传导结构域之间连接或融合的跨膜结构域。因此，在一些实施方案中，所述抗原结合组分(例如，抗体)与一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域连接。
在一个实施方案中，使用天然与所述受体(例如，CAR)中的一个结构域缔合的跨膜结构域。在一些情形中，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然来源或源自合成来源。在来源是天然的情况下，结构域在一些方面源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下的那些(即，包含以下的至少一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16， CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137，CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域来实现。在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。
在一些实施方案中，所述细胞外结构域和跨膜结构域可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，受体含有衍生出跨膜结构域的分子的细胞外部分，如CD28细胞外部分。
所述细胞内信号传导结构域包括模拟或接近于以下的那些：通过天然抗原受体的信号、通过这种受体与共刺激受体的组合的信号、和/或仅通过共刺激受体的信号。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度在 2与10个氨基酸之间的接头(如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)，并且在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。
在一些方面，将T细胞激活描述为由两个类别的胞质信号传导序列来介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些序列(初级胞质信号传导序列) 以及以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些序列(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。
受体(例如，CAR)通常包括至少一种或多种细胞内信号传导组分。在一些方面，CAR包括调节所述TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括源自CD3ζ链、FcRγ、CD3γ、CD3δ和CD3ε的那些。在一些实施方案中，CAR中的一种或多种胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。
在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，所述抗原结合部分连接至一种或多种细胞信号传导模块。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他 CD3跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如，CAR)还包括一种或多种另外的分子(如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，所述CAR或其他嵌合受体包括CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与 CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在连接CAR或其他嵌合受体后，所述受体的胞质结构域或细胞内信号传导结构域激活免疫细胞(例如工程化以表达所述CAR的 T细胞)的正常效应子功能或应答中的至少一种。例如，在一些情况下，CAR 诱导T细胞的功能，如细胞溶解活性或T辅助活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分代替完整的免疫刺激链，例如条件是所述截短部分转导效应子功能信号。在一些实施方案中，一个或多个细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体的那些胞质序列，所述共受体在自然环境中与此类受体协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导。
在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要通过TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于产生次级或共刺激信号的组分也被包括在CAR中。在其他实施方案中，CAR不包括用于产生共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于产生次级或共刺激信号的组分。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些实施方案中，所述CAR包括共刺激受体(如CD28、4-1BB、OX40、 DAP10和ICOS)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面，相同的CAR 包括激活组分和共刺激组分二者。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体含有源自T细胞共刺激分子的细胞内结构域或其功能变体，如位于跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，所述T细胞共刺激分子是CD28或41BB。
在一些实施方案中，所述激活结构域包括在一个CAR中，而所述共刺激组分由识别另一种抗原的另一个CAR提供。在一些实施方案中，所述CAR包括激活或刺激CAR、共刺激CAR，它们均在相同细胞上表达(参见 WO2014/055668)。在一些方面，所述细胞包括一种或多种刺激或激活CAR 和/或共刺激CAR。在一些实施方案中，细胞还包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，如识别除了与疾病或病症相关和/或为所述疾病或病症特有的抗原以外的抗原的CAR，其中通过靶向疾病的CAR递送的激活信号由于抑制性CAR与其配体的结合而有所减小或被抑制，例如以减小脱靶效应。
在一些实施方案中，两种受体分别将激活和抑制信号诱导至细胞，使得一种受体与其抗原的连接激活细胞或诱导应答，但是第二抑制性受体与其抗原的连接诱导了抑制或减弱该应答的信号。例子是激活CAR与抑制性CAR (iCAR)的组合。例如，可以使用这种策略以降低在下述情况下的脱靶效应的可能性，在所述情况中激活CAR结合在疾病或病症中表达但也在正常细胞上表达的抗原，并且抑制性受体结合至在正常细胞上表达但不在疾病或病症的细胞上表达的单独抗原。
在一些方面，嵌合受体是或包括抑制性CAR(例如，iCAR)，并且包括减弱或抑制免疫应答(例如细胞中ITAM和/或共刺激促进的应答)的细胞内组分。此类细胞内信号传导组分的示例是在免疫检查点分子(包括PD-1、 CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、EP2/4 腺苷受体(包括A2AR))上发现的那些组分。在一些方面，工程化细胞包括抑制性CAR，所述抑制性CAR包含这样的抑制性分子的信号传导结构域或源自这样的抑制性分子的信号传导结构域，使得其起到减弱细胞的应答(例如，由激活和/或共刺激性CAR诱导的应答)的作用。
在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含连接至CD3(例如， CD3-ζ)细胞内结构域的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含连接至CD3ζ细胞内结构域的嵌合CD28和CD137 (4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR涵盖在胞质部分中的一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如，初级激活结构域)。示例性 CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些实施方案中，所述抗原受体进一步包括标记，和/或表达所述CAR 或其他抗原受体的细胞进一步包括替代标记，如细胞表面标记，所述标记可以用于证实细胞被转导或工程化以表达所述受体。在一些方面，所述标记包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体的全部或部分(例如截短形式)，如这种细胞表面受体的截短形式(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，编码所述标记的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列，例如，T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记和任选地接头序列可以是如公开的专利申请号 WO 2014031687中所披露的任一种。例如，标记可以是截短的EGFR (tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。
用于截短的EGFR(例如，tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:7或 16中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:7或16至少85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。示例性T2A接头序列包含SEQ ID NO:6或 17中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:6或17至少85％、86％、87％、 88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述标记是并未在T细胞上天然发现的或并未在T 细胞表面上天然发现的分子(例如，细胞表面蛋白)或其部分。在一些实施方案中，所述分子是非自身分子(例如，非自身蛋白)，即没有被细胞过继转移到其中的宿主的免疫系统识别为“自身”的分子。
在一些实施方案中，所述标记不起任何治疗作用和/或不产生除了用作基因工程化的标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，所述标记可以是治疗性分子或以其他方式发挥一些所需作用的分子，如在体内将遇到的细胞的配体，如共刺激性或免疫检查点分子，以在过继转移和遇到配体时增强和/或减弱所述细胞的应答。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合时仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的信号；在一些方面，第三代CAR是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
例如，在一些实施方案中，所述CAR含有对抗原(包括如所述的任一种) 具有特异性的抗体(例如抗体片段，如scFv)、是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域、以及含有CD28的信号传导部分或其功能变体和 CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述CAR含有对抗原(包括如所述的任一种)具有特异性的抗体(例如抗体片段，如scFv)、是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域、以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，受体还包括含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分(如Ig铰链，例如IgG4铰链)的间隔子，如仅铰链间隔子。
在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)的跨膜结构域是或包括人 CD28(例如登录号P01747.1)的跨膜结构域或其变体，如包含SEQ ID NO:8 中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:8至少85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域；在一些实施方案中，重组受体的含有跨膜结构域的部分包含SEQ ID NO:9中所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组受体(例如，CAR)的一个或多个细胞内信号传导组分含有人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的结构域。例如，细胞内信号传导结构域可以包含SEQ ID NO:10或11中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:10或11至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，细胞内结构域包含4-1BB(例如登录号Q07011.1) 的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如SEQ ID NO:12中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:12至少85％、86％、87％、88％、 89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，重组受体(例如CAR)的细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ(登录号：P20963.2) 的亚型3的112AA胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号 8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO:13、14或15中所示的氨基酸序列或展现出与SEQ ID NO:13、14或15至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如 SEQ ID NO:1中所示的仅铰链间隔子。在其他实施方案中，所述间隔子是或含有任选地与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，如源自IgG4的铰链。在一些实施方案中，所述间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4 铰链，如SEQ ID NO:4中所示。在一些实施方案中，所述间隔子是仅与CH3 结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:3中所示。在一些实施方案中，所述间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。
例如，在一些实施方案中，CAR包括抗体(如抗体片段，包括scFv)、间隔子(如含有免疫球蛋白分子的一部分(如铰链区和/或重链分子的一个或多个恒定区)的间隔子，如含有Ig铰链的间隔子)、含有源自CD28的跨膜结构域的全部或部分的跨膜结构域、源自CD28的细胞内信号传导结构域和 CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括抗体或片段(如scFv)、间隔子(如任何含Ig铰链的间隔子)、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB 的细胞内信号传导结构域和源自CD3ζ的信号传导结构域。
示例性替代标记可以包括截短形式的细胞表面多肽，如是非功能性的并且不转导或不能转导信号或通常被细胞表面多肽的全长形式转导的信号、和/或不内化或不能内化的截短形式。示例性截短的细胞表面多肽包括截短形式的生长因子或其他受体，如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，在7或16中所示的示例性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。tEGFR可以含有抗体西妥昔单抗
Figure BDA0002556467450001231
或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以用于鉴定或选择已经工程化以表达tEGFR构建体和编码的外源蛋白质的细胞，和/或用于消除或分离表达所编码的外源蛋白质的细胞。参见美国专利号 8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，标记(例如替代标记)包括全部或部分(例如，截短形式)的CD34、NGFR、 CD19或截短的CD19(例如，截短的非人CD19)或表皮生长因子受体(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，标记是或包含荧光蛋白，如绿色荧光蛋白 (GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或 DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体、以及密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。
在一些实施方案中，标记是选择标记。在一些实施方案中，选择标记是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，选择标记是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其修饰形式。
在一些实施方案中，编码标记的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO2014031687中所公开的任一种。
在一些实施方案中，编码此类CAR构建体的核酸分子例如在编码CAR的序列的下游进一步包括编码T2A核糖体跳跃元件的序列和/或tEGFR序列。在一些实施方案中，所述序列编码SEQ ID NO:6或17中所示的T2A核糖体跳跃元件或展现出与SEQ ID NO:6或17至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，还可以产生表达抗原受体(例如CAR)的T细胞以将截短的EGFR(EGFRt)表达为非免疫原性选择表位(例如通过引入编码被T2A核糖体开关分隔开的CAR和EGFRt的构建体，以表达来自相同构建体的两种蛋白质)，然后所述非免疫原性选择表位可用作检测此类细胞的标记(参见例如美国专利号8,802,374)。在一些实施方案中，所述序列编码SEQ ID NO:7或16中所示的tEGFR序列或展现出与SEQ ID NO:7或16至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、 97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些情况下，所述肽 (如T2A)可以导致核糖体跳过(核糖体跳跃)2A元件C末端处的肽键的合成，这导致2A序列末端与下游的下一个肽之间分开(参见，例如，de Felipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和deFelipe等人Traffic 5:616-626 (2004))。已知许多2A元件。可以用于本文公开的方法和核酸中的2A序列的例子包括但不限于来自以下的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如，SEQ ID NO: 21)、马鼻炎A病毒(E2A，例如，SEQ ID NO:20)、明脉扁刺蛾β四体病毒 (Thosea asigna virus)(T2A，例如，SEQ ID NO:6或17)和猪捷申病毒(porcine teschovirus)-1(P2A，例如，SEQ IDNO:18或19)，如美国专利公开号 20070116690中所述。
在一些情况下，编码重组受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。信号肽的非限制性示例性例子包括例如 SEQ ID NO:62中所示并且由SEQID NO:61中所示核苷酸序列编码的 GMCSFRα链信号肽、SEQ ID NO:60中所示的CD8α信号肽或SEQ ID NO:59 中所示的CD33信号肽。
由给予至受试者的细胞表达的重组受体(如CAR)通常识别或特异性地结合至在所治疗的疾病或病症或其细胞中表达、与所治疗的疾病或病症或其细胞相关和/或为所治疗的疾病或病症或其细胞特有的分子。在与所述分子例如抗原特异性结合后，受体通常将免疫刺激信号(如ITAM转导的信号)递送到细胞中，从而促进靶向所述疾病或病症的免疫应答。例如，在一些实施方案中，细胞表达CAR，所述CAR特异性地结合至由疾病或病症的细胞或组织表达或与所述疾病或病症相关的抗原。
B.TCR
在一些实施方案中，提供了工程化细胞(如T细胞)，其表达识别靶多肽 (如肿瘤、病毒或自身免疫蛋白的抗原)的肽表位或T细胞表位的T细胞受体 (TCR)或其抗原结合部分。
在一些实施方案中，“T细胞受体”或“TCR”是含有可变α和β链(也分别称为TCRα和TCRβ)或可变γ和δ链(也分别称为TCRα和TCRβ)的分子或其抗原结合部分，并且所述分子或其抗原结合部分能够与结合至MHC分子的肽特异性地结合。在一些实施方案中，TCR呈αβ形式。通常，以αβ和γδ形式存在的TCR在结构上总体上相似，但是表达它们的T细胞可以具有不同的解剖学位置或功能。TCR可以在细胞的表面上发现或以可溶形式发现。通常，在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上发现TCR，在此处它通常负责识别结合至主要组织相容性复合物(MHC)分子的抗原。
除非另有说明，否则术语“TCR”应当理解为涵盖完整的TCR以及其抗原结合部分或抗原结合片段。在一些实施方案中，TCR是完整或全长TCR，包括呈αβ形式或γδ形式的TCR。在一些实施方案中，TCR是这样的抗原结合部分，其少于全长TCR但与在MHC分子中结合的特定肽结合，如与MHC-肽复合物结合。在一些情况下，TCR的抗原结合部分或片段可以仅含有全长或完整TCR的结构性结构域的一部分，但是仍能够结合与完整TCR结合的肽表位(如MHC-肽复合物)。在一些情况下，抗原结合部分含有TCR的可变结构域(如TCR的可变α链和可变β链)，足以形成用于与特定MHC-肽复合物结合的结合位点。通常，TCR的可变链含有参与对肽、MHC和/或MHC-肽复合物的识别的互补决定区。
在一些实施方案中，TCR的可变结构域含有超变环或互补决定区 (CDR)，其通常是抗原识别和结合能力和特异性的主要贡献者。在一些实施方案中，TCR的CDR或其组合形成给定TCR分子的全部或基本上全部的抗原结合位点。TCR链的可变区内的各个CDR通常由框架区(FR)隔开，与 CDR相比，所述框架区通常在TCR分子之间展示较低可变性(参见，例如，Jores等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.U.S.A.87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J. 7:3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。在一些实施方案中，CDR3是负责抗原结合或特异性的主要CDR，或者在给定TCR 可变区上在三个CDR中对于抗原识别和/或对于与肽-MHC复合物的经处理肽部分的相互作用最重要。在一些情况下，所述α链的CDR1可以与某些抗原肽的N末端部分相互作用。在一些情况下，所述β链的CDR1可以与所述肽的C末端部分相互作用。在一些情况下，CDR2对与MHC-肽复合物的MHC部分的相互作用或识别具有最强的作用或者是主要的负责CDR。在一些实施方案中，所述β-链的可变区可以含有另外的高变区(CDR4或HVR4)，其通常参与超抗原结合而非抗原识别(Kotb(1995)ClinicalMicrobiology Reviews, 8:411-426)。
在一些实施方案中，TCR还可以含有恒定结构域、跨膜结构域和/或短胞质尾(参见例如，Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,第3版,Current Biology Publications,第4页:33,1997。在一些方面，TCR的每条链可以具有一个N末端免疫球蛋白可变结构域、一个免疫球蛋白恒定结构域、跨膜区和位于C末端的短胞质尾。在一些实施方案中，TCR 与参与介导信号转导的CD3复合物的不变蛋白质缔合。
在一些实施方案中，TCR链含有一个或多个恒定结构域。例如，给定TCR 链(例如，α链或β链)的细胞外部分可以含有与细胞膜相邻的两个免疫球蛋白样结构域，如可变结构域(例如，Vα或Vβ；通常为基于Kabat编号的氨基酸1至116，Kabat等人,“Sequences ofProteins of Immunological Interest”,US Dept.Health and Human Services,PublicHealth Service National Institutes of Health,1991,第5版)和恒定结构域(例如，α链恒定结构域或Cα，通常为基于Kabat编号的链的位置117至259；或β链恒定结构域或Cβ，通常为基于Kabat 的链的位置117至295)。例如，在一些情况下，由两条链形成的TCR的细胞外部分含有两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域，所述可变结构域各自含有CDR。TCR的恒定结构域可以含有短连接序列，其中半胱氨酸残基形成二硫键，从而连接TCR的两条链。在一些实施方案中，TCR可以在α链和β链中的每一个中具有另外的半胱氨酸残基，使得TCR在恒定结构域中含有两个二硫键。
在一些实施方案中，TCR链含有跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域带正电荷。在一些情况下，TCR链含有胞质尾。在一些情况下，所述结构允许TCR与其他分子(像CD3)及其亚基缔合。例如，含有恒定结构域与跨膜区的TCR可以将蛋白质锚定在细胞膜中并与CD3信号传导设备或复合物的不变亚基缔合。CD3信号传导亚基(例如，CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ链)的细胞内尾含有TCR复合物的信号传导能力中所涉及的一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。
在一些实施方案中，TCR可以是两条链α和β(或者任选地γ和δ)的异二聚体，或者它可以是单链TCR构建体。在一些实施方案中，TCR是含有如通过一个或多个二硫键连接的两条单独链(α和β链或γ和δ链)的异二聚体。
在一些实施方案中，TCR可以从一个或多个已知的TCR序列(如Vα、Vβ链的序列)产生，所述一个或多个已知的TCR序列的基本上全长的编码序列是容易获得的。用于从细胞来源获得全长TCR序列(包括V链序列)的方法是熟知的。在一些实施方案中，编码TCR的核酸可以从多种来源获得，如通过一种或多种给定细胞内的或从所述一种或多种给定细胞中分离的编码 TCR的核酸的聚合酶链式反应(PCR)扩增获得，或者通过公众可获得的TCR DNA序列的合成获得。
在一些实施方案中，TCR是从生物来源获得，如来自细胞(如来自T细胞(例如细胞毒性T细胞))、T细胞杂交瘤或其他公众可获得的来源。在一些实施方案中，T细胞可以从体内分离的细胞获得。在一些实施方案中，TCR 是胸腺选择的TCR。在一些实施方案中，TCR是新表位限制性TCR。在一些实施方案中，T细胞可以是经培养的T细胞杂交瘤或克隆。在一些实施方案中， TCR或其抗原结合部分或其抗原结合片段可以根据对所述TCR序列的知识以合成方式产生。
在一些实施方案中，TCR是从通过针对靶多肽抗原或其靶T细胞表位筛选候选TCR文库而鉴定或选择的TCR产生的。TCR文库可以通过扩增来自T 细胞的Vα和Vβ库来产生，所述T细胞是从受试者中分离的，包括存在于 PBMC、脾或其他淋巴器官中的细胞。在一些情况下，T细胞可以从肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)扩增。在一些实施方案中，可以从CD4+或CD8+T细胞产生TCR文库。在一些实施方案中，TCR可以从正常或健康受试者的T细胞来源扩增，即正常TCR文库。在一些实施方案中，TCR可以从患病受试者的 T细胞来源扩增，即患病TCR文库。在一些实施方案中，使用简并引物扩增Vα和Vβ的基因库，如在从人获得的样品(如T细胞)中通过RT-PCR扩增。在一些实施方案中，scTv文库可以从幼稚Vα和Vβ文库组装，其中经扩增的产物被克隆或组装以通过接头隔开。根据受试者和细胞的来源，所述文库可以是 HLA等位基因特异性的。可替代地，在一些实施方案中，TCR文库可以通过亲本或支架TCR分子的诱变或多样化产生。在一些方面，使TCR经历例如α或β链的定向进化，如通过诱变来进行。在一些方面，TCR的CDR内的特定残基被改变。在一些实施方案中，可以通过亲和力成熟来修饰经选择的TCR。在一些实施方案中，可以如通过筛选以评估针对肽的CTL活性来选择抗原特异性T细胞。在一些方面，可以选择例如存在于抗原特异性T细胞上的TCR，如通过结合活性，例如对抗原的特定亲和力或亲合力来选择。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分是已修饰或工程化的TCR或其抗原结合部分。在一些实施方案中，使用定向进化方法来产生具有改变的特性(如对特定MHC-肽复合物具有较高亲和力)的TCR。在一些实施方案中，定向进化通过展示方法实现，所述展示方法包括但不限于酵母展示 (Holler等人(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler等人(2000)Proc Natl Acad Sci U S A,97,5387-92)；噬菌体展示(Li等人(2005)Nat Biotechnol,23, 349-54)或T细胞展示(Chervin等人(2008)J Immunol Methods,339,175-84)。在一些实施方案中，展示方法涉及工程化或修饰已知的亲本或参考TCR。例如，在一些情况下，野生型TCR可以用作模板以用于产生经诱变的TCR，其中CDR的一个或多个残基被突变，并且选择具有所希望改变的特性(如对所希望的靶抗原具有更高的亲和力)的突变体。
在一些实施方案中，用于产生或生成目的TCR的靶多肽的肽是已知的或者可以容易地鉴定。在一些实施方案中，适用于产生TCR或抗原结合部分的肽可以基于目的靶多肽(如下文所述的靶多肽)中HLA限制性基序的存在来确定。在一些实施方案中，使用可用的计算机预测模型来鉴定肽。在一些实施方案中，对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于ProPred1 (Singh和Raghava(2001)Bioinformatics 17(12):1236-1237)和SYFPEITHI(参见Schuler等人(2007)Immunoinformatics Methods in MolecularBiology,409(1): 75-93 2007)。在一些实施方案中，MHC限制性表位是HLA-A0201，其在所有高加索人的大约39％-46％中表达，并且因此表示用于制备TCR或其他 MHC-肽结合分子的MHC抗原的合适选择。
使用计算机预测模型的HLA-A0201结合基序以及蛋白酶体和免疫蛋白酶体的切割位点是已知的。对于预测MHC I类结合位点，此类模型包括但不限于ProPred1(更详细地描述于Singh和Raghava,ProPred:prediction of HLA-DR binding sites.BIOINFORMATICS17(12):1236-1237 2001)和 SYFPEITHI(参见Schuler等人SYFPEITHI,Database forSearching and T-Cell Epitope Prediction.，Immunoinformatics Methods inMolecular Biology,第409(1) 卷:75-93 2007)中。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合部分可以是重组产生的天然蛋白或其突变形式，其中一种或多种特性(如结合特征)已发生改变。在一些实施方案中，TCR可以源自多个动物物种之一，如人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。TCR可以是细胞结合的或呈可溶形式。在一些实施方案中，出于所提供的方法的目的，TCR呈在细胞表面上表达的细胞结合形式。
在一些实施方案中，TCR是全长TCR。在一些实施方案中，TCR是抗原结合部分。在一些实施方案中，TCR是二聚体TCR(dTCR)。在一些实施方案中，TCR是单链TCR(sc-TCR)。在一些实施方案中，dTCR或scTCR具有如WO 03/020763、WO 04/033685、WO 2011/044186中所述的结构。
在一些实施方案中，TCR含有对应于跨膜序列的序列。在一些实施方案中，TCR确实含有对应于胞质序列的序列。在一些实施方案中，TCR能够与 CD3形成TCR复合物。在一些实施方案中，任何TCR(包括dTCR或scTCR) 可以与信号传导结构域连接，从而在T细胞表面上产生活性TCR。在一些实施方案中，TCR在细胞表面上表达。
在一些实施方案中，dTCR含有第一多肽(其中对应于TCRα链可变区序列的序列与对应于TCRα链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)和第二多肽(其中对应于TCRβ链可变区序列的序列与对应于TCRβ链恒定区细胞外序列的序列的N末端融合)，所述第一和第二多肽通过二硫键连接。在一些实施方案中，所述键可以对应于天然二聚体αβTCR中存在的天然链间二硫键。在一些实施方案中，链间二硫键不存在于天然TCR中。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入dTCR多肽对的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键两者。在一些实施方案中，TCR含有跨膜序列以锚定至膜。
在一些实施方案中，dTCR含有TCRα链，所述TCRα链含有可变α结构域、恒定α结构域和附接至恒定α结构域C末端的第一二聚化基序；以及TCRβ链，所述TCRβ链包含可变β结构域、恒定β结构域和附接至恒定β结构域C末端的第一二聚化基序，其中所述第一和第二二聚化基序易于相互作用以在第一二聚化基序的氨基酸与第二二聚化基序的氨基酸之间形成共价键，从而将 TCRα链与TCRβ链连接在一起。
在一些实施方案中，TCR是scTCR。通常，可以使用已知的方法产生 scTCR。参见例如Soo Hoo,W.F.等人PNAS(USA)89,4759(1992)；Wülfing,C. 和Plückthun,A.,J.Mol.Biol.242,655(1994)；Kurucz,I.等人PNAS(USA)90 3830(1993)；国际公开PCT号WO96/13593、WO 96/18105、WO99/60120、 WO99/18129、WO 03/020763、WO2011/044186；和Schlueter,C.J.等人J. Mol.Biol.256,859(1996)。在一些实施方案中，scTCR含有引入的非天然链间二硫键以促进TCR链的缔合(参见例如，国际公开PCT号WO 03/020763)。在一些实施方案中，scTCR是非二硫键连接的截短的TCR，其中与其C末端融合的异源亮氨酸拉链促进链缔合(参见例如，国际公开的PCT号WO 99/60120)。在一些实施方案中，scTCR含有通过肽接头与TCRβ可变结构域共价连接的TCRα可变结构域(参见例如，国际公开PCT号WO 99/18129)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由对应于TCRα链可变区的氨基酸序列构成)、第二区段(其由与对应于TCRβ链恒定结构域细胞外序列的氨基酸序列的N末端融合的对应于TCRβ链可变区序列的氨基酸序列构成)和接头序列(其将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与α链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的α链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列β链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的β链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR含有第一区段(其由与β链细胞外恒定结构域序列的N末端融合的TCRβ链可变区序列构成)和第二区段(其由与序列α链细胞外恒定和跨膜序列的N末端融合的α链可变区序列构成)以及任选地接头序列(其将第一区段的C末端连接至第二区段的N末端)。
在一些实施方案中，scTCR的连接第一和第二TCR区段的接头可以是能够在保持TCR结合特异性的同时形成单条多肽链的任何接头。在一些实施方案中，接头序列可以例如具有式-P-AA-P-，其中P是脯氨酸并且AA代表氨基酸序列，其中氨基酸是甘氨酸和丝氨酸。在一些实施方案中，第一和第二区段配对，使得其可变区序列定向用于这种结合。因此，在一些情况下，接头具有足够的长度以跨越第一区段的C末端与第二区段的N末端之间的距离，或反之亦然，但是不能太长而阻断或减少scTCR与靶配体的结合。在一些实施方案中，所述接头可以含有从10至45个氨基酸或从约10至约45个氨基酸，如10至30个氨基酸或26至41个氨基酸残基，例如29、30、31或32个氨基酸。在一些实施方案中，接头具有式-PGGG-(SGGGG)5-P-，其中P是脯氨酸，G 是甘氨酸并且S是丝氨酸(SEQ ID NO:28)。在一些实施方案中，接头具有序列GSADDAKKDAAKKDGKS(SEQ ID NO:29)。
在一些实施方案中，scTCR含有共价二硫键，其将α链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基连接至β链的恒定结构域的免疫球蛋白区域的残基。在一些实施方案中，天然TCR中不存在链间二硫键。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个半胱氨酸掺入scTCR多肽的第一和第二区段的恒定区细胞外序列中。在一些情况下，可能需要天然和非天然二硫键两者。
在dTCR或scTCR含有引入的链间二硫键的一些实施方案中，不存在天然二硫键。在一些实施方案中，形成天然链间二硫键的一个或多个天然半胱氨酸被取代为另一种残基，如丝氨酸或丙氨酸。在一些实施方案中，引入的二硫键可以通过使第一和第二区段上的非半胱氨酸残基突变为半胱氨酸来形成。TCR的示例性非天然二硫键描述于已公开的国际PCT号WO 2006/000830 中。
在一些实施方案中，TCR或其抗原结合片段展现出对靶抗原的亲和力，其平衡结合常数在或在约10-5与10-12M之间以及其中的所有单独值和范围。在一些实施方案中，靶抗原是MHC-肽复合物或配体。
在一些实施方案中，编码TCR(如α和β链)的一种或多种核酸可以通过 PCR、克隆或其他合适的手段扩增，并且克隆到一种或多种合适的表达载体中。表达载体可以是任何合适的重组表达载体，并且可以用于转化或转染任何合适的宿主。合适的载体包括设计用于繁殖和扩增或用于表达或用于两者的那些，如质粒和病毒。
在一些实施方案中，载体可以是以下系列的载体：pUC系列(Fermentas LifeSciences)、pBluescript系列(Stratagene，加利福尼亚州拉霍亚)、pET系列(Novagen，威斯康星州麦迪逊)、pGEX系列(Pharmacia Biotech，瑞典乌普萨拉)或pEX系列(Clontech，加利福尼亚州帕洛阿尔托)。在一些情况下，也可以使用噬菌体载体，如λG10、λGT11、λZapII(Stratagene)、λEMBL4 和λNM1149。在一些实施方案中，可以使用植物表达载体，并且包括pBI01、 pBI101.2、pBI101.3、pBI121和pBIN19(Clontech)。在一些实施方案中，动物表达载体包括pEUK-Cl、pMAM和pMAMneo(Clontech)。在一些实施方案中，使用病毒载体，如逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，重组表达载体可以使用标准的重组DNA技术来制备。在一些实施方案中，载体可以含有调节序列(如转录和翻译起始和终止密码子)，其对引入载体的宿主(例如，细菌、真菌，植物或动物)的类型具有特异性，酌情并考虑所述载体是基于DNA还是基于RNA。在一些实施方案中，载体可以含有非天然启动子，其与编码TCR或抗原结合部分(或其他 MHC-肽结合分子)的核苷酸序列可操作地连接。在一些实施方案中，所述启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子、 SV40启动子、RSV启动子和在鼠干细胞病毒的长末端重复序列中发现的启动子。还设想了其他已知的启动子。
在一些实施方案中，为了产生编码TCR的载体，将α和β链从表达目的 TCR的T细胞克隆中分离的总cDNA进行PCR扩增，并且将其克隆到表达载体中。在一些实施方案中，将α和β链克隆到同一载体中。在一些实施方案中，将α和β链克隆到不同的载体中。在一些实施方案中，将所产生的α和β链掺入逆转录病毒(例如，慢病毒)载体中。
V.组合物、配制品和给予方法
在一些实施方案中，通过本文提供的方法(如在章节I中所述的)产生的经富集T细胞的输出组合物作为细胞疗法(例如，过继细胞疗法)给予。在特定实施方案中，一种或多种细胞组合物(例如，本文所述的输出细胞组合物)作为细胞疗法给予。在一些实施方案中，过继T细胞治疗方法描述于例如以下文献中：Gruenberg等人的美国专利申请公开号2003/0170238；Ros enberg的美国专利号4,690,915；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10): 577-85)。参见，例如Themeli等人(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara等人(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila等人(2013)PLoSONE 8(4):e61338。
在某些实施方案中，本文提供的方法从自单一生物样品分离、选择和/ 或富集的输入细胞产生经富集T细胞的单一输出组合物，其作为细胞疗法给予。在特定实施方案中，所述单一输出组合物是经富集CD4+T细胞的组合物。在某些实施方案中，所述单一输出组合物是经富集CD4+和CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，本文提供的方法从单一来源，例如生物样品和/ 或从生物样品中分离、选择或富集的输入组合物产生两种或更多种输出组合物，所述两种或更多种输出组合物给予至受试者。在一些实施方案中，将所述两种或更多种输出组合物分开给予至受试者。在某些实施方案中，将所述两种或更多种输出组合物合并为单一组合物并且给予至受试者。在某些实施方案中，所述两种或更多种输出组合物包括经富集CD4+T细胞的输出组合物。在特定实施方案中，所述两种或更多种输出组合物包括经富集CD8+T 细胞的输出组合物。
在一些实施方案中，给予至受试者的经富集CD4+T细胞的输出组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的 CD4+T细胞。在某些实施方案中，所述输出组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD4+T细胞。在某些实施方案中，给予至受试者的经富集CD4+T细胞的输出组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T细胞。
在一些实施方案中，给予至受试者的经富集CD8+T细胞的输出组合物包含至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的 CD8+T细胞。在特定实施方案中，所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD8+T细胞。在某些实施方案中，给予至受试者的经富集CD8+T细胞的输出组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含有CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。
所治疗的疾病或病症可以是任何疾病或病症，其中抗原的表达与疾病、病症或障碍的病因相关和/或参与所述病因，例如引起、加重或以其他方式参与这种疾病、病症或障碍。示例性疾病和病症可以包括与恶性肿瘤或细胞转化(例如癌症)、自身免疫性疾病或炎性疾病或例如由细菌、病毒或其他病原体引起的感染性疾病相关的疾病或病症。上文描述了示例性抗原，其包括与可以治疗的各种疾病和病症相关的抗原。在特定实施方案中，嵌合抗原受体或转基因TCR特异性地结合至与所述疾病或病症相关的抗原。
疾病、病症和障碍包括肿瘤，包括实体瘤、血液恶性肿瘤和黑色素瘤，并且包括局部和转移性肿瘤；感染性疾病，如病毒或其他病原体的感染，例如HIV、HCV、HBV、CMV、HPV和寄生虫病；以及自身免疫性和炎性疾病。在一些实施方案中，疾病、障碍或病症是肿瘤、癌症、恶性肿瘤、肿疡或其他增殖性疾病或障碍。此类疾病包括但不限于白血病、淋巴瘤，例如，急性髓样(或髓性)白血病(AML)、慢性髓样(或髓性)白血病(CML)、急性淋巴细胞(或成淋巴细胞)白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、边缘区淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、滤泡性淋巴瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)和多发性骨髓瘤(MM)。在一些实施方案中，疾病或病症是选自以下的B细胞恶性肿瘤：急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、成人ALL、慢性成淋巴细胞性白血病(CLL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，疾病或病症是NHL，并且NHL选自侵袭性NHL、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)NOS型(从头的和从惰性转化的)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、富含T细胞/ 组织细胞的大B细胞淋巴瘤(TCHRBCL)、伯基特淋巴瘤、套细胞淋巴瘤 (MCL)和/或滤泡性淋巴瘤(FL)，任选地，3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)。在一些方面，重组受体(如CAR)特异性地结合至与疾病或病症相关的或在与B细胞恶性肿瘤相关的病灶环境的细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、 ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30，或其组合。
在一些实施方案中，疾病或病症是骨髓瘤，如多发性骨髓瘤。在一些方面，重组受体(如CAR)特异性地结合至与疾病或病症相关的或在与多发性骨髓瘤相关的病灶环境的细胞中表达的抗原。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与多发性骨髓瘤相关的抗原。在一些方面，在多发性骨髓瘤上表达抗原，例如第二或另外抗原，如疾病特有抗原和/或相关抗原，如B细胞成熟抗原(BCMA)、G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)、CD38(环状 ADP核糖水解酶)、CD138(多配体聚糖-1、多配体聚糖、SYN-1)、CS-1(C S1、CD2子集1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)、BAFF-R、TACI和/ 或FcRH5。其他示例性多发性骨髓瘤抗原包括CD56、TIM-3、CD33、CD12 3、CD44、CD20、CD40、CD74、CD200、EGFR，β2-微球蛋白、HM1.24、 IGF-1R、IL-6R、TRAIL-R1和IIA型激活素受体(ActRIIA)。参见Benson和B yrd,J.Clin.Oncol.(2012)30(16):2013-15；Tao和Anderson,Bone Marrow R esearch(2011):924058；Chu等人,Leukemia(2013)28(4):917-27；Garfall等人,Discov Med.(2014)17(91):37-46。在一些实施方案中，抗原包括存在于淋巴样肿瘤、骨髓瘤、与AIDS相关的淋巴瘤和/或移植后淋巴组织增生上的抗原，如CD38。针对此类抗原的抗体或抗原结合片段是已知的并且包括例如以下文献中所述的那些：美国专利号8,153,765、8,603477、8,008,450；美国公开号US20120189622或US20100260748；和/或国际PCT公开号WO 2006 099875、WO 2009080829或WO 2012092612或WO 2014210064。在一些实施方案中，此类抗体或其抗原结合片段(例如scFv)包含在多特异性抗体、多特异性嵌合受体(如多特异性CAR)和/或多特异性细胞中。
在一些实施方案中，疾病或病症是感染性疾病或病症，例如但不限于病毒、逆转录病毒、细菌和原生动物感染、免疫缺陷、巨细胞病毒(CMV)、埃-巴二氏病毒(Epstein-Barrvirus，EBV)、腺病毒、BK多瘤病毒。在一些实施方案中，疾病或病症是自身免疫性或炎性疾病或病症，如关节炎(例如，类风湿性关节炎(RA))、I型糖尿病、系统性红斑狼疮(SLE)、炎性肠病、银屑病、硬皮病、自身免疫性甲状腺疾病、格雷夫斯病、克罗恩病、多发性硬化症、哮喘和/或与移植相关的疾病或病症。
在一些实施方案中，与疾病或障碍相关的抗原选自以下：αvβ6整合素 (avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为 NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、 CC基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、 CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、表皮生长因子蛋白(EGFR)、截短的表皮生长因子蛋白(tEGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40 (EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、胎儿乙酰胆碱受体、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、 Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB 二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-AI)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α (IL-22Ra)、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、 L1细胞粘附分子(L1CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富含亮氨酸的重复序列的8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、 MAGE-A3、MAGE-A6、间皮素、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白 1(MUC1)、MUC16、天然杀伤组2成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、优先表达抗原黑色素瘤 (PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶像孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、 Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知 B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、 CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b 或CD30。在一些实施方案中，所述抗原是病原体特异性抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)是通过自体转移来进行，其中所述细胞是从要接受所述细胞疗法的受试者或者从源自这个受试者的样品分离和/或以其他方式制备。因此，在一些方面，所述细胞源自需要治疗的受试者(例如，患者)，并且在分离和处理后将所述细胞给予同一受试者。
在一些实施方案中，所述细胞疗法(例如，过继T细胞疗法)通过同种异体转移进行，其中从将要接受或最终接受细胞疗法的受试者以外的受试者 (例如，第一受试者)分离和/或以其他方式制备细胞。在此类实施方案中，然后将所述细胞给予相同物种的不同受试者，例如第二受试者。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相同的。在一些实施方案中，第一和第二受试者在遗传上是相似的。在一些实施方案中，第二受试者表达与第一受试者相同的HLA类别或超型。
通过章节I中提供的方法生成的细胞(例如工程化细胞)可以通过任何合适的手段给予。在特定实施方案中，将来自两种或更多种单独输出组合物 (例如，通过章节I中所述的方法产生的经富集T细胞的组合物)的细胞合并为待给予的单一细胞组合物。在某些实施方案中，将来自单独输出组合物的细胞各自分开给予至受试者。在某些实施方案中，将CD4+T细胞与CD8+T 细胞分开给予。
在一些实施方案中，所述细胞可以是通过以下方式来给予：通过推注输注，通过注射(例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、球后注射、球周注射)或后近巩膜(posterior juxtascleral) 递送。在一些实施方案中，它们通过肠胃外、肺内和鼻内给予以及(如果局部治疗需要)病灶内给予。肠胃外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给予。在一些实施方案中，给定剂量是通过所述细胞的单次推注给予来给予。在一些实施方案中，给定剂量是例如在不超过3天的时间段内通过所述细胞的多次推注给予来给予，或通过所述细胞的连续输注给予来给予。在一些实施方案中，所述细胞剂量或任何其他疗法(例如，淋巴细胞清除疗法、干预疗法和/或组合疗法)的给予是通过门诊递送进行的。
为了预防或治疗疾病，适当的剂量可取决于待治疗的疾病类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、是针对预防目的还是治疗目的给予细胞、先前的治疗、受试者的临床病史和对细胞的应答以及主治医师的决断。在一些实施方案中，将组合物和细胞以合适的方式一次或经一系列治疗给予受试者。
在一些实施方案中，将细胞作为组合治疗的一部分给予，如与另一种治疗性干预如抗体或工程化细胞或受体或药剂(如细胞毒性剂或治疗剂)同时给予或以任何顺序依次给予。所述细胞在一些实施方案中是与一种或多种另外的治疗剂或结合另一种治疗性干预同时或以任何顺序依次共给予。在一些情况下，所述细胞是与另一种疗法共给予，其时间足够接近，使得细胞群增强一种或多种另外的治疗剂的作用，或反之亦然。在一些实施方案中，将所述细胞在所述一种或多种另外的治疗剂之前给予。在一些实施方案中，将细胞在所述一种或多种另外的治疗剂之后给予。在一些实施方案中，一种或多种另外的药剂包括细胞因子(例如IL-2)以例如增强持久性。在一些实施方案中，所述方法包括给予化学治疗剂。
在一些实施方案中，所述方法包括在所述给予之前给予化学治疗剂(例如，调理性化学治疗剂)例如以减小肿瘤负荷。
用免疫清除(例如，淋巴细胞清除)疗法预调理受试者在一些方面可以改善过继细胞疗法(ACT)的效果。
因此，在一些实施方案中，所述方法包括在起始细胞疗法之前将预调理剂给予至受试者，所述预调理剂如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可以在起始细胞疗法之前至少2天(如之前至少3、4、5、6或7天)，向受试者给予预调理剂。在一些实施方案中，在起始细胞疗法之前不超过7天(如之前不超过6、5、4、3或2天)，向受试者给予预调理剂。
在一些实施方案中，用环磷酰胺以在或在约20mg/kg与100mg/kg之间，如在或在约40mg/kg与80mg/kg之间的剂量对受试者进行预调理。在一些方面，用或用约60mg/kg的环磷酰胺对受试者进行预调理。在一些实施方案中，环磷酰胺可以按单剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天一次给予环磷酰胺，持续一天或两天。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含环磷酰胺的情况下，以在或在约100mg/m2与500mg/m2之间，如在或在约200mg/m2与400mg/m2之间或250mg/m2与350mg/m2之间(包括端值)的剂量向受试者给予环磷酰胺。在一些情形中，向受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺。在一些实施方案中，环磷酰胺可以按单剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予环磷酰胺，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情形中，在起始细胞疗法之前，每天向受试者给予约300mg/m2的环磷酰胺，持续3天。
在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含氟达拉滨的情况下，以在或在约1mg/m2与100mg/m2之间，如在或在约10mg/m2与75mg/m2之间、15 mg/m2与50mg/m2之间、20mg/m2与40mg/m2之间或24mg/m2与35mg/m2之间 (包括端值)的剂量向受试者给予氟达拉滨。在一些情形中，向受试者给予约30mg/m2的氟达拉滨。在一些实施方案中，氟达拉滨可以按单剂量给予或者可以按多个剂量给予，如每天给药、每隔一天给药或每三天给药。在一些实施方案中，每天给予氟达拉滨，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情形中，在起始细胞疗法之前，每天向受试者给予约30mg/m2的氟达拉滨，持续3天。
在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂包含药剂的组合，如环磷酰胺和氟达拉滨的组合。因此，药剂的组合可以包括任何剂量或给予时间表(如上述那些剂量或给予时间表)下的环磷酰胺以及任何剂量或给予时间表(如上述那些剂量或给予时间表)下的氟达拉滨。例如，在一些方面，在第一剂量或后续剂量之前，向受试者给予60mg/kg(约2g/m2)的环磷酰胺和3至5个剂量的25mg/m2氟达拉滨。
在一些实施方案中，在给予细胞后，例如通过许多已知方法中的任一种测量工程化细胞群的生物学活性。要评估的参数包括工程化或天然T细胞或其他免疫细胞与抗原的特异性结合，其是在体内例如通过成像评估，或离体例如通过ELISA或流式细胞术评估。在某些实施方案中，工程化细胞破坏靶细胞的能力可以使用任何合适的已知方法来测量，所述方法例如描述于例如以下文献中的细胞毒性测定：Kochenderfer等人,J.Immunotherapy,32(7): 689-702(2009)，和Herman等人J.Immunological Methods,285(1):25-40 (2004)。在某些实施方案中，通过测定一种或多种细胞因子(如CD107a、IFNγ、IL-2和TNF)的表达和/或分泌来测量细胞的生物学活性。在一些方面,所述生物活性是通过评估临床结果(如肿瘤负荷或负担的减小)来测量。
在一些实施方案中，将工程化细胞以任何数量的方式进一步修饰，从而增加其治疗或预防功效。例如，可以将所述群体表达的工程化CAR或TCR直接或通过接头间接缀合至靶向部分。将化合物(例如，CAR或TCR)与靶向部分缀合的实践是已知的。参见，例如，Wadwa等人,J.Drug Targeting 3:1 1 1(1995)和美国专利5,087,616。
在一些实施方案中，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物将一定剂量的细胞给予受试者。在一些实施方案中，所述剂量的大小或时间安排是根据所述受试者的特定疾病或病症来确定。在一些情况下，鉴于所提供的描述，针对特定疾病的所述剂量的大小或时间安排可以凭经验来确定。
在一些实施方案中，细胞的所述剂量包含在2x 105或约2x 105个细胞/kg 与2x106或约2x 106个细胞/kg之间，如在4x 105或约4x 105个细胞/kg与1x 106或约1x 106个细胞/kg之间或在6x 105或约6x 105个细胞/kg与8x 105或约8 x 105个细胞/kg之间。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包含不超过2x 105个细胞(例如，抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如不超过或不超过约3x 105个细胞/kg、不超过或不超过约4x 105个细胞/kg、不超过或不超过约5x 105个细胞/kg、不超过或不超过约6x 105个细胞/kg、不超过或不超过约7x 105个细胞/kg、不超过或不超过约8x 105个细胞/kg、不超过或不超过约9x 105个细胞/kg、不超过或不超过约1x 106个细胞/kg、或不超过或不超过约2x106个细胞/kg。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包含至少或至少约或为或为约2x 105个细胞(例如，抗原表达细胞，如CAR表达细胞)/公斤受试者体重(细胞/kg)，如至少或至少约或为或为约3x 105个细胞 /kg、至少或至少约或为或为约4x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或为约5 x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或为约6x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或为约7x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或为约8x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或为约9x 105个细胞/kg、至少或至少约或为或为约1x 106个细胞/kg、或至少或至少约或为或为约2x 106个细胞/kg。
在某些实施方案中，所述细胞或单独的细胞亚型群体以约100万至约 1000亿个细胞和/或按每公斤体重该细胞量的范围给予受试者，例如像100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约 250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5 亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤体重的这些范围之间的任何值。剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。
在一些实施方案中，细胞的所述剂量是细胞的平坦剂量或细胞的固定剂量，使得细胞的所述剂量与受试者的体表面积或体重无关或不基于受试者的体表面积或体重。
在一些实施方案中，例如，在所述受试者是人的情况下，所述剂量包括少于约1x108个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如在约1x 106至1x 108个此类细胞的范围内，如2x 106、5 x 106、1x 107、5x 107或1x 108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，在所述受试者是人的情况下，所述剂量包括约1x 106与3x 108个之间的总重组受体(例如，CAR)表达细胞，例如在约1x 107至2 x 108个此类细胞的范围内，如1x 107、5x 107、1x 108或1.5x 108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，给予患者多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，所述细胞剂量包括给予从或从约1x 105至5x 108个总重组受体表达T细胞或总T细胞、 1x 105至1x 108个总重组受体表达T细胞或总T细胞、从或从约5x105至1x 107个总重组受体表达T细胞或总T细胞或者从或从约1x 106至1x 107个总重组受体表达T细胞或总T细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，所述剂量的T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞或 CD4+和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，例如，在所述受试者是人的情况下，所述剂量的 CD8+T细胞(包括在剂量中包括CD4+和CD8+T细胞)包括约1x 106与1x 108个之间的总重组受体(例如，CAR)表达CD8+细胞，例如在约5x 106至1x 108个此类细胞的范围内，如1x 107、2.5x 107、5x107、7.5x 107或1x 108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，给予患者多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包括给予从或从约1x 107至0.75x 108个表达重组受体的总 CD8+T细胞、1x 107至2.5x 107个表达重组受体的总CD8+T细胞、从或从约 1x 107至0.75x 108个表达重组受体的总CD8+T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包括给予或给予约1x 107、2.5x 107、5x 107、 7.5x 107或1x 108个表达重组受体的总CD8+T细胞。
在一些实施方案中，细胞(例如，重组受体表达T细胞)的剂量作为单剂量给予受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长的时间段内仅给予一次。
在过继细胞疗法的情况下，给予给定“剂量”涵盖给予作为单一组合物和/或单次不间断给予(例如，作为单次注射或连续输注)的给定量或数量的细胞，并且还涵盖在指定时间段中(如在不超过3天中)给予在多种单独组合物或输注中提供的作为分割剂量或作为多种组合物的给定量或数量的细胞。因此，在一些情况下，所述剂量是在单一时间点给予或起始的指定数量的细胞的单次或连续给予。然而，在一些情况下，所述剂量是在不超过三天的时间段中以多次注射或输注(如每天一次，持续三天或两天)来给予，或者是在一天的时间段中通过多次输注来给予。
因此，在一些方面，所述剂量的细胞以单一药物组合物给予。在一些实施方案中，所述细胞剂量以共同含有所述剂量的细胞的多种组合物给予。
在一些实施方案中，术语“分割剂量”是指被分割使得在多于一天中给予的剂量。这种类型的给药包括在本发明方法中并且被认为是单剂量。
因此，所述细胞剂量可以作为分割剂量给予，例如随时间给予的分割剂量。例如，在一些实施方案中，所述剂量可以在2天内或在3天内给予所述受试者。用于分割给药的示例性方法包括在第一天给予25％的剂量并在第二天给予剩余的75％的剂量。在其他实施方案中，可以在第一天给予33％的剂量，并且在第二天给予剩余的67％。在一些方面，在第一天给予10％的剂量，在第二天给予30％的剂量，并且在第三天给予60％的剂量。在一些实施方案中，所述分割剂量的分布不超过3天。
在一些实施方案中，所述剂量的细胞可以通过给予多种组合物或溶液 (如第一和第二，任选地更多)来给予，每种组合物或溶液含有所述剂量的一些细胞。在一些方面，任选地在某一时间段内，分开地或独立地给予各自含有不同细胞群和/或细胞亚型的所述多种组合物。例如，细胞群或细胞亚型可以分别包括CD8+和CD4+T细胞，和/或分别包含富集CD8+和CD4+的群体，例如CD4+和/或CD8+T细胞，其各自单独地包括基因工程化以表达重组受体的细胞。在一些实施方案中，所述剂量的给予包括给予第一组合物，所述第一组合物包含一定剂量的CD8+T细胞或一定剂量的CD4+T细胞，以及给予第二组合物，所述第二组合物包含CD4+T细胞和CD8+T细胞的剂量中的另一者。
在一些实施方案中，所述组合物或剂量的给予(例如，所述多种细胞组合物的给予)涉及分开给予细胞组合物。在一些实施方案中，所述细胞组合物是通过章节I中所述的方法产生的单独输出组合物。在一些方面，分开给予同时或按任何顺序依次进行。在一些实施方案中，所述剂量包含第一组合物和第二组合物，并且所述第一组合物和第二组合物的给予相隔0至12小时，相隔0至6小时或相隔0至2小时。在一些实施方案中，第一组合物的给予的起始和第二组合物的给予的起始相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟进行。在一些实施方案中，第一组合物的给予的起始和/或完成和第二组合物的给予的完成和/或起始相隔不超过2小时、不超过1小时或不超过30分钟，相隔不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟进行。
在一些组合物中，第一组合物(例如所述剂量的第一组合物)包含CD4+ T细胞。在一些组合物中，第一组合物(例如所述剂量的第一组合物)包含 CD8+T细胞。在一些实施方案中，第一组合物是在第二组合物之前给予的。
在一些实施方案中，细胞的所述剂量或组合物包含限定或目标比率的表达重组受体的CD4+T细胞与表达重组受体的CD8+T细胞和/或限定或目标比率的CD4+T细胞与CD8+T细胞，所述比率任选地为或为大约1:1或者在大约1:3与大约3:1之间，如大约1:1。在一些方面，具有目标或所需比率的不同细胞群(如CD4+:CD8+比率或CAR+CD4+:CAR+CD8+比率，例如1: 1)的组合物或剂量的给予涉及给予含有一个所述群体的细胞组合物，并且然后给予包含另一所述群体的单独细胞组合物，其中所述给予是以或大约以目标或所需比率来进行的。在一些方面，以限定比率给予细胞的剂量或组合物导致T细胞疗法的扩增、持久性和/或抗肿瘤活性得到改善。
在一些实施方案中，受试者接受细胞的多个剂量，例如两个或更多个剂量或多个连续剂量。在一些实施方案中，将两个剂量给予受试者。在一些实施方案中，受试者接受连续剂量，例如，第二剂量是在第一剂量后大约4、5、 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天给予的。在一些实施方案中，在第一剂量后给予多个连续剂量，使得在给予连续剂量后给予另外一个或多个剂量。在一些方面，以另外的剂量给予受试者的细胞数量与第一剂量和/或连续剂量相同或相似。在一些实施方案中，所述另外一个或多个剂量大于先前剂量。
在一些方面，第一和/或连续剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结果(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
在一些方面，第一剂量的给予与连续剂量的给予之间的时间为约9至约 35天、约14至约28天或15至27天。在一些实施方案中，给予连续剂量是在给予第一剂量后大于约14天且小于约28天的时间点。在一些方面，第一剂量与连续剂量之间的时间为约21天。在一些实施方案中，在给予连续剂量后给予另外一个或多个剂量(例如连续剂量)。在一些方面，在给予先前剂量后至少约14天且小于约28天给予所述另外一个或多个连续剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天(例如，在先前剂量后4、5、6、7、8、9、10、 11、12或13天)给予另外的剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约 14天不给予剂量，和/或在先前剂量后超过约28天不给予剂量。
在一些实施方案中，细胞(例如，重组受体表达细胞)的剂量包含两个剂量(例如，双剂量)，包含T细胞的第一剂量和T细胞的连续剂量，其中第一剂量和第二剂量中的一个或两个包含给予T细胞的分割剂量。
在一些实施方案中，所述细胞剂量通常足够大以有效减轻疾病负荷。
在一些实施方案中，所述细胞以所需剂量给予，所述所需剂量在一些方面包括所需剂量或数量的细胞或一种或多种细胞类型和/或所需比率的细胞类型。因此，在一些实施方案中，细胞剂量基于细胞总数(或每kg体重的细胞数量)和所需的单独群体或亚型的比率，如CD4+与CD8+的比率。在一些实施方案中，所述细胞剂量基于单独群体中或单独细胞类型的细胞的所需总数(或每kg体重的细胞数)。在一些实施方案中，所述剂量基于此类特征的组合，此类特征是例如所需的总细胞数、所需比率和所需的单独群体中的细胞总数。
在一些实施方案中，细胞(如CD8+和CD4+T细胞)的所述群体或亚型是以总细胞的所需剂量(如T细胞的所需剂量)来给予，或在所述所需剂量的容忍差异内给予。在一些方面，所需剂量是所需细胞数或被给予所述细胞的受试者的每单位体重的所需细胞数，例如细胞/kg。在一些方面，所需剂量等于或高于最小细胞数或每单位体重的最小细胞数。在一些方面，在以所需剂量给予的总细胞中，单独群体或亚型是以等于或接近所需输出比率(如CD4+与CD8+比率)存在，例如，在这个比率的某一容忍差异或误差内。
在一些实施方案中，所述细胞是以细胞的一种或多种单独群体或亚型的所需剂量(如CD4+细胞的所需剂量和/或CD8+细胞的所需剂量)来给予，或在所述所需剂量的容忍差异内给予。在一些方面，所需剂量是所需的亚型或群体的细胞数或所需的被给予所述细胞的受试者的每单位体重的此类细胞数(例如细胞/kg)。在一些方面，所述所需剂量等于或高于群体或亚型的最小细胞数或每单位体重的所述群体或亚型的最小细胞数。
因此，在一些实施方案中，所述剂量是基于总细胞的所需固定剂量和所需比率，和/或是基于一种或多种(例如，每种)单独亚型或亚群的所需固定剂量。因此，在一些实施方案中，所述剂量是基于所需的T细胞的固定或最小剂量和所需的CD4+与CD8+T细胞的比率，和/或是基于所需的CD4+和/或 CD8+T细胞的固定或最小剂量。
在一些实施方案中，所述细胞是以多种细胞群或亚型(如CD4+和CD8+ T细胞或亚型)的所需输出比率来给予，或在所述所需输出比率的容忍范围内给予。在一些方面，所述所需比率可以是特定比率或者可以是比率的范围。例如，在一些实施方案中，所述所需比率(例如，CD4+与CD8+T细胞的比率)在1:5或约1:5与5:1或约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)，或在 1:3或约1:3与3:1或约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，如在2:1或约2:1与1:5或约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1)，如为或为约5:1、 4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、 1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、 1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、 1:4.5或1:5。在一些方面，所述容忍差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％(包括这些范围之间的任何值)内。在某些实施方案中，将经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的组合物以所需比率合并并且作为单一细胞组合物给予至受试者。在特定实施方案中，将经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的组合物作为单独组合物以所需比率给予。
在特定实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指重组受体(例如，CAR) 表达细胞的数量。在其他实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指给予的所有细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)的数量或浓度。
在一些方面，所述剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结果(例如， CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
在一些实施方案中，所述方法还包括给予一个或多个另外的剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞和/或淋巴细胞清除疗法，和/或重复所述方法的一个或多个步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量与初始剂量相同。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量不同于初始剂量，例如更高，如比初始剂量高2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10 倍或更多倍，或者更低，如比初始剂量低2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、 8倍、9倍或10倍或更多倍。在一些实施方案中，基于以下确定一个或多个另外的剂量的给予：受试者对初试治疗或任何先前治疗的反应、受试者的疾病负荷(如肿瘤负担、体积、大小或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结果(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所给予的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。
VI.制品
还提供了制品和试剂盒，其含有通过本文提供的方法(如本文如在章节 I中所述的方法)产生的表达重组受体的工程化细胞，例如细胞的输出组合物；和任选的使用说明书，例如用于如通过本文如在章节III中所述的方法将所述工程化细胞给予至受试者的说明书。
在一些实施方案中，本文提供了制品和/或试剂盒，其包括包含治疗有效量的本文所述的任何工程化细胞的组合物；和向受试者给予以治疗疾病或病症的说明书。在一些实施方案中，所述说明书可以规定用于给予本文所提供的细胞的方法的一些或所有要素。在一些实施方案中，所述说明书规定给予用于细胞疗法的细胞的具体指导，例如，用于给予的剂量、时间安排、受试者的选择和/或鉴定以及用于给予的条件。在一些实施方案中，所述制品和/ 或试剂盒进一步包含用于淋巴细胞清除疗法的药剂，并且任选地进一步包括用于给予淋巴细胞清除疗法的说明书。在一些实施方案中，所述说明书可以作为伴随用于给予的组合物的标签或包装说明书而包含在内。
在一些实施方案中，所述制品可以具有容器(任选地小瓶)，所述容器含有表达重组受体的经富集CD4+T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述制品或试剂盒包含，任选地包括第二容器(任选地第二小瓶)，所述第二容器含有表达重组受体的经富集CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，低温保护剂与所述细胞一起被包括。在一些方面，所述容器是小瓶或袋。在一些实施方案中，所述容器含有经富集CD4+和CD8+T细胞的组合物。
在一些实施方案中，所述容器内的经富集CD4+T细胞的组合物包含至少 60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，所述容器的所述组合物包含至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD4+T细胞。在某些实施方案中，所述容器内的经富集CD4+T细胞的组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD8+T细胞，和/或不含有CD8+T细胞，和/或不含或基本上不含CD8+T 细胞。
在一些实施方案中，所述容器内的经富集CD8+T细胞的组合物包含至少 60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的CD8+ T细胞。在特定实施方案中，所述容器内的所述组合物包含至少30％、至少 40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或为或为约100％的表达重组受体和/或已用重组多核苷酸转导或转染的CD8+T细胞。在某些实施方案中，给予至受试者的经富集CD8+T细胞的输出组合物包含少于40％、少于35％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的CD4+T细胞，和/或不含有CD4+T细胞，和/或不含或基本上不含CD4+T细胞。
在一些实施方案中，说明书规定了待给予的细胞的剂量。例如，在一些实施方案中，所述说明书中规定的剂量包括在约1x 106与3x 108个之间的总重组受体(例如，CAR)表达细胞，例如，在约1x 107至2x 108个范围内的此类细胞，如1x 107、5x 107、1x 108或1.5x108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，给予患者多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。
在一些实施方案中，所述容器(如所述小瓶)包含大于或大于约10x 106个T细胞或重组受体表达T细胞、大于或大于约15x 106个T细胞或重组受体表达T细胞、大于或大于约25x 106个T细胞或重组受体表达T细胞。在一些方面，所述小瓶包含约1000万个细胞/ml至约7000万个细胞/ml、约1000万个细胞/ml 至约5000万个细胞/ml、约1000万个细胞/ml至约2500万个细胞/ml、约1000万个细胞/ml至约1500万个细胞/ml、1500万个细胞/ml至约7000万个细胞/ml、约1500万个细胞/ml至约5000万个细胞/ml、约1500万个细胞/ml至约2500万个细胞/ml、约2500万个细胞/ml至约7000万个细胞/ml、约2500万个细胞/ml至约5000万个细胞/ml、和约5000万个细胞/ml至约7000万个细胞/ml。
在一些实施方案中，规定用于给予的多个小瓶或多个细胞或单位剂量的细胞共同包含一定剂量的细胞，所述剂量包含从或从约1x 105至5x 108个总重组受体表达T细胞或总T细胞、1x 105至1x 108个总重组受体表达T细胞或总T细胞、从或从约5x 105至1x 107个总重组受体表达T细胞或总T细胞、或从或从约1x 106至1x 107个总重组受体表达T细胞或总T细胞，每个都包含端值。在一些方面，所述制品包含一个或多个单位剂量的所述CD4+和CD8+T 细胞或CD4+受体+T细胞和CD8+受体+T细胞，其中所述单位剂量包含在1x 107或约1x 107个与2x 108或约2x 108个之间的重组受体表达T细胞、在5x 107或约5x 107个与1.5x 108或约1.5x 108个之间的重组受体表达T细胞、5x 107或约5x 107个重组受体表达T细胞、1x 108或约1x 108个重组受体表达T细胞、或1.5x 108或约1.5x 108个重组受体表达T细胞，任选地其中所述制品中的信息规定给予一个或多个单位剂量和/或对应于此一个或多个单位剂量的体积。在一些情况下，所述制品包含一个或多个单位剂量的所述CD8+T细胞，其中所述剂量包含在5x 106或约5x 106个与1x 108或约1x 108个之间的重组受体表达CD8+T细胞，所述剂量包含在1x 107或约1x 107个与0.75x 108或约0.75 x 108个之间的重组受体表达CD8+T细胞，所述剂量包含2.5x 107或约2.5x 107个重组受体表达CD8+T细胞，或所述剂量包含5x107或约5x 107个重组受体表达CD8+T细胞，或所述剂量包含0.75x 108或约0.75x 108个重组受体表达CD8+T细胞，任选地其中所述制品中的信息规定给予一个或多个单位剂量和/或对应于此一个或多个单位剂量的体积。在一些实施方案中，所述制品中的细胞总地包含一定剂量的细胞，所述剂量包含不超过1x 108个总重组受体表达T细胞或总T细胞、不超过1x107个总重组受体表达T细胞或总T细胞、不超过0.5x 107个总重组受体表达T细胞或总T细胞、不超过1x 106个总重组受体表达T细胞或总T细胞、不超过0.5x 106个总重组受体表达T细胞或总T细胞。
在一些实施方案中，所述说明书可以规定给予的剂量方案和时间安排。例如，在一些实施方案中，所述说明书可以规定向所述受试者给予细胞的多个剂量，例如，两个或更多个剂量。在一些实施方案中，所述说明书规定所述多个剂量的时间安排，例如，第二剂量是在第一剂量之后约4、5、6、7、 8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天时给予；和/或规定每个剂量中的剂量量。
在一些实施方案中，所述制品或试剂盒包含表达重组受体的经富集 CD4+T细胞的组合物；和用于向患有疾病或病症的受试者给予所述经富集 CD4+T细胞的组合物的全部或一部分以及进一步给予表达重组受体的CD8+ T细胞的说明书。在一些实施方案中，所述说明书规定在给予所述CD8+T细胞之前给予所述CD4+T细胞。在一些情况下，所述说明书规定在给予所述 CD4+T细胞之前给予所述CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述制品或试剂盒包含表达重组受体的多个CD8+T细胞；和用于向患有疾病或病症的受试者给予所述多个CD8+T细胞的全部或一部分以及表达重组受体的CD4+T细胞的说明书。在一些实施方案中，所述说明书规定给予所述细胞的剂量方案和时间安排。
在一些方面，所述说明书规定相隔0至12小时、相隔0至6小时或相隔0至 2小时给予所述CD4+T细胞的全部或一部分以及所述CD8+T细胞的全部或一部分。在一些情况下，所述说明书规定相隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟给予所述CD4+ T细胞和所述CD8+T细胞。
在一些实施方案中，所述说明书规定了细胞或一种或多种细胞类型的剂量或数量和/或细胞类型(例如，单独群体或亚型)的比率，如CD4+与CD8+ 的比率。在一些实施方案中，细胞的群体或亚型，如CD8+和CD4+T细胞。例如，在一些实施方案中，所述说明书规定，所述细胞是以多个细胞群体或亚型(如CD4+和CD8+T细胞或亚型)的输出比率来给予，或在所述输出比率的容忍范围内给予，所述输出比率是在1:5或约1:5与5:1或约5:1之间 (或大于约1:5且小于约5:1)，或在1:3或约1:3与3:1或约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，如在2:1或约2:1与1:5或约1:5之间(或大于约1: 5且小于约2:1)，如为或为约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、 1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、 1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、 1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在某些实施方案中，所述说明书规定将经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的组合物以所需比率合并并且作为单一细胞组合物给予至受试者。在特定实施方案中，所述说明书规定将经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的组合物作为单独组合物以所需比率给予。在一些方面，所述容忍差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％(包括这些范围之间的任何值)内。
VII.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或用辞旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不一定应当被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。多肽(包括所提供的受体和其他多肽，例如接头或肽) 可以包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。在一些方面，多肽可以含有关于原生或天然序列的修饰，只要蛋白质保持所需活性即可。这些修饰可能是故意的(如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(如通过产生蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误)。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。在一些实施方案中，给予一种或多种药剂、细胞、细胞群或组合物的受试者 (例如，患者)是哺乳动物，通常是灵长类动物，如人。在一些实施方案中，所述灵长类动物是猴或猿。受试者可以是雄性或雌性，并且可以是任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青春期、成年和老年受试者。在一些实施方案中，受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物。
如本文所用，“治疗”(“treatment”)(及其语法变体如“治疗”(“treat”或“treating”))是指疾病或病症或障碍、或者与之相关的症状、不良效果或结果或表型的完全或部分改善或减轻。所希望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓和症状、减少疾病的任何直接或间接病理后果、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或减缓疾病状态以及缓解或改善预后。所述术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结果的一种或多种影响。
如本文所用，“延迟疾病的发生”意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(如癌症)的发生。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。在一些实施方案中，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，如转移的发生。
如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发展或延缓疾病的进展。
如本文所用，“抑制”功能或活性是当与除了目的条件或参数以外其他都相同的条件相比时，或者可替代地与另一种条件相比时，降低功能或活性。例如，与不存在细胞的情况下的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。
在给予的情况下，药剂(例如，药物配制品、细胞或组合物)的“有效量”是指在必要的剂量/量下和必要的时间段内有效实现所需结果(如治疗或预防结果)的量。
药剂(例如，药物配制品或细胞)的“治疗有效量”是指在所需剂量下和所需时间段中有效实现所需治疗结果(如针对疾病、病症或障碍的治疗) 和/或治疗的药代动力学或药效学作用的量。治疗有效量可以根据诸如以下的因素而变化：疾病状态、受试者的年龄、性别和体重、和所给予的细胞群。在一些实施方案中，所提供的方法涉及以有效量(例如，治疗有效量)给予细胞和/或组合物。
“预防有效量”是指在必要的剂量下和必要的时间段内有效实现所需预防结果的量。通常但不是必须的，因为预防剂量是在疾病之前或早期在受试者中使用的，所以预防有效量将小于治疗有效量。在肿瘤负荷较低的情况下，在一些方面，预防有效量将高于治疗有效量。
如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。
除非上下文另有明确规定，否则如本文所用，单数形式“一种/一个” (“a”)、“一种/一个”(“an”)和“所述”(“the”)包括复数指示物。例如，“一种/一个”(“a”)或“一种/一个”(“an”)意指“至少一种/至少一个”或“一种或多种/一个或多个”。
在整个本公开文本中，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应当理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对所要求保护的主题的范围的硬性限制。因此，应当将范围的描述视为已明确公开所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，在提供值的范围的情况下，应理解，该范围的上限与下限之间的每个中间值以及该所陈述范围中的任何其他所陈述值或中间值涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在所述较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何明确排除的限值。在所陈述范围包括所述限值中的一个或两个的情况下，排除那些所包括限值中的任何一个或两个的范围也被包括在所要求保护的主题内。无论范围的宽度如何，这都适用。
如本文所用的，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。
如本文所用，当提及一种或多种特定细胞类型或细胞群时，“富集”是指例如与所述组合物中的总细胞数或组合物体积相比，或者相对于其他细胞类型，如通过基于所述群体或细胞表达的标记的阳性选择，或通过基于在要耗尽的所述细胞群或细胞上不存在的标记的阴性选择，增加所述细胞类型或群体的数量或百分比。所述术语不需要从组合物完全去除其他细胞、细胞类型或群体，并且不需要如此富集的细胞在被富集组合物中以等于或甚至接近 100％存在。
如本文所用，细胞或细胞群针对特定标记呈“阳性”的陈述是指，特定标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中的可检测存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术(例如通过用特异性地结合至所述标记的抗体染色并检测所述抗体)所检测的表面表达的存在，其中所述染色可通过流式细胞术以如下水平检测到：显著高于在其他都相同的条件下用同种型匹配的对照或荧光减一(FMO)门控对照通过实施相同程序检测到的染色的水平，和/或与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平基本上相似的水平，和/ 或显著高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平的水平。
如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阴性”的陈述是指，特定标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中不存在基本上可检测的存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术(例如通过用特异性地结合至所述标记的抗体染色并检测所述抗体)所检测的表面表达的不存在，其中所述染色未通过流式细胞术以如下水平检测到：显著高于在其他都相同的条件下用同种型匹配的对照或荧光减一(FMO)门控对照通过实施相同程序检测到的染色的水平，和/或显著低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平的水平，和/或与已知对所述标记呈阴性的细胞的水平基本上相似的水平。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播其所连接的另一核酸分子的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在此被称为“表达载体”。
VIII.示例性实施方案
所提供的实施方案包括：
1.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括在抑制mTOR活性的药剂存在下培育包含包括用重组受体工程化的细胞的原代人T 细胞的工程化细胞组合物，其中所述组合物中的细胞在培育之前尚未暴露于所述药剂；并且
其中所述方法导致所述组合物中的所述细胞的增殖或扩增以产生包含工程化T细胞的输出组合物。
2.根据实施方案1所述的方法，其中所述原代T细胞是CD4+和/或CD8+ T细胞。
3.根据实施方案1或2所述的方法，其中所述工程化T细胞组合物包含经富集CD4+T细胞。
4.根据实施方案1或2所述的方法，其中所述工程化T细胞组合物包含经富集CD8+T细胞。
5.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括在抑制 mTOR活性的药剂存在下培育包含包括用重组受体工程化的T细胞的经富集 CD4+和/或经富集CD8+原代人T细胞的工程化细胞组合物；
其中所述方法导致所述组合物中细胞的增殖或扩增以产生包含工程化的经富集CD4+或经富集CD8+T细胞的输出组合物。
6.根据实施方案2、3或5中任一项所述的方法，其中所述工程化T细胞组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％ CD4+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
7.根据实施方案2、4或5中任一项所述的方法，其中所述工程化T细胞组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％ CD8+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD8+原代人T细胞组成。
8.根据实施方案2-5中任一项所述的方法，其中所述工程化T细胞组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％ CD4+和CD8+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+和CD8+原代人T细胞组成。
9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述培育是在一种或多种细胞因子存在下进行，任选地其中所述一种或多种细胞因子包括IL-2、 IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、G-CSF和GM-CSF中的一种或多种，任选地其中所述一种或多种细胞因子包括IL-2、IL-7或IL-15。
10.根据实施方案9所述的方法，其中所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。
11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中在所述培育之前，所述方法进一步包括：
(a)在刺激条件下孵育包含原代T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括存在能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂，从而生成经刺激组合物；并且
(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而生成包含工程化T细胞的工程化组合物。
12.根据实施方案11所述的方法，其中所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含原代CD4+和/或CD8+T细胞。
13.根据实施方案11或12所述的方法，其中所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含经富集CD4+T细胞。
14.根据实施方案11或12所述的方法，其中所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含经富集CD8+T细胞。
15.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)在刺激条件下孵育包含针对CD4+和/或CD8+原代人T细胞进行富集的T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)抑制 mTOR活性的药剂；以及
(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而生成包含工程化T细胞的工程化组合物。
16.根据实施方案12、13和15中任一项所述的方法，其中所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
17.根据实施方案12、14或15中任一项所述的方法，其中所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD8+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD8+原代人T细胞组成。
18.根据实施方案12-15中任一项所述的方法，其中所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+和CD8+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+和CD8+原代人T细胞组成。
19.根据实施方案1-18中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是小分子、小有机分子、多核苷酸、寡核苷酸、siRNA或多肽，任选地其中所述抑制mTOR活性的药剂是小有机分子。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂抑制mTORC1和/或mTORC2激酶活性。
21.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂抑制至少一种另外的激酶的活性，任选地其中所述至少一种另外的激酶是PI3K。
22.根据实施方案19-21中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是BEZ235、BGT226、GDC0980、NVP-BEZ235、PF-04691502、PI-103、 SAR245409、SF1126、VS5584或XL765。
23.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂：
(i)不抑制PI3K活性；
(ii)在针对mTOR活性的IC50下不可检测地抑制PI3K活性；和/或
(iii)在所有可检测地抑制mTOR活性的浓度下均不可检测地抑制PI3K。
24.根据实施方案1-19或23中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR 活性的药剂抑制mTORC1和mTORC2激酶活性。
25.根据实施方案1-19、23或24中任一项所述的方法，其中所述抑制 mTOR活性的药剂是吡唑并嘧啶、Torin l、Torkinib、PP30、Ku-0063794、 WAY-600(Wyeth)、WAY-687(Wyeth)、WAY-354(Wyeth)、OSI-027、DS3078a 或AZD8055。
26.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂选择性地抑制mTORC1活性。
27.根据26所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂：
(i)不抑制mTORC2活性；
(ii)在针对mTORC1活性的IC50下不可检测地抑制mTORC2活性；和/或
(iii)在所有可检测地抑制mTORC1活性的浓度下均不可检测地抑制 mTORC2。
28.根据实施方案26或27所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是雷帕霉素、替西罗莫司、依维莫司、地弗莫司或AZD8055。
29.根据实施方案1-19、23或24中任一项所述的方法，其中所述药剂包括式I中所示的式，
Figure BDA0002556467450001571
其中R1是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，
R2是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，并且
R3和R4独立地是H或C1-8烷基。
30.根据实施方案29所述的方法，其中R1是取代的芳基、取代或未取代的杂芳基，如取代的苯基。
31.根据实施方案29或30所述的方法，其中R2是取代或未取代的芳基和/或取代或未取代的苯基。
32.根据实施方案29-31中任一项所述的方法，其中取代的基团是被一个或多个如下基团取代：卤素；C1-8烷基；C2-8烯基；C2-8炔基；羟基；C1-8烷氧基；氨基；硝基；硫醇；硫醚；亚胺；氰基；酰胺基；膦酸基；膦；羧基；硫代羰基；磺酰基；磺酰胺；酮；醛；酯；羰基；卤代烷基；B(OH)2；碳环环烷基；杂环烷基；单环或稠合或非稠合多环芳基或杂芳基；氨基；O- 低级烷基；O-芳基；芳基；芳基-低级烷基；CO2CH3；CONH2；OCH2CONH2； NH2；SO2NH2；OCHF2；CF3；或OCF3基团。
33.根据实施方案1-19、23、24或29-32中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物63。
34.根据实施方案1-19、23或24中任一项所述的方法，其中所述药剂包括式(II)中所示的式，
Figure BDA0002556467450001581
其中L是直接键、NH或O，
Y是N或CR3，
其中R1是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的C2-8烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，
R2是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，
R3是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、-NHR4或 -N(R4)2，并且
R4在每次出现时独立地是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基。
35.根据实施方案34所述的方法，其中R1是取代的芳基和/或取代的苯基。
36.根据实施方案34或35所述的方法，其中Y是CH。
37.根据实施方案34-36中任一项所述的方法，其中L是直接键。
38.根据实施方案34-37中任一项所述的方法，其中R1是取代的芳基并且R2是被一个或多个选自以下的取代基取代的C1-8烷基：烷氧基、氨基、羟基、环烷基或杂环烷基。
39.根据实施方案38所述的方法，其中R2是被杂环烷基取代的C1-8烷基。
40.根据实施方案1-19、23、24或34-39中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物155。
41.根据实施方案1-19、23或24中任一项所述的方法，其中所述药剂包括式III中所示的式
Figure BDA0002556467450001591
其中R1是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基或取代或未取代的杂环基烷基，
R2是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳烷基或取代或未取代的环烷基烷基，并且
R3是H，或取代或未取代的C1-8烷基。
42.根据实施方案41所述的方法，其中R1是取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
43.根据实施方案41或42所述的方法，其中R1是取代的吡啶基。
44.根据实施方案41-43中任一项所述的方法，其中R1是被一个或多个独立地选自以下的取代基取代的吡啶基：取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的杂环基、卤素、氨基羰基、氰基、羟基烷基、-OR和-NR2，其中每个R独立地是H，或取代或未取代的C1-4烷基。在一些实施方案中，R1是1H- 吡咯并[2,3-b]吡啶基或苯并咪唑基，任选地被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：取代或未取代的C1-8烷基和-NR2，其中R独立地是H，或取代或未取代的C1-4烷基。
45.根据实施方案41-44中任一项所述的方法，其中R1是
Figure BDA0002556467450001601
其中R在每次出现时独立地是H、或取代或未取代的C1-4烷基(例如，甲基)；R1在每次出现时独立地是取代或未取代的C1-4烷基、卤素、氰基、-OR 或-NR2；m是0-3；并且n是0-3。
46.根据实施方案41-45中任一项所述的方法，其中R2是H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、环戊基、环己基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、(C1-4烷基)-苯基、(C1-4烷基)-环丙基、(C1-4烷基)-环丁基、(C1-4烷基)-环戊基、(C1-4烷基)-环己基、(C1-4烷基)- 吡咯烷基、(C1-4烷基)-哌啶基、(C1-4烷基)-哌嗪基、(C1-4烷基)-吗啉基、(C1-4烷基)-四氢呋喃基或(C1-4烷基)-四氢吡喃基，各自任选地被取代。
47.根据实施方案41-46中任一项所述的方法，R2是H、C1-4烷基、(C1-4烷基)(OR)、
Figure BDA0002556467450001602
其中R在每次出现时独立地是H、或取代或未取代的C1-8烷基，R'在每次出现时独立地是H、-OR、氰基或取代或未取代的C1-8烷基，并且p是0-3。
48.根据实施方案1-19、23、24或41-47中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物246。
49.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括在抑制 mTOR活性的药剂存在下培育包含包括用重组受体工程化的T细胞的经富集原代人T细胞的工程化细胞组合物；
其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物63、化合物155或化合物246；并且
其中所述方法导致所述组合物中细胞的增殖或扩增以产生包含工程化T 细胞的输出组合物。
50.根据实施方案33或49所述的方法，其中在500nM与2μM之间、在1 nM与100nM之间、在50nM与250nM之间或在100nM与500nM之间的化合物63存在下培育所述工程化细胞组合物。
51.根据实施方案40或49所述的方法，其中在500nM与2μM之间、在1 nM与100nM之间、在50nM与250nM之间或在100nM与500nM之间的化合物155存在下培育所述工程化细胞组合物。
52.根据实施方案48或49所述的方法，其中在500nM与2μM之间、在1 nM与100nM之间、在50nM与250nM之间或在100nM与500nM之间的化合物246存在下培育所述工程化细胞组合物。
53根据实施方案49所述的方法，其中在所述培育之前，所述方法进一步包括：
(a)在刺激条件下、在抑制mTOR活性的药剂存在下孵育包含原代T细胞的输入组合物，其中所述刺激条件包括存在能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂，从而生成经刺激组合物；并且其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物63、化合物155或化合物246；以及
(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而生成包含工程化T细胞的工程化组合物。
54.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)在刺激条件下孵育包含原代人T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)抑制mTOR活性的药剂，其中所述抑制mTOR 活性的药剂是化合物63、化合物155或化合物246；以及
(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而生成包含工程化T细胞的工程化组合物。
55.根据实施方案53或实施方案54所述的方法，其中所述原代T细胞富集CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。
56.根据实施方案11-48、53、54或55中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂包含：
与TCR复合物的成员特异性地结合、任选地与CD3特异性地结合的一级药剂；以及
任选地与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
57.根据实施方案55或实施方案56所述的方法，其中所述一级和/或二级药剂包括抗体，任选地其中所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。
58.根据实施方案55-57中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和/或二级药剂存在于固体支持物的表面上。
59.根据实施方案58所述的方法，其中所述固体支持物是或包含珠。
60.根据实施方案59所述的方法，其中所述珠的直径大于或大于约3.5 μm，但是不大于约9μm或不大于约8μm或不大于约7μm或不大于约6μm或不大于约5μm。
61.根据实施方案60或实施方案61所述的方法，其中所述珠的直径为或为约4.5μm。
62.根据实施方案59-61中任一项所述的方法，其中所述珠是惰性的。
63.根据实施方案59-62中任一项所述的方法，其中所述珠是或包括聚苯乙烯表面。
64.根据实施方案59-63中任一项所述的方法，其中所述珠是磁性或超顺磁性的。
65.根据实施方案59-64中任一项所述的方法，其中珠与细胞的比率为从或从约4:1至0.25:1。
66.根据实施方案11-48或53-65中任一项所述的方法，其中所述引入包括用包含编码所述重组受体的多核苷酸的病毒载体转导所述经刺激组合物的细胞。
67.根据实施方案66所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
68.根据实施方案66或实施方案67所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
69.根据实施方案11-48或53-65中任一项所述的方法，其中所述引入包括用包含编码所述重组受体的多核苷酸的载体转染所述经刺激组合物的所述细胞。
70.根据实施方案69所述的方法，其中所述载体是转座子，任选地 SleepingBeauty(SB)转座子或Piggybac转座子。
71.根据实施方案1-14、16-53或55-70中任一项所述的方法，其中在所述培育之后，所述方法进一步包括收集所述输出组合物的细胞。
72.根据实施方案1-14、16-53或55-71中任一项所述的方法，所述方法进一步包括任选地在药学上可接受的赋形剂存在下配制所述输出组合物的细胞以用于低温保存和/或给予至受试者。
73.根据实施方案72所述的方法，其中在低温保护剂存在下配制所述输出组合物的所述细胞。
74.根据实施方案73所述的方法，其中所述低温保护剂包括DMSO。
75.根据实施方案72-74中任一项所述的方法，其中将所述输出组合物的所述细胞配制于容器，任选地小瓶或袋中。
76.根据实施方案11-48或53-75中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在所述孵育之前将所述CD4+和/或所述CD8+T细胞从生物样品中分离。
77.根据实施方案76所述的方法，其中所述分离包括基于CD4和/或CD8 的表面表达来选择细胞，任选地通过阳性或阴性选择。
78.根据实施方案76或实施方案77所述的方法，其中所述分离包括进行基于免疫亲和力的选择。
79.根据实施方案76-78中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括从受试者获得的原代T细胞。
80.根据实施方案76-79中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或包括全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级 T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
81.根据实施方案1-80中任一项所述的方法，其中所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
82.根据实施方案81所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
83.根据实施方案81或82所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
84.根据实施方案81-83中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自 5T4、8H9、avb6整合素、B7-H6、B细胞成熟抗原(BCMA)、CA9、癌症- 睾丸抗原、碳酸酐酶9(CAIX)、CCL-1、CD19、CD20、CD22、CEA、乙型肝炎表面抗原、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、癌胚抗原(CEA)、CE7、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、c-Met、双重抗原、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、肝配蛋白B2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、 erbB二聚体、EGFR vIII、雌激素受体、胎儿AchR、叶酸受体α、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、G250/CAIX、GD2、GD3、 G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、gp100、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、 HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE) -A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、NCAM、NKG2D、NKG2D配体、NY-ESO-1、O-乙酰化GD2(OGD2)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、PSCA、孕酮受体、存活蛋白、ROR1、TAG72、tEGFR、VEGF受体、VEGF-R2、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原和与通用标签相关的抗原。
85.根据实施方案1-84中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
86.实施方案1-85中任一项的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体 (CAR)。
87.根据实施方案1-86中任一项所述的方法，其中所述重组受体是抗 CD19 CAR。
88.根据实施方案87所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含含有抗原结合结构域的细胞外结构域。
89.根据实施方案88所述的方法，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。
90.根据实施方案89所述的方法，其中所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
91.根据实施方案89或实施方案90所述的方法，其中所述片段包含 scFv。
92.根据实施方案90-91中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体还包含间隔子和/或铰链区。
93.根据实施方案90-92中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含细胞内信号传导区域。
94.根据实施方案93所述的方法，其中所述细胞内信号传导区域包含细胞内信号传导结构域。
95.根据实施方案94所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
96.根据实施方案95所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包含CD3链、任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
97.根据实施方案94-96中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体还包含设置在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
98.根据实施方案94-97中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导区域还包含共刺激信号传导区域。
99.根据实施方案98所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域包含T 细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
100.根据实施方案98或实施方案99所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
101.根据实施方案99-100中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导区域之间。
102.根据实施方案1-14、16-53或55-100中任一项所述的方法，其中
(i)所述原代T细胞包括经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的单独组合物，并且其中分别培育所述经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的组合物；或
(ii)所述原代T细胞包括经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的单独组合物，并且其中将所述组合物混合以便一起培育所述经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞。
103.一种包含工程化细胞的组合物，所述组合物通过根据实施方案 1-102中任一项所述的方法产生。
104.根据实施方案103所述的组合物，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
105.根据实施方案103或实施方案104所述的组合物，所述组合物包含低温保护剂，任选地DMSO。
106.一种制品，所述制品包含根据实施方案103-105中任一项所述的组合物；和用于将所述输出组合物给予至受试者的说明书。
107.根据实施方案106所述的制品，其中所述受试者患有疾病或病症，任选地其中所述重组受体特异性地识别或特异性地结合至与所述疾病或病症相关或在所述疾病或病症的细胞上表达或存在的抗原。
108.根据实施方案106或107所述的制品，其中所述输出组合物是工程化 CD4+T细胞的组合物。
109.根据实施方案107或108所述的制品，其中所述输出组合物是CD8+T 细胞的工程化组合物。
110.一种制品，所述制品包含通过实施方案2-3、5-6、9-14、16-17、19-49、 51-53或56-109中任一项所述的方法产生的工程化CD4+T细胞的组合物、通过实施方案2、4、5、7、9-13、15、16、18-49、51-53或56-109中任一项所述的方法产生的工程化CD8+T细胞的组合物；和用于将所述工程化CD4+T 细胞和所述工程化CD8+T细胞给予至受试者的说明书。
111.根据实施方案110所述的制品，其中所述说明书规定将所述CD4+T 细胞和CD8+T细胞分开给予至所述受试者。
112.根据实施方案110或111所述的制品，其中所述说明书规定将所述 CD4+T细胞和所述CD8+T细胞以所需比率给予至所述受试者。
IX.实施例
以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。
实施例1：用于原代人T细胞的培养的mTOR激酶抑制剂的剂量确定
通过监测对核糖体蛋白S6的抑制来评估示例性mTOR激酶抑制剂在原代人T细胞中的剂量效应。
通过基于免疫亲和力的富集从来自人供体受试者的白细胞单采术样品中分离CD4+和CD8+T细胞。将分离的CD4+和CD8+T细胞1:1混合，并且在渐增浓度的mTOR激酶抑制剂，即PI-103、化合物155、化合物63或化合物246 存在下用抗CD3/抗CD28磁珠刺激。将T细胞培养物在37℃下孵育过夜(大约 16小时)。在PI-103、化合物155、化合物63或化合物246存在下孵育后，通过流式细胞术评估T细胞的细胞内S6磷酸化，并针对CD4或CD8的表面表达共染色。
将结果示于图1A-图1D中。所有评估的mTOR激酶抑制剂均抑制CD4+和 CD8+T细胞中的S6磷酸化。PI-103、化合物155、化合物63和化合物246抑制 T细胞中S6磷酸化的IC50分别为大约100nM、100nM、500nM和500nM。 CD4+和CD8+T细胞中的IC50示出在表E1中。
Figure BDA0002556467450001671
实施例2：在mTOR激酶抑制剂存在下孵育后对T细胞扩增的评估
通过基于免疫亲和力的富集从人白细胞单采术样品中分离CD4+和 CD8+细胞的单独组合物，并进行低温冷冻。随后将所述组合物的CD4+和 CD8+细胞解冻，并且通过在抗CD3/抗CD28磁珠和重组IL-2、IL-7和/或IL-15 存在下在刺激条件下分别培养细胞大约20小时来激活。然后用编码抗CD19 嵌合抗原受体(CAR)的病毒载体转导细胞。转导后，将CD4+和CD8+细胞分别在各种浓度的mTOR激酶抑制剂(化合物155、化合物63或化合物246) 存在下孵育。对于对照，将细胞与仅培养基、DMSO媒介物或200nM PI-103 一起孵育。解冻后将孵育在37℃下进行大约8天，其中更换一次培养基，此时将化合物以相同浓度重新添加到培养基中。
与转导后接种用于培养的细胞数量相比，在所述过程结束时的CD8+和 CD4+T细胞的百分比示出于图2中。选择耐受剂量的截止值设定为培养基和 DMSO对照的平均值的70％。导致与媒介物对照组中所观察到的相似的CD8 和CD4 T细胞扩增水平的化合物155、化合物63和化合物246的最高耐受剂量分别为100nM、1μM和100nM。
实施例3：对在mTOR激酶抑制剂存在下扩增的嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞(CAR T细胞)的功能评估
从三名人供体中分离CD4+和CD8+细胞的单独组合物，将其激活并用编码抗CD19CAR的病毒载体进行转导，基本上如实施例2中所述。转导后，将源自每名供体的CD4+和CD8+T细胞在mTOR激酶抑制剂存在下分别孵育8 天以扩增T细胞，基本上如实施例2中所述，除了在200nM PI-103、1μM化合物63存在下进行，或者用DMSO媒介物或仅培养基对照进行。然后，将来自每名供体的CD4+和CD8+T细胞分开收获、配制和低温冷冻。将低温冷冻的工程化CD4+和CD8+T细胞解冻、洗涤以去除化合物，并且然后将来自同一供体的细胞以1:1活CD4+/CAR+与活CD8+/CAR+T细胞的比率合并，以产生扩增的含有CD4+和CD8+T细胞的抗CD19 CAR-T细胞组合物。评估了生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的功能活性。
糖酵解代谢
在与CD4+T细胞合并之前，在来自生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的 CD8+CAR-T细胞中测量细胞糖酵解代谢响应于T细胞受体(TCR)刺激的变化。通过使用细胞外通量生物分析仪(Seahorse Bioanalyzer，Agilent Technologies)实时测量CD8+CAR-T细胞中的细胞外酸化速率(ECAR)来评估糖酵解代谢。从来自生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的培养的CD8+ CAR-T细胞中获取基线ECAR测量值。在第三次ECAR测量后(在测定中大约20分钟)，将抗CD3/抗CD28磁珠添加到培养物中。确定了测定中0到76分钟的ECAR速率(mpH/min)的曲线下面积(AUC)和相对于培养基对照的最大ECAR糖酵解爆发比率(n＝3名供体)。
如图3A所示，在所有生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物中，用抗CD3/ 抗CD28珠刺激增加了CD8+CAR-T细胞中的ECAR。在三名供体中的每一名中，通过ECAR AUC(图3B)或相对于培养基对照的ECAR比率(图3C)，观察到在通过在化合物63存在下扩增生成的抗CD19 CAR-T细胞中，在CD8+ CAR-T的TCR刺激后，糖酵解爆发增强的趋势。
经扩增的CAR-T细胞中的CAR信号传导
通过监测磷酸-S6的激活来评估生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物中 CAR-T细胞的抗原依赖性信号传导。将来自在仅培养基、DMSO媒介物、 PI-103或化合物63存在下扩增的生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的细胞与经转导以表达CD19的经辐照K562细胞(K562-CD19靶细胞)以1:1的比率共培养。20小时后，通过流式细胞术针对细胞内S6磷酸化评估细胞，并针对 CD4或CD8的表面表达进行共染色。
如图4A所示，与未用抗原刺激的细胞相比，在用抗原表达细胞刺激后，在每一种生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物中，在CD4+和CD8+T细胞中观察到更高水平的磷酸-S6。与用DMSO媒介物或仅培养基扩增的对照组合物相比，在PI-103或化合物63存在下扩增的组合物中，CD4+和CD8+T细胞中的磷酸-S6染色是相似的。这些结果与以下发现是一致的：在mTOR激酶抑制剂存在下扩增的细胞在洗除抑制剂后仍保持正常的mTOR激酶信号传导活性。
细胞溶解活性
为了评估细胞溶解活性，将生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物与 K562-CD19靶细胞以3:1或1:1效应细胞与靶细胞的比率共培养。用 NucLight Red(NLR)标记靶细胞以允许通过荧光显微镜检查进行追踪。作为阴性对照，将K562-CD19靶细胞单独培养或者与不表达抗CD19 CAR的 CD4+和CD8+T细胞共培养。如通过红色荧光信号(使用
Figure BDA0002556467450001691
活细胞分析系统，Essen Bioscience)所确定，通过测量80小时后活靶细胞的损失来评估杀伤活性。将细胞杀伤定量为活靶细胞的量随时间变化的曲线下面积 (AUC)的倒数。
如图4B所示，在PI-103或化合物63存在下扩增的细胞显示出与用DMSO 媒介物或仅培养基扩增的对照细胞相似的细胞溶解活性。这些结果表明，在在已经在mTOR激酶抑制剂存在下扩增的T细胞中保留靶细胞杀伤功能。
细胞因子测量
为了测量抗原刺激后的细胞因子，将来自生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的细胞与经辐照K562-CD19靶细胞或K562亲本靶细胞以1:1的效应细胞:靶细胞比率共培养。培养过夜(约16小时)后，收获细胞培养上清液，并且使用Luminex Multiplex测定来测量TNF-α、IFN-γ和IL-2细胞因子产生。与在仅培养基中扩增的细胞相比，从在PI-103、化合物63或DMSO媒介物存在下扩增的生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物确定在共培养上清液中观察到的细胞因子产生的倍数变化。
如图5所示，从与抗原表达细胞共培养的T细胞中检测TNF-α、IFN-γ和 IL-2的产生。与对照细胞相比，来自在PI-103或化合物63存在下扩增的生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的细胞展现出细胞因子产生的改善，特别是关于IFN-γ产生，其在使用PI-103或化合物63扩增的细胞中得到改善。
在共培养的T细胞中评估细胞内细胞因子CD107a、IFN-γ(IFNγ)、IL-2、 IL-17a和TNF-α(TNFα)，所述共培养的T细胞被分为两组并与PMA/离子霉素和高尔基体抑制剂或与单独的高尔基抑制剂一起进一步孵育5小时。细胞内细胞因子累积表示为细胞因子阳性细胞的频率相对于仅培养基对照的倍数变化。与对照细胞相比，用PI-103或化合物63扩增的CD8+T细胞(图6A) 和CD4+T细胞(图6B)展现出某些多功能细胞因子谱的频率增加(图6A和图6B中的加框谱)。具体而言，CD8+T细胞在用PMA/离子霉素和高尔基体抑制剂再刺激后展现出CD107a+IFNγ+TNFα+阳性细胞的多功能谱增加，并且在与单独的高尔基体抑制剂一起孵育后展现出CD107a+IFNγ+IL-2+细胞的多功能谱增加(图6A)。在CD4+细胞中，用PMA/离子霉素和高尔基体抑制剂或单独的高尔基体抑制剂处理后，观察到增加的CD107a+IFNγ+TNFα+ 细胞的多功能谱，而在用PMA/离子霉素和高尔基体抑制剂再刺激后 CD107a+IFNγ+IL-2+TNFα+细胞的多功能谱增加，并且在与单独的高尔基体抑制剂一起孵育后CD107a+IFNγ+细胞的多功能谱增加(图6B)。
连续刺激
在一些方面，细胞在重复刺激后离体扩增的能力可以指示CAR-T细胞持续存在(例如，在初始激活后)的能力和/或指示体内功能(Zhao等人(2015) Cancer Cell,28:415-28)。为了在连续刺激测定中评估细胞的功能，将生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物与经辐照K562-CD19靶细胞一起孵育。每3-4天，将T细胞收获、计数，并且每轮在将细胞数重新设定为初始接种密度之后使用相同的培养条件用新的靶细胞进行再刺激。在四轮再刺激后，将T细胞再培养另外4天，而不进一步用靶细胞再刺激。确定群体倍增数(图7A)和相对于用仅培养基扩增的细胞的AUC，随时间随群体倍增数变化的曲线下面积 (AUC)(图7B)。
如图7A所示，在该测定中抗CD19 CAR表达T细胞的数量增加，这与这些细胞在CD19表达细胞存在下增殖的能力一致。如从群体倍增数的AUC的倍数变化所示，与用PI-103或DMSO媒介物扩增的T细胞相比，来自已用化合物63扩增的生成的抗CD19 CAR T细胞组合物的T细胞具有更大的平均AUC (图7B)。该观察结果表明，即使在重复的抗原刺激之后，在CAR-T细胞扩增期间化合物63的存在也支持T细胞的持续扩增和存活。
为了评估进一步次级刺激后的活性，在连续再刺激后第11天时收获 CAR-T细胞，并以1:1的效应细胞:靶细胞比率用经辐照K562-CD19靶细胞刺激大约16小时。收集上清液，并且基本上如上所述使用Luminex Multiplex 测定来测量TNF-α、IFN-γ和IL-2细胞因子产生。确定与在仅培养基中扩增的细胞相比，来自在PI-103、化合物63或DMSO媒介物存在下扩增的生成的抗 CD19 CAR-T细胞组合物的共培养上清液中观察到的细胞因子产生的倍数变化并且示出在图7C中。在基本上如上所述与高尔基体抑制剂一起孵育4小时后，在第11天对细胞的多功能细胞因子谱的评估显示CD107a+IFNγ+细胞的 CD8+多功能细胞因子谱增加(图7D)。
在mTOR抑制剂存在下扩增的生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物通过持续的抗原暴露而保留改善的细胞因子能力和存活的能力与对功能消耗的抗性一致。
CAR特异性扩增
通过将生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的细胞与表面缀合有对抗CD19 CAR具有特异性的抗独特型抗体的珠一起孵育，评估细胞在CAR刺激后扩增的能力。将抗独特型抗体缀合的珠与细胞以1:1的珠:细胞比率在24 孔G-rex扩增容器(Argos Technologies)的孔中一起孵育15天。每5天通过计数培养物中的细胞来确定每孔中总的活T细胞(图8A)。相对于用仅培养基扩增的细胞的AUC计算随时间随T细胞数量变化的平均曲线下面积(AUC) (图8B)。
如图8A所示，用抗独特型抗体缀合的珠刺激细胞导致初始扩增，随后细胞数量下降。与先前用DMSO媒介物扩增的T细胞相比，来自先前已用化合物63或PI-103扩增的生成的抗CD19 CAR T细胞组合物的T细胞具有更大的平均AUC(图8B)。结果表明，在扩增期间mTOR激酶抑制剂的存在支持单一CAR特异性刺激后增强的扩增和存活。
对在用抗独特型抗体缀合的珠扩增后第11天时收获的CAR-T细胞评估用抗原表达细胞刺激之后的次级细胞因子应答。将抗独特型抗体刺激的细胞与经辐照K562-CD19靶细胞以1:1的效应细胞:靶细胞比率一起孵育大约 16小时。收集上清液，并且基本上如上所述使用Luminex Multiplex测定来测量TNF-α、IFN-γ和IL-2细胞因子产生。与在仅培养基中扩增的细胞相比，从在PI-103、化合物63或DMSO媒介物存在下扩增的生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物确定在共培养上清液中观察到的细胞因子产生的倍数变化。如图8C 所示，来自先前已在化合物63或PI-103存在下扩增的生成的抗CD19 CAR T 细胞组合物的T细胞在随后用抗原刺激后展现出改善的次级细胞因子产生。此外，用化合物63进行工程化和扩增的一些源自供体的细胞在第11天展现出作为CD107a+IFNγ+细胞的CD8+T细胞的频率增加，如通过基本上如上所述与高尔基体抑制剂一起孵育4小时后进行细胞内细胞因子染色所确定(图 8D)。
实施例4：在mTOR激酶抑制剂存在下扩增的工程化CD4+和CD8+T细胞的基因表达分析
通过RNA测序(RNA-Seq)评估通过在PI-103、化合物63、DMSO媒介物或仅培养基存在下扩增而生成的实施例2中描述的生成的抗CD19 CAR-T 细胞组合物的细胞中的基因表达。从在每种扩增条件下由三名供体生成的组合物中提取RNA，并通过RNA-Seq进行对全转录组的评估。确定了FPKM和FPKQ值；对FPKQ值进行对数转换(log2)。通过与使用DMSO媒介物扩增的细胞相比，比较在仅培养基、PI-103或化合物63存在下扩增的生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的细胞中CD4+、CD8+或组合的CD4+/CD8+细胞的表达谱来确定基因表达。通过在两个条件之间施加FDR≤10％的截止值，基于对火山图的分析，鉴定了各组之间不同的基因产物。
如图9A中的火山图所示，在PI-103或化合物63存在下扩增的CD4+和/或 CD8+T细胞中鉴定出显著改变的基因表达，其中下调的基因描绘在每个绘图的中间点(“0”)的左侧，并且上调的基因描绘在中间点的右侧。
与用DMSO扩增的细胞中的表达相比，将用PI-103或化合物63扩增的细胞中每个差异表达基因的表达绘制为Log2倍数变化。如图9B所示，鉴定出在用PI-103或化合物63扩增的细胞中差异表达基因的表达之间的线性关系，其指示在用PI-103扩增的细胞与用化合物63扩增的细胞中差异表达基因的表达之间存在强正相关(R2＝0.9)。
基于与用DMSO媒介物扩增的细胞中的表达相比被激活或抑制的差异表达基因的转录调节子，对差异表达基因进行了本体富集分析，以确定基因本体论(GO)类别。基于每个调节网络中预期的转录作用方向相对于用PI-103 或化合物63扩增的细胞中观察到的转录作用的一致性,计算转录调节子的TZ 得分。图9C列出了相对于其相应的Z得分，由每个簇的调节成员定义的示例性鉴定的GO类别。
实施例5：在给予在mTOR激酶抑制剂存在下扩增的CAR-T细胞后对肿瘤异种移植模型中肿瘤负荷和存活率的评估
对通过如实施例2中所述在PI-103、化合物63或仅培养基存在下扩增而生成的所生成抗CD19 CAR-T细胞组合物的抗肿瘤作用进行评估。肿瘤异种移植小鼠模型是通过向nod scidγ(NSG)免疫缺陷小鼠植入0.5x106个被允许移入的Raji细胞(表达CD19的永生化人B淋巴细胞肿瘤细胞系)而产生的。用萤火虫萤光素酶转染Raji细胞，以有利于通过生物发光成像进行的检测。七天后，使小鼠未接受治疗、接受DMSO媒介物或低剂量(0.25x106)或高剂量(1.0x106)的生成的抗CD19 CAR-T细胞组合物的CAR+T细胞。每周或每10天通过生物发光评估肿瘤负荷。
与未治疗或DMSO媒介物相比，用低剂量或高剂量CAR-T细胞治疗携带肿瘤的小鼠改善了肿瘤负荷和存活率。与用DMSO媒介物相比，在给予低剂量或高剂量的来自已在PI-103(图10A，顶图)或化合物63(图11A，顶图) 存在下扩增的抗CD19 CAR-T细胞组合物的CAR-T细胞后，观察到肿瘤负荷减少。与被给予用DMSO媒介物扩增的CAR-T细胞的携带肿瘤的小鼠相比，被给予低剂量或高剂量的先前已在PI-103或化合物63存在下扩增的CAR-T细胞的携带肿瘤的小鼠还显示出显著改善的存活率(图10A和图11A，底图)。被给予高剂量的在化合物63存在下扩增的CAR-T细胞的携带肿瘤的小鼠在植入肿瘤细胞后的至少80天内显示100％存活率。图10B和图11B分别示出了在用在PI-103或化合物63存在下扩增的CAR-T细胞治疗后，携带肿瘤的小鼠在肿瘤细胞植入后长达100天的较晚时间点的存活率结果；所述结果与在化合物63存在下产生的细胞的作用一致，从而导致给予的CAR-T细胞的性能改善。所述结果表明，在mTOR激酶抑制剂(如化合物63)存在下产生的CAR-T 细胞组合物在体内测定中展现出改善的性能。在体内模型中改善的肿瘤清除率和存活率与通过在CAR-T细胞生成期间抑制mTOR信号传导实现的CAR-T 细胞的状态和/或功能的定性改善一致。
实施例6：利用抗独特型缀合的珠长期刺激CAR+T细胞的体外测定
从人供体中分离CD4+和CD8+细胞的单独组合物，通过用抗CD3/抗 CD28磁珠激活进行刺激，并用编码具有源自FMC63的scFv的抗CD19 CAR的病毒载体进行转导。在扩增细胞的条件下培育后，然后对来自每名供体的含有工程化CD4+和CD8+T细胞的T细胞组合物进行分别收获、配制和低温冷冻。将低温冷冻的工程化CD4+和CD8+T细胞解冻，并以1:1的来自同一供体的CD4+和CD8+T细胞比率配制，以生成含有CAR+T细胞的T细胞组合物。将针对抗CD19CAR的抗独特型(ID)抗体缀合的珠与细胞以1:1的珠: 细胞比率一起孵育14天。
在以1:1(用于评估细胞因子水平)或3:1(用于评估细胞溶解活性) 的效应细胞与靶细胞比率用K562-CD19抗原表达靶细胞刺激之后，评估在用抗ID缀合的珠进行CAR特异性刺激后第14天时收获的CAR-T细胞的次级应答(第14天；次级)。还通过用抗原表达细胞进行类似的刺激来确定来自尚未与抗ID缀合的珠一起孵育的T细胞组合物的T细胞的初级应答(第0天；“初级”)。为了评估细胞溶解活性，用NucLight Red(NLR)标记靶细胞，以允许通过荧光显微镜检查进行追踪。如通过动力学荧光显微镜检查(使用
Figure BDA0002556467450001751
活细胞分析系统，Essen Bioscience)检测荧光信号随时间的损失所确定，通过测量72小时内活靶细胞的损失来评估杀伤活性。将杀伤指数确定为随时间变化的靶荧光的曲线下面积(AUC)的倒数。在高尔基体抑制剂存在下孵育之后，通过流式细胞术在共培养的T细胞中评估IL-2和TNF-α的细胞内细胞因子水平。
如图12A所示，与未经历先前CAR特异性刺激的CAR+T细胞的细胞溶解活性相比，含有在用抗ID缀合的珠进行CAR特异性刺激14天后收集的CAR+ T细胞的T细胞组合物的靶细胞杀伤有所减少。在已经接受了使用抗ID缀合的珠的长期CAR特异性刺激的CAR+T细胞中，IL-2和TNF-α的细胞内细胞因子水平也有所降低(图12B)。这些结果与以下观察结果一致：长期CAR特异性刺激(例如通过与抗ID缀合的珠一起孵育14天)导致CAR的长期刺激和持续功能的丧失。
将上述长期刺激测定用于评估在长期刺激之后PI-103或化合物63对改善 CAR+T细胞功能的作用。如上文所述生成抗CD19 CAR+T细胞组合物，但是从起始刺激开始，在PI-103、化合物63或媒介物对照的存在下进行。将来自每种生成的CAR-T细胞组合物的细胞与抗ID缀合的顺磁珠以1:1的珠: 细胞比率一起孵育14天。
在用抗原表达细胞刺激之后评估了CAR-T细胞组合物在解冻时的初级应答(未用抗ID缀合的珠刺激)或CAR刺激的CAR-T组合物的次级应答(在用抗ID缀合的珠进行14天CAR特异性刺激后)。在高尔基体抑制剂存在下将 CAR-T细胞组合物与K562-CD19抗原表达细胞1:1培养，并在针对IL-2、 IFN-γ和TNF-α进行细胞内细胞因子染色后通过流式细胞术评估多功能细胞因子产生。在通过在供体群组内按比例缩放将数据归一化之后，根据如在 CD8+细胞中所确定的细胞因子的累积水平确定了多功能得分(图13A)。确定了在与靶细胞一起孵育20小时之后来自共培养物的细胞培养上清液的总分泌的IL-2、TNF和IFN-γ细胞因子，并且计算所有三种细胞因子的量表得分的平均值，如图13A所示。如图13A所示，基于CAR-T细胞组合物产生细胞因子的能力，PI-103或化合物63导致改善的初级或次级应答。在PI-103或化合物63存在下产生的T细胞组合物中也观察到如上所述与靶细胞以3:1的效应细胞:靶细胞比率共培养后初级或次级细胞溶解应答的改善(图13B和图13C)。
这些结果证明了长期刺激测定用以评价CAR-T细胞组合物(包括在不同条件下或在PI-103或化合物63或其他药剂存在下产生的不同CAR-T细胞组合物)在长期CAR-T细胞刺激后展现出长期存活和/或维持功能(例如在体内延长抗原暴露后可能发生)的能力的实用性。
实施例7：对在mTOR激酶抑制剂存在下制备的嵌合抗原受体(CAR)转导的T细胞(CAR T细胞)的功能评估
在用于工程化T细胞的过程中，进一步评估在细胞产生期间mTOR激酶抑制剂的存在的影响，在所述过程中，将CD4+和CD8+T细胞群分别富集并且然后混合并且在单一组合物中一起处理。所述处理步骤包括用于刺激、用编码嵌合抗原受体的载体进行转导和扩增的那些步骤。
通过基于免疫亲和力的选择从来自同一人供体的白细胞单采术样品的分离的PBMC选择CD4+和CD8+细胞的单独组合物，并且然后将选择的细胞组合物低温冷冻。随后将CD4+和CD8+T细胞的单独组合物解冻，并且以1:1 的活CD4+T细胞与活CD8+T细胞的比率混合。在这项研究中，将混合的 CD4+和CD8+细胞群体在化合物63、PI103存在下或无抑制剂(DMSO媒介物对照)存在下孵育，所述孵育在起始刺激时即开始。更详细地，在具有附接的抗CD3和抗CD28抗体的聚苯乙烯包被的顺磁珠存在下，将混合的CD4+和 CD8+T细胞组合物(在如所指示的抑制剂存在或不存在下)刺激18至30小时，并且然后用编码抗CD19 CAR的慢病毒载体转导。CAR含有对CD19具有特异性的scFv抗原结合结构域(源自FMC63)、CD28跨膜区、4-1BB共刺激信号传导区域、和源自CD3-ζ的细胞内信号传导结构域。然后在细胞因子存在下扩增细胞，通常持续大约6-7天。从刺激开始并且在所述过程的持续时间中，培养基含有DMSO(媒介物对照)、2μM PI103或1μM化合物63。媒介物对照所含的DMSO的体积要与mTOR抑制剂处理过的样品的体积相匹配。将经扩增的细胞低温保存。对于评估，将低温保存的CAR-T细胞解冻并洗涤，然后在没有支持细胞因子和没有抑制剂或媒介物的测定培养基中进行评估。
通过流式细胞术评估细胞的细胞表面标记水平和促凋亡标记细胞内半胱天冬酶3的水平。来自三名供体的代表性流式细胞术绘图示出在图14中。如图所示，观察到在化合物63存在下制备的CAR-T细胞具有降低的促凋亡标记细胞内半胱天冬酶3水平。
在连续刺激测定中，通过将生成的CAR-T细胞与缀合至珠的抗体一起孵育，评估生成的CAR-T细胞的功能属性。抗CAR抗体是识别CAR的源自 FMC63的scFv的抗独特型抗体。将解冻的CAR-T细胞与CAR特异性珠混合，铺板，并孵育14天。每3-4天对T细胞计数。如图15所示，在PI103或化合物 63存在下制备的生成的CAR-T细胞在再刺激后展现出改善的扩增。
通过将新解冻的或根据上文在再刺激第14天的生成的CAR-T细胞与CD19表达靶细胞以3:1的效应细胞与靶细胞比率一起培养来评估生成的 CAR-T细胞的细胞溶解活性。随时间定量靶细胞死亡。对于每种浓度，确定信号随时间的肿瘤细胞生长曲线下面积(AUC)。杀伤指数被计算为肿瘤细胞生长曲线下面积的倒数(1/AUC)。与在DMSO存在下制备的CAR-T细胞相比，在过程中在PI103或化合物63存在下生成的CAR-T细胞展现出改善的靶细胞杀伤(图16)。
在与新解冻的生成的CAR-T细胞或在用CD19表达靶细胞次级再刺激后的CAR-T细胞一起孵育的共培养物的细胞中监测细胞内细胞因子水平。在高尔基体抑制剂存在下，将CAR-T细胞与靶标表达细胞一起孵育5小时。确定 IL-2、TNF-α和IFN-γ的细胞内表达，并且通过针对对IL-2以及IFN-γ和TNF-α的任何组合呈阳性的累积CAR-T细胞进行门控来计算多功能得分。如图17A 所示，与在DMSO存在下制备的CAR-T细胞相比，在初级或次级刺激后，在 CD8+和CD4+子集中，在PI103或化合物63存在下制备的CAR-T细胞均展现出改善的多功能效应细胞因子谱(图17A)。还将生成的CAR-T细胞与CD19抗原表达细胞一起培养20小时，并且通过ELISA评估细胞培养上清液中IL-2、 TNF-α和IFN-γ的水平。用PI103或化合物63生成的CAR-T细胞在上清液中展现出增加的分泌细胞因子水平(图17B)。
总之，这些结果与以下观察结果一致：在用于从CD4+和CD8+T细胞的混合群体产生CAR-T细胞的过程期间，PI103和化合物63的存在改善CAR-T 细胞的功能和活性。
实施例8：在mTOR激酶抑制剂存在下制备的CAR-T细胞的基因表达分析
通过RNA-Seq的差异表达(DESeq2)分析评估含有抗CD19 CAR-T细胞 (如实施例7中所述在DMSO、PI-103或化合物63存在下制备)的组合物的细胞中的基因表达。对从CAR-T细胞中分离的RNA制备的互补DNA(cDNA) 样品进行RNA-seq。对从DESeq2归一化计数产生的RNA-seq数据集进行主成分分析(PCA)。通过将化合物处理的样品与DMSO对照进行比较(对供体进行控制)，使用DESeq2软件包(1.16.1版)在R(3.4版)中进行基因水平差异表达分析。在差异表达分析之前，将基因集过滤以排除所有样品中具有零计数的基因。通过施加0.5的log2倍数变化截止值和0.1的Benjamini-Hochberg 调整的错误发现率(FDR)截止值来鉴定差异表达(DE)基因。在含有在 PI103或化合物63存在下制备的CAR-T细胞的组合物中观察重叠和非重叠基因表达谱二者(图18)。
实施例9：在给予在mTOR激酶抑制剂存在下制备的CAR-T细胞后对肿瘤异种移植模型中的肿瘤负荷和存活率的评估
对如实施例7中所述在DMSO、PI-103或化合物63存在下制备的抗CD19 CAR-T细胞组合物的抗肿瘤作用进行体内评估。肿瘤异种移植小鼠模型是通过向nod scidγ(NSG)免疫缺陷小鼠植入0.5x106个被允许移入的Raji细胞(表达CD19的永生化人B淋巴细胞肿瘤细胞系)而产生的。用萤火虫萤光素酶转染Raji细胞，以有利于通过生物发光成像测量肿瘤负荷。七天后，使小鼠未接受任何治疗，或者接受低剂量(0.25x106)或高剂量(1.0x106)的在DMSO (媒介物)或DMSO和mTOR激酶抑制剂存在下制备的抗CD19 CAR+T细胞的治疗。每周评估肿瘤负荷和死亡率。
与未治疗动物相比，在该研究中观察到，在包括DMSO的存在的过程中从三名不同的人供体的细胞分别制备的抗CD19 CAR-T细胞组合物具有可证明的对动物的抗肿瘤作用，且经治疗的动物展现出降低的死亡率。从匹配供体制备的细胞的结果示出在图19A-图19B和图20A-图20B中。观察到，在用于生成CAR-T细胞的过程中包含mTOR激酶抑制剂化合物63(与抑制剂不存在(即DMSO媒介物)相比)使得改善本研究中在动物体内的抗肿瘤应答。示例性结果示出在图20A和图20B中。使用从另一名供体生成的CAR-T细胞时见到基本上相似的结果。比较在抑制剂PI103存在或不存在下生成的 CAR-T细胞的结果示出在(图19A和图19B)中。对于从另一名供体生成的 CAR-T细胞，对于在PI103存在下产生的细胞和在抑制剂不存在(DMSO媒介物)下产生的细胞，观察到了可比较的抗肿瘤作用。
实施例10：对CAR-T细胞的体内持久性的评估
在向动物给予含有如实施例7中所述已在PI-103、化合物63或无抑制剂存在下制备的细胞的组合物后，在动物血液中评估抗CD19 CAR-T细胞的存在和数量。利用了实施例9中所述的Raji Burkitt的CD19+淋巴瘤肿瘤异种移植模型。使小鼠未接受治疗，或者接受用低剂量(0.25x106)或高剂量(1.0x106) 的相应抗CD19 CAR+T细胞组合物的治疗。每7-10天评估肿瘤负荷和死亡率。
在输注后第18、25和36天对小鼠采血，并且通过流式细胞术评估外周血中循环的CAR+CD4+T细胞或CAR+CD8+T细胞的存在。观察到，如实施例10中所述在从同一匹配供体制备CAR-T细胞期间包含化合物63或PI103导致CAR+T细胞数量随时间增加，这与以下解释一致：在细胞组合物的产生期间使用抑制剂导致在该动物肿瘤模型中给予后，体内细胞暴露增加(例如由于扩增或持久性增加)(图21A和图21B)。使用从第二供体生成的CAR-T 细胞见到基本上相似的结果。
本发明并不意图将范围限于具体公开的实施方案，所述具体公开的实施方案例如是为了说明本发明的各个方面而提供。根据本文的描述和传授，对所述组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不背离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践此类变化，并且此类变化旨在落入本公开文本的范围内。
序列
Figure BDA0002556467450001801
Figure BDA0002556467450001811
Figure BDA0002556467450001821
Figure BDA0002556467450001831
Figure BDA0002556467450001841
序列表
<110> Juno Therapeutics, Inc.
Celgene Corporation
Brahmandam, Archana
Thompson, Lucas James
Mortensen, Deborah
Filvaroff, Ellen
<120> 产生T细胞组合物的方法
<130> 735042013440
<140> 尚未分配
<141> 同时随同提交
<150> US 62/580,435
<151> 2017-11-01
<150> US 62/584,687
<151> 2017-11-10
<150> US 62/699,709
<151> 2018-07-17
<150> US 62/711,494
<151> 2018-07-28
<160> 62
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链) (aa)
<400> 1
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 间隔子 (IgG4铰链) (nt)
<400> 2
gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36
<210> 3
<211> 119
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 铰链-CH3间隔子
<400> 3
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg
1 5 10 15
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
20 25 30
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
35 40 45
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
50 55 60
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
65 70 75 80
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
85 90 95
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
100 105 110
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
115
<210> 4
<211> 229
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 铰链-CH2-CH3间隔子
<400> 4
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe
1 5 10 15
Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr
20 25 30
Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val
35 40 45
Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val
50 55 60
Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser
65 70 75 80
Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu
85 90 95
Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser
100 105 110
Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro
115 120 125
Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln
130 135 140
Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala
145 150 155 160
Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr
165 170 175
Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser
195 200 205
Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser
210 215 220
Leu Ser Leu Gly Lys
225
<210> 5
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> IgD-铰链-Fc
<400> 5
Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala
1 5 10 15
Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala
20 25 30
Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys
35 40 45
Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro
50 55 60
Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly
85 90 95
Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val
100 105 110
Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly
115 120 125
Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn
130 135 140
Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro
145 150 155 160
Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys
165 170 175
Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser
180 185 190
Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu
195 200 205
Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro
210 215 220
Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser
225 230 235 240
Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr
245 250 255
Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg
260 265 270
Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His
275 280
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 6
Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp
1 5 10 15
Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg
20
<210> 7
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 7
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly
20 25 30
Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe
35 40 45
Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala
50 55 60
Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile
85 90 95
Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu
100 105 110
Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala
115 120 125
Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu
130 135 140
Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr
145 150 155 160
Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys
165 170 175
Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly
180 185 190
Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu
195 200 205
Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys
210 215 220
Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu
225 230 235 240
Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met
245 250 255
Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala
260 265 270
His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val
275 280 285
Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His
290 295 300
Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro
305 310 315 320
Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala
325 330 335
Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly
340 345 350
Ile Gly Leu Phe Met
355
<210> 8
<211> 27
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD28 (登录号P10747的氨基酸153-179)
<400> 8
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val
20 25
<210> 9
<211> 66
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD28 (登录号P10747的氨基酸114-179)
<400> 9
Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
1 5 10 15
Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu
20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
50 55 60
Trp Val
65
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD28 (P10747的氨基酸180-220)
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 41
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD28 (LL至GG)
<400> 11
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 12
<211> 42
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 4-1BB (Q07011.1的氨基酸214-255)
<400> 12
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD3 ζ
<400> 13
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD3 ζ
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 15
<211> 112
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD3 ζ
<400> 15
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 16
<211> 335
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> tEGFR
<400> 16
Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu
1 5 10 15
Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe
35 40 45
Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr
50 55 60
Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn
65 70 75 80
Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg
85 90 95
Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile
100 105 110
Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val
115 120 125
Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp
130 135 140
Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn
145 150 155 160
Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu
165 170 175
Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser
180 185 190
Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu
195 200 205
Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln
210 215 220
Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly
225 230 235 240
Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro
245 250 255
His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr
260 265 270
Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His
275 280 285
Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro
290 295 300
Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala
305 310 315 320
Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
325 330 335
<210> 17
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> T2A
<400> 17
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 18
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 18
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 19
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> P2A
<400> 19
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 20
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> E2A
<400> 20
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 21
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> F2A
<400> 21
Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Ser Asn Pro Gly Pro
20
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性接头
<220>
<221> 重复序列
<222> (5)...(9)
<223> SGGGG重复5次
<400> 22
Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro
1 5 10
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性接头
<400> 23
Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 24
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性接头
<400> 24
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 25
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<400> 25
Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 26
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<220>
<221> 变体
<222> (1)...(1)
<223> Xaa 是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸
<220>
<221> 变体
<222> (4)...(4)
<223> Xaa是半胱氨酸或苏氨酸
<400> 26
Xaa Pro Pro Xaa Pro
1 5
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<400> 27
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10 15
<210> 28
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<400> 28
Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 29
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<400> 29
Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro
1 5 10 15
Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu
20 25 30
Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro
35 40 45
Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro
50 55 60
<210> 30
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<400> 30
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro
1 5 10
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<400> 31
Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<400> 32
Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 示例性IgG铰链
<400> 33
Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro
1 5 10
<210> 34
<211> 2549
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223>人mTOR蛋白
<400> 34
Met Leu Gly Thr Gly Pro Ala Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ser
1 5 10 15
Ser Asn Val Ser Val Leu Gln Gln Phe Ala Ser Gly Leu Lys Ser Arg
20 25 30
Asn Glu Glu Thr Arg Ala Lys Ala Ala Lys Glu Leu Gln His Tyr Val
35 40 45
Thr Met Glu Leu Arg Glu Met Ser Gln Glu Glu Ser Thr Arg Phe Tyr
50 55 60
Asp Gln Leu Asn His His Ile Phe Glu Leu Val Ser Ser Ser Asp Ala
65 70 75 80
Asn Glu Arg Lys Gly Gly Ile Leu Ala Ile Ala Ser Leu Ile Gly Val
85 90 95
Glu Gly Gly Asn Ala Thr Arg Ile Gly Arg Phe Ala Asn Tyr Leu Arg
100 105 110
Asn Leu Leu Pro Ser Asn Asp Pro Val Val Met Glu Met Ala Ser Lys
115 120 125
Ala Ile Gly Arg Leu Ala Met Ala Gly Asp Thr Phe Thr Ala Glu Tyr
130 135 140
Val Glu Phe Glu Val Lys Arg Ala Leu Glu Trp Leu Gly Ala Asp Arg
145 150 155 160
Asn Glu Gly Arg Arg His Ala Ala Val Leu Val Leu Arg Glu Leu Ala
165 170 175
Ile Ser Val Pro Thr Phe Phe Phe Gln Gln Val Gln Pro Phe Phe Asp
180 185 190
Asn Ile Phe Val Ala Val Trp Asp Pro Lys Gln Ala Ile Arg Glu Gly
195 200 205
Ala Val Ala Ala Leu Arg Ala Cys Leu Ile Leu Thr Thr Gln Arg Glu
210 215 220
Pro Lys Glu Met Gln Lys Pro Gln Trp Tyr Arg His Thr Phe Glu Glu
225 230 235 240
Ala Glu Lys Gly Phe Asp Glu Thr Leu Ala Lys Glu Lys Gly Met Asn
245 250 255
Arg Asp Asp Arg Ile His Gly Ala Leu Leu Ile Leu Asn Glu Leu Val
260 265 270
Arg Ile Ser Ser Met Glu Gly Glu Arg Leu Arg Glu Glu Met Glu Glu
275 280 285
Ile Thr Gln Gln Gln Leu Val His Asp Lys Tyr Cys Lys Asp Leu Met
290 295 300
Gly Phe Gly Thr Lys Pro Arg His Ile Thr Pro Phe Thr Ser Phe Gln
305 310 315 320
Ala Val Gln Pro Gln Gln Ser Asn Ala Leu Val Gly Leu Leu Gly Tyr
325 330 335
Ser Ser His Gln Gly Leu Met Gly Phe Gly Thr Ser Pro Ser Pro Ala
340 345 350
Lys Ser Thr Leu Val Glu Ser Arg Cys Cys Arg Asp Leu Met Glu Glu
355 360 365
Lys Phe Asp Gln Val Cys Gln Trp Val Leu Lys Cys Arg Asn Ser Lys
370 375 380
Asn Ser Leu Ile Gln Met Thr Ile Leu Asn Leu Leu Pro Arg Leu Ala
385 390 395 400
Ala Phe Arg Pro Ser Ala Phe Thr Asp Thr Gln Tyr Leu Gln Asp Thr
405 410 415
Met Asn His Val Leu Ser Cys Val Lys Lys Glu Lys Glu Arg Thr Ala
420 425 430
Ala Phe Gln Ala Leu Gly Leu Leu Ser Val Ala Val Arg Ser Glu Phe
435 440 445
Lys Val Tyr Leu Pro Arg Val Leu Asp Ile Ile Arg Ala Ala Leu Pro
450 455 460
Pro Lys Asp Phe Ala His Lys Arg Gln Lys Ala Met Gln Val Asp Ala
465 470 475 480
Thr Val Phe Thr Cys Ile Ser Met Leu Ala Arg Ala Met Gly Pro Gly
485 490 495
Ile Gln Gln Asp Ile Lys Glu Leu Leu Glu Pro Met Leu Ala Val Gly
500 505 510
Leu Ser Pro Ala Leu Thr Ala Val Leu Tyr Asp Leu Ser Arg Gln Ile
515 520 525
Pro Gln Leu Lys Lys Asp Ile Gln Asp Gly Leu Leu Lys Met Leu Ser
530 535 540
Leu Val Leu Met His Lys Pro Leu Arg His Pro Gly Met Pro Lys Gly
545 550 555 560
Leu Ala His Gln Leu Ala Ser Pro Gly Leu Thr Thr Leu Pro Glu Ala
565 570 575
Ser Asp Val Gly Ser Ile Thr Leu Ala Leu Arg Thr Leu Gly Ser Phe
580 585 590
Glu Phe Glu Gly His Ser Leu Thr Gln Phe Val Arg His Cys Ala Asp
595 600 605
His Phe Leu Asn Ser Glu His Lys Glu Ile Arg Met Glu Ala Ala Arg
610 615 620
Thr Cys Ser Arg Leu Leu Thr Pro Ser Ile His Leu Ile Ser Gly His
625 630 635 640
Ala His Val Val Ser Gln Thr Ala Val Gln Val Val Ala Asp Val Leu
645 650 655
Ser Lys Leu Leu Val Val Gly Ile Thr Asp Pro Asp Pro Asp Ile Arg
660 665 670
Tyr Cys Val Leu Ala Ser Leu Asp Glu Arg Phe Asp Ala His Leu Ala
675 680 685
Gln Ala Glu Asn Leu Gln Ala Leu Phe Val Ala Leu Asn Asp Gln Val
690 695 700
Phe Glu Ile Arg Glu Leu Ala Ile Cys Thr Val Gly Arg Leu Ser Ser
705 710 715 720
Met Asn Pro Ala Phe Val Met Pro Phe Leu Arg Lys Met Leu Ile Gln
725 730 735
Ile Leu Thr Glu Leu Glu His Ser Gly Ile Gly Arg Ile Lys Glu Gln
740 745 750
Ser Ala Arg Met Leu Gly His Leu Val Ser Asn Ala Pro Arg Leu Ile
755 760 765
Arg Pro Tyr Met Glu Pro Ile Leu Lys Ala Leu Ile Leu Lys Leu Lys
770 775 780
Asp Pro Asp Pro Asp Pro Asn Pro Gly Val Ile Asn Asn Val Leu Ala
785 790 795 800
Thr Ile Gly Glu Leu Ala Gln Val Ser Gly Leu Glu Met Arg Lys Trp
805 810 815
Val Asp Glu Leu Phe Ile Ile Ile Met Asp Met Leu Gln Asp Ser Ser
820 825 830
Leu Leu Ala Lys Arg Gln Val Ala Leu Trp Thr Leu Gly Gln Leu Val
835 840 845
Ala Ser Thr Gly Tyr Val Val Glu Pro Tyr Arg Lys Tyr Pro Thr Leu
850 855 860
Leu Glu Val Leu Leu Asn Phe Leu Lys Thr Glu Gln Asn Gln Gly Thr
865 870 875 880
Arg Arg Glu Ala Ile Arg Val Leu Gly Leu Leu Gly Ala Leu Asp Pro
885 890 895
Tyr Lys His Lys Val Asn Ile Gly Met Ile Asp Gln Ser Arg Asp Ala
900 905 910
Ser Ala Val Ser Leu Ser Glu Ser Lys Ser Ser Gln Asp Ser Ser Asp
915 920 925
Tyr Ser Thr Ser Glu Met Leu Val Asn Met Gly Asn Leu Pro Leu Asp
930 935 940
Glu Phe Tyr Pro Ala Val Ser Met Val Ala Leu Met Arg Ile Phe Arg
945 950 955 960
Asp Gln Ser Leu Ser His His His Thr Met Val Val Gln Ala Ile Thr
965 970 975
Phe Ile Phe Lys Ser Leu Gly Leu Lys Cys Val Gln Phe Leu Pro Gln
980 985 990
Val Met Pro Thr Phe Leu Asn Val Ile Arg Val Cys Asp Gly Ala Ile
995 1000 1005
Arg Glu Phe Leu Phe Gln Gln Leu Gly Met Leu Val Ser Phe Val Lys
1010 1015 1020
Ser His Ile Arg Pro Tyr Met Asp Glu Ile Val Thr Leu Met Arg Glu
1025 1030 1035 1040
Phe Trp Val Met Asn Thr Ser Ile Gln Ser Thr Ile Ile Leu Leu Ile
1045 1050 1055
Glu Gln Ile Val Val Ala Leu Gly Gly Glu Phe Lys Leu Tyr Leu Pro
1060 1065 1070
Gln Leu Ile Pro His Met Leu Arg Val Phe Met His Asp Asn Ser Pro
1075 1080 1085
Gly Arg Ile Val Ser Ile Lys Leu Leu Ala Ala Ile Gln Leu Phe Gly
1090 1095 1100
Ala Asn Leu Asp Asp Tyr Leu His Leu Leu Leu Pro Pro Ile Val Lys
1105 1110 1115 1120
Leu Phe Asp Ala Pro Glu Ala Pro Leu Pro Ser Arg Lys Ala Ala Leu
1125 1130 1135
Glu Thr Val Asp Arg Leu Thr Glu Ser Leu Asp Phe Thr Asp Tyr Ala
1140 1145 1150
Ser Arg Ile Ile His Pro Ile Val Arg Thr Leu Asp Gln Ser Pro Glu
1155 1160 1165
Leu Arg Ser Thr Ala Met Asp Thr Leu Ser Ser Leu Val Phe Gln Leu
1170 1175 1180
Gly Lys Lys Tyr Gln Ile Phe Ile Pro Met Val Asn Lys Val Leu Val
1185 1190 1195 1200
Arg His Arg Ile Asn His Gln Arg Tyr Asp Val Leu Ile Cys Arg Ile
1205 1210 1215
Val Lys Gly Tyr Thr Leu Ala Asp Glu Glu Glu Asp Pro Leu Ile Tyr
1220 1225 1230
Gln His Arg Met Leu Arg Ser Gly Gln Gly Asp Ala Leu Ala Ser Gly
1235 1240 1245
Pro Val Glu Thr Gly Pro Met Lys Lys Leu His Val Ser Thr Ile Asn
1250 1255 1260
Leu Gln Lys Ala Trp Gly Ala Ala Arg Arg Val Ser Lys Asp Asp Trp
1265 1270 1275 1280
Leu Glu Trp Leu Arg Arg Leu Ser Leu Glu Leu Leu Lys Asp Ser Ser
1285 1290 1295
Ser Pro Ser Leu Arg Ser Cys Trp Ala Leu Ala Gln Ala Tyr Asn Pro
1300 1305 1310
Met Ala Arg Asp Leu Phe Asn Ala Ala Phe Val Ser Cys Trp Ser Glu
1315 1320 1325
Leu Asn Glu Asp Gln Gln Asp Glu Leu Ile Arg Ser Ile Glu Leu Ala
1330 1335 1340
Leu Thr Ser Gln Asp Ile Ala Glu Val Thr Gln Thr Leu Leu Asn Leu
1345 1350 1355 1360
Ala Glu Phe Met Glu His Ser Asp Lys Gly Pro Leu Pro Leu Arg Asp
1365 1370 1375
Asp Asn Gly Ile Val Leu Leu Gly Glu Arg Ala Ala Lys Cys Arg Ala
1380 1385 1390
Tyr Ala Lys Ala Leu His Tyr Lys Glu Leu Glu Phe Gln Lys Gly Pro
1395 1400 1405
Thr Pro Ala Ile Leu Glu Ser Leu Ile Ser Ile Asn Asn Lys Leu Gln
1410 1415 1420
Gln Pro Glu Ala Ala Ala Gly Val Leu Glu Tyr Ala Met Lys His Phe
1425 1430 1435 1440
Gly Glu Leu Glu Ile Gln Ala Thr Trp Tyr Glu Lys Leu His Glu Trp
1445 1450 1455
Glu Asp Ala Leu Val Ala Tyr Asp Lys Lys Met Asp Thr Asn Lys Asp
1460 1465 1470
Asp Pro Glu Leu Met Leu Gly Arg Met Arg Cys Leu Glu Ala Leu Gly
1475 1480 1485
Glu Trp Gly Gln Leu His Gln Gln Cys Cys Glu Lys Trp Thr Leu Val
1490 1495 1500
Asn Asp Glu Thr Gln Ala Lys Met Ala Arg Met Ala Ala Ala Ala Ala
1505 1510 1515 1520
Trp Gly Leu Gly Gln Trp Asp Ser Met Glu Glu Tyr Thr Cys Met Ile
1525 1530 1535
Pro Arg Asp Thr His Asp Gly Ala Phe Tyr Arg Ala Val Leu Ala Leu
1540 1545 1550
His Gln Asp Leu Phe Ser Leu Ala Gln Gln Cys Ile Asp Lys Ala Arg
1555 1560 1565
Asp Leu Leu Asp Ala Glu Leu Thr Ala Met Ala Gly Glu Ser Tyr Ser
1570 1575 1580
Arg Ala Tyr Gly Ala Met Val Ser Cys His Met Leu Ser Glu Leu Glu
1585 1590 1595 1600
Glu Val Ile Gln Tyr Lys Leu Val Pro Glu Arg Arg Glu Ile Ile Arg
1605 1610 1615
Gln Ile Trp Trp Glu Arg Leu Gln Gly Cys Gln Arg Ile Val Glu Asp
1620 1625 1630
Trp Gln Lys Ile Leu Met Val Arg Ser Leu Val Val Ser Pro His Glu
1635 1640 1645
Asp Met Arg Thr Trp Leu Lys Tyr Ala Ser Leu Cys Gly Lys Ser Gly
1650 1655 1660
Arg Leu Ala Leu Ala His Lys Thr Leu Val Leu Leu Leu Gly Val Asp
1665 1670 1675 1680
Pro Ser Arg Gln Leu Asp His Pro Leu Pro Thr Val His Pro Gln Val
1685 1690 1695
Thr Tyr Ala Tyr Met Lys Asn Met Trp Lys Ser Ala Arg Lys Ile Asp
1700 1705 1710
Ala Phe Gln His Met Gln His Phe Val Gln Thr Met Gln Gln Gln Ala
1715 1720 1725
Gln His Ala Ile Ala Thr Glu Asp Gln Gln His Lys Gln Glu Leu His
1730 1735 1740
Lys Leu Met Ala Arg Cys Phe Leu Lys Leu Gly Glu Trp Gln Leu Asn
1745 1750 1755 1760
Leu Gln Gly Ile Asn Glu Ser Thr Ile Pro Lys Val Leu Gln Tyr Tyr
1765 1770 1775
Ser Ala Ala Thr Glu His Asp Arg Ser Trp Tyr Lys Ala Trp His Ala
1780 1785 1790
Trp Ala Val Met Asn Phe Glu Ala Val Leu His Tyr Lys His Gln Asn
1795 1800 1805
Gln Ala Arg Asp Glu Lys Lys Lys Leu Arg His Ala Ser Gly Ala Asn
1810 1815 1820
Ile Thr Asn Ala Thr Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala Thr Ala Thr Thr
1825 1830 1835 1840
Thr Ala Ser Thr Glu Gly Ser Asn Ser Glu Ser Glu Ala Glu Ser Thr
1845 1850 1855
Glu Asn Ser Pro Thr Pro Ser Pro Leu Gln Lys Lys Val Thr Glu Asp
1860 1865 1870
Leu Ser Lys Thr Leu Leu Met Tyr Thr Val Pro Ala Val Gln Gly Phe
1875 1880 1885
Phe Arg Ser Ile Ser Leu Ser Arg Gly Asn Asn Leu Gln Asp Thr Leu
1890 1895 1900
Arg Val Leu Thr Leu Trp Phe Asp Tyr Gly His Trp Pro Asp Val Asn
1905 1910 1915 1920
Glu Ala Leu Val Glu Gly Val Lys Ala Ile Gln Ile Asp Thr Trp Leu
1925 1930 1935
Gln Val Ile Pro Gln Leu Ile Ala Arg Ile Asp Thr Pro Arg Pro Leu
1940 1945 1950
Val Gly Arg Leu Ile His Gln Leu Leu Thr Asp Ile Gly Arg Tyr His
1955 1960 1965
Pro Gln Ala Leu Ile Tyr Pro Leu Thr Val Ala Ser Lys Ser Thr Thr
1970 1975 1980
Thr Ala Arg His Asn Ala Ala Asn Lys Ile Leu Lys Asn Met Cys Glu
1985 1990 1995 2000
His Ser Asn Thr Leu Val Gln Gln Ala Met Met Val Ser Glu Glu Leu
2005 2010 2015
Ile Arg Val Ala Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu
2020 2025 2030
Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe
2035 2040 2045
Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr
2050 2055 2060
Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu
2065 2070 2075 2080
Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp
2085 2090 2095
Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser
2100 2105 2110
Lys Gln Leu Pro Gln Leu Thr Ser Leu Glu Leu Gln Tyr Val Ser Pro
2115 2120 2125
Lys Leu Leu Met Cys Arg Asp Leu Glu Leu Ala Val Pro Gly Thr Tyr
2130 2135 2140
Asp Pro Asn Gln Pro Ile Ile Arg Ile Gln Ser Ile Ala Pro Ser Leu
2145 2150 2155 2160
Gln Val Ile Thr Ser Lys Gln Arg Pro Arg Lys Leu Thr Leu Met Gly
2165 2170 2175
Ser Asn Gly His Glu Phe Val Phe Leu Leu Lys Gly His Glu Asp Leu
2180 2185 2190
Arg Gln Asp Glu Arg Val Met Gln Leu Phe Gly Leu Val Asn Thr Leu
2195 2200 2205
Leu Ala Asn Asp Pro Thr Ser Leu Arg Lys Asn Leu Ser Ile Gln Arg
2210 2215 2220
Tyr Ala Val Ile Pro Leu Ser Thr Asn Ser Gly Leu Ile Gly Trp Val
2225 2230 2235 2240
Pro His Cys Asp Thr Leu His Ala Leu Ile Arg Asp Tyr Arg Glu Lys
2245 2250 2255
Lys Lys Ile Leu Leu Asn Ile Glu His Arg Ile Met Leu Arg Met Ala
2260 2265 2270
Pro Asp Tyr Asp His Leu Thr Leu Met Gln Lys Val Glu Val Phe Glu
2275 2280 2285
His Ala Val Asn Asn Thr Ala Gly Asp Asp Leu Ala Lys Leu Leu Trp
2290 2295 2300
Leu Lys Ser Pro Ser Ser Glu Val Trp Phe Asp Arg Arg Thr Asn Tyr
2305 2310 2315 2320
Thr Arg Ser Leu Ala Val Met Ser Met Val Gly Tyr Ile Leu Gly Leu
2325 2330 2335
Gly Asp Arg His Pro Ser Asn Leu Met Leu Asp Arg Leu Ser Gly Lys
2340 2345 2350
Ile Leu His Ile Asp Phe Gly Asp Cys Phe Glu Val Ala Met Thr Arg
2355 2360 2365
Glu Lys Phe Pro Glu Lys Ile Pro Phe Arg Leu Thr Arg Met Leu Thr
2370 2375 2380
Asn Ala Met Glu Val Thr Gly Leu Asp Gly Asn Tyr Arg Ile Thr Cys
2385 2390 2395 2400
His Thr Val Met Glu Val Leu Arg Glu His Lys Asp Ser Val Met Ala
2405 2410 2415
Val Leu Glu Ala Phe Val Tyr Asp Pro Leu Leu Asn Trp Arg Leu Met
2420 2425 2430
Asp Thr Asn Thr Lys Gly Asn Lys Arg Ser Arg Thr Arg Thr Asp Ser
2435 2440 2445
Tyr Ser Ala Gly Gln Ser Val Glu Ile Leu Asp Gly Val Glu Leu Gly
2450 2455 2460
Glu Pro Ala His Lys Lys Thr Gly Thr Thr Val Pro Glu Ser Ile His
2465 2470 2475 2480
Ser Phe Ile Gly Asp Gly Leu Val Lys Pro Glu Ala Leu Asn Lys Lys
2485 2490 2495
Ala Ile Gln Ile Ile Asn Arg Val Arg Asp Lys Leu Thr Gly Arg Asp
2500 2505 2510
Phe Ser His Asp Asp Thr Leu Asp Val Pro Thr Gln Val Glu Leu Leu
2515 2520 2525
Ile Lys Gln Ala Thr Ser His Glu Asn Leu Cys Gln Cys Tyr Ile Gly
2530 2535 2540
Trp Cys Pro Phe Trp
2545
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 35
Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr
1 5
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 36
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 37
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 37
Ser Arg Leu His Ser Gly Val
1 5
<210> 38
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 38
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly
1 5
<210> 39
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 39
Asp Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 40
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 40
Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 41
Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly
1 5
<210> 42
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 42
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> VL
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr
100 105
<210> 44
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 44
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L1
<400> 45
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala
1 5 10
<210> 46
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 46
Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser
1 5
<210> 47
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L3
<400> 47
Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H1
<400> 48
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H2
<400> 49
Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 50
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 50
Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 51
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VH
<400> 51
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 52
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VL
<400> 52
Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr
85 90 95
Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 53
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 53
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 54
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> scFv
<400> 54
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser
130 135 140
Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys
145 150 155 160
Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe
210 215 220
Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Glu Ile Lys Arg
245
<210> 55
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR H3
<400> 55
His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 56
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR L2
<400> 56
His Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 57
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 57
Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr
1 5 10 15
Lys Gly
<210> 58
<211> 735
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码scFv的序列
<400> 58
gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60
atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120
gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180
cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240
gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300
ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360
ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420
cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480
tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540
accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600
agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660
gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720
gtgaccgtga gcagc 735
<210> 59
<211> 16
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> CD33信号肽
<400> 59
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
<210> 60
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD8α信号肽
<400> 60
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala
<210> 61
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFRα链信号序列
<400> 61
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atccca 66
<210> 62
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GMCSFRα链信号序列
<400> 62
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro
20

Claims (111)

1.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)在刺激条件下孵育包含原代人T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)抑制mTOR活性的药剂，其中所述抑制mTOR活性的药剂是选自2-(3-羟基苯基)-9-(2-异丙基苯基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-甲酰胺(化合物63)、6-(4-(2H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)-1-(2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪-2(3H)-酮(化合物155)、或7-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-3-基)-1-((1r,4r)-4-甲氧基环己基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(化合物246)；以及
(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而生成包含工程化T细胞的工程化组合物。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括进一步孵育所述工程化细胞，其中所述孵育包括存在所述抑制mTOR活性的药剂，从而产生输出组合物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述进一步孵育是在一种或多种重组细胞因子存在下进行。
4.根据权利要求2或权利要求3所述的方法，其中所述进一步孵育包括在导致所述组合物中细胞的增殖或扩增的条件下培育。
5.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括在抑制mTOR活性的药剂存在下培育包含包括用重组受体工程化的T细胞的经富集原代人T细胞的工程化细胞组合物；
其中所述抑制mTOR活性的药剂选自2-(3-羟基苯基)-9-(2-异丙基苯基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-甲酰胺(化合物63)、6-(4-(2H-1,2,4-三唑-3-基)苯基)-1-(2-(四氢-2H-吡喃-4-基)乙基)-1H-咪唑并[4,5-b]吡嗪-2(3H)-酮(化合物155)或7-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-3-基)-1-((1r,4r)-4-甲氧基环己基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(化合物246)；并且
其中所述方法导致所述组合物中细胞的增殖或扩增以产生包含工程化T细胞的输出组合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，在所述培育之前，所述方法进一步包括：
(a)在刺激条件下、在抑制mTOR活性的药剂存在下孵育包含原代T细胞的输入组合物，其中所述刺激条件包括存在能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂，从而生成经刺激组合物；并且其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物63、化合物155或化合物246；以及
(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而生成包含工程化T细胞的工程化组合物。
7.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括在抑制mTOR活性的药剂存在下培育包含包括用重组受体工程化的细胞的原代人T细胞的工程化细胞组合物，其中所述组合物中的细胞在培育之前尚未暴露于所述药剂；并且
其中所述方法导致所述组合物中的所述细胞的增殖或扩增以产生包含工程化T细胞的输出组合物。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述原代T细胞是CD4+和/或CD8+T细胞。
9.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其中所述工程化T细胞组合物包含经富集CD4+T细胞。
10.根据权利要求5-8中任一项所述的方法，其中所述工程化T细胞组合物包含经富集CD8+T细胞。
11.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括在抑制mTOR活性的药剂存在下培育包含包括用重组受体工程化的T细胞的经富集CD4+或经富集CD8+原代人T细胞的工程化细胞组合物；
其中所述方法导致所述组合物中细胞的增殖或扩增以产生包含工程化的经富集CD4+或经富集CD8+T细胞的输出组合物。
12.根据权利要求5-9和11中任一项所述的方法，其中所述工程化T细胞组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
13.根据权利要求5-8和10中任一项所述的方法，其中所述工程化T细胞组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD8+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD8+原代人T细胞组成。
14.根据权利要求5-12中任一项所述的方法，其中所述培育是在一种或多种重组细胞因子存在下进行。
15.根据权利要求3、4或8所述的方法，其中所述一种或多种重组细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-12、IL-15、G-CSF和GM-CSF中的一种或多种，任选地其中所述一种或多种重组细胞因子包括IL-2、IL-7或IL-15中的一种或多种。
16.根据权利要求5-15中任一项所述的方法，其中，在所述培育之前，所述方法进一步包括：
(a)在刺激条件下孵育包含原代T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括存在能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂，从而生成经刺激组合物；并且
(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而生成包含工程化T细胞的工程化组合物。
17.根据权利要求1-4和16中任一项所述的方法，其中所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含原代CD4+和/或CD8+T细胞。
18.根据权利要求1-4、16和17中任一项所述的方法，其中所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含经富集CD4+T细胞。
19.根据权利要求1-4、16和17中任一项所述的方法，其中所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含经富集CD8+T细胞。
20.一种用于产生工程化细胞的组合物的方法，所述方法包括：
(a)在刺激条件下孵育包含针对CD4+或CD8+原代人T细胞进行富集的T细胞的输入组合物，所述刺激条件包括以下的存在：(i)能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和/或一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域的刺激试剂和(ii)抑制mTOR活性的药剂；以及
(b)将重组受体引入所述经刺激组合物中，从而生成包含工程化T细胞的工程化组合物。
21.根据权利要求1-4、16-18和20中任一项所述的方法，其中所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD4+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD4+原代人T细胞组成。
22.根据权利要求1-4、16和18-20中任一项所述的方法，其中所述输入组合物、所述经刺激组合物和/或所述工程化组合物包含大于或大于约70％、大于或大于约75％、大于或大于约80％、大于或大于约85％、大于或大于约90％、大于或大于约95％或大于或大于约98％CD8+原代人T细胞；和/或
所述输入组合物基本上由CD8+原代人T细胞组成。
23.根据权利要求7-22中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物、小分子、小有机分子、多核苷酸、寡核苷酸、siRNA或多肽。
24.根据权利要求7-23中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂抑制mTORC1和/或mTORC2激酶活性。
25.根据权利要求7-24中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂抑制至少一种另外的激酶的活性。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述至少一种另外的激酶是PI3K。
27.根据权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是BEZ235、BGT226、GDC0980、NVP-BEZ235、PF-04691502、PI-103、SAR245409、SF1126、VS5584或XL765。
28.根据权利要求7-27中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂：
(i)不抑制PI3K活性；
(ii)在针对mTOR活性的IC50下不可检测地抑制PI3K活性；和/或
(iii)在所有可检测地抑制mTOR活性的浓度下均不可检测地抑制PI3K。
29.根据权利要求7-27或28中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂抑制mTORC1和mTORC2激酶活性。
30.根据权利要求7-27、28或29中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是吡唑并嘧啶、Torin l、Torkinib、PP30、Ku-0063794、WAY-600(Wyeth)、WAY-687(Wyeth)、WAY-354(Wyeth)、OSI-027、DS3078a、AZD8055。
31.根据权利要求7-30中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂选择性地抑制mTORC1活性。
32.根据31所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂：(i)不抑制mTORC2活性；
(ii)在针对mTORC1活性的IC50下不可检测地抑制mTORC2活性；和/或
(iii)在所有可检测地抑制mTORC1活性的浓度下均不可检测地抑制mTORC2。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是雷帕霉素、替西罗莫司、依维莫司、地弗莫司或AZD8055。
34.根据权利要求7-24、28或29中任一项所述的方法，其中所述药剂包括式I中所示的式，
Figure FDA0002556467440000051
其中R1是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，
R2是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，并且
R3和R4独立地是H或C1-8烷基。
35.根据权利要求34所述的方法，其中R1是取代的芳基、取代或未取代的杂芳基，如取代的苯基。
36.根据权利要求34或权利要求35所述的方法，其中R2是取代或未取代的芳基和/或取代或未取代的苯基。
37.根据权利要求34-36中任一项所述的方法，其中取代的基团是被一个或多个如下基团取代：卤素；C1-8烷基；C2-8烯基；C2-8炔基；羟基；C1-8烷氧基；氨基；硝基；硫醇；硫醚；亚胺；氰基；酰胺基；膦酸基；膦；羧基；硫代羰基；磺酰基；磺酰胺；酮；醛；酯；羰基；卤代烷基；B(OH)2；碳环环烷基；杂环烷基；单环或稠合或非稠合多环芳基或杂芳基；氨基；O-低级烷基；O-芳基；芳基；芳基-低级烷基；CO2CH3；CONH2；OCH2CONH2；NH2；SO2NH2；OCHF2；CF3；或OCF3基团。
38.根据权利要求7-24、28或29中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是2-(3-羟基苯基)-9-(2-异丙基苯基)-8-氧代-8,9-二氢-7H-嘌呤-6-甲酰胺(化合物63)。
39.根据权利要求7-24、28或29中任一项所述的方法，其中所述药剂包括式(II)中所示的式，
Figure FDA0002556467440000061
其中L是直接键、NH或O，
Y是N或CR3，
其中R1是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的C2-8烯基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，
R2是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基，
R3是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环烷基、-NHR4或-N(R4)2，并且
R4在每次出现时独立地是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的杂芳基、取代或未取代的环烷基或取代或未取代的杂环烷基。
40.根据权利要求39所述的方法，其中R1是取代的芳基和/或取代的苯基。
41.根据权利要求39或权利要求40所述的方法，其中Y是CH。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的方法，其中L是直接键。
43.根据权利要求39-42中任一项所述的方法，其中R1是取代的芳基并且R2是被一个或多个选自以下的取代基取代的C1-8烷基：烷氧基、氨基、羟基、环烷基或杂环烷基。
44.根据权利要求43所述的方法，其中R2是被杂环烷基取代的C1-8烷基。
45.根据权利要求1-19、23、24或34-39中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物155。
46.根据权利要求7-24、28或29中任一项所述的方法，其中所述药剂包括式III中所示的式，
Figure FDA0002556467440000071
其中R1是取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基或取代或未取代的杂环基烷基，R2是H、取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的环烷基、取代或未取代的杂环基、取代或未取代的杂环烷基、取代或未取代的芳烷基或取代或未取代的环烷基烷基，并且
R3是H，或取代或未取代的C1-8烷基。
47.根据权利要求46所述的方法，其中R1是取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基。
48.根据权利要求46或权利要求47所述的方法，其中R1是取代的吡啶基。
49.根据权利要求46-48中任一项所述的方法，其中R1是被一个或多个独立地选自以下的取代基取代的吡啶基：取代或未取代的C1-8烷基、取代或未取代的杂环基、卤素、氨基羰基、氰基、羟基烷基、-OR和-NR2，其中每个R独立地是H，或取代或未取代的C1-4烷基。在一些实施方案中，R1是1H-吡咯并[2,3-b]吡啶基或苯并咪唑基，任选地被一个或多个独立地选自以下的取代基取代：取代或未取代的C1-8烷基和-NR2，其中R独立地是H，或取代或未取代的C1-4烷基。
50.根据权利要求46-49中任一项所述的方法，其中R1是
Figure FDA0002556467440000081
其中R在每次出现时独立地是H、或取代或未取代的C1-4烷基(例如，甲基)；R1在每次出现时独立地是取代或未取代的C1-4烷基、卤素、氰基、-OR或-NR2；m是0-3；并且n是0-3。
51.根据权利要求46-50中任一项所述的方法，其中R2是H、甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、环戊基、环己基、四氢呋喃基、四氢吡喃基、(C1-4烷基)-苯基、(C1-4烷基)-环丙基、(C1-4烷基)-环丁基、(C1-4烷基)-环戊基、(C1-4烷基)-环己基、(C1-4烷基)-吡咯烷基、(C1-4烷基)-哌啶基、(C1-4烷基)-哌嗪基、(C1-4烷基)-吗啉基、(C1-4烷基)-四氢呋喃基或(C1-4烷基)-四氢吡喃基，各自任选地被取代。
52.根据权利要求46-50中任一项所述的方法，其中R2是H、C1-4烷基、(C1-4烷基)(OR)、
Figure FDA0002556467440000091
其中R在每次出现时独立地是H、或取代或未取代的C1-8烷基，R'在每次出现时独立地是H、-OR、氰基或取代或未取代的C1-8烷基，并且p是0-3。
53.根据权利要求7-24、28或29或46-52中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是7-(6-(2-羟基丙-2-基)吡啶-3-基)-1-((1r,4r)-4-甲氧基环己基)-3,4-二氢吡嗪并[2,3-b]吡嗪-2(1H)-酮(化合物246)。
54.根据权利要求5-6和38中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物63并且在500nM与2μM之间、在1nM与100nM之间、在50nM与250nM之间或在100nM与500nM之间的化合物63存在下培育所述工程化细胞组合物。
55.根据权利要求1-4和38中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物63并且在500nM与2μM之间、在1nM与100nM之间、在50nM与250nM之间或在100nM与500nM之间的化合物63存在下孵育所述工程化细胞组合物。
56.根据权利要求1-4和45中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物155并且在500nM与2μM之间、在1nM与100nM之间、在50nM与250nM之间或在100nM与500nM之间的化合物155存在下孵育所述工程化细胞组合物。
57.根据权利要求5-6和38中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物155并且在500nM与2μM之间、在1nM与100nM之间、在50nM与250nM之间或在100nM与500nM之间的化合物155存在下培育所述工程化细胞组合物。
58.根据权利要求1-4和53中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物246并且在500nM与2μM之间、在1nM与100nM之间、在50nM与250nM之间或在100nM与500nM之间的化合物246存在下孵育所述工程化细胞组合物。
59.根据权利要求5-6和53中任一项所述的方法，其中所述抑制mTOR活性的药剂是化合物246并且在500nM与2μM之间、在1nM与100nM之间、在50nM与250nM之间或在100nM与500nM之间的化合物246存在下培育所述工程化细胞组合物。
60.根据权利要求1-4和16-58中任一项所述的方法，其中所述刺激试剂包含与TCR复合物的成员特异性地结合、任选地与CD3特异性地结合的一级药剂。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述刺激试剂进一步包含与T细胞共刺激分子特异性地结合的二级药剂，任选地其中所述共刺激分子选自CD28、CD137(4-1-BB)、OX40或ICOS。
62.根据权利要求60或权利要求61所述的方法，其中所述一级和/或二级药剂包括抗体，任选地其中所述刺激试剂包括与抗CD3抗体和抗CD28抗体或其抗原结合片段一起孵育。
63.根据权利要求59-61中任一项所述的方法，其中所述一级药剂和/或二级药剂存在于固体支持物的表面上，任选地其中所述固体支持物是或包括珠。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述珠的直径大于或大于约3.5μm，但是不大于约9μm或不大于约8μm或不大于约7μm或不大于约6μm或不大于约5μm。
65.根据权利要求63或权利要求64所述的方法，其中所述珠的直径为或为约4.5μm。
66.根据权利要求63-65中任一项所述的方法，其中所述珠是惰性的。
67.根据权利要求63-66中任一项所述的方法，其中所述珠是或包含聚苯乙烯表面。
68.根据权利要求63-67中任一项所述的方法，其中所述珠是磁性或超顺磁性的。
69.根据权利要求63-68中任一项所述的方法，其中珠与细胞的比率为从或从约4:1至0.25:1。
70.根据权利要求1-4和16-69中任一项所述的方法，其中所述引入包括用包含编码所述重组受体的多核苷酸的病毒载体转导所述经刺激组合物的细胞。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体。
72.根据权利要求70或权利要求71所述的方法，其中所述病毒载体是慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
73.根据权利要求2-72中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括收集所述输出组合物的细胞。
74.根据权利要求2-73中任一项所述的方法，所述方法进一步包括任选地在药学上可接受的赋形剂存在下配制所述输出组合物的细胞以用于低温保存和/或给予至受试者。
75.根据权利要求74所述的方法，其中在低温保护剂存在下配制所述输出组合物的所述细胞。
76.根据权利要求75所述的方法，其中所述低温保护剂包括DMSO。
77.根据权利要求74-76中任一项所述的方法，其中所述输出组合物的所述细胞配制于容器，任选地小瓶或袋中。
78.根据1-4和16-77中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在所述孵育之前将所述CD4+和/或所述CD8+T细胞从生物样品中分离。
79.根据权利要求78所述的方法，其中所述分离包括基于CD4和/或CD8的表面表达来选择细胞，任选地通过阳性或阴性选择。
80.根据权利要求78或权利要求79所述的方法，其中所述分离包括进行基于免疫亲和力的选择。
81.根据权利要求78-80中任一项所述的方法，其中，所述生物样品包括从受试者获得的原代T细胞。
82.根据权利要求78-81中任一项所述的方法，其中所述生物样品是或包含全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物。
83.根据权利要求1-82中任一项所述的方法，其中所述重组受体能够与靶抗原结合，所述靶抗原与疾病、障碍或病症相关，为疾病、障碍或病症所特有，和/或在疾病、障碍或病症的细胞或组织上表达。
84.根据权利要求83所述的方法，其中所述疾病、障碍或病症是感染性疾病或障碍、自身免疫性疾病、炎性疾病或者肿瘤或癌症。
85.根据权利要求83或权利要求84所述的方法，其中所述靶抗原是肿瘤抗原。
86.根据权利要求83-85中任一项所述的方法，其中所述靶抗原选自5T4、8H9、avb6整合素、B7-H6、B细胞成熟抗原(BCMA)、CA9、癌症-睾丸抗原、碳酸酐酶9(CAIX)、CCL-1、CD19、CD20、CD22、CEA、乙型肝炎表面抗原、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD138、CD171、癌胚抗原(CEA)、CE7、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、c-Met、双重抗原、EGFR、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、EPHa2、肝配蛋白B2、erb-B2、erb-B3、erb-B4、erbB二聚体、EGFR vIII、雌激素受体、胎儿AchR、叶酸受体α、叶酸结合蛋白(FBP)、FCRL5、FCRH5、胎儿乙酰胆碱受体、G250/CAIX、GD2、GD3、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、gp100、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erbB2)、HMW-MAA、IL-22R-α、IL-13受体α2(IL-13Ra2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、路易斯Y、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MART-1、间皮素、鼠CMV、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、NCAM、NKG2D、NKG2D配体、NY-ESO-1、O-乙酰化GD2(OGD2)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、PSCA、孕酮受体、存活蛋白、ROR1、TAG72、tEGFR、VEGF受体、VEGF-R2、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性抗原和与通用标签相关的抗原。
87.根据权利要求1-86中任一项所述的方法，其中所述重组受体是或包含功能性非TCR抗原受体或TCR或其抗原结合片段。
88.根据权利要求1-87中任一项所述的方法，其中所述重组受体是嵌合抗原受体(CAR)。
89.根据权利要求1-88中任一项所述的方法，其中所述重组受体是抗CD19CAR。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含：含有抗原结合结构域的细胞外结构域和含有细胞内信号传导结构域的细胞内信号传导区域。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述抗原结合结构域是或包含抗体或其抗体片段，所述抗体片段任选地是单链片段。
92.根据权利要求91所述的方法，其中所述片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。
93.根据权利要求91或权利要求92所述的方法，其中所述片段包含scFv。
94.根据权利要求91-93中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体进一步包含在所述细胞外结构域与所述细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。
95.根据权利要求91-94中任一项所述的方法，其中所述嵌合抗原受体进一步包含在所述抗原结合结构域与所述跨膜结构域之间的间隔子，任选地其中所述间隔子是免疫球蛋白恒定区的一部分，任选地其中所述部分是或包括铰链区。
96.根据权利要求90-95中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包括初级信号传导结构域、能够在T细胞中诱导初级激活信号的信号传导结构域、T细胞受体(TCR)组分的信号传导结构域、和/或包含基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)的信号传导结构域。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述细胞内信号传导结构域是或包括CD3链、任选地CD3-zeta(CD3ζ)链的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
98.根据权利要求90-97中任一项所述的方法，其中所述细胞内信号传导区域还包含共刺激信号传导区域。
99.根据权利要求98所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域包含T细胞共刺激分子的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
100.根据权利要求98或权利要求99所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域包含CD28、4-1BB或ICOS的细胞内信号传导结构域或其信号传导部分。
101.根据权利要求98-100中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区域位于所述跨膜结构域与所述细胞内信号传导区域之间。
102.根据权利要求1-4和15-101中任一项所述的方法，其中所述原代T细胞包括经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的单独组合物，并且其中分别孵育所述经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的组合物。
103.根据权利要求5-16和23-101中任一项所述的方法，其中所述原代T细胞包括经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的单独组合物，并且其中分别培育所述经富集CD4+T细胞和经富集CD8+T细胞的组合物。
104.一种包含工程化细胞的组合物，所述组合物通过根据权利要求1-103中任一项所述的方法产生。
105.根据权利要求104所述的组合物，所述组合物进一步包含药学上可接受的载体。
106.根据权利要求104或权利要求105所述的组合物，所述组合物包含低温保护剂，任选地DMSO。
107.一种制品，所述制品包含根据权利要求104-106中任一项所述的组合物；和用于将所述输出组合物给予至受试者的说明书。
108.根据权利要求107所述的制品，其中所述受试者患有疾病或病症，任选地其中所述重组受体特异性地识别或特异性地结合至与所述疾病或病症相关或在所述疾病或病症的细胞上表达或存在的抗原。
109.根据权利要求107或权利要求108所述的制品，其中所述输出组合物是工程化CD4+T细胞的组合物。
110.根据权利要求107或权利要求108所述的制品，其中所述输出组合物是CD8+T细胞的工程化组合物。
111.根据权利要求107或权利要求108所述的制品，其中所述输出组合物是CD4+和CD8+T细胞的工程化组合物。
CN201880084187.4A 2017-11-01 2018-11-01 产生t细胞组合物的方法 Pending CN111615556A (zh)

Applications Claiming Priority (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201762580435P 2017-11-01 2017-11-01
US62/580,435 2017-11-01
US201762584687P 2017-11-10 2017-11-10
US62/584,687 2017-11-10
US201862699709P 2018-07-17 2018-07-17
US62/699,709 2018-07-17
US201862711494P 2018-07-28 2018-07-28
US62/711,494 2018-07-28
PCT/US2018/058812 WO2019090004A1 (en) 2017-11-01 2018-11-01 Process for producing a t cell composition

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111615556A true CN111615556A (zh) 2020-09-01

Family

ID=64332414

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880084187.4A Pending CN111615556A (zh) 2017-11-01 2018-11-01 产生t细胞组合物的方法

Country Status (14)

Country Link
US (1) US20210254000A1 (zh)
EP (1) EP3704229B1 (zh)
JP (1) JP7258899B2 (zh)
KR (1) KR20200097253A (zh)
CN (1) CN111615556A (zh)
AU (1) AU2018360801A1 (zh)
BR (1) BR112020008565A2 (zh)
CA (1) CA3080509A1 (zh)
ES (1) ES2971659T3 (zh)
IL (1) IL274330A (zh)
MA (1) MA50859A (zh)
MX (1) MX2020004239A (zh)
SG (1) SG11202003657VA (zh)
WO (1) WO2019090004A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11202104611YA (en) * 2018-11-08 2021-06-29 Neximmune Inc T cell compositions with improved phenotypic properties
CN113203718B (zh) * 2021-05-13 2022-05-31 桂林电子科技大学 一种基于荧光共振能量转移的gpc3检测方法

Family Cites Families (83)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4452773A (en) 1982-04-05 1984-06-05 Canadian Patents And Development Limited Magnetic iron-dextran microspheres
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US4795698A (en) 1985-10-04 1989-01-03 Immunicon Corporation Magnetic-polymer particles
IN165717B (zh) 1986-08-07 1989-12-23 Battelle Memorial Institute
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
ES2067018T3 (es) 1988-12-28 1995-03-16 Stefan Miltenyi Procedimiento y materiales para la separacion en alto gradiente magnetico de materiales biologicos.
US5200084A (en) 1990-09-26 1993-04-06 Immunicon Corporation Apparatus and methods for magnetic separation
US5925517A (en) 1993-11-12 1999-07-20 The Public Health Research Institute Of The City Of New York, Inc. Detectably labeled dual conformation oligonucleotide probes, assays and kits
US5538848A (en) 1994-11-16 1996-07-23 Applied Biosystems Division, Perkin-Elmer Corp. Method for detecting nucleic acid amplification using self-quenching fluorescence probe
US5827642A (en) 1994-08-31 1998-10-27 Fred Hutchinson Cancer Research Center Rapid expansion method ("REM") for in vitro propagation of T lymphocytes
WO1996013593A2 (en) 1994-10-26 1996-05-09 Procept, Inc. Soluble single chain t cell receptors
WO1996018105A1 (en) 1994-12-06 1996-06-13 The President And Fellows Of Harvard College Single chain t-cell receptor
US6013516A (en) 1995-10-06 2000-01-11 The Salk Institute For Biological Studies Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells
DE19608753C1 (de) 1996-03-06 1997-06-26 Medigene Gmbh Transduktionssystem und seine Verwendung
US6451995B1 (en) 1996-03-20 2002-09-17 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Single chain FV polynucleotide or peptide constructs of anti-ganglioside GD2 antibodies, cells expressing same and related methods
EP0912250B1 (en) 1996-04-24 1999-11-03 Claude Fell Cell separation system for biological fluids like blood
SE506700C2 (sv) 1996-05-31 1998-02-02 Mikael Kubista Sond och förfaranden för analys av nukleinsyra
ATE295427T1 (de) 1996-06-04 2005-05-15 Univ Utah Res Found Überwachung der hybridisierung während pcr
US6489458B2 (en) 1997-03-11 2002-12-03 Regents Of The University Of Minnesota DNA-based transposon system for the introduction of nucleic acid into DNA of a cell
JP2001519143A (ja) 1997-10-02 2001-10-23 スノル・モレキュラー・コーポレーション 可溶性の一本鎖ｔ細胞レセプタータンパク質
JP2001523450A (ja) 1997-11-13 2001-11-27 リージェンツ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミネソタ 細胞のｄｎａへの核酸の導入のための核酸転移ベクター
US5994136A (en) 1997-12-12 1999-11-30 Cell Genesys, Inc. Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors
IL139344A0 (en) 1998-05-19 2001-11-25 Avidex Ltd Soluble t cell receptor
GB9812768D0 (en) 1998-06-13 1998-08-12 Zeneca Ltd Methods
WO2000014257A1 (en) 1998-09-04 2000-03-16 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Fusion receptors specific for prostate-specific membrane antigen and uses thereof
US6410319B1 (en) 1998-10-20 2002-06-25 City Of Hope CD20-specific redirected T cells and their use in cellular immunotherapy of CD20+ malignancies
WO2000038762A1 (en) 1998-12-24 2000-07-06 Biosafe S.A. Blood separation system particularly for concentrating hematopoietic stem cells
US20020131960A1 (en) 2000-06-02 2002-09-19 Michel Sadelain Artificial antigen presenting cells and methods of use thereof
CA2417986C (en) 2000-08-11 2013-11-26 University Of Utah Research Foundation Single-labeled oligonucleotide probes
AU2001297703B2 (en) 2000-11-07 2006-10-19 City Of Hope CD19-specific redirected immune cells
US7070995B2 (en) 2001-04-11 2006-07-04 City Of Hope CE7-specific redirected immune cells
US20090257994A1 (en) 2001-04-30 2009-10-15 City Of Hope Chimeric immunoreceptor useful in treating human cancers
DE60203125T2 (de) 2001-08-31 2006-04-06 Avidex Ltd., Abingdon Löslicher t zell rezeptor
US7939059B2 (en) 2001-12-10 2011-05-10 California Institute Of Technology Method for the generation of antigen-specific lymphocytes
US20030170238A1 (en) 2002-03-07 2003-09-11 Gruenberg Micheal L. Re-activated T-cells for adoptive immunotherapy
ITCZ20020002A1 (it) 2002-04-11 2003-10-13 Parco Scient E Tecnologico Del Dispositivo e metodo per il rilevamento simultaneo di differenti anticorpi e antigeni in campioni clinici, alimentari ed ambientali
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
NZ539225A (en) 2002-10-09 2006-09-29 Avidex Ltd Single chain recombinant T cell receptors
US20050129671A1 (en) 2003-03-11 2005-06-16 City Of Hope Mammalian antigen-presenting T cells and bi-specific T cells
US20050025763A1 (en) 2003-05-08 2005-02-03 Protein Design Laboratories, Inc. Therapeutic use of anti-CS1 antibodies
MXPA06008700A (es) 2004-02-06 2007-01-19 Morphosys Ag Anticuerpos anti-cd38 humanos y usos para los mismos.
ATE475669T1 (de) 2004-06-29 2010-08-15 Immunocore Ltd Einen modifizierten t-zellen-rezeptor exprimierende zellen
ES2716874T3 (es) 2005-03-23 2019-06-17 Genmab As Anticuerpos contra cd38 para el tratamiento del mieloma múltiple
RU2410125C2 (ru) 2005-03-23 2011-01-27 Биосейф С.А. Комплексная система для сбора, обработки и трансплантации клеточных субпопуляций, включая зрелые стволовые клетки, для регенеративной медицины
KR20140104060A (ko) 2006-10-19 2014-08-27 시그날 파마소티칼 엘엘씨 헤테로아릴 화합물, 이들의 조성물 그리고 단백질 키나아제 억제제로서의 이들의 용도
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
CN101679432B (zh) 2006-10-19 2015-04-22 西格诺药品有限公司 杂芳基化合物、其组合物及其作为蛋白激酶抑制剂的用途
EP3357338A1 (en) 2007-03-30 2018-08-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Constitutive expression of costimulatory ligands on adoptively transferred t lymphocytes
ES2640216T3 (es) 2007-12-07 2017-11-02 Miltenyi Biotec Gmbh Sistemas y métodos para procesamiento de células
US8479118B2 (en) 2007-12-10 2013-07-02 Microsoft Corporation Switching search providers within a browser search box
LT2222861T (lt) 2007-12-11 2018-03-26 The University Of North Carolina At Chapel Hill Retrovirusiniai vektoriai modifikuoti polipurino atkarpa
ES2475201T3 (es) 2007-12-26 2014-07-10 Biotest Ag Agentes dirigidos contra CD138 y usos de los mismos
JP5173594B2 (ja) 2008-05-27 2013-04-03 キヤノン株式会社 管理装置、画像形成装置及びそれらの処理方法
EP2331566B1 (en) 2008-08-26 2015-10-07 City of Hope Method and compositions for enhanced anti-tumor effector functioning of t cells
US8110578B2 (en) 2008-10-27 2012-02-07 Signal Pharmaceuticals, Llc Pyrazino[2,3-b]pyrazine mTOR kinase inhibitors for oncology indications and diseases associated with the mTOR/PI3K/Akt pathway
CN102216332A (zh) 2008-10-31 2011-10-12 艾伯特生物治疗学公司 抗-cs1抗体用于治疗罕见淋巴瘤的用途
WO2010120561A1 (en) 2009-04-01 2010-10-21 Genentech, Inc. Anti-fcrh5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
WO2011044186A1 (en) 2009-10-06 2011-04-14 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Human single-chain t cell receptors
EP3527585B1 (en) 2009-11-03 2022-02-16 City of Hope Truncated epiderimal growth factor receptor (egfrt) for transduced t cell selection
KR20230133410A (ko) 2010-12-09 2023-09-19 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 암을 치료하기 위한 키메릭 항원 수용체 변형 t 세포의 용도
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
BR112013024395B1 (pt) 2011-03-23 2021-10-26 Fred Hutchinson Cancer Research Center Composições adotivas de imunoterapia celular e método para fabricação da dita composição
US8398282B2 (en) 2011-05-12 2013-03-19 Delphi Technologies, Inc. Vehicle front lighting assembly and systems having a variable tint electrowetting element
CA2852921C (en) * 2011-10-19 2023-10-10 Signal Pharmaceuticals, Llc Treatment of cancer with tor kinase inhibitors
MX359234B (es) 2011-11-11 2018-09-20 Hutchinson Fred Cancer Res Inmunoterapia de celulas t objetivadas en ciclina a1 para cancer.
AU2013221672B2 (en) 2012-02-13 2017-11-09 Seattle Children's Hospital D/B/A Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
WO2013126726A1 (en) 2012-02-22 2013-08-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Double transgenic t cells comprising a car and a tcr and their methods of use
BR112014027374B1 (pt) 2012-05-03 2022-05-31 Fred Hutchinson Cancer Research Center Método para gerar um receptor de células t (tcr) com afinidade aumentada
KR102135239B1 (ko) 2012-08-20 2020-07-17 프레드 헛친슨 켄서 리서치 센터 세포 면역요법을 위한 방법 및 조성물
CN104853766A (zh) 2012-10-02 2015-08-19 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 用于免疫疗法的组合物和方法
WO2014097442A1 (ja) 2012-12-20 2014-06-26 三菱電機株式会社 車載装置及びプログラム
TWI654206B (zh) 2013-03-16 2019-03-21 諾華公司 使用人類化抗－ｃｄ１９嵌合抗原受體治療癌症
AR096687A1 (es) 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
US9108442B2 (en) 2013-08-20 2015-08-18 Ricoh Company, Ltd. Image forming apparatus
EP3647412A1 (en) 2014-04-23 2020-05-06 Juno Therapeutics, Inc. Methods for isolating, culturing, and genetically engineering immune cell populations for adoptive therapy
SG11201610170SA (en) * 2014-06-06 2017-01-27 Bluebird Bio Inc Improved t cell compositions
TWI751102B (zh) 2014-08-28 2022-01-01 美商奇諾治療有限公司 對ｃｄ１９具專一性之抗體及嵌合抗原受體
PT3757206T (pt) 2014-11-05 2024-05-21 Juno Therapeutics Inc Métodos de transdução e processamento de células
DK3227432T3 (en) 2014-12-05 2023-10-23 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen and uses thereof
HUE053995T2 (hu) 2014-12-05 2021-08-30 Memorial Sloan Kettering Cancer Center B-sejt-érési antigént célzó antitestek és alkalmazási eljárások
MX2017007247A (es) 2014-12-05 2018-01-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Receptor acoplado a la proteina g dirigida a anticuerpos y metodos de uso.
SG10202007326QA (en) 2014-12-05 2020-08-28 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Chimeric antigen receptors targeting g-protein coupled receptor and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
IL274330A (en) 2020-06-30
SG11202003657VA (en) 2020-05-28
ES2971659T3 (es) 2024-06-06
JP2021501607A (ja) 2021-01-21
AU2018360801A1 (en) 2020-05-14
EP3704229B1 (en) 2023-12-20
WO2019090004A1 (en) 2019-05-09
MA50859A (fr) 2020-09-09
KR20200097253A (ko) 2020-08-18
MX2020004239A (es) 2020-09-09
CA3080509A1 (en) 2019-05-09
EP3704229A1 (en) 2020-09-09
JP7258899B2 (ja) 2023-04-17
US20210254000A1 (en) 2021-08-19
BR112020008565A2 (pt) 2020-10-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6987945B2 (ja) ヒトメソテリンキメラ抗原受容体およびその使用
US20230052970A1 (en) Phosphoglycerate kinase 1 (pgk) promoters and methods of use for expressing chimeric antigen receptor
US20200061113A1 (en) Chimeric antigen receptor therapy characterization assays and uses thereof
AU2015330898B2 (en) Biomarkers predictive of therapeutic responsiveness to chimeric antigen receptor therapy and uses thereof
JP2022043043A (ja) 免疫細胞の有効性および増大を改善する方法
WO2019213282A1 (en) Biomarkers for evaluating car-t cells to predict clinical outcome
EP3801769A1 (en) Combination therapy with chimeric antigen receptor (car) therapies
CN111542596A (zh) 产生工程化细胞的治疗性组合物的方法
CN112203680A (zh) 用于细胞疗法的表型标记和相关方法
CN114269371A (zh) 细胞介导的细胞毒性疗法与促存活bcl2家族蛋白的抑制剂的组合疗法
CN115803824A (zh) 鉴定与临床反应相关的特征的方法及其用途
EP3886894B1 (en) Methods for dosing and treatment of b cell malignancies in adoptive cell therapy
JP7258899B2 (ja) Ｔ細胞組成物を作製するための方法
IL293393A (en) Cell therapy-related toxicity and response-related methods for the treatment of b-cell malignancies
EA043641B1 (ru) Способ получения t-клеточной композиции
CA3179800A1 (en) Methods and uses related to cell therapy engineered with a chimeric antigen receptor targeting b-cell maturation antigen

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination