JP2002051785A - 抗癌ヒトモノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識される抗原エピトープのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡヌクレオチド配列 - Google Patents
抗癌ヒトモノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識される抗原エピトープのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡヌクレオチド配列Info
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- JP2002051785A JP2002051785A JP2000241927A JP2000241927A JP2002051785A JP 2002051785 A JP2002051785 A JP 2002051785A JP 2000241927 A JP2000241927 A JP 2000241927A JP 2000241927 A JP2000241927 A JP 2000241927A JP 2002051785 A JP2002051785 A JP 2002051785A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 抗癌ヒトモノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧ
によって認識される抗原エピトープのアミノ酸配列及び
それをコードするＤＮＡヌクレオチド配列の提供。 【解決手段】 下記のアミノ酸配列 を有するペプチド又はモノクローナル抗体CLN-IgGと結
合性を有するその断片。上記のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡ。
によって認識される抗原エピトープのアミノ酸配列及び
それをコードするＤＮＡヌクレオチド配列の提供。 【解決手段】 下記のアミノ酸配列 を有するペプチド又はモノクローナル抗体CLN-IgGと結
合性を有するその断片。上記のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡ。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、たとえば、ヒトの
疾患の予防、治療、診断などの医学および薬学分野や、
生化学試薬、生体高分子の精製試薬などの薬理学、生化
学分野などの広い分野において有用な蛋白質の構造に関
する。さらに詳しくは、本発明は、ヒト子宮癌患者のB
細胞とヒトリンパ芽球細胞株とのヒト／ヒト融合細胞株
CLN/SUZ H11が産生する癌細胞に結合性を有するヒト免
疫グロブリンが認識する抗原のアミノ酸配列ならびにそ
の遺伝子の塩基配列に関する。
疾患の予防、治療、診断などの医学および薬学分野や、
生化学試薬、生体高分子の精製試薬などの薬理学、生化
学分野などの広い分野において有用な蛋白質の構造に関
する。さらに詳しくは、本発明は、ヒト子宮癌患者のB
細胞とヒトリンパ芽球細胞株とのヒト／ヒト融合細胞株
CLN/SUZ H11が産生する癌細胞に結合性を有するヒト免
疫グロブリンが認識する抗原のアミノ酸配列ならびにそ
の遺伝子の塩基配列に関する。
【０００２】
【従来の技術及び課題】癌細胞は正常細胞とは質的・量
的に異なった癌特異抗原あるいは癌関連抗原を有してお
り、そのような抗原を十分にもつ癌細胞は宿主の免疫系
によって排除されると考えられているが、それでも宿主
で増殖をくり返すのはシェディング、マスキング、アナ
ジーなどの癌細胞の抗原性の変化によると考えられる。
ヒトの場合、初期の研究において悪性黒色腫の患者血清
中に自己の癌細胞と反応する抗体の存在が確認されたこ
とから、そのような抗体を大量に、なおかつ、安定に供
給することが可能であれば、癌抗原の構造や機能の解析
といった基礎生物学的側面のみならず、治療・診断とい
った臨床的側面においてもきわめて利用価値の高いもの
になると考えられた。しかし、患者血清中には、1）多
種多様な特異性を持つ抗体が含まれていること、2）量
的に制限があること、3）安定供給が得られないことな
どの問題点があった。
的に異なった癌特異抗原あるいは癌関連抗原を有してお
り、そのような抗原を十分にもつ癌細胞は宿主の免疫系
によって排除されると考えられているが、それでも宿主
で増殖をくり返すのはシェディング、マスキング、アナ
ジーなどの癌細胞の抗原性の変化によると考えられる。
ヒトの場合、初期の研究において悪性黒色腫の患者血清
中に自己の癌細胞と反応する抗体の存在が確認されたこ
とから、そのような抗体を大量に、なおかつ、安定に供
給することが可能であれば、癌抗原の構造や機能の解析
といった基礎生物学的側面のみならず、治療・診断とい
った臨床的側面においてもきわめて利用価値の高いもの
になると考えられた。しかし、患者血清中には、1）多
種多様な特異性を持つ抗体が含まれていること、2）量
的に制限があること、3）安定供給が得られないことな
どの問題点があった。
【０００３】KohlerとMilsteinにより開発されたハイブ
リドーマ法によるモノクローナル抗体の作製技術はこれ
らの問題点を解決するものであった。彼らの報告以後、
ヒト癌細胞あるいはその抽出物でマウスを免疫し、ヒト
癌細胞と反応する多数のマウスモノクローナル抗体がつ
くられ、それを用いて種々の抗原が同定され、また、そ
の一部は臨床応用も試みられている。
リドーマ法によるモノクローナル抗体の作製技術はこれ
らの問題点を解決するものであった。彼らの報告以後、
ヒト癌細胞あるいはその抽出物でマウスを免疫し、ヒト
癌細胞と反応する多数のマウスモノクローナル抗体がつ
くられ、それを用いて種々の抗原が同定され、また、そ
の一部は臨床応用も試みられている。
【０００４】それらの結果から、マウスにとって異物で
あるヒトの細胞を免疫原として使用した場合、得られる
抗体は癌抗原に対するよりはヒト抗原に対するものが多
く、腫瘍免疫を惹起する真のヒト癌抗原を認識している
かどうか疑問がもたれた。また、臨床試験の結果から、
ヒトにとって異種であるマウス抗体をヒトに頻回投与す
ると、HAMA反応（ヒト抗マウス抗体反応）が誘導され、
その結果、副作用ならびに抗体の治療または予防効果の
低下を引き起こすことが明らかとなった。以上の点か
ら、より安全性の高い同種由来の抗癌抗体、すなわちヒ
ト抗癌モノクローナル抗体の出現が期待された。
あるヒトの細胞を免疫原として使用した場合、得られる
抗体は癌抗原に対するよりはヒト抗原に対するものが多
く、腫瘍免疫を惹起する真のヒト癌抗原を認識している
かどうか疑問がもたれた。また、臨床試験の結果から、
ヒトにとって異種であるマウス抗体をヒトに頻回投与す
ると、HAMA反応（ヒト抗マウス抗体反応）が誘導され、
その結果、副作用ならびに抗体の治療または予防効果の
低下を引き起こすことが明らかとなった。以上の点か
ら、より安全性の高い同種由来の抗癌抗体、すなわちヒ
ト抗癌モノクローナル抗体の出現が期待された。
【０００５】このような状況の中で本発明者らの一人
は、特開昭58-201994号公報（特公平01-59878号公
報）、特開昭59-135898号公報、および特開昭59-137497
号公報に詳しく開示されているごとく、ヒト癌細胞に高
い反応性を有するヒトモノクローナル抗体を産生する細
胞株CLN H11（ATCC No. HB8307）を樹立した。この細胞
株が産生するモノクローナル抗体（CLN-IgG）は、γ1お
よびκのアイソタイプを持つ抗体であり、該抗体の全ア
ミノ酸配列およびDNA塩基配列も報告されている（特開
平06-141884号公報）。
は、特開昭58-201994号公報（特公平01-59878号公
報）、特開昭59-135898号公報、および特開昭59-137497
号公報に詳しく開示されているごとく、ヒト癌細胞に高
い反応性を有するヒトモノクローナル抗体を産生する細
胞株CLN H11（ATCC No. HB8307）を樹立した。この細胞
株が産生するモノクローナル抗体（CLN-IgG）は、γ1お
よびκのアイソタイプを持つ抗体であり、該抗体の全ア
ミノ酸配列およびDNA塩基配列も報告されている（特開
平06-141884号公報）。
【０００６】一方、CLN-IgGが認識する抗原について
は、本発明者らの研究により、これ迄に以下のことが明
らかとなっている：１）分子量６万と５万３千のタンパ
ク質であること［Aotsuka, Y. and H. Hagiwara (1988)
Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 24: 829-838］、２）
各種腫瘍細胞に発現されているが、特に神経膠腫では、
悪性度の高い腫瘍ほど抗原の強い発現がみられること、
３）細胞周期のG2/M期で発現が増大し、逆にG1期で減少
することから、細胞増殖に関係した分子であると考えら
れること［Kokunai, T., N. Tamaki, et al. (1990)
J. Neurosurg., 73: 901-908;、4）細胞表面に露出しAD
CC（抗体依存性細胞障害）やCDC（補体依存性細胞障
害）の標的分子となること［Kokunai, T., N. Tamaki,
et al. (1990)J. Neurosurg., 73: 901-908; Osumi,
K., J. Nagao, et al. (1992) Cancer Letters, 62: 17
9-183］。
は、本発明者らの研究により、これ迄に以下のことが明
らかとなっている：１）分子量６万と５万３千のタンパ
ク質であること［Aotsuka, Y. and H. Hagiwara (1988)
Eur. J. Cancer Clin. Oncol., 24: 829-838］、２）
各種腫瘍細胞に発現されているが、特に神経膠腫では、
悪性度の高い腫瘍ほど抗原の強い発現がみられること、
３）細胞周期のG2/M期で発現が増大し、逆にG1期で減少
することから、細胞増殖に関係した分子であると考えら
れること［Kokunai, T., N. Tamaki, et al. (1990)
J. Neurosurg., 73: 901-908;、4）細胞表面に露出しAD
CC（抗体依存性細胞障害）やCDC（補体依存性細胞障
害）の標的分子となること［Kokunai, T., N. Tamaki,
et al. (1990)J. Neurosurg., 73: 901-908; Osumi,
K., J. Nagao, et al. (1992) Cancer Letters, 62: 17
9-183］。
【０００７】以上のことから、CLN-IgGが認識する抗原
は腫瘍関連抗原と考えられる。しかしながら、該抗原の
構造の詳細については、これまでまったく不明であっ
た。
は腫瘍関連抗原と考えられる。しかしながら、該抗原の
構造の詳細については、これまでまったく不明であっ
た。
【０００８】そこで、本発明者らは、CLN-IgGが認識す
る抗原の構造を解明すべく、抗原の強い発現がみられる
膠芽腫細胞株U-251MGから該抗原を分離・精製し解析し
た結果、その抗原の実体がビメンチンであることを発見
した。さらに、ビメンチンの各種ペプチド断片を作製
し、それぞれの断片とCLN-IgGとの反応性からCLN-IgGに
よって認識される抗原エピトープ領域を同定し、本発明
を完成するに至った。
る抗原の構造を解明すべく、抗原の強い発現がみられる
膠芽腫細胞株U-251MGから該抗原を分離・精製し解析し
た結果、その抗原の実体がビメンチンであることを発見
した。さらに、ビメンチンの各種ペプチド断片を作製
し、それぞれの断片とCLN-IgGとの反応性からCLN-IgGに
よって認識される抗原エピトープ領域を同定し、本発明
を完成するに至った。
【０００９】
【課題を解決するための手段】かくして、本発明によれ
ば、下記のアミノ酸配列 Glu Trp Tyr Lys Ser Lys Phe Ala Asp Leu Ser Glu Ala Ala Asn Arg 1 5 10 15 Asn Asn Asp Ala Leu Arg Gln Ala Lys Gln Glu Ser Thr Glu Tyr Arg 20 25 30 Arg Gln Val Gln Ser Leu Thr Cys Glu Val Asp Ala Leu Lys Gly Thr 35 40 45 Asn Glu Ser Leu Glu Arg Gln Met Arg Glu Met Glu Glu Asn Phe Ala 50 55 60 Val Glu Ala Ala Asn Tyr Gln Asp Thr Ile Gly Arg Leu Gln Asp 65 70 75 を有するペプチドまたはモノクローナル抗体CLN-IgGと
結合性を有するその断片ならびにそれをコードするＤＮ
Ａが提供される。
ば、下記のアミノ酸配列 Glu Trp Tyr Lys Ser Lys Phe Ala Asp Leu Ser Glu Ala Ala Asn Arg 1 5 10 15 Asn Asn Asp Ala Leu Arg Gln Ala Lys Gln Glu Ser Thr Glu Tyr Arg 20 25 30 Arg Gln Val Gln Ser Leu Thr Cys Glu Val Asp Ala Leu Lys Gly Thr 35 40 45 Asn Glu Ser Leu Glu Arg Gln Met Arg Glu Met Glu Glu Asn Phe Ala 50 55 60 Val Glu Ala Ala Asn Tyr Gln Asp Thr Ile Gly Arg Leu Gln Asp 65 70 75 を有するペプチドまたはモノクローナル抗体CLN-IgGと
結合性を有するその断片ならびにそれをコードするＤＮ
Ａが提供される。
【００１０】以下、本発明により提供されるペプチドま
たはその断片ならびにそれをコードするＤＮＡについ
て、さらに詳細に説明する。
たはその断片ならびにそれをコードするＤＮＡについ
て、さらに詳細に説明する。
【００１１】
【発明の実施の形態】1）ペプチド及びその断片の構造
と製法 CLN-IgGが認識する抗原は、膠芽腫細胞株U-251MG（以
下、単にU-251MGという）の細胞抽出液から次の方法で
精製・解析することができた。
と製法 CLN-IgGが認識する抗原は、膠芽腫細胞株U-251MG（以
下、単にU-251MGという）の細胞抽出液から次の方法で
精製・解析することができた。
【００１２】（イ）まず、膠芽腫細胞株U-251MGの細胞
抽出液をCLN-IgG結合カラムを用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーおよび二次元電気泳動にかけて抗原を
精製後、さらにリジンエンドペプチダーゼで消化し、得
られたペプチドの一部アミノ酸配列を決定した。他方、
（ロ）膠芽腫細胞株U-251MGの細胞抽出液を二次元電気
泳動にかけて蛋白質を分離後、CLN-IgGと結合性を有す
るスポットをトリプシンで断片化し、得られたペプチド
を質量分析にかけた。上記（イ）で決定したペプチドの
部分アミノ酸配列及び上記（ロ）で得られたペプチドの
分子量を、ＭＳ−Ｆｉｔ(data base)で検索した結果、C
LN-IgGによって認識される抗原がビメンチンであること
が示唆された。
抽出液をCLN-IgG結合カラムを用いたアフィニティーク
ロマトグラフィーおよび二次元電気泳動にかけて抗原を
精製後、さらにリジンエンドペプチダーゼで消化し、得
られたペプチドの一部アミノ酸配列を決定した。他方、
（ロ）膠芽腫細胞株U-251MGの細胞抽出液を二次元電気
泳動にかけて蛋白質を分離後、CLN-IgGと結合性を有す
るスポットをトリプシンで断片化し、得られたペプチド
を質量分析にかけた。上記（イ）で決定したペプチドの
部分アミノ酸配列及び上記（ロ）で得られたペプチドの
分子量を、ＭＳ−Ｆｉｔ(data base)で検索した結果、C
LN-IgGによって認識される抗原がビメンチンであること
が示唆された。
【００１３】ビメンチンは、細胞の構造を維持する働き
をする細胞骨格蛋白質のうち中間径フィラメントに分類
される既知の蛋白質（アミノ酸残基数466、分子量53,65
1）である。中間径フィラメントは一般にN末端側から、
head・coil 1（c1）・ coil2（c2）・ tailという４つ
のドメイン構造を有し、特にc1およびc2ドメインはらせ
ん状の構造を持っている。ビメンチンの場合、head・c1
・ c2・ tailドメインはそれぞれ95、150、152、69アミ
ノ酸からなる。
をする細胞骨格蛋白質のうち中間径フィラメントに分類
される既知の蛋白質（アミノ酸残基数466、分子量53,65
1）である。中間径フィラメントは一般にN末端側から、
head・coil 1（c1）・ coil2（c2）・ tailという４つ
のドメイン構造を有し、特にc1およびc2ドメインはらせ
ん状の構造を持っている。ビメンチンの場合、head・c1
・ c2・ tailドメインはそれぞれ95、150、152、69アミ
ノ酸からなる。
【００１４】そこで、これらドメインのうち、いずれに
CLN-IgGが認識する抗原エピトープが存在するかを調べ
るため、まず、U-251MGのmRNAを鋳型にRT-PCR法により
ビメンチンの各種ドメインに相当するDNA断片を取得
し、GST（グルタチオンSトランスフェラーゼ）との融合
蛋白質発現ベクターに連結後、ビメンチンの各種ドメイ
ンとＧＳＴとの融合蛋白質を大腸菌で発現させ、それぞ
れのドメインとCLN-IgGとの結合性をウェスタンブロッ
ティングを用いて検討した。その結果、CLN-IgGはC2ド
メインを有する融合蛋白質とのみ結合することが判明し
た。
CLN-IgGが認識する抗原エピトープが存在するかを調べ
るため、まず、U-251MGのmRNAを鋳型にRT-PCR法により
ビメンチンの各種ドメインに相当するDNA断片を取得
し、GST（グルタチオンSトランスフェラーゼ）との融合
蛋白質発現ベクターに連結後、ビメンチンの各種ドメイ
ンとＧＳＴとの融合蛋白質を大腸菌で発現させ、それぞ
れのドメインとCLN-IgGとの結合性をウェスタンブロッ
ティングを用いて検討した。その結果、CLN-IgGはC2ド
メインを有する融合蛋白質とのみ結合することが判明し
た。
【００１５】さらに、C2ドメイン内のエピトープ領域を
絞り込むために、GST-C2融合蛋白質発現ベクターの
5’、3’両側から様々な長さの欠失を持つ突然変異クロ
ーンを作製し、上述した方法と同様にして融合蛋白質を
大腸菌で発現させ、それぞれの融合蛋白質とCLN-IgGと
の結合性をウェスタンブロッティングを用いて検討し、
該結合に関わる最小限の領域を同定した。その結果、CL
N-IgGが認識するビメンチンのエピトープはC2ドメイン
中央の79アミノ酸（ビメンチンのアミノ酸残基289- 36
7）からなる領域に存在し、そのアミノ酸配列は配列表
の配列番号１５に示すとおりであることが確認された。
絞り込むために、GST-C2融合蛋白質発現ベクターの
5’、3’両側から様々な長さの欠失を持つ突然変異クロ
ーンを作製し、上述した方法と同様にして融合蛋白質を
大腸菌で発現させ、それぞれの融合蛋白質とCLN-IgGと
の結合性をウェスタンブロッティングを用いて検討し、
該結合に関わる最小限の領域を同定した。その結果、CL
N-IgGが認識するビメンチンのエピトープはC2ドメイン
中央の79アミノ酸（ビメンチンのアミノ酸残基289- 36
7）からなる領域に存在し、そのアミノ酸配列は配列表
の配列番号１５に示すとおりであることが確認された。
【００１６】このようにCLN-IgGが認識する抗原ペプチ
ド（以下、単に抗原ペプチドということがある）の構造
が明らかとなったことにより、該抗原ペプチドは種々の
方法で製造することが可能となる。たとえば、本発明の
抗原ペプチドは、ペプチド化学の分野でそれ自体既知の
固相または液相合成法に従い化学的に合成することがで
きる。また、該抗原ペプチドのアミノ酸配列からそれを
コードするＤＮＡを合成し、それを、バクテリア細胞、
動物細胞または植物細胞とそれに対する発現ベクターか
らなるベクター-宿主細胞系に適用して遺伝子工学的手
法によっても、本発明の抗原ペプチドを製造することも
できる。さらに、遺伝子工学的手法による場合、本発明
の抗原ペプチドは種々の機能を有する融合蛋白質の形態
で発現させることもできる。
ド（以下、単に抗原ペプチドということがある）の構造
が明らかとなったことにより、該抗原ペプチドは種々の
方法で製造することが可能となる。たとえば、本発明の
抗原ペプチドは、ペプチド化学の分野でそれ自体既知の
固相または液相合成法に従い化学的に合成することがで
きる。また、該抗原ペプチドのアミノ酸配列からそれを
コードするＤＮＡを合成し、それを、バクテリア細胞、
動物細胞または植物細胞とそれに対する発現ベクターか
らなるベクター-宿主細胞系に適用して遺伝子工学的手
法によっても、本発明の抗原ペプチドを製造することも
できる。さらに、遺伝子工学的手法による場合、本発明
の抗原ペプチドは種々の機能を有する融合蛋白質の形態
で発現させることもできる。
【００１７】また、抗原ペプチドの断片は、CLN-IgGと
結合性を有するものであれば、その大きさには特に制限
はない。
結合性を有するものであれば、その大きさには特に制限
はない。
【００１８】さらに、本発明の抗原ペプチドは、CLN-Ig
Gとの結合性が損なわれない範囲で、アミノ酸配列の一
部が欠失、置換及び／又は追加されているものも包含さ
れる。 2）用途（有用性）についての説明 このようにCLN-IgGが認識する抗原ペプチドの構造が明
らかになったことから、このペプチドを様々な目的で使
用することが可能となる。特に癌の治療・予防・診断の
分野で有用である。
Gとの結合性が損なわれない範囲で、アミノ酸配列の一
部が欠失、置換及び／又は追加されているものも包含さ
れる。 2）用途（有用性）についての説明 このようにCLN-IgGが認識する抗原ペプチドの構造が明
らかになったことから、このペプチドを様々な目的で使
用することが可能となる。特に癌の治療・予防・診断の
分野で有用である。
【００１９】CLN-IgGは、ヒト抗癌モノクローナル抗体
として、ヒト腫瘍移植ヌードマウス・ヌードラット等を
用いた動物実験［Taomoto, K., A. Ijichi, et al. (19
91)Biological Aspects of Brain Tumors. K. Tabuchi.
Tokyo, Springer-Verlag:452-463］および神経膠腫患
者を対象とした臨床試験において腫瘍増殖抑制作用が認
められている。したがって、CLN-IgGを投与する代わり
に該抗原ペプチドを投与することにより、体内にCLN-Ig
G様の抗原特異性をもつ体液性及び細胞性免疫を惹起す
ることができる。誘導された免疫応答は抗癌作用を持つ
と考えられることから、本発明のペプチドは有効な癌の
ワクチンを提供するものである。
として、ヒト腫瘍移植ヌードマウス・ヌードラット等を
用いた動物実験［Taomoto, K., A. Ijichi, et al. (19
91)Biological Aspects of Brain Tumors. K. Tabuchi.
Tokyo, Springer-Verlag:452-463］および神経膠腫患
者を対象とした臨床試験において腫瘍増殖抑制作用が認
められている。したがって、CLN-IgGを投与する代わり
に該抗原ペプチドを投与することにより、体内にCLN-Ig
G様の抗原特異性をもつ体液性及び細胞性免疫を惹起す
ることができる。誘導された免疫応答は抗癌作用を持つ
と考えられることから、本発明のペプチドは有効な癌の
ワクチンを提供するものである。
【００２０】また本発明の抗原ペプチドを用いたワクチ
ン療法を他の療法と併用してその有効性を高めたり、あ
るいは本発明の抗原ペプチドをさらに高い免疫原性をも
つ形に修飾・改変することによりその有効性を高めるこ
とも可能である。また、本発明の抗原ペプチドは治療の
みならず、癌に未だ罹患していない健康人に対しても癌
予防の観点から用いることができる。
ン療法を他の療法と併用してその有効性を高めたり、あ
るいは本発明の抗原ペプチドをさらに高い免疫原性をも
つ形に修飾・改変することによりその有効性を高めるこ
とも可能である。また、本発明の抗原ペプチドは治療の
みならず、癌に未だ罹患していない健康人に対しても癌
予防の観点から用いることができる。
【００２１】診断面では、癌患者における抗癌免疫反応
の状態を調べるために本発明の抗原ペプチドを利用する
ことができる。具体的には、本発明の抗原ペプチドを用
いることにより、癌患者の血液あるいは体液中に存在す
る抗体あるいは癌抗原そのものを検出あるいは定量する
ことができ、癌の早期発見、治療効果の判定などに役立
つ。
の状態を調べるために本発明の抗原ペプチドを利用する
ことができる。具体的には、本発明の抗原ペプチドを用
いることにより、癌患者の血液あるいは体液中に存在す
る抗体あるいは癌抗原そのものを検出あるいは定量する
ことができ、癌の早期発見、治療効果の判定などに役立
つ。
【００２２】
【実施例】以下、実施例により、本発明をより詳細かつ
具体的に説明するが、本発明はそれらによって何ら制限
されるものではない。 実施例１：抗原の精製および部分アミノ酸配列の決定 U-251MG細胞（ＲＣＢ０４６１）を細胞破砕緩衝液（0.2
5 M サッカロース、25mM Tris-HCl、PH 7.5）中で破砕
し、100,000 x G 30分間遠心後の沈殿を得た。その沈殿
を2M NaCl 、5M 尿素で可溶化した後、CLN-IgGアフィニ
ティーカラムにかけ、5M 尿素 pH6.4で溶出した分画を
得た。次にその分画中の蛋白質をDOC-TCAで沈殿させ
た。DOC-TCAによる沈殿は以下のように行った。得られ
た分画1mlに対し2％ DOC（デオキシコール酸ナトリウ
ム）を0.01 ml加え氷上で10分間放置し、ついで60％TCA
（トリクロロ酢酸）を0.2ml加え遠心分離後、上清を除
去する。沈殿に対しアセトンを0.5ml加え懸濁後、再度
遠心分離し上清を除去した。残った沈殿は減圧乾固し使
用時まで-80度で保存した。
具体的に説明するが、本発明はそれらによって何ら制限
されるものではない。 実施例１：抗原の精製および部分アミノ酸配列の決定 U-251MG細胞（ＲＣＢ０４６１）を細胞破砕緩衝液（0.2
5 M サッカロース、25mM Tris-HCl、PH 7.5）中で破砕
し、100,000 x G 30分間遠心後の沈殿を得た。その沈殿
を2M NaCl 、5M 尿素で可溶化した後、CLN-IgGアフィニ
ティーカラムにかけ、5M 尿素 pH6.4で溶出した分画を
得た。次にその分画中の蛋白質をDOC-TCAで沈殿させ
た。DOC-TCAによる沈殿は以下のように行った。得られ
た分画1mlに対し2％ DOC（デオキシコール酸ナトリウ
ム）を0.01 ml加え氷上で10分間放置し、ついで60％TCA
（トリクロロ酢酸）を0.2ml加え遠心分離後、上清を除
去する。沈殿に対しアセトンを0.5ml加え懸濁後、再度
遠心分離し上清を除去した。残った沈殿は減圧乾固し使
用時まで-80度で保存した。
【００２３】次に、この沈殿をIPG 緩衝液（8M 尿素, 2
%CHAPS, 1%DTT）に溶解し IPG DryStrip ゲル13cm pH3-
10 (Amersham pharmacia Biotech社)を用いて二次元電
気泳動を行った。二次元電気泳動は以下の条件で行っ
た。まず、ゲルを12時間膨潤後、500 V、1000 V、8000
Vの条件でそれぞれ1、1、3時間泳動した後、一次元目の
IPG DryStrip ゲルを平衡化緩衝液(6 M 尿素, 30% グリ
セリン, 10% SDS, 0.25%DTT)に10分間3回浸し平衡化
し、ついで140 mm×140 mm×1 mmのSDS-ポリアクリルア
ミドゲルに重層し二次元めの泳動をおこなった。二次元
電気泳動後のゲルをCBB（クマシー・ブリリアント・ブ
ルー）染色およびCLN-IgGを用いたウェスタンブロッテ
ィングで検出したところ、５つのスポット（No1- No5）
が検出された（図１）。このうち1番大きなNo4 のスポ
ットをリジンエンドプロテアーゼにより消化し、さらに
断片化ペプチドを溶出しHPLCで分離分取した。得られた
ピークのうち34.17 minのピークをアミノ酸シーケンサ
ーにかけたところ、得られた配列（LHEEEIQELQ）がビメ
ンチンの237 - 246番目の配列と100%一致した。ウェス
タンブロッティングは以下のように行った：二次元電気
泳動が終了したゲルをブロッティング液(48mM Tris, 39
mM グリシン, 0.037%SDS，10% メタノール)に浸し、ゲ
ルと同じ大きさに切っておいた濾紙及びあらかじめブロ
ッティング液に浸しておいたニトロセルロース膜(Hybon
d ECL Western : アマシャムファルマシアバイオテク
社)をセミドライタイプの泳動層におき、下から順に濾
紙3枚、ニトロセルロース膜、ゲル、濾紙3枚の順番で気
泡が入らないように重ね、1.25mA/cm2定電流で1時間電
流を流し、ゲルからニトロセルロース膜へ転写する。
%CHAPS, 1%DTT）に溶解し IPG DryStrip ゲル13cm pH3-
10 (Amersham pharmacia Biotech社)を用いて二次元電
気泳動を行った。二次元電気泳動は以下の条件で行っ
た。まず、ゲルを12時間膨潤後、500 V、1000 V、8000
Vの条件でそれぞれ1、1、3時間泳動した後、一次元目の
IPG DryStrip ゲルを平衡化緩衝液(6 M 尿素, 30% グリ
セリン, 10% SDS, 0.25%DTT)に10分間3回浸し平衡化
し、ついで140 mm×140 mm×1 mmのSDS-ポリアクリルア
ミドゲルに重層し二次元めの泳動をおこなった。二次元
電気泳動後のゲルをCBB（クマシー・ブリリアント・ブ
ルー）染色およびCLN-IgGを用いたウェスタンブロッテ
ィングで検出したところ、５つのスポット（No1- No5）
が検出された（図１）。このうち1番大きなNo4 のスポ
ットをリジンエンドプロテアーゼにより消化し、さらに
断片化ペプチドを溶出しHPLCで分離分取した。得られた
ピークのうち34.17 minのピークをアミノ酸シーケンサ
ーにかけたところ、得られた配列（LHEEEIQELQ）がビメ
ンチンの237 - 246番目の配列と100%一致した。ウェス
タンブロッティングは以下のように行った：二次元電気
泳動が終了したゲルをブロッティング液(48mM Tris, 39
mM グリシン, 0.037%SDS，10% メタノール)に浸し、ゲ
ルと同じ大きさに切っておいた濾紙及びあらかじめブロ
ッティング液に浸しておいたニトロセルロース膜(Hybon
d ECL Western : アマシャムファルマシアバイオテク
社)をセミドライタイプの泳動層におき、下から順に濾
紙3枚、ニトロセルロース膜、ゲル、濾紙3枚の順番で気
泡が入らないように重ね、1.25mA/cm2定電流で1時間電
流を流し、ゲルからニトロセルロース膜へ転写する。
【００２４】ブロッティング後のニトロセルロース膜を
ブロッキング液(5%スキムミルク/0.3%Tween-PBS pH6.4)
に浸し37℃1時間振とうする。ブロッキング液を除去
後、1次抗体液（0.05 mg/ml CLN-IgG、0.3%Tween-PBS p
H6.4)に浸し37℃1時間振とうする。
ブロッキング液(5%スキムミルク/0.3%Tween-PBS pH6.4)
に浸し37℃1時間振とうする。ブロッキング液を除去
後、1次抗体液（0.05 mg/ml CLN-IgG、0.3%Tween-PBS p
H6.4)に浸し37℃1時間振とうする。
【００２５】次に洗浄液(0.3%Tween-PBS pH6.4)で10分
間、3回洗浄し、さらに2次抗体液（Peroxidase conjuga
te anti-human IgG Fab ICN社 1/5000 0.3%Tween-PB
S pH6.4)に浸し37℃1時間振とうする。最後に洗浄液で1
0分間4回洗浄した後、ECL Western blotting detection
reagents (アマシャムファルマシアバイオテク社)に1
分間浸し、暗室でＸ線フィルム(Hyperfilm-ECL: アマシ
ャムファルマシアバイオテク社)に1-10分間露光させ現
像し検出する。 実施例２：質量分析による抗原の解析 U-251MG細胞を細胞破砕緩衝液中で破砕し、100,000 x G
30分間遠心後の沈殿分画を2M NaCl、5M 尿素で可溶化
した後、蛋白質をDOC-TCAで沈殿させた。DOC-TCAによる
沈殿は以下のように行った。得られた分画1mlに対し、2
％DOC（デオキシコール酸ナトリウム）を0.01ml加え氷
上で10分間放置する。その後60％TCA（トリクロロ酢
酸）を0.2ml加え遠心分離後、上清を除去する。沈殿に
対しアセトンを0.5ml加え懸濁後、再度遠心分離し上清
を除去した。残った沈殿は減圧乾固し使用時まで-80度
で保存した。
間、3回洗浄し、さらに2次抗体液（Peroxidase conjuga
te anti-human IgG Fab ICN社 1/5000 0.3%Tween-PB
S pH6.4)に浸し37℃1時間振とうする。最後に洗浄液で1
0分間4回洗浄した後、ECL Western blotting detection
reagents (アマシャムファルマシアバイオテク社)に1
分間浸し、暗室でＸ線フィルム(Hyperfilm-ECL: アマシ
ャムファルマシアバイオテク社)に1-10分間露光させ現
像し検出する。 実施例２：質量分析による抗原の解析 U-251MG細胞を細胞破砕緩衝液中で破砕し、100,000 x G
30分間遠心後の沈殿分画を2M NaCl、5M 尿素で可溶化
した後、蛋白質をDOC-TCAで沈殿させた。DOC-TCAによる
沈殿は以下のように行った。得られた分画1mlに対し、2
％DOC（デオキシコール酸ナトリウム）を0.01ml加え氷
上で10分間放置する。その後60％TCA（トリクロロ酢
酸）を0.2ml加え遠心分離後、上清を除去する。沈殿に
対しアセトンを0.5ml加え懸濁後、再度遠心分離し上清
を除去した。残った沈殿は減圧乾固し使用時まで-80度
で保存した。
【００２６】さらに、この沈殿にIPG 緩衝液（8M 尿素,
2%CHAPS, 1%DTT）を加え二次元電気泳動を行いCLN-IgG
が認識する抗原の分子量に相当するスポット No1-19を
それぞれ別々に切り出した。それらを2 mm厚のSDS-PAGE
ゲルのコームに入れ泳動後、ウェスタンブロッティン
グ, 免疫染色, ECLでCLN-IgGとの反応性を検討した（図
2）。その結果、No7とNo8のスポットに強い反応が認め
られた。そこで、二次元電気泳動を行い、No7とNo8のス
ポットをそれぞれ切り出し、ゲル内でTCPKトリプシンに
より消化後溶出し、得られたペプチド混合物をTOF/MS
にかけた。その結果、No7より分子量1428.68、1115.5
1、1309.57、1570.67のピークが得られ、MS−Fitデータ
ベース検索によりビメンチンであることが明らかとなっ
た。 実施例3: 二次元電気泳動・ウェスタンブロッティング
による抗原の確認 神経膠腫U-251MGを2×107個培養し、その後培養液を除
去しPBSで2度洗浄する。ディシュ（皿）に付着した細胞
にプロテアーゼ阻害剤(CompleteTM :Boehringer Mannhe
im社)を添加したIPG 緩衝液(8M 尿素,2%CHAPS, 1%DTT)
を1ml加え、細胞を溶解する。得られた細胞溶解液を10,
000×G 60分間の遠心分離し、得られた上清を二次元電
気泳動およびウェスタンブロッティングにかけた。一次
抗体として、CLN-IgGのほかに、抗ビメンチン抗体(IBL
社)および抗GFAP抗体（生化学工業社）を用いた。二次
抗体はCLN-IgGの場合にはペルオキシダーゼ結合抗ヒトI
gG抗体を用い、また、他の抗体の場合にはペルオキシダ
ーゼ結合抗マウスIgG抗体を用いた。CLN-IgGおよび抗ビ
メンチン抗体で認識されるスポットが同一のものである
ことが明らかとなった（図3）。 実施例4：ヒトビメンチン遺伝子のPCR産物の調製 すでに報告されているヒトビメンチンの配列を元に配列
表に示した配列番号1および2のプライマーを合成した。
これらのプライマーとU-251MGよりRNeasy（QIAGEN社）
を用いて得られた全RNAを鋳型に用いて、サーマルサイ
クラー（モデル：GENIUS ,Techne社）を使い（96℃で30
秒、55℃で60秒、72℃で120秒）X 30→72℃で300秒の条
件でPCR（ポリメラーゼチェーンリアクション）を行っ
た結果、ヒトビメンチン遺伝子と考えられる約1400bpの
断片を得た（図4右側レーンfull）。 実施例5：ヒトビメンチン各ドメインのPCR産物の調製 すでに明らかになっているヒトビメンチンの配列を元に
配列表に示した配列番号3から8のプライマーを合成し
た。これらのプライマーと実施例2で得られた断片を鋳
型に用いて、サーマルサイクラー（モデル：GENIUS ,Te
chne社）を使い（96℃で30秒、55℃で60秒、72℃で120
秒）X 30→72℃で300秒の条件でPCRを行った結果、ヒト
ビメンチン各ドメイン（head, c1, c2, tail, hc1（hea
dとc1がつながったもの）, c2t（c2とtailがつながった
もの））の断片を得た（図4）。 実施例6：GSTとの融合蛋白を発現させるためのプラスミ
ドの調製 実施例3及び4で得られた断片をEcoRIとNotIで消化した
後、精製を行った。これらの断片とGST融合蛋白質発現
ベクターpGEX-4T-1（アマシャムファルマシアバイオテ
ク社）をEcoRIとNotIで消化したものをDNAライゲーショ
ンキット・バージョン2（宝酒造）を用いた反応により
連結した。反応終了後、反応液で大腸菌株BL21を形質転
換し、アンピシリン耐性株を選択し、保有するプラスミ
ドをアルカリ法で調製した。得られたプラスミドをEcoR
IとNotIで消化してアガロース電気泳動を行い、目的の
断片が挿入されているクローンを選択した。 実施例7：ヒトビメンチン全長および各ドメインとGSTの
融合蛋白の調製 実施例6で得られた各組換えプラスミドを有する大腸菌
のクローンを2mlのLB培地（バクトトリプトン 10g、バ
クトイーストエキストラクト 5g、塩化ナトリウム 10 g
/l）に植え、25℃で一晩培養した。この培養液を再び20
mlのLB培地に植え、25℃で3.5時間培養した後、1MのIP
TGを2μl加えてさらに2時間培養した。5,000 rpmで5分
間遠心して集菌し、上清を捨て、沈殿に1mlのPBS（フォ
スフェートバッファーセーライン）を加えた。菌体を懸
濁した溶液を超音波処理し、20% TritonX-100を1ml加え
た後、4℃で1時間振盪し、グルタチオンセファロース4B
（アマシャムファルマシアバイオテク社）によるアフィ
ニティークロマトグラフィーでヒトビメンチン全長およ
び各ドメインとGSTの融合蛋白を精製した（図5）。 実施例8：ヒトビメンチン全長および各ドメインとGSTの
融合蛋白蛋白とCLN-IgGとの結合 実施例7で得られた各融合蛋白質の濃度を測定した後、
同量の蛋白質が泳動されるようにしてSDS-PAGEを行っ
た。泳動後のゲルからセミドライ・ブロッティング法に
よりHybond-ECL膜（アマシャムファルマシアバイオテク
社）に蛋白質を転写した。蛋白質が転写された膜をブロ
ッキング溶液（5% スキムミルク含有PBS-T（ 0.3% Twee
n 20含有PBS））に37℃で１時間浸した後、一次抗体溶
液（ヤギ抗GST抗体（アマシャムファルマシアバイオテ
ク社）in PBS-T + 1% スキムミルク）に37℃で30分浸し
た。PBS-Tで5分×3回洗った後、二次抗体溶液（ペルオ
キシダーゼ結合抗ヤギIgG抗体 in PBS-T + 1% スキムミ
ルク）に37℃で30分浸した。PBS-Tで5分×3回洗った
後、ECL detection reagent（アマシャムファルマシア
バイオテク社）をかけ1分静置した（ECL detection rea
gentは膜に固定された蛋白質をペルオキシダーゼ結合抗
体を用いた化学発光により迅速かつ高感度に目的の抗原
のシグナルをX線フィルム上に検出するシステム）。Det
ection reagentを除去したあとOHPシートにはさみ、X線
フィルムに1分露光した後、現像した。この結果よりc2
ドメイン内にCLN-IgGと結合する領域が存在することが
確認できた（図6）。 実施例9：c2ドメインの3’末端欠失クローンの作製 c2断片を含むpGEX-4T-1プラスミドをもとにしてKilo-Se
quence用Deletion Kit（宝酒造）を使い、様々な長さを
もつ欠失プラスミドを作製し、JM109を形質転換した。
得られたアンピシリン耐性株が保有するプラスミドのイ
ンサートの長さをPCRによって確認した（図7）。 実施例10：3’末端欠失クローンが発現する融合蛋白質
の確認 実施例9で得られた欠失クローンが保有するプラスミド
を単離、精製した後、大腸菌株BL21を形質転換した。得
られたアンピシリン耐性株を2 mlのLB培地（バクトトリ
プトン 10g、バクトイーストエキストラクト 5g、塩化
ナトリウム 10g/l）に植え、25℃で3.5時間培養した
後、100mMのIPTGを2μl加えてさらに2時間培養した。5,
000 rpmで5分間遠心して集菌し、上清を捨て、沈殿に1m
lのPBSを加えた。得られた菌の懸濁液に当量の2 x SDS
サンプル緩衝液（100mM Tris HCl（pH6.8）, 200mM DT
T, 4% SDS, 0.2% BPB, 20% グリセリン）を加えて、100
℃、5分間処理したものサンプルにしてSDS-PAGEで融合
蛋白質の発現を確認した（図8）。 実施例11：3’末端欠失クローンが発現する融合蛋白質
とCLN-IgGとの結合 実施例10で発現を確認したサンプルでSDS-PAGEを行っ
た。泳動後のゲルからセミドライ・ブロッティング法に
よりHybond-ECL（アマシャムファルマシアバイオテク
社）に蛋白質を転写した。蛋白質が転写された膜をブロ
ッキング溶液（5%スキムミルク含有 PBS-T（0.3% Tween
20含有PBS））に37℃で１時間浸した後、一次抗体溶液
（50 μg/ml CLN-IgG in PBS-T + 1% スキムミルク）に
37℃で30分間浸した。PBS-Tで5分×3回洗った後、二次
抗体溶液 （PO-conjugated anti humanIgG in PBS-T +
1% スキムミルク）に37℃で30分間浸した。PBS-Tで5分
×3回洗った後、ECL detection reagent（アマシャムフ
ァルマシアバイオテク社）をかけ1分間静置した。Detec
tion reagentを除去したあとOHPシートにはさみ、X線フ
ィルムに1min露光した後、現像した。この結果より、反
応性が強いもの、弱いもの、ないものの3種類に分かれ
ることを確認した（図9）。 実施例12：3’末端欠失クローンの配列決定 実施例11で用いたクローンのプラスミドを精製し、これ
とABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Core Kitを
用いてサンプルを調製し、サーマルサイクラー（モデ
ル：GENIUS ,Techne社）でPCRを行った。反応産物の塩
基配列はシークエンサーDSQ-1（島津製作所）で解析し
た。この結果、CLN-IgGに対する反応性を維持している
もっとも短いクローンはクローン98であった（図10）。 実施例13：5’末端欠失クローンの作製 クローン98の配列を元に配列表に示した配列番号9のプ
ライマー（vim3-10）を合成した。このプライマーとビ
メンチンの配列を参考にして合成した配列番号10-14(vi
m5-5,9,8,6,7)のプライマーの組み合わせでクローン98
を鋳型にしてPCRを行った。得られた断片をEcoRIとNotI
で消化した後、精製を行った。これらの断片とGST融合
蛋白質発現ベクターpGEX-4T-1（アマシャムファルマシ
アバイオテク社）をEcoRIとNotIで消化したものをDNAラ
イゲションキット・バージョン2（宝酒造）を用いた反
応により連結した。反応終了後、反応液で大腸菌株BL21
を形質転換し、アンピシリン耐性株を選択し、保有する
プラスミドをアルカリ法で調製した。得られたプラスミ
ドをEcoRIとNotIで消化してアガロース電気泳動を行
い、目的の断片が挿入されているクローンを選択した。 実施例14：5’末端側の欠失クローンが発現する融合蛋
白質の確認 実施例13で得られたプラスミドで大腸菌株BL21を形質転
換した。得られたアンピシリン耐性株を2 mlのLB培地
（バクトトリプトン 10g、バクトイーストエキストラク
ト 5g、塩化ナトリウム 10g/l）に植え、25℃で3.5時間
培養した後、100mMのIPTGを2μl加えてさらに2時間培養
した。5,000 rpmで5分間遠心して集菌し、上清を捨て、
沈殿に1mlのPBSを加えた。得られた菌の懸濁液に当量の
2 x SDSサンプル緩衝液（100mM Tris HCl（pH 6.8）, 2
00mM DTT, 4% SDS, 0.2% BPB, 20% グリセリン）を加え
て、100℃、5分間処理したものサンプルにしてSDS-PAGE
で融合蛋白質の発現を確認した（図１１）。 実施例15：3’末端欠失クローンが発現する融合蛋白質
とCLN-IgGとの結合 実施例14で発現を確認したサンプルでSDS-PAGEを行っ
た。泳動後のゲルからセミドライ ブロッティング法に
よりHybond-ECL（アマシャムファルマシアバイオテク
社）に蛋白質を転写した。蛋白質が転写されたメンブラ
ンをブロッキング溶液（5% スキムミルク含有PBS-T（0.
3% Tween 20含有PBS））に37℃で１時間浸した後、一次
抗体溶液（50μg/ml CLN-IgG 含有 PBS-T + 1% スキム
ミルク）に37℃で30分間浸した。PBS-Tで5分×3回洗っ
た後、二次抗体溶液（PO-conjugated anti human IgG i
n PBS-T + 1% スキムミルク）に37℃で30分間浸した。P
BS-Tで5分×3回洗った後、ECL detection reagent （ア
マシャムファルマシアバイオテク社）をかけ1分間静置
した。Detection reagentを除去したあとOHPシートには
さみ、X線フィルムに1min露光した後、現像した。この
結果よりvim5-9と3-10の組み合わせで得られる断片から
作られるペプチドとCLN-IgGは反応性を保持している
が、これより短くなったものでは反応性が無くなること
を確認した（図１２）。
2%CHAPS, 1%DTT）を加え二次元電気泳動を行いCLN-IgG
が認識する抗原の分子量に相当するスポット No1-19を
それぞれ別々に切り出した。それらを2 mm厚のSDS-PAGE
ゲルのコームに入れ泳動後、ウェスタンブロッティン
グ, 免疫染色, ECLでCLN-IgGとの反応性を検討した（図
2）。その結果、No7とNo8のスポットに強い反応が認め
られた。そこで、二次元電気泳動を行い、No7とNo8のス
ポットをそれぞれ切り出し、ゲル内でTCPKトリプシンに
より消化後溶出し、得られたペプチド混合物をTOF/MS
にかけた。その結果、No7より分子量1428.68、1115.5
1、1309.57、1570.67のピークが得られ、MS−Fitデータ
ベース検索によりビメンチンであることが明らかとなっ
た。 実施例3: 二次元電気泳動・ウェスタンブロッティング
による抗原の確認 神経膠腫U-251MGを2×107個培養し、その後培養液を除
去しPBSで2度洗浄する。ディシュ（皿）に付着した細胞
にプロテアーゼ阻害剤(CompleteTM :Boehringer Mannhe
im社)を添加したIPG 緩衝液(8M 尿素,2%CHAPS, 1%DTT)
を1ml加え、細胞を溶解する。得られた細胞溶解液を10,
000×G 60分間の遠心分離し、得られた上清を二次元電
気泳動およびウェスタンブロッティングにかけた。一次
抗体として、CLN-IgGのほかに、抗ビメンチン抗体(IBL
社)および抗GFAP抗体（生化学工業社）を用いた。二次
抗体はCLN-IgGの場合にはペルオキシダーゼ結合抗ヒトI
gG抗体を用い、また、他の抗体の場合にはペルオキシダ
ーゼ結合抗マウスIgG抗体を用いた。CLN-IgGおよび抗ビ
メンチン抗体で認識されるスポットが同一のものである
ことが明らかとなった（図3）。 実施例4：ヒトビメンチン遺伝子のPCR産物の調製 すでに報告されているヒトビメンチンの配列を元に配列
表に示した配列番号1および2のプライマーを合成した。
これらのプライマーとU-251MGよりRNeasy（QIAGEN社）
を用いて得られた全RNAを鋳型に用いて、サーマルサイ
クラー（モデル：GENIUS ,Techne社）を使い（96℃で30
秒、55℃で60秒、72℃で120秒）X 30→72℃で300秒の条
件でPCR（ポリメラーゼチェーンリアクション）を行っ
た結果、ヒトビメンチン遺伝子と考えられる約1400bpの
断片を得た（図4右側レーンfull）。 実施例5：ヒトビメンチン各ドメインのPCR産物の調製 すでに明らかになっているヒトビメンチンの配列を元に
配列表に示した配列番号3から8のプライマーを合成し
た。これらのプライマーと実施例2で得られた断片を鋳
型に用いて、サーマルサイクラー（モデル：GENIUS ,Te
chne社）を使い（96℃で30秒、55℃で60秒、72℃で120
秒）X 30→72℃で300秒の条件でPCRを行った結果、ヒト
ビメンチン各ドメイン（head, c1, c2, tail, hc1（hea
dとc1がつながったもの）, c2t（c2とtailがつながった
もの））の断片を得た（図4）。 実施例6：GSTとの融合蛋白を発現させるためのプラスミ
ドの調製 実施例3及び4で得られた断片をEcoRIとNotIで消化した
後、精製を行った。これらの断片とGST融合蛋白質発現
ベクターpGEX-4T-1（アマシャムファルマシアバイオテ
ク社）をEcoRIとNotIで消化したものをDNAライゲーショ
ンキット・バージョン2（宝酒造）を用いた反応により
連結した。反応終了後、反応液で大腸菌株BL21を形質転
換し、アンピシリン耐性株を選択し、保有するプラスミ
ドをアルカリ法で調製した。得られたプラスミドをEcoR
IとNotIで消化してアガロース電気泳動を行い、目的の
断片が挿入されているクローンを選択した。 実施例7：ヒトビメンチン全長および各ドメインとGSTの
融合蛋白の調製 実施例6で得られた各組換えプラスミドを有する大腸菌
のクローンを2mlのLB培地（バクトトリプトン 10g、バ
クトイーストエキストラクト 5g、塩化ナトリウム 10 g
/l）に植え、25℃で一晩培養した。この培養液を再び20
mlのLB培地に植え、25℃で3.5時間培養した後、1MのIP
TGを2μl加えてさらに2時間培養した。5,000 rpmで5分
間遠心して集菌し、上清を捨て、沈殿に1mlのPBS（フォ
スフェートバッファーセーライン）を加えた。菌体を懸
濁した溶液を超音波処理し、20% TritonX-100を1ml加え
た後、4℃で1時間振盪し、グルタチオンセファロース4B
（アマシャムファルマシアバイオテク社）によるアフィ
ニティークロマトグラフィーでヒトビメンチン全長およ
び各ドメインとGSTの融合蛋白を精製した（図5）。 実施例8：ヒトビメンチン全長および各ドメインとGSTの
融合蛋白蛋白とCLN-IgGとの結合 実施例7で得られた各融合蛋白質の濃度を測定した後、
同量の蛋白質が泳動されるようにしてSDS-PAGEを行っ
た。泳動後のゲルからセミドライ・ブロッティング法に
よりHybond-ECL膜（アマシャムファルマシアバイオテク
社）に蛋白質を転写した。蛋白質が転写された膜をブロ
ッキング溶液（5% スキムミルク含有PBS-T（ 0.3% Twee
n 20含有PBS））に37℃で１時間浸した後、一次抗体溶
液（ヤギ抗GST抗体（アマシャムファルマシアバイオテ
ク社）in PBS-T + 1% スキムミルク）に37℃で30分浸し
た。PBS-Tで5分×3回洗った後、二次抗体溶液（ペルオ
キシダーゼ結合抗ヤギIgG抗体 in PBS-T + 1% スキムミ
ルク）に37℃で30分浸した。PBS-Tで5分×3回洗った
後、ECL detection reagent（アマシャムファルマシア
バイオテク社）をかけ1分静置した（ECL detection rea
gentは膜に固定された蛋白質をペルオキシダーゼ結合抗
体を用いた化学発光により迅速かつ高感度に目的の抗原
のシグナルをX線フィルム上に検出するシステム）。Det
ection reagentを除去したあとOHPシートにはさみ、X線
フィルムに1分露光した後、現像した。この結果よりc2
ドメイン内にCLN-IgGと結合する領域が存在することが
確認できた（図6）。 実施例9：c2ドメインの3’末端欠失クローンの作製 c2断片を含むpGEX-4T-1プラスミドをもとにしてKilo-Se
quence用Deletion Kit（宝酒造）を使い、様々な長さを
もつ欠失プラスミドを作製し、JM109を形質転換した。
得られたアンピシリン耐性株が保有するプラスミドのイ
ンサートの長さをPCRによって確認した（図7）。 実施例10：3’末端欠失クローンが発現する融合蛋白質
の確認 実施例9で得られた欠失クローンが保有するプラスミド
を単離、精製した後、大腸菌株BL21を形質転換した。得
られたアンピシリン耐性株を2 mlのLB培地（バクトトリ
プトン 10g、バクトイーストエキストラクト 5g、塩化
ナトリウム 10g/l）に植え、25℃で3.5時間培養した
後、100mMのIPTGを2μl加えてさらに2時間培養した。5,
000 rpmで5分間遠心して集菌し、上清を捨て、沈殿に1m
lのPBSを加えた。得られた菌の懸濁液に当量の2 x SDS
サンプル緩衝液（100mM Tris HCl（pH6.8）, 200mM DT
T, 4% SDS, 0.2% BPB, 20% グリセリン）を加えて、100
℃、5分間処理したものサンプルにしてSDS-PAGEで融合
蛋白質の発現を確認した（図8）。 実施例11：3’末端欠失クローンが発現する融合蛋白質
とCLN-IgGとの結合 実施例10で発現を確認したサンプルでSDS-PAGEを行っ
た。泳動後のゲルからセミドライ・ブロッティング法に
よりHybond-ECL（アマシャムファルマシアバイオテク
社）に蛋白質を転写した。蛋白質が転写された膜をブロ
ッキング溶液（5%スキムミルク含有 PBS-T（0.3% Tween
20含有PBS））に37℃で１時間浸した後、一次抗体溶液
（50 μg/ml CLN-IgG in PBS-T + 1% スキムミルク）に
37℃で30分間浸した。PBS-Tで5分×3回洗った後、二次
抗体溶液 （PO-conjugated anti humanIgG in PBS-T +
1% スキムミルク）に37℃で30分間浸した。PBS-Tで5分
×3回洗った後、ECL detection reagent（アマシャムフ
ァルマシアバイオテク社）をかけ1分間静置した。Detec
tion reagentを除去したあとOHPシートにはさみ、X線フ
ィルムに1min露光した後、現像した。この結果より、反
応性が強いもの、弱いもの、ないものの3種類に分かれ
ることを確認した（図9）。 実施例12：3’末端欠失クローンの配列決定 実施例11で用いたクローンのプラスミドを精製し、これ
とABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Core Kitを
用いてサンプルを調製し、サーマルサイクラー（モデ
ル：GENIUS ,Techne社）でPCRを行った。反応産物の塩
基配列はシークエンサーDSQ-1（島津製作所）で解析し
た。この結果、CLN-IgGに対する反応性を維持している
もっとも短いクローンはクローン98であった（図10）。 実施例13：5’末端欠失クローンの作製 クローン98の配列を元に配列表に示した配列番号9のプ
ライマー（vim3-10）を合成した。このプライマーとビ
メンチンの配列を参考にして合成した配列番号10-14(vi
m5-5,9,8,6,7)のプライマーの組み合わせでクローン98
を鋳型にしてPCRを行った。得られた断片をEcoRIとNotI
で消化した後、精製を行った。これらの断片とGST融合
蛋白質発現ベクターpGEX-4T-1（アマシャムファルマシ
アバイオテク社）をEcoRIとNotIで消化したものをDNAラ
イゲションキット・バージョン2（宝酒造）を用いた反
応により連結した。反応終了後、反応液で大腸菌株BL21
を形質転換し、アンピシリン耐性株を選択し、保有する
プラスミドをアルカリ法で調製した。得られたプラスミ
ドをEcoRIとNotIで消化してアガロース電気泳動を行
い、目的の断片が挿入されているクローンを選択した。 実施例14：5’末端側の欠失クローンが発現する融合蛋
白質の確認 実施例13で得られたプラスミドで大腸菌株BL21を形質転
換した。得られたアンピシリン耐性株を2 mlのLB培地
（バクトトリプトン 10g、バクトイーストエキストラク
ト 5g、塩化ナトリウム 10g/l）に植え、25℃で3.5時間
培養した後、100mMのIPTGを2μl加えてさらに2時間培養
した。5,000 rpmで5分間遠心して集菌し、上清を捨て、
沈殿に1mlのPBSを加えた。得られた菌の懸濁液に当量の
2 x SDSサンプル緩衝液（100mM Tris HCl（pH 6.8）, 2
00mM DTT, 4% SDS, 0.2% BPB, 20% グリセリン）を加え
て、100℃、5分間処理したものサンプルにしてSDS-PAGE
で融合蛋白質の発現を確認した（図１１）。 実施例15：3’末端欠失クローンが発現する融合蛋白質
とCLN-IgGとの結合 実施例14で発現を確認したサンプルでSDS-PAGEを行っ
た。泳動後のゲルからセミドライ ブロッティング法に
よりHybond-ECL（アマシャムファルマシアバイオテク
社）に蛋白質を転写した。蛋白質が転写されたメンブラ
ンをブロッキング溶液（5% スキムミルク含有PBS-T（0.
3% Tween 20含有PBS））に37℃で１時間浸した後、一次
抗体溶液（50μg/ml CLN-IgG 含有 PBS-T + 1% スキム
ミルク）に37℃で30分間浸した。PBS-Tで5分×3回洗っ
た後、二次抗体溶液（PO-conjugated anti human IgG i
n PBS-T + 1% スキムミルク）に37℃で30分間浸した。P
BS-Tで5分×3回洗った後、ECL detection reagent （ア
マシャムファルマシアバイオテク社）をかけ1分間静置
した。Detection reagentを除去したあとOHPシートには
さみ、X線フィルムに1min露光した後、現像した。この
結果よりvim5-9と3-10の組み合わせで得られる断片から
作られるペプチドとCLN-IgGは反応性を保持している
が、これより短くなったものでは反応性が無くなること
を確認した（図１２）。
【００２７】以上のことから、配列表番号１５に記載の
７９アミノ酸よりなるペプチドがCLN−IgGとの反応性に
必須であることが示された。
７９アミノ酸よりなるペプチドがCLN−IgGとの反応性に
必須であることが示された。
【００２８】そこで、そのアミノ酸配列に基づき配列表
番号１６に記載のヌクレオチド配列を持つＤＮＡを合成
し、そのＤＮＡを含むプラスミドを実施例６と同様にし
て作製し、そのプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１を形質転
換し、得られたアンピシリン耐性株を用い実施例１０と
同様にして蛋白質を発現させ、その蛋白質がCLN−IgGと
強く結合することを確認した。
番号１６に記載のヌクレオチド配列を持つＤＮＡを合成
し、そのＤＮＡを含むプラスミドを実施例６と同様にし
て作製し、そのプラスミドで大腸菌株ＢＬ２１を形質転
換し、得られたアンピシリン耐性株を用い実施例１０と
同様にして蛋白質を発現させ、その蛋白質がCLN−IgGと
強く結合することを確認した。
【００２９】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Yoshihide HAGIWARA <110> Hideaki HAGIWARA <120> 抗癌ヒトモノクローナル抗体CLN−IgGによって認識される抗原エピトープ のアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡヌクレオチド配列 <130> 200008031 <160> 16 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトビメンチンの配列を参考にして合成 <400> 1 gatgaattca tgtccaccag gtcc 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトビメンチンの配列を参考にして合成 <400> 2 atttgcggcc gcttattcaa ggtc 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトビメンチンの配列を参考にして合成 <400> 3 tattgcggcc gcctcggtgt tgat 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトビメンチンの配列を参考にして合成 <400> 4 tgagaattca agaacacccg cacc 24 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトビメンチンの配列を参考にして合成 <400> 5 aagcggccgg ccagctcctg gattt 25 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトビメンチンの配列を参考にして合成 <400> 6 ccagaattcc aggctcagat tcag 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトビメンチンの配列を参考にして合成 <400> 7 aagcggccgc aatctcaatg tcaa 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトビメンチンの配列を参考にして合成 <400> 8 taagaattcg ccacctacag gaag 24 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトビメンチンの配列を参考にして合成 <400> 9 gcggccgcat cctgcaggcg gccaat 26 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトビメンチンの配列を参考にして合成 <400> 10 tcagaattcc tgcgtgacgt acgt 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトビメンチンの配列を参考にして合成 <400> 11 cgggaattcg aatggtacaa atcc 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトビメンチンの配列を参考にして合成 <400> 12 tcagaattcg agtccactga gtac 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトビメンチンの配列を参考にして合成 <400> 13 cgggaattca aaggaaccaa tgag 24 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ヒトビメンチンの配列を参考にして合成 <400> 14 tcagaattcg aagctgctaa ctac 24 <210> 15 <211> 79 <212> PRT <213> human <220> <223> <400> 15 Glu Trp Tyr Lys Ser Lys Phe Ala Asp Leu Ser Glu Ala Ala Asn Arg 1 5 10 15 Asn Asn Asp Ala Leu Arg Gln Ala Lys Gln Glu Ser Thr Glu Tyr Arg 20 25 30 Arg Gln Val Gln Ser Leu Thr Cys Glu Val Asp Ala Leu Lys Gly Thr 35 40 45 Asn Glu Ser Leu Glu Arg Gln Met Arg Glu Met Glu Glu Asn Phe Ala 50 55 60 Val Glu Ala Ala Asn Tyr Gln Asp Thr Ile Gly Arg Leu Gln Asp 65 70 75 <210> 16 <211> 237 <212> DNA <213> <220> <223> <400> 16 gaatggtaca aatccaagtt tgctgacctc tctgaggctg ccaaccggaa caatgacgcc 60 ctgcgccagg caaagcagga gtccactgag taccggagac aggtgcagtc cctcacctgt 120 gaagtggatg cccttaaagg aaccaatgag tccctggaac gccagatgcg tgaaatggaa 180 gagaactttg ccgttgaagc tgctaactac caagacacta ttggccgcct gcaggat 237
【図１】神経膠腫U-251MGからCLN-IgGを用いたアフィニ
ティークロマトグラフィーで精製された抗原分子の二次
元電気泳動パターン。（A）CBB染色、（B）CLN-IgGを用
いたECL
ティークロマトグラフィーで精製された抗原分子の二次
元電気泳動パターン。（A）CBB染色、（B）CLN-IgGを用
いたECL
【図２】二次元電気泳動で分離した神経膠腫U-251MG蛋
白質のうちCLN-IgGと結合性を有する蛋白質のウェスタ
ンブロッティング法によるパターン。
白質のうちCLN-IgGと結合性を有する蛋白質のウェスタ
ンブロッティング法によるパターン。
【図３】CLN-IgGに結合する神経膠腫U-251MG蛋白質のウ
ェスタンブロッティングパターン。（上）CLN-IgG、
（中）抗GFAP抗体、(下）抗ビメンチン抗体で染めたも
の。
ェスタンブロッティングパターン。（上）CLN-IgG、
（中）抗GFAP抗体、(下）抗ビメンチン抗体で染めたも
の。
【図４】ＰＣＲにより増幅されたヒトビメンチン各ドメ
イン遺伝子断片の電気泳動パターン。
イン遺伝子断片の電気泳動パターン。
【図５】大腸菌で発現したヒトビメンチン各ドメインと
GSTとの融合蛋白質の電気泳動パターン。
GSTとの融合蛋白質の電気泳動パターン。
【図６】ヒトビメンチン各ドメインとGSTとの融合蛋白
質とCLN-IgGとの結合性を示すウェスタンブロッティン
グパターン。
質とCLN-IgGとの結合性を示すウェスタンブロッティン
グパターン。
【図７】ヒトビメンチンC2ドメインとGSTとの融合蛋白
質をコードする遺伝子の３’末端欠失クローンのPCRに
よるインサート解析の電気泳動パターン。
質をコードする遺伝子の３’末端欠失クローンのPCRに
よるインサート解析の電気泳動パターン。
【図８】種々の欠失をもつヒトビメンチンC2ドメインと
GSTとの融合蛋白質のSDS-PAGEパターン。
GSTとの融合蛋白質のSDS-PAGEパターン。
【図９】3’末端欠失クローンが発現する融合蛋白質とC
LN-IgGの結合性を示すウエスタンブロッティングパター
ン。
LN-IgGの結合性を示すウエスタンブロッティングパター
ン。
【図１０】3’末端欠失クローンのアミノ酸配列とCLN-I
gGとの結合性の関係を示す図。
gGとの結合性の関係を示す図。
【図１１】5’末端欠失クローンのライセートのSDS-PAG
Eパターン。
Eパターン。
【図１２】5’末端欠失クローンが発現する融合蛋白質
とCLN-IgGの結合性を示すウエスタンブロッティングパ
ターン。
とCLN-IgGの結合性を示すウエスタンブロッティングパ
ターン。
フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA36 CA03 CA07 CA20 DA06 GA11 GA19 GA27 HA03 HA04 4B065 AA26X AA93X AA93Y AB01 AC14 AC16 BA02 BA25 BB01 BC03 BD14 BD15 BD16 BD50 CA24 CA44 CA46 4H045 AA11 BA10 BA40 CA40 DA86 EA28 EA51 FA74 GA01 GA15 GA26 GA33
Claims (2)
- 【請求項１】 下記のアミノ酸配列 Glu Trp Tyr Lys Ser Lys Phe Ala Asp Leu Ser Glu Ala Ala Asn Arg 1 5 10 15 Asn Asn Asp Ala Leu Arg Gln Ala Lys Gln Glu Ser Thr Glu Tyr Arg 20 25 30 Arg Gln Val Gln Ser Leu Thr Cys Glu Val Asp Ala Leu Lys Gly Thr 35 40 45 Asn Glu Ser Leu Glu Arg Gln Met Arg Glu Met Glu Glu Asn Phe Ala 50 55 60 Val Glu Ala Ala Asn Tyr Gln Asp Thr Ile Gly Arg Leu Gln Asp 65 70 75 を有するペプチドまたはモノクローナル抗体CLN-IgGと
結合性を有するその断片。 - 【請求項２】 請求項1に記載のアミノ酸配列をコード
するDNA。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000241927A JP2002051785A (ja) | 2000-08-09 | 2000-08-09 | 抗癌ヒトモノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識される抗原エピトープのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡヌクレオチド配列 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000241927A JP2002051785A (ja) | 2000-08-09 | 2000-08-09 | 抗癌ヒトモノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識される抗原エピトープのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡヌクレオチド配列 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002051785A true JP2002051785A (ja) | 2002-02-19 |
Family
ID=18733036
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000241927A Pending JP2002051785A (ja) | 2000-08-09 | 2000-08-09 | 抗癌ヒトモノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識される抗原エピトープのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡヌクレオチド配列 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002051785A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004046193A1 (ja) * | 2002-11-19 | 2004-06-03 | Yoshihide Hagiwara | 癌細胞増殖抑制ヒトモノクローナル抗体の取得法 |
| EP2015785A2 (en) * | 2006-04-24 | 2009-01-21 | Shantha West, Inc. | Agrm2 antigen |
| JP2015525569A (ja) * | 2012-08-07 | 2015-09-07 | スキャンセル リミテッド | 修飾型自己エピトープに対する抗腫瘍免疫応答 |
-
2000
- 2000-08-09 JP JP2000241927A patent/JP2002051785A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004046193A1 (ja) * | 2002-11-19 | 2004-06-03 | Yoshihide Hagiwara | 癌細胞増殖抑制ヒトモノクローナル抗体の取得法 |
| EP2015785A2 (en) * | 2006-04-24 | 2009-01-21 | Shantha West, Inc. | Agrm2 antigen |
| EP2015785A4 (en) * | 2006-04-24 | 2009-07-15 | Shantha West Inc | ANTIGEN AGRM2 |
| JP2015525569A (ja) * | 2012-08-07 | 2015-09-07 | スキャンセル リミテッド | 修飾型自己エピトープに対する抗腫瘍免疫応答 |
| JP2018197236A (ja) * | 2012-08-07 | 2018-12-13 | スキャンセル リミテッド | 修飾型自己エピトープに対する抗腫瘍免疫応答 |
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