JP2004168691A - 癌細胞増殖抑制ヒトモノクローナル抗体の取得法 - Google Patents
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Abstract
【課題】癌細胞増殖抑制活性を有するヒトモノクローナル抗体を選別するための簡便な方法を提供すること。
【解決手段】ヒトモノクローナル抗体又はその断片をヒトビメンチン又は少なくともヒトビメンチンのアミノ酸配列残基番号２４６〜３７２の領域を含むヒトビメンチン断片と接触させ、ヒトビメンチンのアミノ酸配列のアミノ酸残基番号２４６〜３７２の領域と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体又はその断片を選択することを特徴とする癌細胞増殖抑制活性を有するヒトモノクローナル抗体又はその断片の取得方法。
【選択図】 なし
【解決手段】ヒトモノクローナル抗体又はその断片をヒトビメンチン又は少なくともヒトビメンチンのアミノ酸配列残基番号２４６〜３７２の領域を含むヒトビメンチン断片と接触させ、ヒトビメンチンのアミノ酸配列のアミノ酸残基番号２４６〜３７２の領域と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体又はその断片を選択することを特徴とする癌細胞増殖抑制活性を有するヒトモノクローナル抗体又はその断片の取得方法。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、たとえば、ヒトの疾患の治療、診断、予防などの医学および薬学分野や、生化学試薬、生体高分子の精製試薬などの薬理学・生化学分野などの広い分野において有用な癌細胞増殖抑制活性を有するヒトモノクローナル抗体またはその断片の取得方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および課題】
癌細胞は正常細胞とは質的・量的に異なった癌特異抗原あるいは癌関連抗原を有しており、ある場合には、そのような抗原をもつ癌細胞は宿主の免疫系によって排除されると考えられる。ヒトの場合、初期の研究において癌患者の血清中に自己の癌細胞と反応する抗体の存在が確認されたことから、そのような抗体を大量に且つ安定に供給することが可能であれば、癌の治療・診断において極めて利用価値の高いものになると考えられた。しかし、癌患者の血清中には、１）多種多様な特異性をもつ抗体が含まれていること、２）量的に制限があること、３）安定供給が得られないこと、などの問題点があった。
【０００３】
ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎによって開発されたハイブリドーマ法によるモノクローナル抗体の作製技術はこれらの問題点を解決するものであった。彼らの報告以後、ヒト癌細胞あるいはその抽出物でマウスを免疫し、ヒト癌細胞と反応する多数のマウスモノクローナル抗体がつくられ、それらが認識する抗原の同定とともに、一部の抗体は臨床応用も試みられた。
【０００４】
しかしながら、そのような臨床試験の結果から明らかになった問題点は、ヒトにとって異種であるマウス由来の抗体をヒトに頻回投与した場合、ＨＡＭＡ反応（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ヒト抗マウス抗体反応）が誘導され、その結果、副作用ならびに治療効果の減弱を引き起こすことであった。そこで、より安全性の高い同種由来の抗癌抗体、すなわちヒト抗癌モノクローナル抗体の出現が要望された。
【０００５】
このような状況下に、本発明者らは、特公平１−５９８７８号公報、特公平７−１２１２２１号公報、特公平７−１１９２４０号公報、特許第２５９９２５８号公報、特許第２５０９１９１号公報、特公平８−２９０７８号公報、特公平７−９８０００号公報、特許第２７２１８１７号公報、特許第２８３０９７６号公報、特開昭６２−７０４００号公報、特開平０６−１４１８８４号公報、特開平０９−１００３００号公報に詳しく開示されているごとく、癌患者リンパ球とヒトＢ細胞リンパ芽球との細胞融合により種々のヒト−ヒトハイブリドーマを創製し、癌細胞と結合性を有するヒトモノクローナル抗体を多数取得した。本発明者らは、それら抗体に関しさらに研究を行なったところ、ヒトモノクローナル抗体の癌細胞結合活性と抗癌効果（細胞増殖抑制効果）との間には明確な相関が存在しないこと、すなわち、癌と結合する抗体のすべてが抗癌効果を示すものでは必ずしもないことが判明した。癌細胞に結合する抗体の特異性は非常に多様であるので、それらすべてにおいて抗癌効果を調べることは実際上不可能である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主たる目的は、癌細胞と結合する多数のヒトモノクローナル抗体の中から抗癌効果を示す抗体を選別・取得することができる簡便な方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記の如き課題を解決すべく、以下のような研究を行った。
【０００８】
本発明者らは、先に、子宮癌患者リンパ球とヒトＢ細胞リンパ芽球との細胞融合により、ヒト癌細胞に高い反応性を有するヒトモノクローナル抗体を産生するヒト−ヒトハイブリドーマ細胞株ＣＬＮＨ１１を樹立した。そして、ＣＬＮＨ１１が産生するモノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧが子宮癌のみならず脳腫瘍、肺癌、胃癌、大腸癌などの多くの種類の癌と結合し、さらには癌細胞の増殖を抑制することを明らかにした。さらに、ＣＬＮ−ＩｇＧが認識する抗原は細胞骨格蛋白質の一種であるヒトビメンチンであることを明らかにした（Ｈａｇｉｗａｒａｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ １０，７７−８２（２００１））。また、ヒトビメンチンの各種断片を作製し、それぞれの断片とＣＬＮ−ＩｇＧの結合性を調べ、ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識される抗原エピトープ領域を同定したところ、ヒトビメンチンのロッドＣ２ドメイン上のアミノ酸残基番号２８９〜３６７からなる領域にエピトープが存在することが判明した（特開２００２−５１７８５号公報）。
【０００９】
癌細胞増殖抑制効果を期待して抗体を作製する場合、これまでは、細胞増殖関連蛋白質（たとえば、細胞膜上の細胞増殖因子受容体や細胞増殖因子など）や特に癌細胞で過剰に発現している細胞表面蛋白質などを標的抗原として用いるのが通例であった。したがって、細胞骨格蛋白質であるヒトビメンチンが癌抗原として機能し、なおかつ、抗体による細胞増殖抑制効果の標的となりうることはこれまで全く知られておらず、ましてや、ヒトビメンチンを標的とした抗癌ヒトモノクローナル抗体は皆無であった。
【００１０】
そこで、本発明者らは、ヒト癌細胞と反応する種々のヒトモノクローナル抗体の特異性と抗腫瘍効果との関連性を調べた。その結果、今回、ヒトビメンチンの特定のエピトープに結合性を有する抗体は癌細胞増殖抑制活性を持ち、他方、結合性を有しない抗体は癌細胞増殖抑制活性を実質的に示さないことを究明し、ヒトビメンチン又は少なくともヒトビメンチンのアミノ酸配列残基番号２４６〜３７２の領域を含むヒトビメンチン断片と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体又はその断片を選択することによって、癌細胞の破壊または増殖抑制効果を有するヒトモノクローナル抗体又はその断片を選択・所得できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
【発明の実施の形態】
かくして、本発明によれば、ヒトモノクローナル抗体又はその断片をヒトビメンチン又は少なくともヒトビメンチンのアミノ酸配列残基番号２４６〜３７２の領域を含むヒトビメンチン断片と接触させ、ヒトビメンチンのアミノ酸配列のアミノ酸残基番号２４６〜３７２の領域と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体又はその断片を選択することを特徴とする癌細胞増殖抑制活性を有するヒトモノクローナル抗体又はその断片の取得方法が提供される。
【００１２】
以下、本発明によって提供される方法についてさらに詳細に説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
ヒトビメンチンは、細胞の構造を維持する働きをする細胞骨格蛋白質のうち、中間径フィラメントに分類される蛋白質（アミノ酸残基数４６６、分子量５３，６５１）である。ヒトビメンチンはＮ末端側からｈｅａｄ、ｃｏｉｌ１（Ｃ１）、ｃｏｉｌ２（Ｃ２）、ｔａｉｌの４つのドメイン構造を有し、特にＣ１およびＣ２は螺旋状の構造を有している。
【００１４】
このうち、Ｃ２ドメイン上にヒトモノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識されるエピトープが存在する。そこで、本発明者らは、このエピトープ領域をさらに絞り込むために、種々のＣ２断片をコードするＤＮＡを大腸菌発現ベクターに組込み、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）との融合蛋白質として発現させ精製した後、ウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡ法を用いて、それら断片とモノクローナル抗体との結合性を調べた。その結果、２種類のモノクローナル抗体がビメンチンのアミノ酸残基２８９〜３６７の断片と結合することが明らかとなった（特開２００２−５１７８５号公報）。
【００１５】
つぎに、各種ヒトモノクローナル抗体の癌細胞増殖抑制活性を調べるために、ヌードマウスを用いてｉｎ ｖｉｖｏ試験を行った。まず、ヒトモノクローナル抗体と子宮頸部癌細胞株ＭＥ−１８０を混合し、ヌードマウスの皮下に移植した後、腫瘍体積を経時的に測定し、細胞増殖抑制効果を評価した。その結果、上述したようなヒトビメンチンエピトープと結合性を示した抗体のみに強い細胞増殖抑制効果が認められた。
【００１６】
これらのことより、ヒトモノクローナル抗体において、ヒトビメンチンのＣ２ドメイン上のエピトープ領域に対する結合性と癌細胞増殖抑制効果との間には密接な関連があることが示された。したがって、該ヒトビメンチンエピトープを用いることによって、癌細胞増殖抑制効果を示すヒトモノクローナル抗体を容易に選択・取得することが可能となる。
【００１７】
ヒトモノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識されるヒトビメンチンのＣ２ドメイン上のエピトープ領域について、本発明者らは、先に、ヒトビメンチンのＣ２ドメインの各種ペプチド断片を作製し、それぞれの断片とＣＬＮ−ＩｇＧとの反応性から、ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識される抗原エピトープ領域を同定し、その領域のアミノ酸配列を解析し、その領域がヒトビメンチンのアミノ酸配列のアミノ酸残基番号２８９〜３６７の部分に相当することを明らかにした（特開２００２−５１７８５号公報）。本発明者らは、ヒトモノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識されるヒトビメンチンのＣ２ドメイン上のエピトープ領域について、その三次元構造も含めてさらに検討を重ねた結果、ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識される抗原エピトープ領域は、ヒトビメンチンのアミノ酸配列残基２８９〜３６７の部分よりも、さらに広い領域を認識している可能性があることがわかり、その領域のアミノ酸配列を解析し、下記のアミノ酸配列
で示されるヒトビメンチンのアミノ酸配列残基番号２４６〜３７２の部分を決定した（配列表の配列番号６）。
【００１８】
上記のアミノ酸配列残基２４６〜３７２の領域を含むヒトビメンチン断片（以下「ヒトビメンチンエピトープ断片」ということがある）は種々の方法で製造することが可能である。たとえば、ヒトビメンチンエピトープ断片は、それ自体既知の固相または液相合成法によって化学的に合成することができる。また、ヒトビメンチンエピトープ断片のアミノ酸配列からそれをコードするＤＮＡを合成し、それを細菌、動物細胞、植物細胞などの宿主とそれに対する発現ベクターからなるベクター−宿主細胞系に適用して遺伝子工学的に製造することも可能である。この場合、種々の機能を有する融合蛋白質の形態で発現させることもできる。
【００１９】
ヒトビメンチンエピトープ断片は、ＣＬＮ−ＩｇＧと結合するものであれば、その大きさには特に制限はなく、また、ＣＬＮ−ＩｇＧとの結合性が損なわれない範囲で、アミノ酸配列の一部が欠失、置換および／又は追加されているものも包含される。
【００２０】
他方、本発明の方法において、ヒトビメンチンとしては、ヒトビメンチンを発現しているヒト細胞、例えばヒト膠芽腫細胞株Ｕ−２５１ ＭＧそのものを使用することができ、或いは該細胞から通常の蛋白質精製法に従い、例えばアフィニティクロマトグラフィー等の手段により分離される粗製の又は精製されたヒトビメンチンを使用することもできる。
【００２１】
ヒトビメンチン又はヒトビメンチンエピトープ断片を用いて、癌細胞増殖抑制活性を有するヒトモノクローナル抗体又はその断片（以下、便宜上「ヒトモノクローナル抗体」ということがある）を選別・取得する方法としては、例えば、ヒトビメンチン又はヒトビメンチンエピトープ断片を適当な固体担体（例えば、マイクロプレート、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ガラスビーズ、樹脂、センサーチップ等）上に付着固定し、被検ヒトモノクローナル抗体又はその断片を含む液体と接触させ、担体上のヒトビメンチン又はヒトビメンチンエピトープ断片と結合するヒトモノクローナル抗体又はその断片を、酵素抗体法を利用するウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、ドットブロッティング法；表面プラズモン共鳴を利用する測定法等によって検出することからなる方法が挙げられる。
【００２２】
かくして、ヒトビメンチンのアミノ酸配列のアミノ酸残基番号２４６〜３７２の領域と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体又はその断片を選択・取得することができる。
【００２３】
なお、上記の被検ヒトモノクローナル抗体としては、精製されたヒトモノクローナル抗体のみならず、ヒトモノクローナル抗体を産生している細胞そのものを使用することもできる。
【００２４】
以上に述べた本発明の方法により取得されるヒトモノクローナル抗体又はその断片は、その抗体の由来に応じて各種の癌細胞の増殖を抑制する効果を有しており、癌細胞増殖抑制剤の有効成分として、例えば、子宮癌、肺癌、胃癌、大腸癌、脳腫瘍、肝癌、乳癌、前立腺癌などの癌疾患の処置のために使用することが期待される。
【００２５】
本発明により取得されるヒトモノクローナル抗体又はその断片を癌細胞増殖抑制剤として臨床的に使用する場合、該ヒトモノクローナル抗体又はその断片は、それ自体既知の方法で、例えば適当な賦形剤と共に凍結乾燥粉末の形態に製剤化することができ、得られる製剤は注射用蒸留水で復元した後、非経口的に例えば静脈内、腫瘍内に投与することができる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらによって何ら制限されるものではない。
実施例１：ヒトビメンチンに結合するヒトモノクローナル抗体のウェスタンブロッティング法による選択
ヒト膠芽腫細胞株Ｕ−２５１ ＭＧを６２．５ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、２％ ＳＤＳ、５％ ２−メルカプトエタノール、４Ｍ尿素を含む溶液中で超音波破砕し、細胞５ｘ１０４個に相当する破砕液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。
【００２７】
電気泳動後、セミドライ型のブロッティング装置を用いて４８ｍＭトリス、３９ｍＭグリシン、０．０３７％ＳＤＳ、１０％メタノール中でＨｙｂｏｎｄ ＥＣＬ膜（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に蛋白質を転写した。
【００２８】
つぎに、転写後の膜をブロッキング溶液（５％スキムミルク含有ＰＢＳ−Ｔ（０．３％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水））に３７℃で１時間浸した後、１０μｇ／ｍＬの一次抗体（１％スキムミルク含有ＰＢＳ−Ｔに溶解したＣＬＮ−ＩｇＧ、ＴＯＨ／Ｇ２−ＩｇＧ、ＩＭ９−ＩｇＧ又はＨＴ２−ＩｇＭ）に、３７℃で３０分間浸した。
【００２９】
さらに、膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗った後、二次抗体（１％スキムミルク含有ＰＢＳ−Ｔで溶解したペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体又はペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体（いずれもＢＩＯＳＯＲＣＥ社製、１万倍希釈））に３７℃で３０分間浸した。ＰＢＳ−Ｔで３回洗った後、ＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を添加し、１分間静置した（ＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔは、膜上に固定された蛋白質の中から、ペルオキシダーゼ標識抗体を用いて、目的の抗原を化学発光によって検出する高感度システムである）。
【００３０】
最後に、膜からＤｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを除去し、膜をＯＨＰシートにはさみＸ線フィルムに１分間露光した後、フィルムを現像した。
【００３１】
その結果、図１に示すとおり、被検ヒトモノクローナル抗体４種のうち、ＣＬＮ−ＩｇＧとＨＴ２−ＩｇＭの２種がヒトビメンチンを認識していることが判明した（図１で矢印はビメンチンの位置を表す）。
実施例２：ヒトビメンチンＣ２断片−ＧＳＴ融合蛋白質の作製
ヒトビメンチンのアミノ酸配列をもとに配列表に示す配列番号１，２，３の３’側のＤＮＡプライマーおよび配列番号４，５の５’側のＤＮＡプライマーを合成し、これらのプライマーを種々組み合わせて、ヒトビメンチンＣ２ドメインを含むプラスミドを鋳型にＰＣＲを行い、Ｃ２ドメインの種々部分配列を増幅した。得られた断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化した後、ＤＮＡライゲーションキット・バージョン２（宝酒造社製）を用いて、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化したＧＳＴ融合蛋白質発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に連結した。さらに、大腸菌ＢＬ２１を得られたプラスミドで形質転換し、アンピシリン耐性株を選択し、それらからアルカリ法でプラスミドを調製した。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化した後、アガロース電気泳動にかけ、ヒトビメンチンＣ２の断片が挿入されているクローンを確認し選択した。
【００３２】
上記で得られた各組換えプラスミドを有する大腸菌クローンを２ｍＬのＬＢ培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に植え、２５℃で一晩培養した。この培養液を再び２０ｍＬのＬＢ培地に植え、２５℃で３．５時間培養した後、１ＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を２μＬ加えてさらに２時間培養した。５，０００ｒｐｍで５分間遠心して集菌し、上清を捨て、沈殿に１ｍＬのＰＢＳ（フォスフェートバッファードセーライン、生理食塩水（ｐＨ７．２））を加えた。菌体を懸濁した溶液を超音波処理し、２０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１ｍＬ加えた後、４℃で１時間振盪し、グルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）によるアフィニティクロマトグラフィーで精製し、ヒトビメンチンＣ２断片−ＧＳＴ融合蛋白を得た。
実施例３：ヒトビメンチンＣ２断片に結合するヒトモノクローナル抗体のウェスタンブロッティング法による選択
実施例１で得られた各融合蛋白質を２００ｎｇ／レーンの濃度に調整し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルからセミドライ・ブロッティング法によりＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ膜（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に蛋白質を転写した。転写後の膜をブロッキング溶液（５％ スキムミルク含有 ＰＢＳ−Ｔ）に３７℃で１時間浸した後、一次抗体（１％ スキムミルク含有ＰＢＳ−Ｔで溶解したＣＬＮ−ＩｇＧまたはＨＴ２−ＩｇＭ（それぞれ１０μｇ／ｍＬ））に３７℃で３０分間浸した。ＰＢＳ−Ｔで３回洗った後、二次抗体溶液（１％ スキムミルク含有ＰＢＳ−Ｔで溶解したペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体又はペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体（いずれもＢＩＯＳＯＲＣＥ社製、２５，０００倍希釈））に３７℃で３０分間浸した。ＰＢＳ−Ｔで３回洗った後、ＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を添加し１分間静置した。さらに、膜からＤｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを除去し、膜をＯＨＰシートにはさみＸ線フィルムに１分間露光した後、フィルムを現像した。その結果を図２に示す。なお、図２Ｂにおいては、融合蛋白質の他に参照として、ウシ血清アルブミンを２００ｎｇ／レーンの濃度で、また、膠芽腫細胞株Ｕ−２５１ＭＧの細胞抽出液（８Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、４％ＤＴＴ、０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８で細胞を破砕した溶液）を１０μｇ蛋白／レーンの濃度で電気泳動にかけた。
【００３３】
その結果、ＣＬＮ−ＩｇＧ（図２Ａ）とＨＴ２−ＩｇＭ抗体（図２Ｂ）のいずれもヒトビメンチン（アミノ酸残基番号２４６〜３９７）と反応すること、特にヒトビメンチンＣ２エピトープ断片（アミノ酸残基番号２４６〜３７２）と強く反応することが判明した。このことから、ＣＬＮ−ＩｇＧおよびＨＴ２−ＩｇＭはヒトビメンチンのアミノ酸残基番号２４６〜３７２からなる領域を認識することが明らかとなった。
実施例４：ヌードマウス移植癌に対する細胞増殖抑制効果
ヒト子宮頸部癌ＭＥ−１８０細胞株（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３３）５ｘ１０６個をヒトモノクローナル抗体（ＣＬＮ−ＩｇＧ、ＴＯＨ／Ｇ２−ＩｇＧ又はＩＭ９−ＩｇＧ）１７０μｇと混合した後、ヌードマウス（日本クレア、ＢＡＬＢ／ｃＡＪＣｌ−ｎｕ ｎｕ／ｎｕ ６週齡雌、１群５匹）の皮下へ移植し、経時的に腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は（長径）ｘ（短径）２ｘ１／２の近似式により求めた。
【００３４】
その結果、ヒトビメンチン又はヒトビメンチンエピトープと結合性を有しないＩＭ９−ＩｇＧおよびＴＯＨ／Ｇ２−ＩｇＧでは癌細胞増殖抑制効果はほとんど認められなかったが、ヒトビメンチン又はヒトビメンチンエピトープと結合性を有しているＣＬＮ−ＩｇＧは強い癌細胞増殖抑制効果を示した（図３）。
実施例５：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける癌細胞増殖抑制試験
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＦ培地に５ｘ１０４／ｍＬの濃度で懸濁したヒト膠芽種細胞株Ｕ２５１ＭＧを１００μＬずつ９６ウェルマイクロプレート（ヌンク社製）にまき、そこへＨＴ２−ＩｇＭ又はＩＭ９−ＩｇＧを最終濃度が５０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬになるように添加した。さらに、炭酸ガス濃度５％、３７℃の条件で２日間培養した後、Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ試薬（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いてＳ期の細胞によるＢｒｄＵの取り込みを測定した。具体的には、ウェルあたり１０μＬのＢｒｄＵ（１００μＭ）を加え、２時間培養し、細胞の固定とＤＮＡの変性を行った後、ペルオキシダーゼ標識抗ＢｒｄＵ抗体と９０分間反応させ、最後に酵素基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し３７０ｎｍの吸光度を測定した。抗体を添加しない細胞のみの対照群と比較し、細胞増殖抑制活性を求めた。
【００３５】
結果は下表（表１）に示すとおりであり、ＨＴ２−ＩｇＭでは癌細胞増殖抑制効果が認められたが、ＩＭ９−ＩｇＧでは認められなかった。すなわち、ヒトビメンチンエピトープ断片との結合性を有しているＨＴ２−ＩｇＭ抗体は増殖抑制活性を示し、他方、結合性を有していないＩＭ９−ＩｇＧ抗体は増殖抑制効果を示さなかったことから、該エピトープ断片に対する反応性の有無を調べることにより、細胞増殖抑制効果をもつ抗体を選別・取得することが可能となる。
【００３６】
【表１】
【００３７】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ウェスタンブロッティングでみたヒトモノクローナル抗体とヒト膠芽種細胞株Ｕ−２５１ＭＧのビメンチンとの結合性。
【符号の説明】
１ 分子量マーカー
２ ＣＬＮ−ＩｇＧ
３ ＴＯＨ／Ｇ２−ＩｇＧ
４ ＩＭ９−ＩｇＧ
５ ＨＴ２−ＩｇＭ
図中、右側に示した矢印はヒトビメンチンの位置を表す。
【図２】ウェスタンブロッティングでみたヒトモノクローナル抗体とビメンチン断片−ＧＳＴ融合蛋白質との結合性。
【符号の説明】
Ａ． ＣＬＮ−ＩｇＧを用いたウェスタンブロッティング
１ 分子量マーカー
２ ＧＳＴ
３ ヒトビメンチンＣ２ドメイン（アミノ酸残基番号２４６〜３９７）−ＧＳＴ融合蛋白質
４ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２４６〜３６７）−ＧＳＴ融合蛋白質
５ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２４６〜３７２）−ＧＳＴ融合蛋白質
６ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２８９〜３６７）−ＧＳＴ融合蛋白質
７ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２４６〜３７１）−ＧＳＴ融合蛋白質
８ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２４６〜３７２）−ＧＳＴ融合蛋白質
９ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２８９〜３７１）−ＧＳＴ融合蛋白質
１０ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２８９〜３７２）−ＧＳＴ融合蛋白質
１１ 分子量マーカー
Ｂ． ＨＴ−２ ＩｇＭを用いたウェスタンブロッティング
レーン１〜６はＣＢＢ染色、レーン７〜１２はウェスタンブロッティング
１ 分子量マーカー
２ ヒトビメンチンＣ１ドメイン（アミノ酸残基番号９６〜２４５）−ＧＳＴ 融合蛋白質
３ ヒトビメンチンＣ２ドメイン（アミノ酸残基番号２４６〜３９７）−ＧＳＴ融合蛋白質
４ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２４６〜３７２）−ＧＳＴ融合蛋白質
５ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
６ ヒト膠芽腫Ｕ−２５１ ＭＧ細胞抽出液
７ 分子量マーカー
８ ヒトビメンチンＣ１ドメイン（アミノ酸残基番号９６〜２４５）−ＧＳＴ融合蛋白質
９ ヒトビメンチンＣ２ドメイン（アミノ酸残基番号２４６〜３９７）−ＧＳＴ融合蛋白質
１０ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２４６〜３７２）−ＧＳＴ融合蛋白質
１１ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
１２ ヒト膠芽腫Ｕ−２５１ ＭＧ細胞抽出液
【図３】ヌードマウス移植癌（ヒト子宮頸部癌細胞株ＭＥ−１８０）に対する各種ヒトモノクローナル抗体の細胞増殖抑制効果
【符号の説明】
○：ＰＢＳ
■：ＴＯＨ／Ｇ２−ＩｇＧ
●：ＩＭ９−ＩｇＧ
▲：ＣＬＮ−ＩｇＧ
【発明の属する技術分野】
本発明は、たとえば、ヒトの疾患の治療、診断、予防などの医学および薬学分野や、生化学試薬、生体高分子の精製試薬などの薬理学・生化学分野などの広い分野において有用な癌細胞増殖抑制活性を有するヒトモノクローナル抗体またはその断片の取得方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および課題】
癌細胞は正常細胞とは質的・量的に異なった癌特異抗原あるいは癌関連抗原を有しており、ある場合には、そのような抗原をもつ癌細胞は宿主の免疫系によって排除されると考えられる。ヒトの場合、初期の研究において癌患者の血清中に自己の癌細胞と反応する抗体の存在が確認されたことから、そのような抗体を大量に且つ安定に供給することが可能であれば、癌の治療・診断において極めて利用価値の高いものになると考えられた。しかし、癌患者の血清中には、１）多種多様な特異性をもつ抗体が含まれていること、２）量的に制限があること、３）安定供給が得られないこと、などの問題点があった。
【０００３】
ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎによって開発されたハイブリドーマ法によるモノクローナル抗体の作製技術はこれらの問題点を解決するものであった。彼らの報告以後、ヒト癌細胞あるいはその抽出物でマウスを免疫し、ヒト癌細胞と反応する多数のマウスモノクローナル抗体がつくられ、それらが認識する抗原の同定とともに、一部の抗体は臨床応用も試みられた。
【０００４】
しかしながら、そのような臨床試験の結果から明らかになった問題点は、ヒトにとって異種であるマウス由来の抗体をヒトに頻回投与した場合、ＨＡＭＡ反応（Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉ−Ｍｏｕｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ：ヒト抗マウス抗体反応）が誘導され、その結果、副作用ならびに治療効果の減弱を引き起こすことであった。そこで、より安全性の高い同種由来の抗癌抗体、すなわちヒト抗癌モノクローナル抗体の出現が要望された。
【０００５】
このような状況下に、本発明者らは、特公平１−５９８７８号公報、特公平７−１２１２２１号公報、特公平７−１１９２４０号公報、特許第２５９９２５８号公報、特許第２５０９１９１号公報、特公平８−２９０７８号公報、特公平７−９８０００号公報、特許第２７２１８１７号公報、特許第２８３０９７６号公報、特開昭６２−７０４００号公報、特開平０６−１４１８８４号公報、特開平０９−１００３００号公報に詳しく開示されているごとく、癌患者リンパ球とヒトＢ細胞リンパ芽球との細胞融合により種々のヒト−ヒトハイブリドーマを創製し、癌細胞と結合性を有するヒトモノクローナル抗体を多数取得した。本発明者らは、それら抗体に関しさらに研究を行なったところ、ヒトモノクローナル抗体の癌細胞結合活性と抗癌効果（細胞増殖抑制効果）との間には明確な相関が存在しないこと、すなわち、癌と結合する抗体のすべてが抗癌効果を示すものでは必ずしもないことが判明した。癌細胞に結合する抗体の特異性は非常に多様であるので、それらすべてにおいて抗癌効果を調べることは実際上不可能である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の主たる目的は、癌細胞と結合する多数のヒトモノクローナル抗体の中から抗癌効果を示す抗体を選別・取得することができる簡便な方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】
そこで、本発明者らは、上記の如き課題を解決すべく、以下のような研究を行った。
【０００８】
本発明者らは、先に、子宮癌患者リンパ球とヒトＢ細胞リンパ芽球との細胞融合により、ヒト癌細胞に高い反応性を有するヒトモノクローナル抗体を産生するヒト−ヒトハイブリドーマ細胞株ＣＬＮＨ１１を樹立した。そして、ＣＬＮＨ１１が産生するモノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧが子宮癌のみならず脳腫瘍、肺癌、胃癌、大腸癌などの多くの種類の癌と結合し、さらには癌細胞の増殖を抑制することを明らかにした。さらに、ＣＬＮ−ＩｇＧが認識する抗原は細胞骨格蛋白質の一種であるヒトビメンチンであることを明らかにした（Ｈａｇｉｗａｒａｅｔ ａｌ． Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ １０，７７−８２（２００１））。また、ヒトビメンチンの各種断片を作製し、それぞれの断片とＣＬＮ−ＩｇＧの結合性を調べ、ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識される抗原エピトープ領域を同定したところ、ヒトビメンチンのロッドＣ２ドメイン上のアミノ酸残基番号２８９〜３６７からなる領域にエピトープが存在することが判明した（特開２００２−５１７８５号公報）。
【０００９】
癌細胞増殖抑制効果を期待して抗体を作製する場合、これまでは、細胞増殖関連蛋白質（たとえば、細胞膜上の細胞増殖因子受容体や細胞増殖因子など）や特に癌細胞で過剰に発現している細胞表面蛋白質などを標的抗原として用いるのが通例であった。したがって、細胞骨格蛋白質であるヒトビメンチンが癌抗原として機能し、なおかつ、抗体による細胞増殖抑制効果の標的となりうることはこれまで全く知られておらず、ましてや、ヒトビメンチンを標的とした抗癌ヒトモノクローナル抗体は皆無であった。
【００１０】
そこで、本発明者らは、ヒト癌細胞と反応する種々のヒトモノクローナル抗体の特異性と抗腫瘍効果との関連性を調べた。その結果、今回、ヒトビメンチンの特定のエピトープに結合性を有する抗体は癌細胞増殖抑制活性を持ち、他方、結合性を有しない抗体は癌細胞増殖抑制活性を実質的に示さないことを究明し、ヒトビメンチン又は少なくともヒトビメンチンのアミノ酸配列残基番号２４６〜３７２の領域を含むヒトビメンチン断片と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体又はその断片を選択することによって、癌細胞の破壊または増殖抑制効果を有するヒトモノクローナル抗体又はその断片を選択・所得できることを見い出し、本発明を完成するに至った。
【００１１】
【発明の実施の形態】
かくして、本発明によれば、ヒトモノクローナル抗体又はその断片をヒトビメンチン又は少なくともヒトビメンチンのアミノ酸配列残基番号２４６〜３７２の領域を含むヒトビメンチン断片と接触させ、ヒトビメンチンのアミノ酸配列のアミノ酸残基番号２４６〜３７２の領域と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体又はその断片を選択することを特徴とする癌細胞増殖抑制活性を有するヒトモノクローナル抗体又はその断片の取得方法が提供される。
【００１２】
以下、本発明によって提供される方法についてさらに詳細に説明する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
ヒトビメンチンは、細胞の構造を維持する働きをする細胞骨格蛋白質のうち、中間径フィラメントに分類される蛋白質（アミノ酸残基数４６６、分子量５３，６５１）である。ヒトビメンチンはＮ末端側からｈｅａｄ、ｃｏｉｌ１（Ｃ１）、ｃｏｉｌ２（Ｃ２）、ｔａｉｌの４つのドメイン構造を有し、特にＣ１およびＣ２は螺旋状の構造を有している。
【００１４】
このうち、Ｃ２ドメイン上にヒトモノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識されるエピトープが存在する。そこで、本発明者らは、このエピトープ領域をさらに絞り込むために、種々のＣ２断片をコードするＤＮＡを大腸菌発現ベクターに組込み、ＧＳＴ（グルタチオンＳトランスフェラーゼ）との融合蛋白質として発現させ精製した後、ウェスタンブロッティングおよびＥＬＩＳＡ法を用いて、それら断片とモノクローナル抗体との結合性を調べた。その結果、２種類のモノクローナル抗体がビメンチンのアミノ酸残基２８９〜３６７の断片と結合することが明らかとなった（特開２００２−５１７８５号公報）。
【００１５】
つぎに、各種ヒトモノクローナル抗体の癌細胞増殖抑制活性を調べるために、ヌードマウスを用いてｉｎ ｖｉｖｏ試験を行った。まず、ヒトモノクローナル抗体と子宮頸部癌細胞株ＭＥ−１８０を混合し、ヌードマウスの皮下に移植した後、腫瘍体積を経時的に測定し、細胞増殖抑制効果を評価した。その結果、上述したようなヒトビメンチンエピトープと結合性を示した抗体のみに強い細胞増殖抑制効果が認められた。
【００１６】
これらのことより、ヒトモノクローナル抗体において、ヒトビメンチンのＣ２ドメイン上のエピトープ領域に対する結合性と癌細胞増殖抑制効果との間には密接な関連があることが示された。したがって、該ヒトビメンチンエピトープを用いることによって、癌細胞増殖抑制効果を示すヒトモノクローナル抗体を容易に選択・取得することが可能となる。
【００１７】
ヒトモノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識されるヒトビメンチンのＣ２ドメイン上のエピトープ領域について、本発明者らは、先に、ヒトビメンチンのＣ２ドメインの各種ペプチド断片を作製し、それぞれの断片とＣＬＮ−ＩｇＧとの反応性から、ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識される抗原エピトープ領域を同定し、その領域のアミノ酸配列を解析し、その領域がヒトビメンチンのアミノ酸配列のアミノ酸残基番号２８９〜３６７の部分に相当することを明らかにした（特開２００２−５１７８５号公報）。本発明者らは、ヒトモノクローナル抗体ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識されるヒトビメンチンのＣ２ドメイン上のエピトープ領域について、その三次元構造も含めてさらに検討を重ねた結果、ＣＬＮ−ＩｇＧによって認識される抗原エピトープ領域は、ヒトビメンチンのアミノ酸配列残基２８９〜３６７の部分よりも、さらに広い領域を認識している可能性があることがわかり、その領域のアミノ酸配列を解析し、下記のアミノ酸配列
【００１８】
上記のアミノ酸配列残基２４６〜３７２の領域を含むヒトビメンチン断片（以下「ヒトビメンチンエピトープ断片」ということがある）は種々の方法で製造することが可能である。たとえば、ヒトビメンチンエピトープ断片は、それ自体既知の固相または液相合成法によって化学的に合成することができる。また、ヒトビメンチンエピトープ断片のアミノ酸配列からそれをコードするＤＮＡを合成し、それを細菌、動物細胞、植物細胞などの宿主とそれに対する発現ベクターからなるベクター−宿主細胞系に適用して遺伝子工学的に製造することも可能である。この場合、種々の機能を有する融合蛋白質の形態で発現させることもできる。
【００１９】
ヒトビメンチンエピトープ断片は、ＣＬＮ−ＩｇＧと結合するものであれば、その大きさには特に制限はなく、また、ＣＬＮ−ＩｇＧとの結合性が損なわれない範囲で、アミノ酸配列の一部が欠失、置換および／又は追加されているものも包含される。
【００２０】
他方、本発明の方法において、ヒトビメンチンとしては、ヒトビメンチンを発現しているヒト細胞、例えばヒト膠芽腫細胞株Ｕ−２５１ ＭＧそのものを使用することができ、或いは該細胞から通常の蛋白質精製法に従い、例えばアフィニティクロマトグラフィー等の手段により分離される粗製の又は精製されたヒトビメンチンを使用することもできる。
【００２１】
ヒトビメンチン又はヒトビメンチンエピトープ断片を用いて、癌細胞増殖抑制活性を有するヒトモノクローナル抗体又はその断片（以下、便宜上「ヒトモノクローナル抗体」ということがある）を選別・取得する方法としては、例えば、ヒトビメンチン又はヒトビメンチンエピトープ断片を適当な固体担体（例えば、マイクロプレート、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ガラスビーズ、樹脂、センサーチップ等）上に付着固定し、被検ヒトモノクローナル抗体又はその断片を含む液体と接触させ、担体上のヒトビメンチン又はヒトビメンチンエピトープ断片と結合するヒトモノクローナル抗体又はその断片を、酵素抗体法を利用するウェスタンブロッティング法、ＥＬＩＳＡ法、ドットブロッティング法；表面プラズモン共鳴を利用する測定法等によって検出することからなる方法が挙げられる。
【００２２】
かくして、ヒトビメンチンのアミノ酸配列のアミノ酸残基番号２４６〜３７２の領域と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体又はその断片を選択・取得することができる。
【００２３】
なお、上記の被検ヒトモノクローナル抗体としては、精製されたヒトモノクローナル抗体のみならず、ヒトモノクローナル抗体を産生している細胞そのものを使用することもできる。
【００２４】
以上に述べた本発明の方法により取得されるヒトモノクローナル抗体又はその断片は、その抗体の由来に応じて各種の癌細胞の増殖を抑制する効果を有しており、癌細胞増殖抑制剤の有効成分として、例えば、子宮癌、肺癌、胃癌、大腸癌、脳腫瘍、肝癌、乳癌、前立腺癌などの癌疾患の処置のために使用することが期待される。
【００２５】
本発明により取得されるヒトモノクローナル抗体又はその断片を癌細胞増殖抑制剤として臨床的に使用する場合、該ヒトモノクローナル抗体又はその断片は、それ自体既知の方法で、例えば適当な賦形剤と共に凍結乾燥粉末の形態に製剤化することができ、得られる製剤は注射用蒸留水で復元した後、非経口的に例えば静脈内、腫瘍内に投与することができる。
【００２６】
【実施例】
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はそれらによって何ら制限されるものではない。
実施例１：ヒトビメンチンに結合するヒトモノクローナル抗体のウェスタンブロッティング法による選択
ヒト膠芽腫細胞株Ｕ−２５１ ＭＧを６２．５ｍＭトリス（ｐＨ６．８）、２％ ＳＤＳ、５％ ２−メルカプトエタノール、４Ｍ尿素を含む溶液中で超音波破砕し、細胞５ｘ１０４個に相当する破砕液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。
【００２７】
電気泳動後、セミドライ型のブロッティング装置を用いて４８ｍＭトリス、３９ｍＭグリシン、０．０３７％ＳＤＳ、１０％メタノール中でＨｙｂｏｎｄ ＥＣＬ膜（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に蛋白質を転写した。
【００２８】
つぎに、転写後の膜をブロッキング溶液（５％スキムミルク含有ＰＢＳ−Ｔ（０．３％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するリン酸緩衝生理食塩水））に３７℃で１時間浸した後、１０μｇ／ｍＬの一次抗体（１％スキムミルク含有ＰＢＳ−Ｔに溶解したＣＬＮ−ＩｇＧ、ＴＯＨ／Ｇ２−ＩｇＧ、ＩＭ９−ＩｇＧ又はＨＴ２−ＩｇＭ）に、３７℃で３０分間浸した。
【００２９】
さらに、膜をＰＢＳ−Ｔで３回洗った後、二次抗体（１％スキムミルク含有ＰＢＳ−Ｔで溶解したペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体又はペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体（いずれもＢＩＯＳＯＲＣＥ社製、１万倍希釈））に３７℃で３０分間浸した。ＰＢＳ−Ｔで３回洗った後、ＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を添加し、１分間静置した（ＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔは、膜上に固定された蛋白質の中から、ペルオキシダーゼ標識抗体を用いて、目的の抗原を化学発光によって検出する高感度システムである）。
【００３０】
最後に、膜からＤｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを除去し、膜をＯＨＰシートにはさみＸ線フィルムに１分間露光した後、フィルムを現像した。
【００３１】
その結果、図１に示すとおり、被検ヒトモノクローナル抗体４種のうち、ＣＬＮ−ＩｇＧとＨＴ２−ＩｇＭの２種がヒトビメンチンを認識していることが判明した（図１で矢印はビメンチンの位置を表す）。
実施例２：ヒトビメンチンＣ２断片−ＧＳＴ融合蛋白質の作製
ヒトビメンチンのアミノ酸配列をもとに配列表に示す配列番号１，２，３の３’側のＤＮＡプライマーおよび配列番号４，５の５’側のＤＮＡプライマーを合成し、これらのプライマーを種々組み合わせて、ヒトビメンチンＣ２ドメインを含むプラスミドを鋳型にＰＣＲを行い、Ｃ２ドメインの種々部分配列を増幅した。得られた断片をＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化した後、ＤＮＡライゲーションキット・バージョン２（宝酒造社製）を用いて、ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化したＧＳＴ融合蛋白質発現ベクターｐＧＥＸ−４Ｔ−１（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に連結した。さらに、大腸菌ＢＬ２１を得られたプラスミドで形質転換し、アンピシリン耐性株を選択し、それらからアルカリ法でプラスミドを調製した。得られたプラスミドをＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩで消化した後、アガロース電気泳動にかけ、ヒトビメンチンＣ２の断片が挿入されているクローンを確認し選択した。
【００３２】
上記で得られた各組換えプラスミドを有する大腸菌クローンを２ｍＬのＬＢ培地（バクトトリプトン１０ｇ／Ｌ、バクトイーストエキストラクト５ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム１０ｇ／Ｌ）に植え、２５℃で一晩培養した。この培養液を再び２０ｍＬのＬＢ培地に植え、２５℃で３．５時間培養した後、１ＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を２μＬ加えてさらに２時間培養した。５，０００ｒｐｍで５分間遠心して集菌し、上清を捨て、沈殿に１ｍＬのＰＢＳ（フォスフェートバッファードセーライン、生理食塩水（ｐＨ７．２））を加えた。菌体を懸濁した溶液を超音波処理し、２０％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を１ｍＬ加えた後、４℃で１時間振盪し、グルタチオンセファロース４Ｂ（ファルマシア社製）によるアフィニティクロマトグラフィーで精製し、ヒトビメンチンＣ２断片−ＧＳＴ融合蛋白を得た。
実施例３：ヒトビメンチンＣ２断片に結合するヒトモノクローナル抗体のウェスタンブロッティング法による選択
実施例１で得られた各融合蛋白質を２００ｎｇ／レーンの濃度に調整し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルからセミドライ・ブロッティング法によりＨｙｂｏｎｄ−ＥＣＬ膜（アマシャムファルマシアバイオテク社製）に蛋白質を転写した。転写後の膜をブロッキング溶液（５％ スキムミルク含有 ＰＢＳ−Ｔ）に３７℃で１時間浸した後、一次抗体（１％ スキムミルク含有ＰＢＳ−Ｔで溶解したＣＬＮ−ＩｇＧまたはＨＴ２−ＩｇＭ（それぞれ１０μｇ／ｍＬ））に３７℃で３０分間浸した。ＰＢＳ−Ｔで３回洗った後、二次抗体溶液（１％ スキムミルク含有ＰＢＳ−Ｔで溶解したペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体又はペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製ヤギ抗ヒトＩｇＭ抗体（いずれもＢＩＯＳＯＲＣＥ社製、２５，０００倍希釈））に３７℃で３０分間浸した。ＰＢＳ−Ｔで３回洗った後、ＥＣＬ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（アマシャムファルマシアバイオテク社製）を添加し１分間静置した。さらに、膜からＤｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを除去し、膜をＯＨＰシートにはさみＸ線フィルムに１分間露光した後、フィルムを現像した。その結果を図２に示す。なお、図２Ｂにおいては、融合蛋白質の他に参照として、ウシ血清アルブミンを２００ｎｇ／レーンの濃度で、また、膠芽腫細胞株Ｕ−２５１ＭＧの細胞抽出液（８Ｍ尿素、２％ＳＤＳ、４％ＤＴＴ、０．１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ６．８で細胞を破砕した溶液）を１０μｇ蛋白／レーンの濃度で電気泳動にかけた。
【００３３】
その結果、ＣＬＮ−ＩｇＧ（図２Ａ）とＨＴ２−ＩｇＭ抗体（図２Ｂ）のいずれもヒトビメンチン（アミノ酸残基番号２４６〜３９７）と反応すること、特にヒトビメンチンＣ２エピトープ断片（アミノ酸残基番号２４６〜３７２）と強く反応することが判明した。このことから、ＣＬＮ−ＩｇＧおよびＨＴ２−ＩｇＭはヒトビメンチンのアミノ酸残基番号２４６〜３７２からなる領域を認識することが明らかとなった。
実施例４：ヌードマウス移植癌に対する細胞増殖抑制効果
ヒト子宮頸部癌ＭＥ−１８０細胞株（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３３）５ｘ１０６個をヒトモノクローナル抗体（ＣＬＮ−ＩｇＧ、ＴＯＨ／Ｇ２−ＩｇＧ又はＩＭ９−ＩｇＧ）１７０μｇと混合した後、ヌードマウス（日本クレア、ＢＡＬＢ／ｃＡＪＣｌ−ｎｕ ｎｕ／ｎｕ ６週齡雌、１群５匹）の皮下へ移植し、経時的に腫瘍体積を測定した。腫瘍体積は（長径）ｘ（短径）２ｘ１／２の近似式により求めた。
【００３４】
その結果、ヒトビメンチン又はヒトビメンチンエピトープと結合性を有しないＩＭ９−ＩｇＧおよびＴＯＨ／Ｇ２−ＩｇＧでは癌細胞増殖抑制効果はほとんど認められなかったが、ヒトビメンチン又はヒトビメンチンエピトープと結合性を有しているＣＬＮ−ＩｇＧは強い癌細胞増殖抑制効果を示した（図３）。
実施例５：ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける癌細胞増殖抑制試験
１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＦ培地に５ｘ１０４／ｍＬの濃度で懸濁したヒト膠芽種細胞株Ｕ２５１ＭＧを１００μＬずつ９６ウェルマイクロプレート（ヌンク社製）にまき、そこへＨＴ２−ＩｇＭ又はＩＭ９−ＩｇＧを最終濃度が５０μｇ／ｍＬまたは１００μｇ／ｍＬになるように添加した。さらに、炭酸ガス濃度５％、３７℃の条件で２日間培養した後、Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ試薬（ベーリンガー・マンハイム社製）を用いてＳ期の細胞によるＢｒｄＵの取り込みを測定した。具体的には、ウェルあたり１０μＬのＢｒｄＵ（１００μＭ）を加え、２時間培養し、細胞の固定とＤＮＡの変性を行った後、ペルオキシダーゼ標識抗ＢｒｄＵ抗体と９０分間反応させ、最後に酵素基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を添加し３７０ｎｍの吸光度を測定した。抗体を添加しない細胞のみの対照群と比較し、細胞増殖抑制活性を求めた。
【００３５】
結果は下表（表１）に示すとおりであり、ＨＴ２−ＩｇＭでは癌細胞増殖抑制効果が認められたが、ＩＭ９−ＩｇＧでは認められなかった。すなわち、ヒトビメンチンエピトープ断片との結合性を有しているＨＴ２−ＩｇＭ抗体は増殖抑制活性を示し、他方、結合性を有していないＩＭ９−ＩｇＧ抗体は増殖抑制効果を示さなかったことから、該エピトープ断片に対する反応性の有無を調べることにより、細胞増殖抑制効果をもつ抗体を選別・取得することが可能となる。
【００３６】
【表１】
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】ウェスタンブロッティングでみたヒトモノクローナル抗体とヒト膠芽種細胞株Ｕ−２５１ＭＧのビメンチンとの結合性。
【符号の説明】
１ 分子量マーカー
２ ＣＬＮ−ＩｇＧ
３ ＴＯＨ／Ｇ２−ＩｇＧ
４ ＩＭ９−ＩｇＧ
５ ＨＴ２−ＩｇＭ
図中、右側に示した矢印はヒトビメンチンの位置を表す。
【図２】ウェスタンブロッティングでみたヒトモノクローナル抗体とビメンチン断片−ＧＳＴ融合蛋白質との結合性。
【符号の説明】
Ａ． ＣＬＮ−ＩｇＧを用いたウェスタンブロッティング
１ 分子量マーカー
２ ＧＳＴ
３ ヒトビメンチンＣ２ドメイン（アミノ酸残基番号２４６〜３９７）−ＧＳＴ融合蛋白質
４ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２４６〜３６７）−ＧＳＴ融合蛋白質
５ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２４６〜３７２）−ＧＳＴ融合蛋白質
６ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２８９〜３６７）−ＧＳＴ融合蛋白質
７ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２４６〜３７１）−ＧＳＴ融合蛋白質
８ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２４６〜３７２）−ＧＳＴ融合蛋白質
９ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２８９〜３７１）−ＧＳＴ融合蛋白質
１０ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２８９〜３７２）−ＧＳＴ融合蛋白質
１１ 分子量マーカー
Ｂ． ＨＴ−２ ＩｇＭを用いたウェスタンブロッティング
レーン１〜６はＣＢＢ染色、レーン７〜１２はウェスタンブロッティング
１ 分子量マーカー
２ ヒトビメンチンＣ１ドメイン（アミノ酸残基番号９６〜２４５）−ＧＳＴ 融合蛋白質
３ ヒトビメンチンＣ２ドメイン（アミノ酸残基番号２４６〜３９７）−ＧＳＴ融合蛋白質
４ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２４６〜３７２）−ＧＳＴ融合蛋白質
５ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
６ ヒト膠芽腫Ｕ−２５１ ＭＧ細胞抽出液
７ 分子量マーカー
８ ヒトビメンチンＣ１ドメイン（アミノ酸残基番号９６〜２４５）−ＧＳＴ融合蛋白質
９ ヒトビメンチンＣ２ドメイン（アミノ酸残基番号２４６〜３９７）−ＧＳＴ融合蛋白質
１０ ヒトビメンチンＣ２断片（アミノ酸残基番号２４６〜３７２）−ＧＳＴ融合蛋白質
１１ ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）
１２ ヒト膠芽腫Ｕ−２５１ ＭＧ細胞抽出液
【図３】ヌードマウス移植癌（ヒト子宮頸部癌細胞株ＭＥ−１８０）に対する各種ヒトモノクローナル抗体の細胞増殖抑制効果
【符号の説明】
○：ＰＢＳ
■：ＴＯＨ／Ｇ２−ＩｇＧ
●：ＩＭ９−ＩｇＧ
▲：ＣＬＮ−ＩｇＧ
Claims (4)
- ヒトモノクローナル抗体又はその断片をヒトビメンチン又は少なくともヒトビメンチンのアミノ酸配列残基番号２４６〜３７２の領域を含むヒトビメンチン断片と接触させ、ヒトビメンチンのアミノ酸配列のアミノ酸残基番号２４６〜３７２の領域と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体又はその断片を選択することを特徴とする癌細胞増殖抑制活性を有するヒトモノクローナル抗体又はその断片の取得方法。
- 請求項１に記載の方法により得られるヒトモノクローナル抗体。
- 請求項１に記載の方法により得られるヒトモノクローナル抗体由来のヒトビメンチンのアミノ酸配列のアミノ酸残基番号２４６〜３７２の領域と特異的に結合する断片。
- ヒトビメンチンのアミノ酸配列のアミノ酸残基番号２４６〜３７２の領域と特異的に結合するヒトモノクローナル抗体又はその断片を有効成分として含有することを特徴とする癌細胞増殖抑制剤。
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