KR20210125847A - 고양이 과립구 집락 자극인자 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

고양이 과립구 집락 자극인자 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 출원은 고양이 과립구 집락 자극인자 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 재조합 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로서, 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 단편; 및 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자를 포함하는 재조합 단백질, 및 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 고양이 범 백혈구 감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

Description

고양이 과립구 집락 자극인자 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도{The fusion protein comprising Feline granulocyte colony-stimulating factor and antigen binding fragments for serum albumin and use thereof}
본 출원은 고양이 과립구 집락 자극인자 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.
국민 소득 수준의 향상과 저출산 및 고령화 현상으로부터 비롯된 1-2인 가구 수의 증가에 따라, 국내외 반려동물 보유 가구의 수는 급격하게 증가하고 있다. 한국펫사료협회가 발표한 ‘반려동물 보유 현황 및 국민 의식 조사 보고(2017)’에 따르면, 우리나라 전체 1,956만 가구 중 563만(28.8%) 가구가 반려동물을 기르는 것으로 보고된 바 있으며, 이들 중 약 109만 가구가 반려묘를 기르는 것으로 추정하고 있다. 또한, KB 금융지주 연구소가 2018년 12월에 발표한 "반려동물 보고서"에 따르면, 우리나라 전체 가구 중 25.1%는 반려동물을 기르고 있으며, 반려동물 양육 가구의 85.6%는 '반려동물은 가족의 일원'으로 인식한다고 보고되었다.
한편, 고양이 범 백혈구 감소증(Feline panleukopenia)은 고양이 파보 바이러스(Feline parvo virus: FPV)에 의해 발병하는 바이러스성 장염으로서, 전염성이 매우 강하고, 치사율이 높아 모든 고양이 종에게 치명적인 질병 중 하나이다. 현재, 상기 고양이 범 백혈구 감소증의 치료법으로는 백혈구 수의 증가시키기 위한 전혈의 수혈 또는 과립구 집락 자극인자(Granulocyte colony stimulating factor: G-CSF)의 투여, 또는 탈수에 의한 패혈증을 방지하기 위한 항생제와 비타민 A, B, C 등을 포함한 수액의 정맥 투여 등이 적용되고 있다. 그러나, 항생제 등을 포함하는 수액의 정맥 투여는 상기 질병의 직접적인 치료법이라 볼 수 없으며, 수혈 방식 역시 충분한 양의 전혈을 확보하는데 어렵다는 문제점이 존재한다. 따라서, 현재 과립구 집락 자극인자(G-CSF)의 투여가 고양이 범 백혈구 감소증의 치료에 널리 통용되고 있으나, 이 역시 치료에 사용되는 재조합 과립구 집락 자극인자는 고양이 유래가 아닌, 인간 유래의 hG-CSF에 대한 것으로서, 이를 장기간 사용할 경우 hG-CSF에 대한 항-약물 항체(anti-drug antibody: ADA)의 생성으로 인해, 약효 또는 치료 효능이 감소될 뿐만 아니라, 급성 면역 반응, 자가면역질환과 같은 심각한 부작용을 유발할 우려가 있다.
또한, 고양이 과립구 집락 자극인자는 고양이 체내에서 분비되는 호르몬 중 하나로서, 체내에 순환하는 혈구의 골수 내 생성을 조절하는 단백질로 알려져 있다. 상기 과립구 집락 자극인자는 구체적으로, 호중구의 증식과 분화를 자극하여 혈중 호중구 수준을 높임으로써, 호중구가 감소하는 기간을 단축시키고, 면역력을 회복하는데 기여한다. 그러나, 상기 단백질의 체내 반감기는 약 4 내지 5시간에 불과하여, 치료 효능을 오랜 기간 유지하기 위해서는 다수 회의 반복 투여가 필요한 실정이다. 이에 따라, 과립구 집락 자극인자에 폴리(알킬렌 글리콜) 유도체와 같은 폴리머를 결합시키는 페길화, 또는 과당화(Hyperglycosylation) 기술 등이 다양하게 활용되고 있으나(한국공개특허 10-2010-0052501), 이 역시 화학적 융합 과정에서 야기되는 단백질 변성 및 이에 따른 면역원성 유발 가능성 등의 문제점을 수반한다.
이러한 기술적 배경 하에서, 고양이 과립구 집락 자극인자를 포함하는 단백질 제제, 구체적으로, 범 백혈구 감소증의 치료용 재조합 융합 단백질 제제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 고양이화 키메릭 항체 단편인 FL355 Fab 항체 단편과 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자를 융합한 재조합 단백질을 제조하였으며, 상기 재조합 단백질의 개선된 약물동태학적 특성 및 치료학적으로 유효한 수준의 백혈구 증가를 확인하고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
일 양상은 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 단편; 및 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자를 포함하는 재조합 단백질을 제공한다.
다른 양상은 재조합 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
다른 양상은 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 고양이 범 백혈구 감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
일 양상은 (a) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 도메인을 포함하며,
상기 중쇄 가변 도메인에 결합된 고양이 유래의 중쇄 불변 1 도메인 및 상기 경쇄 가변 도메인에 결합된 고양이 유래의 경쇄 불변 도메인 포함하는, 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 단편;
(b) 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자(Feline granulocyte colony-stimulating factor); 및
(c) 상기 항원 결합 단편과 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자를 연결하는 링커를 포함하는 재조합 단백질로서,
상기 중쇄 불변 1 도메인 내 경쇄와 중쇄 도메인의 이황화 결합에 사용되는 아미노산인 시스테인, 경쇄 불변 도메인 내 경쇄와 중쇄 도메인의 이황화 결합에 사용되는 아미노산인 시스테인, 또는 중쇄 불변 1 도메인 내 경쇄와 중쇄 도메인의 이황화 결합에 사용되는 아미노산인 시스테인 및 경쇄 불변 도메인 내 경쇄와 중쇄 테인은 보존 또는 결실되거나 시스테인외의 다른 아미노산 잔기로 치환된 것인, 재조합 단백질을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "중쇄(Heavy Chain: HC 또는 CH)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역(Variable Region: VR) 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3 개의 불변영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3을 포함하는 전체길이 중쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "경쇄(Light Chain: LC 또는 CL)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변영역 도메인 CL을 포함하는 전체길이 경쇄 및 이의 단편을 모두 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 알부민에 결합하는 항원 결합 단편은 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 도메인과 상기 도메인에 결합된 고양이 유래의 중쇄 불변 1 도메인; 및 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 도메인과 상기 도메인에 결합된 고양이 유래의 경쇄 불변 도메인으로 이루어져 키메릭화된 것일 수 있다.
상기 고양이 유래의 중쇄 불변 1 도메인 및 고양이 유래의 경쇄 불변 도메인은 IgG1 항체 불변 도메인으로부터 유래한 것일 수 있고, 이들 중 어느 하나 이상은 경쇄와 중쇄 도메인의 이황화 결합에 사용되는 아미노산인 시스테인이 보존 또는 결실되거나 시스테인외의 다른 아미노산 잔기로 치환된 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 고양이 유래의 중쇄 불변 1 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 고양이 유래의 경쇄 불변 도메인은 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 상기와 같은 도메인 내 시스테인의 결실 또는 치환은, 하기 언급되는 재조합 단백질의 생산 과정에서, 형질전환된 세포 내 재조합 단백질의 발현 수준을 향상시키는데 기여할 수 있다.
상기 알부민에 결합하는 항원 결합 단편은 서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄; 및 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어진 것일 수 있다.
상기 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자는 돌연변이되지 않은 자연형 단백질일 수 있고, 이는 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/와 같은 기 공개된 데이터베이스로부터 수득할 수 있고, 예를 들어, 서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 상기 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자는 상기 자연형 과립구 집락 자극인자에서 자유 시스테인기 및 O-당쇄가 제거되도록 변형된 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기와 같은 자유 시스테인기 및 O-당쇄의 제거는 재조합 단백질의 생산, 분리, 및 정제 공정의 용이성을 제공할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 단편과 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자는 링커를 통해 연결되어 있을 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는 항원 결합 단편의 중쇄 불변 1 도메인의 C 말단, 중쇄 가변 도메인의 N 말단, 경쇄 불변 도메인의 C 말단, 및 경쇄 가변 도메인의 N 말단으로부터 선택된 어느 하나의 영역과 상기 과립구 집락 자극인자를 연결하는 것일 수 있다. 또한, 상기 링커는 필요에 따라, 적의 변경하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 링커는, 5 내지 400개, 5 내지 200개, 또는 5 내지 200개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드일 수 있다. 상기 펩티드 링커는 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩티드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있다. 또한 기능적 일부분 사이의 적절한 분리를 달성하기 위하여 또는 필수적인 내부-일부분(inter-moiety)의 상호작용을 유지하기 위한　링커의 최적화를 고려하여 카피 수 "n"을 조절할 수 있다. 해당 기술분야에서 다른 링커들이 알려져 있는데, 예를 들어 수용성을 향상시키기 위하여 극성 아미노산 잔기를 추가하는 것뿐만 아니라 유연성을 유지하기 위하여 T 및 A와 같은 아미노산 잔기를 추가한 G 및 S　링커가 있을 수 있다. 따라서, 상기　링커는 G, S, 및/또는 T, A 잔기를 포함하는 유연성　링커일 수 있다. 상기　링커는 (GpSs)n 및 (SpGs)n으로부터 선택되는 일반식을 가질 수 있고, 이 경우, 독립적으로, p는 1 내지 10의 정수이고, s = 0 내지 10의 0 또는 정수이고, p + s는 20 이하의 정수이고, 및 n은 1 내지 20의 정수이다. 더욱 구체적으로 링커의 예는 (GGGGS)n, (SGGGG)n, (SRSSG)n, (SGSSC)n, (GKSSGSGSESKS)n, (RPPPPC)n, (SSPPPPC)n, (GSTSGSGKSSEGKG)n, (GSTSGSGKSSEGSGSTKG)n,　(GSTSGSGKPGSGEGSTKG)n, 또는 (EGKSSGSGSESKEF)n이고, 상기 n은 1 내지 20, 또는 1 내지 10의 정수일 수 있다. 또한, 상기 링커는 서열번호 20 또는 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에서, 재조합 단백질은 고양이 혈청 알부민과 결합하는 중쇄 가변 도메인과 고양이 유래의 중쇄 불변 1 도메인이 결합된 항원 결합 단편과, 상기 고양이 유래의 중쇄 불변 1 도메인의 N 말단에 결합된 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자를 포함하는 중쇄 재조합 단백질; 및 고양이 혈청 알부민과 결합하는 경쇄 가변 도메인와 고양이 유래의 경쇄 불변 도메인이 결합된 항원 결합 단편의 조합으로 이루어질 수 있다. 여기서, 상기 중쇄 재조합 단백질은 서열번호 22 또는 23의 아미노산 서열로 이루어질 수 있고, 상기 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원 결합 단편은 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 상기의 재조합 단백질은 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자의 고유의 생물학적 활성을 유지하면서도, 약물동태학적 특성을 유의적으로 개선시킨 것일 수 있다.
일 실시예에 따르면, 고양이 유래의 중쇄 불변 1 도메인 및 경쇄 불변 도메인이 각각 결합된 고양이 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 단편; 및 상기 고양이 유래의 중쇄 불변 1 도메인에 융합된 돌연변이형 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자를 포함하는, 재조합 단백질(APB-F1)을 제조하였으며, 상기의 재조합 단백질은 각각의 인자들이 갖는 생물학적 활성을 유지한 채, 높은 수율로 수득됨을 확인하였다.
다른 양상은 상기 재조합 단백질을 코딩하는 핵산, 상기 핵산을 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
상기 핵산, 발현 벡터, 및 형질전환된 세포는 전술한 재조합 단백질, 또는 재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 그대로 포함하거나, 이를 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 기재를 생략한다.
예를 들어, 일 양상으로서, 재조합 단백질을 코딩하는 핵산을 분리하여 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 핵산을 분리하고, 이를 복제 가능한 벡터 내로 삽입하여 추가로 클로닝하거나 (DNA의 증폭) 또는 추가로 발현시킨다. 이를 바탕으로, 다른 관점에서 상기 핵산을 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "핵산"은 DNA(gDNA 및 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산에서 기본 구성단위인 뉴클레오티드는 자연의 뉴클레오티드 뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함한다.
상기 핵산은 상기 뉴클레오티드 서열에 대하여 실질적인 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 실질적인 동일성은 본 발명의 뉴클레오티드 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인 된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 의미한다.
상기 재조합 단백질을 암호화하는 DNA는 통상적인 과정을 사용하여 (예를 들어, 재조합 단백질을 암호화하는 DNA와 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써) 용이하게 분리 또는 합성한다. 많은 벡터가 입수 가능하다. 벡터 성분에는 일반적으로, 다음 중의 하나 이상이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다: 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유 전자, 증강인자 요소, 프로모터, 및 전사 종결 서열.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 숙주세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단으로 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 박테리오파지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스벡터 같은 바이러스벡터 등을 포함한다. 상기 벡터에서 재조합 단백질을 코딩하는 핵산은 프로모터와 작동적으로 연결되어 있다.
"작동적으로 연결"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.
원핵세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pLλ 프로모터, pRλ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로모터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 또한, 예를 들어, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터, β-액틴 프로모터, 사람 헤로글로빈 프로모터 및 사람 근육 크레아틴 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40프로모터, 사이토메갈로 바이러스(CMV) 프로모터, HSV의 tk 프로모터, 마우스 유방종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, 몰로니 바이러스의 프로모터엡스타인바 바이러스(EBV)의 프로모터 및 로우스 사코마 바이러스(RSV)의 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다. 경우에 따라서, 벡터는 그로부터 발현되는 재조합 단백질의 정제를 용이하게 하기 위하여 다른 서열과 융합될 수도 있다. 융합되는 서열은, 예컨대 글루타티온 S-트랜스퍼라제(Pharmacia, USA), 말토스 결합 단백질(NEB, USA), FLAG(IBI, USA) 및 6xHis(hexahistidine; Quiagen, USA) 등이 있다. 상기 벡터는 선택표지로서 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성유전자가 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 언급된 벡터로 형질전환된 세포에 관한 것이다. 본 발명의 재조합 단백질을 생성시키기 위해 사용된 세포는 원핵생물, 효모 또는 고등 진핵생물 세포일 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다. 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas)(예를 들면, 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 스타필로코쿠스(Staphylococcus)(예를 들면, 스타필로코쿠스 카르노수스(Staphylocus carnosus))와 같은 원핵 숙주세포를 이용할 수 있다. 다만, 동물 세포에 대한 관심이 가장 크며, 유용한 숙주 세포주의 예는 COS-7, BHK, CHO (GS null CHO-K1), CHOK1, DXB-11, DG-44, CHO/-DHFR, CV1, COS-7, HEK293, BHK, TM4, VERO, HELA, MDCK, BRL 3A, W138, Hep G2, SK-Hep, MMT, TRI, MRC 5, FS4, 3T3, RIN, A549, PC12, K562, PER.C6, SP2/0, NS-0, U20S, 또는 HT1080일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “형질전환”은, 본래의 세포가 가지고 있던 것과 다른 종류의 외래 유전자가 있는 DNA사슬 조각 또는 플라스미드가 세포들 사이에 침투되어 원래 세포에 존재하던 DNA와 결합함으로써 세포의 유전형질을 변화시키는 분자생물학적 기술을 의미한다. 상기 형질전환은 상기 재조합 단백질 유전자를 포함하는 발현 벡터가 숙주 세포로 삽입되는 것을 의미할 수 있다.
다른 양상은 (a) 상기 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양된 세포에서 재조합 단백질을 회수하는 단계를 포함하는 상기 재조합 단백질의 제조방법에 관한 것이다. 상기 세포는 각종 배지에서 배양할 수 있다. 시판용 배지 중 제한없이 배양 배지로서 사용할 수 있다. 당업자에게 공지되어 있는 기타 모든 필수 보충물이 적당한 농도로 포함될 수도 있다. 배양 조건, 예를 들어 온도, pH 등이 발현을 위해 선별된 숙주 세포와 함께 이미 사용되고 있고, 이는 당업자에게 명백할 것이다. 상기 재조합 단백질의 회수는 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 불순물을 제거하고, 그 결과물을 예를 들어 친화 크로마토그래피 등을 이용하여 정제할 수 있다. 추가의 기타 정제 기술 예를 들어 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호 작용 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피 등이 사용될 수 있다.
다른 양상은 상기 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 고양이 범 백혈구 감소증(Feline panleukopenia)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물; 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 고양이 범 백혈구 감소증을 치료하는 방법; 및 고양이 범 백혈구 감소증의 예방 또는 치료를 위한 상기 재조합 단백질의 의약적 용도를 제공한다.
예를 들어, 일 양상은 (a) 상기 재조합 단백질의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 고양이 범 백혈구 감소증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 전술한 재조합 단백질을 유효성분으로 이용하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 기재를 생략한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "예방"은 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 고양이 범 백혈구 감소증을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "치료"는 상기 약학적 조성물의 투여에 의해 고양이 범 백혈구 감소증에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "개체"는 고양이 범 백혈구 감소증의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하며, 보다 구체적으로, 고양이과 동물을 의미하는 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인 "고양이 범 백혈구 감소증"은 혈변, 설사, 심한 탈수, 영양 실조 등과 같은 임상적 증상과 함께, 백혈구의 현저한 감소를 특징으로 질병으로서, 전염성이 매우 강하고, 치사율이 높아 모든 고양이 종에게 치명적인 질병 중 하나이다. 상기 고양이 범 백혈구 감소증은 고양이 파보 바이러스(Feline parvo virus: FPV)의 감염에 의해 발생하는 것일 수 있다. 상기 질병의 치료법으로 과립구 집락 자극인자(G-CSF)의 투여가 널리 통용되고 있으나, 항-약물 항체(anti-drug antibody: ADA)의 생성 등으로 인한 치료적 한계가 있다.
일 실시예에 따르면, 고양이화 키메릭 항체 단편인 FL355 Fab 항체 단편과 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자를 융합한 재조합 단백질(APB-F1)은, 고양이 체내 반감기가 약 13.3시간으로서, 2.7시간을 나타낸 fG-CSF에 비해 약 4.9배 증가되었으며, 상기 재조합 단백질의 투여에 의한 혈중 림프구 및 호중구 수치의 증가는 각각 투여 후 20일째, 및 11일째까지 지속됨을 확인하였다. 따라서, 일 양상에 따른 재조합 단백질은 고양이 범 백혈구 감소증의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있음을 확인하였다.
일 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자와 비교하여, 체내 반감기가 3 내지 20배 증가된 것일 수 있다. 상기 체내 반감기는 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자와 비교하여, 예를 들어, 3.5 내지 6.0배, 4.0 내지 6.0배, 4.5 내지 6.0배, 5.0 내지 6.0배, 5.5 내지 6.0배, 3.0 내지 5.5배, 3.5 내지 5.5배, 4.0 내지 5.5배, 4.5 내지 5.5배, 5.0 내지 5.5배, 3.0 내지 5.0배, 3.5 내지 5.0배, 4.0 내지 5.0배, 4.5 내지 5.0배, 3.0 내지 4.5배, 3.5 내지 4.5배, 또는 4.0 내지 4.5배 증가된 것일 수 있다. 또한, 상기 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자의 체내 반감기는 일 실시예에 따른 돌연변이형 fG-CSF을 피하 주사한 후 평가한 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 약학적 조성물은 혈중 백혈구 수준을 증가시키는 것일 수 있으며, 예를 들어, 상기 백혈구는 호중구, 단핵구, 호염기구 또는 이의 조합인 것일 수 있다. 상기 백혈구 수준의 증가는 투여 후 20일째까지, 예를 들어, 투여 후 15일째, 투여 후 12일째, 투여 후 10일째, 투여 후 8일째, 투여 후 7일째까지 지속 및 유지되는 것일 수 있다.
상기 약학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 바람직하게는 비경구 투여일 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장 내 투여 등으로 투여할 수 있다. 일 실시예에서, 피하 주사 형태로 투여되는 것일 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.
상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 명세서에 있어서, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 일 양상에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료 약물과 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료 약물과 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 고양이 범 백혈구 감소증을 예방 또는 치료하는 데 충분한 양을 의미한다.
상기 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이 때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 좌제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 단편; 및 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자를 포함하는 재조합 단백질은, 체내 반감기 증가를 포함하는 개선된 약물동태학적 특성을 지니며, 치료학적으로 유효한 수준의 혈중 백혈구 증가 효과를 지속적으로 나타낼 수 있다.
따라서, 일 양상에 따른 재조합 단백질은 고양이 범 백혈구 감소증의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다.
도 1은 인간 항-혈청 알부민 Fab 항체 단편의 키메릭 항체, FL335의 발현 벡터를 나타낸 것으로서, 도 1의 A는 FL335 Fd pd2535NT 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이고, 도 1의 B는 APB-F1 L pd2539 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 2는 고양이 혈청 알부민의 발현 벡터로서, Feline serum albumin pJK-dhfr 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 3은 자연형 fG-CSF의 발현 벡터로서, Feline G-CSF pd2535NT 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이다.
도 4는 FL335 및 feline G-CSF의 융합 단백질인 APB-F1의 발현 벡터로서, 도 4의 A는 APB-F1 (v1, v2) Fd pd2535NT 벡터의 개열 지도를 나타낸 것이고, 도 4의 B는 APB-F1 L pd2539 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.
도 5는 FL335의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 6은 일 실시예에 따른 발현 및 정제 과정 후, 배양액 내 FL335 Fd, L 및 고양이 혈청 알부민을 확인한 것으로서, 도 6의 A는 FL335를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이고, 도 6의 B는 고양이 혈청 알부민을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이다.
도 7은 혈청 알부민에 대한 FL335의 결합 능력을 확인한 것으로서, 도 7의 A는 인간 및 고양이 혈청 알부민과 SL335간 결합 능력을 ELISA를 통해 확인한 결과이고, 도 7의 B는 인간 및 고양이 혈청 알부민과 FL335간 결합 능력을 ELISA를 통해 확인한 결과이다.
도 8은 일 실시예에 따른 발현 및 정제 과정 후, 배양액 내 자연형 fG-CSF와 돌연변이형 fG-CSF를 확인한 것으로서, 도 8의 A는 자연형 fG-CSF를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이고, 도 8의 B는 돌연변이형 fG-CSF를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이다.
도 9는 APB-F1의 구조를 개략적으로 나타낸 것이다.
도 10은 일 실시예에 따른 발현 및 정제 과정 후, 배양액 내 APB-F1을 확인한 것으로서, 도 10의 A는 APB-F1(v1)을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이고, 도 10의 B는 APB-F1(v2)을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이다.
도 11은 일 실시예에 따른 발현 및 정제 과정 후, APB-F1 시료의 순도를 확인한 것으로서, 도 11의 A는 APB-F1(v1) 시료에 대한 SEC-HPLC 분석 결과이고, 도 11의 B는 APB-F1(v2) 시료에 대한 SEC-HPLC 분석 결과이다.
도 12는 M-NFS60 세포를 대상으로 실시한 APB-F1의 세포 증식 어세이 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 APB-F1의 분자량을 원형 질량 분석을 통하여 확인한 것으로서, 도 13의 A는 APB-F1 Fd의 질량을 확인한 결과이고, 도 13의 B는 APB-F1 L의 질량을 확인한 결과이다.
도 14는 APB-F1 Fd의 N-말단 서열에 대한 LC-MS/MS 분석 결과를 MASCOT 소프트웨어를 이용하여 나타낸 것이다.
도 15는 고양이를 대상으로 APB-F1의 약물동태학적 평가를 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 고양이를 대상으로 APB-F1의 약력학적 평가를 실시한 결과를 나타낸 것으로서, 혈중 백혈구의 수치를 확인한 결과이다.
도 17은 고양이를 대상으로 APB-F1의 약력학적 평가를 실시한 결과를 나타낸 것으로서, 혈중 호중구의 수치를 확인한 결과이다.
도 18은 고양이를 대상으로 APB-F1의 약력학적 평가를 실시한 결과를 나타낸 것으로서, 혈중 단핵구의 수치를 확인한 결과이다.
도 19는 고양이를 대상으로 APB-F1의 약력학적 평가를 실시한 결과를 나타낸 것으로서, 혈중 호염기구의 수치를 확인한 결과이다.
도 20은 고양이를 대상으로 APB-F1의 약력학적 평가를 실시한 결과를 나타낸 것으로서, 혈중 림프구의 수치를 확인한 결과이다.
도 21은 고양이를 대상으로 APB-F1의 약력학적 평가를 실시한 결과를 나타낸 것으로서, 혈중 호산구의 수치를 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<제조예>
제조예 1. 발현 벡터의 제조
모든 DNA 클로닝 실험은 표준 절차에 따라 진행하였다. Feline IgG CH1(delta C, IMGT AB016710 IGHG1*01, Felis catus, CH1), Feline CL kappa(delta C, IMGT000050 IGKC*01, Felis catus, C-region), 고양이 혈청 알부민(FSA, UniProtKB P49064), 고양이 과립구 집락 자극인자(fG-CSF, UniProtKB Q9GJU0)), 및 APB-F1(v2) (FL335Fd+mutant fG-CSF) 유전자는 ㈜ 코스모진텍(South Korea)으로부터 수득하였다. 또한, 중합 효소 연쇄 반응(Polymerase chain reaction, PCR)에서, 중합효소로는 pyrobest DNA polymerase (Takara, Japan)를 사용하였고, PCR은 T100 Thermal 사이클러(Bio-Rad, Hercules, Caligornia) 기계를 이용하여 수행하였다. 또한, T4 DNA ligase (NEB Bio Lab, Ipswich, Massachusetts)를 사용하여 유전자를 발현 벡터로 삽입하였다. 한편, 프라이머에 대한 서열 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
Primer
No. 		올리고뉴클레오티드 서열 (5′- 3′) 서열번호
1 gatcaactct agagccacca tggagtggtc ctgggtc 25
2 tgagctgact gtgaccagag tg 26
3 ggtcacagtc agctcagctt ctaccaccgc accttc 27
4 aggaagacgc ttttagaggc ggccgctcag tcggttcggt ccactgtttt atcgac 28
5 gacatcgtcc tgacccagag ccccg 29
6 ccgcttgatc tccagctggg tgcc 30
7 cagctggaga tcaagcggag tgacgcacaa ccttctg 31
8 aggaagacgc ttttagagct actccctctg ggactcgctc cgattaaa 32
9 accaccggag tgctttccac ccccctggga ccaacctcca gcctgcccca gtcc 33
10 atcggcggcc gcgaagacgc ttttagatca gtggtggtgg tgatggtggt ggtgcccagg 34
11 gcgtgaccac cggagtgctt tccgcaaccc cactgggacc aaccagttc 35
12 atcggcggcc gcgaagacgc ttttagatca gtggtggtgg tgatggtggt ggtgccctgg cttggtaaag tggcgaagag cccg 36
13 cttggagcca gaggcaagac agaag 37
14 cttctgtctt gcctctggct ccaag 38
15 aggaagacgc ttttagaggc ggccgctcaa gg 39
(1) FL335 발현 벡터의 제조
인간 항-혈청 알부민 Fab 항체 단편 'SL335'의 키메릭 항체 단편인 'FL335'를 제작하기 위하여, SL335 Fab 항체 단편의 가변 부위인, VH 유전자의 증폭은 프라이머 1, 및 2를 사용한 5℃ 30초, 60℃ 20초, 72℃, 50초 30 사이클 조건의 PCR을 통해 진행되었다. 또한, VL 유전자의 증폭에 대해서도 프라이머 5 및 6을 사용하여, 상기와 동일한 조건의 PCR이 진행되었다. 또한, SL335 VH 유전자와 고양이 IgG CH1에 대하여, 프라이머 1, 및 4를 사용하여 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃, 1분, 30 사이클의 조건으로 linking PCR을 진행함으로써, 키메릭 Fd(VH+CH1) 유전자를 제작하였다. 아울러, SL335 VL 유전자와 고양이 경쇄(kappa) CL에 대하여, 프라이머 5, 및 8을 사용하여, 상기와 동일한 조건으로 linking PCR을 수행하여 키메릭 L(VL+CLk) 유전자를 획득하였다.
이후, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 키메릭 Fd 유전자를 BbsⅠ(Takara, Japan) 제한 효소로 처리한 후, 발현 벡터 pd2535nt(ATUM, Newark, California)에 삽입하여 FL335 Fd pd2535NT 벡터를 제조하였고, 상기 키메릭 L 유전자를 BbsⅠ, 및 BsrGⅠ(Takara, Japan) 제한 효소로 처리한 후 발현 벡터 pd2539(ATUM, Newark, California)에 삽입하여 APB-F1 L pd2539 벡터를 제조하였다.
(2) 고양이 혈청 알부민 또는 자연형 고양이 과립구 집락 자극인자 발현 벡터의 제조
도 2에 나타낸 바와 같이, 고양이 혈청 알부민 유전자를 EcoRⅠ(Takara, Japan), 및 ApaⅠ(Takara, Japan) 제한효소로 처리한 후, pJK 발현 벡터에 삽입하여 Feline serum albumin pJK-dhfr 벡터를 제조하였다. 또한, 도 3에 나타낸 바와 같이, 자연형 fG-CSF 유전자에 대하여, 프라이머 1, 9, 및 10을 사용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 진행함으로써, fG-CSF의 N-말단에 myc tag를, C-말단에 His tag를 연결하였으며, 이를 Bbs Ⅰ 제한 효소로 처리한 후, 발현 벡터 pd2535nt에 삽입하여 Feline G-CSF pd2535NT 벡터를 제조하였다.
(3) APB-F1 발현 벡터의 제조
APB-F1은 두 가지 버전, APB-F(v1) 및 APB-F(v2)으로 제작하였다. 구체적으로, APB-F(v1)은 O-당쇄가 있는 자연형 fG-CSF가 FL335에 융합된 형태이며, APB-F(v2)는 APB-F(v1)에서 자유 시스테인기(C17S)와 O-당쇄가 제거된(T133A), 돌연변이형 fG-CSF가 FL335에 융합된 형태이다.
APB-F(v1) Fd를 제조하기 위하여, 자연형 fG-CSF를 주형으로 프라이머 14, 및 15를 사용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 진행하여 링커 서열(GSAGSAPAPAGSGEF)이 일부 포함된 자연형 fG-CSF 유전자를 획득하였고, FL335 Fd 유전자를 주형으로 프라이머 1, 및 2를 이용하여 PCR을 진행하여 상기 링커 서열이 일부 포함된 FL335 Fd 유전자를 제작했다. 이후, 제작된 자연형 f-GCSF와 FL335 Fd 유전자를 주형으로 프라이머 1, 및 15를 사용하여 상기와 동일한 조건으로 linking PCR을 진행함으로써, APB-F(v1) Fd(FL335 Fd - GSAGSAPAPAGSGEF - 자연형 fG-CSF) 유전자를 제작하였다. 이후, 도 4의 A에 나타낸 바와 같이, 상기 제작된 유전자를 BbsⅠ 제한효소로 처리한 후, pd2535nt 발현 벡터에 삽입하여 APB-F1(v1) Fd pd2535NT 벡터를 제조하였다. 한편, 도 4의 B에 나타낸 바와 같이, APB-F1의 경쇄는 pd2539 발현 벡터에 삽입되어 있는 FL335의 경쇄를 사용하였다.
또한, APB-F(v2) Fd를 제조하기 위하여, 이와 동일한 방식으로, 프라이머 1, 11, 및 12를 사용하여 통해 fG-CSF의 C-말단에 His tag를 연결하고, APB-F(v2) Fd(FL335 Fd - GGGGSGGGGS- 돌연변이형 fG-CSF) 유전자를 합성하여 제작하였으며, 상기와 마찬가지로, 도 4의 A에 나타낸 바와 같이, 상기 제작된 유전자를 BbsⅠ 제한 효소로 처리한 후, pd2535nt 발현 벡터에 삽입하여 APB-F1(v2) Fd pd2535NT 벡터를 제조하였다.
이후, CHO 세포 형질전환을 위한 유전자를 다량 획득하기 위하여, DH5α 세포(RBC royal bank, Canada)와 유전자가 섞인 혼합물에 42℃, 45초간 열 충격을 가하여 세포로 plasmid DNA를 삽입하였고, 이후, DNA prep kit(GeneAll, South Korea)을 사용하여 plasmid DNA를 수득하였다.
제조예 2. 재조합 단백질의 일시적 발현 시스템 구축
FL335 Fab, 고양이 혈청 알부민, 자연형 fG-CSF, APB-F1(v1), 및 APB-F1(v2) 등의 단백질 발현을 위하여, 본 실험에서는 ExpiCHO Expression System을 이용하였다. 구체적으로, ExpiCHO-STM 세포(ThermoFhisher scientific)는 ExpiCHO expression media(Gibco, ThermoFisher scientific)를 사용하여, 37℃, 5% CO2, 140 rpm 조건으로 Erlenmeyer flasks에서 배양되었다. 이후, 상기 10 ㎕의 세포 배양액과 10 ㎕의 trypan blue를 혼합한 뒤, 10 ㎕의 혼합물을 cell counting chamber slides에 첨가한 뒤, 이에 따른 세포 수 및 세포 생존율 변화를 Countess Ⅱ Automated Cell Counter(Invitrogen) 기계를 사용하여 측정하였다. 이후, 상기 제조예 1에서 제작된 발현 벡터를 이용한 세포의 형질전환은 OptiPRO SFM medium(ThermoFisher scientific)과 ExpiFectamine™ CHO reagent(ExpiFectamine™ CHO Transfection Kit)를 사용하여 수행되었다. 형질전환시킨 시점(day 0)으로부터 18-22 시간째, 배양 배지에 ExpiFectamine?? CHO Enhancer와 ExpiCHO?? Feed를 첨가하고, 세포 농도가 2 x 106 cells/mL이 되었을 때 배양 조건을 32℃, 5% CO2, 140 rpm으로 변경하여 형질전환된 세포를 배양하였다. 형질전환시킨 시점으로부터 5일째, 배양 배지에 ExpiCHO?? Feed를 추가로 첨가하고, 세포 생존율이 80%에 이를 때까지 세포를 배양한 후, 형질전환된 세포를 포함하는 배양액을 회수하였다.
회수한 배양액 내 단백질 발현 양상과 발현 수준은 western blot을 통하여 확인하였다. 우선, 단백질 시료를 4-15% 구배 겔에 1 ㎍/well로 로딩한 후, 150V에서 50분간 전기영동하였다. 이후, 니트로셀룰로오스 트랜스퍼 멤브레인에 transfer buffer(Tris base, glycine, SDS, 20% methanol)를 사용하여 constant 400mA, 60분간 해당 단백질을 transfer하였다. 이후, 단백질의 transfer가 완료된 멤브레인에 pH 7의 3% skim milk 용액을 첨가한 후, 이를 상온에서 shaking 하여 1시간 blocking 하였고, wash buffer (0.1% tween in 1x PBS)로 shaking 하면서 세척하였다. 이후, 검출 항체를 pH 7의 3% skim milk 용액에 희석한 뒤, 이를 상기 blocking된 멤브레인과 상온에서 1시간 반응시켰다. 각각의 단백질에 대하여 사용된 검출 항체는 다음과 같다. APB-F1(v1, v2)과 fG-CSF(자연형, 돌연변이형)에 대하여, rabbit anti-Fe GCSF pAb(1st Ab)(Aprilbio, South Korea) 그리고 donkey anti-rabbit IgG(H+L) HRP (2nd Ab)(Jackson Immuno Research, West Grove, Pennsylvania)를 사용하였으며, FL335 Fab에 대하여, 1st Ab goat anti-cat light chain Ab(Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) 2nd Ab goat IgG-Fc fragment cross antibody antobody(Bethyl) 또는 1st Ab goat anti-Cat F(ab)2-biotin(Jackson Immuno Research, Bar Harbor, Maine), 2nd Streptavidin-HRP(GE Healthcare, Illinois, Chicago)를 사용하였고, 마지막으로 FSA에 대하여, anti-His Tag HRP(BioLegend, Sandiego, California)를 사용하였다. 이후, 상기 membrane을 wash buffer로 세척한 뒤, 여기에 1 mL의 TMB(Surmodics, Eden prairie, Minnesota)를 첨가하여 1-5분간 기질 반응을 진행하였다. 이후, 여기에 3차 증류수를 첨가하여 기질 반응을 종료시키고, TMB와 3차 증류수가 섞인 혼합액을 버린 뒤, 단백질의 발현 양상과 발현 수준을 확인하였다.
제조예 3. 재조합 단백질의 생산을 위한 안정화 세포주의 제작
FL335 Fab, 자연형 fG-CSF, APB-F1(v1), APB-F1(v2) 등을 생산하는 안정화 세포주를 제작하기 위하여, GS null CHO-K1 세포(HD-BIOP3 cells, Horizon Discovery, UK, Cambridge)를 사용하였으며, DNA 클로닝에서 제작된 유전자를 사용하여 stable 형질전환을 아래와 같이 수행하였다. 기본 배지와 생산 배지로는 CD FortiCHOTM Media (Life technologies, Carlsbad, California)를 사용하였고 37℃, 5% CO2, 125 rpm 조건에서 Erlenmeyer flasks(Corning)를 사용하여 계대 배양하였다. 이후, 상기 10 ㎕의 세포 배양액과 10 ㎕의 trypan blue를 혼합한 뒤, 10 ㎕의 혼합물을 cell counting chamber slides에 첨가한 뒤, 이에 따른 세포 수 및 세포 생존율 변화를 Countess Ⅱ Automated Cell Counter(Invitrogen) 기계를 사용하여 측정하였다. GS null CHO-K1세포로의 형질전환을 위하여, 600 ㎕의 OptiPRO SFM medium이 포함된 2개의 tube를 준비한 뒤, 어느 하나에 37.5 ㎍의 plasmid DNA를 첨가하고, 다른 하나에는 37.5 ㎕의 Freestyle™ Max reagent (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific)를 첨가하였다. 이후, 상기 2개의 tube를 조심스럽게 흔들며 섞은 후 5분간 상온에서 인큐베이팅하였다. 이후, Freestyle™ Max reagent가 포함된 SFM medium을 plasmid DNA가 포함된 tube로 옮겨 담고, 조심스럽게 흔들며 섞은 후 20-25 분간 상온에서 반응시켰다. 이후, 상기 혼합물을 GS null CHO-K1 세포에 조심스럽게 분주하고, 이를 37℃, 5% CO2, 125 rpm 조건에서 배양하였다. 이로부터 2일 경과 후, 배양 배지를 glutamine이 첨가되지 않은 CD FortiCHOTM Media으로 교체한 뒤, 50M의 L-Methionine sulfoximine, 10 ㎍/mL의 puromycin을 사용하여 pool selection을 진행하였다.
안정화 세포주의 Pool selection을 완료 후, 각각의 세포주에서 재조합 단백질의 생산성을 확인하기 위하여 ELISA를 진행하였다. APB-F1 (v1, v2), FL335의 포획 항원(capture Ag)으로 인간 혈청 알부민(Sigma Aldrich, Saint Louis, Missouris)을 사용하였으며, fG-CSF (자연형, 돌연변이형)의 포획 항원으로는 Rat anti-Human G-CSF Ab (SouthenBiotech, Canada)을 사용하였다. 각 시료에 대한 100 ㎕의 포획 항원을 1 ㎍/mL의 농도로 MaxiSorp NUNC Immuno ELISA plate (Thermo Fisher, Waltham, Massachusetts)에 첨가한 후, 이를 4℃에서 밤새도록 배양함으로써, 포획 항원을 플레이트 상에 코팅시켰다. 이후, 3% bovine serum albumin(BSA)이 포함된 PBST [0.1% (v/v) Tween(Thermo Fisher)가 포함된 phosphate buffered saline(PBS)]를 각 웰에 300 ㎕씩 첨가하여 상온에서 3시간 blocking 하고, 각 웰에 wash buffer (PBST 0.1%)를 300 ㎕씩 분주하여 세척하였으며, 이러한 과정을 3회 반복 수행하였다. 시료 및 항체 희석 용액으로 0.3% PBA(in PBST 0.1%)를 사용하였으며 희석 용액으로 희석한 시료를 각 웰에 100 ㎕씩 분주하여, 상온에서 1시간 반응시켰다. 위와 같은 방법으로 3회 세척한 뒤, 검출 항체를 100 ㎕/well씩 분주하여 상온에서 1시간 반응시켰다. 여기서, APB-F1(v1, v2), fG-CSF의 검출 항체로 rabbit anti-Fe GCSF pAb(1st Ab)(Aprilbio)와 donkey anti-rabbit IgG(H+L) HRP(Jackson Immuno Research, West Grove, Pennsylvania)을 사용하였으며, FL335의 검출 항체로 Goat anti-Cat IgG(H+L)-HRP을 사용하였다.
또한, 각각의 정제된 단백질을 표준물질로 하여, 이들의 생산량을 측정하였다. 구체적으로, 결합 시그널은 3,3’,5,5’-tetramethyl benzidine(TMB) 기질을 사용하여 ELISA reader로 absorbance 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
제조예 4. 재조합 단백질의 분리 및 정제
재조합 단백질은 다음의 방법으로 AKTA pure 150 L(GE Healthcare, Illinois, Chicago) 장비를 이용하여 분리 및 정제하였다.
(1) FL335의 분리 및 정제
FL335는 Capto L 레진을 이용한 Affinity chromatography(AC)와 두 단계의 이온교환 크로마토그래피 정제 기법을 이용하여 정제하였다. 우선, CD FortiCHOTM Media를 이용하여 생산한 600ml의 배양액을 냉장 조건에서 4,000 rpm, 20분간 원심분리하여 상층액을 회수하고, 이를 0.2 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 상층액을 준비하였다. 준비된 600 ml의 배양 상층액을 1x PBS 10 컬럼 부피(CVs)로 평형화한 prepacked Capto L 10 ml column에 153 cm/h 유속으로 흘려주어 시료를 결합시킨 후, 1 x PBS 버퍼로 UV 280 nm 10 mAU 이하까지 229 cm/h 유속으로 컬럼을 세척하였다. 컬럼 세척이 완료된 후 단백질 용출 버퍼인 pH 2.5의 50 mM sodium citrate 버퍼를 사용하여 229 cm/h 유속으로, 100%의 용출 버퍼를 흘려주어 UV 280nm 10 mAU 이상의 단백질 용출 분획을 수집하였다. 이후, 수집한 용출 분획에 1M Tris-Cl pH 8.0 용액을 첨가하여 pH를 6.0~6.4으로 약 산성화한 후 0.2 ㎛ 필터로 불순물을 제거하였다. AC 정제로 획득한 시료는 pH 6.4의 20 mM의 Sodium phosphate 버퍼 10 CVs로 평형화한 Hitrap SP FF resin 5ml column에 60 cm/h 유속으로 흘려주어, 시료를 결합시킨 후, pH 6.4의 20 mM sodium phosphate 버퍼로 UV 280nm 10 mAU 이하까지 60 cm/h 유속으로 컬럼을 세척하였다. 컬럼 세척이 완료된 후 단백질 용출 버퍼인 pH 6.4의 20 mM Sodium phosphate, 1M NaCl 버퍼를 사용하여 60 cm/h 유속으로 용출 버퍼 농도단계별 용출을 진행하여 UV 280 nm 10 mAU 이상의 용출 분획을 수집하였다. SDS-PAGE 분석을 이용하여 분리 및 정제 결과를 확인한 후, 후속 정제 단계를 진행하기 위하여, pH 6.4의 20 mM sodium citrate 버퍼를 사용하여 냉장 조건에서 밤새도록(약 16시간) 투석을 진행하였다. pH 6.4의 20 mM sodium citrate 버퍼로 교체된 FL335 시료를 pH 6.4의 20 mM sodium citrate 버퍼 10 CVs로 평형화한 prepacked Hitrap Q FF resin 5 ml column에 60 cm/h 유속으로 흘려 주었고, 이후, 컬럼에 결합하지 않고 통과하는 시료(FT, flow through)를 수집하였다. 이후, SDS-PAGE 분석을 이용하여 정제 결과를 확인한 후, 0.2 ㎛ 필터로 불순물을 제거하고, UV 단백질 정량법을 이용하여 단백질 정량한 후 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.
(2) 고양이 알부민의 분리 및 정제
ExpiCHO Expression System을 이용하여 생산한 고양이 알부민은 immobilized-metal affinity 크로마토그래피(IMAC) 정제 기법을 이용하여 정제하였다. 우선, 100 ml의 ExpiCHO expression media에서 생산한 고양이 알부민이 포함된 배양액을 냉장 조건에서 4,000 rpm, 20분간 원심분리하여 상층액을 회수하고, 이를 0.2 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 상층액을 준비하였다. 준비된 100ml의 배양 상층액을 50 mM sodium phosphate, pH 8.0의 300 mM NaCl 버퍼 10 CVs로 평형화된 prepacked Ni-NTA His·Bind® Resin 5 ml column에 45 cm/h 유속으로 흘려주어 시료를 결합시킨 후, pH 8.0의 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole 버퍼로 UV 280 nm 10 mAU 이하까지 60cm/h 유속으로 컬럼을 세척하였다. 컬럼 세척이 완료된 후 단백질 용출 버퍼인 pH 8.0의 50 mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 500 mM imidazole 버퍼를 사용하여 60cm/h 유속으로, 용출 버퍼 농도 단계별 용출을 진행하여 각 농도별 용출 분획을 수집하였다. SDS-PAGE 분석을 이용하여 분리, 정제 결과를 확인한 후, 냉장 조건에서 밤새도록 pH 7.4의 1x PBS 용액으로 투석하여 0.2 ㎛ 필터로 불순물을 제거하고, UV 단백질 정량법을 이용하여 단백질 정량 후 용 전까지 -20℃에 보관하였다.
(3) 자연형 또는 돌연변이형 fG-CSF의 분리 및 정제
자연형 fG-CSF, 또는 돌연변이형 fG-CSF는 immobilized-metal affinity 크로마토그래피(IMAC) 정제 기법과 두 단계의 이온교환 크로마토그래피 정제 기법을 이용하여 정제하였다. 우선, CD FortiCHOTM Media를 이용하여 생산한 300ml의 배양액을 냉장 조건에서 4,000 rpm, 20분간 원심분리하여 상층액을 회수하고, 이를 0.2 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 상층액을 준비하였다. 준비된 300 ml의 배양 상층액을 pH 7.4의 20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl 버퍼 10 CVs로 평형화된 prepacked Ni-NTA His·Bind® Resin 5 ml column에 45 cm/h 유속으로 흘려주어 시료를 결합시킨 후, pH 7.4의 20mM sodium phosphate, 500mM NaCl, 5mM imidazole 버퍼로 UV 280nm 10mAU 이하까지 60cm/h 유속으로 컬럼을 세척하였다. 컬럼 세척이 완료된 후 단백질 용출 버퍼인 pH 8.0의 50mM sodium phosphate, 300 mM NaCl, 500 mM imidazole 버퍼를 사용하여 60 cm/h 유속으로, 용출 버퍼 농도 단계별 용출을 진행하여 각 농도별 용출 분획을 수집하였다. SDS-PAGE 분석을 이용하여 분리, 정제 결과를 확인한 후, 후속 정제 단계를 진행하기 위하여 pH 5.5의 20 mM sodium citrate 버퍼를 사용하여 냉장 조건에서 밤새도록 투석을 진행하였다. pH 5.5의 20 mM sodium citrate 버퍼로 교체된 fG-CSF 시료를 pH 5.5의 20 mM sodium citrate 버퍼 10 CVs로 평형화한 prepacked Hitrap SP HP 5 ml column에 60cm/h 유속으로 흘려주어 시료를 결합시킨 후, pH 5.5의 20 mM sodium citrate 버퍼로 UV 280 nm 10 mAU 이하까지 60 cm/h 유속으로 컬럼을 세척하였다. 컬럼 세척이 완료된 후 단백질 용출 버퍼인 pH 6.5의 20mM sodium citrate, 1M NaCl 버퍼를 사용하여 60 cm/h 유속으로, 용출 버퍼 농도 단계별 용출을 진행하여 UV 280 nm 10 mAU 이상의 용출 분획을 수집하였다. 이후, SDS-PAGE 분석을 이용하여 분리, 정제 결과를 확인한 후, 후속 정제 단계를 진행하기 위하여 pH 5.5 의 20 mM sodium citrate 버퍼를 사용하여 냉장 조건에서 밤새도록 투석을 진행하였다. pH 5.5의 20 mM sodium citrate 버퍼로 교환된 fG-CSF 시료를 pH 5.5의 20 mM sodium citrate 버퍼 10 CVs로 평형화한 prepacked POROS XQ 5ml column에 60 cm/h 유속으로 흘려 컬럼에 결합하지 않고 통과하는 시료를 수집하였다. 이후, SDS-PAGE 분석을 이용하여 분리, 정제 결과를 확인한 후, 0.2 ㎛ 필터로 불순물을 제거하고, UV 단백질 정량법을 이용하여 단백질 정량 후 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.
(4) APB-F1의 분리 및 정제
APB-F1(v1, v2)은 Capto L 레진을 이용한 Affinity chromatography와 두 단계의 이온교환 크로마토그래피 정제 기법을 이용하여 정제하였다. 우선, CD FortiCHOTM Media를 이용하여 생산한 900ml의 APB-F1(v1, v2) 배양액을 냉장 조건에서 4,000rpm, 20분간 원심분리하여 상층액을 회수하고, 이를 0.2 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 상층액을 준비하였다. 준비된 900ml의 배양 상층액을 1x PBS 10 CVs로 평형화한 prepacked Capto L 34 ml column 에 120 cm/h 유속으로 흘려주어, 시료를 결합시킨 후, pH 6.0의 20 mM sodium citrate, 1% D-mannitol 버퍼로 UV 280nm 10mAU 이하까지 120 cm/h 유속으로 컬럼을 세척하였다. 컬럼 세척이 완료된 후 단백질 용출 버퍼인 pH 3.0의 50 mM sodium citrate, 3% D-mannitol 버퍼를 사용하여 120 cm/h 유속으로 100%의 용출 버퍼를 흘려주어 UV 280 nm 10 mAU 이상의 단백질 용출 분획을 수집하였다. 수집한 용출 분획에 pH 8.0의 1M Tris-Cl 용액을 첨가하여, pH를 6.0으로 약 산성화한 후 0.2 ㎛ 필터로 불순물을 제거하였다. AC 정제로 획득한 시료는 pH 6.0의 20mM sodium citrate 버퍼 10 CVs로 평형화한 CM sepharose FF10ml column에 153 cm/h 유속으로 흘려주어 시료를 결합시킨 후, pH 6.0의 20 mM sodium citrate 버퍼로 UV 280 nm 10 mAU 이하까지 153 cm/h 유속으로 컬럼을 세척하였다. 컬럼 세척이 완료된 후 단백질 용출 버퍼인 pH 6.0의 20 mM sodium citrate, 1M NaCl 버퍼를 사용하여 153 cm/h 유속으로, 용출 버퍼 농도 단계별 용출을 진행하여 UV 280 nm 10 mAU 이상의 용출 분획을 수집하였다. SDS-PAGE 분석을 이용하여 분리 정제 결과를 확인한 후, 후속 정제 단계를 진행하기 위하여 pH 6.0의 20 mM sodium citrate 버퍼를 사용하여 냉장 조건에서 밤새도록 투석을 진행하였다. pH 6.0의 20 mM sodium citrate 버퍼로 교환된 APB-F1(v1, v2) 시료를 pH 6.0의 20 mM sodium citrate 버퍼 10 CVs로 평형화한 prepacked POROS 50HQ 35 ml column에 34cm/h 유속으로 흘려 컬럼에 결합하지 않고 통과하는 시료를 수집하였다. 이후, SDS-PAGE 분석을 이용하여 분리 정제 결과를 확인한 후, 0.2 ㎛ 필터로 불순물을 제거하였다.
제조예 5. SDS-PAGE 분석
본 실험에서 정제된 APB-F1(v1), APB-F1(v2), FSA, FL335 Fab 항체 단편, 자연형 fG-CSF, 및 돌연변이형 fG-CSF 단백질에 대하여, 다음의 조건으로 SDS-PAGE 분석을 진행하였다. 우선, 단백질 시료를 ① 환원 조건 10% glycerol, 1% lithium dodecyl sulfate(LDL), pH 7.6의 0.2 M triethanolamine-Cl, 1% Ficoll®-400, 0.000625% phenol red, 0.000625% coomassie G250, 0.5 mM EDTA disodium, 1.25% 2-Mercaptoethanol, 10 분간 boiling), ② 비-환원 조건(10% glycerol, 1% lithium dodecyl sulfate(LDL), pH 7.6의 0.2 M triethanolamine-Cl, 1% Ficoll®-400, 0.000625% phenol red, 0.000625% coomassie G250, 0.5 mM EDTA disodium, 10 min boiling), ③ 비환원 조건[not boiling](10% glycerol, pH 6.8의 0.375 M triethanolamine-Cl, 0.005% Bromophenol blue, not boiling), 총 3가지 조건으로 처리하였다. 이후, 상기 단백질 시료를 precast 4-15% 구배 겔에 1 ㎍/well 농도로 로딩한 후, constant 150 V, 50분 조건으로 전기영동을 실시하였다. 전기 영동 후 분리한 겔을 Ez-Gel 염색 용액으로 1시간 염색한 후 물로 탈색하였다. 이후, Excelband?? Enhanced 3-color high range protein marker와 비교하는 방식으로 단백질 분석을 실시하였다.
제조예 6. 크기 배제 크로마토그래피
APB-F1(v1, v2)의 순도를 확인하기 위하여 Agilent 1260 Infinity II system을 이용하여 SE-HPLC를 진행하였다. SE-HPLC 컬럼으로는 TSK gel UltraSW aggregate 7.8 ⅹ 300mm (Tosoh Biosciences, Japan) 컬럼을 이용하였으며, 구체적으로, ① Column temperature: 20℃, ② mobile phase A: 20 mM sodium citrate pH 5.5, 100 mM NaCl, ③ 유속: 0.7 ml/min, ④ Wavelength: 280 nm, ⑤ injection: 40 ㎍, ⑥ gradient: isocratic 조건에서 수행하였다.
<실시예>
실시예 1. FL335 및 고양이 혈청 알부민의 발현 및 생산
본 실시예에서는 상기 제조예에 따른 FL335 항체 단편 및 고양이 혈청 알부민의 발현 및 생산을 확인하고자 하였다. FL335는 도 5에 나타낸 바와 같이, SL335의 인간 VH, VL 서열과 고양이 IgG1 CH1 (delta C), CL-kappa로 이루어진다. FL335를 제작하기 위하여, SL335 VH와 고양이 IgG1 CH1을 linking PCR을 통해 연결하여, FL335 Fd 유전자를 제작하고, 이와 동일한 방식으로 SL335 VL 과 고양이 CL-kappa를 연결하여 FL335 L 유전자를 제작하였다. 이후, 상기 FL335 Fd 또는 FL335 L를 발현 벡터에 각각 삽입한 후, 상기 발현 벡터에 의한 단백질의 발현을 ExpiCHO expression system을 이용한 일시적 발현을 통하여 확인하였다. 이후, 안정화 세포주를 flask 생산하여 획득한 배양액에 대하여, 친화성 크로마토그래피와 두 단계의 이온교환 크로마토그래피를 포함하는 정제 과정을 진행하였으며, GS null CHO-K1 세포 배양액 상층액으로부터 정제된 단백질을 4 ~ 15% 구배 겔 상에서 SDS-PAGE로 확인하였다.
또한, 고양이 혈청 알부민 역시 유전자 합성을 통해 직접 제작하였으며, 분리 및 정제와 분석을 위하여 N-term에 myc tag와 C-term에 his tag를 연결하고, 이를 발현 벡터 pJK plasmid에 삽입하였다. 이후, 상기 발현 벡터에 의한 단백질의 발현을 ExpiCHO expression system을 이용한 일시적 발현을 통하여 확인하였다. 또한, 안정화 세포주의 flask 생산을 통하여 얻은 배양액을 분리 정제하고, 이로부터 정제된 단백질을 SDS-PAGE로 확인하였다.
도 6은 일 실시예에 따른 발현 및 정제 과정 후, 배양액 내 FL335 Fd, L 및 고양이 혈청 알부민을 확인한 것으로서, 도 6의 A는 FL335를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이고, 도 6의 B는 고양이 혈청 알부민을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이다.
도 6의 A에 나타낸 바와 같이, 23.492 kDa의 이론적 분자량을 갖는 FL335 Fd, 23.877kDa의 이론적 분자량을 갖는 FL335 L에 상응하는 단백질 밴드를 확인하였으며, 이와 마찬가지로, 47.352 kDa의 이론적 분자량을 갖는 FL335 Fab에 상응하는 단백질 밴드 역시 확인하였다. 또한, 도 6의 B에 나타낸 바와 같이, 67.8 kDa의 이론적 분자량을 갖는 고양이 혈청 알부민과 상응하는 단백질 밴드를 확인하였다.
실시예 2. 고양이 혈청 알부민에 대한 FL335의 결합 능력 확인
본 실시예에서는 고양이 혈청 알부민에 대한 FL335의 결합 능력을 확인하고자 하였다. 구체적으로, 고양이 혈청 알부민을 pH 9.6의 carbonate coating buffer에 1 ㎍/mL로 희석하고, MaxiSorp NUNC Immuno ELISA plate의 각각의 웰에 100 ㎕의 희석 용액을 첨가한 후, 이를 4℃에서 밤새도록 방치함으로써, 고양이 혈청 알부민을 플레이트에 코팅시켰다. Blocking buffer로는 3% 소 혈청 알부민이 포함된 PBST [0.1% (v/v) Tween을 포함하는 PBS]를 사용하였고, 각각의 웰에 300 ㎕의 blocking buffer를 첨가하여, 상온에서 blocking 하였다. 이후, 각각의 웰에 300 ㎕의 wash buffer(PBST)를 분주하여 세척하였고, 이를 3회 반복하였다. 항체 단편 또는 시료의 희석을 위한 용액으로 0.3% PBA (in PBST 0.1%)를 사용하였으며, 고양이 혈청 알부민으로 코팅된 웰에 100 ㎕의 희석 용액을 분주하고, 상온에서 1시간 반응시켰다. 상기와 동일한 방법으로 3회 세척하였다. 이후, SL335 detection 1st 항체로서 goat anti-human kappa-HRP를 1:3000으로 희석하여 상기 웰에 첨가하였고, FL335 detection 1st 항체로서, goat anti-cat light chain Ab을 1:3000으로 희석하고, FL335 detection 2nd 항체로서 goat IgG-Fc fragment cross antibody antobody을 1:5000으로 희석하여 상기 웰에 첨가하였다. 이에 따른 항원-항체 반응은 상온에서 1시간 진행하였으며, 결합 시그널은 3,3’,5,5’-tetramethyl benzidine(TMB) 기질)을 사용하여 ELISA reader로 absorbance 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 한편, 본 실시예에서는 알부민과의 결합하는 FL335 항체 단편의 기능성을 확인하기 위하여, 인간 혈청 알부민 또는 고양이 혈청 알부민과의 결합 수준을 인간 알부민에 특이적으로 결합하는 Fab의 단편인 SL335와 비교하였다.
도 7은 혈청 알부민에 대한 FL335의 결합 능력을 확인한 것으로서, 도 7의 A는 인간 및 고양이 혈청 알부민과 SL335간 결합 능력을 ELISA를 통해 확인한 결과이고, 도 7의 B는 인간 및 고양이 혈청 알부민과 FL335간 결합 능력을 ELISA를 통해 확인한 결과이다.
도 7에 나타낸 바와 같이, FL335 항체 단편은 모든 혈청 알부민에 대하여, SL335와 유사한 수준의 결합 능력을 보여 주었다. 이러한 실험 결과는 항-혈청 알부민에 특이적으로 결합하는 기존의 항체, 즉, SL335의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 도메인에, 고양이 유래의 중쇄 불변 1 도메인 또는 경쇄 불변 도메인(CH1, Cκ)을 결합시킨 경우에도, 알부민과의 결합 능력은 그대로 유지됨을 나타내는 것이다.
실시예 3. 고양이 과립구 집락 자극인자의 발현 및 생산
본 실시예에서는 상기 제조예에 따른 fG-CSF 단백질의 발현 및 생산을 확인하고자 하였다., 단백질의 생산되는 과정에서 야기될 수 있는 miss folding을 방지하고, 정제 및 공정 과정의 편의성을 위하여, 자연형 고양이 과립구 집락 자극인자(자연형 fG-CSF)와 더불어, 돌연변이형 고양이 과립구 집락 자극인자(돌연변이형 fG-CSF), 총 2 종류의 고양이 과립구 집락 자극인자를 제조하였다. 구체적으로, 돌연변이형 fG-CSF는 자연형 fG-CSF에서, 자유 시스테인의 제거를 위해 C17S, O-당쇄의 제거를 위해 T133A로 치환된 형태로 제작하였다. 자연형 fG-CSF와 돌연변이형 fG-CSF를 안정적으로 발현하는 세포주를 제작하기 위하여, GS null CHO-K1 세포에 이를 형질 전환시킨 후 L-Methionine sulfoximine와 puromycin을 사용하여 약 4주에 걸쳐 선별함으로써 안정화 세포주를 제작하였다. 이후, 안정화 세포주를 flask 생산하여 획득한 배양액에 대하여, immobilized-metal affinity 크로마토그래피와 두 단계의 이온교환 크로마토그래피를 포함하는 정제 과정을 진행하였으며, GS null CHO-K1 세포 배양액 상층액으로부터 정제된 단백질을 4 ~ 15% 구배 겔 상에서 SDS-PAGE로 확인하였다.
도 8은 일 실시예에 따른 발현 및 정제 과정 후, 배양액 내 자연형 fG-CSF와 돌연변이형 fG-CSF를 확인한 것으로서, 도 8의 A는 자연형 fG-CSF를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이고, 도 8의 B는 돌연변이형 fG-CSF를 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 자연형 fG-CSF와 돌연변이형 fG-CSF에 상응하는 단백질 밴드를 확인하였으며, 비- 환원(not boiled) 조건에서, 자유 시스테인 및 O-당쇄의 제거에 의해, 돌연변이형 fG-CSF의 단백질 밴드 크기는 자연형 fG-CSF에 비해 감소됨을 확인하였다.
실시예 4. APB-F1의 발현 및 생산
본 실시예에서는 상기 제조예에 따른 APB-F1의 발현 및 생산을 확인하고자 하였다. APB-F1은 도 9에 나타낸 바와 같이, fG-CSF에 따라 두 종류의 단백질로 제작되었다. 즉, APB-F1(v1)은 FL335 Fd의 C 말단에 자연형 fG-CSF를 연결한 단백질이며, APB-F1(v2)는 FL335 Fd의 C 말단에 돌연변이형 fG-CSF를 연결한 단백질이다. 이후, APB-F1(v1)과 APB-F1(v2)를 안정적으로 발현하는 세포주를 제작하기 위하여, GS null CHO-K1 세포에 이를 형질 전환시킨 후 L-Methionine sulfoximine와 puromycin을 사용하여 약 4주에 걸쳐 선별함으로써 안정화 세포주를 제작하였다. 이후, 안정화 세포주를 flask 생산하여 획득한 배양액에 대하여, 친화성 크리마토그래피와 두 단계의 이온교환 크로마토그래피를 포함하는 정제 과정을 진행하였으며, GS null CHO-K1 세포 배양액 상층액으로부터 정제된 단백질을 4 ~ 15% 구배 겔 상에서 SDS-PAGE로 확인하였다.
도 10은 일 실시예에 따른 발현 및 정제 과정 후, 배양액 내 APB-F1을 확인한 것으로서, 도 10의 A는 APB-F1(v1)을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이고, 도 10의 B는 APB-F1(V2)을 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과이다. 또한, 도 11은 일 실시예에 따른 발현 및 정제 과정 후, APB-F1 시료의 순도를 확인한 것으로서, 도 11의 A는 APB-F1(v1) 시료에 대한 SEC-HPLC 분석 결과이고, 도 11의 B는 APB-F1(v2) 시료에 대한 SEC-HPLC 분석 결과이다.
도 10에 나타낸 바와 같이, APB-F1(v1), 및 APB-F1(v2)에 상응하는 단백질 밴드를 확인하였으며, 상기 결과와 마찬가지로, 비- 환원(not boiled) 조건에서, 자유 시스테인 및 O-당쇄의 제거에 의해, 돌연변이형 fG-CSF를 포함하는 APB-F1(v2)의 단백질 밴드 크기는 자연형 fG-CSF를 포함하는 APB-F1(v1)에 비해 감소됨을 확인하였다. 또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, 상기와 같은 일련의 제조 공정 및 정제를 거쳐 획득한 APB-F1(v1) 및 APB-F1(v2) 시료는 약 98%의 높은 순도를 가짐을 확인하였다.
실시예 5. APB-F1에 대한 생물학적 활성 평가
본 실시예에서는 APB-F1에 대한 EC50를 측정하여 이들의 생물학적 활성을 평가하였다. 구체적으로, M-NFS60 세포(ATCC No. 1838)를 대상으로 세포 증식 어세이를 수행하였다. 음성 대조군으로 FL335를 사용하였고, 양성 대조군으로 WHO가 지정한 생물학적 활성 표준 물질인, 인간 과립구 집락 자극인자(hG-CSF I.S, rDNA Derived, 2nd International Standard, NIBSC code: 09/136)를 사용하였으며, 비교군으로는 Filgrastim, PEG-Filgrastim, 및 fG-CSF를 사용하였다. 우선, M-NFS60 세포를 1% FBS 가 첨가된 RPMI-1640 배지에서 배양하였으며, 배양 조건은 37℃, 5% CO2을 유지하였다. 이후, 상기 세포를 6×104 cells/ml의 농도로 RPMI-1640(Gibco) 배지와 희석하였고, 100 ㎕의 희석 용액을 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 이어서, APB-F1, 대조 물질, 및 대조 물질을 RPMI-1640 배지에 0.01-1000 pM 농도로 희석한 뒤, 이를 각각의 웰당 100 ㎕씩 triplicate하여 첨가하고, 37℃, 5% CO2 조건에서 42시간 배양하였다. 이후, 상기 배양된 세포에 cell counting kit-8 용액 을 20 ㎕/well 농도로 첨가하고, 다시 6시간 반응을 진행하였다. 이후, 세포 생존율을 확인하기 위하여, Microplate reader로 absorbance 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
도 12는 M-NFS60 세포를 대상으로 실시한 APB-F1의 세포 증식 어세이 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 12에 나타낸 바와 같이, hG-CSF I.S, fG-CSF, APB-F1(v1), 및 APB-F1(v2)의 EC50는 각각 2.45pM, 3.59 pM, 8.32 pM, 및 5.67 pM을 나타내었고, Filgrastim, 및 PEG-Filgrastim의 EC50는 각각 3.94 pM 및 3.07 pM임을 확인하였다. 구체적으로, 본 실험에서 측정된 Filgrastim의 활성도는 0.6×108 U/mg로서, 기존에 알려져 있는 Filgrastim의 활성도 수준인, (0.6±1.0)×108 U/mg의 범위에 포함되어 본 실험의 유효성을 확인할 수 있었다. 또한, fG-CSF 및 PEG-Filgrastim의 활성도는 각각 6.5 ×106 U/mg, 3.6×107 U/mg으로 측정되었고, APB-F1(v1), 및 APB-F1(v2)의 활성도는 각각 7.8 ⅹ 106 U/mg, (8.7±0.3)×106 U/mg으로, 유사한 수준의 활성을 나타냄을 확인하였다. 이는 fG-CSF 내 자유 시스테인 및 O-당쇄의 제거에도 불구하고, APB-F1(v2)의 생물학적 활성은 그대로 유지됨을 나타낸 것으로서, 재조합 단백질의 생산, 분리, 및 정제 공정의 용이성을 고려하여, 이하의 실시예에서는 APB-F1(v2)를 APB-F1 단백질로 선택하였다.
실시예 6. 원형 질량 분석
본 실시예에서는 APB-F1의 정확한 분자량을 확인하기 위하여 환원 조건 하에서 원형 질량 분석을 실시하였다. 본 실험에서 Dionex UHPLC와 Q-TOF 5600+ MS/MS system 을 사용하였다. Acquity UPLC® BEH130 C4, 1.7 ㎛ 컬럼, 이동상으로 아세토니트릴을 사용하여, 0.3 ml/min 유속의 조건에서 APB-F1의 질량을 측정하였다.
도 13은 APB-F1의 분자량을 원형 질량 분석을 통하여 확인한 것으로서, 도 13의A는 APB-F1 Fd의 질량을 확인한 결과이고, 도 13의 B는 APB-F1 L의 질량을 확인한 결과이다. 도 13에 나타낸 바와 같이, APB-F1 Fd의 질량은 47.743 kDa, APB-F1 Fd L의 질량은 23.872 kDa으로 측정되었다.
실시예 7. N-말단 서열 분석
본 실시예에서는 APB-F1의 N-말단 서열을 구체적으로 확인하고, 재조합 단백질의 발현 후 신호 서열의 제거와 같은 과정의 정확성을 확인하기 위하여 N-말단 서열 분석을 실시하였다. 본 실험은 ㈜프로테움텍에 의뢰하여 진행되었으며, 에드만 분해법과 LC-MS/MS 방법을 이용하였다. 상기 에드만 분해법은 Protein Sequencer 장비를 이용하여 3.5-18.0분의 노출 시간, 0.005 AUFS의 검출기 스케일 조건에서, 표준물질(PTH-AA, 8.0 pM)의 상대 머무름 시간(relative retention time, dptu) 기준으로, APB-F1(10.0 pM)의 N-말단 서열을 분석하였다.
표 2는 APB-F1의 N-말단 서열을 에드만 분해법을 통하여 확인한 결과이다.
표 2에 나타낸 바와 같이, APB-F1 L의 N-말단 서열은 DIVLT임을 확인하였다. 반면, APB-F1 Fd에 대해서는 반응이 차단되어 그 서열을 확인할 수 없었으며, 이는 첫번째 잔기인 글루타민(Gln)이 폴리글루타메이트(pGlu)으로 생물학적 변환됨에 따른 결과로 판단된다.
사이클 Residue APB-F1(v2)
Fd chain 		APB-F1(v2)
Light chain
Amino Acid Amino Acid
1 Blank - -
2 Standard - -
3 1 - Asp(D)
4 2 - Ile(I)
5 3 - Val(V)
6 4 - Leu(L)
7 5 - Thr(T)
이후, LC-MS/MS은 NanoUPLC, LTQ-orbitrap-mass spectromete 장비를 이용하여 Peptide Mass Tolerance (± 10 ppm), Fragment Mass Tolerance (± 0.8 Da), Max Missed Cleavages(2) 조건으로 300-2,000 m/z 범위에서 QVQLVQSGGGPVKPGGSLRLSCAAS 염기서열에 대해 분석을 실시하였다. 이후, Proteome Discoverer, MASCOT 소프트웨어를 이용하여 분석하였다.
표 3은 APB-F1 Fd의 N-말단 서열에 대한 LC-MS/MS 분석 결과를 Proteome Discoverer 소프트웨어를 이용하여 나타낸 것이고, 도 14는 APB-F1 Fd의 N-말단 서열에 대한 LC-MS/MS 분석 결과를 MASCOT 소프트웨어를 이용하여 나타낸 것이다.
표 3 및 도 14에 나타낸 바와 같이, APB-F1 Fd의 N-말단 서열은 Q(pyro-glu)VQLV임을 확인하였다.
Figure pat00001
실시예 8. APB-F1에 대한 약물동태학적 평가
본 실시예에서는 APB-F1의 흡수, 분포, 생체 내 변화 및 배설 등을 확인하기 위하여, 약물동태학적 평가를 실시하였다. 구체적으로, 건강한 고양이에 APB-F1의 시험 물질을 피하 주사한 후, 혈액 시료를 채취하여 분석하였다. 각각의 그룹은 수컷 고양이 2마리와 임신하지 않은 암컷 고양이 2마리, 총 4마리로 구성하였으며, 시험 물질 투여 2일 전 또는 4일 전, 시험 물질 투여 직후, 시험 물질 투여 후 2, 6, 또는 12 시간이 경과한 시점, 시험 물질 투여 후시간의 경과에 따라 총 15회에 걸쳐, 경정맥 채혈을 통해 매회 3 ml의 전혈을 수득하였다. 상기 전혈은 수득한 즉시 3,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 혈장을 분리한 후, 이를 사용 전까지 초저온 냉동고(약 -70℃)에 보관하였다. 본 실험에서 실험군으로는 100 ㎍/kg의 돌연변이형 fG-CSF 단백질 투여군, 360 ㎍/kg의 APB-F1 투여군을 설정하였다.
이후, 수득한 시료를 ELISA 방법으로 분석하였다. 우선, pH 9.6의 carbonate coating buffer를 이용하여 1 ㎍/mL 농도로 희석한 렛트 항-인간 G-CSF Ab 용액를 ELISA plate 각각의 웰에 100 ng/well로 100 ㎕씩 로딩한 후, 2-8℃에서 배양하여 밤새도록 항체를 코팅하였다. 상기 플레이트 내 용액을 제거한 후, wash buffer를 웰당 300 ㎕씩 첨가하고, 1회 세척하였다. 이후, 여기에 blocking buffer를 웰당 300 ㎕씩 분주한 후, 상온에서 3시간 blocking 하였다. 상기 플레이트 내 용액을 제거하고, 상온에서 1시간 플레이트를 뒤집어 잔존하는 용액을 모두 제거한 뒤, 표준물질과 희석 검액을 100 ㎕의 triplicate로 웰에 첨가하였다. 이후, sealer로 플레이트를 마감한 후, 이를 상온, 450 rpm 조건에서, 90분 반응시키고, wash buffer를 이용하여 상기와 같은 방법으로 4회 세척하였다. 이후, 여기에 1차 항체, Rabbit anti-fG-CSF pAb를 1:1,000으로 희석하여 모든 웰에 100 ㎕씩 분주한 뒤, sealer로 플레이트를 마감하고 상온에서 1시간 반응시켰다. 이어서, 2차 항체, Peroxidse-conjugated AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L)를 첨가하여 항원항체 반응을 유도하였다. 구체적으로, 상기와 같은 방법으로 4회 세척한 뒤, 1:10,000으로 희석한 2차 항체를 모든 웰에 100 ㎕씩 첨가하고, 상온, 빛이 차단된 조건에서 1시간 반응시켰다. 이후, 상기와 같은 방법으로 5회 세척한 뒤, 여기에 BioFX® TMB Super Sensitive One Component HRP Microwell Substrate을 100 ㎕/well씩 첨가하고, 실온에서 5~10분 반응시켰다. 이후, 1N의 HCL을 첨가하여 기질 반응을 종료시켰다. 이어서, SPECTROstar Nano Microplate reader 기기를 이용하여 측정 파장 450nm, 참조 파장 650nm에서 흡광도를 측정하였고, Phoenix WinNonlin 소프트웨어로 통계 분석을 실시하였다.
표 4 및 도 15는 고양이를 대상으로 APB-F1의 약물동태학적 평가를 실시한 결과를 나타낸 것이다.
표 4 및 도 15에 나타낸 바와 같이, 최고혈중농도 도달 시간(Tmax)은 fG-CSF의 경우 6시간인 반면, APB-F1는 12시간을 나타내었으며, AUClast는 APB-F1의 경우 19025.4 h·ng/mL로서, 6050.03 h·ng/mL의 값을 나타낸 fG-CSF에 비해 약 3.1배의 증가된 것이었다. 또한, 최고혈중농도(Cmax)는 fG-CSF의 경우 576.3 ng/mL인 반면, APB-F1는 823.9ng/mL로서, fG-CSF에 비해 1.4배 증가된 값을 나타내었으며, 소실 반감기(T1/2)는 APB-F1의 경우 13.3시간으로서, 2.7시간을 나타낸 fG-CSF에 비해 약 4.9배의 증가된 것이었다. 이러한 실험 결과로부터 일 실시예에 따른 APB-F1는 돌연변이형 fG-CSF 단백질에 비해 개선된 약물동태학적 특성을 지님을 알 수 있었다.
Test
article 		Dose t1/2
(N=4) 		T max
(N=4) 		C max
(N=4) 		CL
(N=4) 		AUClast
(N=4)
(νg/kg) h h ng/ml mL/hr/kg hr*ng/mL
fG-CSF 100 2.7127844 6 576.2821 16.17919 6050.035536
APB-F1 360 13.280243 12 823.9247 18.9209 19025.3947
실시예 9. APB-F1에 대한 약력학적 평가
본 실시예에서는 APB-F1의 생리적, 생리화학적 작용 및 효과를 확인하기 위하여, 약력학적 평가를 실시하였다. 구체적으로, 건강한 고양이에 APB-F1 등의 시험 물질을 피하 주사한 후, 혈액 내 백혈구 수치를 측정하여 분석하였다. 각각의 그룹은 수컷 고양이 2마리와 임신하지 않은 암컷 고양이 2마리, 총 4마리로 구성하였다. 투여일(Day 0)를 기준으로 시간의 경과에 따라, 경정맥 채혈을 통해 매회 3ml의 전혈을 수득하였다. 이후, 수득한 시료를 대상으로, 자동혈액분석기를 사용한 혈액학적 검사, 및 혈액생화학분석기와 전해질자동분석기를 사용한 혈액생화학적 검사를 진행하였다. 본 실험에서, 실험군으로는 36 ㎍/kg의 APB-F1 투여 군, 360 ㎍/kg의 APB-F1 투여 군, 10 ㎍/kg의 fG-CSF 투여군, 10 ㎍/kg의 Filgrastim(Grasin) 투여군, 100 ㎍/kg의 PEG-filgrastim(Neulasta) 투여군, 26 ㎍/kg의 FL335(Fab) 투여군을 설정하였으며, 대조군으로는 vehicle 투여군을 설정하였다.
도 16은 고양이를 대상으로 APB-F1의 약력학적 평가를 실시한 결과를 나타낸 것으로서, 혈중 백혈구의 수치를 확인한 결과이다. 도 16에 나타낸 바와 같이, APB-F1 투여군의 백혈구 수치는 투여 후 1일째부터 11일째까지 투여 전에 비하여 유의하게 높은 것으로 나타났으며, 투여 후 20일째에도 정상범위 수준(4.9×103 - 2.0×104 cells/㎕)보다 높게 관찰되었다(미도시). 또한, fG-CSF 투여군의 백혈구 수치는 투여 후 1일째, 투여 전에 비하여 유의한 차이를 보였으나, 투여 후 5일째부터 정상범위 수준으로 감소되었고, Filgrastim 투여군 역시 백혈구 수치가 투여 후 1일째, 유의한 수준으로 증가하였으나, 투여 후 2일째에 정상범위 수준으로 감소되었다. 또한, PEG-Filgrastim 투여 군의 백혈구 수치는 투여 후 7일째까지 투여 전에 비하여 유의하게 높은 것으로 나타났으며, 투여 후 10일째까지 정상 범위보다 높은 수준을 유지함을 확인하였다.
도 17은 혈중 호중구의 수치를 확인한 결과이다. 도 17에 나타낸 바와 같이, fG-CSF 및 APB-F1 투여군의 혈중 호중구 수치는 투여 후 1일째, 모두 투여 전에 비하여 유의한 높은 것으로 나타났으나, APB-F1 투여군의 혈중 호중구 수치가 fG-CSF 투여군에 비해 더욱 높게 관찰되었다. 또한, APB-F1 투여군의 혈중 호중구 수치는 1일부터 11일째까지 유의하게 높은 수준을 유지하였다. 이와 유사하게, Filgrastim 투여군에 비해 PEG-Filgrastim 투여군의 혈중 호중구 수치는 더욱 높게 그리고, 오랜 기간 유지하는 패턴이 관찰되었다. 한편, 그 밖의 투여군은 대조군가 큰 차이를 보이지 않았다.
도 18은 혈중 단핵구의 수치를 확인한 결과이다. 도 18에 나타낸 바와 같이, APB-F1 투여군의 혈중 단핵구 수치는 투여 후 2일째부터 9일째까지 투여 전에 비하여 유의하게 높은 것으로 나타났고, PEG-Filgrastim 투여군의 혈중 단핵구 수치는 투여 후 2일째부터 5일째까지 투여 전에 비하여 높게 나타났다. 한편, 그 밖의 투여군은 대조군가 큰 차이를 보이지 않았다.
도 19는 혈중 호염기구의 수치를 확인한 결과이다. 도 19에 나타낸 바와 같이, APB-F1 투여군의 혈중 호염기구 수치는 투여 후 2일째에서 7일째까지 정상범위 수준보다 유의하게 높은 것으로 나타났다.
도 20은 혈중 림프구의 수치를 확인한 결과이고, 도 21은 혈중 호산구의 수치를 확인한 결과이다. 도 20 및 도 21에 나타낸 바와 같이, 혈중 림프구 및 혈중 호산구에 대하여, 실험군과 대조군간 유의적인 차이는 관찰되지 않았다.
이러한 일련의 실험 결과로부터 일 실시예에 따른 APB-F1는 혈중 백혈구, 구체적으로, 혈중 호중구, 혈중 단핵구, 및 혈중 호염기구의 수치를 증가시키고 오랜 기간 유지하는데 기여함을 알 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> APRILBIO CO., LTD. <120> The fusion protein comprising Feline granulocyte colony-stimulating factor and antigen binding fragments for serum albumin and use thereof <130> PN131676KR <160> 39 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable domain 1 <400> 1 Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Gly Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly His Cys Gln Arg Gly Ile Cys Ser Asp Ala Leu Asp 100 105 110 Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain variable domain 2 <400> 2 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Lys Ala Ala Cys Leu Thr Pro Lys Val Asp Ala Leu Arg 180 185 190 Glu Lys Val Leu Ala Ser Ser Ala Lys Glu Arg Leu Lys Cys Ala Ser 195 200 205 Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ser Val Ala Arg 210 215 220 Leu Ser Gln Lys Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Ile Ser Lys Leu 225 230 235 240 Val Thr Asp Leu Ala Lys Ile His Lys Glu Cys Cys His Gly Asp Leu 245 250 255 Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu 260 265 270 Asn Gln Asp Ser Ile Ser Thr Lys Leu Lys Glu Cys Cys Gly Lys Pro 275 280 285 Val Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ser Glu Val Glu Arg Asp Glu Leu 290 295 300 Pro Ala Asp Leu Pro Pro Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Asp Lys Glu 305 310 315 320 Val Cys Lys Asn Tyr Gln Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Thr Phe 325 330 335 Leu Tyr Glu Tyr Ser Arg Arg His Pro Glu Tyr Ser Val Ser Leu Leu 340 345 350 Leu Arg Leu Ala Lys Glu Tyr Glu Ala Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala 355 360 365 Thr Asp Asp Pro Pro Ala Cys Tyr Ala His Val Phe Asp Glu Phe Lys 370 375 380 Pro Leu Val Glu 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<213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 25 gatcaactct agagccacca tggagtggtc ctgggtc 37 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 26 tgagctgact gtgaccagag tg 22 <210> 27 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 27 ggtcacagtc agctcagctt ctaccaccgc accttc 36 <210> 28 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 28 aggaagacgc ttttagaggc ggccgctcag tcggttcggt ccactgtttt atcgac 56 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5 <400> 29 gacatcgtcc tgacccagag ccccg 25 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 6 <400> 30 ccgcttgatc tccagctggg tgcc 24 <210> 31 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 7 <400> 31 cagctggaga tcaagcggag tgacgcacaa ccttctg 37 <210> 32 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 8 <400> 32 aggaagacgc ttttagagct actccctctg ggactcgctc cgattaaa 48 <210> 33 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 9 <400> 33 accaccggag tgctttccac ccccctggga ccaacctcca gcctgcccca gtcc 54 <210> 34 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 10 <400> 34 atcggcggcc gcgaagacgc ttttagatca gtggtggtgg tgatggtggt ggtgcccagg 60 60 <210> 35 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 11 <400> 35 gcgtgaccac cggagtgctt tccgcaaccc cactgggacc aaccagttc 49 <210> 36 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 12 <400> 36 atcggcggcc gcgaagacgc ttttagatca gtggtggtgg tgatggtggt ggtgccctgg 60 cttggtaaag tggcgaagag cccg 84 <210> 37 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 13 <400> 37 cttggagcca gaggcaagac agaag 25 <210> 38 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 14 <400> 38 cttctgtctt gcctctggct ccaag 25 <210> 39 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 15 <400> 39 aggaagacgc ttttagaggc ggccgctcaa gg 32

Claims (12)

  1. (a) 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변 도메인, 및 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 서열번호 12 및 서열번호 13으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변 도메인을 포함하며,
    상기 중쇄 가변 도메인에 결합된 고양이 유래의 중쇄 불변 1 도메인 및 상기 경쇄 가변 도메인에 결합된 고양이 유래의 경쇄 불변 도메인 포함하는, 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 단편;
    (b) 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자(Feline granulocyte colony-stimulating factor); 및
    (c) 상기 항원 결합 단편과 고양이 유래의 과립구 집락 자극인자를 연결하는 링커를 포함하는 재조합 단백질로서,
    상기 중쇄 불변 1 도메인 내 경쇄와 중쇄 도메인의 이황화 결합에 사용되는 아미노산인 시스테인, 경쇄 불변 도메인 내 경쇄와 중쇄 도메인의 이황화 결합에 사용되는 아미노산인 시스테인, 또는 중쇄 불변 1 도메인 내 경쇄와 중쇄 도메인의 이황화 결합에 사용되는 아미노산인 시스테인 및 경쇄 불변 도메인 내 경쇄와 중쇄 도메인의 이황화 결합에 사용되는 아미노산인 시스테인은 보존 또는 결실되거나 시스테인외의 다른 아미노산 잔기로 치환된 것인, 재조합 단백질.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 고양이 유래의 중쇄 불변 1 도메인은 서열번호 14의 아미노산 서열로 이루어진 것인 재조합 단백질.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 고양이 유래의 경쇄 불변 도메인은 서열번호 15의 아미노산 서열로 이루어진 것인 재조합 단백질.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 고양이 유래의 과립구 집락 자극 인자는 자연형 과립구 집락 자극인자에서 자유 시스테인기 및 O-당쇄가 제거되도록 변형된 것인 재조합 단백질.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 고양이 유래의 과립구 집락 자극 인자는 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 것인 재조합 단백질.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 링커는 상기 혈청 알부민에 결합하는 항원 결합 단편의 중쇄 불변 1 도메인의 C 말단, 중쇄 가변 도메인의 N 말단, 경쇄 불변 도메인의 C 말단, 및 경쇄 가변 도메인의 N 말단으로부터 선택된 어느 하나의 영역과 상기 과립구 집락 자극인자를 연결하는 것인 재조합 단백질.
  7. 청구항 1의 재조합 단백질을 코딩하는 핵산.
  8. 청구항 7의 핵산을 포함하는 발현 벡터.
  9. 청구항 8의 발현 벡터로 형질전환된 세포.
  10. 청구항 1의 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 고양이 범 백혈구 감소증(Feline panleukopenia)의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 조성물은 혈중 백혈구 수준을 증가시키는 것인 약학적 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 백혈구는 호중구, 단핵구, 호염기구 또는 이의 조합인 것인 약학적 조성물.
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