JP2023521363A - 猫の顆粒球コロニー刺激因子及び血清アルブミン抗原結合断片を含む組み換えタンパク質、並びにその用途 - Google Patents

猫の顆粒球コロニー刺激因子及び血清アルブミン抗原結合断片を含む組み換えタンパク質、並びにその用途 Download PDF

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Abstract

猫の顆粒球コロニー刺激因子及び血清アルブミンに結合する抗原結合断片を含む組み換えタンパク質、該組み換えタンパク質をコードする核酸分子、ベクター、細胞、並びにその用途に係わり、猫汎百血球減少症の治療用の組成物が提供される。

Description

［関連出願に係わる相互参照］
本出願は、２０２０年４月９日に出願されたＫＲ第１０－２０２０－００４３６０６号に対する優先権を主張し、その開示内容は、その全体が参照として本明細書に統合される。
［電子的に提出された配列表参照］
本出願と共に提出されたＡＳＣIIテキストファイル（名称：2662-0002WO01_Sequence_Listing_ST25.txt、大きさ：４８ＫＢ、生成日付：２０２１年４月９日）の電子的に提出された配列表の内容は、全体が本明細書に参照として含まれる。
［技術分野］
本発明は、猫の顆粒球コロニー刺激因子と血清アルブミンに結合する抗原結合断片とを含む組み換えタンパク質、該組み換えタンパク質をコードする核酸分子、ベクター、細胞、組成物、並びにその用途に関する。
猫汎白血球減少症（feline panleukopenia）は、猫パルボウイルス（ＦＰＶ：feline parvovirus）によって誘発されるウイルス性腸炎であり、伝染性が高く、死亡率が高く、全ての猫種に最も致命的な疾病のうち一つである。現在、猫汎白血球減少症の治療には、白血球数を増加させるための全血の輸血、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）投与、あるいは敗血症による脱水を防止するために、抗生物質及びビタミンＡ，Ｂ，Ｃなどが含有された輸液の静脈投与が含まれる。しかしながら、抗生物質などが含まれた輸液の静脈投与は、疾病の直接治療ではなく、輸血も、十分な量の全血を確保し難いという問題点がある。猫汎白血球減少症の治療に、ＧＣＳＦの投与が広く使用されているが、治療に使用される組み換えＧＣＳＦは、猫ではないヒトに由来するｈＧＣＳＦである。従って、長期間使用すれば、ｈＧＣＳＦに対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）が生成され、薬効や治療効能を低下させるだけではなく、急性免疫反応、自家免疫疾患のような深刻な副作用を誘発する。
また、猫の体内で分泌するホルモンのうち一つである猫ＧＣＳＦは、骨髄で循環する血球の生成を調節するタンパク質として知られている。具体的には、該ＧＣＳＦは、好中球の増殖及び分化を刺激し、血液内の好中球数値を増大させ、好中球減少期間を短縮させ、免疫性を回復させることに寄与する。しかしながら、該タンパク質は、生体内半減期が約４時間ないし約５時間に過ぎず、長期間、治療効能を維持するためには、何回も投与しなければならない。そのような理由により、ポリ（アルキレングリコール）誘導体のような高分子をＧＣＳＦに接合させるＰＥＧ化（PEGylation）またはハイパーグリコシル化（hyperglycosylation）が広く使用されている（韓国特許公開第１０－２０１０－００５２５０１号）。それは、また、化学的融合過程で生じるタンパク質変性及び免疫原性の可能性のような問題を伴う。
（ａ）重鎖及び軽鎖を含む抗原結合断片、及び（ｂ）猫の顆粒球コロニー刺激因子（ｆＧＣＳＦ）を含む組み換えタンパク質が本願に開示され、
ここで、前記重鎖は、重鎖可変ドメイン及び猫の重鎖定常１ドメインを含み、ここで、前記重鎖可変ドメインは
（１）ＳＹＧＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン１（ＣＤＲ１）、
ＷＩＮＴＹＳＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン２（ＣＤＲ２）、及び
ＬＧＨＣＱＲＧＩＣＳＤＡＬＤＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン３（ＣＤＲ３）；
（２）ＳＹＧＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＲＩＮＴＹＮＧＮＴＧＹＡＱＲＬＱＧ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
ＬＧＨＣＱＲＧＩＣＳＤＡＬＤＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（３）ＮＹＧＩＨ（配列番号５５）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＳＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５６）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
ＤＶＨＹＹＧＳＧＳＹＹＮＡＦＤＩ（配列番号５７）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（４）ＳＹＡＭＳ（配列番号５８）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＶＩＳＨＤＧＧＦＱＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
ＡＧＷＬＲＱＹＧＭＤＶ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（５）ＡＹＷＩＡ（配列番号６１）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＭＩＷＰＰＤＡＤＡＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号６２）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
ＬＹＳＧＳＹＳＰ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；あるいは
（６）ＡＹＳＭＮ（配列番号６４）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＳＩＳＳＳＧＲＹＩＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６５）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
ＥＴＶＭＡＧＫＡＬＤＹ（配列番号６６）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；を含み、
ここで、前記軽鎖は、軽鎖可変ドメイン及び猫の軽鎖定常ドメインを含み、ここで、前記軽鎖可変ドメインは
（７）ＲＡＳＱＳＩＳＲＹＬＮ（配列番号６７）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＧＡＳＲＬＥＳ（配列番号６８）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＱＳＤＳＶＰＶＴ（配列番号６９）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（８）ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号７０）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号７１）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＱＳＹＳＴＰＰＹＴ（配列番号７２）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（９）ＲＡＳＱＳＩＦＮＹＶＡ（配列番号７３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号７４）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＱＲＳＫＷＰＰＴＷＴ（配列番号７５）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（１０）ＲＡＳＥＴＶＳＳＲＱＬＡ（配列番号７６）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号７７）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＱＹＧＳＳＰＲＴ（配列番号７８）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（１１）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＳＬＡ（配列番号７９）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号７７）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＫＹＳＳＹＰＬＴ（配列番号８０）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；あるいは
（１２）ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ（配列番号８１）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＧＡＳＴＧＡＴ（配列番号８２）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＱＹＹＳＦＬＡＫＴ（配列番号８３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
前記組み換えタンパク質は、前記ｆＧＣＳＦを抗原結合断片に連結するリンカをさらに含むものでもあり得る。一部の実施例において、軽鎖と重鎖との鎖間ジスルフィド結合に位置する（ｉ）猫の重鎖定常１ドメイン内のシステイン、及び／または（ｉｉ）猫の軽鎖定常ドメイン内のシステインは、保存され、欠失され、及び／又はシステイン以外のアミノ酸残基で置換される。
本願に開示された組み換えタンパク質の一部の実施例において、前記重鎖可変ドメインは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
一部の実施例において、前記重鎖可変ドメインは、配列番号１，２，３，４，５または６に対し少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施例において、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号７，８，９，１０，１１，１２または１３に対し少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施例において、前記重鎖可変ドメインは、配列番号１，２，３，４，５または６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号７，８，９，１０，１１，１２または１３を含む。
一部の実施例において、前記猫の重鎖定常１ドメインは、配列番号１４に対し少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施例において、前記猫の軽鎖定常ドメインは、配列番号１５に対し少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一部の実施例において、前記ｆＧＣＳＦは、天然のｆＧＣＳＦから、遊離システイン基及びＯ－糖鎖を除去することによって変形される。一部の実施例において、前記ｆＧＣＳＦは、配列番号１８に対し少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施例において、前記ｆＧＣＳＦは、配列番号１９に対し少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施例において、前記ｆＧＣＳＦは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
一部の実施例において、前記リンカは、ｆＧＣＳＦを、猫の重鎖定常１ドメインのＣ末端、重鎖可変ドメインのＮ末端、猫の軽鎖定常ドメインのＣ末端、及び／または軽鎖可変ドメインのＮ末端と連結する。一部の実施例において、前記リンカは、１ないし５０個のアミノ酸、または１ないし２０個のアミノ酸を含む。一部の実施例において、前記リンカは、（ＧｐＳｓ）ｎまたは（ＳｐＧｓ）ｎの式を含み、ここで、Ｇは、グリシンであり、Ｓは、セリンであり、ｐは、１ないし１０の整数であり、ｓは、０、または１ないし１０の整数であり、ｐ＋ｓは、２０以下の整数であり、ｎは、１～２０の整数である。
本願に開示された組み換えタンパク質をコードする核酸分子が本願に開示されている。本願に開示された核酸分子を含む発現ベクターが本願に開示されている。本願に開示された発現ベクターで形質転換された細胞が本願に開示される。
本願に開示された組み換えタンパク質を含む組成物が本願に開示されている。本願に開示された組成物、及び薬剤学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が本願に開示される。本願に開示された組成物及びその使用指針を含むラベルを含むキットが本願に開示される。
本明細書に開示された組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む、猫汎白血球減少症を治療する方法が本明細書に開示される。一部の実施例において、前記組成物は、個体の血液内白血球を増加させる。一部の実施例において、前記白血球は、好中球、単核球、好塩基球、またはそれらの組み合わせである。
また、それを必要とする個体において、猫汎白血球減少症を治療するための、本願に開示された組成物の使用が本願に開示される。また、それを必要とする個体において、猫汎白血球減少症の治療に使うための、本願に開示された組成物が本願に開示される。また、それを必要とする個体において猫汎白血球減少症を治療するための薬剤製造のための、本願に開示された組成物の使用が本願に開示される。
本開示内容の特定実施形態の、前述のところ、及び他の態様、特徴及び利点は、添付図面と共になされる以下の説明からさらに明白であろう。
図１Ａ及び１Ｂはヒト抗血清アルブミンＦａｂ抗体断片のキメラ抗体である、ＦＬ３３５の発現ベクターを図示したものであり、ここで図１Ａは、ＦＬ３３５ Ｆｄ ｐｄ２５３５ＮＴベクターの開裂マップを示す図であり、図１Ｂは、ＡＰＢ－Ｆ１Ｌ ｐｄ２５３９ベクターの開裂マップを示す図である。
猫血清アルブミンの発現ベクターである、猫血清アルブミンｐＪＫ－ｄｈｆｒベクターの開裂マップを示す図である。
天然ｆＧＣＳＦの発現ベクターである、猫ＧＣＳＦ ｐｄ２５３５ＮＴベクターの開裂マップを示す図である。
図４Ａ及び４Ｂは、ＦＬ３３５と猫ＧＣＳＦとの融合タンパク質であるＡＰＢ－Ｆ１の発現ベクターを示したものであり、図４Ａは、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１，ｖ２） Ｆｄ ｐｄ２５３５ＮＴベクターの開裂マップを示す図であり、図４Ｂは、ＡＰＢ－Ｆ１Ｌ ｐｄ２５３９ベクターの開裂マップを示す図である。
ＦＬ３３５の構造を概略的に示す図である。
図６Ａ及び６Ｂは、１つの例示的な具体例による発現及び精製の過程後、培養培地において、ＦＬ３３５ Ｆｄ、ＦＬ３３５ Ｌ及び猫血清アルブミンを確認したところを示し、図６Ａは、ＦＬ３３５を確認したＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す図であり、図６Ｂは、猫血清アルブミンを確認したＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す図である。
図７Ａ及び７Ｂは、血清アルブミンに対するＦＬ３３５の結合能を示す図であり、ここで、図７Ａは、ヒト血清アルブミン及び猫血清アルブミンに対するＳＬ３３５の結合能を確認したＥＬＩＳＡ結果を示す図であり、図７Ｂは、ヒト血清アルブミン及び猫血清アルブミンに対するＦＬ３３５の結合能を確認したＥＬＩＳＡ結果を示す図である。
図８Ａ及び８Ｂは、１つの例示的な具現例による発現及び精製の過程後、培養培地における、天然ｆＧＣＳＦ及び突然変異体ｆＧＣＳＦの確認を示す図であり、図８Ａは、天然ｆＧＣＳＦを確認したＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す図でり、図８Ｂは、突然変異ｆＧＣＳＦを同定したＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す図である。
ＡＰＢ－Ｆ１の構造を概略的に示す図である。
図１０Ａ及び１０Ｂは、１つの例示的な具現例による発現及び精製の過程後、培養培地における、ＡＰＢ－Ｆ１の確認を示す図であり、ここで、図１０Ａは、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１）を確認したＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す図であり、図１０Ｂは、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ２）を確認したＳＤＳ－ＰＡＧＥ結果を示す図である。
図１１Ａ及び１１Ｂは、１つの例示的な具現例による発現及び精製の過程後、ＡＰＢ－Ｆ１サンプルの純度を示す図であり、ここで、図１１Ａは、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１）試料を分析したＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す図であり、図１１Ｂは、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ２）試料を分析したＳＥＣ－ＨＰＬＣ結果を示す図である。
ＡＰＢ－Ｆ１を利用した、Ｍ－ＮＦＳ６０に対する細胞増殖アッセイの分析結果を示す図である。
図１３Ａ及び１３Ｂは、ＡＰＢ－Ｆ１の分子量を原形（intact）質量分析で測定した結果を示したものであり、図１３Ａは、ＡＰＢ－Ｆ１ Ｆｄの質量を測定した結果を示す図であり、図１３Ｂは、ＡＰＢ－Ｆ１Ｌの質量を測定した結果を示す図である。
ＭＡＳＣＯＴソフトウェアを利用して、ＡＰＢ－Ｆ１ ＦｄのＮ末端配列を分析したＬＣ－ＭＳ／ＭＳ結果を示す図である。
猫における、ＡＰＢ－Ｆ１の薬物動態学的評価結果を示す図である。
ＡＰＢ－Ｆ１の薬力学的評価を実施した結果を示したものであり、血液内の白血球数値を確認した結果である。
猫における、ＡＰＢ－Ｆ１の薬力学的評価を実施した結果を示したものであり、血液内の好中球数値を確認した結果である。
猫における、ＡＰＢ－Ｆ１の薬力学的評価を実施した結果を示したものであり、血液内の単核球数値を確認した結果である。
猫における、ＡＰＢ－Ｆ１の薬力学的評価を実施した結果を示したものであり、血液内の好塩基球数値を確認した結果である。
ＡＰＢ－Ｆ１の薬力学的評価を実施した結果を示したものであり、血液内のリンパ球数値を確認した結果である。
猫における、ＡＰＢ－Ｆ１の薬力学的評価を実施した結果を示したものであり、血液内好酸球数値を確認した結果である。
本明細書において使用される用語、「約」及び「およそ」は、数値または数値範囲を修飾するために使用されるとき、前述の数値または数値範囲より、最大１０％以上、及び最大１０％以下の偏差が意図された意味内において維持されることを示す。
本明細書において使用される用語「予防」は、前記医薬組成物の投与により、猫汎白血球減少症を抑制させるか、あるいは発病を遅延させる全ての行為を意味する。
本明細書において使用される用語「治療」は、前記医薬組成物の投与により、猫汎白血球減少症の症状が好転するか、改善されるか、消失されるか、あるいは良好に変更される全ての行為を意味する。
本明細書において使用される用語「個体」は、猫汎白血球減少症の治療を必要とする個体を意味し、さらに具体的には、猫科動物、猫、飼い猫（domestic cat）、例えば、ペット猫（pet cat）を称しうる。
前記医薬組成物による予防または治療の対象疾病である「猫汎白血球減少症」は、血便、下痢、激しい脱水、栄養失調のような臨床的症状と共に、白血球の顕著な減少を特徴とする疾病であり、伝染性が非常に強く、致死率が高く、全ての猫種に致命的な疾病のうち一つである。前記猫汎白血球減少症は、猫パルボウイルス（ＦＰＶ：feline parvovirus）の感染によって生じるものでもある。前記疾病の治療法として、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）の投与が広く通用されているが、抗薬物抗体（ＡＤＡ：anti-drug antibody）の生成などによる治療的限界がある。
［抗体及びその断片］
本明細書においては、（ａ）重鎖及び軽鎖を含む抗原結合断片、及び（ｂ）猫の顆粒球コロニー刺激因子（ｆＧＣＳＦ）を含む組み換えタンパク質であり、
ここで、前記重鎖は、重鎖可変ドメイン及び猫の重鎖定常１ドメインを含み、ここで、前記重鎖可変ドメインは、
（１）ＳＹＧＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン１（ＣＤＲ１）、
ＷＩＮＴＹＳＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン２（ＣＤＲ２）、及び
ＬＧＨＣＱＲＧＩＣＳＤＡＬＤＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン３（ＣＤＲ３）；
（２）ＳＹＧＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＲＩＮＴＹＮＧＮＴＧＹＡＱＲＬＱＧ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
ＬＧＨＣＱＲＧＩＣＳＤＡＬＤＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（３）ＮＹＧＩＨ（配列番号５５）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＳＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５６）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
ＤＶＨＹＹＧＳＧＳＹＹＮＡＦＤＩ（配列番号５７）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（４）ＳＹＡＭＳ（配列番号５８）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＶＩＳＨＤＧＧＦＱＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
ＡＧＷＬＲＱＹＧＭＤＶ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（５）ＡＹＷＩＡ（配列番号６１）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＭＩＷＰＰＤＡＤＡＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号６２）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
ＬＹＳＧＳＹＳＰ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；あるいは
（６）ＡＹＳＭＮ（配列番号６４）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＳＩＳＳＳＧＲＹＩＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６５）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
ＥＴＶＭＡＧＫＡＬＤＹ（配列番号６６）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み、
ここで、前記軽鎖は、軽鎖可変ドメイン及び猫の軽鎖定常ドメインを含み、ここで、前記軽鎖可変ドメインは、
（７）ＲＡＳＱＳＩＳＲＹＬＮ（配列番号６７）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＧＡＳＲＬＥＳ（配列番号６８）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＱＳＤＳＶＰＶＴ（配列番号６９）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（８）ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号７０）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号７１）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＱＳＹＳＴＰＰＹＴ（配列番号７２）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（９）ＲＡＳＱＳＩＦＮＹＶＡ（配列番号７３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号７４）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＱＲＳＫＷＰＰＴＷＴ（配列番号７５）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（１０）ＲＡＳＥＴＶＳＳＲＱＬＡ（配列番号７６）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号７７）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＱＹＧＳＳＰＲＴ（配列番号７８）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（１１）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＳＬＡ（配列番号７９）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号７７）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＫＹＳＳＹＰＬＴ（配列番号８０）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；あるいは
（１２）ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ（配列番号８１）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＧＡＳＴＧＡＴ（配列番号８２）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＱＹＹＳＦＬＡＫＴ（配列番号８３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
前記組み換えタンパク質は、前記ｆＧＣＳＦを、抗原結合断片に連結するリンカをさらに含むものでもあり得る。一部の実施例において、軽鎖と重鎖とのあいだの鎖間ジスルフィド結合に位置する（ｉ）猫の重鎖定常１ドメイン内のシステイン、及び／または（ｉｉ）猫の軽鎖定常ドメイン内のシステインは、保存され、欠失され、及び／又はシステイン以外のアミノ酸残基で置換される。
本願に開示された組み換えタンパク質の一部の実施例において、前記重鎖可変ドメインは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
一部の実施例において、前記重鎖可変ドメインは、配列番号１，２，３，４，５または６に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する。
一部の実施例において、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号７，８，９，１０，１１，１２または１３に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する。
一部の実施例において、重鎖可変ドメインは、配列番号１，２，３，４，５または６のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変ドメインは、配列番号７，８，９，１０，１１，１２または１３を含む。
一部の実施例において、前記猫の重鎖定常１ドメインは、配列番号１４に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する。
一部の実施例において、前記猫の軽鎖定常ドメインは、配列番号１５に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する。
一部の実施例において、前記リンカは、ｆＧＣＳＦを、猫の重鎖定常１ドメインのＣ末端、重鎖可変ドメインのＮ末端、猫の軽鎖定常ドメインのＣ末端、及び／または軽鎖可変ドメインのＮ末端と連結する。一部の実施例において、前記リンカは、１ないし５０個のアミノ酸、または１ないし２０個のアミノ酸を含む。一部の実施例において、前記リンカは、（ＧｐＳｓ）ｎまたは（ＳｐＧｓ）ｎの式を含み、ここで、Ｇは、グリシンであり、Ｓは、セリンであり、ｐは、１ないし１０の整数であり、ｓは、０、または１ないし１０の整数であり、ｐ＋ｓは、２０以下の整数であり、ｎは、１～２０の整数である。
本明細書において、組み換えタンパク質は、猫キメラ抗体断片であるＦＬ３５５Ｆａｂ抗体断片と猫ＧＣＳＦとを融合して製造され得、前記組み換えタンパク質は、薬動学的特性が改善され、猫汎白血球減少症の治療において、白血球を治療学的に有効なレベルに増加させることが立証された。従って、本明細書においては、血清アルブミンに結合する抗原結合断片、及び猫の顆粒球コロニー刺激因子を含む組み換えタンパク質が開示される。
本明細書において使用される用語「重鎖（ＨＣまたはＣＨ：heavy chain）」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域（ＶＲ：variable region）配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ、及び３個の定常領域ドメインＣＨ１，ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片をいずれも意味する。本明細書において使用される用語「軽鎖（ＬＣまたはＣＬ：light chain）」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ、及び定常領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片をいずれも意味する。
一部の実施態様において、前記アルブミンに結合する抗原結合断片は、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び前記ドメインに連結された猫の重鎖定常１ドメイン；並びに、例えば、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、及び前記ドメインに連結された猫の軽鎖定常ドメインを含むことにより、キメラ化されうる。
前記猫の重鎖定常１ドメイン及び前記猫の軽鎖定常ドメインは、ＩｇＧ１抗体定常ドメインに由来するものであり得、それらのうちいずれか１以上は、軽鎖ドメインと重鎖ドメインとの間のジスルフィド結合に使用されるアミノ酸であるシステインが保存または欠失されるか、あるいはシステイン以外の他のアミノ酸残基で置換されたものでもあり得る。例えば、前記猫の重鎖定常１ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を含むものでもあり、前記猫の軽鎖定常ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を含むものでもあり得る。ドメイン内システインの欠失または置換は、前述の組み換えタンパク質を生産する過程において形質転換された細胞において、組み換えタンパク質の発現レベルを向上させるのに寄与しうる。一部の実施例において、軽鎖と重鎖とのあいだの鎖間ジスルフィド結合に位置する（ｉ）猫の重鎖定常１ドメイン内のシステイン、及び／または（ｉｉ）猫の軽鎖定常ドメイン内のシステインは、保存または欠失されるか、あるいはシステイン以外の他のアミノ酸残基で置換される。
一部の実施例において、前記猫キメラ抗原結合断片結合は、配列番号１６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号１７に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖を含むものでもあり得る。
前記猫由来の顆粒球コロニー刺激因子（ｆＧＣＳＦ）は、突然変異されていない天然型タンパク質でもあり得、それは、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/のような既公開のデータベースから得ることができ、例えば、配列番号１８のアミノ酸配列を含み得るが、それに限定されるものではない。一部の実施例において、前記猫の顆粒球コロニー刺激因子は、天然顆粒球コロニー刺激因子から、遊離システイン基及びＯ－糖鎖を除去することによっても変形され得、配列番号１９のアミノ酸配列を含むものでもあり得るが、それに限定されるものではない。前記遊離システイン基とＯ－糖鎖の除去は、組み換えタンパク質の生産、分離及び精製の過程の便宜性を提供することができる。
一部の実施例において、前記ｆＧＣＳＦは、配列番号１８に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施例において、前記ｆＧＣＳＦは、配列番号１９に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施例において、前記ｆＧＣＳＦは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
一部の実施例において、前記血清アルブミンに結合する抗原結合断片、及び猫の顆粒球コロニー刺激因子は、リンカを介して互いに連結されうる。例えば、前記リンカは、抗原結合断片の重鎖定常１ドメインのＣ末端、重鎖可変ドメインのＮ末端、軽鎖定常ドメインのＣ末端、及び軽鎖可変ドメインのＮ末端のうちから選択されたいずれか１つの領域と、前記顆粒球コロニー刺激因子とを連結し得る。また、前記リンカは、必要により、適宜変更して使用されうる。例えば、前記リンカは、１ないし５０個、または１ないし２０個の任意アミノ酸または非任意アミノ酸によってなるポリペプチドでもあり得る。前記ペプチドリンカは、Ｇｌｙ残基、Ａｓｎ残基及びＳｅｒ残基を含むものでもあり得、また、Ｔｈｒ及びＡｌａのような中性アミノ酸を含むものでもあり得る。ペプチドリンカに適するアミノ酸配列は、当業界で公知にされている。機能的モイエティ間の適切な分離を達成させるため、あるいは必要なモイエティ間（inter-moiety）相互作用を維持するためのリンカ最適化を考慮し、コピー数「ｎ」を調節することができる。当該技術分野において他のリンカも知られており、例えば、水溶性を向上させるために、極性アミノ酸残基を追加するだけではなく、柔軟性を維持させるために、Ｔ及びＡのようなアミノ酸残基を追加したＧリンカ及びＳリンカがある。従って、前記リンカは、Ｇ，Ｓ残基及び／またはＴ，Ａ残基を含む柔軟性リンカでもあり得る。前記リンカは、（ＧｐＳｓ）ｎ及び（ＳｐＧｓ）ｎのうちから選択される一般式を有することができ、その場合、独立して、ｐは、１ないし１０の整数であり、ｓは、０、あるいは０から１０までの整数であり、ｐ＋ｓは、２０以下の整数であり、ｎは、１ないし２０の整数である。さらに具体的には、前記リンカの例は、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４０）、（ＳＧＧＧ）ｎ（配列番号４１）、（ＳＲＳＳＧ）ｎ（配列番号４２）、（ＳＧＳＳＣ）ｎ（配列番号４３）、（ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ）ｎ（配列番号４４）、（ＲＰＰＰＰＣ）ｎ（配列番号４５）、（ＳＳＰＰＰＰＣ）ｎ（配列番号４６）、（ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ）ｎ（配列番号４７）、（ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＥＧＳＧＳＴＫＧ）ｎ（配列番号４８）、（ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ）ｎ（配列番号４９）または（ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ）ｎ（配列番号５０）を含むものでもあり得、ここで、ｎは、１ないし２０、または１から１０の整数であり得る。
一部の実施態様において、前記リンカは、ｆＧＣＳＦと、猫の重鎖定常１ドメインのＣ末端、重鎖可変ドメインのＮ末端、猫の軽鎖定常ドメインのＣ末端、及び／または軽鎖可変ドメインのＮ末端を連結する。一部の実施例において、前記リンカは、（ＧｐＳｓ）ｎまたは（ＳｐＧｓ）ｎの式を含み、ここで、Ｇは、グリシンであり、Ｓは、セリンであり、ｐは、１ないし１０の整数であり、ｓは、０、または１ないし１０の整数であり、ｐ＋ｓは、２０以下の整数であり、ｎは、１ないし２０の整数である。また、前記リンカは、配列番号２０または配列番号２１のアミノ酸配列を含むものでもあり得るが、それに限定されるものではない。
一部の実施態様において、前記組み換えタンパク質は、猫血清アルブミンに結合する抗原結合断片を含む重鎖組み換えタンパク質の組み合わせによっても構成され得、ここで、前記抗原結合断片は、重鎖可変ドメイン及び猫の重鎖定常１ドメイン、及び猫の重鎖定常ドメインのＮ末端と連結された猫の顆粒球コロニー刺激因子；並びに猫血清アルブミンに結合する抗原結合断片と結合され、ここで、前記抗原結合断片は、軽鎖可変ドメイン及び猫の軽鎖定常ドメインと連結される。ここで、前記重鎖組み換えタンパク質は、配列番号２２または２３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９７％、１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むものでもあり得、前記軽鎖可変ドメインを含む抗原結合断片は、配列番号１７に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含むものでもあり得る。
前記組み換えタンパク質は、猫の顆粒球コロニー刺激因子の固有な生物学的活性を維持しながら、格段に改善された薬動学的特性を有することができる。
本明細書において使用される用語、「抗体」（antibody及びantibodies）は、当業界の用語であり、相互交換的に使用され得、抗原に特異的に結合する抗原結合部位を有する分子を称する。抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組み換え的に生成された抗体、ヒト抗体、猫抗体、表面露出残基変形抗体（resurfaced antibodies）、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、２個の重鎖及び２個の軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖・抗体重鎖対、イントラボディ（intrabodies）、ヘテロ接合体抗体、単一ドメイン抗体、一価抗体、一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体、アフィボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイブ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗・抗Ｉｄ抗体を含む）、二重特異性抗体、及び多重特異的抗体を含み得る。
抗体は、任意の類型（例：ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＹ）、任意のクラス（例：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２）、または任意のサブクラス（例：免疫グロブリン分子のＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ）の免疫グロブリン分子であり得る。一部の実施例において、前記抗体は、猫キメラ抗体である。
本明細書において使用される用語、「バイオエフェクターモイエティ」、「抗原結合ドメイン」、「抗原結合領域」、「抗原結合部位」、及びそれと類似した用語は、前記組み換えタンパク質に抗原に対する特異性を付与するアミノ酸残基を含む組み換えタンパク質の部分を意味する（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ））。前記抗原結合領域は、猫、齧歯類（例えば、マウス、ラットまたはハムスター）、及びヒトのような任意の動物類に由来しうる。
本明細書において使用される用語、「可変領域」または「可変ドメイン」は、相互交換的に使用され、当業界において、一般的なものである。前記可変領域は、典型的に、抗体の一部、一般的に、軽鎖または重鎖の一部、典型的に、成熟した重鎖における約１１０ないし１２０個のアミノ酸、及び成熟した軽鎖における約９０ないし１１５個のアミノ酸を称し、それは、抗体間配列が特に異なり、特定抗原に対する特定抗体の結合と特異性とに使用される。前記配列の可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域に集中される一方、可変ドメインにおいて、より高度に保存された領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される。何らかの特定のメカニズムまたは理論にとらわれず、軽鎖及び重鎖のＣＤＲは、抗原と抗体との相互作用及び特異性に係わる主な原因になると見られる。特定実施例において、前記可変領域は、ヒト可変領域である。特定実施例において、前記可変領域は、齧歯類ＣＤＲまたはマウスＣＤＲ、及びヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。特定実施例において、該可変領域は、霊長類（例えば、非ヒト霊長類）可変領域である。特定実施例において、前記可変領域は、齧歯類ＣＤＲまたはマウスＣＤＲ及び霊長類（例えば、非ヒト霊長類）フレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
用語、「ＶＬ」及び「ＶＬドメイン」は、抗体の軽鎖可変領域を称するために、相互交換的に使用される。用語、「ＶＨ」及び「ＶＨドメイン」は、抗体の重鎖可変領域を称するために相互交換的に使用される。
用語「Kabatナンバリング（Kabat numbering）」、及びそれと類似した用語は、当業界に認識されており、抗体の重鎖可変領域内及び軽鎖可変領域内のアミノ酸残基、またはその抗原結合部分内のアミノ酸残基をナンバリングするシステムである。特定態様において、抗体のＣＤＲは、Kabatナンバリングシステムによって決定され得る（例えば、Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 and Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242参照）。Kabatナンバリングシステムを使用して、抗体重鎖分子内のＣＤＲは、典型的に、アミノ酸位置３１ないし３５（任意で、位置３５（Kabatナンバリング方式において、３５Ａ及び３５Ｂと称される）の後に１個または２個のさらなるアミノ酸を含み得る）（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０ないし６５（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸位置９５ないし１０２（ＣＤＲ３）に存在する。Kabatナンバリングシステムを使用して、抗体軽鎖分子内のＣＤＲは、典型的に、アミノ酸位置２４ないし３４（ＣＤＲ１）、アミノ酸位置５０ないし５６（ＣＤＲ２）、及びアミノ酸位置８９ないし９７（ＣＤＲ３）に存在する。一部の実施例において、本願明細書に記載された抗体のＣＤＲは、Kabatナンバリング方式によって決定されたものである。
本明細書において使用される用語、「定常領域」または「定常ドメイン」は、相互交換可能であり、当業界において、共通した意味を有する。前記定常領域は、抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用のような多様なエフェクター機能を示すことができる抗体部分、例えば、軽鎖及び／または重鎖のカルボキシル末端部分である。免疫グロブリン分子の定常領域は、一般的に、免疫グロブリン可変ドメインに比べ、より保存されたアミノ酸配列を有する。
本明細書において使用される用語「重鎖」は、抗体と係わって使用される場合、定常領域のアミノ酸配列に基づいて任意の別個類型、例えば、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）及びミュー（μ）を称し得、それらはそれぞれＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧ及びＩｇＭ類型の抗体を生成し、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４のようなＩｇＧのサブクラスを含む。
本明細書において使用される用語「軽鎖」は、抗体と係わって使用される場合、定常領域のアミノ酸配列に基づいて任意の別個類型、例えば、カッパー（κ）またはラムダ（λ）を称しうる。軽鎖アミノ酸配列は、当業界でよく知られている。特定実施例において、該軽鎖は、ヒト軽鎖である。
「結合親和力」は、一般的に、分子（例えば、抗体）の単一結合部位と、その結合パートナー（例えば、抗原）との非共有結合的相互作用の総合強度を称する。他に明示されない限り、本明細書において使用される「結合親和力」は、結合対の構成員（例えば、抗体及び抗原）間１：１相互作用を反映させた固有の結合親和力を称する。パートナーＹに対する分子Ｘの親和力は、一般的に、解離定数（ＫＤ）によって示すことができる。該親和力は、以下のところに限定されるものではないが、平衡解離定数（ＫＤ）及び平衡結合定数（ＫＡ）を含む当業界で公知の多様な方式により、測定及び／または表現されうる。前記ＫＤは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの商から算出される一方、ＫＡは、ｋｏｎ／ｋｏｆｆの商から算出される。ｋｏｎは、例えば抗原に対する抗体の、結合速度定数を称し、ｋｏｆｆは、例えば抗原に対する抗体の、解離定数を称する。ｋｏｎ及びｋｏｆｆは、BIAcore（登録商標）またはKinExAのような当業者に知られた技術によって決定され得る。
本明細書において使用される「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当業界で定義されている。そのようなファミリーは、塩基性側鎖（例：リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例：アスパラギン酸、グルタミン酸）、電荷を帯びていない極性側鎖（例：グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例：アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ－分枝型側鎖（例：トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例：チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。特定実施例において、抗体のＣＤＲ内またはフレームワーク領域内の１以上のアミノ酸残基は、類似した側鎖を有するアミノ酸残基で代替されうる。
本明細書において使用される「エピトープ」は、当業界の用語であり、抗体が特異的に結合しうる抗原の局所領域を称する。該エピトープは、例えば、ポリペプチドの連続アミノ酸（線形エピドープまたは連続エピトープ）でもあり得、あるいは該エピトープは、例えば、１つのポリペプチドまたは複数のポリペプチドの２個以上の非連続領域から共に出てくることができる（立体配置的，非線形，不連続または非連続エピトープ）。特定実施例において、抗体が結合する前記エピトープは、例えば、ＮＭＲ分光法、Ｘ線回折結晶学研究、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析法とカップリングされた水素／重水素交換（例えば、液体クロマトグラフィエレクトロスプレー質量分析）、アレイベースのオリゴペプチドスキャニング分析、及び／または突然変異誘発マッピング（例：部位指定突然変異誘発マッピング）によって決定され得る。Ｘ線結晶学の場合、結晶化は、当業界に知られた任意の方法を使用して達成されることができる（例：Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303）。抗体：抗原結晶は、周知のＸ線回折技術を使用しても研究され、Ｘ－ＰＬＯＲ（Yale University, 1992, distributed by Molecular Simulations, Inc.; Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,; U.S. 2004/0014194)、及びBUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 1316-1323を参照）のようなコンピュータソフトウェアを使用しても高精度化される。突然変異誘発マッピング研究は、当業者に知られた任意の方法を使用して達成され得る。アラニンスキャニング突然変異誘発技術を含む突然変異誘発技術に係わる説明については、例えば、Champe M et al., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394、及びCunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085を参照する。一部の実施例において、抗体の前記エピトープは、アラニンスキャニング突然変異誘発研究を使用して決定される。
本明細書において使用される用語、「免疫特異的に結合」、「免疫特異的に認識」、「特異的に結合」、及び「特異的に認識」は、抗体の文脈において類似した用語であり、当業者によってそのような結合が理解されるところの、抗原に結合する分子（例えば、エピトープ、免疫複合体、または抗原結合サイトの結合パートナー）を称する。例えば、抗原に特異的に結合する分子は、一般的に、例えば、免疫アッセイ、BIAcore（登録商標）、KinExA3000機器（Sapidyne Instruments, Boise, ID）、または当業界に知られたその他アッセイによって決定されるところにより、他のペプチドまたはポリペプチドにより低い親和力で結合することができる。一部の実施例において、抗原に免疫特異的に結合する分子は、該分子が他の抗原に結合するときのＫＡに比べ、少なくとも、２ｌｏｇ、２．５ｌｏｇ、３ｌｏｇ、４ｌｏｇ、またはさらに大きいＫＡで該抗原に結合する。
他の実施態様において、抗原に免疫特異的に結合する分子は、類似した結合条件下において、他のタンパク質と交差反応しない。一部の実施例において、抗原に免疫特異的に結合する分子は、他のタンパク質と交差反応しない。一部の実施例において、他の関連性のない抗原に対してより高い親和力で特定抗原に結合する組み換えタンパク質が、本願に提供される。特定実施例において、特定抗原（例えば、ヒト血清アルブミン）と結合する組み換えタンパク質が本願に提供される。前記組み換えタンパク質は、他の抗原、または関連性がない抗原に比べ、特定抗原に対して、例えば、放射性免疫検定、表面プラズモン共鳴または動力学排除アッセイによって測定されたとき、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上高い親和力で結合するものでもある。一部の実施例において、関連性のないタンパク質に対する本願に記載された組み換えタンパク質の結合程度は、例えば、放射性免疫検定によって測定された特定抗原に対する抗体の結合の１０％、１５％または２０％未満である。
一部の実施態様において、猫、齧歯類（例えば、マウス、ラットまたはハムスター）及びヒトのような多様な種の抗原に結合する組み換えタンパク質が本願に提供される。一部の実施態様において、抗原の他種より高い親和力でもって猫抗原に結合する組み換えタンパク質が本願に提供される。特定実施例において、例えば、放射性免疫分析、表面プラズモン共鳴または動力学排除分析によって測定されたとき、他種に比べ、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、またはそれ以上高い親和力で猫抗原に結合する組み換えタンパク質が本願に提供される。一部の実施例において、本願において記述される組み換えタンパク質は、猫抗原に結合し、例えば、放射性免疫分析、表面プラズモン共鳴または動力学排除分析によって測定されたとき、猫抗原タンパク質に対する抗体の結合の１０％、１５％、または２０％より少なく、他種の抗原に結合する。
本明細書において使用される用語「宿主細胞」は、任意種類の細胞、例えば、一次細胞、培養中の細胞、細胞株由来細胞であり得る。実施形態において、用語「宿主細胞」は、核酸分子によってトランスフェクトされた細胞、及びそのような細胞の子孫、または潜在的な子孫を称する。そのような細胞の子孫は、例えば、突然変異または後続世代で生じうる環境的影響、または核酸分子の宿主細胞ゲノムにおける統合により、核酸分子にトランスフェクトされた親細胞と同一ではない。
本明細書において使用される用語「有効量」は、被験者に対する治療投与の文脈において、所望する予防効果または治療効果を達成する治療の量を称する。
一部の実施態様において、前記Ｆａｂは、配列番号１，２，３，４，５または６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ドメインを含む。
一部の実施態様において、前記Ｆａｂは、配列番号７，８，９，１０，１１，１２または１３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ドメインを含む。
一部の実施態様において、前記Ｆａｂは、配列番号１，２，３，４，５または６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ドメイン、及び配列番号７，８，９，１０，１１，１２または１３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ドメインをそれぞれ含むか、あるいは前述の重鎖可変領域ドメイン及び軽鎖可変領域ドメインの任意組み合わせを含む。例えば、前記Ｆａｂは、配列番号６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％以上、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号１３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％以上、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含むものであり得る。
一部の実施態様において、前記Ｆａｂは、配列番号１６（ＶＨＣＨ１ドメイン）に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％以上、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖ドメイン、及び配列番号１７（ＶＬ－ＣＬドメイン）に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％以上、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖ドメインを含む。
特定の態様において、本願において記述された組み換えタンパク質は、そのＶＬドメイン単独、またはそのＶＨドメイン単独、またはその３個のＶＬ ＣＤＲ単独、またはその３個のＶＨ ＣＤＲ単独によっても記述され得る。例えば、その全体が本願に参照によって統合されるRader C et al., (1998) PNAS 95: 8910-8915を参照すれば、ヒト軽鎖またはヒト重鎖のライブラリーから、それぞれ補完的な軽鎖または重鎖を確認し、マウス抗αｖβ３抗体に対するヒト化を遂行し、それは、本来の抗体の親和力に比べ、同様に高いか、あるいはより高い親和力を有するヒト化抗体変異体を提供することを記述する。また、その全体が本願に参照によって統合されるClackson T et al., (1991) Nature 352: 624-628を参照すれば、相補的な可変ドメインに係わるライブラリースクリーニング、及び特定ＶＬドメイン（または、ＶＨドメイン）を使用し、特定抗原と結合する抗体を生産する方法を記述する。前記スクリーニングは、ＥＬＩＳＡによって決定されたように強力なバインダーである、特定ＶＨドメインにつき、１３個の新たなパートナー、及び特定ＶＬドメインにつき、１４個の新たなパートナーを作製した。また、その全体が本願に参照によって統合されるKim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45: 572-577を参照すれば、相補的なＶＬドメインに対するライブラリー（例：ヒトＶＬライブラリー）スクリーニング、及び特定ＶＨドメインを使用し、特定抗原と結合する抗体を生産する方法を記述し、選択されたＶＬドメインは、追加の相補的な（例：ヒト）ＶＨドメインの選択をガイドするのにも使用されえる。
特定の態様において、抗体の前記ＣＤＲは、免疫グロブリン構造ループの位置を示すChothiaナンバリング方式によって決定され得る（例えば、Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82;及び米国特許No. 7,709,226）。典型的に、Kabatナンバリング規則を使用する場合、Chothia ＣＤＲ－Ｈ１ループは、重鎖アミノ酸２６ないし３２，３３または３４に存在し、Chothia ＣＤＲ－Ｈ２ループは、重鎖アミノ酸５２ないし５６に存在し、Chothia ＣＤＲ－Ｈ３ループは、重鎖アミノ酸９５ないし１０２に存在する一方、Chothia ＣＤＲ－Ｌ１ループは、軽鎖アミノ酸２４ないし３４に存在し、Chothia ＣＤＲ－Ｌ２ループは、軽鎖アミノ酸５０ないし５６に存在し、Chothia ＣＤＲ－Ｌ３ループは、軽鎖アミノ酸８９ないし９７に存在する。Kabatナンバリング規則を使用して番号を付すとき、Chothia ＣＤＲ－Ｈ１ループの末端は、ループの長さにより、Ｈ３２とＨ３４との間で異なる（それは、Kabatナンバリング体系は、挿入物をＨ３５Ａ及びＨ３５Ｂに配するためであり、３５Ａまたは３５Ｂがいずれも存在しない場合、ループは、３２で終結され、３５Ａだけ存在する場合、ループは、３３で終結され、３５Ａと３５Ｂとがいずれも存在する場合、ループは、３４で終結される）。
特定の態様において、血清アルブミン（例えば、猫血清アルブミン）に特異的に結合し、ＶＬのChothia ＶＬ ＣＤＲを含む組み換えタンパク質が本願に提供される。特定態様において、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に特異的に結合し、ＶＨのChothia ＶＨ ＣＤＲを含む抗体が本願で提供される。特定態様において、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に特異的に結合し、ＶＬのChothia ＶＬ ＣＤＲを含み、ＶＨのChothia ＶＨ ＣＤＲを含む抗体が本願で提供される。特定実施例において、血清アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）に特異的に結合する抗体は、１以上のＣＤＲを含み、ここで、Chothia及びKabat ＣＤＲは、同一アミノ酸配列を有する。特定実施例において、血清アルブミンに特異的に結合し、Kabat ＣＤＲ及びChothia ＣＤＲの組み合わせを含む抗体が本願で提供される。
特定の態様において、抗体の前記ＣＤＲは、Lefranc MP, (1999) The Immunologist 7: 132-136、及びLefranc MP et al., (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212に記載されているようなＩＭＧＴナンバリングシステムによって決定され得る。前記ＩＭＧＴナンバリング体系によれば、ＶＨ－ＣＤＲ１は、位置２６ないし３５、ＶＨ－ＣＤＲ２は、位置５１ないし５７、ＶＨ ＣＤＲ３は、位置９３ないし１０２、ＶＬ－ＣＤＲ１は、位置２７ないし３２、ＶＬ－ＣＤＲ２は、位置５０ないし５２、ＶＬ－ＣＤＲ３は、位置８９ないし９７にある。
特定の態様において、抗体の前記ＣＤＲは、MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745によって決定され得る。また、例えば、Martin A. 「Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains」， Antibody Engineering, Kontermann、及びDubel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)を参照する。
特定の態様において、抗体の前記ＣＤＲｓは、ＡｂＭナンバリング体系によって決定され、それは、Kabat ＣＤＲとChothia構造ループとの折衷案を示すＡｂＭ超可変領域を称し、オックスフォード分子グループ抗体モデリングソフトウェア（Oxford Molecular Group, Inc.）によって使用される。
一部の実施態様において、本願に記載された抗体のＶＨ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）領域、及び／またはＶＬ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）領域による１以上のＣＤＲの位置は、抗原に対する免疫特異的結合が維持される範囲（例えば、実質的に維持、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）において、１個、２個、３個、４個、５個、または６個のアミノ酸位置によって異なり得る。例えば、本願に記載される抗体のＣＤＲを定義する位置は、本願に記載された或る抗体のＣＤＲ位置と比べて、抗原に対する免疫特異的結合が維持される範囲（例えば、実質的に維持、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）において、ＣＤＲのＮ末端及び／またはＣ末端の境界を１個、２個、３個、４個、５個または６個のアミノ酸だけ移動させることによって異なり得る。他の実施例において、本願に記載される抗体のＶＨ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）領域、及び／またはＶＬ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３）領域に沿った１以上のＣＤＲの長さは、抗原に対する免疫特異的結合が維持される範囲（例えば、実質的に維持、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）において、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸だけ異なり得る（例えば、より短いか、あるいはより長い）。
一部の実施態様において、本願に記載されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及び／またはＶＨ ＣＤＲ３は、本願に記載されたＣＤＲのうち１以上と比べて、抗原に対する免疫特異的結合が維持される範囲（例えば、実質的に維持、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）において、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸だけ短いものであり得る。他の実施例において、本願に記載されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及び／またはＶＨ ＣＤＲ３は、本願に記載されたＣＤＲのうち１以上と比べて、抗原に対する免疫特異的結合が維持される範囲（例えば、実質的に維持、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）において、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸だけ長いものであり得る。他の実施例において、本願に記載されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及び／またはＶＨ ＣＤＲ３のアミノ末端は、本願に記載されたＣＤＲのうち１以上と比べて、抗原に対する免疫特異的結合が維持される範囲（例えば、実質的に維持、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）において、
１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸だけ延長されることができる。他の実施例において、本願に記載されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及び／またはＶＨ ＣＤＲ３のカルボキシ末端は、本願に記載されたＣＤＲのうち１以上と比較し、抗原に対する免疫特異的結合が維持される範囲（例えば、実質的に維持、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）において、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸だけ延長されうる。他の実施例において、本願に記載されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及び／またはＶＨ ＣＤＲ３のアミノ末端は、本願に記載されたＣＤＲのうち１以上と比較し、抗原に対する免疫特異的結合が維持される範囲（例えば、実質的に維持、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）において、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸だけ短くなることができる。他の実施例において、本願に記載されるＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ３、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及び／またはＶＨ ＣＤＲ３のカルボキシ末端は、本願に記載されたＣＤＲのうち１以上と比べて、抗原に対する免疫特異的結合が維持される範囲（例えば、実質的に維持、例えば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％）において、１個、２個、３個、４個、５個、またはそれ以上のアミノ酸だけ短くなることができる。当業界で公知の任意の方法が、抗原に対する免疫特異的結合が維持されるか否かということを確認するために使用され、例えば、本願の「実施例」欄に記述された結合アッセイ及びその条件が使用されうる。
２個の配列（例えば、アミノ酸配列または核酸配列）間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用しても達成され得る。２つのシークエンスの比較に使用される数学的アルゴリズムの具体的な非限定的例としては、Karlin S & Altschul SF (1993) PNAS 90: 5873-5877のように変形されたKarlin S & Altschul SF (1990) PNAS 87: 2264-2268のアルゴリズムがある。そのようなアルゴリズムは、Altschul SF et al., (1990) J Mol Biol 215: 403のＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラムに統合されている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索はＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータ設定、例えば、スコア＝１００、単語長＝１２で遂行され、本願に記載された核酸分子と相同性であるヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索はＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータ設定、例えば、スコア＝５０、単語長＝３で遂行され、本願に記載されたタンパク質分子と相同性であるアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ整列を得るために、Altschul SF et al., (1997) Nuc Acids Res 25: 3389 3402に記載されているように、Gapped ＢＬＡＳＴが活用されうる。代替として、分子間の遠縁の関係を探索する反復的な検索を行うためにＰＳＩ ＢＬＡＳＴが使用され得る（同上）。ＢＬＡＳＴ，Gapped ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ Blastプログラムを使用する場合、各プログラム（例：ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる（例：worldwide web（ncbi.nlm.nih.gov）のNCBI(National Center for Biotechnology Information)参照）。配列比較に使用される数学的アルゴリズムの他の特定非制限的例は、Myers and Miller, 1988, CABIOS 4: 11 17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧシークエンス整列ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に統合されている。アミノ酸配列を比較するために、ＡＬＩＧＮプログラムを使用するとき、ＰＡＭ１２０加重値残基表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４が使用されうる。
２個の配列間のパーセント同一性は、ギャップを許容するか、あるいは許容せず、前述のところと類似した技術を使用して決定され得る。該パーセント同一性を計算するとき、典型的に、正確なマッチだけがカウントされる。
本願に開示された組み換えタンパク質は、検出可能な標識または物質に、融合または接合されうる（例えば、共有結合または非共有連結）。検出可能な標識または物質の例としては、グルコースオキシダーゼのような酵素標識；ヨード（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）及びテクネチウム（９９Ｔｃ）のような放射性同位元素；ルミノールのような発光性ラベル；並びにフルオレセイン及びローダミンのような蛍光標識、並びにビオチンを含む。そのような標識された抗体は、抗原タンパク質を検出するのに使用され得る。
［抗体生産］
１つの例示的な実施例によれば、猫血清アルブミンに結合する抗原結合断片を含む組み換えタンパク質（ＡＰＢ－Ｆ１）が製造され、ここで、前記抗原結合断片は、猫の重鎖定常１ドメイン及び猫の軽鎖定常ドメイン、並びに前記猫の重鎖定常１ドメインに融合された突然変異猫の顆粒球コロニー刺激因子と連結される。それぞれの因子が有している生物学的活性を維持しながら、組み換えタンパク質を高収率で得ることができることを確認した。
他の態様は、（ａ）前記細胞を培養する段階、及び（ｂ）前記培養された細胞から、組み換えタンパク質を回収する段階を含む組み換えタンパク質を製造する方法を提供する。前記細胞は、多様な培地において培養され得る。商業的に利用可能な培地は、制限なしに培養培地として使用され得る。当業者に知られた他の全ての必須補充剤も、適切な濃度で含まれうる。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用された条件であり、当業者に自明であろう。組み換えタンパク質の回収は、例えば、遠心分離または限外濾過によって不純物を除去し、例えば、親和性クロマトグラフィなどによって結果物を精製することによって遂行され得る。他の追加精製技術、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィまたは陽イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィなどが使用されうる。
本願に開示された組み換えタンパク質は、抗体合成について当業界に知られた任意の方法、例えば、化学的合成技術または組み換え発現技術によって生成され得る。本願に記述された方法は、他に指示されない限り、分子生物学、微生物学、遺伝子分析、組み換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチドの合成及び修飾、核酸ハイブリダイゼーション、及び関連技術分野の関連分野において一般的な技術を使用する。そのような技術は、例えば、ここに引用された参照文献に記述されており、該文献に完全に説明されている。例えば、Maniatis T et al., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Sambrook J et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B et al., (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press参照。
一部の実施態様において、本願に記載された組み換えタンパク質（例えば、組み換え抗体）は、例えば、合成、ＤＮＡ配列の遺伝工学を介する生成を含む任意の手段により、製造、発現、生成または分離された抗体である。特定実施例において、そのような抗体は、動物または哺乳動物（例えば、ヒト）の生体内抗体生殖系列レパートリー内に自然に存在しない配列（例えば、ＤＮＡ配列またはアミノ酸配列）を含む。
一部の態様において、本願に記載された細胞または宿主細胞を培養することを含む、本願に記載された組み換えタンパク質の製造方法が、本願に提供される。一部態様において、本願に記載された細胞または宿主細胞（例えば、本願に記載された抗体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞または宿主細胞）を使用して抗体を発現（例えば、組み換え的な発現）することを含む、組み換えタンパク質の製造方法が本願に提供される。一部の実施例において、前記細胞は、単離された細胞である。一部の実施例において、外因性ポリヌクレオチドが前記細胞内に導入されている。一部の実施例において、前記方法は、前記細胞または宿主細胞から得られた抗体を精製することをさらに含む。
抗体は、ハイブリドーマ、組み換え及びファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む当業界に知られた非常に多様な技術を使用して製造することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当業界に知られており、例えば、Harlow E & Lane D, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling GJ et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier, NY, 1981)に教示される。本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術を介して生産された抗体に限定されるものではない。例えば、該モノクローナル抗体は、本願に記載された抗体を、外因的に発現する宿主細胞から組み換え的にも生成されえる。
本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、単一細胞（例えば、組み換え抗体を生産するハイブリドーマまたは宿主細胞）によって生成された抗体であり、ここで、前記抗体は、例えば、当業界または本願に提供された実施例において知られたＥＬＩＳＡまたは他の抗原結合アッセイ、または競合的結合アッセイによって決定されるところにより抗原（例：ヒト血清アルブミン）と免疫特異的に結合する。特定実施例において、該モノクローナル抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。特定実施例において、該モノクローナル抗体は、一価抗体または多価（例えば、二価）抗体であり得る。特定実施例において、該モノクローナル抗体は、Ｆａｂ断片またはＦ（ａｂ’）２断片であり得る。本願に記載されたモノクローナル抗体は、例えば、文献Kohler G & Milstein C (1975) Nature 256:495に記載されたハイブリドーマ方法によって製造されるか、あるいは、例えば、本願に記載されているような技術を使用し、例えば、ファージライブラリーから分離され得る。クローン細胞株、及びそれによって発現されるモノクローナル抗体の製造のための他の方法は、当業界で周知である（例えば、文献Chapter 11 in: Short Protocols in Molecular Biology, (2002) 5th Ed., Ausubel FM et al., supra参照）。
ハイブリドーマ技術を使用し、特定抗体を生産してスクリーニングする方法は、ルーチンであり当業界でよく知られている。例えば、ハイブリドーマ方法において、マウス、または他の適切な宿主動物、例えば、羊、山羊、兎、ラット、ハムスターまたはマカク猿（macaque monkey）は、免疫化に使用される抗原（例：ヒト血清アルブミン）に特異的に結合しうる抗体を生産するか又は生産の能力を有するリンパ球を誘導するために免疫化される。代替として、該リンパ球は、インビトロで免疫化されうる。その後、該リンパ球は、ポリエチレングリコールのような適切な融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合され、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding JW(Ed), Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)）。さらには、ＲＩＭＭＳ（反復的免疫化多重部位）技術を使用して動物を免疫化することができる（この全体が参照として含まれるKilpatrick KE et al., (1997) Hybridoma 16: 381-9）。
本願に記載された抗体は、当業者に知られた任意の技術によって生成され得る。例えば、本願に記載されたＦａｂ断片及びＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片生成）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片生成）のような酵素を使用した、免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によっても生成され得る。該Ｆａｂ断片は、四量体抗体分子の２つの等しいアームのうち一つに該当し、重鎖のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと対をなす完全な軽鎖を含む。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域においてジスルフィド結合で連結された四量体抗体分子の２つの抗原結合アームを含む。
さらには、本願に記載された抗体はまた、当業界に知られた多様なファージディスプレイ方法を使用しても生成され得る。該ファージディスプレイ方法において、タンパク質は、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面にディスプレイされる。特に、ＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列が、動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、影響を受けた組織のヒトｃＤＮＡライブラリーまたは鼠ｃＤＮＡライブラリー）から増幅される。前述のＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードするＤＮＡは、ＰＣＲにより、ｓｃＦｖリンカと共に組み換えられ、ファージミドベクターにクローニングされる。前記ベクターは、E. coliに電気穿孔され、前記E. coliは、ヘルパーファージで感染される。そのような方法において使用されるファージは、一般的に、ｆｄ及びＭ１３を含むフィラメントファージであり、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、一般的に、ファージ遺伝子IIIまたは遺伝子VIIIに組み換え的に融合される。特定抗原に結合する抗体を発現するファージは、例えば、抗原を用いて、例えば標識された抗原、又は固体表面もしくはビーズに結合されたかもしくは捕獲された抗原を使用して選択又は同定されうる。本願に記載された抗体を製造するのに使用されうるファージディスプレイ方法の例は、Brinkman U et al., (1995) J Immunol Methods 182: 41-50; Ames RS et al., (1995) J Immunol Methods 184: 177-186; Kettleborough CA et al., (1994) Eur J Immunol 24: 952-958; Persic L et al., (1997) Gene 187: 9-18; Burton DR & Barbas CF (1994) Advan Immunol 57: 191-280; PCT/GB91/001134; WO90/02809, WO91/10737, WO92/01047, WO92/18619, WO93/11236, WO95/15982, WO95/20401及びWO97/13844；並びに米国特許Nos. 5,698,426, 5,223,409, 5,403,484, 5,580,717, 5,427,908, 5,750,753, 5,821,047, 5,571,698, 5,427,908, 5,516,637, 5,780,225, 5,658,727, 5,733,743及び5,969,108に開示されたものを含む。
前記参照文献に記載されているように、ファージ選択後、ファージ由来の前記抗体コード領域が分離され、ヒト抗体を含む抗体を生成するのに使用され、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母及びバクテリア、例えば、下記記述されたところを含む任意の所望する宿主において発現され得る。Ｆａｂ、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２断片のような抗体を組み換え的に生産する技術は、また、WO92/22324; Mullinax RL et al., (1992) BioTechniques 12 (6): 864-9; Sawai H et al., (1995) Am J Reprod Immunol 34: 26-34;及びBetter M et al., (1988) Scienceに開示された技術のような当業界に知られた方法を使用しても利用され得る。
一部の態様において、抗体を生成するために、ＶＨヌクレオチド配列またはＶＬヌクレオチド配列、制限部位、及び前記制限部位を保護するための側面配列を含むＰＣＲプライマーが、テンプレート、例えばｓｃＦｖから、ＶＨ配列またはＶＬ配列を増幅するために使用され得る。当業者に知られたクローニング技術を活用して、ＰＣＲによって増幅されたＶＨドメインは、ＶＨ定常領域を発現するベクターにクローニングされ、ＰＣＲによって増幅されたＶＬドメインは、ＶＬ定常領域、例えば、ヒトカッパ定常領域及びヒトラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングされ得る。前述のＶＨドメイン及びＶＬドメインは、また、必要な定常領域を発現する１つのベクターにクローニングされ得る。次に、重鎖転換ベクター及び軽鎖転換ベクターは、当業者に知られた技術を使用して、細胞株内に共トランスフェクトされ、抗体、例えば、ＩｇＧを発現する、安定した細胞株または一時的な細胞株を生成する。
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来している分子である。例えば、該キメラ抗体は、猫抗体の定常領域に融合されたヒトモノクローナル抗体の可変領域を含むものであり得る。該キメラ抗体を生産する方法は、当業界に知られている。例えば、Morrison SL (1985) Science 229: 1202-7; Oi VT & Morrison SL (1986) BioTechniques 4: 214-221; Gillies SD et al., (1989) J Immunol Methods 125: 191-202;並びに米国特許Nos. 5,807,715, 4,816,567, 4,816,397及び6,331,415を参照する。
猫キメラ抗体は、猫免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域、及びヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲを含み、あらかじめ決定された抗原に結合することができる。
［ポリヌクレオチド、ベクター及び細胞］
本願に開示された組み換えタンパク質をコードする核酸分子が本願に開示されている。
本願に開示された核酸分子を含む発現ベクターが本願に開示されている。
本願に開示された発現ベクターで形質転換された細胞が本願に開示されている。
前述の核酸、発現ベクター及び形質転換細胞は、前述の組み換えタンパク質、または組み換えタンパク質をコードする核酸をそのまま含むか、あるいはそれらを使用するので、共通する説明は、省略する。
例えば、一部態様において、前記組み換えタンパク質は、組み換えタンパク質をコードする核酸を単離することによって生産され得る。前記核酸は、単離され、複製可能なベクターに挿入され、追加クローニング（ＤＮＡ増幅）または追加発現を行う。それを基に、他の態様は、前記核酸を含むベクターに係わる。
本明細書において使用される用語「核酸」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）分子、並びにＲＮＡ分子を包括的に含み、核酸の基本単位であるヌクレオチドは、天然ヌクレオチドだけではなく、修飾された糖または塩基モイエティを有する類似体を含む。
前記核酸は、前記ヌクレオチド配列と実質的な同一性を示すヌクレオチド配列を含むと解釈される。実質的な同一性は、本開示のヌクレオチド配列と別の選択的配列とが可能な限り互いに対応するように整列され、前記整列された配列が、当業界で一般的に使用されるアルゴリズムを利用して分析される場合、少なくとも８０％の相同性、さらに具体的には、少なくとも９０％の相同性、そして最も具体的には、少なくとも９５％の相同性を示すヌクレオチド配列を意味する。
前記組み換えタンパク質をコードするＤＮＡは、一般的な過程（例えば、組み換えタンパク質をコードするＤＮＡに特異的に結合しうるオリゴヌクレオチドプローブを使用すること）を使用することによって容易に単離されるか、あるいは合成される。多くのベクターが使用されうる。ベクター成分は、一般的に、シグナル配列、複製基点、１以上のマーカー遺伝子、エンハンサ要素、プローモーター及び転写終結配列のうち１以上を含むが、それらに限定されるものではない。
本願に使用された用語「ベクター」は、宿主細胞において、標的遺伝子を発現するための手段として、プラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含む。前記ベクターにおいて、組み換えタンパク質をコードする核酸は、プローモーターに作動可能に連結される。
「作動可能に連結」は、核酸発現調節配列（例：プローモーター、シグナル配列、または転写調節因子結合位置のアレイ）と、他の核酸配列との機能的な結合を意味し、それにより、前記調節配列は、前記他の核酸配列の転写及び／または翻訳を調節することになる。
原核細胞が宿主として使用される場合、転写を指示することができる強力なプローモーター（例えば、ｔａｃプローモーター、ｌａｃプローモーター、ｌａｃＵＶ５プローモーター、ｌｐｐプローモーター、ｐＬλプローモーター、ｐＲλプローモーター、ｒａｃ５プローモーター、ａｍｐプローモーター、ｒｅｃＡプローモーター、ＳＰ６プローモーター、ｔｒｐプローモーター及びＴ７プローモーターなど）、翻訳開始のためのリボソーム結合部位、及び転写／翻訳終結配列が一般的に含まれる。例えば、真核細胞を宿主にする場合には、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプローモーター（例：メタロチオニンプローモーター、β－アクチンプローモーター、ヒトヘモグロビンプローモーター及びヒト筋肉クレアチンプローモーター）、または哺乳動物ウイルスに由来するプローモーター（例：アデノウイルス後期プローモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプローモーター、ＳＶ４０プローモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プローモーター、ＨＳＶのｔｋプローモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プローモーター、ＨＩＶのＬＴＲプローモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）のプローモーター、及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプローモーター）が利用され、転写終結配列として、ポリアデニル化配列を一般的に有する。一部の場合、前記ベクターは、そこから発現される組み換えタンパク質の精製を容易にするために、他の配列と融合され得る。前述の融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（Pharmacia、米国）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ、米国）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ、米国）及び６ｘＨｉｓ（hexahistidine；Quiagen、米国）などを含む。前記ベクターは、選択的マーカーとして、当業界で一般的に使用される抗生物質耐性遺伝子、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カルベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子を含む。
さらに他の態様において、本開示内容は、前述のベクターで形質転換された細胞を提供する。本発明の組み換えタンパク質を生産するのに使用される前記細胞は、原核細胞、酵母細胞または高等真核細胞であり得るが、それらに限定されるものではない。大腸菌（Escherichia coli）、枯草菌及びバチルス・チューリンゲンシスのようなバシラス属菌株、ストレプトマイセス（Streptomyces）、シュードモナス（Pseudomonas）（例えば、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida））、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、並びにブドウ球菌（Staphylococcus）（例えば、スタフィロコックス・カルノスス（Staphylococcus carnosus））のような原核宿主細胞を利用することができる。ただし、動物細胞が最大の関心を集めており、有用な宿主細胞株の例としては、ＣＯＳ－７、ＢＨＫ、ＣＨＯ（ＧＳ null ＣＨＯ－Ｋ１）、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ－１１、ＤＧ－４４、ＣＨＯ／－ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ－７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ３Ａ、Ｗ１３８、ＨｅｐＧ２、ＳＫ－Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ。Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、Ｕ２０ＳまたはＨＴ１０８０を含むが、それらに限定されるものではない。
本明細書において使用される用語「形質転換」は、本来の細胞が有していたところと異なる種類の外来遺伝子を有するＤＮＡ鎖断片またはプラスミドが細胞に浸透し、元来細胞に存在していたＤＮＡと結合することにより、細胞の遺伝形質を変化させる分子生物学的技術を意味する。前記形質転換は、前記組み換えタンパク質遺伝子を含む発現ベクターが宿主細胞に挿入されることを意味する。
抗原に免疫特異的に結合する本願に記載された組み換えタンパク質（例えば、可変軽鎖領域及び／または可変重鎖領域）をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子及びベクター、例えば、宿主細胞（例えば、大腸菌及び哺乳動物細胞）における組み換え発現のためのポリヌクレオチドを含むベクターが本願に提供される。本願に提供された任意の抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドだけではなく、そのようなポリヌクレオチド配列を含むベクター、例えば、宿主細胞（例えば哺乳動物細胞）におけるその効率的な発現のための発現ベクターが本願に提供される。
本願に使用された用語「単離された」ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、核酸分子の天然供給源（例：マウスまたはヒト）に存在する他の核酸分子から分離されたものである。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組み換え技術によって生産されるとき、他の細胞物質または培養培地が実質的に伴わないものであるか、あるいは化学的に合成されるとき、化学的前駆体、またはその他化学物質が実質的に伴わないものであり得る。例えば、文言「実質的にない」は、他の物質、例えば、細胞物質、培養培地、その他核酸分子、化学的前駆体、及び／またはその他化学物質を、約１５％，１０％，５％，２％，１％，０．５％または０．１％未満（特に、約１０％未満）に有するポリヌクレオチドまたは核酸分子の調製物を含む。一部の実施例において、本願に記載された抗体をコードする核酸分子は、単離されるか、あるいは精製される。
本願においては、抗原ポリペプチド（例えば、ヒト血清アルブミン）に免疫特異的に結合し、本明細書に記載されているようなアミノ酸配列を含む抗体だけではなく、抗原ポリペプチドに結合するために、該抗体と競合するか（例えば、用量依存的な方式により）、あるいは前記抗体と同一エピトープに結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが本願に提供される。
本願に記載された抗体の軽鎖または重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが本願に提供される。前記ポリヌクレオチドは、本願に記載された抗体のＶＬ ＦＲ及びＣＤＲを含む軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含むものであり得る。前記ポリヌクレオチドは、本願に記載された抗体のＶＨ ＦＲ及びＣＤＲを含む重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むものであり得る。
本願に記載されたヒト血清アルブミンに対する抗体の３個のＶＬ鎖ＣＤＲ、例えば、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２及びＶＬ ＣＤＲ３を含むＶＬ鎖ＣＤＲ、及び本願に記載されたヒト血清アルブミンに対する抗体の３個のＶＨ鎖ＣＤＲ、例えば、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２及びＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨ鎖ＣＤＲを含むＦａｂを含む組み換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが提供される。
ＶＬドメインを含む組み換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが本願で提供される。
特定の実施態様において、本願に記載されたポリヌクレオチドは、本願に記載されたアミノ酸配列（例えば、配列番号７，８，９，１０，１１，１２または１３）を含む軽鎖可変領域を含む本願に提供された組み換えタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、前記抗体は、血清アルブミンに免疫特異的に結合する。
特定実施態様において、本願に記載されたポリヌクレオチドは、本願に記載されたアミノ酸配列（例えば、配列番号１，２，３，４，５または６）を含む重鎖可変領域を含む本願に提供された抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、前記抗体は、血清アルブミンに免疫特異的に結合する。
特定の側面において、軽鎖及び重鎖、例えば、別個の軽鎖及び重鎖を含む抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが本願に提供される。軽鎖に関して、一部の実施例において、本願に提供されたポリヌクレオチドは、カッパ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。他の実施例において、本願に提供されたポリヌクレオチドは、ラムダ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。さらに他の実施例において、本願に提供されたポリヌクレオチドは、ヒトカッパ軽鎖またはヒトラムダ軽鎖を含む本願に記載された抗体をコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施例において、本願に提供されたポリヌクレオチドは、血清アルブミンに免疫特異的に結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、前記抗体は、軽鎖を含み、ここで、ＶＬドメインのアミノ酸配列は、下記提示された配列番号：７，８，９，１０，１１，１２または１３のアミノ酸配列を含むものでもあり、ここで、前記軽鎖の定常領域は、猫カッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列を含む。
また、例えば、コドン／ＲＮＡ最適化、異種シグナル配列への代替、及びｍＲＮＡ不安定要素の除去によって最適化された抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドが本願で提供される。ｍＲＮＡにおいて、コドン変化を導入する、及び／又は抑制領域を除去することにより、組み換え発現のための抗体またはその断片（例えば、軽鎖、重鎖、ＶＨドメインまたはＶＬドメイン）をコードする最適化された核酸を生成する方法は、例えば、米国特許Ｎｏｓ．５，９６５，７２６；６、１７４，６６６；６，２９１，６６４；６，４１４，１３２；６，７９４，４９８に説明された最適化方法を適用して遂行され得る。例えば、ＲＮＡ内の潜在的スプライス部位及び不安定要素（例：Ａ／Ｔリッチ要素またはＡ／Ｕリッチ要素）が、核酸配列によってコードされたアミノ酸を変更しないまま突然変異され、組み換え発現のためのＲＮＡの安定性を増大させることができる。前記変更は、例えば、同一アミノ酸に係わる代替コドンを使用し、遺伝暗号の縮退性を活用する。一部の実施例において、保存的突然変異、例えば、元来アミノ酸と類似した化学的構造、特性及び／または機能を有する類似したアミノ酸をコードするように、１以上のコドンを変更することが望ましくなり得る。
特定の実施態様において、本願に記載された抗体またはその断片（例えば、ＶＬドメインまたはＶＨドメイン）をコードする最適化されたポリヌクレオチド配列は、本願に記載された抗体またはその断片（例えば、ＶＬドメインまたはＶＨドメイン）をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンス（例えば、相補的）ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。特定実施例において、本願に記載された抗体または断片をコードする最適化されたヌクレオチド配列は、高いストリンジェンシー条件下において、本願に記載された抗体またはその断片をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする。一部の実施例において、本願に記載された抗体またはその断片をコードする最適化されたヌクレオチド配列は、高いストリンジェンシー、中間またはさらに低いストリンジェンシーのハイブリダイズ条件下において、本願に記載された抗体またはその断片をコードする最適化されていないヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする。ハイブリダイズ条件に係わる情報が記載されており、例えば、ＵＳ２００５／００４８５４９（例えば、段落７２－７３）を参照するが、それは、本願に参照として含まれる。
当業界に知られた任意の方法によって、ポリヌクレオチドを取得し、該ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定することができる。本願に記載された抗体、及びそれら抗体の変形されたバージョンをコードするヌクレオチド配列は、当業界に広く知られた方法を用いて決定され得、すなわち、特定アミノ酸をコードすると知られたヌクレオチドコドンが、抗体をコードする核酸を生成する態様においてアセンブルされる。抗体をコードするそのようなポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチド（例えば、Kutmeier G et al., (1994), BioTechniques 17: 242-246に記載されているところと同様である）からも組み立てられ、それは、簡略に述べると、前記抗体をコードする配列の部分を含む重畳オリゴヌクレオチドの合成、前記オリゴヌクレオチドのアニーリング及びライゲーション、及びその後のＰＣＲによるライゲーションされたオリゴヌクレオチドの増幅を含む。
代替として、本願に記載された抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチドは、当業界に広く知られた方法（例えば、ＰＣＲ、及びその他分子クローニング方法）を使用して、適する供給源（例えば、ハイブリドーマ）由来の核酸からも生成され得る。例えば、公知にされた配列の３’末端及び５’末端にハイブリダイズしうる合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅が、関心抗体を生産するハイブリドーマ細胞から得られたゲノムＤＮＡを使用して遂行され得る。そのようなＰＣＲ増幅方法は、抗体の軽鎖及び／または重鎖をコードする配列を含む核酸を得るのにも使用される。そのようなＰＣＲ増幅方法は、抗体の可変軽鎖領域及び／または可変重鎖領域をコードする配列を含む核酸を得るのにも使用される。増幅された核酸は、宿主細胞における発現、及び追加クローニング、例えば、キメラ抗体生成及びヒト化抗体生成のために、ベクター内にクローニングされ得る。
特定抗体またはその断片をコードする核酸を含むクローンを利用することができないにしても、抗体分子またはその断片の配列が知られている場合、免疫グロブリンまたは断片をコードする核酸は、適切な供給源（任意の組織または抗体を発現する細胞、例えば、本願に記載された抗体を発現するために選択されたハイブリドーマ細胞から生成された抗体ｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー、前記組織または細胞から分離された核酸分子、例えば、poly Ａ＋ＲＮＡ）から、前記配列の３’末端及び５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅、または例えば、前記抗体をコードするｃＤＮＡ由来のｃＤＮＡクローンを識別するための、特定遺伝子配列に係わる特定のオリゴヌクレオチドプローブを使用したクローニングにより、化学的に合成されるか、あるいは得られる。ＰＣＲによって生成された増幅された核酸は、当業界で周知の任意の方法を使用して、複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
本願に記載された組み換えタンパク質をコードするＤＮＡは、一般的な手順を使用して、容易に単離されて配列決定されうる（例えば、組み換えタンパク質の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合しうるオリゴヌクレオチドプローブを使用する）。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの供給源の役割を果たすことができる。いったん単離されれば、前記ＤＮＡは、発現ベクターに配置され得、それは、次に、E. coli細胞、猿ＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例：ＣＨＯ ＧＳ System（商標）（Lonza）由来のＣＨＯ細胞）、または通常なら免疫グロブリンタンパク質を生産しない骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトされ、組み換え宿主細胞で合成された組み換えタンパク質を得る。
抗体を生成するために、ＶＨヌクレオチド配列またはＶＬヌクレオチド配列、制限部位、及び制限部位を保護するための側面配列を含むＰＣＲプライマーが、ｓｃＦｖクローンにおけるＶＨ配列またはＶＬ配列を増幅することに使用され得る。当業者に知られたクローニング技術を利用してＰＣＲ増幅されたＶＨドメインは、重鎖定常領域、例えば、ヒトガンマ４定常領域を発現するベクター内にクローニングされ得、ＰＣＲ増幅されたＶＬドメインは、軽鎖定常領域、例えば、ヒトカッパ定常領域またはヒトラムダ定常領域を発現するベクター内にクローニングされ得る。特定実施例において、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを発現するためのベクターは、ＥＦ－１αプローモーター、分泌シグナル、可変ドメインのためのクローニング部位、定常ドメイン、及びネオマイシンのような選択マーカーを含む。ＶＨドメイン及びＶＬドメインはまた、必要な定常領域を発現する１つのベクターにもクローニングされ得る。次に、前述の重鎖転換ベクター及び軽鎖転換ベクターは、当業者に知られた技術を使用して、全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定した細胞株、または一時的な細胞株を生成するために、細胞株内に共トランスフェクトされる。
前記ＤＮＡは、また、例えば、マウス配列の代わりに、ヒト重鎖定常ドメイン及びヒト軽鎖定常ドメインに係わるコード配列を置換することにより、または非免疫グロブリンポリペプチドに係わるコード配列の全部または一部を、免疫グロブリンコード配列に共有結合的に連結することにより、変形されうる。
また、本願に記載された抗体をコードするポリヌクレオチドにつき、高いストリンジェンシー、中間または低いストリンジェンシーのハイブリッド化条件下においてハイブリダイズされるポリヌクレオチドが本願に提供される。特定実施例において、本願に記載されたポリヌクレオチドは、本願に提供されたＶＨドメイン及び／またはＶＬドメインをコードするポリヌクレオチドにつき、高いストリンジェンシー、中間またはさらに低いストリンジェンシーのハイブリダイズ条件下においてハイブリダイズされる。
ハイブリダイズ条件は、当業界に記載されており、当業者に知られている。例えば、ストリンジェントな条件下におけるハイブリダイズは、約４５℃における６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）内のフィルタ結合ＤＮＡに対するハイブリダイズに続き、約５０～６５℃において、０．２ｘ ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳにおける１以上の洗浄を含むものであり得、非常にストリンジェントな条件下におけるハイブリダイズは、約４５℃における６ｘＳＳＣ内のフィルタ結合核酸に対するハイブリダイズに続き、約６８℃において、０．１ｘ ＳＳＣ／０．２％ ＳＤＳにおける１以上の洗浄を含むものであり得る。他のストリンジェントなハイブリダイズ条件下におけるハイブリダイズは、当業者に知られており、例えば、Ausubel FM et al., eds., (1989) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., New York at pages 6.3.1-6.3.6 and 2.10.3を参照する。
以下を含む発現ベクターが本願にさらに開示される：
（ａ）プローモーター、
（ｂ）血清アルブミンに結合する抗原結合断片（Ｆａｂ）をコードする第１核酸分子、及び
（ｃ）ｆＧＣＳＦのような生理活性エフェクターモイエティ及びリンカをコードする第２核酸分子
ここで、前記プローモーター、前記第１核酸配列、及び前記第２核酸分子は、作動可能に連結される。前記第２核酸分子は、２、３、４、５、６、またはそれ以上の生理活性エフェクターモイエティ及びリンカをコードしうる。
また、次を含む発現ベクターが本願に開示される：
（ａ）プローモーター、及び
（ｂ）本願に開示されているような重鎖可変ドメイン、及び本願に開示されているような猫の重鎖定常１ドメインをコードする核酸分子。
また、次を含む発現ベクターが本願に開示される：
（ａ）プローモーター、及び
（ｂ）本願に開示されているようなｆＧＣＳＦ、本願に開示されているような重鎖可変ドメイン、及び本願に開示されているような猫の重鎖定常１ドメインをコードする核酸分子。
また、次を含む発現ベクターが本願に開示される：
（ａ）プローモーター、及び
（ｂ）本願に開示されているような軽鎖可変ドメイン、及び本願に開示されているような猫の軽鎖定常ドメインをコードする核酸分子。
また、次を含む発現ベクターが本願に開示される：
（ａ）プローモーター、及び
（ｂ）本願に開示されているようなｆＧＣＳＦ、本願に開示されているような軽鎖可変ドメイン、及び本願に開示されているような猫の軽鎖定常ドメインをコードする核酸分子。１個、２個、３個、またはそれ以上の発現ベクターまたは核酸分子が発現されて、所望する組み換えタンパク質を生成することができる。
一部の実施例において、第１核酸分子またはベクターは、（ａ）重鎖を含む抗原結合断片を含む組み換えタンパク質をコードする核酸配列を含み、ここで、前記重鎖は、重鎖可変ドメイン及び猫鎖定常１ドメインを含み、ここで、前記重鎖可変ドメインは、
（１）ＳＹＧＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン１（ＣＤＲ１）、
ＷＩＮＴＹＳＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン２（ＣＤＲ２）、及び
ＬＧＨＣＱＲＧＩＣＳＤＡＬＤＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン３（ＣＤＲ３）；
（２）ＳＹＧＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＲＩＮＴＹＮＧＮＴＧＹＡＱＲＬＱＧ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
ＬＧＨＣＱＲＧＩＣＳＤＡＬＤＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（３）ＮＹＧＩＨ（配列番号５５）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＳＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５６）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
ＤＶＨＹＹＧＳＧＳＹＹＮＡＦＤＩ（配列番号５７）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（４）ＳＹＡＭＳ（配列番号５８）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＶＩＳＨＤＧＧＦＱＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
ＡＧＷＬＲＱＹＧＭＤＶ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
（５）ＡＹＷＩＡ（配列番号６１）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＭＩＷＰＰＤＡＤＡＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号６２）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
ＬＹＳＧＳＹＳＰ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；あるいは
（６）ＡＹＳＭＮ（配列番号６４）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
ＳＩＳＳＳＧＲＹＩＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６５）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
ＥＴＶＭＡＧＫＡＬＤＹ（配列番号６６）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む。
一部の実施態様において、第２核酸分子またはベクターは、（ａ）軽鎖を含む抗原結合断片を含む組み換えタンパク質をコードする核酸配列を含み、ここで、前記軽鎖は、軽鎖可変ドメイン及び猫の軽鎖定常ドメインを含み、ここで、前記軽鎖可変ドメインは、
（７）ＲＡＳＱＳＩＳＲＹＬＮ（配列番号６７）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＧＡＳＲＬＥＳ（配列番号６８）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＱＳＤＳＶＰＶＴ（配列番号６９）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（８）ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号７０）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号７１）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＱＳＹＳＴＰＰＹＴ（配列番号７２）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（９）ＲＡＳＱＳＩＦＮＹＶＡ（配列番号７３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号７４）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＱＲＳＫＷＰＰＴＷＴ（配列番号７５）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（１０）ＲＡＳＥＴＶＳＳＲＱＬＡ（配列番号７６）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号７７）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＱＹＧＳＳＰＲＴ（配列番号７８）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
（１１）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＳＬＡ（配列番号７９）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号７７）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＫＹＳＳＹＰＬＴ（配列番号８０）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；あるいは
（１２）ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ（配列番号８１）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
ＧＡＳＴＧＡＴ（配列番号８２）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
ＱＱＹＹＳＦＬＡＫＴ（配列番号８３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む。
例えば、前記ｆＧＣＳＦをコードする核酸分子は、前述の第１もしくは第２の核酸分子またはベクターに連結されうる。
他の実施態様において、前記第１核酸分子は、前述の（１）を含む重鎖可変ドメイン,及び前述の（７）を含む軽鎖可変ドメイン；前述の（２）を含む重鎖可変ドメイン、及び前述の（８）を含む軽鎖可変ドメイン；前述の（３）を含む重鎖可変ドメイン、及び前述の（９）を含む軽鎖可変ドメイン；前述の（４）を含む重鎖可変ドメイン、及び前述の（１０）を含む軽鎖可変ドメイン；前述の（５）を含む重鎖可変ドメイン、及び前述の（１１）を含む軽鎖可変ドメイン；前述の（６）を含む重鎖可変ドメイン、及び前述の（１２）を含む軽鎖可変ドメイン；あるいは前述の重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインの任意、またはいずれかもしくは全ての組み合わせを含むものでもある。
一部の実施態様において、前記第１核酸分子は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変ドメイン、並びに配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変ドメインを含むＦａｂ（ＦＬ３３５）をコードする核酸配列を含む。前記第２核酸分子は、ｆＧＣＳＦをコードしうる。
他の実施態様において、前述の第１核酸分子またはベクターは、配列番号１，２，３，４，５または６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含むＦａｂをコードする核酸配列を含む。一部の実施例において、前述の第２核酸分子またはベクターは、配列番号７，８，９，１０，１１，１２または１３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをＦａｂをコードする核酸配列を含む。前記ｆＧＣＳＦをコードする核酸分子は、第１もしくは第２の核酸分子またはベクターに連結されうる。
一部の実施例において、前述の第１核酸分子またはベクターは、配列番号１，２，３，４，５または６に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、及び配列番号７，８，９，１０，１１，１２または１３に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインをそれぞれ含むＦａｂをコードする核酸配列を含む。
一部の実施態様において、前記第１核酸分子は、配列番号１６のアミノ酸配列（ＶＨ－ＣＨ１ドメイン）を含む重鎖ドメイン、及び配列番号１７（ＶＬ－ＣＬドメイン）のアミノ酸配列を含む軽鎖ドメインを含むＦａｂ（ＳＬ３３５）をコードする核酸配列を含む。
一部の実施態様において、生理活性エフェクターモイエティは、ｆＧＣＳＦである。例えば、第２核酸分子は、配列番号１８及び１９のうちいずれか１以上に対し少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９３％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むものであり得る。
特異的に結合する本願に記載された抗体またはその断片（例えば、本願に記載された抗体の重鎖または軽鎖）の組み換え発現は、抗体または断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を含む。本願に記載された抗体またはその断片（例えば、重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメイン）をコードするポリヌクレオチドが得られれば、抗体分子の生産のためのベクターが、当業界に広く知られた技術を使用する組み換えＤＮＡ技術によって生産され得る。従って、抗体または抗体断片（例えば、軽鎖または重鎖）を含むポリヌクレオチドを発現することにより、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を製造する方法が本願に記載されている。当業者に周知の方法は、抗体または抗体断片（例えば、軽鎖または重鎖）のコード配列、並びに適切な転写及び翻訳の制御シグナルを含む発現ベクターを構築するのにも使用され得る。そのような方法には、例えば、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術、及び生体内遺伝子組み換えが含まれる。プローモーターに作動可能に連結された、本願に記載された抗体分子、抗体の重鎖または軽鎖、抗体またはその断片の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメイン、または軽鎖ＣＤＲまたは重鎖ＣＤＲを含む複製可能なベクターが本願に提供される。そのようなベクターは、例えば、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むものであり得（例えば、ＷＯ８６／０５８０７及びＷＯ８９／０１０３６；並びに米国特許Ｎｏ．５，１２２，４６４を参照）、抗体の可変ドメインが、全体重鎖、全体軽鎖、または全体重鎖及び軽鎖の両方の発現のためにそのようなベクター内にクローニングされ得る。
発現ベクターは、一般的な技術により、細胞（例えば、宿主細胞）に移入され得、生成された細胞は、次に、本願に記載された抗体を生成するために、一般的な技術によって培養され得る。
記述された抗体分子を発現するために、多様な宿主発現ベクターシステムが利用されうる。そのような宿主発現システムは、関心あるコード配列が生成され後続的に精製されうるビークルを示すが、また、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換されるかもしくはトランスフェクトされるとき、本願に記載された抗体分子をインサイチュで発現することができる細胞も示し得る。ここでは、抗体コード配列を含む組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡの発現ベクターで形質転換されたバクテリア（例えば、E. coli及びB. subtilis）；抗体コード配列を含む組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス・ピキア）；抗体コード配列を含む組み換えウイルス発現ベクターで感染された昆虫細胞システム（例えば、バキュロウイルス）；組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））で感染されるか、あるいは抗体コード配列を含む組み換えプラスミド発現ベクター（例：Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞システム（例えば、コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii＋）のような青海苔）；あるいは哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプローモーター）、または哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プローモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプローモーター）のゲノムに由来するプローモーターを含む組み換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞システム（例：ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ），ＣＨＯ，ＢＨＫ，ＭＤＣＫ，ＨＥＫ２９３，ＮＳ０，ＰＥＲ．Ｃ６，ＶＥＲＯ，ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ，ＨｓＳ７８Ｂｓｔ，ＨｅＬａ細胞、及びＮＩＨ３Ｔ３，ＨＥＫ－２９３Ｔ，ＨｅｐＧ２，ＳＰ２１０，Ｒ１．１，ＢＷ，ＬＭ，、ＢＳＣ１，ＢＳＣ４０，ＹＢ／２０及びＢＭＴ１０細胞）を含むが、それらに限定されるものではない。一部の実施例において、本願に記載された抗体（例えば、抗体ｐａｂ１９４９または抗体ｐａｂ２０４４のうちいずれか一つのＣＤＲを含む抗体）を発現するための細胞は、ＣＨＯ細胞、例えば、ＣＨＯ ＧＳ System（商標）（Lonza）のＣＨＯ細胞である。一部の実施例において、本願に記載された抗体を発現するための細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト細胞株である。一部の実施例において、哺乳動物発現ベクターは、ｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）またはｐｃＤＮＡ３．３である。一部の実施例において、特に、全体組み換え抗体分子発現のための大腸菌のようなバクテリア細胞または真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）が、組み換え抗体分子の発現に使用される。例えば、ヒトサイトメガロウイルスの主要中間初期遺伝子プローモーター要素のようなベクターと結合されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のような哺乳動物細胞は、抗体のための効果的な発現システムである（Foecking MK & Hofstetter H (1986) Gene 45: 101-105、及びCockett MI et al., (1990) Biotechnology 8: 662-667）。特定実施例において、本願に記載された抗体は、ＣＨＯ細胞またはＮＳ０細胞によって生成される。一部の実施例において、本願に記載された抗体をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プローモーター、誘導性プローモーターまたは組織特異的プローモーターによって調節される。
バクテリアシステムにおいて、発現される抗体分子について意図された用途により、多数の発現ベクターが有利に選択されうる。例えば、そのような抗体を量産しなければならない場合、抗体分子の医薬組成物を生成するために、容易に精製される融合タンパク質産物に係わる高レベルの発現を指示するベクターが望ましくなり得る。そのようなベクターとしては、以下に限定されるものではないが、融合タンパク質が生成されるように抗体コード配列がｌａｃＺコード領域とインフレームでベクターに個別的にライゲートされるE. coli発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruether U & Mueller-Hill B (1983) EMBO J 2: 1791-1794）；ｐＩＮベクター（Inouye S & Inouye M (1985) Nuc Acids Res 13: 3101-3109; Van Heeke G Schuster SM (1989) J Biol Chem 24: 5503-5509）などを含む。例えば、ｐＧＥＸベクターもまた、グルタチオン５－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現するところに使用され得る。一般的に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズに吸着及び結合された後、遊離グルタチオンの存在下において溶出されることによって、溶解された細胞からも容易に精製される。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物が、ＧＳＴモイエティから放出されうるように、トロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼの切断部位を含むように設計される。
哺乳動物の宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現システムが利用されうる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、関心ある抗体コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プローモーター及び三者（tripartite）リーダー配列に連結されうる。そのようなキメラ遺伝子は、インビトロまたは生体内の組み換えにより、アデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例：領域Ｅ１または領域Ｅ３）における挿入は、感染された宿主において、生存可能で抗体分子を発現することができる組み換えウイルスを生成させ得る（例えば、Logan J & Shenk T(1984) PNAS 81: 3655-3659参照）。挿入された抗体コード配列の効果的な翻訳のために、特定開始シグナルも必要となる。そのようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドン及び隣接配列を含む。また、全体挿入物の翻訳を保証するために、開始コドンは、所望するコード配列の判読フレームと同位相（in phase）になければならない。そのような外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の両方の多様な起源を有することができる。発現効率は、適切な転写エンハンサ要素、転写終結子などを含むことによって向上され得る（例えば、Bitter G et al., (1987) Methods Enzymol 153: 516-544参照）。
また、挿入された配列の発現を調節するか、あるいは所望する特定方式で遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞菌株が選択されうる。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）及びプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能に重要であり得る。他の宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後のプロセシング及び修飾のための特性、及び特定のメカニズムを有している。発現された外来タンパク質の正確な修飾及びプロセシングを保証するために、適切な細胞株または宿主システムが選択されうる。そのために、一次転写物に対する適切なプロセシング、遺伝子産物のグリコシル化及びリン酸化のための細胞的メカニズムを保有する真核宿主細胞が使用されうる。そのような哺乳動物宿主細胞には、以下に限定されるものではないが、ＣＨＯ，ＶＥＲＯ，ＢＨＫ，Ｈｅｌａ，ＭＤＣＫ，ＨＥＫ２９３，ＮＩＨ３Ｔ３，Ｗ１３８，ＢＴ４８３，Ｈｓ５７８Ｔ，ＨＴＢ２，ＢＴ２Ｏ細胞、及びＴ４７Ｄ，ＮＳ０（免疫グロブリン鎖を内因的に生成しないマウス骨髄腫細胞株），ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ，ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ），ＰＥＲ．Ｃ６，ＶＥＲＯ，ＨｓＳ７８Ｂｓｔ，ＨＥＫ－２９３Ｔ，ＨｅｐＧ２，ＳＰ２１０，Ｒ１．１，ＢＷ，ＬＭ，ＢＳＣ１，ＢＳＣ４０，ＹＢ／２０，ＢＭＴ１０及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞を含む。特定実施例において、本願に記載された組み換えタンパク質（例えば、ＣＤＲを含む抗体）は、ＣＨＯ細胞のような哺乳動物細胞で生産される。
一部の実施態様において、本願に記載された抗体は、低減されたフコース含量を有するか、あるいはフコース含量を有さない。そのような抗体は、当業者に知られた技術を使用して生成されることができる。例えば、抗体は、フコシル化能が欠乏するか、あるいは不足した細胞において発現され得る。特定実施例において、α１，６－フコシルトランスフェラーゼの２つの対立遺伝子がいずれもノックアウトされた細胞株が、フコース含量が減少された抗体を生産するのに使用され得る。Potelligent（登録商標）システム（Lonza）は、フコース含量が低減された抗体を生産するのに使用され得るシステムの一例である。
組み換えタンパク質の長期間かつ高収率の生産のために、安定した発現細胞が生成されうる。例えば、本願に開示された組み換えタンパク質を安定して発現する細胞株が操作されうる。特定実施例において、本願に提供された細胞は、本願に記載された抗体（例えば、ＣＤＲを含む抗体）を形成するのに関連する、軽鎖／軽鎖可変ドメイン及び重鎖／重鎖可変ドメインを安定して発現する。
特定の態様において、ウイルス複製基点を含む発現ベクターを使用する代わりに、宿主細胞は、適切な発現調節要素（例えば、プローモーター、エンハンサ、配列、転写終結子、ポリアデニル化部位など）、及び選択可能なマーカーによって調節されるＤＮＡによっても形質転換され得る。外来ＤＮＡ／ポリヌクレオチドを導入した後、操作された細胞は、富化培地において１～２日間成長するように許容された後、選択培地に転換され得る。前記組み換えプラスミドの選択可能なマーカーは、選択に対する抵抗性を付与し、細胞がプラスミドを染色体に安定して統合して細胞巣（foci）を形成するように成長することを許容し、それが次いでクローニングされて細胞株に拡張されることができる。その方法は、有利なことに本願に記載された抗体またはその断片を発現する細胞株を操作するために使用され得る。そのような操作された細胞株は、抗体分子と直接または間接に相互作用する組成物のスクリーニング及び評価に、特に有用である。
多様な選択システムが使用され、以下に限定されるものではないが、単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus）チミジンキナーゼ（Wigler M et al., (1977) Cell 11 (1): 223-232），ヒポキサンチン・グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska EH Szybalski W(1962) PNAS 48(12): 2026-2034）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy I et al., (1980) Cell 22 (3): 817-823）遺伝子が、ｔｋ－，ｈｇｐｒｔ－またはａｐｒｔ－細胞においてそれぞれ使用され得る。また、抗代謝物質抵抗性は、以下の遺伝子に対する選択の基礎として使用され得る：メトトレキサートに対する抵抗性を付与するｄｈｆｒ（Wigler M et al., (1980) PNAS 77 (6): 3567-3570; O’Hare K et al., (1981) PNAS 78: 1527-1531）；ミコフェノール酸に対する抵抗性を付与するｇｐｔ（Mulligan RC & Berg P (1981) PNAS 78(4): 2072-2076；アミノグリコシドＧ－４１８に対する抵抗性を付与するｎｅｏ（Wu GY & Wu CH (1991) Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev P (1993) Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-596;Mulligan RC (1993) Science 260: 926-932;及びMorgan RA & Anderson WF (1993) Ann Rev Biochem 62: 191-217; Nabel GJ & Felgner PL (1993) Trends Biotechnol 11(5): 211-215)）；ハグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ（Santerre RF et al., (1984) Gene 30(1-3): 147-156）。
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって上昇されうる（検討のために、Bebbington CR & Hentschel CCG, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)参照）。抗体を発現するベクターシステムのマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養物に存在する抑制剤レベルの上昇が、マーカー遺伝子のコピー数を増加させるであろう。増幅された領域は、抗体遺伝子に付随するため、抗体の生産も増大するであろう（Crouse GF et al., (1983) Mol Cell Biol 3: 257-66）。
前記宿主細胞は、本願に記載された２個以上の発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１ベクター、及び軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２ベクターで共トランスフェクトされうる。前記２個のベクターは、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの同一発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含むものであり得る。前記宿主細胞は、異なる含量の２個以上の発現ベクターで共トランスフェクトされうる。例えば、該宿主細胞は、第１発現ベクター及び第２発現ベクターにつき、下記の比率のうちいずれか一つでトランスフェクトされ得る：１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１２、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５または１：５０。
代替として、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドをコードして発現することができる単一ベクターが使用されうる。そのような状況において、軽鎖は、過量の毒性遊離重鎖を防止するために、重鎖の前に配されるべきである（Proudfoot NJ (1986) Nature 322: 562-565; and Koehler G (1980) PNAS 77: 2197-2199）。重鎖及び軽鎖に係わる前記コード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むものであり得る。前記発現ベクターは、モノシストロン性またはマルチシストロン性であり得る。マルチシストロン性核酸作製物は、２，３，４，５、６，７，８，９，１０個以上、または２～５個、５～１０個または１０～２０個の遺伝子／ヌクレオチド配列の範囲をコードしうる。例えば、バイシストロン性核酸作製物は、プローモーター、第１遺伝子（例えば、本願に記載された抗体の重鎖）、及び第２遺伝子（例えば、本願に記載された抗体の軽鎖）の順序で含むものであり得る。そのような発現ベクターにおいて、２つの遺伝子の転写がプローモーターによって駆動される一方、最初の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳はキャップ依存的スキャニングメカニズムによってなされ、２番目の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳は、例えば、ＩＲＥＳによるキャップ非依存的メカニズムによってなされ得る。
前記ベクターは、血清アルブミンに結合する抗原結合断片（Ｆａｂ）をコードする第１核酸分子、及び生理活性エフェクターモイエティ及びリンカをコードする第２核酸分子を含むことができる。
本願に記載された抗体分子が、組み換え発現によって生成されれば、免疫グロブリン分子精製のために、当業界に知られた任意の方法、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換、親和性、特に、親和性タンパク質Ａ後の特定抗原に対する親和性、及びサイズカラムクロマトグラフィ）、遠心分離、さじ的溶解度、またはタンパク質精製のためのその他標準技術によっても精製され得る。さらには、本願に記載された抗体は、本願に記載されるか又は当業界で公知の異種ポリペプチド配列に融合されて精製を促進させ得る。
特定の実施態様において、本願に記載された抗体は、単離されるか、あるいは精製される。一般的に、単離された抗体は、前述の単離された抗体と異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にないところの抗体である。例えば、一部の実施例において、本願に記載された抗体の調製物は、細胞的物質及び／または化学的前駆体が実質的にないものである。「実質的に細胞物質がない」という文言は、単離されるか又は組み換え的に生産される細胞の細胞的成分から抗体が分離された抗体調製物を含む。従って、細胞物質が実質的にない抗体は、約３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満（乾燥重量対比）の異種性タンパク質（本願において、「汚染タンパク質」とも言う）及び／または抗体のバリアント、例えば、抗体の異なる翻訳後修飾された形態を有する抗体調製物を含む。前述の抗体または断片が組み換え的に生産される場合、タンパク質調製物は、一般的に、培養培地が実質的になく、例えば、培養培地は、タンパク質調製物の体積につき、約２０％，１０％，２％，１％，０．５％または０．１％未満を示す。抗体または断片が化学的合成によって生成される場合、前述の抗体または断片には、一般的に、化学的前駆体、またはその他化学物質が実質的になく、すなわち、タンパク質合成に関与する化学的前駆体、またはその他化学物質から分離される。従って、抗体または断片のそのような製剤は、約３０％，２０％，１０％または５％（乾燥重量基準）未満の、関心ある抗体または断片以外の化学的前駆体または化合物を有する。一部の実施例において、本願に記載された抗体は、単離されるか、あるいは精製される。
［組成物］
さらに他の態様は、組成物、例えば、猫汎白血球減少症の予防または治療のための医薬組成物、前記組み換えタンパク質を有効成分として含む医薬組成物；猫汎白血球減少症を治療する方法、前記組成物を個体に投与する方法；及び猫汎白血球減少症の予防または治療のための前記組み換えタンパク質の医薬的用途を提供する。
例えば、前記医薬組成物は、（ａ）前記組み換えタンパク質の薬学的有効量、及び（ｂ）薬学的に許容される担体を含むものであり得る。
一部の実施態様において、前記医薬組成物の生体内半減期は、猫ＧＣＳＦのものと比較し、３ないし２０倍の増大を示しうる。前記生体内半減期は、猫ＧＣＳＦと比較し、例えば、約３．５倍ないし約６倍増大、約４倍ないし約６倍増大、約４．５倍ないし約６倍増大、約５倍ないし約６倍増大、約５．５倍ないし約６倍増大、約３倍ないし約５．５倍増大、約３．５倍ないし約５．５倍増大、約４倍ないし約５．５倍増大、約４．５倍ないし約５．５倍増大、約５倍ないし約５．５倍増大、約３倍ないし約５倍増大、約３．５倍ないし約５倍増大、約４倍ないし約５倍増大、約４．５倍ないし約５倍増大、約３倍ないし約４．５倍増大、約３．５倍ないし約４．５倍増大、または約４倍ないし約４．５倍増大を示しうる。一部の実施例において、さらには、猫ＧＣＳＦの生体内半減期は、突然変異体ｆＧＣＳＦの皮下注射後に評価され得る。
一部の実施例において、前記医薬組成物は、血液内白血球レベルを上昇させうる。前記白血球は、例えば、好中球、単核球、好塩基球、またはそれらの組み合わせであり得る。前述の上昇された白血球レベルは、投与後２０日、投与後１５日、投与後１２日、投与後１０日、投与後８日または投与後７日まで持続及び維持されうる。
前記医薬組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤において一般的に利用されるものを含み得、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、それらに制限されるものではない。本発明の組成物は、前記成分以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁液剤、保存剤などをさらに含み得る。
医薬組成物は、経口投与または非経口投与されうる。具体的には、前記医薬組成物は、非経口投与され、その場合、静脈内注入、皮下注入、筋肉注入、腹腔注入、内皮投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与及び直腸内投与などによって投与され得る。一部の実施例において、それらは、皮下注射の形態によって投与され得る。経口投与の際にタンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は、有効成分をコーティングするか、あるいは胃腸で分解されないように保護して剤形化される必要がある。また、医薬組成物は、活性物質を標的細胞に伝達することができる任意の装置によっても投与され得る。
前記医薬組成物は、薬学的有効量で投与される。本願に使用された「薬学的有効量」は、任意の医学的治療に適用することができる合理的な受恵／危険の比率であり、疾病を治療するに十分な量を称する。有効用量レベルは、患者の疾病種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感性、投与時間、投与経路及び排出の比率、治療期間、併用投与する薬物、及びその他医学界で周知の要素によって決定され得る。前記医薬組成物は、単一治療剤として、あるいは他の治療剤と併用して投与され得、既存治療剤と同時に、個別的に、あるいは順次に、１回または数回分割投与されうる。前述の全ての要素を考慮し、副作用なしに最大の効果を得ることができる最小限量で投与することが重要であり、そのような量は、当業者によって容易に決定されうる。本願に使用された用語「薬学的有効量」は、猫汎白血球減少症を予防するか、あるいは治療するのに十分な量を称する。
前記医薬組成物は、当該発明が属する技術分野において当業者が容易に実施することができる方法により、薬学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化することにより、単位用量形態に製造されるか、あるいは多用量容器内に内入させても製造されえる。
その場合、前記剤形は、油性溶媒内または水性媒質内の溶液、懸濁液またはエマルジョンの形態であるか、あるいは抽出物、坐剤、粉末、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態でもあり得、前記剤形は、分散剤または安定化剤をさらに含むものでもあり得る。
本願においては、生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤（(Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA）において、所望する程度の純度を有する、本願に記載された組み換えタンパク質を含む組成物が本願に提供される。また、本願に記載された組み換えタンパク質、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が、本願に開示される。許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用された用量及び濃度において、受容者に毒性がない。
本開示内容の医薬組成物は、個体に投与された後、有効成分の迅速な、持続された、又は遅延された放出を提供することができ、当業者に広く知られた方法を使用して製剤化され得る。前記剤形は、錠剤、丸剤、粉末、サッシェイ（sachet）、エリキシル剤（elixir）、懸濁液、エマルジョン、溶液、シロップ、エアロゾール、軟質または硬質のゼラチンカプセル、滅菌注射溶液、滅菌粉末などの形態でもあり得る。適する担体、賦形剤及び希釈剤の例は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルである。また、前記剤形は、充填剤、凝集防止剤、潤滑剤、湿潤剤、香味剤、乳化剤、防腐剤などをさらに含むものでもあり得る。
本願に記載された医薬組成物は、本願に記載された組み換えタンパク質の活性を向上、誘導または活性化させ、疾病または病態を治療するのに有用であり得る。
生体内投与に使用される組成物は、滅菌されうる。それは、例えば、滅菌濾過膜を介する濾過によって容易に達成される。
［用途及び方法］
本明細書に開示された医薬組成物を投与することを含む、それを必要とする個体の猫汎白血球減少症を治療する方法がまた本願に開示される。前記個体は、猫科（例：飼い猫または野生猫、ライオン、虎、ジャガー、チーター、オオヤマネコなど）である。
また、それを必要とする個体において猫汎白血球減少症を治療するための、本願に開示された組成物の使用が本願に開示される。また、それを必要とする個体における猫汎白血球減少症の治療に使用するための、本願に開示された組成物が本願に開示される。また、それを必要とする個体において猫汎白血球減少症を治療するための医薬製造のための、本願に開示された組成物の使用が本願に開示される。
猫汎白血球減少症ウイルス（ＦＰＬＶ）は、全世界的に、猫科動物（猫）科の野生個体及び飼育個体を感染させることができるパルボウイルスの種（species）である。それは、胃腸、免疫系及び神経系の疾患を誘発する、伝染性が高く重篤な感染症である。その主要な影響は、白血球数を減少させることである。
一部の実施態様において、組成物は、個体の血液内白血球を増加させる。一部の実施態様において、白血球は、好中球、単核球、好塩基球、またはそれらの組み合わせである。
猫化キメリック抗体断片であるＦＬ３５５Ｆａｂ抗体断片と、猫由来の顆粒球コロニー刺激因子とを融合した一実施例による組み換えタンパク質（ＡＰＢ－Ｆ１）は、猫体内半減期が約１３．３時間であり、２．７時間を示したｆＧＣＳＦに比べ約４．９倍増大され、前記組み換えタンパク質の投与による血中リンパ球及び好中球数値の増加は、それぞれ、投与後の２０日目、及び１１日目まで持続した。従って、本願に開示された組み換えタンパク質は、猫汎白血球減少症の予防用または治療用の医薬組成物の有効成分としても使用されることを確認した。
一部の実施態様において、前記組み換えタンパク質の除去半減期（Ｔ１／２）は、猫の顆粒球刺激因子（ｆＧＣＳＦ）のものに比べ、少なくとも約２倍以上、少なくとも約３倍以上、少なくとも約４倍以上、少なくとも約５倍以上、少なくとも約７倍以上、少なくとも約１０倍以上、またはそこから誘導された任意の倍数、または倍数の範囲ほどでもあり得る。一部の実施態様において、前記組み換えタンパク質は、約８時間ないし約２０時間、約１０時間ないし約１８時間、約１２時間ないし約１５時間、またはそこから誘導された任意の半減期または範囲の除去半減期（Ｔ１／２）を有する。一部の実施態様において、前記組み換えタンパク質のＴｍａｘは、ｆＧＣＳＦのＴｍａｘに比べ、少なくとも約１０％ないし約２００％高いか、約５０％ないし１００％高いか、約５０％ないし７５％高いか、あるいはそこから誘導された任意の％、または％の範囲だけ高い。一部の実施態様において、前記被検体に対する約３６０μｇ／ｋｇの組み換えタンパク質の用量は、約８時間ないし約２０時間、約１０時間ないし約１５時間、約１２時間ないし約１４時間のＴｍａｘ、またはそこから誘導される任意のＴｍａｘ、またはＴｍａｘの範囲を提供する。一部の実施態様において、前記組み換えタンパク質のＣｍａｘは、ｆＧＣＳＦのＣｍａｘに比べ、約１０％以上高いか、約２０％以上高いか、約３０％以上高いか、あるいはそこから誘導される任意の％、または％の範囲だけ高い。一部の実施態様において、前記被検体に対する約３６０μｇ／ｋｇの組み換えタンパク質の用量は、約７００ｎｇ／ｍｌないし約１，０００ｎｇ／ｍｌ、約７５０ｎｇ／ｍｌないし約９００ｎｇ／ｍｌ、約８００ｎｇ／ｍｌないし約８５０ｎｇ／ｍｌのＣｍａｘ、またはそこから誘導される任意の用量、または用量の範囲のＣｍａｘを提供する。一部の実施態様において、前記組み換えタンパク質のＡＵＣｌａｓｔは、ｆＧＣＳＦのＡＵＣｌａｓｔに比べ、少なくとも約２倍大きいか、少なくとも約３倍大きいか、少なくとも約４倍大きいか、少なくとも約５倍大きいか、あるいはそこから誘導された任意の倍数、または倍数の範囲だけ大きい。一部の実施態様において、前記被検体に対する約３６０μｇ／ｋｇの組み換えタンパク質の用量は、約８，０００ｈｒ＊ｎｇ／ｍｌないし約２５，０００ｈｒ＊ｎｇ／ｍｌ、約１６，０００ｈｒ＊ｎｇ／ｍｌないし約２２，０００ｈｒ＊ｎｇ／ｍｌ、約１８，０００ｈｒ＊ｎｇ／ｍｌないし約２０，０００ｈｒ＊ｍｇ／ｍｌのＡＵＣｌａｓｔ、あるいはそこから誘導された任意の濃度、または濃度の範囲のＡＵＣｌａｓｔを提供する。
一部の態様において、本願は、本願に記載された抗体またはその組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む、個体において１以上の免疫機能または免疫反応を調節する方法に係わるものである。抗体またはその組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む、個体において１以上の免疫機能または免疫反応を活性化、向上または誘導させる方法が本願に開示される。一部の実施例において、本願に記載された抗体またはその組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む、１以上の免疫機能または免疫反応を活性化または増進させることが望ましいところの疾病を予防及び／または治療する方法が本願に提示される。特定実施例において、抗体またはその組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む、自家免疫疾患またはその病態を治療する方法が本願に提示される。
一部の実施態様において、本願に記載された抗体は、当業界で周知のアッセイ、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ、ＥＬＩＳＡ及び細胞増殖アッセイを使用して、本願に記載された組み換えタンパク質が投与されていない個体の免疫機能に比べ、個体において、１以上の免疫機能または免疫反応を、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、または少なくとも１０％、あるいは１０％ないし２５％、２５％ないし５０％、５０％ないし７５％、または７５％ないし９５％の範囲において、活性化又は向上又は誘導させる。
［投与経路及び用量］
本開示の医薬組成物は、経口、経皮、皮下、静脈内及び筋肉内の投与経路を含む多様な投与経路を介して個体に投与されうる。
病態の治療及び／または予防に効果的な、本願に開示された組み換えタンパク質または組成物の量は、疾病の特性に依存するものであり、標準的臨床技術によって決定され得る。
実際に投与される、本願に開示された組み換えタンパク質の量は、治療しなければならない疾病、選択された投与経路、患者の年齢・性別及び体重、疾病の重症度、及び有効成分としての生理活性ポリペプチドの類型を含む、多様な関連因子に照らして決定される。本発明の組み換えタンパク質は、血液内において、すぐれた持続性を有するので、本発明の組み換えタンパク質を含むペプチド製剤の投与回数及び頻度を顕著に低減させることができる。
組成物に使用される正確な用量もまた、投与経路、及び疾病の深刻性に依存するものであり、実務者の判断、及び各個体の状況によって決定されるものである。例えば、有効用量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態（年齢、体重及び健康を含む）、投与されるその他薬物、または治療が予防的なものであるかあるいは治療的なものであるかということによっても異なり得る。一般的に、患者は、猫、飼い猫またはペット猫である。治療用量は、安全性と効能とを最適化するために最適に調整される。
特定の実施態様において、最適の投与量範囲を確認することを助けるためにインビトロアッセイが使用される。有効用量は、インビトロまたは動物モデルの試験系に由来する用量反応曲線で推論されうる。
［キット］
本願に記載された１以上の組み換えタンパク質、またはそのコンジュゲート（conjugate）を含むキットが本願に提供される。本願に開示された組成物を含むキット、及びその使用指針を含むラベルが本願に開示される。一部の実施例において、本願に提供された１以上の組み換えタンパク質のような、本願に記載された医薬組成物の成分のうち１以上によって充填された１以上の容器を含む薬剤学的なパックまたはキットが本願に提供される。一部の実施例において、該キットは、本願に記載された医薬組成物、及び本願に記載されたような任意の予防剤または治療剤を含む。選択的に、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関で規定した形式の通知がそのような容器に付随し得、その通知は、猫への投与についての製造機関、使用機関または販売機関の承認を反映させる。また、前記方法で使用されうるキットが本願において提供される。一部の実施例において、該キットは、本願に記載された組み換えタンパク質、例えば、精製された組み換えタンパク質を１以上の容器に含む。一部の実施例において、本願に記載されたキットは、対照としても使用され得る、実質的に単離された抗原（例えば、猫血清アルブミン）を含む。他の実施例において、本願に記載されたキットは、血清アルブミン抗原と反応しない対照抗体をさらに含む。他の実施例において、本願に記載されたキットは、血清アルブミン抗原に対する組み換えタンパク質の結合を検出するための１以上の要素を含む（例えば、組み換えタンパク質は、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物または発光性化合物のような検出可能な基質にコンジュゲート化され得、あるいは第１抗体を認識する第２抗体が検出可能な基質にコンジュゲート化され得る）。特定実施例において、本願で提供されるキットは、組み換え的に生成されるか又は化学的に合成された血清アルブミン抗原を含むものでもあり得る。該キットにおいて提供される血清アルブミン抗原は、固体支持体に付着されていてもよい。一部の実施例において、前述のキットの検出手段は、血清アルブミン抗原が付着した固体支持体を含む。そのようなキットは、付着していないレポータ標識された抗猫抗体または抗マウス／ラット抗体を含むものでもあり得る。血清アルブミンに対する抗体の結合において、抗原は、前記レポータ標識された抗体との結合によって検出され得る。
以下、本発明について、例示的実施形態を介してさらに詳細に説明する。しかしながら、それら例示的実施形態は、本発明について例示的に説明するためだけのものであり、本開示の範囲はそれらに限定されるものではない。
［製造例１．発現ベクターの製造］
全てのＤＮＡクローニング実験は、標準手順によって進められた。Feline ＩｇＧ ＣＨ１（delta Ｃ、ＩＭＧＴ ＡＢ０１６７１０ ＩＧＨＧ１＊０１、Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ、ＣＨ１）、Feline ＣＬ kappa（delta Ｃ、ＩＭＧＴ００００５０ ＩＧＫＣ＊０１、Ｆｅｌｉｓ ｃａｔｕｓ、Ｃ－region）、猫血清アルブミン（ＦＳＡ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ４９０６４）、猫の顆粒球コロニー刺激因子（ｆＧＣＳＦ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｑ９ＧＪＵ０））及びＡＰＢ－Ｆ１（ｖ２）（ＦＬ３３５ Ｆｄ＋mutant ｆＧＣＳＦ）遺伝子は、Cosmogenetech Inc.（韓国）から得られた。また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）において、ポリメラーゼとしては、ｐｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡpolymerase（Takara、日本）を使用し、ＰＣＲは、Ｔ１００ Thermal サイクラ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、Hercules、California）機械を利用して遂行した。また、Ｔ４ ＤＮＡ ligase（ＮＥＢ Ｂｉｏ Ｌａｂ、Ipswich、Massachusetts）を使用して遺伝子を発現ベクターに挿入した。一方、プライマーに係わる配列情報は、下記表１に示した。
Figure 2023521363000002
（１）ＦＬ３３５発現ベクターの製造
ヒト抗血清アルブミンＦａｂ抗体断片ＳＬ３３５のキメリック抗体断片であるＦＬ３３５を作製するための、ＳＬ３３５ Ｆａｂ抗体断片の可変部位であるＶＨ遺伝子の増幅は、プライマー１及び２を使用した、５℃ ３０秒、６０℃ ２０秒、７２℃ ５０秒の３０サイクル条件のＰＣＲを介して進められた。また、ＶＬ遺伝子の増幅についても、プライマー５及び６を使用し、前述のところと同一条件のＰＣＲが進められた。また、ＳＬ３３５ ＶＨ遺伝子と猫ＩｇＧ ＣＨ１とにつき、プライマー１及び４を使用し、９５℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ １分の３０サイクルの条件で、linking ＰＣＲを進めることにより、キメリックＦｄ（ＶＨ＋ＣＨ１）遺伝子を作製した。併せて、ＳＬ３３５ ＶＬ遺伝子と猫軽鎖（kappa）ＣＬとにつき、プライマー５及び８を使用し、前述のところと同一条件でlinking ＰＣＲを遂行し、キメリックＬ（ＶＬ＋ＣＬｋ）遺伝子を得た。
その後、図１に示されているように、前記キメリックＦｄ遺伝子をＢｂｓＩ（Takara、日本）制限酵素で処理した後、発現ベクターｐｄ２５３５ｎｔ（ＡＴＵＭ、Newark、California）に挿入し、ＦＬ３３５ Ｆｄ ｐｄ２５３５ＮＴベクターを製造し、前記キメリックＬ遺伝子を、ＢｂｓＩ制限酵素及びＢｓｒＧＩ（Takara、日本）制限酵素で処理した後、発現ベクターｐｄ２５３９（ＡＴＵＭ、Newark、California）に挿入し、ＡＰＢ－Ｆ１Ｌ ｐｄ２５３９ベクターを製造した。
（２）猫血清アルブミンまたは天然の猫顆粒球コロニー刺激因子の発現ベクターの製造
図２に示されているように、猫血清アルブミン遺伝子を、ＥｃｏＲＩ（Takara、日本）制限酵素及びＡｐａＩ（Takara、日本）制限酵素で処理した後、ｐＪＫ発現ベクターに挿入し、Feline serum albumin ｐＪＫ－ｄｈｆｒベクターを製造した。また、図３に示されているように、天然ｆＧＣＳＦ遺伝子につき、プライマー１，９及び１０を使用し、前述のところと同一条件でＰＣＲを進めることにより、ｆＧＣＳＦのＮ末端にｍｙｃ tagを、Ｃ末端にＨｉｓ tagを連結し、それをＢｂｓＩ制限酵素で処理した後、発現ベクターｐｄ２５３５ｎｔに挿入し、Feline ＧＣＳＦ ｐｄ２５３５ＮＴベクターを製造した。
（３）ＡＰＢ－Ｆ１発現ベクターの製造
ＡＰＢ－Ｆ１は、２つのバージョンであるＡＰＢ－Ｆ（ｖ１）及びＡＰＢ－Ｆ（ｖ２）で作製した。具体的には、ＡＰＢ－Ｆ（ｖ１）は、Ｏ－糖鎖がある天然発生（「天然型」）ｆＧＣＳＦがＦＬ３３５に融合された形態であり、ＡＰＢ－Ｆ（ｖ２）は、ＡＰＢ－Ｆ（ｖ１）から、遊離システイン基（Ｃ１７Ｓ）とＯ－糖鎖とが除去された突然変異型ｆＧＣＳＦがＦＬ３３５に融合された形態である。
ＡＰＢ－Ｆ（ｖ１）Ｆｄを製造するために、天然型ｆＧＣＳＦをテンプレートとして、プライマー１４及び１５を使用し、前述のところと同一条件でＰＣＲを進め、リンカ配列（ＧＳＡＧＳＡＰＡＰＡＧＳＧＥＦ（配列番号８４））が一部含まれた天然型ｆＧＣＳＦ遺伝子を獲得し、ＦＬ３３５ Ｆｄ遺伝子をテンプレートとして、プライマー１及び２を利用してＰＣＲを進め、前記リンカ配列が一部含まれたＦＬ３３５ Ｆｄ遺伝子を作製した。その後、作製された天然型ｆ－ＧＣＳＦ遺伝子と、ＦＬ３３５ Ｆｄ遺伝子とをテンプレートとして、プライマー１及び１５を使用し、前述のところと同一条件でlinking ＰＣＲを進めることにより、ＡＰＢ－Ｆ（ｖ１）Ｆｄ（ＦＬ３３５ Ｆｄ－ＧＳＡＧＳＡＰＡＰＡＧＳＧＥＦ（配列番号８４）－天然型ｆＧＣＳＦ）遺伝子を作製した。その後、図４Ａに示されているように、前述の作製された遺伝子をＢｂｓＩ制限酵素で処理した後、ｐｄ２５３５ｎｔ発現ベクターに挿入し、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１） Ｆｄ ｐｄ２５３５ＮＴベクターを製造した。一方、図４Ｂに示されているように、ＡＰＢ－Ｆ１の軽鎖は、ｐｄ２５３９発現ベクターに挿入されているＦＬ３３５の軽鎖を使用した。
また、ＡＰＢ－Ｆ（ｖ２）Ｆｄを製造するために、前述のところと同一方式で、プライマー１，１１及び１２を使用し、ｆＧＣＳＦのＣ末端にＨｉｓ tagを連結し、ＡＰＢ－Ｆ（ｖ２）Ｆｄ（ＦＬ３３５ Ｆｄ－ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号８５）－突然変異型ｆＧＣＳＦ）遺伝子を合成して作製し、前述のところ同様に、図４Ａに示されているように、前記作製された遺伝子をＢｂｓＩ制限酵素で処理した後、ｐｄ２５３５ｎｔ発現ベクターに挿入し、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ２） Ｆｄ ｐｄ２５３５ＮＴベクターを製造した。
その後、ＣＨＯ細胞形質転換のための遺伝子を多量獲得するために、ＤＨ５細胞（ＲＢＣ royal bank、カナダ）と遺伝子の混合物に、４２℃で４５秒間、ヒートショックを加えて、細胞にプラスミドＤＮＡを挿入し、その後、ＤＮＡ ｐｒｅｐ kit（ＧｅｎｅＡｌｌ、韓国）を使用して、プラスミドＤＮＡを得た。
［製造例２．組み換えタンパク質の一時的発現システム構築］
ＦＬ３３５ Ｆａｂ、猫血清アルブミン、天然型ｆＧ－ＣＳＦ、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１）及びＡＰＢ－Ｆ１（ｖ２）のようなタンパク質の発現のために、本実験においては、ＥｘｐｉＣＨＯ Expression Systemを利用した。具体的には、ＥｘｐｉＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞（ThermoFisher Scientific）が、ＥｘｐｉＣＨＯ expression media（Gibco、ThermoFisher Scientific）を使用して３７℃、５％ ＣＯ２、１４０ｒｐｍの条件で、Erlenmeyerフラスコで培養された。その後、１０μｌの前記細胞培養液と、１０μｌのトリパンブルーとを混合した後、１０μｌの混合物をCell Counting Chamber Slidesに添加した。その後、細胞数及び細胞生存率の変化を、Countess II Automated Cell Counter（Invitrogen）機械を使用して測定した。その後、前記製造例１で作製された発現ベクターを利用した細胞の形質転換が、ＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ培地（ThermoFisher Scientific）とＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬（ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ Transfection Kit）とを使用して遂行された。形質転換させた時点（０日）から１８～２２時間後、培養培地にＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ EnhancerとＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Feedとを添加し、細胞濃度が２ｘ１０６細胞／ｍＬになったとき、培養条件を、３２℃、５％ ＣＯ２、１４０ｒｐｍに変更し、形質転換された細胞を培養した。形質転換させた時点から５日目に、培養培地にＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄをさらに添加し、細胞生存率が８０％に達するまで細胞を培養した後、形質転換された細胞を含む培養液を回収した。
回収された培養液内タンパク質発現様相と発現レベルは、ウェスタンブロットを介して確認した。まず、タンパク質試料を、４～１５％勾配ゲルに、１μｇ／ウェルでローディングした後、１５０Ｖで５０分間電気泳動した。その後、転写バッファ（Ｔｒｉｓ塩基、グリシン、ＳＤＳ、２０％メタノール）を使用し、定電流４００ｍＡ、６０分間、当該タンパク質をニトロセルローストランスファーメンブレンに転写した。その後、タンパク質の転写が完了したメンブレンに、ｐＨ７の３％スキムミルク溶液を添加した後、それを常温で振盪して１時間ブロッキングし、洗浄バッファ（１ｘＰＢＳ内０．１％ tween）で振盪しながら洗浄した。その後、検出抗体をｐＨ７の３％スキムミルク溶液に希釈した後、それを前記ブロッキングされたメンブレンと常温で１時間反応させた。それぞれのタンパク質について使用された検出抗体は、次の通りである。ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１，ｖ２）とｆＧ－ＣＳＦ（天然型、突然変異型）とにつき、ウサギ抗Ｆｅ ＧＣＳＦ ｐＡｂ（１ｓｔ Ａｂ）（Aprilbio、韓国）及びロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ（２ｎｄ Ａｂ）（Jackson Immuno Research、West Grove、Pennsylvania）を使用し、ＦＬ３３５ Ｆａｂにつき、１ｓｔ Ａｂヤギ抗猫軽鎖Ａｂ（Bethyl Laboratories、Montgomery、ＴＸ）、２ｎｄ ＡｂヤギＩｇＧ－Ｆｃ fragment cross antibody（Bethyl）、または１ｓｔ Ａｂヤギ抗猫Ｆ（ａｂ）２－ビオチン（Jackson Immuno Research、Bar Harbor、Maine）、２ｎｄ ストレプトアビジン－ＨＲＰ（ＧＥ Healthcare、Chicago、Illinois）を使用し、最後にＦＳＡにつき、抗Ｈｉｓ Ｔａｇ ＨＲＰ（BioLegend、Sandiego、California）を使用した。その後、前記メンブレンを洗浄バッファで洗浄した後、そこに、１ｍＬのＴＭＢ（Surmodics、Edenprairie、Minnesota）を添加し、１～５分間基質反応を進めた。その後、そこに、三次蒸溜水を添加して基質反応を終了させ、ＴＭＢと三次蒸溜水とが混ざった混合液を捨てた後、タンパク質の発現パターンと発現レベルとを確認した。
［製造例３．組み換えタンパク質の生産のための安定化細胞株の作製］ ＦＬ３３５ Ｆａｂ、天然型ｆＧＣＳＦ、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１）、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ２）などを生産する安定化細胞株を作製するために、ＧＳ null ＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＨＤ－ＢＩＯＰ３細胞、Horizon Discovery、英国）を使用し、ＤＮＡクローニングで作製された遺伝子を使用し、安定形質転換を下記のように遂行した。基本培地と生産培地としては、ＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）Media（Life technologies、Carlsbad、California）を使用し、３７℃、５％ ＣＯ２、１２５ｒｐｍの条件で、Erlenmeyerフラスコ（Corning）を使用して継代培養した。その後、１０μｌの前記細胞培養液と、１０μｌのトリパンブルーとを混合した後、１０μｌの混合物を、Cell Counting Chamber Slidesに添加した。その後、細胞数及び細胞生存率の変化をCountess II Automated Cell Counter (Invitrogen）機械を使用して測定した。ＧＳ null ＣＨＯ－Ｋ１細胞への形質転換のために、６００μｌのＯｐｔｉＰＲＯ ＳＦＭ培地が含まれた２個のチューブを準備した後、いずれか一つに３７．５μｇのプラスミドＤＮＡを添加し、他の一つには、３７．５μｌのFreestyle（商標）Ｍａｘ試薬（Invitrogen、ThermoFisher Scientific）を添加した。その後、前記２個のチューブを注意深く振りながら混ぜた後、５分間常温でインキュベートした。その後、Freestyle（商標）Ｍａｘ試薬が含まれたＳＦＭ培地を、プラスミドＤＮＡが含まれたチューブに移し入れ、注意深く振りながら混ぜた後、２０～２５分間常温で反応させた。その後、前記混合物を、ＧＳ null ＣＨＯ－Ｋ１細胞に注意深く分注し、それを、３７℃、５％ ＣＯ２、１２５ｒｐｍの条件で培養した。そこから２日経過後、培養培地を、グルタミンが添加されていないＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）Mediaに交替した後、５０ＭのＬ－メチオニンスルホキシイミン、１０μｇ／ｍＬのピューロマイシンを使用して、プール選択を進めた。
安定化細胞株のプール選択を完了した後、それぞれの細胞株における組み換えタンパク質の生産性を確認するために、ＥＬＩＳＡを進めた。ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１，ｖ２）、ＦＬ３３５の捕獲抗原（capture Ａｇ）として、ヒト血清アルブミン（Sigma Aldrich、Saint Louis、Missouris）を使用し、ｆＧＣＳＦ（天然型、突然変異型）の捕獲抗原としては、ラット抗ヒトＧＣＳＦ Ａｂ（SouthenBiotech、カナダ）を使用した。各試料に係わる１００μｌの捕獲抗原を、１μｇ／ｍＬの濃度で、ＭａｘｉＳｏｒｐ ＮＵＮＣ Ｉｍｍｕｎｏ ＥＬＩＳＡプレート（Thermo Fisher、Waltham、Massachusetts）に添加した後、それを、４℃で一晩培養することにより、捕獲抗原をプレート上にコーティングさせた。その後、３％ ＢＳＡ（bovine serumal bumin）が添加されたＰＢＳＴ［０．１％（ｖ／ｖ）Tween（Thermo Fisher）が含まれたＰＢＳ（phosphate buffered saline）］を、各ウェルに３００μｌずつ添加して、常温で３時間ブロッキングし、各ウェルに洗浄バッファ（ＰＢＳＴ ０．１％）を３００μｌずつ分注して洗浄し、そのような過程を３回反復遂行した。試料及び抗体の希釈溶液として０．３％ ＰＢＡ（０．１％ＰＢＳＴ中）を使用し、希釈溶液で希釈された試料を、各ウェルに１００μｌずつ分注し、常温で１時間反応させた。前述のような方法で３回洗浄した後、検出抗体を１００μｌ／ウェルずつ分注し、常温で１時間反応させた。ここで、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１，ｖ２）、ｆＧＣＳＦの検出抗体として、ウサギ抗Ｆｅ ＧＣＳＦ ｐＡｂ（１ｓｔ Ａｂ）（Aprilbio）とロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰ（Jackson Immuno Research、West Grove、Pennsylvania）とを使用し、ＦＬ３３５の検出抗体として、ｆＧＣＳＦ、ヤギ抗猫ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰを使用した。
また、それぞれの精製されたタンパク質を標準物質にして、それらの生産量を測定した。具体的には、結合シグナルは、３，３，５，５－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を使用し、ＥＬＩＳＡリーダを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
［製造例４．組み換えタンパク質の分離及び精製］
組み換えタンパク質は、次の方法により、ＡＫＴＡ pure １５０Ｌ（ＧＥ Healthcare、シカゴ、Illinois）装備を利用して分離及び精製した。
（１）天然型ｆＧ－ＣＳＦまたは突然変異型ｆＧ－ＣＳＦの分離及び精製
天然型ｆＧＣＳＦまたは突然変異型ｆＧＣＳＦは、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）精製技法と、２段階のイオン交換クロマトグラフィ精製技法とを利用して精製した。まず、ＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）Mediaを利用して生産された３００ｍｌの培養液を、冷蔵条件において、４，０００ｒｐｍ、２０分間、遠心分離して上澄み液を回収し、それを、０．２ μｍメンブレンフィルタで濾過し、上澄み液を準備した。準備された３００ｍｌの培養上澄み液を、ｐＨ７．４の２０ｍＭリン酸ナトリウムと５００ｍＭ ＮａＣｌバッファとの１０ＣＶｓによって平衡化された５ｍｌ prepacked Ｎｉ－ＮＴＡ His・Bind（登録商標）Resinカラムに、４５ｃｍ／ｈ流速で流して試料を結合させた後、ｐＨ７．４の２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭイミダゾールバッファを用いて、ＵＶ ２８０ｎｍ １０ｍＡＵ以下になるまで、６０ｃｍ／ｈ流速でカラムを洗浄した。カラム洗浄が完了した後、タンパク質溶出バッファであるｐＨ８．０の５０ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾールバッファを使用し、６０ｃｍ／ｈ流速で、溶出バッファ濃度段階別溶出を進め、各濃度別溶出分画を収集した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を利用して、分離、精製の結果を確認した後、後続精製段階を進めるためにｍｐＨ５．５の２０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファを使用して冷蔵条件で一晩透析を進めた。ｐＨ５．５の２０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファに交替されたｆＧＣＳＦ試料を、ｐＨ５．５の２０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファの１０ＣＶｓで平衡化されたprepacked Ｈｉｔｒａｐ ＳＰ ＨＰ５ｍｌカラムに、６０ｃｍ／ｈ流速で流して試料を結合させた後、ｐＨ５．５の２０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファで、ＵＶ ２８０ｎｍ １０ｍＡＵ以下になるまで、６０ｃｍ／ｈ流速でカラムを洗浄した。カラム洗浄が完了した後、タンパク質溶出バッファであるｐＨ６．５の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌバッファを使用し、６０ｃｍ／ｈ流速で、溶出バッファ濃度段階別溶出を進め、ＵＶ ２８０ｎｍ １０ｍＡＵ以上の溶出分画を収集した。その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を利用して、分離、精製の結果を確認した後、後続精製段階を進めるために、ｐＨ５．５の２０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファを使用して冷蔵条件において一晩透析を進めた。ｐＨ５．５の２０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファに交替されたｆＧＣＳＦ試料を、ｐＨ５．５の２０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファ１０ＣＶｓで平衡化されたprepacked ＰＯＲＯＳ ＸＱ ５ｍｌカラムに６０ｃｍ／ｈ流速で流し、カラムに結合せずに通過する試料を収集した。その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を利用して、分離、精製の結果を確認した後、０．２μｍフィルタで不純物を除去し、ＵＶタンパク質定量法を利用し、タンパク質定量後、使用前まで－２０℃で保管した。
（２）ＡＰＢ－Ｆ１の分離及び精製
ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１，ｖ２）は、Capto Ｌレジンを利用したアフィニティクロマトグラフィ精製技法と、２段階のイオン交換クロマトグラフィ精製技法とを利用して精製した。まず、ＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）Mediaを利用して生産された９００ｍｌのＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１，ｖ２）培養液を、冷蔵条件において、４，０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離して上澄み液を回収し、それを０．２μｍメンブレンフィルタで濾過し、上澄み液を準備した。準備された９００ｍｌの培養上澄み液を、１ｘＰＢＳ １０ＣＶｓで平衡化されたprepacked Capto Ｌ３４ｍｌカラムに、１２０ｃｍ／ｈ流速で流し、試料を結合させた後、ｐＨ６．０の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１％Ｄ－マンニトールバッファを用いて、ＵＶ ２８０ｎｍ １０ｍＡＵ以下になるまで、１２０ｃｍ／ｈ流速でカラムを洗浄した。カラム洗浄が完了した後、タンパク質溶出バッファであるｐＨ３．０の５０ｍＭクエン酸ナトリウム、３％Ｄ－マンニトールバッファを使用し、１２０ｃｍ／ｈ流速で、１００％の溶出バッファを流し、ＵＶ ２８０ｎｍ １０ｍＡＵ以上のタンパク質溶出分画を収集した。収集された溶出分画に、ｐＨ８．０の１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ溶液を添加し、ｐＨを６．０に弱酸性化させた後、０．２μｍフィルタで不純物を除去した。ＡＣ精製で得られた試料を、ｐＨ６．０の２０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファ１０ＣＶｓで平衡化されたＣＭ sepharose Ｆ－Ｆ １０ｍｌカラムに、１５３ｃｍ／ｈ流速で流して、試料を結合させた後、ｐＨ６．０の２０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファを用いて、ＵＶ ２８０ｎｍ １０ｍＡＵ以下になるまで、１５３ｃｍ／ｈ流速でカラムを洗浄した。カラム洗浄が完了した後、タンパク質溶出バッファであるｐＨ６．０の２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１Ｍ ＮａＣｌバッファを使用して、１５３ｃｍ／ｈ流速で、溶出バッファ濃度段階別溶出を進め、ＵＶ ２８０ｎｍ １０ｍＡＵ以上の溶出分画を収集した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を利用して分離精製結果を確認した後、後続精製段階を進めるために、ｐＨ６．０の２０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファを使用して冷蔵条件において一晩透析を進めた。ｐＨ６．０の２０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファに交替されたＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１，ｖ２）試料を、ｐＨ６．０の２０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファ１０ＣＶｓで平衡化されたprepacked ＰＯＲＯＳ ５０ＨＱ ３５ｍｌカラムに、３４ｃｍ／ｈ流速で流し、カラムに結合せずに通過する試料を収集した。その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を利用して分離精製結果を確認した後、０．２μｍフィルタで不純物を除去した。
［製造例５．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析］
タンパク質試料を、（１）還元条件（１０％グリセロール、１％ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＬ）、ｐＨ７．６の０．２Ｍトリエタノールアミン－Ｃｌ、１％フィコール（登録商標）－４００、０．０００６２５％フェノールレッド、０．０００６２５％クマシーＧ２５０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム、１．２５％ ２－メルカプトエタノール：１０分間煮沸）、（２）非還元条件（１０％グリセロール、１％ドデシル硫酸リチウム（ＬＤＬ）、ｐＨ７．６の０．２Ｍトリエタノールアミン－Ｃｌ、１％フィコール（登録商標）－４００、０．０００６２５％フェノールレッド、０．０００６２５％クマシーＧ２５０、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ二ナトリウム、１０分間煮沸）、（３）非還元条件［煮沸せず］（１０％グリセロール、ｐＨ６．８の０．３７５Ｍトリエタノールアミン－Ｃｌ、０．００５％ブロモフェノールブルー：煮沸せず）の総３種条件で処理した。その後、前記タンパク質試料を、プレキャスト４～１５％勾配ゲルに、１μｇ／ウェル濃度でローディングした後、定電圧１５０Ｖ、５０分条件で電気泳動を実施した。電気泳動後、分離されたゲルを、Ｅｚゲル染色溶液で１時間染色した後、水で脱色させた。その後、Ｅｘｃｅｌｂａｎｄ（商標）Enhanced 3-color high range protein markerと比較する方式でタンパク質分析を実施した。
［製造例６．サイズ排除クロマトグラフィ］
ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１，ｖ２）の純度を確認するために、Agilent １２６０ InfinityIIシステムを利用し、ＳＥ－ＨＰＬＣを進めた。ＳＥ－ＨＰＬＣカラムとしては、ＴＳＫ gel UltraＳＷ aggregate 7.8 x 300mm（Tosoh Biosciences、日本）カラムを利用し、具体的には、（１）カラム温度：２０℃、（２）移動相Ａ：２０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．５、１００ｍＭ ＮａＣｌ、（３）流速：０．７ｍｌ／分、（４）波長：２８０ｎｍ、（５）注入：４０μｇ、（６）グラジエント：アイソクラティック条件で遂行した。
［実施例１．ＦＬ３３５及び猫血清アルブミンの発現及び生産］
本実施例においては、前記製造例によるＦＬ３３５抗体断片及び猫血清アルブミンの発現及び生産を確認するものである。ＦＬ３３５は、図５に示されているように、ＳＬ３３５のヒトＶＨ，ＶＬ配列、猫ＩｇＧ１ ＣＨ１（delta Ｃ）及びＣＬ－kappaを含む。ＦＬ３３５を作製するために、ＳＬ３３５ＶＨと猫ＩｇＧ１ ＣＨ１とを、linking ＰＣＲを介して連結し、ＦＬ３３５ Ｆｄ遺伝子を作製し、前述のところと同一方式により、ＳＬ３３５ＶＬと猫ＣＬ－kappaとを連結し、ＦＬ３３５ Ｌ遺伝子を作製した。その後、前記製造例によって生産及び精製されたＦＬ３３５ Ｆｄ、ＦＬ３３５ Ｌ及び猫血清アルブミンをＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。
ＦＬ３３５ ＦｄまたはＦＬ３３５ Ｌを発現ベクターにそれぞれ挿入した後、前記発現ベクターによるタンパク質の発現を、ＥｘｐｉＣＨＯ発現システムを利用した一時的発現を介して確認した。その後、安定化細胞株をフラスコ生産して得た培養液につき、親和性クロマトグラフィと、２段階のイオン交換クロマトグラフィとを含む精製過程を進め、ＧＳ null ＣＨＯ－Ｋ１細胞培養液上澄み液から精製されたタンパク質を、４～１５％勾配ゲル上でＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。
また、猫血清アルブミンも、遺伝子合成を介して直接作製し、分離、精製及び分析のために、Ｎ末端にｍｙｃ tagを、Ｃ末端にｈｉｓ tagを連結し、それを発現ベクターｐＪＫプラスミドに挿入した。その後、前記発現ベクターによるタンパク質の発現を、ＥｘｐｉＣＨＯ発現システムを利用した一時的発現を介して確認した。また、安定化細胞株のフラスコ生産を介して得られた培養液を分離精製し、そこから精製されたタンパク質をＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。
図６Ａ及び図６Ｂは、一実施例による発現及び精製の過程後、培養液内ＦＬ３３５ Ｆｄ、ＦＬ３３５ Ｌ及び猫血清アルブミンを確認したものであり、図６のＡは、ＦＬ３３５をＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して確認した結果であり、図６のＢは、猫血清アルブミンをＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して確認した結果である。
図６のＡに示されているように、２３．４９２ｋＤａの理論的分子量を有するＦＬ３３５ Ｆｄ、２３．８７７ｋＤａの理論的分子量を有するＦＬ３３５ Ｌに相応するタンパク質バンドを確認し、それと同様に、４７．３５２ｋＤａの理論的分子量を有するＦＬ３３５ Ｆａｂに相応するタンパク質バンドも確認した。また、図６のＢに示されているように、６７．８ｋＤａの理論的分子量を有する猫血清アルブミンと相応するタンパク質バンドを確認した。
［実施例２．猫の血清アルブミンに対するＦＬ３３５の結合能の確認］

本実施例においては、猫血清アルブミンに対するＦＬ３３５の結合能を確認するものである。具体的には、猫血清アルブミンを、ｐＨ９．６の炭酸コーティングバッファ（carbonate coating buffer）で１μｇ／ｍＬに希釈し、ＭａｘｉＳｏｒｐ ＮＵＮＣ Ｉｍｍｕｎｏ ＥＬＩＳＡプレートのそれぞれのウェルに、１００μｌの希釈溶液を添加した後、それを４℃で一晩放置することにより、猫血清アルブミンをプレートにコーティングさせた。ブロッキングバッファとしては、３％牛血清アルブミンが含まれたＰＢＳＴ［０．１％（ｖ／ｖ）Tweenを含むＰＢＳ］を使用し、それぞれのウェルに、３００μｌのブロッキングバッファを添加し、常温でブロッキングした。その後、それぞれのウェルに、３００μｌの洗浄バッファ（ＰＢＳＴ）を分注して洗浄し、それを３回反復した。抗体断片または試料の希釈のための溶液として、０．３％ ＰＢＡ（０．１％ＰＢＳＴ内）を使用し、猫血清アルブミンでコーティングされたウェルに、１００μｌの希釈溶液を分注し、常温で１時間反応させた。前述のところと同一方法を用いて３回洗浄した。その後、ＳＬ３３５検出（detection）１ｓｔ抗体として、ヤギ抗ヒトkappa－ＨＲＰを１：３，０００に希釈し、前記ウェルに添加し、ＦＬ３３５検出１ｓｔ抗体として、ヤギ抗猫軽鎖Ａｂを１：３，０００に希釈し、ＦＬ３３５検出２ｎｄ抗体として、ヤギＩｇＧ－Ｆｃフラグメントcross antibodyを１：５，０００に希釈し、前記ウェルに添加した。それによる抗原・抗体反応は、常温で１時間進め、結合シグナルは、３，３，５，５－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を基質としてを使用し、ＥＬＩＳＡリーダを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。一方、本実施例においては、アルブミンと結合するＦＬ３３５抗体断片の機能性を確認するために、ヒト血清アルブミンまたは猫血清アルブミンとの結合レベルを、ヒトアルブミンに特異的に結合するＦａｂ断片であるＳＬ３３５と比較した。
図７Ａ及び図７Ｂは、血清アルブミンに対するＦＬ３３５の結合能を確認したものであり、図７Ａは、ヒト及び猫血清アルブミンとＳＬ３３５との結合能を、ＥＬＩＳＡを介して確認した結果であり、図７Ｂは、ヒト及び猫血清アルブミンとＦＬ３３５との結合能を、ＥＬＩＳＡを介して確認した結果である。
図７に示されているように、ＦＬ３３５抗体断片は、全ての血清アルブミンにつき、ＳＬ３３５と類似したレベルの結合能を示している。そのような実験結果は、抗血清アルブミンに特異的に結合する既存の抗体、すなわち、ＳＬ３３５の重鎖可変領域ドメインまたは軽鎖可変領域ドメインに、猫由来の重鎖定常１ドメインまたは軽鎖定常ドメイン（ＣＨ１，Ｃκ）を結合させた場合にも、アルブミンとの結合能は、そのまま維持されるということを示す。
［実施例３．猫の顆粒球コロニー刺激因子の発現及び生産］
本実施例においては、前記製造例によるｆＧＣＳＦタンパク質の発現及び生産を確認するものである。タンパク質が生産される過程において引き起こされうるミスフォールディングを防止し、精製工程及び処理工程の便宜性のために、天然型猫顆粒球コロニー刺激因子（天然型ｆＧＣＳＦ）と共に、突然変異型猫の顆粒球コロニー刺激因子（突然変異型ｆＧＣＳＦ）の総２種類の猫の顆粒球コロニー刺激因子を製造した。具体的には、突然変異型ｆＧＣＳＦは、天然型ｆＧＣＳＦから、遊離システインの除去のためにＣ１７Ｓで置換され、Ｏ－糖鎖の除去のためにＴ１３３Ａで置換された形態に作製された。天然型ｆＧＣＳＦと突然変異型ｆＧＣＳＦとを安定して発現する細胞株を作製するために、ＧＳ null ＣＨＯ－Ｋ１細胞にそれらを形質転換させた後、Ｌ－メチオニンスルホキシイミンとピューロマイシンとを使用し、約４週にわたって選別することにより、安定化細胞株を作製した。その後、安定化細胞株をフラスコ生産して得られた培養液につき、固定化金属アフィニティクロマトグラフィと、２段階のイオン交換クロマトグラフィとを含む精製過程を進め、ＧＳ null ＣＨＯ－Ｋ１細胞培養液上澄み液から精製されたタンパク質を、４～１５％勾配ゲル上でＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。
図８のＡ及び図８のＢは、一実施例による発現及び精製の過程後、培養液内の天然型ｆＧ－ＣＳＦと突然変異型ｆＧＣＳＦとを確認したものであり、図８のＡは、天然型ｆＧＣＳＦを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して確認した結果であり、図８のＢは、突然変異型ｆＧＣＳＦを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して確認した結果である。
図８に示されているように、天然型ｆＧＣＳＦと突然変異型ｆＧＣＳＦとに相応するタンパク質バンドを確認し、非還元（煮沸せず）条件において、遊離システイン及びＯ－糖鎖の除去により、突然変異型ｆＧＣＳＦのタンパク質バンドサイズは、天然型ｆＧＣＳＦに比べ小さくなることを確認した。
［実施例４．ＡＰＢ－Ｆ１の発現及び生産］
本実施例においては、前記製造例によるＡＰＢ－Ｆ１の発現及び生産を確認するものである。ＡＰＢ－Ｆ１は、図９に示されているように、ｆＧＣＳＦにより、２種類のタンパク質に作製された。すなわち、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１）は、ＦＬ３３５ ＦｄのＣ末端に、天然型ｆＧＣＳＦを連結したタンパク質であり、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ２）は、ＦＬ３３５ ＦｄのＣ末端に、突然変異型ｆＧＣＳＦを連結したタンパク質である。その後、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１）とＡＰＢ－Ｆ１（ｖ２）とを安定して発現する細胞株を作製するために、ＧＳ null ＣＨＯ－Ｋ１細胞にそれらを形質転換させた後、Ｌ－メチオニンスルホキシイミンとピューロマイシンとを使用して約４週にわたって選別することにより、安定化細胞株を作製した。その後、安定化細胞株をフラスコ生産して得られた培養液につき、親和性クロマトグラフィと、２段階のイオン交換クロマトグラフィとを含む精製過程を進め、ＧＳ null ＣＨＯ－Ｋ１細胞培養液上澄み液から精製されたタンパク質を、４－１５％勾配ゲル上でＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。
図１０のＡ及び図１０のＢは、一実施例による発現及び精製の過程後、培養液内ＡＰＢ－Ｆ１を確認したものであり、図１０のＡは、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して確認した結果であり、図１０のＢは、ＡＰＢ－Ｆ１（Ｖ２）を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを介して確認した結果である。また、図１１は、一実施例による発現及び精製の過程後、ＡＰＢ－Ｆ１試料の純度を確認したものであり、図１１Ａは、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１）試料に対するＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析結果であり、図１１Ｂは、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ２）試料に対するＳＥＣ－ＨＰＬＣ分析結果である。
図１０に示されているように、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１）及びＡＰＢ－Ｆ１（ｖ２）に相応するタンパク質バンドを確認し、前記結果と同様に、非還元（煮沸せず）条件において、遊離システイン及びＯ－糖鎖の除去により、突然変異型ｆＧＣＳＦを含むＡＰＢ－Ｆ１（ｖ２）のタンパク質バンドサイズは、転円型ｆＧＣＳＦを含むＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１）に比べて小さくなることを確認した。また、図１１に示されているように、前述のような一連の製造工程及び精製工程を介して得られたＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１）及びＡＰＢ－Ｆ１（ｖ２）の試料は、約９８％の高い純度を有することを確認した。
［実施例５．ＡＰＢ－Ｆ１の生物学的活性の評価］
本実施例においては、ＡＰＢ－Ｆ１のＥＣ５０を測定して、それらの生物学的活性を評価した。具体的には、Ｍ－ＮＦＳ６０細胞（ＡＴＣＣ Ｎｏ．１８３８）を対象とし、細胞増殖アッセイを行った。陰性対照群として、ＦＬ３３５を使用し、陽性対照群として、ＷＨＯが指定した生物学的活性標準物質であるヒト顆粒球コロニー刺激因子（hGCSF I.S、rDNA Derived、2nd International Standard, NIBSC code: 09/136）を使用し、比較群としては、フィルグラスチム（Filgrastim）、ＰＥＧ－フィルグラスチム及びｆＧＣＳＦを使用した。まず、Ｍ－ＮＦＳ６０細胞を、１％ ＦＢＳが添加されたＲＰＭＩ－１６４０培地で培養し、該培養条件は、３７℃、５％ ＣＯ２を維持した。その後、前記細胞を、６×１０４細胞／ｍｌの濃度に、ＲＰＭＩ－１６４０（Gibco）培地で希釈し、１００μｌの希釈溶液を、９６ウェルプレートに添加した。次に、ＡＰＢ－Ｆ１、対照物質及び対照物質を、ＲＰＭＩ－１６４０培地に０．０１～１，０００ｐＭ濃度に希釈した後、それらを、それぞれのウェル当たり１００μｌずつ三つ組み（triplicate）にして添加し、３７℃、５％ ＣＯ２条件において４２時間培養した。その後、前述の培養された細胞に、セルカウンティングキット－８溶液を、２０μｌ／ウェル濃度で添加し、さらに６時間反応を進めた。その後、細胞生存率を確認するために、マイクロプレートリーダを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
図１２は、Ｍ－ＮＦＳ６０細胞を対象に実施したＡＰＢ－Ｆ１の細胞増殖アッセイ分析結果を示したものである。図１２に示されているように、ｈＧＣＳＦ Ｉ．Ｓ、ｆＧＣＳＦ、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１）及びＡＰＢ－Ｆ１（ｖ２）のＥＣ５０は、それぞれ、２．４５ｐＭ、３．５９ｐＭ、８．３２ｐＭ及び５．６７ｐＭを示し、フィルグラスチム及びＰＥＧ－フィルグラスチムのＥＣ５０は、それぞれ、３．９４ｐＭ及び３．０７ｐＭであることを確認した。具体的には、本実験で測定されたフィルグラスチムの活性度は、０．６×１０８Ｕ／ｍｇであり、既知のフィルグラスチムの活性度レベルである（０．６±１．０）×１０８Ｕ／ｍｇの範囲に含まれ、本実験の有効性を確認することができた。また、ｆＧＣＳＦ及びＰＥＧ－フィルグラスチムの活性度は、それぞれ６．５×１０６Ｕ／ｍｇ、３．６×１０７Ｕ／ｍｇと測定され、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ１）及びＡＰＢ－Ｆ１（ｖ２）の活性度は、それぞれ７．８×１０６Ｕ／ｍｇ、（８．７±０．３）×１０６Ｕ／ｍｇと、類似したレベルの活性を示すということを確認した。それは、ｆＧＣＳＦ内の遊離システイン及びＯ－糖鎖の除去にもかかわらず、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ２）の生物学的活性がそのまま維持されることを示したものであり、組み換えタンパク質の生産、分離及び精製工程の容易性を考慮し、以下の実施例においては、ＡＰＢ－Ｆ１（ｖ２）をＡＰＢ－Ｆ１タンパク質として選択した。
［実施例６．原形（Intact）質量分析］
本実施例においては、ＡＰＢ－Ｆ１の正確な分子量を確認するために、還元条件下において、原形質量分析を実施した。本実験において、Dionex ＵＨＰＬＣ及びＱ－ＴＯＦ５６００＋ＭＳ／ＭＳシステムを使用した。Acquity ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ１３０ Ｃ４、１．７μｍカラム、移動相としてアセトニトリルを使用し、０．３ｍｌ／分流速の条件でＡＰＢ－Ｆ１の質量を測定した。
図１３Ａ及び図１３Ｂは、ＡＰＢ－Ｆ１の分子量を、原形質量分析を介して確認したものであり、図１３Ａは、ＡＰＢ－Ｆ１ Ｆｄの質量を確認した結果であり、図１３Ｂは、ＡＰＢ－Ｆ１Ｌの質量を確認した結果である。図１３に示されているように、ＡＰＢ－Ｆ１ Ｆｄの質量は、４７．７４３ｋＤａ、ＡＰＢ－Ｆ１ ＦｄＬの質量は、２３．８７２ｋＤａと測定された。
［実施例７．Ｎ末端配列決定］
本実施例においては、ＡＰＢ－Ｆ１のＮ末端配列を具体的に確認し、組み換えタンパク質の発現後、シグナル配列の除去のような過程の正確性を確認するために、Ｎ末端配列決定分析を実施した。本実験は、ProteomeTech Inc.に依頼して進められ、エドマン分解（Edman degradation）法とＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法とを利用した。前記エドマン分解法は、プロテインシーケンサ（protein sequencer）装備を利用し、標準物質（ＰＴＨ－ＡＡ、８．０ｐＭ）の相対保持時間（relative retention time）（ｄｐｔｕ）基準で、３．５～１８．０分の露出時間、０．００５ＡＵＦＳの検出器スケール条件で、ＡＰＢ－Ｆ１（１０．０ｐＭ）のＮ末端配列を分析した。
表２は、ＡＰＢ－Ｆ１のＮ末端配列を、エドマン分解法を介して確認した結果である。
Figure 2023521363000003
表２に示されているように、ＡＰＢ－Ｆ１ＬのＮ末端配列は、ＤＩＶＬＴであることを確認した。一方、ＡＰＢ－Ｆ１ Ｆｄについては、反応が遮断されてその配列を確認することができず、それは、最初残基であるグルタミン（Ｇｌｎ）がポリグルタメート（ｐＧｌｕ）に生物学的変換されることによる結果と判断される。
その後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、ＮａｎｏＵＰＬＣ，ＬＴＱ－orbitrap－mass spectromete装備を利用し、ペプチド質量マッチングにおける誤差範囲（peptide mass tolerance）（±１０ｐｐｍ）、断片質量マッチングにおける誤差範囲（fragment mass tolerance）（±０．８Ｄａ）、Max Missed Cleavages（２） ３００－２，０００ｍ／ｚ範囲の条件において、ＱＶＱＬＶＱＳＧＧＧＰＶＫＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳ塩基配列に対して分析を実施した（配列番号２２及び２３のＮ末端）。その後、Proteome Discoverer，ＭＡＳＣＯＴソフトウェアを利用して分析した。
表３は、ＡＰＢ－Ｆ１ ＦｄのＮ末端配列に対するＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果につき、Proteome Discovererソフトウェアを利用して示したものであり、図１４は、ＡＰＢ－Ｆ１ ＦｄのＮ末端配列に係わるＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析結果を、ＭＡＳＣＯＴソフトウェアを利用して示したものである。
Figure 2023521363000004
表３及び図１４に示されているように、ＡＰＢ－Ｆ１ Ｆｄ（配列番号２２及び２３）のＮ末端配列は、Ｑ（pyro－ｇｌｕ）ＶＱＬＶであることを確認した。
［実施例８．ＡＰＢ－Ｆ１の薬物動態学的評価］
本実施例においては、ＡＰＢ－Ｆ１の吸収、分布、生体内変化及び排泄などを確認するために、薬物動態学的評価を実施した。具体的には、健常な猫に、ＡＰＢ－Ｆ１の試験物質を皮下注射した後、血液試料を採取して分析した。それぞれのグループは、雄猫２匹及、及び妊娠していない雌猫２匹の総４匹によって構成され、試験物質投与の２日前または４日前、試験物質投与直後、試験物質投与後の２，６または１２時間が経過した時点、試験物質投与後に、経時的に総１５回にわたり、頚静脈採血を介し、毎回３ｍｌの全血を得た。前記全血は、得られた直後、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、血漿を分離した後、それを、使用前まで超低温冷凍庫（約－７０℃）に保管した。本実験において、実験群としては、１００μｇ／ｋｇの突然変異型ｆＧＣＳＦタンパク質投与群、３６０μｇ／ｋｇのＡＰＢ－Ｆ１投与群を設定した。
その後、得られた試料を、ＥＬＩＳＡ方法で分析した。まず、ｐＨ９．６の炭酸コーティングバッファを利用し、１μｇ／ｍＬ濃度に希釈されたラット抗ヒトＧＣＳＦ Ａｂ溶液を、ＥＬＩＳＡプレートそれぞれのウェルに、１００ｎｇ／ウェルに、１００μｌずつローディングした後、２～８℃でインキュベートし、一晩抗体をコーティングした。前記プレート内溶液を除去した後、洗浄バッファをウェル当たり３００μｌずつ添加し、１回洗浄した。その後、そこに、ブロッキングバッファを、ウェル当たり３００μｌずつ分注した後、常温で３時間ブロッキングした。前記プレート内溶液を除去し、常温で１時間プレートを逆さにし、残存する溶液を除去した後、１００μｌの標準物質と希釈検液とを、三つ揃いでウェルに添加した。その後、シーラ（sealer）でプレートを覆い、それを、常温、４５０ｒｐｍの条件で９０分反応させ、洗浄バッファを利用して前述のような方法によって４回洗浄した。その後、そこに、一次抗体であるウサギ抗ｆＧＣＳＦｐＡｂを１：１，０００に希釈し、全てのウェルに１００μｌずつ分注した後、シーラでプレートを覆い、常温で１時間反応させた。次に、二次抗体であるperoxidase-conjugated AffiniPureヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を添加し、抗原抗体反応を誘導した。具体的には、前述のような方法で４回洗浄した後、１：１０，０００に希釈された二次抗体を、全てのウェルに１００μｌずつ添加し、常温、遮光の条件で１時間反応させた。その後、前述のような方法で５回洗浄した後、そこに、ＢｉｏＦＸ（登録商標）ＴＭＢ Super Sensitive One Component ＨＲＰ Microwell Substrateを１００μｌ／ウェルずつ添加し、室温で５～１０分反応させた。その後、１ＮのＨＣＬを添加し、基質反応を終了させた。次に、SPECTROstar Nano Microplateリーダを利用して、測定波長４５０ｎｍ、参照波長６５０ｎｍで吸光度を測定し、Phoenix ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアで統計分析を実施した。
表４及び図１５は、猫を対象に、ＡＰＢ－Ｆ１の薬物動態学的評価を実施した結果を示したものである。
表４及び図１５に示されているように、最高血中濃度到達時間（Ｔｍａｘ）は、ｆＧＣＳＦの場合で６時間である一方、ＡＰＢ－Ｆ１は、１２時間を示し、ＡＰＢ－Ｆ１のＡＵＣｌａｓｔは１９，０２５．４ｈ・ｎｇ／ｍＬであり、これは６，０５０．０３ｈ・ｎｇ／ｍＬの値を示したｆＧＣＳＦに比べ約３．１倍増大されたものであった。また、最高血中濃度（Ｃｍａｘ）は、ｆＧＣＳＦの場合、５７６．３ｎｇ／ｍＬである一方、ＡＰＢ－Ｆ１は、８２３．９ｎｇ／ｍＬであり、ｆＧＣＳＦに比べて１．４倍増大された値を示し、消失半減期（Ｔ１／２）は、ＡＰＢ－Ｆ１の場合、１３．３時間であり、２．７時間を示したｆＧＣＳＦに比べて約４．９倍増大されたものであった。そのような実験結果から、一実施例によるＡＰＢ－Ｆ１は、突然変異型ｆＧＣＳＦタンパク質に比べ、改善された薬物動態学的特性を有するということが分かった。
Figure 2023521363000005
［実施例９．ＡＰＢ－Ｆ１の薬力学的評価］
本実施例においては、ＡＰＢ－Ｆ１の生理的、生理化学的な作用及び効果を確認するために、薬力学的評価を実施した。具体的には、健常な猫に、ＡＰＢ－Ｆ１のような試験物質を皮下注射した後、血液内の白血球数値を測定して分析した。それぞれのグループは、雄猫２匹、及び妊娠していない雌猫２匹の総４匹によって構成されている。投与日（０日）を基準に、経時的に、頚静脈採血を介して毎回３ｍｌの全血を得た。その後、得られた試料を対象に、自動血液分析器を使用した血液学的検査、及び血液生化学分析器と電解質自動分析器とを使用した血液生化学的検査を進めた。本実験において、実験群としては、３６μｇ／ｋｇのＡＰＢ－Ｆ１投与群、３６０μｇ／ｋｇのＡＰＢ－Ｆ１投与群、１０μｇ／ｋｇのｆＧＣＳＦ投与群、１０μｇ／ｋｇのフィルグラスチム（Grasin）投与群、１００μｇ／ｋｇのＰＥＧ－フィルグラスチム（Neulasta）投与群、２６μｇ／ｋｇのＦＬ３３５（Ｆａｂ）投与群を設定し、対照群としては、ビークル投与群を設定した。
図１６は、猫を対象に、ＡＰＢ－Ｆ１の薬力学的評価を実施した結果を示したものであり、血中白血球の数値を確認した結果である。図１６に示されているように、ＡＰＢ－Ｆ１投与群の白血球数値は、投与後１日目から１１日目まで、投与前に比べ有意に高く示され、投与後２０日目にも、正常範囲レベル（４．９×１０３細胞／μｌ０～２．０×１０４細胞／μｌ）より高く観察された（図示せず）。また、ｆＧＣＳＦ投与群の白血球数値は、投与後１日目、投与前に比べて有意な差を示したが、投与後５日目から正常範囲レベルに低下し、フィルグラスチム投与群も、白血球数値が、投与後１日目に有意なレベルに上昇したが、投与後２日目に、正常範囲レベルに低下した。また、ＰＥＧ－フィルグラスチム投与群の白血球数値は、投与後７日目まで、投与前に比べ有意に高く示され、投与後１０日目まで正常範囲より高いレベルを維持することを確認した。
図１７は、血中好中球の数値を確認した結果である。図１７に示されているように、ｆＧＣＳＦ投与群及びＡＰＢ－Ｆ１投与群の血中好中球数値は、投与後１日目、いずれも投与前に比べ、有意に高く示されたが、ＡＰＢ－Ｆ１投与群の血中好中球数値が、ｆＧＣＳＦ投与群に比べ、さらに高く観察された。また、ＡＰＢ－Ｆ１投与群の血中好中球数値は、１日目から１１日目まで有意に高いレベルを維持した。それと類似して、フィルグラスチム投与群に比べ、ＰＥＧ－フィルグラスチム投与群の血中好中球数値は、より高く、かつ長期間維持されるパターンが観察された。一方、それ以外の投与群は、対照群と有意差を示していない。
図１８は、血中単核球の数値を確認した結果である。図１８に示されているように、ＡＰＢ－Ｆ１投与群の血中単核球数値は、投与後２日目から９日目まで、投与前に比べ、有意に高く示され、ＰＥＧ－フィルグラスチム投与群の血中単核球数値は、投与後２日目から５日目まで、投与前に比べ、高く示されている。一方、それ以外の投与群は、対照群と有意差を示していない。
図１９は、血中好塩基球の数値を確認した結果である。図１９に示されているように、ＡＰＢ－Ｆ１投与群の血中好塩基球数値は、投与後２日目から７日目まで、正常範囲レベルより有意に高く示されている。
図２０は、血中リンパ球の数値を確認した結果であり、図２１は、血中好酸球数値を確認した結果である。図２０及び図２１に示されているように、血中リンパ球及び血中好酸球につき、実験群と対照群との有意的な差は、観察されていない。
そのような一連の実験結果から、一実施例によるＡＰＢ－Ｆ１は、血中白血球、具体的には、血中好中球、血中単核球及び血中好塩基球の数値を上昇させ、長期間維持させるのに寄与するということが分かった。
血清アルブミンに結合する抗原結合断片と、猫の顆粒球コロニー刺激因子とを含む組み換えタンパク質は、生体内（in-vivo）半減期の増大を含む薬物動態特性を改善させることができ、血液中の白血球レベルを治療的に有効なレベルまで上昇させる効果を継続的に示すことができる。
従って、本明細書に開示された組み換えタンパク質は、猫汎白血球減少症の予防用のまたは治療用の組成物の活性成分としても使用される。
特定の実施例に係わる前述の説明は、本発明の一般的な特性を十分に示しうるので、他の者が、本技術分野の技術内における知識を適用することにより、発明の一般的な概念から外れずに、多様な適用につき、容易に変形及び／または適応させることができる。従って、そのような適応及び変形は、ここに提示された教示及び指針に基づいて開示された実施例の等価物の意味内及び範囲内にあることが意図される。本明細書の語句または用語は、限定ではなく説明の目的のためのものであり、本明細書の用語または語句は、教示及び指針に照らして当業者によって解釈されるべきであることが理解される。
本発明の幅と範囲は、前述の例示的な実施例のいずれによっても制限されるものではなく、特許請求の範囲及びその均等物によってのみ定義されるものである。本明細書に記載された全ての多様な様態、実施例及びオプションは、任意かつ全てのバリエーション中に組み合わされ得る。
本明細書で言及される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの個別刊行物、特許または特許出願が参照により本明細書に含まれることが具体的かつ個別的に表示された場合と同一の程度において、参照により本明細書に含まれる。

Claims (25)

  1. （ａ）重鎖及び軽鎖を含む抗原結合断片、及び（ｂ）猫の顆粒球コロニー刺激因子（ｆＧＣＳＦ）を含む、組み換えタンパク質であって、
    ここで、該重鎖は、重鎖可変ドメイン及び猫の重鎖定常１ドメインを含み、該重鎖可変ドメインは、
    （１）ＳＹＧＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン１（ＣＤＲ１）、
    ＷＩＮＴＹＳＧＴＫＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号５２）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン２（ＣＤＲ）、及び
    ＬＧＨＣＱＲＧＩＣＳＤＡＬＤＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定ドメイン３（ＣＤＲ３）；
    （２）ＳＹＧＩＳ（配列番号５１）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
    ＲＩＮＴＹＮＧＮＴＧＹＡＱＲＬＱＧ（配列番号５４）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
    ＬＧＨＣＱＲＧＩＣＳＤＡＬＤＴ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
    （３）ＮＹＧＩＨ（配列番号５５）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
    ＳＩＳＹＤＧＳＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５６）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
    ＤＶＨＹＹＧＳＧＳＹＹＮＡＦＤＩ（配列番号５７）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
    （４）ＳＹＡＭＳ（配列番号５８）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
    ＶＩＳＨＤＧＧＦＱＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号５９）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
    ＡＧＷＬＲＱＹＧＭＤＶ（配列番号６０）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；
    （５）ＡＹＷＩＡ（配列番号６１）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
    ＭＩＷＰＰＤＡＤＡＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号６２）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
    ＬＹＳＧＳＹＳＰ（配列番号６３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３；又は
    （６）ＡＹＳＭＮ（配列番号６４）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、
    ＳＩＳＳＳＧＲＹＩＨＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号６５）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び
    ＥＴＶＭＡＧＫＡＬＤＹ（配列番号６６）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み、
    該軽鎖は、軽鎖可変ドメイン及び猫の軽鎖定常ドメインを含み、該軽鎖可変ドメインは、
    （７）ＲＡＳＱＳＩＳＲＹＬＮ（配列番号６７）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、 ＧＡＳＲＬＥＳ（配列番号６８）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
    ＱＱＳＤＳＶＰＶＴ（配列番号６９）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
    （８）ＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号７０）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
    ＡＡＳＳＬＱＳ（配列番号７１）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
    ＱＱＳＹＳＴＰＰＹＴ（配列番号７２）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
    （９）ＲＡＳＱＳＩＦＮＹＶＡ（配列番号７３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
    ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号７４）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
    ＱＱＲＳＫＷＰＰＴＷＴ（配列番号７５）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
    （１０）ＲＡＳＥＴＶＳＳＲＱＬＡ（配列番号７６）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
    ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号７７）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
    ＱＱＹＧＳＳＰＲＴ（配列番号７８）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；
    （１１）ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＳＬＡ（配列番号７９）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
    ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号７７）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
    ＱＫＹＳＳＹＰＬＴ（配列番号８０）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３；又は
    （１２）ＲＡＳＱＳＶＧＳＮＬＡ（配列番号８１）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、
    ＧＡＳＴＧＡＴ（配列番号８２）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び
    ＱＱＹＹＳＦＬＡＫＴ（配列番号８３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含む、
    組み換えタンパク質。
  2. ｆＧＣＳＦを抗原結合断片に連結するリンカをさらに含む、請求項１に記載の組み換えタンパク質。
  3. 軽鎖と重鎖とのあいだの鎖間ジスルフィド結合に位置する（ｉ）猫の重鎖定常１ドメイン内のシステイン、及び／または（ｉｉ）猫の軽鎖定常ドメイン内のシステインが保存され、欠失され、及び／又はシステイン以外のアミノ酸残基で置換されている、請求項１または２に記載の組み換えタンパク質。
  4. 前記重鎖可変ドメインは、配列番号６４のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３を含み、
    前記軽鎖可変ドメインは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、配列番号８２のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号８３のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含むものである、
    請求項１～３のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
  5. 前記重鎖可変ドメインが、配列番号１，２，３，４，５または６に対して８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含むものである、請求項１～４のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
  6. 前記軽鎖可変ドメインが、配列番号７，８，９，１０，１１，１２または１３に対し少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むものである、請求項１～５のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
  7. 前記重鎖可変ドメインは、配列番号１，２，３，４，５または６のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変ドメインは、配列番号７，８，９，１０，１１，１２または１３のアミノ酸配列を含むものである、請求項１～６のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
  8. 前記猫の重鎖定常１ドメインが、配列番号１４に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むものである、請求項１～７のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
  9. 前記猫の軽鎖定常ドメインが、配列番号１５に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むものである、請求項１～８のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
  10. 前記ｆＧＣＳＦは、天然ｆＧＣＳＦから遊離システイン基及びＯ－糖鎖を除去して改変されたものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
  11. 前記ｆＧＣＳＦは、配列番号１８に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
  12. 前記ｆＧＣＳＦは、配列番号１９に対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
  13. 前記ｆＧＣＳＦは、配列番号１９のアミノ酸配列を含むものである、請求項１～９のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
  14. 前記リンカは、前記ＧＣＳＦを、前記猫の重鎖定常１ドメインのＣ末端、重鎖可変ドメインのＮ末端、猫の軽鎖定常ドメインのＣ末端、及び／又は軽鎖可変ドメインのＮ末端と連結する、請求項２～１３のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
  15. 前記リンカが、１～５０個のアミノ酸を含むものである、請求項２～１４のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質。
  16. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質をコードする、核酸分子。
  17. 請求項１６に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
  18. 請求項１７に記載の発現ベクターで形質転換された、細胞。
  19. 請求項１～１５のいずれか一項に記載の組み換えタンパク質を含む、組成物。
  20. 請求項１７に記載の組成物、及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
  21. 請求項１９または２０に記載の組成物、及び使用マニュアルを含むラベルを含む、キット。
  22. 請求項２０に記載の医薬組成物を、それを必要とする個体に投与することを含む、猫の汎白血球減少症の治療方法。
  23. 前記組成物は、個体の血液内白血球を増加させる、請求項２２に記載の方法。
  24. 前記白血球は、好中球、単核球、好塩基球、またはそれらの組み合わせである、請求項２３に記載の方法。
  25. 前記組み換えタンパク質の除去半減期（Ｔ１／２）は、猫の顆粒球コロニー刺激因子（ｆＧＣＳＦ）のものより少なくとも約２倍大きいものである、請求項２２～２４のいずれか一項に記載の方法。
JP2022561431A 2020-04-09 2021-04-09 猫の顆粒球コロニー刺激因子及び血清アルブミン抗原結合断片を含む組み換えタンパク質、並びにその用途 Pending JP2023521363A (ja)

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