KR20150118565A - 항-혈청 알부민에 대한 항원결합 단편-이펙터 모이어티 융합 작제물 및 이의 제조방법 - Google Patents

항-혈청 알부민에 대한 항원결합 단편-이펙터 모이어티 융합 작제물 및 이의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20150118565A
KR20150118565A KR1020150136164A KR20150136164A KR20150118565A KR 20150118565 A KR20150118565 A KR 20150118565A KR 1020150136164 A KR1020150136164 A KR 1020150136164A KR 20150136164 A KR20150136164 A KR 20150136164A KR 20150118565 A KR20150118565 A KR 20150118565A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
leu
gly
thr
ala
Prior art date
Application number
KR1020150136164A
Other languages
English (en)
Inventor
차상훈
Original Assignee
주식회사 에이프릴바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 에이프릴바이오 filed Critical 주식회사 에이프릴바이오
Publication of KR20150118565A publication Critical patent/KR20150118565A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K47/48238—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/555—Interferons [IFN]
    • C07K14/565—IFN-beta
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)

Abstract

본 발명은 항원-결합 단편(Fab) 및 상기 항원결합 단편을 포함하는 항원 결합 단편-이펙터(effector) 융합 단백질 또는 (폴리)펩타이드에 관한 것이다. 본 발명에 따른 항원 결합 단편은 혈청 알부민에 특이적으로 결합함으로써 증가된 생체 내 반감기를 갖게 된다. 또한, 본 발명에 따른 항원 결합 단편은 중쇄 불변 1 도메인(CH1 도메인) 경쇄 불변 도메인(CκL 도메인) 내 사슬간 이황화 결합에 필요한 시스테인 잔기를 갖고 있지 않은 것이 특징이다. 본 발명에 따른 항원 결합 단편-이펙터(effector) 융합 단백질 또는 (폴리)펩타이드는 대장균의 주변세포질 내에서 고수율로 생산할 수 있으며, 크게 증가된 생체 내 반감기를 갖게 된다. 또한, 본 발명은 다양한 종류의 항원 결합 단편-이펙터(effector) 융합 단백질 또는 (폴리)펩타이드를 생산하는 대장균 균주, 및 항원 결합 단편-이펙터(effector) 융합 단백질 또는 (폴리)펩타이드를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

Description

항-혈청 알부민에 대한 항원결합 단편-이펙터 모이어티 융합 작제물 및 이의 제조방법{An anti serum albumin Fab-effector moiety fusion construct, and the preparing method thereof}
본 발명은 항원-결합 단편(Fab) 및 이를 포함하는 항원 결합 단편-이펙터(effector) 융합 단백질에 관한 것이다.
항원-결합 단편(Fab) 제조는 가장 성공적인 단일클론 항체 치료제 중의 하나이다. 예를 들어, 아비시맙(Abciximab, ReoPro®), 래니비주마브(Ranibizumab, Lucentis®) 및 세르톨리주마브 패골(Certolizumab pegol, Cimzia®) 등은 많은 국가에서 약제로써 이미 승인을 받은 상태이다. 또한, 아비시맙(Abciximab, ReoPro®), 래니비주마브(Ranibizumab, Lucentis®) 및 세르톨리주마브 패골(Certolizumab pegol, Cimzia®)를 포함하는 다클론성 항원 결합 단편(Fab) 제조는 유럽에서도 상용화되어 있다.
외인성 이펙터(effector) 모이어티와 Fab가 Fab-이펙터(effector) 모이어티 구조물을 형성하면 외인성 이펙터(effector) 모이어티의 결합이 Fab에 치료 효과를 부여할 수도 있다. 따라서, 임상 개발 상태에 있는 다수의 항체 단편들은 외인성 기능성 모이어티에 결합되어 있다. 그러한 Fab-융합 단백질 작제물(또는 Fab-이펙터(effector) 모이어티 작제물)에서, 항원 결합 모이어티는 표적을 제공할 수 있고, 융합 단백질 또는 (폴리)펩타이드(이펙터(effector) 모이어티)는 치료 효과를 제공할 수 있다. 원핵생물에서 유래한 융합 도메인은 사이토톡신, 예를 들어 deBouganin(탈면역화된 식물 독소)(Entwistle et al., 2012) Cancer Biother Radiopharm. 27, 582-92), staphylococcal enterotoxin(SE)(참조 Ilack et al., (2003) Toxicology. 185, 161-174) 또는 Pseudomonas exotoxin의 돌연변이 형태(참조 Choe et al., (1994) Cancer Res. 54, 3460-3467; 참조 Kreitman et al., (1994) Int . J. Cancer 57, 856-864). 부가적으로, ScFv(참조 Lu et al., (2002) J Immunolog Meth . 267, 213 226) 같은 진핵생물로부터의 (폴리)펩타이드 또는 사이토카인(참조 Holzer et al., (1996) Cytokine. 8, 214-221; 참조 Sjogaard et al., (1999) Int J Oncol. 15, 873-882)을 포함하는 융합 도메인은 치료제로써 기능할 수 있다. 일반적으로 방사성 동위원소를 Fab 또는 (Fab')2 단편에 화학적으로 결합시키지만, 세포독소, 사이토카인 또는 효소는 유전적으로 Fab 또는 (Fab')2에 결합시켰다. scFv, Fv 또는 dsFv와 달리 Fab 분자는 대장균의 주변세포질 내 수용성 형태로 1~2 g/L까지 쉽게 생산할 수 있고(참조 Humphreys et al., J. Immunol . Methods. 209, 193-202; Carter et al., Biotechnology (N Y). 10, 163-167; Venturi et al., J Mol Biol. 315, 1-8; Donzeau et al., Methods Mol Biol . 378, 14-31), 심지어 Pseudomonas fluorescnes 내에서 생산할 수도 있다(참조 Retallack et al., Prot Exp Purif . 81, 157-165). 현재, 대부분의 통상적으로 사용되는 rhGH, 인슐린 또는 다양한 형태의 사이토카인 같은 생물학 제재는 대장균에서 생산되고 있다(참조 Graumann and Premstaller, (2006) Biotechnol J. 1, 164-186; Chadd and Chamow, (2001) Curr Opin Biotechnol. 12, 188-194). 이러한 관점에서, Fab 단편에 대한 치료 도메인의 유전적 연결은 새로운 생물학적 의학 제재의 개발 및 현재 생물학적 약제의 효능 향상에 있어서 큰 장점을 가지고 있다. 또한, 이중-특이적 또는 삼중-특이적 항체 분자의 제조를 위해 Fab 분자는 scFv, Fv, dsFv 또는 dAb 같은 다른 항체 단편과 융합시킬 수 있다(참조 Lu et al., (2002) J Immunolog Meth. 267, 213-226). 하지만, 대장균 내 부적절한 폴딩 또는 당화 공정의 결핍에 의해 이펙터(effector) 도메인이 생물학적으로 기능할 수 없기 때문에, 대장균 내 진핵생물 기원의 이펙터(effector)를 포함하는 Fab-이펙터(effector) 융합 단백질의 발현은 방해를 받는다. 또한, 대장균의 주변 세포질 내 Fab-이펙터(effector) 융합 단백질을 생산하는 최적의 융합 포맷은 아직까지 연구되지 않은 상태이다. 사이토카인 및 성장 인자 같은 50kDa 및 60kDa 사이보다 낮은 분자량을 갖는 대부분의 혈청 단백질은 신장 청정에 의해 수 분에서 수 시간 사이의 생체 내 짧은 반감기를 갖고 있다. 따라서, 치료용 (폴리)펩타이드 또는 단백질의 혈청 반감기의 연장은 생물-약학 연구 분야에서 가장 심도있게 연구되는 영역 중의 하나이다(참조 Kontermann, (2012) Wiley, ISBN: 978-3-527-32849-9). 이러한 목적으로, 페길화, 폴리사이알릴화, 당화, HESylation를 포함하는 다양한 방법, 또는 유연하고 친수성인 아미노산 사슬(500 내지 600 아미노산)에 융합시킨 재조합 PEF 유사체가 개발되고 있다(참조 Chapman, (2002) Adv Drug Deliv Rev. 54, 531-545; Schlapschy et al., (2007) Prot Eng Des Sel . 20, 273-283; Kontermann (2011) Curr Op Biotechnol. 22, 868-876; Jevsevar et al., (2012) Methods Mol Biol. 901, 233-246). 또한, FcRn 매개성 재생 메카니즘은 치료 단백질의 생체 내 반감기를 연장시키기 위해 직접적으로 또는 간접적으로 활용되고 있다. 혈청 단백질 중에서, 인간 혈청 알부민(HSA) 및 면역 글로불린(특히, IgG)는 FcRn-매개성 재생 메카니즘을 통해 예외적으로 긴 반감기를 갖는 것으로 알려져 있다. 인체 내에서, 알부민의 혈청 반감기는 19일이고 IgG 분자의 혈청 반감기는 IgG의 하위 분류에 따라 대략 1주에서 4주 사이이다. 따라서, 이러한 두 가지 분자는 치료 단백질 및/또는 (폴리)펩타이드의 반감기를 연장시키기 위한 융합 파트너로써 사용되어 왔다.
대장균의 세포질 또는 주변세포질에서 제조된 재조합 hGH(~19 kDa)는 어른 뿐 아니라 유아의 성장 호르몬 부족에 의해 발생하는 질병을 치료하기 위해 병원에서 사용되어 왔다(참조 Blethen et al., (1997) J. Clin . Endocrinol . Metab . 82, 418-420). rhGH 투여의 주요한 단점은 짧은 반감기(30분 미만) 때문에 매일 투여해야 하는 점이다. hGH의 혈청 반감기를 연장하기 위해, 폴리에틸렌 글라이콜과의 화학적 결합(참조 Clark et al., (1996) J. Biol . Chem. 271, 21969-21977; Pradhananga et al., 2002 J Mol Endocrinol. 29, 1114; Cho et al., 2011; Sondergaard et al., (2011) J Clin Endocrinol Metabol. 96, 681-688), 및 인간화시킨 CovX-body IgG의 Fab 암(arm)에 대한 변형된 hGH의 화학적 결합(참조 Palanki et al., (2013) Bioorg . Med . Chem . Lett . 23, 402-406)이 개발되어 왔다. 추가적으로, 혈청 내 hGH의 반감기 연장은 인간 혈청 알부민(HSA)(Albutropin®) 또는 Pro-Ala-Ser(PAS) 잔기 수백개를 포함하는 폴리펩타이드 서열(PASylation)과의 유전적 융합에 의해 성공적으로 성취되어 왔다(참조 Osborn et al., 2002 Eur J Pharmacol. 456, 149-158; Anderson et al., (2011) J Biol Chem. 286, 5234-5241; Sleep et al., (2013) Biochimica et Biophysica Acta . 1830, 5526-5534; Schlapschy et al., (2013) Protein Eng Des Sel. 26, 489-501). 이 분야에서 가장 잘 연구된 소재는 VRS-317로써, N-말단 및 C-말단에 대하여 XTEN 아미노산 서열을 유전적으로 연결시킨 rGH인데, 월 1회 투여 요법이 가능하였다(참조 Schellenberger et al., (2007) Nat Biotech. 27, 1186-1190; Cleland et al., (2012) J Pharm Sci. 101, 2744-2754; Yuen et al., (2013) J Clin Endocrinol Metab. 98, 2595-2603).
Fab-융합 단백질(또는 (폴리)펩타이드)는 특별히 긴 시간 동안 다량의 약제 투여를 필요로 하는 만성 질환의 치료 시, 특히 Fab-융합 단백질이 저비용으로 미생물 발현 시스템 내에서 생산되는 경우에 치료제로써 큰 잠재력을 가지고 있다. 하지만, Fab 사용에서의 이러한 가능한 잠재력에도 불구하고, 생체 내 연장된 반감기를 갖춘 단백질 또는 (폴리)펩타이드 약제의 개발에서 항-혈청 알부민(SA) Fab 항체를 적용하려는 시도는 없었다. 본 발명에서, 본 발명자들은 신규한 항-혈청 알부민(SA) Fab-이펙터(effector) 단백질(또는 (폴리)펩타이드) 융합 작제물를 제조하고, 대장균 주변세포질 내 기능적 융합 작제물의 고수율 생산을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 해결하고자 하는 기술적 과제는 연장된 생체 내 혈청 반감기를 갖는 신규한 항원 결합 단편(Fab를 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 또 다른 기술적 과제는 숙주 세포의 주변세포질에서 최적 생산을 가능하게 하는 Fab-이펙터(effector) 융합 작제물를 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는 고수율의 수용성 형태인 Fab-이펙터(effector) 작제물를 생산할 수 있는 발현 벡터 및 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 발명에서 해결하고자 하는 다른 기술적 과제는 상기 융합 작제물를 포함하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 대장균 내 주변세포질 발현을 위한 최적의 Fab-이펙터(effector) 융합 작제물(또는 형태)를 제공하였는데, 상기 Fab는 중쇄 불변 1 도메인(CH1)에 결합하는 중쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 도메인(CL)에 결합하는 경쇄 가변 도메인을 포함하고 있다.
본 발명의 일 구체예에서, 작은 펩타이드 또는 도메인 항체(dAb)처럼 알부민 또는 알부민-결합 모이어티에 대한 다양한 치료 단백질의 융합이 FcRn-매개성 재생 메카니즘을 통해 치료 단백질의 반감기를 연장시킨다는 것을 고려하여, 인간 항-SA Fab는 항체 단편으로 선택하였다(참조 Dennis et al., (2002) Biochimica et Biophysica Acta . 1830, 5526-5534; Sleep et al., (2013) Biochimica et Biophysica Acta . 1830, 5526-5534; Nguyen et al., (2006) Protein Eng Des Sel . 19, 291-297; Kontermann, (2011) Curr Op Biotechnol . 22, 868-876). 선행기술에 따라, Fab 단편은 인체 내 16~20h의 반감기를 갖고 있으며(참조 Ujhelyi and Robert, (1995) Clin Pharmacokinet. 28, 483-493) 정맥 내 투여 후 랫트 내 3h의 반감기를 갖는다(참조 Nguyen et al., (2006) Protein Eng Des Sel . 19, 291-297). 놀랍게도, 본 발명에서 Fab(SL335)의 반감기는 랫트 내 37h인데 이는 통상적인 인간 Fab의 대략 12배 정도 길며, SL335는 인체 내에서 최소한 160~200h(6일 내지 8일)의 반감기를 갖는 것으로 추측하는 것은 타당하였다. 그 동안, RSA에 대하여 각각 13nM 및 1mM의 결합 친화성을 갖는 2가지 Vk 도메인인 dAbr3 및 dAbr16은 랫트 내에서 53h(dAbr3) 및 43h(dAbr16)의 반감기를 갖는 것으로 알려져 있다(참조 Holt et al., (2008) Protein Eng Des Sel . 21, 283-288). 더욱이, RSA에 대하여 92mM의 친화도를 갖는 항체 Fab4D5-H의 반감기는 26.9h이다(참조 Nguyen et al., (2006) Protein Eng Des Sel . 19, 291-297). 따라서, 이는 SL335의 생체 내 기능성이 기존에 보고된 dAbs 및 SA에 대해 특이적인 펩타이드의 기능성과 유사할 것을 암시하였다. SL335의 VH 및 VL은 전장 수준에서 단지 65~67% 아미노산 상동성을 공유하였고, 기존에 보고된 알부민-특이적 dAbs와의 상보성 결정 구역(CDR) 수준에서는 ~50%의 아미노산 상동성을 공유한다는 사실은 주목할 만하다. 바람직하게는, 본 발명의 실시예 내 혈청 알부민(SA)에 특이적인 Fab는 서열번호 1 (SA138 VH: QVQLLQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT SYGISWVRQA PGQGLEWVGW INTYSGGTKYA QKFQGRVTMT RDTSISTVYM ELSGLKSDDTAVY YCARLGHCQRGICSDAL DTWGQGTLVT VSS), 서열번호 2 (SA139 VH: EVQLLQSGAE VKEPGASVKV SCKASGYTFS SYGISWVRQA PGQGLEWVGR INTYNGNTGYA QRLQGRVTMT TDTSTSIAYM EVRSLRSDDTAVY YCARLGHCQRGICSDAL DTWGQGTMVT VSS), 서열번호 3 (SA140 VH: QVQLVQSGGG VVQTGGSLRL SCAASGFTFR NYGIHWVRQA PGKGLEWVAS ISYDGSNKYYA DSVKGRFTIS RDNSRNTVHV QMDSLRGGDTAVY YCARDVHYYGSGSYYNAF DIWGQGTLVT VSS), 서열번호 4 (SA141 VH: QVQLVQSGGG LVQPGGSLRL SCAASGFTFS SYAMSWVRQA PGKGLEWLSV ISHDGGFQYYA DSVKGRFTVS RDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVY YCARAGWLRQYGM DVWGQGTLVT VSS), 서열번호 5 (SL18 VH: EVQLVQSGTE VKKPGESLKI SCKISGYSFT AYWIAWVRQM PGKGLEWMGM IWPPDADARYS PSFQGQVTFS VDKSISTAYL QWHSLKTSDTAVY YCARLYSGSY SPWGQGTLVT VSS) 및 서열번호 6 (SL301, SL310 and SL335 VH: QVQLVQSGGG PVKPGGSLRL SCAASGFMFR AYSMNWVRQA PGKGLEWVSS ISSSGRYIHYA DSVKGRFTIS RDNAKNSLYL QMNSLRAEDTAVY YCARETVMAGKAL DYWGQGTLVT VSS)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인; 및 서열번호 7 (SA130: ELVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS RYLNWYQQKP GKAPKLLIYG ASRLESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SDSVPVTFGQ GTRLEIKR), 서열번호 8 (SA139 VL: DIVLTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYA ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYSTPPYTFGQ GTKLEIKR), 서열번호 9 (SL18 VL: ELVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSIF NYVAWYQQKP GQAPRLLIYD ASNRATGIPA RFSGSGSGTD FTLTISSLEP EDFAVYYCQQ RSKWPPTWTFGQ GTRVDIKR), 서열번호 10 (SL301 VL: ELVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASETVSS RQLAWYQQKP GQAPRLLIYG ASSRATGIPD RFSGSGSGTD FTLTISRLEP EDSAVFYCQQ YGSSPRTFGG GTKLEIKR), 서열번호 11 (SL310 VL: ELVLTQSPGT LSLSPGERAT LSCRASQSVSS SSLAWYQQKP GQAPRLLIYG ASSRATGIPD RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDAATYYCQK YSSYPLTFGQ GTKLEIKR), 및 서열번호 12 (SL335 VL: ELVLTQSPGT LSLSPGETAT LSCRASQSVG SNLAWYQQKP GQAPRLLIYG ASTGATGVPA RFSGSRSGTD FTLTITSLQP EDFATYYCQQ YYSFLAKTFGQ GTQLEIKR)로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인을 포함하였다. 상기 Fab의 VH 도메인은 중쇄 불변 1 도메인(CH1 도메인)에 결합하였고, Fab의 VL 도메인은 경쇄 불변 도메인(CκL 도메인)에 결합하였다. 더욱이, 본 발명의 혈청 알부민(SA)에 특이적인 Fab는 SL335의 VH 영역 내 서열번호 13 (CDR1)(AYSMN), 서열번호 14 (CDR2) (SISSSGRYIHYADSVKG) 및 서열번호 15 (CDR3) (ETVMAGKALDY)의 아미노산 서열 및 SL335의 VL 영역 내 서열번호 16 (CDR1)(RASQSVGSNLA), 서열번호 17 (CDR2) (GASTGAT) 및 서열번호 18 (CDR3) (QQYYSFLAKT)의 아미노산 서열을 포함하였다.
하나의 구체예에서 Fab의 CH1 도메인 및 CκL 도메인의 시스테인 아미노산은 결실되거나 세린 잔기로 치환되었다. 특히, 상기 SL335에 대하여, CH1 도메인의 시스테인 아미노산은 CH1 도메인의 N-말단으로부터 시작된 233th 아미노산이고, CκL 도메인의 시스테인은 세린 잔기로 치환된 CκL 도메인의 N-말단으로부터 시작된 214th 아미노산이다. 혼란을 회피하기 위해, Fab를 포함하는 H 사슬 및 L 사슬은 하기와 같이 명명하였다: Hcys: 233th 위치에 시스텐을 갖는 H 사슬, 2) Lcys: 214th 위치에 시스테인을 갖는 L 사슬, 3) Hser: 233th 위치에 세린을 갖는 H 사슬, 및 Lser:214th 위치에 세린을 갖는 L 사슬.
본 발명의 또 다른 구체예에서, Fab-이펙터(effector) 융합은 Fd 또는 Fab 분자 경쇄의 N-말단 또는 C-말단에 대하여 이펙터(effector) 도메인을 유전적 융합에 의해 연결함으로써 제조하였다. 대장균 내 재조합 단백질의 폴딩 및 이질이량체화 메카니즘은 매우 복잡하고 알려진 바가 적기 때문에, Fab-이펙터(effector) 융합 포맷이 기능적 발현에 최적이라는 것은 예측할 수 없다.
또한, 또 다른 구체예에서, 항원 결합 단편(Fab) 및 이펙터(effector) 도메인(생리활성 이펙터(effector) 모이어티)의 융합 작제물가 제공되었는데, 상기 작제물에서 Fab의 CH1 도메인 내 시스테인 아미노산 및 CκL 도메인 내 시스테인 아미노산은 결실되거나 세린 잔기로 치환되었고; 상기 생리활성 이펙터(effector) 모이어티는 단백질 또는 (폴리)펩타이드이며; 상기 Fab 및 생리활성 이펙터(effector) 모이어티는 유전적 융합에 의해 공유결합되어 있다. Fab 및 생리활성 이펙터(effector) 모이어티는 0 내지 20 아미노산의 펩타이드 링커를 사용하는 유전적 융합에 의해 공유결합될 수 있다. 본 발명의 6가지 Fab-이펙터(effector) 융합 포맷(작제물) 중에서, HserG/Lser이 대장균 내 가장 높은 발현 수율을 나타냄은 명백하였다. 이러한 실시예에 부합하여, 결실 또는 다른 아미노산으로의 치환에 의한 CH1 도메인 내 Cys233 및 CκL 도메인 내 Cys214의 제거는 배양 상층액 내 SL335-융합 이펙터(effector) 작제물의 수용성 발현을 향상시켰다. 이는 세 가지 중요한 과제를 제시하였다. 첫째, 이펙터(effector) 모이어티, 예를 들어 hGH의 CH1 C-말단으로의 융합은 CκL C-말단으로의 융합에 비해 바람직하였다. Lu et al.은 항-KDR Fab의 CH1 C-말단에 대한 항-Flt-1 scFv의 유전적 결합은 CL 도메인의 C-말단에 대한 결합에 비해 5배 증가된 수율을 나타냄을 이미 보고하였다(참조 Lu et al., (2002) J Immunolog Meth . 267, 213?226). 결과는 포함되지 않았지만, 본 발명자들은 전체 대장균 파쇄물을 이용한 웨스턴 블롯 분석에서 LcysG/Hcys 및 LserG/Hcys의 Fd 단편이 대부분 분해되었고, 대장균 상층액 내 융합 단백질의 수용성 형태는 거의 관찰되지 않았음을 입증하였다. VH 도메인은 대장균 내에서 응집되기 쉬우므로, CL의 C-말단 끝에서의 이펙터(effector) 도메인의 존재는 VL 도메인에 대한 VH 도메인의 상호작용 및 CL 도메인에 대한 CH1 도메인의 상호작용을 제한하여 Fd 단편의 빠른 응집 및 분해를 유발한다는 것을 예측할 수 있다. LserG/Hcys 및 LserG/Hser 사이의 수용성 발현 수율을 비교해 보면, CH1 도메인 내 Cys233의 존재는 아마도 부적절한 이황화 결합 형성에 의해 상기 과정을 촉진하는 것처럼 보인다. CH1 도메인 내 Cys233의 제거 후에, CH1 말단의 이펙터(effector) 도메인의 존재는 VH-VL 짝 이전에 VH 도메인에 대한 소수성 표면의 부분적인 블로킹에 의해 VH 도메인 응집의 환원에 대한 이로운 효과를 가질 것이다. HserG/Lser보다 HserG/Lcys의 낮은 수율은 Bence Jones 단백질에 알려진 것처럼(참조 Kirsh et al., (2005) J Immunol Methods. 301, 173-185), L 사슬의 동종이량체 형성 경향에 의해 설명할 수 있는데, CLκ의 Cys214는 동종이량체의 안정화에 영향을 미칠 수 있고, 융합 단백질 내 다른 시스테인 잔기와의 부적절한 이황화 결합에 참여할 수 있다. Fab 내 CH1 및 CL의 C-말단 사이의 이황화 결합은 상당한 수준의 유연성을 갖고 있어서 이동성이 좋다는 것이 알려져 있다(참조 Rothlisberger et al., (2005) J. Mol . Biol . 347, 773-789; Humphreys et al., (2007) Protein Eng Des Sel . 20, 227-234). 이러한 측면에서, 본 발명은 중쇄 불변 도메인 1(CH1)의 Cys233 및 경쇄 불변 도메인(CLK)의 Cys214이 없는 항원-결합 단편(Fab)를 제공하였다. 이와 같이, HserGF/Lser 및 HserIFNb/Lser은 대장균 내 가장 높은 발현 수율을 나타내었다. 본 발명의 융합 작제물에서, Fab에 대한 생리활성 (폴리)펩타이드 (또는 단백질)의 몰 비율은 1:1 및 10:1이고, 바람직하게는 1:1 및 4:1이다. 세번째로, 발현 수율 뿐만 아니라 hGH 도메인에 대한 항-hGH 항체의 접근성이 이러한 SL335 내 2가지 C-말단 시스테인 잔기의 존재에 의해 일정 부분 제한될 수 있다. 이는 이펙터(effector) 도메인 및 이의 리간드 사이의 상호작용이 저해받는 경우에, Fab-이펙터(effector) 융합체 내 이펙터(effector) 도메인의 치료 기능에 대하여 중요하다. 본 발명자들은 G-CSF 및 IFN-b가 동일한 결론을 나타내기 때문에, 융합 파트너로써 FabΔds의 사용은 hGH에 대해서는 적확하지는 않다고 제시하였다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 발현 벡터 및 숙주 세포로서의 변이 대장균 SUPEX5 균주(KCTC 12657BP)는 상기 기술적 과제를 해결하기 위해 제공되었다. 이러한 균주는 통상적인 생물-치료제의 생산에 적합한 주요 숙주 균주 중의 하나로 대장균 K12 균주로부터 유래되었다는 이유로 선택된 MC1061 대장균 균주의 무작위 화학 변이에 의해 제조되었다. 모체 MC1061 균주와 비교하여, 발현 숙주로써 변이 SUPEX5 대장균의 사용은 추가적으로 HserG/Lser의 생산에 대한 유용한 효과를 시행하였다. SL335-hGH 융합 뿐만 아니라 FabΔds 및 SUPEX5 대장균 균주의 조합은 일반적인 Fab-이펙터(effector) 융합 단백질의 수용성 발현에 유용한데, 이는 SL335-GCSF 융합체(SL335wt-GCSF vs. SL335Δds-GCSF), SL335-IFNb 융합체(SL335wt-IFNb vs. SL335Δds-IFNb), EGL4-hGH 융합체(EGL4wt-hGH vs. EGL4Δds-hGH) 및 1b28-hGH 융합체(1b28wt-hGH vs. 1b28Δds-hGH)로부터 수득한 결과에 의해 입증되었다. 따라서, 결과는 FabΔds, CH1 내 Cys233 및 CLK 내 Cys214가 결실된 Fab 변이체 형태의 사용이 최소한 SUPEX5 대장균 내 Fab-이펙터(effector) 융합 단백질의 수용성 발현에서 통상적인 Fab보다 유용하다는 점을 강력하게 지지하였다. 이러한 융합이 대장균 내 수용성 Fab 단편의 주변세포질 발현을 증가시킨다고 알려져 있으므로(참조 Schlapschy et al., (2006) Escherichia coli . Protein Eng Des Sel. 19, 385-390), 샤페론 단백질 또는 이황화 이성질화효소(FkpA, SurA, Skp, Sec A, Sec B, DsbA 또는 Dsb C)의 공통 발현은 SL335wt-GCSF 또는 SL335Δds-GCSF의 수용성 발현 및 기능성 발현을 향상시켰다. 본 발명자들은 포체 내 이황화 형성을 위한 샤페론 및 촉매 기작이 숙주 세포 내 Fab-이펙터(effector) 융합 단백질의 과발현에 의해 과부하될 경우 FabΔds의 사용이 특히 효과적일 거라고 믿고 있다.
본 발명의 하나의 구체예에서, SL335Δds-hGH는 배양 플라스크를 사용하여 10 ㎎/L 농도로 생산되었는데, 본 발명에서 분자량이 4배 증가했음에도 기존 연구에 비해 높은 수율이다. 기존의 보고에 따르면, 대장균 주변세포질 내 rhGH의 수용성 발현에 대한 연구는 pelB-hGH에 대하여 0.64-2.57 ㎎/L 및 ompA-hGH에 대하여 0.32-2.29 ㎎/L의 수율을 나타내었고(참조 Sockolosky and Szoka, (2013) Protein Exp Purif . 87, 129-135), 반면 rhGH의 수율은 사용된 프로모터 및 숙주 대장균 균주에 따라 크게 달라졌다(참조 Soares et al., (2003) Protein Engineering. 16, 1131-1138). 간단한 배지 최적화를 통해, 본 발명자들은 OD600nm=~10 -11 의 세포 밀도를 허용하는 배양 플라스크를 사용하여 배양 상층액 내 50 ㎎/L의 수율을 통상적으로 획득하였는데, 이는 배지 조성의 정교한 맞춤 및 페드-배치 배양 시스템을 통해 산업적 규모에 충분하도록 더 증가시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, SL335Δds-이펙터(effector) 단백질은 HSA에 대한 증가된 친화도를 나타내었다. 하나의 구체예에서, SL335Δds-hGH는 본래의 SL335의 수치와 비교했을 때, HSA(Human Serum Albumin, 인간 혈청 알부민)에 대한 반응의 5 내지 9배 증가, RSA(Rat Serum Albumin, 랫트 혈청 알부민)에 대한 반응의 1.3 내지 4배 증가를 나타내었다. 항체 단편 및 이펙터(effector) 도메인의 유전적 연결은 항체 단편의 항원-결합 친화도에 영향을 줄 수 있고, 친화도의 변화는 항체 단편의 본성, 이펙터(effector) 도메인 및 두 가지 기능적 모이어티를 연결하는 방법에 따라 크게 다양해 질 수 있다. 친화도의 이러한 차이가 사슬간 이황화 결합의 부재 또는 hGH 융합 도메인의 존재에 의한 것인지는 분명하지 않다. 그럼에도 불구하고, 인간 혈청 알부민, 마우스 혈청 알부민, 랫트 혈청 알부민에 대한 친화도가 본래의 DOM h-14에 대하여 7.7, 22.3 및 15.8배인 INF-a2b-DOM7 h-14에 비해(참조 Walker et al., (2010) Protein Eng Des Sel . 23, 271-278), 항원에 대한 SL335Δds의 결합 친화도에 대한 hGH 융합의 효과는 무시할 만 하다. 따라서, CH1 및 CL 도메인이 예상되는 리간드에 결합하는 항원-결합 영역 및 이펙터(effector) 도메인 사이의 공간 방해를 감소하는 공간을 제공하기 때문에, Fab는 친화도 및 이펙터(effector) 폴딩을 유지한다는 점에서 도메인 Ab에 비해 장점을 가지고 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, SL335Δds-hGH는 자체의 t1/ 2(정맥 투여시 16.6h)이 PEG5-hGH(250kDa)의 t1/2와 유사하다는 점에서(참조 Clark et al., 1996). 혈청 반감기를 크게 연장시켰다. 흥미롭게도, 실험은 동일한 조건에서 실시하지 않았아서 이러한 비교가 통상적이라는 점에도 불구하고, SL335Δds-hGH의 t1/2는 Albutropin®의 t1/2보다 5.6배 더 연장되었고, SL335Δds-hGH 및 Albutropin® 사이의 t1/2 차이는 피하 투여시 16 배(97.2 h vs. 5.93 h)까지 추가적으로 연장되었다(참조 Osborn et al., 2002). 유사하게. IFB-a2b-DOM7 h-14의 t1/2는 대략 HSA-IFN-a2b의 t1/2에 비해 1.5배 더 길었다(참조 Walker et al., 2010). 따라서, 알부민-결합인자의 융합이 알부민과의 융합에 비해 연장된 반감기를 제공한다는 점은 그럴듯 하지만, 뒷받침되는 메카니즘은 아직 확인되지 않은 상태이다. 정맥 투여시 SL335Δds-hGH의 혈청 t1/2는 VRS-317의 수치(t1/2=15h)와 유사하다는 점은 주목해야 한다(Cleland et al., (2012) J Pharm Sci . 101, 2744-2754). 이는 일주일에 1회 투여 또는 한 달에 1회 투여보다 더 긴 투여가 SL335Δds-hGH에 대하여 가능하다는 것을 제시하였다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, SL335Δds-hGH의 약력학 효과는 Albutropin®보다 매우 우수하고 주 1회 투여량 요법을 사용하면 Growtropin®보다 7배 더 강력하다. 불행하게도, 하수체 절단된 랫트 중 일부, 특히 첨가제 단독 투여 그룹에 속한 랫트들이 조기에 사망했기 때문에, 본 발명자는 2-주간의 약력학 연구를 11일째에 중단하였다. 동물은 수술 후 일본에서 대한민국까지의 장기간 운반에 따른 심각한 스트레스를 받았고 , 이는 첨가제 단독 그룹에 속하는 랫트의 5% 체중 감소 및 예측한 것보다 큰 범위의 표준 편차에 의해 입증되었다. 그럼에도 불구하고, SL335Δds-hGH는 장기적으로 활성을 갖는 hGH로써 개발될 수 있는 큰 잠재력을 갖고 있음이 명백해 보이므로, 본 발명자는 지금부터 SL335Δds-hGH을 SAFAtropin®로 명명하였다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, Fab에 융합된 생리활성 (폴리)펩타이드는 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장 인자, 전사 인자, 혈액 인자, 백신, 구조 단백질, 리간드 단백질 및 수용체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나이다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 생리활성(폴리)펩타이드는 인간 성장 호르몬(hGH), 성장 호르몬 방출 호르몬(GHRH), 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론(IFNs), 인터페론 수용체, 콜로니 자극 인자(CSFs), 과립구-군락 자극 인자(GCSFs), 글루카곤-유사 펩타이드, G-단백질-결합 수용체, 인터루킨, 인터루킨 수용체, 효소, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 대식세포 활성 인자, 대식세포 펩타이드, B 세포 인자, T 세포 인자, 단백질 A, 알러지 저해제, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림프독소, 종양 괴사 인자, 종양 억제제, 암전이 성장 인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, 알파-락트알부민, 아포리포단백질-E, 에리트로포이에틴, 고도로 당화된 에리트로포이에틴, 안지오포이에틴, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 XIII, 플라스미노겐 활성 인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나아제, 스트렙토키나아제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 저해제, 콜라게나아제 저해제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오 펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩티드, 가스트린 방출 펩티드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체류, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편류로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 약학 조성물에 제공되었는데, 상기 조성물은 본 발명의 Fab-이펙터(effector) 모이어티 융합 작제물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하였고, 생체 내 안정성이 증가하였다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 정맥 내 또는 근육 내 다양한 경로를 통해 체내로 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 환자에게 투여된 후 활성 성분의 신속,지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있으며 당 업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 알약, 분말, 새세이(sachet), 엘릭서(elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자이리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀루?, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 사용될 수 있다. 제제는 또한, 충진제, 항음집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질 또는 (폴리)펩타이드의 실제 투여량은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중, 및 질환의 중증도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성성분인 생리활성 폴리펩타이드의 종류에 따라 결정된다. 본 발명의 융합 단백질은 혈중 지속성이 매우 우수하므로, 본 발명의 융합 단백질을 포함하는 펩타이드 제제의 투여 횟수 및 빈도를 현저하게 감소시킬 수 있다.
본 발명에서 "생리활성 (폴리)펩타이드 또는 단백질"은 인간을 포함한 포유동물에 투여되었을 때 유용한 생물학적 활성을 나타내는 (폴리)펩타이드 또는 단백질을 의미한다.
본 발명에서, "항원 결합 단편(Fab)-이펙터(effector) 모이어티 융합 작제물(또는 포맷)"은 생리활성 (폴리)펩타이드 또는 단백질이 Fab에 공유 결합된 작제물를 의미한다. 또한, "항원 결합 단편(Fab)-이펙터(effector) 모이어티 융합 작제물(또는 포맷)"은 Fab-융합 단백질, Fab-융합 (폴리)펩타이드, 융합 작제물 및 융합 포맷을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서, 항-혈청 알부민 FabΔds-결합(SAFA) 기술은 장기간-활성을 갖는 생물치료제의 개발을 위한 신규 플랫폼 기술로써 제공하였다. 이러한 측면에서, 본 발명은 생체 내 장기간 활성, 이펙터(effector) 도메인의 형태, 결합 친화도의 유지, 간단한 생산 및 저렴한 비용의 공정이라는 관점에서 페길화(PEGlyation), Fc-융합, AlbudAb 기술 및 알부민-융합을 포함하는 다른 통상적인 기술에 비해 장점을 갖고 있다.
도 1은 항-SA(혈청알부민) Fab 파아지 항체의 결합 특이성을 측정하기 위한 단일클론 파아지 ELISA 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 인간 Fab 클론의 항원-결합 특이성을 ELISA를 통해 나타낸 것이다.
도 3은 SL335의 생체 내(In vivo) 약물동력학을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 6가지 SL335-hGH 융합 포맷을 도시하는 다이어그램이다.
도 5는 대장균 배양 상층액 내 수용성 SL335-hGH 융합물의 수율 및 결합 반응성을 측정하기 위한 ELISA 결과를 나타낸 것이다. 결합 신호는 TMB 기질을 사용하여 시각화하였고, 450nm에서의 흡광은 ELISA 리더를 사용하여 측정하였다. 자료는 3회 실험 결과의 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
도 6은 SL335 및 SL335-hGH 변이체들의 숙주 대장균- 및 온도(20℃, A; 25℃, B; 또는 30℃, C)-의존성 발현을 측정한 ELISA를 나타낸 것이다.
도 7은 대장균 배양 상층액 내 수용성 SL335-GCSF 및 SL335-IFNβ 융합 작제물들의 수율을 측정한 ELISA를 나타낸 것이다.
도 8은 대장균 배양 상층액 내 수용성 EGL4-hGH 융합(A) 및 1b28-hGH 융합(B)의 수율을 측정한 ELISA를 나타낸 것이다.
도 9는 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의한 SL335wt-hGH 및 SL335ds-hGH의 분석결과를 나타낸 것이다.
도 10은 칩-기반의 캐필러리 전기영동에 의해 HcysG/Lcys 및 HserG/Lser을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 MALDI-TOF 질량 분석기에 의해 HcysG/Lcys 및 HserG/Lser을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 FPLC를 이용하는 젤 여과에 의해 HserG/Lser의 정제를 나타낸 것이다.
도 13은 Nb2-11 세포 증식 실험에 의해 SL335Δds-hGH의 생체 외(In vitro) hGH의 생리활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 ELISA 및 생체 외(in vitro) Nb2-11 세포 증식 실험에 의한 SL335ds-hGH의 혈청 안정성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 래트 내 Growtropin 또는 SL335Δds-hGH의 약물동력학적 분석 결과이다.
도 16은 Growtropin® 또는 SL335Δds-hGH를 처리한 하수체 적출된 래트의 투여량-의존적 체중 증가를 나타낸 것이다. 치료 그룹 당 래트의 N수는 3이고, 래트에 대하여 하루에 한 번씩 체중을 측정하였다.
도 17은 Growtropin® 또는 SL335Δds-hGH를 처리에 의한 경골 길이의 투여량-의존적 증가를 나타낸 것이다. 치료 그룹 당 래트의 N수는 3-4이고, 래트에 대하여 경골은 1회 측정하였다.
도 18은 본 발명에 따른 pHEKA 벡터를 도시한 것이다.
도 19는 본 발명에 따른 pHEKA 벡터의 핵산 서열을 도시한 것이다.
도 20은 본 발명에 따른 Fab의 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명에 따른 Fab의 핵산 서열을 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명에 따른 Fab-이펙터(effector) 융합 작제물들의 서열 정보를 나타낸 것이다. 링커 및 이펙터(effector) 도메인은 밑줄로 표시하였고, 상보성 결정 영역(CDR)은 굵은 글씨로 표시하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
재료 및 분석
1-(1) 클로닝 및 균주
모든 DNA 클로닝 실험은 표준 절차에 따라 실시하였다(참고, Sambrook et al., (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, 2nd ed., (New York, USA:Cold Spring Harbor Laboratory Press)). SL335-이펙터(effector) 융합 작제물를 제조하기 위한 서열분석 수준의 올리고뉴클레오티드 및 코돈-최적화시킨 유전자들은 바이오니아사에서 합성-제공하였다(Daejeon, South Korea). 특별한 언급이 없으면, PCR 증폭은 Pyrobest 또는 Ex-Taq DNA 중합효소(Takara, tsu, Japan)를 사용하여 94℃ 1분, 58℃ 1분 및 72℃에서 1분인 25 사이클 및 이후 72℃ 10분인 조건에서 실시하였다. 또한, 제한효소, shrimp 알칼리성 탈인산화효소(SIP) 및 T4 DNA 연결효소도 Takara에서 구입하였다. 대장균 MC1061 균주 [araD139 Del(araA-leu)7697 Del(lac)X74 galK16 galE15(GalS) lambda- e14- mcrA0 relA1 rpsL150(strR) spoT1 mcrB1 hsdR2] (ATCC, Manassas, USA) 는 클로닝에 사용하였고 대장균 SUPEX5 균주는 재조합 단백질 발현에 사용하였다. 대장균 TG1 균주{F' [traD36 proAB+ lacIq lacZM15]supE thi-1 (lac-proAB) (mcrB-hsdSM)5, (rK -mK -)} (Agilent Technologies, Palo Alto, USA)는 재조합 파아지 제조에 사용하였다.
1-(2) HuDVFab-8L 항체 라이브러리의 바이오스패닝(Biospanning)
타켓 항원에 결합된 재조합 파아지의 부화(enrichment)를 「Joo et al., (2008) J. Immunol. Methods. 333, 24~37; Hur et al., (2010) Immunol Lett. (2010) 132, 24~30」에 따라 실시하였다. 요약하면, 인간 혈청 알부민(HSA), 랫트 혈청 알부민 (RSA) 또는 마우스 혈청 알부민(MSA)과 결합시켜서 토실레이트화된 마그네틱 비드를 HuDVFab-8L 항체 라이브러리(에이프릴바이오, 춘천, 대한민국)로부터의 1010 파아지와 4시간 동안 4℃에서 혼합하고, 0.02% Tween을 함유하는 인산완충식염수(PSST)로 3회 세척하였다. 비드에 결합된 파아지 항체들은 용리 완충액(0.1 M 글라이신, pH 2)로 용리하였다. 상응하는 경쇄(L chain, VL+CLK)를 포함하는 신선한 TG1 세포는 용리된 파아지를 사용하여 감염시켰고, 25 ㎍/㎖의 암피실린, 30 ㎍/㎖의 카베니실린 및 10 ㎍/㎖의 테트라사이클린을 함유하는 2YT 배지에서 배양하였다. 배양 후에, 연속적인 패닝(panning)을 위해 재조합 파아지는 Ex-12 헬퍼 파아지를 이용하여 증폭하였다. 최종 패닝 후에, 단일클론 파아지 ELISA를 실시하여 양성 클론을 확인하였다. 양성 클론으로부터의 Fd(VH+CH1) 유전자는 pHg3A-3 벡터(에이프릴 바이오)로 서브클로닝하였고 L 사슬 최적화는 pLf1T-3 파아지미드 벡터(에이프릴 바이오) 내 1.4×108 인간 나이브 kL 사슬 레퍼토리를 사용하여 실시하였다.
1-(3) DNA 서열 분석
pHf13A-2(에이프릴 바이오) 파아지미드 및 pLf1A-3 플라스미드(에이프릴 바이오)는 항-SA Fab 분자를 생산하는 대장균 세포로부터 Wizard 플라스미드 미니프렙 키트(Promega, Medison, WI, USA)를 사용하여 분리하였다. pHf1g3A-2 또는 pLT-2에 상보적인 두 가지 다른 서열의 프라이머(5'-gtgccgttctatagccatagcac-3'(서열번호 19) 및 5-ggcactggctggtttcgctaccgtg-3(서열번호 20)를 사용하여 VH 유전자 및 VL 유전자를 각각 해독하였다. DNA 서열분석은 Solgent(대전, 대한민국)에서 실시하였다.
1-(4) pHEKA 발현 벡터의 구축
Bgl II 제한효소 부위+trc 프로모터+g10 번역 증강자-리보솜 결합 부위(RBS)를 포함하는 DNA 단편 #1은 pTrcHis-B 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)로부터 Pyrobest DNA 중합효소 및 PCR 프라이머 세트 #1 (5'-gggagatcttgaaatgagctgttgacaattaatcatccg-3' (서열번호 21)) 및 #2 (5'-cctctttaatttttaataataaagttaatcgataattcc-3' (서열번호 22))를 사용한 PCR 증폭에 의해 획득하였다. g10 전사 증강자+RBS+BamH I_멀티-클로닝 사이트(MCS)+전사 종결인자를 포함하는 DNA 단편 #2는 상기와 같은 템플레이트로부터 PCR 프라이머 세트 #3 (5'-ggaattatcgattaactttattattaaaaattaaagaggtatatattaggatccgagctcgagttc
tgca-3'(서열번호 23)) 및 #4 (5'-gggcactacgtgcgaaaggcccagtctttcgact-3' (서열번호 24))를 이용한 PCR 증폭에 의해 획득하였다. 결합 PCR은 상기 2 가지 DNA 단편을 Ex-Tag DNA 중합효소 및 한 세트 PCR #1 및 #4 프라이머를 사용하여 조립함으로써 실시하였다. 그 결과물인 ~520bp DNA 단편은 아가로즈 젤 전기영동을 통해 분리하였다. 그리하여, 연결 PCR 생성물 및 pET28a (Invitrogen) 플라스미드는 Bgl II 및 Dra III를 이용하여 절단하였고 T4 DNA 결합효소를 사용하여 상온에서 2시간 동안 연결시켰다. MC1061 일렉트로컴피턴트 세포를 3㎖의 결합 반응물로 형질전환시킨 후에, 대장균 형질전환체를 50㎍/㎖의 카나마이신(Sigma-Aldrich)를 포함하는 2×YT 플레이트에서 선별하였다. pHEKA 벡터에 대한 Fab 유전자의 서브클로닝을 위해, Fd(VH+CH1) 사슬 유전자는 pHf1g3A-2 파아지미드 벡터로부터 PCR 프라이머 세트 #5 (5'-ggccgcagatctgttaattaaggaggaatttaaagaattcatgaaaaaactgctgttcgcgatt
ccgct-3'(서열번호 25)) 및 #6 (5'-gggaagcttattaacaagatttgggctcaactctcttgtcc-3'(서열번호 26))을 이용하여 PCR 증폭하였고, L 사슬 유전자는 pLT-2 플라스미드 벡터로부터 PCR 프라이머 세트 #7 (5'-gggggatccatgaaaaagacagctatcgcgattgcagtg-3' (서열번호 27)) 및 #8 (5'-attcctccttaattaacagatctgcggccgcactcgagattaacactct
cccctgttgaagctctttgt-3' (서열번호 28)을 이용하여 PCR 증폭하였다. 그 결과물인 Fd 및 L 사슬 유전자 단편은 연결 PCR을 통해 프라이머 #6 및 #7 프라이머를 사용하여 조립하였고, 그 결과물인 크기 ~1.4 Kbp인 PCR 생성물은 아가로즈 젤로부터 절취하였다. 그리하여, PCR 생성물 및 pHEKA 플라스미드는 BamH I and Hind III를 이용하여 절단하였고, T4 DNA 연결효소를 이용하여 상온에서 2시간 동안 결합시켰으며, 대장균 MC1061 또는 SUPEX5 일렉트로컴피턴트 세포로 전기천공(electroporation)시켰다. pHEKA 발현 벡터의 제조에 사용한 PCR 프라이머들은 하기의 표 1에 나타내었다. 도 18은 pHEKA 발현 벡터의 도식을 나타낸 것이다.
pHEKA 발현 벡터를 제조하는 PCR 프라이머
프라이머 올리고뉴클레오티드 서열
프라이머 1 5'-gggagatcttgaaatgagctgttgacaattaatcatccg-3' (서열번호 21)
프라이머 2 5'-cctctttaatttttaataataaagttaatcgataattcc-3' (서열번호 22)
프라이머 3 5'-ggaattatcgattaactttattattaaaaattaaagaggtatatattaggatccgagctcgagttctgca-3'
(서열번호 23)
프라이머 4 5'-gggcactacgtgcgaaaggcccagtctttcgact-3' (서열번호 24)
프라이머 5 5'-ggccgcagatctgttaattaaggaggaatttaaagaattcatgaaaaaactgctgttcgcgattccgct-3'
(서열번호 25)
프라이머 6 5'-gggaagcttattaacaagatttgggctcaactctcttgtcc-3' (서열번호 26)
프라이머 7 5'-gggggatccatgaaaaagacagctatcgcgattgcagtg-3' (서열번호 27)
프라이머 8 5'-attcctccttaattaacagatctgcggccgcactcgagattaacactctcccctgttgaagctctttgt-3'
(서열번호 28)
1-(5) 대장균 SUPEX5 균주 변이체의 구축
선행 기술에 기재된 바에 같이 화학적 돌연변이를 필수적으로 실시하였다. 요약하면, 알칼리성 탈인산화효소(AP)와 융합시킨 항-인간 가지형 사슬 케토 산 탈수소효소 복합체-E2(BCKD-E2) scFV를 발현하는 대장균 MC1061 세포는 50㎍/㎖ 앰피실린을 포함하는 루리아 브로쓰(Luria Broth, LB) 배지에서 ~0.3의 O.D600가 될 때까지 배양하였다. 배양액 5㎖에 포함된 세포는 3000×g 에서 10 분간 원심분리하여 수집하였고, 수집된 세포는 냉각화된 0.1M 구연산나트륨(sodium citrate) 버퍼(pH 5.5)를 사용하여 2회 세척하였다. 이후에, 세포는 동일 버퍼 1.9㎖을 사용하여 재부유하였고, 50㎍/㎖의 MNNG(M-메틸-N'-나이트로-N-나이트로구아니딘, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 37℃에서 15분, 30분 및 45분 동안 처리하였다. MNNG 처리 후에, 세포는 혼합하였고, 2회 세척한 후 2 ㎖의 LB 배지로 재부유하였다. 그 후에, 하기에 기재된 바와 같이 2-멤브레인 시스템을 갖춘 콜로니 리프트 어세이를 실시하였다. 요약하면, LB 아가 플레이트를 단백질 결합능이 낮은 1차 나일론 멤브레인(0.45㎛ 나이트란 N 나일론 블로팅 멤브레인, GE healthcare Life Science, Wauwatos, WI, USA)를 사용하여 덮었다. 돌연변이화된 박테리아는 멤브레인 상에 106 세포/플레이트의 밀도로 스프레딩(spread)하였고, 37℃에서 8시간 동안 배양하였다. 반면, 2차 나이트로셀룰로오스 멤브레인(Bio-TraceTM NT 나이트로셀룰로오스 트랜스퍼 멤브레인)(PALL, Port Washington, NY, USA)는 50㎍/㎖의 앰피실린, 10㎍/㎖의 카베니실린 및 1mM 이소프로필-베타-D-1-씨오갈락토피라노사이드(IPTG, Sigma-Aldrich)를 포함하는 신선한 LB 아가 플레이트 상에 배치하였다. 1차 나일론 멤브레인은 LB 아가 플레이트로부터 떼어내어, 2차 멤브레인 위에 배치하였고, 이후에 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 배양 후에, 1차 멤브레인(콜로니 포함)은 떼어내서, 50㎍/㎖의 앰피실린, 10㎍/㎖의 카베니실린을 포함하는 신선한 LB 아가 플레이트 위에 배치하였고, 박테리아의 늦은 회복을 위해 4℃에서 보관하였다. 2차 멤브레인은 0.1% v/v 트윈 20을 포함하는 신선한 인산화-버퍼 살린(PBS/트윈) 내에서 10분간 3회 세척하였고, 나이트로 블루 테트라졸리움 클로라이드(NBT)/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 인산 (BCIP) 기질(Duchefa, Haarelem, Netherlands) 내에 담그어서 대장균 콜로니의 AP를 시각화하였다. 특징적인 AP 활성을 보여주는 대장균 콜로니는 상응하는 1차 필러로부터 집어 내어, 함께 수집하였고, 2차 돌연변이 유도 및 콜로니 리프트 어세이를 실시하였다. 2차 콜로니 리프트 어세이 후에, 잠정적인 양성 대장균 클론을 선택하였고, 50㎍/㎖의 앰피실린, 10㎍/㎖의 카베니실린을 포함하는 10㎖의 YT 배지에서 OD600이 0.5가 될 때까지 배양하였다. IPTG는 최종 농도 0.1mM이 되도록 배양액에 추가하였고, 세포는 27℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 배양 상층액은 3,300×g에서 20분 동안 원심분리하여 획득하였다. 주변세포질 추출물을 제조하기 위해, 세포 펠릿은 주변세포질 추출 버퍼(2X 농축; 200mM Tric-HCl, 20mM EDTA, 2M NaCl, pH 7.4)내에 재부유시키고, 3회 동안 냉각과 해동을 실시하였으며, 10,000×g 및 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 수용성 항-BCKD-AP 융합체를 포함하는 주변세포질 추출물은 상층액을 얻음으로써 최종적으로 획득하였다. 배양 상층액 및 주변세포질 추출물 시료의 순차적인 희석물은 1% 소 혈청 알부민(BSA, Sigma-Aldrich)를 포함하는 PBS를 사용하여 제조하였고, 50㎖의 배양 상층액 또는 주변세포질 추출물 시료는 96-웰 마이트로타이터 플레이트(SPL, 대한민국) 내에 100㎖의 p-나이트로페닐 인산(pNPP) 기질(SPL)과 혼합하였다. 5 내지 10분 후에, 3M NaOH 25 마이크로리터를 각각의 웰에 추가하여 반응을 정지시켰고, 415nm에서의 흡광을 ELISA 리더기(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 항-BCKD-AP 융합체의 발현 증가를 보이는 4 가지 변이체 대장균 균주(M#5, M#7, M#54 및 M#69)를 항생제가 없는 2×YT 배지 및 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이후에 세포는 ~103 세포/플레이트 밀도로 LB 아가 플레이트 상에 스프레드하였고, 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 그 결과인 콜로니는 50㎍/㎖ 앰피실린이 포함된 LB 아가 플레이트 또는 포함되지 않은 LB 아가 플레이트 내에서 복제되었다. 항생제가 없는 LB 아가 플레이트에서 성장하면서 항생제가 있는 LB-아가 플레이트에서 성장하지 못하는 대장균 콜로니를 선별하였고, 항생제가 없는 2×YT 배지에서 OD600이 1.0이 될 때까지 배양하였다. 글리세롤(20% v/v)을 추가하여 세포 스탁(stock)을 제조하였고, -80℃에 보관하였다. 클로닝에 사용하기 위해, 일렉트로컴피턴트 세포를 표준 프로토콜에 따라 변이 균주로부터 제조하였고, -80℃에 보관하였다. 변이 대장균 균주의 하나인 M#5는 SUPEX5(KCTC 12657BP)로 명명하였고, Fab 및 Fab-이펙터(effector) 융합 단백질의 발현에 사용하였다.
1-(6) 효소결합 면역 측정법(ELISA, Enzyme-linked immunosorbent assay)
단일클론 파아지 ELISA를 위해, 재조합 파아지는 파아지 구제(phage rescue)를 사용하여 양성 대장균 클론으로부터 수득하였고, ~108 CFU/웰 은 5㎍/㎖ HAS, RSA, MSA 또는 BSA로 코팅된 MaxiSorb ELISA 플레이트(Nunc, Roskilde, Denmark)에 추가하였다. 파아지는 pH 6 또는 pH 7 및 37℃에서 1시간 동안 항원과의 결합을 허용하였다. HRPO(Sigma-Aldrich)와 결합시킨 염소(goat) 항-인간 카파 L 항체를 2차 항체로 사용하였다. 결합 신호는 TMB 기질(BD Science, San Jose, CA, USA)를 사용하여 시각화하였고, 450nm에서의 흡광도는 ELISA 리더기(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)를 이용하여 측정하였다. 결과자료는 3회 실험 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 통상적인 ELISA에 대하여, 다양한 항원 [인간 SA, 래트 SA, 마우스 SA, 원숭이 SA(Alpha diagnositic Intl., San Antonio, TX, USA), 개의 SA(CUSABIO, Wuhan, Hubei, China), 토끼 SA(Sigma-Aldrich), 상피세포 성장인자 수용체(EGFR)(R&D systems, Minneapolis, MN, USA), 상피세포 흡착 분자(EpCAM)(R&D systems), IL-15 수용체 알파(IL-15Rα, R&D systems), IL-1β(eBioscience, San Diego, CA, USA), CD16a(R&D systems), c-MET(Sinobiological, Beijing, China)]를 5㎍/㎖ 농도로 마이트로타이터 플레이트 상에 고정시켰고, Fab 분자는 항원과의 결합을 허용하였으며, 상기와 같이 탐지하였다. 수용성 Fab 또는 Fab-hGH 융합 단백질의 농도를 측정하기 위해, 포획 항체로써 마우스 항-인간 IgG Fd mAb(에이프릴 바이오), 탐지 항체로써 HRPO 결합된 염소 항-인간 카파 L 사슬 pAb(Sigma-Aldrich)를 사용하여 샌드위치 ELISA를 실시하였다. 인간 Fab 단편(Bethyl, Montgomery, TX, USA)는 알려진 농도로 사용하여 표준 곡선을 그렸다. hGH 도메인을 탐지하기 위해, T-20, hGH의 C-말단에 특이적인 염소 pAb(Santacruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) 및 전장 hGH에 특이적인 마우스 단일클론항체(Prospec, East Brunswick, NJ, USA)를 사용하였고, 이후에 2차 항체로써 HRPO 결합된 토끼 항-염소 IgG pAb(Sigma-Aldrich) 또는 HRPO 결합된 염소 항-마우스 IgG pAb(Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 염소 항-인간 G-CSF pAb (R&D systems)를 사용하여 G-CSF 도메인을 탐지하였고, 토끼 항-인간 IFN-β pAb(PERPROTECH, Rocky Hill, USA)를 사용하여 IFN-β 도메인을 탐지하였다.
1-(7) 수용성 Fab 및 Fab-이펙터(effector) 융합 단백질의 제조
대장균 SUPEX5 세포를 50㎍/㎖ 카나마이신을 포함하는 2×YT 배지 10㎖ 또는 1L, 37℃에서 0D600nm=0.5가 될 때까지 배양한 후 0.05mM IPTG를 첨가하여 수용성 Fab 및 Fab-hGH 융합 단백질을 생산하였다. 20℃에서 세게 흔들면서 20시간 배양한 후, 배양 상층액 및 세포 펠릿은 3300×g에서 20분간 원심분리하여 분리하였다. 주변세포질 추출물은 앞선 기재에 따라 수득하였다. 정제를 위해, 세포 상층액 및/또는 주변세포질 추출물은 인간 혈청 알부민 (HSA, 에이프릴바이오)가 고정된 세파로스 4B 레진에 통과시켰다. 레진에 결합된 Fab 분자를 세척한 후, Fab 분자는 용리 버퍼(O.1M 글라이신, 10% 글리세롤, pH3)로 용리하였고 이후에 트리스 버퍼(0,5M Tris HCl, 2 M NaCl, pH 9.0)으로 즉시 중화시켰다. 또한, AKTA FPLC(GE Healthcare, Wauwatosa, WI, USA)를 사용한 흡착 정제 후에 HserG/Lser의 젤 여과를 실시하였다. 요약하면, HiprepTM16/60 SephacrylTM S-200HRP repacked 컬럼은 평형 버퍼(20mM HEPEA, 150mM NaCl, pH 7.4)를 사용하여 평형화하였고 5㎕의 HserG/Lser(SL335Δds-hGH)를 로딩하였다. 용리는 평형 버퍼를 사용하여 0.35Mpa 경고 압력 및 0.5㎕/분의 유속에서 실시하였다. 분획 번호 13, 16, 19 및 23은 하기에 기재된 바와 같이 SDS-PAGE에 의해 분석하였다.
1-(8) 바이오레이어 인터페로메트리 ( Biolayer interferometry)에 의한 흡착 측정
정제된 SL335 및 항원들(인간 SA, 랫트 SA 또는 마우스 SA) 간의 실시간 결합 실험은 옥텟 RED 시스템(ForteBio, Menio park, CA, USA)을 갖춘 바이오레이어 인터페로메트리를 사용하여 AR2G(아민 반응성 2차-생성) 센서를 사용한 것을 제외하고 선행문헌(Costin et al., (2013) J Virol . 87, 52~66)에 기재된 대로 실시하였다. 즉, 예정된 농도의 SL335는 키네틱스(kinetics) 급 AR2G 바이오센서와 커플링하였고, 결합하지 않은 Fab 단편은 키네틱스 버퍼(1M 에탄올아민, pH 8.5) 내 배양함으로써 센서 표면으로부터 제거하였다. 이후에 탐침은 예정된 농도 및 pH 6.0 또는 pH 7.4 조건(pH 6.0 및 pH 7.4에서 인간 SA 농도: 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM and 12.5 nM; pH 6.0에서 랫트 SA 농도:4 mM, 1 mM, 500 nM, 250 nM and 125 nM; pH 7.4에서 랫트 SA 농도: 4 mM, 1 mM, 500 nM, 250 nM and 125 nM; pH 6.0 및 pH 7.4에서 마우스 SA 농도: 20mM, 10mM, 5mM, 2,5mM 및 12,5mM)에서 인간 SA, 랫트 SA 또는 마우스 SA에 결합시켰고, 이후에 0.1% BSA를 포함하는 PBS(pH 6.0 또는 pH 7.4)내에서 분리시켰다. 결합 및 분리 키네틱스는 Octet QK 소프트웨어 패키지를 사용하여 계산하였는데, 이는 관찰된 결합 곡선을 1:1 결합 모델에 맞추어 결합속도 상수를 계산하는 것이다. 결합 및 분리 속도 상수는 최소한 3가지 다른 농도의 인간 SA, 랫트 SA 또는 마우스 SA를 사용하여 계산하였다. 평형 분리 상수는 키네킥 분리 속도 상수를 키네틱 결합 속도 상수로 나누어서 계산하였다.
1-(9) SL335-hGH 융합 작제물의 제조
SL335Δds를 제조하기 위해, Hser로 명명된 변이체 Fd(Cys233→Ser233 치환)는 PCR 프라이머 세트 #9 (5'-ggggaatt catgaaatatctgctgcctacggcggcggcgggcctgctgc
tgctggctgcacaa-3'(서열번호 29) and #10 (5'-gggaagcttttagctgctcttcggttccacgcgtt-3' (서열번호 30)를 사용하여 SL225의 코돈-최적화된 Fd 사슬 유전자로부터 PCR 증폭하였고, ~750bp의 PCR 생성물은 EcoR I/Hind III를 처리하였고 pHEKA에 클로닝하여 수득하였다. Lser로 명명된 변이체 L 사슬(Cys214→Ser214 치환)는 PCR 프라이머 세트#11 (5'-gggggatccatgaaaaaaactgcgattgcgattgcggtgctggccggctttg-3' (서열번호 31)) 및 #12 (5'-gggctcgagttagctttcgccgcggttaaagctctttg-3' (서열번호 32))를 사용하여 SL335의 코돈 최적화된 L 사슬 유전자로부터 PCR 증폭하였고, BamH I/Xho I으로 절단하여 Hser를 포함하는 pHEKA에 클로닝하여 수득하였다. HcysG/Lcys 작제물를 제조하는 클로닝 과정은 하기와 같다: Hcys로 명명된 Cys233을 갖는 야생형 Fd는 SL335의 코돈-최적화된 Fd로부터 프라이머 세트 #9 및 #13 (5'-agatccaggagctggtgcagaaccgcagctcttcggttccacgcgtt-3'(서열번호 33))를 사용하여 PCR 증폭하였고, 링커 서열을 포함하는 hGH는 코돈-최적화된 hGH 유전자로부터 PCR 프라이머 세트 #14 (5'-ggttctgcaccagctcctggatcttttccgaccattccgctgagccg-3' (서열번호 34)) 및 #15 (5'-gggaagcttttagaagccgcaggagccctcca-3'(서열번호 35))를 사용하여 PCR 증폭하였다. Hcys 및 hGH 유전자는 같이 연결하여 프라이머 세트 #9 및 #15를 사용한 어셈블리(assembly) PCR에 의해 제조되었고, EcoR I/Hind III로 절단하였으며, Lcys로 명명된 SL335의 Cys214를 갖는 야생형 L 사슬을 포함하는 pHEKA로 클로닝하였다. LcysG/Hcys 작제물를 제조하기 위해, Lcys는 SL335의 코돈-최적화된 L 사슬로부터 프라이머 세트 #11 및 # 16(5'-agatccaggagctggtgcagaaccgcattcgccgcggttaaagctcttt-3' (서열번호 36))을 사용하여 PCR 증폭하였고, 링커 서열을 포함하는 hGH는 코돈-최적화된 hGH 유전자로부터 PCR 프라이머 세트 #14 및 #17(5'-gggctcgagttagaagccgcaggagccctcca-3' (서열번호 37))을 사용하여 PCR 증폭하였다. Lcys 및 hGH 유전자를 연결하고 프라이머 세트 #11 및 #17을 이용한 어셈블리 PCR에 의해 LcysG를 제조하였고, BamH I/Xho I으로 절단하고, 야생형 Fd를 포함하는 pHEKA로 클로닝하였다. HserG/Lcys 작제물를 제조하기 위해, Hser은 코돈-최적화된 야생형 Fd로부터 프라이머 세트 #9 및 #18(5'-gggctcgagttagaagccgcaggagccctcca-3' (서열번호 38))을 사용하여 PCR 증폭하였다. 링커 서열을 포함하는 hGH의 PCR 증폭, 어셈블리 PCR 및 HserG의 클로닝은 HcysG/Lcys 작제물를 제조함으로써 실시하였다. LserG/Hcys 작제물를 제조하기 위해, Lser은 SL335의 코돈-최적화된 L 사슬로부터 프라이머 세트 #11 및 #19(5'-agatccaggagctggtgcagaaccgctgctcttcggttccacgcgtt-3' (서열번호 39))를 사용하여 PCR 증폭하였다. 링커 서열을 포함하는 hGH의 PCR 증폭, 어셈블리 PCR 및 LserG의 클로닝은 LcysG/Hcys 작제물의 제조처럼 실시하였다. HserG/Lser 작제물를 제조하기 위해, Lser을 포함하는 pHEKA를 클로닝에 사용한 점을 제외하고 HserG/Lcys 작제물를 제조하는 것과 같이 HserG 및 hGH의 PCR 증폭 및 어셈블리 PCR을 실시하였다. 또한, Hser을 포함하는 pHEKA를 클로닝에 사용한 점을 제외하고 LserG/Hcys 작제물의 제조와 같이 LserG/Hser을 제조하였다. SL335-hGH 융합 작제물 및 SL335Δds-hGH 융합 작제물의 제조에 필요한 PCR 프라이머는 하기 표 2에 나타내었다.
SL335-hGH 융합 작제물 또는 SL335Δds-hGH 융합 작제물에 필요한 PCR 프라이머
작제물 프라이머 올리고뉴클레오티드 서열
SL335Δds


프라이머 9 5'-ggggaattcatgaaatatctgctgcctacggcggcggcgggcctgctgctgctggctgcacaa-3'
프라이머 10 5'-gggaagcttttagctgctcttcggttccacgcgtt-3'
프라이머 11 5'-gggggatccatgaaaaaaactgcgattgcgattgcggtgctggccggctttg-3'
프라이머 12 5'-gggctcgagttagctttcgccgcggttaaagctctttg-3'
SL335wt-hGH
융합



 프라이머 13 5'-agatccaggagctggtgcagaaccgcagctcttcggttccacgcgtt-3'
프라이머 14 5'-ggttctgcaccagctcctggatcttttccgaccattccgctgagccg-3'
프라이머 15 5'-gggaagcttttagaagccgcaggagccctcca-3'
프라이머 16 5'-agatccaggagctggtgcagaaccgcattcgccgcggttaaagctcttt-3'
프라이머 17 5'-gggctcgagttagaagccgcaggagccctcca-3'
SL335Δds-hGH 융합'
 프라이머 18 5'-agatccaggagctggtgcagaaccgctgctcttcggttccacgcgtt-3'
프라이머 19 5'-agatccaggagctggtgcagaaccgctttcgccgcggttaaagctctttg-3'
1-(10) SL335- GCSF 융합 작제물의 제조
HcysGF/Lcys 작제물의 제조에 필요한 클로닝 과정은 하기와 같다: Hcys는 SL225의 코돈-최적화된 H 사슬로부터 프라이머 세트 #9 및 #20(5'-agatccaggagctggtgcagaaccgctttcgccgcggttaaagctctttg-3'(서열번호 40))을 사용하여 PCR 증폭하였고, 링커 서열을 포함하는 G-CSF는 코돈-최적화된 G-CSF 유전자로부터 프라이머 세트 #21 (5'-ggttctgcaccagctcctggatctgcgcctacctatcgcgcgagca-3'(서열번호 41)) 및 #22 (5'-gggaagcttattaaggctgtgccagatggcgcag-3'(서열번호 42))를 사용하여 PCR 증폭하였다. Hcys 및 G-CSF 유전자는 PCR 프라이머 세트 #9 및 #22를 사용한 어셈블리 PCR에 의해 연결되었고, EcoR i/Hind III를 사용하여 절단하였고 SL335의 L 사슬을 포함하는 pHEKA로 클로닝하였다. LcysGF/Hcys 작제물를 제조하기 위해, Lcys는 SL335의 코돈-최적화된 L 사슬로부터 PCR 프라이머 세트 #11 및 #23(5′-agatccaggagctggtgcagaaccgcattcgccgcggttaaagctcttt-3′(서열번호 43))을 사용하여 PCR 증폭하였고, 링커 서열을 포함하는 G-CSF는 코돈-최적화된 G-CSF 유전자로부터 PCR 프라이머 세트 #21 및 #24(5′-taacagatctgcggccgcactcgagattaaggctgtgccagatggcgcag-3′(서열번호 44))를 사용하여 PCR 증폭하였다. Lcys 및 G-CSF 유전자는 PCR 프라이머 세트 #11 및 #25(5′-agatccaggagctggtgcagaaccgctgctcttcggttccacgcgtt-3′(서열번호 45))를 사용한 어셈블리 PCR에 의해 연결되었고, BamH I/Xho I으로 절단하였고, SL335의 Fd를 포함하는 pHEKA에 클로닝하였다. HserGF/Lser 작제물를 제조하기 위해, Hser은 SL335의 코돈-최적화된 Fd로부터 프라이머 세트 #9 및 #25를 사용하여 PCR 증폭하였다. Hser 및 G-CSF 유전자는 PCR 프라이머 세트 #9 및 #22를 사용한 어셈블리 PCR에 의해 연결하였고, EcoR I/Hind III로 절단하였고, Lser을 포함하는 pHEKA로 클로닝하였다. LserGF/Hser 작제물를 제조하기 위해, Lser은 SL335의 코돈-최적화된 L 사슬로부터 PCR 프라이머 세트 #11 및 # 26(5′-agatccaggagctggtgcagaaccgctttcgccgcggttaaagctctttg-3′(서열번호 46))을 사용하여 PCR 증폭하였고, 링커 서열을 포함하는 G-CSF는 코돈-최적화된 G-CSF 유전자로부터 프라이머 세트 #21 및 #24를 사용하여 PCR 증폭하였다. Lcys 및 G-CSF 유전자는 PCR 프라이머 세트#11 및 #25를 사용한 어셈블리 PCR에 의해 연결하였고, BamH I/Xho I으로 절단하였고, Hser을 포함하는 pHEKA에 클로닝하였다. SL335-GCSH 융합 작제물 및 SL335Δds-GCSF 융합 작제물의 제조에 필요한 PCR 프라이머는 하기 표 3에 나타내었다.
SL335-GCSH 융합 작제물 및 SL335Δds-GCSF 융합 작제물에 필요한 PCR 프라이머
작제물 프라이머 올리고뉴클레오티드 서열
SL335wt-GCSF 융합



 프라이머 20 5′-agatccaggagctggtgcagaaccgcagctcttcggttccacgcgtt-3′
(서열번호 40)
프라이머 21 5′-ggttctgcaccagctcctggatctgcgcctacctatcgcgcgagca-3′
(서열번호 41)
프라이머 22 5'-gggaagcttattaaggctgtgccagatggcgcag-3'
(서열번호 42)
프라이머 23 5′-agatccaggagctggtgcagaaccgcattcgccgcggttaaagctcttt-3′
(서열번호 43)
프라이머 24 5′-taacagatctgcggccgcactcgagattaaggctgtgccagatggcgcag-3′
(서열번호 44)
SL335Δds-GCSF 융합
 프라이머 25 5′-agatccaggagctggtgcagaaccgctgctcttcggttccacgcgtt-3′
(서열번호 45)
프라이머 26 5′-agatccaggagctggtgcagaaccgctttcgccgcggttaaagctctttg-3′
(서열번호 46)
1-(11) SL335- IFN -b 융합 작제물의 제조
HcysIFNb/Lcys 작제물의 제조에 필요한 클로닝 과정은 하기와 같다. Hcys는 SL335의 코돈-최적화된 H 사슬로부터 PCR 프라이머 세트 #9 및 #27(5′-agatccaggagctggtgcagaaccgcagctcttcggttccacgcgtt-3′(서열번호 47))을 사용하여 PCR 증폭하였고, 링커 서열을 포함하는 IFN-b는 코돈-최적화된 IFN-b1a 유전자로부터 PCR 프라이머 세트 #28 (5′-ggttctgcaccagctcctggatcttcatacaacctgctgggcttcctg-3′(서열번호 48)) 및 #29 (5′-gggaagcttttagttgcgcagatagccggtcag-3′(서열번호 49))를 사용하여 PCR 증폭하였다. Hcys 및 IFN-b1a 유전자는 PCR 프라이머 세트 #9 및 #29를 사용한 어셈블리 PCR에 의해 연결하였고, EcoR I/Hind III로 절단하였고, Lcys를 포함하는 pHEKA에 클로닝하였다. HserIFN-b/Lser 작제물를 제조하기 위해, Hser은 SL335의 코돈-최적화된 H 사슬로부터 PCR 프라이머 세트 #9 및 #30(5′-agatccaggagctggtgcagaaccgctgctcttcggttccacgcgtt-3′(서열번호 50))을 사용하여 PCR 증폭하였다. Hser 및 IFN-b1a 유전자는 PCR 프라이머 세트 #9 및 #29를 사용한 어셈블리 PCR에 의해 연결되었고, EcoR I/Hind III로 절단하였고, Lser을 포함하는 pHEKA에 클로닝하였다. SL335-IFNb 융합 작제물 및 SL335Δds-IFNb 융합 작제물의 제조에 필요한 PCR 프라이머는 하기 표 4에 나타내었다.
SL335-IFNb 또는 SL335Δds-IFNb 융합 작제물에 필요한 PCR 프라이머
작제물 프라이머 올리고뉴클레오티드 서열
SL335Δds-IFNb 및 SL335-IFNb 융합


 프라이머 27 5′-agatccaggagctggtgcagaaccgcagctcttcggttccacgcgtt-3′
(서열번호 47)
프라이머 28 5′-ggttctgcaccagctcctggatcttcatacaacctgctgggcttcctg-3′
(서열번호 48)
프라이머 29 5′-gggaagcttttagttgcgcagatagccggtcag-3′
(서열번호 49)
프라이머 30 5′-agatccaggagctggtgcagaaccgctgctcttcggttccacgcgtt-3′
(서열번호 50)
1-(12) EGL4 - hGH 및 1b28 - hGH 융합 작제물의 제조
EGL4, 인간 항-EGFR Fab, 및 1b28 , 인간 항-IL-1b Fab는 HuDVFab-8L 항체 라이브러리(미공개, 에이프릴 바이오)로부터 분리하였다. EGL4wt 및 EGL4Δds를 제조하기 위해, Hcys 및 Hser은 EGL4 cDNA의 H 사슬 유전자로부터 PCR 프라이머 세트 #5 및 #6, #5 및 #31(5′-gggaagcttattaactagatttgggctcaactctcttg-3′(서열번호 51))을 사용하여 각각 PCR 증폭하였다. 750bp PCR 생성물은 EcoR I/Hind III를 처리하였고, pHEKA로 클로닝하였으며, MC1061 컴피턴트 세포에 형질전환시켰다. Lcys 및 Lser은 EGL4 cDNA의 L 사슬 유전자로부터 PCR 프라이머 세트 #11 및 #32(5′-gggctcgagttagcattcgccgcggttaaagctcttt-3′(서열번호 52)), #11 및 #33(5′-gggctcgagttagctttcgccgcggttaaagctcttt-3′(서열번호 53))을 각각 사용하여 PCR 증폭하였다. PCR 생성물은 BamH I/Xho I으로 절단하여 각각 EGL4의 Hcys 또는 Hser를 포함하는 pHEKA로 클로닝하였다. EGL4wt-hGH 융합 작제물를 제조하기 위해, HcysG/Lcys 작제물를 제조하기 위한 클로닝 과정은 하기와 같다. Hcys는 EGL4 cDNA의 H 사슬로부터 PCR 프라이머 세트 #5 및 #34(5′-agatccaggagctggtgcagaaccacaagatttgggctcaactctcttgtc-3′(서열번호 54))를 사용하여 PCR 증폭하였고, 링커 서열을 포함하는 hGH는 PCR 프라이머 세트 #14 및 #15를 사용하여 코돈-최적화된 hGH 유전자로부터 PCR 증폭하였다. Hcys 및 hGH 유전자는 PCR 프라이머 세트 #5 및 #15를 사용한 어셈블리 PCR에 의해 연결되었고, EcoR I/Hind III로 절단하였고, EGL4의 Lcys를 포함하는 pHEKA로 클로닝하였다. EGL4Δds-hGH 융합 작제물의 제조를 위해, Hser은 EGL4 cDNA의 H 사슬로부터 PCR 프라이머 세트 #5 및 #35(5′-agatccaggagctggtgcagaaccactagatttgggctcaactctcttgtc-3′(서열번호 55))를 사용하여 PCR 증폭하였고, 링커 서열을 포함하는 hGH는 코돈-최적화된 hGH 유전자로부터 PCR 프라이머 세트 #14 및 #15를 사용하여 PCR 증폭하였다. Hser 및 hGH 유전자는 PCR 프라이머 세트 #5 및 #15를 사용한 어셈블리 PCR에 의해 연결되었고, EcoR I/Hind III로 절단하였고, EGL4Δds의 Lser을 포함하는 pHEKA로 클로닝하였다. 1b28wt, 1b28Δds, 1b28wt-hGH 및 1b28Δds-hGH는 1b28 cDNA를 PCR 템플레이트로 사용한 점을 제외하고 같은 PCR 프라이머 세트를 사용하여 EGL4-hGH 융합체로써 제조하였다. EGL4-hGH 및 1b28-hGH 융합 작제물를 제조하기 위한 PCR 프라이머는 하기 표 5에 나타내었다.
작제물 프라이머 올리고뉴클레오티드 서열
EGL4-hGH 융합체 및
1b28-hGH 융합체



 프라이머 31 5′-gggaagcttattaactagatttgggctcaactctcttg-3′
(서열번호 51)
프라이머 32 5′-gggctcgagttagcattcgccgcggttaaagctcttt-3′
(서열번호 52)
프라이머 33 5′-gggctcgagttagctttcgccgcggttaaagctcttt-3′
(서열번호 53)
프라이머 34 5′-agatccaggagctggtgcagaaccacaagatttgggctcaactctcttgtc-3′
(서열번호 54)
프라이머 35 5′-agatccaggagctggtgcagaaccactagatttgggctcaactctcttgtc-3′
(서열번호 55)
1-(13) SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석
SDS-PAGE 분석을 위해, 정제된 SL335wt-hGH 및 SL335Δds-hGH 단백질은 NuPAGE® 샘플 환원제(Invitrogen)을 포함하거나 포함하지 않는 NuPAGE® LDS 샘플 버퍼(Invitrogen) 내에 재부유시켰고, 웰 당 7㎍ 농도로 젤에 로딩하였다. 단백질 밴드는 코마시 블루 염색(Bio-Rad)를 사용하여 시각화하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해, 500ng의 흡착-정제된 SL335wt-hGH 및 SL335Δds-hGH는 상기와 같이 각각의 웰에 로딩하였고 나이트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겨졌다. 0.1% 트윈(Sigma-Aldric)를 포함하는 PBS 내 3% 탈지 분유(Bio-Rad)를 사용하여 멤브레인을 블로킹한 후, 단백질은 AP(Bethyl)-결합된 염소 항-인간 카파 L 사슬 pAb와 배양하여 탐지하였다. 나이트로 블루 테트라졸리움 클로라이드(NBT)/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 인산(BCIP) 기질(Duchefa)를 멤브레인에 추가하여 결합 신호를 시각화하였다.
1-(14) 칩-기반의 모세관 전기영동
칩-기반의 모세관 전기영동은 Agilent 2100 바이오분석 시스템(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)를 사용하여 실시하였다. 단백질 시료는 제작자의 프로토콜에 따라 준비하였고, 단백질 80 키트 상에서 분석하였는데, 이는 5 내지 80kDa 사이의 단백질 분석에 추천되는 것이다. 요약하면, 환원 전기영동 또는 비-환원 전기영동을 위해, 시료는 DTT 포함된 샘플 버퍼 , 또는 DTT 없는 샘플 버퍼와 혼합하였다. 시료는 95℃에서 변성되었고, 변성된 시료는 형광염료 및 젤 용액을 포함하는 적절한 제재가 채워진 칩으로 로딩하였다. 이후에 칩은 시스템 내로 삽입되었고, Expert 2100 소프트웨어를 사용하는 시스템 상에서 분석되었다. 결과는 단백질 크기에 대한 형광 강도 유닛을 반영하도록 플롯되었다.
1-(15) MALDIP - TOF 질량 분석기
MALDI-TOF 질량 분석은 Autoflex III Smartbeam 장치(Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA) 상에서 실시하였다. 시료는 동일한 부피의 MALDI 매트릭스(10㎎/㎖ a-시아노-4-하이드록시시나믹 산)과 혼합하였고, MALDI 표적 플레이트 상에 스팟팅하였다(spotted). 외부 조정은 펩타이드 및 단백질 MALDI-MS 조정 키트(Sigma-Aldrich)를 사용하여 실시하였다.. 15000-160000 및 10000-70000에 대한 m/z 범위 내 질량 스펙트럼을 양성 이온 모드 내에서, SL335wt-hGH 융합체 및 SL335Δds-hGH 융합체에 대하여 각각 획득하였다.
1-(16) 생체 외(in vitro) hGH 생리활성 시험
Nb2-11 랫트 림프종 세포(Sigma-Aldrich)는 5% 말 혈청(Sigma-Aldrich) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen)을 보충하여 완전한 DMEM 내, 37℃의 가습된 5% CO2 배양기에서 배양하였다(Tanaka et al., (1980) J Clin Endocrinol Metab. 51, 1058-1063). 세포는 DMEM으로 2회 세척하였고, 1000×g에서 5분간 원심분리하였고, 8×104 세포/㎖이 되도록 5%(v/v) 말 혈청을 포함하는 DMEM으로 재부유하였다. 세포 부유액 50㎕ 분획은 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였고, 하룻밤 동안 배양하였다. 이후에 세포는 Growtropin®(변형되지 않은 rhGH; 동아제약, 대한민국)의 증가하는 농도(0~20nM) 또는 5% 말 혈청을 포함하는 50㎖ DMEM 내 SL335Δds-hGH를 37℃에서 48시간 동안 처리하였다. 배양 후에, 10㎕의 CCK-8(Dojindo, Mashiki-machi, Japan)을 각각의 웰에 추가하였고, 4시간 동안 배양하였다. 450nm에서의 흡광도는 마이크로플레이트 리더기(Bio-Rad)에 기록하였다.
1-(17) SL335 Δds -gGH의 혈청 안정성
SL335wt 및 SL335Δds-hGH(최종 농도 10㎍/㎖)는 0.03% 아지트화 나트륨(sodium azide)을 포함하는 우태아 혈청(FBS)(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 내에 재부유시키고, 37℃에서 16일 동안 배양하였다. 소량의 분획(50㎖)을 매일 취하여 사용 전에 -20℃에 보관하였다. HSA에 대한 결합 반응성은 ELISA로 측정하였고, 생체 외(in vitro) hGH 생리활성은 상기에 기재된 바와 같이 Nb2-11 세포(Sigma-Aldrich)를 사용하여 측정하였다.
1-(18) 생체 내(In vivo) 약물동력학(PK) 시험
PK 연구는 검증된 CRO 사(ChemOn, 수원)에서 실시하였다. 동물은 설치류 펠릿의 표준 식이요법으로 공급하였고, 물은 임의로 공급하였으며, 일정한 습도와 온도 및 조명(12시간 주간 후에 12시간 야간)이 조절되는 공간에서 보존하였다. 요약하면, SL335 및 Neg Fab(관련성이 없는 인간 Fab)를 3두의 Sprague Dawley 랫트 그룹에 1㎎/㎏으로 정맥(I.V.) 주사 또는 피하(S.C.) 주사하였다. 혈청 시료는 다양한 시간 포인트(5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 96 h 및 144 h for I.V.; 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 및 96 h for S.C.)에서 수득하였다. 혈청 시료 내 SL335 및 Neg Fab의 농도는 각각 포획항체 및 탐지항체로써 HRPO와 결합된 마우스 항-인간 IgG Fd mAb 및 염소 항-인간 카파 L 사슬 pAb를 사용한 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 알려진 농도의 인간 Fab 단편은 표준 곡선을 수득하기 위해 본 시험에 포함시켰다. 시간에 대한 혈청 농도의 곡선은 WinNolin 소프트웨어(SL335 및 Neg Fab)를 사용한 비구획(noncompartment) 모델에 대하여 맞추었고, 시그마 플롯 소프트웨어를 사용하여 플롯화하였다 유사하게, Growtropin® 및 SL335Δds-hGH는 3 내지 4 래트의 그룹으로 분리하여 정맥 내 또는 피하 주사하였다. 각각, 정맥 내 투여에 대한 Growtropin® 및 SL335Δds-hGH의 투여량은 0.3 ㎎/㎏이고, 피하 투여에 대한 투여량은 0.6 ㎎/㎏이다. 혈청 시료는 다양한 시간 포인트(Growtropin®에 대하여 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 3 h, 4 h, 6 h 및 8 h ; SL335Δds-hGH에 대하여 5 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 96 h 및 144 h)에서 수득하였다. 혈청 시료 내 Growtropin®의 양은 hGH ELISA 탐지 키트(Genway, San Diego, CA, USA)를 사용하여 측정하였고, SL335Δds-hGH의 양은 상기 기재된 바와 같이 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 시간에 대한 혈청 농도 곡선은 PhoenixTM WinNonlin 소프트웨어(버전 6.2)를 사용한 구획 모델에 대하여 맞추었다.
1-(19) 생체 내 약역학(pharmacodynamics) 시험
체중 긍가를 촉진하기 위한 Growtropin®의 일일 투여 효과 및 SL335Δds-hGH의 주 1회 투여의 효과는 기존에 보고된 바와 같이(참조 Clark et al., (1996) J. Biol. Chem . 271, 21969-21977) ChemOn에서의 피하 투여를 이용하여 하수체 적출된 랫트에서 분석하였다. 요약하면, 하수체 적출된 어린 Sprague Dawley 랫트(Harlan, Toyko, Japan)을 구입하였고, 수술 후 첫 15일이 지나서 7g 이상 체중이 증가된 동물은 본 시험에서 제외하였다. 동물은 5가지 시험 그룹(첨가제만 투여, 0.3 ㎎/㎏ Growtropin® 일일투여, SL335Δds-hGH의 0.6㎎/㎏, 1.2㎎/㎏ 또는 2.㎎/㎏의 주 1회 투여)에 대하여 무작위로 선별하였다. 경골 성장은 본 카리퍼를 사용하여 신중하게 측정하였다. 통계적 비교는 변이 분석 후의 Dunnett's 복수 비교 테스트를 사용하여 실시하였고, 0.05 미만의 p 수치는 유의한 것으로 판단하였다.
실험 결과
2-(1) 항-SA Fab 클론의 분리
HuDVFab-8L 항체 라이브러리는 인간 SA, 랫트 SA, 또는 마우스 SA를 결합시킨 마그네틱 비드에 대하여 pH 6 또는 pH 7.4에서 선별하였다. 3라운드의 바이오패닝 이후에, 단일클론 파아지 ELISA를 실시하여 항원에 특이적인 파아지 항체 클론을 검증하였다. 60개 이상의 양성 클론이 ELISA에 의해 검증되었고(결과는 나타내지 않음), VH 및 VL 유전자의 DNA 서열분석은 8가지 구분되는 파아지 항체를 확인하였고, 각각 SA 138, SA 139, SA140, SA 141, SL 18, SL 301. SL310 및 SL335로 명명하였다. 3 가지 파이지 항체 클론, SA 138, SA 139 및 SA141은 pH 조건에 관계없이 인간 SA에 대해서만 반응성이 있었다. SA140은 pH 7.4에서 인간 SA만을 인식하였지만, SA140의 결합 반응성은 pH 6.0에서 사라졌다. 반면, SL18, SL310 및 SL335는 작은 차이가 있지만 두 가지 pH 조건(6.0 및 7.4)에서 인간 SA, 랫트 SA 및 마우스 SA에 결합하였다. SL301은 두 가지 pH에서 인간 SA 및 랫트 SA에 대하여 반응성이 매우 좋았고, pH 7.4에서는 오직 마우스 SA에 대해서만 약한 반응성을 보였다. 여덟가지 Fab 클론은 모두 소의 SA 에 대해서는 반응성이 나타나지 않았다. SL18, SL301, SL310 및 SL335는 최소한 2 가지 다른 종으로부터의 SA에 대한 교차-반응성 때문에 추가적으로 검사하였다. 4개의 파아지 항체 클론의 Fd 및 L 사슬 유전자는 대장균 내 주변세포질 발현을 위해 pHEKA 벡터로 서브클로닝하였고, 수용성 Fab 단편은 배양 상층액 또는 주변세포질 추출물로부터 제조하였다. 흡착 정제 후에, ELISA를 실시하여 이러한 단편들의 pH6(도 2A) 및 pH 7.4(도 2B) 조건에서의 인간 SA, 랫트 SA 또는 마우스 SA에 대한 결합 반응성을 비교하였다. 5 ㎍/㎖ 농도에서 HSA, RSA, MSA 또는 BSA는 마이크로타이터 플레이트 내 각각의 웰에 고정시켰고, 네 가지 정제된 Fab 분자(SL18, SL301, SL310 및 SL3350는 pH 6.0(도 2A) 또는 pH 7.4(도 2B)에서 항원과 결합시켰다. 염소 항-인간 카파 L 사슬 pAb HRPO 결합체는 2차 항체로써 사용하였다. 결합 신호는 TMB 기질을 사용하여 시각화하였고, 450nm에서의 흡광은 ELISA 리더기(Bio-Rad)를 사용하여 측정하였다. 결과는 3가지 실험에 대한 평균± 표준 편차로 나타내었다. 인간 SA 결합에서, 결합 신호는 두 가지 pH 6 및 pH7.4에서 SL335 > SL310 > SL301 > SL18의 순서였다. 랫트 SA 결합에서, 결합 신호는 pH 6에서 SL335 > SL310 > SL301 > SL18의 순서이고, pH 7.4에서 SL335 = SL310 > SL301 = SL18의 순서였다. 마우스 SA 결합에서, 결합 신호는 pH 6에서 SL18 > SL335 > SL310의 순서이고, pH 7.4에서 SL335 > SL310 > SL18의 순서였다. 도 2에 나타난 바와 같이, SL301은 pH 6에서 마우스 SA와 결합하지 않았고, pH 7.4에서 매우 약하게 결합하였다. SL335는 pH 조건에 관계없이 네 가지 Fab 클론 중에서 인간 SA 및 랫트 SA에 대한 최고의 결합인자였다. SL335는 pH 6에서 pH 7.4(2Ong/ml 대 40ng/ml에서 50% 결합 신호)에서보다 2배 강하게 인간 SA에 결합하였고, 동일한 pH 조건(2Ong/ml 대 400ng/ml에서 50% 결합 신호)에서 랫트 SA에 대하여 20배 강하게 결합하였으며, pH 7.4(4Ong/ml 대 160ng/ml에서 50% 결합 신호)에서 랫트 SA에 대한 결합보다 4배 강하게 결합하였다.
2-(2) SL335의 교차-반응성 및 결합 친화성
SL335는 네 가지 항-인간 SA Fab 클론 중 가장 강한 결합인자이므로, SL335의 교차-반응성은 ELISA에 의해 추가적으로 분석하였다. 인간 SA, 랫트 SA 및 마우스 SA에 대한 결합 반응성이 도 2에 나타낸 바와 같이 재현되었다. 또한, SL335는 시노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey) SA를 강하게 인식하였고 개의 SA에 대하여 약하게 결합한다는 것이 추가적으로 확인되었다. 하지만, SL335는 EGFR, EpCAM, IL-15Ra, IL-1b, CD16a 또는 c-MET를 포함하는 다른 관련없는 항체뿐만 아니라 토끼 SA를 인식하지 못하였다. pH 6 또는 pH 7.4에서의 인간 SA, 랫트 SA 및 마우스 SA에 대한 SL335의 결합 친화성은 SL335로 코팅된 바이오센서 상의 다른 농도의 항원을 통과시킴으로써 바이레이어 인터페로메트리에 의해 추가적으로 측정하였다(하기의 표 6 참조). 결과는 HSA에 대한 SL335의 분리상수가 각각 pH 6에서 9nM이고 pH 7.4에서 13nM이라는 점에서 도 2에 나타낸 ELISA 결과와 상응하였고, RSA에 대한 결과는 각각 pH 6에서 122nM이고 pH 7.4에서 65nM이다. MSA에 대한 SL335의 결합 친화성은 대략 pH 6에서 10mM이고 pH 7.4에서 1,6mM인데, 이러한 결과는 신뢰도가 부족하여 표 6에 포함시키지 않았다.
바이레이어 인터페로메트리 결합 시험에 의한 SL335 및 HserG/Lser의 결합 친화도 측정
결합인자 항원 pH 조건 KD(M) K on (1/Ms) K off (1/s) Full R^2 Chi2 values
SL335


 HSA
 pH 6.0 8,68E-09 1.79E+05 1.55E-03 0.920807 0.479289
pH 7.4 1.30E-08 1.17E+05 1.52E-03 0.966233 0.378597
RSA
 pH 6.0 1.22E-07 4.71E+04 5.76E-03 0.882417 1.299042
pH 7.4 6.53E-08 4.32E+04 2.82E-03 0.839612 2.718799
HserG/Lser


 HSA
 pH 6.0 1.68E-09 5.00E+05 8.41E-04 0.951998 1.015294
pH 7.4 1.51E-09 6.73E+05 1.02E-03 0.915507 0.652098
RSA
 pH 6.0 4.99E-07 6.96E+04 3.47E-03 0.980042 0.214899
pH 7.4 8.36E-08 9.33E+04 7.80E-03 0.836744 1.101016
결합 키네틱스 및 분리 키네틱스는 Octet QK 소프트웨어 패키지를 사용하여 계산하였다.
2-(3) 생체 내 SL335의 약물동력학
모든 혈장 단백질 중에서, HSA는 FcRn-매개성 재생 메카니즘에 의해 예외적으로 긴 반감기를 가지고 있고, 시료 단백질의 반감기를 연장하기 위한 융합 파트너로써 통상적으로 사용되고 있다. 부가적으로, 혈청 알부민에 결합된 항체 단편은 연장된 혈청 반감기를 갖는 것으로 알려져 있다. 그 뒤로, 약물동력학 분석을 실시하여 SL335 또한 긴 혈청 반감기를 갖고 있는지를 검증하였다. 알려지지 않은 결합 특이성을 갖는 인간 Fab는 음성 대조군(Neg Fab)으로 포함하였다. SL335 및 Neg Fab는 3두의 랫트로 구성된 그룹에 1㎎/㎏으로 정맥 내 주사 또는 피하 주사하였고, 혈청 시료는 여러 시간 포인트(정맥 내 주사에 대하여, 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 96 h 및 144 h; 피하 주사에 대하여 5 min, 15 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h, 및 96 h)에서 수집하였다. 혈청 시료 내 SL335 및 Neg Fab의 농도는 포획항체 및 탐지 항체로써 마우스 항-인간 IgG Fd mAb 및 HRPO 결합시킨 염소 항-인간 카파 L 사슬 pAb를 각각 사용한 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다. 알려진 농도의 인간 Fab 단편은 표준 곡선을 얻기 위해 시험 내에 포함시켰다. 시간에 대한 혈청 농도(SL335 및 Neg Fab)의 곡선은 WinNolin 소프트웨어를 이용한 하나의 분획 모델에 대하여 맞추었고 시그마 플롯 소프트웨어를 사용한 2-분획 모델에 대하여 맞추었다. 정맥 내 투여 시, SL335의 최종 반감기(t 1/2 )는 37 h이고, 곡선 아래의 면적(AUC0 →∞)은 187 h ㎎/㎖인데, Neg Fab(각각 3.8h 및 7 h ㎎/㎖)에 비해 t 1/2 는 10배 증가하였고, AUC0→∞는 26배 증가하였다(도 3A). SL335의 피하 주사는 유사한 측정 결과를 나타내었는데, Neg Fab(각각 87h 및 2 h ㎎/㎖)에 비해 t 1/2 는 9배 증가(120 h vs. 13h)하였고, AUC0→∞는 44배 증가하였다(도 3B). 이러한 결과는 SL335의 연장된 혈청 반감기를 명백하게 보여주었고, SL335는 랫트 내에서 RSA 및 FcRn 사이의 상호작용을 간섭하지 않는 것을 암시하였다.
2-(4) SL335-hGH 융합체의 생산
SL335는 2가지 SL335-hGH 융합체 및 Fd 또는 L 사슬의 N-말단 또는 C-말단에 대하여 짧은 펩타이드 링커에 의한 재조합 hGH(27 내지 191 아미노산)의 유전적 융합을 통해 4 가지의 추가적인 SL335-hGH 융합체의 제조에 사용하였다. 재조합 hGH cDNA(27 내지 191 아미노산)은 짧은 펩타이드 링커에 의해 통상적인 형태의 Fab 내 SL335wt의 H 또는 L 사슬의 C-말단에 융합되었고, 2가지 융합 작제물를 제조하였다(HserG/Lcys 및 LcysG/Hcys). 4 가지 추가적인 융합 작제물(HserG/Lcys, LserG/Hcys, HserG/Lser 및 LserG/Hser)는 SL335null(null form) 또는 C-말단 CH1에서의 Cys233 및/또는 C-말단 CLκ에서의 Cys214가 Ser으로 치환된 Δds Fab 형태(SL335Δds)를 사용한다는 점을 제외하고는 상기와 같이 제조하였다. 융합 단백질의 주변세포질 발현을 위해, ompA(MKKTAIAIAVLAGFATVAQA (서열번호 56)) 리더 서열을 L 사슬 또는 L-hGH 융합체의 상류에 배치하였고, pelB 리더 서열MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMA (서열번호 57))은 H 사슬 또는 H-hGH 융합체의 상류에 배치하였다. 이러한 예비 실험에서, Fd 또는 L 사슬의 N-말단에 대한 hGH의 유전적 연결은 수용성 융합 단백질의 낮은 발현 또는 발현이 되지 않는 결과가 나타났다. Fd C-말단에 대한 hGH의 융합은 낮은 수율을 나타내었고, SL335-hGH 융합체 내 비정상적인 이황화 결합에 의한 hGH 도메인의 폴딩 방해인 것으로 추측된다. 이전에, CH1 및 CLκ 내 C-말단 Cys 잔기를 변이시켜서(각각 Cys233 및 Cys214) Fab'의 사슬간 이황화결합을 제거하면 주변세포질 생산, 추출 및 정제시 안정성, 혈청 안정성 또는 혈청 반감기에 영향을 주지 않는다는 사실이 보고되어 있다(참조 Kabat et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest; Humphreys et al., (1997) J. Immunol . Methods. 209, 193-202; Humphreys et al., (2007) Protein Eng Des Sel . 20, 227-234.). CH1 내 Cys233 및 CLκ 내 Cys214 모두를 세린으로 대체함으로써(Cys233 → Ser233 및 Cys214 → Ser214 치환), 본 발명자는 SL335 내 이러한 Cys 잔기가 SL335-hGH 융합체의 수용성 발현 및 적절한 폴딩을 조절하는지 시험하였다. 도 4는 6가지 SL225-hGH 융합 작제물를 나타내고 있다. SL335wt 및 SL335Δds 외에, SL335null로 명명한 하나 이상의 SL335 변이체는 CH1 내 Cys233 또는 CLκ 내 Cys214 를 Ser로 치환하여 각각의 시스테인 잔기(Cys233 또는 Cys214)의 효과를 구분하여 검증하기 위해 제조하였다. 2가지 SL335wt 융합 유도체는 HcysG/Lcys(HCys233-hGH와 LCys214의 융합체) 및 LcysG/Hcys(LCys214-hGH와 HCys233의 융합체)이고, 2가지 SL335null 융합 유도체는 HserG/Lcys(HSer233-hGH 및 LCys214의 융합체) 및 LserG/Hcys(LSer214-hGH 및 HCys233의 융합체)이다. 최종적으로, 2 가지 SL335Δds 융합 유도체는 HserG/Lser(HSer233-hGH 및 LSer214의 융합체) 및 LserG/Hser(LSer214-hGH 및 HSer233의 융합체)이다. 이러한 6가지 SL335-hGH 융합 작제물는 대장균 SUPEX5 숙주 세포 내에서 발현시켰고, 수율 및 배양 상층액 내 이러한 6가지 SL335-hGH 융합 단백질의 HSA-결합 반응성은 ELISA에 의해 분석하엿다. SL335-hGH 융합 단백질을 발현하는 대장균 클론은 IPTG가 있는 이상적인 조건에서 배양하였고, 배양 상층액은 간단한 원심분리에 의해 획득하였다. 수용성 SL335-hGH 융합체의 농도는 포획 항체로써 마우스 항-인간 Fd mAb 및 탐지 항체로써 HRPO 결합된 항-인간 카파 L 사슬 pAb를 사용하는 샌드위치 ELISA에 의해 측정하였다(도 5A). 어떠한 형태의 수용성 Fab도 LcysG/Hcys 또는 LserG/Hcys로부터 탐지되지 않았다. 결과는 나타내지 않았지만, 대장균 균주 파쇄물을 사용한 웨스턴 블롯은 Fd 내 Cys233이 단백질 응집에 의한 단백질이 분해 및 Fd 단편이 분비되지 않는 것에 필요하다는 것을 검증하였다. HcysG/Lcys의 수율은 0.5㎍/㎖ 이며, HserG/Lcys 및 LserG/Hser 각각의 수율은 대략 1.8㎍/㎖ 및 1.4㎍/㎖였다(도 5A). 흥미롭게도, HserG/Lser의 수율은 HcysG/Lcys 수율보다 8배 큰 약 4㎍/㎖이었다. 전체 수율은 배양 상층액 내 존재하는 단백질 대비 ~30% 이지만, 주변세포질 추출물은 동일한 발현 패턴을 나타내었다(자료는 나타내지 않음). 반복된 실험에서, HcysG/Lcys 및 HserG/Lser 사이의 수율 차이는 대장균 클론의 클론 차이 또는 성장 속도와 무관하다는 것이 입증되었다. HSA에 대한 SL335-hGH 융합체의 결합 반응성은 5㎍/㎖ HSA로 코팅된 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 비교하였고, SL335-hGH 융합체를 포함하는 배양 상층액의 연속적인 희석물과 배양하였다. HSA에 결합한 SL335-hGH 융합체는 HRPO와 결합시킨 염소 항-인간 카파 L 사슬 pAb를 사용하여 탐지하였다. 예상된 바와 같이, 항-인간 카파 L pAb를 이용한 HSA 결합 HserG/Lser의 탐지결과는 HcysG/Lcys보다 8배 강한 결합 신호를 나타내었고, HserG/Lcys 및 LserG/Hser보다 4배 강한 결합 신호를 나타내었다(도 5B). T-20(hGH의 C-말단에 특이적인 염소 pAb)을 사용하여 SL335-hGH 융합체의 탐지에 사용하면, 유사한 결합 신호 패턴을 관찰할 수 있다(도 5C). 하지만, 전장 hGH에 특이적인 마우스 mAb인 NYThGH를 사용한 탐지에서, HserG/Lser은 HserG/Lcys 및 LserG/Hser보다 30배 강한 결합신호를 나타내었고, HcysG/Lcys보다 60배 강한 결합 신호를 나타내었는데(도 5D), 이는 HcysG/Lcys의 hGH 도메인에 대한 NYThGH 의 결합이 SL335 사슬간 이황화 결합에 의해 방해받음을 제시하는 것이다. HcysG/Lcys 및 HserG/Lser은 SL335-hGH 융합체의 제조에 대한 SL335wt 및 SL335Δds의 유용함을 보여주기 때문에, 이후로는 SL335wt-hGH 융합체 및 SL335Δds-hGH 융합체로 각각 명명하였다(도 5).
*수용성 SL335Δds-hGH 융합체의 높은 수율이 SL335 내 사슬간 이황화 결합의 제거, 숙주 대장균 균주 또는 유도 온도에 의존한다는 것을 측정하기 위해, SL335wt, SL335Δds, SL3435wt-hGH 융합체 및 SL335Δds-hGH 융합체는 변이체 SUPEX5 세포 뿐만 아니라 모균주 MC1061 내에서 20℃(도 6A), 25℃(도 6B) 또는 30℃(도 6C)에서 발현시켰고, 배양 상층액 내 Fab 분자의 양은 ELISA에 의해 측정하였다. MC1061 균주 내 발현되는 SL335wt의 수율은 20℃에서 1㎍/㎖이고, 이는 25℃ 및 30℃에서의 수율보다 약 3배 높다. 이는 MC1061을 숙주 균주로 사용하면 25℃ 이하에서의 SL335wt의 유도이 효율적이라는 것을 암시한다. 유사한 결과가 SUPEX5 균주를 이용한 경우에 나타났다. SL335Δds의 경우에는, 수율이 숙주 대장균 균주 및 유도 온도에 관계 없이 대략 1.3 ㎍/㎖이다. 이러한 결과는 Fab 내 사슬간 이황화 결합의 존재 또는 부재가 대장균 숙주 균주에 관계 없이 20℃에서의 수용성 Fab 생산의 수율에 크게 영향을 미치지 않는다는 것을 제시하였다. SL3435wt-hGH 융합체의 수율은 숙주 대장균 균주 및 유도 온도에 관계 없이 대략 0.3 내지 0.5 ㎍/㎖이다. 반면, SUPEX5 내에서 발현시킨 SL335Δds-hGH 융합체의 수율은 20℃ 및 25℃에서는 4.0 ㎍/㎖이고, 30℃에서는 3.5 ㎍/㎖이다. 이러한 결과는 SL335Δds 형태 및 대장균 SUPEX5 균주의 사용이 SL335wt 형태 및 대장균 MC1061 균주의 조합과 비교해서 SL335-hGH 융합 단백질이 대략 12배 높은 수율을 얻을 수 있게 한다는 것을 의미한다.
2-(5) SL335-GCSF, SL335-IFNb, EGL4-hGH 및 1b28-hGH 융합 작제물의 제조
Fab-이펙터(effector) 융합 단백질의 수용성 발현 증가에 대한 SL335Δds 형태 및 대장균 SUPEX5 균주의 유용한 효과를 설명하기 위해, 다양한 Fab-이펙터(effector) 융합 작제물를 제조하였다. 우선, 2 가지 SL335-GCSF 융합 변이체(SL335wt-GCSF로 명명된 HcysGCSF/Lcys, SL335Δds-GCSF로 명명된 HserGF/Lser) 및 2 가지 SL335-IFNb 융합 변이체(SL335wt-IFNb로 명명된 HcysIFNb/Lcys 및 SL335Δds-IFNb로 명명된 HserIFNb/Lser)은 이펙터(effector) 도메인의 효과를 측정하기 위한 SL335wt-hGH 및 SL335Δds-hGH의 제조와 같은 방법으로 제조하였다. 유도 온도는 최적 20℃로 설정하였고, 대장균 배양 상층액 내 상기 융합 단백질의 발현 수율은 ELISA에 의해 비교하였다. SL335wt-GCSF의 수율은 MC1061 및 SUPEX5 내에서 각각 0.3 ㎎/㎖ 및 0.6 ㎎/㎖이고, SL335Δds-GCSF의 수율은 MC1061 및 SUPEX5 내에서 각각 0.6 ㎎/㎖ 및 1.5 ㎎/㎖이다(도 7A). 반면, SL335wt-IFNb의 수율은 두 균주 MC1061 및 SUPEX5에서 대략 0.16 ㎎/㎖이고, SL335Δds-IFNb의 수율은 MC1061 및 SUPEX5 내에서 각각 0.2 ㎎/㎖ 및 0.5 ㎎/㎖이다(도 7B). 따라서, SL335Δds-GCSF 및 SUPEX5 균주의 조합이 SL335wt-GCSF 융합체 및 MCF1061의 조합에 비해 SL335-GCSF보다 약 5배 높은 수율을 나타내었고, SL335Δds-IFNb 및 SUPEX5의 조합은 SL335wt-IFNb 융합체와 MC1061 균주의 조합에 비해 SL335-IFNb 융합체의 양보다 약 3배 높았다. 두 번째, 본 발명자들은 EGL4, 인간 항-EGFR Fab, 1b28, 인간 항-IL-1b Fab 를 이용한 Fab-hGH 융합 작제물를 제조하여 Fab의 영향을 측정하였다. SL335wt-hGH 융합체 및 SL335Δds-hGH 융합체 제조 방법과 같이, 2가지 EGL4-hGH 융합 작제물는 HcysG/Lcys 형태 내 EGL4wt-hGH 융합체 및 HserG/Lser 형태 내 EGL4Δds-hGH 융합체이다. 유사하게, 1b284-hGH 융합 작제물는 HcysG/Lcys 형태 내 1b28wt-hGH 융합체 및 HserG/Lser 형태 내 1b28Δds-hGH 융합체이다. EGL4wt-hGH 융합체의 수율은 MC1061 및 SUPEX5 균주에서 80 내지 90 ng/㎖이고, EGL4Δds-hGH 융합체의 수율은 MC1061 균주에서 140 ng/㎖이고 SUPEX5 균주에서 220 ng/㎖(도 8A)인데, 이는 EGL4Δds-hGH 융합체 및 SUPEX5 숙주 세포의 조합이 EGL4wt-hGH 융합체 및 MC1061 숙주 세포의 조합에 비해 배양 상층액 내 EGL4-융합 단백질의 양이 2.4배 높다는 것을 제시하였다. 1b28-hGH 융합 작제물의 경우, 1b28wt-hGH 융합체의 수율은 MC1061 균주에서 50 ng/㎖이고 SUPEX5 균주에서 100 ng/㎖이며 1b28Δds-hGH 융합체의 수율은 MC1061 균주에서 900 ng/㎖이고 SUPEX5 균주에서 4 ㎎/㎖(도 8B)인데, 이는 1b28Δds-hGH 융합체 및 SUPEX5 숙주 세포의 조합이 1b28wt-hGH 융합체 및 MC1061 숙주세포의 조합에 비해 배양 상층액 내 1b28-hGH 융합체 형태의 양이 800배 높다는 것을 제시하였다.
2-(6) SL335 wt -hGH 및 SL335 Δds -hGH의 분자적 특징
SL335wt-hGH 및 SL335Δds-hGH 융합체는 분자 수준에서 좀 더 연구를 실시하였다. 배양 상층액 내 융합 단백질은 HSA로 코팅된 레진을 통과시켜서 흡착-정제하였고, 환원 및 비-환원 조건에서 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. HcysG/Lcys(레인 1) 및 HserG/Lser(레인 2)는 HSA-고정된 세파로즈 비드를 이용하여 배양 상층액으로부터 흡착-정제되었고, SDS-PAGE는 환원 또는 비-환원 조건에서 4~12% Bis-Tris 젤을 사용하여 실시하였다. 단백질 밴드는 코마시 블루 염색을 사용하여 시각화하였다(도 9A). SDS-PAGE 내 단백질은 나이트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겨졌고, AP-결합된 염소 항-인간 카파 L Ab를 사용하여 Lcys 및 Lser을 탐지하였다(도 9B). 결합 신호는 NBT/BCIP 기질을 사용하여 시각화하였다. SDS-PAGE 분석에서, SL335wt-hGH 및 SL335Δds-hGH는 환원 조건에서, 각각 Fd-hGH 융합체 및 L 사슬에 상응하는 크기 46kDa 및 23kDa에서 2가지 주요 단백질 밴드를 나타내었다. 비-환원 조건에서, SL335Δds-hGH는 사슬간 이황화 결합이 없으므로 2 가지 동일한 단백질 밴드를 나타낼 것으로 예측하였다. SL335wt-hGH의 경우에, SL335wt-hGH의 정확한 이질이량체 형태에 상응하는 주요한 70kDa 단백질 밴드가 나타났다. 하지만, SL335wt-hGH의 다양한 크기의 유도체들 또한 관찰되었는데, 이는 24kDa부터 45kDa 범위의 알려지지 않았지만 명백한 4 가지의 단백질 밴드, 크기상 100kDa 및 135kDa에 상응하는 한 쌍의 약한 단백질 밴드를 포함하였다. 크기가 15kDa 및 12.5kDa인 단백질은 모든 종류의 시료에서 관찰되었다. 이후에, 웨스턴 블롯 분석은 항-인간 Fd mAb, 항-카파 L 사슬 pAb 및 항-hGH pAb(T-20)을 사용하여 실시하였다. 항-인간 Fd mAb를 이용한 블롯은 비-환원 및 환원 조건에서 크기가 46kDa인 HcysG 및 HserG 만을 탐지하였다(결과는 나타내지 않음). 반면, SL335wt-hGH 시료 내 70 kDa보다 큰 단백질 뿐만 아니라 24kDa 부터 45kDa 범위의 4 가지 단백질 밴드는 비-환원 조건에서 항-카파 L 사슬 pAb에 의해 모두 탐지되었다(도 9B). 이 결과는 다양한 멀티머 L 사슬의 형성, 최소한 비정상적인 이황화 결합 형성에 관련되어 있다. T-20 항-hGH pAb를 이용한 블롯은 비-환원 조건에서 70kDa인 SL335wt-hGH의 이질이량체 형태 및 SL335Δds-hGH의 ~45kDa 단량체 HerG를 정확하게 탐지하였다(도 9C). 크기가 15kDa 및 12.5kDa인 단백질은 모든 항체에 의해 탐지되지 않았는데, 이는 상기 단백질이 대장균 숙주 단백질로부터의 융합체의 분해 생성물이거나 또는 오염물인 것으로 추측되었다.
칩-기반의 모세관 전기영동은 SDS-PAGE 분석결과를 확인하였다. HcysG/Lcys(도 10A) 및 HserG/Lser(도 10B)는 환원 또는 비-환원 전기영동을 위해 DTT의 유무에 따른 샘플 버퍼를 이용하여 제조하였고, 칩-기반의 모세관 전기영동은 단백질 80kit을 사용한 제작자의 프로토콜에 따라 Agilent 2100 Bioanalyzer 시스템을 이용하여 실시하였다. 결과는 단백질 크기에 대비한 형관 강조 유닛을 반영하도록 플롯화하였다. SL335wt-hGH는 비-환원 조건하에서 크기가 27.1 kDa부터 52.4 kDa 범위인 다양한 SL335wt-hGH 유도체들을 생산하였고, 이들 대부분은 DTT가 있는 환원 조건에서 사라졌다(도 10A). SL335Δds-hGH는 분자량에서 작은 차이를 제외하고 비-환원 및 환원 조건 사이에 거의 동일한 단백질 피크를 나타내었다(도 10B).
SL335wt-hGH 및 SL335Δds-hGH는 MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 추가적으로 분석하였다. MALDI-TOF 질량 분석은 Autoflex III Smartbeam 장치(Bruker Daltonics, Billerica, MA, USA) 상에서 실시하였다. 흡착-정제된 HcysG/Lcys(도 11A) 및 HserG/Lser(도 11B)는 MALDI-매트릭스와 혼합하였고, 스펙트럼은 양성 이온 모드 내에서 m/z 범위 10000-150000 Da에서 획득하였다. 10000-70000 m/z 범위의 질량 스펙트럼은 SL335Δds-hGH에 대하여 획득하였다. SL335wt-hGH에 대하여, 도 8A에 나타난 바와 같이 SL335wt-hGH 시료는 70kDa보다 큰 단백질 밴드를 나타내기 때문에 15000-160000의 질량 스펙트럼을 획득하였다. Lcys, HcysG 및 SL335wt-hGH의 분자 질량은 각각 23,225 Da, 46,226 Da 및 69,837 Da로 각각 확인되었다(도 11A). 각각의 단백질 크기는 정확한 SL335wt-hGH인 92.824 Da, 117,455 Da 및 139,347 Da보다 컸다. SL335Δds-hGH의 경우, Lser 및 HserG의 분자량이 23,334 Da 및 46,667 Da로 확인되었다(도 11B). Lser와 비교하여 HserG의 낮은 피크는 더 큰 분자의 낮은 이온화 효율 또는 시료 내 Lser보다 HserG의 낮은 몰 비율을 나타내는 것이다.
흡착-정제된 SL335Δds-hGH는 FPLC를 이용한 Sephacryl S-200HR에 통과시켜서 추가적으로 정제하였다. 컬럼을 미리 충진한 SepharylTM S-200HR 및 AKTA FPLC(GE Healthcare, Wauwatosa, WI, USA)를 사용한 흡착 정제 후에 HserG/Lser의 젤 여과를 실시하였다. 컬럼은 평형 버퍼(150 mM NaCl을 포함하는 20 mM HEPES pH 7.4)를 사용하여 평형화하였고, 흡착-정제된 HserG/Lser은 상기 컬럼 상에 로딩하였다. 용리는 0.5㎖/min의 유속에서 평 버퍼를 사용하여 실시하였다. 화살표는 SDS-PAGE 분석을 위해 선택된 분획들을 나타내었다(도 12A). 두 개의 다른 피크로부터 회수된 분획 #13, #16, #19 및 #23은 환원 조건에서 4-12% Bis-Tris 젤에 의해 분석하였다(도 12B). 단백질 밴드는 코마시 블루 염색으로 시각화하였다. 대략 66 kDa 및 25 kDa에 상응하는 2 개의 피크는 분획 #12부터 #27까지에서 나타났다(도 9A). 그 뒤에, 4개의 분획(분획 #13, #16, #19 및 #23)은 분획 내 단백질 함량을 측정하기 위해 환원 조건에서 SDS-PAGE에 의해 분석하였다(도 9B). 결과는 66 kDa 피크(분획 #13, #16 및 # 19)로부터의 분획은 이질이량체 SL335Δds-hGH 을 포함하고, 25 kDa 피크(분획 #23)으로부터의 분획은 주로 단량체 Lser을 포함한다는 것을 나타내고 있다.
2-(7) SL335 Δds - hGH의 생체 외 기능적 특징
SL335wt 및 hGH의 융합체 내 사슬간 이황화 결합의 제거가 HSA 또는 RSA에 대한 결합 친화성에 영향을 주는지 측정하기 위해, 바이레이어 인터페로메트리 시험을 pH 6 및 pH 7.4 조건에서 SL335Δds-hGH을 사용하여 실시하였다(상기 표 6 참조). HSA에 대한 SL335Δds-hGH의 분리 상수는 pH 6에서 1.7 nM이고 pH 7.4에서 1.5 nM인데, 이는 SL335에 분리 상수에 비해 각각 5배 및 8.7 배의 흡착 증가를 나타내었다. RSA에 대한 분리 상수는 pH 6에서 499 nM이고 pH 7.4에서 83.6 nM인데, 이는 SL335의 분리 상수에 비해 친화도가 각각 4.2배 및 1.3배 감소한 것을 나타내었다.
SL335Δds-hGH의 생체 외(in vitro) hGH 활성은 hGH 처리시 농도-의존적 형태로 증식하는 Nb2-11 랫트 림프종 세포를 이용하여 측정하였다. Nb2-11 랫트 림프종 세포는 5%(v/v) 말 혈청을 포함하는 DMEM 내에 8×104 세포/㎖로 재부유시켰고, 세포 부유액의 50㎕ 분액은 96-웰 플레이트 내 각각의 웰에 추가한 후 하룻밤 동안 배양하였다. 이후 세포는 5% 말 혈청을 포함하는 50 ㎖ DMEM 내 증가하는 농도의 Growtropin® 또는 HserG/Lser(0 - 20 nM)을 37℃에서 48시간 동안 처리하였다. 배양 후에, CCK-8 용액 10 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였고, 세포는 4시간 동안 배양하였다. 흡광은 450 nm 파장의 마이크로플레이트 리더기 상에서 기록하였다. 결과는 3회 시험의 평균±표준 편차로 나타내었다. HSA가 없을 시, SL335Δds-hGH는 50 pM(3.5 ng/㎖)의 명백한 EC50을 갖는 Nb2-11의 성장을 자극할 수 있다(도 13A). 이 수치는 Growtropin®의 수치, rhGH 표준(7.5 pM)보다 6.7배 낮은 수치이다. SL335Δds-hGH이 Growtropin®의 수치와 비교하여 잠재력에서 대략 5배 감소를 나타내었지만, 10 mM HSA가 있을 경우에는 Growtropin® 및 SL335Δds-hGH의 예상 잠재력이 크게 영향받지 않았다(도 13B). 음성 대조군으로 사용한 SL335는 증식 효과를 나타내지 않았다. 이러한 결과는 SL335Δds-hGH의 기능적 hGH 생리활성을 명백하게 입증하였다.
이후에 SL335Δds-hGH를 37℃에서 16일간 배양함으로써 혈청 안정성을 측정하였다. 인간 혈청 내에서 HSA에 대한 SL335Δds-hGH 및 SL335의 결합 능력이 차후의 시험을 복잡하게 할 수 있으므로, 시료의 재부유를 위해 인간 혈청 대신 FBS를 사용하였다. 시료는 하루에 1회 수집하였고, HSA-결합 반응성 및 생체 외 생리활성은 ELISA(도 14A), Nb2-11 세포 증식 시험(도 14B)에 의해 측정하였다. SL335는 대조군으로 포함하였다. SL335와 유사하게, HSA에 대한 결합 반응성 및 SL335Δds-hGH의 Nb2-11 증식 활성은 37℃에서 16일 이상 배양한 후에도 변화하지 않았는데, 이는 SL335Δds-hGH가 사슬간 이황화 결합의 부재에도 SL335만큼 안정적임을 나타내는 것이다.
2-(8) 랫트에서의 약물 동력학 및 약력학 연구
SL335Δds-hGH는 장기가-활동하는 hGH에 대한 유망한 후보임이 밝혀졌으므로, 생체 내 효율에 대한 연구를 실시하였다. 1차적으로, 단일 정맥내 주사 또는 피하 주사 후에 시간의 함수로써 각각의 유사체에 대한 혈청 수준을 측정함으로써 Growtropin® 및 SL335Δds-hGH의 약물동력학을 랫트 내에서 비교하였다. 랫트 각각의 그룹(그룹당 4두)에 대하여 0.6 ㎎/㎏ Growtropin 또는 SAFAtropin의 단일 복용량의 피하 주사(도 15A) 또는 0.3 ㎎/㎏ Growtropin 또는 SAFAtropin의 단일 복용량 정맥 내 주사를 실시하였다. 혈청 시료는 단백질에 따라 144h까지 연장시킨 간격으로 수집하였다. 혈청 시료는 상기에 기재된 바와 같이 Growtropin® 또는 SAFAtropin® 에 대하여 지정된 시간에 ELISA에 의해 분석하였다. 약물동력학 매개변수(parameter)는 표 7에 나타내었다.
Growtropin 또는 SAFAtropin을 정맥 내 또는 피하 내 단일 주사한 랫트의 약물 동력학 매개변수
t1/2 (h) Cmax (ng/㎖) AUC0→∞(h ng/㎖) Cl / f
(㎖/hr/㎏)
I.V. Growtropin 0.23 ± 0.05 5168.69 ± 61.32 1759.97 ± 145.03 171.04 ± 13.66
SAFAtropin 16.6 ± 1.5 882.2 ± 81.8 19580.3 ± 999.3 15.34 ± 0.76
S.C. Growtropin 1.35 ± 0.13 283.42 ± 28.84 821.8 ± 52.56 714.79 ± 45.63
SAFAtropin 97.16 ± 30.86 83.2 ± 23.12 7689.4 ± 2640.71 56.11 ± 25.39
수치는 평균 ± 표준편차이다. 약어는 하기와 같다:
Cmax: 최대 농도; t1/2: 최종 반감기; AUC0 →∞: 무한성에 외삽한 농도-시간 곡선 하의 면적; Cl/f: 명백한 전체 혈장 제거
SL335Δds-hGH는 투여 경로에 관계 없이 t1/2의 큰 연장을 나타내었다. 정맥 내 투여시, SL335Δds-hGH는 Growtropin(16.6h vs. 0.2h)에 비해 t1/2의 83-배 증가 및 피하 투여(97.2h vs. 1.4h)시 69-배 증가함을 나타내었다.
또한 SL335Δds-hGH는 경로에 무관하게 Growtropin®에 비해 AUC0→∞에서 10배 증가 및 10-배 이상의 느린 제거 속도(Cl/f)를 보여 주었다. 랫트 각 그룹(그룹 당 4 두)에 대하여 단일 복용량 0.6 ㎎/㎏의 Growtropin 또는 SAFAtropin을 피하 주사하거나 단일 복용량 0.3 ㎎/㎏의 Growtropin 또는 SAFAtropin을 정맥내 주사하였다. 혈청 시료는 단백질에 따라 144h 까지 연장된 간격으로 수집하였다. 혈청 시료는 Growtropin® 또는 SAFAtropin®에 대하여 지정된 시간에 상기에 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 분석하였다. 흥미롭게도, SL335Δds-hGH의 Cmax 수치는 투여 경로에 따라 Growtropin®보다 6배 및 3배 낮았다.
다음으로, 하수체 적출된 랫트의 성장 속도는 Growtropin 또는 첨가제 버퍼 대조군(첨가제 단독)의 일일 피하 투여, 또는 SL335Δds-hGH의 주 1회 피하 투여 후에 10일간 비교하였다. 하수체 적출된 랫트는 첨가제 단독 또는 0.3 ㎎/㎏의 Growtropin® 일일 투여, 또는 0일 및 7일째 SAFAtropin®를 증가 투여하였다. 실선은 체중의 평균 퍼센트 변화를 나타내었다. 에러 바는 표준 편차를 나타내었다. 첨가제를 처리한 랫트는 대략 5% 체중 손실을 나타내었다. 반면, Growtropin® (0.3 ㎎/㎏)을 매일 투여 받은 랫트는 5% 체중 증가를 나타내었는데, 결과적으로 첨가제 단독 그룹에 비해 10% 체중 증가를 나타내었다. 2.4 ㎎/㎏ 투여량이 15% 체중 증가를 나타내고, 0.6 ㎎/㎏ 투여량이 3.5% 체중 증가를 나타낸다는 점에서, SL335Δds-hGH의 주 1회 투여는 투여량-의존적인 체중 증가를 보여 주었다. 등몰의 SL335Δds-hGH (1.2 ㎎/㎏) 투여 요법은 Growtropin®의 일일 투여에 의해 획득된 결과에 비해 5%의 체중이 증가하였다.
도 17은 0.6 ㎎/㎏ SL335Δds-hGH의 주 1회 투여가 Growtropin®의 매일 투여에 의한 결과처럼 경골 길이에서 동량의 증가를 나타냄을 보여 주고 있다. 고체 바는 측정된 경골 길이의 평균을 나타내었다. 에러 바는 표준 편차를 나타내었다.
본 발명의 융합 작제물들은 인간 성장 호르몬, 인터페론, 에리스로포리에틴(erythropoietin), 콜로니 자극 인자 또는 이의 유도체 및 항체 유도체를 포함하는 다양한 형태의 이펙터(effector) 모이어티를 포함하도록 제조할 수 있기 때문에, 본 발명은 생리활성 단백질 또는 폴리펩타이드 치료제의 개발에 활용할 수 있다.
한국미생물자원센터 KCTC12657BP 20140820
<110> AprilBio <120> An anti serum albumin Fab-effector fusion construct, and the preparing method thereof <130> IPNB53438 <150> PCT/KR 10-2013-0104112 <151> 2013-08-30 <160> 97 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 124 <212> PRT <213> human <400> 1 Gln Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Ser Gly Gly Thr Lys Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Val Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Gly Leu Lys Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly His Cys Gln Arg Gly Ile Cys Ser Asp Ala Leu Asp 100 105 110 Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> human <400> 2 Glu Val Gln Leu Leu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Glu Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Gly Arg Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Asn Thr Gly Tyr Ala Gln Arg Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Ile Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Val Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Gly His Cys Gln Arg Gly Ile Cys Ser Asp Ala Leu Asp 100 105 110 Thr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 125 <212> PRT <213> human <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Val His 65 70 75 80 Val Gln Met Asp Ser Leu Arg Gly Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Val His Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Tyr Tyr Asn Ala Phe 100 105 110 Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 4 <211> 120 <212> PRT <213> human <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Ser Val Ile Ser His Asp Gly Gly Phe Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Gly Trp Leu Arg Gln Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 5 <211> 117 <212> PRT <213> human <400> 5 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ile Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Met Ile Trp Pro Pro Asp Ala Asp Ala Arg Tyr Ser Pro Ser Phe 50 55 60 Gln Gly Gln Val Thr Phe Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp His Ser Leu Lys Thr Ser Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Tyr Ser Gly Ser Tyr Ser Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 120 <212> PRT <213> human <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Pro Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Phe Arg Ala Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Ile His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Thr Val Met Ala Gly Lys Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> human <400> 7 Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asp Ser Val Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 8 <211> 109 <212> PRT <213> human <400> 8 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Pro 85 90 95 Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 9 <211> 110 <212> PRT <213> human <400> 9 Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Phe Asn Tyr 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Thr Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Asp Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 10 <211> 109 <212> PRT <213> human <400> 10 Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Thr Val Ser Ser Arg 20 25 30 Gln Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Ser Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro 85 90 95 Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 11 <211> 109 <212> PRT <213> human <400> 11 Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln 65 70 75 80 Pro Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Ser Ser Tyr Pro 85 90 95 Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 12 <211> 109 <212> PRT <213> human <400> 12 Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Gly Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Leu Ala 85 90 95 Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> human <400> 13 Ala Tyr Ser Met Asn 1 5 <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> human <400> 14 Ser Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Ile His Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> human <400> 15 Glu Thr Val Met Ala Gly Lys Ala Leu Asp Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 11 <212> PRT <213> human <400> 16 Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn Leu Ala 1 5 10 <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> human <400> 17 Gly Ala Ser Thr Gly Ala Thr 1 5 <210> 18 <211> 10 <212> PRT <213> human <400> 18 Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Leu Ala Lys Thr 1 5 10 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> human <400> 19 gtgccgttct atagccatag cac 23 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> human <400> 20 ggcactggct ggtttcgcta ccgtg 25 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> human <400> 21 gggagatctt gaaatgagct gttgacaatt aatcatccg 39 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> human <400> 22 cctctttaat ttttaataat aaagttaatc gataattcc 39 <210> 23 <211> 70 <212> DNA <213> human <400> 23 ggaattatcg attaacttta ttattaaaaa ttaaagaggt atatattagg atccgagctc 60 gagttctgca 70 <210> 24 <211> 34 <212> DNA <213> human <400> 24 gggcactacg tgcgaaaggc ccagtctttc gact 34 <210> 25 <211> 69 <212> DNA <213> human <400> 25 ggccgcagat ctgttaatta aggaggaatt taaagaattc atgaaaaaac tgctgttcgc 60 gattccgct 69 <210> 26 <211> 41 <212> DNA <213> human <400> 26 gggaagctta ttaacaagat ttgggctcaa ctctcttgtc c 41 <210> 27 <211> 39 <212> DNA <213> human <400> 27 gggggatcca tgaaaaagac agctatcgcg attgcagtg 39 <210> 28 <211> 69 <212> DNA <213> human <400> 28 attcctcctt aattaacaga tctgcggccg cactcgagat taacactctc ccctgttgaa 60 gctctttgt 69 <210> 29 <211> 63 <212> DNA <213> human <400> 29 ggggaattca tgaaatatct gctgcctacg gcggcggcgg gcctgctgct gctggctgca 60 caa 63 <210> 30 <211> 35 <212> DNA <213> human <400> 30 gggaagcttt tagctgctct tcggttccac gcgtt 35 <210> 31 <211> 52 <212> DNA <213> human <400> 31 gggggatcca tgaaaaaaac tgcgattgcg attgcggtgc tggccggctt tg 52 <210> 32 <211> 38 <212> DNA <213> human <400> 32 gggctcgagt tagctttcgc cgcggttaaa gctctttg 38 <210> 33 <211> 47 <212> DNA <213> human <400> 33 agatccagga gctggtgcag aaccgcagct cttcggttcc acgcgtt 47 <210> 34 <211> 47 <212> DNA <213> human <400> 34 ggttctgcac cagctcctgg atcttttccg accattccgc tgagccg 47 <210> 35 <211> 32 <212> DNA <213> human <400> 35 gggaagcttt tagaagccgc aggagccctc ca 32 <210> 36 <211> 49 <212> DNA <213> human <400> 36 agatccagga gctggtgcag aaccgcattc gccgcggtta aagctcttt 49 <210> 37 <211> 32 <212> DNA <213> human <400> 37 gggctcgagt tagaagccgc aggagccctc ca 32 <210> 38 <211> 32 <212> DNA <213> human <400> 38 gggctcgagt tagaagccgc aggagccctc ca 32 <210> 39 <211> 47 <212> DNA <213> human <400> 39 agatccagga gctggtgcag aaccgctgct cttcggttcc acgcgtt 47 <210> 40 <211> 50 <212> DNA <213> human <400> 40 agatccagga gctggtgcag aaccgctttc gccgcggtta aagctctttg 50 <210> 41 <211> 46 <212> DNA <213> human <400> 41 ggttctgcac cagctcctgg atctgcgcct acctatcgcg cgagca 46 <210> 42 <211> 34 <212> DNA <213> human <400> 42 gggaagctta ttaaggctgt gccagatggc gcag 34 <210> 43 <211> 49 <212> DNA <213> human <400> 43 agatccagga gctggtgcag aaccgcattc gccgcggtta aagctcttt 49 <210> 44 <211> 50 <212> DNA <213> human <400> 44 taacagatct gcggccgcac tcgagattaa ggctgtgcca gatggcgcag 50 <210> 45 <211> 47 <212> DNA <213> human <400> 45 agatccagga gctggtgcag aaccgctgct cttcggttcc acgcgtt 47 <210> 46 <211> 50 <212> DNA <213> human <400> 46 agatccagga gctggtgcag aaccgctttc gccgcggtta aagctctttg 50 <210> 47 <211> 47 <212> DNA <213> human <400> 47 agatccagga gctggtgcag aaccgcagct cttcggttcc acgcgtt 47 <210> 48 <211> 48 <212> DNA <213> human <400> 48 ggttctgcac cagctcctgg atcttcatac aacctgctgg gcttcctg 48 <210> 49 <211> 33 <212> DNA <213> human <400> 49 gggaagcttt tagttgcgca gatagccggt cag 33 <210> 50 <211> 47 <212> DNA <213> human <400> 50 agatccagga gctggtgcag aaccgctgct cttcggttcc acgcgtt 47 <210> 51 <211> 38 <212> DNA <213> human <400> 51 gggaagctta ttaactagat ttgggctcaa ctctcttg 38 <210> 52 <211> 37 <212> DNA <213> human <400> 52 gggctcgagt tagcattcgc cgcggttaaa gctcttt 37 <210> 53 <211> 37 <212> DNA <213> human <400> 53 gggctcgagt tagctttcgc cgcggttaaa gctcttt 37 <210> 54 <211> 51 <212> DNA <213> human <400> 54 agatccagga gctggtgcag aaccacaaga tttgggctca actctcttgt c 51 <210> 55 <211> 51 <212> DNA <213> human <400> 55 agatccagga gctggtgcag aaccactaga tttgggctca actctcttgt c 51 <210> 56 <211> 20 <212> PRT <213> human <400> 56 Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Leu Ala Gly Phe Ala Thr 1 5 10 15 Val Ala Gln Ala 20 <210> 57 <211> 22 <212> PRT <213> human <400> 57 Met Lys Tyr Leu Leu Pro Thr Ala Ala Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala 1 5 10 15 Ala Gln Pro Ala Met Ala 20 <210> 58 <211> 1287 <212> DNA <213> human <400> 58 caagttcagc tggttcagag cggtggcggc ccggtgaaac caggtggcag cctgcgtctg 60 tcctgcgcgg cgagcggttt tatgtttcgt gcgtatagca tgaactgggt gcgccaggcg 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtgagcagc attagcagca gtggccgcta tattcattat 180 gccgacagtg ttaaaggtcg ttttaccatt tctcgtgaca atgcgaaaaa cagcctgtat 240 ctgcaaatga atagcctgcg cgcggaagac accgcggtgt actactgtgc gcgcgaaacc 300 gtgatggcgg gcaaagcact ggattattgg ggtcagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360 gcgagcacca aaggcccgag cgcgagcacc aaaggcccga gcgtgtttcc gctggcacct 420 agttcgaaat caacgagcgg tggcaccgcg gctctgggct gcctggtgaa agattatttc 480 ccggaacctg ttaccgtgag ctggaacagc ggtgcgttga cgagtggtgt gcataccttt 540 cccgcagttc tgcaatcgag cggcctgtac tcactgagca gcgtggttac ggtcccgagc 600 agtagcctgg gtacacagac ctatatttgt aacgtgaacc acaagccttc gaacacgaaa 660 gttgacaaac gcgtggaacc gaagagctgc ggttctgcac cagctcctgg atcttttccg 720 accattccgc tgagccgcct gttcgataac gcgatgctgc gcgcccaccg cctgcatcaa 780 ctggcctttg atacctatca ggagtttgag gaagcgtaca tcccgaagga acagaaatat 840 tcttttctgc agaacccaca gacgagcctg tgctttagcg aatctatccc gaccccgtcc 900 aaccgcgaag aaacccaaca gaagtctaac ctggaactgc tgcgtatctc tctgctgctg 960 attcaatcct ggctggaacc ggttcaattt ctgcgtagcg tgtttgcgaa ctctctggtg 1020 tatggcgcgt ctgactctaa cgtgtatgac ctgctgaaag atctggaaga aggcatccaa 1080 actctgatgg gccgtctgga ggacggctct ccacgtaccg gccagatctt taaacagacc 1140 tatagcaaat ttgacaccaa ttctcacaac gatgatgcgc tgctgaaaaa ctatggcctg 1200 ctgtattgct tccgtaaaga catggataaa gttgaaacgt tcctgcgcat tgttcagtgc 1260 cgttccgtgg agggctcctg cggcttc 1287 <210> 59 <211> 429 <212> PRT <213> human <400> 59 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Pro Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Phe Arg Ala Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Ile His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Thr Val Met Ala Gly Lys Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Ser Ala Pro Ala Pro Gly Ser Phe Pro 225 230 235 240 Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His 245 250 255 Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala 260 265 270 Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr 275 280 285 Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu 290 295 300 Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu 305 310 315 320 Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala 325 330 335 Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu 340 345 350 Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp 355 360 365 Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe 370 375 380 Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu 385 390 395 400 Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg 405 410 415 Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 420 425 <210> 60 <211> 666 <212> DNA <213> human <400> 60 gatatcgttc tgacccaatc tccgggtacg ctgagcctga gcccgggcga aaccgcgacc 60 ctgagctgcc gcgcgagcca aagcgtgggt tctaatctgg cttggtatca gcagaaaccg 120 ggtcaggccc cgcgcctgct gatctatggg gcgagcacgg gggctaccgg cgttccggcg 180 cgctttagtg gcagtcgcag cggcaccgat tttaccctga ccattacaag tctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgccagcaa tattatagct tcctggcgaa aacctttggt 300 cagggcaccc agctggaaat taaacgcacc gtggcggcac ccagcgtgac ggtggcggca 360 cccagcgtgt ttatttttcc tcccagtgat gaacagctga aaagcgggac cgcgagtgtt 420 gtgtgcctgt tgaacaactt ctatcctcgc gaagcgaaag tgcagtggaa agtggataac 480 gcattgcaga gcggcaacag tcaggaaagc gttactgaac aggatagcaa agatagtacg 540 tacagcttga gcaacactct gaccctgagt aaagcggatt atgaaaaaca taaagtgtat 600 gcatgcgaag ttacgcatca ggggctgagc agtccggtga caaagagctt taaccgcggc 660 gaatgc 666 <210> 61 <211> 222 <212> PRT <213> human <400> 61 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Gly Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Leu Ala 85 90 95 Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 130 135 140 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 145 150 155 160 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 165 170 175 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 180 185 190 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 195 200 205 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 62 <211> 1287 <212> DNA <213> human <400> 62 caagttcagc tggttcagag cggtggcggc ccggtgaaac caggtggcag cctgcgtctg 60 tcctgcgcgg cgagcggttt tatgtttcgt gcgtatagca tgaactgggt gcgccaggcg 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtgagcagc attagcagca gtggccgcta tattcattat 180 gccgacagtg ttaaaggtcg ttttaccatt tctcgtgaca atgcgaaaaa cagcctgtat 240 ctgcaaatga atagcctgcg cgcggaagac accgcggtgt actactgtgc gcgcgaaacc 300 gtgatggcgg gcaaagcact ggattattgg ggtcagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360 gcgagcacca aaggcccgag cgcgagcacc aaaggcccga gcgtgtttcc gctggcacct 420 agttcgaaat caacgagcgg tggcaccgcg gctctgggct gcctggtgaa agattatttc 480 ccggaacctg ttaccgtgag ctggaacagc ggtgcgttga cgagtggtgt gcataccttt 540 cccgcagttc tgcaatcgag cggcctgtac tcactgagca gcgtggttac ggtcccgagc 600 agtagcctgg gtacacagac ctatatttgt aacgtgaacc acaagccttc gaacacgaaa 660 gttgacaaac gcgtggaacc gaagagcagc ggttctgcac cagctcctgg atcttttccg 720 accattccgc tgagccgcct gttcgataac gcgatgctgc gcgcccaccg cctgcatcaa 780 ctggcctttg atacctatca ggagtttgag gaagcgtaca tcccgaagga acagaaatat 840 tcttttctgc agaacccaca gacgagcctg tgctttagcg aatctatccc gaccccgtcc 900 aaccgcgaag aaacccaaca gaagtctaac ctggaactgc tgcgtatctc tctgctgctg 960 attcaatcct ggctggaacc ggttcaattt ctgcgtagcg tgtttgcgaa ctctctggtg 1020 tatggcgcgt ctgactctaa cgtgtatgac ctgctgaaag atctggaaga aggcatccaa 1080 actctgatgg gccgtctgga ggacggctct ccacgtaccg gccagatctt taaacagacc 1140 tatagcaaat ttgacaccaa ttctcacaac gatgatgcgc tgctgaaaaa ctatggcctg 1200 ctgtattgct tccgtaaaga catggataaa gttgaaacgt tcctgcgcat tgttcagtgc 1260 cgttccgtgg agggctcctg cggcttc 1287 <210> 63 <211> 429 <212> PRT <213> human <400> 63 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Pro Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Phe Arg Ala Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Ile His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Thr Val Met Ala Gly Lys Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Ser Gly Ser Ala Pro Ala Pro Gly Ser Phe Pro 225 230 235 240 Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His 245 250 255 Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala 260 265 270 Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr 275 280 285 Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu 290 295 300 Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu 305 310 315 320 Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala 325 330 335 Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu 340 345 350 Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp 355 360 365 Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe 370 375 380 Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu 385 390 395 400 Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg 405 410 415 Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 420 425 <210> 64 <211> 666 <212> DNA <213> human <400> 64 gatatcgttc tgacccaatc tccgggtacg ctgagcctga gcccgggcga aaccgcgacc 60 ctgagctgcc gcgcgagcca aagcgtgggt tctaatctgg cttggtatca gcagaaaccg 120 ggtcaggccc cgcgcctgct gatctatggg gcgagcacgg gggctaccgg cgttccggcg 180 cgctttagtg gcagtcgcag cggcaccgat tttaccctga ccattacaag tctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgccagcaa tattatagct tcctggcgaa aacctttggt 300 cagggcaccc agctggaaat taaacgcacc gtggcggcac ccagcgtgac ggtggcggca 360 cccagcgtgt ttatttttcc tcccagtgat gaacagctga aaagcgggac cgcgagtgtt 420 gtgtgcctgt tgaacaactt ctatcctcgc gaagcgaaag tgcagtggaa agtggataac 480 gcattgcaga gcggcaacag tcaggaaagc gttactgaac aggatagcaa agatagtacg 540 tacagcttga gcaacactct gaccctgagt aaagcggatt atgaaaaaca taaagtgtat 600 gcatgcgaag ttacgcatca ggggctgagc agtccggtga caaagagctt taaccgcggc 660 gaaagc 666 <210> 65 <211> 222 <212> PRT <213> human <400> 65 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Gly Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Leu Ala 85 90 95 Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 130 135 140 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 145 150 155 160 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 165 170 175 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 180 185 190 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 195 200 205 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser 210 215 220 <210> 66 <211> 1236 <212> DNA <213> human <400> 66 caagttcagc tggttcagag cggtggcggc ccggtgaaac caggtggcag cctgcgtctg 60 tcctgcgcgg cgagcggttt tatgtttcgt gcgtatagca tgaactgggt gcgccaggcg 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtgagcagc attagcagca gtggccgcta tattcattat 180 gccgacagtg ttaaaggtcg ttttaccatt tctcgtgaca atgcgaaaaa cagcctgtat 240 ctgcaaatga atagcctgcg cgcggaagac accgcggtgt actactgtgc gcgcgaaacc 300 gtgatggcgg gcaaagcact ggattattgg ggtcagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360 gcgagcacca aaggcccgag cgcgagcacc aaaggcccga gcgtgtttcc gctggcacct 420 agttcgaaat caacgagcgg tggcaccgcg gctctgggct gcctggtgaa agattatttc 480 ccggaacctg ttaccgtgag ctggaacagc ggtgcgttga cgagtggtgt gcataccttt 540 cccgcagttc tgcaatcgag cggcctgtac tcactgagca gcgtggttac ggtcccgagc 600 agtagcctgg gtacacagac ctatatttgt aacgtgaacc acaagccttc gaacacgaaa 660 gttgacaaac gcgtggaacc gaagagctgc ggttctgcac cagctcctgg atctgcgcct 720 acctatcgcg cgagcagcct gccgcagtcg tttctgctga aaagcctgga acaggtgcgc 780 aagattcagg gtgacggcgc agctctgcaa gaaaaactgt gcgcgaccta caaattgtgc 840 caccctgagg aactggttct gctgggccat agtctgggca ttccgtgggc gccgctgagc 900 agctgcccgt cgcaggcatt gcagctggct ggctgtctga gccagttaca tagcggtctg 960 tttctgtatc agggcctgct gcaagcgctg gaaggcatca gtcctgagtt gggtccgacc 1020 ctggatacct tacagctgga tgtggcggat ttcgcaacca ccatttggca gcagatggaa 1080 gaattgggca tggctccggc gttgcagccg acccagggcg cgatgcctgc gtttgcaagc 1140 gcttttcagc gccgcgcggg tggggtgctg gtggcgtcgc acttgcagag cttcctggaa 1200 gtgagctacc gtgtcctgcg ccatctggca cagcct 1236 <210> 67 <211> 412 <212> PRT <213> human <400> 67 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Pro Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Phe Arg Ala Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Ile His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Thr Val Met Ala Gly Lys Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Ser Ala Pro Ala Pro Gly Ser Ala Pro 225 230 235 240 Thr Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu 245 250 255 Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys 260 265 270 Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu 275 280 285 Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser 290 295 300 Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu 305 310 315 320 Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu 325 330 335 Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala 340 345 350 Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu 355 360 365 Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg 370 375 380 Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu 385 390 395 400 Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 405 410 <210> 68 <211> 666 <212> DNA <213> human <400> 68 gatatcgttc tgacccaatc tccgggtacg ctgagcctga gcccgggcga aaccgcgacc 60 ctgagctgcc gcgcgagcca aagcgtgggt tctaatctgg cttggtatca gcagaaaccg 120 ggtcaggccc cgcgcctgct gatctatggg gcgagcacgg gggctaccgg cgttccggcg 180 cgctttagtg gcagtcgcag cggcaccgat tttaccctga ccattacaag tctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgccagcaa tattatagct tcctggcgaa aacctttggt 300 cagggcaccc agctggaaat taaacgcacc gtggcggcac ccagcgtgac ggtggcggca 360 cccagcgtgt ttatttttcc tcccagtgat gaacagctga aaagcgggac cgcgagtgtt 420 gtgtgcctgt tgaacaactt ctatcctcgc gaagcgaaag tgcagtggaa agtggataac 480 gcattgcaga gcggcaacag tcaggaaagc gttactgaac aggatagcaa agatagtacg 540 tacagcttga gcaacactct gaccctgagt aaagcggatt atgaaaaaca taaagtgtat 600 gcatgcgaag ttacgcatca ggggctgagc agtccggtga caaagagctt taaccgcggc 660 gaatgc 666 <210> 69 <211> 222 <212> PRT <213> human <400> 69 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Gly Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Leu Ala 85 90 95 Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 130 135 140 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 145 150 155 160 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 165 170 175 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 180 185 190 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 195 200 205 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 70 <211> 1236 <212> DNA <213> human <400> 70 caagttcagc tggttcagag cggtggcggc ccggtgaaac caggtggcag cctgcgtctg 60 tcctgcgcgg cgagcggttt tatgtttcgt gcgtatagca tgaactgggt gcgccaggcg 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtgagcagc attagcagca gtggccgcta tattcattat 180 gccgacagtg ttaaaggtcg ttttaccatt tctcgtgaca atgcgaaaaa cagcctgtat 240 ctgcaaatga atagcctgcg cgcggaagac accgcggtgt actactgtgc gcgcgaaacc 300 gtgatggcgg gcaaagcact ggattattgg ggtcagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360 gcgagcacca aaggcccgag cgcgagcacc aaaggcccga gcgtgtttcc gctggcacct 420 agttcgaaat caacgagcgg tggcaccgcg gctctgggct gcctggtgaa agattatttc 480 ccggaacctg ttaccgtgag ctggaacagc ggtgcgttga cgagtggtgt gcataccttt 540 cccgcagttc tgcaatcgag cggcctgtac tcactgagca gcgtggttac ggtcccgagc 600 agtagcctgg gtacacagac ctatatttgt aacgtgaacc acaagccttc gaacacgaaa 660 gttgacaaac gcgtggaacc gaagagcagc ggttctgcac cagctcctgg atctgcgcct 720 acctatcgcg cgagcagcct gccgcagtcg tttctgctga aaagcctgga acaggtgcgc 780 aagattcagg gtgacggcgc agctctgcaa gaaaaactgt gcgcgaccta caaattgtgc 840 caccctgagg aactggttct gctgggccat agtctgggca ttccgtgggc gccgctgagc 900 agctgcccgt cgcaggcatt gcagctggct ggctgtctga gccagttaca tagcggtctg 960 tttctgtatc agggcctgct gcaagcgctg gaaggcatca gtcctgagtt gggtccgacc 1020 ctggatacct tacagctgga tgtggcggat ttcgcaacca ccatttggca gcagatggaa 1080 gaattgggca tggctccggc gttgcagccg acccagggcg cgatgcctgc gtttgcaagc 1140 gcttttcagc gccgcgcggg tggggtgctg gtggcgtcgc acttgcagag cttcctggaa 1200 gtgagctacc gtgtcctgcg ccatctggca cagcct 1236 <210> 71 <211> 412 <212> PRT <213> human <400> 71 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Pro Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Phe Arg Ala Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Ile His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Thr Val Met Ala Gly Lys Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Ser Gly Ser Ala Pro Ala Pro Gly Ser Ala Pro 225 230 235 240 Thr Tyr Arg Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Ser Leu 245 250 255 Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys 260 265 270 Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu 275 280 285 Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser 290 295 300 Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu 305 310 315 320 Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu 325 330 335 Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala 340 345 350 Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu 355 360 365 Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg 370 375 380 Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu 385 390 395 400 Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro 405 410 <210> 72 <211> 666 <212> DNA <213> human <400> 72 gatatcgttc tgacccaatc tccgggtacg ctgagcctga gcccgggcga aaccgcgacc 60 ctgagctgcc gcgcgagcca aagcgtgggt tctaatctgg cttggtatca gcagaaaccg 120 ggtcaggccc cgcgcctgct gatctatggg gcgagcacgg gggctaccgg cgttccggcg 180 cgctttagtg gcagtcgcag cggcaccgat tttaccctga ccattacaag tctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgccagcaa tattatagct tcctggcgaa aacctttggt 300 cagggcaccc agctggaaat taaacgcacc gtggcggcac ccagcgtgac ggtggcggca 360 cccagcgtgt ttatttttcc tcccagtgat gaacagctga aaagcgggac cgcgagtgtt 420 gtgtgcctgt tgaacaactt ctatcctcgc gaagcgaaag tgcagtggaa agtggataac 480 gcattgcaga gcggcaacag tcaggaaagc gttactgaac aggatagcaa agatagtacg 540 tacagcttga gcaacactct gaccctgagt aaagcggatt atgaaaaaca taaagtgtat 600 gcatgcgaag ttacgcatca ggggctgagc agtccggtga caaagagctt taaccgcggc 660 gaaagc 666 <210> 73 <211> 222 <212> PRT <213> human <400> 73 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Gly Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Leu Ala 85 90 95 Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 130 135 140 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 145 150 155 160 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 165 170 175 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 180 185 190 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 195 200 205 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser 210 215 220 <210> 74 <211> 1209 <212> DNA <213> human <400> 74 caagttcagc tggttcagag cggtggcggc ccggtgaaac caggtggcag cctgcgtctg 60 tcctgcgcgg cgagcggttt tatgtttcgt gcgtatagca tgaactgggt gcgccaggcg 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtgagcagc attagcagca gtggccgcta tattcattat 180 gccgacagtg ttaaaggtcg ttttaccatt tctcgtgaca atgcgaaaaa cagcctgtat 240 ctgcaaatga atagcctgcg cgcggaagac accgcggtgt actactgtgc gcgcgaaacc 300 gtgatggcgg gcaaagcact ggattattgg ggtcagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360 gcgagcacca aaggcccgag cgcgagcacc aaaggcccga gcgtgtttcc gctggcacct 420 agttcgaaat caacgagcgg tggcaccgcg gctctgggct gcctggtgaa agattatttc 480 ccggaacctg ttaccgtgag ctggaacagc ggtgcgttga cgagtggtgt gcataccttt 540 cccgcagttc tgcaatcgag cggcctgtac tcactgagca gcgtggttac ggtcccgagc 600 agtagcctgg gtacacagac ctatatttgt aacgtgaacc acaagccttc gaacacgaaa 660 gttgacaaac gcgtggaacc gaagagctgc ggttctgcac cagctcctgg atcttcatac 720 aacctgctgg gcttcctgca acgtagcagt aactttcaga gccagaagct gttatggcaa 780 ctgaacggcc gcctggagta ctgcctgaag gatcgcatga actttgatat tccggaagaa 840 attaaacagc tgcaacagtt ccagaaagaa gatgcggcgc tgaccattta tgaaatgctg 900 caaaacattt ttgcgatttt tcgccaagat agtagtagca ccggctggaa cgaaaccatt 960 gtggaaaacc tgctcgccaa cgtgtaccat cagattaacc acctgaagac cgtgctggaa 1020 gaaaaactgg aaaaagaaga ttttacccgc ggcaaactga tgagcagcct gcatctgaaa 1080 cgctattatg gccgcattct ccattatctg aaagccaaag agtattccca ctgtgcttgg 1140 accattgttc gcgtggaaat tctgcgcaac ttttatttta ttaaccgcct gaccggctat 1200 ctgcgcaac 1209 <210> 75 <211> 403 <212> PRT <213> human <400> 75 Asn Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Pro Val Lys Pro Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Phe Arg Ala 20 25 30 Tyr Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp 35 40 45 Val Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Ile His Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Thr Val Met Ala Gly Lys Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Ser Ala Pro Ala Pro Gly Ser Ser Tyr 225 230 235 240 Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Ser Gln Lys 245 250 255 Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg 260 265 270 Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln 275 280 285 Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe 290 295 300 Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile 305 310 315 320 Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys 325 330 335 Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys 340 345 350 Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His 355 360 365 Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg 370 375 380 Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr 385 390 395 400 Leu Arg Asn <210> 76 <211> 666 <212> DNA <213> human <400> 76 gatatcgttc tgacccaatc tccgggtacg ctgagcctga gcccgggcga aaccgcgacc 60 ctgagctgcc gcgcgagcca aagcgtgggt tctaatctgg cttggtatca gcagaaaccg 120 ggtcaggccc cgcgcctgct gatctatggg gcgagcacgg gggctaccgg cgttccggcg 180 cgctttagtg gcagtcgcag cggcaccgat tttaccctga ccattacaag tctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgccagcaa tattatagct tcctggcgaa aacctttggt 300 cagggcaccc agctggaaat taaacgcacc gtggcggcac ccagcgtgac ggtggcggca 360 cccagcgtgt ttatttttcc tcccagtgat gaacagctga aaagcgggac cgcgagtgtt 420 gtgtgcctgt tgaacaactt ctatcctcgc gaagcgaaag tgcagtggaa agtggataac 480 gcattgcaga gcggcaacag tcaggaaagc gttactgaac aggatagcaa agatagtacg 540 tacagcttga gcaacactct gaccctgagt aaagcggatt atgaaaaaca taaagtgtat 600 gcatgcgaag ttacgcatca ggggctgagc agtccggtga caaagagctt taaccgcggc 660 gaatgc 666 <210> 77 <211> 222 <212> PRT <213> human <400> 77 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Gly Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Leu Ala 85 90 95 Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 130 135 140 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 145 150 155 160 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 165 170 175 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 180 185 190 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 195 200 205 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 220 <210> 78 <211> 1209 <212> DNA <213> human <400> 78 caagttcagc tggttcagag cggtggcggc ccggtgaaac caggtggcag cctgcgtctg 60 tcctgcgcgg cgagcggttt tatgtttcgt gcgtatagca tgaactgggt gcgccaggcg 120 ccgggcaaag gcctggaatg ggtgagcagc attagcagca gtggccgcta tattcattat 180 gccgacagtg ttaaaggtcg ttttaccatt tctcgtgaca atgcgaaaaa cagcctgtat 240 ctgcaaatga atagcctgcg cgcggaagac accgcggtgt actactgtgc gcgcgaaacc 300 gtgatggcgg gcaaagcact ggattattgg ggtcagggca ccctggtgac cgtgagcagc 360 gcgagcacca aaggcccgag cgcgagcacc aaaggcccga gcgtgtttcc gctggcacct 420 agttcgaaat caacgagcgg tggcaccgcg gctctgggct gcctggtgaa agattatttc 480 ccggaacctg ttaccgtgag ctggaacagc ggtgcgttga cgagtggtgt gcataccttt 540 cccgcagttc tgcaatcgag cggcctgtac tcactgagca gcgtggttac ggtcccgagc 600 agtagcctgg gtacacagac ctatatttgt aacgtgaacc acaagccttc gaacacgaaa 660 gttgacaaac gcgtggaacc gaagagcagc ggttctgcac cagctcctgg atcttcatac 720 aacctgctgg gcttcctgca acgtagcagt aactttcaga gccagaagct gttatggcaa 780 ctgaacggcc gcctggagta ctgcctgaag gatcgcatga actttgatat tccggaagaa 840 attaaacagc tgcaacagtt ccagaaagaa gatgcggcgc tgaccattta tgaaatgctg 900 caaaacattt ttgcgatttt tcgccaagat agtagtagca ccggctggaa cgaaaccatt 960 gtggaaaacc tgctcgccaa cgtgtaccat cagattaacc acctgaagac cgtgctggaa 1020 gaaaaactgg aaaaagaaga ttttacccgc ggcaaactga tgagcagcct gcatctgaaa 1080 cgctattatg gccgcattct ccattatctg aaagccaaag agtattccca ctgtgcttgg 1140 accattgttc gcgtggaaat tctgcgcaac ttttatttta ttaaccgcct gaccggctat 1200 ctgcgcaac 1209 <210> 79 <211> 403 <212> PRT <213> human <400> 79 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Pro Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Met Phe Arg Ala Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ser Gly Arg Tyr Ile His Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Thr Val Met Ala Gly Lys Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Ala 115 120 125 Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser 130 135 140 Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe 145 150 155 160 Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly 165 170 175 Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu 180 185 190 Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr 195 200 205 Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg 210 215 220 Val Glu Pro Lys Ser Ser Gly Ser Ala Pro Ala Pro Gly Ser Ser Tyr 225 230 235 240 Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Ser Gln Lys 245 250 255 Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg 260 265 270 Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln 275 280 285 Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe 290 295 300 Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile 305 310 315 320 Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys 325 330 335 Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys 340 345 350 Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His 355 360 365 Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg 370 375 380 Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr 385 390 395 400 Leu Arg Asn <210> 80 <211> 666 <212> DNA <213> human <400> 80 gatatcgttc tgacccaatc tccgggtacg ctgagcctga gcccgggcga aaccgcgacc 60 ctgagctgcc gcgcgagcca aagcgtgggt tctaatctgg cttggtatca gcagaaaccg 120 ggtcaggccc cgcgcctgct gatctatggg gcgagcacgg gggctaccgg cgttccggcg 180 cgctttagtg gcagtcgcag cggcaccgat tttaccctga ccattacaag tctgcagccg 240 gaagattttg cgacctatta ttgccagcaa tattatagct tcctggcgaa aacctttggt 300 cagggcaccc agctggaaat taaacgcacc gtggcggcac ccagcgtgac ggtggcggca 360 cccagcgtgt ttatttttcc tcccagtgat gaacagctga aaagcgggac cgcgagtgtt 420 gtgtgcctgt tgaacaactt ctatcctcgc gaagcgaaag tgcagtggaa agtggataac 480 gcattgcaga gcggcaacag tcaggaaagc gttactgaac aggatagcaa agatagtacg 540 tacagcttga gcaacactct gaccctgagt aaagcggatt atgaaaaaca taaagtgtat 600 gcatgcgaag ttacgcatca ggggctgagc agtccggtga caaagagctt taaccgcggc 660 gaaagc 666 <210> 81 <211> 222 <212> PRT <213> human <400> 81 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Thr Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Gly Ser Asn 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Thr Gly Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Phe Leu Ala 85 90 95 Lys Thr Phe Gly Gln Gly Thr Gln Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110 Ala Pro Ser Val Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro 115 120 125 Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu 130 135 140 Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn 145 150 155 160 Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser 165 170 175 Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala 180 185 190 Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly 195 200 205 Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser 210 215 220 <210> 82 <211> 1275 <212> DNA <213> human <400> 82 gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgcacag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atggtggtag cgtagtctat 180 gcggactctg tcaggggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag aactgaggac acggccgtct attactgtgc gagagattac 300 ggttactacg gtatggacgt ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctcatcggcc 360 acattggccg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420 acctctgagg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 660 gttgagccca aatcttgtgg ttctgcacca gctcctggat cttttccgac cattccgctg 720 agccgcctgt tcgataacgc gatgctgcgc gcccaccgcc tgcatcaact ggcctttgat 780 acctatcagg agtttgagga agcgtacatc ccgaaggaac agaaatattc ttttctgcag 840 aacccacaga cgagcctgtg ctttagcgaa tctatcccga ccccgtccaa ccgcgaagaa 900 acccaacaga agtctaacct ggaactgctg cgtatctctc tgctgctgat tcaatcctgg 960 ctggaaccgg ttcaatttct gcgtagcgtg tttgcgaact ctctggtgta tggcgcgtct 1020 gactctaacg tgtatgacct gctgaaagat ctggaagaag gcatccaaac tctgatgggc 1080 cgtctggagg acggctctcc acgtaccggc cagatcttta aacagaccta tagcaaattt 1140 gacaccaatt ctcacaacga tgatgcgctg ctgaaaaact atggcctgct gtattgcttc 1200 cgtaaagaca tggataaagt tgaaacgttc ctgcgcattg ttcagtgccg ttccgtggag 1260 ggctcctgcg gcttc 1275 <210> 83 <211> 425 <212> PRT <213> human <400> 83 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Val Val Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Ala Thr Leu Ala Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Glu Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Gly Ser Ala Pro Ala Pro Gly Ser Phe Pro Thr Ile Pro Leu 225 230 235 240 Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln 245 250 255 Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys 260 265 270 Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 275 280 285 Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys 290 295 300 Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp 305 310 315 320 Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val 325 330 335 Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu 340 345 350 Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 355 360 365 Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 370 375 380 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe 385 390 395 400 Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys 405 410 415 Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 420 425 <210> 84 <211> 648 <212> DNA <213> human <400> 84 gatattgtga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gaatattggc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggtaacgccc ctaagttgtt gatctataga gcatccaatt tgcgaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggctc tgggacagat ttcactctta ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatttcg caacttactt ttgtcaacag gctaccattt tccctctcac tttcggcgga 300 gggacccggg tggatatcaa acgttctaga gctgtggctg caccatctgt cttcatcttc 360 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcaacacc 540 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600 cagggcctga gttcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 648 <210> 85 <211> 216 <212> PRT <213> human <400> 85 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Thr Ile Phe Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Asp Ile Lys Arg Ser Arg Thr Val 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 145 150 155 160 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 86 <211> 1275 <212> DNA <213> human <400> 86 gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60 tcctgcacag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120 ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atggtggtag cgtagtctat 180 gcggactctg tcaggggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240 ctgcaaatga acagtctgag aactgaggac acggccgtct attactgtgc gagagattac 300 ggttactacg gtatggacgt ctggggccaa ggaaccctgg tcaccgtctc ctcatcggcc 360 acattggccg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420 acctctgagg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 660 gttgagccca aatctagtgg ttctgcacca gctcctggat cttttccgac cattccgctg 720 agccgcctgt tcgataacgc gatgctgcgc gcccaccgcc tgcatcaact ggcctttgat 780 acctatcagg agtttgagga agcgtacatc ccgaaggaac agaaatattc ttttctgcag 840 aacccacaga cgagcctgtg ctttagcgaa tctatcccga ccccgtccaa ccgcgaagaa 900 acccaacaga agtctaacct ggaactgctg cgtatctctc tgctgctgat tcaatcctgg 960 ctggaaccgg ttcaatttct gcgtagcgtg tttgcgaact ctctggtgta tggcgcgtct 1020 gactctaacg tgtatgacct gctgaaagat ctggaagaag gcatccaaac tctgatgggc 1080 cgtctggagg acggctctcc acgtaccggc cagatcttta aacagaccta tagcaaattt 1140 gacaccaatt ctcacaacga tgatgcgctg ctgaaaaact atggcctgct gtattgcttc 1200 cgtaaagaca tggataaagt tgaaacgttc ctgcgcattg ttcagtgccg ttccgtggag 1260 ggctcctgcg gcttc 1275 <210> 87 <211> 425 <212> PRT <213> human <400> 87 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ser Val Val Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Tyr Gly Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser Ser Ala Thr Leu Ala Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Glu Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Ser Gly Ser Ala Pro Ala Pro Gly Ser Phe Pro Thr Ile Pro Leu 225 230 235 240 Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln 245 250 255 Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys 260 265 270 Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 275 280 285 Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys 290 295 300 Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp 305 310 315 320 Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val 325 330 335 Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu 340 345 350 Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 355 360 365 Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 370 375 380 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe 385 390 395 400 Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys 405 410 415 Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 420 425 <210> 88 <211> 648 <212> DNA <213> human <400> 88 gatattgtga tgacccagtc tccatcttcc gtgtctgcat ctgttggaga cagagtcacc 60 atcacttgtc gggcgagtca gaatattggc agctggttag cctggtatca gcagaaacca 120 ggtaacgccc ctaagttgtt gatctataga gcatccaatt tgcgaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagcg gcagtggctc tgggacagat ttcactctta ccatcagcag cctgcagcct 240 gaagatttcg caacttactt ttgtcaacag gctaccattt tccctctcac tttcggcgga 300 gggacccggg tggatatcaa acgttctaga gctgtggctg caccatctgt cttcatcttc 360 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcaacacc 540 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600 cagggcctga gttcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagagt 648 <210> 89 <211> 216 <212> PRT <213> human <400> 89 Asp Ile Val Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ala 1 5 10 15 Thr Ile Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Asp Ile Lys 20 25 30 Arg Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser 35 40 45 Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn 50 55 60 Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala 65 70 75 80 Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys 85 90 95 Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp 100 105 110 Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu 115 120 125 Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser Met Thr Gln 130 135 140 Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr 145 150 155 160 Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu 180 185 190 Arg Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu 210 215 <210> 90 <211> 1275 <212> DNA <213> human <400> 90 caggtgcagc tggtgcagtc agggggaggc ctggtcaggc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggact catattcagt aattatagca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg ggctggagtg ggtctcatca ataagtagtg ctggtagtta caaatactac 180 acagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa gtcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agtcgacgac acggccgtct attactgtgc aagaggggac 300 tatgatacgg gcatggagcc ctggggccaa ggcaccatgg tcaccgtctc ctcatcggcc 360 acattggccg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 660 gttgagccca aatcttgtgg ttctgcacca gctcctggat cttttccgac cattccgctg 720 agccgcctgt tcgataacgc gatgctgcgc gcccaccgcc tgcatcaact ggcctttgat 780 acctatcagg agtttgagga agcgtacatc ccgaaggaac agaaatattc ttttctgcag 840 aacccacaga cgagcctgtg ctttagcgaa tctatcccga ccccgtccaa ccgcgaagaa 900 acccaacaga agtctaacct ggaactgctg cgtatctctc tgctgctgat tcaatcctgg 960 ctggaaccgg ttcaatttct gcgtagcgtg tttgcgaact ctctggtgta tggcgcgtct 1020 gactctaacg tgtatgacct gctgaaagat ctggaagaag gcatccaaac tctgatgggc 1080 cgtctggagg acggctctcc acgtaccggc cagatcttta aacagaccta tagcaaattt 1140 gacaccaatt ctcacaacga tgatgcgctg ctgaaaaact atggcctgct gtattgcttc 1200 cgtaaagaca tggataaagt tgaaacgttc ctgcgcattg ttcagtgccg ttccgtggag 1260 ggctcctgcg gcttc 1275 <210> 91 <211> 425 <212> PRT <213> human <400> 91 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ile Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ala Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Asp Thr Gly Met Glu Pro Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser Ser Ala Thr Leu Ala Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Glu Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Cys Gly Ser Ala Pro Ala Pro Gly Ser Phe Pro Thr Ile Pro Leu 225 230 235 240 Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln 245 250 255 Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys 260 265 270 Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 275 280 285 Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys 290 295 300 Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp 305 310 315 320 Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val 325 330 335 Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu 340 345 350 Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 355 360 365 Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 370 375 380 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe 385 390 395 400 Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys 405 410 415 Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 420 425 <210> 92 <211> 648 <212> DNA <213> human <400> 92 gagctcgagc tcgtgtcgac gcagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt gggagacaga 60 gtcaccatta cttgccgggc aagtcagagc attagcaggt atttaaattg gtatcagcag 120 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggtgcat ccagattaga aagtggggtc 180 ccatcaaggt tcagtggcag tggttctggg acagacttca ctctcaccat caacagcctg 240 caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagagtt acagtacccc tctaactttt 300 ggccagggga cccgagtcga aattaaacgt gctgtggctg caccatctgt cttcatcttc 360 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcaacacc 540 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600 cagggcctga gttcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgt 648 <210> 93 <211> 216 <212> PRT <213> human <400> 93 Glu Leu Val Ser Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys Arg Ser Arg Thr Val 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 145 150 155 160 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 94 <211> 1275 <212> DNA <213> human <400> 94 caggtgcagc tggtgcagtc agggggaggc ctggtcaggc cgggggggtc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctctggact catattcagt aattatagca tgaactgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg ggctggagtg ggtctcatca ataagtagtg ctggtagtta caaatactac 180 acagactcag tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa gtcactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgag agtcgacgac acggccgtct attactgtgc aagaggggac 300 tatgatacgg gcatggagcc ctggggccaa ggcaccatgg tcaccgtctc ctcatcggcc 360 acattggccg cctccaccaa gggcccatcg gtcttccccc tggcaccctc ctccaagagc 420 acctctgggg gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg actacttccc cgaaccggtg 480 acggtgtcgt ggaactcagg cgccctgacc agcggcgtgc acaccttccc ggctgtccta 540 cagtcctcag gactctactc cctcagcagc gtggtgaccg tgccctccag cagcttgggc 600 acccagacct acatctgcaa cgtgaatcac aagcccagca acaccaaggt ggacaagaga 660 gttgagccca aatctagtgg ttctgcacca gctcctggat cttttccgac cattccgctg 720 agccgcctgt tcgataacgc gatgctgcgc gcccaccgcc tgcatcaact ggcctttgat 780 acctatcagg agtttgagga agcgtacatc ccgaaggaac agaaatattc ttttctgcag 840 aacccacaga cgagcctgtg ctttagcgaa tctatcccga ccccgtccaa ccgcgaagaa 900 acccaacaga agtctaacct ggaactgctg cgtatctctc tgctgctgat tcaatcctgg 960 ctggaaccgg ttcaatttct gcgtagcgtg tttgcgaact ctctggtgta tggcgcgtct 1020 gactctaacg tgtatgacct gctgaaagat ctggaagaag gcatccaaac tctgatgggc 1080 cgtctggagg acggctctcc acgtaccggc cagatcttta aacagaccta tagcaaattt 1140 gacaccaatt ctcacaacga tgatgcgctg ctgaaaaact atggcctgct gtattgcttc 1200 cgtaaagaca tggataaagt tgaaacgttc ctgcgcattg ttcagtgccg ttccgtggag 1260 ggctcctgcg gcttc 1275 <210> 95 <211> 425 <212> PRT <213> human <400> 95 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Ile Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Ala Gly Ser Tyr Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Asp Thr Gly Met Glu Pro Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Met Val Thr Val Ser Ser Ser Ala Thr Leu Ala Ala Ser Thr Lys Gly 115 120 125 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Glu Gly 130 135 140 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 145 150 155 160 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 165 170 175 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 180 185 190 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 195 200 205 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 210 215 220 Ser Ser Gly Ser Ala Pro Ala Pro Gly Ser Phe Pro Thr Ile Pro Leu 225 230 235 240 Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln 245 250 255 Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys 260 265 270 Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe 275 280 285 Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys 290 295 300 Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp 305 310 315 320 Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val 325 330 335 Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu 340 345 350 Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg 355 360 365 Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser 370 375 380 His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe 385 390 395 400 Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys 405 410 415 Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe 420 425 <210> 96 <211> 648 <212> DNA <213> human <400> 96 gagctcgagc tcgtgtcgac gcagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt gggagacaga 60 gtcaccatta cttgccgggc aagtcagagc attagcaggt atttaaattg gtatcagcag 120 aaaccaggga aagcccctaa gctcctgatc tatggtgcat ccagattaga aagtggggtc 180 ccatcaaggt tcagtggcag tggttctggg acagacttca ctctcaccat caacagcctg 240 caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagagtt acagtacccc tctaactttt 300 ggccagggga cccgagtcga aattaaacgt gctgtggctg caccatctgt cttcatcttc 360 ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 420 ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 480 tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcaacacc 540 ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 600 cagggcctga gttcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagagt 648 <210> 97 <211> 216 <212> PRT <213> human <400> 97 Glu Leu Val Ser Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys Arg Ser Arg Thr Val 100 105 110 Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys 115 120 125 Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg 130 135 140 Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn 145 150 155 160 Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser 165 170 175 Leu Ser Asn Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys 180 185 190 Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr 195 200 205 Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Ser 210 215

Claims (12)

  1. 중쇄 불변 1 도메인(CH1 도메인) 내 경쇄와 중쇄 도메인의 S-S 결합에 사용되는 아미노산인 시스테인, 경쇄 불변 도메인(CκL 도메인) 내 경쇄와 중쇄 도메인의 S-S 결합에 사용되는 아미노산인 시스테인, 또는 중쇄 불변 1 도메인(CH1 도메인) 내 경쇄와 중쇄 도메인의 S-S 결합에 사용되는 아미노산인 시스테인 및 경쇄 불변 도메인(CκL 도메인) 내 경쇄와 중쇄 도메인의 S-S 결합에 사용되는 아미노산인 시스테인은 결실되거나 시스테인 외의 다른 아미노산 잔기로 치환되고; 생리활성 이펙터(effector) 모이어티(moiety)는 단백질 또는 (폴리)펩타이드이며; 혈청 알부민 결합 단편 및 생리활성 이펙터(effector) 모이어티는 유전공학적 수단에 의한 융합에 의해 공유결합되어 있는, 혈청 알부민 결합 단편 및 생리활성 이펙터(effector) 모이어티를 포함하는 융합 작제물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 혈청 알부민 결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티는 0 내지 20 아미노산의 펩타이드 링커를 이용한 유전적 융합에 의해 공유 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 융합 작제물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 생리활성 이펙터 모이어티는 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장 인자, 전사 인자, 혈액 인자, 백신, 구조 단백질, 리간드 단백질 및 수용체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 융합 작제물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 생리활성 이펙터 모이어티는 인간 성장 호르몬(hGH), 성장 호르몬 방출 호르몬(GHRH), 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론(IFNs), 인터페론 수용체, 콜로니 자극 인자(CSFs), 과립구-군락 자극 인자(GCSFs), 글루카곤-유사 펩타이드, G-단백질-결합 수용체, 인터루킨, 인터루킨 수용체, 효소, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 대식세포 활성 인자, 대식세포 펩타이드, B 세포 인자, T 세포 인자, 단백질 A, 알러지 저해제, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림프독소, 종양 괴사 인자, 종양 억제제, 암전이 성장 인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, 알파-락트알부민, 아포리포단백질-E, 에리트로포이에틴, 고도로 당화된 에리트로포이에틴, 안지오포이에틴, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 XIII, 플라스미노겐 활성 인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나아제, 스트렙토키나아제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 저해제, 콜라게나아제 저해제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오 펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩티드, 가스트린 방출 펩티드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 융합 작제물.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 생리활성 이펙터 모이어티는 인간 성장 호르몬(hGH), 과립구-군락 자극 인자(GCSFs) 또는 인터페론(IFNs)인 것을 특징으로 하는 융합 작제물.
  6. 제 1항에 있어서,
    혈청 알부민 결합 단편에 대한 생리활성 (폴리)펩타이드 또는 단백질의 몰 비율은 1:1 내지 10:1인 것을 특징으로 하는 융합 작제물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 시스테인 외의 다른 아미노산 잔기가 세린인 융합 작제물.
  8. 제 6항에 있어서,
    혈청 알부민 결합 단편에 대한 생리활성 (폴리)펩타이드 또는 단백질의 몰 비율은 1:1 내지 4:1인 것을 특징으로 하는 융합 작제물.
  9. (a) 1차 핵산 서열 및 2차 핵산 서열과 기능적으로 연결되어 있는 프로모터, (b) 혈청 알부민 결합 단편을 암호화하는 1차 핵산 서열 및 (c) 링커 및 생리활성 (폴리)펩타이드 또는 단백질을 암호화하는 2차 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터를 대장균(E. coli) 내로 도입하는 것을 포함하는, 대장균(E. coli)의 주변세포질 내 생리활성 (폴리)펩타이드 또는 단백질의 수용액에서의 발현을 증가시키는 방법으로서,
    상기 혈청 알부민 결합 단편이 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변 도메인(VH 도메인); 및 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변 도메인(VL 도메인)을 포함하며, 중쇄 불변 1 도메인(CH1 도메인) 내 경쇄와 중쇄 도메인의 S-S 결합에 사용되는 아미노산인 시스테인, 경쇄 불변 도메인(CκL 도메인) 내 경쇄와 중쇄 도메인의 S-S 결합에 사용되는 아미노산인 시스테인, 또는 중쇄 불변 1 도메인(CH1 도메인) 내 경쇄와 중쇄 도메인의 S-S 결합에 사용되는 아미노산인 시스테인 및 경쇄 불변 도메인(CκL 도메인) 내 경쇄와 중쇄 도메인의 S-S 결합에 사용되는 아미노산인 시스테인은 결실되거나 세린 잔기로 치환되는 것을 특징으로 하는, 대장균(E. coli)의 주변세포질 내 생리활성 (폴리)펩타이드 또는 단백질의 수용액에서의 발현을 증가시키는 방법.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 대장균은 SUPEX5(KCTC12657BP)인 것을 특징으로 하는, 대장균의 주변세포질 내 생리활성 (폴리)펩타이드 또는 단백질의 수용액에서의 발현을 증가시키는 방법.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 생리활성 (폴리)펩타이드 또는 단백질은 호르몬, 사이토카인, 효소, 항체, 성장 인자, 전사 인자, 혈액 인자, 백신, 구조 단백질, 리간드 단백질 및 수용체로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 대장균(E. coli)의 주변세포질 내 생리활성 (폴리)펩타이드 또는 단백질의 수용액에서의 발현을 증가시키는 방법.
  12. 제 9항에 있어서,
    상기 생리활성 (폴리)펩타이드 또는 단백질은 인간 성장 호르몬(hGH), 성장 호르몬 방출 호르몬(GHRH), 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론(IFNs), 인터페론 수용체, 콜로니 자극 인자(CSFs), 과립구-군락 자극 인자(GCSFs), 글루카곤-유사 펩타이드, G-단백질-결합 수용체, 인터루킨, 인터루킨 수용체, 효소, 인터루킨 결합 단백질, 사이토카인 결합 단백질, 대식세포 활성 인자, 대식세포 펩타이드, B 세포 인자, T 세포 인자, 단백질 A, 알러지 저해제, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림프독소, 종양 괴사 인자, 종양 억제제, 암전이 성장 인자, 알파-1 안티트립신, 알부민, 알파-락트알부민, 아포리포단백질-E, 에리트로포이에틴, 고도로 당화된 에리트로포이에틴, 안지오포이에틴, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈 수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 XIII, 플라스미노겐 활성 인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나아제, 스트렙토키나아제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 저해제, 콜라게나아제 저해제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오 펩틴, 연골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩티드, 가스트린 방출 펩티드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 대장균(E. coli)의 주변세포질 내 생리활성 (폴리)펩타이드 또는 단백질의 수용액에서의 발현을 증가시키는 방법.
KR1020150136164A 2013-08-30 2015-09-25 항-혈청 알부민에 대한 항원결합 단편-이펙터 모이어티 융합 작제물 및 이의 제조방법 KR20150118565A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130104112 2013-08-30
KR20130104112 2013-08-30

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140115673A Division KR101576561B1 (ko) 2013-08-30 2014-09-01 항-혈청 알부민에 대한 항원결합 단편-이펙터(effector) 모이어티 융합 작제물 및 이의 제조방법

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150118565A true KR20150118565A (ko) 2015-10-22

Family

ID=52586989

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140115673A KR101576561B1 (ko) 2013-08-30 2014-09-01 항-혈청 알부민에 대한 항원결합 단편-이펙터(effector) 모이어티 융합 작제물 및 이의 제조방법
KR1020150136164A KR20150118565A (ko) 2013-08-30 2015-09-25 항-혈청 알부민에 대한 항원결합 단편-이펙터 모이어티 융합 작제물 및 이의 제조방법

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020140115673A KR101576561B1 (ko) 2013-08-30 2014-09-01 항-혈청 알부민에 대한 항원결합 단편-이펙터(effector) 모이어티 융합 작제물 및 이의 제조방법

Country Status (17)

Country Link
US (2) US9879077B2 (ko)
EP (2) EP3039038B1 (ko)
JP (2) JP6422977B2 (ko)
KR (2) KR101576561B1 (ko)
CN (1) CN105899532B (ko)
AU (1) AU2014312456B2 (ko)
BR (1) BR112016004355A2 (ko)
CA (1) CA2922618C (ko)
DK (1) DK3039038T3 (ko)
ES (1) ES2866848T3 (ko)
HK (1) HK1223107A1 (ko)
MX (1) MX371328B (ko)
PH (1) PH12016500403A1 (ko)
PL (1) PL3039038T3 (ko)
RU (1) RU2661087C2 (ko)
UA (1) UA117493C2 (ko)
WO (1) WO2015030539A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210125847A (ko) * 2020-04-09 2021-10-19 주식회사 에이프릴바이오 고양이 과립구 집락 자극인자 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108623691B (zh) * 2017-03-17 2020-05-15 北京比洋生物技术有限公司 IgG样长效免疫融合蛋白及其应用
US20210340272A1 (en) * 2018-06-18 2021-11-04 Anwita Biosciences, Inc. Anti-mesothelin constructs and uses thereof
KR20210095781A (ko) 2020-01-24 2021-08-03 주식회사 에이프릴바이오 항원결합 단편 및 생리활성 이펙터 모이어티로 구성된 융합 컨스트럭트를 포함하는 다중결합항체 및 이를 포함하는 약학조성물
KR20220044057A (ko) * 2020-09-29 2022-04-06 주식회사 에이프릴바이오 인터루킨-18 결합 단백질 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질, 및 이의 용도
WO2023242251A1 (en) * 2022-06-15 2023-12-21 UCB Biopharma SRL Follistatin-fc fusion proteins
KR20240048577A (ko) * 2022-10-04 2024-04-16 주식회사 에이프릴바이오 난포자극 호르몬 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW517061B (en) * 1996-03-29 2003-01-11 Pharmacia & Amp Upjohn Ab Modified/chimeric superantigens and their use
US9321832B2 (en) * 2002-06-28 2016-04-26 Domantis Limited Ligand
ATE328906T1 (de) * 2002-06-28 2006-06-15 Domantis Ltd Dual-specifische liganden mit erhöhter halbwertszeit
GB0315450D0 (en) * 2003-07-01 2003-08-06 Celltech R&D Ltd Biological products
WO2005118642A2 (en) * 2004-06-01 2005-12-15 Domantis Limited Bispecific fusion antibodies with enhanced serum half-life
CN101031588A (zh) * 2004-06-01 2007-09-05 多曼蒂斯有限公司 药物组合物，融合物和结合物
AU2005334481A1 (en) * 2004-08-11 2007-01-25 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain fusion proteins
MX2007003907A (es) * 2004-10-05 2007-05-21 Genentech Inc Agentes terapeuticos con toxicidad reducida.
MX2007006602A (es) 2004-12-02 2007-12-10 Domantis Ltd Peptidos de dominio plad con vida media en suero aumentada debido a conjugacion con anticuerpos de dominio.
EP1860120B1 (en) * 2005-02-08 2018-01-24 The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute Method for improving antibody
US20090042254A1 (en) * 2007-06-08 2009-02-12 Dow Global Technologies Inc. Expression of soluble antibody fragment by truncation of ch1 domain
CN101842387B (zh) * 2007-09-26 2014-05-07 Ucb医药有限公司 双特异性抗体融合物
JP5639039B2 (ja) * 2008-04-11 2014-12-10 メリマック ファーマシューティカルズ インコーポレーティッド ヒト血清アルブミンリンカーおよびそのコンジュゲート
CN105601745B (zh) * 2008-09-26 2020-09-08 Ucb医药有限公司 生物产品
CN102307897B (zh) * 2008-12-05 2016-01-20 葛兰素集团有限公司 选出蛋白酶抗性多肽的方法
CN102612376A (zh) * 2009-08-06 2012-07-25 诺沃-诺迪斯克保健股份有限公司 具有延长的体内功效的生长激素
GB201005063D0 (en) * 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
US20120276098A1 (en) * 2009-09-30 2012-11-01 Bruce Hamilton Drug fusions and conjugates with extended half life
US8846042B2 (en) * 2011-05-16 2014-09-30 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific FAB fusion proteins and methods of use
DK2776466T3 (da) * 2011-11-11 2017-11-20 Ucb Biopharma Sprl Albuminbindende antistoffer og bindingsfragmenter deraf

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20210125847A (ko) * 2020-04-09 2021-10-19 주식회사 에이프릴바이오 고양이 과립구 집락 자극인자 및 혈청 알부민에 대한 항원 결합 단편을 포함하는 융합 단백질 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
DK3039038T3 (da) 2021-02-08
JP6422977B2 (ja) 2018-11-14
EP3039038B1 (en) 2020-11-25
EP3632930A1 (en) 2020-04-08
BR112016004355A2 (pt) 2017-10-17
MX2016002539A (es) 2016-10-13
US9879077B2 (en) 2018-01-30
UA117493C2 (uk) 2018-08-10
US20180030127A1 (en) 2018-02-01
AU2014312456B2 (en) 2017-07-06
CA2922618C (en) 2020-04-28
JP2018172391A (ja) 2018-11-08
JP6800180B2 (ja) 2020-12-16
EP3039038A4 (en) 2017-07-05
MX371328B (es) 2020-01-27
KR20150026997A (ko) 2015-03-11
WO2015030539A1 (en) 2015-03-05
US10618953B2 (en) 2020-04-14
US20160376350A1 (en) 2016-12-29
HK1223107A1 (zh) 2017-07-21
EP3039038A1 (en) 2016-07-06
ES2866848T3 (es) 2021-10-19
CN105899532B (zh) 2021-10-08
JP2016528922A (ja) 2016-09-23
KR101576561B1 (ko) 2015-12-10
RU2016105586A (ru) 2017-10-04
AU2014312456A1 (en) 2016-03-03
CA2922618A1 (en) 2015-03-05
RU2661087C2 (ru) 2018-07-11
PH12016500403A1 (en) 2016-05-16
PL3039038T3 (pl) 2021-04-19
CN105899532A (zh) 2016-08-24
AU2014312456A8 (en) 2016-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101576561B1 (ko) 항-혈청 알부민에 대한 항원결합 단편-이펙터(effector) 모이어티 융합 작제물 및 이의 제조방법
KR102271204B1 (ko) 다중특이적 항체 작제물
JP5647222B2 (ja) Ｉｌ−６ｒ関連疾患及び障害の治療のためのｉｌ−６ｒに指向性を有する改善されたアミノ酸配列及びこれを含むポリペプチド
AU2006254333B2 (en) Anti-IL2 antibodies
EP2441838A2 (en) Fusion proteins that contain natural junctions
CN108610421B (zh) Cx3cr1结合多肽
EP2838920B1 (en) Anti-baff-anti-il-17 bispecific antibodies
JP2011523550A (ja) Ｃｘｃｒ４及び他のｇｐｃｒに指向性を有するアミノ酸配列及びそれを含む化合物
JP2009523459A (ja) 天然の連結部を含有する融合タンパク質
CA3075367A1 (en) Specific binding molecules
IL262111B2 (en) Monovalent inhibitors of hutnfr1 interaction
CN118119645A (zh) 双功能融合蛋白及其用途
CN116554343A (zh) 一种长效重组人生长激素及其应用
OA17072A (en) CX3CR1-binding polypeptides.

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application