JP2002515230A - ベロ毒素iiを認識するヒト型化抗体、および該抗体を産生する細胞株 - Google Patents
ベロ毒素iiを認識するヒト型化抗体、および該抗体を産生する細胞株Info
- Publication number
- JP2002515230A JP2002515230A JP2000549293A JP2000549293A JP2002515230A JP 2002515230 A JP2002515230 A JP 2002515230A JP 2000549293 A JP2000549293 A JP 2000549293A JP 2000549293 A JP2000549293 A JP 2000549293A JP 2002515230 A JP2002515230 A JP 2002515230A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- humanized
- verotoxin
- humanized antibody
- light chain
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1228—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K16/1232—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia from Escherichia (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Description
ロナール抗体技術との結合に関し、さらに詳細には、例えばベロ毒素II(VT2
)抗原、ベロ毒素II変種抗原(VT2V)に対して特異的な非免疫原性(ヒトに
おいて)免疫グロブリンの生産法、および同法のインビトロおよびインビボ使用
法に関する。本発明は、特にVT2およびVT2Vを中和可能なVT2に対する
ヒト型化モノクロナール抗体、同抗体をコードするポリヌクレオチド配列、同抗
体の生産法、同抗体を活性成分として含む薬剤組成物、同抗体を活性成分として
含む、ベロ毒素生産性大腸菌(VTEC)感染および溶血性尿毒症症候群(HU
S)治療用薬剤、ならびにそのような疾患の治療法に関する。
はベロ毒素生産性大腸菌(VTEC)感染において、出血性下痢をまねいたり、
また溶血性尿毒症症候群を引き起こすことが知られている。VTEC感染をまね
く病因のひとつに、有毒な大腸菌0157がある。VTはまた、VTEC感染を
引き起こす細菌以外のものによって産生されることがある。その場合もヒトに毒
性症状を引き起こすことがある。免疫反応の低下した小児や老人の場合、腸で生
育している細菌によって生産されるVTが、腸の上皮細胞を破壊することによっ
て血流中に入ることがある。これが溶血性尿毒症症候群(HUS)を誘発する可
能性がある。この症状は腎臓機能不全や、場合によって脳損傷を起こす特徴をも
つ(例えば、Karmali, M等、The Lancet, 1, 619-620 (1983)、Siegler, R., Th e Journal of Pediatrics , 125, 511-518 (1994) 参照)。現在まで上記有毒症
状に対する有効な薬は存在しない。抗生物質はこの有毒症状の進行を防ぐ効力を
示していない(例えば、Carter, A等、The New England Journal of Medicine,
316, 1497-1500 (1987), Griffen, P.等、Annals of Internal Medicine, 109,
705-712 (1988) 参照)。これは抗生物質に殺された細菌からVTが放出される
ためかも知れないし、また抗生物質がVTに対して無効なためかも知れない。
1またはSLT−1)と、ベロ毒素II(VT2またはSLT−2)である(O’r
ien等、Curr. Top. Microbiol. Immunol., 180, 65-94 (1992) 参照)。VT2
生産性大腸菌は、VTEC感染症を患っている患者から分離された。(Russmann
等、J. Med. Microbiol., 40 (5), 338-343 (1994) 参照)。Ostroff等、J. Inf ect. Dis . 160, 994-998 (1989)、およびKleanthous等、Arch. Dis. child. 65,
722-727 (1990)は、VT2を含むがVT1は含まない大腸菌0157株の方が
HUSと相関する場合が多いことを報告している。この他にも臨床的に分離され
たVT2変種(VT2V)がある。(例えば、Microb. Pathog., 8, 47-60 (199
0), FFBS Lett., 79, 27-30 (1991)、Microb. Pathog., 5, 419-426 (1988)、お
よびJ. Bacteriol., 170, 4223-4230 (1988) 参照)。Armstrong等J. Infect. D is. , 171 (4), 1042-1045 (1995) によれば、臨床治験においてVT吸収剤を試
験したところ、この薬物は腸管では働くものの血流に達したVTを吸収するため
には用いることができなかった。γ‐グロブリン製剤は、VT1に対する作用と
比較するとVT2に対しては極めて低い中和活性しか示さなかった(Ashkenazi,
S.等、The Journal of Pediatrics, 113, 1008-1014 (1988)、Morooka, T.等、 Acta Pediatrica Japonica , 38, 294-295 (1996))。VT2を中和するマウスモ
ノクロナール抗体が従来から報告されている。しかしながら、この抗体はVT2
Vに対しては比較的低い結合親和性しか示さないことが報告されている(Schmit
t, C.等、Infection and Immunity, 59, 1065-1073 (1991))。
、特にその治療処方が繰り返される場合には次のような欠点がある。例えばマウ
スモノクロナール抗体の半減期は人体では短くなり、またヒトに使用した場合、
他の重要な免疫グロブリン機能特性を欠如する傾向がある。
となる多くのアミノ酸配列を含んでいる。外来性抗体の注入後、その注入された
抗体に対して患者の誘起する免疫反応が強烈であって、初回投与後の同抗体の治
療効果をほとんど取り去ってしまうことがあることは、既に多くの研究が示して
いる。さらに、マウスやその他の(ヒトに対して)抗原性のモノクロナール抗体
を各種ヒトの疾患の治療に使用した場合、無関係のマウス抗体による爾後の治療
が交差反応性のために無効となったり、場合によって危険なものになる可能性が
ある。
もの)は幾分か成功を実証したけれども、相当な免疫原性をもつという問題は依
然として残っている。一般に多くの抗原に対するのと同様に、VT2抗原に対し
ても高い親和性をもって反応するヒト免疫グロブリンを生産することは、通常の
ヒトモノクロナール抗体生産法を用いたのでは極めて難しい。
その他の用法に好適であるように、簡単かつ経済的に生産することのできるVT
2抗原特異的なヒト型化免疫グロブリンの改良型が求められている。本発明はこ
うした需要およびその他の需要を満たすものである。
化抗体を提供する。この抗体のあるものは、VT2のBサブユニットおよび/ま
たはVT2変種のBサブユニットに特異的に結合する。この抗体のあるものは、
VT2および/またはVT2変種を中和する。好ましい抗体は、VT2またはV
T2変種のLD50値の10倍量を投与したマウスまたは他の哺乳動物に対して、
少なくとも50%、75%、95%、または100%の保護を与える程度に、V
T2および/またはVT2変種を中和する。
鎖可変領域が図1(A)に示すものであるマウス抗体VTm1−1をヒト型化し
たものである。
マウス抗体VTm1−1と競合する抗体を提供する。
来の相補性決定領域と、ヒトGF4抗体重鎖・軽鎖枠組み領域由来の重鎖・軽鎖
可変領域枠組み領域とを含み、L49、H29、H30、H49、およびH98
からなる群から選ばれた少なくともひとつの位置がマウスVTm1−1抗体の重
鎖または軽鎖可変領域枠組み領域の等価的位置に存在するアミノ酸残基によって
占められたものである。このようなヒト型化抗体は、107M-1からマウスVT
m1−1抗体の親和性の3、5、または10倍の親和定数をもってベロ毒素IIに
特異的に結合する。
H49、およびH98からなる群から選ばれた各位置は、マウスVTm1−1抗
体重鎖、または軽鎖可変領域枠組み領域の等価位置に存在するアミノ酸残基によ
って占められている。
、L85、H1、H4、H5、H79、H89、およびH93からなる群から選
ばれた少なくともひとつの位置が、ヒト抗体の重鎖または軽鎖共通配列の等価位
置に存在するアミノ酸残基によって占められている。
L79、L85、H1、H4、H5、H79、H89、およびH93からなる群
から選ばれたそれぞれの位置が、ヒト抗体の重鎖または軽鎖共通配列の等価位置
に存在するアミノ酸残基によって占められている。
、図2(B)に示した軽鎖可変領域とを含む。ここで、L49、H29、H30
、H49、H98、L3、L4、L19、L76、L85、H1、H4、H5、
H79、H89、およびH93からなる群から選ばれたひとつ以上の位置が、第
2表、第3表に示すように置換されていてもよい。
B)に示す軽鎖可変領域とを含む。
とも85%相同な配列のヒト型化重鎖と、図2(B)に示したヒト型化軽鎖と少
なくとも85%相同な配列のヒト型化軽鎖であってもよい。ただしここに、L4
9、H29、H30、H49、およびH98からなる群から選ばれた少なくとも
ひとつの位置が、マウスVTm1−1抗体の重鎖または軽鎖可変領域枠組み領域
の等価的位置に存在するアミノ酸残基によって占められていなければならない。
て各鎖は一つの可変領域と一つの定常部とを含む。
ある。
ある。
前述の抗体のいずれかの重鎖および軽鎖をコードする塩基配列を含み、それによ
ってヒト型化抗体を発現することが可能な細胞株を培養し、その細胞株によって
発現されるヒト型化抗体を回収することからなる。この方法のあるものは、さら
に抗体を製薬学的に許容可能な担体と混ぜて製剤組成物を生産することを含む。
組成物を提供する。好ましいそのような組成物は、図2(A)に示した重鎖可変
領域と図2(B)に示した軽鎖可変領域を含むヒト型化抗体である。本発明はさ
らに、ベロ毒素による作用を被っている、または被る危険のある患者の治療用薬
剤を製造するための前記いずれかの抗体の使用法を提供する。
者の治療法であって、同患者に対してベロ毒素IIおよび/またはベロ毒素II変種
に特異的に結合するヒト抗体またはヒト型化抗体の有効量を投与することをから
なる治療法を提供する。この方法のあるものにおいては、前記抗体はベロ毒素II
またはベロ毒素II変種に対する特異的結合についてマウス抗体VTm1−1と競
合する。この方法のあるものにおいては、前記ヒト型化抗体は、VT2および/
またはVT2変種と特異的に結合する。この方法のあるものにおいては、前記ヒ
ト型化抗体は、VT2および/またはVT2変種のBサブユニットと特異的に結
合する。この方法のあるものにおいては、前記ヒト型化抗体は、VT2および/
またはVT2変種と特異的に結合し、VT2および/またはVT2変種を中和す
る。この方法のあるものにおいては、前記ヒト型化抗体は、VT2のBサブユニ
ットおよび/またはVT2変種のBサブユニットに特異的に結合し、VT2およ
び/またはVT2変種を中和する。この方法のあるものにおいては、前記抗体は
マウスVTm1−1抗体をヒト型化したヒト型化抗体である。この方法のあるも
のにおいては、前記抗体は図2(A)に示す重鎖可変領域と、第2B図に示す軽
鎖可変領域を含むヒト型化抗体である。この方法のあるものにおいては、患者は
ベロ毒素生産性大腸菌に感染しており、同抗体が治療剤として投与される。この
方法のあるものにおいては、患者はベロ毒素生産性大腸菌による感染の危険があ
り、同抗体が予防的に投与される。この方法のあるものはさらに、ベロ毒素IIま
たはベロ毒素II変種の毒作用からの回復に関して患者を観察することを含む。
細胞株を提供する。
(HUS)治療に有用な新規組成物、すなわちVT2抗原のBサブユニットに特
異的に結合し、それによってVT2およびVT2変種を中和することの可能なヒ
ト型化免疫グロブリンを含む組成物を提供する。前記免疫グロブリンは、2対の
軽鎖・重鎖複合体であって、少なくとも一鎖はヒト枠組み領域と機能的に接合し
た1個以上のマウス相補性決定領域を含んでいてもよい。例えばマウス相補性決
定領域であるが、これはもともとある付加的マウスアミノ酸残基を含んでいても
いなくてもよいが、同決定領域をヒト枠組み領域に導入して約107M-1よりも
高い親和性レベルで前記抗原に結合することのできるヒト型化免疫グロブリンを
生産することが可能である。このヒト型化免疫グロブリンはさらに、VT2に対
するCDR供与性マウスモノクロナール抗体の結合を阻止することが可能である
。
ロブリンは、好ましくは骨髄腫細胞やハイブリドーマ細胞のような不死化された
真核細胞を形質転換して最終的に発現させることを含む、各種DNA組み換え法
により簡単に生産できる。ヒト型化免疫グロブリン枠組み領域をコードする第一
配列と、所期の免疫グロブリン相補性決定領域をコードする第二配列組を含むポ
リヌクレオチドは、合成することにより、または適当なcDNAやゲノムDNA
断片と結合することによって生産できる。
溶血性尿毒症症候群(HUS)罹患時に発生するものと同様の、VT2またはV
T2Vの毒作用による疾患を治療する際に、実質的に純粋な形で用いることも可
能である。ヒト型化免疫グロブリンまたはその複合体は、投与方式に応じて変わ
る製薬学的に許容可能な剤形として調製することが可能である。
DNAまたはヒト型化免疫グロブリンのアミノ酸配列)の場合において、「実質
的に同一」という文言は、下記の配列比較法および/または目視検査による測定
において最大の一致を得るように比較、整列させた場合、少なくとも80%、さ
らに好ましくは85%、90−95%もしくはそれ以上のヌクレオチドまたはア
ミノ酸残基の相同性を有する二つ以上の配列もしくは部分配列をいう。このよう
な「実質的に同一な」配列は、通常、相同的と判断される。できればその「実質
的同一性」は、配列のうちの少なくともその長さが約50残基の領域に渡って存
在すること、さらには少なくとも100残基の領域に渡って存在することが好ま
しい。最も好ましくはそれらの配列が少なくとも約150残基に渡って、または
比較される二つの配列の全長に渡って、実質的に同一であることである。後述す
るように、二つの抗体配列はKabatの残基番号割り当て法に従えば、あるひとつ
の方法でしか並べることができない。したがって抗体の場合、相同性パーセント
は一意的で明確な意味をもつ。
れHxおよびLxと命名される。ここに、xはKabatの「Sequences of Proteins
of Immunological Interest」命名法(国立保健研究所、ベセスダ、メリーラン
ド州、1987年および1991年)によってアミノ酸の位置を指定する数である。Kaba
tは各サブグループについて、たくさんの抗体アミノ酸配列をリストし、かつそ
のサブグループの中の各残基位置について共通配列を構成する最も一般的なアミ
ノ酸をリストした。Kabatは、リストされた配列中の各アミノ酸に残基番号を割
り当てる方法を用いているが、この残基番号割り当て法は、この分野における標
準法になっている。Kabatの方法は、彼の配列集に収録されていない他の抗体に
も拡張可能である。すなわち、保存されたアミノ酸を参照しながらKabatの共有
配列のひとつに問題とする抗体を揃えることによってそれが可能である。例えば
ヒト抗体のL50位置のアミノ酸は、マウス抗体のL50のアミノ酸と等価な位
置を占める。
。例えば脂肪族側鎖をもつアミノ酸グループはグリシン、アラニン、バリン、ロ
イシン、およびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖をもつアミノ酸グ
ループはセリンとスレオニンであり、アミドを含む側鎖をもつアミノ酸グループ
はアスパラギンとグルタミンであり、芳香族側鎖をもつアミノ酸グループはフェ
ニルアラニン、チロシン、トリプトファンであり、塩基性側鎖をもつアミノ酸グ
ループはリジン、アルギニン、ヒスチジンであり、硫黄を含む側鎖をもつアミノ
酸グループはシスティンとメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換体グ
ループはバリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジ
ン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
保有性に関してスクリーニングを実施することができる。例えばそのような方法
は、Cesareni, FEBS Lett 307:66-70 (1992); Swimmer等、Proc. Natl. Acad. S ci. USA 89: 3756-60 (1992); Gram等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576-
80 (1992); Clackson等、Nature 352: 624-8 (1991); Scott & Smith, Science
249: 386-90 (1990); Garrad等、Bio/Techniques 9: 1373-1377 (1991) に記載
されている。これらを引用することによってその全体をすべての目的に渡って本
明細書に含める。
なわち、モル比としてその目的種が組成中の他のどの種よりも多量であること)
、望ましくは実質的に精製された分画が、その目的種が存在するすべての巨大分
子種の少なくとも約50%(モル比として)を含む組成であることが好ましい。
一般には、実質的に純粋な組成物は、同組成物中に存在するすべての巨大分子種
の約80から90%以上を含む。最も好ましくは、目的種は事実上の均一性にま
で精製され(混入種が通常の検出法ではその組成物中に検出されない)、同組成
物は事実上単一種の巨大分子からなる。
体の特異的結合が抑制される程度を定量することによって求められる。各種の競
合的結合による定量法が知られている。例えば固相直接または間接ラジオイムノ
アッセー(RIA)、サンドイッチ競合定量法(Stahl等、 Methods in Enzymol ogy 9: 242-253 (1983) 参照)、固相直接ビオチン・アビジンEIA (Kirklan
d等、J. Immunol. 137: 3614-3619 (1986) 参照)、固相直接標識定量法、固相
直接標識サンドイッチ定量法(HarlowおよびLane著、「Antibodies, A Laborato
ry Manual」、Cold Spring Harbor Press (1988) 参照)、I−125ラベルに
よる固相直接標識RIA(Morel等、Molec. Immunol. 25 (1): 7-15 (1988) 参
照)、固相直接ビオチン・アビジンEIA(Cheung等、Virology 176: 546-552
(1990) 参照)、および直接標識RIA(Moldenhauer等、Scand. J. Immunol. 3
2: 77-82 (1990))である。通常、試験免疫グロブリンは過量に存在する。競合
定量法によって特定される抗体(競合抗体)は、参照抗体と同じエピトープに結
合する抗体および立体障害を起こさせるのに十分なほど参照抗体の結合するエピ
トープに近いエピトープに結合する抗体を含む。通常、競合性抗体が過量に存在
する場合、同抗体は指定の抗原標的に対する参照抗体の特異的結合を少なくとも
50ないし75%抑制する。
化免疫グロブリンが提供される。この免疫グロブリンはVT2のBサブユニット
に対して、少なくとも約107 M-1から1010 M-1の結合親和性をもち、また
好ましくは108 M-1から1010 M-1、またはそれ以上の結合親和性をもつも
のであるが、このものは例えばVT2およびVT2V(VT2抗原)の毒性を中
和することができる。かかるヒト型化免疫グロブリンは、ヒトの枠組み領域をも
ち、かつ免疫グロブリン、特にマウス免疫グロブリン由来のVT2抗原と特異的
に反応する1個以上の相補性決定領域(CDR)をもつ。ある好ましい実施態様
では、1個以上のCDRがMuVTm1.1抗体から得られる。したがって本発
明の免疫グロブリンは経済的に大量に生産することが可能であるが、例えばヒト
の患者におけるベロ毒素生産性大腸菌(VTEC)感染および溶血性尿毒症症候
群(HUS)の中毒症状を処置する際に、さまざまの方法で用いられる。
各対が1本の「軽」鎖(約25kD)と1本の「重」鎖(約50−70kD)を
もつ、二対の同一ポリペプチド鎖からなる。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原
認識にあずかる約100から110以上のアミノ酸からなる可変領域を含む。各
鎖のカルボキシル末端部分は、主にエフェクター機能に与る定常部にあたる。
ァ、デルタ、またはイプシロンに分類され、それぞれIgG、IgM、IgA、
IgD、およびIgEという抗体アイソタイプを定める。軽鎖と重鎖の内部にお
いて、可変領域と定常部は”J”領域と約12個以上のアミノ酸によって接合さ
れるが、重鎖はさらに”D”領域ま たは約10個以上のアミノ酸を含む(全般的に、Paul, W. 編、「Fundamental Im
munology」、第7章、131-166、Raven Press, N.Y. (1984)参照。引用することに
よって本文献を本明細書に含める)。
個の超可変域によって接合される比較的保存された枠組み領域からなる同様な一
般的構造を示す。この超可変域は、別に相補性決定域またはCDRとも呼ばれる
(Kabat等著「Sequences of Proteins of Immunological Interest」、米国厚生
省、1987年)およびChotiaとLesk, J. Mol. Biol., 196, 901-917 (1987)参照。
引用することによって本文献を本明細書に含める)。各対の二本鎖由来のCDR
は枠組み領域によって揃えられ、これにより特定のエピトープに結合することが
可能になる。
ン遺伝子によってコードされる1個以上のポリペプチドからなる蛋白をさす。既
知の免疫グロブリン遺伝子は、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イ
プシロン、およびミュー定常部遺伝子と、それと同時に莫大な数の免疫グロブリ
ン可変領域遺伝子とを含む。免疫グロブリンは、抗体の他にもさまざまな形態に
おいて存在する。そのような形態としては、例えばFv、Fab、およびF(a
b’)2や、二重機能性ハイブリッド抗体(Lanzavecchia等、Eur. J. Immunol.
17, 105 (1987) 参照)や、単一鎖(例えば、Huston等、Proc. Natl. Acad. Sci . U.S.A. , 85, 5879-5883 (1988)、およびBird等、Science 242, 423-426 (1988
) を参照。引用することによってこれらの文献を本明細書に含める)。(全般的
には、Hood等著、「Immunology」, Benjamin, N.Y., 2版、1984年、Harlow and La
ne著、「Antibodies. A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory (
1988) およびHunkapillerとHood, Nature, 323, 15-16 (1986) を参照。引用す
ることによってこれらの文献を本明細書に含める)。
種に属する免疫グロブリン遺伝子セグメントから構築された抗体である。例えば
マウスモノクロナール抗体遺伝子のうち、可変(V)セグメントをヒトの定常セ
グメント(C)、例えばY1およびY3に接合することも可能である。したがっ
て、通常の治療用キメラ抗体はマウス抗体由来のV、すなわち抗原結合ドメイン
と、ヒト抗体由来のC、すなわちエフェクタードメインからなるハイブリッド蛋
白である。もっとも、他の哺乳動物種を用いることも可能である。
定義したように、単一種のさまざまな免疫グロブリンの間で比較的保存されてい
る免疫グロブリンの軽鎖・重鎖可変領域(すなわちCDR領域以外の部分)をさ
す。本明細書で使用される「ヒト枠組み領域」とは、天然のヒト抗体の枠組み領
域と実質的に同一(約85%以上)の枠組み領域である。
領域と、少なくとも1個の非ヒト抗体由来のCDRを含む免疫グロブリンであっ
て、その定常部が実質的にヒト免疫グロブリン定常部と同一である、すなわち少
なくとも約85−90%、好ましくは少なくとも95%相同である免疫グロブリ
ンをさす。したがって、ヒト型化免疫グロブリンの、恐らくCDRを除く全ての
部分は、ヒトのひとつのまたはそれ以上の天然型免疫グロブリン配列上の対応部
分と実質的に同一である。例えばヒト型化免疫グロブリンは、マウス可変領域・
ヒト定常部からなるキメラ抗体を含まない。
によってはキメラ抗体よりも、少なくとも三つの利点をもつと考えられる。
相互作用をもつ可能性がある。例えば、補体依存性細胞傷害性(CDC)、抗体
依存性細胞傷害性(ADCC)によって標的細胞をより効率的に破壊する。
ろうから、それが注入されても同抗体に対する抗体反応は、完全に異物であるマ
ウス抗体または部分的に異物であるキメラ抗体に対するよりは、低度であろう。
るかに短い半減期をもつことが報告されている(Shaw等、J. Immunol, 138, 453
4-4538 (1987))。注入されたヒト型化抗体は、天然のヒト抗体のものとほとん
ど同じ半減期をもつことが考えられる。そのため、投与の量と回数を減らすこと
が可能になる。
Bサブユニットに結合することのできる免疫グロブリンの重鎖および/または軽
鎖CDRをコードする組み換えポリヌクレオチドである。これらの領域をコード
するポリヌクレオチドは、通常、適当なヒトの枠組み領域をコードするポリヌク
レオチドに接合される。ヒトの枠組み領域に関しては、CDR含有非ヒト免疫グ
ロブリンの枠組み領域、または可変領域のアミノ酸配列を、ヒト免疫グロブリン
配列集の中の対応配列と比較し、高度の相同性をもつ配列を選択する。モノクロ
ナール抗体MuVTm1.1の重鎖・軽鎖CDRを含むポリペプチド鎖をコード
するポリヌクレオチドを図1に例示する。コドンの縮重と必須ではないアミノ酸
置換がありうるため、他のポリヌクレオチド配列も、後述するように容易にこれ
らの配列と置換することが可能である。ヒト型化免疫グロブリンの設計は次のよ
うに行ってもよい。あるアミノ酸が下記の範疇に属する場合、使用するヒト免疫
グロブリンの枠組み領域のアミノ酸(受容側免疫グロブリン)を、CDR含有非
ヒト免疫グロブリン(供与側免疫グロブリン)由来の枠組み領域のアミノ酸と交
換する。
ロブリンに対して異常であるが、一方供与側免疫グロブリンの対応アミノ酸は、
その位置のヒト免疫グロブリンに対して通常のものである場合、 前記アミノ酸の位置がCDRのひとつに直近である場合、または、 前記アミノ酸が、免疫グロブリンの3次元構造モデルにおいて、CDRの約3
A以内にある場合(それぞれ、Queen等、前述、および、Co等、Proc. Natl. Acad . Sci. USA 88, 2869 (1991)参照。引用することによって本文献を本明細書に
含める)。
免疫グロブリンのアミノ酸が、その位置におけるヒト免疫グロブリンに対して異
常である場合、そのアミノ酸をその位置におけるヒト免疫グロブリンに対して典
型的なアミノ酸と交換する。
前述)およびCo等(前述)を参照されたい。
合する発現制御ポリヌクレオチド配列を含む。この中には天然の関連するプロモ
ーター領域、または異種のプロモーター領域が含まれる。好ましくはこの発現制
御配列は、真核性の宿主細胞を形質転換もしくはトランスフェクトすることが可
能なベクターに組み込まれた真核プロモーター系であるが、前核性宿主用の制御
配列も使用可能である。ひとたびベクターが適当な宿主に導入されたならば、ヌ
クレオチド配列の高度の発現に適した条件で維持し、必要により軽鎖、重鎖、軽
鎖・重鎖二量体、または完全長抗体、結合性フラグメントやその他の免疫グロブ
リン形の回収・精製を続けて行ってもよい。
まざまのポリヌクレオチド(ゲノムまたはcDNA、RNA、合成オリゴヌクレ
オチド等)や各種成分(例えば、V、J、DおよびC領域)から、さまざまの方
法を用いて形成することが可能である。適当なゲノム配列と合成配列とを接合す
ることが現在のところもっとも一般的な製造法であるが、cDNA配列を用いて
もよい(欧州特許第0239400号、およびRiechmann, L.等、Nature, 332, 323-327
(1988) 参照。引用することによって本文献の両方を本明細書に含める)。
可能であるが、できれば不死化したB細胞株から単離することが好ましい(Kaba
t等、前述、およびWP 87/02671)。本発明の免疫グロブリン生産用CDRは、既
知の方法によって抗体の生産可能なマウス、ラット、ウサギ、またはその他の脊
椎動物を含む好適な哺乳動物供給源において生産されるVT2に結合可能なモノ
クロナール抗体から得ることができる。前記ポリヌクレオチド配列の好適な供給
源細胞、および免疫グロブリンの発現と分泌のための宿主細胞は、いろいろな供
給源、例えばAmerican Type Culture Collection(「Catalogue of Cell Lines
and Hybridomas」、第5版、(1985)、Rockville、メリーランド州、米国。この文
献を引用することによって本明細書に含める)から入手可能である。
に相同な」修飾免疫グロブリン類も、当業者には既知の各種組み換えDNA技術
を用いて簡単に設計・製造が可能である。例えば前記枠組み領域は、いくつかの
アミノ酸置換、末端のあるいは中間の付加や欠失等を行うことによって一次構造
レベルにおける天然型配列を改変することができる。さらに、本発明のヒト型化
免疫グロブリンのための材料として、さまざまのヒト枠組み領域を単独で、また
は組合せて使用することが可能である。一般に、遺伝子の修飾は各種の既知の技
術、例えば部位指向性突然変異法を用いて簡単に実行できる(Gillman and Smit
h, Gene 8, 81-97 (1979)、およびRoberts S.等、Nature 328, 731-734 (1987)
参照。いずれも引用することによって本明細書に含める)。
トであって、1個以上の免疫グロブリン活性(例えば補体固定活性)をもつフラ
グメントを生産してもよい。このようなポリペプチドフラグメントは、当業者に
は既知の方法を用いて完全長の抗体を蛋白分解酵素によって切断して生産しても
よい。あるいは、部位指向性突然変異法を用いてベクター中の所望の位置に、例
えばCH1の後に終止コドンを挿入してFabフラグメントを、またはヒンジ領
域の後に終止コドンを挿入してF(ab’)2フラグメントを生産してもよい。
また、VLとVHをDNAリンカーで接合して一本鎖抗体を生産してもよい(Hust
on等、前述、およびBird等、前述)。さらに、多くの遺伝子と同様、免疫グロブ
リン関連遺伝子も、それぞれが1個以上の別個の生物学的活性をもつ別々の機能
性領域を含むので、これらの遺伝子を他の遺伝子由来の機能的領域と融合して新
規の性質をもつ融合蛋白を生産することもできる。
結合した後(すなわち発現制御配列の機能を保証するように位置付けた後)、宿
主において発現される。これらの発現ベクターは、通常、エピゾームとして、ま
たは宿主染色体DNAに組み込まれた一部としてホスト生物中で複製が可能であ
る。通常、発現ベクターは、例えばテトラサイクリンまたはネオマイシンのよう
な選択マーカーを含み、それによって所期のDNA配列で形質転換された細胞の
検出が可能となっている(例えば米国特許第4704362号参照。引用するこ
とによって本文献を本明細書に含める)。
宿主である。その他の使用に好適な微生物宿主としては、Bacillus subtilisの
ような枯草菌、サルモネラ属、セラチア属のようなその他の腸内細菌類、および
各種シュードモナス種がある。これら前核細胞性宿主において、通常、宿主細胞
と両立が可能な発現制御用配列(例えば複製起点)を含む発現ベクターを造成す
ることができる。さらに任意の数の各種既知のプロモーター系、例えばラクトー
スプロモーター系、トリプトファンプロモーター系、ベータ・ラクタマーゼプロ
モーター系、またはラムダファージ由来のプロモーター系が存在することになる
。これらプロモーターは、通常、必要によりオペレーター配列を用いて発現を制
御し、かつ転写・翻訳を開始・終了するためのリボソーム結合部位配列等をもつ
。
キナーゼや、その他の解糖酵素を含む、プロモーターのような発現制御配列、複
製開始点、終結配列等を必要に応じて備えた好適なベクターをもつサッカロミセ
ス属が好ましい宿主である。
いてもよい(Winnacker、「From Genes to Clones」、VCH Publishers, ニューヨ
ーク、ニューヨーク州 (1987) 参照。本文献を引用することによって本明細書に
含める)。実際には真核細胞が好ましい。なぜなら、この分野において完全長免
疫グロブリンを分泌することが可能ないくつかの好適な宿主細胞株が開発されて
おり、その中にはCHO細胞株、各種COS細胞株、HeLa細胞株があるが、
好ましくは骨髄腫細胞系、または形質転換されたB細胞であるハイブリドーマが
よい。上記細胞用発現ベクターは、複製開始点、プロモーター、エンハンサー(
Queen等、Immunol. Rev. 89, 46-68 (1986)。本文献を引用することによって本
明細書に含める)、リボソーム結合部位、RNAスプライシング部位、ポリアデ
ニル化部位、および転写終結配列のような、加工処理のために必要な情報をもつ
部位等の発現制御配列を含んでいてもよい。好ましい発現制御配列は、免疫グロ
ブリン遺伝子、SV40、アデノウィルス、牛パピローマウィルス、サイトメガ
ロウィルス等由来のプロモーターである。
は、細胞性宿主の種類に応じて変わってくる既知の方法により宿主細胞に導入す
ることができる。例えば、一般に前核細胞の場合には塩酸カルシウムによるトラ
ンスフェクションが利用されるのであるが、その他の細胞性宿主の場合、リン酸
カルシウム処理または電気穿孔が用いられる。(全般的に、Maniatis等、「Molec
ular Cloning: A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Press (1982) 参照
。本文献を引用することによって本明細書に含める)。
鎖、またはその他の免疫グロブリン形を、例えば硫酸アンモニウム沈殿法、アフ
ィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動等を含む当分野に
おける標準法に従って精製することができる(全般的に、Scopes, R.「Protein P
urification」、Springer-Verlag、ニューヨーク(1982) を参照。本文献を引用す
ることによって本明細書に含める)。製薬学的使用のためには、少なくとも約9
0から95%の均質性をもつものが好ましく、さらに好ましくは98から99%
以上の均質性をもつ、実質的に純粋な免疫グロブリンを用いる。部分的に、また
は所望の均質性に精製しえたならば、次にそのポリペプチドを治療的に(体外的
使用を含む)、または評価法、免疫蛍光染色法等の開発・実施に使用してもよい
。(全般に、「Immunological Methods」IおよびII巻、LefkovitsおよびPernis
編、Academic Press、ニューヨーク、ニューヨーク州(1979, 1981)参照)。
、および溶血性尿毒症症候群(HUS)の毒性作用の治療および/またはVT2
抗原の中和化のために個別的に使用される。限定するという意味ではなく実例を
示すという意味で、治療対象として好適ないくつかの典型的な病状を挙げると、
腸に局在する出血性大腸炎、腎臓の機能不全、および脳損傷がある。
ち皮下、筋肉内、または静脈内投与に特に有用である。非経口投与用組成物は、
通常、免疫グロブリンまたはその混合物を許容可能な担体、できれば水性担体に
溶解した溶液である。さまざまな水性担体が使用可能であり、例えば水、緩衝水
、0.4%生理食塩水、0.3%グリシン、5%グルコース、ヒトアルブミン液
等が挙げられる。前記溶液は無菌であり、一般に粒状物質を含まない。前記組成
物は、通常の既知の滅菌法によって滅菌してもよい。前記組成物は、生理的条件
に近似させる必要から、製薬学的に許容可能な補助物質を含んでいてもよい。例
えばpH調節剤、緩衝剤や、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、
塩化カルシウム、乳酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム等のような、浸透圧剤、
毒性調節剤等である。これらの処方における免疫グロブリンの濃度は、重量とし
て約0.5%未満から、通常は少なくとも約1%から、多い場合は15から20
%まで広範に変動してよいが、選択した特定の投与法に応じ、主に液の容量や粘
度等に基づいて決められる。
−10mgの免疫グロブリンを含むように作製してもよい。静注輸液用の典型的
な組成物は、250mlの滅菌リンゲル液と、150mgの免疫グロブリンを含
むように作製できる。非経口的投与が可能な組成物の実際の調製法は、当業者に
は既知または明白であり、例えば「Remington's Pharmaceutical Science」、15
版、Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980) にさらに詳細に
記載されている。ここに、引用することによって本文献を本明細書に含める。
当な担体によって再構成させることができる。この方法は通常の免疫グロブリン
について有効であることが示されており、かつ当分野で既知の凍結乾燥法や再構
成法が用いられる。凍結乾燥や再構成が種々の程度の免疫グロブリン活性損失を
招く可能性のあること(例えば通常の免疫グロブリンの場合、IgM抗体はIg
G抗体よりも活性損失が大きくなる傾向がある)、およびそれを補うために使用
濃度を調節しなければならないことは当業者にはよく認識されている。
置のため、または予防処置のために投与することができる。治療用途の場合、組
成物をベロ毒素生産大腸菌(VTEC)感染および溶血性尿毒症症候群(HUS
)に罹患している、またはその他のVT2抗原による中毒症状を呈している患者
に対し、その毒性症候群およびその合併症を治療する、または少なくとも部分的
に停止させるのに十分な量を投与する。上記を達成するのに十分な量を「治療有
効量」と定義する。予防用途の場合、前記組成物はVT2抗原による感染および
/またはその毒性症状を予防、または検出可能なほどに抑制するのに十分な量を
感染の危険のある患者に投与する。このような使用法における有効量は、病気の
程度や患者自身の免疫系の一般的状態に依存するが、一般的には患者一人当り0
.1から5mg/kg範囲の用量の免疫グロブリンが使用される。本発明の物質
は一般に重大な病状、すなわち生命を脅かす、または生命を脅かす可能性のある
状況で使用されることを念頭に置かなければならない。そのような場合、本発明
のヒト型化免疫グロブリンは外来性の物質を極小としており、それによって惹起
される「異物」拒絶反応の確率は比較的低く抑えられていることを考え合わせる
と、治療を担当する医師にとってはこの免疫グロブリンを実質的に過剰量投与す
ることが可能であり、かつ好ましく思うことであろう。
師の選択のままに実行してよい。いずれにしろ製薬処方は患者を有効に治療する
のに十分な量供給しなければならない。
、ベロ毒素生産大腸菌(VTEC)感染と溶血性尿毒症症候群(HUS)および
/またはVT2やVT2Vを産生するその他の感染症において、VT2抗原を検
出するのに用いることが可能である。したがって、本発明のヒト型化免疫グロブ
リン、例えばMuVTm1.1抗体によって特定される抗原決定基に結合するヒ
ト型化免疫グロブリンは、標識してVT2またはVT2Vを相当量含む解剖学的
部位を特定するのに使用できる。例を挙げると、だからといってこれだけに限定
されるわけではないが、このヒト型化免疫グロブリンにひとつ以上の標識体をつ
けてもよい。標識体としては、これだけに限定されるわけではないが、例えばX
線不透過染色剤、X線造影剤、蛍光分子、スピン標識分子、酵素、放射線画像法
もしくは核磁気共鳴画像法において特に診断的価値を有するその他の標識体が挙
げられる。
使途を見出すことができる。例を挙げると、かかる免疫グロブリンはVT2抗原
等の検出に利用することが可能である。
標識免疫グロブリンを、本発明のヒト型化免疫グロブリンと反応性をもつ他の標
識抗体(二次抗体)と併用してもよい。そのような二次抗体としては、例えばヒ
ト免疫グロブリン定常部に対して特異的な抗体である。別法として、前記免疫グ
ロブリンを直接標識することも可能である。多種多様の標識の使用が可能であり
、例えば放射性核種、蛍石、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、リガン
ド(特にハプテン類)等がある。各種のイムノアッセーが利用可能であるが、こ
れは当業者にはよく知られているところである。
択された抗原の存在検出のために、本発明の免疫グロブリン使用のためのキット
を提供することも可能である。したがって、本発明の免疫グロブリン組成物は、
通常、容器に凍結乾燥された形で、単独で、または所期の細胞型に対して特異的
に反応する他の抗体と併せて提供されてもよい。標識体または毒素と結合された
、または結合されていない本免疫グロブリンは、トリス、リン酸、炭酸等のバッ
ファーや、安定化剤、防腐剤、殺生物剤、血清アルブミンのような不活性蛋白や
、一組の使用説明書と共にキットに含められていてもよい。一般に、これらの材
料は活性免疫グロブリンの量に応じて約5%重量未満として存在するが、通常は
、この場合も免疫グロブリン濃度に応じて、全量として少なくとも約0.001
%重量として存在する。活性成分を希釈するための不活性の希釈剤、または賦形
剤を含めることが好ましい場合がしばしばある。この場合、賦形剤は全組成の約
1から99%重量で存在させることができる。本免疫グロブリンに結合可能な二
次抗体を定量法に使用する場合には、このものは通常別の瓶に納められる。通常
、かかる二次抗体は標識化されており、本発明の免疫グロブリンと同様に調製さ
れる。
結合についてマウスVTm1−1と競合するヒト抗体が提供される。
ては、Oestberg等、Hybridoma 2: 361-367 (1983)、Oestberg、米国特許第4,634
,664号、およびEngleman等、米国特許第4,634,666号に記載されている(本文献
のそれぞれを引用することによってすべてを本明細書に含める)。この方法によ
って得られた抗体産生細胞株をトリオーマとよぶ。なぜなら、それは三つの細胞
、すなわち二つのヒト細胞と一つのマウス細胞からの子孫だからである。最初に
マウスの骨髄腫細胞株をヒトのBリンパ球と融合して非抗体生産性異種間ハイブ
リッド細胞を得る。例えばOestberg(前述)によって記載されたSPAZ−4細
胞株のような異種細胞を、ヒト免疫化Bリンパ球と融合して抗体生産性トリオー
マ細胞株を得る。トリオーマはヒト細胞から制作した通常のハイブリドーマより
もより安定に抗体を生産することが見出されている。
手する。生きているヒトをベロ毒素IIまたはベロ毒素II変種によりインビボで免
疫化することは有害な反応を惹起する危険性があるので望ましくない。したがっ
て、通常、Bリンパ球はこれらの抗原、またはその抗原性断片、またはそのいず
れかを坦持する細胞を用いてインビトロで免疫化する。通常、Bリンパ球は、1
0%ヒト血清を添加したRPMI−1640(Engleman(前述)参照)
のような培養液中で、7−14日間抗原に暴露する。
種間ハイブリッド細胞に融合させる。例えば、これらの細胞を約37℃において
約5−10分間、分子量1000−4000の40−50%ポリエチレングリコ
ールで処理する。細胞を融合混合物から分離し、所期のハイブリッドに対して選
択的な培地(例えばHATまたはAH)に移す。必要な結合特異性をもつ抗体を
分泌するクローンは、トリオーマ培養液をベロ毒素IIまたはベロ毒素II変種に対
する結合能力を定量して特定する。所期の特異性をもつヒト抗体を生産するトリ
オーマを、例えば限界希釈法によってサブクローニングし、インビトロで培地中
にて培養する。
。このトリオーマ由来の抗体遺伝子を1個以上の発現ベクターにクローニングし
、そのベクターを後述するような細胞株に形質転換し、組み換えまたはヒト型化
免疫グロブリンを発現させることによって発現レベルを増加させることができる
。
くともヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部分をコードする導入遺伝子を有するヒ
ト以外のトランスジェニック哺乳類から生産することもできる。通常、このよう
なトランスジェニック哺乳類の内在性免疫グロブリン遺伝子座は機能的に不活性
化される。このヒト免疫グロブリン遺伝子座の部分は、重鎖と軽鎖成分が再編成
されていない配列であることが好ましい。内在性免疫グロブリン遺伝子の不活性
化、および外来免疫グロブリン遺伝子の導入の両方を、選択的相同組換え法、ま
たはYAC染色体の導入で実現することが可能である。この方法によって得られ
るトランスジェニック哺乳類は、内在性免疫グロブリン遺伝子を発現させること
なく、機能的に前記免疫グロブリン部分の配列を再構成し、ヒト免疫グロブリン
遺伝子によってコードされる各種アイソタイプのいろいろな抗体を発現すること
ができる。このような性質をもつ哺乳類の生産法や特性は、例えば、Lonberg等
、WO93/12227 (1993)、およびKucherlapati, WO 91/10741 (1991) に詳細に記載
されている(本文献それぞれの全部を引用することによって、すべての目的に関
して本明細書に含める)トランスジェニックマウスが特に好適である。抗体は、
LonbergまたはKucherlapati(前述)の記載するように、トランスジェニック非
ヒト哺乳類を免疫化することによって取得する。モノクロナール抗体は、例えば
通常のKohler-Milstein法を用い、そのような哺乳類から得たBリンパ球を適当
な骨髄腫細胞に融合させて調製する。
施例は、VT2抗原のBサブユニットに対する高い結合親和性をもつヒト型化抗
体を生産するHuVTm1.1抗体に関連しているが、VT2エピトープに結合
する他のモノクロナール抗体由来のCDRを用いることも考えられることは理解
されよう。
で調製した。VT2トキソイドは、1mgの精製VT2を0.1Mリン酸バッフ
ァー(pH7.6)に溶解させた0.4%ホルムアルデヒドにて37℃で7日間
処理して調製した。
ト(Gibco BRL)と混合したVT2トキソイドで、腹腔内注射(i.p.)によ
り免疫化した。約4週後、フロインドの完全アジュバンドと混合したVT2トキ
ソイド(1μg)を腹腔注射により投与した。次に、同マウスにフロインドの不
完全アジュバンドと混合したVT2トキソイド(1μgを2回、4μgを2回、
5μgを1回)を腹腔注射により1から5週間隔で連続的に投与した。
、3000rpmで10分間遠心して血清を収集した。VT2に対する血清力価
をELISAにより以下のように測定した。
.01Mリン酸バッファー/生理食塩水(PBS)で希釈した50μlの1μg
/ml VT2でコートし、室温で1時間インキュベートした。 各ウェルをPBS−0.05%Tween20で3回洗浄した。 各ウェルを室温で1時間、PBS−3%BSAでブロッキング処理した。 各ウェルをPBS−0.05%Tween20で3回洗浄した。 PBSで連続希釈した50μlの血清を各ウェルに加え、室温で1時間インキ
ュベートした。 各ウェルをPBS−0.05%Tween20で3回洗浄した。 各ウェルにPBS−3%BSAで希釈した(×1000)50μlのアルカリ
ホスファターゼ複合ヤギ抗マウスIgG(ZYMED)を加え、室温で1時間インキ
ュベートした。 各ウェルをPBS−0.05%Tween20で3回洗浄した。 各ウェルにp−ニトロフェノールホスフェート(PNPP、和光純薬)を加え
、室温で1時間インキュベートした。 各ウェルにつき、405nmにおける吸収を測定、記録した。
行った。5×107 個の脾臓細胞と、5×106 P3X63Ag8U.1(P3
U1)マウス骨髄腫細胞を結合し、RPMI 1640培地で一度洗浄し、15
00rpmで5分間遠心した。この細胞塊を静かに分散し、1mlのポリエチレ
ングリコール(PEG)液(RPMI培養液5.75ml+PEG3.5ml+
ジメチルスルホキシド0.75ml)に再懸濁し、2分間静かに回転攪拌した。
次にRPMI培養液1mlを添加し、2分間回転攪拌した。その後、RPMI培
養液2mlを添加し、2分間回転攪拌した。4mlのGIT−HAT培養液(9
5μMヒポキサンチン、0.4μMアミノプテリン、1.6μMチミジン、5%
FCS)を添加し、2分間回転攪拌した。次に8mlのGIT−HAT培養液を
添加し、2分間回転攪拌した。37℃で30分間インキュベーション後、この細
胞懸濁液をウェル当り104 個のマウス腹腔マクロファージをしいた96ウェル
平底プレートの各ウェルに加えた。このプレートを5%CO2−95%空気のイ
ンキュベーター中、37℃で1週間インキュベートした。その後、各ウェルの培
養液の半分を新鮮なGIT−HT培地と交換し(アミノフェリンを含まないGI
T−HAT培地)、同プレートを約1週間インキュベートしてハイブリドーマ細
胞を育成した。
するスクリーニングを行った。ハイブリドーマ上清をスクリーニングに用いた。
結合活性は、実施例1に記載のELISA法によって測定した。VT2中和活性
は、以下の方法によって測定した。
FCS−MEMに溶解した200pg/mlのVT2を30μl加えた。 このプレートを37℃で1時間インキュベートした。 上記溶液の50μlを、Vero細胞(ATCC)をウェル当り4×104 個
接種した96ウェル平底プレートの各ウェルに加えた。 このプレートを5%CO2−95%空気のインキュベーター中、37℃で4日
間インキュベートした。 0.014%ニュートラルレッド溶液100μlを各ウェルに添加した。 プレートを37℃で1時間インキュベートして生細胞を染色した。 ウェルをPBSで洗浄した後、1%酢酸溶液を含む50%エタノール溶液10
0μlを各ウェルに加えた。 各ウェルについて、550nmにおける吸収度を測定し、記録した。
のハイブリドーマ細胞を、あらかじめ104 個のマウス腹腔マクロファージをフ
ィーダー細胞として接種した96ウェル平底プレートの各ウェルに添加した。約
2週間後、その上清について、それぞれ実施例1、3に記載した方法に従ってV
T2に対する結合能およびVT2に対する中和能を測定した。ここで述べたクロ
ーニング法を数回繰り返すことにより、VT2を中和するモノクロナール抗体(
MuVTm1.1)を分泌するハイブリドーマ細胞クローンを確立した。
ェリン、エタノールアミン、および亜セレン酸塩を含む血清非含有eRDF基礎
培地に適応させた。培養上清をプロテインGセファローズカラム(Pharmacia)
に通し、標準法により抗体を溶出させた。抗体の純度はポリアクリルアミドゲル
電気泳動(PAGE)にて確認し、その濃度をSRIDで求めた。この精製Mu
VTm1.1について、実施例3に記載の通りにVT2変種中和能についてテス
トした。結果を表1と図7に示す。
アンカーPCR法(Co等、J. Immunol. 148: 1149 (1992))を用いてハイブリド
ーマ細胞より単離したmRNAからクローニングした。使用した5’プライマー
はcDNAに付加したポリdGテールにアニールし、3’プライマーは定常部に
アニールした。次に、この増幅された遺伝子フラグメントをプラスミドpUC1
8に挿入した。VL およびVH cDNA両方のいくつかの独立クローンについて
塩基配列を決定した。重鎖については、マウス重鎖可変領域において典型的な単
一で一意な配列が決定された。軽鎖については、共にマウス軽鎖可変領域配列に
相同的で一意な二つの配列が決定された。しかしながら、一方の配列はヌクレオ
チドが1残基消失しており、そのためにV−J接合部でフレームシフトが生じて
機能を失っており、非生産的対立遺伝子と特定された。他方の配列は機能的なマ
ウスカッパ鎖可変領域について典型的なものであった。重鎖と、機能をもつ軽鎖
の可変領域cDNA配列、およびその翻訳されたアミノ酸配列を図1に示す。マ
ウスのVK 配列は、Kabatのマウスカッパ鎖サブグループVに属する。マウスVH はKabatの重鎖サブグループIII(D)に属する。
en等、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029 (1989)、および米国特許第5,585
,089号と第5,693,762号の一般的方法に従った。高い結合活性を維持するには枠
組み領域部分の選択が決め手となる可能性がある。原理的にはいずれのヒト抗体
に由来する枠組み領域配列であってもCDRグラフティングのための枠組みとす
ることができる。しかしながら、そのような枠組み領域へのCDRの単純な移植
は結合親和性の相当の消失を招く可能性のあることが実証されている(Glaser等
、J. Immunol. 149: 2606 (1992); Tempest等、Biotechnology 9:266 (1992); S
halaby等、J. Exp. Med. 17:217 (1992))。ヒトの抗体が元のマウス抗体に相同
的であればあるほど、ヒトの枠組み領域が親和性を低下させる原因となると予想
されるマウスCDRにもたらす歪みを少なくすることが考えられる。Kabatのデ
ータベースにおける相同配列サーチの結果に基づいて(Kabat等著、「Sequence
of Proteins of Immunological Interest」、第5版、米国厚生省、1991年
)、MuVTm1.1抗体に対する好適な枠組み領域の相同性があるヒト抗体G
F4を選んだ。他の相同性の高いヒト抗体鎖も、このヒト型化抗体枠組み領域と
して好適であることが予想される。特にKabatの定義するヒトサブグループIII由
来のカッパ軽鎖、およびヒトサブグループIII由来の重鎖がそうである。
. 168: 595 (1983))を用いてVTm1.1の可変領域の分子モデルを構築した
。このモデルを用いてVTm1.1枠組み領域においてCDRと相互作用をもつ
可能性のあるほどCDRに近接しているアミノ酸を特定した。ヒト型化VTm1
.1重鎖・軽鎖可変領域を設計するために、マウスVTm1.1抗体由来のCD
RをヒトGF4枠組み領域に移植した。コンピュータモデルからCDRとの相当
の接触のあることが予想された枠組み領域の位置については、マウス抗体由来の
アミノ酸は元のヒト枠組み領域のアミノ酸に置換された。ヒト型化VTm1.1
形成のために、この置換は重鎖の29、30、49および98番残基において、
および軽鎖の49番残基において実行された。さらに、ヒト抗体のデータベース
のその位置にめったに現れることのない枠組み領域のアミノ酸残基は、その位置
におけるヒト共通アミノ酸で置換した。ヒト型化VTm1.1形成のために、こ
の置換は重鎖の1、4、5、79、89および93番残基において、および軽鎖
の3、4、19、76、79および85番残基において実行された。
ナルペプチド配列を含めて図2に示す。CDR接触が予想される多くの残基は、
それと置換しても抗原に対する実質的な親和性を維持することが可能な他のアミ
ノ酸と置換してもよい。表2は前記枠組み領域において、代替アミノ酸が好適で
あると思われるいくつかの位置を示している(LC=軽鎖、HC=重鎖)。
領域のアミノ酸残基の多くは本発明のヒト型化抗体の親和性または非免疫原性を
大きく失うことなく、ヒトGF4抗体、他のヒト抗体、マウスVTm1.1抗体
、または他のマウス抗体における対応位置のアミノ酸残基による置換を受け入れ
る可能性がある。表3に、前記枠組み領域において、さらにいくつかの代替アミ
ノ酸が好適と思われる位置を示す。
造の容易さ、その他の好ましい性質をさまざまに組合せたヒト型化VTm1.1
の改変体の生産が可能である。したがって、表3の実例は例示のために示される
のであって、限定のためにではない。
ルペプチド、スプライスドナー信号、および適当な制限酵素切断部位を含めたそ
れらをコードする遺伝子を構築した(図2)。軽鎖・重鎖可変領域遺伝子を、第
3図に示すように、その長さが約65から80塩基長の範囲である8個の重複す
る合成オリゴヌクレオチドを用いて構築し、増幅した(He等、J. Immunol. 160:
1029 (1998) 参照)。このオリゴヌクレオチドのペア同士をアニールし、DN
AポリメラーゼIのクレノー断片によって延長し、4個の二本鎖フラグメントを
得た。この得られたフラグメントを変性し、アニールし、クレノー断片で延長し
、2個のフラグメントを得た。これらのフラグメントを変性し、ペア同士アニー
ルし、もう一度延長して完全長の遺伝子を得た。得られた産物をTaqポリメラ
ーゼによるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)にて増幅し、ゲル精製し、XbaI
にて消化し、再びゲル精製し、pVkまたはpVg1発現ベクターのXbaI部
位にサブクローニングした。それぞれ、軽鎖および重鎖発現用として用いたpV
kおよびpVg1ベクターについては以前に報告されている(Co等、J. Immunol . 148: 1149 (1992)参照)。
認した。DNA操作はすべて当業者にはよく知られた標準法によって行った。
ミドでマウス骨髄腫細胞株Sp2/0−Ag14(ATCC CRL1581)
を形質転換した。トランスフェクション前に、重鎖・軽鎖含有プラスミドはFs
pIを用いて直線化した。各プラスミド約20μgを、PBSに懸濁させた1×
107 個の細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションは遺伝子パ
ルス装置(BioRad)を用い、メーカーの使用説明書に従って360V、25μF
D容量による電気穿孔にて行った。トランスフェクションを経た細胞を、それぞ
れ4個の96ウェル細胞培養プレートに接種し、2日後に選択培地(DMEM、
10%FCS、1×HT添加物(Sigma)、0.25mg/mlキサンチン、1
μg/mlミコフェノール酸)を加えた。
スクリーニングを行った。高生産性クローンによる抗体の調製は次のように行っ
た。すなわち、細胞を通常培地(10%FCSを含むDMEM)にてコンフルエ
ントになるまで培養し、次にこの培養液を血清無添加培地(ハイブリドーマSM
F、Gibco)と交換し、同培養液中で最大の抗体価が得られるまで培養した。培
養上清をプロテインAセファローズカラム(Pharmacia)に通し、抗体を0.1
Mグリシン、100mM NaCl、pH3で溶出し、中和し、次いでリン酸緩
衝液(PBS)にバッファー交換した。抗体の純度は、アクリルアミドゲル分析
で確認し、1.0mgの抗体は1.4のOD280 読み取り値を与えると仮定して
OD280 の読み取り値からその濃度を求めた。
を、ビオチン化MuVTm1.1抗体による競合的結合によって求めた。実験行
程は以下の通り。
を、ウェル当り50μlのVT2溶液(0.2μg/mlのPBS溶液)でコー
トした。ゆるやかに振とうしながら37℃で2時間インキュベートした。
溶解した0.1%Tween20)にて4回洗浄した。
バッファー(#37515)で、室温にて30分間ブロッキングした。
て4回洗浄した。
未標識マウス抗体もしくはHuVTm1.1抗体を混合し、全量100μlの結
合用バッファー(1%BSA、PBSに溶解させた0.1%Tween20)に
溶解したものを加えた。ゆるやかに振とうしながら4℃で一晩インキュベートし
た。抗体液を吸引除去し、各ウェルを400μlの洗浄バッファーで4回洗浄し
た。
)(結合用バッファーで1:500に希釈)100μlを加えた。ゆるやかに振
とうしながら37℃で1時間インキュベートした。
で6回洗浄した。
。色彩が現れるまで室温でインキュベートした。このプレートにつき、Molecula
r Devices社製ELISAプレートリーダーで415nmにて測定した。
て、マウス抗体と比較した場合、係数2以内でビオチン化マウス抗体に対してよ
く競合することを示す。さらに、BIAcore法を用いてHuVTm1.1と
MuVTm1.1の親和度を求めた。表4に示すように、HuVTm1.1のK D 計算値は約3.6×10-9 Mであり、それに対してMuVTm1.1では1
.9×10-9 Mであった。
uVTm1.1と比較した。
うに96ウェルプレートに接種し、37℃で24時間インキュベートした。
溶液30μlと、あらかじめ37℃で1時間インキュベートした10%FCS−
MEMで連続希釈した試験抗体(マウスまたはヒト型化VTm1.1)30μl
との混合液のうち、50μlを各ウェルに加え、37℃で4日間インキュベート
した。
に加え、37℃で1時間インキュベートした(Mullbacher等、1984, Journal of
Immunological Methods, 68, 205-215)。
分間インキュベートした。
、550nmにおける吸収値を記録した。
。HuVTm1.1におけるED50は、MuVTm1.1で0.2μg/mlで
あったのに対し、0.33μg/mlであった。VT2変種に対するHuVTm
1.1の中和活性を以下に示す。
リルアミドゲル電気泳動によって分離し、ウェスタンブロット法によってニトロ
セルロース膜(BioRad)に転写した。このニトロセルロース膜をPBSに溶解し
た3%BSAで一晩ブロッキングし、次に10μg/mlのHuVTm1.1、
または3%BSA/PBSで希釈したウサギ抗VT2血清と室温で1時間反応さ
せた。この膜を1%BSA/PBSにて6回洗浄し、3%BSA/PBSで希釈
したアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトIgG(TAGO)、またはアルカリホ
スファターゼ結合ヤギ抗ウサギIgG(TAGO)25μg/mlと室温で1時間反
応させた。この膜を1%BSA/PBSにて6回洗浄し、NBT(ニトロブルー
塩化テトラゾリウム)−BCIP(5−ブロモ−4−クロロ−3’−インドリル
ホスフェート p−トルイジン塩)溶液(PIERCE)と室温で10分間反応させた
。図6に示す結果は、HuVTm1.1が主にVT2のBサブユニットに結合す
ることを示す。
1、またはPBSの4.8μgを静脈注射した。1時間後、マウスの腹腔に46
ngのVT2(10LD50に相当)を注射した。1週間後、マウスの生存率を測
定した。
全に保護した。
くの利点を提供することが理解されたであろう。このヒト型化免疫グロブリンは
、非ヒトであるがゆえに免疫原性を潜在的にもつアミノ酸配列をマウスモノクロ
ナール抗体に比べて実質的に少なくしか含まない。ヒト患者への注入後に抗原性
をもつ可能性が小さいということは、治療法の大きな改善である。
考文献として組み入れられたごとくに、ここに引用することによって本明細書に
含める。明瞭さと理解を助けるために、本発明を例示と実施例を用いてやや詳細
に説明したけれども、本願特許請求の範囲内において、いくらかの変更や変形を
なしうることは明白であろう。
可変領域のcDNAと翻訳されたアミノ酸配列を示す図。相補性決定領域(CD
R)には下線を施し、また成熟鎖の第1アミノ酸には二重下線を施した。
)可変領域のcDNAと翻訳されたアミノ酸配列を示す図。相補性決定領域(C
DR)には下線を施し、また成熟鎖の第1アミノ酸には二重下線を施した。
体の競合的結合を示す図。競合抗体の濃度を増加させてビオチン化したトレーサ
ーMuVTm1.1の存在下にコートしたVT2と共にインキュベートし、吸収
を測定して未標識競合抗体の濃度に対してプロットした。
示す図。
す図。
Claims (22)
- 【請求項1】 ベロ毒素IIおよび/またはベロ毒素II変種に特異的に結合す
るヒト型化抗体。 - 【請求項2】 ベロ毒素IIのBサブユニットおよび/またはベロ毒素II変種
のBサブユニットに特異的に結合するヒト型化抗体。 - 【請求項3】 ベロ毒素IIおよび/またはベロ毒素II変種を中和する活性を
有する請求項1に記載のヒト型化抗体。 - 【請求項4】 ベロ毒素IIおよび/またはベロ毒素II変種を中和する活性を
有する請求項2に記載のヒト型化抗体。 - 【請求項5】 図1(B)に示す軽鎖可変領域と、図1(A)に示す重鎖可
変領域によって特徴づけられるマウス抗体VTm1.1のヒト型化形態であるヒ
ト型化抗体。 - 【請求項6】 ベロ毒素IIおよび/またはベロ毒素II変種に対する特異的結
合に関してマウス抗体VTm1.1と競合する抗体。 - 【請求項7】 マウスVTm1.1抗体由来の相補性決定領域、およびヒト
GF4抗体の重鎖・軽鎖枠組み配列由来の重鎖・軽鎖可変領域枠組み配列を含み
、かつL49、H29、H30、H49、およびH98からなる群から選ばれた
少なくとも一つの位置がマウスVTm1.1抗体の重鎖または軽鎖可変領域枠組
み配列の等価位置に存在するアミノ酸残基で占められ、かつ107 M-1からマウ
スVTm1.1抗体の親和度の10倍までの親和定数をもってベロ毒素IIに特異
的に結合する請求項1から請求項6のいずれかに記載のヒト型化抗体。 - 【請求項8】 L49、H29、H30、H49、およびH98からなる群
から選ばれた各位置が、マウスVTm1.1抗体の重鎖または軽鎖可変領域枠組
み配列の等価位置に存在するアミノ酸残基で占められている請求項7に記載のヒ
ト型化抗体。 - 【請求項9】 L3、L4、L19、L76、L79、L85、H1、H4
、H5、H79、H89、およびH93からなる群から選ばれた少なくとも一つ
の位置が、ヒト抗体の重鎖または軽鎖共通配列の等価位置に存在するアミノ酸残
基で占められている請求項8に記載のヒト型化抗体。 - 【請求項10】 L3、L4、L19、L76、L79、L85、H1、H
4、H5、H79、H89、およびH93からなる群から選ばれた各位置が、ヒ
ト抗体の重鎖または軽鎖共通配列の等価位置に存在するアミノ酸残基で占められ
ている請求項9に記載のヒト型化抗体。 - 【請求項11】 図2(A)に示す重鎖可変領域と図2(B)に示す軽鎖可
変領域を含み、かつL49、H29、H30、H49、H98、L3、L4、L
19、L76、L79、L85、H1、H4、H5、H79、H89、およびH
93からなる群から選ばれた1個以上の位置が、表2と表3に示すように置換さ
れていてもよい請求項1から請求項6のいずれかに記載のヒト型化抗体。 - 【請求項12】 図2(A)に示す重鎖可変領域と、図2(B)に示す軽鎖
可変領域を含む請求項1から請求項6のいずれかに記載のヒト型化抗体。 - 【請求項13】 図2(A)に示すヒト化重鎖と少なくとも85%の相同性
をもつヒト化重鎖配列と、図2(B)に示すヒト化軽鎖と少なくとも85%の相
同性をもつヒト化軽鎖配列とを含み、かつL49、H29、H30、H49、お
よびH98からなる群から選ばれた少なくとも一つの位置がマウスVTm1.1
抗体の重鎖または軽鎖可変領域枠組み配列の等価位置に存在するアミノ酸残基で
占められている請求項1から請求項6のいずれかに記載のヒト型化抗体。 - 【請求項14】 2対の軽鎖・重鎖二量体からなり、各鎖は一つの可変領域
と一つの定常部とを含む請求項1から請求項6のいずれかに記載のヒト型化抗体
。 - 【請求項15】 FabフラグメントまたはF(ab’)2である請求項1
から請求 項6のいずれかに記載のヒト型化抗体。 - 【請求項16】 精製された請求項1から請求項6のいずれかに記載のヒト
型化抗体。 - 【請求項17】 IgG1免疫グロブリンサブタイプである請求項1から請
求項6のいずれかに記載のヒト型化抗体。 - 【請求項18】 請求項1から請求項6のいずれかに記載のヒト型化抗体の
重鎖・軽鎖をコードする塩基配列をもつ細胞株を培養し、それによって該ヒト型
化抗体を発現させ、かつ該細胞株によって発現されたヒト型化抗体を回収するこ
とを含む、ヒト型化VTm1.1抗体の製造法。 - 【請求項19】 さらに該抗体を製薬学的に許容可能な担体と混合して薬剤
組成物を製造することを含む、請求項18に記載の方法。 - 【請求項20】 請求項1から請求項6のいずれかに記載のヒト型化抗体と
、製薬学的に許容可能な担体とを含む薬剤組成物。 - 【請求項21】 請求項12に記載のヒト型化抗体と、製薬学的に許容可能
な担体とを含む薬剤組成物。 - 【請求項22】 請求項1から請求項6のいずれかに記載のヒト型化抗体を
生産しうる細胞株。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US8657098P | 1998-05-20 | 1998-05-20 | |
US60/086,570 | 1998-05-20 | ||
PCT/US1999/011179 WO1999059629A1 (en) | 1998-05-20 | 1999-05-19 | Humanized antibodies that recognize verotoxin ii and cell line producing same |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002515230A true JP2002515230A (ja) | 2002-05-28 |
JP4044733B2 JP4044733B2 (ja) | 2008-02-06 |
Family
ID=22199443
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000549293A Expired - Fee Related JP4044733B2 (ja) | 1998-05-20 | 1999-05-19 | ベロ毒素iiを認識するヒト型化抗体、および該抗体を産生する細胞株 |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US7846435B1 (ja) |
EP (1) | EP1079856B1 (ja) |
JP (1) | JP4044733B2 (ja) |
KR (1) | KR100548167B1 (ja) |
CN (1) | CN1330375C (ja) |
AT (1) | ATE335504T1 (ja) |
AU (1) | AU748852B2 (ja) |
BR (1) | BR9910589A (ja) |
CA (1) | CA2328485C (ja) |
DE (1) | DE69932719T2 (ja) |
DK (1) | DK1079856T3 (ja) |
ES (1) | ES2270598T3 (ja) |
HK (1) | HK1036215A1 (ja) |
IL (2) | IL139571A0 (ja) |
NO (1) | NO326197B1 (ja) |
NZ (1) | NZ508119A (ja) |
PT (1) | PT1079856E (ja) |
RU (1) | RU2217166C2 (ja) |
WO (1) | WO1999059629A1 (ja) |
ZA (1) | ZA200006370B (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7910096B2 (en) | 1996-11-15 | 2011-03-22 | Trustees Of Tufts College | Human neutralizing antibodies against hemolytic uremic syndrome |
US8293245B2 (en) | 2006-04-20 | 2012-10-23 | The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. | Methods and compositions based on Shiga toxin type 1 protein |
EP2381954B8 (en) | 2009-01-23 | 2017-01-25 | The Henry M. Jackson Foundation for the Advancement of Military Medicine, Inc. | Methods and compositions based on shiga toxin type 2 protein |
CA2913702C (en) * | 2013-05-27 | 2023-08-01 | Inmunova S.A. | Chimeras of brucella lumazine synthase and beta subunit of ab5 toxins |
US10167333B2 (en) * | 2014-01-16 | 2019-01-01 | Mario Umberto Francesco Mondelli | Neutralizing human monoclonal antibodies against hepatitis B virus surface antigen |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
JP3236667B2 (ja) | 1991-06-28 | 2001-12-10 | 三菱化学株式会社 | ヒト型モノクローナル抗体およびそれをコードする遺伝子、ハイブリドーマ並びに抗腫瘍剤 |
GB9125979D0 (en) | 1991-12-06 | 1992-02-05 | Wellcome Found | Antibody |
NZ251621A (en) | 1992-03-26 | 1996-04-26 | Microcarb Inc | Polyclonal antibodies to shiga-like toxins |
CA2078716A1 (en) | 1992-09-21 | 1994-03-22 | Joyce De Azavedo | Attaching and effacing protein of enterohemorrhagic e. coli |
US5747272A (en) | 1994-02-14 | 1998-05-05 | Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine | Detection of shiga-like toxins of enterohemoragic Escherichia coli |
CA2116179C (en) | 1994-02-22 | 2008-01-08 | C. A. Lingwood | Verotoxin pharmaceutical compositions and medical treatments therewith |
JPH11506424A (ja) | 1995-03-24 | 1999-06-08 | オフィディアン ファーマシューティカルズ インコーポレーテッド | ベロ毒素産生大腸菌に対する治療 |
CA2163716C (en) | 1995-11-24 | 2009-05-19 | Clifford A. Lingwood | Verotoxin pharmaceutical compositions and medical treatments therewith |
DE19641466A1 (de) | 1996-10-09 | 1998-04-16 | Biotest Pharma Gmbh | Orale Anwendung eines Immunglobulinpräparates zur Prävention des Hämolytischen Urämischen Syndroms sowie Präparat hierfür |
WO1998020903A1 (en) | 1996-11-15 | 1998-05-22 | Trustees Of Tufts College | Humanized neutralizing antibodies against hemolytic uremic syndrome |
US20030170248A1 (en) | 1997-12-23 | 2003-09-11 | Jeffrey R. Stinson | Humanized monoclonal antibodies that protect against shiga toxin induced disease |
-
1999
- 1999-05-19 JP JP2000549293A patent/JP4044733B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-19 AT AT99924395T patent/ATE335504T1/de active
- 1999-05-19 CN CNB998063835A patent/CN1330375C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-19 AU AU40904/99A patent/AU748852B2/en not_active Ceased
- 1999-05-19 WO PCT/US1999/011179 patent/WO1999059629A1/en active IP Right Grant
- 1999-05-19 CA CA2328485A patent/CA2328485C/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-19 PT PT99924395T patent/PT1079856E/pt unknown
- 1999-05-19 IL IL13957199A patent/IL139571A0/xx unknown
- 1999-05-19 BR BR9910589-6A patent/BR9910589A/pt not_active IP Right Cessation
- 1999-05-19 RU RU2000132226/14A patent/RU2217166C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1999-05-19 DE DE69932719T patent/DE69932719T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-19 ES ES99924395T patent/ES2270598T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-19 KR KR1020007012995A patent/KR100548167B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1999-05-19 DK DK99924395T patent/DK1079856T3/da active
- 1999-05-19 US US09/700,851 patent/US7846435B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-05-19 NZ NZ508119A patent/NZ508119A/xx not_active IP Right Cessation
- 1999-05-19 EP EP99924395A patent/EP1079856B1/en not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-11-07 ZA ZA200006370A patent/ZA200006370B/en unknown
- 2000-11-09 IL IL139571A patent/IL139571A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-11-17 NO NO20005833A patent/NO326197B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-09-07 HK HK01106324A patent/HK1036215A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BR9910589A (pt) | 2001-01-16 |
ATE335504T1 (de) | 2006-09-15 |
IL139571A0 (en) | 2002-02-10 |
WO1999059629A1 (en) | 1999-11-25 |
CN1330375C (zh) | 2007-08-08 |
DE69932719T2 (de) | 2007-09-13 |
KR100548167B1 (ko) | 2006-01-31 |
CN1301175A (zh) | 2001-06-27 |
CA2328485A1 (en) | 1999-11-25 |
CA2328485C (en) | 2011-05-03 |
DK1079856T3 (da) | 2006-12-04 |
RU2217166C2 (ru) | 2003-11-27 |
KR20010052367A (ko) | 2001-06-25 |
NO326197B1 (no) | 2008-10-13 |
JP4044733B2 (ja) | 2008-02-06 |
US7846435B1 (en) | 2010-12-07 |
HK1036215A1 (en) | 2001-12-28 |
AU4090499A (en) | 1999-12-06 |
ES2270598T3 (es) | 2007-04-01 |
AU748852B2 (en) | 2002-06-13 |
NO20005833L (no) | 2001-01-15 |
DE69932719D1 (de) | 2006-09-21 |
EP1079856A1 (en) | 2001-03-07 |
PT1079856E (pt) | 2006-12-29 |
EP1079856B1 (en) | 2006-08-09 |
IL139571A (en) | 2009-09-22 |
NZ508119A (en) | 2003-06-30 |
NO20005833D0 (no) | 2000-11-17 |
ZA200006370B (en) | 2001-08-22 |
EP1079856A4 (en) | 2002-03-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP3689909A1 (en) | Tigit antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical use thereof | |
US11623948B2 (en) | Process for preparation of secretory IgA and secretory IgM | |
AU2012298877B2 (en) | Clostridium difficile antibodies | |
US6730300B2 (en) | Humanization of an anti-carcinoembryonic antigen anti-idiotype antibody and use as a tumor vaccine and for targeting applications | |
TWI338009B (en) | Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof | |
EP2567982A1 (en) | Antibody against carcinoembryonic antigen and uses thereof | |
JP2001515920A (ja) | クロストリジウム・ディフィシレ・トキシンによる疾患の治療及び予防のためのアミノ酸配列 | |
WO2022095926A1 (zh) | 靶向于白介素36r的抗体及其制备方法和应用 | |
JP2022523710A (ja) | Cd44に特異的な抗体 | |
US20230138315A1 (en) | Anti-angptl3 antibody and use thereof | |
EP3310816B1 (en) | Cys80 conjugated immunoglobulins | |
JP2022514786A (ja) | Muc18に特異的な抗体 | |
CN113817052A (zh) | 抗SARS-CoV-2核衣壳蛋白单克隆抗体及其制备方法和用途 | |
JP2002513398A (ja) | フィブロネクチン結合タンパク質組成物および使用法 | |
JP4044733B2 (ja) | ベロ毒素iiを認識するヒト型化抗体、および該抗体を産生する細胞株 | |
US20040260068A1 (en) | Humanized chicken antibodies | |
CN111018984B (zh) | 抗ck8单克隆抗体及其应用 | |
EP4257195A2 (en) | Anti-cfae antibodies and methods of use | |
JPH0213376A (ja) | 緑膿菌に対するモノクローナル抗体、ならびにその調製および使用 | |
CN111100204A (zh) | 靶向cd20的抗体、其制备方法和应用 | |
JPS63500035A (ja) | プソイドモナス アエルギノサ 外毒素aに対する保護用ヒトモノクロ−ナル抗体 | |
MXPA00011434A (en) | Humanized antibodies that recognize verotoxin ii and cell line producing same | |
CN111040033A (zh) | 靶向肿瘤细胞的抗人角蛋白18的单克隆抗体及其应用 | |
JP2002542768A (ja) | 抗−p53抗体 | |
CN115594762A (zh) | 一种铁蛋白重链抗体及其用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20040325 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20040325 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20041026 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20041104 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050126 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060801 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20061101 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070515 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070814 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20071023 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20071116 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101122 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111122 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121122 Year of fee payment: 5 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131122 Year of fee payment: 6 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |