CN1330375C - 识别维罗毒素ⅱ的人源化抗体和产生它的细胞系 - Google Patents

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Abstract

本发明提供特异性结合并优选中和维罗毒素Ⅱ(VT2)的人源化抗体。该抗体可用于治疗遭受或处于遭受维罗毒素的毒性影响的危险的患者。

Description

识别维罗毒素Ⅱ的人源化抗体和产生它的细胞系
相关申请的交叉参考
本申请要求1998年5月20日提交的USSN60/086,570的优先权，为此目的其全文被引入作为参考。
发明领域
本发明通常涉及重组DNA与单克隆抗体技术结合开发新的生物制品，更具体地说，例如制备特异于维罗毒素(verotoxin)II(VT2)抗原和维罗毒素II变异体抗原(VT2V)的非免疫原性(对人)的免疫球蛋白以及其在体外和体内的用途。本发明还更具体地涉及能中和VT2和VT2V的抗VT2人源化单克隆抗体，编码抗体的多核苷酸序列，制备抗体的方法，包含抗体作为活性成分的药物组合物，治疗产维罗毒素大肠杆菌(VTEC)感染以及溶血性尿毒症(HUS)的包含抗体作为活性成分的治疗剂，和治疗这些疾病的方法。
发明的背景技术
业已知还被称为志贺样毒素(SLT)的维罗毒素(VT)在产生毒素大肠杆菌(VTEC)感染中导致血性腹泻和溶血性尿毒症的发生。一个VTEC感染的病原体为毒性大肠杆菌0157。VT还可由在人中也产生毒性综合症的导致VTEC感染的细菌之外的细菌产生。在免疫反应降低的儿童或老人中，由在肠中生长的细菌产生的VT可通过使肠上皮细胞破裂而进入血液。这可能诱导特征在于肾功能紊乱和有时大脑损伤的溶血性尿毒症(HUS)(参见例如Karmali，M.等 柳叶刀，1，619-620(1983)；Siegler，R.， 儿科学杂志，125，511-518(1994))。目前，对于这些毒性综合症没有有效的药物。没有证实抗生素对防止毒性综合症的发展的功效(参见例如Carter，A.等， 新英格兰医学杂志，316，1496-1500(1987)；Griffen，P.等 国内医学年鉴，109，705-712(1988))。这可能因为抗生素杀死的细菌释放VT以及抗生素抗VT的无效性。
存在两种类型的维罗毒素(或志贺样毒素)，即维罗毒素I(VT1或SLT-1)和维罗毒素II(VT2或SLT-2)。(参见O’Brien等， 现代微生物 免疫学总论，180，65-94(1992))。已从患有VTEC感染的患者中分离产生VT2的大肠杆菌。(参见Russmann等， 医学微生物学杂志，40(5)，338-343(1994))。Ostroff等， 传染病杂志160994-998(1989)和Kleanthous等儿童主要疾病65，772-727(1990)报道包含VT2但不包含VT1的大肠杆菌0157菌株更经常与HUS相关。存在其他在临床上也被分离的VT2变异体。(参见例如 微生物病原体，8，47-60(1990)；FEBSLett.，79，27-30(1991)； 微生物病原体，5，419-426(1988)； 和微生物学杂志，170，4223-4230(1988))。Armstong等 传染病杂志，171(4)，1042-1045(1995)，在临床试验中测试了一个VT吸收剂，然而，此药物仅在肠中起作用，不能吸收到达血液中的VT。与对VT1比较，γ-球蛋白制剂对VT2显示极低的中和活性(Ashkenazi，S.等 儿科学杂志，113，1008-1014(1988)；Morooka，T.等 ActaPaediatricaJaponica，38，294-295(1996))。报道了中和VT2的小鼠单克隆抗体。然而，该抗体被报道显示相对低的VT2V结合亲和性(Schmitt，C.等 传染和免疫，59，1065-1073(1991))。
而且，如上面描述的那些小鼠单克隆抗体的用途在人治疗中具有一些缺陷，尤其是在如下描述的重复治疗方案中。例如，小鼠单克隆抗体在人中往往具有短的半衰期，并且当用于人中时缺乏其他重要免疫球蛋白功能性特征。
此外，小鼠单克隆抗体本质上包含当注射至患者中时为免疫原性的氨基酸序列。许多研究表明在注射外源抗体后，由针对注射抗体由患者引发的免疫反应可相当强，在初始治疗后，基本上消除抗体的治疗用途。而且，如果小鼠或其他抗原性(对人)单克隆抗体被用来治疗各种人疾病，由于交叉反应，随后的用不相关的小鼠单克隆抗体的治疗可能无效或甚至对他们自身有害。
虽然所谓“嵌合抗体”的产生(例如小鼠的可变区与人恒定区相连)已在一定程度上被证实是成功的，仍存在明显的免疫原性问题。通常，使用典型的人单克隆抗体制备技术制备与如许多抗原一样，高亲和性地与VT2抗原反应的人免疫球蛋白是极其困难的。
因此，需要改进形式的特异于VT2抗原，对人基本上为非免疫原性，并且以适宜于治疗制剂和其他用途的方式容易并经济地制备的人免疫球蛋白。本发明满足这些和其他需要。
发明概述
本发明提供与VT2和/或VT2变异体特异性结合的人源化抗体。其中一些抗体特异性地与VT2的B亚基和/或VT2变异体的B亚基结合。其中一些抗体中和VT2和/或VT2变异体。优选的抗体中和VT2和/或VT2变异体以提供至少50％，75％，95％或100％的对用10LD50VT2或VT2变异体攻击的小鼠或其他哺乳动物个体的保护。
一些人源化抗体为小鼠抗体VTm1-1的人源化形式，其中小鼠抗体特征在于示于图1B的轻链可变区和示于图1A的重链可变区。
本发明进一步提供与小鼠抗体VTm1-1竞争特异性结合VT2和/或VT2变异体的抗体。
如上所述，一些人源化抗体包含来自小鼠VTm1-1抗体的互补决定区和来自人GF4抗体重链和轻链框架的重链和轻链可变区框架，前提是选自L49，H29，H30，H49和H98的至少一个位置被存在于小鼠VTm1-1抗体重链或轻链可变区框架相同位置的氨基酸占据。这些人源化抗体以107M-1至小鼠VTm1-1抗体亲和性的3，5或10倍的亲和常数特异性地与维罗毒素II结合。
在前面段落描述的一些人源化抗体中，选自L49，H29，H30，H49和H98的各个位置被存在于小鼠VTm1-1抗体重链或轻链可变区框架相同位置的氨基酸占据。
在一些上面的人源化抗体中，选自L3，L4，L19，L76，L79，L85，H1，H4，H5，H79，H89和H93的至少一个位置被存在于人抗体重链或轻链共有序列的相同位置的氨基酸占据。在一些人源化抗体中，选自L3，L4，L19，L76，L79，L85，H1，H4，H5，H79，H89和H93的各个位置被存在于人抗体重链或轻链共有序列的相同位置的氨基酸占据。
一些人源化抗体包含图2A所示的重链可变区和图2B所示的轻链可变区，前提是选自L49，H29，H30，H49和H98，L3，L4，L19，L76，L79，L85，H1，H4，H5，H79，H89和H93的一个或多个位置可被如表2和3所示取代。
一些人源化抗体包含图2A所示的重链可变区和图2B所示的轻链可变区。
一些人源化抗体包含与图2A所示人源化重链具有至少85％相同性的人源化重链和与图2B所示人源化轻链具有至少85％相同性的人源化轻链，前提是选自L49，H29，H30，H49和H98的至少一个位置被存在于小鼠VTm1-1抗体重链或轻链可变区框架相同位置的氨基酸占据。
如上所述的一些人源化抗体包含两对轻链/重链二聚体，其中每一条链包含一个可变区和一个恒定区。
如上所述的一些人源化抗体为Fab片段或F(ab’)2。
任选地，如上所述，人源化抗体以纯化的形式提供。
如上所述，一些人源化抗体具有IgG1免疫球蛋白同型。
本发明进一步提供制备人源化VTm1-1抗体的方法。该方法包括培养编码上述任一抗体的重链和轻链的细胞系，从而表达人源化抗体；回收细胞系表达的人源化抗体。其中一些方法进一步包括将抗体与药物学可接受载体混合以制备药物组合物。
本发明进一步提供包含上述任一抗体和药物学可接受载体的药物组合物。优选的组合物包括包含图2A所示的重链可变区和图2B所示的轻链可变区的人源化抗体。本发明进一步提供上述任一抗体在制备用于治疗患有或处于维罗毒素毒性作用危险中的患者的药物中的应用。
本发明进一步提供治疗患有或处于维罗毒素毒性作用危险中的患者的方法，包括给患者施用与维罗毒素II和/或维罗毒素II变异体特异性结合的有效量的人或人源化抗体。在其中一些方法中，抗体与小鼠抗体VTm1-1竞争特异性地与维罗毒素II或维罗毒素II变异体结合。在其中一些方法中，人源化抗体特异性地与VT2和/或VT2变异体结合。在其中一些方法中，人源化抗体特异性地与VT2和/或VT2变异体的B亚基结合。在其中一些方法中，人源化抗体特异性地与VT2和/或VT2变异体结合并中和VT2和/或VT2变异体。在其中一些方法中，人源化抗体特异性地与VT2的B亚基和/或VT2变异体的B亚基结合并中和VT2和/或VT2变异体。在其中一些方法中，抗体为人源化抗体，其为小鼠VTm1-1抗体的人源化形式。在其中一些方法中，抗体为包含图2A所示的重链可变区和图2B所示的轻链可变区的人源化抗体。在其中一些方法中，患者为被产维罗毒素大肠杆菌感染并治疗性地施用抗体。在其中一些方法中，患者为处于被产维罗毒素大肠杆菌感染的危险中并预防性地施用抗体。其中一些方法进一步包括监测患者对维罗毒素II或维罗毒素II变异体的毒性作用的恢复。
在另一个方面，本发明提供产生上述任一抗体的细胞系。
本发明提供新的可用于例如治疗产生维罗毒素大肠杆菌(VTEC)感染和溶血性尿毒症(HUS)的组合物，该组合物包含能特异性地与VT2抗原的B亚基结合并中和VT2和VT2的变异体的人源化免疫球蛋白。免疫球蛋白可具有两对轻链/重链复合物，至少一条链包含一个或多个功能性地与人框架区片段相连的小鼠互补决定区。例如，带有或不带有其他天然相关的小鼠氨基酸残基的小鼠的互补决定区可被导入人框架区以产生能以大于107M-1的亲和水平与抗原结合的人源化免疫球蛋白。这些人源化免疫球蛋白也能阻断提供CDR的小鼠单克隆抗体与VT2的结合。
本发明的免疫球蛋白，包括结合片段和它的其他衍生物可容易地通过各种重组DNA方法制备，并在转染的细胞中最后表达，优选无限增殖的真核细胞，如骨髓瘤或杂交瘤细胞。包含编码人源化免疫球蛋白框架区的第一序列和编码所需免疫球蛋白互补决定区的第二序列组的多核苷酸可合成制备或通过重组适宜的cDNA和基因组DNA片段制备。
在治疗来自如在产生维罗毒素大肠杆菌(VTEC)感染和溶血性尿毒症(HUS)期间产生的VT2或VT2V的可能的毒性后果中，可使用基本上纯的形式的人源化免疫球蛋白。人源化免疫蛋白或它们的复合物可以药物可接受的剂型制备，它随给药方式而变化。
附图的简要说明
图1：小鼠VTm1.1抗体(MuVTm1.1)的重链(A)和轻链(B)可变区的cDNA和翻译的氨基酸序列。互补决定区(CDRs)被下划线，成熟链的第一个氨基酸被双划线。
图2：人源化VTm1.1抗体(HuVTm1.1)的重链(A)和轻链(B)可变区的cDNA和翻译的氨基酸序列。互补决定区(CDRs)被下划线，成熟链的第一个氨基酸被双划线。
图3：合成人源化抗体可变区cDNA的方案。
图4：MuVTm1.1和HuVTm1.1抗体与大肠杆菌维罗毒素II(VT2)的竞争性结合。在生物素化的示踪物MuVTm1.1存在下，将增加浓度的竞争抗体与包被的TV2一起培养。测定吸光率并对未标记的竞争抗体的浓度作图。
图5：与MuVTm1.1比较，HuVTm1.1的体外中和活性。
图6：HuVTm1.1被识别抗原(VT2的B亚基)的确定。
图7：MuVTm1.1对VT2和VT2变异体的中和活性。
定义
术语“基本上相同”，在两个核酸或多肽(例如编码人源化免疫球蛋白的DNA或人源化免疫球蛋白的氨基酸序列)中指当比较和排列最大对应性时，如使用下面的序列比较方法和/或通过肉眼观察所测定的，具有至少约80％，最优选85％，90-95％或更高的核苷酸或氨基酸残基相同性的两个或多个序列或亚序列。这些“基本上相同的”序列通常被认为同源。优选地，“基本上相同”存在于长度为约至少50残基的区域相同，较优选至少约100个残基的区域，最优选序列至少150个残基基本相同，或比较的两个序列的全长相同。如下所述，通过使用Kabat的计数系统，任何两个抗体序列可仅用一种方式比较。因此，对于抗体，相同的百分率具有唯一并确切定义的含义。
来自免疫球蛋白的成熟重链和轻链的可变区的氨基酸序列被分别称为Hx和Lx，其中根据Kabat方法，SequenceofImmunologicalInterest(国家健康协会，BethesdaMD，1987和1991)，x为表示氨基酸位置的序号。Kabat列出了各个亚组抗体的许多氨基酸序列，并列出了亚组中各个残基位置最常出现的氨基酸以产生共有序列。Kabat使用用于定位所列序列中各个氨基酸的残基序号的方法，该定位残基序号的方法在本领域已成为标准方法。通过参考保守氨基酸，将讨论的抗体与Kabat的共有序列比较，Kabat的方法可延伸至未包括在其总结中的其他抗体。例如，人抗体的L50位置的氨基酸占据了与小鼠抗体的位置L50的氨基酸相同的位置。
保守氨基酸取代指具有类似侧链的残基的互换性。例如，具有脂族侧链的一组氨基酸为甘氨酸、丙氨酸、颉氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂族-羟基侧链的一组氨基酸为丝氨酸和苏氨酸；具有包含酰胺的侧链的一组氨基酸为天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香侧链的一组氨基酸为苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸为赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的一组氨基酸为半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基团为：颉氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-颉氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
可使用如Cesareni，FEBSLett307：66-70(1992)；Swimmer等， Proc. Natl.Acad.Sci.USA89：3756-60(1992)；Gram等 Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：3576-80(1992)；Clackson等， 自然，352：624-8(1991)；Scott和Smith， 科学249：386-90(1990)；Garrard等， 生物/技术9：1373-1377(1991)所描述的噬菌体展示法筛选作为例证的抗体序列的类似物结合活性的保留，其中上述参考文献为此目的全文被引入作为参考。
术语“基本上纯的”指目的物为存在的主要物质(即以摩尔为基础，在组合物中它比任何其他各物质量更大)，优选基本上纯化的组合物为目的物包含存在的所有大分子物质的至少约50％(以摩尔为基础)的组合物。通常，基本上纯的组合物包含组合物中存在的所有大分子物质的约80-90％。最优选地，目的物被纯化至本质上均一(通过常规检测方法在组合物中不能检测到污染物)，其中组合物本质上由单一大分子物质组成。
抗体之间的竞争通过这样一种分析法检测，即待测的免疫球蛋白抑制参考抗体与抗原决定簇的特异性结合。已知许多类型的竞争性结合分析法，例如：固相直接或间接放射免疫分析法(RIA)、固相直接或间接酶免疫分析法(EIA)、夹层竞争分析法(参见Stahli等 酶学方法9：242-253(1983)；固相直接生物素-抗生物素EIA(参见Kirkland等免疫学杂志137：3614-3619(1986))；固相直接标记分析法，固相直接标记夹层分析法(参见Harlow和Lane，“抗体，实验室手册”冷泉港出版(1988)；使用I-125标记的固相直接标记RIA(参见Morel等， 分子免疫 学25(1)：7-15(1988)；固相直接生物素-抗生物素EIA(Cheung等 病毒学176：546-552(1990)；和直接标记RIA(Moldenhauer等 Scand.免疫学杂 志32：77-82(1990))。通常检测的免疫球蛋白过量存在。通过竞争分析法确定的抗体(竞争抗体)包括与参考抗体相同表位结合的抗体和与邻近表位结合的抗体，其中该邻近的表位与被参考抗体结合以发生空间位阻的表位足够靠近。通常，当竞争抗体过量存在时，它将抑制至少50％或75％的参考抗体与指定的抗原靶的特异性结合。
发明详细描述
根据本发明，提供特异性地与VT2的B亚基反应的人源化免疫球蛋白。这些与VT2的B亚基具有至少约10-M-1-10101M-1，优选106M-1-10101M-1或更高的结合亲和性的免疫球蛋白能例如中和VT2和VT2V(VT2抗原)的毒性。人源化的免疫球蛋白具有人框架并具有一个或多个与VT2抗原特异性反应的来自免疫球蛋白，通常为来自小鼠免疫球蛋白的互补决定区(CDR’s)。在一个优选的具体实施方案中，一个或多个CDR来自MuVTm1.1抗体。因此，可大量经济地制备的本发明的免疫球蛋白在例如通过各种技术在患者中治疗来自产维罗毒素大肠杆菌(VTEC)感染和溶血性尿毒症(HUS)的毒性后果中找到了应用。
已知基本的抗体结构单元包含四聚体。每一个四聚体由两个相同的多肽链对组成，每一对具有一个“轻”(约25kD)和一个“重”链(约50-70kD)。各个链的氨基末端包括一个主要负责抗原识别的约100-110或更多氨基酸的可变区。各个链的羧基末端部分决定主要负责效应子功能的恒定区。
轻链被分为kappa或λ。重链被分为γ、mu、α、δ或ε，定义抗体的同型分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。在轻链和重链中，可变区和恒定区通过“J”区和约12个或更多的氨基酸相连，重链还包括“D”区或约10或更多的氨基酸(通常参见 基础免疫学Paul，W.，编，第7章，131-166，RavenPress，N.Y.(1984)，其被本文引作参考)。
各个轻链/重链对的可变区形成了抗体结合位点。所有链均显示通过三个高变区相连的相对保守框架区相同的一般性结构，也称为互补决定区或CDR’s(参见“感兴趣的免疫蛋白的序列”Kabat，E.，等美国 健康和人类保障系，(1987)；和Chothia和Lesk 分子生物学杂 志，196，901-917(1987)，其被本文引作参考)。来自每对两个链的CDR’s通过框架区排列，使得能与特定的表位结合。
如本文所采用的，术语“免疫球蛋白”指由一个或多个本质上由免疫蛋白基因编码的多肽组成的蛋白。已知的免疫球蛋白的基因包括kappa、λ、α、γ、δ、ε和mu恒定区基因以及无数免疫球蛋白可变区基因。免疫球蛋白可以除抗体之外的各种形式存在；包括例如Fv、Fab和F(ab’)以及双功能杂交抗体(例如Lanzavecchia等 欧洲免疫学杂志17105(1987))和存在于单链中(例如Huston等 Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.85，5879-5883(1988)和Bird等 科学242，423-426(1988)，其被本文引作参考)。(通常参见Hood等 免疫学，Benjamin，N.Y.，第二版编(1984)，Harlow和Lane， 抗体实验室手册，冷泉港实验室(1988)和Hunkapiller和Hood， 自然，323，15-16(1986)，其被本文引作参考)。
嵌合抗体为通常通过遗传工程的方法从属于不同种的免疫球蛋白基因片段构建其轻链和重链基因的抗体。例如，来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区(V)片段可与人恒定区(C)片段，如γ1和γ3相连。因此，典型的治疗性嵌合抗体为由V或来自小鼠抗体的抗原结合区和C或来自人抗体的效应子区组成的杂交蛋白，虽然可使用其它哺乳动物种类。
如本文所采用，如Kabat等在 所引用的书中所定义的，术语“框架区”指单一种中不同的免疫球蛋白中相对保守的(即不是CDR’s)免疫球蛋白轻链的重链可变区的那些部分。如本文所采用的，“人框架区”为与天然产生的人抗体的框架区基本相同(大约85％或更多)的框架区。
如本文所采用的，术语“人源化免疫球蛋白”指包含人框架，至少一个来自非人抗体以及其中存在的任一恒定区基本上与人免疫球蛋白恒定区相同，即至少约85-90％，优选至少95％相同的的CDR的免疫球蛋白。因此，除开可能的CDR’s，人源化免疫球蛋白的所有部分基本上与一个或多个天然人免疫球蛋白序列的对应部分相同。例如，人源化免疫球蛋白不包括嵌合的小鼠可变区/人恒定区抗体。
人源化抗体在用于人类治疗中比小鼠和一些情况下的嵌合抗体具有至少三个可能的优点：
由于效应子部分为人的，它可更好地与人免疫系统的其它部分相互作用(例如通过补体依赖细胞毒性(CDC)或抗体依赖细胞细胞毒性(ADCC)更有效地摧毁靶细胞)。
人免疫系统不将人源化抗体的框架或C区识别为外源性的，因此针对该注射抗体的抗体反应应比针对整个外源小鼠抗体或部分外源嵌合抗体小。
已报道注射的小鼠抗体在人体循环中具有正常抗体的半衰期更短的半衰期(Shaw，D. 等免疫学杂志，138，4534-4538(1987))。推测注射的人源化抗体具有基本上与天然产生的人抗体相同的半衰期，这使得可施用更小和更少频率的剂量。
在一个方面，本发明涉及编码来自能结合VT2的B亚基的免疫球蛋白，如单克隆抗体MuVTm1.1的重链和/或轻链CDR’s的重组多核苷酸。编码这些区域的多核苷酸通常与编码适宜人框架区的多核苷酸相连。对于人框架区，将提供CDR的非人免疫球蛋白的框架或可变区氨基酸序列与人免疫球蛋白序列组中的对应序列比较，选择具有高同源性的序列。在表达上编码包含单克隆抗体MuVTm1.1的重链和轻链CDR’s的多肽链的作为实例的多核苷酸包括在图1中。如下所述，由于密码子的简并性和非关键氨基酸的取代，其它多核苷酸序列可容易地替代那些序列。可如下进行人源化免疫球蛋白的设计。当一个氨基酸归于下面的分类中时，使用的人免疫球蛋白(受体免疫球蛋白)的框架氨基酸被来自提供CDR的非人免疫球蛋白(供体免疫球蛋白)的框架氨基酸代替：
受体免疫球蛋白的人框架区中的氨基酸在该位置对于人免疫球蛋白是不常见的，而受体免疫蛋白中的对应氨基酸在该位置对于人免疫球蛋白是常见的；
氨基酸的位置紧邻一个CDR’s；或
在免疫球蛋白的三极结构模型中，CDR的一个氨基酸为约3_(分别参见Queen等，在所引用的书中和Co等 Proc.Natl.Acad.Sci.USA88，2869(1991)，其均被本文引作参考)。
当受体免疫球蛋白的人框架区中的各个氨基酸和受体免疫球蛋白中的对应的氨基酸在该位置对于人是不常见的，该氨基酸在该位置被人免疫球蛋白常见的氨基酸代替。
对于人源化免疫球蛋白制备的详细描述参见Queen等 所引用的书 中和Co等 所引用的书中。
多核苷酸通常进一步包括可操作性地与人免疫球蛋白编码序列相连的表达调控多核苷酸序列，包括天然相关或异源启动子区。优选地，表达调控序列为能转化或转染真核宿主细胞的载体的真核启动子系统，但也可使用用于原核宿主的调控序列。一旦载体被搀入适宜的宿主中，在适宜于核苷酸序列的高水平表达的条件下培养宿主，如果需要，可接着进行轻链、重链、轻链/重链二聚体或完整的抗体、结合片段或其他免疫球蛋白形式收集和纯化。
能最终表达所需人源化抗体的本发明的核酸序列可从各种不同的多核苷酸(基因组或cDNA、RNA、合成的寡核苷酸等)和各部分(例如V、J、D和C区)以及通过各种不同的技术形成。连接适宜的基因组和合成序列是目前最常用的制备方法，但也可使用cDNA序列(参见欧洲专利申请公开号0239400和Riechmann，L.等 自然332，323-327(1988)，其均被本文引作参考)。
可根据熟知的方法从各种人细胞，但优选无限增殖的B细胞来分离人恒定区DNA序列(参见Kabat，在引用的书中和WP87/02671)。制备本发明的免疫球蛋白的CDR’s将类似地从能与VT2抗原结合并在任何常规的哺乳动物来源中产生的单克隆抗体产生，其中哺乳动物来源包括小鼠、大鼠、兔或其他能通过熟知的方法产生抗体的脊椎动物。用于多核苷酸序列的适宜来源的细胞和用于免疫球蛋白表达和分泌的宿主细胞可从许多来源获得，如美国典型培养物中心( 细胞系和杂 交瘤分类，第五版(1985)Rockville，Maryland，美国，其被本文引作参考)。
除开本文具体描述的人源化免疫球蛋白，其他“基本上同源”的修饰的免疫球蛋白可容易地通过使用本领域技术人员熟知的各种重组DNA技术来设计和制备。例如，框架区可在一级结构的水平上通过几个氨基酸的取代、末端和中间的插入和缺失等从天然序列变化而来。而且，各种不同的人框架区可被单独或结合使用作为本发明的人源化免疫球蛋白的基础。通常，可容易地通过各种熟知的技术完成基因的修饰，如定点诱变(参见Gillman和Smith， 基因8，81-97(1979)和Roberts等自然328，731-734(1987)，其均被本文引作除开)。
另一方面，可制备仅包含抗体一级结构的一部分的多肽片段，该片段拥有一种或多种免疫球蛋白活性(例如补体结合活性)。这些多肽可通过本领域熟知的方法，通过蛋白裂解完整抗体，或通过使用定点诱变在载体所需位置插入终止密码子，如在CH1之后产生Fab片段或在铰链区之后以产生F(ab’)2片段来制备。可通过将VL和VH与DNA接头相连来制备单链抗体(参见Huston等， 在引用的书中和Bird等 在 引用的书中)。而且由于类似于许多基因，免疫球蛋白相关基因包含分离的功能区，每一个具有一个或多个独特的生物活性，因此，可将基因与来自其他基因的功能区融合以产生具有新特性的融合蛋白。
如前所述，在序列开操作性地(即被定位以确保其功能)与表达调控序列相连后，多核苷酸将在宿主中表达。这些表达载体通常可以游离基因或作为宿主染色体DNA的整合部分的形式在宿主生物中复制。通常，表达载体包含选择标记，例如四环素或新霉素，以使得能检测用所需DNA序列转染的那些细胞(参见例如美国专利4,704,362，其被本文引作参考)。
大肠杆菌为尤其可用于克隆本发明的多核苷酸的原核宿主细胞。适用的其他微生物宿主包括细菌，如 枯草芽孢杆菌和其他肠细菌，如沙门氏菌属、 沙雷氏菌属和各种 假单孢菌属的种。在这些原核宿主，还可制备通常包含与宿主细胞相容的表达调控序列(例如复制的起点)的表达载体。此外，存在大量各种熟知的启动子，如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统，或来自λ噬菌体的启动子系统。启动子通常调控表达，任选使用操纵序列来调控，并具有用于启动和完成转录和转译的核糖体结合位点序列等。
其他微生物，如酵母也可被用于表达。 酵母为优选的宿主，具有带有表达调控序列的适宜的载体，如启动子，包括如所需的3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶，复制的启动子、终止序列等。
除开微生物，哺乳动物组织细胞培养物还可被用来表达和制备本发明的多肽(参见Winnacker， 从基因至克隆，VCH出版，N.Y.，N.Y.(1987)，其被本文引作参考)。真核细胞确实是优选的，由于在现有技术中已开发了许多适宜的能分泌完整免疫球蛋白的宿主细胞系，包括CHO细胞系、各种COS细胞系、Hela细胞，优选骨髓瘤细胞系等，或转化的骨髓瘤B细胞。用于这些细胞的表达载体可包括表达调控序列，如复制起点，启动子和增强子(Queen等 免疫学综述89，46-68(1986)，其被本文引作参考)，和必需的加工信息位点，如核糖体结合位点，RNA剪接位点、聚腺苷酸环化位点和转录终止序列。优选的表达调控序列为来源于免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。
包含感兴趣的多核苷酸序列(例如重链和轻链编码序列和表达调控序列)的载体可以熟知的方法转入宿主细胞中，其根据宿主细胞的类型而变化。例如，氯化钙转染被通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他宿主细胞(通常参见Maniatis等 分子克隆：实验室手 册，冷泉港出版(1982)，其被本文引作参考)。
一旦表达，本发明的整个抗体、其二聚体、各轻链和重链或其他免疫球蛋白形式可根据本领域的标准方法纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳等(通常参见Scopes，R.， 蛋白质纯化，Springer-Verlag，N.Y.(1982)，其被本文引作参考)。对于药物用途，优选具有至少约90-95％均一性的基本上纯的免疫球蛋白，最优选98-99％或更高均一性。一旦如所需地被部分纯化或纯化均一的，多肽可接着被治疗性地使用(包括体外)或用于开发和进行分析步骤以及免疫荧光染色等中(通常参见 免疫学方法，I和II卷，Lefkovits和Pernis编，AcademicPress，纽约，N.Y.(1979和1981))。
本发明的免疫球蛋白通常分别在治疗产维罗毒素大肠杆菌(VTEC)感染和溶血性尿毒症(HUS)的毒性作用和/或中和VT2抗原中找到用途。通过非限制性的实例，适宜于治疗的一些典型的疾病症状包括肠局部出血性结肠炎、肾功能紊乱和脑损伤。
本发明人源化的免疫球蛋白和其药物组合物尤其可用于胃肠外给药，即经皮下、肌肉内或静脉内给药。用于胃肠外给药的组合物通常包含溶解在可接受载体中的免疫球蛋白溶液或其混合物，优选含水载体。可使用各种含水载体，例如水、缓冲液、0.4％盐溶液、0.3％甘氨酸、5％葡萄糖、人清蛋白溶液等。这些溶液为无菌的，通常不含特定的物质。这些组合物可通过常规熟知的灭菌方法灭菌。这些组合物可包含药物可接受的用来接近生理条件所需的赋形剂物质，如pH调节剂和缓冲剂、张力剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠、柠檬酸钠等。根据选择的具体的给药途径，这些制剂中的免疫球蛋白的浓度可广泛地变化，即从小于约0.5％，通常至少约1％至15％或20％(重量计)，并将主要根据液体的体积、粘度等来进行选择。
因此，用于注射的典型的药物组合物可被制备成包含1ml无菌缓冲水溶液和1-10mg免疫球蛋白。用于静脉内注射的典型的组合物可被制备成包含250ml无菌Ringer’s溶液和150mg免疫球蛋白。用于制备可胃肠外给药组合物的实际方法对于本领域技术人员来讲是显而易见的，详细描述在例如 Remington’sPharmaceuticalScience，第15版，MackPublishingCompany，Easton，宾夕法尼亚州(1980)，其被本文引作参考。
本发明的免疫球蛋白可被冷冻或冷冻干燥以用于贮存和在使用前用适宜的载体重新配制。该技术对于常规的免疫球蛋白已显示是有效的，并可采用现有技术已知的冷冻干燥和重新配制方法。本领域技术人员知道冷冻干燥和重新配制可导致不同程度的免疫球蛋白活性的丧失(例如对于常规的免疫球蛋白，IgM抗体比IgG抗体可能具有更大的活性损失)和可能不得不调节使用水平以进行补偿。
包含本发明人源化免疫球蛋白或其混合物的组合物可被给药用于治疗或预防性治疗。在治疗性应用中，组合物被以足以治疗或至少部分抑制毒性症状和其综合症的量给药至已经患有产生维罗毒素的大肠杆菌感染和溶血性尿毒症(HUS)或具有其他来自VT2抗原的毒性症状的患者。足以完成此目的的量被定义为“治疗有效量”。在预防性应用中，组合物以足以预防或可检测地抑制由于VT2抗原造成的这些感染和/或其毒性症状的量给药至处于感染危险中的患者。用于这些用途的有效量取决于疾病的严重性和患者自身免疫系统的一般状况，但通常使用的剂量一般为从约0.1-5mg/kg免疫球蛋白/患者的范围。必须记住本发明的物质可通常用于重病中，即危害生命或可能危害生命的情况。在这些情况下，由于通过本发明的人源化免疫球蛋白获得的外源物质的减少和较低的“外源物质”排异的可能性，治疗医生可能并且可望给药本质上过量的这些免疫球蛋白。
可根据治疗医生选择的剂量水平和方式进行组合物的一次或多次给药。在任何情况下，药物制剂应提供足以有效治疗患者的量的本发明的免疫球蛋白。
在具体的实施方案中，包含本发明人源化免疫球蛋白的组合物可被用于检测产维罗毒素大肠杆菌感染(VTEC)和溶血性尿毒症(HUS)和/或其他产生VT2或VT2V感染中的VT2抗原。因此，本发明的人源化免疫球蛋白，如与通过MuVTm1.1抗体证实的抗原决定簇结合的人源化免疫球可被标记并用于确定包含显著浓度的VT2或VT2V的解剖学位点。例如，但不局限于，一个或多个标记部分可与人源化免疫球蛋白相连。作为实例的标记部分包括，但不局限于不透X线染料、放射对比剂、荧光分子、自旋标记分子、酶或其他具有诊断价值的标记部分，尤其是在放射学或磁共振成像技术中。
本发明人源化免疫球蛋白可进一步在各种体外应用中找到用途。例如，免疫球蛋白可用于检测VT2抗原等。
对于诊断目的，免疫球蛋白可被标记或不标记。未标记的免疫球蛋白可与其他与人源化免疫球蛋白反应的标记抗体(二抗)一起结合使用，如特异于人免疫球蛋白恒定区的抗体。另一方面，可直接标记免疫球蛋白。可采用各种标记，如放射性核素、荧光、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、配体(尤其是半抗原)等。许多类型的免疫分析法是可行的并为本领域技术人员所熟知。
含有讨论的免疫球蛋白的试剂盒也可被用来保护或检测细胞活性或选择的抗原的存在。因此，本发明讨论的免疫球蛋白组合物可以在容器中通常为冷冻各种的形式，单独或与特异于所需细胞类型的其他抗体结合来提供。可能与标记物或毒素结合或未结合的免疫球蛋白和缓冲液如Tris、磷酸盐、碳酸盐等、稳定剂、防腐剂、杀生物剂、惰性蛋白等、血清白蛋白等以及一份使用说明一起包括在试剂盒中。通常，这些物质以少于基于活性免疫球蛋白的量的约5wt.％的量存在，通常以总量为基于活性免疫球蛋白的量的至少约0.001％wt.的量存在。经常可望它包含惰性补充剂或赋形剂以稀释活性成分，其中赋形剂可以整个组合物的约1-99％wt.的量存在。在分析中采用能与免疫球蛋白结合的二抗时，这通常存在于单个管形瓶中。二抗通常与标记物结合并以与上述免疫球蛋白配制类似的方法配制。
人抗体
在本发明的另一个方面，提供与小鼠VTm1-1竞争结合维罗毒素II或维罗毒素II变异体的人抗体。
a.三杂交瘤(Trioma)方法
用于本方法中的基本方法和作为实例的细胞融合配偶体SPAZ-4已由Oestberg等 杂交瘤2：361-367(1983)；Oestberg，美国专利号4,634,664；和Engleman等美国专利号4,634,666(它们均被本文引作参考)所描述。通过本方法获得的产生抗体的细胞系称为三杂交瘤，由于它们来自于三个细胞-两个来自人，一个来自小鼠。开始时，将小鼠骨髓瘤细胞系与人B淋巴细胞融合以获得不产生抗体的异种杂交细胞，如上文由Oestberg描述的SPAZ-4细胞系。接着将异种细胞与免疫的人B淋巴细胞融合以获得产生抗体的三杂交瘤细胞系。发现三杂交瘤产生比由人细胞制备的普通的杂交瘤更稳定的抗体。
B淋巴细胞从供者的血液、脾、淋巴结或骨髓中获得。
由于启动有害的反应的危险性，用维罗毒素II或维罗毒素II变异体体内免疫人通常是不希望的。因此，通常用这些抗原或这些抗原中的一种的抗原性片段或含有其中之一的细胞体外免疫B淋巴细胞。一般在补充有10％人血清的培养基，如RPMI-1640中(参见上文Engleman)，将B淋巴细胞暴露于抗原中7-14天。
通过熟知的方法将免疫的B淋巴细胞与异种杂交细胞，如SPAZ-4融合。例如，约37℃下，将细胞用40-50％的MW为1000-4000的聚乙二醇处理约5-10分钟。将细胞从融合混合物中分离并在为所需杂交选择的培养基中增殖(例如HAT或AH)。分泌具有所需结合特异性的抗体的克隆通过分析三杂交瘤培养基的与维罗毒素II或维罗毒素II变异体结合活性来确定。产生具有所需特异性的人抗体的三杂交瘤通过例如有限稀释方法来亚克隆并在培养基中体外培养。
虽然，三杂交瘤为遗传稳定的，但它们不能以极高水平产生抗体。可通过将来自三杂交瘤的抗体基因克隆至一个或多个表达载体中，并将载体转化至细胞系中，如下文讨论的细胞系以表达重组或人源化的免疫球蛋白来增加表达水平。
b.转基因非人哺乳动物
与维罗毒素II和/或维罗毒素II毒素反应的人抗体也可从具有编码至少一个人免疫球蛋白基因座片段的转基因的非人转基因哺乳动物制备。通常这些转基因哺乳动物的内源免疫球蛋白基因座被功能性失活。优选地，人免疫球蛋白基因座的片段包括重链和轻链部分的未重排序列。内源免疫球蛋白基因失活和外源免疫球蛋白基因的导入可通过靶定的同源重组或通过导入YAC染色体来完成。从该方法产生的转基因哺乳动物能够功能性地重排免疫球蛋白部分的序列，并表达由人免疫球蛋白基因编码的各种同型抗体的所有组成成分，而不表达内源免疫球蛋白基因。具有这些性质的哺乳动物的制备和特性由例如Lonberg等详细描述在WO 93/12227(1993)；Kucherlapati，WO 91/10741(1991)中(为此目的其均被本文引作参考)。转基因小鼠尤其适宜。如上文Lonberg或Kucherlapati所描述的，通过免疫转基因非人哺乳动物获得抗体。通过例如使用常规的Kohler-Milstein技术将来自这些哺乳动物的B细胞与适宜的骨髓瘤细胞系融合来制备单克隆抗体。
提供下面的实施例作为例证而非起限制作用。应理解虽然实施例涉及HuVTm1.1抗体，产生对VT2抗原的B亚基具有高亲和力的人源化抗体，但还设想使用与VT2表位结合的来自其他单克隆抗体的CDR’s。
实验
实施例1：用VT2类毒素免疫小鼠
如Oku等 微生物病原体，1989，6(2)，113-122描述来制备VT2。37℃下，用0.4％甲醛的0.1M磷酸缓冲液，pH7.6将1mg纯化的VT2处理7天来制备VT2类毒素。
通过腹膜内(i.p.)注射，将Balb/c小鼠(NipponCharlesRiver)用与Freund氏完全佐剂(GibcoBRL)混合的VT2类毒素免疫。约4周后，通过腹膜内注射，小鼠获得与Freund氏完全佐剂混合的VT2类毒素。接着，依次以1至5周的间隔，通过腹膜内注射，小鼠获得与Freund氏不完全佐剂混合的VT2类毒素(1ug两次，4ug两次，5ug一次)。
通过切断尾静脉让小鼠放血，37℃下，将血液培养30分钟来收集血清，并以3000rpm离心10分钟。如下通过ELISA测定对VT2的血清效价：
将96井平底平板(Falcon3912，BectonDickinson)的各井用以0.01M磷酸缓冲盐溶液(PBS)稀释的50ul 1ug/mlVT2覆盖，室温下培养1小时。
将各井用PBS-0.05％Tween20洗涤3次。
室温下，将各井用PBS-3％BSA封闭1小时。将各井用PBS-0.05％Tween20洗涤3次。将50ul用PBS系列稀释的血清加入至各井中并在室温下培养1小时。
将各井用PBS-0.05％Tween20洗涤3次。
向各井中加入50ul用PBS-3％BSA稀释(×1000)的碱性磷酸酶结合山羊抗小鼠IgG(ZYMED)，室温下培养1小时。
向各井中加入磷酸对硝基苯酯(PNPP：WakoChemicals)并在室温下培养1小时。
405nm下，测定并记录各井的吸光率。
实施例2.通过细胞融合方法构建杂交瘤
选择其血清包含对VT2具有活性的抗体的小鼠并取其脾脏。将5×107个脾细胞与5×106P3×63Ag8U.1(P3U1)小鼠骨髓瘤细胞混合并用RPMI1640培养基洗涤一次，1500rpm离心5分钟。将细胞沉淀轻轻分散并重新悬浮在1ml聚乙二醇(PEG)溶液(包含RPMI1640培养基5.75ml+PEG3.5ml+二甲基亚砜0.75ml)并轻轻旋转2分钟。接着加入1mlRPMI培养基并旋转2分钟。此后，加入2mlRPMI培养基并旋转2分钟。加入4mlGIT-HAT培养基(95uM次黄嘌呤，0.4uM氨基嘌呤，1.6uM胸苷，5％FCS)并旋转2分钟。接着加入8mlGIT-HAT培养基并旋转2分钟。37℃培养30分钟后，将细胞悬液转至接种了104个小鼠腹膜巨嗜细胞/井的96井平底平板的各井中。将平板在37℃5％CO2-95％空气培养箱培养1周。接着将各井中的一半培养基用新鲜的GIT-HT培养基(不含氨基嘌呤的GIT-HAT培养基)替换，将平板培养约1周以培养杂交瘤细胞。
实施例3：分泌抗VT2抗体的小鼠杂交瘤细胞的筛选
通过选择分泌与VT2结合并中和VT2的抗体的杂交瘤细胞进行筛选。杂交瘤上清被用于筛选。根据实施例1描述的ELISA方法测定结合活性。根据下面方法测定VT2中和活性。
向96井平板的各井中加入30ul杂交瘤上清和30ul200pg/mlVT2的10％FCS-MEM溶液。
37℃下，将平板培养1小时。
将50ul上面的溶液加入至接种了Vero细胞(ATCC)(4×104细胞/井)的96井平底平板的各井中。
37℃下，在5％CO2-95％空气的培养箱中将平板培养4天。
将100ul0.014％中性红加入至各井中。
37℃下，将平板培养1小时以染色活细胞。
在用PBS洗涤各井后，将100ul包含1％乙酸(ETOH-AcOH)溶液的50％乙醇溶液加入至各井中。
550nm下，测定并记录各井的吸光率。
实施例4；杂交瘤细胞的克隆
通过有限稀释进行杂交瘤细胞的克隆。将一至两个杂交瘤细胞加入至事先用104的作为饲养细胞的小鼠腹膜巨嗜细胞接种的96井平底平板的各井中。约2周后，分别如实施例1和实施例3所描述的，测定上清与VT的结合以及对VT2的中和。通过将如上所述的该克隆方法重复数次，建立分泌中和VT2的单克隆抗体的杂交瘤细胞克隆。
实施例5：MuVTm1.1的纯化
用包含胰岛素、运铁蛋白、乙醇胺和亚硒酸盐的eRDF基本无血清培养基培养分泌MuVTm1.1的杂交瘤细胞。将培养基上清通过ProteinG柱(Pharmacia)并使用标准方法洗脱抗体。用丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)证实抗体的纯度，用SRID确定其浓度。如实施例3所描述，检测纯化的MuVTm1.1的中和VT2变异体的能力。结果示于下表和图7中。
表1
MuVTm1.1对各种VT2变异体的中和活性
    菌株     来源  毒素类型     中和
    大肠杆菌0157V50     人  VT2vh     +
    大肠杆菌0157V354     人  VT2vh     +
    大肠杆菌0157V601     人  ？     +
    大肠杆菌0157:H7TK40     人  VT2，VT2vx1*     +
    大肠杆菌0157:H7TK51     人  VT2vx1     +
   大肠杆菌091:H21     人  VT2vha，VT2vhb     +
*VT2vx为VT2变异体的新亚型
实施例6：小鼠VTm1.1可变区cDNA的克隆和测序
使用锚式PCR(Co等， 免疫学杂志148：1149(1992))从分离自杂交瘤细胞的mRNA克隆小鼠VTm1.1(MuVTm1.1)重链和轻链可变区cDNA。将使用的5’引物对加入至cDMA的poly-dG尾退火，3’引物对恒定区退火。接着将扩增的基因片段插入至质粒pUC18中。从一些独立克隆确定核苷酸序列的VL和VHcDNA。对于重链，确定对小鼠重链可变区典型的单个独特序列。对于轻链，确定均与小鼠轻链可变区序列同源的两个独特序列。然而，由于在V-J接头处导致框架的移动的一个缺失核苷酸，一个序列是非功能性的，并被确定为无效等位基因。另一个序列为功能性小鼠kappa链可变区的特性。重链的可变区cDNA序列和功能性轻链以及转译的氨基酸序列示于图1中。小鼠Vk序列属于Kabat氏小鼠kappa链亚组V。小鼠VH属于Kabat氏重链亚组III(D)。
实施例7：人源化VTm1.1可变区的设计
为了保留人源化抗体中小鼠抗体的结合亲和性，采用Queen等的一般方法(Queen等 Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：10029(1989)和美国专利号5,585,089和5,693,762)。在保持高结合活性中框架残基的选择是关键。原则上，来自任何人抗体的框架序列可作为CDR嫁接的模板；然而，已证实将CDR直接置换入该框架中可导致对抗体的结合亲和性的显著丧失(Glaser等， 免疫学杂志149：2606(1992)；Tempest等 生物技 术9：266(1992)；Shalaby等 实验医学杂志17：217(1992))。人抗体与起始小鼠抗体越同源，人框架将错乱导入可降低亲和性的小鼠CDR中的可能性越小。基于对Kabat数据库的序列特异性检索(Kabat等， 免疫学 感兴趣的蛋白质的序列，第五版，美国健康和人类保障系，1991)，选择人抗体GF4来提供与MuVTm1.1抗体良好的框架同源性。其他高同源的人抗体链也适宜于提供人源化抗体框架，尤其是来自如Kabat所定义的人亚组III的kappa轻链和来自人亚组III的重链。
计算机程序ABMOD和ENCAD(Levitt等， 分子生物学杂志168：595(1983))被用来构建VTm1.1可变区的分子模型，其中该可变区被用来定位与CDR足够靠近以致可能与它们相互作用的VTm1.1框架中的氨基酸。为了设计人源化VTm1.1重链和轻链可变区，将来自小鼠VTm1.1抗体的CDR与人GF4抗体的框架区嫁接。在计算机模型表明与CDR明显接触的框架位置，来自小鼠抗体的氨基酸取代最初的人框架氨基酸。对于人源化VTm1.1，这在重链的残基29，30，49和98和轻链的残基49进行。而且，仅仅很少出现在它们在人抗体数据库位置上的框架残基在那些位置被人保守氨基酸置换。对于人源化VTm1.1，这在重链的残基1，4，5，79，89和93以及轻链的残基3，4，19，76，79和85中进行。
人源化VTm1.1抗体重链和轻链可变区的序列，包括起始密码子和信号肽序列示于图2中。然而，许多可能的CDR接触残基被可仍然使得抗体对抗原基本上保持亲和性的其他氨基酸取代。下表列出了许多框架中其他氨基酸可能为适宜的位置(LC＝轻链，HC＝重链)。
表2
    位置     人源化VTm1.1     替换物
    LC-49     K     Y
    HC-29     F     S
    HC-30     S     K
    HC-49     A     S
    HC-98     R     K
同样，许多不与人源化VTm1.1重链和轻链中的CDR接触的框架残基可容纳来自人GF4抗体、其他人抗体、小鼠VTm1.1抗体或其他小鼠抗体的相应位置的氨基酸的取代，而没有人源化抗体的亲和性或非免疫原性的显著丧失。下表列出了许多框架中其他氨基酸可能适宜的其他位置。
表3
    位置     人源化VTm1.1     替代物
    LC-3     V     L
    LC-4     L     M
    LC-19     A     V
    LC-76     S     N
    LC-79     E     Q
    LC-85     V     L，M
    HC-1     E     Q
    HC-4     L     V
    HC-5     V     L
    HC-79     L     V
    HC-89     E     D
    HC-93     V     M，I
各种其他氨基酸的选择可被用来制备各种具有变化组合的亲和性、特异性、非免疫原性、生产的简易性和其他所需特性的人源化VTm1.1。因此，以说明而非限制性的方式提供上表中的实施例。
实施例8：人源化VTm1.1的构建
一旦如上构建了人源化可变区的氨基酸序列，构建基因以编码它们，包括信号肽、剪接供体信号和适宜的限制性位点(图2)。使用长度为约65-80个碱基的重叠的合成寡核苷酸构建和扩增轻链和重链可变区基因，如图3所示(参见He等 免疫学杂志160：1029(1998))。将寡核苷酸成对退火并用DNA聚合酶I的Klenow片段延伸，产生四个双链片段。将产生的片段变性，退火并用Klenow延，产生两个片段。将这些片段变性，成对退火并再延伸一次，产生全长基因。使用Taq聚合酶通过聚合酶链反应(PCR)扩增产生的产物，凝胶纯化，用XbaI消化，再凝胶纯化，并亚克隆至pVk或pVgl表达载体的XbaI位点。用于各轻链和重链表达的pVk和pVgl载体以前已被描述(参见Co等免疫学杂志148：1149(1992))。
通过核苷酸测序和限制性内切酶作图证实最后质粒的结构。通过本领域技术人员熟知的标准方法进行所有DNA操作。
为了构建产生人源化VTm1.1的细胞系，将重链和轻链质粒转染至小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0-Ag14(ATCCCRL1581)。转染前，使用FspI线性化包含重链和轻链的质粒。在PBS中将约20ug各种质粒转染至1×107细胞中。根据制造商的说明，在360V和25uFD容量下，使用GenePulser装置(BioRad)电穿孔进行转染。将来自各个转染的细胞平板接种在四个96井组织培养平板中，两天后，使用选择培养基(DMEM，10％FCS，1×HT补充物(Sigma)，0.25mg/ml黄嘌呤，1ug/ml霉酚酸)。
约两周后，通过ELISA筛选出现的克隆的抗体产生。来自高产量克隆的抗体通过在常规培养基(具有10％FCS的DMEM)中将细胞培养至铺满，接着用无血清培养基(杂交瘤SMF；Gibco)替换培养基并培养直至在培养基中获得最大的抗体效价来制备。将培养物上清通过蛋白A-Sepharose柱(Pharmacia)；将抗体用0.1M甘氨酸，100mMNaCl，pH3洗脱，中和并接着交换至磷酸缓冲盐溶液(PBS)中。通过在丙烯酰胺凝胶分析证实抗体的纯度，通过OD280读数确定其浓度，假定1.0mg抗体蛋白具有1.4的OD280读数。
实施例9：人源化VTm1.1的性质
亲和性测定
MuVTm1.1和HuVTm1.1抗体对维罗毒素II(VT2)的亲和性通过与生物素化MuVTm1.1抗体竞争性结合来确定。实验方法描述如下：
将DynatechLaboratoriesImmulon296井平板(部分#0110103455)用50ulVT2溶液(0.2ug/ml的PBS溶液)覆盖。37℃下，轻轻摇动培养2小时。
吸出VT2溶液。用400ul洗涤缓冲液(0.1％Tween20的PBS缓冲液)将各井洗涤4次。
室温下，将各井用400ulPierceSuperBlock封闭缓冲液的PBS溶液(分类#37515)封闭30分钟。
吸出封闭溶液。用400ul洗涤缓冲液将各井洗涤4次。
向各井中加入与各种浓度的未标记小时或VTm1.1抗体混合的总体积为100ul结合缓冲液(1％BSA，0.1％Tween20的PBS溶液)的20ng生物素化MuVTm1.1抗体。4℃下，轻轻摇动培养过夜。吸出抗体溶液。将各井用400ul洗涤缓冲液洗涤4次。向各井中加入100ul过氧化物酶结合的抗生蛋白链菌素(Bioscource分类#5NN2004)(用结合缓冲液1∶500稀释)。37℃下，轻轻摇动培养1小时。
吸出抗生蛋白链菌素溶液。将各井用400ul洗涤缓冲液洗涤6次。
加入100ul/井过氧化物酶底物(BioRad#172-1064)。室温下培养直至产生颜色。415nm，用MolecularDevicesELISA平板读出器读取平板。
如图4所示，结果证实在竞争性ELISA分析中，人源化VTm1.1抗体很好地与生物素化的小鼠抗体竞争，在与小鼠抗体比较时为2倍。
HuVTm1.1和MuVTm1.1的亲和性还使用BIAcore方法来计算。如下表中所示，HuVTm1.1的计算的KD为约3.6×10-9M，对于MuVTm1.1为1.9×10-9M：
表4
    MuVTm1.1     HuVTm1.1
    Ka     9.9×104M-1S-1     9.5×104M-1S-1
    Kd     1.9×104S-1     3.4×104S-1
    Kp     1.9×10-9M     3.6×10-9
实施例10：HuVTm1.1的体外中和活性
HuVTm1.1
在下面描述的体外分析法中，还与小鼠MuVTm1.1比较，测定了HuVTm1.1的中和活性：
将来源于人肾的细胞系(ACHN)以1×104个细胞/井接种
至96井平板中，并在37℃培养24小时。
吸出培养基，37℃下，将预温育1小时的用10％FCS-MEM稀释的30ul540pg/mlVT2溶液与30ul用10％FCS-MEM稀释的测试抗体(小鼠或人源化VTm1.1)的混合溶液加入至各井中并37℃培养4天。
将100ul0.028％中性红的培养基加入至各井中并在37℃下培养1小时(Mullbacher，A.等，1984，免疫学方法杂志， 68，205-215)。
吸出溶液。将各井用150ulPBS洗涤两次。
将100ul50％EtOH/1％AcOH加入至各井中并室温下培养5-10分钟。
使用MolecularDevicesELISA平板读出器记录各井在550nm处的吸光率。根据下面的公式计算中和活性：
Figure C9980638300331
HuVTm1.1与MuVTm1.1中和活性的比较示于图5中。HuVTm1.1的ED50为0.33ug/ml，MuVTm1.1的ED50为0.2ug/ml。HUVTm1.1对VT2变异体的中和活性示于下面：
表5
体外HuVTm1.1VT2变异体中和分析
      菌株  来源 毒素类型  ED50(ug/ml)
 大肠杆菌0157   人  VT2     0.33
 大肠杆菌0157(V50)   人  VT2vh     0.36
 大肠杆菌0157(V354)   人  VT2vh     0.39
 大肠杆菌0157(V601)   人  VT2v     0.32
 大肠杆菌0157:H7(TK40)   人  VT2，VT2vx*     0.35
*VT2vx：VT2变异体的新的亚型
实施例11：识别的VT2抗原的分析
VT2减少，A和B亚基通过包含SDS的聚丙烯酰胺凝胶分离并通过蛋白质印迹方法转移至硝酸纤维素膜上(BioRad)。硝酸纤维素膜用3％BSA的PBS溶液封闭过夜，接着室温下，与用3％BSA的PBS溶液稀释的10ug/mlHuVTm1.1或兔抗VT2血清反应1小时。将膜用1％BSA-PBS洗涤6次，室温下，与用3％BSA的PBS溶液稀释的25ug/ml碱性磷酸酶结合的山羊抗人IgG(TAGO)或碱性磷酸酶结合的山羊抗兔IgG(TAGO)反应。将膜用1％BSA-PBS洗涤6次，室温下与NBT(硝酸-氯化四氮唑兰)-BCIP(5-溴-4-氯-3’-吲哚磷酸对甲苯胺盐)溶液(PIERCE)反应10分钟。示于图6的结果表明HuVTm1.1主要与VT的B亚基结合。
实施例12：体内HuVTm1.1对VT2的活性
经静脉途径对DdY小鼠(NipponSLC)注射4.8ug无菌HuVTm1.1、MuVTm1.1或PBS。1小时后，经腹膜途径(i.p.)对小鼠注射46ngVT2(对应于10LD50)。一周后，测定小鼠的存活率。
下表显示结果。HuVTm1.1完全保护小鼠免于由VT2导致的死亡。
表6
    处理     存活小鼠
    PBS     100％(5/5)
    VT2     0％(0/5)
    HuVTm1.1+VT2     100％(5/5)
    MuVTm1.1+VT2     100％(5/5)
从上可知，本发明的人源化免疫球蛋白提供许多优于其他抗VT特异性抗体的优点。与小鼠单克隆抗体的比较，本发明的人源化免疫球蛋白基本上包含很少的非人和可能的免疫原性氨基酸序列。在注射至患者后降低的抗原性可能性代表显著的治疗性改进。
上面所引用的所有出版物和专利申请在相同程度上被本文引作参考，正如每一出版物或专利申请具体并独立地被引用作为参考。虽然为了清楚和理解的目的，本发明已通过说明和实施例的方式进行了详细描述，显然在所附权利要求的范围内可进行一些变化和修改。

Claims (19)

1.在人可变区框架中包含至少一个非人抗体互补决定区的人源化抗体，其中该抗体为人源化形式的小鼠抗体VTm1-1，所述小鼠抗体的特征在于图1B所示的轻链可变区和图1A所示的重链可变区，以及其中人源化抗体特异性结合VT2和/或VT2变异体。
2.权利要求1的人源化抗体，该抗体与小鼠抗体VTm1-1竞争特异性结合VT2和/或VT2变异体。
3.权利要求1的人源化抗体，该抗体包含示于图2A的重链可变区和示于图2B的轻链可变区。
4.权利要求1的人源化抗体，其中所述抗体包含两对轻链/重链二聚体，其中每一条链包含一个可变区和一个恒定区。
5.权利要求1的人源化抗体，其为Fab片段或F(ab’)2 。
6.权利要求1的人源化抗体，其为纯化的形式。
7.权利要求1的人源化抗体，其具有IgG1免疫球蛋白同型。
8.一种制备人源化抗体的方法，该方法包括培养编码权利要求1-7任一项的人源化抗体的重链和轻链的细胞系，从而表达人源化抗体；以及回收由细胞系表达的人源化抗体。
9.包含权利要求1-7任一项的人源化抗体和药物学可接受载体的药物组合物。
10.权利要求1-7任一项的人源化抗体在制备用于治疗患有或处于维罗毒素II和/或维罗毒素II变异体毒性作用危险中的患者的药物中的应用。
11.权利要求10的应用，其中人源化抗体与小鼠抗体VTm1-1竞争特异性结合维罗毒素II或维罗毒素II变异体。
12.权利要求10的应用，其中人源化抗体特异性地与VT2和/或VT2变异体的B亚基结合。
13.权利要求10的应用，其中人源化抗体特异性地与VT2和/或VT2变异体结合并中和VT2和/或VT2变异体。
14.权利要求10的应用，其中人源化抗体特异性地与VT2的B亚基和/或VT2变异体的B亚基结合并中和VT2和/或VT2变异体。
15.权利要求10的应用，其中人源化抗体为小鼠VTm1-1抗体的人源化形式。
16.权利要求10的应用，其中抗体为包含图2A所示的重链可变区和图2B所示的轻链可变区的人源化抗体。
17.权利要求10的应用，其中患者为被产维罗毒素大肠杆菌感染并治疗性地施用人源化抗体。
18.权利要求10的应用，其中患者为处于被产生维罗毒素的大肠杆菌感染的危险中并预防性地施用人源化抗体。
19.产生权利要求1-7任一项的人源化抗体的细胞系。
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Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7910096B2 (en) 1996-11-15 2011-03-22 Trustees Of Tufts College Human neutralizing antibodies against hemolytic uremic syndrome
CA2646319A1 (en) 2006-04-20 2007-11-01 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine , Incorporated Methods and compositions based on shiga toxin type 1 protein
RU2011126896A (ru) 2009-01-23 2013-02-27 Дзе Хенри М. Джексон Фаундейшн Фо Дзе Эдвенсмент Оф Милитэри Медисин, Инк. Композиция и полипептид для стимулирования иммунологической реакции на шига токсин 2 типа
CA2913702C (en) * 2013-05-27 2023-08-01 Inmunova S.A. Chimeras of brucella lumazine synthase and beta subunit of ab5 toxins
SG10201806025TA (en) * 2014-01-16 2018-08-30 Mario Umberto Francesco Mondelli Neutralizing human monoclonal antibodies against hepatitis b virus surface antigen

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3236667B2 (ja) 1991-06-28 2001-12-10 三菱化学株式会社 ヒト型モノクローナル抗体およびそれをコードする遺伝子、ハイブリドーマ並びに抗腫瘍剤
GB9125979D0 (en) 1991-12-06 1992-02-05 Wellcome Found Antibody
CA2132953C (en) 1992-03-26 2001-01-30 Howard C. Krivan Monospecific polyclonal antibodies to shiga-like toxins
CA2078716A1 (en) 1992-09-21 1994-03-22 Joyce De Azavedo Attaching and effacing protein of enterohemorrhagic e. coli
US5747272A (en) 1994-02-14 1998-05-05 Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine Detection of shiga-like toxins of enterohemoragic Escherichia coli
CA2116179C (en) 1994-02-22 2008-01-08 C. A. Lingwood Verotoxin pharmaceutical compositions and medical treatments therewith
WO1996030043A1 (en) 1995-03-24 1996-10-03 Ophidian Pharmaceuticals Treatment for verotoxin-producing escherichia coli
CA2163716C (en) 1995-11-24 2009-05-19 Clifford A. Lingwood Verotoxin pharmaceutical compositions and medical treatments therewith
DE19641466A1 (de) 1996-10-09 1998-04-16 Biotest Pharma Gmbh Orale Anwendung eines Immunglobulinpräparates zur Prävention des Hämolytischen Urämischen Syndroms sowie Präparat hierfür
WO1998020903A1 (en) 1996-11-15 1998-05-22 Trustees Of Tufts College Humanized neutralizing antibodies against hemolytic uremic syndrome
US20030170248A1 (en) 1997-12-23 2003-09-11 Jeffrey R. Stinson Humanized monoclonal antibodies that protect against shiga toxin induced disease

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins

Also Published As

Publication number Publication date
KR20010052367A (ko) 2001-06-25
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JP2002515230A (ja) 2002-05-28
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WO1999059629A1 (en) 1999-11-25
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EP1079856A4 (en) 2002-03-13
ES2270598T3 (es) 2007-04-01
ATE335504T1 (de) 2006-09-15
JP4044733B2 (ja) 2008-02-06

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