PT1079856E - Anticorpos humanizados que reconhecem a verotoxina ii e linha celular que os produz - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Anticorpos humanizados que reconhecem a verotoxina II e linha celular que os produz"

REFERÊNCIA CRUZADA COM UM PEDIDO RELACIONADO

Este pedido tem prioridade relativamente a USSN 60/086570, apresentado a 20 de Maio de 1998.

CAMPO DO INVENTO O presente invento refere-se geralmente à combinação de tecnologias de ADN recombinante e anticorpos monoclonais para desenvolvimento de novos produtos biológicos e, mais particularmente, por exemplo, à produção (em humanos) de imunoglobulinas não imunogénicas específicas para o antigénio da Verotoxina II (VT2) e os antigénios de variantes de Verotoxina II (VT2V) e suas utilizações in vitro e in vivo. O presente invento refere-se também mais especificamente a anticorpos monoclonais humanizados contra VT2 que são capazes de neutralizar VT2 e VT2V, sequências polinucleotídicas que codificam os anticorpos, um método de produzir os anticorpos, composições farmacêuticas compreendendo o anticorpo como ingrediente activo, agentes terapêuticos para tratar infecção por E. coli produtora de Verotoxina (VTEC) e Síndroma Urémica Hemolítica (HUS) compreendendo o anticorpo como ingrediente activo, e métodos de tratar tais doenças.

ANTECEDENTES DO INVENTO

Sabe-se que a Verotoxina (VT), também conhecida como toxina semelhante a Shiga (SLT), causa diarreia sangrenta e o desenvolvimento da síndroma urémica hemolítica na infecção por E. coli produtora de Verotoxina (VTEC). Um dos agentes etiológicos da infecção por VTEC é a E. coli 0157 virulenta. A VT pode também ser produzida por outras bactérias que não as que causam a infecção por VTEC que pode também resultar numa síndroma tóxica em humanos. Nas crianças ou em adultos idosos com respostas imunitárias reduzidas, a VT produzida pelas bactérias que crescem nos intestinos pode entrar na corrente sanguínea através da destruição das células epiteliais 2 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ intestinais. Isto pode induzir a Síndroma Urémica Hemolítica (HUS) que é caracterizada por disfunção renal e por vezes danos cerebrais (ver, p. ex., Karmali, M. et ai., The Lancet 1: 619-620, 1983); Siegler, R., The Journal of Pediatrics 125: 511-518, 1994). Até à data, não existe nenhum fármaco eficaz para estas síndromas tóxicas. Os antibióticos não demonstraram eficácia a impedir a progressão das síndromas tóxicas (ver, p. ex., Cárter, A. et al., The New England Journal of Medicine 316: 1496-1500, 1987; Griffen, P. et al., Annals of Internai Medicine 109: 705-712, 1988). Isto poderia ser por causa da libertação de VT das bactérias mortas pelos antibióticos e da ineficácia dos antibióticos contra VT.

Existem dois tipos de Verotoxina, (ou toxina semelhante a Shiga) a Verotoxina I (VT1 ou SLT-1) e a Verotoxina II (VT2 ou SLT-2) (Ver, 0'Brien et ai., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 180: 65-94, 1992). A E. coli produtora de VT2 foi isolada a partir de pacientes sofrendo de infecção por VTEC (Ver, Russmann et al. , J. Med. Microbiol. 40(5): 338-343, 1994). Ostroff et al., J. Infect. Dis. 160 : 994-998, 1989 e Kleanthous et al., Arch. Dis. child. 65: 722-727, 1990 relatam que as estirpes de E. coli 0157 que continham VT2 mas não VT1 estavam mais frequentemente associadas a HUS. Existem variantes de VT2 adicionais (VT2V) que foram também isoladas clinicamente (Ver, p. ex., Microb. Pathog. 8 : 47-60, 1990; FEBS Lett. 79: 27-30, 1991; Microb. Pathog. 5: 419-426, 1988; e J. Bacteriol. 170: 4223-4230, 1988). Armstrong et al., J. Infect. Dis. 171(4): 1042-1045, 1995 testaram um absorvente de VT em ensaios clínicos, no entanto este fármaco funciona apenas no intestino e não está disponível para absorver VT que tenha alcançado a corrente sanguínea. Uma preparação de γ-globulina mostrou uma actividade de neutralização muito baixa para VT2 em comparação com aquela para VT1 (Ashkenazi, S. et ai., The journal of Pediatrics 113 : 1008-1014, 1988; Morooka, T. et al., Acta Paediatrica Japonica 38: 294-295, 1996). Foi relatado um anticorpo monoclonal de ratinho que neutraliza VT2. No entanto, foi relatado que este anticorpo mostra uma afinidade de ligação relativamente baixa para VT2V (Schmitt, C. et ai., Infection and Immunity 59: 1065-1073, 1991) . 3 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ

Mais, a utilização de anticorpos monoclonais de murideo tais como os descritos acima tem certos inconvenientes no tratamento humano, particularmente em regimes terapêuticos repetidos como explicado abaixo. Os anticorpos monoclonais de ratinho, por exemplo, tendem a ter uma semivida curta nos seres humanos, e não têm outras importantes caracteristicas funcionais das imunoglobulinas quando utilizados em humanos.

Adicionalmente, os anticorpos monoclonais de murideo contêm substanciais sequências de aminoácidos que serão imunogénicas quando injectadas num paciente humano. Numerosos estudos mostraram que, após injecção de um anticorpo estranho, a resposta imunitária provocada por um paciente contra o anticorpo injectado pode ser bastante forte, eliminando essencialmente a utilidade terapêutica do anticorpo após um tratamento inicial. Além disso, se forem utilizados anticorpos monoclonais de ratinho ou outros antigénicos (para seres humanos) para tratar várias doenças humanas, tratamentos subsequentes com anticorpos de ratinho não relacionados podem ser ineficazes ou mesmo perigosos eles próprios, devido a reactividade cruzada.

Embora a produção dos designados “anticorpos quiméricos" (p. ex., regiões variáveis de ratinho unidas a regiões constantes humanas) se tenha mostrado de certa forma bem sucedida, permanece um problema significativo de imunogenicidade. Em geral, a produção de imunoglobulinas humanas reactivas com o antigénio VT2 com elevada afinidade, tal como com muitos antigénios, seria extremamente difícil utilizando técnicas típicas de produção de anticorpos monoclonais humanos.

Assim, existe a necessidade de formas melhoradas de imunoglobulinas humanizadas específicas para o antigénio VT2 que sejam substancialmente não imunogénicas em humanos, mas no entanto produzidas de forma fácil e económica de um modo apropriado para formulação terapêutica e outras utilizações. O presente invento preenche estas e outras necessidades. 4 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ

SUMÁRIO DO INVENTO O presente invento proporciona anticorpos humanizados que se ligam especif icamente a VT2 e/ou a uma variante de VT2. Alguns destes anticorpos ligam-se especificamente à subunidade B de VT2 e/ou à subunidade B da variante de VT2. Alguns destes anticorpos neutralizam VT2 e/ou uma variante de VT2. Os anticorpos preferidos neutralizaram VT2 e/ou uma variante de VT2 de forma a proporcionar pelo menos 50%, 75%, 95% ou 100% de protecção em ratinhos ou outro mamífero confrontados com 10 DL50 de VT2 e/ou de uma variante de VT2.

Alguns anticorpos humanizados são uma forma humanizada do anticorpo de ratinho VTml-1, sendo o anticorpo de ratinho caracterizado por uma região variável da cadeia leve mostrada na Fig. 1B e uma região variável de cadeia pesada mostrada na Fig. IA. O presente invento proporciona ainda anticorpos humanizados que competem com o anticorpo de ratinho VTml-1 pela ligação específica a VT2 e/ou a uma variante de VT2.

Alguns dos anticorpos humanizados, tal como descrito acima, compreendem regiões determinantes de complementaridade do anticorpo de ratinho VTml-1 e estruturas da região variável da cadeia pesada e leve das estruturas da cadeia pesada e leve do anticorpo humano GF4, com a condição de que pelo menos uma posição seleccionada de entre o grupo que consiste em L49, H29, H30, H49 e H98 seja ocupada pelo aminoácido presente na posição equivalente da estrutura da região variável da cadeia pesada ou leve do anticorpo de ratinho VTml-1. Tais anticorpos humanizados ligam-se especificamente a verotoxina II com uma constante de afinidade entre 107 M_1 e três, cinco ou dez vezes a afinidade do anticorpo de ratinho VTml-1.

Nalguns anticorpos humanizados descritos no parágrafo precedente, cada posição seleccionada de entre o grupo que consiste em L49, H29, H30, H49 e H98 é ocupada pelo aminoácido presente na posição equivalente da estrutura da região variável da cadeia pesada ou leve do anticorpo de ratinho VTml-1. 5 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ

Nalguns dos anticorpos humanizados de cima, pelo menos uma posição seleccionada de entre o grupo L3, L4, L19, L76, L79, L85, Hl, H4, H5, H79, H89 e H93 é ocupada por um aminoácido presente na posição equivalente de uma sequência de consenso da cadeia pesada ou leve do anticorpo humano. Nalguns anticorpos humanizados cada posição seleccionada de entre o grupo L3, L4, L19, L76, L79, L85, Hl, H4, H5, H79, H89 e H93 é ocupada por um aminoácido presente na posição equivalente de uma sequência de consenso da cadeia pesada ou leve do anticorpo humano.

Alguns anticorpos humanizados compreendem uma região variável da cadeia pesada mostrada na Fig. 2A e uma região variável da cadeia leve mostrada na Fig. 2B com a condição de que uma ou mais posições seleccionadas de entre o grupo que consiste em L49, H29, H30, H49, H98, L3, L4, L19, L76, L79, L85, Hl, H4, H5, H79, H89 e H93 possam ser substituídas tal como mostrado nas Tabelas 2 e 3.

Alguns anticorpos humanizados compreendem uma região variável da cadeia pesada mostrada na Fig. 2A e uma região variável da cadeia leve mostrada na Fig. 2B.

Alguns anticorpos humanizados compreendem uma cadeia pesada humanizada possuindo pelo menos 85% de identidade com a cadeia pesada humanizada mostrada na Fig. 2A e uma cadeia leve humanizada possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência com a cadeia leve humanizada mostrada na Fig. 2B, com a condição de que pelo menos uma posição seleccionada de entre o grupo que consiste em L49, H29, H30, H49 e H98 seja ocupada pelo aminoácido presente na posição equivalente da estrutura da região variável da cadeia pesada ou leve do anticorpo de ratinho VTml-1.

Alguns dos anticorpos humanizados, tal como descritos acima, compreendem dois pares de dímeros de cadeia leve/pesada, em que cada cadeia compreende uma região variável e uma região constante.

Alguns dos anticorpos humanizados, tal como descritos acima, são um fragmento Fab ou um F(ab')2· 6 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ

Opcionalmente, os anticorpos humanizados, tal como descritos acima, são proporcionados numa forma purificada.

Alguns anticorpos humanizados, tal como descritos acima, têm um isotipo de imunoglobulina igGi. O presente invento proporciona ainda métodos de produção do anticorpo VTml-1 humanizado. Tais métodos compreendem a cultura de uma linha celular, que codifica cadeias de cadeia pesada e leve de qualquer um dos anticorpos descritos acima, através da qual o anticorpo humanizado é expresso; e recuperação do anticorpo humanizado expresso pela linha celular. Alguns desses métodos compreendem ainda a mistura do anticorpo com um transportador farmaceuticamente aceitável para produzir uma composição farmacêutica. O presente invento proporciona ainda composições farmacêuticas compreendendo qualquer um dos anticorpos descritos acima e um transportador farmaceuticamente aceitável. Uma tal composição preferida compreende um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada mostrada na Fig. 2A e uma região variável da cadeia leve mostrada na Fig. 2B. O presente invento proporciona ainda a utilização de qualquer um dos anticorpos descritos acima no fabrico de um medicamento para o tratamento de um paciente que sofra ou esteja em risco de efeitos tóxicos de uma verotoxina.

Os métodos de tratar um paciente sofrendo ou em risco de efeitos tóxicos de uma verotoxina, compreendem a administração ao paciente de uma dosagem eficaz de um anticorpo humano ou humanizado que se ligue especificamente à verotoxina II e/ou a uma variante da verotoxina II. Nalguns desses métodos, o anticorpo compete com o anticorpo de ratinho VTml-1 para ligação específica à verotoxina II ou à variante da verotoxina II. Nalguns desses métodos, o anticorpo humanizado liga-se especif icamente à VT2 e/ou a uma variante de VT2. Nalguns desses métodos, o anticorpo humanizado liga-se especificamente à subunidade B de VT2 e/ou da variante de VT2. Nalguns desses métodos, o anticorpo humanizado liga-se especificamente a VT2 e/ou à variante de VT2 e neutraliza a VT2 e/ou a variante de VT2. Nalguns desses métodos, o anticorpo humanizado liga-se 7 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ especificamente à subunidade B de VT2 e/ou à subunidade B de uma variante de VT2 e neutraliza a VT2 e/ou a variante de VT2. Nalguns desses métodos, o anticorpo é um anticorpo humanizado, que é uma forma humanizada do anticorpo de ratinho VTml-1. Nalguns desses métodos, o anticorpo é um anticorpo humanizado que compreende uma região variável da cadeia pesada mostrada na Fig. 2A e uma região variável da cadeia leve mostrada na Fig. 2B. Nalguns desses métodos, o paciente está infectado com E. coli produtora de verotoxina e o anticorpo é administrado terapeuticamente. Nalguns desses métodos, o paciente está em risco de infecção por E. coli produtora de verotoxina e o anticorpo é administrado profilacticamente. Alguns desses métodos compreendem ainda a monitorização do paciente quanto à recuperação dos efeitos tóxicos da verotoxina II ou de uma variante da verotoxina II.

Noutro aspecto, o presente invento proporciona uma linha celular que produz qualquer um dos anticorpos acima descritos. O presente invento proporciona composições novas úteis, por exemplo, no tratamento de infecção por E. coli produtora de Verotoxina (VTEC) e de Síndroma Urémica Hemolítica (HUS), contendo as composições imunoglobulinas humanizadas especificamente capazes de se ligar à subunidade B do antigénio VT2 e de neutralizar VT2 e variantes de VT2. As imunoglobulinas podem ter dois pares de complexos cadeia leve/cadeia pesada, compreendendo pelo menos uma cadeia, uma ou mais regiões determinantes de complementaridade de ratinho funcionalmente unidas a segmentos da região estrutural humana. Por exemplo, podem ser introduzidas regiões determinantes de complementaridade de ratinho, com ou sem resíduos de aminoácidos de ratinho adicionais naturalmente associados, em regiões estruturais humanas para produzir imunoglobulinas humanizadas capazes de se ligar ao antigénio a níveis de afinidade mais fortes que cerca de 107 M_1. Estas imunoglobulinas humanizadas serão também capazes de bloquear a ligação do anticorpo monoclonal de ratinho que doa a CDR a VT2 .

As imunoglobulinas humanizadas do presente invento podem ser facilmente produzidas através de uma variedade de técnicas de ADN recombinante, com expressão final em células 8 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ transfectadas, de preferência células eucarióticas imortalizadas, tais como células de mieloma ou hibridoma.

Podem ser produzidos, sinteticamente ou através da combinação do ADNc apropriado com segmentos de ADN genómico, polinucleótidos compreendendo uma primeira sequência de codificação para regiões da estrutura da imunoglobulina humanizada e um segundo conjunto de sequências codificando para as desejadas regiões determinantes de complementaridade da imunoglobulina.

As imunoglobulinas humanizadas podem ser utilizadas numa forma substancialmente pura no tratamento de potenciais efeitos tóxicos de VT2 ou VT2V, tais como os produzidos durante a infecção por E. coli produtora de Verotoxina (VTEC) e a Síndroma Urémica Hemolítica (HUS). As imunoglobulinas humanizadas ou os seus complexos podem ser preparados numa forma de dosagem farmaceuticamente aceitável, que variará dependendo do modo de administração.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Figura 1. 0 ADNc e as sequências de aminoácidos traduzidas das regiões variáveis da cadeia pesada (A) (SEQ ID NOS: 1 e 2) e da cadeia leve (B) (SEQ ID NOS: 3 e 4) do anticorpo de ratinho VTml.1 (MuVTml.l). As regiões determinantes de complementaridade (CDR) estão sublinhadas e os primeiros aminoácidos das cadeias maduras estão duplamente sublinhados.

Figura 2. O ADNc e as sequências de aminoácidos traduzidas das regiões variáveis da cadeia pesada (A) (SEQ ID NOS: 5 e 6) e da cadeia leve (B) (SEQ ID NOS: 7 e 8) do anticorpo VTml.1 humanizado (HuVTml.l). As regiões determinantes de complementaridade (CDR) estão sublinhadas e os primeiros aminoácidos das cadeias maduras estão duplamente sublinhados.

Figura 3. Esquema para a síntese do ADNc da região variável do anticorpo humanizado.

Figura 4. Ligação competitiva dos anticorpos MuVTml.l e HuVTml.l à Verotoxina II de E. coli (VT2). Foram incubadas 9 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ concentrações crescentes de anticorpo competidor com VT2 revestida na presença de marcador biotinilado MuVTml.1. A absorvância foi medida e representada contra a concentração dos anticorpos competidores não marcados.

Figura 5. Actividade neutralizante in vitro de HuVTml.1 versus MuVTml.1.

Figura 6. Identificação do antigénio reconhecido (a subunidade B de VT2) de HuVTml.1.

Figura 7. Actividade neutralizante de MuVTml.1 contra VT2 e variante de VT2.

DEFINIÇÕES A frase "substancialmente idênticas" no contexto de ácidos nucleicos ou polipéptidos (p. ex., ADN codificando uma imunoglobulina humanizada ou a sequência de aminoácidos da imunoglobulina humanizada) refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que tenham pelo menos cerca de 80%, de preferência 85%, 90-95% ou uma identidade de resíduos de nucleótidos ou aminoácidos superior, quando comparadas e alinhadas para uma correspondência máxima, medida utilizando o seguinte método de comparação de sequências e/ou através de inspecção visual. Tais sequências "substancialmente idênticas" são tipicamente consideradas como sendo homólogas. De preferência, a "identidade substancial" existe ao longo de uma região da sequência que tem pelo menos cerca de 50 resíduos de comprimento, de preferência ao longo de uma região com pelo menos cerca de 100 resíduos e de maior preferência as sequências são substancialmente idênticas ao longo de pelo menos cerca de 150 resíduos, ou ao longo de todo o comprimento das duas sequências a comparar. Tal como descrito abaixo, quaisquer duas sequências de anticorpo apenas podem ser alinhadas de um modo, através da utilização do sistema de numeração de Kabat. Portanto, para anticorpos, a percentagem de identidade tem um significado único e bem definido.

As sequências de aminoácidos das regiões variáveis das cadeias pesada e leve maduras das imunoglobulinas são designadas Hx e Lx, respectivamente, onde x é um número que 10 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ designa a posição de um aminoácido de acordo com o esquema de Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (National Institutes of Health, Bethesda MD, 1987 e 1991). Kabat lista muitas sequências de aminoácidos para anticorpos para cada subgrupo e lista o aminoácido que ocorre mais frequentemente para cada posição de aminoácido nesse subgrupo para criar uma sequência de consenso. Kabat utiliza um método para atribuir um número de resíduo a cada aminoácido numa sequência listada, e este método para atribuição de números a resíduos tornou-se padrão no campo. O esquema de Kabat é extensível a outros anticorpos não incluídos no seu compêndio através do alinhamento do anticorpo em questão com uma das sequências de consenso em Kabat por referência aos aminoácidos conservados. Por exemplo, um aminoácido na posição L50 de um anticorpo humano ocupa a posição equivalente a um aminoácido na posição L50 de um anticorpo de ratinho.

As substituições de aminoácidos conservativas referem-se à possibilidade de troca de resíduos possuindo cadeias laterais semelhantes. Por exemplo, um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais alifáticas é glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais hidroxilo alifáticas é serina e treonina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias contendo amida é asparagina e glutamina; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais aromáticas é fenilalanina, tirosina e triptofano; um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais básicas é lisina, arginina e histidina; e um grupo de aminoácidos possuindo cadeias laterais contendo enxofre é cisteína e metionina. Os grupos de substituição conservativa de aminoácidos preferidos são: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina.

Podem ser pesquisados análogos das sequências de anticorpo exemplificadas quanto à manutenção da actividade de ligação utilizando métodos de apresentação fágica tal como descrito, por exemplo, por Cesareni, FEBS Lett 307: 66-70, 1992; Swimmer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 3756-60, 1992; Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 3576-80, 1992; Clackson et al., Nature 352: 624-8, 1991; Scott e Smith, Science 249: 386-90, 1990; Garrard et al., Bio/Techniques 9: 11 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ 1373-1377, 1991, que são aqui incorporados por referência na sua totalidade para todos os fins. O termo "substancialmente puro" significa que uma espécie objecto é a espécie predominante presente (i.e., numa base molar é mais abundante que qualquer outra espécie individual na composição) e de preferência uma fracção substancialmente purificada é uma composição em que a espécie do objecto compreende pelo menos cerca de 50 porcento (numa base molar) de todas as espécies macromoleculares presentes. Geralmente, uma composição substancialmente pura compreenderá mais do que aproximadamente 80 a 90 porcento de todas as espécies macromoleculares presentes na composição. De maior preferência, a espécie objecto é purificada até homogeneidade essencial (não se consegue detectar espécies contaminantes na composição através dos métodos de detecção convencionais) em que a composição consiste essencialmente numa única espécie macromolecular. A competição entre anticorpos é determinada através de um ensaio em que a imunoglobulina em teste inibe a ligação especifica de um anticorpo de referência a um determinante antigénico. São conhecidos numerosos tipos de ensaios de ligação competitiva, por exemplo: radioimunoensaio directo ou indirecto de fase sólida (RIA), imunoensaio enzimático directo ou indirecto de fase sólida (EIA), ensaio de competição em sanduíche (ver Stahli et al., Methods in Enzymology 9: 242-253, 1983); EIA biotina-avidina directo de fase sólida (ver Kirkland et al., J. Immunol. 137: 3614-3619, 1986); ensaio marcado directo de fase sólida, ensaio em sanduíche marcado directo de fase sólida (ver Harlow e Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)); RIA marcado directo de fase sólida utilizando o marcador 1-125 (ver Morei et al., Molec. Immunol. 25(1): 7-15, 1988); EIA biotina-avidina directo de fase sólida (Cheung et al., Virology 176: 546-552, 1990); e RIA marcado directo (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32: 77-82, 1990). Geralmente a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Anticorpos identificados através de ensaio de competição (anticorpos competidores) incluem anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência e anticorpos que se ligam a um epítopo adjacente suficientemente proximal ao 12 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ epítopo ao qual se liga o anticorpo de referência para que ocorra impedimento espacial. Geralmente, quando um anticorpo competidor está presente em excesso, este inibe a ligação especifica de um anticorpo de referência a um designado alvo antigénico em pelo menos 50 ou 75%.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

De acordo com o presente invento, são proporcionadas imunoglobulinas humanizadas especificamente reactivas com a subunidade B de VT2. Estas imunoglobulinas, que têm afinidades de ligação à subunidade B de VT2 de pelo menos cerca de 107 M_1 a IO10 M-1, e de preferência 106 M_1 a IO10 M_1 ou mais forte, são capazes de, p. ex., neutralizar a toxicidade de VT2 e VT2V (os antigénios VT2). As imunoglobulinas humanizadas terão uma estrutura humana e terão uma ou mais regiões determinantes de complementaridade (CDR) de uma imunoglobulina, tipicamente uma imunoglobulina de ratinho, especificamente reactivas com os antigénios VT2. Numa concretização preferida, uma ou mais das CDR virão do anticorpo MuVTml.1. Assim, as imunoglobulinas do presente invento, que podem ser produzidas de forma económica em grandes quantidades, encontram utilização, por exemplo, no tratamento dos efeitos tóxicos da infecção por E. coli produtora de Verotoxina (VTEC) e da Sindroma Urémica

Hemolítica (HUS) em pacientes humanos através de uma variedade de técnicas.

Sabe-se que a unidade estrutural básica do anticorpo compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto por dois pares idênticos de cadeias polipeptidicas, possuindo cada par uma cadeia "leve" (cerca de 25 kDa) e uma "pesada" (cerca de 50-70 kDa) . A porção amino-terminal de cada cadeia inclui uma região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos primeiramente responsáveis pelo reconhecimento do antigénio. A porção carboxi-terminal de cada cadeia define uma região constante primeiramente responsável pela função efectora.

As cadeias leves são classificadas como capa ou lambda. As cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou épsilon e definem o isotipo do anticorpo como IgG, IgM, igA, IgD e IgE, respectivamente. Dentro das cadeias leves e pesadas, as regiões variáveis e constantes são unidas por 13 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ uma região "J" e cerca de 12 ou mais aminoácidos, com a cadeia pesada a incluir também uma região "D" ou cerca de mais 10 aminoácidos (ver, geralmente, "Immunology Fundamental", Paul, W., Ed., Capítulo 7, págs. 131-166, Raven Press, N.Y. (1984)).

As regiões variáveis de cada par cadeia leve/pesada formam o local de ligação do anticorpo. As cadeias exibem todas a mesma estrutura geral de regiões estruturais relativamente conservadas unidas por três regiões hipervariáveis, também chamadas Regiões Determinantes de Complementaridade ou CDR (ver, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," Kabat, E., et al., U.S. Departament of Health and Human Services, (1987); e Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917, 1987). As CDR das duas cadeias de cada par são alinhadas pelas regiões estruturais, permitindo a ligação a um epítopo específico.

Tal como aqui se utiliza, o termo "imunoglobulina" refere-se a uma proteína que consiste num ou mais polipéptidos substancialmente codificados por genes de imunoglobulina. Os genes de imunoglobulina reconhecidos incluem os genes das regiões constantes capa, lambda, alfa, gama, delta, épsilon e mu, bem como os incontáveis genes das regiões variáveis das imunoglobulinas. As imunoglobulinas podem existir numa variedade de formas para além dos anticorpos; incluindo, por exemplo, Fv, Fab e F(ab'>2 bem como anticorpos híbridos bifuncionais (p. ex., Lanzavecchia et al., Eur. J. Immunol. 17: 105, 1987) e em cadeias únicas (p. ex., Huston et al.,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879-5883, 1988) e Bird et al., Science 242: 423-426, 1988) (Ver, geralmente, Hood et al., "Immunology", Benjamin, N.Y., 2a ed. (1984), Harlow e Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor

Laboratory (1988)) e Hunkapiller e Hood, Nature 323: 15-16, 1986) .

Os anticorpos quiméricos são anticorpos cujos genes da cadeia leve e pesada foram construídos, tipicamente através de engenharia genética, a partir de segmentos de genes de imunoglobulina pertencentes a uma espécie diferente. Por exemplo, os segmentos variáveis (V) dos genes de um anticorpo monoclonal de ratinho podem ser unidos a segmentos constantes 14 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ (C) humanos, tais como γι e 73. Um anticorpo quimérico terapêutico típico é assim uma proteína híbrida que consiste no domínio V ou de ligação ao antigénio de um anticorpo de ratinho e no domínio C ou efector de um anticorpo humano, embora possam ser utilizadas outras espécies de mamífero.

Tal como aqui se utiliza, o termo "região estrutural" refere-se às porções das regiões variáveis da cadeia leve e pesada da imunoglobulina que são relativamente conservadas (i.e., para além das CDR) entre diferentes imunoglobulinas numa única espécie, tal como definido por Kabat, et al., op. cit. Tal como aqui se utiliza, "uma região estrutural humana" é uma região estrutural que é substancialmente idêntica (cerca de 85% ou mais) à região estrutural de um anticorpo humano de ocorrência natural.

Tal como aqui se utiliza, o termo "imunoglobulina humanizada" refere-se a uma imunoglobulina compreendendo uma estrutura humana, pelo menos uma CDR de um anticorpo não humano, e na qual qualquer região constante presente é substancialmente idêntica a uma região constante de uma imunoglobulina humana, i.e., pelo menos cerca de 85-90%, de preferência pelo menos 95% idêntica. Assim, todas as partes de uma imunoglobulina humanizada, excepto possivelmente as CDR, são substancialmente idênticas às partes correspondentes de uma ou mais sequências da imunoglobulina humana nativa. Por exemplo, uma imunoglobulina humanizada não englobaria um anticorpo quimérico de região variável de ratinho/região constante humana.

Os anticorpos humanizados possuem pelo menos três potenciais vantagens em relação aos anticorpos de ratinho e nalguns casos aos quiméricos para utilização em terapia humana:

Como a porção efectora é humana, pode interagir melhor com as outras partes do sistema imunitário humano (p. ex., destruir as células alvo mais eficientemente através da citotoxicidade dependente do complemento (CDC) ou da citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). O sistema imunitário humano não deverá reconhecer a estrutura ou a região C do anticorpo humanizado como 15 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ estranha, e portanto a resposta de anticorpos contra um tal anticorpo injectado deverá ser menor que contra um anticorpo de ratinho totalmente estranho ou um anticorpo quimérico parcialmente estranho.

Foi relatado que os anticorpos de ratinho injectados têm uma semivida na circulação humana muito mais curta que a semivida dos anticorpos normais (Shaw, D. et al., J. Immunol. 138: 4534-4538, 1987). Os anticorpos humanizados injectados terão presumivelmente uma semivida essencialmente idêntica aos anticorpos humanos de ocorrência natural, permitindo que sejam dadas doses menores e menos frequentes.

Num aspecto, o presente invento é dirigido a imunoglobulinas humanizadas que são codificadas por polinucleótidos recombinantes codificando as CDR da cadeia pesada e/ou leve de uma imunoglobulina capaz de se ligar à subunidade B de VT2, tal como o anticorpo monoclonal MuVTml.1 e regiões estruturais humanas apropriadas. Tal como para a região estrutural humana, uma sequência de aminoácidos da região estrutural ou variável de uma imunoglobulina não humana proporcionadora de CDR é comparada com as sequências correspondentes numa colecção de sequências de imunoglobulinas humanas, e é seleccionada uma sequência que possua homologia elevada. Os polinucleótidos exemplares, que sob expressão codificam para as cadeias polipeptidicas que compreendem as CDR das cadeias pesada e leve do anticorpo monoclonal MuVTml.1 estão incluídos na Fig. 1. Devido à degenerescência dos codões e a substituições de aminoácidos não críticas, outras sequências polinucleotídicas podem ser facilmente substituídas por essas sequências, tal como detalhado abaixo. A concepção de imunoglobulinas humanizadas pode ser realizada como se segue. Quando um aminoácido recai na seguinte categoria, o aminoácido da estrutura de uma imunoglobulina humana a utilizar (imunoglobulina aceitadora) é substituído por um aminoácido da estrutura de uma imunoglobulina não humana proporcionadora de CDR (imunoglobulina dadora): o aminoácido na região estrutural humana da imunoglobulina aceitadora é invulgar para uma imunoglobulina humana nessa posição, enquanto que o aminoácido correspondente na imunoglobulina dadora é típico para uma imunoglobulina humana nessa posição; 16 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ a posição do aminoácido é imediatamente adjacente a uma das CDR; ou o aminoácido está dentro de cerca de 3 Â de uma CDR num modelo de estrutura terciária de imunoglobulina (ver,

Queen et al., op. cit., e Co et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88: 2869, 1991, respectivamente, ambas as quais são aqui incorporadas por referência).

Quando cada um dos aminoácidos na região estrutural humana da imunoglobulina aceitadora e um aminoácido correspondente na imunoglobulina dadora é invulgar para a imunoglobulina humana nessa posição, tal aminoácido é substituído por um aminoácido típico para uma imunoglobulina humana nessa posição.

Para uma descrição detalhada da produção de imunoglobulinas humanizadas ver, Queen et al., op. cit., e Co et al., op. cit.

Os polinucleótidos incluirão ainda tipicamente uma sequência polinucleotídica de controlo da expressão operativamente ligada às sequências de codificação da imunoglobulina humanizada, incluindo regiões promotoras naturalmente associadas ou heterólogas. De preferência, as sequências de controlo da expressão serão sistemas promotores eucarióticos em vectores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas, mas podem também ser utilizadas sequências de controlo para células hospedeiras procarióticas. Uma vez incorporado o vector no hospedeiro apropriado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para expressão de elevado nível das sequências nucleotídicas, e, conforme desejado, pode-se seguir a recolha e purificação das cadeias leves, cadeias pesadas, dímeros de cadeia leve/pesada ou anticorpos intactos, fragmentos de ligação ou outras formas de imunoglobulina.

As sequências de ácido nucleico capazes de finalmente expressar os anticorpos humanizados desejados podem ser formadas a partir de uma variedade de diferentes polinucleótidos (ADN genómico ou ADNc, ARN, oligonucleótidos sintéticos, etc.) e componentes (p. ex., as regiões V, J, D e C) bem como através de uma variedade de técnicas diferentes. A 17 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ união de sequências genómicas e sintéticas apropriadas é actualmente o método mais vulgar de produção, mas podem também ser utilizadas sequências de ADNc (ver, Publicação de Patente Europeia N° 0239400 e Riechmann, L. et al., Nature 332: 323-327, 1988, ambas as quais são aqui incorporadas por referência).

As sequências de ADN das regiões constantes humanas podem ser isoladas de acordo com procedimentos bem conhecidos a partir de uma variedade de células humanas, mas de preferência células B imortalizadas (ver, Kabat op. cit. e WO 87/02671). As CDR para produção das imunoglobulinas do presente invento serão derivadas de forma semelhante de anticorpos monoclonais capazes de se ligar aos antigénios VT2 e produzidos em qualquer fonte de mamífero conveniente, incluindo, ratinhos, ratos, coelhos ou outros vertebrados capazes de produzir anticorpos através de métodos bem conhecidos. As células fonte adequadas para as sequências polinucleotídicas e as células hospedeiras para expressão e secreção das imunoglobulinas podem ser obtidas a partir de várias fontes, tais como American Type Culture Collection, (Catálogo de Linhas Celulares e Hibridomas, Quinta edição (1985) Rockville, Maryland, EUA, que é aqui incorporado por referência).

Para além das imunoglobulinas humanizadas aqui descritas especificamente, outras imunoglobulinas modificadas "substancialmente homólogas" podem ser facilmente desenhadas e produzidas utilizando várias técnicas de ADN recombinante bem conhecidas dos peritos na arte. Por exemplo, as regiões estruturais podem variar das sequências nativas ao nível da estrutura primária em diversas substituições de aminoácidos, adições terminais e intermédias e deleções, e semelhantes. Para além disso, pode ser utilizada uma variedade de diferentes regiões estruturais humanas sozinhas ou em combinação como base para as imunoglobulinas humanizadas do presente invento. No geral, as modificações dos genes podem ser facilmente alcançadas através de uma variedade de técnicas bem conhecidas, tais como mutagénese dirigida ao local (ver, Gillman e Smith, Gene 8: 81-97, 1979 e Roberts S. et al., Nature 328: 731-734, 1987). 18 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ

Alternativamente, podem ser produzidos fragmentos polipeptidicos compreendendo apenas uma porção da estrutura primária de anticorpo, fragmentos esses que possuem uma ou mais actividades de imunoglobulina (p. ex., actividade de fixação do complemento). Estes fragmentos polipeptídicos podem ser produzidos por clivagem proteolítica de anticorpos intactos através de métodos bem conhecidos na arte, ou através da inserção de codões stop nas localizações desejadas nos vectores utilizando mutagénese dirigida ao local, tal como após CHI para produzir fragmentos Fab ou após a região charneira para produzir fragmentos F(ab')2- Anticorpos de cadeia simples podem ser produzidos através da união de VL e VH com um ligante de ADN (ver Huston et al., op. cit., e Bird et al., op. cit.). Também, tal como muitos genes, os genes relacionados com as imunoglobulinas contêm regiões funcionais separadas, possuindo, cada uma, uma ou mais actividades biológicas distintas, os genes podem ser fundidos com regiões funcionais de outros genes para produzir proteínas de fusão possuindo propriedades novas.

Tal como anteriormente afirmado, os polinucleótidos serão expressos em hospedeiros após as sequências terem sido operativamente ligadas a (i.e., posicionadas de forma a assegurar o funcionamento de) uma sequência de controlo da expressão. Estes vectores de expressão são tipicamente replicáveis nos organismos hospedeiros como epissomas ou como parte integrante do ADN cromossómico do hospedeiro. Vulgarmente, os vectores de expressão conterão um marcador de selecção, p. ex. tetraciclina ou neomicina, para permitir a detecção das células transformadas com as sequências de ADN desejadas (ver, p. ex., Patente U.S. N° 4704362, que é aqui incorporada por referência). A E. coli é um hospedeiro procariótico útil particularmente para clonagem dos polinucleótidos que codificam os anticorpos humanizados do presente invento. Outros hospedeiros microbianos adequados para utilização incluem bacilos, tais como Bacillus subtilis, e outras enterobacteriáceas, tais como Salmonella, Serratia, e várias espécies de Pseudomonas. Nestes hospedeiros procarióticos, pode-se também produzir vectores de expressão, que conterão tipicamente sequências de controlo da expressão compatíveis 19 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ com a célula hospedeira (p. ex., uma origem de replicação) . Adicionalmente, estará presente um número qualquer de uma variedade de promotores bem conhecidos, tal como o sistema promotor da lactose, um sistema promotor do triptofano (trp), um sistema promotor da beta-lactamase ou um sistema promotor do fago lambda. Os promotores controlarão tipicamente a expressão, opcionalmente com uma sequência operadora, e têm sequências do local de ligação ao ribossoma e semelhantes, para iniciar e terminar a transcrição e a tradução.

Outros micróbios, tais como leveduras, podem também ser utilizados para expressão. A Saccharomyces é um hospedeiro preferido, com os vectores adequados possuindo sequências de controlo da expressão, tais como promotores, incluindo 3-fosfoglicerato-quinase ou outras enzimas glicoliticas e uma origem de replicação, sequências de terminação e semelhantes, conforme desejado.

Para além de microrganismos, pode também ser utilizada uma cultura de células de tecidos de mamífero para expressar e produzir os polipéptidos do presente invento (ver, Winnacker, "From Genes to Clones", VCH Publishers, N.Y., N.Y. (1987)). As células eucarióticas são actualmente preferidas, porque várias linhas celulares hospedeiras adequadas capazes de segregar imunoglobulinas intactas foram desenvolvidas na arte, e incluem as linhas celulares CHO, várias linhas celulares COS, células HeLa, de preferência linhas celulares de mieloma, etc., ou células B transformadas de hibridomas. Os vectores de expressão para estas células podem incluir sequências de controlo da expressão, tais como uma origem de replicação, um promotor e um estimulador (Queen et al., Immunol. Rev. 89: 46-68, 1986), e locais de processamento de informação necessários, tais como locais de ligação ao ribossoma, locais de processamento do ARN e locais de poliadenilação, e sequências terminadoras da transcrição. Sequências de controlo da expressão preferidas são promotores derivados de genes de imunoglobulinas, SV40, Adenovírus, vírus do Papiloma Bovino, citomegalovírus e semelhantes.

Os vectores contendo as sequências polinucleotídicas de interesse (p. ex., as sequências codificando a cadeia pesada e leve e as sequências de controlo da expressão) podem ser 20 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ transferidos para a célula hospedeira através de métodos bem conhecidos, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção com cloreto de cálcio é vulgarmente utilizada para células procarióticas, enquanto que o tratamento com fosfato de cálcio ou a electroporação podem ser utilizados para outros hospedeiros celulares (ver, geralmente, Maniatis et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1982), que é aqui incorporado por referência).

Uma vez expressos, os anticorpos inteiros, seus dimeros, as cadeias leve e pesada individuais ou outras formas de imunoglobulina do presente invento podem ser purificadas de acordo com procedimentos padrão na arte, incluindo precipitação com sulfato de amónio, colunas de afinidade, cromatografia de coluna, electroforese em gel e semelhantes (ver, geralmente, Scopes, R., "Protein Purification", Springer-Verlag, N.Y. (1982)). Imunoglobulinas substancialmente puras com pelo menos cerca de 90 a 95% de homogeneidade são preferidas, e são mais preferidas com 98 a 99% ou mais de homogeneidade, para utilizações farmacêuticas. Uma vez purificados, parcialmente ou até à homogeneidade, conforme desejado, os polipéptidos podem então ser utilizados terapeuticamente (incluindo extracorporalmente) ou no desenvolvimento e na realização de procedimentos de ensaio, colorações imunofluorescentes, e semelhantes (ver, geralmente, "Immunological Methods", Vols. I e II, Lefkovits e Pernis, eds., Academic Press, New York, N.Y. (1979 e 1981).

As imunoglobulinas do presente invento encontrarão tipicamente utilização individualmente no tratamento dos efeitos tóxicos de infecção por E. coli produtora de Verotoxina (VTEC) e Síndroma Urémica Hemolítica (HUS) e/ou a neutralizar os antigénios VT2. Como exemplo mas não como limitação, alguns estados de doença típicos adequados para tratamento incluem colite hemorrágica localmente nos intestinos, disfunção renal e danos cerebrais.

As imunoglobulinas humanizadas e as composições farmacêuticas destas deste invento são particularmente úteis para administração parentérica, i.e., subcutaneamente, intramuscularmente ou intravenosamente. As composições para 21 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ administração parentérica compreenderão geralmente uma solução da imunoglobulina ou uma mistura desta dissolvida num transportador aceitável, de preferência um transportador aguoso. Pode ser utilizada uma variedade de transportadores aguosos, p. ex., água, água tamponada, solução salina a 0,4%, glicina a 0,3%, glucose a 5%, solução de albumina humana e semelhantes. Estas soluções são estéreis e geralmente isentas de matéria particulada. Estas composições podem ser esterilizadas através de técnicas de esterilização convencionais bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis conforme necessário para se aproximar das condições fisiológicas tais como agentes de ajuste e tamponamento do pH, agentes de tonicidade, agentes de ajuste da toxicidade e semelhantes, por exemplo acetato do sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, lactato de sódio, citrato de sódio, etc. A concentração de imunoglobulina nestas formulações pode variar largamente, i.e., de menos de cerca de 0,5%, habitualmente pelo menos cerca de 1% até tanto quanto 15 ou 20% em peso e será seleccionada primeiramente com base nos volumes, viscosidades, etc. dos fluidos, de acordo com o modo particular de administração seleccionado.

Assim, uma composição farmacêutica tipica para injecção pode ser preparada para conter 1 ml de água tamponada estéril e 1-10 mg de imunoglobulina. Uma composição tipica para infusão intravenosa pode ser preparada para conter 250 ml de solução de Ringer estéril e 150 mg de imunoglobulina. Os métodos actuais para preparação de composições parentericamente administráveis são conhecidos ou aparentes dos peritos na arte e estão descritos mais detalhadamente em, por exemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences", 15a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pensilvânia, (1980).

As imunoglobulinas deste invento podem ser congeladas ou liofilizadas para armazenamento e reconstituídas num transportador adequado antes da utilização. Esta técnica mostrou ser eficaz com globulinas imunitárias convencionais e podem ser empregues as técnicas de liofilização e reconstituição conhecidas na arte. Será apreciado pelos peritos na arte que a liofilização e a reconstituição podem conduzir a graus variáveis de perda de actividade da 22 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ imunoglobulina (p.ex., com globulinas imunitárias convencionais, os anticorpos IgM tendem a ter maior perda de actividade gue os anticorpos IgG) e gue os níveis de utilização podem ter de ser ajustados para compensar.

As composições contendo as presentes imunoglobulinas humanizadas ou uma mistura destas podem ser administradas para tratamentos terapêuticos ou profilácticos. Na aplicação terapêutica, as composições são administradas a um paciente gue já sofra de infecção por E. coli produtora de Verotoxina (VTEC) e Síndroma Urémica Hemolítica (HUS), ou outras manifestações tóxicas de antigénios VT2, numa guantidade suficiente para curar ou pelo menos parar parcialmente a síndroma tóxica e as suas complicações. Uma guantidade adequada para alcançar isto é definida como uma "dose terapeuticamente eficaz". Em aplicações profiláticas, as composições são administradas a pacientes em risco de infecção numa quantidade suficiente para prevenir ou inibir de forma detectável tal infecção e/ou manifestação tóxica desta devido aos antigénios VT2. As quantidades eficazes para tais utilizações dependem da gravidade da doença e do estado geral do próprio sistema imunitário do paciente, mas variam geralmente de cerca de 0,1 a 5 mg/kg de imunoglobulina por paciente, dose que é vulgarmente utilizada. Não nos devemos esquecer que os materiais deste invento podem ser geralmente empregues em estados de doença graves, isto é, situações com perigo de vida ou potencial perigo de vida. Nesses casos, tendo em vista a minimização de substâncias estranhas e a probabilidade mais baixa de rejeições de "substâncias estranhas" que é conseguida pelas presentes imunoglobulinas humanizadas deste invento, é possível e pode ser sentido como desejável pelo médico assistente administrar excessos substanciais destas imunoglobulinas.

Administrações únicas ou múltiplas das composições podem ser realizadas com os níveis e padrão de dose a serem seleccionados pelo médico assistente. Em qualquer caso, as formulações farmacêuticas devem proporcionar uma quantidade suficiente da(s) imunoglobulina(s) deste invento para tratar eficazmente o paciente. 23 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ

Em concretizações particulares, as composições compreendendo a imunoglobulina humanizada do presente invento podem ser utilizadas para detectar antigénios VT2 em infecção por E. coli produtora de Verotoxina (VTEC) e Síndroma Urémica Hemolítica (HUS) e/ou noutras infecções produtoras de VT2 ou VT2V. Assim, uma imunoglobulina humanizada do presente invento, tal como uma imunoglobulina humanizada que se ligue ao determinante do antigénio identificado pelo anticorpo MuVTml.1 pode ser marcada e utilizada para identificar os locais anatómicos que contenham concentrações significativas de VT2 ou VT2V. Por exemplo mas não para limitação, pode ser ligada à imunoglobulina humanizada uma ou mais porções marcadoras. Porções marcadoras exemplares incluem, mas não se limitam a, corantes radiopacos, agentes de radio-contraste, moléculas fluorescentes, moléculas marcadas por centrifugação, enzimas, ou outras porções marcadoras com valor em diagnóstico, particularmente em técnicas de imagiologia radiológicas ou de ressonância magnética.

As imunoglobulinas humanizadas do presente invento podem ainda encontrar uma ampla variedade de utilizações in vitro. Como exemplo, as imunoglobulinas podem ser utilizadas para detecção de antigénios VT2, ou semelhantes.

Para fins de diagnóstico, as imunoglobulinas podem ser marcadas ou não marcadas. Imunoglobulinas não marcadas podem ser utilizadas em combinação com outros anticorpos marcados (anticorpos secundários) que sejam reactivos com a imunoglobulina humanizada, tais como anticorpos específicos para regiões constantes de imunoglobulinas humanas. Alternativamente, as imunoglobulinas podem ser marcadas directamente. Pode ser empregue uma ampla variedade de marcadores, tais como radionuclidos, fluoróforos, enzimas, substratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inibidores enzimáticos, ligandos (particularmente haptenos), etc. Numerosos tipos de imunoensaios estão disponíveis e são bem conhecidos dos peritos na arte.

Podem também ser fornecidos estojos para utilizar com as imunoglobulinas objecto na protecção contra ou detecção de uma actividade celular ou para a presença de um antigénio seleccionado. Assim, a composição de imunoglobulina objecto do 24 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ presente invento pode ser proporcionada, geralmente numa forma liofilizada num recipiente, sozinha ou conjuntamente com anticorpos adicionais específicos para o tipo de célula desejado. As imunoglobulinas, que podem estar conjugadas com um marcador ou uma toxina, ou não conjugadas, são incluídas nos estojos com tampões, tais como Tris, fosfato, carbonato, etc., estabilizantes, conservantes, biocidas, proteínas inertes, p. ex., albumina do soro, ou semelhantes, e um conjunto de instruções para utilização. Geralmente, estes materiais estarão presentes a menos de cerca de 5% do peso com base na quantidade de imunoglobulina activa, e habitualmente presentes numa quantidade total de pelo menos cerca de 0,001% do peso novamente com base na concentração de imunoglobulina. Frequentemente, será desejável incluir um diluente ou excipiente inerte para diluir os ingredientes activos, em que o excipiente pode estar presente a de cerca de 1 a 99% do peso da composição total. Quando é empregue num ensaio um anticorpo secundário capaz de se ligar à imunoglobulina, este estará habitualmente presente num frasco separado. O anticorpo secundário está tipicamente conjugado com um marcador e é formulado de um modo análogo ao das formulações de imunoglobulina descritas acima.

Anticorpos Humanos A descrição proporciona ainda anticorpos humanos que competem com o VTml-1 de ratinho pela ligação à verotoxina II ou à variante de verotoxina II e que podem ser gerados utilizando os seguintes métodos. a. Metodologia do Trioma A abordagem básica e um parceiro de fusão celular exemplar, SPAZ-4, para utilização nesta abordagem foram descritos por Oestberg et al., Hybridoma 2: 361-367, 1983; Oestberg, Patente U.S. N° 4634664; e Engleman et al., Patente U.S. N° 4634666. As linhas celulares produtoras de anticorpos obtidas através deste método são designadas triomas, porque descendem de três células - duas humanas e uma de ratinho. Inicialmente, uma linha de mieloma de ratinho é fundida com um linfócito B humano para se obter uma célula híbrida xenogeneica não produtora de anticorpos, tal como a linha 25 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ celular SPAZ-4 descrita por Oestberg, supra. A célula xenogeneica é então fundida com um linfócito B humano imunizado para se obter uma linha celular de trioma produtora de anticorpos. Verificou-se que os triomas produzem anticorpo de forma mais estável que os hibridomas vulgares produzidos a partir de células humanas.

Os linfócitos B são obtidos a partir do sangue, do baço, dos nódulos linfáticos ou da medula óssea de um dador humano. A imunização in vivo de um ser humano vivo com verotoxina II ou variante de verotoxina II é habitualmente indesejável devido ao risco de iniciar uma resposta prejudicial. Assim, os linfócitos B são habitualmente imunizados in vitro com estes antigénios ou um fragmento antigénico de um destes, ou uma célula possuindo qualquer um destes. Os linfócitos B são tipicamente expostos ao antigénio durante um período de 7-14 dias em meios tais como RPMI-1640 (ver Engleman, supra) suplementado com o soro humano a 10%.

Os linfócitos B imunizados são fundidos com uma célula híbrida xenogeneica tal como SPAZ-4 através de métodos bem conhecidos. Por exemplo, as células são tratadas com polietilenoglicol a 40-50% de PM 1000-4000, a cerca de 37 graus, durante cerca de 5-10 min. As células são separadas da mistura de fusão e propagadas em meios selectivos para os híbridos desejados (p. ex., HAT ou AH). Os clones que segregam anticorpos possuindo a especificidade de ligação requerida são identificados ensaiando o meio de cultura do trioma quanto à capacidade para se ligar à verotoxina II ou à variante de verotoxina II. Os triomas produzindo anticorpos humanos possuindo a especificidade desejada são subclonados através, p. ex., da técnica de diluição limitante e criados in vitro em meio de cultura.

Embora os triomas sejam geneticamente estáveis podem não produzir anticorpos a níveis muito elevados. Os níveis de expressão podem ser aumentados através da clonagem dos genes de anticorpo a partir do trioma num ou mais vectores de expressão e transformando o vector numa linha celular tal como as linhas celulares discutidas, infra, para expressão de imunoglobulinas recombinantes ou humanizadas. 26 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ b. Mamíferos Não Humanos Transgénicos

Anticorpos humanos reactivos com a verotoxina II e/ou a toxina de verotoxina II podem também ser produzidos a partir de mamíferos transgénicos não humanos possuindo transgenes codificando pelo menos um segmento do locus da imunoglobulina humana. Geralmente, o locus da imunoglobulina endógena de tais mamíferos transgénicos é funcionalmente inactivado. De preferência, o segmento do locus da imunoglobulina humana inclui sequências não rearranjadas de componentes de cadeias pesadas e leves. Tanto a inactivação dos genes endógenos de imunoglobulina como a introdução de genes exógenos de imunoglobulina podem ser alcançadas através de recombinação homóloga direccionada, ou através da introdução de cromossomas YAC. Os mamíferos transgénicos que resultam deste processo são capazes de rearranjar funcionalmente as sequências de componentes da imunoglobulina, e de expressar um repertório de anticorpos de vários isotipos codificados por genes de imunoglobulina humana, sem expressar os genes endógenos de imunoglobulina. A produção e as propriedades dos mamíferos possuindo estas propriedades são descritas em detalhe, por exemplo, por Lonberg et al., WO 93/12227 (1993); Kucherlapati, WO 91/10741 (1991). Ratinhos transgénicos são particularmente adequados. Os anticorpos são obtidos através de imunização de um mamífero não humano transgénico, tal como descrito por Lonberg ou Kucherlapati, supra. Anticorpos monoclonais são preparados, p. ex., através de fusão de células B de tais mamíferos com linhas celulares de mieloma adequadas utilizando tecnologia convencional de Kohler-Milstein.

Os seguintes exemplos são oferecidos para ilustração, não para limitação. Compreender-se-á que embora os exemplos se refiram ao anticorpo HuVTml.l, produzindo anticorpos humanizados com elevada afinidade de ligação à subunidade B do antigénio VT2, está também contemplada a utilização de CDR de outros anticorpos monoclonais que se liguem a um epítopo de VT2 .

PARTE EXPERIMENTAL

Exemplo 1:_Imunização de ratinhos com o toxóide VT2 VT2 foi preparado tal como descrito por Oku et al., Microb. Pathog. 6(2): 113-122, 1989. O toxóide VT2 foi 27 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ preparado através do tratamento de 1 mg de VT2 purificada durante 7 dias a 37°C com formaldeido a 0,4% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,6.

Ratinhos Balb/c (Nippon Charles River) foram imunizados com o toxóide VT2 (0,5 pg) combinado com Adjuvante Completo de Freund (Gibco BRL) através de injecção intraperitoneal (i.p.). Após cerca de 4 semanas, os ratinhos receberam o toxóide VT2 (1 pg) combinado com Adjuvante Completo de Freund através de injecção i.p. Depois os ratinhos receberam o toxóide VT2 (1 pg duas vezes, 4 pg duas vezes, 5 pg uma vez) combinado com Adjuvante Incompleto de Freund através de injecção i.p. sequencialmente a intervalos de 1 a 5 semanas.

Os ratinhos foram sangrados cortando a veia da cauda e o soro foi recolhido através de incubação do sangue durante 30 min. a 37°C e centrifugação a 3000 rpm durante 10 min. O título sérico contra VT2 foi medido através de ELISA como se segue:

Cada poço de uma placa de 96 poços de fundo plano (Falcon 3912, Becton Dickinson) foi revestido com 50 pl de VT2 a 1 pg/ml diluído com solução salina tamponada com fosfato (PBS) 0,01 Me incubado à t.a. durante 1 h.

Cada poço foi lavado 3 vezes com PBS - Tween 20 a 0,05%.

Cada poço foi bloqueado com PBS - BSA a 3% à t.a. durante 1 h.

Cada poço foi lavado 3 vezes com PBS - Tween 20 a 0,05%.

Foram adicionados a cada poço 50 pl de soro diluído em série com PBS e incubou-se à t.a. durante 1 h.

Cada poço foi lavado 3 vezes com PBS - Tween 20 a 0,05%. A cada poço foram adicionados 50 pl de IgG de cabra anti-ratinho conjugada com fosfatase alcalina (ZYMED) diluída (x 1000) com PBS - BSA a 3% e incubou-se à t.a. durante 1 h.

Tween 20 a

Cada poço foi lavado 3 vezes com PBS -0,05%. 28 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ A cada poço foi adicionado fosfato de p-nitrofenilo (PNPP: Wako Chemicals) e incubou-se à t.a. durante 1 h. A absorção a 405 nm foi medida e registada para cada poço.

Exemplo 2._Construção do hibridoma através do método de fusão celular

Os ratinhos cujo soro continha anticorpos reactivos contra VT2 foram escolhidos e esplenectomizados. 5xl07 células do baço e 5χ106 P3 X 63 Ag8U.l (P3U1) células de mieloma de ratinho foram combinadas e lavadas uma vez com meio RPMI 1640 e centrifugadas a 1500 rpm durante 5 min. O sedimento celular foi disperso gentilmente e ressuspenso em 1 ml de solução de polietilenoglicol (PEG) (contendo 5, 75 ml de meio RPMI 1640 + 3,5 ml de PEG + 0,75 ml de dimetilsulf óxido) e rodado gentilmente durante 2 min. Então foi adicionado 1 ml de meio RPMI e rodou-se durante 2 min. Depois, foram adicionados 2 ml de meio RPMI e rodou-se durante 2 min. Foram adicionados 4 ml de meio GIT-HAT (hipoxantina 95 μΜ, aminopterina 0,4 μΜ, timidina 1,6 μΜ, FCS a 5%) e rodou-se durante 2 min. Depois foram adicionados 8 ml de meio GIT-HAT e rodou-se durante 2 min. Após 30 min. de incubação a 37°C a suspensão celular foi distribuída por cada poço da placa de 96 poços de fundo plano inoculada com 104 macrófagos peritoneais de ratinho/poço. A placa foi incubada a 37°C numa incubadora de CO2 a 5% - ar a 95% durante uma semana. Depois metade do meio em cada poço foi substituído por meio GIT-HT fresco (meio GIT-HAT sem aminoferina) e a placa foi incubada durante cerca de uma semana para que as células do hibridoma crescessem.

Exemplo 3:_Pesquisa de células de hibridoma de ratinho que segregam anticorpo contra VT2 A pesquisa foi feita seleccionando células de hibridoma que segregavam anticorpos que se ligavam a VT2 e neutralizavam VT2. O sobrenadante do hibridoma foi utilizado para a pesquisa. A actividade de ligação foi medida de acordo com o método de ELISA descrito no Exemplo 1. A actividade de neutralização de VT2 foi medida de acordo com o seguinte método: 29 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ A cada poço de uma placa de 96 poços foram adicionados 30 μΐ de sobrenadante do hibridoma e 30 μΐ de VT2 a 200 pg/ml em FCS-MEM a 10%. A placa foi incubada a 37°C durante 1 h. 50 μΐ da solução de cima foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo plano no qual foi inoculada uma célula Vero (ATCC) (4xl04 células/poço). A placa foi incubada a 37°C durante 4 dias numa incubadora de CO2 a 5% - ar a 95%.

Foram adicionados a cada poço 100 μΐ de uma solução de vermelho neutro a 0,014%. A placa foi incubada a 37°C durante 1 h para corar as células vivas.

Após lavagem dos poços com PBS, foram adicionados a cada poço 100 μΐ de etanol a 50% contendo solução de ácido acético a 1% (ETOH-AcOH). A absorção a 550 nm foi medida e registada para cada poço.

Exemplo 4:_Clonagem de células de hibridoma A clonagem de células de hibridoma foi conduzida através de diluição limitante. Foi adicionada uma ou duas células de hibridoma a cada poço de uma placa de 96 poços de fundo plano previamente inoculada com 104 macrófagos peritoneais de ratinho como células alimentadoras. Após cerca de 2 semanas, o sobrenadante foi medido quanto à ligação a VT2 e à neutralização contra VT2 tal como descrito nos Exemplos 1 e 3, respectivamente. Repetindo este procedimento de clonagem várias vezes tal como descrito acima, foi estabelecido um clone da célula de hibridoma segregando um anticorpo monoclonal (MuVTml.l) que neutraliza VT2.

Exemplo 5:_Purificação de MuVTml.l

As células de hibridoma que segregam MuVTml.l foram adaptadas a meio basal eRDF isento de soro contendo insulina, transferrina, etanolamina e selenite. O sobrenadante da cultura foi passado por uma coluna de proteina G-Sepharose (Pharmacia) e o anticorpo eluido utilizando métodos padrão. A 30 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ pureza do anticorpo foi verificada através de electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e a sua concentração foi determinada através de SRID. O MuVTml.1 purificado foi testado quanto à sua capacidade para neutralizar variantes de VT2 tal como descrito no Exemplo 3. Os resultados são apresentados na tabela abaixo e na Figura 7. TABELA 1

Actividade Neutralizante de MuVTml.1 Contra várias Variantes de VT2

Estirpes Origem Tipo de Toxina Neutralização E. coli 0157 V50 Humana VT2vh + E. coli 0157 V354 Humana VT2vh + E. coli 0157 V601 Humana ? + \E. coli 0157:H7 TK40 ÍHumana VT2, VT2vxl* + E. coli 0157:H7 TK51 Humana VT2vxl + E. coli 091:H21 Humana VT2vha, VT2vhb + *VT2vx é um novo subtipo de variante de VT2

Exemplo 6:_Clonagem e sequenciação de ADNc da região variável de VTml.1 de ratinho

Os ADNc da região variável da cadeia pesada e leve de VTml.1 de ratinho (MuVTml.1) foram clonados a partir de ARNm isolado de células de hibridoma utilizando PCR ancorado (Co et al., J. Imunol. 148: 1149, 1992). Os iniciadores 5' utilizados ligaram-se às caudas poli-dG adicionadas ao ADNc, e os iniciadores 3' às regiões constantes. Os fragmentos génicos amplificados foram então introduzidos no plasmídeo pUC18. As sequências nucleotídicas foram determinadas a partir de diversos clones independentes para ambos o ADNc de VL e de VH. Para a cadeia pesada, foi identificada apenas uma sequência única, típica de uma região variável de cadeia pesada de ratinho. Para a cadeia leve, foram identificadas duas sequências únicas, ambas homólogas às sequências da região variável da cadeia leve de ratinho. No entanto, uma sequência não era funcional devido a um nucleótido ausente que causou uma mudança de enquadramento na junção V-J, e foi identificado como o alelo não produtor. A outra sequência era típica de uma região variável da cadeia capa de ratinho funcional. As sequências de ADNc da região variável da cadeia pesada e da 31 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ cadeia leve funcional e as sequências de aminoácidos traduzidas são mostradas na Figura 1. A sequência Vk de ratinho pertence ao subgrupo V de cadeias pesadas capa de ratinho de Kabat. A VH de ratinho pertence ao subgrupo III (D) de cadeias pesadas de Kabat.

Exemplo 7:_Desenho das regiões variáveis de VTml.1 humanizado

Para manter a afinidade de ligação do anticorpo de ratinho no anticorpo humanizado, foram seguidos os procedimentos gerais de Queen et al. (Queen et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 10029, 1989 e Patente U.S. Nos 5585089 e 5693762) . A escolha dos resíduos estruturais pode ser crítica na retenção da elevada afinidade de ligação. Em princípio, uma sequência estrutural de qualquer anticorpo humano pode servir como molde para o enxerto da CDR; no entanto, demonstrou-se que a substituição directa da CDR numa tal estrutura pode conduzir a uma perda significativa de afinidade de ligação ao antigénio (Glaser et al., J. Immunol. 149: 2606, 1992; Tempest et al. , Biotecnology 9: 266, 1992; Shalaby et al., J. Exp. Med. 17: 217, 1992). Quanto mais homólogo for um anticorpo humano ao anticorpo de ratinho original, menos provável será a introdução de distorções pela estrutura humana nas CDR de ratinho que poderiam reduzir a afinidade. Baseado numa pesquisa de homologia de sequência contra a base de dados de Kabat (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a ed., U.S. Department of Health and Human Services, 1991), o anticorpo humano GF4 foi escolhido como proporcionando uma boa homologia estrutural com o anticorpo MuVTml.1. Outras cadeias de anticorpos humanos altamente homólogas seriam também adequadas para proporcionar a estrutura do anticorpo humanizado, especialmente as cadeias leves capa do subgrupo humano III e as cadeias pesadas do subgrupo humano III tal como definidas por Kabat.

Os programas de computador ABMOD e ENCAD (Levitt et al., J. Mol. Biol. 168: 595, 1983) foram utilizados para construir um modelo molecular do domínio variável de VTml.l, que foi utilizado para situar os aminoácidos na estrutura de VTml.l que estão suficientemente próximos das CDR para potencialmente interagir com elas. Para desenhar as regiões variáveis da 32 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ cadeia pesada e leve de VTml.1 humanizado, as CDR do anticorpo de ratinho VTml.1 foram enxertadas nas regiões estruturais do anticorpo GF4 humano. Nas posições estruturais onde o modelo de computador sugeriu um contacto significativo com as CDR, os aminoácidos do anticorpo de ratinho foram substituídos pelos aminoácidos estruturais humanos originais. Para o VTml.1 humanizado, isto foi feito nos resíduos 29, 30, 49 e 98 da cadeia pesada e no resíduo 49 da cadeia leve. Além disso, os resíduos estruturais que ocorriam apenas raramente nas suas posições na base de dados de anticorpos humanos foram substituídos por um aminoácido humano de consenso nessas posições. Para o VTml.1 humanizado isto foi feito nos resíduos 1, 4, 5, 79, 89 e 93 da cadeia pesada e nos resíduos 3, 4, 19, 76, 79 e 85 da cadeia leve. A sequência das regiões variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo VTml.1 humanizado, incluindo o codão de iniciação e as sequências do péptido sinal, é mostrada na Figura 2. No entanto, muitos dos potenciais resíduos de contacto com as CDR são passíveis de substituições por outros aminoácidos que possam ainda permitir que o anticorpo retenha uma substancial afinidade para o antigénio. A seguinte tabela lista várias posições na estrutura onde podem ser adequados aminoácidos alternativos (CL = cadeia leve, CH = cadeia pesada). TABELA 2

Posição VTml.1 Humanizado Alternativos LC-49 K Y HC-29 F S HC-30 S K HC-49 A S HC-98 R K

Do mesmo modo, muitos dos resíduos estruturais não em contacto com as CDR nas cadeias pesada e leve do VTml. 1 humanizado podem acomodar substituições de aminoácidos das posições correspondentes do anticorpo GF4 humano, de outros anticorpos humanos, do anticorpo VTml.1 de ratinho, ou de outros anticorpos de ratinho, sem perda significativa da afinidade ou da não imunogenicidade do anticorpo humanizado. A 33 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ seguinte tabela lista várias posições adicionais na estrutura onde aminoácidos alternativos podem ser adequados. TABELA 3

Posição VTml.1 Humanizado Alternativos LC-3 V L LC-4 L M LC-19 A V LC-76 S N LC-79 E Q LC-85 V L, M HC-1 E Q HC-4 L V HC-5 V L HC-79 L V HC-89 E D HC-93 V Μ, I A selecção de vários aminoácidos alternativos pode ser utilizada para produzir versões de VTml.1 humanizado que tenham combinações variáveis de afinidade, especificidade, não imunogenicidade, facilidade de produção e outras propriedades desejáveis. Assim, os exemplos nas tabelas de cima são oferecidos para fins de ilustração, não de limitação.

Exemplo 8 :_Construção de VTml♦1 humanizado

Uma vez desenhadas as sequências de aminoácidos da região variável humanizada tal como descrito acima, foram construídos os genes para as codificar, incluindo péptidos sinal, sinais dadores de união e locais de restrição apropriados (Figura 2). Os genes da região variável da cadeia leve e pesada foram construídos e amplificados utilizando oito oligonucleótidos sintéticos sobreponíveis variando no comprimento de aproximadamente 65 a 80 bases, tal como mostrado na Figura 3 (ver He et al., J. Immunol. 160: 1029, 1998) . Os oligos foram ligados aos pares e prolongados com o fragmento de Klenow da ADN-polimerase I, rendendo quatro fragmentos de cadeia dupla. Os fragmentos resultantes foram desnaturados, ligados e prolongados com Klenow, rendendo dois fragmentos. Estes fragmentos foram desnaturados, ligados aos pares e prolongados 34 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ outra vez, rendendo um gene inteiro. O produto resultante foi amplificado através de reacção em cadeia da polimerase (PCR) utilizando polimerase Taq, purificado em gel, digerido com Xbal, novamente purificado em gel, e subclonado no local XbaI do vector de expressão pVk ou pVgl. Os vectores pVk e pVgl para a respectiva expressão da cadeia leve e da cadeia pesada foram anteriormente descritos (ver Co et al., J. Immunol. 148: 1149, 1992). A estrutura dos plasmídeos finais foi verificada através de sequenciação nucleotidica e mapeamento de restrição. Todas as manipulações de ADN foram executadas através de métodos padrão bem conhecidos dos peritos na arte.

Para construir uma linha celular produtora de VTml.1 humanizado, os plasmídeos da cadeia leve e da cadeia pesada foram transfectados para a linha celular de mieloma de ratinho Sp2/0-Agl4 (ATCC CRL 1581). Antes da transfecção, os plasmídeos contendo a cadeia pesada e leve foram linearizados utilizando FspI. Foram transfectados aproximadamente 20 μρ de cada plasmídeo para lxlO7 células em PBS. A transfecção foi através de electroporação utilizando um aparelho Gene Pulser (BioRad) a 360 V e 25 yFD de capacitância de acordo com as instruções do fabricante. As células de cada transfecção foram plaqueadas em quatro placas de cultura de tecidos de 96 poços e após dois dias foi aplicado o meio de selecção (DMEM, FCS a 10%, suplementado com HT lx (Sigma), 0,25 mg/ml de xantina, 1 pg/ml de ácido micofenólico).

Após aproximadamente duas semanas, os clones que apareceram foram pesquisados quanto à produção de anticorpos através de ELISA. O anticorpo do clone de elevada produção foi preparado através de cultura das células até confluência em meio normal (DMEM com FCS a 10%) , substituindo depois o meio por um meio isento de soro (Hybridoma SMF; Gibco) e cultivando até serem alcançados na cultura títulos máximos de anticorpo. O sobrenadante da cultura foi corrido através de uma coluna de proteína A-Sepharose (Pharmacia); o anticorpo foi eluído com Glicina 0,1 M, NaCl 100 mM, pH 3, neutralizado e subsequentemente mudado para solução salina tamponada com fosfato (PBS). A pureza do anticorpo foi verificada através da sua análise num gel de acrilamida, e a sua concentração foi 35 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ determinada através de uma leitura de DO280, assumindo que 1,0 mg de proteína de anticorpo tinha um leitura de DO280 de 1,4.

Exemplo 9: Propriedades do VTml.1 humanizado Medição da afinidade A afinidade do anticorpo MuVTml.1 e HuVTml.1 para a verotoxina II (VT2) foi determinada através de ligação competitiva com anticorpo MuVTml.1 biotinilado. O procedimento para a experiência é descrito abaixo:

Revestiu-se uma placa Dynatech Laboratories Immulon 2 de 96 poços (parte #0110103455) com 50 μΐ de solução de VT2 (0,2 pg/ml em PBS) por poço. Incubou-se a 37°C durante 2 horas com agitação suave.

Aspirou-se a solução de VT2. Lavou-se cada poço 4 vezes com 400 μΐ de tampão de lavagem (Tween 20 a 0,1% em PBS).

Bloqueou-se cada poço com 400 μΐ de Tampão de Bloqueio Pierce SuperBlock em PBS (cat #37515) à temperatura ambiente durante 30 minutos.

Aspirou-se a solução de bloqueio. Lavou-se cada poço 4 vezes com 400 μΐ de tampão de lavagem.

Em cada poço adicionaram-se 20 ng de anticorpo MuVTml.1 biotinilado misturado com várias concentrações dos anticorpos VTml.1 de ratinho ou Hu não marcados num volume total de 100 μΐ em tampão de ligação (BSA a 1%, Tween 20 a 0,1% em PBS). Incubou-se a 4°C de um dia para o outro com agitação suave. Aspiraram-se as soluções de anticorpo. Lavou-se cada poço 4 vezes com 400 μΐ de tampão de lavagem.

Adicionaram-se a cada poço 100 μΐ de estreptavidina conjugada com peroxidase (Bioscource cat #5NN2004) (diluição 1:500 em tampão de ligação). Incubou-se a 37°C durante 1 h com agitação suave. - Aspirou-se a solução de estreptavidina. Lavou-se cada poço 6 vezes com 400 μΐ de tampão de lavagem.

Adicionaram-se 100 μΐ/poço de substrato da peroxidase (BioRad #172-1064). Incubou-se à temperatura 36 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ ambiente até a cor revelar. Leu-se a placa no leitor de placas de ELISA Molecular Devices a 415 nm. O resultado, mostrado na Figura 4, demonstrou que o anticorpo VTml.1 humanizado compete bem contra o anticorpo de ratinho biotinilado no ensaio ELISA de competição, dentro de um factor de 2 em comparação com o anticorpo de ratinho. A afinidade de HuVTml.1 e MuVTml.1 é também calculada utilizando o método BIAcore. A KD calculada para o HuVTml.1 é de aproximadamente 3,6χ10-9 M versus l,9xlCT9 M para o Mu VTml.1 tal como mostrado na Tabela abaixo: TABELA 4

MuVTml.1 HuVTml.1 Ka 9,9 x 104 M-1 S_1 9,5 x 104 M-1 S_1 Kd 1,9 x 10“4 S_1 3,4 x 10~4 S“ KD 1,9 x 10“9 M 3,6 x 10~y M

Exemplo 10: Actividade neutralizante in vitro de HuVTml.1 A actividade neutralizante de HuVTml.1 é também medida em comparação com MuVTml.1 de ratinho num ensaio in vitro descrito abaixo: - A linha celular derivada de rim humano (ACHN) foi inoculada numa placa de 96 poços a lxlO4 células/poço e incubada a 37°C durante 24 h. O meio foi aspirado e foram adicionados a cada poço 50 μΐ de uma solução mista de 30 μΐ de solução de VT2 a 540 pg/ml diluída com FCS-MEM a 10% e 30 μΐ do anticorpo de teste diluído em série com FCS-MEM a 10% (VTml.1 de ratinho ou humanizado) pré-incubado a 37°C durante lhe incubou-se a 37°C durante quatro dias.

Foram adicionados a cada poço 100 μΐ de vermelho neutro a 0,028% e incubou-se a 37°C durante 1 h (Mullbacher, A. et al., Journal of Immunological Methods 68: 205-215, 1984). A solução foi aspirada. Cada poço foi lavado duas vezes com 150 μΐ de PBS. 37 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ

Foram adicionados a cada poço 100 μΐ de EtOH a 50%/AcOH a 1% e incubou-se à temperatura ambiente durante 5-10 minutos. O valor da absorção a 550 nm foi registado para cada poço utilizando um leitor de placas de ELISA Molecular Devices. A actividade neutralizante foi calculada de acordo com a seguinte fórmula:

Neutralizaçao (%) DO (VT2 + Ab) - DO (VT2 sozinha) DO (meio sozinho) - DO (VT2 sozinha) X 100 A actividade neutralizante de HuVTml.1 em comparação com a de MuVTml.1 é mostrada na Figura 5. A DE5q para o HuVTml.1 é de 0,33 pg/ml versus 0,2 pg/ml para MuVTml.1. A actividade neutralizante de HuVTml.1 para as variantes de VT2 é mostrada abaixo: TABELA 5

Ensaio de neutralização in vitro de variantes de VT2 com HuVTml.1

Estirpes Origem Tipo de Toxina EDso (pg/ml) E. coli 0157 Humana VT2 0,33 E. coli 0157 (V50) Humana VT2vh 0,36 E. coli 0157 (V354) Humana VT2vh 0,39 E. coli 0157 (V601) Humana VT2v 0,32 E. coli 0157:H7 (TK 40) Humana VT2, VT2vx* 0,35 *VT2vx: Novo subtipo de variante de VT2

Exemplo 11:_Análise do antigénio VT2 reconhecido VT2 foi reduzida, as subunidades A e B foram separadas através de gel de poliacrilamida contendo SDS e transferidas para uma membrana de nitrocelulose (BioRad) através do método de "Western blotting". A membrana de nitrocelulose foi bloqueada de um dia para o outro em BSA a 3% em PBS e depois reagiu com 10 pg/ml de HuVTml.1 ou soro de coelho anti-VT2 diluído com BSA a 3% em PBS durante 1 h à t.a. A membrana foi lavada 6 vezes com BSA a 1%-PBS e reagiu com 25 yg/ml de IgG de cabra anti-humano conjugada com fosfatase alcalina (TAGO) ou IgG de cabra anti-ratinho conjugada com fosfatase alcalina 38 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ (TAGO) diluída com BSA a 3% em PBS durante 1 h à t.a. A membrana foi lavada 6 vezes com BSA a 1% em PBS e reagiu com NBT (Cloreto de tetrazólio Nitro-Azul) - solução BCIP (sal de 5-Bromo-4-Cloro-3'-Indoliefosfato-p-Toluidina) [PIERCE] durante 10 min. à t.a. O resultado mostrado na Figura 6 indica que HuVTml.1 se liga principalmente à subunidade B de VT2.

Exemplo 12:_Actividade de HuVTml. 1 contra VT2 in vivo

Ratinhos Ddy (Nippon SLC) foram injectados através da via intravenosa com 4.8 pg de HuVTml. 1, MuVTml. 1 ou PBS esterilizado. Uma hora depois, os ratinhos foram injectados através da via intraperitoneal (i.p.) com 46 ng de VT2 (correspondendo a LD5o 10) . Após uma semana, foi medida a viabilidade dos ratinhos. A seguinte tabela mostra o resultado. HuVTml.1 protege completamente os ratinhos da morte causada por VT2. TABELA 6 TRATAMENTO SOBREVIVENTES PBS 100% (5/5) VT2 0% (0/5) HuVTml.1 + VT2 100% (5/5) MuVTml.1 + VT2 100% (5/5)

Do antecedente, apreciar-se-á que as imunoglobulinas humanizadas do presente invento oferecem numerosas vantagens sobre outros anticorpos anti-VT específicos. Em comparação com anticorpos monoclonais de ratinho, as presentes imunoglobulinas humanizadas contêm substancialmente menos sequências de aminoácidos não humanas e potencialmente imunogénicas. Esta reduzida probabilidade de antigenicidade após injecção num paciente humano representa uma melhoria terapêutica significativa.

Embora o presente invento seja descrito com algum detalhe por meio de ilustração e exemplos para fins de clareza e compreensão, será aparente que certas mudanças e modificações podem ser praticadas dentro do âmbito das reivindicações anexas. 39

ΕΡ 1 079 856/PT

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Yoh-Ichi Matsumoto Tsuyoshi Kimura Atsuchi Imaizumi Tae Takedo May Sung Co Maximiliano Vasquez

<120> ANTICORPOS HUMANIZADOS QUE RECONHECEM VEROTOXINA II E LINHA CELULAR QUE OS PRODUZ

<130> 019026-000100EP <140> EP 99 924395.9 <141> 1999-05-19 <150> WO 99/59629 <151> 1999-05-19 <150> US 60/086,570 <151> 1998-05-20 <160> 8 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 414 <212> ADN <213> Mus musculus <2 2 0 > <221> CDS <222> (1)..(414) <2 2 0 > <223> Figura 1 (A) : Região variável da cadeia pesada do anticorpo VTml.1 de ratinho (MuVTml.l). <400> 1 atg aac ttt gtg ctc age teg att ttc ctt gee ctc att tta aaa gga 48

Met Asn Phe Vai Leu Ser Ser Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 15 10 15 gtc cag tgt gaa gtg cag ctg gtg gag teg ggg gga ggc tta gtg aag 96

Vai Gin Cys Glu Vai Gin Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Lys 20 25 30 cct gga ggg ccc ctg aaa ctc tcc tgt gea gee tet gga ttc act ttc 144

Pro Gly Gly Pro Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agt agt tat ggc atg tet tgg gtt ege cag act ccg gag aag agg ctg 192

Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Vai Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu 50 55 60 gag tgg gtc gea acc att agt act ggt ggt agt tac acc tac tac cca 240

Glu Trp Vai Ala Thr Ile Ser Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr pro 65 70 75 80 40 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ gac Asp agt Ser gtg Vai aag Lys ggt Gly 85 cga Arg ttc Phe acc Thr ate Ile tcc Ser 90 aga Arg gac Asp aat Asn gcc Ala aag Lys 95 aac Asn 288 gcc Ala ctg teu tat Tyr ctg Leu 100 caa Gin atg Met age Ser agt Ser ctg Leu 105 agg Arg tct Ser gag Glu gac Asp acg Thr 110 gcc Ala ata Ile 336 tat Tyr tac Tyr tgt Cys 115 gca Ala aga Arg cgg Arg ggg Gly gac Asp 120 gca Ala tgg Trp ggt aac Gly Asn ttg Leu 125 gac Asp tac Tyr tgg Trp 384 ggt Gly ca a Gin 130 gga Gly acc Thr tct Ser gtc Vai acc Thr 135 gtc Vai tcc Ser tea Ser 414

<210> 2 <211> 138 <212> PRT <213> Mus musculus <2 2 0 > <223> Figura 1 (A) : Região variável da cadeia pesada do anticorpo VTml.1 de ratinho (MuVTml.l). <400> 2

Met 1 Asn Phe Vai Leu 5 Ser Ser Ile Phe Leu 10 Ala Leu Ile Leu Lys 15 Gly Vai Gin Cys Glu 20 Vai Gin Leu Vai Glu 25 Ser Gly Gly Gly Leu 30 Vai Lys Pro Gly Gly 35 Pro Leu Lys Leu Ser 40 Cys Ala Ala Ser Gly 45 Phe Thr Phe Ser Ser 50 Tyr Gly Met Ser Trp 55 Vai Arg Gin Thr Pro 60 Glu Lys Arg Leu Glu 65 Trp Vai Ala Thr Ile 70 Ser Thr Gly Gly Ser 75 Tyr Thr Tyr Tyr Pro 80 Asp Ser Vai Lys Gly Arg 85 Phe Thr Ile Ser 90 Arg Asp Asn Ala Lys 95 Asn Ala Leu Tyr Leu 100 Gin Met Ser Ser Leu 105 Arg Ser Glu Asp Thr 110 Ala Ile Tyr Tyr Cys 115 Ala Arg Arg Gly Asp 120 Ala Trp Gly Asn Leu 125 Asp Tyr Trp Gly Gin 130 Gly Thr Ser Vai Thr 135 Vai Ser Ser <210> 3 <211> 381 <212> ADN <213> Mus museulus <220> <221> CDS <222> (D · .(381) 41 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ <220> <223> Figura 1 (Β) : Região variável da cadeia leve do anticorpo VTml.1 de ratinho (MuVTml.l). <400> 3 atg gtt ttc aca cct cag ata ctt gga ctt atg ctt ttt tgg att tea 48 Met Val Phe Thr Pro Gin Ile Leu Gly Leu Met Leu Phe Trp Ile Ser 1 5 10 15 gcc tcc aga ggt gat gtt gtg cta act cag tet cca gcc acc ctg tet 96 Ala Ser Arg Gly Asp Val Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 gtg act cca gga gat age gtc agt ctt tcc tgc agg gcc agt caa act 144 Vai Thr Pro Gly Asp Ser Val Ser Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Thr 35 40 45 att age aac aac cta cac tgg tat caa cac aaa tea cat gag tet cca 192 Ile Ser Asn Asn Leu His Trp Tyr Gin His Lys Ser His Glu Ser Pro 50 55 60 agg ctt ctc ate aag tet gct tcc cag tcc ate tet ggg ate ccc tcc 240 Arg Leu Leu Ile Lys Ser Ala Ser Gin Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 75 80 agg ttc agt ggc agt gga tea ggg aca gat ttc act ctc agt ate aac 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn 85 90 95 agt gtg gaa act gaa gat ttt gga atg tat ttc tgt caa cag agt tac 336 Ser Val Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Tyr 100 105 110 age tgg ccg ctc acg ttc ggt gct ggg acc aag ctg gag ctg aaa 381 Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125

<210> 4 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Figura 1(B): Região variável da cadeia leve do anticorpo VTml.1 de ratinho (MuVTml.l). <400> 4

Met 1 Val Phe Thr Pro 5 Gin Ile Leu Gly Leu 10 Met Leu Phe Trp Ile 15 Ser Ala Ser Arg Gly Asp 20 Val Val Leu Thr 25 Gin Ser Pro Ala Thr 30 Leu Ser Val Thr Pro 35 Gly Asp Ser Val Ser 40 Leu Ser Cys Arg Ala 45 Ser Gin Thr 42 ΕΡ 1 Ο79 856/ΡΤ

Ile Ser Asn Asn Leu His Trp Tyr Gin His <0 >, Ser His Glu Ser Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Lys Ser Ala Ser Gin Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser 65 70 75 B0 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn 85 90 95 Ser Vai Glu Thr Glu Asp Phe Gly Met Tyr Phe Cys Gin Gin Ser Tyr 100 105 110 Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 115 120 125

<210> 5 <211> 414 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(414) <220> do anticorpo <223> Figure 2 (A) : Região variável da cadeia pesada VTml.1 humanizado (HuVTml.l). <400> 5 atg aac ttt gtg ctc age teg att ttc ctt gee ctc att tta aaa gga Met Asn Phe Vai Leu Ser Ser Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gaa gtg caa ctg gtg gag teg ggg gga ggc tta gtg cag Vai Gin Cys Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin 20 25 30 cct gga ggg tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gee tet gga ttc act ttc Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 agt agt tat ggc atg tet tgg gtt ege cag gct ccg ggt aag ggt ctg Ser Ser Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg gtc gca acc att agt act ggt ggt agt tac acc tac tac cca Glu Trp Vai Ala Thr Ile Ser Thr Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro 65 70 75 80 gac agt gtg aag ggt cga ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag aac Asp Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 85 90 95 acc ctg tat ctg caa atg aac agt ctg agg gct gag gac acg gee gta Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 tat tac tgt gca aga cgg ggg gac gca tgg ggt aac ttg gac tac tgg 48 96 144 240 288 336 192 334 414 43ΕΡ 1 079 856/ΡΤ

Tyr Tyr Cys 115 Ala ggt caa gga acc Gly Gin 130 Gly Thr Arg Arg Gly Asp Ala 120 tta gtc acc gtc tcc Leu Vai Thr Vai Ser 135

Trp Gly Asn Leu Asp Tyr Trp 125 tca

Ser

<210> 6 <211> 138 <212> PRT <213> Mus musculus <2 2 0 > <223> Figure 2 (A) : Região variável da cadeia pesada do anticorpo VTml.1 humanizado (HuVTml.l). 400> 6 Met Asn 1 Phe Vai Leu 5 Ser Ser Ile Phe Leu 10 Ala Leu Ile Leu Lys 15 Gly Vai Gin Cys Glu 20 Vai Gin Leu Vai Glu 25 Ser Gly Gly Gly Leu 30 Vai Gin Pro Gly Gly 35 Ser Leu Arg Leu Ser 40 Cys Ala Ala Ser Gly 45 Phe Thr Phe Ser Ser 50 Tyr Gly Met Ser Trp 55 Vai Arg Gin Ala Pro 60 Gly Lys Gly Leu Glu 65 Trp Vai Ala Thr Ile 70 Ser Thr Gly Gly Ser 75 Tyr Thr Tyr Tyr Pro 80 Asp Ser Vai Lys Gly 85 Arg Phe Thr Ile Ser 90 Arg Asp Asn Ser Lys 95 Asn Thr Leu Tyr Leu 100 Gin Met Asn Ser Leu 105 Arg Ala Glu Asp Thr 110 Ala Vai Tyr Tyr Cys 115 Ala Arg Arg Gly Asp Ala 120 Trp Gly Asn Leu 125 Asp Tyr Trp Gly Gin 130 Gly Thr Leu Vai Thr 135 Vai Ser Ser

<210> 7 <211> 381 <212> ADN <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (I)..(381) <220> <223> Figure 2 (B) : Região variável da cadeia leve do anticorpo VTml.1 humanizado (HuVTml.l). <400> 7 44 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ atg gtt ttc aca cct cag ata ctt gga ctt atg ctt ttt tgg att tea 48 Met Vai Phe Thr Pro Gin Ile Leu Gly Leu Met Leu Phe Trp Ile Ser 1 5 10 15 gcc tcc aga ggt gaa att gtg cta act cag tct cca gcc acc ctg tct 96 Ala Ser Arg Gly Glu Ile Vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 gtg tct cca gga gaa aga gcc act ctt tcc tgc agg gcc agt caa act 144 Vai Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Thr 35 40 45 att age aac aac cta cac tgg tat caa caa aaa cca ggt cag gct cca 192 Ile Ser Asn Asn Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60 agg ctt ctc ate aag tct gct tcc cag tcc ate tct ggg ata ccc gcc 240 Arg Leu Leu Ile Lys Ser Ala Ser Gin Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 agg ttc agt ggc agt gga tea ggg aca gat ttc act ctc act ate age 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 agt ctg gaa tct gaa gat ttt gea gtg tat tac tgt caa cag agt tac 336 Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr 100 105 110 agt tgg ccg ctc acg ttc ggt ca a ggg acc aag gtg gag ate aaa 381 Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 115 120 12 5

<210> 8 <211> 127 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Figura 2(Β): Região variável da cadeia leve do anticorpo VTml.1 humanizado (HuVTml.l). <400 V 00 Met Vai Phe Thr Pro Gin Ile Leu Gly Leu Met Leu Phe Trp Ile Ser 1 5 10 15 Ala Ser Arg Gly Glu Ile val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser 20 25 30 Vai Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Thr 35 40 45 Ile Ser Asn Asn Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro 50 55 60 Arg Leu Leu Ile Lys Ser Ala Ser Gin Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 45 ΕΡ 1 079 856/ΡΤ

Ser Leu Glu Ser Glu Asp Phe Ala Vai Tyr Tyr Cys Gin Gin Ser Tyr 100 105 110

Ser Trp Pro Leu Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Vai Glu Ile Lys 115 120 125

Lisboa,

Claims (20)

1. ΕΡ 1 079 856/ΡΤ 1/4 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo humanizado que se liga especificamente a VT2 e/ou a uma variante de VT2, em que o anticorpo humanizado compreende pelo menos uma CDR de um anticorpo não humano numa estrutura de região variável humana.
2. 2. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 1 que se liga especif icamente à subunidade B de VT2 e/ou à subunidade B da variante de VT2.
3. 3. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 1 ou da reivindicação 2 que neutraliza VT2 e/ou a variante de VT2 .
4. 4. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 1 que é uma forma humanizada do anticorpo de ratinho VTml.l, sendo o anticorpo de ratinho caracterizado por uma região variável da cadeia leve mostrada na Fig. 1B (SEQ ID NO: 4) e uma região variável da cadeia pesada mostrada na Fig. IA (SEQ ID NO: 2).
5. 5. Anticorpo humanizado da reivindicação 1 que compete com o anticorpo de ratinho VTml.l pela ligação especifica a VT2 e/ou variante de VT2, em que as regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo de ratinho são designadas SEQ ID NOS: 2 e 4, respectivamente.
6. ΕΡ 1 079 856/ΡΤ 2/4 do anticorpo de ratinho são designadas SEQ ID NO: 2 e 4, respectivamente.
7. 7. Anticorpo humanizado de acordo com a reivindicação 6, com a condição de que pelo menos uma posição, de preferência cada posição, do grupo que consiste em L3, L4, L19, L76, L79, L85, Hl, H4, H5, H79, H89 e H93, seja ocupada por um aminoácido presente na posição equivalente de uma sequência de consenso da cadeia pesada ou leve do anticorpo humano.
8. 8. Anticorpo humanizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 compreendendo uma região variável da cadeia pesada mostrada na Fig. 2A (SEQ ID NO: 6) e uma região variável da cadeia leve mostrada na Fig. 2B (SEQ ID NO: 8) com a condição de que uma ou mais das posições seleccionadas a partir do grupo que consiste em L49, H29, H30, H49, H98, L3, L4, LI9, L76, L79, L85, Hl, H4, H5, H79, H89 e H93 possam ser substituídas tal como mostrado nas Tabelas 2 e 3; e em que o anticorpo humanizado se liga especificamente a verotoxina II com uma constante de afinidade entre 1CT7 M e dez vezes a afinidade do anticorpo VTml-1 de ratinho.
9. 9. Anticorpo humanizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 compreendendo uma região variável da cadeia pesada mostrada na Fig. 2A (SEQ ID NO: 6) e uma região variável da cadeia leve mostrada na Fig. 2B (SEQ ID NO: 8).
10. 10. Anticorpo humanizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 compreendendo uma cadeia pesada humanizada possuindo pelo menos 85% de identidade com a cadeia pesada humanizada mostrada na Fig. 2A (SEQ ID NO: 6) e uma cadeia leve humanizada possuindo pelo menos 85% de identidade de sequência com a cadeia leve humanizada mostrada na Fig. 2B (SEQ ID NO: 8), com a condição de que pelo menos uma posição seleccionada do grupo que consiste em L49, H29, H30, H49 e H98, seja ocupada pelo aminoácido presente na posição equivalente da estrutura da região variável da cadeia pesada ou leve do anticorpo VTml.1 de ratinho.
11. 11. Anticorpo humanizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que o anticorpo compreende dois pares ΕΡ 1 079 856/ΡΤ 3/4 de dímeros de cadeia leve/pesada, em que cada cadeia compreende uma região variável e uma região constante. acordo com qualquer uma das um fragmento Fab ou F(ab')2·
12. 12. Anticorpo humanizado de reivindicações 1 a 5 ou 11, que é
13. 13. Anticorpo humanizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, 11 ou 12 na forma purificada.
14. 14. Anticorpo humanizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, 11, 12 ou 13 que possui um isotipo de imunoglobulina IgGi.
15. 15. Método de produção de um anticorpo VTml.1 humanizado, compreendendo a cultura de uma linha celular, que codifica as cadeias pesada e leve do anticorpo humanizado de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, pelo qual o anticorpo humanizado é expresso; e recuperação do anticorpo humanizado expresso pela linha celular; compreendendo ainda opcionalmente o referido método a mistura do anticorpo com um transportador farmaceuticamente aceitável para produzir uma composição farmacêutica.
16. 16. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo humanizado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
17. 17. Utilização de um anticorpo humanizado tal como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 que se liga especificamente a verotoxina II e/ou a uma variante de verotoxina II, no fabrico de um medicamento para tratamento de um paciente sofrendo, ou em risco de sofrer, os efeitos tóxicos de uma verotoxina.
18. 18. Utilização da reivindicação 17, em que: (a) o anticorpo compete com o anticorpo VTml-1 de ratinho pela ligação especifica à verotoxina II ou à variante de verotoxina II; ou (b) o anticorpo humanizado liga-se especificamente a VT2 e/ou a uma variante de VT2; ou ΕΡ 1 079 856/ΡΤ 4/4 (c) ο anticorpo humanizado liga-se especificamente à subunidade B de VT2 e/ou da variante de VT2; ou (d) o anticorpo humanizado liga-se especificamente a VT2 e/ou a uma variante de VT2 e neutraliza VT2 e/ou a variante de VT2; ou (e) o anticorpo humanizado liga-se especificamente à subunidade B de VT2 e/ou à subunidade B de uma variante de VT2 e neutraliza VT2 e/ou uma variante de VT2; ou (f) o anticorpo é um anticorpo humanizado, que é uma forma humanizada do anticorpo VTml.1 de ratinho; ou (g) o anticorpo é um anticorpo humanizado compreendendo uma região variável da cadeia pesada mostrada na Fig. 2A (SEQ ID NO: 6) e uma região variável da cadeia leve mostrada na Fig. 2B (SEQ ID NO: 8) ; em que as regiões variáveis da cadeia pesada e leve do anticorpo VTml.1 de ratinho são designadas SEQ ID NO: 2 e 4, respectivamente.
19. 19. Utilização de acordo com a reivindicação 17 ou a reivindicação 18, em que o paciente está infectado com E. coli produtora de verotoxina e o medicamento é adaptado para administrar o anticorpo terapeuticamente ou profilacticamente.
20. 20. Linha celular que produz um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14. Lisboa,