PT98944B

PT98944B - Processo de preparacao de anticorpos alterados e de composicoes farmaceuticas para a prevencao e tratamento de infeccoes

Info

Publication number: PT98944B
Application number: PT98944A
Authority: PT
Inventors: William J Harris; Philip R Tempest; Geraldine Taylor
Original assignee: Scotgen Ltd
Priority date: 1990-09-11
Filing date: 1991-09-11
Publication date: 1999-02-26
Also published as: KR930702519A; EP0548190A1; CA2091335A1; WO1992004381A1; PT98944A; GB9019812D0; JPH06501152A; NZ239728A; ZA917170B; AU654827B2; AU8505891A; IE913177A1; MX9101046A

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

ANTECEDENTES DO INVENTO

Tem havido desde há muito tempo uma necessidade de agentes eficazes para a prevenção e tratamento de infecções em animais e no Homem. Os processos típicos compreendem a administração de agentes químicos que inibem o crescimento de microorganismos, permitindo que o sistema imunitário erradique o agente infeccioso. Embora os produtos químicos naturais e sintéticos tenham sido particularmente eficazes como tratamentos de infecções bacterianas o aparecimento de estirpes resistentes mostrou-se frequente e problemático. Nas infecções virais, os agentes químicos têm tido efeito limitado e a gravidade da doença está normalmente correlacionada com o estado do sistema imunitário.

É conhecida há muitos anos, a eficácia do soro de indivíduos imunes, na prevenção e tratamento de doenças infecciosas. Contudo, é bem conhecido gue os anticorpos dos soros imunes humanos que são responsáveis por tratamentos eficazes, i.e., o componente de anticorpo neutralizante, são apenas uma fracção muito pequena dos anticorpos totais dos soros. Além disso, a utilização de soros imunes tem sido limitada pelos baixos níveis de anticorpos neutralizantes, pela escassez de doadores imunes, pelo custo do tratamento e mais recentemente pelo risco de propagação acidental de doenças através de microorganismos nos soros de dadores.

desenvolvimento da tecnologia dos anticorpos monoclonais proporcionou o meio de desenvolvimento e produção de anticorpos monoclonais murinos puros, em grandes quantidades, a partir de linhas de células desprovidas de microorganismos patogénicos. Com esta técnica foi possível proporcionar anticorpos monoclonais que interagem com organismos patogénicos, podendo alguns destes anticorpos monoclonais impedir o crescimento dos microorganismos alvo em ratinhos infectados. Infelizmente, não foi possível prever a partir de estudos in vitro quais os anticorpos que serão mais eficazes para matar in vivo os microorganismos. Muitos

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-4anticorpos monoclonais com elevada afinidade de ligação com o seu alvo, num conjunto in vitro, não são eficazes in vivo. De facto, nalguns casos onde os anticorpos são eficazes na prevenção do crescimento dos microorganismos sob condições laboratoriais, mostram-se ineficazes no ambiente in vivo.

O impacto e as limitações dos anticorpos monoclonais murinos no tratamento de doenças infecciosas são ilustrados pelo caso da infecção pelo vírus sincicial respiratório (RSV). O RSV é a principal causa de infecção do tracto respiratório inferior em crianças no primeiro ano de vida e uma causa significativa de doença respiratória no gado jovem. No Homem, têm falhado a maioria das tentativas de vacinação contra a infecção por RSV e o tratamento da infecção por RSV com drogas químicas tais como ribavirina só é parcialmente eficaz. Os anticorpos monoclonais murinos, específicos para o RSV mostraram ser eficazes na prevenção e tratamento do RSV em ratinhos. Contudo, a utilização de anticorpos monoclonais murinos no tratamento e prevenção do RSV em espécies não murinas está potencialmente limitada pela resposta imunitária destas espécies ao anticorpo de murino estranho, i.e., têm havido respostas imunitárias em seres humanos contra anticorpos murinos, quer para regiões constantes quer para regiões variáveis da imunoglobulina (anticorpos anti-ratinho de ser humano). Por consequência, as variantes não imunogénicas dos anticorpos monoclonais onde as regiões constantes e variáveis da imunoglobulina contêm sequências de aminoácidos reconhecidas como auto pelo receptor infectado por RSV são necessárias para a prevenção e tratamento eficazes da infecção por RSV.

A tecnologia de ADN recombinante proporcionou a capacidade de alterar anticorpos, de forma a substituir regiões da imunoglobulina (Ig) especificas de uma espécie por regiões de uma outra. 0 Pedido de Patente PCT N². PCT/GB85/00392 (Neuberger et al e Celltech Limited) descreve um processo pelo qual o domínio variável das cadeias pesada e leve complementares, de uma molécula de Ig de uma espécie pode ser combinado com os domínios constantes da cadeia pesada e leve complementares de Ig de uma

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outra espécie. Este processo pode ser utilizado, por exemplo, para alterar anticorpos monoclonais murinos dirigidos contra uma doença humana específica. Tal alteração é efectuada por substituição dos domínios da região constante dos anticorpos murinos por domínios da região constante da XgG humana para criar um anticorpo quimérico, a ser potencialmente utilizado para tratamento dessa doença humana. Contudo esses anticorpos quiméricos irão ainda originar potencialmente uma resposta imunitária em humanos contra as regiões variáveis murinas (i.e., estranho).

Pedido de Patente Britânica Publicação Número GB2188638A (Winter) descreve um processo pelo qual os anticorpos são alterados por substituição das suas regiões determinantes de complementaridade (CDR) de uma espécie por aquelas de uma outra. Este processo pode ser utilizado, por exemplo, para substituir as CDR de domínios da região variável da cadeia pesada e leve de Ig humana por CDR alternativas de domínios da região variável de murinos. Estas regiões variáveis de Ig alteradas podem ser combinadas subsequentemente com regiões constantes de Ig humana para criar anticorpos que são totalmente humanos em composição com a excepção das CDR de murino substituídas. Estes anticorpos substituídos com CDR de murino são capazes de originar, em humanos, uma resposta imunitária consideravelmente reduzida comparada à dos anticorpos quiméricos porque eles contêm consideravelmente menos componentes murino. Contudo, como referido no Pedido de Patente Britânica Publicação Número GB2188638A, a mera substituição de uma ou mais CDR por CDR complementares de uma outra espécie que são específicas para uma doença desejada pode não resultar sempre num anticorpo alterado que mantenha a capacidade de ligação a antigénio das CDR complementares. 0 Pedido de Patente Britânica propõe que por experimentação de rotina ou por tentativa e erro possa ser obtido, um anticorpo alterado funcional com capacidade de ligação a antigénio. Contudo não é fornecida qualquer descrição da natureza da experimentação de rotina ou do processo de tentativa e erro necessários para se obter o anticorpo desejado e há a sugestão de que deviam ser tentadas substituições sucessivas das

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CDR de diferentes fontes.

O exame das estruturas tridimensionais de várias IgG conduziu à conclusão de que as regiões variáveis das cadeias pesada e leve de Ig compreendem cada uma três estruturas em laçada (lopped structures) (que incluem as CDR) apoiadas numa estrutura semelhante a folha, denominada estrutura da região variável. A definição predominante do que compreende uma CDR e do que compreende uma estrutura é baseada nas sequências de aminoácidos de um certo número de Ig.

Na configuração tridimensional, as estruturas em laçada acima mencionadas e as CDR entre um anticorpo de ratinho e de humano não correspondem exactamente, embora haja sobreposição considerável. Por consequência, parece gue, nalguns casos, a transferência de especificidade de ligação a antigénio por substituição das CDR pode requerer a substituição adicional de resíduos adjacentes às CDR definidas. Por exemplo, tem sido colocada a hipótese de que, em certos casos, os resíduos de aminoácidos da estrutura da região variável possam ser importantes na ligação de antigénio através de interacção directa com as CDR (Ver, Amit et al.. Science. 233 (1986) pag. 747-753? Queen et al.. Proc. Natl. Acad. Sei., 86 (1989) pag. 10029-10033? e Protein Design Labs, Pedido de Patente PCT Publicação Número W09007861, publicado em 26 de Julho de 1990). Na referência de Queen et al., os autores seleccionaram regiões variáveis de humanos para a substituição da CDR de murino com base na homologia máxima para a região variável de murino gue compreende as CDR utilizadas para a substituição. Adicionalmente, com base em modelação por computador os autores Queen et al., utilizaram uma estrutura humana para substituição das CDR que incluiu vários aminoácidos da estrutura de murino que se pensa interagirem com as CDR de murino. 0 anticorpo alterado resultante, embora mantendo a capacidade de ligação a antigénio, continha aminoácidos adicionais da estrutura de murino. Tais aminoácidos adicionais da estrutura de murino podiam contribuir para uma resposta imunitária intensificada para o anticorpo alterado em humanos.

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-7Adicionalmente, estudos anteriores (ver, por exemplo, Riechmann et al. . Nature, 332 (1988), p323-327) mostraram que a utilização da remodelação pode ser utilizada para transferir a elevada afinidade de ligação in vitro de anticorpos de ratinho para anticorpos humanos, mas não foi mostrado anteriormente que é possível proporcionar a combinação das propriedades requeridas para a conservação da prevenção eficaz do crescimento do vírus sincicial respiratório (RSV) humano in vivo.

Por consequência, há necessidade de anticorpos alterados com imunogenicidade mínima para a prevenção e tratamento de doenças infecciosas. Adicionalmente, há necessidade de um processo definido para produzir tais anticorpos alterados sem a alteração radical das estruturas da região variável e do efeito associado na imunogenicidade. 0 presente invento proporciona anticorpos alterados para prevenção e tratamento de doenças infecciosas e um processo para a sua produção por introdução só de modificações críticas na estrutura da região variável.

RSV, que está no género Pneumovirus da família Paramyxoviridae, é a causa principal de infecções do tracto respiratório inferior em crianças jovens. A infecção primária dá uma imunidade incompleta e é frequentemente observada reinfecção durante a infância. 0 papel dos mecanismos imunitários na doença humana não foi clarificado. As tentativas anteriores para desenvolver vacinas eficazes com o RSV atenuado ou morto não tiveram sucesso, i.e., não só as crianças estavam não protegidas, como as infecções subsequentes com RSV resultaram, por vezes, em doenças mais graves do que nos controlos não imunizados. A infecção com RSV é também a causa principal de infecção respiratória no gado jovem.

Recentemente, tem sido obtida uma certa informação imunológica e molecular que diz respeito às propriedades antigénicas e funcionais das proteínas de RSV. A proteína de fusão (F) do RSV e a proteína de ligação (G) do RSV foram identificadas como os principais antigénios virais e os seus genes foram cionados e sequenciados. Foram descritos dois

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SBC Case P30148 subgrupos antigenicamente distintos de RSV humano, designados por A e B. As diferenças antigénicas entre os subgrupos A e B residem principalmente na proteína G de RSV. Em contraste, a proteína F de RSV tem um elevado grau de homologia genética e antigénica entre os dois subgrupos e as várias estirpes destes subgrupos.

Os anticorpos monoclonais (mAb) dirigidos contra ambas as glicoproteínas do invólucro (F e G) do RSV têm demonstrado neutralizar o vírus. (Ver, Walsh & Hruska, J. Viroloqy. 47, 171-177 (1983); e Walsh et al.. J. Gen. Virolocrv. 65, 761-767 (1984)). Contudo, estudos in vitro e in vivo com mAb ou com recombinantes de vírus vacina que expressam proteína F indicaram que esta proteína é o antigénio mais importante na indução de imunidade de protecção cruzada. (Ver Johnson et al., J.Virology. 61. 3163-3166 (1987); Olmsted et al., Proc. Nat. Acad. Sei.. USA, 7462-7466 (1986); Wertz et al. , J. Virolocrv. 61. 293-310 (1987); e Walsh et al.. Infection and Immunitv. 43. 756-758 (1984)). Os vários autores identificaram diferentes locais antigénicos na proteína F e mostraram que, pelo menos três destes locais antigénicos estão envolvidos na neutralização. Dois ou três epítopos de neutralização foram localizados na proteína F de diferentes formas. Utilizando vírus mutantes de fuga, Lopez et al., J. Virology. 64. 927-930 (1990), mostraram que os dois resíduos de aminoácidos (i.e., 262-Asn e 268-Asn) da subunidade F-l da proteína F são essenciais para a integridade de um epítopo de neutralização particular. Um outro epítopo de neutralização altamente conservado foi mapeado com péptidos sintéticos nos resíduos 221-Ile a 232-Glu da subunidade F-j_ da proteína F por Trudel et al.. J. General Virology. 68. 2273-2280 (1987).

Finalmente, uma análise recente pelo procedimento Pepscan identificou um epítopo nas posições 483-Phe a 488-Phe da subunidade F-l da proteína F, epítopo que podia corresponder a um outro epítopo de neutralização. (Ver, Scopes et al.. J, General virology, 71. 53-59 (1990)).

Há uma necessidade de desenvolvimento de novas terapias para o tratamento e prevenção da infecção por RSV. Um epítopo de neutralização e protector de um antigénio virai de RSV podia

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SBC Case P30148 —9— provar ser útil na produção de anticorpos monoclonais úteis para a profilaxia e/ou tratamento da infecção por RSV. O presente invento proporciona um tal epítopo novo na proteína F de RSV que é reconhecido por um anticorpo neutralizante e protector in vivo.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra a sequência de ADN e a correspondente sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada (VH) de RSV19. As sequências da CDR estão enquadradas. Os primeiros oito e os últimos onze aminoácidos, como sublinhado, correspondem às sequências dos iniciadores oligonucleotídicos utilizados.

A Figura 2 mostra a sequência de ADN e a correspondente sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve (VK) de RSV19. As sequências da CDR estão enquadradas. Os primeiros oito e os últimos seis aminoácidos, como sublinhado, correspondem às sequências dos iniciadores oligonucleotídicos utilizados.

A Figura 3 mostra o plasmídeo básico pHuRSV19VH que compreende uma estrutura da região variável da cadeia pesada de Ig humana e as CDR derivadas do RSV19 de ratinho.

A Figura 4 mostra o plasmídeo básico pHuRSV19VK que compreende uma estrutura da região variável da cadeia leve de Ig humana e as CDR derivadas do RSV19 de ratinho.

A Figura 5 mostra as sequências derivadas de aminoácidos da região variável da Ig codificadas por RSV19VH, RSV19VK, pHuRSV19VH e pHuRSV19VK e derivações de pHuRSV19VH.

A Figura 6 mostra uma análise ELISA da ligação do anticorpo HuRSV19VH/VK e do seu derivado, HuRSV19VHFNS/VK, ao antigênio de RSV.

A Figura 6A mostra que há pouca diferença, se alguma, entre a capacidade dos anticorpos RSV19 e HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK para se ligarem ao vírus RS não desnaturado, intacto.

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-10Sr*?'

A Figura 7 mostra que o mAb RSV19 se liga a dois péptidos sintéticos que consistem, respectivamente, nos resíduos de aminoácidos 417-432 e 422-438 da proteína F.

SUMÁRIO DO INVENTO

O presente invento refere-se a anticorpos alterados nos quais pelo menos partes das regiões determinantes de complementaridade (CDR) nos domínios variáveis leves e/ou pesados de um anticorpo monoclonal aceitador foram substituídas por partes análogas das CDR de um ou mais anticorpos monoclonais dadores e em que pode ou não haver alteração mínima da região da estrutura de domínio variável leve e/ou pesado do anticorpo monoclonal aceitador de forma a manter a especificidade de ligação ao anticorpo monoclonal dador, em que tais anticorpos dadores têm especificidade para os microorganismos, em particular especificidade para o vírus sincicial respiratório (RSV). O presente invento refere-se também a um processo de preparação destes anticorpos alterados; uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade não tóxica, terapêutica, destes anticorpos alterados e um veículo ou diluente farmacêuticamente aceitável; e a um processo de tratar profilática ou terapeuticamente um estado de doença induzido por microorganismos num humano ou num animal com essa necessidade que compreende a administração de uma quantidade eficaz de tais anticorpos alterados a esse humano ou animal. Preferivelmente, os anticorpos alterados do invento serão produzidos por tecnologia de ADN recombinante. 0 anticorpo alterado do presente invento pode compreender uma molécula de anticorpo completa (tendo cadeias pesadas e leves de comprimento total) ou um seu qualquer fragmento, tal como o fragmento Fab ou (Fab')₂, um dímero de cadeia leve ou de cadeia pesada ou um qualquer seu fragmento recombinante mínimo tal como um Fv ou um SCA (anticorpo de cadeia única) ou qualquer outra molécula com a mesma especificidade que o anticorpo alterado do invento. Alternativamente, o anticorpo alterado do invento pode ter ligado a ele uma molécula efectora ou repórter”. Por exemplo, o anticorpo alterado do invento pode ter um macrociclo, para quelar um átomo de metal pesado, ou uma

ligação covalente. Alternativamente, o procedimento de tecnologia de ADN recombinante pode ser utilizado para produzir um anticorpo alterado do invento no qual o fragmento Fc ou o domínio CH3 de uma molécula de anticorpo completa foi substituído por uma enzima ou molécula de toxina. 0 resto do anticorpo alterado pode ser derivado de qualquer imunoglobulina humana adequada. Contudo, não necessita de compreender apenas sequências de proteína da imunoglobulina humana. Por exemplo, pode ser construído um gene no qual uma sequência de ADN que codifica parte de uma cadeia de imunoglobulina humana é fundida com uma sequência de ADN que codifica a sequência de aminoácidos de uma molécula polipeptídica efectora ou repórter.

Um outro aspecto deste invento é a verificação de que um epítopo específico da proteína F (fusão) de RSV, que demonstrou ser um alvo para anticorpos monoclonais protege e cura os ratinhos da infecção por RSV. Adicionalmente verificou-se também que os fragmentos Fab de tais anticorpos monoclonais protegem os ratinhos da infecção in vivo. Assim, o presente invento refere-se também a um tal epítopo específico da proteína F de RSV; anticorpos monoclonais dirigidos contra um tal epítopo; e fragmentos Fab de tais anticorpos monooclonais. Adicionalmente, este invento refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapêutica, não tóxica, de tais anticorpos monoclonais ou de fragmentos Fab e um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável; e a um processo de tratar profilática ou terapeuticamente a infecção por RSV num humano ou animal com essa necessidade que compreende a administração de uma quantidade eficaz de tais anticorpos monoclonais ou fragmentos Fab a esse humano ou animal.

presente invento proporciona anticorpos alterados com especificidade para microorganismos e o ADN que codifica tais anticorpos. Estes anticorpos compreendem regiões constantes e regiões variáveis de Ig de uma fonte, e uma ou mais CDR de uma fonte diferente.

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12Adicionalmente, são descritas substituições de aminoãcidos nas estruturas da região variável as quais são críticas para a afinidade de ligação ao antigénio. 0 invento proporciona também vectores que produzem os anticorpos alterados em células hospedeiras de mamífero.

O presente invento aplica-se particularmente ao fornecimento de anticorpos alterados com a combinação das propriedades requeridas para a prevenção e tratamento de infecções em animais e no homem. Por exemplo, os anticorpos não humanos com especificidade para microorganismos podem ser alterados para produzir anticorpos humanizados” que originam uma resposta imunitária mínima em humanos. Em particular, o invento proporciona anticorpos humanizados com especificidade para RSV que mostram ser eficazes num modelo animal para a infecção por RSV em humanos e que reconhecem uma grande variedade de isolados clínicos humanos de RSV.

O presente invento proporciona também um processo para efectuar modificações mínimas nos aminoãcidos das estruturas de região variável de forma a manter a capacidade de ligação ao antigénio das CDR de uma fonte diferente. O processo envolve a alteração por passos e o teste de aminoácidos individuais na estrutura da região variável potencialmente crítica para a afinidade de ligação ao antigénio. 0 processo evita a introdução principal de aminoácidos de estrutura da mesma fonte das CDR.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Como aqui utilizado, o termo anticorpo humanizado refere-se a uma molécula tendo as suas regiões determinantes de complementaridade (e, talvez, porções mínimas da sua região da estrutura de domínio variável leve e/ou pesado) derivada de uma imunoglobulina de uma espécie não humana, sendo as restantes partes derivadas da molécula de imunoglobulina derivadas de uma imunoglobulina humana.

O presente invento refere-se a anticorpos alterados nos

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quais pelo menos partes das regiões determinantes de complementaridade (CDR) nos domínios variáveis leves e/ou pesados de um anticorpo monoclonal aceitador foram substituídas por partes análogas de CDR de um ou mais anticorpos monoclonais dadores, e em que pode ou não ter havido uma alteração mínima da região da estrutura de domínio variável leve e/ou pesado do anticorpo monoclonal aceitador de forma a manter a especificidade de ligação ao anticorpo monoclonal dador, em que tais anticorpos dadores têm especificidade para microorganismos, em particular especificidade para o vírus sincicial respitarório (RSV). 0 presente invento refere-se também a um processo de preparação de tais anticorpos alterados; a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapêutica, não tóxica, de tais anticorpos alterados e um portador ou diluente farmaceuticamente aceitável; e a um processo de tratar profilática ou terapeuticamente um estado de doença induzido por microorganismo num humano ou animal com essa necessidade o qual compreende a administração de uma quantidade eficaz de tais anticorpos alterados a esse humano ou animal.

Os anticorpos alterados do invento podem ser produzidos pelo processo seguinte:

(a) produção, por técnicas convencionais, num vector de expressão de um operão tendo uma sequência de ADN que codifica uma cadeia pesada ou leve de anticorpo em que pelo menos as CDR (e aquelas porções mínimas da região da estrutura de domínio variável leve e/ou pesado do anticorpo monoclonal aceitador requeridas por forma a manter a especificidade de ligação ao anticorpo monoclonal dador) do domínio variável são derivadas de uma imunoglobulina não humana, tal como aquela produzida pelo RSV19 e as restantes partes derivadas da imunoglobulina da cadeia do anticorpo são derivadas de uma imunoglobulina humana, produzindo assim o vector do invento;

(b) produção, por técnicas convencionais, num vector de expressão de um operão tendo uma sequência de ADN que codifica uma cadeia leve ou pesada de anticorpo complementar em que pelo menos as CDR (e aquelas porções mínimas da região de estrutura de domínio variável leve e/ou pesado do anticorpo monoclonal

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-14aceitador requeridas de forma a manter a especificidade de ligação ao anticorpo monoclonal dador) do domínio variável são derivadas de uma imunoglobulina não humana, tal como aquela produzida pelo RSV19 e as restantes partes derivadas de imunoglobulina da cadeia do anticorpo são derivadas de uma imunoglobulina humana, produzindo assim um outro vector do invento;

(c) transfecção de uma célula hospedeira por técnicas convencionais com o vector ou com cada um dos vectores para criar a célula hospedeira transfectada do invento;

(d) cultura da célula transfectada por técnicas convencionais para produzir o anticorpo alterado do invento.

A célula hospedeira pode ser transfectada com dois vectores do invento, o primeiro vector contendo um operão que codifica um polipéptido derivado da cadeia leve e o segundo vector contendo um operão que codifica um polipéptido derivado da cadeia pesada. Preferivelmente, os vectores são idênticos com a excepção de que as sequências de codificação e os marcadores seleccionáveis estão relacionados para assegurar tanto quanto possível que cada cadeia polipeptídica seja igualmente expressa. Alternativamente, pode ser utilizado um único vector do invento, incluindo o vector a sequência que codifica os polipéptidos derivados quer da cadeia leve quer da cadeia pesada. 0 ADN nas sequências de codificação das cadeias leve e pesada pode compreender ADNc ou ADN genómico ou ambos.

A célula hospedeira utilizada para expressar o anticorpo alterado do invento é preferivelmente uma célula eucariótica, mais preferivelmente uma célula de mamífero, tal como uma célula CHO ou uma célula mielóide.

Os processos gerais pelos quais os vectores do invento podem ser construídos, os processos de transfecção requeridos para produzir a célula hospedeira do invento e os processos de cultura necessários para produzir o anticorpo alterado do invento a

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-15partir dessa célula hospedeira são todos técnicas convencionais. Igualmente, uma vez produzidos, os anticorpos alterados do invento podem ser purificados de acordo com os procedimentos padrão da arte, incluindo a precipitação por sulfato de amónio, colunas de afinidade, cromatografia em coluna, electroforese em gel e semelhantes.

Um exemplo do anticorpo alterado do invento são os anticorpos humanizados derivados do anticorpo monoclonal de murino RSV19 tais como HuRSV19VH/VK e HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK que são descritos nos Exemplos. Tais anticorpos são úteis no tratamento, terapêutico ou profilático, de um humano contra a infecção por RSV humano. Por consequência, este invento refere-se também a um processo de tratamento, terapêutico ou profilático, da infecção por RSV humano num humano com essa necessidade que compreende a administração de uma dose de tratamento da infecção por RSV humano, eficaz, desses anticorpos alterados a esse humano.

Os anticorpos alterados deste invento podem também ser utilizados em conjunção com outros anticorpos, particularmente anticorpos monoclonais humanos reactivos com outros marcadores (epítopos) responsáveis pela doença contra a qual está dirigido o anticorpo alterado do invento.

Os anticorpos alterados deste invento podem também ser utilizados como composições separadamente administradas dadas em conjunção com agentes quimioterapêuticos ou imunossupressores. A combinação apropriada dos agentes a utilizar pode ser facilmente determinada por um perito na arte utilizando técnicas convencionais. Como exemplo de uma tal combinação, o anticorpo alterado do invento conhecido como HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK pode ser dado em conjunção com o agente antiviral ribavirina de forma a facilitar o tratamento da infecção por RSV num humano.

Uma composição farmacêutica do presente invento compreende a utilização dos anticorpos objecto do invento em imunotoxinas, i.e., moléculas que são caracterizadas por dois componentes e são

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SBC Case P30148 —16— particularmente úteis para matar células seleccionadas in vitro ou in vivo. Um componente é um agente citotóxico que é normalmente fatal para uma célula quando fixado ou absorvida. O segundo componente, conhecido como o veículo de distribuição proporciona um meio para distribuir o agente tóxico a um tipo de células particular, tal como as células que compreendem um carcinoma. Os dois componentes são normalmente quimicamente ligados um ao outro por qualquer um de uma variedade de procedimentos químicos bem conhecidos. Por exemplo, quando o agente citotóxico é uma proteína e o segundo componente é uma imunoglobulina intacta, a ligação pode ser por meio de ligantes cruzados heterobifuncionais, por exemplo, carbodiimida, glutaraldeido e semelhantes. A produção das várias imunotoxinas é bem conhecida na arte.

Uma variedade de agentes citotóxicos é adequada para utilização em imunotoxinas, e pode incluir, entre outros, radionuclidos, drogas quimioterapêuticas tais como metotrexato e proteínas citotóxicas tais como proteínas de inibição ribossomal (por exemplo, ricina).

componente de distribuição da imunotoxina incluirá as imunoglobulinas semelhantes às humanas, do presente invento. São preferivelmente utilizadas as imunoglobulinas intactas ou os seus fragmentos de ligação, tais como Fab. Tipicamente, os anticorpos nas imunotoxinas serão do isotipo IgM ou IgG humano, mas podem ser utilizadas se desejado outras regiões constantes de mamífero.

Os anticorpos alterados e as composições farmacêuticas do invento são particularmente úteis para administração parentérica, i.e., subcutânea, intramuscular ou intravenosa. As composições para administração parentérica compreenderão geralmente uma solução do anticorpo alterado do invento ou uma sua mistura dissolvida num portador aceitável, preferivelmente num portador aquoso. Pode ser empregue uma variedade de portadores aquosos, por exemplo, água, água tamponada, solução salina a 0,4%, glicina a 0,3% e semelhantes. Estas soluções são estéreis e geralmente isentas de matéria em partículas. Estas soluções podem ser

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-17esterilizadas por técnicas de esterlização, convencionais bem conhecidas. As composições podem conter substâncias auxiliares farmacêuticamente aceitáveis na medida do requerido para a aproximação das condições fisiológicas tais como ajuste de pH e agentes tamponantes, etc. A concentração do anticorpo alterado do invento em tal formulação farnmacêutica pode variar amplamente, i.e., de menos do que cerca de 0,5%, normalmente a ou pelo menos cerca de 1% até tanto quanto 15 ou 20% em peso e será seleccionada principalmente com base nos volumes de fluído, viscosidades, etc., de acordo com o modo de administração particular seleccionado.

Assim, uma composição farmacêutica do invento para injecção intramuscular pode ser preparada de forma a conter 1 ml de água tamponada estéril e 50 mg de um anticorpo alterado do invento. Similarmente, uma composição farmacêutica do invento para infusão intravenosa pode ser preparada de modo a conter 250 ml de solução de Ringer estéril e 150 mg de um anticorpo alterado do invento. Os processos reais de preparação de composições administráveis parentericamente são bem conhecidos ou serão evidentes para os peritos na arte e são descritos com mais detalhe, por exemplo, em Reminqton^/s Pharmaceutical Science, 15^a ed. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Os anticorpos alterados do invento podem ser liofilizados para armazenamento e reconstituídos num portador adequado antes da utilização. Esta técnica mostrou ser eficaz com imunoglobulinas convencionais e podem ser empregues a liofilização e as técnicas de reconstituição conhecidas na arte.

Dependendo do resultado pretendido, a composição farmacêutica do invento pode ser administrada para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Em aplicação terapêutica, as composições são administradas a um paciente que já sofre de uma doença, numa quantidade suficiente para curar ou pelo menos travar parcialmente a doença e as suas complicações. Em aplicações profiláticas, as composições contendo os presentes anticorpos ou uma sua mistura são administradas a um paciente que

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-18ainda não está num estado de doença para aumentar a resistência do paciente.

As administrações simples ou múltiplas das composições farmacêuticas podem ser realizadas com níveis e modelos de dosagem a serem selecionados pelo médico encarregado do tratamento. Em qualquer caso, a composição farmacêutica do invento deveria proporcionar uma quantidade dos anticorpos alterados do invento suficiente para tratar eficazmente o paciente.

Devia também observar-se que os anticorpos alterados deste invento podem ser utilizados para a concepção e síntese de compostos peptídicos ou de compostos não peptídicos (miméticos) que seriam úteis na mesma terapia que o anticorpo. Ver, por exemplo, Saragovi et al.. Science. 253. 792-795 (1991).

Um outro aspecto deste invento é a verificação de um epítopo específico da proteína F (fusão) de RSV que demonstrou ser um alvo para os anticorpos monoclonais que protegem e curam os ratinhos da infecção por RSV. Adicionalmente, foi também demonstrado que os fragmentos Fab destes anticorpos monoclonais protegem os ratinhos da infecção in vivo. Assim, o presente invento refere-se também a esse epítopo específico da proteína F de RSV; aos anticorpos monoclonais dirigidos contra esse epítopo; e aos fragmentos Fab desses anticorpos monoclonais. Adicionalmente, este invento refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapêutica, não tóxica, desses anticorpos monoclonais ou de fragmentos Fab e um portador ou diluente farmaceuticamente aceitável; e a um processo de tratar profilática ou terapeuticamente a infecção por RSV num humano ou animal com essa necessidade que compreende a administração de uma quantidade eficaz desses anticorpos monoclonais ou fragmentos Fab a esse humano ou animal.

presente invento proporciona anticorpos alterados com especificidade para microorganismos e o ADN que codifica esses anticorpos. Estes anticorpos compreendem regiões constantes e

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-19regiões variáveis de Ig de uma fonte e uma ou mais CDR de uma fonte diferente.

Adicionalmente, são descritas as substituições de aminoãcidos nas estruturas da região variável que são críticas para a afinidade de ligação ao antigénio. 0 invento proporciona também vectores que produzem os anticorpos alterados em células hospedeiras de mamífero.

presente invento aplica-se particularmente ao fornecimento de anticorpos alterados com a combinação de propriedades requerida para a prevenção e tratamento das infecções em animais e no homem. Por exemplo, os anticorpos não humanos com especificidade para microorganismos podem ser alterados para produzir anticorpos humanizados que originam uma resposta imunitária mínima em humanos. Em particular, o invento proporciona anticorpos humanizados com especificidade para o RSV que mostram ser eficazes num modelo animal para a infecção por RSV em humanos e reconhecer uma grande variedade de isolados clínicos humanos de RSV.

presente invento proporciona também um processo para efectuar modificações mínimas nos aminoácidos das estruturas da região variável de forma a manter a capacidade de ligação ao antigénio das CDR de uma fonte diferente. 0 processo envolve a alteração por passos e o teste de aminoácidos individuais na estrutura da região variável potencialmente crítica para a afinidade de ligação ao antigénio. 0 processo evita e introdução principal dos aminoácidos de estrutura da mesma fonte que as CDR.

Os exemplos seguintes são dados com o propósito de ilustração, não de limitação.

EXEMPLOS

Nos exemplos seguintes todas as enzimas de restrição, plasmídeos e outros reagentes e materiais necessários foram obtidos em fontes comerciais a não ser que de outro modo

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indicado.

Nos exemplos seguintes, a não ser que de outro modo indicado, toda a clonagem, ligação ou outra metodologia de ADN recombinante, geral, foi realizada como descrito em Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982) ed T. Maniatis et al.. publicado por Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (a partir daqui referido como Maniatis et al.).

Nos exemplos seguintes, podem ser empregues as seguintes abreviaturas:

dCTP desoxicitidina-trifosfato dATP desoxiadenosina-trifosfato dGTP desoxiguanosina-trifosfato dTTP desoxitisiodina-trifosfato

DTT ditiotreitol

C citosina

A adenina

T timina

G guanina

DMEM meio de Eagle modificado de Dulbecco

PBST solução salina tamponada por fosfato contendo

Tween 20 a 0,02% (pH 7,5)

ANTICORPOS ALTERADOS

Os exemplos 1-3 descrevem a preparação dos anticorpos alterados do invento.

EXEMPLO 1 - PRODUÇÃO DE ANTICORPOS ALTERADOS ESPECÍFICOS PARA RSV

A fonte das CDR dadoras utilizada para preparar estes anticorpos alterados foi um anticorpo monoclonal de murino, RSV19, específico para a proteína de fusão (F) de RSV. A linha de células de hibridoma RSV19 foi obtida a partir do Dr^â. Geraldine Taylor, Institute for Animal Health, Compton Laboratory, Compton, Near Newbury, Berks, RG16 ONN, Inglaterra. A metodologia para o

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isolamento das linhas de células de hibridoma que segregam anticorpos monoclonais específicos para RSV é descrita por Taylor et al.. ImmunolodV, 52 (1984) pl37-142.

ARN citoplásmico foi preparado pelo processo de Favaloro et al.. (1980) Methods in Enzvmoloqy. Vol. 65. p. 718-749, a partir da linha de células de hibridoma RSV19 e o ADNc foi sintetizado utilizando iniciadores da região variável de Ig como se segue:

para a região variável de cadeia pesada (VH) da Ig, foi utilizado o iniciador

VH1FOR(5'TGAGGAGACGGTGACCGTGGTCCCTTGGCCCCAG3·) e

para a região variável de cadeia leve (VK) da Ig, foi utilizado o iniciador VK1FOR(5'GTTAGATCTCCAGCTTGGTCCC3').

As reacções de síntese do ADNc consistiram em 20/xg de ARN 0,4μΜ de VH1F0R ou VK1FOR, 250μΜ de cadaum de dATP, dRTP, dGTP e dTTP, Tris-HCl 50mM, pH 7,5, KC1 75mM, DTT lOmM, MgCl₂ 3mM e 27 unidades de inibidor de RNase (Pharmacia, Milton Keynes, Reino Unido) num volume total de 50μ1. As amostras foram aquecidas a 70°C durante 10 minutos (min) e lentamente arrefecidas a 42°C durante um período de 30 min. Depois, foram adicionados 100μ de transcriptase inversa MMLV (Life Technologies, Paisley, Reino Unido) e a incubação, a 42’C, continuou durante l hora.

Os ADNc VH e VK foram então amplificados utilizando a reacção em cadeia da polimerase (PCR) como descrito por Saiki et al.. Science. 239 (1988), p487-491. Para tal PCR, foram utilizados os iniciadores seguintes:

VH1FOR;

VK1FOR;

VH1BACK (5'AGGTSMARCTGCAGSAGTCWGG3'); e

VK1BACK (5·GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCA3·), onde M = C ou A, S = C ou G, e W = A ou T.

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-22Os iniciadores VH1FOR, VK1FOR, VHIBACK e VK1BACK e a sua utilização para a amplificação por PCR do ADN de Ig de ratinho, são descritos por Orlandi et al., Proc. Nat. Acd. Sei. USA. 86. 3833-3937 (1989).

Para a amplificação por PCR de VH, as misturas ADN/iniciador consistem em 5μ1 de híbrido ARN/ADNc e 0,5μΜ de iniciadores VH1FOR e VHIBACK. Para as amplificações por PCR de VK, as misturas ADN/iniciador consistiam em 5μ1 de híbrido ARN/ADNc e 0,5μΜ de iniciadores VH1FOR e VHIBACK. A estas misturas foram adicionadas 200 μΜ de cada um de dATP, dCTP, dGTP e dTTP, Tris-HCl lOmM, pH 8,3, KC1 50mM, MgCl₂ l,5mM, 0,01% (p/v) de gelatina, 0,01% (v/v) de Tween 20, 0,01% (v/v) de Nonidet P40 e 2 unidades de ADN polimerase Taq (United States Biochemicals-Cleveland, Ohio, EUA). As amostras foram submetidas a 25 ciclos térmicos de PCR a 94°C, 1 min; 60°C, 1 min? 72°C, 2 min? acabando com 5 min a 72°C. Para a clonagem e sequenciação, o ADN de VH amplificado foi purificado num gel de agarose de baixo ponto de fusão e por cromatografia em coluna de Elutip-d (Schleicher e Schuell-Dussel, Alemanha) e clonado no fago M13 (Pharmacia-Milton Keynes, Reino Unido). A metodologia de clonagem e ligação geral foi como descrita em Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982) ed. T. Maniatis et al.. publicado por Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (a partir daqui referido como Maniatis et al.. o ADN de VH ou foi ligado directamente no local Smal de M13 mpl8/19 (Pharmacia-Milton Keynes, UK) ou, a seguir à digestão com PstI. no local PstI de M13tgl31 (Amersham International-Little Chalfont, UK). O VK amplificado foi purificado em gel similarmente e clonado pelas alternativas seguintes:

PvuII digerido em M13mpl9 (local Smal)

PvuII e BglII digeridos em M13mpl8/19 (local Smal- BamHI)

PvuII e BglII digeridos em M13tgl31 (local EcoRV - BglII)

BglII digerido em M13tgl31 (local Smal - BglII)

As colecções resultantes de clones de sobreposição foram sequenciadas pelo processo de didesoxi (Sanger et al.. Proc. Nat. Acad. Sei. Usa. 74 (1977) p5463-5467) utilizando Sequenase

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-23(United States Biochemicals-Cleveland, Ohio, EUA).

A partir da sequência de domínios VH e VK de RSV19, como mostrado na Figura 1 e 2 respectivamente, foram elucidadas as sequências de CDR de acordo com a metodologia de Kabat et al., em Sequences of Proteins of Immunological Interest (US Dept of Health and Human Services, US Government Printing Office, (1987) utilizando alinhamento assistido por computador com outras sequências VH e VK.

A transferência das CDR de RSV19 de murino para as estruturas humanas foi conseguida por mutagénese dirigida ao local. Foram utilizados os iniciadores seguintes:

VHCDRl 5'

VHCDR2 5^Z

VHCDR3 5' VKCDR1 5'

VKCDR2 5⁷

VKCDR3 5'

CTGTCTCACCCAGTGCATATAGTAGTCGCTGAAGGTGAAGCCA GACACGGT3'

CATTGTCACTCTGCCCTGGAACTTCGGGGCATATGGAACATCA TCATTCTCAGGATCAATCCA3'

CCCTTGGCCCCAGTGGTCAAAGTCACTCCCCCATCTTGCACAATA3' CTGCTGGTACCATTCTAAATAGGTGTTTCCATCAGTATGT ACAAGGGTCTGACTAGATCTACAGGTGATGGTCA3' GCTTGGCACACCAGAAAATCGGTTGGAAACTCTGTAG ATCAGCAG3'

CCCTTGGCCGAACGTCCGAGGAAGATGTGAACCTTGAA

AGCAGTAGTAGGT3·

Os moldes de ADN para mutagénese compreenderam as regiões de estrutura humana derivadas das proteínas dissolvidas cristalograficamente, NEW (descrito por Saul et al.. J. Biol. Chem. 53 (1978), p585-597) com uma substituição do aminoácido 27 de serina para fenilalanina (ver, Riechmann et al., loc. cit.) e REI (descrito por Epp et al.. Eur. J. Biochem. 45 (1974), p513-524) para os domínios VH e VK, respectivamente. Os moldes à base de M13 compreendendo as estruturas humanas com CDR não importantes foram preparadas como descrito por Riechmann et al., Nature 332 (1988).

A mutagénese dirigida ao local do oligonucleótido dos genes VH e VK humanos foi baseada no processo de Nakamaye et al., Nucl.

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-24Acids Res. 14 (1986) p9679-9698.

A 5Mg de ADN de cadeia simples VH ou VK em M13 foi adicionado um excesso molar de duas vezes de cada um dos três oligonucleótidos fosforilados VH ou VK que codificam as sequências CDR (região determinante de complementaridade) de ratinho. Os iniciadores foram desnaturados/renaturados com o molde por aquecimento a 70°C e lentamente arrefecidos a 37°C. Ao ADN desnaturado/renaturado foi adicionados fragmento Klenow 6 (Life Technologies, Paisley, UK); ADN de ligase T4 6 (Life Technologies, Paisley, UK) ; 0,5mM de cada um dos nucleósido-trifosfatos seguintes (dATP, dGTP, dTTP e 2*-desoxicitidina-5'-0-(1-tiotrifosfato) (tiodCTP); 60mM de Tris-HCl (pH 8,0); 6mM de MgCl₂; 5mM de DTT (Sigma, Poole, UK); e lOmM de ATP num volume reaccional de 50μ1. Esta mistura foi incubada a 16 °C durante 15 horas (h). 0 ADN foi então precipitado por etanol e digerido com 5 unidades de Ncil (Life Technologies, Paisley, UK) que corta a cadeia progenitora mas deixa a cadeia recentemente sintetizada contendo tiodCTP, intacta. A cadeia progenitora foi então removida por digestão durante 30 min com 100 unidades de exonuclease III (Pharmacia, Milton Keynes, Reino Unido) em 50μ1 de Tris-HCl 60mM (pH 8,0), MgCl₂ 0,66mM e DTT lmM. O ADN foi então reparado através da adição de 3 unidades de ADN polimerase I (Life Technologies, Paisley, UK), 2 unidades de ADN ligase T4 em 50μ1 de Tris-HCl 60mM (pH 8,0), MgCl₂ 6mM, DTT 5mM, ATP lOmM e 0,5mM de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP. 0 ADN foi transformado em células E. coli TG1 competentes (Amersham International, Little Chalfont, UK) pelo processo de Maniatis et al. 0 ADN de cadeia simples foi preparado a partir de placas individuais e sequenciado pelo processo de Messing (1983) Methods in Enzvmologv. 101. p.20-78. Se apenas forem obtidos mutantes simples ou duplos, então estes são submetidos a posteriores séries de mutagénese (utilizando a metodologia descrita acima) utilizando os oligonucleótidos apropriados até serem obtidos os mutantes de CDR triplos.

Os genes VH e VK substituídos por CDR foram clonados em vectores de expressão (pelo processo de Maniatis et al.) para dar

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os plasmídeos mostrados nas Figuras 3 e 4, respectivamente, e tais plasmídeos foram denominados de pHuRSV19VH e pHuRSV19VK. Para o pHuRSV19VH, o gene VH substituído por CDR em conjunto com o promotor de cadeia pesada da Ig (Figuras 3 e 4), locais de união (splice) apropriados e sequências peptídicas de sinal (Figuras 3 e 4) foram excisados a partir de M13 por digestão com HindIII e BamHi. e cionados num vector de expressão contendo o intensificador de cadeia pesada da Ig de murino (Figuras 3 e 4), o promotor SV40 (Figuras 3 e 4), o gene gpt para selecção em células de mamífero (Figuras 3 e 4) e os genes para replicação e selecção em E. coli (Figuras 3 e 4). Foi então adicionada uma região constante de IgGl humana, como um fragmento BamHi (Figuras 3 e 4). A construção do plasmídeo pHuRSV19VK foi essencialmente a mesma com a excepção de que o gene gpt foi substituido pelo gene de resistência à higromicina (Figuras 3 e 4) e foi adicionada uma região constante de cadeia kapa humana (Figuras 3 e 4).

Digeriram-se ío^g de pHuRSV19VH e 20/xg de pHuRSV19VK com Pvul utilizando técnicas convencionais. Os ADN foram misturados em conjunto, precipitados por etanol e dissolvidos em 25/il de água. Foram deixadas crescer até à semi-confluência aproximadamente 10⁷ células YB2/0 (da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EUA), recolhidas por centrifugação e ressuspensas em 0,5ml de DMEM (Gibco, Paisley, UK) em conjunto com o ADN digerido numa cuvete. Após 5 min em gelo, foi dado às células um único impulso de 170V a 960/xF (Gene-Pulser, Bio-Rad-Richmond, Califórnia, EUA) e deixadas em gelo durante 20 min adicionais. As células foram então colocadas em 20 ml de DMEM mais soro de vitela fetal a 10% e deixadas recuperar durante 48h. Após este tempo, as células foram distribuídas numa placa de 24 cavidades e aplicou-se meio selectivo (DMEM, soro de vitela fetal a 10%, o,8gg/ml de ácido micofenólico e 250/xg/ml de xantina). Passados 3-4 dias, o meio e as células mortas foram removidos e substituídos por meio selectivo fresco. Os clones transfectados eram visíveis a olho nú passados 10-12 dias.

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-26A presença de anticorpo humano no meio das cavidades contendo clones transfectados foi medida por técnicas ELISA convencionais. As placas de microtitulação foram revestidas durante a noite a 4°C com anticorpos anti-IgG humana (específicos da cadeia gama) de cabra (Sera-Lab-Ltd., Crawley Down, UK) a 1 /xg por cavidade. Após lavagem com PBST (solução salina tamponada com fosfato contendo 0,02% de Tween 20x (pH 7,5)), foram adicionados a cada cavidade de microtitulação, durante lh a 37°C, ΙΟΟμΙ de meio de cultura das cavidades contendo transfectantes. As cavidades foram então esvaziadas, lavadas com PBST e foram adicionados ou anticorpos anti-IgG humana de cabra conjugados com peroxidase ou anticorpos anti-região constante kapa humana de cabra conjugados com peroxidase (ambos obtidos a partir de Sera-Lab Ltd., Crawley Down, UK) a 100 ng por cavidade. As placas foram então incubadas a 37°C durante lh. As cavidades foram então esvaziadas e lavadas com PBST. Foram adicionados 340 Mg/ml de o-fenilenodiamina em 50mM de citrato de sódio, 50mM de fosfato de sódio (pH 5,0) e 0,003% (v/v) de H₂O₂ a 200μ1 por cavidade. As reacções foram paradas passados 1 a 5 min pela adição de ácido sulfúrico 12,5% a 50 μ1 por cavidade. A absorvância a 492 nm foi então medida espectrofotometricamente.

anticorpo humanizado hURSV19VH/VK, segregado a partir de linhas de células transfectadas cotransfectadas com pHuRSWH e pHuRSVVK, foi purificado em colunas de agarose Protein-A (Boehringer Mannheim, Lewes, UK) e testado quanto à ligação ao vírus RSV num ensaio ELISA. 0 antigénio consistiu em células de rim de vitela (CK) infectadas com RSV (estirpe A2 de RSV obtida a partir de uma criança na Austrália e descrito por Lewis et al., Med. J. Australia. 48, 932-933 (1961) e tratadas com 0,5% (v/v) de detergente NP40 para dar um lisado de células. Foi similarmente preparado um lisado de células de controlo utilizando células CK não infectadas. As cavidades da placa de microtitulação foram revestidas quer com lisados de células infectadas quer com lisados de células de controlo. As placas revestidas com antigénio foram bloqueadas com PBST durante 1 hora a 37°C, lavados com PBST e, em seguida, foi aplicado anticorpo humanizado (i.e. HuRSV19VH/VK). Após 1 hora a 37°C, as cavidades

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-27foram esvaziadas, lavadas com PBST e foram adicionados 200 ng de anticorpos anti-IgG humana de cabra (Sera Lab-Ltd., Crawley Down, UK) por cavidade. Após 1 hora a 37°C, as cavidades foram esvaziadas, lavadas com PBST e foram adicionados 200μ1 de uma diluição a 1:1000 de anticorpos anti-IgG de cabra de coelho conjugados com peroxidase de rábano silvestre (Sigma-Poole, UK). Após 1 hora a 37°C, as cavidades foram esvaziadas e lavadas com PBST. A cada cavidade foram adicionados 200μ1 de tampão de substrato (340Mg/ml de o-fenilenodiamina em citrato de sódio 50 mM, fosfato de sódio 50 mM (pH 5,0) e 0,003% (v/v) de H₂O₂. As reacções foram paradas pela adição de 50μ1 de ácido sulfúrico a 12,5%. Foi então medida a absorvância a 492 nm. O anticorpo HuRSWH/VK ligou-se a RSV embora com uma afinidade menor do que o anticorpo RSV19 de murino.

EXEMPLO 2- PRODUÇÃO DE ANTICORPOS DE ELEVADA AFINIDADE ESPECÍFICOS PARA O RSV POR UM PROCESSO CONCEBIDO PARA SE OBTEREM MODIFICAÇÕES MÍNIMAS DA ESTRUTURA DA REGIÃO VARIÁVEL QUE DÁ ORIGEM A UMA LIGAÇÃO DE ELEVADA AFINIDADE

O processo deste invento envolve a seguinte ordem de passos de alteração e teste:

1. Os resíduos de aminoácidos de estrutura individual que se sabe serem críticos para a interacção com as CDR são comparados no anticorpo primário e no anticorpo de substituição de CDR alterado. Por exemplo, o resíduo de aminoácidos de cadeia pesada 94 (numeração de Kabat- ver Kabat et al., acima citado) é comparado nos anticorpos primários (dadores) e nos anticorpos alterados. Pensa-se que um resíduo arginina nesta posição interage com o resíduo de ácido aspártico de CDR de cadeia pesada não variante na posição 101.

Se o aminoácido 94 compreende arginina na estrutura do anticorpo primário mas não na estrutura do anticorpo alterado, é então produzido um gene de cadeia pesada alternativo compreendendo arginina 94 no anticorpo alterado. Na situação inversa, em que a estrutura de anticorpo alterado compreende um resíduo arginina na posição 94 mas o anticorpo primário não o

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SBC Case P30148 compreende, é então produzido um gene de cadeia pesada alternativo compreendendo o aminoácido original na posição 94. Antes de qualquer análise adicional, os plasmídeos alternativos produzidos nesta base são testados quanto à produção de anticorpos alterados de elevada afinidade.

2. Os aminoácidos de estrutura nos 4 resíduos das CDR como definido de acordo com Kabat (ver Kabat et al., acima citado) são comparados no anticorpo primário e no anticorpo de substituição de CDR alterado. Onde estiverem presentes diferenças, então para cada região (por exemplo, a montante de VHCDR1) os aminoácidos específicos daquela região são substituídos por aqueles da região correspondente do anticorpo alterado para dar um pequeno número de genes alterados. Os plasmídeos alternativos produzidos nesta base são então testados quanto à produção de anticorpos de elevada afinidade.

3. Os resíduos de estrutura nos anticorpos primários e nos anticorpos de substituição de CDR alterados são comparados e os resíduos com maiores diferenças na carga, tamanho ou hidrofobicidade são realçados. Os plasmídeos alternativos são produzidos nesta base com os aminoácidos realçados individuais representados pelos correspondentes aminoácidos do anticorpo primário e tais plasmídeos alternativos são testados quanto à produção de anticorpos de elevada afinidade.

processo é exemplificado pela produção de um anticorpo alterado de elevada afinidade derivado de HuRSVVH/VK (ver, Exemplo 1) específico para RSV. A comparação das sequências de genes VH entre RSV19VH e pHuRSV19VH (ver, Figura 5) indica que ocorrem 3 em 4 diferenças de aminoácidos entre os aminoácidos 27 a 30 e entre os aminoácidos 91 a 94. Assim, o pHuRSV19VHNIK e o pHuRSV19VHFNS foram produzidos com os aminoácidos de estrutura 27 a 30 e 91 a 94 no primeiro, e com os aminoácidos 91 e 94 no segundo, representados como no RSV19VH primário. Utilizando a mutagénese dirigida ao local de oligonucleótido, como descrito no Exemplo 1, foram utilizados os oligonucleótidos seguintes para mutagénese do gene HuRSV19VH em M13:

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-29pHuRSV19VHNIK - 5' ATATAGTAGTCTTTAATGTTGAAGCCAGACA3 ' pHuRSV19VHFNS - 5' CTCCCCCATGAATTACAGAAATAGACCG3'

O anticorpo HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK humanizado foi testado num ensaio ELISA, como descrito no Exemplo 1, para análise da ligação ao antigénio RSV preparado a partir de células infectadas com vírus, extractadas com detergente. A Figura 6 mostra que a substituição dos resíduos VH 91 a 94 no HuRSV19VH/VK por resíduos VH de RSV19VH de ratinho restabeleceu parcialmente os níveis de ligação ao antigénio. A análise adicional das propriedades de ligação ao HuFNS foi realizada utilizando rua ensaio ELISA no qual foi utilizado como antigénio o vírus de RS Tipo A intacto (estirpe Long). Os dados de uma tal análise adicional (como mostrado na Figura 6A) mostram que há pouca, se alguma, diferença entre a capacidade dos anticorpos RSV19 e HuRSVl9VHFNS/HuRSV19VK para se ligarem ao vírus RS não desnaturado, intacto. Esta análise adicional mostrou também a ligação detectável do HuRSV19VH/VK ao vírus intacto, embora com uma magnitude muito menor do que a observada quer com RSV19 quer com HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK. Assim, os dados desta análise adicional sugerem que a afinidade para o antigénio nativo foi restabelecida no mAb HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK. A especificidade do HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK para a proteína F de RSV foi mostrada por transferência de Western convencional utilizando uma estrutura de proteína F solúvel, truncada, expressa em células CHO.

EXEMPLO 3- ESPECIFICIDADE E ACTIVIDADE BIOLÓGICA DE UM ANTICORPO ALTERADO ESPECÍFICO PARA RSV.

De forma a verificar a utilidade clínica potencial de um anticorpo humanizado específico para RSV, foi realizada uma análise de imunofluorescência da ligação dos 24 isolados clínicos de RSV. Os isolados foram obtidos a partir de crianças durante o Inverno de 1983-84 pelo Bristol Public Health Laboratory (Bristol, Inglaterra) e representam os dois maiores subgrupos de RSV. Foram serotipados 13 isolados como subgrupo A e 11 isolados como subgrupo B. As células HeLa ou MA104 infectadas com isolados de RSV foram desenvolvidas em cultura de tecidos. Quando as

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células mostraram evidência de efeito citopático, foram adicionados 20 ml de EDTA (ácido etilenodiaminatetraacético) de dissódio (BDH Chemicals Ltd., Poole, UK) em PBS a 0,02% (p/v) e 3ml de tripsina em PBS a 0,25% (p/v) e a suspensão de células foi colocada em cavidades de placas revestidas com PTFE (placas revestidas com politetrafluoroetileno) (Hendley, Essex, UK). Após 3 horas a 37°C, as placas foram secas e fixadas em acetona a 80%. As células foram cobertas com anticorpo monoclonal (i.e., anticorpo humanizado, HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK, ou anticorpo de murino RSV19) durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem extensa/ foi adicionado quer IgG anti-ratinho de coelho conjugada com fluoresceína (Nordic Laboratories-Tilburg, Holanda) quer IgGl anti-humano de cabra conjugada com fluoresceína (Southern Biotechnology, Birmingham, Alabama, EUA) e a incubação foi repetida. Após lavagem adicional, as células foram montadas em glicerol e examinadas sob luz UV.

A Tabela I mostra os resultados da imunofluorescência comparativa para o anticorpo humanizado, HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK, e para o anticorpo de murino RSV19. Estes dados indicam que 100% dos isolados clínicos são reconhecidos pelos anticorpos humanizados e pelos de murino. Esses dados demonstram que o anticorpo humanizado tem o potencial de reconhecimento da maioria dos isolados clínicos compreendendo os dois maiores subgrupos de RSV.

(segue Tabela I)

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-31TABELA I

Ligação do Antí-RSV Humanizado aos Isolados Clínicos

Extensão da Fluorescência*

Número do isolado

HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK RSV19 de Murino

Subgrupo A

V818	++++	++++
V795	++++	++++
V00401	++	+++
V00214	+	++
V00764	++	+++
V743	++	+++
V316	++	++
V369	++++	++++
V1249	+++	+++
V04692	+++	+++
V1248	+	+
V01232	++	++
V729	+	++

Subgrupo B

V00634	+	++
V4715	++	+++
V00463	+	++
V4712	++	++
V00165	++	++
V00422	++	++
V837	+++	+++
V00900	++	++
4677	+++	+++
4424	++	++
V01231	+	+

* +, ++, +++ e ++++ referem-se a números relativos de células fluorescentes observadas e representam a proporção de células infectadas.

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-320 anticorpo humanizado, HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK, foi em seguida testado quanto à actividade biológica in vitro num ensaio de inibição de fusão. Uma suspensão de células MA104 foi infectada com RSV a uma m.o.i. (multiplicidade de infecção) de 0,01 PFU (unidades formadoras de placa) por célula. Após 1 hora a 37°C, foram distribuídos em lamelas de vidro em tubos, 2ml de células a 10⁵/ml. Após 24 horas adicionais a 37°C, o meio de cultura foi substituído por meio contendo diluições de anticorpo humanizado, HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK. 24 horas mais tarde, as culturas das lamelas foram fixadas em metanol durante 10 minutos e coradas com corante de May Grunwald (BDH Chemicals Ltd., Poole, UK). A Tabela II mostra o efeito das concentrações crescentes de HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK na inibição da frequência das células gigantes. Os dados representados na Tabela II seguinte põem em evidência a actividade biológica do anticorpo humanizado HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK na inibição da fusão de células induzida por RSV Tipo A. Deve-se observar que os estudos adicionais mostraram que eram comparáveis os títulos de inibição da fusão para RSV19 versus HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK, fornecendo evidência adicional de que a afinidade para o antigênio virai nativo estava completamente restabelecida no HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK. 0 anticorpo humanizado HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK mostrou também, (utilizando metodologia análoga àquela utilizada acima para mostrar a inibição da fusão de células induzida por RSV Tipo A), exibir uma inibição dependente da dose da fusão de células gigantes induzida por RSV Tipo B (estirpe 8/60).

(segue Tabela II)

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-33TABELA II

Inibição da Fusão de Células Induzida por RSV pelo Anti-RSV

Humanizado

Concentração de Número de

HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK Células (Mg/ml) Gigantes*

Número Médio de

Núcleos

100	44	4,5
50	71	4,0
25	40	3,8
12,5	67
6,3	89
3,1	87
1,6	164
0,8	201
0,4	292
0,2	219
0	239, 259	14, 13
0 (nenhum	10

vírus) * Registado como o número de células com 2 ou mais núcleos em 20 campos com uma lente de microscópio de objectiva 25x

O anticorpo humanizado, HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK, foi em seguida testado quanto à actividade biológica in vivo num modelo de infecção de ratinho por RSV. Os ratinhos BALB/c (obtidos a partir de Charles Rivers: padrão de categoria 4 isento de patogénios específicos) foram desafiados intranasalmente com 10⁴PFU da estirpe A2 de RSV humano (como descrito por Taylor et al.. Infection and Immunitv. 43 (1984) p649-655). Aos grupos de ratinhos foram administrados 25/ig de anticorpo humanizado um dia antes da infecção por virus ou 4 dias após a infecção.

A administração de anticorpo foi pela via intranasal (i.n.)

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ou pela via intraperitonial (i.p.). Sacrificaram-se os ratinhos 5 dias após a infecção por RSV e os pulmões foram analisados para as PFU de RSV (ver, Taylor et al.. Infection and Immunitv. 43 (1984) p649-655). Os dados na Tabela III seguinte mostram que o HuRSVl9VHFNS/HuRSVl9VK numa única dose de 25/xg por ratinho é extremamente eficaz na prevenção e tratamento da infecção por RSV.

TABELA III

Prevenção e Tratamento da Infecção por RSV em Ratinhos por

Anti-RSV Humanizado

Tratamento por Anticorpo

Dia* Via⁺ logiQ PFU por grama de pulmão“

-1 i.p. <1,7 <1,7 <1,7 <1,7 <1,7

-1 i.n. <1,7 <1,7 <1,7 <1/7 <1,7 +4 i-p. <1/7 <1,7

1,7 <1,7 +4 i.n. <1,7

1,7 <1,7

1/7 <1,7

Sem anticorpo - 4,47

4,32 4,64 4,61 4,55 * -1 refere-se à administração do anticorpo

HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK 1 dia antes da infecção por RSV, +4 refere-se à administração do anticorpo 4 dias após a infecção + i.p. - intraperitoneal, i.n. - intranasal

PFU de vírus são expressas como o título de vírus de diluições

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de homogeneizados de pulmão a 10% (p/v) (ver Taylor et al. . loc. cit.) ajustadas às PFU por grama de pulmão. <1,7 de log₁₀ PFU por grama significa que não foi detectado qualquer vírus na diluição de partida do homogeneizado de pulmão a 10%.

O HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK mostrou também ser activo in vivo quando administrado profilaticamente a ratinhos desafiados com o RSV Tipo B (estirpe 8/60) utilizando uma metodologia similar àquela descrita acima. Adicionalmente, o anticorpo humanizado HURSV19VH/VK mostrou também ser activo in vivo quando profilaticamente administrado a ratinhos desafiados com o RSV Tipo B (estirpe 8/60) utilizando uma metodologia similar àquela descrita acima.

Este invento refere-se também a um processo de prevenir a infecção por RSV humano num humano com essa necessidade, caracterizado por compreender a administração a esse humano de uma dose de inibição da infecção por RSV humano, eficaz, de um anticorpo alterado deste invento para o qual RSV19 ou RSV20 foi o anticorpo monoclonal dador.

Este invento refere-se também a um processo de tratar terapeuticamente a infecção por RSV humano num humano com essa necessidade, caracterizado por compreender a administração a esse humano de uma dose terapêutica da infecção por RSV humano, eficaz, de um anticorpo alterado deste invento para o qual RSV19 ou RSV20 foi o anticorpo monoclonal dador.

Para evitar eficazmente a infecção por RSV num humano, devia ser administrada uma dose de aproximadamente 1 mg/kg até aproximadamente 20 mg/kg de um anticorpo alterado deste invento para o qual RSV19 ou RSV20 foi o anticorpo monoclonal dador, tal como HURSV19VH/VK ou HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK parentericamente, preferivelmente i.v. (intravenosamente) ou i.m. (intramuscularmente),· ou devia ser administrada uma dose de aproximadamente 200 /xg/kg até aproximadamente 2 mg/kg desse anticorpo i.n. (intranasalmente). Preferivelmente, tal dose devia ser repetida de seis (6) em seis semanas começando no principio

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-36da estação do RSV (Outubro-Novembro) até ao final da estação do RSV (Março-Abril). Alternativamente, no começo da estação do RSV devia ser administrada i.v. ou i.m. uma dose de aproximadamente 5 mg/kg até aproximadamente 100 mg/kg de um anticorpo alterado deste invento para o qual RSV19 ou RSV20 foi o anticorpo monoclonal dador, tal como HuRSVl9VH/VK ou HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK ou devia ser administrada i.n. uma dose de aproximadamente 0,5 mg/kg até aproximadamente 10 mg/kg desse anticorpo.

Para tratar terapêutica e eficazmente a infecção por RSV num humano devia ser administrada parentericamente, preferivelmente i.v. ou i.m. uma dose de aproximadamente 2 mg/kg até aproximadamente 20 mg/kg de um anticorpo alterado deste invento para o qual RSV19 ou RSV20 foi o anticorpo monoclonal dador, tal como HURSV19VH/VK ou HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK; ou deviam ser administrados i.n. aproximadamente 200 p.g/kg até aproximadamente 2 mg/kg de um tal anticorpo. Tal dose podia, se necessário, ser repetida em intervalos de tempo apropriados até ter sido erradicada a infecção por RSV.

Os anticorpos alterados do invento podem também ser administrados por inalação. Por inalação” pretende-se referir administração intranasal e inalação oral. As formas de dosagem apropriadas para tal administração, tais como uma formulação em aerossol ou inalador de dose medida, podem ser preparadas por técnicas convencionais. Por exemplo, para preparar uma composição para administração por inalação, para um recipiente aerossol com uma capacidade de 15-20 ml: misturar 10 mg de um anticorpo alterado deste invento com 0,2-0,2% de um agente lubrificante, tal como polissorbato 85 ou ácido oleico, e dispersar tal mistura num propulsor, tal como fréon, preferivelmente numa combinação de (1,2-diclorotetrafluoroetano) e difluoroclorometano e colocar num recipiente aerossol apropriado adaptado para administração intranasal ou para inalação oral. Como exemplo adicional, para uma composição para administração por inalação, para um recepiente aerossol com uma capacidade de 15-20 ml: dissolver 10 mg de um anticorpo alterado deste invento em etanol (6-8 ml), adicionar 0,1-0,2% de um agente lubrificante, tal como

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-37#X— polissorbato 85 ou ácido oleico? e dispersar isto num tal como fréon, preferivelmente uma combinação de (1,2-diclorotetrafluoroetano) e difluoroclorometano, e colocar num recipiente aerossol apropriado adaptado para administração intranasal ou para inalação oral.

A quantidade de dosagem diariamente preferida a ser empregue de um anticorpo alterado do invento para tratar profilática ou terapeuticamente a infecção por RSV num humano,com essa necessidade, a ser administrada por inalação, é de cerca de 0,1 mg a cerca de 10 mg/kg por dia.

As infecções por RSV naturais têm sido descritas no gado, cabras ovelhas e chimpanzés. Assim, por exemplo, utilizando a metodologia acima descrita, um anticorpo de ratinho apropriado podia ser bovinizado” e podiam ser efectuadas as alterações dos resíduos da região da estrutura apropriada, se necessário, para restabelecer a afinidade de ligação específica. Uma vez criado o anticorpo de ratinho apropriado, um perito na arte, utilizando as técnicas de determinação da dosagem convencionais, pode determinar rapidamente os níveis e regimes de dose apropriados requeridos para tratar eficazmente, profilática ou terapeuticamente, a infecção por RSV bovino.

Os Exemplos 1-3 mostram que os anticorpos alterados para a prevenção e tratamento da infecção podem ser produzidos com estruturas de região variável potencialmente reconhecidas como auto por receptores do anticorpo alterado. Podem ser implementadas menores modificações às estruturas de região variável para efectuar grandes aumentos na ligação ao antigênio sem apreciável imunogenicidade aumentada para o receptor. Tais anticorpos alterados podem evitar e erradicar eficazmente a infecção.

Assim, o presente invento proporciona um anticorpo alterado no qual as regiões determinantes de complementaridade (CDR) nos domínios variáveis de cadeia pesada ou leve foram substituídas por partes análogas de CDR de uma fonte diferente resultando em

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anticorpos que possuem a combinação de propriedades requeridas para a prevenção e tratamento eficaz da doença infecciosa em animais ou no Homem. Adequadamente, têm sido substituídas as CDR completas. Preferivelmente, os domínios variáveis quer nas cadeias leves quer pesadas têm sido alterados por substituição de CDR. Tipicamente, as CDR de um anticorpo de ratinho são enxertadas nas regiões de estrutura de um anticorpo humano. 0 anticorpo alterado tem preferivelmente a estrutura de um anticorpo natural ou de um seu fragmento.

Um anticorpo preferido é um dirigido contra o vírus sincicial respiratório (RSV), preferivelmente um específico para a proteína de fusão (F) de RSV. Um anticorpo particularmente preferido deste tipo tem as seguintes sequências de aminoácidos de domínio variável N-terminal (ver a Tabela de Abreviaturas de Aminoácidos imediatamente a seguir) nas suas cadeias pesada e leve:

pesada: OVOLOESGPGLVRPSOTLSLTCTVSGFTFS(ou

NIK)DYYMHWVRQPPGRGLEWIGWIDPENDDVQYAPKFQG

RVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYÇAR(ou FCNS)WGSDFDHWGQGTTVTVSS leve:

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQTLVHTDGNTYLEWY

QQKPGAPKLLIYRVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQP

EDIATYYCQSHLPRTFGQGTKVEIK (segue Tabela de Abreviaturas)

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Tabela de Abreviaturas de Aminoácidos
Aminoácido	Abreviatura de três letras	Símbolo de uma letra
Alanina	Ala	A
Arginina	Arg	R
Asparagina	Asn	N
Ácido aspártico	Asp	D
Cisteína	Cys	C
Glutamina	Gin	Q
Ácido glutâmico	Glu	E
Glicina	Gly	G
Histidina	His	H
Isoleucina	Ile	I
Leucina	Leu	L
Lisina	Lys	K
Metionina	Met	M
Fenilalanina	Phe	F
Prolina	Pro	P
Serina	Ser	S
Treonina	Thr	T
Triptofano	Trp	w
Tirosina	Tyr	Y
Vaiina	Vai	V

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-40Será entendido por aqueles peritos na arte que um tal anticorpo alterado pode ser adicionalmente alterado por mudanças nos aminoácidos de domínio variável sem afectar necessariamente a especificidade do anticorpo para a proteína de fusão (F) de RSV e antecipa-se que podem ser substituídos até mesmo tanto como 25% dos aminoácidos de cadeia pesada e leve por outros aminoácidos nas estruturas do domínio variável ou nas CDR ou em ambas. Tais anticorpos alterados podem ser eficazes na prevenção e tratamento da infecção pelo vírus sincicial respiratório (RSV) em animais e no Homem.

O invento inclui também um plasmídeo recombinante contendo a sequência de codificação do anticorpo alterado do invento e uma linha de células de mamífero transfectadas com um plasmídeo recombinante contendo a sequência de codificação dos seus anticorpos alterados. Um tal vector é preparado por técnicas convencionais e compreende adequadamente sequências de ADN que codificam domínios de imunoglobulina incluindo as estruturas de região variável e as CDR derivadas de uma fonte diferente e um promotor adequado operacionalmente ligado às sequências de ADN que codificam o anticorpo alterado. Um tal vector é transfectado numa célula de mamífero transfectada através de técnicas convencionais.

O invento compreende adicionalmente um processo para efectuar modificações mínimas nas estruturas de região variável de um anticorpo alterado necessárias para produzir um anticorpo alterado com afinidade de ligação aumentada compreendendo os passos seguintes:

(a) análise dos aminoácidos de estrutura conhecidos como críticos para interacção com as CDR e produção e teste de anticorpos alterados onde os aminoácidos de estrutura única foram substituídos pelos correspondentes aminoácidos da mesma fonte que as CDR;

(b) análise dos aminoácidos de estrutura adjacentes às CDR e produção e teste dos anticorpos alterados onde um ou mais dos aminoácidos nos quatro resíduos das CDR foram substituídos pelos

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correspondentes aminoácidos da mesma fonte das CDR;

(c) análise dos resíduos de estrutura no anticorpo alterado e produção e teste de anticorpos alterados onde os aminoácidos únicos foram substituídos pelos correspondentes aminoácidos com diferenças principais na carga, tamanho ou hidrofobicidade da mesma fonte das CDR.

Os Exemplos seguintes referem-se ao novo epítopo de proteína F de RSV do invento.

EPÍTOPO DE PROTEÍNA F DE RSV ESPECÍFICO

Os exemplos seguintes põem em evidência os dois monoclonais que protegem e curam os ratinhos da infecção in vivo por RSV reconhecem um epítopo linear na proteína F de RSV (epítopo linear que pode fazer parte de um epítopo conformacional) e que contém os resíduos de aminoácidos 417 a 438 da sequência que codifica a proteína F incluindo um resíduo arginina essencial na posição 429 ou uma sua porção qualquer imunoprotectora, tal como, mas não limitados aos resíduos de aminoácidos 417-432 da sequência que codifica a proteína F, e os resíduos de aminoácidos 422-438 da sequência que codifica a proteína F. Este novo epítopo (que pode ser referido aqui como epítopo 417-438) é um alvo adequado para análise de outros epítopos neutralizantes, para agentes protectores e terapêuticos contra o RSV, e em particular, para anticorpos monoclonais contra este epítopo. O conhecimento deste epítopo possibilita a um perito na arte definir péptidos sintéticos que seriam adequados como vacinas contra o RSV. O epítopo 417-438 é também útil para gerar anticorpos monoclonais que serão úteis no tratamento, terapêutico e/ou profilático, da infecção por RSV humano em humanos.

invento inclui também um plasmídeo recombinante contendo a presente invento aplica-se também à utilização de fragmentos Fab derivados de anticorpos monoclonais dirigidos contra esse epítopo novo como agentes protectores e terapêuticos contra a infecção in vivo por vírus, e refere-se particularmente à protecção contra o RSV.

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-42sequência de codificação de um anticorpo monoclonal gerado contra o epítopo 417-438 e uma linha de células de mamífero transfectadas com um plasmídeo recombinante contendo tal sequência de codificação. Um tal vector é preparado por técnicas convencionais e compreende adequadamente as sequências de ADN que codificam os domínios de imunoglobulina que incluem as estruturas de região variável e as CDR e um promotor adequado operacionalmente ligado às sequências de ADN que codificam o anticorpo. Um tal vector é transfectado numa célula de mamífero através de técnicas convencionais.

EXEMPLO 4

Este exemplo mostra a produção de anticorpos monoclonais de murino contra a proteína F de RSV que protegem e curam os ratinhos da infecção.

Os anticorpos monoclonais de murino (mAb) 19 e 20 foram produzidos como se segue. Os ratinhos BALB/c (obtidos a partir de patogénios específicos de Charles Rivers isentos) foram intranasalmente (i.n.) inoculados em duas ocasiões, com 3 semanas de intervalo, com lxlO⁴ PFU da estirpe A2 de RSV humano (H) (descrito por Lewis et al.. 1961, Med. J. Australia. 48. 932-933). Após um intervalo de 4 meses, os ratinhos foram intraperitonealmente (i.p.) inoculados com 2xl0⁷ PFU da estirpe 127 de RSV de bovino (B) (isolado no Institute for Animal Health, Compton, Near Newbury, Berks, Inglaterra). Três dias após a inoculação, os imuno-esplenócitos foram fundidos com células de mieloma NS-1 (ver, Williams et al.. 1977, Cell. 12. 663). Os hibridomas resultantes foram analisados quanto ao anticorpo para RSV por radio-imunoensaio e imunofluorescência como previamente descrito (Taylor et al. . 1984, Immunolocry. 52. 137-142), clonados duas vezes em ágar mole (como descrito por Kohler et al.. Immunologic Methods, pag. 397-402, ed. I. Lefkovitz & B. Perris, Academic Press) e as células clonadas resultantes foram inoculadas em ratinhos BALB/c para produzir fluído ascítico como previamente descrito (ver, Taylor et al.. 1984, Immunoloqy. 52, 137-142).

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A especificidade dos mAb para os polipéptidos virais foi determinada por radio-imunoprecipitação dos lisados de células infectadas com RSV marcados com (³⁵S)-metionina ou (³H)-glucosamina como previamente descrito (ver, Kennedy et al. . 1988, J. Gen. Virol., 69. 3023-3032) e por imunotransferência (ver, Taketa et al. . 1985, Electrophoresis. 6., 492-497). Os antigénios utilizados na imunotransferência eram células Hep-2 (obtidas na American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EUA) infectadas com a estirpe A2 de HRSV ou células de rim de vitela (CK) primárias (produzidas no Institute for Animal Health, Compton) infectadas com a estirpe 127 de BRSV. Foram utilizadas células Hep-2 ou CK não infectadas como antigénios de controlo.

O isotipo imunoglobulina dos mAb foi determinado por imunodifusão utilizando um conjunto de imunodifusão radial (Serotec, Kidlington, Oxfordshire, UK).

As propriedades dos mAb 19 e 20 são mostradas na Tabela A seguinte.

(segue Tabela A)

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JP i—I 0) Λ (0

Ol lin d) -rl tfl PO w -P 0 O >3 0 (8 fl HO- t P 3 PH	>3,8	>3,8
•rt\| 1 O IO C ·Η i(0 (0 3 1(0 Η Λ 0-3 IP to	+	+
1 3 -P Psr d) 3 Ή Ο Ό d) H H g	«d* (Ώ	cn *» -cf
d) III to 0 g d) cm •Η Ό 0 i—1 d) O PI O Ag -P	I> K H	CD r-
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8/60	>·	CD 00
CM rf!	CM *►	O *1 co Λ
tfll (0 d) d) tP H 10 Ό H u	3 CM O	3 CM O
Especif icidade da proteína	¹ Transf.Western	Reduzida	IP CD V	ÍP CD
Nativa	140K, 70K	IP ÍP o o v > H
RIPA	IP	IP
1	σι H	O CM

(H A Μ X ω o h API •H W

A N P

-44dJ O ag P O •rt O

d) ^M n d> O o, 3 ¹ -P H g ω 3 tf tf ^3 ⁰S H )(0 ί'Φσ o r4 tP O i—I

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-45A imunoprecipitação do RSV radiomarcado (pelo processo de Brunda et al.. (1977) J. Immunol. 119. 193-198) indicou que os mAb 19 e 20 reconheceram a glicoproteína de fusão (F). Isto foi confirmado por uma transferência de Western de lisados não reduzidos e reduzidos de células infectadas com RSV. As transferências foram sondadas com IgG anti-ratinho de cabra conjugada com HRP (Kpl, Gaithersburg, Maryland, EUA). Os mAb 19 e 20 reconheceram o dímero de proteína F de 140k e o monómero de 70K presentes no antigénio de proteína F nativa e o fragmento F1 de 46K no antigénio desnaturado por ebulição em 2-mercaptoetanol. Os mAb 19 e 20 foram identificados como IgG2a e os seus títulos ELISA contra as estirpes A2 e 8/60 de HRSV foram similares aos títulos ELISA contra a estirpe 127 de BRSV, indicando que os epítopos reconhecidos por estes mAb estavam conservados entre as estirpes de RSV humano e de bovino. Os mAb 19 e 20 neutralizaram a infectividade do RSV e inibiram a formação de células gigantes multinucleadas em células MA104 infectadas com RSV. Em contraste ao mAb 19, o mAb 20 lisou células infectadas por RSV na presença do complemento de coelho. A incapacidade do mAb 19 para lisar células infectadas por RSV não foi devida à incapacidade para se ligar à superfície das células infectadas por RSV uma vez que o mAb 19 corou 88% de tais células. A incapacidade do mAb 19 e do complemento para lisar células infectadas por vírus indica que a lise mediada por anticorpo e complemento não é importante na protecção in vivo mediada por este anticorpo. A capacidade dos mAb 19 e 20 para protegerem contra a infecção por RSV foi avaliada por desafio i.n. de ratinhos com aproximadamente 10⁴ PFU de RSV 24 h após inoculação i.p. dos mAb 19 e 20. Os pulmões de ratinhos não tratados mortos 5 dias após o desafio continham 5,5 log_1Q PFU de RSV/g de tecido enquanto que o vírus não foi detectado nos pulmões de ratinhos aos quais foi dado o mAb 19 ou 20.

EXEMPLO 5

Este exemplo descreve processos de isolamento de mutantes de RSV que são resistentes à inibição por mAb 19 e 20 gerados no Exemplo 4.

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-46Os vírus RS mutantes refractários à neutralização por mAb 19 e 20 foram produzidos utilizando uma técnica de redução em placa com a estirpe A2 de HRSV como se segue. As monocamadas confluentes de células CK, num balão de cultura de tecidos, foram infectadas com a estirpe A2 de HRSV a uma MOI de 0,1. Partindo de 24 horas após a infecção e continuando durante 3 a 5 dias, o meio de cultura foi diariamente substituído com meio fresco contendo 10% de mAb. O vírus foi colhido quando foi observado um efeito citopático. 0 vírus preparado desta forma foi misturado com um volume igual de mAb 19 ou 20 não diluídos, ou só em meio durante 1 hora à temperatura ambiente e inoculado em monocamadas de CK em placas de multicavidades de 35mm (Nunc, Kamstrup, Riskilde, Dinamarca). Após 1 hora de incubação a 37°C, as placas foram cobertas com meio contendo 0,25% de agarose e 10% de mAb ou apenas meio. As culturas foram incubadas a 37°C em CO₂ a 5% em ar durante 7 dias antes da adição de corante vital, 0,3% de Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazolil-2)-2,5-difeniltetrazólio em NaCl 0,15M, à cobertura para visualizar as placas de vírus.

Os vírus mutantes putativos foram removidos em rolhões de ágar a partir das placas que continham placas únicas, diluidos em meio, misturados com um volume igual de mAb 19 e 20 e inoculados em monocamadas de CK em placas de multicavidades de 35 mm, como anteriormente. Os vírus mutantes putativos foram de novo colhidos em placa e inoculados em tubos contendo lamelas de células de testículos de vitelo. Após 4 a 6 dias de incubação, as lamelas foram removidas e coradas com mAb 19 e 20 e Ig anti-ratinho de coelho marcada com FITC (Nordic Labs, Tilburg, Holanda). Como controlo positivo, as lamelas foram coradas com antissoro de bovino policlonal para o RSV (produzido no Institute for Animal Health-Compton a partir de um vitelo gnotobiótico hiperimunizado com RSV) e Ig anti-bovino de coelho marcada com FITC (obtida a partir de Nordic Immunology, Tilburg, Holanda). Os vírus RS que não conseguiram reagir por imunof luorescência com o mAb 19 ou 20 foram classificados como vírus mutantes e foram utilizados para infectar monocamadas de células Hep-2 para produzir o antigénio para ELISA. Assim, 3 a 4 dias após infecção por RSV, as células raspadas para meio, centrifugadas a 400 g durante 5 min,

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ressuspensas em água destilada e tratadas com 0,5% (v/v) de detergente NP40 para dar um lisado de células. Um lisado de células de controlo foi feito de uma forma similar utilizando células Hep-2 não infectadas. A ligação de um conjunto de mAb para a proteína F de RSV aos vírus mutantes foi examinada por ELISA. As cavidades da placa de microtitulação foram revestidas com 50μ1 de lisado de células infectadas ou de lisado de células de controlo, durante a noite, a 37°C, incubadas com tampão de bloqueio consistindo em soro de porco normal a 5% em PBS e 0,05% de Tween 20 durante 1 hora à temperatura ambiente e lavadas 5x com PBS/TWEEN. Foram adicionadas às cavidades diluições em série φ (três vezes) dos mAb e as placas foram incubadas durante 1 hora.

Após lavar 5 vezes com PBS/Tween, foi adicionada a cada cavidade

IgG anti-ratinho de cabra conjugada com HRP (Kpl, Gaithersburg,

Maryland, EUA), diluida a 1:2000. Após uma lavagem final, foi detectado o conjugado ligado utilizando o substrato 3,3^z , 5,5'-tetrametilbenzidina (TMB), (obtido em ICN Immunobiologicals, Illinois). Os vírus mutantes, seleccionados para resistência ao mAb 19, não conseguiram reagir num ELISA com os mAb 19 e 20. Similarmente, os vírus mutantes seleccionados para resistência ao mAb 20 não conseguiram reagir com os mAb 19 e 20. Todos os outros mAb testados reagiram com os mutantes na mesma extensão gue para o HRSV progenitor, estirpe A2. Estes resultados são ilustrados na Tabela B seguinte:

TABELA B

Tabela B. Ligação dos mAb anti-F aos mutantes de fuga de anticorpo de RSV.

(segue Tabela B)

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-48h i i .............................. ................................. il

II | | Mutantes seleccionados com o mAb indicado

mÃb \| 1 1	Proge- nitora	1 19	20
\| C4848f	1 \|C4909/l 1	1 [C4902/6 1	C4902Wa	1 \|C42902Wb I	1 1 C4902WC
1 ¹ 1	+	1	1 \| +	1 \| +	+	1 \| +	\| +
2 \|	+	1	\| +	\| +	+	\| +	1 +
⁵ 1	+	\| +	1 ⁺	\| +	+	\| +	\| +
li \|	+	\| +	\| +	\| +	+	1 ⁺	\| +
13 \|	+	\| +	\| +	\| +	+	1 ⁺	\| +
¹⁴ 1	+	\| +	\| +	\| +	+	\| +	\| +
¹⁶ 1	+	1 +	1 ⁺	\| +	+	\| +	\| +
17 \|	+	\| +	1 ⁺	\| +	+	\| +	\| +
18 \|	+	\| +	\| +	\| +	+	1 +	\| +
19 \|	+	\|	\|	I	-	\|	1
20 \|	+	1	1	\|	-	\|	1
²¹ 1	+	1 +	\| +	1 +	+	\| +	1 +
BI \|	+	\| +	I +	\| +	+	\| +	\| +
B2 \|	+	1 +	1 +	1 +	+	\| +	\| +
B3 \|	+	\| +	\| +	\| +	+	\| +	j +
B4 \|	+	\| +	\| +	\| +	+	\| +	1 +
B5 \|	+	1	\| +	\| +	+	\| +	\| +
B6 \|	+	\| +	1 ⁺	\| +	+	\| +	\| +
B7 \|	+	\| +	\| +	\| +	+	\| +	\| +
B8 \|	+	\| +	\| +	\| +	+	1 ⁺	\| +
B9 \|	+	\| +	1 +	\| +	+	\| +	\| +
B10 \|	+	1	1 +	\| +	+	\| +	\| +
7C2 \|	+	1 +	\| +	\| +	+	\| +	\| +
47F \|	+	\| +	\| +	1 +	+	\| +	\| +

II I I I I............... I I I II

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-49EXEMPLO 6

Este exemplo descreve a identificação de uma sequência de aminoácidos na proteína F que liga anticorpos monoclonais protectores e demonstra que a arginina 429 é essencial para ligar os mAb protectores a esta sequência de aminoácidos.

Os ARN poli(A)⁺, isolados a partir de células infectadas com a estirpe A2 de HRSV ou com cada um dos mutantes descritos no Exemplo 5, foram utilizados para sequenciar o ARNm de proteína F. Estas sequências foram determinadas pelo processo de didesoxi (citado acima) utilizando iniciadores oligonucleotídicos marcados em 5' com ³²P, sintetizados de acordo com a sequência de proteína F previamente descrita da estirpe Long de RSV (ver, Lopez et al., 1988, Vírus Res. 10. 249-262), seguido por uma gravação com desoxinucleótido-transferase terminal (ver, DeBorde et al.. 1986, Anal Biochem. 157. 275-282). Três mutantes foram seleccionados com mAb 19 e três foram seleccionados com mAb 20. Todos esses mutantes mostraram uma única transversão (C para G) no nucleótido 1298 comparado com a estirpe A2 progenitora. Esta substituição de nucleótidos altera o resíduo de aminoácido na posição 429 da proteína F de arginina para serina. Uma vez que os mAb 19 reagiram em transferência de Western com a subunidade Fj, é provável que o local de ligação a anticorpo seja determinado por uma sequência linear de aminoácidos contíguos em que o resíduo 429 da subunidade Fq_ desempenha um papel essencial. Os péptidos sintéticos correspondentes aos resíduos de aminoácidos 417-432, 422-438, 417-438 e 421-450 da proteína F foram examinados quanto à sua capacidade para reagirem com os mAb 19 e 20 num ELISA. Os mAb 19 e 20 reagiram com os péptidos 417-432 (F417), 417-438 e com 422-438 (F422) mas não com o péptido 431-450. A ligação do mAb 19 aos péptidos 417-432 e 422-438 (2Mg/cavidade) revestidos nas cavidades de placa de microtitulação durante a noite a 37°C (''seco) ou revestidos nas cavidades durante 1 hora à temperatura ambiente (húmido) é mostrada na Figura 7. Deve-se observar que o mAb 20 deu essencialmente os mesmos resultados.

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-50EXEMPLO 7

Este exemplo mostra que os fragmentos Fab derivados dos mAb 19 e 20 podem proteger e tratar ratinhos infectados por RSV.

Os mAb 19 e 20 foram purificados a partir de fluído ascítico utilizando Protein A Sepharose (Pharmacia, Milton Keynes, Reino Unido). Aproximadamente 10 mg dos mAb 19 e 20 purificados foram incubados com 0,5 ml de papaína imobilizada (Pierce-Oud-Beijerland, Holanda) durante 5 h e durante a noite, respectivamente, a 37°C com mistura constante. Os fragmentos Fab resultantes foram recuperados numa coluna de Protein A imobilizada (Pierce). A IgG purificada e os fragmentos clivados por papaína foram analisados por SDS-PAGE sob condições redutoras. A IgG purificada mostrou bandas a 53 OOOd e 23 OOOd, correspondendo às cadeias pesada e leve de Ig. As fracções de Protein A contendo os fragmentos Fab mostraram bandas a aproximadamente 25 OOOd e a fracção contendo os fragmentos Fc mostrou 3 bandas distintas correspondentes às cadeias pesada e leve da IgG não digerida e também o fragmento Fc a aproximadamente 28 OOOd. A IgG purificada e os fragmentos clivados com papaína foram avaliados quanto à actividade anti-RSV por ELISA com células Hep-2 não infectadas e infectadas por HRSV estirpe A2 como antigênio e Fab anti-ratinho de cabra HRP (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mi, EUA) e Fc anti-ratinho de cabra HRP (ICN ImmunoBiologicals, Illinois). 0 ELISA mostrou que os fragmentos Fab dos mAb 19 e 20 não estavam contaminados com Ig não digerida. Estes dados são ilustrados na Tabela C seguinte.

(segue Tabela C)

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TABELA C

Tabela C. Efeitos profiláticos e terapêuticos dos fragmentos Fab na infecção por RSV em ratinhos.

Título ELISA (log₁₀)

Título de RSV D5 nos pulmões

Anticorpo

Fab

Anti-Fc

4,4 <2,0

Anti-Fab

4,3

4,6 mAb d-1 <1,7 (0/5) <1,7 (0/5) mAb d4 <1,7 (0/4) <1,7 (0/5)

Nenhum

4,6 ± 0,06

5,1 | 5,1 <1,7 (0/5) <1,7 (1/5)

Fab <2,0 | 4,8 <1,7 (2/5) <1,7 (2/5)

Nenhum

4,5 ± 0,08

Título do anticorpo medido por ELISA utilizando RSV/A2 e antigénio.

A concentração de anticorpo nos mAb 19 e 20 não digeridos foi ajustada para dar títulos ELISA similares àqueles dos fragmentos Fab e examinada quanto à sua capacidade para proteger contra a infecção por RSV em ratinhos BALB/c. Grupos de 5 ratinhos foram inoculados i.n. com mAb 19 ou mAb 20 purificado, não digerido, ou fragmentos Fab (de mAb 19 ou mAb 20) 1 dia antes ou 4 dias após inoculação i.n. com aproximadamente 10⁴ PFU da estirpe A2 de HRSV. Os ratinhos de controlo só foram inoculados com HRSV. Cinco dias após o desafio com vírus, os ratinhos foram mortos e os pulmões analisados quanto às PFU de RSV em células CK secundárias como previamente descrito (ver, Taylor et al.. 1984, Infect. Iromun., 43, 649-655). Os fragmentos Fab dos mAb 19 e 20

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administrada i.n. (intranasalmente) uma dose de aproximadamente 200 Mg/kg até aproximadamente 2 mg/kg desse anticorpo. Preferivelmente, essa dose deve ser repetida todas as seis (6) semanas começando no início da estação do RSV (Outubro-Novembro) até ao fim da estação do RSV (Março-Abril). Alternativamente, no início da estação do RSV, deve ser administrada i.v. ou i.m. uma dose de aproximadamente 5 mg/kg até aproximadamente 100 mg/kg de um anticorpo monoclonal gerado contra o epítopo 417-438 ou deve ser administrada i.n. uma dose de aproximadamente 0,5 mg/kg até aproximadamente 10 mg/kg desse anticorpo.

Para tratar terapêutica e eficazmente a infecção por RSV num humano, devia ser administrada parentericamente, preferivelmente i.v. ou i.m. uma dose de aproximadamente 2 mg/kg até aproximadamente 20 mg/kg de um anticorpo monoclonal gerado contra o epítopo 417-438; ou deve-se administrar i.n. aproximadamente 200 até aproximadamente 2 mg/kg desse anticorpo. Essa dose pode, se necessário, ser repetida a intervalos de tempo apropriados até a infecção por RSV ter sido erradicada.

Um anticorpo monoclonal gerado contra o epítopo 417-438 pode também ser administrado por inalação. Por inalação pretende-se referir a administração intranasal e inalação oral. As formas de dosagem apropriadas para essa administração, tais como uma formulação de aerossol ou um inalador de dose medida, podem ser preparadas por técnicas convencionais. Por exemplo, para preparar uma composição para administração por inalação, para um recipiente aerossol com uma capacidade de 15-20 ml: Misturar 10 mg de um anticorpo monoclonal gerado contra o epítopo 417-438 com 0,2-0,2% de um agente lubrificante, tal como polissorbato 85 ou ácido oleico, e dispersar tal mistura num propulsor, tal como fréon, preferivelmente numa combinação de (1,2-diclorotetrafluoroetano) e difluoroclorometano e colocar num recipiente aerossol apropriado adaptado para administração intranasal ou para inalação oral. Como exemplo adicional, para uma composição para administração por inalação, para um recipiente aerossol com uma capacidade de 15-20 ml: Dissolver 10 mg de um anticorpo monoclonal gerado contra o epítopo 417-438 em

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-52foram altamente eficazes na prevenção da infecção por RSV e na eliminação de uma infecção estabelecida.

Este invento refere-se ao epítopo 417-438. Este invento refere-se também a anticorpos monoclonais gerados contra o epítopo 417-438. Tais anticorpos monoclonais são produzidos por técnicas convencionais e incluem, sem limitação, os anticorpos monoclonais de murino, os anticorpos monoclonais humanos e os anticorpos monoclonais de bovino. Tais anticorpos monoclonais podem compreender uma molécula de anticorpo completa (tendo cadeias pesadas e leves de comprimento total) ou um seu qualquer fragmento, tal como o fragmento Fab ou (Fab')₂, um dímero de cadeia leve ou cadeia pesada ou um seu qualquer fragmento recombinante mínimo tal como um Fv ou um SCA (anticorpo de cadeia única) ou uma outra molécula qualquer com a mesma especificidade que o anticorpo monoclonal.

Este invento refere-se também a uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo monoclonal gerado contra o epítopo 417-438 e um portador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

Este invento refere-se também a um processo de prevenção da infecção por RSV humano num humano com essa necessidade que compreende a administração a esse humano de uma dose de inibição da infecção por RSV humano, eficaz, de um anticorpo monoclonal gerado contra o epítopo 417-438.

Este invento refere-se também a um processo de tratar terapeuticamente a infecção por RSV humano num humano com essa necessidade que compreende a administração a esse humano de uma dose terapêutica contra a infecção por RSV humano, eficaz, de um anticorpo monoclonal gerado contra o epítopo 417-438.

Para impedir eficazmente a infecção por RSV num humano, devia ser administrada parentericamente, preferivelmente i.v. (intravenosamente) ou i.m. (intramuscularmente) uma dose de aproximadamente 1 mg/kg até aproximadamente 20 mg/kg de um anticorpo monoclonal gerado contra o epítopo 417-438; ou devia ser

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54-54etanol (6-8 ml), adicionar 0,1-0,2% de um agente lubriíicante, tal como polissorbato 85 ou ácido oleico; e dispersar isto num propulsor, tal como fréon, preferivelmente uma combinação de (1,2-diclorotetrafluoroetano) e difluoroclorometano, e colocar num recipiente aerossol apropriado adaptado para administração intranasal ou para inalação oral.

A quantidade de dosagem diária a ser empregue, de um anticorpo monoclonal gerado contra o epítopo 417-438 para tratar profilática ou terapeuticamente a infecção por RSV num humano com essa necessidade, a ser administrada por inalação, é de cerca de 0,1 mg a cerca de 10 mg/kg por dia.

Claims

1 - Processo de preparação de um anticorpo alterado, no qual pelo menos partes das regiões determinantes de complementaridade (CDR) nos domínios variáveis leve e/ou pesado de um anticorpo monoclonal aceitador foram substituídas por partes análogas de CDR de um, ou mais anticorpos monoclonais dadores e no qual podem ter ou não havido alterações mínimas da região da estrutura do domínio variável leve e/ou pesado do anticorpo monoclonal aceitador de modo que se mantenha a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal dador, possuindo os referidos anticorpos dadores especificidade para um microorganismo particular, caracterizado por:

(a) produzir, num vector de expressão, um operão possuindo uma sequência de ADN que codifica uma cadeia pesada ou leve do anticorpo, onde pelo menos o CDR ( e as porções mínimas da região da estrutura do domínio variável leve e/ou pesado do anticorpo monoclonal aceitador necessárias para manter a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal dador) do domínio variável são provenientes de uma imunoglobulina não humana e as restantes partes derivadas de imunoglobulina da cadeia do anticorpo são derivadas de uma imunoglobulina humana, produzindo-se assim um vector;

(b) produzir, num vector de expressão, um operão possuindo uma sequência de ADN que codifica uma cadeia pesada ou leve do anticorpo, complementar onde pelo menos as CDR ( e as porções mínimas da região da estrutura do domínio variável leve e/ou pesado do anticorpo monoclonal aceitador necessárias para manter a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal dador) do domínio variável são provenientes de uma imunoglobulina não humana e as restantes partes derivadas de imunoglobulina da cadeia do anticorpo são derivadas de uma imunoglobulina humana, produzindo-se assim um outro vector;

(c) transfectar uma célula hospedeira com o vector, ou com cada um deles, de modo a criar uma célula transfectada; e (d) cultivar as células transfectadas de modo a produzir o anticorpo alterado.

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2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o microorganismo ser vírus sincicial respiratório humano (HRSV).

3 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o anticorpo dador ser dirigido contra a proteína de fusão (F) do vírus sincicial respiratório (RSV).

4 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o anticorpo dador ser dirigido contra o epítopo 417-438.

5 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o anticorpo alterado ter as seguintes sequências de amino-ácidos do domínio variável N-terminal nas suas cadeias pesada e leve:

pesada: OVOLOESGPGLVRPSOTLSLTCTVSGFTFS(ou

NIK)DYYMHWVRQPPGRGLEWIGWIDPENDDVQYAPKFQG RVTMLVDTSKNOFSLRLSSVTAADTAVYYCAR (OU FCNS)WGSDFDHWGQGTTVTVSS leve:

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQTLVHTDGNTYLEWY

QQKPGAPKLLIYRVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQP

EDIATYYCQSHLPRTFGQGTKVEIK

6 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o anticorpo monoclonal dador ser RSV19.

7 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o anticorpo monoclonal dador ser RSV20.

8 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o anticorpo alterado ser HuRSV19VH/VK.

9 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o anticorpo alterado ser HuRSVi9VHFNS/HuRSVl9VK.

10 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o anticorpo alterado ser um fragmento Fab ou um fragmento

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SBC Case P30148 (Fak>')₂.

11 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se associar um anticorpo alterado preparado de acordo com a reivindicação 1, com um portador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

12 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o microorganismo ser HRSV.

13 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o anticorpo dador ser dirigido contra a proteína de fusão (F) de RSV.

14 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o anticorpo dador ser dirigido contra o epítopo 417-438.

15 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o anticorpo alterado ter as seguintes sequências de aminoácidos do domínio variável N-terminal nas suas cadeias pesada e

OVOLOESGPGLVRPSQTLSLTCTVSGFTFS(ou NIK)DYYMHWVRQPPGRGLEWIGWIDPENDDVQYAPKFQG RVTMLVDTSKNQFSLRLSSVTAADTAVYYÇAR( OU FCNS)WGSDFDHWGQGTTVTVSS

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRSSQTLVHTDGNTYLEWY QQKPGAPKLLIYRVSNRFSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQP EDIATYYCQSHLPRTFGQGTKVEIK

16 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o anticorpo monoclonal dador ser RSV19.

17 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o anticorpo monoclonal dador ser RSV20.

18 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o anticorpo alterado ser HuRSV19VH/VK.

leve: pesada:

leve:

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19 - Processo do por o anticorpo de acordo com a reivindicação 16, caracterizaalterado ser HuRSV19VHFNS/HuRSV19VK.

20 - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por o anticorpo alterado ser um fragmento Fab ou um fragmento (Fab')₂.

21 - Processo de produção de um anticorpo monoclonal gerado contra o epítopo 417-438, caracterizado por se produzir por técnicas convencionais um tal anticorpo.

22 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se associar o anticorpo monoclonal de acordo com a revindicação 21, com um portador ou diluente farmaceuticamente aceitável.

23 - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado por o anticorpo monoclonal ser um fragmento Fab ou um fragmento (Fab')₂.

24 - Processo para efectuar modificações mínimas na estrututura da região variável de um anticorpo alterado necessárias para produzir um anticorpo alterado com afinidade de ligação aumentada, caracterizado por compreender os passos de:

(a) análise da estrutura de aminoácidos que se considera crítica para a interação com CDR e produção e teste dos anticorpos alterados nos quais os aminoácidos da estrutura simples foram substituídos pelos correspondentes aminoácidos provenientes da mesma fonte que as CDR;

(b) análise da estrutura de aminoácidos adjacente às CDR e produção e teste dos anticorpos alterados nos quais um ou mais dos aminoácidos dos 4 resíduos das CDR foram substituídos pelos correspondentes aminoácidos provenientes da mesma fonte que as CDR;

(c) análise da estrutura dos resíduos do anticorpo alterado e produção e teste dos anticorpos alterados nos quais aminoácidos simpes foram substituídos pelos correspondentes aminoácidos, sendo as principais diferenças na carga, tamanho e

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SBC Case P30148 —59— hidrofobicidade, provenientes da mesma fonte que as CDR;

25 - Processo de produção de um plasmídeo recombinante contendo a sequência do anticorpo alterado da reivindicação 1, caracterizado por se produzir por técnicas convencionais um vector de expressão contendo (a) um operão possuindo uma sequência de ADN que codifica uma cadeia pesada ou leve do anticorpo, onde pelo menos o CDR (e as porções mínimas da região da estrutura do domínio variável leve e/ou pesado do anticorpo monoclonal aceitador, necessárias para manter a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal dador) do domínio variável são provenientes de uma imunoglobulina não humana e as restantes partes derivadas de imunoglobulina da cadeia do anticorpo são derivadas de uma imunoglobulina humana; e/ou (b) um operão possuindo uma sequência de ADN que codifica uma cadeia pesada ou leve do anticorpo, complementar, onde pelo menos as CDR (e as porções mínimas da região da estrutura do domínio variável leve e/ou pesado do anticorpo monoclonal aceitador necessárias, para manter a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal dador) do domínio variável são provenientes de uma imunoglobulina não humana e as restantes partes derivadas de imunoglobulina da cadeia do anticorpo são derivadas de uma imunoglobulina humana.

26 - Processo de preparação de uma linha de células de mamífero transfectada com o plasmídeo recombinante produzido pelo processo da reivindicação 25, caracterizado por se transformar uma linha de células de mamífero com o plasmídeo recombinante produzido pelo processo da reivindicação 25.

27 - Processo de produção de um plasmídeo recombinante contendo a sequência do anticorpo monoclonal produzido pelo processo da reivindicação 21, caracterizado por se produzir por técnicas convencionais um vector de expressão contendo (a) um operão possuindo uma sequência de ADN que codifica uma cadeia pesada ou leve do anticorpo, onde pelo menos o CDR (e as porções mínimas da região da estrutura do domínio variável leve e/ou pesado do anticorpo monoclonal aceitador, necessárias para manter a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal dador) do • 73 108

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-60domínio variável são provenientes de uma imunoglobulina não humana ou humana dirigida contra o epítopo 417-438 e as restantes partes derivadas de imunoglobulina da cadeia do anticorpo são derivadas de uma imunoglobulina humana ou não humana; e/ou (b) um operão possuindo uma sequência de ADN que codifica uma cadeia pesada ou leve do anticorpo, complementar, onde pelo menos as CDR (e as porções mínimas da região da estrutura do domínio variável leve e/ou pesado do anticorpo monoclonal aceitador necessárias para manter a especificidade de ligação do anticorpo monoclonal dador) do domínio variável são provenientes de uma imunoglobulina não humana ou humana dirigida contra o epítopo 417-438 e as restantes partes derivadas de imunoglobulina da cadeia do anticorpo são derivadas de uma imunoglobulina humana ou não humana.

28 - Processo de preparação de uma linha de células de mamífero transfectada com o plasmídeo recombinante produzido pelo processo da reivindicação 27, caracterizado por se transformar uma linha de células de mamífero com o plasmídeo recombinante produzido pelo processo da reivindicação 27.