BR112012011143B1 - "anticorpos específicos para claudina 6 (cldn6)". - Google Patents

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Korden Walter
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Maria Kreuzberg
Bernd Hubner
Michael Erdeljan
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Abstract

patente de invenção para: "anticorpos específicos para claudina 6 (cldn6)". a presente invenção fornece anticorpos últeis como agentes terapêuticos para o tratamento e/ou prevenção de doenças associadas com células que expressam claudina-6 (cldn6), incluindo doenças relacionadas com o tumor, tais como câncer de ovario, câncer de pulmão, câncer gástrico, cânce de mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pele, malanoma maligno, câncer de cabeça e pescoço, sarcoma, câncer do ducto biliar, câncer de bexiga urinário, câncer renal, câncer de cólon, coriocarcinoma da placenta, câncer cervical, câncer testicular e câncer uterino.

Description

ANTICORPOS ESPECÍFICOS PARA CLAUDINA 6 (CLDN6).
Os anticorpos foram introduzidos com sucesso na clínica para uso na terapia do câncer e surgiram como a terapêutica mais promissora em oncologia durante a ultima década. Terapias à base de anticorpos para o câncer têm o potencial de especificidade mais alta e menor perfil de efeitos colaterais em comparação com os fármacos convencionais. A razão é uma distinção precisa entre as células normais e neoplásicas pelos anticorpos e o fato de que seus modos de ação baseiam-se em mecanismos antitumorais imunológicos menos tóxicos, como ativação do complemento e recrutamento de células imunes citotóxicas.
Claudinas são proteínas integrais de membrana, localizadas dentro das junções firmes do epitélio e do endotélio. Claudinas são previstas como tendo quatro segmentos transmembrana com duas alças extracelulares e os N e C terminais localizados no citoplasma. A família de proteínas transmembranares da claudina (CLDN) desempenha um papel crítico na manutenção das junções firmes epitelial e endotelial e também podem desempenhar um papel na manutenção do citoesgueleto e na sinalizaçao celular. A expressão diferencial destas proteínas entre as células tumorais e normais, além das suas localizações na membrana, as torna alvos atrativos para a imunoterapia do câncer e o uso de terapias à base de anticorpo para o alvejamento de CLDNs na terapia do câncer promete um alto nível de especificidade terapêutica.
No entanto, a aplicação clínica de agentes terapêuticos direcionados para CLDN enfrenta vários obstáculos. A expressão ubíqua de CLDNs no corpo e o papel crítico das CLDNs na manutenção de junções firmes requer especificidade alvo de terapêuticas direcionadas à CLDN a fim de maximizar a especificidade do tratamento e minimizar a toxicidade sistêmica.
WO 2009/087978 refere-se aos anticorpos anti-CLDN6 e ao uso destes como agentes anticâncer. Em particular, os anticorpos monoclonais designados AB3-1, AE1-16, AE49-11 e ΆΕ3-20 são descritos. No entanto, nenhum destes anticorpos foi específico para CLDN6, como mostrado por análise FACS no Exemplo 5. O anticorpo AE3—20 reagiu com CLDN9, enquanto que os anticorpos AE1-16 e AE49-11 mostraram reatividade considerável com CLDN9 e também reagiram com CLDN4. A ligação do anticorpo AB3-1 à CLDN6 foi tão forte quanto sua liqação à C.IDN9. É descrito no Exemplo 7 que o anticorpo AE49-11, quando administrado a um modelo de tumor de camundongo, tendeu a inibir o crescimento tumoral e teve um efeito de prolongamento de vida. Contudo, devido à inespecificidade do claro se os e f e i t o s „hií7acIo ainda não está anticorpo utiiizaao, descritos são devido à ligaçao do
CLDN6.
até o momento, nenhum anticorpo CLDN6 especifico descrito que se liga seletivamente à superfície das células que expressam CLDN6. No entanto, tal anticorpo especifico poderia ser necessário para abordagens terapêuticas baseadas em anticorpos utilizando CLDN6 como um alvo.
O alinhamento da sequência de
CLDN3, CLDN4, CLDN6 e
CLDN9 mostrado na figura ilustra que há um elevado grau de conservação de
CLDN6 com as outras proteínas claudina.
Esta homologia elevada de CLDN6 com outras proteínas claudina, em particular
CLDN9 e CLDN4, e o facto de que WO
2009/087978 falhou em fornecer anticorpos específicos para
CLDN6 sugerem que pode não ser possível produzir anticorpos que se ligam especificamente a
CLDN6.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Os resultados experimentais aqui.
descritos confirmam que CLDN6 é expresso humanas, enquanto que em diferentes células cancerosas ~ +-ao idos normais é a expressão em teciuuo
ΊImitada à placenta.
pela primeira vez,
Além disso, a presente invenção, descreve a produção bem sucedida de anticorpos específicos para ChOM capazes de se ligarem à superfície de células íntegras que quo expressam CLDN6. Análises FACS de células expressam CLDN6 mostraram a ligação específica enquanto nenhuma ligação foi de anticorpos anti CLDN6, observada para as células que expressam outras proteínas claudina, que não
Assim, a em particular, CLD«, CLDN4 e CLONS, ou células
-a ripptas proteínas CLDN.
expressam qualquer uma desta P , rac-i-rA -inesperadamente que um presente invenção demonstra P anticorpo pode ser produzido especlficamente reação antigeno-anticorpo com CLDN6 na células que expressam CLDN6, mas não realizando a reação antígeno-anticorpo com altamente homólogas.
A presente realizando uma superfície das substancialmente outras claudinas
- frirripce geralmente invenção torneie y úteis como agentes terapêuticos prevenção de doenças associadas CLDN6 e sendo caracterizadas por suas superfícies celulares, com tumor, em particular ovário, em particular anticorpos para o tratamento e/ou com células expressando associação de CLDN6 com as incluindo doenças relacionadas ~ j—i c- como câncer de câncer, Laís oon^ adenocarcinoma de , râncPT d© OUl.inãOf teratocarcinoma de ovário, cancer incluindo câncer de pulmão de pulmão de células carcinoma de pulmão pequenas células (SCLC) e não pequenas (NSChC), em de células escamosas câncer de particular e adenocarcinoma, câncer gástrico, câncer de mama, pâncreas, câncer de basal e carcinoma câncer de pleomórfico sinovial e de bexiga, pele, câncer hepático, em particular carcinoma de célula escamosa, melanoma cabeça e maligno, pescoço, sarcoma, câncer de de célula maligno, em particular em particular adenoma sarcoma carcinossarcoma, câncer do dueto biliar, câncer em particular o carcinoma de células de transição e carcinoma paprlar carcinoma de célula renal células claras câncer de rim, em incluindo carcinoma e carcinoma celular papilar renal cólon, câncer do intestino delgado, incluindo o particular renal de câncer de câncer do íleo, em particular adenocarcinoma do intestino delgado e adenocarcinoma do íleo carcinoma embrionário testicular z pÂnrsr ceÊvicâlf coriocarcinoma placentario, testicular, um ou câncer em particular seminoma testicular, câncer testicular embrionário, cancer tumor de células germinativas, um carcinoma embrionário, em teratoma uterine, tal como teratocarcinoma particular um tumor de células germinativas do testículo metastáticas.
Em um é capaz de e as suas formas aspecto, a invenção refere-se a um ligar à CLDN6 associada com a anticorpo que anticorpo cr πι\ΐ (ή De preferência, que expressa C .1 d J N e . uc t , οω liaar à CLDN9 associada não é substancialmente capaz de o g uma célula com a superfície de uma célula que expressa CLDN9. De preferência, o anticorpo não é substancialmente capaz de se ligar à CLDN4 associada com a superfície de uma célula que expressa CLDN4 e/ou não é substancialmente capaz de se ligar à CLDN3 associada com a superfície de uma célula que expressa CLDN3. Mais preferivelmente, o anticorpo não é substancialmente capaz de se ligar a uma proteína CLDN que não seja CLDN6 associada com a superfície de uma célula que expressa a dita proteína CLDN e é específica para CLDN6. Preferivelmente, a dita célula que expressa a dita proteína CLDN é uma célula íntegra, em particular uma célula não permeabilizada, e a dita proteína CLDN associada com a superfície de uma célula tem uma conformação nativa, isto é, não desnaturada. De preferência, o anticorpo é capaz de se ligar a um ou mais epítopos de CLDN6 nas suas conformações nativas.
Em uma modalidade, o anticorpo é capaz de se ligar a um epítopo localizado dentro de uma porção extracelular da CLDN6, em que a dita porção extracelular de CLDN6 compreende de preferência a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15, de preferência a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7, mais preferivelmente a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6. De preferência, o anticorpo é capaz de se ligar a um epítopo localizado dentro da sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ TD NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 e SEQ ID NO: 15, de preferencia a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7.
Em uma modalidade, o anticorpo é capaz de se ligar à CLDN6 por interação em pelo menos um, de preferência mais do que um, tal como 2, 3, 4 ou 5, de preferência todos os aminoácidos selecionados do grupo consistindo de Thr33, Phe35, Gly37, Ser39, Ile40 e Leul51, de preferência através da interação com pelo menos um, de preferência mais do que um, de preferencia todos os aminoácidos selecionados do grupo consistindo de Thr33, Phe35, Gly37, Ser39 e Ile40, mais preferivelmente através da interação com pelo menos um, de preferência mais do que um, de preferência todos os aminoácidos selecionados do grupo consistindo de Phe35, Gly37, Ser39 e Ile40, ou consistindo de Thr33, Phe35, Gly37 e Ser39 e, em particular, através da interação com pelo menos um, de preferência mais do que um, de preferência todos os aminoácidos selecionados do grupo consistindo de Phe35' Gly37 θ Ser39· De Preferência, o anticorpo não interage com um ou mais, de preferência todos os aminoácidos selecionados do grupo que consiste em Glul54, AIal55, Argl58 e Glyl61 e, de preferência, não interage com um ou mais, de preferência todos os aminoácidos selecionados do grupo que consiste em Argl58 e Glyl61.
A interação entre um anticorpo e CLDN6, em particular na sua conformação nativa, pode ser analisada por mutagênese de varredura de alanina dos aminoácidos mutantes de CLDN6 podem ser avaliados quanto uma
Os sua capacidade de ser ligados por antrcorpos monoclonais específicos. A ligação prejudicada de um anticorpo monoclonal específico a um mutante CLDN6 aminoácido modificado é um resíduo de contato ligação pode ser analisada, por exemplo, por sugere que importante.
citometria de fluxo.
Em uma modalidade, o método compreendendo a etapa um peptídeo com a sequência dentre as SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 15, de preferência a ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7, 1 equivalente, ou um ácido anticorpo é obtenível por um de imunização de um animal com de aminoácidos de qualquer uma ID NO: 7, SEQ ID NO: 14 e SEQ sequência de aminoácidos de SEQ ou um peptídeo imunologicamente nucleico ou célula hospedeira expressando o dito peptídeo.
Era modalrdadcs diferentes, a CLDN6 a qual o antreorpo ó capaz de se ligar tem a seguência de aminoácrdos da SEQ ID NO: 2 ou a sequência de aminoácidos da SEQ_ ID NO. 8.
partlcularmente preferido que o anticorpo seja capaz de se ligar à CLDN6 com a e capaz de se sequência de aminoácidos ligar à CLDN6 com a de SEQ ID NO:
sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
Em uma n dl invenção compreende modalidade, um anticorpo da compreendendo pelo menos todas as pesada de anticorpo rs ν-Ω feri ve Imente uma, de preferência duas, ma- prefer uma cadeia três sequências de CDR de uma anticorpo selecionada
40, ou uma variante marcadas por uma anticorpos
Em uma dentre dessas.
sequência de cadeia as SEQ ID NOs: 34,
As sequências de nas sequências de cadeia acima mencionadas dadas na Figur . modalidade, um anticorpo da invenção uma cadeia
CDR3 Xaal aminoácido, pesada de
36, 38 e
CDR estão pesada de compreende pesada de anticorpo compreendendo a sequência
Giy de
Xaa2 Vai Xaa3, preferência um em que Xaal qualquer aminoácido aromático, mais . _ preferivelmente Tyr, Xaa2 Phe ou Tyr, mais preteri preferivelmente um d? preferência é qualquer amrnoacido, de P , . rmis preferivelmente Phe aromático, mai P
Xaa3 é qualquer preferivelmente Tyr, e
Leu ou Phe, um aminoácido ou Tyr, mais aminoácido, de mais preferivelmente Leu. Em uma da Invenção compreende uma cadeia sequência CDR3 Asp *aal modalidade, um anticorpo compreendendo a a on Xaal Gly Xaa2 Vai Xaa3 Asp, Gly Xaa2 Vai Xaa3 ou Xaal G y Ύ orima Em uma , » Xaal são como definidos acima.
Xaal, Xaa2 e Xaad anticorpo em que modalidade, um anticorpo da mve ç pesada de anticorpo compreendendo a se^noia Gly Xaa2 Vai Xaa3 Asp, definidos acima. Em em uma invenção compreende uma compreendendo a sequênc compreende uma cadeia
CDR3 Asp Xaal que Xaal, Xaa2 e modalidade, um cadeia pesada
CDR3 Ala
Arg Asp
Xaa3 sao como anticorpo da de
Xaal anticorpo
Gly Xaa2 vai Xaa3 Asp Tyr. que XM1'
Xaa2
Xaa3 são como de acordo um anticorpo com as modalidades anteriores compreende uma cadela pesada o . ml de acordo com a 10 de anticorpo compreendendo a sequencia .
sequência CDR2, ae • c prima Em uma modalidade, definidos acima.
seq io «0: 47 °u uma variante sua e/°U a
CFO ID NO: 48 ou uma variante sua.
acordo com a SEQ w anticorpo da invenção compreen Em uma modalidade, u Uma cadeia posada de anticorpo compreendendo nma 15 de cadeia pesada do anticorpo selecionada dentre mv-iante das mesmas.
34, 36, 38 e 40 ou uma variant pniácorpo da invenção Em uma modalidade, um de anticorpo que compreende pelo uma cadeia leve de duas, sequência as SEQ Ιθ compreende menos uma, sequências CDR de uma todas as tres nrPferivelmence mais preiej--1da cadeia leve sequência de anticorpo selecionada dentre as
SEQ ID NOs: 35, 37, e 41, ou uma uma das mesmas.
As sequência
CDR estão • o de cadeia leve nas sequências de n anresenfadas na figura 26. mencionadas acima apresen marcadas por dc anticorpo
.......... ..........
......................................-..............
CDR3 Arg Xaal Xaa2 Xaa3 Pro, aminoácido,
Ser, Xaa2 é
He, Asn ou qualquer em que Xaal r„ nrPfcrivelmente Asn, mais preiex-tv qualquer aminoácido, de preferência Tyr, Ser,
Thr, mais Ί +-ω tvt Ser ou Asn, mais preferivelmente lyr, preferivelmente
Asn, ou Tyr, preferência Ser modalidade, um anticorpo
Xaa3 é qualquer aminoácido, de mais preferivelmente Tyr. Em « da invenção compreende uma cadeia de anticorpo que compreende a sequência
Xaal Xaa2 definidos invenção
CDR3 Gin Arg
Xaa3 Pro Pro, em que Xaal, Xaa2 e
Xaa3 são como acima. Em compreende uma uma modalidade, um cadeia leve anticorpo da de anticorpo compreendendo a sequência CDR3 Gin
Pro Pro Trp Thr, definidos acima. Em
Gin
Arg
Xaal
Xaa2 Xaa3 em que Xaal,
Xaa2
Xaa3 são como uma modalidade, um anticorpo de acordo compreende uma cadeia leve
CDR1 de acordo com a com as modalidades de anticorpo compreendendo a sequência SEQ ID NO: 52 OU uma variante sua e/ou a seguira COR2, de 3 oF0 !D NO: 53 ou uma variante sua.
mordo com a SEQ 1 t;m uma modalidade, um antrcorpo da invenção compreen e
... cedera leve de antrcorpo compreendendo uma sequência de
SEQ ID NOs:
de anticorpo selecionada dentre c 41, ou uma variante das mesmas.
Em várias modalidades, um anticorpo da invenção compreende uma cadeia pesada de anticorpo tal como discutido acima e uma cadeia leve de anticorpo como também discutido acima.
Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende:
(i) uma cadeia pesada de anticorpo que compreende pelo menos uma, de preferência duas, mais preferivelmente todas as três sequências CDR de uma sequência de cadeia pesada de anticorpo da SEQ ID NO: x, ou uma variante sua, e (ii) uma cadeia leve de anticorpo que compreende pelo menos uma, de preferência duas, mais preferivelmente todas as três sequências CDR de uma sequência da cadeia leve de anticorpo da SEQ ID NO: x+1, ou uma variante sua;
em que x é selecionado de 34, 36, 38 e 40.
As sequências CDR estão marcadas por uma caixa nas sequências de cadeia pesada de anticorpo e nas sequências de cadeia leve de anticorpo, respectivamente mencionadas acima, apresentadas na Figura 25 e na Figura 26, respectivamente.
Em uma modalidade, um anticorpo da invenção compreende:
(i) uma cadeia pesada de anticorpo compreendendo uma sequência CDR3 selecionada do qrupo consistindo de Xaal Gly
Vai Xaa3 Asp, Asp , Vai Xaa3 Asp Xaal Gly
Xaal Gly Xaa2 Vai Xaa3 Asp,
Ala Arg Asp , ' ade preferência aminoácido, cie p5 preferivelmente Phe ou Tyr' é qualquer aminoácido, preferivelmente phe
Xaa3 é qualquer aromático, mais Tyr, em que Xaal é qualquer ura aminoácido aromátrco, mais mais preferivelmente Tyr, Xaa2 de preferência um aminoácido ou Tyr, mais aminoácido, preferivelmente Tyr, Leu ou Phe, preferivelmente Leu, e cadeia leve de anticorpo compreendendo pueferência sequência
Xaa2 Xaa3 uma
CDR3
Pro, , Hr> arupo consistindo selecionada do grup
Gin Arg Xaal Xaa2 Xaa3
V 9 Xaa3 Pro Pro Trp Thr, Xaal Xaa2 Xaal de preferência Ser ou aminoácido,
Ser, Xaa2 é qualquer aminoácido,
Pro Pro, de uma em
Asn, de Arg
Xaal
Gin Gin Arg
Ile, Asn ou mais que Xaal θ qualquer mais preferivelmente preferivelmente Tyr, Ser, , ivr Ser ou Asn, mais preferivelmente Tyr, preferivelmente preferência
Asn,
Xaa3 qualquer aminoácido, de . referivelmente Tyr. ou Tyr, mais prerer de Em uma modalidade, um anticorpo modalidades precedentes compreende (r) ™a anticorpo compreendendo a sequência COR1 acordo com as adeia pesada de de acordo com a
3Εζ) I') N0: ou uma variante sua e/ou a sequência CDR2 de e/ou acordo com
SEC 10 NO: w °o uma varlante comprecndendo a sequência C0R1 uma cadeia leve de anticorpo de acordo com a
SEQ ID NO:
ou „ 1 - cpiRO de acordo com a sequencra CDkz <ae variante sua.
Em uma compreende :
uma sequência de uma variante modalidade, cadeia pesada cadeia pesada sua, uma cadeia leve uma variante sua e/ou a
SEQ ID NO: 53 ou uma um anticorpo da invenção de de de anticorpo compreendendo uma anticorpo da SEQ ID NO: x ou anticorpo Sequéncd de cadeia leve de anticorpo da uma variante sua, em que x é selecionado de 34, 36, 38 compreendendo uma
SEQ ID .
NO: x+1 ou
Em modalidades preferidas, o anticorpo das seguintes atividades:
morte de tem uma uma ou mais célula que expressa CLON6, (d) miPiçào da proliferado de - célula que expressa CLPN6, (-> -»^0 da ferido de colonras de uma célula que expressa CLDN6, mediação da remissão, isto redução em tamanho, de preferência completa, desaparecimento completo de r o f o rmaç a o de tumores prevenção da inibição da metástase de ou uma utilizado expressa CDDN6.
um ou
Deste modo, o anticorpo pode ser dos precedentes, em particular 4 . tr.do a um paciente. Tal morte das quando administrado a ui m e/ou inibição de uma ou mais ut i1iz ada s documento. Em proliferação colônias das prevenir o inibição de atividades de células podem terapeuticamente como descrito particular, a morte de células, das células e/ou células podem ser câncer, incluindo proliferação, metástase de células pode para tratar ou prevenir inibição de utilizadas metástases formação de ser utilizada no presente inibição formação para tratar do câncer.
da de ou colônias e/ou em particular, a metástase do câncer e espalhamento preferência, da metástase das células cancerosas.
rx invenção medeia a morte anticorpo da invent células através da indução de lise mediada complemento (CDC),
De das pela citotoxicidade dependente do medrada pela citotoxicidade celuiar dependente de anticorpo (ADCC), apoptose, adesão homotipica preferência através da indução de Use lise mediada por ADCC. No entanto, também inclui modalidades em atividade como aqui descrito, inibindo uma ou mais exemplo, mediada por CDC e/ou a presente invenção que o anticorpo exerce a sua tal como matando as células atividades das células, por proliferação celular e/ou formaçao de colonias, sem induzir a lise mediada por citotoxicidade dependente do complemento (CDC), a mediada por citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC), apoptose, adesão
............ .... ................ » ............ ’ “ invenção r- nm efeito simplesmente pela pode também exercer um eteu da célula, à CLDN6 na superfície deste modo, por exemplo, n nroliferação das bloqueando a prom
Em uma modalidade, o anticorpo da mvenç induz a das células mediada por CDC.
mediada por
ADCC
De o ií se das células preferencia, a use ar j— oa mo em modalidades de células efetoras que, em na presença particulares, são , .ο. rrrnno nue consiste de selecionadas do grupo q monócitos, células mononucleares, células NK e PMNs, fagocitose é por melo de maorôfagos.
A atividade de inibição ou ov-nressam CLDN6, células que expressai redução da proliferação de ,,,ν.ρ Ser medida in cancerosas, pode de preferência células vitro por determinação da
- de células cancerosas expressando C10N6 em um 15 proliferação de (5.bromo-2-desoxiuridina, usando bromodesoxiuridina (5 b
BrdU) BrdU é um nucleosrdeo sintetic ensaio timidina e pode ser incorporado no DNA que é um análogo da recém sintetizado de de repücaçao (durante a fase
S do ciclo celular),
4- -· nor timidina durante a substituindo p ί -í r' n c ã o do DNA. A replicaçcio detecção da substãnora income a utilizando, por anticorpo específicos para BrdU indica células exemplo, que estavam replicando atlvamente
Inibição ou redução da formação de seu DNA.
colônias das células que expressam CLDN6, de preferência as células cancerosas, pode ser medida in vitro em um ensaio clonogênico. Um ensaio clonogênico é uma técnica de microbiologia para estudar a eficácia de aqentes específicos na sobrevivência e proliferação das células. Ele é frequentemente utilizado em laboratórios de pesquisa do câncer para determinar o efeito dos fármacos ou radiação na proliferação de células tumorais. 0 experimento envolve três etapas principais: (i) aplicação de um tratamento a uma amostra de células, em particular células cancerosas, (ii) plaquear as células em um frasco de cultura de tecidos e (iü) permitir que as células cresçam. As colonias produzidas são fixadas, coradas e contadas. A formação de colônias é de importância no que diz respeito à formação de metástases se células tumorais individuais colonizam órgãos. A atividade inibidora dos anticorpos indica os seus potenciais na supressão da formação de metástases. Os anticorpos possuindo a atividade de inibição ou redução da formação de colônias em um ensaio clonogênico são particularmente úteis para tratar ou prevenir a metástase e o espalhamento metastático das células cancerosas, em particular dos tipos de câncer mencionados no presente documento.
Em modalidades preteridas, o anticorpo apresenta uma ou mais funções carrega CLDN6 na ou mais funções selecionadas do efetoras imunes contra uma célula que em que essas uma sua conformação nativa, em yu cãn de preferência, efetoras imunes sao, ue c grupo consistindo de citotoxicidade dependente do complemento (CDC), citotoxicidade de anticorpo (ADCC), indução de preferência, célula dependente e inibição da proliferação;
efetoras são ADCC e/ou CDC.
De preferência, as ditas ou mais funções efetoras anticorpo
CLDN6, de são induzidas pela porção extracelular extracelular de CLDN6 mediada por de apoptose as funções uma ou mais atividades ou uma imunes exibidas pelo dito ligação do dito anticorpo a a um epitopo localizado dentro de dita porção de CLDN6, em que compreende de preferência a sequência
6, SEQ ID NO:
de aminoácidos de qualquer uma de SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: U e SEQ ID NO: 15, de preferência
SEQ ID NO:
sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: S ou . 1 a sequência de aminoácidos da SEQ mais preferivelmente a seque
NO: 6.
De acordo com a invenção,
CLDN6 é de preference
CLDN6
CLDN6
7,
ID uma célula que expressa caracterizada com a sua superfície celular. Uma ou uma célula que carrega
CLDN6 por associação de célula que expressa na sua conformação nativa é, uma célula tumoral, tal como uma célula cancerosa, de preferência uma célula câncer selecionado do grupo consistindo ovário, cancerosa de de câncer um de em particular adenocarcinoma ovariano e teratocarcinoma ovariano, cancer de pulmão, câncer de pulmão de pequenas células (SCLC) incluindo câncer de pulmão de carcinoma células de pulmão não de câncer gástrico, câncer pequenas (NSCLC), em célula escamosa particular adenocarcinoma, de mama, câncer hepático, câncer de pâncreas, câncer de pele, em particular carcinoma de célula basal carcinoma de célula escamosa melanoma maligno, câncer de cabeça e pescoço, em particular adenoma pleomórfico maligno, narticular S â 32 COlTlâ sarcoma , cm parnumat sinovial e carcinossarcoma de bexiga carcinoma de célula câncer do dueto biliar, câncer em especial carcinoma de célula de transição e papilar, câncer de rim, em particular renal incluindo carcinoma de célula célula clara e cólon, câncer í leo, carcinoma renal de carcinoma de célula renal papilar de intestino delgado, incluindo em particular adenocarcinoma do adenocarcinoma do ileo, câncer de câncer de intestino delgado e carcinoma embrionário testicular coriocarcinoma da placenl.a, câncer cervical, câncer testicular, em particular seminoma testicular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário câncer uterino, um tumor de células germinativas, tal como um teratocarcinoma ou um carcinoma um tumor de célula germmativa embrionário, em particular do testículo, e as formas metastáticas do mesmo.
O anticorpo da invenção pode sen Uqado a uma dn exemplo, porções efetoras terapêuticas , por vnv-.amr as citotoxinas, enzimas radiomarcadores, o que induzem a apoPtose e similares, citotoxicidade direcionada, isto e, tumorais.
Em uma modalidade terapêuticas, agentes a fim de proporcionar a morte das células o anticorpo da invenção (i) se liga às células que expressam CLDN6 sendo caracterizado por associação de CLDN6 com as suas superfícies celulares, e (ii) não se liga as células que sendo caracterizado por superfícies preferência das células celulares (i) medeia não expressam CLDN6, nao associação de CLDN6 anticorpo da morte e/ou inibe a que expressam CLDN6, associação de CLDN6 com as suas dl) não medeia a morte e/ou não células que não expressam CLDN6, com as invenção suas de proliferação sendo caracterizado por superfícies celulares, e inibem a proliferação de não sendo caracterizado por associação do CT.DN6 com as suas superftcres celulares Em modalidades particulares preferidas, da invenção se liga aos epítopo superfície de células vivas nativos de CLDN6 presente tais como aquelas das SEQ na
ID
NOs: 6 ou 7· Em da invenção θ expressam CLDN6 outras modalidades preferidas específico para e não se liga às
CLDN6.
O anticorpo células cancerosas células cancerosas que que não ser derivados de c da invenção podem ser
Os anticorpos da camundongo, diferentes, rnclutndo, mas sem rato, coelho, porquinho-da-índra limitar, a humanos. Os anticorpos da invenção também incluem moléculas quiméricas em que uma região constante de anticorpo humanos, é derivada de uma espécie, combinada com o sítio de ligação ao antigeno derivado de , „ ém disso, outras especre anticorpos da invenção lórnlas humanizadas incluem moléculas em que sítios de ligação ao antigeno de um anticorpo derivado de uma espécie não
São combinados com regiões constante 15 humana sao com de estrutura de origem humana.
n, da invenção incluem os anticorpos da anticorpos policlonais e • „ e incluem anticorpos monoclonais e
IgG2a (por t c,2a k M , lg«b (por ^P10' exemplo, IgG2a, , k, λ) , e IgM- No entanto, outros 20 IgG3 (por exemplo, IgG3, . também são englobados pela invenção, de anticorpos Lamoem incluindo Το.λ9 ΓαΑ secretora, TnGi igAi, igA2, -g anticorpos IgGU ã
IgO e IgE· 05 «oticotpOS P°dem ,, „ inimiros ou anticorpos mua fragmentos de ligação a antigeno dos mesmos, incluindo, por exemplo, Fab, F(ab')2, Fv, fragmentos Fv de cadela simples ou anticorpos brespeclficos. Alem disso, os fragmentos de a antigeno incluem proteínas de fusão de domínio de ligação ligação à imunoglobulina, compreendendo de polipeptídeo (tal como uma cadeia pesada ou fundida com um imunoglobulina, (i) um domínio região variável de de uma região variável da cadeia leve) que e polipeptídeo da uma região pesada de imunoglobulina fundida (iii) uma região constante imunoglobulina fundida com a proteínas de fusão de domínio são adicionalmente divulgadas região de dobradiça da constante CH2 da cadeia à região de dobradiça, e
CH3 da cadeia pesada de região constante CH2. Tais de ligação à imunoglobulina em US 2003/0118592 e US
2003/0133939.
- .i,^ nrpf Arênciã é U-ΓΠ cl.ntÍCOX?pO o anticorpo da invenção de preferencia monoclonal, quimérico, humano ou humanizado, ou fragmento de um anticorpo
Os anticorpos da invenção incluem anticorpos totalmente humanos. Tais anticorpos podem ser produzidos em um animal transgênrco por exemplo, um camundongo transgênico, capaz não humano, de produzir isotipos múltiplos de
CLDN6 submetendo se anticorpos monoclonais humanos para a a recombinação V-D-J e comutação de
Tal animal transgênico também pode ser um coelho . para a prod^o de anticorpos polidonais, tai transgenrco para P como divulgado em US 2003/0013534.
da presente invenção , Com uma constante de preferência se anticorpos de CLDN6 de equilíbrio de dissociação (KD) de
100 nM ou menos.
Preferivelmente, forma cruzada relacionados e, os aproximadamente 1 a anticorpos da Invenção não reagem de com antígenos de superfície assim, não inibem a função destes.
celular
Em modalidades preteridas, os caracterizados invenção podem seguintes propriedades
a) especificidade para CL0N6;
b) afinidade anticorpos da presente por uma ou mais das de ligação para CLDN6 de cerca de 10 0 nM de preferência, cerca de OU menos, de prei.
mais preferivelmente, cerca de 1 a 3 expressam
CLDN6 com
d) a expressam
CLDN6 com nM nM ou menos ou menos, capacidade de induzir
CDC das células que ~ naracterizadas pela
CLDN6 e sao caracuer associação de as suas superfícies celulares;
capacidade de inibir o crescimento de células que
C1.DN6 e as ão caracterizadas pela suas superfícies capacidade para expressam CLDN6 e
CLDN6 com as suas celulares;
induzir a apoptose são caracterizadas pela superficies celulares, associação de de células que associação de a adesão homotipica de capacidade para inducxr a adesa
CLDN6 são caracterizadas de CLDN6 com capacidade de celulares, suas superficies
Txncr de células que induzir ADCC ae expressam
CLDN6 e são , npla associação caracterizadas pel de
CLDN6 com s superfícies celulares na presença as suas superr-t células efetoras;
h) a capacidade para prolongar de indivíduo tendo caracterizadas células tumorais que pela associação de a sobrevivência expressam CLDN6
CLDN6 com as de um e são suas superficies ceiulares; expressam •, a capacidade para destruxr as p . de CLDN6 com as
- caracterizadas pela assocraçao
CLDN6 e sao caracter superfícies celulare , rfície de , pnreaar CLDN6 na super capacidade de agregar suas células
............—-q-/:r: ..................ϋίΖ ................ célula de hxbridoma depositada 2Q 38124 Braunschweig, Alemanha) e ~ „ números de acesso.
designações e nume..
1. GT512muMAB
Um número H seguintes tendo uma das y de
DSM ACC3067, oi de junho de 2010, depositado em acesso DSM ACC3068
GT512muMAB 60A, número o'! He junho depositado em 21 d® 1 de 2010;
3. GT512muMAB
61D, z z He acesso numero αθ dsm
ACC3069, depositado em 21 de
4. GT512muMAB j unho
64A, de 2010;
número de
DSM
ACC3070, depositado em 21 de GT512muMAB junho
65A, de 2010;
número de acesso
DSM
ACC3071, depositado em 21 de GT512muMAB depositado em 21 de
3. GT512muMAB junho
66B, junho
67A, de 2010;
número de de 2010;
número de aces so
DSM
DSM
ACC3032,
ACC3073,
-I- a a o em 21 de depositado 8. GT512muMAB junho
55A, de 2010;
número de
DSM
ACC3089, depositado em 31 de 9. GT512muMAB agosto de 2010, ou acesso em 31 de depositado Os anticorpos 89A, número de agosto de 2010. da invenção sao
DSM designados
ACC3090, aqui P°r . ' designação referencia a a u e/ou por referência ao muMAB 59A.
clone produtor
Outros anticorpos pzeficidade dos anticorpos especirr do anticorpo _ nor exempio, do anticorpo, P a são aqueles qt® obteníveis a preferidos produzidos per em partir dos htbridomas aqueles compreendendo acima uma porção de ligação antigθηο ou uma antigeno, em . - _-i idêntica variavel, ou altamente homóloga àquela dos anticorpos e obteníveis a produzidos por partir dos hibridomas acima descritos. É contemplado que os anticorpos altamente são aqueles que têm
CDR idênticas ou ' e radioes dos anticorpos homólogas as regí produzidos , · a nartir dos hibridomas acima 5 por e obteníveis a partir descritos.
Por altamente homólogo é contemplado que de a 5, de preferência de 1 a 4, substituições podem ser tal como de 1 a 3 feitas eia cada ou ou região
CDR.
Os anticorpos
2.0 quimerizadas particularmente preferidos e humanizadas dos anticorpos são as formas produzidos por obteníveis a partir dos
Deste modo, um hibridomas acima anticorpo da invenção pode ser selecionado que consiste do grupo ou obtenível a partir de um anticorpo de um clone depositado produzido por a» acesso DSM ACC3067 15 sob o número de acesso (GT512muMAB
59A) ,
DSM
ACC3068
ACC3070
ACC3072
ACC3089 (GT512muMAB (GT512muMAB (GT512muMAB
60A) ,
64A) ,
66B) ,
12muMAB 55A)
DSM
DSM
DSM
ACC3069
ACC3071 (GT512muMAB (GT512muMAB
61D) ,
65A) ,
DSM
DSM
DSM
67A) , (GT512muMAB DSM ACC3090 (GTSlZmuMAB 89A),
ACC3073 é uma forma do anticorpo designado em quimerizada ou humanizada (iii) um anticorpo que tem a um 3spef:it ididhde do anticorpo designado em compreende a porção de ligaçao ant;iCOrP° ' do anticorpo designado em (r)· sítio de ligação a antígeno de ligação ao antígeno de ligação ao antigeno do anticorpo designado em (i) pode compreender a variável do anticorpo designado em região varrav^x A presente invenção também se retere a uma célula, tal de hibridoma que produz como uma célula oe um anticorpo como descrito bo presente documento.
Células depositadas
Alemanha) e acesso:
de hibridoma preferidas são aquelas
7B 38124 Braunschweig, no DSMZ (Inhoffenstr.
com uma das seguintes designações números de
1. GT512muMAB depositada em 21 de
2. GT512muMAB depositada em 21 de
3. GT512muMAB
59A, junho
60A, junho
61D, número de 2010;
de
DSM
ACC3067, número de de 2010;
número de
DSM
DSM
ACC3068,
ACC3069, depositada em 21 de
4. GT 512muMAB depositada em 21 de
GT512muMAB junho
64A, junho de 2010;
número de de 2010;
número de acesso
DSM
DSM
ACC3070,
ACC3071, tada em 21 de j unho de 2010;
6. GT512muMAB
66B, número de acesso
DSM
ACC3072, depositada em 21 de junho de 2010;
GT512muMAB
67A, número de
ACC3073, depositada em 21 de junho de 2010;
8. GT512muMAB depositada em 31 de
9. GT512muMAB depositada em 31 de
Os anticorpos ser derivatizados, especificidades de
55A, número de acesso agosto de 2010; ou
89A, número de acesso agosto de 2010.
anti-CLDNô ligados ligação.
invenção fornece uma multiespecifica
Em da ou uma
DSM ACC3089,
DSM ACC3090, presente invenção podem coexpressos com outras modalidade particular, molécula biespecifica ou
Hrndo pelo menos uma primeira compreendendo pe a liaacão para CLDN6 especificidade de anti-CLDN6 ou um mimético csnecificidade de ligação para segunda especif a csnecificidade de ligação tai como uma espe anticorpo (por exemplo, um receptor Eo-gama, tal (por exemplo, um do mesmo), uma uma célula efetora, para um receptor como Fc-gama RI, „tor PC) OU um receptor de células qualquer outro receptor por exemplo, CD3.
a presente invenção
Deste modo, P rí ficas e multiespecificas que se brespecifícas um receptor a um ou a
Fc ou
T, inclui moléculas ligam tanto à CLDN6 de células T, Por exemplo,
CD3· Exemplos de
Fc são o receptor de
IgG,
Fc-gama (FcyR), tal como 1c,») <CD64>, de jgA (por exomplo, tcaR. ), também podem ser alvejados.
receptor Fc está preferencialmente localizado na superfície de uma célula efetora, por exemplo, um monócito, macrófago ativada. Em biespecíficas em um ou uma célula mononuclear uma modalidade mui tie sped ficas que é distinto imunoglobulina (por exemplo,
Portanto, a ligação das preferida, se ligam a do sitio
IgG ou moléculas de
IgA) um moléculas receptor Fc ligaçao Fc de do receptor.
biespecíficas e multiespecificas não é bloqueada pelos nrvers fisiológicos das imunoglobulinas.
, _ o pttHcocoos anti “ CLDN 6 da
Em ainda outro aspecto, os anticorpos
Invenção são derivatrcados, ligados a ou coexpressos com outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína anticorpo exemplo, (por exemplo, um fragmento Fab'). For da Invenção pode ser funcionalmente por acoplamento químico, fusão exemplo, um ligado (por genética, associação não covalente ou outra forma) a um ou mais outras entidades moleculares, tal como outro anticorpo (por exemplo, para produzir um anticorpo biespecífico , o· nma citotoxina, ligante celular multiespecifico), uma antígeno mra oroduzir um imunoconjugado, (por exemplo, para proou/.xb como uma imunotoxina). Um anticorpo da presente ou ou invenção pode ser ligado a outras terapêuticas, exemplo, um radioisótopo, um fármaco anticàncer de molécula pequena, uma ou quimiocina _ neste modo, recombmante. uesr presente -vençàc engloba , o dp anticorpos, conjugados de grande variedade uma grane:
moléculas biespecificas de
-epos e proteínas multiespecifícas P de fusão, todas as quais se 5 ugando às céiulas ζζ sendo caracterizadas por associaçao às com células as suas olulares e que podem ser usadas superfícies celulares para alvejar outras moléculas a Cais células.
para os fins da presente invenção, todos Geralmente, para . de anticorpos, tais os derivados de como conjugados de anticorpos, molecules brespecif i«s proteínas de fusàc agui descritas são multiespecifícas e englobados pelo termo anticorpo .
p esnecto, a invenção Em outro aspect,
CLDN6 derivadas de também prevê proteínas domínios que não sao ligaçao . , r proteínas de cadeia única, particular prorexn imunoglobulmas, destas estéo descritos, por exempio, em a produção col· (2005) incorporado 9-> (10): 1257-1268, aqui Biotechnology - dado oue o ensinamento dado d mra ser entendido que referência- E para se documento com relaçao moléculas de ligação derivadas de imunoglobulina pondcntemente imunoglobulina também , de domínio derivada^ u nãoi-pcr de ligação às moléculas αθ , i i na Em particular, imunoglobulina. m t utilizando tais moléculas de não-imunoglobulina é possível expressam o dito alvo e associação do dito alvo com ligação derivadas de domínios bloquear CLDN6 de células que que são caracterizadas por as suas superfícies celulares assim, para produzir efeitos terapêuticos tais como aqui descritos para os anticorpos da invenção, em particular, a inibição de uma aqui divulgado, obrigatório, é ou mais atividades de células tumorais tal como possível anticorpos para tais como a proliferação. Embora não conferir funções efetoras moléculas de ligação seja dos nãoimunoglobulina através de, por exemplo, fusão com a região
Fc de anticorpos.
A presente invenção geralmente engloba o tratamento e/ou o diagnóstico de doenças, tumorais, por alvejamento de CLDN6 em particular doenças expressa pelas células e sendo associada com a superfície das células proporcionam a detecção θ/ou erradicaçao
Estes seletiva métodos de tais células células minimizando normais que caracterizadas por superfícies celulares assim os efeitos adversos para as não expressam CLDN6 e não sendo associação de CLDN6 com as suas
Doenças preferidas para uma terapia z , . nmiplas em que as células ou diagnostico sao aqueia expressando cnrAN-prizadas por associação de CLDN6 e sendo caracLeii.· m
CLDN6 com as suas superficies celulares estão envolvidas, tal como as doenças tumorais, cm particular as Venças de câncer, tais i-oc; descritas aqui · como aquelas oomposições, P«
Em um aspecto, a rnvençao torn
- c/kits farmacêuticos θ de composiçoes/krts t-ártoroo ou uma combinação 5 compreendendo um antrcorp farmacêutica da exemplo, da invenção.
Uma composição compreender um opcionalmente diagnóstico, de anticorpos invenção pode aceitável e pode farmaceuticamente aceit ou mais adjuvantes, compreender um veiculo etc. Em uma modalidade partrcular, a de anticorpos que se ligam características estabilizantes' • inclui uma combinação an composição mciu rrtosuen ou que possu rnc e/ou ADCC θ tais como indução de CDC modalidade da rneençào, os a epltopos diferentes funcionais distintas, indução de apoptose. Ne ã P°r exemplo, ,em ser utilirtdos em combxnaçao, anticorpos pode adendo dois ou mais Por exemplo, anticorpos porém . ~ farmacêutica compreen· composição farmaceu anti-CLDN6.
i5 como uma anticorpos monoclonal® possuindo anti-CLDN6 atividades diferentes, complementares, podem ser combinados em uma única terapia desej ado.
para alcançar - efeito terapêutico inclui um
Em uma modalidade preferida, composição anticorpo anti-CLDN6 que medeia cpC combinado com outro anticorpo anti-CLDN6 que induz a apoptose.
E.m outra modalidade, composição altamente morte inclui um ant icorpo
Í-CLDN6 que medeia
- a alvo na presença de células de células efetoras, combinado com outro que inibe o crescimento de células sendo caracterizado por associação anticorpo anti-CLDN6 expressando CLDN6 e de CLDN6 com suas superfícies celulares.
A presente invenção também inclui simultânea ou sequencial de dois ou mais
CLDN6 da invenção, ditos anticorpos é menos a administração anticorpos antiem que de preferência pelo menos um dos um anticorpo anti-CLDNS quimérico e pelo um anticorpo adicional humano, os anticorpos diferentes de CLDN6.
um anticorpo anti-CLDN6 que se ligando a epítopos iguais ou De preferência, um anticorpo CLDN6 quimérico da invenção é administração de um invenção, em Que o administrado primeiro seguido pela anticorpo anti-CLDN6 humano da anticorpo anti-CLDN6 humano é administrado preferivelmente por tempo, isto é, como terapia
Os anticorpos um período prolongado de de manutenção.
conjugados, biespecíficas/multiespecíficas invenção podem ser utilizados moléculas e composições da presente em uma variedade de para inibir o crescimento de células sendo caracterizadas por associaçao que expressam de CLDN6 com métodos
CLDN6 e as suas superfícies celulares e/ou quo expressam CLDN6 e são matando seletivamente as células caracterizadas por associação de
CLDN6 com as suas superfícies celulares por contato das células com modo que o a a eficaz do anticorpo, conjugado, uma quantidade efica.
~o biespecífica/multiespecífíca, composição biesp célula é inibido e/ou a célula rescimento da morta. Em uma modalidade,
O método inclui matar a célula que expressa
CLDN6
CLDN6 com a sua superfície oor associação de caracterizada po opcionalmente na celular, presença de células efetoras, por exemplo, através de CDC, por apoptose, ADCC, fagocitose ou mais destes mecanismos. Células uma combinação de expressando CLDN6 dois ou sendo j3C. cor associação iO caracterizadas por de CLDN6 com suas superficies celulares, , inibidas ou que podem ser mortas usando anticorpos incluem células da invenção, inCJcancerosas.
conj ugados, moléculas
Anticorpos, 15 plespecifloas/multiespecificas invenção podem ser usadas para variedade de doenças que • odãc oor associaçao de rarterizaclas pojCLDN6 θ Sa° através da administração dos suas superfícies celulares atreve composições tratar e/ou envolvem as células da presente prevenir uma que expressam
CLDN6 com as anticorpos aos pacientes que > tais doenças, sofrem de tais
Exemplos de doenças que podem i- a-is (oor exemplo, ser tratadas ipo-<melhoradas) nâo estão limitadas, ou evitadas incluem, mas n numerals, que podem doenças tumorais. Exemplos de doen, tratadas „ r- a n c e r í.qena s, incluem doenças cancc tais como . · a» particular adenocarcinoma de câncer do ovário, em part
- câncer de pulmão, teratocarclnoma de ovarro, cano incluindo câncer do pulmão de pequenas células (SCLC) câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) , em particular carcinoma pulmonar de células escamosas adenocarcinoma, hepático, câncer gástrico, câncer de de pâncreas, cance mama, câncer câncer em particular o n carcinoma células basais e o ca de células carcinoma de . o-â-ncpr de cabeça melanoma maligno, cance pescoço, em escamosas, particular particular ί 4 r-pno sarcoma, adenoma pleomórfico ma carcinossarcoma, câncer carcinoma sarcoma sinovial , r câncer de bexiga, em especial· dueto biliar, cancer células de transição e car câncer de rim, carcinoma papilar' em do de em particular carcinoma de células renais inclurndo carcinoma de células renais de células claras e carcinoma de célula renal papilar, câncer de cólon, câncer de intestino delgado, incluindo câncer do íleo, em particular adenocarcinoma do intestino delgado e adenocarcinoma do carcinoma de carcinoma embrionário râncer cervical, câncer placenta, cancer testicular, seminoma ticular embrionário, f em particular , η „ p câncer m i-psticulâi teratoma tescx meri®, um tumor de célula câncer uterino, rrn um carcinoma um teratocarcinoma ou um célula germinativa . em particular um tumor de célula embrionário, em par germinativa, tal como do testículo, e as formas
Em outro aspecto, a metastáticas dos mesmos.
invenção se um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou distúrbio envolvendo células que expressam
CLDN 6 que sao caracterizadas por associação de
CLDN 6 com as suas administração do compreendendo a , u^soecitica/multiespecifica a ooniugado, molécula brespec anticorpo, congug preferéncia, a . da invenção a um indivíduo. De p ou composição da mv Ç em distúrbio é uma doença relacionada ao doenÇa ° é selecionada do grupo modalidades particulares, consistindo de cancer do orfícies celulares, superfícies ' π em particular de ovário, e111 u ovário, adenocarcinoma do ovário
Câncer de pulmão, incluindo , (SCLC) e câncer de pulmão de células (SCLU) teratocarcinoma do câncer de pulmão de células não (NSCLC) , em particular carcinoma pulmonar de pequenas pequenas células gástrico, câncer de rnnesr de ρθΐθτ hepático, câncer de pancrea , e o carcinoma de 'cular carcinoma de células em particul de cabeça e células escamosas, melanoma maligno, can.
s em particular adenoma pleomor 1
„.^aao. em t carcinossarcoma, escamosas e mama, câncer arcoma, adenocarcinoma, câncer maligno, em particular sarcoma sinovia .
câncer de bexiga, em partrcu.. dueto britar, cancer carcinoma de células transição carcinoma papilar, de η - carcinoma de célula renal rim, em particular incluindo o carcinoma de célula renal de células claras e carcinoma de célula renal papilar, câncer de cólon, câncer de intestino delgado, incluindo o câncer do ileo, em particular o adenocarcinoma do intestino delgado e adenocarcinoma do ileo, carcinoma embrionário testicular, coriocarcinoma de placenta, câncer cervical, câncer testicular, em particular seminoma testicular, teratoma testicular e câncer testicular embrionário, câncer do útero, um tumor de células germinativas, tal como um teratocarcinoma ou um carcinoma embrionário, em particular um tumor de célula germinativa do testículo, e as formas metastáticas dos mesmos. CLDN6 é de preferência expressa na superfície das ditas células.
A invenção pode envolver a utilização dos agentes e composições aqui descritos para um tratamento profilático e/ou terapêutico de doenças tumorais, isto é, para o tratamento de um paciente com uma doença tumoral, ou estando em risco de desenvolver uma doença tumoral. Em um aspecto, a invenção fornece métodos para inibir o crescimento tumoral compreendendo a administração de um ou mais dos agentes e composições aqui descritos.
De preferência, os agentes e composições descritos no presente documento são administrados de uma maneira tal que a substância terapeuticamente ativa não é distribuida ou não é substancialmente que enquanto ο distribuída a um tecido ou órgão, em tecido ou órgão está isento de expressam CLDN6 são caracterizadas pela ociação de CLDN6 com as suas superfícies celulares, tal tecido de placenta ou placenta. Para como tecioo e este fim, os e composições aqui agentes « descritos podem administrados localmente.
Em um aspecto, a invenção aqui descrito para utilização fornece um nos métodos anticorpo como
Τθ tratamento descritos no presente documento. Em uma modalidade, a invenção • ~ farmacêutica tal como aqui fornece uma composição descrita para utlllsagão nos métodos de tratamento agui descritos.
o indivíduo , -j ή dade particular da invenção, Em uma modalidade pa o anticorpo é adiolonalmente tratado 15 sendo administrado com í-oránico radiação ou com um agente quimioterapic , modula, por exemplo, estimula ou inibe.
atividade de um receptor Fc, por exemplo, como uma citocina.
g ama,
administração durante o
estimulador de colônias de
estimuiador de colônias de
CSF), interfer on-γ (iFN-γ)
(TNF) · Agentes terapêuticos
granulócitos de tratamento granulóciLos
um agente que
a expressão ou
um receptor Fc-
s típicas para
incluem fator
(G-CSF), fator
-macrófagos (GM-
tumoral incluem, entre outros, agentes antineoplásicos, tais como doxorrubicina, cisplatina, taxotere, 5-fluoruracil, metotrexato, gemzitabina e ciclofosfamida.
Em ainda outro aspecto, a invenção se refere a uma estratégia de imunização para imunizar animais não humanos, tais como camundongos, com CLDN6 humano ou um fragmento peptidico do mesmo para obter anticorpos. Peptideos preferidos para a imunização são aqueles selecionados do
grupo consistindo de SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO:
14 e SEQ ID NO : 15, e os peptideos imunologicamente
equivalentes .
Animais não humanos de tipo selvagem bem como
transgênicos podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida de antigeno CLDN6 ou um fragmento de peptideo do mesmo e/ou ácidos nucleicos e/ou células que expressam CLDN6 ou um fragmento peptidico das mesmas. De preferência, o animal não humano transgênico é capaz de produzir isotipos múltiplos de anticorpos monoclonais humanos para CLDN6 (por exemplo, IgG, IgA e/ou IgM) submetendo-se à recombinação V-D-J e comutação de isotipo. A comutação de isotipo pode ocorrer através de, por exemplo, comutação de isotipo clássica ou não clássica.
Assim, em ainda outro aspecto, a invenção íornece células B isoladas de um animal não humano, como descrito acima .
As células B isoladas podem então ser por fusão para uma célula fonte (por exemplo, um ~ „ ττί ς hibr i domas invenção, lais ins15 imortalizadas imortalizada para fornecer uma hibridoma) de anticorpos da isto é, que produzem anticorpos da invenção) são também incluídos no escopo da
Em um aspecto adicional, respeito aos métodos para invenção.
a presente diaqnóstico, invenção diz detecção ou monitoramento detecção e/ou de uma doença determinação células expressando CLDN6 associação de CLDN6 com as tumoral compreendendo da quantidade de CLDN6 ou sendo caracterizadas pela suas superfícies celulares em uma amostra biológica isolada de o aa Invenção. A amostra anticorpo da inverno um paciente utilizando um biológica pode ser isolada de um paciente com uma doença tumoral, sendo ter ou adoecer com uma doença tumoral ou tendo suspeito de um potencial para uma doença tumoral.
Em uma modalidade do detecção ou monitoramento de com a invenção, uma amostra controle/referência é de um ao tecido ou órgão que é se monitorado em relação ao af por exemplo, a doença tumora' monitorada é detectada ou método para diagnóstico, a uma doença tumoral de acordo biológica e/ou uma amostra de tecido ou órgão correspondendo rá diagnosticado, detectado ou etado por uma doença tumoral, 1 que é para ser diagnosticada, câncer de ovário e a amostra biológica e/ou amostra de controle/referência é o tecido do tecidos órgãos aqui descritos, por exemplo, juntamente com doenças tumorais e
Em uma modalidade dos métodos de diagnóstico, detecção monitoramento de uma doença tumoral, a amostra biológica é de » tecido ou órgão, em que as células, quando o tecido ou órgão está isento de tumores, não expressam substancialmente CLDN6 e não são caracterizadas por associação substancial de CLDN6 com as suas superficies celulares. Preferivelmente, o dito tecido é um tecido diferente do tecido da placenta.
Tipicamente, o nível de uma molécula alvo em uma amostra biológica é comparado com um nível de referencia, em que um desvio do dito nível de referência é indicativo da presença e/ou estágio de uma doença tumoral em um indivíduo. O nível de referência pode ser um nível tal como determinado em uma amostra de controle (por exemplo, de um tecido ou indivíduo saudável) ou um nível mediano de indivíduos saudáveis. Um desvio do dito nível de referência designa qualquer alteração significativa, tal como um aumento ou diminuição de pelo menos 10%, 20% ou
30%, de preferência de pelo menos 40% ou 50%, ou mesmo mais. De preferência, a presença de CLDN6 ou células expressando CLDN6 e ndo caracterizadas por associação de
CLDN6 com suas superfícies celulares na dita amostra ou uma expressam
CLDN6 e quantidade de CLDN6 ou sejam caracterizadas por células que associação de na amostra suas superficies celulares
,.,,,,,.,,....-.--..=.....,.1. ............. ----1 p/ou determinação a detecção e/ou
Tipicamente, a quantidade nos métodos da invenção envolve a utilizo anticorpos marcados que se liga™ especifícament
CLDN 6 com as de da de uma molécula alvo.
Em um aspecto particular, a invenção se refere a um método para ã detecção, isto a determinação da posição ou de uma doença tumoral, por exemplo, um tecido ou órgão particular, que da presente invenção compreende administrar que está acoplado paciente. A marcação de um detectável a um paciente no dito paciente pode indicar a presença n n-i-i-rh tecido ou órgão, tumoral no dito uma doença
Como podem ser um anticorpo um tecido de, ou marcador ou órgão risco de ivficado, os anticorpos aqui exempli ficado, da invenção mrtir de hibridomas que obtidos diretamente d psrtrr ou podem ser clonados e expressos de uma célula hospedeira • c u-ir-AÍ Outros exemplos célula linfociLica).
anticorpo, expressam forma recombinantc em (por exemplo, uma célula CHO, ou uma de hospedeiras são microrganismos, tars como E.
coli, e fungos, tais podem ser produzidos humano ou vegetal como leveduras. Alternativamente, eles de forma recombinante em um animal não transgêmcos.
No entanto, a presente invenção também prevê modalidades produzidos por imunização ou estratégias de imunização, um paciente.
A presente invenção nucleicos que compreendem nucleicos que codificam em que os anticorpos são vacinação como aqui divulgado também utilizando situ em aos ácidos genes ou sequências anticorpos ou partes i uma cadeia de anticorpo, como descrito exemplo, uma caueia documento. Os ácidos nucleicos um vetor, por bacteriófago ou por exemplo, de ácidos destes, por no presente podem estar compreendidos em exemplo, um outro vetor plasmídeo, cosmídeo, vírus, utilizado convencionalmente, em engenharia genetics.
O vetor pode compreender genes adicionais, tais que permitem a seleção do vetor em genes marcadores célula hospedeira adequada e sob oondrçdes adequadas. Além disso, o vetor pode compreender elementos de controle permitem a expressão adequada das regiões de de conhecidos expressão que adequados. Tais elementos de controle técnico podem incluir um promotor, um cassete de união e um códon de iniciação da tradução.
De preferência, Ί da invenção está ácido nucleico operativamente ligado o de controle de às sequências expressão acima, que permitem asseguram a expressão em
2r. em células a expressão
Elementos de controle que células eucarlóticas ou procarióticas são bem conhecidos pelas pessoas versadas na técnica.
Métodos para a
- , ί mc.· de acido He moléculas oe construção de nucleico de acordo com a presente invenção, Para a construção de vetores compreendendo as moléculas de ácido nucleico acima, Para introdução dos vetores em células escolhidas, hospedeiras alcançar a expressão são apropriadamente bem conhecidos para causar ou invenção se refere a Um aspecto adicional da presente 15 uma célula hospedeira compreendendo vetor, tal como divulgado no presen vantagens da um ácido nucleico ou documento.
presente
Outras características ,n serão evidentes a partir da invenção serau descrição detalhada e reivindicações.
breve descrição dos desenhos da sequência de CLDN3, Figura 1. Alinhamento da <ju
CLDN4,
CLDN6 e CLDN9. ~ soros . a 2 Análise por imunof luorescencra 9 a oara produzir anticorpos obtidos de camundongos imunizados P es (A)
CH0-K1 não fixadas cotransfectadas com codificam CLDN6 humana
GFP, pectlvamente, foram sondadas com um anticorpo monoclonal de camundongo anti-CLDN6 (R&D Systems,
MAB3656). CLDN6 está localizada na e pode ser membrana plasmatica das células transfectadas x cor anticorpos alvejada « células vivas P específicos· (B) Soro de um c hibridoma F3-6C3-H8 que que se ligam à CLDN6 na fixadas cotransfectadas amundonqo, com base no qual £oi produzido continha anticorpos superfície de células CHO-K1 não com ácidos nuclercos que codificam
CLDN6 e GFP humanas.
Figura 3. Análise expressão endógena de de Western proteínas blot para avaliar a claudina em células
HEK293T.
' as das células HEK293T transfectadas Lisados de proteínas da leicos que codificam CLDN3, CLDN4, CLDN6 e com ácidos nuclercos qu
CLDN9, foram testados nr, transfectados de forma simulada spectivamente, ou transro hinrt-incí utilizando anticorpos Western blotting , A anti-CLDN3 (A) omercialmente disponíveis
No .
(Zymed,
34-1700), anti-CLDN4(A) anti-CLDN9(A)
32-9400), anti λ- / -λ \ ΓΛΡP (31-8863) CLDN6(A) (Santa
17672). Os anticorpos detectaram a express ão dos seus alvos
6 correspondentes
HEK293T. Nenhuma claudinas foi apenas nos respectivos transfectantes expressão endógena de qualquer uma destas , am células HEK293T não observada em ceiuiao
Figura 4. Análise de citometria de fluxo para avaliar disponíveis.
A ligação disponíveis a nucleicos que anticorpos de anticorpos células HEK293T codificam CLDN3, anti-CLDN comercialmente anti-CLDN comercialmente transfectadas com ácidos
CLDN4, CLDN6
CLDN9, on não transfectadas foi determinada por respectivamente, ou nao rrans citometria de comercialmente
Figura 5.
fluxo. Apenas o anticorpo anti-CLDN3 disponível é especifico para o seu alvo.
Análise de citometria de fluxo para avaliar acordo com a invenção.
de anticorpos de
A ligação de anticorpos em sobrenadantes de subclones hibridomas monoclonais às células
HEK293T cotransfechadas
CLDN4 ou CLDN9 (A) hibridoma com um que codifica CLDN6, CLDN3, um vetor que codifica um marcador determinada por citometria de fluxo.
Anticorpos no sobrenadante do subclone ί F3-6C3-H8 se ligam especificamente monoclonal E3-bca uo s.
de de às transfectadas com CLDN6, mas não às células
CLDN3, CLDN4 e CLDN9, respectivamente. Ao transfectadas com subclone de os anticorpos no sobrenadante hibridoma monoclonal F4 4F1 F2 . 1 c células ligam as transfectadas com CLDN6 sobrenadante do subclone de ou
CLDN9. Anticorpos
n.nal F3-6C3-H8 hibridoma monoclonal células transfectadas com a van também se W* as (I143V)-SNP de CLDN6.
(B) Anticorpos Tonal F3-7B3-B4 se ligam hibridoma monoclonal no sobrenadante do subclone de às células transfectadas sobrenadante se ligam às oom CLDN6, CLDN3 ou CLDN9. do subclone de hibridoma células transfectadas com CLDN6,
Anticorpos no monoclonal
F3-3F7-A5
CLDN4 ou
CLDN9.
Figura
6.
de ligação de monoclonals anti-CLDN6 muMAB 59A, murxnos anti uum
60A,
61D, 64A, 65A, 66B e 67A.
enti-CLDNô às A ligação dos anticorpos
CLDN6, 3, 4, 9 humanas
Tnxm bnP (polimorf ismo de à variante I143V CLDN6 tometria de fl-^o nucleotideo utilizand° células foi analisada Por ( HEK293T expressando transitoriamente a claudina humana correspondente.
HEK293T foram fluorescência para íectadas (população Q1 θ - 02 e 04) . A concentração do Q3) e transfectadas (populagao Q2 i o com um marcador de cotransfectadas com distinguir entre anticorpos , foi a concentração utilizada foi que saturou a humanas
CLDN6 (25
A expressão das
CLDN6, 3, 4, 9
CLDN6-SNP(I143V) foi confirmada com anticorpos „r.i onais comercialmente monoclonal^ disponíveis contra claudina 6
-v (rsd Systems, humana \R“U r
Systems, MAB4620) e a Claudina
MAB3656), Claudina 3 humana (R&D humana (R&D
Systems, MAB
4219)· anticorpos π Afinidades Figura '· monoclonais murinos anti-CLDN6 muMAB 5 9 A,
60A,
61D, 64A, 10 65Ά, 66B e 67A.
Para determinar as afinidades relativas, a ligaçao dos anticorpos anti-CLDN6 à CLDN6 humana expressa de forma estável na citometria de fluxo.
ligação, a de células HEK293
No experimento concentração dos anticorpos foi analisada por de saturaçao de foi representada da intensidade
Unais FACS (mediana contra os sinais anticorpo que se graficamente \ Ά EC50 (concentração de fluorescência)· A Ebou ligação liga à metade dos sítios de calculada por regressão não espeeilicos muMAB 59A, 60A,
61D, de no ml ores de ECoO exibiram valores muito baixos ng/ml) saturação da ligação concentrações.
Figura 8.
Atividade equilíbrio) for anticorpos CLDN6
65A, 66B e 6'7A (EC50 de 200 500 alcançada em baixas da oltotoxicidade dependente do complemento (CDC) de anticorpo monoclonal mnrxno muMAB 59A, 60A, 61D,
A atividade CDC anti-CLDN6
64A, 65A, 66B de anticorpos utilizando um ensaio dependente de ATP endógeno dentro de células células CHO Kl foram tratadas 60A, 61D, 64A,
65Ά,
66B induziram e 67A.
anti-CLDN6 foi analisada luciferase para detectar não lisadas. Portanto, expressando de forma estável a CLDN6 humana com diferentes concentrações de muMAB 59A, 65A, 66B e 61A. MuMAB 59A, 60A, 61D, 64A, e 67A exibiram atividade CDC dose-dependente e
CDC em baixas concentrações.
Figura complemento CLDN6 muMAB (expressão
9. Atividade da citotoxicidade dependente do (CDC) de anticorpos monoolonais murxnos anti65A e 66B em células NEC8 e NEC8 LVTS2 54 reduzida de CLDN6) expressando CLDN6 endogenamente.
Os anticorpos anti-CLDNô muMAB
65A e 66B induziram CDC em células NEC8 especificidade de de uma maneira dose-dependente. A alvo de muMAB 65A e 66B foi provada pelo reduzida de CLDN6).
Uso de células NEC8 LVTS2 54 (expressão 10. Efeito terapêutico de muMAB 59A, 60A, 61D,
Figura
64A, 65Ά,
66B e
67A em um modelo tratamento usando camundongos enxertados com a linhagem de células tumorais NEC8 modelo usou xenoenxer Los
NEC8 expressando endogenamente CLDN6 em camundongo Nude-Foxnlnu atimicos. Comparado ao grupo de controle de salina, muMAB 59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B e 67A mostraram inibição do crescimento tumoral em camundongos enxertados com células NEC8.
Figura 11. Especificidade de ligação de anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A e 89A.
A ligação dos anticorpos anti-CLDN6 à CLDN6, 3, 4 e 9 humanas, respectivamente, foi analisada por citometria de fluxo utilizando células HEK293 expressando estavelmente a claudina humana correspondente. A concentração de anticorpo utilizada foi a concentração que saturou a ligação (25 pg/mL). A expressão de CLDN3, 4, 6 e 9 humanas foi confirmada com anticorpos monoclonais comercialmente disponíveis contra Claudina-3 humana (R&D Systems, MAB4620), Claudina-4 humana (R&D Systems, MAB 4219) e o anticorpo monoclonal murino CLDN6/9-reativo muMAB 5F2D2, respectivamente. O controle negativo foi realizado sob condições idênticas, sem o anticorpo primário.
Figura 12. Afinidades relativas de anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 chim AB 61D, 64A, 67A e 89A às células HEK293-CLDN6.
Para determinar as afinidades relativas, a ligação de anticorpos anti-CLDN6 à CLDN6 humana expressa de forma estável na citometria superfície de células HEK293 foi analisada por de fluxo. No experimento de saturaçao ligação, a concentração dos graficamente contra os sinais anticorpos foi representada FACS (mediana da intensidade
Ά EC50 (concentração de de fluorescência). a ncou liga a metade dos sitlos de ligação em calculada específicos
EC50 muito da ligação anticorpo que se equilíbrio) foi por regressão não para CLDN6 chimAB 64A baixos (EC50 de 450 a linear.
Os anticorpos e 89A exibiram valores de
600 ng/mL) e a saturaçao foi alcançada em baixas concentrações. CbimAB
67A e 61D apresentaram valores e médios (EC50 de 2300 ng/ml),
Figura 13. Afinidades monoclonais quimericos
89A às células NEC8.
Para determinar as anti-CLDN6 às baixos (EC50 de respectivamente.
relativas de anti-CLDN6 chimAB 61D, afinidades de ligação células tumorais que expressam
CLDN6 humana, a ligaçao a testicular NEC8 foi analisada anticorpos CLDN6 específicos valores de saturação da enquanto que médio (EC50 ligação foi chimAB 61D
1000 ng/ml) anticorpos
64A, 67A e de anticorpos endogenamente linhagem celular de câncer por citometria de fluxo. Os chimAB 64Ά e 89A exibiram baixos (EC50
600-650 ng/ml) e alcançada em concentrações baixas, e 67A apresentaram valores de EC50 de 1700 ng/ml) e elevado (EC50 de 6100 ng/ml), respectivamente .
Figura 14- Afinidades relativas de monoclonais quimérioos anti-CLDN6 chinAB 61D, anticorpos
64Ά, 67A e
89Ά às células OV90.
para determinar as afinidades de ligação de anticorpos anti-CLDN6 às
CLDN6 humana, ovário OV90 células tumorais que expressam cl foi anticorpos CLDN6 endogenamente ligação à linhagem celular analisada por citometria específicos chimAB
64A de câncer de de fluxo. Os
89A exibiram valores de EC50 muito baixos (EC50 de
550 a
600 ng/ml) e a saturação da ligação foi alcançada em baixas concentrações.
ChimAB 61D e 67A apresentaram valores de EC50 médios (EC5 de 1500 ng/ml e EC50 de 2300 ng/ml, respectivamente).
Figura 15. Atividade da oitotoxioidade dependente do complemento (CDC) de anticorpos monoclonais quxmerrcos anti-CLDN6 chimAB 61D, 64A
67A e 89A em células NEC8 com expressão reduzida e
A atividade CDC utilizando um ensaio
ATP endógeno no células NEC8 ectopicamente a células NEC8 tipo selvagem.
de anticorpos anti-CLDN6 foi analisada dependente de luciferase para detectar de células não lisadas. Portanto, tipo selvagem (NEC8 LVTS2 luciferase foram tratadas concentrações do chimAB 010, 64A, 07A e
NEC-8 chimAB 61D,
64A,
77) expressando com diferentes
89A. As
67A e 89A apresentaram atividade CbC de maneira dose-dependente enquanto que cora redução da expressão de CLDN6 (NEC8 nas células NEC 8
LVTS2 54) nenhum destes anticorpos induziu a lise resultado demonstrou as funções celular inespecífica. Este efetoras alvo especificas de chimAB 61D, 64Ά, 67A e 89A.
Figura 16. Atividade de celular dependente de anticorpo (ADCC) dos anticorpos monoclonais prices anti-C^E =— 6W, «A, 87A e 8SA » eêlulas , δΛ Ha expressão e NEC8 tipo selvagem.
NEC8 com redução da express
A atividade ADCC dos anticorpos antÍ-CLDN6 foi analisada utilizando um ensaio para detectar ATE endógeno no lisadas. Portanto, as células LVTS2 77) foram tratadas com chimAB 61D, 64A, 67A e 89A.
dependente de luciferase interior das células não NEC-8 tipo selvagem (NEC8 diferentes concentrações de
ChimAB 61D, exibiram atividade ADCC dose-dependente e mesmo em baixas concentrações de a especificidade alvo, anticorpo.
células NEC8 com expressão de CLDN6 estável (NEC8
LVTS2
54)
Figura 17. Efeito terapêutico de anticorpos
67Ά em um monoclonais murinos
64A, 67A e 8 9A induziram ADCC
Para demonstrar uma redução da foram usadas longo prazo anti-CLDN6 muMAB
61D, de
64A e modelo de xenoenxerto de tratamento inicial usando camundongos tumorais NEC8 .
enxertados com a linhagem de células modelo usou xenoenxertos de NEC8 expressando CLDN6 endogenamente em camundongos Mude Foxni atimicos. θ5 camundongos foram tratados durante 46 dias com anticorpos para
CLDN6. Após tratamento, crescimento tumoral foi monitorado durante 60 dias.
Mesmo após a interrupção rcraoia os camundongos tratados com da imunoterapia, antlcorPos monoclonais murinos muMAB 610,
64A e 67Ά não apresentaram qualquer crescimento tumoral.
Figura
18. Efeito dos anticorpos monoclonais murinos anti-CLDN6 muMAB 89A em um modelo de de tratamento modelo endogenamente de dispersão usando camundongos a linhagem de células tumorais NEC8 .
usou xenoenxertos de NEC8 expressando COOM6 nu -i+-í micos · Manchas em camundongos Nude-Foxnl atrmrco representam os volumes em diferentes intervalos durante xenoenxertos NEC8 em
Comparado com o grupo apresentou inibição do de tumores tratamento enxertados inicial de camundongos
Nude-Foxnlnu atímicos.
de controle crescimento rélulas NEC8(A)· enxertados com células tratados durante anticorpo c resc ime nto comparação de salina, tumoral em dias com PBS especifi tumora1 com muMAB 8 9A camundongos camundongos foram como co para CLDN6, respectivamente.
foi monitorado durante mais 51 dias.
Em η hp PBS, não houve tumores controle de uno, detectáveis em camundongos tratados com muMAB89A no final do estudo (B)·
Efeito terapêutico do anticorpo
Figura 19· murino anti-CLDN6 muMAB 64A em um modelo tratamento avançado usando linhagem de células tumorais cam.und.ongo s enxertados com a
Manchas de dispersão representam os volumes dos fforontes intervalos durante o tumores enxertados em drferentes to de xenoenxerto NEC8 avançado em camundongos tratamento de xe , imunoterapia com o antrcorpo antx 1() Nude-ΓοχηΓ” atimicos. A
CLDN6 monoclonal murmo do crescimento tumoral muMAB 64A apresentou uma inibrção de xenoenxertos sólidos de NEC8 em comparação tanto com o controle de salina.
anticorpo quanto
Figura 20. Efeito anticorpo modelo de camundongos
NEC8 .
com grupos de de dias após o enxerto, durante em longo prazo do anti“CLDN6 muMAB
64A em um usando linhagem de células camundongos foram tumorais tratados Com o anticorpo muMAB 64A
- π fní monitorado CLDN6. 0 crescimento tumora durante mais 49 (A) 0 . , mostrou sobrevida de sobrevida mosrr _ tratados com o anticorpo muMAB prolongada dos camundongos tratad
6 64A especifico para CLDN6 (B) .
de anticorpos
Figura
Efeito terd^um 61D 67 A e 89A, em anti-CLDN6 muMAB 610, de murinos anti . ,_^amento avançado usando
21.
πτη modelo de j_ células tumorais linhagem de cei camundongos
NECB .
atam os volumes de tumores Manchas de dispersão represe j o em diferentes
NEC8 enxertados
Hp xenoenxertos NEC8 tratamento de xen intervalos durante o avançados. Em comparaÇao a_rnle de anticorpo, 10 com os grupos de salina e contr cnesermento tumoral foi alcangada com antl-CLDN6 monoclonais murinos muMAB 610, 61A a inibição anticorpos do
89A.
de longo prazo de , 22 Efeito terapeu^
Figura . 67A • anti-CLDN6 muMAB biu, ____onais de murino anti avançado e 89A em um linhagem de células usando c—gos enfados com a tumorais NEC8.
fnram tratados .· a após o enxerto, os camundongos foram dias apos 'firos para CLDN6 específicos p muMAB 61D, 67A e
89A.
durante mais 49 dias
S anticorpos foi monitorado 0 crescimento tumoral for ,f.co de sobrevida mostrou O grafico (A) · sobrvida prolongada dos camundongos tratados cem os anticorpos específicos para CLDNfi muMAB 61D e 61A (B>· a..e,eo de anticorpos
Figura 23·
Efeito monoclonais de murino modelo camundongo s anti-CLDN6 muMAB 64A e de tratamento avançado com células NEC8 tipo selvagem e hec8 com uma redução esbãvel da expressão de CLDN 6
MuMAB 64A e 89A apresentaram efeito terapentreo aPe mfc8 tipo selvagem, mas nao camundongos enxertados com NEC8 trp ~ todos com células NEC8 com redução camundongos enxertado em em , . especificidade alvo dos expressão de CLDN6, demonstrando anticorpos m vivo.
Figura 24. Mapeamento de epitopo chimMAB 61D, 64A, 67A e 89A.
os mutantes de alanrna são denominados como „ mn oi icina de número , , tino selvagem ou g de número de resíduo tipo de alta resolução de nn caso de alanina tipo , , ti do selvagem , no de resíduo tipo
- idos são fornecidos no código de vagem, onde os aminoácidos sao
-cidos E35, G31, S39 e, possivelmente, letra única. Os aminoácidos h orimeiro domínio extracelular de
T33 do primevo
CLDN6 são importantes resíduo 140 para a interação com os anticorpos para CLDN6 chimAB
610, 64Ά, 67A quiméricos
89A. 0 a ligação de chimAB 89A e de chimAB 610 o Além disso, contribui para a ligação I1151 do segundo domínio a interação com chimAB 67A. Embora experimen o de CLDN6 contribui extracelular ue de imunofluorescência expressão de tendam confirmado a exp.
G49A, D50A, W51A, C54A mutantes de CLDN6 P23A, «OA, não apresentaram coloraçao de membrana. P°r este
C64A, ele motrvo, não Podemos exclurr a anticorpos com esses aminoácidos. No
- „ de nossos interaçao ae epítopo como é consistente com presente documento 5 identificado no θ peptídeos nossa estratégia de imunrzaçao , víd d-θ CLDN6.
domínio Loi
Figura 25. Alinhamento cadeia pesada de anticorpos de aminoácidos região variável de 10 para CLDN6 da invenção. hcdr3) As sequências de CDR OCDR1, HCDR do da destacadas por uma caixa. ^inoácidos a 26 Alinhamento das sequenei Fig d ia leve de anticorpos especifida região variável de cadeia 15 para CLDN6 da invenção.
q TrnR2 e LCDR3) estão ’nrias de CDR (LCDR1, LCDR
As sequências destacadas por «a caixa.
definição db tbbmos A fim de qua a Presente 20 prontamente compreendida, Definições adicionais são descrição detalhada.
primei r o .
de toda a
Ao longo deste r, oca ser mais invenção possa
r.o são definidos termos sau estabelecidas ao descritivo _ «up o contexto
- S cue se seguem, a menos que reivindicações q longo das contrário, compreende implicando a etapas, etapas.
a palavra compreender compreendendo , inclusão de ou etapa ou grupo um de mas ou
Os não a etapa exclusão ou grupo termos um' semelhantes utilizadas no de de variações serão entendidas membro estabelecido, membros, qualquer membros, e uma θ contexto de como como número números inteiros ou outro membro, número números descrição inteiros ou referências da invenção . +- „ Hee reivindicações) mmpnte no contexto das rei (especialmenre devem abranqer tanto o singular quant interpretados para abrang aaui indicado de outra forma ... rvno qpia aqui plural, a menos que sej seja claramente contradito pelo contexto.
ou de larxas de valores aqut é —e -negada a servir tr» um método abreviado de valor separado estando contrário no presente incorporado no individuaImente podem referlr_se individualmente a cada a faixa Salvo indicação em dentro da faixa.
i TTdinr individual é documento, cada valor , ripqrritivo como se relatório descririv citado apropriada, a menos que fosse aqui. Todos os métodos realizados em qualquer se-ja indicado de outra f o rma aqui ordem aqui, oll, de outra forma, claramente contradito pelo ou linquagem mucr um e todos os exemplos, utilização de quaiq tal como) aqui fornecida . - · q-vn Inor exemplo, exemplifícadora (por destina-se meramente me Ihor invenção não limitaçâo sobre o escopo da isenção apresenta uma limitaça noivrndicada. Nenhuma Iraquagem no interpretada como f Udo reivindicado essencial para a P elemento nao forma deve indicando de outra celató ri o qualquer rática da invenção.
. 'lia de proteínas que são os Claudinas são uma famiH ~ „ firmes, onde elas mais importantes das junçoe componentes mai harrpira paracelular estabelecem a barreira p que controla o fluxo de moléculas no espaço intercelular entre as células de um epitélio.
Claudinas são proteínas transmembranares que rodeiam a membrana , σ AC. extremidades vezes com ambas
N• η IncaliZcldâS Π O rminal e c-termmal loca citoplasma. A primeira alça extracelular consiste, » ^dia, de 53 aminoácidos, segunda de membros mais cerca de 24 aminoácidos. CLDN6 da família CLDN.
semelhantes
O termo claudina
CLDN9 são n aaui utilizado, significa CLDN, tal como aqu inclul CLDN6, CLDN9, «.0N4 e CLDN3. De
CLDN é uma CLDN humana.
termo
CLDN6 de preferência
à. CLDN 6 humana empreendendo uma sequência de ί — ν' El \J.m em particular, sequência de ácido aminoácidos da SEQ ID ácido nucleico
NO: 2 ou que que nucleico codifica codifica a sequência de
- · i o Hi SEQ ID NO: aminoácidos da como um ácido nucleico compreendendo a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 1 ou (ii) uma proteína que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8. A primeira alça extracelular de CLDN6 compreende de preferência os 5 aminoácidos 28 a 80, mais preferivelmente os aminoácidos 28 a 76 da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 ou a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8, tai como a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 7. A sequnda alça extracelular de CLDN6 compreende de 10 preferência os aminoácidos 138 a 160, de preferência os aminoácidos 141 a 159, mais preferivelmente os aminoácidos 145 a 157 da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 2 ou a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 8, tal como a sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID 15 NO: 6. As ditas primeira e segunda alças extracelulares formam, preferivelmente, a porção extracelular de CLDN6.
O termo CLDN9 de preferência se refere à CLDN9 humana e, em particular, a (i) um ácido nucleico compreendendo uma sequência de ácidos nucleicos que 20 codifica a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 9 ou (ii) uma proteína compreendendo a sequência de aminoácidos da
SEQ ID NO: 9. A primeira alça extracelular de CLDN9
compreende de preferência os aminoácidos 2 8 a 76 da
sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO: 9. A
segunda alça extracelular de preferência aminoácidos os aminoácidos mostrada na SEQ
141 a
ID NO:
CLDN9
159
9. As compreende de da sequência de ditas primeira e segunda alças extracelulares formam, referivelmente, porção extracelular de CLDN9.
termo
CLDN4 de preferência se um humana em particular, a uma sequência de ácidos compreendendo codifica a sequência compreendendo (11) uma proteína da SEQ ID
NO:
compreende de sequência de segunda refere à CLDN4 ácido nucleico nucleicos que ' · a d da SEQ ID NO: 10 ou de aminoácidos da SEO sequência de aminoácidos
10. a primeira alça preferência os aminoácidos mostrada alça extracelular preferência aminoácidos aminoácidos mostrada na SEQ imi ar de CLDN4 extracelular ue da aminoácidos na SEQ de
CLDN4
141 a
ID NO:
159
10.
As a
ID NO:
compreende da sequência de de ditas primeira e ί --Ί nrpq fo£rCLcirO-f segunda algas extracelulares extracelular de CLDN4.
de preferência, a porção termo
CLDN3 de refere
CLDN3 humana em particular, a um ácido nucleico
-cc·. o de ácidos uma sequencia nucleicos que compreendendo codifica a sequência de (:il) uma proteína compreendendo a sequene.ua da SEQ ID NO: 11. A aminoácidos da SEQ
ID NO: 11 ou de aminoácidos extrace lular de CLDN3 compreende de preferência os ammoacidos sequência de aminoácidos mostrada segunda alça extracelular de preferência os aminoácidos 140 a aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:
segunda alças extracelulares porção extracelular de CLDN3.
As sequências CLDN acima variantes variantes alélicas, a 7 5 da na SEQ ID NO: H- A
CLDN3 compreende de
158 da sequência de
11. As ditas primeira e formam, de preferência, descritas incluem das ditas sequências, em particular de união, conformações, isoformas, quaisquer mutantes, variantes variantes de espécies e homólogos de espécies, em particular aquelas que estão naturalmente presentes.
normal de obscuro.
atélica se refere a » alteração na sequência um gene, o significado da qual sendo muitas vezes identifica gene. Um sequência original sequenciamento genético completo frequentemente numerosas variantes alélicas para um determinado homólogo de espécie um ácido nucleico ou oerécie diferente da de aminoácidos com um P de uma determinada sequência de ácidos nuoleicos
- Ω termo CLDN deve englobar ou de aminoácidos. O rermc variantes de união de CLDN, as variantes de CLDN modificadas pós-traducionalmente, partioularmente incluindo tal como status de variantes com diferente glicosilação, de conformação de CLDN,
N-glicosilação, variantes (iv) as variantes de CLDN relacionadas com câncer e as nao relacionadas com câncer. De preferência, uma CLDN está presente na sua conformação nativa.
Verificou-se que CLDN6 é expressa, por exemplo, no câncer de ovário, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer da mama, câncer hepático, câncer pancreático, câncer de pele, melanomas câncer de cabeça e pescoço, sarcomas câncer do dueto biliar, câncer de células renais e cancer de bexiga. CLDN 6 é um alvo particularmente preferido para a prevenção e/ou tratamento de câncer do ovário, em particular adenocarcinoma do ovário e teratocarcinoma do ovário, câncer de pulmão, incluindo o câncer de pulmão de pequenas células (SCLC) e câncer de pulmão de células naopequenas (NSCLC), em particular, carcinoma e adenocarcinoma de pulmão de células escamosas, câncer gástrico, cancer de mama, câncer hepático, câncer em particular o carcinoma de pancreático, câncer de pele, células basais e o carcinoma de células escamosas, melanoma maligno, câncer de cabeça e pescoço, « particular adenoma pleomórflco maligno, sarcoma, em particular sarcoma slnovral e carcinossarcoma câncer do dueto biliar, câncer de bexiga em especial o , róinlas de transição e carcinoma papilar carcinoma de células uc scâncer de rim, em particular carcinoma de células renais incluindo o carcinoma de células renais de células claras e carcinoma câncer do de células renais pupilares, intestino delgado, incluindo o particular adenocarcinoma coriocarcinoma câncer câncer de cólon, do ileo, em adenocarcinoma do intestino delgado do carcinoma embrionário testicular, de placenta, câncer cervical, câncer testicular, em particular seminoma testicular, testicular e câncer testrcular embrionário, câncer um tumor de células germinativas, . tal carcinoma embrionário, em germinativas do testículo, teratocarcinoma ou um um tumor de células formas metastáticas.
teratoma como um particular as suas Em uma modalidade, a doença cancerosa d cs cT dn6 é selecionada a associada com a expressão de CLDD6 do grupo consistindo de câncer do ovário, câncer de câncer de metastático câncer de partir pulmão, pulmão metastático.
carcinoma ou
De preferência, câncer de ovário é um um pulmão é um preferência modalidade,
CLDN6 é uma adenocarcinoma.
De preferência, o câncer de carcinoma ou um adenocarcinoma, de ou câncer bronquiolar, adenocarcinoma célula élula de tal como carcinoma
Em uma bronquiolar.
tumoral associada com a expressão de tal câncer.
nnrcão refere se a O termo porpau uma fração.
No que diz respeito a uma estrutura particular como uma s equência de aminoácidos ou proteína, o termo porção do mesmo pode fração continua ou descontínua da dita designar uma uma sequência de
De preferência, uma porção aminoácidos compreende pelo menos 1 pelo menos 5%, pelo
Ί Ω θ- Ώθ1θ ΓΠθΠ-OS menos ItK Pex
20%, pelo menos
30%, de preferência ί mpnos 40%, de pelo menoto preferivelmente pelo menos 70%, ainda mais preferivelmente pelo _ ~ => nelo menos 50-s, preferência P preferivelmente menos 60%, mais preferivelmente menos 90% dos pelo menos 80% e aminoácidos da mais mais dita é uma . , ne preferência, se a porção de aminoácidos. De prei . a a dita fração descontínua é composta de 10 fração descontínua, a dita sequência
2, 3,
4, 5,
6, 7, 8 ou . Mrtes de uma estrutura, sendo mais parreo cada parte um elemento
- a da estrutura. Por exemplo, continuo da esia uma fração descontínua de uma sequência de aminoácidos pode composta de 2,
3,
4,
5,
6, 7,
Qr ou mais, de preferência, não mais do que partes da dita sequência de aminoácidos, em que cada parte compreende, pelo menos aminoácidos contínuos, preferivelmente, pelo menos aminoácidos contínuos, de preferência pelo menos aminoácidos contínuos, de pelo aminoácidos contínuos da preferência de aminoácidos.
equência menos
Os termos parLe fragmento são aqui utilitados e se refere.m a um elemento continuo, alternadamen . sequência rinrte de uma estrutura Lar eXemP1°' , ina se refere a um elemento contrnuo de aminoácidos ou proterna estrutura
_.ma parte ou um fragmento de da dita estrutura, «ma porcao, uma par de preferência uma ou mais uma estrutura compreende • dn dita estrutura. Por exemplo, uma propriedades funcionais da dit q narte ou um fragmento de porção, uma parte imunologicamente um epitopo ou peptideo é, de preferência, ou peptídeo do qual
O termo uma é derivado.
equivalente ao epítopo i η v dp uma CLDN , no porção extracelular de refere a uma parte de uma contexto da presente invenção, a o espaço extracelular de uma celu a , CLDN de frente para .
, i 3 nartir do exterior da de preferência, sende acessrvel a Par 'lula por exemplo, por anticorpos localiza o dita célula, pojda célula. De preferência, o termo alças extracelulares ou parte extracelular de específica para a dita compreende, pelo menos menos 15, pelo menos a uma parte uma
CLDN
CLDN .
5, aminoácidos ou
O termo a CLDN em nat uralmente mais.
CLDN se refere a uma ou mais delas ou qualquer outra que de preferência
Preferivelmente, a dita parte
r.c R pelo menos 10, pelo pelo menos «, peio
Rn nu oelo menos 50 menos 30 ou p^x
20, pelo com a superfície de uma relação à CLDN nativa, ser entendido em estado não desnaturado, dobrada. De preferência, de uma célula de preferência termo CLDN significa que a nssoei ada com .
' . cia<tó com e localizada na membrana plasmatron
CLDN esta associada oelo menos da dita célula, em que pel uma parte da CLDN, de do a porção extracelular, da dita célula da dita célula, por fica de frente para o e é acessível· a partir oor anticorpos exemplo, po-in fora da célula. A associação localizados fora oa i 3 associação pode indireta. Por exemple, a asse pode ser direta ou ser por um ou mais nrn3 ou mais transmembranares, com qualquer outr estrutura que pode domínios e/ou pela interação sacarideo ou outra foliolo externo da exemplo, pode ser integral ser uma através âncoras lipidicas proteína, iipideo, ser encontrada no de uma célula. Por membrana plasmatica
...Pínip de uma célula uma CLDN associada com a supe roteína „to é, uma protema uma proteína transmembrana, porção extracelular ou p a superfície de uma célula de membrana, tendo uma proteína associada com da interação com outra proteína que e uma proteína transmembrana.
_ annerficie de clM6 está associada 3 SUPe iocallsada ™ SUP«ficie da dtta anticorpos uma célula se célula e for ela estiver ligação por específicos para
CLDN 6 à célula.
adicionado , onr-qrteri zada sendo car.accci..
Em modalidades prefer idas, uma célula por sua superfície celular uma célula que xpressa CLDN6.
para entendido que, no em que
CLDN6 é pelas
Células, a CLDN6 • h com a superfície das associada com ditas . torção da CLDN6 expressa, células pode ser apenas um , a uma célula transportando uma CLDN sig
Ω termo uma . .a que a dita célula transporta uma CLDN na de preferencia, que sua superfície, isto ^nprfície da dita célula.
que a CLDN está associada com
Superfície celular ou utilizado de acordo com o seu e, assim, inclui o exterior superfície significado da célula e outras moléculas ligação por proteínas expressão CLDN expressa na . .. a mie a CLDN expressa significa que encontra em associação com a superfície célula expressa De acordo com a invenção, uma célula e associada expressão expressão placenta.
em com uma superfície e associação for de uma célula normal na técnica que é acessível a superfície de uma por uma célula da
CLDN 6 não e não da célula, dita célula.
substancialmente substancialmente menor em comparação com associação em células da placenta ou tecido
De menor do que 10%
0,5%, 0,1 de da ainda menos.
nível de expressão e de preferência menor do de que ou 0,05% da expressão células da placenta ou
De preferência,
CLDN 6 uma célula não nHh com uma superfície associada cem tecidos da placenta ou não é substancialmente ubstancialmente se nível de expressão ~ „ ωvprlp ο nível associaçao exceae em da placenta, de expressão e de tumorigênico por não mais ou do canceroso, que 2 vezes, de preferência 1, expressão e de não cancer expressa associada expressão para de associação em com preferência não no dito tecido De preferência, CLDN6 não uma célula e não esta excede o nível de não tumorigênico, substancialmente substancialmente uma superfície celular, ou associação está nível de expressão permitir a ligação por se o nível de abaixo do limite de detecção ou associação é muito baixo anticorpos específicos para
CLDN6 adicionados às células.
De célula acordo com a invenção,
CLDN 6 expressa em uma de está associada com expressão e de uma superfície da célula, associação excede de expressão canceroso do gue 2 ou e de associação em tecido não tumorigênico, não exceto vezes,
10000 uma célula nível de limite tecido da placenta, de preferência em mais de preferência 10 vezes, 100
1000 vezes. De preferência, CLDN6 e :á associada com uma superfície expressão e detecção e/ou de se expressa celular, nível de expressão suficientemente em para permitir do de para
CLDN 6 adicionados células. De preferência, a CLDN6 ecressa ou exposta na superfície membrana célula.
dentro expressa em uma célula da dita célula.
aos microdomrníos de ipd-erol localizados rlcos em esfingolipídeos e cole membrana plasrtótlca de uma do de foliolo externo da , . , m oertas proteínas de capacidade de cerra y domínios e a capacidade de formação de «egregados» ou ’agregados focais- pode afetar proteína. Por exemplo, a translocaçao de moléculas a função
CLDN6 da em m gerem ligadas p°u estruturas, depois de serem anticorpos da de complex03 plasmáticas.
anticorpo de meio dos presente invenção, uma elevada densidade membranas antígeno-anticorpo de CLDN6 Tal densidade elevada de complexos
...r a ativação eficiente do
CLDN6 pode permitir antigenodurante CDC.
termo doença se refere sistema complemento De acordo com a invenção, z . incluindo câncer, em particular qualquer estado patologico, mclum câncer aqui descritas.
aquelas formas de cancer
Doenças que envolvem as células que expressam CLDN6 e , rv.rnrterizadas pela sendo caracLcix de
CLDN6 com as suas oiu.ves significa, de superfícies celulares acordo com a invenção, células de quo a expressão e associação em
He oreferência, aumentada em órgão doente e, de prelo um tecido c ompa r a ç ã o ou com rerido ou órgão saudavel. estado em um tecido
Um aumento refere a um aumento de pelo menos 10%, em particular de pelo menos 20%, pelo menos 50%, pelo menos 100%, pelo menos 200%, pelo menos 500%, pelo menos 1000%, pelo menos 10000-6, ou mesmo mais. Em uma modalidade, a expressão e associaçao com a superfície celular é encontrada apenas em um tecido doente, enquanto que a expressão em um tecido saudável é reprimida. De acordo com a invenção, as doenças associadas com as células que expressam CLDN6 e sendo caracterizadas pela associação de CLDN6 com as suas superfícies celulares incluem doenças tumorais, tais como doenças cancerígenas. Além disso, de acordo com a invenção, doenças tumorais, tais como doenças cancerígenas, de preferência são aquelas em que as células tumorais ou células cancerosas expressam
CLDN6 e são caracterizadas pela associação de CLDN6 com as suas superfícies celulares.
Como utilizado no presente documento, uma doença tumoral, doença relacionada com o tumor ou doença tumorigênica inclui uma doença caracterizada por crescimento celular regulado de forma aberrante, proliferação, diferenciação, adesão e/ou migração, o que pode resultar na produção de ou tendência para produzir tumores e/ou metástase de tumor. Por célula tumoral se entende uma célula anormal que cresce por uma proliferação celular descontrolada e rápida e continua a crescer mesmo após os estímulos que iniciaram o novo crescimento terem cessado.
Por tumor se entende um grupo anormal de células ou um tecido que cresce por uma proliferação celular rápida e descontrolada e continua a crescer após os estímulos que iniciaram o novo crescimento terem cessado. Os tumores mostram falta parcial ou completa da organizaçao estrutural e coordenação funcional com o tecido normal, e geralmente formam uma massa distinta de tecido, que pode ser benigna, pré-maligna ou maligna.
De preferência, uma doença tumoral , doença relacionado com tumor ou doença tumorigênica, de acordo com a invenção, é uma doença cancerígena, isto é, uma doença maligna e uma célula tumoral é uma célula cancerosa. De preferência, uma doença tumoral, doença relacionado com tumor ou doença tumorigênica é caracterizada por células expressando CLDN6 e sendo caracterizada pela associação de CLDN6 com suas superfícies celulares e uma célula tumoral expressa CLDN6 e é caracterizada pela associação de CLDN6 com a sua superfície celular.
Uma célula que expressa CLDN6 e sendo caracterizada por associação de CLDN6 com a sua superfície celular, de preferência é uma célula tumoral ou célula cancerígena, de preferência dos tumores e cânceres aqui descritos. De
4 preferência, tal célula célula placentária.
Doenças cancerígenas com a invenção, são câncer de ovário, em teratocarcinoma de câncer de pulmão de ou pulmão de carcinoma células de pulmão uma célula diferente de uma cânceres preferidos, de acordo consistindo de selecionados do grupo adenocarcinoma de ovário particular ovário, câncer de pulmão, pequenas células (SCLC) e não pequenas (NSCLC), em de células escamosas câncer gástrico, câncer de mama, câncer incluindo câncer de particular e adenocarcinoma, hepático, câncer pancreático, câncer de pele, célula basal maligno, câncer em particular carcinoma de carcinoma de célula escamosa, melanoma de cabeça e pescoço, em particular adenoma , r1 iωπο, sarcoma, em pleomorfico maligno, particular sarcoma sinovial e de bexiga, carcinossarcoma, em particular transição e carcinoma câncer do dueto biliar, câncer o carcinoma de células de iiar câncer de rim, em particular carcinoma papilar, cance de célula renal incluindo carcinoma carcinoma celular papilar renal, renal câncer de de cólon, câncer do intestino delgado, incluindo o câncer do em particular adenocarcinoma do intestino delgado e ,, íleo, carcinoma adenocarcinoma do n embrionário testicular, c o r i o c a r c1n oma
4-' · câncer cervical, câncer placentario, canccx
-i- c.cr i cular, teratoma seminoma testicular, testicular e câncer testicular embrionário, câncer uterino, um tumor de células germinativas, tal como teratocarcmoma ou um carcinoma embrionário, em particular um tumor de células germinativas do testículo, e as suas formas metastátleas .
Os principais tipos de cânceres de pulmão são ο carcinoma de pulmão de pequenas células (SCLC) e ο carcinoma de pulmão de células não pequenas (NSCLC).
Existem três subtipos principais de carcinomas de pulmão de células não pequenas: carcinoma de pulmão de células escamosas, adenocarcinoma e carcinoma pulmonar de células grandes. Adenocarcinomas representam aproximadamente 10% dos cânceres de pulmão. Este câncer geralmente é visto perifericamente nos pulmões, ao contrário do cancer de pulmão de pequenas células e do câncer de pulmão de células escamosas, em que ambos tendem a ser localizados mais centralmente.
Câncer de pele é um crescimento maligno na pele. Os cânceres de pele mais comuns são câncer de célula basal, câncer de célula escamosa e melanoma. O melanoma maligno é um tipo grave de câncer de pele. Ocorre devido ao crescimento descontrolado de células de pigmento, chamadas mclanócitos.
De acordo com a invenção, um carcinoma é um cancer r-Awada de revestimento (células que começa na camada dos órgãos .
Carcinoma bronquiolar , , ser derivado acredita-se ’ om ΠΊ1Θ O t0CÍdO terminais, ona que epiteliais) é um carcinoma do do epitélio de neoplásico pulmão, que bronquíolos estende ao longo . ivpoiares e cresce em pequenas das paredes alveoiares m npHcm ser demonstradas dos alvéolos. Mucma podem ser células no material células desnudas.
Adenocarcinoma é glandular. Este tecido massas dentro em algumas das nos alvéolos, que um maior de tecido, conhecida outros tecidos
O epitélio endoderma e também inclui câncer que se origina no tecido também parte de uma categoria como tecido epitelial. 0 tecido glândulas uma variedade de que revestem as cavidades e órgãos do corpo, derivado embriologicamente do ectoderm, ser classificado como mesoderma. Para adenocarcinoma, as células não precisam necessariamente fazer parte propriedades humanos.
de uma glândula, contanto que elas tenham
Esta forma de alguns mamíferos superiores, carcinoma pode incluindo seres bem diferenciados tendem Adenocarcinomas bem , r cio derivados, lhar^se ao tecido glandular de que sae assemelhar oe embora os pouco diferenciados não possam. Ao
Células de uma biépsia, u» patologista irá determinar tumor é um adenocarcinoma ou
ZÀdenocarcinomas podem surgir algum outro tipo em muitos devido á natureza ubiqua das
Embora cada substância, tecidos de câncer.
do corpo, glândulas dentro do corpo.
glândula pode não uma vez que existe uma mesma função exócrina para a forma maligna célula, ela e considerada glandular e sua portanto, chamada adenocarcinoma. Adenocarcinomas malignos invadem outros tecidos e muitas vezes fazem metástase, dado tempo inclui suficiente para fazer isto.
adenocarcinoma de tipo mais comum de carcinoma
Ele adenocarcinomas adenocarcinoma endometrióide.
mucinosos, de células claras e adenocarcinoma
Cistadenocarcinoma epitelial-estromal de uma forma superfície, um maligna de um tumor tipo de câncer de orai teliais-estromais
Tumores epiueiia de superfície são uma pasmas de ovário que acredita-se que sejam classe de neoplasmas derivados do epitélio da modificado) ou do tecido da trompa de superfície do tecido endometrial ectopico ou (tubário). Este grupo de
Falópio tumores representa a maioria de todos os tumores de ovário.
Teratocarcinoma se refere um tumor de células germinativas que e uma mistura de teratoma com carcinoma embrionário, com coriocarcinoma, a nm câncer maligno Coriocarcinoma e um cano agressivo, geralmente da placenta.
disseminação hematogênica precoce
Um sarcoma é um câncer do ou com ambos.
trofoblástico
Ele é caracterizado pela para os pulmões.
conj untivo osso, nmrdura) , resultando em cartilagem, goraura;, proliferação n Tsto é ao contrário dos carcinomas, que são mesoderma. isto e a origem câncer epitelial. Um sarcoma sinovial que geralmente ocorre perto braço ou perna. Ele
Carcinoma de de células é um câncer é uma forma rara das articulações um dos sarcomas dos tecidos moles.
do de de do células renais, também conhecido como renais ou renal que se túbulo contorcido proximal, que filtram
Carcinoma de câncer renal sangue e célula adenocarcinoma de células origina no revestimento do tubos muito pequenos no rim removem produtos residuais.
renal é de longe o tipo mais comum de em adultos e mais letal de todos os tumores genitourinários. Subtipos distintos de carcinoma de células renais
Hes célula renal papilar. arcinoma oe cciuia carcinoma de células de células claras e
Carcinoma de célula j r1aras é a forma mais comum de carcinoma renal de células claras ear de célula renal. Quando vistas sob células qUe, compõem o carcinoma de um microscópio, células renais as de células claras pa recem muito pálidas ou claras
Carcinoma de células renais papilar
Zstes cânceres formam (chamadas papilas) em tumores.
Um derivado tumor de es é o segundo subtipo mais pequenas projeções alguns, não na células germinativas comum.
tipo dedo maioria, dos um neoplasma • Ativas Os tumores de células de células germinativas.
tumores cancerosos ou nao podem ser tumores germinativas . ocorrem dentro
Células germinativas non , . A e testículos) . Tumores de células das gônadas (ovários e cancerosos.
rminativas que se originam fora das gônadas (Por exemplo, nclve- em fetos, bebês na cabeça, dentro da boca, pescoço, crianças pequenas são mais frequentemente encontrados linha média do corpo, principalmente na ponta do
- i-t-ns resultantes de erros podem ser defeitos congênitos desenvolvimento do embrião.
As duas classes principais de tumores de cóccix) durante células s são os seminomas e não-seminomas, germinativas sao em que os carcinoma não-seminomas incluem:
saco vitel-ino, embrionário, tumores do .
teratocarcinoma, coriocarcinoma e . , . maioria das linhagens celulares de teratoma diferencrado. Λ marorr u equivalentes aos não-seminomas sao egu carcinomas embrionários, elas São compostas quase inteiramente de células tronco que não diferenciam em condições basais, embora . r a indutores de diferenciação, tal algumas possam respond como o ácido retinóico Por metástase se entende
A formação depende do primário, membranas corporal sangue a propagação de células lugar original para outra de metástases é desprendimento basais um de parte do corpo.
processo muito complexo células malignas do tumor da matriz extracelular, penetração das γ- na cavidade endoteliais para e vasos para, em seguida, serem transportadas pelo crescimento infiltrarem angiogênese.
remoção do componentes metastático acordo com de um novo
A metástase que se ~ 3ivn Finalmente, o os órgãos alv tumor no tumoral ocorre tumor primário porque podem permanecer e
Em uma modalidade, invenção, se relaciona com uma tumor primário do como
As células exemplo, que, fígado, tumor anormais, alvo depende da geralmente após a as células desenvolver refere metástase tumorais ou potencial tSíinO ΓΠ.Θ t3 St â S Θ i sistema linfonodo de um tumor no tumor não metástase distante , que está afastada regional.
secundário ou original. Isto câncer de ovário fizer secundário é composto do de células hepáticas chamado de fígado é não de câncer hepatico.
câncer de metastático significa, são por metástase para o de células ovarianas anormais. 0 tumor ovário metastático, no ntende a administração de Por tratamento se ent
Hescrito a um sujeito, a ι-o ou composição como aqui
COmpOStO OU CUiiihfim de prevenir ou elimrnar uma doença, incluindo a redução do tamanho de um tumor ou número de tumores em um
Indivíduo;
retardar interromper ou uma doença em um a r o desenvolvimento de uma nov inibir ou retardar o desen ·Γ a frequência ou severidade um indivíduo; diminui em um indivíduo que , , e/ou recorrências dos sintomas e/ p uá teve anteriormente uma atualmente tem ou que ga indivíduo;
doença em doença;
10 e/ou prolongar, isto aumentar a expectativa de vida do indivíduo.
termo _ de uma doença inclui tratamento de umcl a cura, redução da inibição da orevenção, diminuição ou duração, melhoria,
- ou agravamento, ou prevenção progressão ou agr n dos sintomas da mesma, doença ou dos ·! ní r*l Ω cis 15 re“r risoo„ se entende um indevida tsto identificado como tendo «« stance
Por estando em um paciente, que e da normalidade acima oa de desenvolver uma doenç em câncer em comparação com a população em geral. Além um indivíduo que tenha tido, ou que tem câncer, θ um atualmente uma doença, indivíduo que tem maior doença, uma vez que ivcr uma doença, desenvolver uind particular para o desenvolvimento de indivíduo pode contrnuar indivíduos que atualmente têm, ou em um uma que t ive r am câncer também têm um risco aumentado para câncer.
termo imunoterapia Um tratamento que envolve uma reação imune presente invenção, termos especifica.
proteger, como No contexto da prevenir , „ _ referem a ou protetor se ha ocorrência e/ou ~o ou tratamento ou ambos, prevenção ou propagação de imunoterapia profüático' , preventivo z , η termo nm indivíduo. u um tumor era no contexto da presente à imunização do tumor ativo iO de preferência, a imun a Ai- r-A de uma tumor. Uma administração pro i administração profilâtioa da preferência protege do crescimento tumoral- Uma uma imunoterapia, P°r terapêutica da composição da por exemplo, uma invenção, de desenvolvimento terapêutica de administração invenção se refere, vacinação do imunoterapia, composição da receptor do administração exemplo, invenção, do tumor.
uma pode à inibição do progresao/crescimento 1CTa -o do progresao/ctoaoimento a desaceleração do P
Isto do compreende tumor, om tumor, Que
Ha progressão do particular -a interrupção leva à eliminação do tumor, preferencialmente leva P imunoterapia pode ~ μ ή de uma uma administração terapêutica indivíduo, por exemplo, da disseminação ou metástaso de tumores já existentes
O termo imunização ou vacinação descreve processo de administração de antigeno a um indivíduo com a finalidade de induzir uma m γλύ~ razoes resposta imune po terapêuticas ou profiláticas.
Os termos indivíduo, , organismo ou individual , paciente são usados indistintamente e referem aos vertebrados, de n-orns. Por exemplo, preferência aos ma mamíferos, no t to da presente invenção são seres contexto oa p humanos, prlmatas não humanos, animais domesticados tans
r. Cães, gatos, ovelhas, como caes, c,ohrôSr pOlCOSf bovinos, cabras, n q etc , animais de cavalos, e / · + ί s corno laboratorio tai ' j; ΐ, ptc. i bem , ratos, coelhos, porquinhos-da-indra, camundongos, moA de zoológicos. 0 . · cativeiro como animais como animais art inclui também os seres animal, como aqui utalizado, mclu termo animai , , rambém incluir um indivíduo pode também c O termo ιηαινχ humanos. o o i-cz nm ser humano i oreferivelmente um sei . ..to é, um animal, preier paciente, i associada com a de preferência uma doença asso com uma doença, m doença tumorigênica O da CLDN6, de preferência uma expressão da cuui tal como um câncer.
O termo adjuvante se refere compostos que mqnosta imune. A ficam ou aceleram uma resposu prolongam ou rntensrl h nrpferencia o da presente invenção de pre. composição da p.
adjuvantes.
patente pode
Adjuvantes compreendem um adição de . -p do presente pedido de composição do Ρ qualguer conhecido.
seu
Ainda assim, a conter grupo heterogêneo de compostos tais como emulsões de óleo (por exemplo, adjuvantes de Freund), compostos minerais (tais como alúmen), produtos bacterianos (tal como a toxina de Bordetella pertussis), lipossomas e complexos imunoestimulantes. Exemplos de adjuvantes são monotosforillipídeo A (MPL SmithKline Beecham). Saponinas, tais como QS21 (SmithKline Beecham), DQS21 (SmithKline Beecham; WO 96/33239) , QS7, QS17, QS18 e QS-L1 (So e col., 1997, Mol. Cells 7: 178-186), adjuvantes de Freund incompletos, adjuvantes de Freund completos, vitamina E, montanide, z η <~< i iz η rx o col 3.595» Nsturê alúmen, oligonucleotideos CpG (Krieg e co . ,
374: 546-549), e várias emulsões água-em-óleo, que sao preparadas a partir de óleos biologicamente degradáveis, tais como o esqualeno e/ou tocoferol.
De acordo com invenção, uma amostra pode ser qualquer amostra útil de acordo com a presente invenção, em particular uma amostra biológica como amostra de tecido, incluindo fluidos corporais e/ou uma amostra celular, que pode Ser obtida da maneira convencional, tal como por biópsia de tecido, incluindo brópsra Por punção, e tomando amostra de sangue, aspirado brônqurco, escarro, urma, fezes ou invenção, outros fluidos corporais. De termo amosLra biologica acordo com a também inclui fracções de amostras biológicas.
Ae refere a uma glicoproteina que O termo anticorpo' se refere compreende pelo cadeias inclui ligação leves (L) qualquer menos duas cadelas pesadas e duas interconectadas por pontes dissulfeto, e molécula que compreende uma porção de ao antigeno do anticorpos monoclonais mesmos, incluindo, sem mesmo. 0 termo anticorpo inclui e fragmentos ou derivados dos limitação, anticorpos monoclonais anticorpos monoclonais humanizados, anticorpos humanos, anticorgu ' Anticorpos de cadeia simples, por monoclonais quiméricos, anttcorpo exemplo, scFv e fragmentos de anticorpo antigeno como formss anticorpos glicosilados ao antigeno c FAb e Fab' e inclui também todas fragmentos Fab e recomblnantes de anticorpos, Por exemplo,
Acs em procariotos, anticorpos não expressos em c , o Hp Anticorpo de ligação e quaisquer fragmentos de anticorp e derivados, como aqui descritos. Cada cadeia variável da cadeia pesada pesada é composta por uma região (aqui abreviado como VH) e uma região constante da pesada. Cada cadeia leve é composta por uma de cadeia leve (aqui abreviada como VL) regiões VH e de cadeia região variável uma região
VL podem ainda subdivididas em regiões de 1nhiΊ i dade chamadas hipervariabiiiouue, de determinação intercaladas com regiões que são mais de complementaridade (CDR), conservadas, chamadas
Cada VH e VL é composta por de regiões de estrutura ,· o-ι ,-, do terminal amino para três CDRS e quatro FRs, dispostos perminal carbóxi
FR3, CDR3, FR4 .
leve contêm um na seguinte ordem: FR1,
As regiões variáveis das domínio de ligação que
CDR1, FR2, CDR2, cadeias pesada e interage com um nstantes dos anticorpos podem mediar antígeno. As regiões const t-pcidos do hospedeiro ou a ngação da imunoglobulina aos tecido incluindo várias células do õur.vrqc.', e o primeiro exemplo, células efetoras) sistema complemento clássico.
fatores, De acordo com a invenção, o termo sistema imune (por componente (Clq) do pelo menos uma das de preferência pelo
- CDR significa o v sequências iuk dPouências de CDR de uma οπρ3 O termo sequenoi sequencia CDKD· refere a CDR1, CDR2 anticorpo de prei« cadeia pesada ou cadeia leve de De acordo com a invenção, um anticorpo.
uma referência a sequência de anticorpo compreendendo uma
CDR3 particular significa como uma sequencia CDR3 pa c CDR particular forma a região CDR, sequência CDR partregião CDR3 da dita
CDR consiste da dita menos cadeia e CDR3 de da uma cadeia
CDR particular tal que tal a dita como a da região
CDR, cadeia de sequência tal como anticorpo, anticorpo, isto
CDR particular, região ou forma uma a região CDR3 da dita cadeia . .. cnp compreende a diía a região CDR comp.
sequência CDR particularSe de acordo com a invenção for anticorpo que compreende uma cadeia pesada particular de e/ou uma cadeia leve particular de anticorpo, tal como uma cadeia compreendendo sequenc é preferível que ambas as cadeias pesadas ambas as cadeias leves ooriü uma composta da do anticorpo segam, cada adeia pesada particular de
O termo molécula com particular de anticorpo anticorpo.
anticorpo humanizado e/ou da cadeia leve refere a uma a antigeno substancialmente derivado de ligação de uma imunoglobulina que é de uma era que a estrutura de imunoglobulina espécie não humana, em qu restante da sequência de molécula é baseada na uma imunoglobulina humana.
estrutura e/ou na de ligação variáveis completos pode compreender domínios domínios constantes ou apenas as regiões de . açâo de complementaridade (CDR) enxertadas em determinação oe ao antigeno fundidos em • U α nos domínios variaveis. de estrutura apropriadas regiões de envcá ti os de ligação a antigeno modificados por por exemplo, imunoglobulinas formas de camundongo uma ou mais modificados humanas de podem ser de tipo selvagem ou de aminoácidos, substituições para forma mais assemelhar com
Algumas •73dos preservam todas humanizados pjqnti corpo humanizado
COR (por exemplo, um antrcorp anticorpos que contém todas
CDRs do anticorpo de de camundongo) . Outras formas têm uma ou mais CDRs que são alteradas em relação ao anticorpo original.
O termo anticorpo quimérico se refere àqueles anticorpos em que uma porção de cada uma das sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve é homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencentes a uma classe particular, enquanto que o segmento restante da cadeia é homólogo às sequências correspondentes em outra. Tipicamente, a região variável das cadeias leve e pesada mimetiza as regiões variáveis de anticorpos derivados de uma espécie de mamíferos, enquanto que as porções constantes são homólogas às sequências de anticorpos derivadas de outra. Uma vantagem evidente para tais formas quiméricas é que a região variável pode ser convenientemente derivada de fontes atualmente conhecidas usando células B ou hibridomas prontamente disponíveis de organismos hospedeiros não humanos em combinação com regiões constantes derivadas de, por exemplo, preparações de células humanas. Embora a região variável tenha a vantagem da facilidade de preparação e a especificidade não ser afetada pela fonte, a região constante sendo humana, é menos provável de extrair uma resposta imune a partir de um indivíduo humano, quando os anticorpos são injetados do que seria com a região nartir de uma fonte não humana. No entanto, constante a partir definição não está limitada porção de simplesmente, aqui utilizado, anticorpo que especificamente se refere ligação xemplo particular.
ao antigeno de um porção a um ou retém a a um antigeno.
de ligação ao antigeno de um de ligação), tal como mais fragmentos capacidade de se
Foi demonstrado que a de um ligar função anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de
Exemplos de fragmentos de ligação porção de fragmentos domínios comprimento total.
englobados no termo ligação ao antigeno de um anticorpo incluem (i)
F3.b f £3CjnientOS
VL, VH, CL fragmentos bivalentes ligados por uma ponte que monovaientes que consistem de
CH;
compreendem dissulfeto na (iii) fragmentos consistindo dos fragmentos Fv braço de um (1989) Nature
VH ;
isolada isoladas ligante fragmentos F(ab ) dois fragmentos Fab região de dobradiça;
Fd consistindo dos dominios domínios VL e anticorpo, (CDR) e
VH e CH;
VH de um fragmentos dAb (Warde único que consistem de nm dominio de determinação combinações que podem, opcionalmente, de complementaridade de duas ou mais CDRs ser unidas por um sintético. Além disso, embora os dois domrnios do fragmento I'v< ^L
VH, sejam codificados por genes separados, eles podem unidos, utilizando métodos tecombinantes, por um ligante sintético que permite que sejam feitos como uma cadeia de proteína única em que as
VL
VH pareiam para formar moléculas monovalentes (conhecidas como cadeia única Fv (scFv); ver, por exemplo,
Bird e col. (1988) Science 242: 423-426; e
Huston e col. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 5879
5883). Tais anticorpos de cadeia simples também se destinam a serem englobados no termo porção de ligação ao antigeno de um anticorpo. Outro exemplo são as proteínas de fusão ao domimio de ligação de imunoglobulina, compreendendo (i) um um dominio de ligação ao polipeptideo que é fundido a polipeptideo da região de dobradiça da imunoglobulina, uma região constante CH2 da cadela pesada de imunoglobulina fundida à região de dobradiça, uma região constante
CH3 da cadeia pesada de imunoglobulma constante CH2. O domínio de ligação fundida com a região ao polipeptideo pode ser uma região variável da cadela pesada ou uma região variável da cadeia leve. As proteínas de fusão aos domínios dc ligação da imunoglobulina são adicionalmente divulgadas cm US 2003/0118592 e US 2003/0133939.
fragmentos de anticorpo
Obtidos Utilizando técnicas convencionais conhecidas pelas versadas na técnica, o fragmentos são testados quanto à utilidade da mesma maneira que os anticorpos intactos.
termo epítopo refere a um determinante antigênrco em uma molécula, isto é, à parte que é reconhecida pelo sistema imune, por reconhecida por um anticorpo. Por exemplo, em uma molécula exemplo, que é os epitopos são
e. aí c.-rolns de um antigeno, que são tridimensionais discretos oe reconhecidos pelo sistema imune
No contexto da presente ~ o eoitopo é preferencialmente derivado de invenção, o epiwpu c proteína CLDN.
agrupamentos de moléculas, uma
Epitopos consistem geralmente superfície quimicamente como aminoácidos ou cadeias de ativos laterais de de açúcar e geralmente têm tridimensionais especificas características estruturais bem como características de carga específicas.
conformacionais primeiro, solventes como CLDN
Epitopos conformacionais são distinguidos em que a ligação não ao mas não ao último, é perdldã na presença de de desnaturação. Um epltopo de uma proteína, tal compreende de preferência uma porção contínua ou descontínua da diLa entre 5 e 100, de preferivelmente entre e 2.5 aminoácidos de n nncmii de preferência, proteína e possui, v preferência entre 5 e 50, mais 8 e 30, mais preferivelmente entre 10 comprimento, por exemplo, o epítopo pode ser preferivelmente de 8, 9
16, 17, 18, 19, 20, 21, 2.2, 23,
10, 11, 12, 13,
14, 15, ou 25 aminoácidos de comprimento .
te rmo epítopo descontínuo , como aqui usado, significa um epitopo conformacional em um que é formado a partir de pelo menos duas na sequência primária da proteína.
termo molécula biespecífica se antígeno proteico regiões separadas destina a incluir qualquer agente, por exemplo, uma proteína, complexo de proteína ou peptideo, que especificidades de ligação diferentes. Por molécula pode se ligar, superfície celular, e uma célula efetora. O peptídeo ou tem duas exemplo, ou interagir com (a) um antígeno (b) um receptor Fc na superfície termo molécula multiespecifica de de ou molécula nretende incluir qualquer heteroespeciíica prefenu agente, por exemplo, uma proteína, peptideo proteína ou peptideo, gue tem mars do complexo de que duas especificidades de ligação diferentes.
Por exemplo, a molécula pode se ligar ou interagir com um antígeno de superfície celular, (b) um receptor Fc na superfície de pelo menos um outro componente.
For conseguinte, a invenção inclui, mas não limitada, triespecíficas, tetraesecíficas outras multiespec.íficas que são direcionadas para CLDN6, para como receptores Fc em células c Pdnpcíficos também inclui O termo anticorpos biespccuic^ diacorpos. Os biespecificos em diacorpos são anticorpos bivalentes que os domínios VH e VL são expressos em uma única cadeia polipeptídica, que é muito curto para permitir domínios na mesma cadeia, deste mas utilizando um ligante o pareamento entre os dois modo, forçando os domínios a emparelhar com domínios complementares de outra cadeia e criando exemplo
USA 90:
dois sítios de ligação ao antigeno (ver, por Holliger, P., e col.(1993) Proc. Natl. Read. Scr.
ο'Ί oi n rol (1994) Structure 2: 6444-6448 ; Poljak, R.J., θ co1·
1121-1123).
Tal como aqui utilirado, o termo heteroanticorpos se refere a dois ou mais anticorpos, seus derivados ou regiões de ligação ao antigeno unidas, pelo menos, dois possuindo especificidades diferentes. Estas dos quais diferentes especificidades incluem uma especificidade de ligaçao para um receptor Et em uma célula efetora, e uma especifIcrdade de ligação para um antigeno ou epitopo em uma célula alvo, por exemplo, uma célula tumoral.
Os humanos descritos podem ser anticorpos anticorpos aqui ctesciibu u termo anticorpo humano como utilizado no presente documento, destina-se regiões variáveis c constantes imunoglobulína de linhagem a incluir anticorpos tendo derivadas de sequências de germinativa humana. Os anticorp03 humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulina de linhagem germlnativa mutações introduzidas por mutagênese humana (por exemplo, aleatória ou sitioespecifica m vüro ou por mutação somática in vivo) .
termo anticorpo monoclonal, tal como aqui utilizado, refere a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. Um anticorpo monoclonal apresenta especificidade e afinidade de ligação únicas para um epitopo particular.
Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtrda de um animal não humano, exemplo, camundongo, fundida com uma célula termo anticorpo recombinante, utilizado, expressos, tais como por imortalizada.
tal como aqui inclui todos anticorpos que são preparados, criados ou isolados por meios recombinantes, anticorpos camundongo), relaçao aos preparado a que é genes hospedeira por exemplo, de um isolados de um animal (por exemplo, um transgênico ou transcromossomal em da imunoglobulina ou um hibridoma deste, anticorpos isolados de uma r a—, r~\ η ν' p xo τ' θ s s a r o anticorpo, ransformada para expre^pcL±.
transfectoma, (c) anticorpos isolados partir de uma biblioteca de anticorpos recombrnantes, combinatória, criados ou isolado (d) anticorpos preparados, expressos, por quaisquer outros meios que envolvem a união de sequências de genes da imunoglobulina a outras sequências de DNA.
O termo transfecioma, tal como utilizado no presente documento, inclui células hospedeiras eucarióticas recombinantes que expressam um anticorpo, tais como células CHO, células NS/0, células HEK293, células HEK293T, células vegetais ou fungos, incluindo células de levedura.
Como utilizado no presente documento, um anticorpo heterólogo é definido em relação a um organismo transgênico que produz tal anticorpo. Este termo se refere a um anticorpo que tem uma sequência de aminoácidos ou uma sequência de ácidos nucleicos codificante correspondente àquela encontrada em um organismo que não consiste no organismo transgênico, e sendo geralmente derivada de uma espécie diferente do organismo transgênico.
Como utilizado no presente documento, um anticorpo heterohibrido se refere a um anticorpo que possui cadeias leves e pesadas de diferentes origens de organismos. Por exemplo, um anticorpo possuindo uma cadeia pesada humana associada com uma cadeia leve de murino é um anticorpo heterohibrido.
A invenção inclui todos os anticorpos e derivados de anticorpos, tais como aqui descritos que, para as finalidades da invenção, são englobados pelo termo
6 ,, 0 termo derivados de anticorpo anticorpo . G ten
...........................—......'.....-Ζ,ΣΡΤ.
a micoroo e outro agente ou ant conjugado do anticorpo fragmento de anticorpo.
a um um oresente documento estão Os anticorpos descritos preferivelmente isolados.
aqui utilizado, substancialmente especificidades isolado que pretende livre de substancialmente especificamente
Um anticorpo isolado”, tal como referir a um anticorpo que e outros anticorpos antigênicas (por exemplo, com um liga especificamente livre de anticorpos que antígenos diferentes de diferentes anticorpo
CLDN 6 se ligam
CLDN6)· Um anticorpo isolado que se isoforma ou variante reatividade cruzada ί HA OUtTâS exemplor liga especificamente um epitopo, de com
CLDN 6 outros espécies humana pode, no entanto, ter , antígenos relacionados, por r · ΓΤΠΝ6). Além disso, espécies CLDNo) estar substancialmente (por exemplo, homólogos de um anticorpo isolado livre de outro material oelular Em uma modalidade da invenção, produtos químicos. Em , anticorpos monoclonais combinação de anticorp r-om diferentes aos anticorpos com combinados em uma composição bem
De acordo com a presente capaz pode uma isolados se refere especificidades definida.
invenção, um de se ligar a » ^o predeterminado, se sendo anticorpo e ele tem uma
O dito alvo predeterminado e H nativa para o ano afinidade significativa g se liga ao dito alvo predeterminado em ensaios pa , ensures descrrtos no presente documento.
De como se ligar a um alvo Ferência, um anticorpo e capaz preferencia, anAiise P dito alvo em uma anal de 5 de se ligar detestavelmente ao ~ zg · FACS) em que a Ugaçao < ·. ηθ-ria de fluxo (analise FACS) citomeLria ue , ssnresso na superfície de anticorpo ao dito alvo express .
. ne preferência, o anticorp intactas é determinada. De p dito alvo, caoo esteia presente do dito células se liga em uma detectaveImente ao concentração de pg/ml ou menos, 5 pg/ml ou menos, ou 2 se liga de modo
De pg/mL ou menos, detectável ao dito nM ou menos, preferência, o anticorpo presente em uma 30 nM ou menos ou 15 é geraimente medida concentração de alvo, nM ou menos.
Afinidade ou idade de ligação de preferência, o termo arão de equilíbrio (K„) · De dissociação a •í-F ί cat iva se refere à afinidade signifrcativ ligação a um alvo predeterminado com uma constante de (KD) de
IO5 M ou menos,
10“6 M ou menos, 1θ i o'8 m ou ou menos, 1 g η-9 M OU menos, iu u in'10 M ou menos, menos,
2q 10 M ou menos' ou
Od anticorpos da 10-12 M ou menos. Os invenção têm, c valores de EC50 para de preferencia, a ligação à CLON6 de menos, 2500 ng/ml ou menos, „00 ng/ml ou menos, 3000 ng/ml ou 2000 ng/ml ou menos, 1500 ng/ml ou menos, 1000 ng/ml ou menos ,
500 ng/ml ou menos, 400 ng/ml ou menos, 300 ng/ml ou menos,
200 ng/ml ou menos, ou
100 ng/ml ou menos.
capaz de Um anticorpo ligar a um alvo se (substancialmente) ele não tem afinidade significativa pelo liga significativamente ao dito alvo em ensaios padrão.
(substancialmente)
De um anticorpo não se ligar a capaz de se u um alvo se ele nao alvo em uma análise de se ligar detectavelmente ao dito 10 cltometria de fluxo (anâlrse FACS) ao dito alvo expresso anticorp nnticorpo nao se . , np preferência, o anticorp . g. é determinada. De pre intactas pstiver presente ao dito alvo se estiver p liga detectavelmente ao dit em que a ligação do dito na superfície de células em / i de preferência ate uma concentração de até 2 pg m , ferência até 10 pg/™l. de preferenc 15 pg/mL, de preference pg/ml, mais preferivelmente até pig/ml, em particular até /η,ϊ ou até 150 ligML,
0 pg/mL, ou até 200 μg/ml· ou mais.
De anticorpo nao detectavelmente ao preferência, obtiver presente dito alvo se estive p se liga em uma concentração de nM, até 10 0 nM, de de preferência ate 50
150 nM, nM, de
1'7 0 nM, ate
300 mM, até
0 preferência ate nM, até 1000 nM, até até 1300 nM ou anticorpo
Pja mais.
detectaveImente entração que satura a
CLDN6.
alvo se estiver ligação ao alvo tem afinidade significativa para um alvo, dito alvo
103 vezes,
KD para a com uma Κυ vezes, ligação ao é capaz de se um anticorpo é de 10 7 M, ligar.
presente em uma a que o anticorpo um anticorpo não que é pelo menos 10 vezes, 100 vezes, o on 106 vezes maior do que a vezes ou iu alvo predeterminado
Por exemplo, se a KD ao alvo anticorpo não tem pelo menos 10 M,
Um anticorpo se ele é capaz enquanto não e não tem nenhuma não se padrão.
a que o anticorpo para a ligação de a que o anticorpo é capaz de se ligar para a nenhuma
10'5 M, ligação a um alvo para afinidade
10~4 M, 10 3 é específico para qual o significativa seria de
M, 10-2 M ou IO1 M.
um alvo predeterminado de se ligar ao dito alvo predeterminado, capaz de se ligar a outros alvos, afinidade significativa para outros liga _ gnificativamente a outros alvos em alvos e ensaios νί vos em particular proteínas , He se ligar a outros alvoo, ei P capaz de se i y
CT ΠΝ9 CLDN 4, CLDN 3 e CLDN6, como CLDbiy, claudina diferentes de é esoecífico para CLDN6 um anticorpo e especn se a afinidade por e , m nN6 tal como CLDN9, diferente de CLDN ,
-r, n uma proteína claudina a ligaçao a uma ριCLDN4, CLDN3 e CLDN1,
100 não exceder significativamente a afinidade para ou ligação às proteínas claudina não relacionadas, tais como albumina de soro bovino (BSA), caseína, albumina de soro humano (HSA) ou proteínas tansmembrana que não são claudina, tais como moléculas MHC ou receptor de transferrina, ou qualquer outro polipeptídeo especificado. De preferência, um anticorpo e especifico para um alvo predeterminado se ele se liga ao dito alvo com uma KD que é pelo menos 10 vezes, 100 vezes, 103 vezes, 104 vezes, 105 vezes ou 106 vezes menor do que a KD para a ligaçao a um alvo para o qual não é específico. Por exemplo, se a KD para a ligação de um anticorpo ao alvo para o qual ele e específico é 10'7 M, a KD para a ligação a um alvo para o qual ele não é específico seria de pelo menos ΙΟ'6 Μ, 105 Μ, ΙΟ'4 Μ, ΙΟ'3 Μ, 10'2 M ou 10'1 M.
A ligação de um anticorpo a um alvo pode ser determinada experimentalmente usando qualquer método adequado; ver, por exemplo, Berzofsky e col., AntibodyAntigen interactions em Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raver, Press Nova Iorque, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, w. H. Freeman and Company Nova Iorque, N Y (1992), e métodos aqui descritos. As afinidades podem ser facilmente determinadas utilizando técnicas convencionais, tais como por diálise de equilíbrio; usando o instrumento
101
BIAcore 2000, utilizando os procedimentos gerais descritos pelo fabricante; por radioimunoensaio utilizando antigeno alvo radiomarcado; ou por outro método conhecido pela pessoa versada na técnica. Os dados de afinidade podem ser analisados, por exemplo, pelo método de Scatchard e col., Ann N.Y. Acad. ScL, 51: 660 (1949). A afinidade medida de uma interação anticorpo-antigeno particular pode variar se for medida sob diferentes condições, por exemplo, concentração salina, pH. Assim, as medições de afinidade e outros parâmetros de ligação ao antigeno, por exemplo, Kd, IC50, são de preferência feitas com soluções padronizadas de anticorpo e antigeno e um tampão padronizado.
Uma característica única do anticorpo da presente invenção é a capacidade de se ligar à claudina 6 da superfície da célula. Isto é demonstrado por análise de citometria de fluxo de células que expressam claudina 6.
Para testar a ligação dos anticorpos monoclonais às células vivas expressando claudinas, a citometria de fluxo pode ser usada. Resumidamente, as linhagens celulares que expressam claudinas associadas à membrana (cultivadas sob condições de crescimento padrão) são misturadas com várias concentrações dc anticorpos em PBS contendo 2% de FCS inativado por calor e 0,1% de NaN:i a 4°C durante 30 min. Após lavagem, as células reagem com um anticorpo secundário
102 marcado por fluorescência sob as mesmas condições de coloração do anticorpo primário. As amostras podem ser analisadas por FACS usando propriedades de dispersão lateral e luz para entrada em células individuais e a ligação dos anticorpos marcados é determinada.
O termo ligação, de acordo com a invenção, de preferência se refere a uma ligação especifica, tal como aqui definido.
Tal como aqui utilizado, isotipo se refere à classe de anticorpos (por exemplo, IgM ou IgGl) que é codificada por genes da região constante da cadeia pesada.
Tal como aqui utilizado, comutação de isotipo se refere ao fenômeno pelo qual a classe ou isotipo de um anticorpo muda de uma classe Ig para uma das outras classes de Ig.
termo ocorrência natural, tal como aqui utilizado, conforme aplicado a um objeto, se refere ao fato de que um objeto pode ser encontrado na natureza. Por exemplo, uma sequência de polipeptideo ou polinucleotideo que está presente em um organismo (incluindo virus) que pode ser isolada de uma fonte na natureza e que não foi intencionalmente modificada pelo homem no laboratório é de o c o r rê n ci a natural.
O termo rearranjado, tal como aqui utilizado, se
103 refere a uma configuração de um locus de imunoglobulina de cadeia pesada ou cadeia leve, em que um segmento V esta posicionado imediatamente adjacente a um segmento D-J ou J em uma conformação que codifica essencialmente um domínio VH ou VL completo, respectivamente. Um locus de gene de imunoglobulina rearranjada (anticorpo) pode identificado por comparação com o DNA da linhagem germinativa; um locus rearranjado terá pelo menos um elemento de homologia de heptâmero/nonâmero recombrnado.
termo não rearranjado ou configuração de linhagem germinativa, tal como aqui utilizado em referência a um segmento V, se refere à configuração em que o segmento V não é recombinado de modo a estar imediatamente adjacente a um segmento D ou J.
O termo molécula de ácido nucleico, tal como aqui utilizado, pretende incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de cadeia simples ou de cadeia dupla, mas de preference e DNA de cadeia dupla. Uma molécula de ácido nucleico pode ser para introdução em, isto é, transfecção de por exemplo, sob a forma de RNA, que pode ser por transcrição in vitro a partir de um molde de , . .. _i' cpr modificado antes da
DNA. O RNA pode, alem disso, er aplicação por sequência empreqa arada de estabilização, cobertura e
104 poliadenilação.
OS ácidos nucleicos descritos de acordo com a invenção q o n termo ácido nucleico foram preferivelmente isolados.
„ AAa de acordo com a invenção, isolado significa, ae nucleico foi amplificado in vitro, reação em cadela da polimerase (PCR), forma recombinante por exemplo, por divagem e gel, ou (iv) sintetizado, que o ácido
por exemplo, por
,ii) produzido de
pur ifiçado, por
em clonagem, fracionamento eletroforético química.
por exemplo, por síntese . é um ácido nucleico , J PI CO 1301310 e
Um ácido nucleico ' A nara a manipulação por técnicas disponível para recombinante.
Os ácidos nucleicos podem, de acordo com a estar presentes sozinhos ou nucleicos, que podem ser modalidades preferidas, funcionalmente ligado expressão que que o ácido sequência de às em combinação homólogos ou um ácido sequências que está de DNA invenção, com outros ácidos heterólogos. Em nucleico está de controle de podem ser homólogas ou heterólogas em relaçao nucleico também esta em que o termo homólogo funcionalmente controle de expressão naturalmente, que ácido nucleico significa ligado à e o termo funcionalmonte ligado a sequência de controle de expressão naturalmente.
105 m Ácido nucleico que um ácido nucleico, tal como um
OU peptideo, e uma sequencia de controle forma
RNA e/ou proteína ssão são funcionalmente ligados de expressão sac estâo covalentemente ligados entre si de tal nucleico sob o controle ou sob a mflue da dita sequência ~ <te o ácido de controle de expressão.
nucleico deve ser então, com uma traduzido em uma proteína funcional, de controle de expressão funcionalmente Seq“nCia indução da dita sequência de lta na transcrição do dito ácido resulta nu a oqtrutura na sequência uma mudança de estr
- cia codificadora não sendo capaz sequencia coax a codif icadora, 10 uma sequencí cnLrole de expressão nucleico, sem causar codificadora ou dita de ser traduzida na proteína
O termo sequência compreende de acordo com os de ligação de ribossomo, ligada a ou peptideo desejado.
de controle de expressão promotores da invenção, intensificadores e transcrição de outros um gene elementos de ou tradução invenção, as reguladas. A controle que regulam a de um mRNA. Em modalidades . de controle da expressão podem ser 3βίΐυέη“35 , cia. de controle de estrutura exata das sequencia^ particulares da xpressão pode variar como
.. Hn espécie ou tipo de uma função da espe não célula, mas em geral
5' e 3' não compreende sequências ociV) envolvidas traduzidas, que estão
106 no inicio da transcrição e da tradução, respectivamente, tais como TATA box, sequência de nivelamento, sequência CAAT e similares. Mais especificamente, as sequências de controle de expressão 5' não transcritas compreendem uma região promotora que inclui uma sequência promotora para o controle transcricional do ácido nucleico funcionalmente ligado. Sequências de controle de expressão podem também compreender sequências intensificadoras ou sequências ativadoras à montante.
De acordo com a invenção, o termo promotor ou região promotora se refere a uma sequência de ácido nucleico que está localizada à montante (5') em relação à sequência de ácido nucleico sendo expressa e que controla a expressão da sequência pelo fornecimento de um sitio de reconhecimento e de ligação para a RNA-polimerase. A região promotora pode incluir sítios de reconhecimento e ligação adicionais para fatores adicionais que estão envolvidos na regulação da transcrição de um gene. Um promotor pode controlar a transcrição de um gene procariótico ou eucariótico. Além disso, um promotor pode ser induzível e pode iniciar a transcrição em resposta a um agente indutor ou pode ser constitutivo se a transcrição não é controlada por um agente indutor. Um gene que tá sob o controle de um promotor induzível não é
107 ou é expresso apenas em expresso, ou e exH pequena extensão, se um n tnr estiver ausente. agente indutor csn indutor, gene ligado ou o
Na presença do agente transcrição é nivel de , Tsto é mediado, em geral, aumentado. Isto pela ligação de um transcrição especifico.
fator de transoid são preferidos para a SP6, T3 e T7 promotor de CMV e mesmos (por exemplo,
Promotores que incluem promotores de RN A U6 humano, dos de acordo com a polimerase' promotores invenção promotor híbridos °u partes são promotores como, por dos
CMV) , onde uma parte fundidas com Parte ganes de outras proteínas exemplo, GAPDH humana desidrogenase) incluindo ou adi
De acordo no seu sentido ou de
RN A expressão celulares, tais (gllceraldeido 3 fosfato não incluindo intron(s) termo expressão e usado com a invenção, , a nrodução de RNA . e compreende a P^OQ mais gerar, p'Hao Ele também compreende proteina/peptlde · de ácidos parcial nucleicos.
Além disso, pode rea11z ada de forma transiente ou de forma estávelDe acordo com a invenção, o termo expressão também inclui aberrante oU uma expressão abe expressão anormal
Expressão aberrante ou expre anormal significa, de acordo com a invenção, quC a
108 alterada, de preferência aumentada, em comparação com uma referência, de preferência em comparação com o estado em uma célula normal não tumorigênica ou um indivíduo saudável. Um aumento na expressão se refere a um aumento de pelo menos 10%, em particular pelo menos 20%, pelo menos 50% ou pelo menos 100%. Em uma modalidade, a expressão e encontrada apenas em um tecido doente, enquanto que a expressão em um tecido saudável é reprimida.
Em uma modalidade preferida, uma molécula de acido nucleico está, de acordo com a invenção, presente em um vetor, quando apropriado com um promotor, que controla a expressão do ácido nucleico. O termo vetor e aqui utilizado no seu sentido mais geral e compreende qualquer veículo intermediário para um ácido nucleico que permite que o dito ácido nucleico, por exemplo, seja introduzido em células procarióticas e/ou eucarióticas e, quando apropriado, seja integrado em um genoma. Vetores deste tipo são, de preferência, replicados e/ou expressos nas células. Os vetores compreendem plasmídeos, fagomideos, bacteriófagos ou genomas virais. O termo plasmideo, tal como aqui utilizado, geralmente se refere a uma construção de material genético extracromossômico, geralmente um duplex do UNA circular, que pode se replicar independentemente do UNA cromossômico.
109 de _ vetoi para a
Como o vee^x r de vetor em que a stão presentes de um anticorpo, tanto expressão de cadeia pesada em diferentes e a cadeia leve do vetores cadeia _ cadeia pesada e a em que a caaei n utilizado.
no mesmo vetor pode ser presentes inamento dado pelo presente
O ensinamento documento ao ácido aminoácidos, sequências, ou um tipo leve estão em relação as sequências nucleico especifico , aquelas mostradas na listagem por exemplo, aqueia é para ser interpretado de forma a também de de se modificações, isto e, específicas que resultam , eauivalentes as funcionalmente eqU o referir às sequências 'firas por exemplo, especitrcae, u propriedades _ „ de aminoácidos q_5 sequências exibindo variantes das ditas nas sequências que são sequências ditas aminoácido s sequências de idênticas ou semelhantes . cias de ácidos nucleicos sequências ae às das de aminoácidos que p codificam as sequências , semelhantes às das oHades idênticas propriedades , codificadas pelas o c- de aminoácidos θ'1 eolticas. bma propriedade importante exibem a ligação sequência sequências de n aO seu alvo ou manter as de um anticorpo ao _ tais como CDC e/ou ADCC. de um anticorp , modificada em relação a uma uma sequência quando substitui a sequência em um anticorpo, retém ligação do dito
110 anticorpo alvo e de preferência funções do dito anticorpo, como po mesmo modo, i- dado no presente ensinamento daci documento com relação aos anticorpos hibridomas produtores de anticorpos interpretado de forma a também se específicos, deve ser referir aos anticorpos caracterizados por uma sequência de aminoácidos sequência de ácidos nucleicos que é modificada em comparação com 10 de ácidos nucleicos dos sequência de aminoácidos sequência anticorpos específicos, porém sendo .valentes. Dma propriedade rmportante e funcionalmente eguivalen . manter reter a de um anticorpo ao · funções efetoras de um sequência modificada em anticorpo. De preferência, n« relação a uma sequência especifico, , pia substitui
3,5 quando eia pm um especifica e® anticorpo, retém a lipoção preferência, as funÇ°e descrito, por —P10' sequência do dito e' de do dito anticorpo mediada por CDC ou nor ADCC.
las pessoas versadas na Será percebido pelas pe em particular, . variáveis podem ser sequências ligar a um alvo.
como aqui lise mediada técnica que, •~,= a hinervariáveis de CDR, regiões h Pcapacidade anç sem perder a modificadas sem p
CDR serão tanto
Por exemplo r does dos anticorpos Idênti.oas ou altamente homóloga.,
Ill aqu de .· m.e Por altamente homólogo se especificados, for de 1 a 4, tal como de a 5, de preferência substituições podem ser feitas nas CDRs.
de entende que a 3 ou 1
Além disso, modificadas variáveis podem ser ih o + A ΤΊ C Ί 3.1 com 3-S modo a que elas apresentem —logra snbstan regiões hipervariáveis esoecificamente reveladas no regiões de anticorpos especii documento.
É para ser entendido que os áerdos também incluem ácidos presente nucleicos nucleicos específicos aqui descritos ~ estão de otimização da utilrzaçao d modificados por uma questão . .rA ou organismo particular.
c6dons em uma célula hospedetra diferenças na utilização iedade de problemas levar a uma de um gene heterólogo. A otimização de OU mais nucleotldeos da sequência da expressão de de códons entre os organismos pode envolvendo a expressão alteração de códon por oriqinal um ácido uma otimização
Ha eficácia particular na otimização da nn heterólogo em que hospedeiro homólogo ou hete em nucleico deva ser expresso.
pode resultar nucleico, de tradução, em um dito ácido uma variante, derivado, De acordo com a invenção, uma forma modificada ou fragmento de uma sequencia de nucleico, sequência de aminoácidos, ou peptideo de t em uma propriedade funcional da sequence nucleicos, ' r·i an° ou peptideo, ~ -g de anumoacidoo - t equencia αθ
112 respectivamente, partir do qual ela foi derivada. Tais propriedades funcionais compreendem a interação com ou ligação outras moléculas. Em uma modalidade, uma variante, derivado, forma modificada ou fragmento de uma sequencra de ácido sequência de aminoácidos ou peptideo imunologicamente equivalente à sequencia de ácido nucleico, sequência respectivamente, a partir do
De preferência, sequência de ácido ácido nucleico que variante da dita será de pelo menos preferivelmente de aminoácidos ou peptideo, qual ela foi derivada.
grau de identidade nucleico especifica e uma é modificada com relação a sequência de ácido
70%, de preferência de pelo menos preferivelmente de pelo menos 90^ pelo menos 95%, 96-6, 97o, variantes de ácido nucleico CLDN6, de preferência,
300, pelo menos menos de de 600 modalidades todo ou ou pelo mais grau entre uma sequência de ou que é uma menos 75%, mais ainda mais preferivelmente
Em relação de identidade de pelo menos cerca às de dado para uma região cerca de 400, pelo menos cerca de 450, pelo
500, pelo menos cerca de 550, pelo menos ou pelo comprimento da menos cerca 630 nucleotideos. Em grau de identidade é dado para sequência de ácidos nucleicos de como as sequências de ácido nucleico dadas
113 na listagem de sequências. De o El S CÍVJ.3-S preferencia, tável uma capazes de hibridizar formar uma duplex com outra, com a hibridização preferencialmente sendo zada sob condições que permitem a hibridizaçao específica entre (condições estringentes sao descritas,
Condições estringentes)·
->_ em Molecular por exemplo, em a Taboratory Manual, Cloning: A Laooi i o rol , Editors, j. Sambrook e coi.,
1. , nress, Cold Spring
Laboratory press, i- Protocols in Molecular Toraue 1989 ou Current Protoco nr mrbor, Nova Iorque, 10 Ha „ , e CO1 , Editors, John S
Biology, I?·»· Rusubel θ • ~ cr>i d Spring Harbor 2a Edição, Cold up Iorgue e se referem, por exemplo, Inc., Nova Iorque ~ ap bibridização (3,5 a 65°C em tampao d , n albumina de pollvlnllpitrolidone 0,02-.
15 NaH2PO4 2,5 mM (pH 7) , SDS
0,5%, EDTA 2 de sódio 0,15
M/citrato a membrana hibridizaçao, lavada, por e«®P10- em 2 em seguida, 0,1 a 0,5 termo variante de sódio
0,15 qual °
SSC em
DNA à hibridizaçao
SSC, Fico! 0,02%,
soro bovino 0,02%,
mM) · SSC é cloreto
M, pH 7 · Após a
f oi transferido é
ambiente e, temperatura de acordo mntantes, variantes de variantes aléücas, homólogos
SDS em temperaturas com variantes em particular de especies, cm 1.
de invenção também conformações, de aqueles Pue sao
114 naturalmente presentes. Uma variante alélica se refere a uma alteração na sequência normal de um gene, cujo significado é muitas vezes pouco claro. O sequenciamento genético completo frequentemente identifica numerosas variantes alélicas para um determinado gene. Um homólogo de espécie é uma sequência de ácido nucleico ou de aminoácidos com uma diferente espécie de origem daquela de uma dada sequência de ácidos nucleicos ou de aminoácidos.
Para as finalidades da presente invenção, variantes de uma sequência de aminoácidos compreende variantes de inserção de aminoácidos, variantes de adição de aminoácidos, variantes de eliminação de aminoácidos e/ou variantes de substituição de aminoácidos. Variantes de eliminação de aminoácidos que compreendem a eliminação na extremidade N-terminal e/ou C-terminal da proteína são
também chamadas C-terminal. de variantes de truncagem N-terminal e/ou
Variantes de inserção de aminoácidos compreendem
inserções de um ou dois ou mais aminoácidos em uma
sequência de aminoácidos particular. No caso de variantes da sequência de aminoácidos possuindo uma inserção, um ou mais resíduos de aminoácidos são inseridos em um sitio particular em uma sequência de aminoácidos, embora a inserção aleatória com varredura apropriada do produto
115 resultante também seja possível.
Variantes de adição de aminoácidos compreendem fusões amino e/ou carbóxi terminais de um ou mais aminoácidos, tais como 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ou mais aminoácidos.
Variantes de eliminação de aminoácidos são
caracterizadas pela remoção de um ou mais aminoácidos da
sequência, tais como por remoção de 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30,
ou mais aminoácidos. As eliminações podem ser em qualquer posição da proteína.
Variantes de substituição de aminoácidos são caracterizadas por pelo menos um resíduo na sequência sendo removido e outro resíduo sendo inserido no seu lugar. É dada preferência às modificações nas posições na sequência de aminoácidos que não são conservados entre as proteínas ou peptídeos homólogas e/ou a substituição de aminoácidos com outros tendo propriedades semelhantes. Preferivelmente, as mudanças de aminoácidos nas variantes de proteína são mudanças de aminoácidos conservadoras, isto é, substituições de aminoácido semelhantemente carregados ou não carregados. Uma modificação de aminoácidos conservadora envolve a substituição de um de uma família de aminoácidos que estão relacionados em suas cadeias laterais. Aminoácidos de ocorrênc.ia natural são geralmente divididos em quatro famílias: aminoácidos ácidos (aspartato,
116 • -a hi stidina) másrccs (Usina, argimna, hist gfnramato), básicos lsoleucina, leucina, f apoiares prolina, feniialanina, . L. 1 i y metionina, a-icina, asparagina,
Feniialanina, descarregados ma tirosina) · 5 serina, treon , clasSifiçados em _ VP7GS Cl^Sbl gão algumas vezes tirosina sao glutamina, tript°fano e conjunto como 'ridos aromáticos.
amin . o grau de similaridade, De preferência. V oácidos identidade entre uma seguencia „ ._ de aminoácidos que uma sequencia é uma variante da dita ou que e uríW ppesentando homologia substancí , . nrPferencia PeJ P oreferivelmente pelo a o s- ou mais pr
V Pel° men°S similaridade ° 9MU . . de aminoácidos gue e uma região de ceIca de 20%, P®1° de preferência especifica de
97%, dado meno ou 99%· preferivelmente menos cerca de de 30^ sequência é modificada com relaçao para
10%, pelo de 50%, Pel° menOS -1Pio menos cerca de de 1θ0% de todo sequência equências pelo menos de de aminoácidos aminoácidos pelo menos 70%, preferivelmente a c.®· 9 6% , menos 95o, ou identidade e menos cerca de pelo menos de pelo menos cerca cerca de 60o, P cerca de 90%
80%, pel° menOS comprimento da sequência ou de aminoácido de
Por exemplo' a sequência de iste em 20° aminoácidos, ° aminoácido de
117 grau de similaridade ou identidade é dado preferivelmente para pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 120, pelo menos cerca de 140, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de 180 ou cerca de 200 aminoácidos, de preferência aminoácidos contínuos. No que diz respeito às variantes de polipeptídeo CLDN6, o grau de similaridade ou identidade é dado preferivelmente para uma região de pelo menos cerca de 100, pelo menos cerca de 120, pelo menos cerca de 140, pelo menos cerca de 160, pelo menos cerca de 180, pelo menos cerca de 200 ou pelo menos cerca de 210 aminoácidos. Em modalidades preferidas, o grau de similaridade ou identidade é dado para todo o comprimento da sequência de aminoácidos de referência, tais como as sequências de aminoácidos dadas na listagem de sequências. O alinhamento para a determinação da similaridade de sequência, de preferência a identidade de sequência, pode ser feito com as ferramentas conhecidas na técnica, de preferência usando o melhor alinhamento de sequência, por exemplo, usando Align, usando as configurações padrão, de preferência EMBOSS:: needle, Matrix: Blosum62, Gap Open 10,0, Gap Extend 0,5.
Similaridade de sequência indica a porcentagem de aminoácidos que tanto são idênticos ou que representam
118 » · j ~ mP SΘ uvado i?a S · substituições de aminoacrdo sequências
-,ή. entre duas sequencra polipeptideos indica
Identidade de ácidos nucleicos
Hp aminoácidos porcentagem de , , .cue são idênticos entre nucleotideoo que identidade as sequências.
de ou ou alinhamento, sendo esta as diferenças entre de forma aleatória e sequências comparações de obtida após o melhor puramente estatística e percentual e porcentagem
- rCas sendo distribuídas duas sequências seus comprimentos. As em todos os seu duas sequências de entre duas nucleotídeos oU realizadas mediante de tê-las alinhado sendo realizada por aminoácidos são convencionalmente identificar a comparação dessas da meihor maneira, segmento on per Unela de e comparar regiõe alinhamento sequências, depois comparação a dita comparação locais de ótimo das similaridade de sequências para manualmente, Por sequência.
comparação pode
Igoritmo de meio do a ser além produzido, homologia local de de do
482, Por mel° e wunsch, 1970,
2,
App· Math. local de Neddleman smith e Waterman, 1981, Ads de homologia algoritmo oe n. 1 48, 443, per mei°
J. Mol- Biol· tomo de Pearson similaridade cie z j a<=> busca de do método de ou
USA 85, que ulj-j·blast n
P, e Lipman,
Ni a i” X · A c a d.
1988, Proc. Naude computador programas oe
2444, ou por meio de (GAP, BESTFIT,
o.-Pi-ware de estes algoritmos e iFASTA no Pacote de fasta, BLAST
119
Computer Group, 575 Science Drive, Genetics, Genetics Computer
Madison, ntllal é calculada por determinação A identidade percentua a-t-t-/ r-· a s entre as duas i noç-irões idênticas do número de posiçoes oaradas dividindo este número pelo sendo comparadas, posições comparadas e multiplicando , nhtpr a identidade
100, de modo a obter duas sequências.
Substituições conservadoras resultado sequências número de obtido por percentual entre estas podem ser feitas, por em polaridade, hAPP de semelhança exemplo, com base ae , á Ha de hidrof ilicidade solubilidade, hidrofobicrdade,
,. -Hua dos resíduos envolvidos. Por natureza antipatrca caiares (hidrofóbicos) incluem aminoácidos apoiares carga, exemplo:
alanina,
Alina prolina, fenilalanina, leucina, isoleucma, valtna, ι-AÍann e metionina; triptofano e niicina, serina, incluem glicina, (b) aminoácidos neutros polares steína, tirosma, treonma, cistern*, aminoácidos positivamente glutamina, sina θ histidina, carregados (básicos) tinem -9“ζη , c (d) aminoácidos negatrvamente carregados ácido glutâmico. As substitutes asparagina (ácidos) incluem ácido aspártico podem, . c-a ser fertas dentro dos grupos (a)-(d). tipicamente, °
Além disso, glicina i nodem ser substituídas uma prolma podem
-na capacidade para romper as av,ncp na sua t-an pela outra com base substituições preferidas podem ser feitas hélices. Algumas subsLi -d
120 /á\ c a T; (ii) P e G entre os seguintes grupos. ( )
V, L e I. Dado o código genético conhecido, técnicas de DNA recombinante sintético, cientista versado na pode prontamente construir
DNAs que codificam variantes conservadoras de aminoácidos.
A presente invenção compreende anticorpos em que as alterações foram feitas na região Fc a fim de anticorpos.
propriedades funcionais ou farmacocinétlcas dos Tais alterações pode™ resultar em « diminuição ou aurtento
Uoprin de FcvR e ADCC. As da ligação Cig e CDC ou a ligaçao γ substituições dos resíduos podem, por exemplo, ser feitas em um ou maus de aminoácidos da região constante da cadeia pesada causando assim uma alteração em uma função efetora, retendo ao mesmo tempo a capacidade antigeno, em comparação com o anticorpo de se ligar modificado, cf.
ao
US
5,624,821 e US 5,648,260.
A meia-vida in vivo dos anticorpos pode ser melhorada através da recuperação modificação do epitopo do domínio constante de constante Iglike do receptor de
Ig ou um domínio de modo que a molécula não compreenda um domínio CI-b> intacto ou uma 6,121,022 e US 6,194,551.
região Fc de Ig intacta, cf. US A meia-vida in vivo pode, além disso, aumentada através de mutações na região Fc, por exomp.l o, por substituição de treonina por leucina na
121 ~o de treonina por serina na por substituição de posição 2o2, P treonina P°r „ por substituição de aãp 254, ou por cf . OS 6,277,375 de glicosilação dos de alterar a função tenxlal^na na po^ão 256
Além disso, padrão 5 pode ser modifico a fl™ v,r-r-: Por exemplo, anticorpos, t-o os anticorpos anticorpos efetora dos rransfectoma, Que em um transia não adiciona podem ser expressos a unidade de fucose i A ASH HcL pOSÍ-ÇãO normalmente ligada
297 da região Fc de ._r a afinidade da região modo a aumentar
Fc por receptores
Fc , ira resultar em uma qtja vez, -L ·* que, Por
ADCC aumentada dos „ na presença de anticorpos na p (2002) JBC, 227: 26733galeotosrlãÇâo pode ser
Alternativamente, células NK,
Além disso, feita de modo a cf ·
Shield e col.
a modificação da modificar CDC.
em outra modalidade, as mutações
-introduzidas podem ser aleatoriamente ao longo de toda ou parte de uma segoência
CLDN6, tal como P°r anti-CLDNô anticorpos anti
De acordo hospedeira uma como enzimas, codificadora de anticorpos anti mutagênese de saturação, e oS . resultantes podem ser modificados resu à atividade de com a invenção, ligação.
termo com uma membrana célula ou célula uma célula intacta, intacta que não tenha normais, tais • 4- r a <’P 1 U & 32 Θ S componentes m . , ó-f-áco Uma célula plas ou material genetrco.
organeias
122 célula viável, as suas funções metabóllcas termo se refere, de acordo op ser transformada
- a qualquer célula que pode invenção, a qua 4 nucleico exog« a invenção, 4 a de preferência uma intacta e oe r capaz de realizar . Preferivelmente, normais, ir dito com a botada com um ácido 5 ou transfectao termo células ia inclui, de célula 111 acordo com (por exemplo,
E.
coli} ou células . uTaas células B, Ίη células dendriticas, lP°r θ’1* ' élulas E532, células HEK293, C0S' e célula de inaeto) . O hela células de levedura e células - encontrado dentro da ácido nucleico exôgeno pode incorporado como tal, eucarióticas células CHO, célula em um livremente disperso célula integrado vetor reoombmante ou „u no ONA mitocondrral.
hospedeira ou no nO genoma da células de mamíferos como as células de 15 são partícula „ camundongos, seres humanos,
4-o f ™e , porcos, cabras hamsters, P primatas · As células podem
Has de um grande ser derivadas número de tipos de tecidos
Exemplo5
Ainias primárias θ incluem células P específicos incluem linhagens celulares.
queratinócitos, leucócitos p da medula óssea e tronco ca Q neriférico, cex do sangue Pc células-tronco embrionárias. Em modalidades adicionais, a vnpno ® particular de antigeno, n termo , . to ou macrófago.
monociLo umai célula dendritica, nm hospedeira , tal
123 como aqui referir a utilizado, de uma recombinants -O
Uma célula preferência célula em que introduzido.
que compreende um • n de preferência expressa nucleico de pi o ácido nucleico.
odificados pelo acM animal transgênico termo animai é tencionado a se vetor de expressão ί écula de ácido uma molecuia * j a nu proteína o peptideo ou P refere a um animal compreende um mais transgenes, de tendo um genoma que _o de cadeia transgenes ae leve, preferência 10 transcromossomos genômico natural (integrados do animal), ou pesada não integrados ao e que ou
DNA de expressar os transgenes.
Por é de preferência capaz exemplo, um camundongo transgênico pode ter um transgene . A leve humano e de cadeia ievc
H P ccicisÍS· tanto um transgene pesada humano ou um η» cadela pesada humano, transcromossomo de cadei transei anti-CLDN6 produza anticorpos tal modo que o humanos quando camundongo imunizado com o antigeno CLDN6 e/ou células expressando
CLDN 6.
transgene da cade' pesada humano pode integrado no DNA cromossomai do camundongo, como é o caso para camundongos transgênicos, por exemplo, camundongos
HuMAb, tais como amundongos HCo7 ou
HCO12., ou o transgene da cadeia PS«da humano pode mantido dos camundongos somicamente, como crornos sômi co s (por exemplo, descrito em WO FM) como descí.
124
02/43478.
podem anticorpos
IgG, IgA transgênicos s camundongos _ de produzir capazes oe H anscromossomais múltiplos de isotipos muro -v monoclonais humanos para e/ou IgE) submetendo-se à
CLDN6 (por exemplo, recombinação V D J de isotipo.
ou inibir, tal Reduzir ou iHade de causar uma d ca a capacidade significa comutação preferivelmente de 5* ou mata, mais preferivelmente de 50* ou
10% como aqal utili^do, diminuição global, de ou mais, 20% ou mais, mars , vic 7 5% ou mais, d0 de 'o o proliferação das '1ptps incluem simi-luueíD jao nive 1, células. θ por uma inibição completa, isto
T e rrtto s tais uma redução e mais preferivelmente exemplo, no nível de inibir ou frases termo mio complete ou essencralmente a zero ou essencialmente intensificando preferivelmente dizem respeito cerca de pelo menos 10%, c r-u Delo menos 30^5, preferencia pei preferivelmente M preferivelmente pelo menos vetps termos 1(10¾. Esues menos Ituocomo aumentando aumento ou melhorra po o pelo menos 20%, de preferencia per q orefcrivelmente pelo menos mais preio c 50% ainda mais pelo menos 5to, . referivelmente pelo «n% e mais preier± também podem referir às em que no „„ 7pro não tempo zeiu existe um sinal num ra um certo detectavel par mn-nrvalo particular além condição
r. zero, há um sinal do tempo zero, composto ou
125 . r>n condição. detectável para - -termina0 termo Vmunologlcamente equrvalen sequênoia mo— rmunologroamente e^-e. , imunologicamente senciaimente encialmente significa que a exibe aminoácidos propriedades e/ou exerce iguais, Por
Imunológicas Iguais ou es imunológicos iguais ou que diz respeito ao exemplo, no iguais tipo de efeito imunológico, tal como humoral e/ou induzida ou contexto da resposta imune a indução de uma duração da reação imune
No força imune induzida.
, , .j., reaçao imune a especiflcr a ~ „lmunologleamente presente invenção, celular, a termo em relação aos efeitos equivalente e ou propriedades utilizado para peptídeo utm imunológica ado de preferência de um peptídeo ou imunização. Uma capacidade de s imunológicos variante de propriedade ligar aos anticorpos quando apropriado
- ria por estimulação da de preferencia P°r
Por exemplo, gerar uma geração uma sequência de resposta imune, de anticorpos.
sequência aminoácidos θ de aminoácidos
Ί qP í P 3- Υ1Π13· imunologicamente equsva ~ aminoácidos, quanlã dita sequencia 20 de referência, se lndivlduo, uma reaçao sistema imune especü ieidade DEeferència anticorpos, ten pr . g referência, uai
-„tia de aminoácido de com a seque - faz parte , Hp referencia que de aminoácidos exposta ao imune, do de reação como a sequência
126 da CLDN6.
O termo funções imunes efetoras, no contexto da presente invenção, inclui quaisquer funções mediadas por componentes do sistema imune que resultam na inibição do crescimento tumoral e/ou inibição do desenvolvimento tumoral, incluindo a inibição da disseminação e metástase tumoral. De preferência, as funções imunes efetoras resultam na morte das células tumorais. De preferência, as funções imunes efetoras no contexto da presente invenção são funções efetoras mediadas por anticorpos. Tais funções compreendem a citotoxicidade dependente do complemento (CDC), a citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), a indução da apoptose nas células que transportam o antigeno associado ao tumor, por exemplo, por ligação do anticorpo a um antigeno de superfície e/ou inibição da proliferação das células que transportam o antigeno associado ao tumor, de preferência ADCC e/ou CDC. Assim, os anticorpos que são capazes de mediar uma ou mais funções imunes efetoras são, de preferência, capazes de mediar a morte de células por indução da lise mediada por CDC, lise mediada por ADCC, apoptose, adesão homotípica e/ou fagocitose, de preferência através da indução da lise mediada por CDC e/ou da lise mediada por ADCC. Os anticorpos podem também exercer um efeito simplesmente pela
127 ligação a antígenos associados a tumor na superfície de uma célula tumoral. Por exemplo, os anticorpos podem bloquear a função do antígeno associado ao tumor ou induzir a apoptose apenas pela ligação ao antigeno associado ao tumor na superfície de uma célula tumoral.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Mecanismos de ação do mAb.
Embora a descrição a seguir forneça considerações sobre o mecanismo subjacente à eficácia terapêutica dos anticorpos da invenção, isto não deve ser considerado como limitante da invenção sob qualquer aspecto.
Os anticorpos aqui descritos podem interagir com os componentes do sistema imune, de preferência através de ADCC ou CDC. Os anticorpos da invenção podem também ser utilizados em cargas alvo (por exemplo, radioisótopos, fármacos ou toxinas) para matar diretamente as células tumorais ou podem ser usados sinergicamente com agentes quimioterápicos tradicionais, atacando tumores por meio de mecanismos de ação complementares que podem incluir respostas imunes antitumorais, que podem ter sido comprometidas devido aos efeitos colaterais citotóxicos dos quimioterápicos sobre os linfócitos T. No entanto, os anticorpos da invenção podem também exercer um efeito simplesmente pela ligação à CLDN6 na superfície celular,
128 assim, por exemplo, bloqueando a proliferação das células.
Citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo.
ADCC descreve a capacidade de morte celular das células efetoras, tal como descrito no presente documento, particularmente linfócitos, que preferivelmente requer que a célula alvo seja marcada por um anticorpo.
ADCC, de preferência, ocorre quando os anticorpos se ligam aos antigenos nas células tumorais e os domínios Fc do anticorpo se ligam aos receptores Fc (FcR) sobre a superfície de células imunes efetoras. Várias famílias de receptores Fc foram identificadas, e as populações de células específicas expressam caracteristicamente receptores Fc definidos. ADCC pode ser visto como um mecanismo para induzir diretamente um grau variável de destruição imediata do tumor, que leva à apresentação do antígeno e à indução de respostas de células T direcionadas a tumor. De preferência, a indução de ADCC in vivo levará às respostas de células T direcionadas ao tumor e às respostas de anticorpo derivadas do hospedeiro.
Citotoxicidade dependente do complemento.
CDC é outro método de morte celular que pode ser direcionado por anticorpos. IgM é o isotipo mais eficaz para ativação do complemento. IgGl e IgG3 são também muito
129 eficazes no direcionamento de CDC através da via de ativação do complemento clássica. Preferivelmente, nesta cascata, a formação de complexos antigeno-anticorpo resulta na exposição de múltiplos sitios de ligação de Clq em estreita proximidade com os domínios CH2 de moléculas de anticorpo participantes, como moléculas de IgG (Clq é um dos três subcomponentes do complemento Cl). De preferência, estes sítios de ligação de Clq expostos convertem a interação Clq-IgG anteriormente de baixa afinidade em uma de elevada avidez, o que desencadeia uma cascata de eventos que envolve uma série de outras proteínas do complemento e leva à liberação proteolítica dos agentes quimiotáticos/de ativação de células efetoras C3a e C5a. De preferência, a cascata do complemento termina na formação de um complexo de ataque à membrana, que cria poros na membrana celular de modo a facilitar a livre passagem de água e solutos para dentro e para fora da célula.
Produção de anticorpos.
Os anticorpos da invenção podem ser produzidos por uma variedade dc técnicas, incluindo a metodologia do anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milstein, Nature 256: 495 (1975). Embora os procedimentos de hibridização de células somáticas sejam preferidos, a
130 princípio, outras técnicas para a produção de anticorpos monoclonais podem ser empregadas, por exemplo, a transformação viral ou oncogênica dos linfócitos B ou técnicas de exibição de fagos utilizando bibliotecas de genes de anticorpo.
sistema animal preferido para a preparação de hibridomas que secretam anticorpos monoclonais é o sistema murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Protocolos de imunização e técnicas para o isolamento de esplenócitos imunizados para a fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão são também conhecidos.
Outros sistemas animais preferidos para a preparação de hibridomas que secretam anticorpos monoclonais são os sistemas de rato e de coelho (por exemplo, descritos em Spieker-Polet e col., Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 92:9348 (1995), ver também Rossi e col., Am. J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).
Em ainda outra modalidade preferida, anticorpos monoclonais humanos direcionados contra CLDN6 podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossomais que transportam partes do sistema imune humano em vez do sistema de camundongo. Esses camundongos
131 transgênicos e transcromossomais incluem camundongos, conhecidos como camundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são coletivamente mencionados aqui como camundongos transgênicos. A produção de anticorpos humanos em tais camundongos transgênicos pode ser realizada como descrito em detalhes para CD20 em W02004 035607.
Ainda outra estratégia para a geração de anticorpos monoclonais é isolar diretamente os genes que codificam anticorpos a partir de linfócitos produtores de anticorpos da estratégia definida, ver, por exemplo, Babcock e col., 1996; A novel strategy for generating monoclonal antibodies from single, isolated lymphocytes producing antibodies of defined strategy. Para detalhes de engenharia de anticorpos recombinantes, ver também Welschof e Kraus, Recombinant antibodes for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8 e Benny K.C. Lo Antibody Engineering ISBN 1-58829-092-1.
Imunizações .
Para gerar anticorpos para CLDN6, os camundongos podem ser imunizados com peptideos conjugados com transportador derivados da sequência de CLDN6, uma preparação enriquecida de antigeno CLDN6 recombinantemente expresso ou seus fragmentos e/ou células que expressam CLDN6 ou seus fragmentos, como descrito. Alternativamente, os camundongos podem ser imunizados com DNA que codifica CLDN6 humana de
132 comprimento total ou fragmentos seus. No caso em que as imunizações utilizando uma preparação purificada ou enriquecida do antigeno CLDN6 não resultam em anticorpos, os camundongos também podem ser imunizados com células que expressam CLDN6, por exemplo, uma linhagem celular, para promover respostas imunes.
A resposta imune pode ser monitorada ao longo do curso do protocolo de imunização com amostras de plasma e de soro sendo obtidas por sangramento retrorbital ou da veia da cauda. Os camundongos com títulos suficientes de imunoglobulina anti-CLDN6 podem ser usados para fusões. Os camundongos podem ser reforçados por via intraperitoneal ou intravenosa com células expressando CLDN6 3 a 5 dias antes do sacrifício e remoção do baço para aumentar a taxa de hibridomas secretores de anticorpos específicos.
Geração de Hibridomas Produtores de Anticorpos
Monoclonais.
Para gerar hibridomas produtores de anticorpos
monoclonais para CLDN6, células dos linfonodos ou baços obtidas a partir de camundongos imunizados podem ser isoladas e fundidas a uma linhagem apropriada de células imortalizadas, tal como uma linhagem de células de mieloma de camundongos. Os hibridomas resultantes podem então ser testados quanto à produção de anticorpos antigeno
133 específicos. Poços individuais podem então ser testados por ELISA para os hibridomas secretores de anticorpos. Por análise de imunofluorescência e FACS usando células que expressam CLDN6, anticorpos com especificidade para CLDN6 podem ser identificados. Os hibridomas secretores de anticorpos podem ser replaqueados, novamente testados e, se ainda forem positivos para anticorpos monoclonais antiCLDN6, podem ser subclonados por diluição limitante. Os subclones estáveis podem então ser cultivados in vitro para gerar anticorpo em meio de cultura de tecidos para caracterização.
Geração de Transfectomas Produtores de Anticorpos Monoclonais.
Os anticorpos da invenção também podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira usando, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de genes, como são bem conhecidos na técnica (Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).
Por exemplo, em uma modalidade, o(s) gene(s) de interesse, por exemplo, genes de anticorpos, podem ser ligados em um vetor de expressão, tal como um plasmídeo de expressão eucariótica, como utilizado pelo sistema de expressão de genes GS divulgado em WO 87/04462, WO 89/01036 e EP 338841, ou outros sistemas de expressão bem conhecidos
134 na técnica. O plasmídeo purificado com os genes de anticorpo clonados pode ser introduzido em células hospedeiras eucarióticas, tais como células CHO, células NS/0, células HEK293T ou células HEK293 ou, alternativamente, outras células eucarióticas, como as células derivadas de plantas, fungos ou células de leveduras. Os métodos usados para introduzir estes genes podem ser métodos descritos na técnica, tais como eletroporação, lipofectina, lipofectamina ou outros. Após a introdução destes genes de anticorpos nas células hospedeiras, células que expressam o anticorpo podem ser identificadas e selecionadas. Estas células representam os transfectomas que podem então ser amplificados para o seu nível de expressão e ter a escala aumentada para produzir anticorpos. Os anticorpos recombinantes podem ser isolados e purificados a partir destes sobrenadantes de cultura e/ou células.
Alternativamente, os genes de anticorpos clonados podem ser expressos em outros sistemas de expressão, incluindo células procarióticas, tais como microrganismos, por exemplo, E. coli. Além disso, os anticorpos podem ser produzidos em animais não humanos transgênicos, tais como no leite de ovelha e coelhos ou em ovos de galinhas ou em plantas transgênicas; ver, por exemplo, Verma, R., e col.
135 (1998) J. Immunol. Meth. 216: 165-181; Pollock, e col. (1999) J. Immunol. Meth. 231: 147-157; e Fischer, R., e col. (1999) Biol. Chem. 380: 825-839.
Uso de Sequências de Anticorpo Parciais para Expressar Anticorpos Intactos (isto e, humanização e quimerização).
a) Quimerização
Anticorpos monoclonais de murinos podem ser usados como anticorpos terapêuticos em seres humanos, quando marcados com toxinas ou isótopos radioativos. Anticorpos de murinos não marcados são altamente imunogênicos no homem quando aplicados repetidamente, levando à redução do efeito terapêutico. A imunogenicidade principal é mediada pelas regiões constantes da cadeia pesada. A imunogenicidade de anticorpos murinos no homem pode ser reduzida ou completamente evitada se os anticorpos correspondentes forem quimerizados ou humanizados. Os anticorpos quiméricos são anticorpos, as porções diferentes dos quais sendo derivadas de diferentes espécies animais, tais como aquelas que têm uma região variável derivada de um anticorpo de murino e uma região constante de imunoglobulina humana. A quimerização dos anticorpos é conseguida através da junção das regiões variáveis da cadeia pesada e leve de anticorpo de murino com a região constante de cadeia pesada e leve humana (por exemplo, como descrito por Kraus e col., em
136
Methods in Molecular Biology series, Recombinant antibodies for cancer therapy ISBN-0-89603-918-8). Em uma modalidade preferida, os anticorpos quiméricos são gerados pela união da região constante da cadeia leve capa humana com a região variável da cadeia leve de murino. Em uma modalidade também preferida, os anticorpos quiméricos podem ser gerados pela união da região constante da cadeia leve lambda humana com a região variável da cadeia leve de murino. As regiões constantes da cadeia pesada preferidas para a geração de anticorpos quiméricos são IgGl, IgG3 e IgG4 . Outras regiões constantes da cadeia pesada preferidas para a geração de anticorpos quiméricos são IgG2, IgA, IgD e IgM.
b) Humanização
Os anticorpos interagem com antígenos alvo predominantemente através de resíduos de aminoácidos que estão localizados nas seis regiões determinantes de complementaridade de cadeia pesada e leve (CDRs). Por esta razão, as sequências de aminoácidos nas CDRs são mais diversas entre os anticorpos individuais do que as sequências fora das CDRs. Uma vez que as sequências de CDR são responsáveis pela maioria das interações anticorpoantigeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que mimetizam as propriedades dos anticorpos de ocorrência natural específicos pela construção de vetores de expressão
137 que incluem sequências de CDR do anticorpo de ocorrência natural específico enxertadas nas sequências estruturais a partir de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (ver, por exemplo, Riechmann, L. e col. (1998) Nature 332: 323-327; Jones, P. e col. (1986) Nature 321: 522-525; e Queen, C. e col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 86: 10029-10033). Tais sequências de estrutura podem ser obtidas a partir de bancos de dados de DNA públicos, que incluem sequências de genes de anticorpos de linhagem germinativa. Estas sequências de linhagem germinativa irão diferir das sequências de genes de anticorpos maduros porque elas não incluirão genes variáveis completamente montados, que são formados por união V(D)J durante a maturação das células B. Sequências de genes da linhagem germinativa irão também diferir das sequências de um anticorpo de repertório secundário de alta afinidade no indivíduo uniformemente através da região variável. Por exemplo, as mutações somáticas são relativamente pouco frequentes na porção aminoterminal da região de estrutura 1 o na porção carboxiterminal da região de estrutura 4. Além disso, muitas mutações somáticas não alteram significativamente as propriedades de ligação do anticorpo. Por esta razão, não é necessário obter a sequência completa de DNA de um anticorpo particular a fim de recriar um
138 anticorpo recombinante intacto tendo propriedades de ligação semelhantes àquelas do anticorpo original (ver WO 99/45962). Sequências parciais de cadeia pesada e leve que englobam as regiões CDR são tipicamente suficientes para esta finalidade. A sequência parcial é usada para determinar qual variável da linhagem germinativa e segmentos do gene de união contribuiram para os genes variáveis de anticorpo recombinados. A sequência da linhagem germinativa é então utilizada para encher as porções que faltam das reqiões variáveis. Sequências líder de cadeia pesada e leve são clivadas durante a maturação da proteína e não contribuem para as propriedades do anticorpo final. Para adicionar sequências que faltam, sequências de cDNA clonadas podem ser combinadas com oligonucleotídeos sintéticos por ligação ou amplificaçao por PCR. Alternativamente, toda a região variável pode ser sintetizada como um conjunto de oligonucleotídeos curtos, sobreponíveis e combinados através de amplificaçao por PCR para criar um clone da região variável totalmente sintético. Este processo tem certas vantagens, como a eliminação ou inclusão ou sítios de restrição particulares, ou otimização de códons particulares.
As sequências de nucleotídeos dos transcritos de cadeia pesada e leve a partir de hibridomas são utilizadas
139 para conceber um conjunto de sobreposição de oligonucleotídeos sintéticos para criar seguências V sintéticas com capacidades de codificação de aminoácidos idênticas às sequências naturais. As sequências de cadeia pesada e capa sintéticas podem diferir das sequências naturais de três formas: fitas de bases de nucleotideo repetidas são interrompidas para facilitar a síntese de oligonucleotídeos e amplificação por PCR; sítios de iniciação de tradução ótimos são incorporados de acordo com as regras de Kozak (Kozak, 1991, J. Biol. Chem. 266: 1986719870); e sítios HindIII são concebidos à montante dos sítios de iniciação de tradução.
Para ambas as regiões variáveis de cadeia pesada e leve, as sequências de fita codificantes otimizadas e as não codificantes correspondentes são quebradas em 30 a 50 nucleotídeos aproximadamente no ponto médio do oligonucleotídeo não codificante correspondente. Assim, para cada cadeia, os oligonucleotídeos podem ser montados em grupos de dupla fita que se sobrepõem e se estendem por segmentos de 150 a 400 nucleotídeos. Os agrupamentos são então usados como moldes para a produção de produtos de amplificação por PCR de 150 a 400 nucleotídeos. Tipicamente, um conjunto de oligonucleotídeos da região variável única será quebrado em dois agrupamentos, que são
140 amplificados separadamente para gerar dois produtos de PCR que se sobrepõem. Estes produtos sobrepostos sao então combinados através de amplificação por PCR para formar a região variável completa. Também pode ser desejável incluir um fragmento de sobreposição da região constante da cadeia pesada ou leve na amplificação por PCR para gerar fragmentos que podem ser facilmente clonado nos constructos do vetor de expressão.
As regiões variáveis de cadera pesada e leve quimerizadas ou humanizadas reconstruídas são, então, combinadas com as sequências de promotor, lider, de inicio de tradução, região constante, 3' não traduzida, de poliadenilação e de terminação de transcrição clonadas para formar constructos de vetor de expressão. Os constructos de expressão de cadeia pesada e leve podem ser combinados em um único vetor, cotransfectados, transfectados em série ou transfectados separadamente em células hospedeiras que sáo, então, fundidas para formar uma célula hospedeira expressando ambas as cadeias. Os plasmldeos para uso na construção de vetores de expressão para IqGK humanos sao descritos. Os plasmldeos podem ser construídos de modo que as sequências de cDNA de cadeia V capa leve e V pesada amplificadas por PCR possam ser usadas para reconstruir mlnigenes completos de cadeia pesada e leve. Estes
141 plasmídeos podem ser
Capa ou IgG4, Capa
Plasmídeos similares usados para expressar anticorpos IgGl, completamente humanos ou quimencos.
podem ser construídos para a expressão de outros isotipos de cadeia pesada, ou para a expressão anticorpos que compreendem cadeias leves lambda.
Assim, em outro aspecto da invenção, de as características estruturais invenção sao usada s para humanizados estruturalmente dos anticorpos anti-CLDN6 criar anticorpos relacionados que menos uma propriedade funcional dos anticorpos tal como ligação à CLDN6. Mais especificamente, regiões de podem ser estrutura anticorpos da anti-CLDN6 retêm pelo da invenção,
CDR de anticorpos monoclonais de combinadas recombinantemente com humanas conhecidas
CDRs para anti-CLDN6 humanizados, uma ou mais camundongo regiões de outros recombinantemente manipulados da invenção.
Ligação às células que expressam antigenos.
A capacidade do anticorpo de se ligar à CLDN6 pode ser determinada utilizando ensaios de ligação padrão, tais como aqueles estabelecidos nos exemplos (por exemplo, ELISA,
Western Blot,
Imunofluorescência e
Análise por Citometria de Fluxo).
Isolamento e caracterização de anticorpos.
Para purificar os anticorpos antl-CLUN6 hibridomas
142 selecionados dois litros podem ser cultivados em frascos giratórios de para a purificação de anticorpo monoclonal.
711ternat ivamente, os anticorpos anti-CLDN6 podem ser produzidos em biorreatores ã base sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de diálise. Os caso necessário, por afinidade com proteína pode ser líquida solução
G-Sepharose ou proteína A-sepharose. IgG eluida verificada por eletroforese em gel e cromatografia de alta para assegurar a pureza. A tampão pode ser trocada em PBS, pode ser determinada por OD280 usando a concentração coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a 80°C.
para determinar se os antroorpos monoclonais antiCLDN6 selecionados se ligam a epitopos únicos, mutagénese dirigida podem ser usadas.
sítio-dirigida ou multi
Determinação do isotipo.
Para determinar o isotipo dos anticorpos purificados,
PPPSAs de isotipo com vários kits comerciais (por z.ymed, Roche Diagnostics) podem ser realizados. Os exemplo, poços de placas de microtitulação podem ser revestidos camundongo. Após o bloqueio, as placas anticorpos monoclonais ou controlos de isotipo com Ig anti reagem com purificados, em temperatura ambiente durante duas horas
Os poços podem
143 então com IgGl/
IgG2a, IgG2b ou
IgG3, igA de camundongo, sondas conj ugadas com a peroxidase
IgM de camundongo.
Após a lavagem, as mg/ml) kit de podem ser desenvolvidas com substrato ABTS (1 m OD de 405-650. AlternatIvamente, e analisadas e camundongo isotipagem de anticorpo i ή /ado como No. cat. 1493027) pode ser
IsoStrip (Roche, descrito pelo fabricante.
citometria de fluxo.
Análise por strar a presença de anticorpos antift fim de demonstrar P âo de soros de camundongos imunizados CLDM n°S . às células vivas gue expressam anticorpos monoclonais
1-riA de fluxo pode
CLDN6, citometr , as linhagens ser usada. As ω exoressam CLDN6 celulares que P naturalmente ou apos transfecção e controles negativos sem a expressão de CLDN6 (cultivados sob condições de crescimento padrão) podem ser anticorpos misturadas várias concentrações de com varia monoclonais , íps de hibridoma ou em PBS em sobrenadantes incubadas a 4 °C durante conLendo 1% de FBS, min. Após a lavagem, ou Alexa647 pode se e podem ser anti-IgG marcado com ABC ligar ao anticorpo monoclonal ligado ã o anticorpo
CL.HN6 sob de fluxo ondiçoes que a marcação com anticorpo ;r analisadas por citometria rftCS usando propriedades um instrumento FAO mesmas
As amostras podem
144 espalhamento luz para penetrar em células vivas individuais .
A fim de distinguir anticorpos monoclonais específicos para CLDN6 de ligantes não específicos em uma medição, método de cotransfecção pode utilizado.
Células transfectadas transientemente com plasmídeos podem ser que codificam CLDN6 e um marcador fluorescente coradas como descrito acima.
As células transfectadas podem ser fluorescência diferente das
Uma vez que maioria das ambos transgenes, detectadas em células marcadas um canal de com anticorpo.
células transfectadas expressam anticorpos monoclonais CLDN6 específicos se 1i g am preferivelmente às células que expressam anticorpos marcadores de fluorescência, enquanto que não específicos sê legam a ama razáo comparável t-ranqfectadas. Um ensaio às células nao transtecuaoa utilizando microscopia de fluorescência pode além de oU em vez do ensaio de oitometzia ser utilizado de fluxo. As células podem ser coradas exatamente como descri examinadas por microscopia de fluorescência.
Microscopia
A fim de demonsLrar a de anticorpos anti
CLDN6 em de camundongos imunizados ou a ligaçao .1 onais em células vivas que expressam anticorpos monoclonal de microscopia de rmanoflaorescência pode
145 ser usada. Por exemplo, linhagens celulares que expressam CLDN6 tanto espontaneamente como após a transfecção e controles negativos sem expressão de CLDN6 são cultivados em lâminas de câmara sob condições de crescimento padrão em meio DMEM/F12, suplementado com 10% de soro fetal de bezerro (FCS), L-glutamina 2 mM, penicilina 100 Ul/ml e estreptomicina 100 ptg/ml. As células podem então ser fixadas com metanol ou paraformaldeido ou deixadas sem tratamento. As células podem então reagir com anticorpos monoclonais contra CLDN6 durante 30 min a 25°C. Após a lavagem, as células podem reagir com um anticorpo secundário IgG anticamundongo marcado com Alexa555 (Molecular Probes), sob as mesmas condições. As células
podem então ser examinadas por microscopia de
fluorescência.
Os níveis de CLDN6 total nas células podem ser
observados quando as células são fixadas em metanol ou em paraformaldeido e permeabilizadas com Triton X-100. Em células vivas e não permeabilizadas, a localização de CLDN6 na superfície de células fixadas com paraformaldeido pode sor examinada. Além disso, o alvejamento de CLDN6 nas junções firmes pode ser analisado por co-coloração com marcadores de junção firme, como ZO-1. Além disso, os efeitos de ligação de anticorpo e localização de CLDN6 na
6 membrana celular podem ser examinados.
Western Blot.
ί η(Ha L θ s 13. d cl IgG anti-CLDM pode ainda quanto à reatividade com antígeno CLDN6 por Western
Blotting.
expressam oinlares de células que
Resumidamente, extratos celulares
4- neqativos adequados podem ser
CLDN6 e controles nega poliacrilamida preparados . , à pietroforese em qei de e submetidos a eleuro de dodecilsulfato de (SOS). Após ® eletroforese, 3Hos serão transferidos para antígenos separados sera membranas de nitrocelulose, bloqueados sondados com
OS anticorpos monoclonais a serem testados. A üg^o detectada utilizando IgG peroxidase desenvolvida com o substrato ECL.
IgGs de camundongo anti CLDN6 pod quanto à reatividade com da
IgG pode ser anti camundongo ser ainda testadas antígeno
Tmunoistoquimrca de uma maneara
.. pot exemplo usando çriosseçoes versada, Ροχ·
CLDN6 por bem conhecida para a pessoa fixadas em parutormaldeido ou acetona ou seções parafina fixadas com paraformalderdo ou amostras de tecido durante procedimentos de tecido embebidas em a partir de tecido não canceroso obtidas de de rotina ou a nnrtando tumores , · τ. de camundongos por part ir xenoenxertados com linhagens celulares gue expressam CLDN6
147 rransfeccão. Para imunocoloraçao, espontaneamente ou apos transfecç anticorpos reatrvos pura CLDN6 poóem ser incubados seguido Por anticorpos de cabra anticamundongo ou de cabra anticoeltio (DAKO) conjugados com a peroxidase de rabano silvestre, de acordo com as instruções
Atividades Fagociticas e de dos fornecedores
Morte Celular
Anticorpos in vitro.
Além de se ligarem especificamente anti-CLDN6 podem ser testados quanto
Fnnocitose e morte de células mediar a fagocicose de à CLDN6, anticorpos suas capacidades de expressando CLDN6 e crCo dp CLDN6 com as suas sendo caracterizadas pela assocraçao de atividade do anticorpo superficies celulares. 0 monoclonal in vitro do teste em modelos
Citotoxicidade anticorpo (ADCC) :
Resumidamente, irá fornecer uma triagem inicial antes , célula dependente de mediada por ceiu-L jc células polímorfonucleares (PMNs), células NK, monócitos, células mononucleates ou outras de doadores purificados por centrifugação de seguido por Use de eritrócitos lavadas podem ser com bezerro alternativamente, com soro saudáveis, podem ser densidade Ficoll Hypaque, contaminant.es. As células suspensas em RPMI suplementado inativado pelo calor a 10% ou, humano inativado pelo calor a 5-s
148 e misturados com células alvo xpressando CLDN6 marcadas com e sendo caracterizadas por associação de CLDN6 com suas superficies celulares, em várias taxas de células r s n nara células alvo. Alternativamente, as células efetoras para cex υχα 5 alro podem ser marcadas com ™ ii9-do rntensiftcador de fluorescência (BATDA). dm guelato altamente fluorescente
Európio células de com ligante intensificador, que é liberado de mortas, pode ser medido por um fluorômetro. Outra alternativa pode utrlizar a transfecção de células alvo com luciferase
Amarelo lucifer adicionado pode então, oxidado apenas por células viáveis
As IgGs ser, antiCLDN6 purificadas podem ser então, adicionadas em várias τπΓ humana irrelevante pode concentrações. IgG numaiia como controle negativo durante 4 a 20 horas a
Os ensaios podem °C, dependendo do efetora utilizada. As amostras podem ser citólise por medição de liberação de > Cr quelato EuTDA no sobrenadante da cultura, a luminoscéncia resultante da oxidação pode ser uma medida de células viáveis.
Anticorpos monoclonais anti CLDN6 testados em várias combinações para citólise é aumentada com anticorpos ser utilizada ser realizados tipo de célula avaliadas para a ou a presença do
Alternativamente, de amarelo lúcifer também podem ser determinar se monoclonais múltiplos crtotoxicldade dependente do Conplemento (CDC):
149
Anticorpos monoclonais anti-CLDN6 podem ser testados quanto às suas capacidades de mediar CDC usando uma variedade de técnicas conhecidas. Por exemplo, o soro para complemento pode ser obtido a partir de sangue de uma maneira conhecida pela pessoa versada na técnica. Para determinar a atividade CDC de mAbs, diferentes métodos podem ser usados. A liberação de 5iCr pode, por exemplo, ser medida ou a elevada permeabilidade da membrana pode ser avaliada utilizando um ensaio de exclusão de iodeto de propidio (IP) . Resumidamente, as células alvo podem ser lavadas e 5x 105/ml podem ser incubadas com várias concentrações de mAb durante 10 a 30 min em temperatura ambiente ou a 37°C. O soro ou plasma pode, então, ser adicionado até uma concentração final de 20% (v/v) e as células incubadas a 37°C durante 20 a 30 min. Todas as células de cada amostra podem ser adicionadas à solução IP em um tubo FACS. A mistura pode, então, ser analisada imediatamente por análise de citometria de fluxo utilizando
FACSArray.
Em um ensaio alternativo, a indução de CDC pode ser determinada em células aderentes. Em uma modalidade deste ensaio, as células são semeadas 24 h antes do ensaio com uma densidade do 3 x lO^/poço em placas de microtiLulação de fundo chato de cultura de tecidos. No dia seguinte o
150 hp crescimento meio oe triplicates com as oélulas são incubadas ,s oélulas de controle são anticorpos. As cei é removido e incubadas contendo e a lise min em meio de cresciment de crescimento ou ί i pp de fundo a determinação n 7¾ nara a uewn aponrna 0,2 P d,,rante 20 ftpós incubaçao durante sobrenadante é removido em DMEM (pré-aguecido máxima, res temperatura ambiente, plasma humano 20% ou soro é adicionado às células
Ί ° c T odci s min a 31 as células incubado durante mais de cada amostra são adicionadas à solução ' HÍ o (10 μρ/ιιΐ) · Em de rodeto de propidio (
- substituídos por PBS contendo sobrenadantes sac subs a emissão de tluorescencia
2,5 pg/ml mediante
Satirede brometo de etidio excitação a 520 nm é especifica
A lise percentual calculada da seguinte f o rma de especifica (amostra de fluorescência fluorescência
Inibição inonoclonars:
anticorpos fundo lise de fluorescência) fluorescência) x
100.
fundo de proliferação celular P« da monoclonais com células máxima capacidade de micianti_CLDN6 podem, por
CLDN6 positivas tumorais de anticorpos a apoptose, exemplo, ser incubados p r-Ansíectadas tumorais transit Com CLDN6 a 37°C durante de 2 0
151 er coibidas, lavadas em tampão de horas. As células podem θ lncubadas com Annexm
Irgação Annexin-V <00 Oroscrence 15 min oom me OU ARC (00 Bioscxen
V conjugada
ΠΟ θ S OU.3S O ·
Todas células de cada amostra podem à solução de IR CO imediatamente pig/ml em PBS) θ- um por citometria uma inibição tubo adicionadas
FACS e avaliadas Alternativamente, por anticorpos monoclonais comercialmente.
(como acima) proliferação celular detectada com tits 10 proliferação celular é um imunoensaro nao incorporação de 5-bromo-2' sfntese de ONA células em , a detectado
BrdU incorporado e , Para permitin nr-cado com europio. Pa 15 marcauu n „ oão fixadas as células sao indutor európi° de fluxo geral pode kit da de disponíveis
PELFIA (Perkin-Elmer, isotópico baseado
-desoxiuridina (OrdO) durante a proliferação em mrcroplaoas. usando anticorpo monoclonal a detecção do anticorpo, desnaturado usando solução
Cat. AD0200) na medição da o DNA ligado anticorpo nao
DELFIA é adicionado do anticorpo marcado m Fluorescentes utos altamente Liuo quclatoa . removido Por lavagem e para dissociar os ions de em medida onde eles formam do indutor com componentes .1.- fT uorimetria _ utilizando tiuo solução, dflfia. a resold ida na detecção é proporcional a dc DNA na no tempo r-Ainla de cada P°Ç° ’ , o nré-clxnicos. Estudos Pre
152
- ctdNê também ,ω ςρ iiqam a CLUino os anticorpos J ln víV0 (por exemplo, em a , ser testados em um modelo podem ser , imunodef icientes camundongos nr-tam tumores que transportam r-indos tnoculados com snoenxer Lados
CLDN6, possivelmente expressam CLDNü, determinar a células tumorais que destes no linhagens celulares gue após a transfecçào) para controle do crescimento de expressam CLDN6.
Estudos in vivo
CLDN 6 após que expressam em 10 outros animai podem prto de células tumorais o xenoenxert « imunocomprometrdos camundongos a o. utilizando realizados uti ou anticorpos da invenção.
os anticorpos podem ser administrados em camundongos ae tumor isentos '-v seguido por . . de células tumorais ingeçao oe medir os dos anticorpos P«a prevenrr 15 sintomas relacionados com ·,arados aos camundongos administrado terapêutica formação de tumores ou os anticorpos podem tumor.
dos de ser
-ova determinar a com tumor para anticorpos para eficácia r eduz i r crescimento nu os sintomas a metástase ou os tumoral, a me Ά aplicação de anticorpos pode ser ionados com Lumor.
a aplicação de outras substâncias, como 20 C°blMda Tstáticos, inibidores do fator tármacos cistos lnibidores da angiogenese ou > r-íclo celuiaif bioqueadores eficácia sinérgica e ap +- erminar a .urros anticorpos para - analisar os combinações. Para de crescimento, toxicidade potencial
153 , Delos anticorpos da , .,crais tóxicos mediados colateral ri ser inoculados com anticorpos ou invenção, os animais po em investigados quanto ompletamente mve terapia de reagentes de controle sintomas anticorpo possivelmente para CLDN6. Os possíveis relacionados com a efeitos colaterais da aplicação ση de anticorpos in vivo
CLDN6 particularmente incluem . .Hade em tecidos toxicidaae . dr, a placenta. Anticorpos incluindo a pr que expressam CL»6, que reconhecem CIOM em seres humanos em outras DOr exemplo, espécies, POL úteis para prever efeitos ela aplicação de anticorpos colaterais potencrais mediados P r A^res humanos.
a rara CLDN6 em seres monoclonais par aao particularmente pO camundongos,
Mapeamento de epltopos.
mapeamento de epitopos ί 4 7aHo como apt realizaou . in Molecular Biology), protocols (Methods m Mo
TSBN-089603-315-9 e em Morris rum.
practical Approach A practical Approach Olwyn M. R· Westwood, da invenção pode Epitope Mappmg por Glenn E.
Mapping :
248, por
Moléculas biesp' ligam à CLDN6.
Em ainda outra para »DN6 p°dem niolécula funcional.
conhecidos pelos anticorpos descrito em detalhes em
Frank. C. Hay· a 1 idade da invenção, modalidaoe or dcrivatisados ou
Epitope
Serie5» que θ® os anticorpos
154 um fragmento Fab')
Çpor exemplo, um bi.e5pecm=a - »meSpecmea.
múltiplos ou epitop para que se alvo.
gerar liga
Por uma molécula exemplo, um ligado (P°r
Ha invenção pode ser anticorpo da rn _ Dor acoplamento exemplo, P · essooração não -valente oh outras moléculas de ligaçao, funcionalmente , ,ro fusão genética, químico, outra forma) uma ou mais nutro anticorpo, como ouuru
He ligação.
peptideo ou mimétloo · conseguinte, e multiespecíficas especificidade de x.Hc de ligação para pgoecificidade oe segunda espec .
cd Hade particular alvo. Em uma modalrd
Fc, Por
Por a presente _ inclui moléculas invenção mciui iO biespecíficas uma primeira epítopo alvo
3_5 humano (CD64) um receptor ou um receptor , an nelo menos compreendendo pel ~ nara CLDN6 e uma ligaçao par um segundo epltopo invenção, o segundo exemplo, Eo-gamaM rrn89), ou um
Fc-alfa humano (CD89), exemplo, cd3· multiespecíficas expressando portanto, a por biespecíficas , às células efetoras Fc_epsllonR —P1°' “η6“ΪΟ5' pc-gamaR, Ec-alfaR - υ quanto as . la, collmorionucleares macrófagos ou celu ««ct.riz.da. por células alvo expressando receptor invenção capazes de células 1, inclui moléculas ί i car tanto de se ugai celulares· . _ de CLDN6 com associaçao oe Ί nóespecificas st as moléculas b- 1 alvejar célula» expressando CLW® superfícies ^Wlespecífica» pode» O sendo caracterizadas
155 por associação de C10N6 com as
Unlas efetoras e podem para células suas superfície3 celulares desencadear atividades de receptor Fc, mWas efetoras mediadas pelo ' ,fse de células expressando C1ON6 fagoci ο CLDN6 com como a sendo as suas
Has cor associação 5 “iaCterlZa . --toxicidade celular dependente de οτ-fícies celulares, mtosuperficies de citocina ou a
ÍAOCC), liberaçao de ciu anticorpo (ADGC), geraçao do ânion superóxido.
rmrí ficas e multiespecrficas Moléculas bxesp da invenção de ligação, conpcificidade ha incluir uma terceira esp 10 podem ainda i ~ anti-Fc e de uma especificidade de liqaçao anti . -O anti-CLDN6· Em uma modalidade, a especificidade de Ugaçao anti além de uma , ligação é uma porção do fator terceira especrf ioidade de itc . (EF) por e^plo. « molécula que se anti-lntensifioaçao (EF) , P de superfície 15 liga a uma proteína , . deste modo, aumenta citotóxica e, aesr envolvida na atividade a resposta imune contra a célula alvo. A poto do fator ser um anticorpo, um fragmento de anti-intensificaçao' pode ligante que anticorpo funcional ou liga a uma dada molécula, P« exemplo, a um um uma antigeno ou a intensificação um do r e, desse modo, resulta em dos determinantes de ligação para
Fc ou antiqeno de célula alvo. A porção do receptor de •fqr-Acão pode ligar fator de anti-intensrfs . , . „ de célula alvo. Aiternativamente, ou a um antigeno d a um receptor Fc
156 do fator anti-intensificação pode ee que é diferente da entidade especificidades de ligação s< do fator anti-intensificação à qual ligam.
pode se ligar a uma entidade
Por e x emp1 o, ligar a uma segunda a porção célula T ' · „ínor exemplo, citotoxica \POJCD2,
CD3, CD8, CD28, CD4,
CD40, 1CAM-1 ou outra célula resposta imune aumentada contra Em uma modalidade, as rpqnlta em uma imune que resuiw a célula alvo) moléculas biespecificas e da invenção compreendem multiespecifícas nplo menos um . , Hp ligaçao PeJ10 especificidad i nm Fab, Fab' , F (ab 2' incluindo, por exemplo, um
O anticorpo também como uma anticorpo,
Fv ou um Fv de cadeia nn de cadeia pesada, cadeia leve ou de
Fv ou um , a Hoste, como um mínimo oesrc, ips tal como descrito simples,
O anticorpo também pode imunoglobulina de domínio pode ser um dímero de ou qualquer constructo em Ladner e col·., ser uma proteína de ligação, como
US fragmento de cadeia
4,946,778.
de fusão divulgado de em
US2003/0118592
Em uma
US 2003/0133939.
modalidade, moléculas biespecificas multiespecifícas de ligação para conpcificidade r, = n compreendem uma espo da invenção conig-L
Fr-ilfaR presentes na O nil UH1 fC t/ um Fc-gamaR ou célula efetora, uma ceiuici uma segunda _i — rpliila alvo, • vi He de ligação para um antrgeno d especificidade de i-J por exemplo, CLDN6.
157
Em uma modalidade a especificidade de ligação para um receptor Fc é fornecida por um antreorpo monoclonal, a do qual não sendo bloqueada pela rmunoglobulma ligação humana (IgG).
utilizado, o termo receptor dos oito genes da cadeia gama Estes genes codificam um total r de receptor solúvel ou transmembrana, que de doze isoformas de recepuo
IgG se a qualquer um localizados no cromossomo 1.
, ,, om três classes de estão agrupados em receptor Fc gama. Fc gamaRI (CD64), uma modalidade humano de alta
FC-gamaRII preferida, afinidade.
Em ainda outras especificidade de ligação (CD32) e receptor
Fc-gamaRIII (CD16) . Em
Fc-gama é um Fc-gamaRI modalidades preferidas, a θ fornecida para um receptor tc por um anticorpo que se liga exemplo, um receptor Fc alfa a um receptor IgA humano, por (CD89)), a ligação (Fc-alfaRI do qual não sendo de imunoglobulina destina alfaRI) preferência bloqueada pela a íTciA) O termo humana A (igno o produto gênico de receptor IgA se um alfa gene (Fc localizado iq Fste gene é conhecido no cromossoma 19. Este gei isoformas transmembranares
Iternativamente unidas de o5 const itutivamente
110 KDa. Fc-alfaRI (CD89) e em monócitos/macrófagos, não em neutrof iÜcos,
Fc-alfaRI tem afinidade
158 média tanto mediante a (Morton, H.
IgAl quanto para IgA2, que e citocinas, como G CSF c. e col. (1996) Critical Reviews m 16: 423-440). Quatro anticorpos específicos, identificados como A3, .-,1 fciRT fora do domínio ligam ao Fc-alfaRl rora aumentada ou GM-CSF
Immunology monoclonais
Fc-alfaRI
A59, A62 e A77, que se de ligação do ligante aoc^ritos (Monteiro, R· c· e IgA, foram descrirub \
Immunol 148: 1764).
Em outra modalidade, a molécula col.(1992) Jbiespecífica compreendida de dois anticorpos monoclonais de acordo com a invenção, que tais como um têm atividades indução de CDC funcionais complementares, funcional pela anticorpo predominantemente o outro anticorpo predominantemente funcional por indução de apoptose.
Um anticorpo específico de aqui utilizado, se refere anticorpo efetoras.
a um funcional que se
Os anticorpos liga célula efetora, tal como anticorpo ou fragmento de ao receptor
Fc das células preferidos para utilização na invenção se ligam ao receptor
Fc de células em um sítio que não está ligado por imunoglobulina endógena.
Tal como aqui utilizado o termo célula efetora se refero a uma célula imune que esta envolvida na fase c f et ora de uma resposta imune, em oposição às fases
159 resoosta imune. Exemplos de n„a e de ativação de uma resposta cognitiva e ue ou nmiAs de origem mieloide nd uem células rtinlas imunes rnciue aiuIap B e células nlo linfócitos (como células linfoide, por exemplo, (CTLs) , células T incluindo
Uller, células natural neutrófilos, granulócitos, killer, macrófagos, monócitos, polimorfonucleares, e basótllos. Algumas células células efetoras expressam receptores
Em modalidades f ή ΡΠ A Θ iSSâliZ3ΓΩ. Fc específicos funções imunes célula efetora especificas.
é capaz de induzir a preferidas, uma citotoxicidade celular anticorpo (ADCC), por dependente de άγίοο Por exemplo, capaz de induzrr MCC.
ítr estão envolvidos qUe expressam FcR est células alvo na apresentação , cfeiua imune ou componentes exemplo, um neutrófrlo monócitos e macrófagos na morte especifica de de antigenos a outros ligação às células que modalidades, uma célula apresentam antigencs. Em outras , fagocitar um antigeno alvo, efetora po e particular em uma microrganismo. A expressão e um nda por fatores humoraxs, tais fetora pode ser regulada po verificou-se que a express célula el como citocinas.
Por exemplo, de Fc-gamaRl e lada por interferon gama (IFN γ) · suprarregulada poi . citotóxica de ta expressão alçada aumenta a atividade c.i que transportam Ee-gaMaW contra alvos.
Uma f ti-ar ou lisar um antigeno alvo ou célula efetora pode fagocxiar
160 alvo indivíduo pode ser alvegada P« ™ 5 Em modalidades preferidas, expressa ou superexpressa associação de CL0N6 oom a expressando CLDN6 e indesej ável animal) que em um
Inuer célula deve significar (por exemplo. » ser humano o anticorpo da invenção, alvo e uma célula que é caracterizada peU celular. Células associação de a célula
CLDN 6 e sendo sua caracterizadas P°r o o SUâ S
CLDN6 com as superficies lares incluem, celulares 10 trpicamente, as células tumorais.
II invenção apresenta uma Po^o um fármaco (P°r citotoxina, um bal como uma . A nresente aspecto, a P n anti-CLDN6 conjugado anticorpo anti
Em outro terapêutico,
T5 exemplo, am conjugados imunoconjugados imunossupressor) aqui referidos são incluem uma radioisótopo. TalS um racuv-1· munoconjugados mais citotoxinas são citotoxina ou agent judicial para e, incluem o taxol, emetina, como ou que z„rc· Uma imunotoxinas Citotóxico inclui qualquer agente que células. Exemplos brometo de etidio, vincristina, referidos como y~. y j-1 c m 1- s n, par.
mata
B, gramicidina
D, mitomicina, etoposideo, tenoposideo, colchicine, doxorrubicina, vinblastina, • -> -η + τ' A c in cidi ΟΠ3· f dihidroxiantraci mitoxantrona, daunorrubicina, mitramicina,
161
D, actinomicina tetracaina, qlicocorticoides, i-desidrotestosterona, 9 propranolol, lidocaina, puromicina e análogos ou homólogos destes.
ânticos adequados terapêuticos formação de
Agentes limitados, aos antimetabbUeos c_tioguanina,
6-mercaptopurma, 6 decarbazina) , fluorouracil tiotepa incluem, mas não estão exemplo, mecloretamina, , metotrexato, exemplo, meros n-on fiudarabina, 5citarabina, m alauilantes (Por agentes aiqui ‘ Ί ΪΪ1Θ 1 f 1·r lorambucil, iclofosfamida, (por lomustina (CCNU), 10 vsFi bussul£»o, —1 P (II) (DM pia-Hna i) -diclorodiamina I exemplo, mitomicina C cisplatina), antraciclinas daunomicina) platina daunorrubicina (por exemt-^' \ antibióticos doxorrubicina), ant actinomicina) (anteriormente (por exemplo, bleomicina, dactinomicrna mitramicina e (por exemplo, preferida, o um agente Em uma modalidade citotóxico OU agente terapêutico modalidade, (anteriormente (AMO) o agentes antramicma (AMO) +-ína e vinblastina) ,incristina e eu-ico é um agente agente terapeuta . . „ Em outra modalidade, radiotoxrco. M cc,nr Em ainda é um imunossupressoronPnte terapêutico ° - tico é doxorrubicina, m -quente terapêutico preferida, ' lorambucil, (10 bleomicva, carmas— gm-csfPm uma modalidade cisplatina, ofosfamida ou ricrna
162
Os anticorpos a c a um radioisótopo, conjugados a um ou índio-llí, da presente invenção também podem por exemplo, iodo-131, a„„c. citotóxicos para gerar radiofarmac para tratamento de uma como um câncer.
Os
Arxtg de anticorpo da conjugados de invenção a·ficar uma dada resposta para modificar i ' 1 ca e a porção do fármaco não biologica e λ u podem utilizadoS como limitada a agentes Por exemplo, a porção do 10 um polipeptí-deo
Tais proteínas possuindo podem incluir, deve ser interpretada terapêuticos guimicos clássicos, fármaco pode ser uma proteína ou uma atividade biológica desegada.
-> ry uma toxina por exemplo, ativo da mesma, tal ativa ou um fragmento de pseudomonas ou toxina enzimaticamente o A exotoxina como abrina, riem . ° de tumoral diftérica,· uma proteína biológica, mterferon-y; ou mediadores da ou imm-tb i n linfocinas, tal3 como, por exemplo, , . , (pt-2”), interleucma-6 interleucina-2 f lo-nias de granulócitos de colonias oe y interleucina-1 fator estimulante f-itor estimulante rGM-CSF), £aLor de colônias de outros fatores de e macrófagos granulócitos
Técnicas para conjugar crescimento.
terapêutica aos tal porção tetap por exemplo, Arnon conhecidas, p^unotargeting Of Drugs
And Cancer anticorpos são bem , Monoclonal Antibodies For ο°Τ-·' Antibodies ,,, em Monoclonal In cancer Therapy ,
163
Therapy, Reisfeld e col.
(eds.), ΡΡ- 243-56 (Alan R. Liss,
Inc. 1985); Hellstrom e col.,
Antibodies For Drug
Delivery, em Controlled
Drug Delivery (2a Ed.), Robinson e (Marcel Dekker, col. (eds.), PP· 623-53
Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents
Inc. 1987); Thorpe,
In Cancer Therapy: A
Review, i 1 Aniibodies '84: Biological And em Monoclonal Antiooaies
Clinical (1985) ;
Applications, Pinohera e col. (eds.), PP· 'Analysis, Results, And Future Prospective
475-506
Of The
Cancer
Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Therapy, e Monoclonal Antabodies For Cancer Detection And . „ . feds.) PP- 303-16 (Academic Press
Therapy, Baldwin e col. ( >
1985) ,
Thorpe e col·., ''The
Preparation And Cytotoxic
Properties Of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev.,
62: 119-58 (1982) .
Em uma modalidade adicional os anticorpos de acordo com a invenção estão ligados a um ligante-quelante exemplo, tiuxetano, que permite que o anticorpo por se j a conjugado a um radioisótopo.
III.
Composições farmacêuticas.
Em outro aspecto a presente invenção fornece uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos da presente invenção. As composições farmacêuticas podem ser formuladas com veículos ou diluentes tarmaceutacamente aceitáveis, bem
164 como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos, de acordo com tafa como aquelas técnicas convencionais, tais divulgadas em
The Science and Practice Remington- lhe
Pharmacy,
Pd Mack Publishing Co., Edição, Gennaro, ·' a if Hade as composiçoes incluem pa 1995- Em uma modalidad ,
Easton, PA, „1............. “ π atuam por mecanismos , isolados da Invenção que atuam po anticorpos isoiaao Um anticorpo que atua i- nor exemplo, um diferentes, Por i one em combinação com sedominantemente por indução de outro anticorpo que predominantemente atua por iadução da apoptose.
As composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em terapia de combinação, isto combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de incluir uma composição da presente Invenção ura agente anti-milamatbrio ou, pelo menos, -sublessor. Em uma modalidade, tais ag um agente imunossupress combinação pode com pelo menos terapêuticos como um inflamatórro por exemplo,
COX-2, tais
AINEs,
Incluem um ou mais agentes anti-mi lamatérios,
AINES (fármaco anti fármaco esteroidal ou um não esteroidal). Agentes preteridos Incluem, inibidores da espirina e outros saliril^' como sofecoxib (Vioxx) e celecoxib como ibuproteno (Motrin, Advil), (Nalfon), naproxono -prosyn) , sulindaco (Celebrex), fenoprofeno (Clinoril),
165 diclofenaco (Orudis), etodolaco (Indocin)(Voltaren) d1f1un isa1 (Lodine), piroxicam (Feldene), (polobid), nabumetona oxaprozina (Daypro) cetoprofeno (Relafen), indometacina dalidade, tars agentes terapêuticos unclue outra modalida funclonai de que levam à depiegão ou ma lat6rias, como clclofosfamlda de baixa T regUla“rl t. il2 ou anti-receptor
H-CTLA4, anticorpos ant anticorpos anti CTUA^,
Em agentes células de IL2.
Cidade, tais agentes terapêuticos Em ainda outra modalidad Ί Ou mais aqentes incluem um ou
,.) roxol, taxotere, derivados de taxoi, tais como quimioterápicos,
5-fluoruracil, gemcitabina, doxorrubicina (Adriamicina), iclofosfamlda modalidade, °s administrados „ \ Fm outra
Procytox, Neosar). Em (Cytoxan, trocytanticorpos da presente em combinação com preferivelmente, que apresentam, que sofrem de câncer, pacientes que cancer como agui descritos.
invenção podem ser agentes quimioterápicos, eficácia terapêutica em por exemplo, os tipos de os anticorpos da unvenção
-< com a radioterapia e/ou . · errados em conjunto com administrdao.b periféricas autólogas ou ronco peiJ-.
outra modalidade,
Em ainda oui-ia podem transplante de células medula óssea.
como aqui utilizado veiculo farmaceuticamente
166 inclui todos e quaisquer solventes, —s d® agentes antibacterianos retardo de absorção e De revestimentos, dispersão, otônicos e de .VA compatíveis.
fisíologicamente administração antifúngicos, agentes is semelhantes que preferência, veiculo adequado para intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal epidérmica (por exemplo, Por injeção ou composto infusão)
Dependendo da via de administração, biespecífroa molécula tido em um material para node ser revestido cifroa, pod , ·HoS e outras condições c composto da Vo V ácidos , o composto.
nndpm mativar que poaein farmaceuticamente acertavel atividade biologrca . ^itns toxicológicos g enticorpo, pOr exemplo, iO muítiespe naturais
Um sal retem a sal que 15 originai e que indesejáveis (ver, confere quaisquer
S M. , e co1· por exemplo, Berge, S.M
j. pharm.
1-19)·
Exemplos de tais sais de adição de ácido incluem sais e sais de de base.
,. ~ hp ácido _zo de adiçao d qs sais az aaueles derivados incluem aquc de ácidos inorgânicos não como ácido c loridrico, vi-rí co, fosfórico, nitricu, semelhantes, fosforoso hromídrico, sulfurico, brom de bem como a pa - ácidos mono como os orgânicos não tox-.
a'1í táticos, dlcarboxil — ailL ácidos ácidos
167 hidroxialcanoicos, . _ fenil substituídos, ácidos alcanoicos teiu-.
ifânicos alifáticos ácidos sulfonicos ácidos aromáticos, aromáticos e similares. Os de adição de base incluem como de aqueles derivados de metais sódio, potássio, magnésio, cálcio e similares, bem como de orgânicas não tóxicas, tais como
N,N' aminas dibenzilet ilenodiamma, colina, dietanolamina,
N-metilglucamina, etilenodlamina, similares.
Uma composição administrada por uma técnica.
Como dependendo dos da cloroprocaína, procaína presente invenção pode variedade percebido modo de resultados de métodos conhecidos pela pessoa versada na administração irá variar, desejados. Os compostos ativos preparados com vqi-y.-i a liberação rápida, composto contra a veículos que irão proteger podem tal como uma formulação de liberação controlada, transdérmicos e sistemas de biocompatíveis incluindo implantes, emplastros distribuição microencapsulados.
biodegradáveis podem ser
Polímeros como de etileno vinila, aceLato colágeno, polianidridos, ácido pelas pe poliglicólico,
Métodos para a polilático.
— qeralmente conhecidos formulações sao g 0 cici-d-O técnica. Ver, por exemplo, versadas na técnica
168
Sustained and Controlled
Release Drug
Delivery Systems,
J.
r. Robinson, ed., Marcei
Dekker, Inc.,
Nova
Iorque, 1978.
um composto
Para administrar de administração, da pode invenção P°r determinada revestir rom ou coadministrar o composto com, ou composto com urn material composto
Por exemplo, o · „ A sua inativação.
para prevenir a sua administrado a um indivíduo lipossomas, ou um diluente. aceitáveis incluem soluções incluem emulsões CGF (Strejan em um veículo pode ser
Os diluentes apropriado, como farmaceuticamente mea Cs lipossomas e aquosa. os j-p-n ánna bem como lipossomas em-agua, (1984) J- Neuroimmunol· 7: 27).
i rmaceut icamente aceitáveis
Veículos farmaceuLd.
convencionais estéreis ou dispersões aquosas es'-cm pós tampão salina água-em-óleo incluem soluções estéreis para a ou dispersões a-i m dp soluções preparação extemporânea . . estéreis. A utilização de tais injetáveis estereis farmaceuticamente ativas técnica. Exceto “ ™8dlda “ técnica. stU;n o seu onal se-ja incompatível com o composto convencional presente é também podem para substâncias uso nas composições farmacêuticas contemplado.
meios e agentes é conhecido na meio ou agente
4— o ativos suplementares Compostos ativos u ser incorporados
Composições nas composiçoes.
terapêuticas t ipicamente estéreis estáveis sob as condições de devem ser fabricação e
169 „5O pode ser composição p lipossoma 1 armazenamento. A η .... microemulsão, solução, à concentração inHa como uma . formulaoa ou outra estrutura Drdenada adequada de ser um solvente ou meio veiculo pode ser pOr exemplo, â<3ua' . , = polietilenogl propilencgírccí e P . rvras adequadas.
e suas misturas , , OOr exemplo, Pel° u' mantida, P tina pela manutenção lecitma, n ,j. no caso requerido, de fârmaco elevada. O de dispersão contendo, . , (per exemplo, glicerol, etanol, poU01 lP°r e similareS^ ' icol liquido, flulder adequada pede ser um revestimento tal co« tamanho de parties de do de dispersão, res casos, será Em muitos e pelo uso de tensoativos. preferível --P tais como o isotônicos, por exemp manitol, sorbitol prolongada das absorçao Prü . , nela inclusão 15 conseguida Ρθ1 retarda a absorção, P°r poliálcoois, sódio na composição. A injetáveis pode ser . de um agente que na composição , sais de monoestearato exemplo, sais açúcares de composições gelatina.
As soluções por incorporação . .s estéreis pedem ser preparada ÍnÚetaVel quantidade requerida do composto ativo na quan apropriado com um ou . . conforme ingredientes enumerados ~ por microWtração de esterrl^çao.
dispersões Geralmente,
.. do composto ativo incorporação uma combinação dos necessário, seguido cm um preparadas veiculo estéril que
170 contém um meio h-slco e OS outros ingredientes de dispersão básico partir , acima enumerados. No caso de injetáveis aracao de soluções pteP · sao secagem a de preparaçao sao um Pô ingê8diente vácuo os métodos preiv^ oue produzem
Uoflllzê?30' ingrediente steriÜza<^a adicional desejado a partir qualquer ativo mais ~ „reviamente de uma solução pr® por filtração do mesmo.
Os regimes ge dosagem são ajustados para fornecer uma ótima resposta desejada (por exemplo, uma terapêutica)· por exemplo, um único boloP°de administrado, várias doses divididas podem ser ao administradas proporcionalmente 15 pelas exigências do tempo ou a longo o° •4a ou aumentada, reduzida da situação terapêutica.
dose pode ser ΐ ndicado como incix specialmente na forma de tpioso formular vantag os composições parenterais a administração dosagem unitária para uniformidade da dosagem.
A forma de dosagem ™itárla unidades tal fisicamente como aqui utilizada discretas adequada como dosagens cada unitárias Para contém unidade uma indivíduos quantidade tratados;
^terminada de composto Pre ^do em associação
Α,,-t-ico desejado cm .uAto terapeuLico a serem z-x ca] culada atxvo para com o p r o duz J u „ ,-mo requer^°' o farmacêutico
171
4-ω aceitáveis .dantes fnrmaceutioamente
Exemplos de antioxi _ tais como c antioxidantes s cloridrato incluem’· ácido ascórbico, metabissulfit° antioxidants3 hidroxianisol sódio, similares' de palmitato hidroxitoiueno alfa-tocoferol de ascorbü3' butllado em água, olúveis cisterna,
.. , de sódio sulfrto a® de bissulfato de tais como solúveis em butilado ' , tecitinS' gVato de propala e (3) agentes quelantes de ácido similares' como ácido tais 10 etrleuodtamlnotetracétteo tartárlco, fosf^oo as composições Para as incluem a tópica nasal, n vaginal e/ou parenteral.
metal, (EDTA), sorbitol , ácido similareS· terapêuticas, aquelas da invenção presente administração sublingaa3d ' reta1' convenien podem ser unitária e conhecidos ngrediente aS formulações adequadas Pa bucal e (incluindo As formulações podem ser na técnica +-~ anresentadas temente apr preparadas farmacêutica.
ser combinada que pode produzir uma ndendo do indivíduo . de administração.
particular <-er combinada com ativo que pod - unjtária
Hc dosagem uniw lima forma de produzir uma ador Para variar, depe por na forma de dosage quaisquer métodos quantidade de com um material n^cqaaem unitária ira forma de dosagem , ω do modo a ser tratado e , de ingrediente quantidade um material carr á geralmente a eador para
172 quantidade da composto ..... adequadas n_cões da presente As formulações . . --çâo vaginal também administração vaginais, apraya contei «is „γίroD£ i-adoS · técnica para serem . transdérmica de a —r3ÇàO tÓP1“ sp„ys, —to, incluem pos» sPraY soluções, emplastros e misturado sob farmaceuticamente ou supositórios tampões , incluem formulações de cremes, 9éls' pastas , veículos, como são espumas ou conhecidos na dosagem para .cões desta invenção composiçoes loções, gélS' remes, 0 composto ativo estéreis com um pastas, pode ser formas de 10 inaiantes.
condições veículo conservantes, tampões e com quaisquer r-eoueridos.
nllP possam ser r q oropelentes que P P P administração frases „ +- a i como administrados , administração tópica, usualmente por rngeç intravenosa, aceitável
As parenteral
-a ilizadas, aqur utiu15 -parenteralmente riram modos de significam administração enteral θ sem limitação, inclui, far intrarteriai intramuscular, intracardíaca, intraorbrta , transtraqueal, diferentes • .Vn e infusão infeçao intratecal, intracapsular, intraperitoneal, intrarticular, subeutânea, subaraquinoide, ubcapsular, intradérmica, subcuticular, , , | epidural θ intraesprnhal, rntraestornal
Exemples de veículos aquosos
- APUOSOS adequados nao aquus
173 utlfitados nas compostque podem ser ão incluem água, etanol, P “ olietllenoglucol propllenoglicob, P adequadas, éleos mistura5 injetáveis, tal mantida, fluidez materiais 3 orgânicos adequada pode ser revestimento, manutenção de do tamanho de dispersões, composiÇ°eS farmacêuticas (tars como gllcerol, x θ S U-cl S similares), de oÜva' ral como óleo ,„ pelo uso de pOr exemplo, P a .cc-ma, pela partícula como ™ caso de tensoativos.
podem também conter adgu molhantes, Ά prevenção cU tanto por assegurada pela inclusão de
Estas conservantes, agentes agentes agentes da como emulsC^5 de microrganrsmos sterili-za(?ão presença procedimentos disp® pode rsantes.
de quanto o oor exemplo, antifúngxcos, po e similareS' de
Antibacterianos «rC agentes sòrPlc°.
mPS isotônicos, incluir agentes clorobutanol, parabeno, cio ser desejável
Pode também se >ares, cloreto açucares,
Além disso, de sódio como absorção tais :omposid°es · 20 farmacêutica inj pode ocorrer e similareS prolongada da inclusão nas forma de retardam cao como monoestearato absorçao, de agentes Qae o nelatina. alumínio e 9θ independentemente a-i presente „s compostos da P selecionada, fndepe de administraç da V utilizados oue podem ser ut Invenção q
174 as composições hidratada apropriada sob uma forma formulados em invenção, sao aceitáveis por métodos alas pessoas versadas na técnica, convencionais conhecidos P ingredientes ativos
Os níveis de dosagem efetrvos .
presente £ormas de dosagem tarmaceutrcamente farmacêuticas da da presente nas composiçoes variar de farmacêuticas modo a obter uma guantrdade do — atwo que seja eficaz para atingir a resposta terapêutica para um paciente, ^articular sem administração p uo c-pi ecionado nível de dosagem se fatores tarmacocinétlcos, composição, modo de desej ada tóxico para dependera incluindo o paciente. 0 de uma variedade de a atividade das presente invenção, a
-......... .......... ” . ...o..»·' “ -..... , rticular sendo utilizado, 15 gxcreção do composto partrcul do tratamento, outros farmacos, usados em combinação com as compostos e/ou a taxa de a duração materiais particulares empregadas idade, aúde θ composições condição, estado geral , „ anterior do paciente sendo clinico anieir conhecidos nas artes sexo, peso, tratado, e fatores semelhantes bem médicas.
Um ou veterinário com conhecimentos normalmonte versados na prontamente determinar farmacêutica a quantidade elic- dã composição técnica pode
175 q o clinico . , Por exemplo, requerida.
com doses dos compostos da farmacêutica em ou veterinário podería invenção utilizados na mals baixos do que desejado e terapêutico para atingir desejado ser aumentar gr adualmente a geral.
invenção alcançado. composição da dosagem ate o dlâtia adequada de uma uma dose drarra do composto ' Aouela quantidade sera aquex n produzir um efeito geralmente dos a administração eficaz a h do sθ que e çap dose mais baixa para eficaz dependerá
Ê preferível que 10 fatores descritos acim · inttaperitoneal ou intramuscular, se3a intravenosa, „ada proximal ao sitto a nr-pferência aorni subeutânea, diária e£icaz de desejado, a • r terapêutica pode composição terap uma dose como duas, do alvo. Se ser administrada mais subdoses administradas ou mais oinrante todo o dia, apropriados durante
..r.v-ip.q Embora de dosaqens unrta va da presente invenção ser a nm composto da P para um ^^ct-rar c H administra isoladamente, r-inco, seis 15 três, quatro, can
4-Ω em intervalos separadamente opcionalmente, nas formas seja possível administrado
Em uma horas, composto como modalidade, infusão, administrados Por preferível
- farmacêutica (composição)· Uma £“mUlaÇaO ' s da dnvenÇão podem ser
OS anticorpos da m nor infusão de preferência po
Modo tal como mais de longo período, colaterais tóxicos. A durante um cont i.nua a fim de reduzir
176 administração também pode ser realizada por infusão continua durante um periodo de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Tal regime pode ser repetido uma ou mais vezes conforme necessário, por exemplo, após 6 meses ou 12 meses. A dosagem pode ser determinada ou ajustada através da medição da quantidade de anticorpos monoclonais anti-CLDNÔ circulantes mediante a administração em uma amostra biológica pelo uso de anticorpos anti-idiotipicos que alvejam os anticorpos anti-CLDN6.
Em ainda outra modalidade, os anticorpos sao administrados por terapia de manutenção, tal como, por exemplo, uma vez por semana durante um período de 6 meses ou mais.
Em ainda outra modalidade, os anticorpos de acordo com a invenção podem ser administrados por um regime incluindo uma infusão de um anticorpo contra CLDN6, seguido por uma infusão de um anticorpo contra CLDN6 conjugado a um radioisótopo. 0 regime pode ser repetido, por exemplo, de 7 a 9 dias depois.
Em uma modalidade da invenção, os compostos terapêuticos da invenção são formulados em lipossomas. Em uma modalidade mais preferida, os lipossomas incluem uma porção de alvejamento. Em uma modalidade mais preferida, os compostos terapêuticos nos lipossomas são distribuídos por
177 injeção em exemplo, o de maneira η n Área desejada, por bolo num local proximal a local de um tumor. A composição deve ser fluida que exista uma facil serrngabilldede. Ela deve , -Fabricação e armazenamento estável sob as condições de fabrrcaça , . acão contaminante de e deve ser preservada contra a açao a tais como bactérias e fungos, microrganismos, tais g o-,c· anticorpos da invenção modalidade adicional, os antzcorp
Em uma podem ser transportes r-a nrevenir ou reduzir os seus formulados para p através da placenta. isto pode pot métodos conhecidos dos anticorpos ou referências podem na técnica, por exemplo, por PEGuilação pelo uso de fragmentos F(ab)2<. Outras ser feitas a «Cunningham-Rundles C, Zhuo z Griffith B, Keenan J. Β-^-οΙ activities of polyethylene-glycol i»unoglobulin conjugates. Resistance to enzymatic degradation. J190; e a Landor M. (1995) immunoglobulins, Ann. Allergy
Immunol. Methods, 152; 177
Maternal-fetal
Asthma Immunol.
oma dosagem terapeutlcamente eficaz tumoral pode ser medida por transfer of
74: 279-283.
para terapia respostas tumorais objetivas, que podem completas v-ra marciais. Uma resposta quanto parcicuo completa (CR) é definida como de evidência radiológica ou outra, de doença. Uma resposta do tumor parcial (PR) aqreqado de mais do que uma redução no tamanho
50%. 0 tempo médio de progressão
178 medida que caracteriza a durabilidade da resposta ticamente eficaz” para a «rapra Uma -dosagem tapeai — _ ί λαΥο t θ t V 3· · tumoral onj« tumoral também pode ser medida Ρθ13 sua capacidade de estabilizar a progressão da doença.
A capacidade de um composto para inibiu câncer pode ser avaliada em um sistema de humanos.
composição composto técnica.
tumores de eficácia em preditivo oHade de uma esta propriedade
... se da capacidade do por analise celular ou crescimento cei para inlblr pelo 1 -rsado papeuticamente efio» de tamanho do tumor, os sintomas em um xndrvi modelo animal
Alternativamente, pode avaliada apoptose P°r na in vitro conhecidos composto
Uma quantidade terapêutico pode diminuir um ou,
Uma forma, melhorar de outra versada na técnica seria capaz pessoa quantidades com base em fatores, de determinar como o tamanho do indivíduo, composição gravidade dos ou s intornas do indivíduo da de administração elecionada.
A composição deve ser fluida seringa.
• ao é administrável por que a composição „ ,ciraio P°de - - .O1UP.O 3 „)llox (Por ”-iCerO1' , similares), le„o91ic«> UqxWo.
na medida em
Além de água, alina tamponada isotônica, propilen°glico1' mistura
179 adequadas destes.
A fluidez exemplo, po nPia manutenção utilização de do tamanho de dispersão utili-zad&o ser mantida, P°r adequada pode se
1-0 tal como iecitina, reVestimento tax Qr-q do no caso de partícula requerí de tensoativos. Em muitos
2sotônicos, pela . , incluir agentes preferível mo ,tai.s como poliálcoois composição.
per ou açúcares, +-Π de sódio na e cloreto de injetáveis pode „razo das composites lod9° praz um agente pela inclusão exemplo, sorbitol, na composição
A absorção a ser provocada que retarda a 10 absorção, P°r exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.
Quando o composto como descrito acima, oral, P°r exemplo, atrvo é adequadamente ptotegido, rte Ser administrado por composto pode nerte ou um vercul nm diluent6 rner com um u-LJ1. comestível assimilávell-3 , ,Λ_ Ha Invença°IV. Usos e Meto -nados, composiç°es ,incluindo imunocongugados, 1 a derivados aqui e outros aerx o utilidades têm numerosas
Os anticorpos biespecm»=/»ltiespecl£1MS' cprite invenção
-ros) da presente descritos) que envolvem o 20 terapêuticas envolvendo as por de distúrbios tratamento «e expressar» OM de CLDN6 com asSociaçao de que caracterizados _ - r-clulares. por superfície. - a P°r exemplo, , -s células em cultura, P administrados as os anticorpos exemplo, sendo as suas podem ser
180 como . a indivíduos
Vivo, OU a humanos , aoui descritos.
aqueles aq*3exemplo, in vivo, variedade de distúrbios, tais , . Q nreferidos incluem Indivíduos pre.
corrigidos que podem ser la morte das células doentes, em particular ou melhorados pel células caracterizadas pacientes bumanos com distúrbios de expressão alterado por um padrão •οοαω de CLDN6 com , alterado de associaçao de CLDN6 e/ou um padrao lulares em comparação com as células as suas superficies celulare normais.
Por exemplo, em uma modalidade, anticorpos da presente invenção com um distúrbio podem ser rratar um indivíduo usados para tratar tumorigênico, por exemplo, Um distúrbio de células , nela presença caracterizado pe ntAfterizado pela CEDN6 e sendo car expressam CLDiw tumorais que associação de _ auas superfícies 15 CLDN6 com as celulares.
Exemplos de doenças tumorigénicas gue podem ser tratadas e/ou prevenidas englobam todos os cânceres que expressam CLDN6 e entidades tumorais, incluindo aquelas aqui descritas.
métodos de tratamento s-icões farmacêuticas e composiçoe.. ~ também invenção pooem uns de acordo com a descritos ~ nara prevenir uma . ou vacinaçao para pr i nara a imunização tilizados para doença aqui descrita.
Em outra modalidade, os anticorpos da invenção podem er utilizados para detectar ' Pis de CLDN6 ou de formas níveis
181 , P1S de células que contêm CTDN6, oU nivel particulares e cujos níveis podem b da membrana, J nu sintomas de doença a = a certas doenças ou ligados a cei
CLDN6 nas suas superficies então
Alternativamente, acima· como os descritos utilizados para esgot expressam 5 anticorpos podem ser a função das com a rung.
células que caracterizadas Por celulares, associaçao de
CLDN6 ou interagir
CLDN6 e com as são suas superfícies implicando, dessa f o rma, estas células como mediadores importantes da doença.
Isto pode 10 ser conseguido atreves entre uma amostra e um do contato entre amostra de controle n anticorpo com o oiii anti-CLW6 sob condições que permitam a formação de um complex0 entre anticorpo anticorpo
CLDN6. Quaisquer complexos , ^ns e comparados
CLDN6 são detect formados entre na amostra 15 numa amostra de controle, lsto θ' uma amostra de referência.
anticorpos
Os testados quanto às da invenção podem atividades de ser inicialmente ligaçao associadas com ou de diagnóstico testados vitro.
utilizando ex®'?-'-0' anticorpos podem ser os anrió· r . Heecritos.
, ia de fluxo tais como agur dea“ dB dem ser utilizados pa« anticorpos da l^ençao P . Has seguintes descobrir m . · 1 uHor· biológicas.
atividadeo . .h,r o crescimento Uou inibir o
182 ~ Um nma célula eme expressa CLDN6 e é diferenciação de uma ceruia ψι n caracterizada por associação celular; matar uma célula caracterizada por associação de CLDN6 com a sua superfície que expressa CLDN6 e sendo de CLDN6 com a sua superfície celular; mediar a fagocitose ou ADCC de uma célula que expressa CLDN6 e sendo caracterizada por associação de CLDN6 com a sua superfície celular na presença de células efetoras; mediar CDC de uma célula que expressa CLDN6 e sendo caracterizado pela associação de CLDN6 com a sua superfície celular na presença de complemento;
mediar a apoptose de uma célula que expressa
CLDN6 sendo caracterizada por associação de
CLDN6 com a sua superfície celular; induzir a adesão homotípica, e/ou induzir a translocaçao em bolsas lipídicas mediante a ligação de
CLDN6.
Em uma modalidade particular, os anticorpos utilizados vivo ou in vitro para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de doenças relacionadas com
CLDN6. Exemplos de doenças relacionadas com CLDN6 incluem, entre outras, cânceres tais como os aqui descritos.
Como descrito acima, anticorpos anti CLDH6 da invenção podem coadminist rados com um ou mais outros agentes exemplo, um agente citotóxrco, um agente radiotóxico, um agente antiangiogênico ou um agente
183 ...................... ,, anticorpos da (tal como um imunocomplexo) liaado ao agente (ta 1 9 /mente. Neste separado do agent pode estar ou pode último caso administrado em separada), o anticorpo P simultaneamente com o agente (administração antes, após ou coadministrado com outras uma terapia ant icâncer, administrado ou pode ser . conhecidas, P°r terapias cum* j qrÃO T 3-1 S como radiaçao.
exemple, agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes 10 antlneoplásicos, coadmlnlstraçao como aqueles listados acima. A dos anticorpos anti-CLDN6 da presente invenção com agentes anticancerigenos fornece dois agentes qulmioteráprcos fornec de diferentes que operam atrave Pfeito citotóxico para . „s oue produzam um efert mecanismo. q node ς Tal coadministraçao pod tumorais. . ,~nCia desenvolvimento de resi na antlgenlcidade das células i5 células problemas devido ao resolver aos fármacos ou a uma mudança tumorais, o que as tornaria não reativas com o anticorpo.
As composições (por cornos, moléculas exemplo, anticorpos, multiespccif ica·.’ têm biespeci1icas e imunoconjugados) da invenção que sítios de 119UÇã° como porções de ^plemenl-o, complemento.
Em ume modalidade, o
IgGl, 2 ou 3 do complemento, tais também podem ser
OU IgM que se liga ao
usadas Ϊ13- presença de
tratamento e. x vivo de uma
184 população agente de podem ser de células compreendendo as células alvo com um ligação da invenção uplementado pela oro contendocomplemento.
células efetoras adequadas adiçao de complemento ou de
A fagocitose das células alvo revestidas com um agente de ligação da presente invenção pode ser melhorada através da ligação de complemento. Em outra modalidade, as revestidas com as composições da lisadas pelo complemento, composições da invenção não
As composições da proteínas do células alvo invenção podem também
Em ainda outra modalidade ativam o complemento.
invenção podem também administradas juntamente com complemento dentro do escopo da invenção as composições anticorpos moléculas multiespecifrcas ser as ser
Assim, estão que compreendem ou biespecíficas
Pgfas composições são vantajosas na soro ou complemento. Estas p medida em que o complemento está localizado em estreita proximidade com ou biespecificas.
anticorpos, moléculas multiespecificas
Alternat ivamente, multiespecificas anticorpos, moléculas ou biespecificas da invenção e complemento ou soro podem A ligação das composições ser administrados separadamente, da presente invenção nas células r-dnc-ar a translocação do alvo podo causar.
complexo antígeno anticorpo de CLDN6 em bolsas lipidicas da membrana celular.
185
Tal translocação cria uma elevada densidade antígeno-anticorpo que pode eficientemente de complexos ativar e/ou intensificar a CDC.
Também estão kits que compre invenção (por e> instruções de ut mais reagentes imunossupressor, radiotóxico, ou invenção (por exe dentro do escopo da endem as composiçõe emplo, anticorpos e .lização. O kit pode adicionais, tais um agente citotóx um ou mais antico pio, um anticorpo pos complementar) .
Consequentemente, os composições do anticorpo 15 adicionalmente administrados ou após a administração de outro agente terapêutico, tal radiotóxico, o qual intensifica resente invenção os de anticorpo da imunoconjugados) e ainda conter um ou como um reagente Í.CO OU um agente rpos adicionais da >suindo uma atividade pacientes tratados com as da invenção podem ser (antes de, simultaneamente com um anticorpo da invenção) com como um agente citotóxico ou ou aumenta o efeito terapêutico dos anticorpos da invenção.
Em outras modalidades, indivíduo pode ser adiciona.! mente tratado com um exemplo, intensifica ou inibe, a receptores Fc-gama ou Fc-alfa, agente que modula, por expressão ou atividade dos por exemplo, tratando o indivíduo com uma citocina.
Citocinas preferidos incluem
186 fator estimulador de colônias , · ,ίnAnr Hp colônias fator estimulador oe (GM-CSF), interferon γ (IFF γ) de granulócitos (G-CSF), o de granulócitos e macrófagos e fator de tumoral , c poentes importantes para (TNF) · Outros agenL.es> r ânbra dos anticorpos eficácia terapêutica aumento da das composições descritas sao β-glicanas, que farmacêuticas aqui descrir homopolissacarideos de resíduos de glicose são produzidas Por uma microrganlsmos, por exemplo, , Ω nrãos Fragmentos leveduras e grãos.
podem ser também organismos β-glicana um polímero de são variedade bactérias, ramificada e de plantas que algas, fungos, de β-glicanas produzidos por utilizados. De preferência, glicose, em que pelo menos algumas das unidades estruturais de glicose, por exemplo, possuem
Em métodos a 6% das unidades estruturais de glicose, ramificações, tais como ramificações ¢(1,6).
de 3 uma para amostra, ou modalidade detectar a medir a particular, a invenção fornece presença do quantidade antigeno CLDN6 de antigeno em uma
CLDN6, compreendendo controle, com
CLDN6, um contato da amostra, uma amostra de um anticorpo que se liga sob condições que permitem a especificamente à formação de um complexo ctdN6 A formação o anticorpo, ou porção do -smo, o CLDH6.
então detectada, em que uma diferença de complexo
187 formação de complexo entre a amostra comparada com a amostra de controle é indicativo da presença do antigeno CLDN6 na amostra.
Em ainda outra modalidade, a invenção fornece um método para detectar a presença ou quantificar as células que expressam CLDN6 e sendo caracterizadas pela associaçao de CLDN6 com as suas superficies celulares in vivo ou in vitro. O método compreende (i) administrar a um indivíduo uma composição da invenção conjugada com um marcador detectável, e (ii) expor o indivíduo a um meio para detectar o dito marcador detectável para identificar áreas que contêm células que expressam CLDN6 e sendo caracterizadas pela associação de CLDN6 com as suas superfícies celulares.
Métodos como os descritos acima são úteis, em particular, para o diagnóstico de doenças relacionadas com CLDN6 e/ou a localização de doenças relacionadas com CLDN6, tais como doenças cancerígenas. De preferência, uma quantidade de CLDN6 em uma amostra que é maior do que a quantidade de CLDN6 em uma amostra controle é indicativo da presença de uma doença relacionada com CLDN6 em um indivíduo, em particular um ser humano, a partir do qual a amostra é derivada.
Quando utilizado em métodos como descritos acima, um
188 anticorpo aqui descrito pode ser fornecido com um marcador que funciona para: (i) fornecer um sinal detectável; (ii) interagir com um segundo marcador para modificar o sinal detectável fornecido pelo primeiro ou segundo marcador, por exemplo, FRET (Transferência de Energia por Ressonância de Fluorescência), (iii) afetar a mobilidade, por exemplo, a mobilidade eletroforética, por carga, hidrofobicidade, formato ou outros parâmetros físicos, ou (iv) fornecer uma porção de captura, por exemplo, afinidade, anticorpo/antígeno ou complexação iônica. São adequados como marcadores estruturas, tais como marcadores fluorescentes, marcadores luminescentes, marcadores cromóforos, marcadores radioisotópicos, marcadores isotópicos, de preferência marcadores isotópicos estáveis, marcadores isobáricos, marcadores de enzimas, marcadores de partículas, em particular marcadores de partículas metálicas, marcadores de partículas magnéticas, marcadores de partículas poliméricas, moléculas orgânicas pequenas tal como biotina, ligantes de receptores ou moléculas de ligação, tais como proteínas de adesão celular ou lectinas, sequências de marcação compreendendo ácidos nucleicos e/ou resíduos de aminoácidos que podem ser detectados pelo uso de agent.es de ligação, etc. Os marcadores compreendem, de uma forma não limitativa, sulfato de bário, ácido
189 iocetâmico, de t i ropanoato ácido iopanoico, emissores de diatrizoato de sódio ipodato de cálcio, diatrizoato de meglumina, metrizamida, rádio diagnóstico, incluindo tais como flúor 18 carbono-11, . , ιοί 1ecnécio-99m, iodo 131 t-τίς como iodo-123, recue — emissores gama, tais como indio-lU, nuclídeos para ressonância magnética nuclear, tais como flúor e gadolinio.
Em ainda outra modalidade, imunoconjugados da invenção exemplo, podem , mp-r-A alveiar compostos (por ser utilizados para aivejaz mArradoiss, citotoxinas, agentes terapêuticos, marcador c Ale ) cara células que têm radiotoxinas, imunossupressores, etc.) Ρ suas superficies através da ligaçao
CLDN6 associada com as de tais fornece compostos ao métodos para a que expressam
A<vim a invenção também anticorpo. Assim, a localização de células ex vivo ou m CLDN6 e são caracterizadas associação de CLOhê com as suas superfícies celulares, como células tumorais circulantes.
á adiei onalmente ilustrada A presente invenção e adicion por pelos ctue não devem ser interpretados como seguintes exemplos, g limitantos do escopo da invenção.
exemplos , , , „ „nrPSente invenção técnicas e métodos utilizados na presen aqui descritos ou realizados de uma maneira conhecida conforme descrito, por exemplo, em Samhrook e
190 col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Todos os métodos incluem o uso de kits e os reagentes são utilizados de acordo com a informação do fabricante, a menos que seja especificamente indicado.
Exemplo 1: Quantificação da expressão de CLDN6 em tecidos normais, tecidos cancerosos e linhagens celulares utilizando PCR-RT em tempo real.
O RNA celular total foi extraído a partir de espécimes de tecido congelado e linhagens celulares cancerosas utilizando o minikit RNeasy (Qiagen) , preparado com um oligonucleotídeo dTi8 e transcrito reversamente com Superscript II (GIBCO/Lifetech), de acordo com as instruções do fabricante. A integridade do cDNA obtido foi testada por amplificação dos transcritos p53 em um PCR de 30 ciclos. Após a normalização para HPRT, a expressão de
CLDN6 foi quantificada usando o cálculo ΔΔΟΤ.
Tecidos de três indivíduos foram testados para cada Lipo de tecido normal. Apenas quantidades traço de Lranscritos de CLDN6 poderíam ser detectadas em tecidos normais após 40 ciclos de RT-PCR. O único tecido normal que excedeu ligeiramente o corte de expressão foi a placenta.
Ao contrário dos tecidos normais, nós encontramos alta expressão de CLDN6 em amostras de câncer de ovário
191 (adenocarcinomas), câncer frequência níveis de /muctC com maior de pulmão (NSCLC, em adenocarcinomas), express90 eu câncer hepátlco, câncer câncer de mama, cancer pancreático, ap. células basais Hp nele (carcinoma de câncer de pei« carcinoma de ,( melanoma maligno, câncer escamosas) , ge cabeça pescoço (sarcoma sinovial (adenoma pleomórfico = carclnossarcoma) , maligno), sarcoma câncer do duto . (carcinoma de células claras câncer de célula renal (carci biliar, cancer e carcinoma papiíar), câncer cancerosas Ά2780 ovário), HCT-116 (câncer de uterine e linhagens ovário), IUH-0VCAR3 de células (câncer de ovário), CPC N (câncer de cólon), ^-21 (SCLC), NCI-H552 (NSCLC), (câncer de
SNU-1 (câncer
YAPC (câncer gástrico),
KATOIII (câncer
A 4- ϊ ΓΩ 'l AG S pancreatico)r (câncer gástrico),
FU97 (câncer 15 gástrico) , câncer de
Exemplo 2: 0^^=^° tecidos normais, tecidos e linhagens
CLDN6 em celulares ãe de de Western blot.
s análise de Western Para a andu , o -t-oial extraída de proteína totai g os extratos i ήse Laemmli· os , de amostra (Both), redução cie blot foram utilizadas 20 μς
Células Usadas com o tampão diluídos em tampão de foram diiuiw submetidos à SDS-PAGE e t-p eleirotransf eri'dOS subsequentemenfmembrana
PVDF p imunomarcaçao reali zada com anticorpos
192 oara CLDN6 (ARE) policlonais reativo (Abeam), seguido pela detecção beta-actina anticorpos primários com unticorpos secondary de cabra anti-coelho ou de cabra ^camundongo conjugados com a peroxidase de rábano silvestre (Dako)·
Hnb de tecido de ate Lisados αθ cinco indivíduos foram normal. Nenhuma expressão testados para cada tipo de tecido • CLDNê foi detectada em gaalguer um PMte eZ dos. Ao contrário dos tecidos normais, normais analisai . C-LDN6 foi detectada em amostras = n de proteína CLDNo alta expressão de P , · o câncer de pulmão. A de câncer do ovário e oanoe em NIH-OVCAR3 (câncer de expressão de ovário), MKN7
CLDN6 foi detectada
HCT-110 (câncer de
AGS (câncer gástrico) , cólon), FU97 (câncer j-oc-t-icular embrionário), JAR (carcinoma testicui placenta), (coriocarcinoma de (coriocarcinoma da placenta) e PA-1
Exemplo
3: Análise
CPC-N (SCLC), gástrico), NEC8 (coriocarcinoma de placenta), BEWO (teratocarcinoma de (IHC) da expressão de CLDN6 em _ tecidos cancerosos . tecidos normais e tec (4 pm) foram em parafina
Seções
Incubadas de tecido embebidas
58°C em uma placa de aquecimento removida (HI 122 0, Leica)· A parafina q- in-is em Roticlear (Roth) das laminas cm das seções durante 2x1°
193 ao as seções foram mun em temperatura ambiente. Em seguida.
™ álcool graduado (99 reidratadas em alcoo g
A recuperação dos min cada)· x 96%, 80% e 70%, 5 antigenos foi realizada pela ebulição das lâminas a 120 (15 psi) durante min em tampão citrato 10 mM (pH 6,0) + Tween-20 0,05c.
Diretamente após a ebulição, as i»~~s foram incubadas em
PBS durante a da peroxidase endógena foi bloqueada com A atividade da percA ' /Hn de hidrogênio 0,3 peroxide oe min.
temperatura as lâminas em MeOH durante 15 min em ambiente. Para evitar a ligação não foram bloqueadas com soro de cabra a 10o e durante 30 etnra ambiente. Logo após, as min em temperatura foram incubadas com lâmmas foram anticorpo policlonal
CLDN6especifico (1 (ARP) de um dia para ° outr° 3 dia seguinte, as lâminas foram lavadas com
PBS em dos temperatura ambiente min) e anticorpos secundários (IgG incubadas com 100 μΐ
HRP-anti-coelho poli
PowerVision pronta para uso (ImmunoLogic) ) durante uma hora , Posteriormente, em temperatura ambiente. Post as lâminas foram prç em temperatura lavadas com PBS ambiente min). A realizada usando o kit de substrato marcação final 1 oK-4800 fie Vector
VECTOR NovaRED on contramarcadas com (Burlingame).
hematoxiliua durante 90 foram segundos temperatura ambiente.
Após a desidratação com álcool graduado
80!
96% e 99%, 5 min cada) e 10
194 min de incubação em xilol as lâminas foram montadas com ο _tra (Medite Histotechnic).
~ He oroteína CLDN6 foi detectável em Nenhuma expressão P tecidos normais de pulmão, pâncreas, fígado, duodeno ou rins, normais, marcação forte ou pelo observada em seções de pulmão, câncer de tecido de estômago, cólon,
Ao contrário dos tecidos menos significativa foi câncer de ovário, câncer de pele, câncer pancreático, câncer mama, câncer de texíga (carcinoma de gástrico, câncer de a transição), câncer cervical, cancer células de transia , testicular câncer (seminoma) acentuada na membrana plasmátlca uterino. A marcação foi das populações claramente de células epiteliais resultados ω células estromais e enquanto que as ceiui
Ementes foram negativas. Estes não malignas adjacentes p a proteína CLDN6 está localizada na indicam que a proveu de células malignas.
malignas, membrana plasmátlca _P1O 4: ae ζζ ' Geraçào ae vetores ae total e fragmentos de CLDN6.
de . de DNA códon-otimizada nao
Uma sequencia de
CLDN6 de comprimento natural total (número de
NO:
vosso NCBI NPJ^OW·2' SEQ ID N0: 2> fOÍ preparada por /rvNPART AG, Alemanha) química (GENEAlo i , clonada no vetor
PUA) produzindo o vetor pcDNft3.1/myc-H- (invU-rogen, ™A> ,
195 inserção de um códon de parada permitiu a ~ da nroteína CLDN6 sem ser fundida com expressão da prorciu myc-His codificada testada por Western imunoflucrescêncra a etiqueta do vetor. A expressão de blot, citometria de fluxo utilizando anticorpos
CLDN6 foi análises de anti-CLDN6 disponíveis comercialmente (ARP,
MAB3656) .
Além disso, uma sequência de
ID NO:
que codifica para extracelular putativo 2 (EC2) de uma fusão
N-terminal assegurar (SEQ ID
01-8865;
R&D Systems,
DNA códon-otimizada (SEQ fragmento do
CLDN6 (SEQ ID NO:
domínio como com um peptídeo sinal derivado do líder
Ig seguido por 4 aminoácidos adicionais um correto sítio de divagem de peptidase capa para sinal
NO:
foi preparada e clonada no vetor pcDNA3.1/myc-His, produzindo expressão do fragmento imunização, microscopia de transitoriamente vetor p3974. Antes da
EC2 foi confirmada por imunofluorescência transfectadas (PFA), usando um em células CHO Kl fixadas com anticorpo anti myc paraformaIdeido ί /roll Dianaling, MAB 2276)· comercialmente disponível (Cell Signaii g, b. Geração de linhagens celulares estavelmente CLDN6 .
As linhagens celulares expressam estavelmente CLDN6
HEK293 e P3X63Ag8U.l que foram geradas por técnicas
196 padrão, utilizando o vetor p3953.
c. Imunizações.
Camundongos Balb/c foram imunizados com 25 μg de DNA de plasmideo p3974 em conjunto com 4 μΐ de PEI manose (PEI
Man; in vivo-jetPEI™-Man de PolyPlus Transfection) (150 mM de PEI-Man em EQO com 5% de glicose) por injeção intraperitoneal nos dias 0, 16 e 36. Nos dias 48 e 62, os camundongos foram imunizados por injeção intraperitoneal com células de mieloma P3X63Ag8U.l transfectadas com o vetor p3953 para expressar estavelmente CLDN6. As células administradas no dia 62 foram irradiadas com 3000 rad antes da injeção. A presença de anticorpos direcionados contra CLDN6 em soros de camundongos foi monitorada por microscopia de imunofluorescência entre os dias 20 e 70, utilizando células CHO-K1 cotransfectadas com ácidos nucleicos que codificam CLDN6 e GFP. Para esta finalidade, 24 h após a transfecção, as células fixadas ou não fixadas com PFA foram incubadas com uma diluição de 1:100 de soros de camundongos imunizados durante 45 minutos em temperatura ambiente (RT) . As células foram lavadas, incubadas com um anticorpo Ig anti-camundongo marcado com Alexa555 (Molecular Probes) e submetidas à microscopia de fluo re s cê n c i a.
197
Anticorpos anti-CLDN6 es amostras de soro obtidas a base no qual o hibridoma figura 2.
Para a geração de camundongos com respostas foram reforçados quatro dias de injeção intraperitoneal estavelmente transfectadas c
d. Geração de hibrid· pecíficos foram detectados nas partir de um camundongo, com F3-6C3-H8 foi produzido; ver anticorpos monoclonais, os imunes anti-CLDN6 detectáveis antes da esplenectomia através de 2 x 107 células HEK293 om o vetor p3953.
□mas produtores de anticorpos monoclonais murinos contra CLDN6.
θ x 107 esplenócitos isolados a partir de camundongo imunizado foram fundidos com 3 x 10 células de linhagem celular de mreloma de camundongo P3X63Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) utilizando PEG 1500 (Roche, CRL 10783641001). As células foram semeadas a cerca de 5 x células por poço em placas de microtitulaçâo de fundo chato e cultivadas durante cerca de duas semanas em meio seletivo , ipç cnrn fetal bovino inativado pelo calor a 10 RPMT contendo soro rerai uu suplemento de clonagem e fusão de hibridoma a 1% (RFCS,
Rocho, CRL 11363735), HEPES 10 mM, piruvato de sódio 1 mM glicose 4,5%,
2-mercaptoetanol
0,1 mM, suplemento 1 x penicilina/estreptomicina e 1 x HAT (Invitrogen, CRL
Após 10 poços individuais foram
198 testados por citometria de fluxo para os anticorpos monoclonais anti-CLDN6. Hibridomas secretores de anticorpos foram subclonados por diluição limitante novamente subclones estáveis anticorpos monoclonais foram cultivados para quantidades de anticorpo em meio de cultura anti-CLDN6. Os gerar pequenas de tecidos para caracterização. Pelo menos um clone de cada hibridoma que reteve a reatividade das células de origem (testado por citometria de fluxo) foi selecionado. Bancos de células de nove frascos foram gerados para cada clone e armazenados em nitrogênio liquido.
Exemplo
Características de ligação dos sobrenadantes de hibridoma e anticorpos monoclonais.
Controle de qualidade de células HEK293T
Western blot análises de citometria de fluxo.
Células HEK293T foram transfectadas com ácidos nucleicos que codificam
CLDN3, CLDN4, CLDN6
CLDN9, respectivamente, ou pseudotransfectadas. A expressão de
CLDN3, CLDN4,
CLDN6 ou CLDN9 em células HEK293T foi determinada por
Western blotting. Para esta finalidade, as coletadas 24 horas após a transfecçao e submetidas
O lisado foi submetido a ujDS PAGE,, em membrana de nitrocelulose e marcado com
199 anticorpos anti-CLDN3(A) (Invitrogen, 34-1700), antiCLDN4(A) (Zymed, 32-9400), anti-CDLN6(A) (ARP, 01-8865) ou anti-CLDN9 (A) (Santa Cruz, sc-17672), que se ligam especificamente ao C-terminal da claudina correspondente sob condições de desnaturação. Após a incubação com um anticorpo secundário marcado com peroxidase e desenvolvimento com reagente ECL, um visualizador LAS-3000 (Fuji) foi utilizado para visualização. Bandas dos pesos moleculares esperados de CLDN3, CLDN4, CLDN6 e CLDN9, respectivamente, foram observadas apenas nas células transfectadas, mas não nas células controle (Figura 3), demonstrando que as células HEK293T não expressam endogenamente gualquer uma das claudinas investigadas e, assim, são uma ferramenta adequada para determinar a reatividade cruzada de anticorpos CLDN6.
(ii) As células HEK293T de (i) foram adicionalmente analisadas por citometria de fluxo, utilizando anticorpos anti-CLDN que reconhecem epitopos nativos (IgG2a anti-CLDN3 de camundongo (R&D, MAB4620), IgG2a anti-CLDN4 de camundongo (R&D, MAB4219), IgG2b anti-CLDN6 de camundongo (R&D, MAB3656)). Os anticorpos obteníveis a partir de Sigma, sob os números de produto M9144 e M8894 serviram como controles dc isotipo. A especificidade destes anticorpos anti-CLDN foi analisada utilizando células
200
... transfectadas com ácidos nucleicos hek293T transitoriamen respectlvamente.
que codificam
O anticorpo
CLDN3, CLDN4, CLDN6 e CLDN9 mostra reatividada cruzada com anti-CLDN6 e CLDN9.
O anticorpo anti-Cid» mostra
CLDN3, CLDN6 e CLDN9. 0 antrcorpo - à CLDN3 (figura 4)·
CLDN3, CLDN4 reatividade cruzada com , liaa especificamente à Chuno ant^CL Se L da’ b Determinação dav . de acordo com a invenção utiliza» o monoclonais produzidos de acor citometria de fluxo.
Células HEK293T foram cotransfectadas ctDN e um vetor que codifica codifica diferentes proteínas CLDN um marcador de fluorescência. 24 h após a transfecção, as células foram coletadas usando
0,05 lavadas com tampão FACS solução de tripsina/EDTA (PBS contendo FCS a 2o e , , . c n 1%) . As células azida de sodio a 0,1 o) placas de microtitulação com fundo por poco e incubadas durante 60 min foram transferidas para
Ti 3 2 x 105 células em U a z χ a 4°C com sobrenadantes brâo vezes com tampão FACS, 3 Anós lavagem por tres de hibridoma. Apos ia y as células i_i movpo secundário , 3 r-om um anticorpo foram incubadas l+2ai2b+3 anti-camundongo conjugado com aloficocianrna (APC) (Dianova,
115-135-164).
Posteriormente, células foram lavadas duas vezes ritometria de fluxo utilizando . r '-,ηα oor c .cr orne o j-j-α ligação foil avaliada po.
um
BD FACSArray (p-igura
A expressão do marcador de
201 fluorescência θ horizontal contra representada graficamente no eixo a ligação do anticorpo no eixo vertical.
Um anticorpo IgG2b anti CLDN6 de disponível (R&D, MAB3656) serviu e o anticorpo obtenível a partir camundongo comercialmente como um controle positivo de Sigma, sob o número de produto M8894, serviu como um controle de isotipo.
Os anticorpos hibridoma monoclonal
6C3-D8 foram
CLDN3 e F3-6C3-G4, específicos
CLDN4.
resultados para
H8. Os anticorpos nos sobrenadantes dos subclones
F3-6C3-H2, F3-6C3-H8, F3 603 H9, todos derivados do para CLDN6 e não se
A figura 5A mostra subclone de hibridoma de
F3hibridoma F3-6C3, ligaram à CLDN9, exemplarmente os monoclonal F3-6C3 no sobrenadante do subclone de hibridoma monoclonal E3-6C3-H8 também transfectadas com variante anticorpos no sobrenadante se ligaram às células (I143V)-SNP do subclone de CLDN6. Os de hibridoma monoclonal se legaram tanto à CLDN6 gnanto CLDN9 (Figura 5A) . Os anticorpos no sobrenadante do subclone de hibridoma monoclonal F3-7B3-B4 se legaram à CLDN6, CLON3 ςρι Os anticorpos no sobrenadante CLDN9 (Figura 5B). Os ancí h do subclone de hibridoma monoclonal F3 3F7
CLDN6, CLDN4 e CLDN9 (Figura 5B).
Exemplo
6: Geração e teste de anticorpos monoclonais contra CLDN6.
202
a. Geração dos vetores de expressão que codificam ο domínio extracelular 1 de CLDN6.
Uma
12) que putativo sequência de codifica
DNA otimizada por códon fragmento do dominio (SEQ ID NO:
(ECI) de CLDN6 (SEQ ID NO: 7) como uma fusão com
Ig capa N-terminal um peptideo sinal derivado líder por 4 aminoácidos adicionais, para assegurar sinal (SEQ ID sitio de clivagem de peptidase vetor pcDNA3.1/myc-His, preparada e clonada no vetor p3973. Antes
EC1 foi confirmada células CHO-K1 da por um
NO:
seguido correto
13) foi produzindo o imunização, a expressão do fragmento microscopia de imunofluorescência em fixadas em paraformaldeido (PFA) transitoriamente transfectadas, usando um anticorpo astimyc comercialmente disponível (Cell Signaling, MAB 2276).
b. Imunização.
Camundongos Balb/c foram imunizados com 25 pg de DNA de plasmideo p3973 em conjunto com 4 μΐ de PBf-manose (PEIMan; jetPEI™-Man in vivo de em H;>0 150 mM com glicose a
PolyPlus Transfection) (PEI Man por injeção intraperitoneal nos dias 0 e 14. Nos dias 28 e 44, os imunizados subcutaneamente com peptideos camundongos foram
KLH-conjugados SEQ ID no; 14 e SEQ ID NO: 15 (100 d® Cada em PBS' JPT
Peptide Technologies GmbH, Alemanha), juntamente com PTO
203
CpG-ODN purificado TCCATGACGTTCCTGACGTT;
por HPLC (25 Ρ9
Eurofins MWG Operon, em PBS;
Alemanha).
5' Nos dias 64, 77
97, os camundongos foram imunizados por injeção intraperitoneal ί -iniarc de mieloma células ue vetor p3953 para expressar administração, as células estavelmente etc-· — Aldrlch, . . „ r l2 5 ug/ml, Siqma-Aldricn, tratadas com mitomrcrna-C (20 ,9 foram trarauao . •-,+-<αοΙαο , Ί mAd foram administradas <4e 97, as células forai M4287). Nos dias 64
P3X63A98U-1, transfectadas
CLDN6. Antes da juntamente com pTO.CpG-0DN purificado por “
PBS), no . com adjuvante de Freund
17, juntamente com auj incompleto.
Para a nrão de anticorpos monoclonais, os geraçao Q Hetectáveis anti-CLDN6 . com respostas imunes detect camundongos com v foram reforçados quatro dias antes injeção intraperitoneal de da esplenectomia com
107 células HEK293 vetor estavelmente transfectadas com
Teste de anticorpos monoclonais p3953.
contra CLDN6.
tometria djg—fdaixo
Para irqação dos anticorpos monoclonars à
CLDN6 transitoriamente claudina correspondente a HUK793T foram as células homologos, as
-i nsmideo codificador feriadas com o plasmi transtecraucio ~ -Fní analisada por e a expressão foi anai h ro células otria de fluxo. A fim de diferencxar citomotria ui.
204 transfectadas e cotransfectadas umrelator. 24 coletadas com (PBS contendo não transfectadas, as células HEK293T de fluorescência com um marcaoor ue h após a transfecção, tripsina/EDTA 0,05%, lavadas com ressuspensas em células/ml. 100 com foram como foram tampão FACS
FCS a azida de sódio tampão FACS a uma μΐ da suspensão de anticorpo apropriado nas concentração de 2 x 106 células foram incubados concentrações indicadas durante 30 min a 4’0. Um antrcorpo de reatividade cruzada fol utilizado para detectar a expressão de CLDN6 e CLDN9.
λnti—claudina de camundongo disponíveis Os anticorpos anti ciauun «er.al.ente anti-LDNS (R&D, «AB4620) e antr-C») (R&D
MAB4219) serviram como controles positivo
IgG2a (Sigma, M9144) e IgG2b (Sigma, M8894 respectivamente, serviram como controle células foram lavadas três vezes com incubadas com um anticorpo secundário enquanto que de camundongo, de isotipo. As tampão FACS e específico IgG l+2a+2b+3a snti-camundongo conjugado com ARC 135-164) durante 30 min a 4°C. As células duas vezes e ressuspensas em tampão FACS.
(Dianova, 115foram lavadas
A ligação foi analisada por citometria A expressão do marcador graficamente no eixo de fluxo utilizando BD FACSArray. de fluorescência foi representada horizontal contra a ligaçao do anticorpo no eixo vertical
205
CDC
A citotoxicidade dependente do complemento (CDC) foi determinada por medição do teor de ATP intracelular em células não lisadas após a adição de complemento humano às células alvo incubadas com anticorpos anti-CLDN6. Como um método analítico muito sensível, a reação luminescente da luciferase foi utilizada para medir ATP.
Células CHO-K1 estavelmente transfectadas com CLDN6
CHO-K1-CLDN6) foram coletadas com tripsina/EDTA 0,05 lavadas duas vezes com meio X-Vivo 15 (Lonza
BE04-418Q) e suspensas a uma concentração de 1 x 107 células/ml em meio X-Vivo 15. 250 μΐ da suspensão celular foram transferidos para uma cubeta de eletroporação de 0,4 cm e misturados com 7 pig de RNA transcrito in vitro codificando a luciferase (RNA IVT de luciferase). As células foram eletroporadas 200 V e 300 μΕ utilizando Gene Pulser Xcell (Bio Rad). Apos a eletroporação, as células foram suspensas em 2,4 ml de DMEM/F12 pré-aquecido (1:1) com meio Glutamax I (Invitrogen, 31331-093) contendo FCS a 10-o (v/v) , penicilina/estreptomicina 1% (v/v) e G418 1,5 mg/ml. 50 μΐ da suspensão celular por poço foram semeados em uma placa pp de 96 poços brancos e incubada a 37 C e CO2 a 7,ao. 2.4 h após a eletroporação, 50 μΐ de anticorpos monoclonais anti206
CLDN6 de murino em RPMI a 60% (contendo HEPES 20 mM) e soro humano a 40% (pool de soro obtido a partir de seis doadores saudáveis) foram adicionados às células nas concentrações indicadas. 10 μΐ de Triton X-100 8% (v/v) em PBS por poço foram adicionados aos controles de lise total, enquanto que 10 μΐ de PBS por poço foram adicionados aos controles com máximo de células viáveis e às amostras efetivas. Após uma incubação de 80 min a 37°C e CO2 7,5%, 50 μΐ de mistura de luciferina (3,84 mg/ml de D-luciferina, 0,64 U/ml de ATPase e HEPES 160 mM em ddH2O) foram adicionados por poço. A placa foi incubada no escuro durante 45 min em temperatura ambiente. A luminescência foi medida utilizando um luminômetro (Infinite M200, TECAN). Os resultados são apresentados como unidades relativas de luz digital integrada (RLU).
As células NEC8 foram eletroporadas em 200 V e 400 μΕ e cultivadas em RPMI 1640 com meio Glutamax-I (Invitrogen, 61870) contendo FCS a 10% (v/v).
A lise especifica é calculada como:
(amostra-lise total) lise específica [%] = 100_______ xlOO (cclulas viáveis max - lise total)
Células viáveis máx: PBS 10 pL, sem anticorpo
Lise total: 10 μΐ do Triton X-100 8» (v/v) en PB
207 sem anticorpo
Iratamento Inicial
Para os tratamentos de anticorpos iniciais x IO7 células NEC8 em 200 μΐ de PBS foram inoculadas por subcutânea no flanco de camundongos
Nude-Foxnl'iu atimicos.
Cada grupo experimental consistiu de dez camundongos fêmeas de 6 a 8 semanas de idade. Três dias após a inoculação, 200 M de anticorpos ^nacionais de murino puraticados muMAB
59A, 60A, 61D, 64A, 65A, 66B e
67A foram aplicados durante dias por alternação de injeções intravenosas intraperitoneais duas experimentais tratados negativos. O volume largura2) /2) foi com tumoral por semana. Os grupos serviram como controles (TV (comprimento monitorado bissemanalmente. TV em mm3, permitindo construção de curvas de tumorais longo do tempo. Quando o tumor é expresso crescimento atingiu um volume maior do que
1500 mm3, os camundongos foram mortos.
d. Resultados.
Anticorpos monoclonais de murinos muMAB
59Ά, 60A, 61D,
64A, 65A, 66B e 67A mostraram forte ligação à CLDN6 humana à variante X143V SNP (polimortismo de nucleotideo de CL0N6, enquanto nenhuma ligação à CLDN3, 4 observada (Figura 6)
208
MuMAB 5 9A, 60Ά,
61D, 64A, 65A, 66B e
67A exibiram valores de EC50 muito baixos (200 a 500 ng/ml de EC50) e a saturação de ligação foi alcançada em baixas concentrações ( Figura 7) ·
MuMAB 59A, 60A,
61D, 64A, 65A, 66B e atividade CDC dependente da dose e induziram concentrações (Figura
67A exibiram
CDC em baixas
Os anticorpos anti-CLDN6 muMAB
65A e 66B induziram CDC e» células NEC8 de uma forma dosedependente (Figura 9). A especrficidade alvo dos muMAB 65A e 66B foi provada usando células NEC8 LVTS2 (diminuição de CLDN6).
Além disso, muMAB 59A, 60A, 61D, 64A,
65A, 66B e 67A em camundongos apresentaram inibição do crescimento tumoral enxertados com células NEC8 (Figura 10).
Exemplo 7: Geração e teste de anticorpos monoclonais quiméricos contra CLDN6.
Geração de anticorpos monoclonais quiméricos de camundongo/humano.
Para a quimerização, a região variável de cadeia leve e cadeia pesada de murino, foram amplificadas por PCR incluindo as sequências lider, utilizando iniciadores listados na tabela abaixo.
As cadeias pesadas de murino foram fundidas ao sitio de restrição Apal (5' GGGCCC 3 ) pela parte N_terminal da cadeia Fcgammal humana, que foi
209 codificada pelo vetor de expressão. Os domínios luindo sequências líder, foram da cadeia capa de murino, clonados em frente da região constante usando um sitio de
BsiWI. A orientação oorreta da região constante no vetor, adequada para o promotor precedente do vetor, foi verificada por sequencramento. Devrdo ã posição qualquer amplificação de uma do sítio de restrição Apal, 1 to viriável incluindo região variavex sequência líder para esta
finalidade tem
sequência da
sequência do
de incluir os primeiros nucleotideos da constante gama 1 humana, além sitio Apal. a sequência de nucleotideos da da con-tante da cadela pesada gama-1 humana está região conmdiite qm TD NO· 24, a sequência de aminoácidos listada como a SEQ ID nu. zu região constante gama-1 humana esta da, assim expressa, regiau listada como SEQ ID NO: 25. A sequêncra de nucleotideos que codifica a parte constante da cadeia capa leve está lietada como a SEQ ID NO:
está listada como camundongo . „ opdiipncia de aminoacidos
26, a respectiva sequenoi a SEQ ID NO: 27.
iniarpq de hibridoma de Linhagens celulares o utilizadas para clonagem de anticorpo muMAB Isotipo
SEQ ID de iniciador NOs:
Cadeia
64A
IgG2a
17, 18
210 pesada
Cadeia leve
9A
61D
67A
64A
9A
61D
67Ά
IgG2a
I gG2 a
IgG2a
IgK
IgK
IgK
IgK
17, 19
17, 20 ^T^XKdeXdX àl con t r apartes
17, 20
21, 22
21, 23
21, 22
21, 22 murinas, os múméricos foram nomeados anticorpos monoclonais qurmerico adicionando o prefixo chim, por exemplo chimAB 64A.
n.c, a. Haq reaiões variáveis de A amplrficaçao das region cadeias leves e pesadas realizada de murino de incluindo sequências lider acordo com o método de PCR descrito em Matz e col.
27, No. 6) . Para isso, de linhagens de por métodos técnica, por (Qiagen). cDNA foi acelerada (Nucleic Acids Research, 1999, vol. o RNA total foi preparado a partir célula padrão de hibridoma monoclonais conhecidos exemplo, de fita com única foi método de mudança de molde col.
Além (ver Tabela pelas pessoas uso do Mini preparado de versadas na
Kit RNeasy acordo com o também descrito em Matz e (Nucleic Acids Research, 1999, vol.
de um oligômero (dT)30
SEQ ID NO: 28),
No. 6, 1558) .
ele incluiu um oligômero blbrtdç do ONA/RNA (SEQ !D NO um adaptador 5' para a mudança do
29) servindo como molde durante a
211 ~ ma de cDNA. Neste oligômero adaptador, polimerizaçao da fita de últimos três nucleotideos foram ribo- ao invés de δ Anbseauente POR acelerada usou desoxirribonucleotideos. A subsequen um oligômero antisense voltado para a constante da cadeia capa de camundongo ou para a região constante da subclasse 2a da cadeia gama (SEQ
ID NO: 30 e
31, anticorpo monoclonal respectivamente). A subclasse IgG do de murino produzida pelas linhagens celulares de hrbrrdoma foi imunologicamente analisada antes com IsoStrip (Roche), oligômero antisense apropriado foi escolhido adequadamente serviu como compreendendo e 3 3.
As (ver Tabela
Uma mistura de iniciador oligômero sense na PCR os dois oligômeros listados nas ~ vTTiávsis de murino regiões variava incluindo sequências lider, foram
PCR omitindo a região constante de adicionando sítios de restrição acelerada ,
SEQ ID NO: 32 identificadas, então amplificadas por camundongo 3' e 5' UTR, às extremidades que permi t iram preparados disso, os a subclonagem nos vetores carregando as oligômeros de expressão regiões constantes humanas.
Além ense forneceram uma sequência Kozak de consenso (5'-GCCGCCACC 3') e os oligômeros antisense para as regiões v a r i a v eis primeiros nucleotideos da cadeia pesada incluiram os da região constante gama-1
212 humana, além do sítio de restrição Apal (ver Tabela 1, SEQ ID NOs: 17 a 23). As regiões variáveis da cadeia leve capa, incluindo as sequências líder, foram clonadas utilizando as enzimas de restrição HindIII e BsiWI, regiões variáveis da cadeia pesada gama demandaram enzimas de restrição HindIII e Apal.
Além disso, as regiões variáveis de murinos das cadeias leve e pesada, incluindo as sequências líder, foram amplificadas e novos anticorpos monoclonais quiméricos contra CLDN6 foram gerados de acordo com o protocolo descrito acima.
b. Produção de anticorpos monoclonais anti-CLDN6 quiméricos.
Anticorpos monoclonais quiméricos foram transitoriamente expressos em células HEK293T (ATCC CRL11268) transfectadas com DNA de plasmideo que codifica as cadeias leve e pesada do anticorpo correspondente. 24 h antes da transfecção, 8 x 107 células foram semeadas em placas de cultura de 145 mm e cultivadas em 25 ml de meio HEK293T (DMEM/F12 + GlutaMAX-I, FCS 10%, pemcilina/estreptomicina 1%). 20 pg de DNA de plasmideo foram dissolvidos em 5 mL de meio HEK293T sem suplementos por placa dc cultura de células. Após a adição de 75 μΐ de
213 polietilenimina linear (PEI) (1 mg/ml) (Polyscience,
23966), a mistura (DNA:PEI) foi incubada 15 min em temperatura ambrente. Depois disso, a mistura de transfecção foi adicionada gota a gota às células. 24 h após a transfecção o meio-HEK293T foi substituído com meio
Pro2 93a (Lonza,
BE12-764Q) contendo
1% de penicilina/estreptomicina. Para a expressão ótima, células transfectadas foram cultivadas a 37°C e C02 7,5^ por mais 96 a 120 h adicionais. O sobrenadante foi coletado o anticorpo quimérico foi purificado por FPLC usando colunas de proteína A.
A concentração do anticorpo foi foi testada por determinada e a qualidade
c. Teste de anticorpos monoclonais
SDS-PAGE.
quiméricos contra
CLDN6.
Citometria de fluxo
Para testar as especificidades e afinidades de anticorpos monoclonais quiméricos específicos para CLDN6 que se ligam às células HEK293 estavelmente transfectadas com CLDN3, 4, 6 ou 9, respectivamente, e as linhagens de ólulas tumorals quo expressam CLDN6 endogenamente foram feitas análises por citometria de fluxo
Portanto, as células foram coletadas com com tampão FACS (PBS contendo tripsina/EDTA 0,05%, lavadas
FCS 2% e azida de sódio 0,1¾) uspensas em Lampão FACo a uma concentração de 2 x 10
214 ooi-iiõr foram incubados com células/ml. 100 pl da suspensão celular anticorpo aproprrado nas concentrates indicadas durante tC. um anticorpo quimérico de reativrdade cruzada min a (chimAB
5F2D2) foi utilizado para detectar a expressão de
CLDN6 e
CLDN9. Os anticorpos anti claudrna de camundongo disponíveis anti-CLDN4 comercialmente anti CLDN3 (R&D, (R&D, MAB4219) serviram como
MAB4620) controles enquanto IgGl-capa humana (Sigma, 15154) como controle negatrvo. As células foram lavadas três vezes r so FACS e incubadas durante 30 min a 4 °C com Fccom tampao cacu e gama de IgG de cabra anti-humano conjugada com APC (Dianova, (Dianova,
109-136-170)
IgG l+2a+2b+3
115-135-164), ou um anticorpo secundário anti-camundongo conjugado com ABC respectivamente. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas
Ί/σηΗΛ nor citometria foi analisada ροχ
FACSArray.
CDC
A citotoxicidade dependente em de do tampão FACS. A ligação fluxo utilizando complemento (CDC) determinada por medição do teor de AT P intracelular
BD foi células células método , ndicão de complemento humano não lisadas apos a adiçao alvo incubadas com anticorpos anti CLDN6. Como analítico muito sensível, reação em às um de bioluminescência da
Luciferase é usada para medir AT
215
Neste ensaio, as células tipo selvagem NEC8 (positivas para CLDN6) e células NEC8 com CLDN6 reduzida (negativas para CLDN6) foram utilizadas, onde ambas foram estavelmente transduzidas com o constructo de expressão da luciferase. As células foram coletadas com 0,05% de tripsina/EDTA e ajustadas até uma concentração de 2 x 10J células/ml em RPMI com meio GlutaMax-I (Invitrogen, 61870-010) contendo FCS a 10% (v/v) . 1 x 104 células foram semeadas em uma placa PP de 96 poços brancos e incubadas durante 24 h a 37 °C e CO2 a 5%. Após a incubação, 50 μΐ de anticorpos monoclonais anti-CLDN6 quiméricos em 60% de RPMI (contendo HEPES 20 mM) e 40% de soro humano (pool de soro obtido a partir de seis doadores saudáveis) foram adicionados as células nas concentrações indicadas. 10 μΐ de Triton X-100 8% (v/v) em PBS por poço foram adicionados aos controles de lise total, enquanto que 10 μΐ de PBS por poço foram adicionados aos controles de células viáveis máximas e as amostras efetivas. Após uma incubação adicional de 80 mm a 37°C e CO2 a 5%, 50 μΐ de mistura de luciferina (3,84 mg/ml de D-luciferina, 0,64 U/ml de ATPase e 160 mM de HEPES em ddH2O) foram adicionados por poço. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente durante 45 min. A bioluminescência foi medida utilizando um luminômetro
216 (Infinite M200, TECAN). Os resultados foram apresentados como unidades relativas de luz digital integrada (RLU).
A lise especifica é calculada como:
lise específica [%] - 100 (amostra - lise total) (células viáveis max - lise total) x 100
Células viáveis máx:
PBS 10 μΐ, sem anticorpo
Lise total μΐ de Triton X-100 8% (v/v) em PBS, sem anticorpo
ADCC
A citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) foi determinada por medição do teor de ATP intracelular em células não Usadas após a adição de PBMC humano às células alvo incubadas com anticorpos anti-CLDN6. Como um método analítico muito sensível, a reação bioluminescente da luciferase é usada para medir ATP.
Neste ensaio, células tipo selvagem NEC-8 (positivas para CLDN6) e células NEC-8 com diminuição de expressão de CLDN6 (negativas para CLDN6) foram utilizadas, em que ambas foram estavelmente transduzidas com o constructo de expressão da luciferase. As células foram coletadas com 0,05% de tripsina/EDTA e ajustadas até uma concentração de 2 x 10s células/ml em RPMI com meio GlutaMax-I (Invitrogen, 61870_010) contendo FCS a 10% (v/v) e Hepes 20 mM. 1 x IO4
217 células foram semeadas em uma placa PP de 96 poços brancos e incubadas durante 4 h a 37 °C e CO2 a 5^.
PBMC foram isoladas de amostras de sangue de doadores humanos por centraiugação em gradiente de densidade usando lot Healthcare, 17144003) . As PMBC contendo
Ficoll Hypaque (GE Healtncdi , interfase foram isoladas e as células foram lavadas duas ml soro com PBS/EDTA (2 mM) . 1 x de meio X-Vivo 15 (Lonza,
108 PBMC foram semeadas
BE04-418Q) contendo 5 humano inativado pelo calor (Lonza, US14-402E) incubadas durante 2 horas a 37 °C e CO2 a 5%.
h após a semeadura das células alvo (NEC-8) 25 μΐ em de de anticorpos monoclonars anti-CLDN6 quiméricos em PBS foram adicionados às celulãs nas concentrações rndicadas. As PBMC não aderentes, que monócitos aderentes, células/ml de células for am monoclonais separaram em 2h de incubação dos foram coletadas e ajustadas a 8 x 10
15. 25 μΐ desta suspensão de adicionados às células alvo e aos anticorpos , . ac oiacas foram anti-CLDN6 quiméricos. As p incubadas durante
Após 24 h de em PBS por poço
4 horas a 37 °C e CO2 a o-6.
incubação, 10 μΐ de Triton X-100 81 (v/v) foram adicionados aos controles de lise total enquanto que μΐ de PBS por poço foram adicionados aos controles de células viáveis máximas e a amostras
218 efetivas. 50 μΐ de mistura de luciferina (3,84 mg/ml de Dluciferina, 0,64 U/ml de ATPase e HEPES 160 mM em ddH2O) foram adicionados por poço. A placa foi incubada no escuro em temperatura ambiente durante 30 min. A bioluminescência foi medida utilizando um luminômetro (Infinite M200, TECAN). Os resultados são apresentados como unidades relativas de luz digital integrada (RLU).
A lise especifica é calculada como:
(amostra - lise total) lise específica [%] = 100 x 100 (células viáveis max - lise total)
Células viáveis máx:
PBS 10 μΐ, sem anticorpo
Lise total μΐ de Triton X-100 8% (v/v) em PBS, sem anticorpo.
d. Resultados.
Anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A e 89A mostraram forte liqação à CLDN6 humana, enquanto nenhuma liqação à CLDN3, 4 e 9 foi observada (Figura 11).
No que diz respeito à liqação à CLDN6 humana estavelmente expressa na superfície de células HEK293, os anticorpos monoclonais quiméricos anti-CLDN6 chimAB 64A e 89A apresentam valores de EC50 muito baixos (450 a 600 ng/ml de EC50) c a saturação da ligação foi alcançada em
219 baixas concentrações de EC50 baixo (EC50 ng/ml),
ChimAB 67A e 61D apresentaram valores de 1000 ng/ml) e médio (EC50 de 2300 respectivamente (figura 12).
que diz respeito à ligaçao de CLDN6 endogenamente monoclonais expressa em células NEC8, anticorpos anti-CLON6 chimAB 64A e 89A exibiram valores de quiméricos
EC50 muito baixos (EC50 de 600 a 650 ng/ml) e a saturação foi alcançada em concentrações baixas, enquanto de ligação que chimAB ί _/No prSO médio (EC50 do 1700 61D e 67A apresentaram valores d ng/ml) e elevado (EC50 de 6100 ng/ml), respectivamente (Figura 13) .
No que diz respeito à ligação de CLDN6 endogenamente expressa em células OV90, anticorpos monoclonais anti-CLDN6 chimAB 64A e 89A exibiram valores de baixos (EC50 de 550 a 600 ng/ml) e a saturação foi alcançada em baixas concentrações. ChrmAB quiméricos
EC50 muito da ligação
61D e 67A apresentaram valores de EC50 médios (EC50 de 1500 de 2300 ng/ml, respectivamente) (Figura 14). monoclonais quiméricos anti-CLDN6
EC50
61D, dose
61D, em
Anticorpos
64A, 67A e dependente
Anticorpos
64A, 677-X e ng/ml e chimAB
89A apresentaram atividade CDC de em células NEC-8 (Figura 15) maneira chimAB monoclonais quiméricos anti CLDN6
89A exibiram atividade ADCC dose dependente células NEC-8 induziram ADCC mesmo em baixas
220 concentrações de anticorpo (Figura 16).
Estes resultados mostram claramente a especificidade destes anticorpos monoclonais quiméricos para CLDN6.
Exemplo 8: Tratamento usando anticorpos monoclonais contra CLDN6.
Tratamento Inicial
Para os tratamentos iniciais com anticorpos, 2 x 107 células NEC8 em 200 μΐ de meio RPMI (Gibco) foram inoculadas subcutaneamente no flanco de camundongos NudeFoxnl™ atimicos. Cada grupo experimental consistiu de dez camundongos fêmeas de 6 a 8 semanas de idade. Três dias após a inoculação de células tumorais, 200 μρ de anticorpo monoclonal de murino purificado muMAB 89A foi aplicado durante sete semanas por alternação de injeções intravenosas e intraperitoneais duas vezes por semana. 0 grupo experimental tratado com PBS serviu como controle negativo. 0 volume tumoral (TV = (comprimento x largura2)/2) foi monitorado bissemanalmente. TV é expresso em mm2, permitindo a construção de curvas de crescimento turnoral ao longo do tempo. Quando os tumores atingiram um volume maior do que 1500 mm3, os camundongos foram sacrificados.
Tratamentos avançados
221
Para os tratamentos com anticorpos de tumores xenoenxertados avançados, 2 x 107 células NEC8 em 200 μΐ de meio RPMI (Gibco) foram inoculadas subcutaneamente no flanco de camundongos Nude-Foxnl1' atímicos fêmeas com 6 a 8 semanas de idade. 0 volume tumoral (TV = (comprimento x largura2)/2) foi monitorado bissemanalmente. TV é expresso em mm , permitindo a construção de curvas de crescimento tumoral ao longo do tempo. De 15 a 17 dias após a inoculação de células tumorais, os camundongos foram divididos em grupos de tratamento de oito animais por grupo com tamanhos de tumor homogêneos acima de 80 mm3. 200 μg de anticorpos monoclonais de murino purificados muMAB 61D, 64A, 67A e 8 9A foram aplicados durante cinco semanas por alternância de injeções intravenosa e intraperitoneal duas vezes por semana. Os grupos experimentais tratados com PBS e um anticorpo inespecífico serviram como controles negativos. Quando os tumores atingiram um volume maior do que 1500 mm3, os camundongos foram sacrificados.
Em um modelo de xenoenxerto de tratamento inicial usando camundongos enxertados com a linhagem de célula tumoral NEC8, os camundongos tratados com anticorpos monoclonais murinos muMAB 61D, 64A e 67A não mostraram qualquer crescimento tumoral mesmo após a interrupção da
222 imunoterapia (Figura 17).
Em um modelo de xenoenxerto de tratamento inicial usando camundongos enxertados com a linhagem de célula tumoral NEC8, muMAB 89A apresentou inibição do crescimento tumoral e nenhum tumor foi detectável nos camundongos tratados com muMAB89A no final do estudo (Figura 18).
Em um modelo de xenoenxerto de tratamento avançado usando camundongos enxertados com a linhagem de célula tumoral NEC8, muMAB 64A apresentou uma inibição do crescimento tumoral (Figura 19).
Em um modelo de xenoenxerto de tratamento avançado usando camundongos enxertados com a linhagem de célula tumoral NEC8, os camundongos tratados com muMAB 64A apresentaram sobrevida prolongada (Figura 20).
Em um modelo de xenoenxerto de tratamento avançado usando camundongos enxertados com a linhagem de célula tumoral NEC8, a inibição do crescimento tumoral foi alcançada com os anticorpos monoclonais murinos anti-CLDN6 muMAB 61D, 67A e 89A (Figura 21).
Em um modelo de xenoenxerto de tratamento avançado usando camundongos enxertados com a linhagem de células tumorais NEC8, os camundongos tratados com o anticorpo CLDN6 especifico muMAB 61D ou 67A mostraram sobrevida prolongada (Figura 22).
223
Em um modelo de xenoenxerto de tratamento avançado utilizando camundongos enxertados com células NEC8 tipo selvagem e células NEC8 com redução de expressão estável de CLDN6, muMAB 64A e 8 9A apenas mostraram um efeito terapêutico em camundongos enxertados com NEC8 tipo selvagem, mas não em camundongos enxertados com células NEC8 com redução de expressão de CLDN6, demonstrando especificidade à CLDN6 do anticorpo in vivo (Figura 23).
Exemplo 9: Mapeamento de epitopo de alta resolução dos anticorpos monoclonais contra CLDN6.
Os anticorpos monoclonais específicos para CLDN6 apresentam apenas ligação muito fraca (se houver) aos peptídeos lineares em estudos de mapeamento de epitopo por ELISA, o que implica que os seus epítopos são conformacionais. Para analisar a interação entre os anticorpos aqui descritos e CLDN6 na sua conformação nativa, mutagênese sítio direcionada em cultura de células de mamíferos foi usada como uma técnica de mapeamento de epitopo.
A mutagênese de varredura de alanina dos aminoácidos 27 a e 13/ a 161 dentro do primeiro e segundo domínio extracelular, respectivamente, foi realizada. Após a expressão transitória em células HEK293T, mutantes de CLDN6 foram avaliados pelas suas capacidades de estarem ligados por anticorpos monoclonais específicos. A
224 ligação prejudicada um mutante de CLDN6 importante resíduo de um anticorpo monoclonal especifico a sugere que o aminoácido modificado é um de ligaçao foi analisada contato conformacional. a
Por citometria de fluxo. Para discriminar entre populações de células transfectadas e transfectadas, as células foram cotransfectadas marcador de fluorescência.
Os resíduos de aminoácidos de CLDN6 que não um importantes para a interact j-uLeraçao com antioormmc· ~ , aiiLicorpos quiméricos -pecifrcos para CLDN6 foram sistematicamente identifreados por varredura de alanrna. Mutações de alanlna θ foram geradas por mutagénese sitio direcionada (GENEART AG,
Alemanha). Para testar a ligação quiméricos à CLDN6 tipo selvagem
HEK293T foram transitoriamente correspondente expressão foi diferenciar transfectadas, uni iTici.rccidoz? do de anticorpos monoclonais seus mutantes, células transfectadas com plasmideo codificador de claudina e analisada por citometria de fluxo. Ά fim entre células as células HEK293T
l.ripsina/EDTA, lavadas com ο θ azida de sódio uma concentração do 2 x 10 de transfectadas e não foram cotransfectadas com um relator. 24 h após a foram coletadas com 0,05% tampão FACS (PBS contendo FCS e lessuspensas em tampão FACS de células/ml . 100 ui ίου μι da suspensão
225 celular foram incubados com 10 pg/ml de anticorpo durante 45 min a 4 °C. O camundongo comercialmente disponível antiCLDN6 (R&D, MAB3656) foi utilizado como um controle para detectar a expressão de superfície celular de mutantes
CLDN6. As células foram lavadas três vezes com tampão FACS e incubadas com Fc-gama de IgG de cabra anti-humana conjugada com APC (Dianova, 109-136-170) ou um anticorpo secundário específico IgG l+2a+2b+3a anti-camundongo conjugado com APC (Dianova, 115-135-164) durante 30 min a 10 4 °C. As células foram lavadas duas vezes e ressuspensas em tampão FACS. A ligação na população de células transfectadas foi analisada por citometria de fluxo utilizando um BD FACSArray. Portanto, a expressão do marcador de fluorescência foi representada graficamente no 15 eixo horizontal contra a ligação do anticorpo no eixo vertical. A intensidade de sinal média de um anticorpo monoclonal quimérico específico para CLDN6 ligado à CLDN6 mutante foi expressa como a porcentagem de ligação tipo selvagem. Os aminoácidos que são essenciais para a ligação 20 não apresentaram ligação depois de serem modificados, enquanto que os aminoácidos que suportam a ligação apenas apresentaram ligação reduzida em comparação com o tipo selvagem.
Mapeamento de epítopos de alta resolução demonstrou
226 que os amino ácidos F35, G37, S39 e, possivelmente, T33 do primeiro domlnro extracelular de CLDN6 são importantes para a interação com os anticorpos quiméricos específicos para CLDN6 chimAB 61D, 64A, 67A e 89A. 0 residue 140 é essencial 5 para a ligação de chimAB 89A e contribui para a ligação de chimAB 61D e 67A. Além disso, L151 do segundo domínio extracelular de CLDN6 é importante para a mteraçao com chimAB 67A (Figura 24).

Claims (7)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Anticorpo que é capaz de se ligar à CLDN6 caracterizado pelo fato de ser selecionado do grupo consistindo de (i) um anticorpo produzido por ou obtenível a partir de um clone depositado sob o número de acesso DSM
    ACC3067 (GT512muMAB 59A), DSM ACC3068 (GT512muMAB 60A), DSM ACC3069 (GT512muMAB 61D), DSM ACC3070 (GT512muMAB 64A), DSM ACC3071 (GT512muMAB 65A), DSM ACC3072 (GT512muMAB 66B), DSM ACC3073 (GT512muMAB 67A) , DSM ACC3089 (GT512muMAB 55A) ou DSM ACC3090 (GT512muMAB 89A), (ii) um anticorpo que é uma
    forma quimerizada ou humanizada do anticorpo em (i), (iii) um anticorpo que compreende a porção de ligação ao antígeno ou sítio de ligação a antígeno do anticorpo em (i) que compreende um conjunto de HCDRs e LCDRs selecionado do grupo que consiste em:
    (a) um HCDR1 de sequência de aminoácido GYSFTGYT identificado dentro da SEQ ID NO: 34, um HCDR2 de sequência de aminoácido INPYNGGT identificado dentro da SEQ ID NO: 34, um HCDR3 de sequência de aminoácido ARDYGYVLDY identificado dentro da SEQ ID NO: 34,
    um LCDR1 de sequência de aminoácido SSVSY identificado dentro da SEQ ID NO: 35, um LCDR2 de sequência de aminoácido STS identificado dentro da SEQ ID NO: 35, e
    um LCDR3 de sequência de aminoácido QQRSIYPPWT
    identificado dentro da SEQ ID NO: 35; (b) um HCDR1 de sequência de aminoácido GYSFTGYT identificado dentro da SEQ ID NO: 36,
    Petição 870190139820, de 26/12/2019, pág. 11/24
  2. 2/5 um HCDR2 de sequência de aminoácido INPYNGGT identificado dentro da SEQ ID NO: 36,
    um HCDR3 de sequência de aminoácido ARDYGFVLDY identificado dentro da SEQ ID : NO: 36, um LCDR1 de sequência de aminoácido SSVSY identificado dentro da SEQ ID NO: 37, um LCDR2 de sequência de aminoácido STS identificado dentro da SEQ ID NO: 37, e um LCDR3 de sequência de aminoácido QQRSNYPPWT
    identificado dentro da SEQ ID NO: 37; (c) um HCDR1 de sequência de aminoácido GYSFTGYT identificado dentro da SEQ ID NO: 38, um HCDR2 de sequência de aminoácido INPYNGGI identificado dentro da SEQ ID NO: 38, um HCDR3 de sequência de aminoácido ARDFGYVLDY identificado dentro da SEQ ID NO: 38,
    um LCDR1 de sequência de aminoácido SSVSY identificado dentro da SEQ ID NO: 39, um LCDR2 de sequência de aminoácido STS identificado dentro da SEQ ID NO: 39, e
    um LCDR3 de sequência de aminoácido QQRSTYPPWT
    identificado dentro da SEQ ID NO: 39; e (d) um HCDR1 de sequência de aminoácido GYSFTGYT identificado dentro da SEQ ID NO: 40, um HCDR2 de sequência de aminoácido INPYNGGS identificado dentro da SEQ ID NO: 40, um HCDR3 de sequência de aminoácido ARDYGYVFDY identificado dentro da SEQ ID NO: 40,
    Petição 870190139820, de 26/12/2019, pág. 12/24
  3. 3/5
    um LCDR1 de sequência de aminoácido SSVNY identificado dentro da SEQ ID NO: 41, um LCDR2 de sequência de aminoácido STS identificado dentro da SEQ ID NO: 41, e um LCDR3 de sequência de aminoácido QQRNNYPPWT
    identificado dentro da SEQ ID NO: 41.
    2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de não ser substancialmente capaz de se ligar à CLDN9 associada com a superfície de uma célula que expressa CLDN9.
    3. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de não ser substancialmente capaz de se ligar à CLDN4 associada com a superfície de uma célula que expressa CLDN4 e/ou que não é substancialmente capaz de se ligar à CLDN3 associada com a
    superfície de uma célula que expressa CLDN3. 4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de ser específico para CLDN6 . 5. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das
    reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser capaz de se ligar a um epítopo localizado dentro de uma porção extracelular de CLDN6, em que a dita porção extracelular de CLDN6 compreende, preferencialmente, a sequência de
    aminoácidos de SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 7. com qualquer uma das 6. Anticorpo, de acordo reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que CLDN6 tem a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 ou a
    sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 8.
    Petição 870190139820, de 26/12/2019, pág. 13/24
  4. 4/5
    7. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das
    reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de ter uma ou mais das seguintes atividades:
    (i) morte de uma célula expressando CLDN6,
    (ii) inibição da proliferação de uma célula que
    expressa CLDN6,
    (iii) inibição da formação de colônias de uma
    célula que expressa CLDN6, (iv) mediação da remissão de tumores estabelecidos, (v) prevenção da formação ou reformação de tumores, e
    (vi) inibição da metástase de uma célula que
    expressa CLDN6, e/ou que de exibe uma ou mais funções efetoras imunes contra uma célula que carrega CLDN6 na sua conformação natural, em que a uma ou mais funções efetoras imunes são, preferencialmente, selecionadas do grupo consistindo de citotoxicidade dependente do complemento (CDC), citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), indução de apoptose e inibição da proliferação, de preferência as funções efetoras são ADCC e/ou CDC.
    8. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das
    reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser um anticorpo monoclonal, quimérico, humano ou humanizado, ou um fragmento de um anticorpo.
    9. Hibridoma, caracterizado pelo fato de ser
    depositado sob o No de acesso DSM ACC3067 (GT512muMAB 59A), (GT512muMAB 59A), DSM ACC3068 (GT512muMAB 60A), DSM ACC3069
    Petição 870190139820, de 26/12/2019, pág. 14/24
  5. 5/5 (GT512muMAB 61D), DSM ACC3070 (GT512muMAB 64A), DSM ACC3071 (GT512muMAB 65A), DSM ACC3072 (GT512muMAB 66B), DSM ACC3073 (GT512muMAB 67A), DSM ACC3089 (GT512muMAB 55A) ou DSM ACC3090 (GT512muMAB 89A).
  6. 10. Conjugado, caracterizado pelo fato de compreender um anticorpo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 acoplado a um agente terapêutico, em que o agente terapêutico é, preferencialmente, uma toxina, um radioisótopo, um fármaco ou um agente citotóxico.
  7. 11. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 8 e/ou o conjugado conforme definido na reivindicação 10, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
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